CN107557338A

CN107557338A - 特异性识别ny‑eso‑1的t细胞及其与细胞因子的联合的应用

Info

Publication number: CN107557338A
Application number: CN201710844510.0A
Authority: CN
Inventors: 刘沐芸; 胡祥; 刘未斌; 李琼书; 刘曲波
Original assignee: Shenzhen Beike Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Beike Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-09-19
Filing date: 2017-09-19
Publication date: 2018-01-09

Abstract

本发明提供了T细胞，其包含编码特异性识别NY‑ESO‑1的TCR的核酸并表达所述特异性识别NY‑ESO‑1的TCR，其还可同时表达IL‑2的T细胞。本发明还提供了与表达LIGHT的间充质干细胞一起培养的前述T细胞。本发明还提供了含有本发明的T细胞的药物组合物。本发明还提供了本发明的T细胞在用于制备预防或治疗癌症的药物中的用途。

Description

特异性识别NY-ESO-1的T细胞及其与细胞因子的联合的应用

技术领域

本发明涉及免疫学和医药领域。具体的，本发明提供了表达特异性识别NY-ESO-1的T细胞受体(TCR)的T细胞。本发明还提供了所述T细胞与细胞因子联合在治疗癌症或制备治疗癌症的药物中的用途。

背景技术

近年来，肿瘤免疫治疗发展迅速，但整体效果依然欠佳。究其原因，可能与肿瘤通过各种机制产生免疫逃逸有关。如肿瘤细胞表达与正常组织细胞相同的抗原而逃避机体免疫系统的识别；通过分泌免疫抑制因子如TGF-β和IL-10等来抑制免疫活性细胞的功能；通过下调TNF-α受体、Fas受体等来抵抗细胞因子及细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxiclymphocyte,CTL)的抗肿瘤效应；通过丢失肿瘤抗原下调HLA使抗原不能有效提呈等。肿瘤浸润性T细胞(tumor-infiltrating lymphocyte，TIL)过继性免疫治疗虽然在部分肿瘤取得成功，但是在大多数肿瘤中并没有达到预期的效果。其主要原因包括：TIL难以获取，这些T细胞体外扩增后功能活性下降，到达肿瘤组织的T细胞数量不足以及在肿瘤组织微环境中丧失免疫活性等。为此，研究者已尝试使用基因修饰T细胞来解决这个问题，如用来修饰T细胞的基因有CAR(chimeric antigen receptor，嵌合型抗原受体)、促进免疫细胞增殖的细胞因子如IL-2、IL-15等均已取得较好的疗效，但由于脱靶性、安全性等问题极大地限制了它们在临床上的应用。

T细胞过继性转移可以增强免疫系统介导的对肿瘤细胞的消除，是近年来获得较高关注的一种特异性、无毒性的癌症新疗法。在T细胞过继转移中，T细胞受体(TCR)基因转移作为一种发展迅速的免疫治疗方法，可以在体外产生大量的具有已知抗原特异性和功能亲和性的T细胞，应用于恶性肿瘤的过继细胞免疫治疗。TCR基因工程化T细胞的产生首先筛选和克隆肿瘤特异性TCR基因,随后以之转染T细胞赋予其抗原特异性,从而获得基因工程化抗原特异性T细胞,最终将TCR基因转染T细胞回输患者体内，重建针对抗原阳性肿瘤的T细胞免疫反应。

然而，至今为止仅鉴定了有限数量的合适TCR候选物。这主要是由于用于TCR基因分离的T细胞克隆的建立困难所致。另外，这些鉴定的TCR转导的T细胞依然存在T细胞活化信号转导弱以及在体内的存活时间短等问题。

NY-ESO-1属于癌症睾丸抗原(CTA)家族，其在肿瘤细胞和睾丸和胎盘的不表达MHC的生殖细胞中表达(Chen，PNAS USA,1997,94(5):1914-1918)。已经发现NY-ESO-1在多种人癌症中表达，包括黑素瘤，乳腺癌，肺癌，前列腺癌，甲状腺癌，卵巢癌，骨肉瘤和滑膜细胞肉瘤。

骨肉瘤是一种起源于骨间叶组织的恶性肿瘤，占原发恶性骨肿瘤的20％，约70％-80％的患者发病年龄在10-25岁，年发病率约为(1-3)/100万人。骨肉瘤恶性程度高，早期有可能发生肺转移，约有10-20％的病人在诊断时发现有转移灶，预后极差。目前,尽管人们尝试用新的化疗药物或联合用药，病人的生存率不再提高。

白细胞介素2(interleukin 2，IL-2)是一类具有广泛免疫学活性的细胞因子，主要由CD4+和CD8+T细胞产生。其在免疫系统中发挥着非常重要的作用：促进所有亚型T细胞增殖及产生细胞因子,延长其生存期；促进NK细胞毒活性；激活单核/巨噬细胞，并增强其杀瘤活性等。IL-2作为免疫治疗剂及免疫佐剂应用也取得了一定的免疫效果。IL-2的抗肿瘤作用除与LAK,TIL有关外，还与其诱导NO的产生有关,但因IL-2价格昂贵、体内半衰期短、大量注射不良反应重，从而限制了它的应用。

LIGHT又称为HVEM-L(Herpesvimsen mediator-Ligand)，是肿瘤坏死因子超家族的第14个成员(TNFSFl4)，在肿瘤微环境下对免疫细胞的活化扮演重要角色。研究表明，其与同为肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor，TNFR)/肿瘤坏死因子(TNF)超家族的受体分子HVEM结合后可提供T细胞活化增殖的正向刺激信号，通过与不同受体的相互作用，可在诱导肿瘤细胞凋亡的同时，共刺激T细胞生长、活化，并在T细胞应答、免疫调节以及正、负效应中起重要作用。虽然作为免疫刺激因子，LIGHT具有较强的抗肿瘤效应，但全身给药作用弱，不良反应大，因此建立肿瘤组织自体旁分泌系统对近距离杀伤肿瘤将有广阔应用前景。

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是成体干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。现有研究显示，间充质干细胞可以特异性趋化到肿瘤组织，而传统的给药手段由于肿瘤组织的无序性，往往难以有效的到达肿瘤组织内部。可以研究借助MSCs来运载抗肿瘤药物以达靶向抗肿瘤作用。

本领域还需要新的抗原特异性的T细胞，以及这些T细胞与其它细胞因子的联合，或是与其它靶向性细胞载体的共同应用，以更有效地进行抗原特异性免疫治疗。

发明内容

本发明提供了一种新的特异性识别NY-ESO-1的T细胞受体，即TCR，以及其与细胞因子，特别是白细胞介素2，即IL-2的联合在T细胞中表达的应用。本发明提供了表达所述特异性识别NY-ESO-1的TCR或共同表达所述TCR与IL-2的T细胞，所述T细胞具有NY-ESO-1抗原特异性并具有更高的增殖能力。本发明还提供了经与表达LIGHT，即肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSFl4)的间充质干细胞一起培养的前述T细胞。本发明提供了本发明T细胞在治疗癌症的方法或制备治疗癌症的药物的用途。

具体的，本发明提供了一种T细胞，其包含编码特异性识别NY-ESO-1的TCR的核酸并表达所述特异性识别NY-ESO-1的TCR，所述TCR包括α链和β链。在本发明的其中一个方面，所述编码特异性识别NY-ESO-1的TCR的核酸包括编码所述TCR的α链的第一核酸片段。优选的，所述第一核酸片段具有序列为SEQ ID NO：1的核苷酸序列。在本发明的其中又一个方面，所述核酸还包括编码所述TCR的β链的第二核酸片段。优选的，所述第二核酸片段具有序列为SEQ ID NO：2的核苷酸序列。在本发明的其中又一个方面，所述编码特异性识别NY-ESO-1的TCR的核酸进一步包括所述第一核酸片段和第二核酸片段之间的接头。优选的，所述接头为编码T2A的核酸序列，例如，所述接头的核苷酸序列为AGGGCTAAACGCTCCGGGTCTGGAGCAACAAACTTCTCTCTGCTGAAGCAGGCTGGCGATGTGGAGGAAAATCCTGGGCCA(SEQ ID NO：4)。

NY-ESO-1是属于癌症睾丸抗原家族的抗原。在本发明中，NY-ESO-1主要是指人NY-ESO-1，其蛋白序列如GenBank:CAA05908.1所定义。编码NY-ESO-1的基因为CTAG1B(cancer/testis antigen 1B)，其核酸序列如Gene ID:1485所定义。

在本发明的其中又一个方面，前述T细胞还包含编码能够表达白细胞介素2，即IL-2的核酸并表达白细胞介素2。优选的，所述编码白细胞介素2的核酸具有序列为SEQ ID NO：3的核苷酸序列。在本发明的其中又一个方面，所述编码白细胞介素2的核酸通过编码T2A的核酸序列与所述编码特异性识别NY-ESO-1的TCR的核酸连接。所述编码T2A的核酸的核苷酸序列例如为AGGGCTAAACGCTCCGGGTCTGGAGCAACAAACTTCTCTCTGCTGAAGCAGGCTGGCGATGTGGAGGAAAATCCTGGGCCA(SEQ ID NO：4)。

本发明提供的T细胞能够特异性识别表达或在细胞表面呈递NY-ESO-1的细胞。本发明的T细胞可以是CD8+T细胞和CD4+T细胞。在本发明的一个方面，本发明的T细胞为CD8+T细胞。本发明提供的T细胞对表达或在细胞表面呈递NY-ESO-1的细胞，特别是癌症细胞有杀伤力，使癌症细胞破裂而死亡，还成为记忆细胞，再次遇到相同抗原刺激时，它将更迅速地增殖分化。

在本发明的其中一个方面，前述本发明的T细胞，包括所述同时编码和表达特异性识别NY-ESO-1的TCR的TCR以及编码和表达白细胞介素2的T细胞，与表达(和分泌)LIGHT的哺乳动物细胞共培养，即在T细胞的制备(培养)过程中，包括与表达(和分泌)LIGHT的哺乳动物细胞一起培养的步骤。在本发明的其中又一个方面，所述哺乳动物细胞是人的间充质干细胞，优选是人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)。

LIGHT，又称为TNFSFl4，即肿瘤坏死因子超家族的第14个成员。在本发明中，LIGHT主要是指人源LIGHT，其蛋白序列如GenBank:CAG46669.1所定义。编码LIGHT的基因为TNFSF14，其核酸序列如Gene ID:8740所定义。

在本发明的其中一个方面，所述T细胞与所述表达(和分泌)LIGHT的哺乳动物细胞共培养，使得所述T细胞的活性增强。例如，共培养后的所述T细胞增殖能力相对没有与所述表达LIGHT的哺乳动物细胞共培养的增殖能力增强；又例如，共培养后所述T细胞分泌细胞因子，例如IFN-γ，的量相对没有与所述表达LIGHT的哺乳动物细胞共培养的T细胞增加。本发明的T细胞与所述表达(和分泌)LIGHT的哺乳动物细胞共培养的时间没有特定限制，以使得所述T细胞的活性增强为标准。在本发明的其中一个方面，共培养的时间为超过一天，优选的，共培养的时间为三天或超过三天。

在本发明的一个方面，提供了含有上述本发明的T细胞的药物组合物。在本发明的一个方面，提供了上述本发明的T细胞在用于制备治疗或预防癌症的药物中的用途。上述本发明的T细胞或重组表达载体可用作治疗或预防癌症的药物组合物。本发明的重组表达载体可以将编码特异性识别NY-ESO-1的TCR和/或IL-2的核酸在T细胞中表达。本发明的T细胞具有特异性识别NY-ESO-1，通过细胞毒性作用和淋巴因子的产生发挥抗肿瘤作用。另外，本发明的T细胞与表达和分泌LIGHT的间充质干细胞共培养，受到LIGHT的刺激和活化，增殖和分泌细胞因子等活性获得增强。并且，由于间充质干细胞可以特异性趋化到肿瘤组织，由此能够位点特异性地增强本发明的T细胞的活性，包括对肿瘤细胞的杀伤。因此，本发明的T细胞可用于治疗或预防癌症，即可为用于治疗或预防肿瘤的药物组合物的活性成分。本发明的T细胞可以与表达和分泌LIGHT的间充质干细胞共同施用，对肿瘤细胞起作用，即共同用作治疗或预防肿瘤的药物组合物的活性成分。本发明的T细胞也可以在与表达和分泌LIGHT的间充质干细胞共培养后，分离出来单独用作治疗或预防肿瘤的药物组合物的活性成分。

本发明的上述药物组合物的施用的方法包括皮内、皮下、肌肉内、静脉施用等等。本发明的药物组合物的施用的方法包括静脉内施用。可将含有本发明的T细胞的试剂，或包括表达LIGHT的间充质干细胞，返回患者的体内，因此可在被本发明T细胞识别和有反应的患者体内有效杀伤肿瘤，结果可治疗或预防肿瘤。

上述本发明的药物组合物可用于预防或治疗癌症。所述癌症包括血癌、实体瘤等，更具体地讲，包括黑素瘤，乳腺癌，肺癌，前列腺癌，甲状腺癌，卵巢癌，骨肉瘤和滑膜细胞肉瘤。优选的，包含本发明的T细胞或重组表达载体的药物组合物可用于预防或治疗骨肉瘤。

在本文中，蛋白符号不用斜体，并全部大写；基因符号使用斜体。例如NY-ESO-1表示抗原蛋白，编码该蛋白的基因写为CTAG1B。但有时在本文中基因符号也不使用斜体。

在本文中，术语“编码多肽或蛋白质的核酸或核酸片段”包括含有所述多肽或蛋白质编码序列的核苷酸。除了所述多肽或蛋白质编码序列的核苷酸，该核酸或核酸片段还可包括其它单一连续区域或不连续区域(例如，多核苷酸被整合噬菌体、整合插入序列、整合载体序列、整合转座子序列中断或由于RNA编辑或基因组DNA重排而被中断)的蛋白或非蛋白编码序列的核苷酸，例如用于协助插入片段的整合的序列、表达调控的序列、编码信号肽的序列等。

附图说明

图1本发明提供的质粒pGreen puro-TCR(NY-ESO-1)和pGreen puro-TCR(NY-ESO-1)-IL2的插入片段的结构示意图。

图2是本发明提供的重组表达载体pGreen puro-TCR(NY-ESO-1)的插入片段的编码碱基序列。

图3是本发明提供的重组表达载体pGreen puro-TCR(NY-ESO-1)-IL2的插入片段的编码碱基序列。

图4是本发明的质粒转染的T淋巴细胞表达NY-ESO-1特异性TCR的上流式细胞仪检测结果图。

图5是转染了pGreen puro-LIGHT和表达LIGHT的人脐带间充质干细胞的蛋白的Western Blot实验图。

图6是本发明的T淋巴细胞抗肿瘤效果。

具体实施方式

下面将结合实施例进一步说明本发明的实质内容和有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。

实施例1重组表达载体pGreen puro-TCR(NY-ESO-1)和pGreen puro-TCR(NY-ESO-1)-IL2的构建

构建了重组表达载体pGreen puro-TCR(NY-ESO-1)和pGreen puro-TCR(NY-ESO-1)-IL2。

载体的插入片段的结构如图1所示。

1.pGreen puro-TCR(NY-ESO-1)

pGreen puro-TCR(NY-ESO-1)的插入片段包括编码TCR的α链的第一核酸片段和编码TCR的β链的第二核酸片段；第一核酸片段和第二核酸片段通过T2A序列连接。

构建过程包括：

合成编码NY-ESO-1TCRα-T2A-NY-ESO-1TCRβ(称为TCR(NY-ESO-1)序列)的核酸片段，其由包括编码NY-ESO-1-TCR的α链的第一核酸片段(碱基序列如SEQ ID No.1所示)、包括编码NY-ESO-1-TCR的β链的第二核酸序列(碱基序列如SEQ ID No.2所示)、以及将所述第一核酸片段和第二核酸片段串联起来的T2A序列(AGGGCTAAACGCTCCGGGTCTGGAGCAACAAACTTCTCTCTGCTGAAGCAGGCTGGCGATGTGGAGGAAAATCCTGGGCCA)组成。所述TCR(NY-ESO-1)序列的核酸片段如图2所示。其中小号字体的序列为编码T2A序列的核酸；小号字体的序列前为第一核酸片段；小号字体的序列后为第二核酸片段。

在所述TCR(NY-ESO-1)序列的核酸片段两端加入EcoR I和BamH I限制性内切酶位点序列。将该核酸片段与慢病毒核心载体pGreen puro用限制性内切酶EcoR I和BamH I进行双酶切，酶切产物切胶回收后，用T4连接酶16℃过夜连接。连接后转化大肠杆菌HB2151感受态，涂布平板，次日挑取单克隆双酶切及测序鉴定，得到重组表达载体pGreen puro-TCR(NY-ESO-1)。

2.pGreen puro-TCR(NY-ESO-1)-IL2

pGreen puro-TCR(NY-ESO-1)-IL2的插入片段包括编码TCR的α链的第一核酸片段和编码TCR的β链的第二核酸片段，以及编码白细胞介素2的第三核酸片段；第一核酸片段和第二核酸片段通过T2A序列连接；第二核酸片段和第三核酸片段通过T2A序列连接。

构建过程包括：

合成编码NY-ESO-1TCRα-T2A-NY-ESO-1TCRβ和IL-2的核酸片段(称为TCR(NY-ESO-1)-IL2序列)，其由包括编码NY-ESO-1-TCR的α链的第一核酸片段(碱基序列如SEQ ID No.1所示)、包括编码NY-ESO-1TCR的β链的第二核酸序列(碱基序列如SEQ ID No.2所示)、包括编码IL-2的第三核酸片段(碱基序列如SEQ ID No.3所示)、以及在所述第一核酸片段和第二核酸片段之间、第二核酸片段和第三核酸片段之间的两个T2A序列(用于将所述三个序列串联起来)组成。所述TCR(NY-ESO-1)-IL2序列的插入片段的核酸片段如图3所示。其中前一个小号字体的序列为编码T2A序列的核酸，其序列前为第一核酸片段，其序列后为第二核酸片段；后一个小号字体的序列为编码T2A序列的核酸，其序列后为第三核酸片段。

在所述TCR(NY-ESO-1)-IL2序列的核酸片段两端加入EcoR I和BamH I限制性内切酶位点序列。将该核酸片段与慢病毒核心载体pGreen puro用限制性内切酶EcoR I和BamHI进行双酶切，酶切产物切胶回收后，用T4连接酶16℃过夜连接。连接后转化大肠杆菌HB2151感受态，涂布平板，次日挑取单克隆双酶切及测序鉴定，得到重组表达载体pGreenpuro-TCR(NY-ESO-1)-IL2。

实施例2重组表达载体pGreen puro-LIGHT的构建

pGreen puro-LIGHT的插入片段包括编码LIGHT的第四核酸片段。

构建过程包括：

合成编码LIGHT的核酸片段(称为LIGHT序列)。所述LIGHT序列的碱基序列如SEQID No.5所示。

在所述LIGHT序列的核酸片段两端加入EcoR I和BamH I限制性内切酶位点序列。将该核酸片段与慢病毒核心载体pGreen puro用限制性内切酶EcoR I和BamH I进行双酶切，酶切产物切胶回收后，用T4连接酶16℃过夜连接。连接后转化大肠杆菌HB2151感受态，涂布平板，次日挑取单克隆双酶切及测序鉴定，得到重组表达载体pGreen puro-LIGHT。

实施例3慢病毒的包装

将得到的重组表达载体pGreen puro-TCR(NY-ESO-1)或pGreen puro-TCR(NY-ESO-1)-IL2或pGreen puro-LIGHT分别与慢病毒骨架质粒pMDLg PRRE、pRSV-Rev和pMD2.G(Addgene)等量通过Lipofectamine 2000脂质体(Life，Invitrogen，货号11668-019)转染进入Hek293T细胞(ATCC,商品号为CRL-3216)中进行慢病毒的包装。

按照慢病毒转化试剂供应商的说明书进行操作。具体步骤包括：用含10％FBS的1640培养基培养293T细胞；然后将293T细胞以3x10⁵/cm²的密度传至直径15cm的培养皿中培养20h，保证转染时细胞汇合度为80-90％；用不含血清的1640培养基换液，备用；取两个EP管，分别在EP管中加入1ml 1640，将慢病毒载体pGreen puro-TCR(NY-ESO-1)、pGreenpuro-TCR(NY-ESO-1)-IL2或pGreen puro-LIGHT与pMDLg PRRE、pRSV-Rev和pMD2.G质粒按照摩尔比1：1：1：1于其中一个EP管中混匀，在另一个EP管中加入150ul Lipo2000，混匀放置5min，将混有lipo2000的1640培养基加入含有质粒的EP管中，混匀，室温放置20min，然后将混合液逐滴加入上述制备的细胞培养皿中，继续培养4h后，用含10％FBS的1640培养基更换培养液。同时做GFP荧光对照组，看转染效率，病毒包装成功。继续培养48h后收集细胞上清用于病毒纯化。

实施例4慢病毒的纯化

将病毒上清用0.22μm过滤膜过滤，滤液收集在50ml超滤管中，3000g/min离心45min；将剩余的浓缩液转移至EP管，放-80℃保存备用。

分别得到带有pGreen puro-TCR(NY-ESO-1)的插入片段、pGreen puro-TCR(NY-ESO-1)-IL2和pGreen puro-LIGHT的插入片段的慢病毒载体。

实施例5CD8+T细胞的获得

A：采集来自志愿者(均签署知情同意书)的全血，倒入50ml离心管，室温离心700g20分钟(普通离心)。

B：取上述离心下部细胞成分，加DPBS至50ml。

C：分别取25ml上述液体加到20ml人淋巴细胞分离液,将离心管室温离心800g 15分钟。

D：取白膜层细胞，加入DPBS，补足至50ml。

E：离心600g 10分钟，弃上清液，得PBMC。

F：采用CD8+T细胞磁珠分选试剂盒分选CD8+T细胞。

实施例6慢病毒载体感染T淋巴细胞

用含10％胎牛血清的RPMI 1640完全培养基培养CD8+T细胞，第一天加入抗CD3单克隆抗体活化；第三天加入150MOI的根据实施例4制备得到的慢病毒(带有pGreen puro-TCR(NY-ESO-1)的插入片段或pGreen puro-TCR(NY-ESO-1)-IL2的插入片段的慢病毒)，未感染的T淋巴细胞作为空白对照；16h后将培养基更换为含有50IU/ml重组人IL-2的RPMI1640完全培养基，继续培养10-20天，然后观察T淋巴细胞生长情况。

观察显示：

细胞在感染病毒后，能够形成典型的增殖克隆团。

实施例7特异性识别NY-ESO-1的TCR在T细胞中的表达

将培养至14天的已感染病毒的T细胞，600g离心10min，弃尽上清以收集细胞；PBS溶液重悬细胞，并将细胞调整密度为1x 10⁷个/ml；将100μl细胞置于EP管，加入10μl FITC标记小鼠抗人CD8单克隆抗体和10μl PE标记的NY-ESO-1五聚体(SLLMWITQC)(Proimmune,Code：F049-2A-G，USA)；4℃孵育30min，PBS溶液洗涤2次，上流式细胞仪检测TCR的正确表达。

图4是带有pGreen puro-TCR(NY-ESO-1)的插入片段的慢病毒感染的CD8+T细胞表达NY-ESO-1特异性TCR上流式细胞仪检测结果图。上流式细胞仪检测结果表明，带有pGreenpuro-TCR(NY-ESO-1)的插入片段的慢病毒感染的CD8+T细胞中，NY-ESO-1特异性TCR的表达为23.81％。

以没有插入片段的载体pGreen puro与骨架质粒pMDLg PRRE、pRSV-Rev和pMD2.G转染Hek293T细胞得到的空载体病毒感染的T细胞作为对照。对照的T细胞的NY-ESO-1特异性TCR的表达率为0.46％)。

在另一实验中，流式细胞仪检测结果表明，带有pGreen puro-TCR(NY-ESO-1)-IL2的插入片段的慢病毒感染的CD8+T细胞也表达了NY-ESO-1特异性TCR。

实施例8人脐带间充质干细胞的分离培养

人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)取自深圳市综合细胞库，以含10％FBS DMEM/F12培养基重悬，接种于25cm²的培养瓶中，放置在37℃、5％CO₂的培养箱中培养，此后3～4d换液一次。

实施例9转染了重组表达载体pGreen puro-LIGHT的慢病毒载体感染hUCMSCs

按1x 10⁶hUCMSCs加入150MOI的实施例6得到的重组表达载体pGreen puro-LIGHT转染的慢病毒，6h后更换为完全培养基，继续培养48小时，收获hUCMSCs，取培养液上清收集蛋白。

对培养液中的蛋白通过特异性识别人LIGHT的抗体(Abcam公司，ab57901)进行Western Blot，来鉴定表达并分泌LIGHT的间充质干细胞。如图5所示，以Actin(CellSignaling公司，4970L)作为内参蛋白，证明获得了表达和分泌LIGHT的人脐带间充质干细胞，下称为MSC-LIGHT。

实施例10MSC-LIGHT与TCR(NY-ESO-1)-IL2基因修饰的T细胞共培养

用抗CD3单克隆抗体(北京同立海源生物科技有限公司，货号TL-101)活化实施例7得到的TCR(NY-ESO-1)-IL2基因修饰的T细胞(即带有TCR(NY-ESO-1)-IL2片段并表达特异性识别NY-ESO-1的TCR)，以作为反应细胞，按照1x 10⁵/孔的数量铺于96孔板，加入根据实施例9得到的表达LIGHT的MSC细胞，1x 10⁴/孔。另外设置以下各组测试：MSC-LIGHT细胞单独孔，TCR(NY-ESO-1)-IL2基因修饰的T细胞单独孔以及TCR(NY-ESO-1)基因修饰的T细胞单独孔。

在培养箱中共培养3天，分离T细胞。T细胞是悬浮细胞，MSC-LIGHT是贴壁细胞，将共培养的细胞置于六孔板中培养24h，MSC-LIGHT细胞贴壁，将培养上清中的T细胞取出，600g速度进行离心，由此将两种细胞分离。通过WST-1检测细胞增殖活性，比较与MSC-LIGHT细胞共培养的TCR(NY-ESO-1)-IL2基因修饰的T细胞与未与MSC-LIGHT细胞共培养的T细胞的增殖活性。同时取第3天的细胞培养上清，采用ELISA法检测IFN-γ的分泌量。

结果表明：MSC-LIGHT与TCR(NY-ESO-1)-IL2基因修饰T细胞共培养之后，T细胞出现大量的增殖克隆团，基因修饰T细胞数量为未与MSC-LIGHT细胞共培养的基因修饰T细胞的2倍以上。ELISA结果显示，与MSC-LIGHT共培养后的基因修饰T细胞分泌的IFN-γ的量为未经过共培养的T细胞的分泌量的2.5倍以上。

实施例11T细胞抗肿瘤效果验证

以稳定表达NY-ESO-1的成骨肉瘤细胞系Saos-2(ATCC#HTB-85)作为靶细胞，分别以以下三种T细胞作为效应细胞：(1)实施例7中获得的带有TCR(NY-ESO-1)序列并表达特异性识别NY-ESO-1的TCR的CD8+T细胞；(2)实施例7中获得的带有TCR(NY-ESO-1)-IL2序列并表达特异性识别NY-ESO-1的TCR的CD8+T细胞；(3)实施例10获得的带有TCR(NY-ESO-1)-IL2序列并表达特异性识别NY-ESO-1的TCR，并且经过和MSC-LIGHT细胞共培养的CD8+T细胞。

将靶细胞按照密度1x 10⁵个/ml接种96孔板，每孔100μl，按照5:1，10:1，20:1效靶比将效应细胞加入靶细胞，置于5％CO₂,37℃培养箱培养4h，采用WST-1检测细胞活力，按以下公式计算杀伤效率：

杀伤效果(增殖抑制率)＝[1－(实验组OD值－效应细胞OD值)/靶细胞OD值]×100％。

结果如图6所示：

本发明提供的仅表达NY-ESO-1TCR或同时表达NY-ESO-1TCR和细胞因子IL-2的T淋巴细胞都对NY-ESO-1阳性肿瘤细胞具有杀伤作用；

同时表达NY-ESO-1TCR和细胞因子IL-2的T淋巴细胞较仅表达NY-ESO-1TCR而未表达IL-2的T淋巴细胞对NY-ESO-1阳性肿瘤细胞具有增强的杀伤作用；

经和MSC-LIGHT细胞共培养后，表达NY-ESO-1TCR和细胞因子IL-2的T淋巴细胞与未经和MSC-LIGHT细胞共培养的T淋巴细胞比较，对NY-ESO-1阳性肿瘤细胞具有显著增强的杀伤作用。

上面是对本发明进行的说明，不能将其看成是对本发明进行的限制。除非另外指出，本发明的实践将使用有机化学、聚合物化学、生物技术等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。

如无特别表示，本文中出现的温度的单位“度”是指摄氏度，即℃。

序列表

<110> 深圳市北科生物科技有限公司

<120> 特异性识别NY-ESO-1的T细胞及其与细胞因子的联合的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 819

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atgactctga agatggatag ctccccaggc ttcgtggccg tgatcctgct catcctggga 60

cggacccacg gcgactccgt gacccagaca gaggggcaag ttactgtgag tgaatcaaaa 120

agcctgatca ttaactgcac atactctgca actagtatcg gctaccccaa cctgttctgg 180

tacgtcaggt atcctggcga ggggctccag cttctgctga aagtgatcac cgcaggccag 240

aaagggtcta gtcgcggctt cgaggctact tacaacaagg aagcaaccag ttttcacctc 300

cagaaagcca gcgtccaaga atccgatagc gccgtgtact attgcgccct ctggagtggg 360

tcatggcagc ttatcttcgg atctggcacc cagctgaccg tgatgccaga cattcagaac 420

cccgagcctg ccgtgtatca gctgaaggac ccccggtcac aagatagcac cctgtgcctg 480

ttcaccgact ttgattccca gattaatgtg cctaagacaa tggaatctgg caccttcatc 540

acggacaaaa ccgtcctgga tatgaaggct atggacagca aatccaacgg tgccatagct 600

tggtccaatc agacatcttt cacttgccaa gacatcttca aggagaccaa tgccacctac 660

ccatcaagcg acgtgccgtg tgatgctact ctgacggaga agagcttcga gaccgacatg 720

aacctgaatt ttcagaacct gagcgtgatg ggcctgagaa tcctgctgct gaaggtcgcc 780

gggttcaatc tgctcatgac actgcggctg tggtcctct 819

<210> 2

<211> 912

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atggccactc gactgctgtg ctacaccgtg ctgtgccttt tgggcgctag aatcctgaac 60

agcaaagtga tccagacccc tagatacctg gtcaagggcc aggggcaaaa agccaagatg 120

agatgcatcc cagagaaagg gcacccggtg gtgttctggt atcagcaaaa caaaaacaac 180

gagttcaagt ttctgattaa cttccagaac caagaagtgc tccagcaaat cgacatgaca 240

gagaagaggt tctcagccga atgcccctca aatagccctt gtagcctgga gatccagagc 300

tccgaagctg gagacagcgc cctgtacctg tgcgctagtc gcgattcacc agagcagtat 360

tttggaccag gcacccggct gaccgtgctg gaggatctgc gtaacgtgac tccccctaaa 420

gtctcactgt tcgagcccag caaggcagaa attgccaaca agcagaaggc caccctggtg 480

tgccttgccc ggggcttctt tcctgaccac gtcgagctga gttggtgggt taacggaaaa 540

gaagtccata gcggcgtgag caccgacccc caggcataca aggagtctaa ttacagttat 600

tgcctgagca gccggctgcg ggtgagcgcc accttctggc acaaccctag gaatcatttc 660

cgctgtcagg tccaatttca cggcctgtcc gaggaagaca aatggccaga ggggtctcca 720

aagccggtga ctcagaacat cagcgccgag gcctggggtc gtgctgattg tgggattacg 780

tccgcatctt atcatcaggg cgtgctgagc gccaccatcc tgtacgagat tctgctcgga 840

aaggccaccc tgtatgccgt gctggtgagc ggtctggtgc tgatggctat ggtgaagaag 900

aagaacagct ga 912

<210> 3

<211> 462

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

atgtacagga tgcagctgct cagctgcatc gccctgagcc tggccctggt cacaaacagc 60

gcccccacca gcagcagcac caagaagacc cagctccagc tggagcacct gctgctggac 120

ctccagatga tcctgaacgg catcaacaat tacaagaatc ccaagctgac tcgcatgctg 180

accttcaagt tttatatgcc taagaaagct accgagctga agcacctcca gtgcctggag 240

gaagagctga agccactgga agaggtgctg aacctggcac aatctaagaa tttccacctg 300

cggccccggg acctgatcag caacatcaat gtgatcgtgc tggagctgaa ggggtccgag 360

accaccttca tgtgcgaata tgcagatgag actgccacga ttgtggagtt cctgaaccgg 420

tggatcacat tttgtcagag tatcatttca accctgacat ga 462

<210> 4

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

agggctaaac gctccgggtc tggagcaaca aacttctctc tgctgaagca ggctggcgat 60

gtggaggaaa atcctgggcc a 81

<210> 5

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

atggaggaga gtgtcgtacg gccctcagtg tttgtggtgg atggacagac cgacatccca 60

ttcacgaggc tgggacgaag ccaccggaga cagtcgtgca gtgtggcccg ggtgggtctg 120

ggtctcttgc tgttgctgat gggggccggg ctggccgtcc aaggctggtt cctcctgcag 180

ctgcactggc gtctaggaga gatggtcacc cgcctgcctg acggacctgc aggctcctgg 240

gagcagctga tacaagagcg aaggtctcac gaggtcaacc cagcagcgca tctcacaggg 300

gccaactcca gcttgaccgg cagcgggggg ccgctgttat gggagactca gctgggcctg 360

gccttcctga ggggcctcag ctaccacgat ggggcccttg tggtcaccaa agctggctac 420

tactacatct actccaaggt gcagctgggc ggtgtgggct gcccgctggg cctggccagc 480

accatcaccc acggcctcta caagcgcaca ccccgctacc ccgaggagct ggagctgttg 540

gtcagccagc agtcaccctg cggacgggcc accagcagct cccgggtctg gtgggacagc 600

agcttcctgg gtggtgtggt acacctggag gctggggaga aggtggtcgt ccgtgtgctg 660

gatgaacgcc tggttcgact gcgtgatggt acccggtctt acttcggggc tttcatggtg 720

tga 723

Claims

1.T细胞，其包含编码特异性识别NY-ESO-1的TCR的核酸并表达所述特异性识别NY-ESO-1的TCR，所述核酸包括编码所述TCR的α链的第一核酸片段和编码所述TCR的β链的第二核酸片段，其中，所述第一核酸片段具有序列为SEQ ID NO：1的核苷酸序列，所述第二核酸片段具有序列为SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

2.权利要求1的T细胞，其还包括编码白细胞介素2，即IL-2的核酸并表达白细胞介素2，优选的，所述编码白细胞介素2的核酸具有序列为SEQ ID NO：3的核苷酸序列。

3.权利要求1或2的T细胞，其中所述T细胞与表达LIGHT的哺乳动物细胞共培养，优选的，所述哺乳动物细胞是人的间充质干细胞，例如为人的脐带间充质干细胞。

4.权利要求3的T细胞，其中所述T细胞与所述表达LIGHT的哺乳动物细胞共培养超过一天，优选为大于或等于三天。

5.权利要求1-4中任一项的T细胞，其为CD4+T细胞或CD8+T细胞，优选为CD8+T细胞。

6.药物组合物，其含有权利要求1-5中任一项的T细胞，优选的，所述药物组合物用于治疗或预防癌症。

7.药物组合物，其含有权利要求1-5中任一项的T细胞和表达LIGHT的哺乳动物细胞，例如人的脐带间充质干细胞，优选的，所述药物组合物用于治疗或预防癌症。

8.权利要求6或7的药物组合物，其中所述癌症选自黑素瘤，乳腺癌，肺癌，前列腺癌，甲状腺癌，卵巢癌，骨肉瘤和滑膜细胞肉瘤，例如为骨肉瘤。

9.权利要求1-5中任一项的T细胞在用于制备治疗或预防癌症的药物中的用途。

10.表达LIGHT的哺乳动物细胞与权利要求1-5中任一项的T细胞在共同用于制备治疗或预防癌症的药物中的用途，优选的，所述哺乳动物细胞是人的间充质干细胞，例如为人的脐带间充质干细胞。