CN114751961B

CN114751961B - circ0005199-173aa蛋白及其在制备食管癌诊断产品中的应用

Info

Publication number: CN114751961B
Application number: CN202210668829.3A
Authority: CN
Inventors: 王铭辉; 吕应成; 林华月; 谭炳华; 李林; 雷凯; 王科峰; 梁睿豪; 胡学廷; 吴多光; 王稳健
Original assignee: Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Priority date: 2022-06-14
Filing date: 2022-06-14
Publication date: 2022-09-20
Anticipated expiration: 2042-06-14
Also published as: CN114751961A

Abstract

本发明公开了circ0005199‑173aa蛋白及其在制备食管癌诊断产品中的应用。本发明研究显示circ0005199‑173aa蛋白表达水平与食管癌患者更大的肿瘤直径、更高的临床分期和更短的五年总生存期（OS）显着相关，其可作为食管癌临床治疗预后预测的生物标志物使用，可依靠免疫组织化学染色技术（IHC）对食管癌肿瘤组织中circ0005199‑173aa蛋白进行检测，从而实现对食管癌患者临床治疗预后效果的判断，有助于临床上对食管癌预后较差的患者进行更为积极主动的治疗和密切的随访。

Description

circ0005199-173aa蛋白及其在制备食管癌诊断产品中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种circRNA翻译蛋白circ0005199-173aa，及其作为新型生物标记物在制备管癌诊断产品中的应用。

背景技术

食管癌是全球第十大最常见的癌症类型，也是第六大癌症死亡原因。食管癌主要有两种组织病理学亚型：食管鳞癌和食管腺癌，其中食管鳞癌约占全球食管癌病例的90%。食管癌一直是严重威胁我国居民健康的主要恶性肿瘤之一，具有较高的发病率和死亡率。在过去的20年中，尽管临床诊断和治疗手段有所进步，但由于复发、广泛浸润、转移和化疗耐药等原因，导致食管癌患者的5年总体生存率依然很低。综合目前的数据来看，我国食管癌负担总体仍呈现持续上升趋势，防控形势依然十分严峻。因此，亟须开发新的诊疗方法，提高诊断的特异性和敏感性，以便于更精确地指导临床治疗。

真核细胞内源性环状RNA（circRNA）是一类环形的基因转录产物，线性前体信使RNA通过反向剪接共价连接3'-端和5'-末端形成，从而没有多聚腺苷酸化尾巴。由于独特的闭环结构，环状RNA能够逃避核酸外切酶的降解，使得环状RNA具有极高的稳定性，此外环状RNA表达显示出细胞、组织和发育阶段的差异性，并在肿瘤疾病进程中发挥重要作用。最新的研究表明，部分环状RNA还可以在肿瘤细胞翻译出新的蛋白质。这些环状RNA编码的蛋白质可发挥重要的调控功能从而影响肿瘤的增殖、干性、分化和耐药等生物学过程。到目前为止，准确筛选出具有翻译潜能的环状RNA并揭示环状RNA编码的蛋白质的生物学功能依然存在困难。环状RNA编码的蛋白质与肿瘤疾病的发生和发展密切相关，可能成为新型的生物标记物及治疗靶点。目前已有很多关于环状RNA翻译蛋白用于肿瘤早期检测和预后生物标志物的报道，其作为肿瘤标志物具有良好的临床应用前景，然而目前还未见与食管癌生物标记物相关的环状RNA编码蛋白的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种circRNA翻译蛋白circ0005199-173aa。

本发明的第二个目的在于提供所述circ0005199-173aa蛋白作为食管癌诊断标记物在制备食管癌辅助诊断或食管癌预后预测产品中的应用。

本发明的第三个目的在于提供一种用于食管癌辅助诊断或食管癌预后预测的产品。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种circRNA翻译蛋白circ0005199-173aa，所述circ0005199-173aa蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明发现环状RNA hsa_circ_0005199可以编码一个长度为173aa的新蛋白：circ0005199-173aa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述hsa_circ_0005199在NCBI中的编号为NM_001105562.3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，本发明通过IHC技术检测食管癌患者癌组织中circ0005199-173aa蛋白的表达水平差异。结果显示，食管癌肿瘤组织中circ0005199-173aa蛋白的高表达水平与食管癌患者更大的肿瘤直径、更高的临床分期和更短的五年总生存期（OS）显着相关，表明circ0005199-173aa蛋白能够作为一种用于协助判断食管癌患者肿瘤的恶性程度、临床分期和预后预测的新型生物标志物，可为临床上判断食管癌患者肿瘤的恶性程度、临床分期、预后和临床治疗提供帮助。

因此，本发明还提供所述circ0005199-173aa蛋白作为食管癌诊断标记物在制备食管癌辅助诊断或食管癌预后预测产品中的应用。

具体地，所述辅助诊断为协助判断食管癌患者肿瘤的恶性程度、临床分期；所述预后预测为预测食管癌治疗效果、五年总生存期。

本发明还提供一种用于检测circ0005199-173aa蛋白表达水平的试剂。

优选地，所述试剂为检测circ0005199-173aa蛋白表达水平的抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体或纳米抗体等。所述抗体可根据circ0005199-173aa蛋白的序列通过本领域常规的抗体制备工艺制备得到。

进一步优选地，所述抗体为多克隆抗体。

进一步优选地，所述多克隆抗体的免疫原序列如SEQ ID NO.2所示。

再优选地，所述多克隆抗体为兔多克隆抗体。

本发明还提供上述检测circ0005199-173aa蛋白表达水平的试剂在制备食管癌辅助诊断或食管癌预后预测产品中的应用。基于circ0005199-173aa蛋白表达水平差异与食管癌的相关性，因此理论上凡是能够检测食管癌患者癌组织中circ0005199-173aa蛋白的表达水平的试剂均可用于制备食管癌辅助诊断或食管癌预后预测产品，均应在本发明保护范围内。

本发明还提供一种用于食管癌辅助诊断或食管癌预后预测的产品，所述产品包含用于检测circ0005199-173aa蛋白表达水平的试剂。

优选地，所述试剂为检测circ0005199-173aa蛋白表达水平的多克隆抗体。

再优选地，所述多克隆抗体为兔多克隆抗体。

优选地，所述产品包括但不限于试剂盒等。

优选地，所述食管癌为食管鳞癌。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了环状RNAcirc_0005199翻译蛋白circ0005199-173aa及其用途。本发明研究显示circ0005199-173aa蛋白表达水平与食管癌患者更大的肿瘤直径、更高的临床分期和更短的五年总生存期（OS）显着相关，其可作为食管癌临床治疗预后预测的生物标志物使用，通过对食管癌肿瘤组织中circ0005199-173aa蛋白进行检测，从而实现对食管癌患者临床治疗预后效果的判断，有助于临床上对食管癌预后较差的患者进行更为积极主动的治疗和密切的随访。

附图说明

图1为翻译蛋白的特异性氨基酸序列SSPSKPEQ与circ0005199-173aa蛋白预测序列的匹配结果。

图2为Kaplan-Meier生存曲线分析结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 circ0005199-173aa蛋白的发现

根据在线数据库circRNADb和TransCirc的预测结果，hsa_circ_0005199（NCBI中的编号为NM_001105562.3，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示）的全序列中包含一个开放阅读框（ORF）和一段位于247-390nt的内部核糖体进入位点（IRES）。这一结果表明circ0005199有可能编码一个长度为173aa的新蛋白质（约25kDa），我们称之为称为circ0005199-173aa蛋白。为了检测这一蛋白产物，我们构建了带有3X Flag标签的circ0005199过表达载体，并将其转染到食管鳞癌细胞中。为了对新蛋白进一步验证，我们使用抗Flag抗体进行了免疫沉淀实验（IP）并对新蛋白进行纯化，随后切下25kDa附近的蛋白质条带并用于质谱分析检测。接下来的质谱分析结果显示翻译蛋白的特异性氨基酸序列SSPSKPEQ与circ0005199-173aa蛋白预测序列的完全匹配（图1），证实了circ0005199-173aa蛋白的存在，所述circ0005199-173aa蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2 验证circ0005199-173aa蛋白在食管癌患者癌组织中的差异表达

70例均已签署知情同意书。实验中所用到的临床标本均经中山大学孙逸仙纪念医院病理科证实为食管鳞癌。所有ESCC标本均包含患者详细的临床信息：如性别、年龄、TNM分期、肿瘤分化级别、肿瘤大小以及详细的随访资料等。本研究经中山大学孙逸仙纪念医院医学伦理委员会批准。

食管鳞癌组织取出后立即置于10%甲醛中固定，常规石蜡包埋、切片。经二甲苯、系列乙醇脱水后于3% H₂O₂室温孵育10分钟，PBS洗后置于抗原修复液（枸缘酸钠缓冲液PH6.0）中进行高压修复，自然冷却至室温用PBS洗涤后加3%牛血清白蛋白封闭15分钟，滴加circ0005199-173aa蛋白兔多克隆抗体（1：100稀释），4℃孵育过夜，PBS冲洗后加入免疫组织化学通用型二抗37℃孵育30 分钟，PBS洗后加入底物二氨基联苯胺（DAB）显色，镜下控制染色，苏木素复染，水洗，l%盐酸乙醇脱色，自来水中返蓝，经系列乙醇、二甲苯脱水透明后，中性树脂封片观察。

所述circ0005199-173aa蛋白兔多克隆抗体的制备方法包括如下步骤：

（1）多肽合成：根据circ0005199-173aa蛋白的免疫原序列：SLSRSSPSKPEQ直接合成多肽；

（2）在多肽偶联载体蛋白KLH（钥孔血蓝蛋白），制备得到免疫原；

（3）将步骤（2）制备得到的免疫原免疫新西兰兔；具体为第0天：初次免疫（300μg/只，完全佐剂，背部皮下多点免疫），第21天：第一次加强免疫（200μg/只），第42天：第二次加强免疫（200μg/只），第63天：第三次加强免疫（200μg/只），第70天：血清检测，采全血，分离抗血清，再进行抗体纯化，即得到circ0005199-173aa蛋白兔多克隆抗体。

circ0005199-173aa蛋白的免疫组化染色用双盲法判定结果，由两位病理科资深医生单独观测每张切片后作出判定，判定水准应用半定量评分法。circ0005199-173aa蛋白以细胞核内或细胞质有棕黄色颗粒为染色阳性。按阳性细胞比例分为：0分，低于10%；1分，10%-25%；2分，超过25%-50%；3分，超过50%-75%；4分，超过75%及以上。阳性细胞的染色强度分为不表达（0分）、弱（1分）、中（2分）、强（3分）3级。最终得分为百分比得分和染色强度得分的乘积。0-3分为低表达，4-12分为高表达（4-6分：+，7-9：++，10-12+++）。

我们根据患者癌组织circ0005199-173aa蛋白的免疫组化评分高低将患者分为circ0005199-173aa高表达组和低表达组。我们进一步分析了circ0005199-173aa蛋白表达水平与食管癌患者临床病理特征之间的关系（表1）。结果显示，circ0005199-173aa蛋白的表达水平与食管癌肿瘤直径大小、肿瘤分化程度和TNM分期显著相关。

表1 circ0005199-173aa蛋白表达水平与食管癌患者临床病理特征关系

我们还记录并分析了这些患者的五年总生存期（OS）。Kaplan-Meier生存曲线分析显示（图2），食管癌组织中circ0005199-173aa蛋白的高表达水平与食管癌患者较短的五年总生存期（OS）显着相关（P＝0.0128）。表明circ0005199-173aa蛋白可作为预测食管鳞癌预后的新型生物标志物，可为临床上判断食管癌患者肿瘤的恶性程度、临床分期、预后和临床治疗提供帮助。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 中山大学孙逸仙纪念医院

<120> circ0005199-173aa蛋白及其在制备食管癌诊断产品中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 173

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Asp Ile Asp Gly Val Ser Cys Glu Lys Ser Met Ser Gln Val Asp

1 5 10 15

Val Asp Ser Gly Ile Glu Asn Met Glu Val Asp Glu Asn Asp Arg Arg

20 25 30

Glu Lys Arg Ser Leu Ser Asp Lys Glu Pro Ser Ser Gly Pro Glu Val

35 40 45

Ser Glu Glu Gln Ala Leu Gln Leu Val Cys Lys Ile Phe Arg Val Ser

50 55 60

Trp Lys Asp Arg Asp Arg Asp Val Ile Phe Leu Ser Ser Leu Ser Ala

65 70 75 80

Gln Phe Lys Gln Asn Pro Lys Glu Val Phe Ser Asp Phe Lys Asp Leu

85 90 95

Ile Gly Gln Ile Leu Met Glu Val Leu Met Met Ser Thr Gln Thr Arg

100 105 110

Asp Glu Asn Pro Phe Ala Ser Leu Thr Ala Thr Ser Gln Pro Ile Ala

115 120 125

Ala Ala Ala Arg Ser Pro Asp Arg Asn Leu Leu Leu Asn Thr Gly Ser

130 135 140

Asn Pro Gly Thr Ser Pro Met Phe Cys Ser Val Ala Ser Phe Gly Ala

145 150 155 160

Ser Ser Leu Ser Arg Ser Ser Pro Ser Lys Pro Glu Gln

165 170

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

Ser Leu Ser Arg Ser Ser Pro Ser Lys Pro Glu Gln

1 5 10

<210> 3

<211> 598

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

gagtagccca tcgaagccag agcagtgaag gagtcagttc tctcagcagc tcgccctcta 60

atagccttga aacgcaatct cagtctctct cacgttccca gagcatggat atcgatggtg 120

tctcatgtga gaaaagcatg tcccaggtgg atgtggattc aggaattgaa aacatggagg 180

ttgatgaaaa tgatcgaaga gaaaagcgga gcctcagtga taaggagcct tcctcgggcc 240

ctgaagtgtc tgaagagcag gccttacagc tggtctgtaa gatcttccgt gtctcttgga 300

aggaccggga cagagatgtc atctttcttt cttctctttc tgcacagttt aagcagaacc 360

caaaagaagt attctccgat tttaaggact tgattggcca gattttaatg gaagtgctaa 420

tgatgtccac tcagaccaga gatgaaaacc catttgccag tctgacagcc acatcacagc 480

caattgctgc agcagcacgg tcaccagaca gaaatctctt gctaaacact ggctccaatc 540

caggaacaag ccccatgttc tgcagcgtgg cttcctttgg tgccagctct ttgtctag 598

Claims

1.circ0005199-173aa蛋白作为食管鳞癌诊断标记物在制备食管鳞癌辅助诊断或食管鳞癌预后预测产品中的应用，其特征在于，所述circ0005199-173aa蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.用于检测权利要求1中所述circ0005199-173aa蛋白表达水平的试剂在制备食管鳞癌辅助诊断或食管鳞癌预后预测产品中的应用。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述试剂为检测circ0005199-173aa蛋白表达水平的多克隆抗体。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述多克隆抗体的免疫原序列如SEQ IDNO.2所示。

5.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述产品为试剂盒。