KR101032607B1 - 간암 진단용 단백질성 마커 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 간암 조기 진단용 단백질성 마커, 상기 단백질성 마커의 변화를 검출하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물, 상기 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트, 상기 단백질성 마커를 이용하는 간암 진단 방법, 상기 단백질성 마커를 활용한 간암 치료제 스크리닝 방법, 및 상기 단백질성 마커를 특이적으로 인식하는 항체에 관한 것이다.

Description

간암 진단용 단백질성 마커 {PROTEINIC MARKERS FOR DIAGNOSING HEPATOCELLULAR CARCINOMA}
본 발명은 간암 조기 진단용 단백질성 마커, 상기 단백질성 마커의 변화를 검출하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물, 상기 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트, 상기 단백질성 마커를 이용하는 간암 진단 방법, 상기 단백질성 마커를 활용한 간암 치료제 스크리닝 방법, 및 상기 단백질성 마커를 특이적으로 인식하는 항체에 관한 것이다.
암은 악성 종양과 동일한 의미를 가지며, 다양한 원인으로 세포의 증식 조절 기능에 훼손되고 이러한 비정상적인 세포들이 통제되지 못하고 과다하게 증식하면서 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고 정상 조직을 파괴하는 상태를 의미한다. 이러한 암은 빠른 성장, 침윤성 (파고들거나 퍼져나감) 성장, 전이 (원래 장소에서 떨어진 곳까지 이동함) 등으로 인하여 생명에 위험을 초래하게 된다.
암 중에서 간암은 세계적으로 가장 치명적인 암의 하나로 알려져 있으며, 특히 아시아와 사하라 이남 아프리카에서 해마다 약 오십만 명 이상이 간암으로 사망 하고 있는 것으로 보고되고 있다. 간암은 크게 간세포 자체로부터 발생한 원발성 간암 (간세포암; hepatocellular carcinoma) 과 다른 조직의 암이 간으로 전이되어 온 전이성 간암으로 구분할 수 있는데, 간암의 약 90% 이상은 원발성 간암이며, 흔히 간암이라 함은 원발성 간암을 지칭하는 것으로 이해된다.
비록 이러한 간암의 발병 원인 중 대다수는 B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스에 의한 급성 또는 만성적인 감염이라는 것이 보고되고 있지만, 간암의 발병에 관한 세포 내의 분자적 메커니즘은 아직도 명확히 규명되지 못한 상태이다. 종래의 연구에 따르면 각종 성장인자 유전자와 같은 전-종양형성유전자 (proto-oncogene) 가 다양한 원인에 의하여 종양형성유전자 (oncogene) 로 돌연변이되어 과발현하거나 과활성을 갖는 경우, 또는 RB 단백질이나 p53 단백질과 같은 종양형성 억제 유전자 (tumor suppressor gene) 가 다양한 원인에 의하여 돌연변이되어 저발현하거나 기능을 잃는 경우 간암을 비롯한 다양한 암으로의 진행을 유발하는 것으로 보고되어 있다. 특히 간암과 관련해서는, 변형된 p53, 베타-카테닌, AXINI, p21(WAF1/CIP1) 및 p27 Kip 등의 유전자가 관련되어 있다는 것이 밝혀지기도 하였다. 그러나, 최근에는 간암을 비롯한 대부분의 암의 발병은 특정한 몇몇 유전자들만에 의하여 이루어지는 것이 아니라 세포주기, 신호전달 등과 관련된 각종 유전자들의 복합적인 상호작용에 발병하는 것으로 인식되고 있으며, 따라서 개별적인 유전자나 단백질의 발현이나 기능에만 중점을 두는 것에서 벗어나 다양한 유전자나 단백질에 대한 총체적인 연구의 필요성이 대두되고 있다.
암은 현재까지 가장 대표적인 난치성 질병으로 알려져 있다. 암을 치료하 는 방법은 크게 수술요법, 항암 화학요법, 방사선 치료 세 가지로 나누어볼 수 있는데, 이외에도 국소치료법, 호르몬요법, 광역학치료법, 레이저치료법 등이 실시되고 있고, 최근에는 면역요법, 유전자요법도 시도되고 있다. 이러한 암의 치료법이 성공 가능성을 높이기 위해서는 암을 되도록 일찍 진단해낼 수 있어야 한다. 특히 암은 조기에 진단되는 경우 약 90% 이상의 높은 치유율을 나타내고 있으며, 재발율도 5% 미만으로 매우 낮은 것으로 알려져 있다. 그러나, 암, 특히 간암의 발병 초기에는 자각증상이 없기 때문에 기존의 진단 방법으로는 암의 조기 진단에 어려움이 있는 실정이다.
암의 조기 진단을 가능하게 하기 위하여 다양한 진단 방법이 개발되고 있는데, 이 중 하나가 체내 또는 특정 조직에서 유래한 시료 내에 암의 존재를 암시하는 암 특이적 마커를 검출해내는 진단 방법이다. 암세포에서 특이적으로 고발현 또는 저발현하는 유전자, 또는 암세포 내에 특이적으로 다량 또는 소량 존재하는 단백질이 암 특이적 마커로 사용되는데, 암의 존재가 의심되는 환자의 조직, 체액 등을 채취하여 암 특이적 마커의 변화 양상을 관찰함으로써 암의 유무를 예측할 수 있게 된다. 예를 들어, AFP는 간암의 대표적인 단백질성 마커로서 알려져 있으며, 정상의 성인에게서는 극히 낮은 농도 (정상의 경우 7-10ng/mL 이하) 로만 존재하지만 간세포와 관련된 종양 환자의 50-70% 이상에서는 AFP의 현저한 수치 증가가 확인되고 있다. 이러한 암 특이적 마커는 그 진단의 용이성 및 정확성으로 인하여 암의 조기 진단에 대한 가능성을 제공할 수 있으며, 암 특이적 마커의 기능 및 특성에 대한 심층적인 연구를 통하여 암의 발병 메커니즘에 대한 단서를 얻을 수 있고, 궁극적으로는 발굴된 암 특이적 마커를 시발점으로 하여 암의 치료제나 예방법의 개발을 시도해볼 수도 있게 되므로, 이러한 암 특이적 마커의 발굴은 학술적 및 의학적으로 중요한 의미를 갖는다.
간암 특이적 마커와 관련된 종래의 기술문헌으로, Xu 등은 문헌 [Xu et al., Cancer Res. 61:3176-3181, 2001] 에서 29개의 간암 환자들의 간암 조직과 주변 정상 조직을 사용하여 각각 cDNA 라이브러리를 구축한 후 그 발현빈도를 분석한 결과, 간암세포에서 발현빈도가 높은 유전자들로 혈청 알부민, α1-항트립신, 인터-α-트립신 저해제, 아포지질단백질 AII, 피브리노겐, 셀레노프로테인 P, 알돌라아제 등을 보고한바 있으며; Park 등은 문헌 [Park et al., Int. J. Cancer 62:276-282, 1995] 에서 간암 세포에서 트랜스페린 (transferrin), IGF-II (insulin-like growth factor II) 및 IGF-1R (insulin growth factor-1 receptor) 의 과발현, 및 세포사멸에 관련된 파스 (fas) 리간드의 발현 증가를 보고한 바 있다.
간암 특이적 마커와 관련된 종래의 특허문헌으로, 한국등록특허 제552,494호 (2006. 2. 8 등록) 에는 간암 특이적 고발현 유전자로서 K-ALPHA-1 (NM_006082), LDHA (NM_005566), FTL (NM_000146), ANXA2 (NM_004039), RPL4 (NM_000968), ENO1 (NM_001428), RPL9 (NM_000661), GNB2L1 (NM_006098), RPL10 (NM_006013) 및 RPL13A (NM_012423) 와, 간암 특이적 저발현 유전자로서 AMBP (NM_001633), SERPINC1 (NM_000488), GC (NM_000583) 및 A1BG (NM_130786) 가 개시되어 있고; 한국등록특허 제777088호 (2007. 11. 9 등록) 에는 LCN2 (NM_005564), MIDKINE (NM_002391, NM_001012333, NM_001012334), 및 TFPI (NM_006287) 가 개시되어 있으 며; 한국공개특허 제2007-99312호 (2007. 10. 9 공개) 에는 HLA-DMA (NM_006120), CD24 (NM_013230), 및 SDFR1 (NM_012428) 가 개시된 바 있고; 한국등록특허 제767,878호 (2007. 10. 10 등록) 에는 UBD (Hs.44532), PRKAG1 (Hs.3136), CSTB (Hs.695), PSORS1C1 (Hs.507), TUBB5 (Hs.110837), Hs.62914, UBPH (Hs.3459), SPARC (Hs.111779), PDHB (Hs.161357), EIF4B (Hs.93379), ABCB10 (Hs.1710), NDFIP2 (Hs.30340), SPAG7 (Hs.90436), RAN (Hs.10842), DDIT4 (Hs.111244), RPS20 (Hs.8102), C9orf9 (Hs.62595), TBC1D14 (Hs.72242), PIP5K2A (Hs.108966), SNX22 (Hs.157607), C9 (Hs.1290), CYP2E1 (Hs.75183), ZFP36L1 (Hs.85155), C6 (Hs.1282), BHMT (Hs.80756), MICAL3 (Hs.165551), DKFZp434C0328 (Hs.24583), GZMB (Hs.1051), PCK1 (Hs.1872), UGT2B7 (Hs.10319), MGC45564 (Hs.132230), UBE4A (Hs.75275), KIAA0316 (Hs.92025), ADH1C (Hs.2523), RPS9 (Hs.139876), SFXN1 (Hs.135742), SLC12A8 (Hs.36793), APOA1 (Hs.93194), BF (Hs.69771), 및 ACAT1 (Hs.37) 가 개시된 바 있다. 그러나, 상기 특허문헌들에 개시된 간암 특이적 마커들은 모두 DNA나 mRNA 수준에서 찾아낸 것일 뿐 실제의 간암 조직의 프로테옴에서 확인한 것은 아니며, 어느 것도 초기의 간암 조직 또는 세포를 사용하고 있지 않다. 암세포는 그 유전물질이 불안정하여 암의 진행 정도에 따라 암과는 전혀 관계없는 다른 유전자의 발현이 영향을 받는 경우가 흔하기 때문에, 이렇게 중기 이후의 암에서 DNA나 mRNA 수준으로 발견된 마커들이 실제 임상적으로 정확한 진단 마커가 될 수 있는지는 미지수이다. 따라서, 실제 임상적으로 정확한 진단 마커가 될 수 있는 간암 진단용 마커의 발굴이 여전히 요구된다.
프로테옴 (proteome) 이란 유전체로부터 만들어질 수 있는 모든 단백질의 총체를 의미하는데, 이는 한 세포 또는 조직에서 특이적인 생리 상태나 병리 상태에 따라 프로테옴의 양상이 항상 변화하게 되는 동적인 개념이다. 프로테오믹스 (proteomics) 는 이러한 프로테옴을 연구하는 방법과 기술을 포괄적으로 지칭하는 것으로, 단백질의 성질을 유전자의 발현, 번역후 변형 (post-translational modification), 다른 단백질과의 결합에 초점을 두어 연구함으로써 세포내 변형 과정과 네트워크 형성을 질병의 진행 과정과 연계시켜서 총체적으로 이해하고자 하는 연구 분야를 뜻한다. 이와 같이 프로테옴은 한 세포 또는 조직에서의 생리 상태나 병리 상태를 대변하므로, 질병의 진단에 직접 쓰일 수 있는 진단의 마커를 찾는 방법으로는 가장 적합한 것이다. 또한, 암과 같은 경우 특정 유전자의 발현이 암의 발병을 촉진하는 것으로 확인된다면, 그 단백질의 존재를 확인 및 동정하여 치료제 개발의 표적 단백질로 삼을 수도 있다. 게노믹스 (Genomics) 의 뛰어난 민감도와 유전자의 쉬운 증폭 등의 장점으로 이를 이용한 진단/치료제 개발 역시 많이 진행되고 있으나, DNA나 mRNA 단계에서의 변화가 실제로 세포 내에서 활성을 갖는 단백질의 변화로 곧바로 연결되지는 않을 수 있다는 점에서 이론상의 문제점이 남아있으며, 나아가 현실적으로는 유전물질이 없는 체액의 경우 프로테오믹스가 유일한 연구방법이다. 현재 비-침습적 접근 (non-invasive approach) 으로 진단에 쓰이고 있는 것은 혈장, 혈청, 뇨, 뇌척수액, 양수, 분비액 등의 체액인데, 많은 연구자들이 진단 마커로 질병 특이적인 단백질을 발굴하기 위해 프로테오믹스 방법을 도입하고 있다.
본 발명에서는 간암 조기 진단용 단백질성 마커, 상기 단백질성 마커의 변화를 검출하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물, 상기 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트, 상기 단백질성 마커를 이용하는 간암 진단 방법, 상기 단백질성 마커를 활용한 간암 치료제 스크리닝 방법, 및 상기 단백질성 마커를 특이적으로 인식하는 항체를 제공하고자 한다.
본 발명자는 정상 간 조직과 초기 간암 조직의 프로테옴을 분석하여 정상 간 조직에 비하여 초기 간암 조직에서 특징적으로 과량 또는 소량 존재하는 단백질들을 검출하여 간암 조기 진단에 사용될 수 있는 단백질성 마커들을 발굴해내었다.
본 발명의 첫번째 국면은 하기 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 조합인 것을 특징으로 하는 간암 조기 진단용 단백질성 마커에 관한 것이다:
AA1XP52_HUMAN (catecholamine-regulated protein 40; NCBI GI:94450030);
ARSA1_HUMAN (arsA arsenite transporter, ATP-binding, homolog 1; NCBI GI:50428938);
MAAI_HUMAN (glutathione transferase zeta 1; NCBI GI:3510757);
UGDH_HUMAN (UDP-glucose dehydrogenase; NCBI GI:4507813);
NDUS3_HUMAN (NADH dehydrogenase (ubiquinone) Fe-S protein 3, 30kDa (NADH-coenzyme Q reductase); NCBI GI:4758788);
FTHFD_HUMAN (formyltetrahydrofolate dehydrogenase isoform a variant; NCBI GI:3560541);
ATP5H_HUMAN (ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit d isoform a; NCBI GI:5453559);
ERLN2_HUMAN (ER lipid raft associated 2 isoform 1; NCBI GI:6005721);
SNP29_HUMAN (synaptosomal-associated protein 29; NCBI GI:4759154);
AIFM1_HUMAN (programmed cell death 8 isoform 2; NCBI GI:22202629);
LDHA_HUMAN (lactate dehydrogenase A variant; NCBI GI:62897717);
ADA_HUMAN (adenosine deaminase; NCBI GI:47078295);
CO3_HUMAN (Chain B, Human Complement Component C3; NCBI GI:78101268);
LMNA_HUMAN (lamin A/C isoform 2; NCBI GI:5031875);
APOA1_HUMAN (apolipoprotein A-I,isoform CRA_b; NCBI GI:119587681);
FRIH_HUMAN (FTH1 protein; NCBI GI:76779199);
ANXA1_HUMAN (Chain A, Crystal Structure Of Human Annexin I At 2.5 Angstroms Resolution; NCBI GI:157829895);
ARLY_HUMAN (argininosuccinate lyase; NCBI GI:18033920);
APT_HUMAN (adenine phosphoribosyltransferase isoform a; NCBI GI:4502171);
HSP71_HUMAN (heat shock 70kDa protein 1B; NCBI GI:147744565);
HS90B_HUMAN (90kDa heat shock protein; NCBI GI:306891);
ADH4_HUMAN (Alcohol dehydrogenase 4 (Alcohol dehydrogenase class II pi chain); NCBI GI:83286923);
GSTA2_HUMAN (glutathione S-transferase A2 subunit; NCBI GI:257476);
VILI_HUMAN (villin 1; NCBI GI:6005944);
ODB2_HUMAN (branched chain acyltransferase precursor; NCBI GI:179354);
PYC_HUMAN (pyruvate carboxylase precursor; NCBI GI:106049292);
KU70_HUMAN (ATP-dependent DNA helicase II, 70 kDa subunit; NCBI GI:4503841);
KU86_HUMAN (ATP-dependent DNA helicase II; NCBI GI:10863945);
TCTP_HUMAN (tumor protein, translationally-controlled 1; NCBI GI:4507669);
PLSL_HUMAN (L-plastin; NCBI GI:4504965);
ACPH_HUMAN (N-acylaminoacyl-peptide hydrolase; NCBI GI:23510451);
GLNA_HUMAN (GLUL protein; NCBI GI:22749655);
AK1C4_HUMAN (Aldo-keto reductase family 1 member C4 (Chlordecone reductase) (CDR); NCBI GI:1705823);
TCPA_HUMAN (T-complex protein 1 isoform a; NCBI GI:57863257);
VINC_HUMAN (vinculin; NCBI GI:4507877);
TYPH_HUMAN (endothelial cell growth factor 1 (platelet-derived); NCBI GI:4503445);
IREB1_HUMAN (aconitase 1; NCBI GI:8659555);
ODBB_HUMAN (chain B, human branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase; NCBI GI:7546385);
TGM2_HUMAN (transglutaminase 2 isoform a; NCBI GI:39777597);
CPT2_HUMAN (carnitine palmitoyltransferase II; NCBI GI:4503023);
EF1B_HUMAN (eukaryotic translation elongation factor 1 beta 2; NCBI GI:4503477);
MOES_HUMAN (moesin; NCBI GI:4505257);
EF1G_HUMAN (eukaryotic translation elongation factor 1 gamma, isoform CRA_d; NCBI GI:119594432);
AOFB_HUMAN (monoamine oxidase B; NCBI GI:38202207);
1433T_HUMAN (tyrosine 3/tryptophan 5 -monooxygenase activation protein, theta polypeptide; NCBI GI:5803227);
PSB9_HUMAN (proteasome beta 9 subunit isoform 2 proprotein; NCBI GI:23110932);
TKT_HUMAN (transketolase; NCBI GI:4507521);
AL4A1_HUMAN (aldehyde dehydrogenase 4A1 precursor; NCBI GI:25777734);
ERP29_HUMAN (endoplasmic reticulum protein 29 isoform 1 precursor; NCBI GI:5803013);
2AAA_HUMAN (Chain A, Structure Of A Complex Between The A Subunit Of Protein Phosphatase 2a And The Small T Antigen Of Sv40; NCBI GI:149243188);
AL1B1_HUMAN (aldehyde dehydrogenase 1B1 precursor; NCBI GI:25777730);
QCR1_HUMAN (ubiquinol-cytochrome c reductase core protein I; NCBI GI:46593007);
HNRH1_HUMAN (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1; NCBI GI:5031753);
1433B_HUMAN (tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein, beta polypeptide; NCBI GI:4507949);
PRDX2_HUMAN (peroxiredoxin 2 isoform2; NCBI GI:32189392);
ACSL1_HUMAN (acyl-CoA synthetase long-chain family member 1; NCBI GI:40807491);
PHB_HUMAN (prohibitin; NCBI GI:4505773);
CBS_HUMAN (cystathionine-beta-synthase; NCBI GI:4557415);
MYH9_HUMAN (Nonmuscle myosin heavy chain A; NCBI GI:189030);
ODO2_HUMAN (dihydrolipoamide succinyltransferase; NCBI GI:643589);
PEX19_HUMAN (peroxisomal biogenesis factor 19; NCBI GI:4506339);
LPPRC_HUMAN (leucine-rich PPR motif-containing protein; NCBI GI:31621305);
CAZA2_HUMAN (capping protein alpha; NCBI GI:433308);
UCRI_HUMAN (ubiquinol-cytochrome c reductase, Rieske iron-sulfur polypeptide 1; NCBI GI:5174743);
TCPE_HUMAN (chaperonin containing TCP1, subunit 5 (epsilon); NCBI GI:24307939);
AL9A1_HUMAN (4-trimethylaminobutyraldehyde dehydrogenase (TMABADH) (Aldehyde dehydrogenase family 9 member A1) (Aldehyde dehydrogenase E3 isozyme) (Gamma-aminobutyraldehyde dehydrogenase) (R-aminobutyraldehyde dehydrogenase); NCBI GI:62511242);
HINT1_HUMAN (histidine triad nucleotide binding protein 1; NCBI GI:4885413);
ST1A1_HUMAN (phenol sulfotransferase; NCBI GI:847763);
SSRD_HUMAN (signal sequence receptor, delta; NCBI GI:5454090);
GDIR_HUMAN (Chain A, Structure Of Rho Guanine Nucleotide Dissociation Inhibitor; NCBI GI:2624719);
KAD2_HUMAN (adenylate kinase 2 isoform b; NCBI GI:7524346);
SNAA_HUMAN (N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein, alpha; NCBI GI:47933379);
TERA_HUMAN (Valosin-containing protein; NCBI GI:6005942);
1433E_HUMAN (tyrosine 3/tryptophan 5 -monooxygenase activation protein, epsilon polypeptide; NCBI GI:5803225);
1433Z_HUMAN (tyrosine 3/tryptophan 5 -monooxygenase activation protein, zeta polypeptide; NCBI GI:4507953);
SKP1_HUMAN (S-phase kinase-associated protein 1 isoform b; NCBI GI:25777713);
ACTG_HUMAN (ACTB protein; NCBI GI:15277503);
HBB_HUMAN (beta globin; NCBI GI:4504349);
TCPB_HUMAN (CCT2; NCBI GI:48146259);
SET_HUMAN (SET translocation (myeloid leukemia-associated); NCBI GI:145843637);
MMSA_HUMAN (aldehyde dehydrogenase 6A1 precursor; NCBI GI:11095441);
BDH_HUMAN (3-hydroxybutyrate dehydrogenase precursor; NCBI GI:17738292);
LGUL_HUMAN (glyoxalase I; NCBI GI:118402586);
ST2A1_HUMAN (sulfotransferase family, cytosolic, 2A dehydroepiandrosterone-preferring, member 1; NCBI GI:29540545);
C1QBP_HUMAN (tat-associated protein; NCBI GI:1096067);
PRDX4_HUMAN (thioredoxin peroxidase; NCBI GI:5453549);
FCL_HUMAN (tissue specific transplantation antigen P35B; NCBI GI:4507709);
DPYS_HUMAN (dihydropyrimidinase; NCBI GI:4503375);
GANAB_HUMAN (Glucosidase II; NCBI GI:2274968);
MVP_HUMAN (major vault protein; NCBI GI:19913410);
UGPA_HUMAN (UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase; NCBI GI:2136353);
IMMT_HUMAN (motor protein; NCBI GI:516766);
GLE1_HUMAN (GLE1 RNA export mediator homolog isoform 2; NCBI GI:4557627);
Q56G89_HUMAN (serum albumin; NCBI GI:62113341);
TOIP1_HUMAN (torsin A interacting protein 1, isoform CRA_b; NCBI GI:119611474);
Q5U0A0_HUMAN (proteasome (prosome, macropain) subunit, alpha type, 5; NCBI GI:54696300);
F108B_HUMAN (family with sequence similarity 108, member B1 isoform 2; NCBI GI:71051602);
HIBCH_HUMAN (3-hydroxyisobutyryl-coenzyme A hydrolase; NCBI GI:3320120);
DCXR_HUMAN (dicarbonyl/L-xylulose reductase; NCBI GI:7705925);
PTOV1_HUMAN (prostate tumor overexpressed gene 1, isoform CRA_b; NCBI GI:7920398);
GLCTK_HUMAN (CG9886-like; NCBI GI:31543063);
CS010_HUMAN (R33729_1; NCBI GI:3355455);
FAH2A_HUMAN (CGI-105 protein; NCBI GI:4929679);
ABHEB_HUMAN (abhydrolase domain containing 14B; NCBI GI:14249382);
CPNE1_HUMAN (copine I; NCBI GI:4503013);
SPEB_HUMAN (agmatinase; NCBI GI:18031951);
CK054_HUMAN (proteasome activator hPA28 suunit beta; NCBI GI:48257065);
BHMT2_HUMAN (betaine-homocysteine methyltransferase 2; NCBI GI:13162290);
MCCC2_HUMAN (methylcrotonoyl-Coenzyme A carboxylase 2 (beta); NCBI GI:11545863);
DBLOH_HUMAN (DIABLO protein; NCBI GI:13325198);
TMOD3_HUMAN (tropomodulin3; NCBI GI:6934244);
VPS29_HUMAN (vacuolar protein sorting 29 isoform 1; NCBI GI:7706441);
GRHPR_HUMAN (glyoxylate reductase/hydroxypyruvate reductase, isoform CRA_a; NCBI GI:119578687);
PCYOX_HUMAN (prenylcysteine oxidase 1; NCBI GI:6561481); 및
PSME2_HUMAN (proteasome activator hPA28 suunit beta; NCBI GI:1008915).
간암의 종양 세포의 등급은 그 분화 정도에 기초하여 크게 4등급으로 나누어진다. 종양세포들이 정상 간세포와 구별이 어려울 정도로 분화가 좋고 얇은 코오드로 구성된 것을 1등급 (E1) 이라 하고, 종양 세포의 핵이 다소 크고 농염되며 선 구조가 많이 보이는 경우를 2등급 (E2) 이라 하며, 종양 세포의 핵이 더욱 커지고 거대 세포들이 많이 나타나는 경우를 3등급 (E3) 이라 하고, 종양 세포들의 분화가 매우 나빠서 종양 세포들의 대부분이 크고 농염된 핵을 가지며 세포들의 접착성이 없이 밀집되어 있는 경우를 4등급 (E4) 으로 분류한다. 본 명세서에서 기술된 연구는 E1 등급 및 E2 등급의 간암을 대상으로 하였다.
본 명세서에서 "간암 조기 진단용 단백질성 마커"는 초기 간암 조직을 정상 간 조직과 구분해내는 기준이 되는 물질 중에서 이 물질이 특히 단백질을 주요 구성물질로 하고 있는 것을 지칭한다. 본 발명에서 이 단백질성 마커는 초기 간암 조직 내에서의 존재량이 정상 간 조직 내에서의 존재량과 비교할 때 특징적으로 많거나 적다. 구체적으로, 본 발명에서 이 단백질성 마커는 초기 간암 조직 내에서의 존재량을 정상 간 조직 내에서의 존재량과 비교한 변화배수가 1.5 이상이거나 -1.5 이하이다.
본 발명은 간암 조직 중 특히 초기 간암 조직의 프로테옴을 정상 간 조직의 프로테옴과 분석한 것이기 때문에, 이렇게 확인된 단백질성 마커는 초기 간암에 대하여 특이적이라고 할 수 있으며, 따라서 간암을 조기에 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다. 나아가, 이렇게 확인된 단백질성 마커가 초기 간암 조직에서 변화 양상이 두드러지는 것이라는 점을 감안한다면, 이 단백질성 마커의 생리학적 기능은 간암의 발병에 직접적으로 관계된 것일 가능성이 있으며, 따라서 이 단백질성 마커는 간암 발병의 메커니즘을 연구하거나 간암 치료제의 개발을 위한 표적 단백질로서도 유용하게 사용될 수 있다.
특히 본 발명의 첫번째 국면의 간암 조기 진단용 단백질성 마커는 실제의 초기 간암 조직에서 프로테옴 수준에서 발굴해낸 것이기 때문에, 종래 DNA 또는 mRNA 수준에서 발견된 간암 특이적 마커들에 비하여 더욱 임상적으로 활용 가치가 높은 마커들이며, 초기의 간암에만 한정되어 있다는 점에서 간암 치료제의 표적으로서도 종래기술의 간암 특이적 마커들보다 더욱 유용한 것이다.
본 발명의 두번째 국면은 상기 첫번째 국면의 간암 조기 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 특이적으로 검출하는 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 간암 조기 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴의 특이적인 검출은 생물학적 시료 내에 본 발명의 간암 조기 진단용 단백질성 마커가 존재하는지 여부 및 그 양과 패턴을 확인하는 과정을 의미하며, 예를 들어, 상기 간암 조기 진단용 단백질성 마커에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 그 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 확인하는 과정이 활용될 수 있다. 본 명세서에서 "생물학적 시료"란 간암 조기 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴이나 이 단백질성 마커에 관한 유전자의 발현 여부와 그 발현량 및/또는 발현 패턴을 검출할 수 있는 세포나 조직 등을 의미하며, 뇨, 혈액, 혈장, 혈청 등을 예로 들 수 있지만 특별히 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 명세서에서 "항체"란 항원의 항원결정기 (epitope) 에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 의미하며, 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함하는 개념이다.
항체를 이용하여 단백질의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 측정하는 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) , 방사선 면역분석 (Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테를로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역 전기영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩 (protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
이 분석 방법들을 통하여, 정상인의 생물학적 시료에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 간암이 의심되는 환자의 생물학적 시료에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 이로부터 본 발명의 간암 조기 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 판단할 수 있으며, 궁극적으로 간암이 의심되는 환자의 간암 발병 여부를 조기에 진단할 수 있게 된다.
여기서 "항원-항체 복합체"란 간암 조기 진단용 단백질성 마커와 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량이나 형성 패턴은 통상 2차 항체에 연계된 검출 라벨 (detection label) 의 시그널의 크기 및 패턴을 검출함으로써 측정이 가능하다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 레독스 분자, 방사선 동위원소 등을 예로 들 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시 다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제, 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 형광물이 사용되는 경우 이용 가능한 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 리간드가 사용되는 경우 이용 가능한 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 발광물이 사용되는 경우 이용 가능한 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 미소입자가 사용되는 경우 이용 가능한 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 레독스 분자가 사용되는 경우 이용 가능한 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4W(CN)8, [Os(bpy)3]2+ , [RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4- 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 방사성 동위원소가 사용되는 경우 이용 가능한 방사성 동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I 또는 186Re 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 두번째 국면에서의 "간암 조기 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 특이적으로 검출하는 물질"은 해당 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 검출하기 위한 분석 방법에서 해당 단백질성 마커에 대하여 특이적으로 사용될 수 있는 임의의 물질일 수 있으며, 반드시 항체로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 두번째 국면은 정상인의 생물학적 시료와 간암이 의심되는 환자의 생물학적 시료에서의 간암 조기 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴의 차이를 검출하는 것에 기술적 특징이 있는 것이기 때문에, 이렇게 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 가능하게 하는 물질이라면 어떠한 것이라도 "간암 조기 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 특이적으로 검출하는 물질"로서 사용될 수 있고 발명이 목적하는 기술적 효과를 달성할 수 있으며, 당업자라면 당업계의 평균적인 지식 및 공지기술을 참고하여 구체적인 실시양상에 따라 적당한 물질을 특별한 어려움 없이 선택/선별하여 사용할 수 있을 것이다.
본 발명의 세번째 국면은 상기 본 발명의 첫번째 국면의 간암 조기 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 및/또는 발현 패턴을 특이적으로 검출하는 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 간암 조기 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴은, 상기 본 발명의 두번째 국면과 같이 단백질 자체를 검출하는 방법을 사용하는 것 외에도, 조직 내에서 해당 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 및/또는 발현 패턴을 검출함으로써 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 유추하는 방법을 사용할 수도 있다.
여기서 유전자의 발현 여부와 그 발현량 및/또는 발현 패턴의 검출은 통상적 으로 해당 유전자의 전사로 인해 생성된 mRNA의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 확인하는 과정으로써 수행될 수 있다. 이러한 mRNA의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 확인하기 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR (Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RNase protection assay), 노던 블랏, DNA 칩 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
이 분석 방법들을 통하여, 정상인의 생물학적 시료에서의 mRNA의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 간암이 의심되는 환자의 생물학적 시료에서의 mRNA의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴과 비교할 수 있고, 이로부터 본 발명의 간암 조기 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 및/또는 발현 패턴의 차이를 판단하며, 궁극적으로 간암이 의심되는 환자의 간암 발병 여부를 조기에 진단하는 것이 가능하게 된다.
mRNA의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 RT-PCR로 측정하기 위한 키트는 본 발명의 간암 조기 진단용 단백질성 마커에 관한 mRNA에 특이적인 프라이머를 포함한다. 본 명세서에서 "프라이머"는 템플레이트 (template) 와 상보적으로 결합할 수 있고 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 템플레이트의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group) 를 가지는 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 특정 유전자의 핵산 서열에 상보적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이가 사용될 수 있다. 그 외 RT-PCR 키트는 구체적인 실시 양상에 따라 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드 (dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수 (DEPCwater), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소) 을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시시킬 수 있다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 다른 염기 서열을 포함할 수도 있다. 프라이머는 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있으며, 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다.
본 발명의 세번째 국면에서의 "간암 조기 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 및/또는 발현 패턴을 특이적으로 검출하는 물질"은 해당 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 및/또는 발현 패턴의 분석 방법에 있어서 해당 단백질성 마커에 특이적으로 사용될 수 있는 임의의 물질일 수 있으며, 반드시 RT-PCR용 프라이머에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 세번째 국면은 정상인의 생물학적 시료와 간암이 의심되는 환자의 생물학적 시료에서 간암 조기 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 및/또는 발현 패턴의 차이를 검출하는 것에 기술적 특징이 있는 것이기 때문에, 이러한 차이의 검출을 가능하게 하는 물질은 어떠한 것이라도 "간암 조기 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 및/또는 발현 패턴을 특이적으로 검출하는 물질"로서 사용될 수 있고 발명이 목적하는 기술적 효과를 달성할 수 있으며, 당업자라면 당업계의 평균적인 지식을 참고하여 구체적인 실시 양상에 따라 적당한 물질을 선택/선별하여 사용할 수 있을 것이다.
본 발명의 네번째 국면은 상기 본 발명의 두번째 국면 또는 세번째 국면의 간암 진단용 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 간암 진단용 키트는 간암 진단용 조성물에 포함되는 간암 조기 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 특이적으로 검출하는 물질 또는 간암 조기 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 및/또는 발현 패턴을 특이적으로 검출하는 물질 외에 단백질 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴의 분석 방법 또는 유전자 발현 여부와 그 발현량 및/또는 발현 패턴의 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 진단 키트가 단백질의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 검출하기 위한 진단 키트인 경우에는, 이 진단 키트는 예를 들어 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 성분을 포함하는 진단 키트일 수 있으며, 이러한 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 성분들, 예를 들어 표지된 2차 항체, 발색단 (chromopores), 효소 (예를 들어, 항체와 접합된 효소) 및 그의 기질, 및 정량 대조군 단백질에 특이적인 항체 등을 포함할 수 있다. 한편, 상기 진단 키트가 유전자의 발현 여부와 그 발현량 및/또는 발현 패턴을 검출하기 위한 진단 키트인 경우에는, 이 진단 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 성분을 포함하는 진단 키트일 수 있으며, 이러한 RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 외에도 구체적인 실시 양상에 따라 예를 들어 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드 (dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수 (DEPCwater), 멸균수, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍 등을 포함할 수 있다. 또한, 구체적인 실시 양상에 따라서는, 상기 간암 진단용 키트는 DNA 칩 또는 단백질 칩을 포함할 수 있다.
본 발명의 다섯번째 국면은, 상기 본 발명의 두번째 국면의 간암 진단용 조성물을 간암이 의심되는 환자에게서 채취한 생물학적 시료에 처리하는 제 1 단계; 및 제 1 단계의 처리 결과를 대조군과 대비하여 본 발명의 첫번째 국면의 간암 조기 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴의 차이를 검출하는 제 2 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진단 방법에 관한 것이다. 또한, 추가로, 본 발명의 다섯번째 국면은, 상기 본 발명의 세번째 국면의 간암 진단용 조성물을 간암이 의심되는 환자에게서 채취한 생물학적 시료에 처리하는 제 1 단계; 및 제 1 단계의 처리 결과를 대조군과 대비하여 본 발명의 첫번째 국면의 간암 조기 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 및/또는 발현 패턴의 차이를 검출하는 제 2 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진단 방법에 관한 것이다.
정상 간 조직에서보다 초기 간암 조직에서 더 많이 존재하는 간암 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴의 차이를 검출하는 경우에는, 예를 들어, 만약 간암이 의심되는 환자의 생물학적 시료에서의 상기 단백질성 마커의 존재량이 대조군에서의 존재량보다 많다면 이는 간암이 발병했을 가능성을 제시하는 것이라고 할 수 있을 것이다. 한편, 정상 간 조직에서보다 초기 간암 조직에서 더 적게 존재하는 간암 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴의 차이를 검출하는 경우에는, 예를 들어, 만약 간암이 의심되는 환자의 생물학적 시료에서의 상기 단백질성 마커의 존재량이 대조군에서의 존재량보다 적다면 이는 간암이 발병했을 가능성을 제시하는 것이라고 할 수 있을 것이다.
한편, 정상 간 조직에서보다 초기 간암 조직에서 더 많이 존재하는 간암 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 및/또는 발현 패턴의 차이를 검출하는 경우에는, 예를 들어, 만약 간암이 의심되는 환자의 생물학적 시료에서의 상기 단백질성 마커를 코딩하는 유전자로부터 전사된 mRNA의 존재량이 대조군에서의 존재량보다 많다면 이는 간암이 발병했을 가능성을 제시하는 것이라고 할 수 있을 것이다. 한편, 정상 간 조직에서보다 초기 간암 조직에서 더 적게 존재하는 간암 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 및/또는 발현 패턴의 차이를 검출하는 경우에는, 예를 들어, 만약 간암이 의심되는 환자의 생물학적 시료에서의 상기 단백질성 마커를 코딩하는 유전자로부터 전사된 mRNA의 존재량이 대조군에서의 존재량보다 적다면 이는 간암이 발병했을 가능성을 제시하는 것이라고 할 수 있을 것이다.
본 발명의 여섯번째 국면은, 본 발명의 첫번째 국면의 간암 조기 진단용 단백질성 마커에 시험 화합물을 결합시키는 제 1 단계; 및 시험 화합물이 상기 간암 조기 진단용 단백질성 마커의 생리학적 활성을 촉진 또는 억제하는지 여부를 확인하는 제 2 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명의 첫번째 국면의 간암 조기 진단용 단백질성 마커는 초기 간암 조직에서 변화 양상이 두드러지는 것이기 때문에 간암의 발병에 직접 관여하는 단백질일 가능성이 있으며, 따라서 간암 발병의 메커니즘을 연구하거나 간암 치료제의 개발을 위한 표적 단백질로서도 유용하게 사용될 수 있는 것이다. 즉, 본 발명의 첫번째 국면의 간암 조기 진단용 단백질성 마커는 간암의 치료제 개발의 중요한 전제를 해결한 것이므로, 따라서 이 단백질성 마커를 이용하여 간암의 치료제를 스크리닝하는 방법도 본 발명의 범주에 속한다.
이런 치료제를 스크리닝하는 방법으로는, 본 발명의 첫번째 국면의 간암 조기 진단용 단백질성 마커를 어피니티 칼럼에 고정시키고 이를 시료와 접촉시켜 정제하는 방법 [Pandya et al, Virus Res 87: 135-143, 2002], 투-하이브리드 방법을 이용하는 방법 [Fields, S and Song, O., Nature 340: 245 -246, 1989], 웨스턴 블랏 ["Molecular Cloning - A Laboratory Manual" Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al. (1982) section 18.30-18.74], 하이스루풋스크리닝 방법 [Aviezer et al, J Biomol Screen 6: 171-7, 2001] 등을 비롯한 다수의 공지의 방법을 사용할 수 있으며, 당업자라면 구체적인 실시 양상에 따라 적절한 방법을 선택할 수 있다. 스크리닝에 사용하기 위한 시험 화합물을 포함하는 시료로서는 조직 추출액, 유전자 라이브러리의 발현산물, 합성 화합물, 합성 펩티드, 천연 화합물 등이 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일곱번째 국면은, 본 발명의 첫번째 국면의 간암 조기 진단용 단 백질성 마커를 특이적으로 인식하는 항체에 관한 것이다.
본 발명의 첫번째 국면의 간암 조기 진단용 단백질성 마커를 특이적으로 인식하는 항체는 간암 조기 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 특이적으로 검출하는 대표적인 물질이며, 따라서 간암의 조기 진단을 위해 유용하게 사용할 수 있는 물질에 해당한다. 나아가, 경우에 따라서는 초기 간암 조직에서 특징적으로 과량 또는 소량이 존재하는 간암의 발병과 연관된 단백질의 활성을 촉진하거나 억제할 수도 있으며, 이에 따라 간암에 대한 치료제로서도 활용될 수 있다.
본 발명의 첫번째 국면의 간암 조기 진단용 단백질성 마커가 발굴되었으므로 이를 이용하여 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체를 제조하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 수행될 수 있다.
다클론 항체는 상기한 본 발명의 첫번째 국면의 간암 조기 진단용 단백질성 마커 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 다양한 동물 종 숙주로부터 제조 가능하며, 그 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법 (hybridoma method) (Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 (Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술 등을 이용하여 제조될 수 있다. 통상적으로, 하이브리도마 방법은 본 발명의 첫번째 국면의 간암 조기 진단용 단백질성 마커 항원을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 집단의 조직들을 폴리에틸렌글리콜과 같은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 융합시키고 나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법 (limited dilution technique) 에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득한 후, 원하는 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 공지된 기술에 따라 시험관 내에서 또는 생체내에서 대량으로 배양한다. 파지 항체 라이브러리 방법은 원하는 항체의 유전자를 획득하여 이를 파아지의 표면에 융합 단백질 형태로 발현시킴으로서 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 이 라이브러리로부터 원하는 단일클론 항체를 분리하여 단일클론 항체를 제작하는 방법이다. 상기 방법으로 제조된 단일클론 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 공지된 방법을 이용하여 분리할 수 있다.
본 발명의 일곱번째 국면의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에 의하여, 간암 조기 진단용 단백질성 마커, 상기 단백질성 마커의 변화를 검출하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물, 상기 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트, 상기 단백질성 마커를 이용하는 간암 진단 방법, 상기 단백질성 마커를 활용한 간암 치료제 스크리닝 방법, 및 상기 단백질성 마커를 특이적으로 인식하는 항체가 제공된다.
상기 단백질성 마커는 초기 간암에 대하여 특이적이고 간암을 조기에 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다. 나아가, 이 단백질성 마커의 생리학적 기능은 간암의 발병에 직접적으로 관계된 것일 가능성이 있으며, 따라서 이 단백질성 마커는 간암 발병의 메커니즘을 연구하거나 간암 치료제의 개발을 위한 표적 단백질로서도 유용하게 사용될 수 있다.
상기 단백질성 마커는 종래 DNA 또는 mRNA 수준에서 발견된 간암 특이적 마커들에 비하여 더욱 임상적으로 활용 가치가 높은 마커들이며, 초기의 간암에만 한정되어 있다는 점에서 간암 치료제의 표적 단백질로서도 종래기술의 간암 특이적 마커들보다 더욱 유용한 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 임상샘플로부터 단백질의 수득 및 정량
5 명의 간암 환자로부터 E1 등급 간암 (HCC) 조직 (n=2) 및 E2 등급 간암 조직 (n=4), 및 각 간암 조직 주변의 정상 간 조직들 (n=5) 을 제공받았다. 각 조직들을 다음과 같이 처리하여 각 조직별로 총 11 세트의 단백질 샘플을 수득하였고 단백질을 정량하였다:
조직을 1×PBS로 세척하고, 혼합 완충액 [완충액 A (증류수 100 ml, 트리스 (50 mM) 0.606 g, KCl (100 mM) 0.746 g , 글리세롤 (20%) 20 g, pH 7.1), 프로테아제 저해자 1A (완충액 A 2 ml, 컴플리트 미니 (프로테아제 저해자 혼합물) 1 정제), 및 프로테아제 저해자 2 (펩스타틴 A (에탄올 100 ml 중 9.603 mg) 10 ml (=1.4 μM), PMSF (페닐메틸술포닐 플루오리드, 에탄올 100 ml 중 1.742 g) 10ml (=1.0 mM))] 을 가하여 분쇄하였다. 분쇄물을 초음파분해 처리하고, 4 ℃ 및 50,000 rpm 에서 1 시간 동안 초원심분리하였다. 상등액 중 10 ml 을 채취하여 10% TCA 침전법으로 단백질 펠렛을 생성시킨 후 남아있는 상등액을 상등액 1로 하였다. 또한, 생성된 단백질 펠렛을 기존의 초원심분리 튜브에 남아있는 상등액 및 혼합 완충액 [완충액 A (증류수 100 ml, 트리스 (50 mM) 0.606 g, KCl (100 mM) 0.746 g , 글리세롤 (20%) 20 g, pH 7.1), 프로테아제 저해자 1A (완충액 A 2 ml, 컴플리트 미니 1 정제), 및 프로테아제 저해자 2 (펩스타틴 A (에탄올 100 ml 중 9.603 mg) 10 ml (=1.4 μM), PMSF (페닐메틸술포닐 플루오리드, 에탄올 100 ml 중 1.742 g) 10ml (=1.0 mM))] 의 혼합액 내에 용해시키고, 생성물을 초음파분해 처리하고, 4 ℃ 및 50,000 rpm 에서 1 시간 동안 초원심분리하였다. 상등액 중 10 ml 을 채취하여 10% TCA 침전법으로 단백질 펠렛을 생성시킨 후 남아있는 상등액을 상등액 2로 하였다. 생성된 펠렛을 혼합 완충액 [9/2/4 완충액 (9 M 우레아, 2 M 티오우레아, 4% CHAPS(+ 18 mM DTT)) 및 프로테아제 저해자 1A 프로테아제 저해 자 1A (완충액 A 2 ml, 컴플리트 미니 1 정제)] 내에서 풀어서 용해시키고, 생성물을 17 ℃ 및 50,000 rpm 에서 1 시간 동안 초원심분리하였다. 펠렛을 제거한 후 남아있는 상등액을 상등액 3으로 하였다. 상등액 1과 2를 혼합하여 sup로 명명하였고, 상등액 3을 ppt로 명명하였으며, 한 종류의 조직에 대하여 sup 및 ppt가 하나의 단백질 샘플 세트를 이루도록 하였다. 단백질 샘플에 대하여, 바이오-래드 (BIO-RAD) 사의 5X 프로틴 에세이 (5X Protein Assay) 를 1X로 희석하여 샘플에 처리하고 595 nm 에서 샘플 중의 단백질을 정량하는 방식으로 브래드포드 (Bradford) 검사법을 수행하였다.
각 조직에서 단백질을 수득 및 정량한 결과는 하기 표 1과 같다.
Figure 112008018779149-pat00001
실시예 2: 2차원 SDS - PAGE 젤 전기영동 수행
실시예 1에서 수득한 각 조직별 총 11 세트의 단백질 샘플에 대하여 다음과 같은 방법으로 2차원 SDS-PAGE 젤 전기영동을 수행하였다:
단백질의 양이 300 μg 이 되도록 sup 및 ppt의 적량을 채취하고, 이를 1 M DTT 6.3 μl (=18 mM DTT), IPG 완충액 7 μl (=2%) 및 BPB (브로모페놀 블루) 2 μl 과 혼합하고, 이 혼합물에 9/2/4 완충액 [(9 M 우레아, 2 M 티오우레아, 4% CHAPS(+ 18 mM DTT))] 을 혼합하여 최종 부피가 350 μl 이 되도록 샘플 혼합물을 준비하였다. 이 샘플 혼합물을 재수화 트레이에 로딩하고 IPG 스트립 (immobilized pH gradient gel strip) 을 그 위에 로딩하여 12 시간 이상 재수화하였다. 충분히 재수화한 IPG 스트립에 대하여 IEF (Isoelectric Focusing) 를 실시하였다 (500 V, 2 mA, 5 W 1 분; 3500 V, 2 mA, 5 W 1 시간 30 분; 3500 V, 2 mA, 5 W 10 시간). IEF가 완료된 후 IPG 스트립을 평형화 (equilibration) 한 후, 3차 증류수로 충분히 세척하였고, SDS-PAGE 젤에 로딩하여 40 mA 에서 최대 전압 하에 전기영동하였다. 전기영동이 완료된 후, 은 착색 (silver staining) [질산은 (2.5%w/v) 사용] 하고, 이미지를 수득하였다. 수득된 이미지를 progenesissmaespot 프로그램 (NonLinear 사) 을 사용하여 배열하고 스팟을 검출하고 단백질의 양의 변화배수를 계산하였다.
수득된 이미지를 도 1 (pI 3-11), 도 2 (pI 3-5.6), 도 3 (pI 5.3-6.5), 및 도 4 (pI 6.2-7.5) 에 나타내었다. 이 이미지들로부터 정상 간 조직과 E1 등급 및 E2 등급 간암 조직 간에 프로테옴 상에서 현저한 차이가 있음을 알 수 있다.
실시예 3: MS 분석을 이용한 단백질의 동정
실시예 2에서 검출된 각 스팟에 대하여 다음과 같은 방법으로 단백질을 동정하였다:
각 스팟을 전기영동 젤로부터 절취하고, 탈색 (30 mM 칼륨 페리시아니드 및 100 mM 나트륨 티오술페이트의 1:1 혼합액) 및 세척한 후, 젤을 건조시켰다. 이어서, 단백질 분해용액 (5-10 ng/μl 트립신 1 μl 및 50 mM 암모늄 비카르보네이트 19 μl) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 밤새 방치하여 단백질을 펩티드화하였다. 추출용매 (50% 아세토니트릴 + 5% 트리플루오로아세트산) 10 내지 20 μl 로 3회 추출하고 4 내지 5 μl 로 농축하였다. 그 후, 매트릭스(matrix) 용액 (50% v/v 아세토니트릴 중 a-시아노-4-히드록시신남산 10 mg/ml, 0.1% TFA) 1μl 와 혼합하여 MALDI-MS 평판에 흡착시키고 건조시킨 후 ABI 익스플로러 4700 (ABI explorer 4700) 를 사용하여 MALDI-TOF 및 MALDI-TOF/TOF 분석하여 각 단백질의 분자량을 알아내었다. 이 분자량을 단백질 데이터베이스 프로그램 (Mascot 프로그램 및 ProbePMF 프로그램) 으로 검색하여 각 단백질을 동정하였다.
동정된 단백질들을 실시예 2에서 계산된 단백질 양의 변화배수에 따라 분류하였고, 변화배수가 1.5 이상 또는 -1.5 이하인 단백질 중 선행기술에 개시되지 않은 단백질 (E1 조직:70 종; E2 조직:77 종) 을 발굴해내었다. 그 결과를 하기 표 2 내지 7에 나타내었다. 표 2 및 3은 E1 조직에 관하여 변화배수가 1.5 이상 또는 -1.5 이하인 단백질들을 나타내고, 표 4 및 5는 E2 조직에 관하여 변화배수가 1.5 이상 또는 -1.5 이하인 단백질들을 나타내며, 표 6 및 7은 E1 및 E2 조직에서의 변화배수의 평균이 1.5 이상 또는 -1.5 이하인 단백질들을 나타낸다. 표 중, "E1"은 2 개의 E1 등급 간암 조직에서의 변화배수의 평균값이고, "E2"는 4 개의 E2 등급 간암 조직에서의 변화배수의 평균값이며, "평균"은 2 개의 E1 등급 및 4 개의 E2 등급 간암 조직에서의 변화배수의 평균값이다.
Figure 712010004401527-pat00013
Figure 112008018779149-pat00003
Figure 112008018779149-pat00004
Figure 112008018779149-pat00005
Figure 112008018779149-pat00006
Figure 112008018779149-pat00007
상기 표 2 내지 7에 제시된 단백질들은 정상 간세포와 비교할 때 간암 조직 중 E1 등급 조직 및/또는 E2 등급 조직에서 특징적으로 다량 또는 소량 존재하는 단백질들로서, 간암 조기 진단용 단백질성 마커로서 사용될 수 있는 단백질들이다. 나아가, 상기 단백질들은 간암의 발병 초기에 단백질 양의 변화가 검출되는 것들이기 때문에 간암의 발병에 직접적으로 관여하는 단백질들일 가능성이 있으며, 따라서 간암의 치료제 개발에 있어서 표적 단백질로서 사용될 수도 있을 것으로 예상된다.
도 1 은 E1 등급 간암 조직 (n=2) 및 E2 등급 간암 조직 (n=4) 과 정상 조직 (n=5) 의 2차원 SDS-PAGE 젤 전기영동 이미지로서, pI 3-11NL 전체에 관한 것이다.
도 2 는 E1 등급 간암 조직 (n=2) 및 E2 등급 간암 조직 (n=4) 과 정상 조직 (n=5) 의 2차원 SDS-PAGE 젤 전기영동 이미지로서, pI 3-5.6NL에 관한 것이다.
도 3 은 E1 등급 간암 조직 (n=2) 및 E2 등급 간암 조직 (n=4) 과 정상 조직 (n=5) 의 2차원 SDS-PAGE 젤 전기영동 이미지로서, pI 5.3-6.5L에 관한 것이다.
도 4 는 E1 등급 간암 조직 (n=2) 및 E2 등급 간암 조직 (n=4) 과 정상 조직 (n=5) 의 2차원 SDS-PAGE 젤 전기영동 이미지로서, pI 6.2-7.5L에 관한 것이다.

Claims (10)

  1. 삭제
  2. 하기 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 조합인 것을 특징으로 하는 간암 조기 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양, 패턴, 또는 양자 모두를 특이적으로 검출하는 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물:
    ERLN2_HUMAN (ER lipid raft associated 2 isoform 1; NCBI GI:6005721);
    NDUS3_HUMAN (NADH dehydrogenase (ubiquinone) Fe-S protein 3, 30kDa (NADH-coenzyme Q reductase); NCBI GI:4758788);
    PSB9_HUMAN (proteasome beta 9 subunit isoform 2 proprotein; NCBI GI:23110932);
    SET_HUMAN (SET translocation (myeloid leukemia-associated); NCBI GI:145843637);
    SSRD_HUMAN (signal sequence receptor, delta; NCBI GI:5454090);
    TGM2_HUMAN (transglutaminase 2 isoform a; NCBI GI:39777597);
    UGPA_HUMAN (UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase; NCBI GI:2136353).
  3. 하기 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 조합인 것을 특징으로 하는 간암 조기 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량, 발현 패턴, 또는 양자 모두를 특이적으로 검출하는 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물:
    ERLN2_HUMAN (ER lipid raft associated 2 isoform 1; NCBI GI:6005721);
    NDUS3_HUMAN (NADH dehydrogenase (ubiquinone) Fe-S protein 3, 30kDa (NADH-coenzyme Q reductase); NCBI GI:4758788);
    PSB9_HUMAN (proteasome beta 9 subunit isoform 2 proprotein; NCBI GI:23110932);
    SET_HUMAN (SET translocation (myeloid leukemia-associated); NCBI GI:145843637);
    SSRD_HUMAN (signal sequence receptor, delta; NCBI GI:5454090);
    TGM2_HUMAN (transglutaminase 2 isoform a; NCBI GI:39777597);
    UGPA_HUMAN (UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase; NCBI GI:2136353).
  4. 제 2 항에 있어서, 간암 조기 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양, 패턴, 또는 양자 모두를 특이적으로 검출하는 물질이 간암 조기 진단용 단백질성 마커를 특이적으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물.
  5. 제 3 항에 있어서, 간암 조기 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량, 발현 패턴, 또는 양자 모두를 특이적으로 검출하는 물질이 간암 조기 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 mRNA를 검출하기 위한 RT-PCR용 프라이머인 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물.
  6. 제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 간암 진단용 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진단용 키트.
  7. 제 2 항 또는 제 4 항의 간암 진단용 조성물을 간암이 의심되는 환자에게서 채취한 생물학적 시료에 처리하여, 처리 결과를 대조군과 대비하여 하기의 간암 조기 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양, 패턴, 또는 양자 모두의 차이를 검출하는 방법:
    ERLN2_HUMAN (ER lipid raft associated 2 isoform 1; NCBI GI:6005721);
    NDUS3_HUMAN (NADH dehydrogenase (ubiquinone) Fe-S protein 3, 30kDa (NADH-coenzyme Q reductase); NCBI GI:4758788);
    PSB9_HUMAN (proteasome beta 9 subunit isoform 2 proprotein; NCBI GI:23110932);
    SET_HUMAN (SET translocation (myeloid leukemia-associated); NCBI GI:145843637);
    SSRD_HUMAN (signal sequence receptor, delta; NCBI GI:5454090);
    TGM2_HUMAN (transglutaminase 2 isoform a; NCBI GI:39777597);
    UGPA_HUMAN (UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase; NCBI GI:2136353).
  8. 제 3 항 또는 제 5 항의 간암 진단용 조성물을 간암이 의심되는 환자에게서 채취한 생물학적 시료에 처리하여, 그 처리 결과를 대조군과 대비하여 하기의 간암 조기 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량, 발현 패턴, 또는 양자 모두의 차이를 검출하는 방법:
    ERLN2_HUMAN (ER lipid raft associated 2 isoform 1; NCBI GI:6005721);
    NDUS3_HUMAN (NADH dehydrogenase (ubiquinone) Fe-S protein 3, 30kDa (NADH-coenzyme Q reductase); NCBI GI:4758788);
    PSB9_HUMAN (proteasome beta 9 subunit isoform 2 proprotein; NCBI GI:23110932);
    SET_HUMAN (SET translocation (myeloid leukemia-associated); NCBI GI:145843637);
    SSRD_HUMAN (signal sequence receptor, delta; NCBI GI:5454090);
    TGM2_HUMAN (transglutaminase 2 isoform a; NCBI GI:39777597);
    UGPA_HUMAN (UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase; NCBI GI:2136353).
  9. 제 3 항 또는 제 5 항의 간암 진단용 조성물을 간암이 의심되는 환자에게서 채취한 생물학적 시료에 처리하여, 그 처리 결과를 대조군과 대비하여 하기의 간암 조기 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량, 발현 패턴, 또는 양자 모두의 차이를 검출하는 방법:
    ERLN2_HUMAN (ER lipid raft associated 2 isoform 1; NCBI GI:6005721);
    NDUS3_HUMAN (NADH dehydrogenase (ubiquinone) Fe-S protein 3, 30kDa (NADH-coenzyme Q reductase); NCBI GI:4758788);
    PSB9_HUMAN (proteasome beta 9 subunit isoform 2 proprotein; NCBI GI:23110932);
    SET_HUMAN (SET translocation (myeloid leukemia-associated); NCBI GI:145843637);
    SSRD_HUMAN (signal sequence receptor, delta; NCBI GI:5454090);
    TGM2_HUMAN (transglutaminase 2 isoform a; NCBI GI:39777597);
    UGPA_HUMAN (UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase; NCBI GI:2136353).
  10. 삭제
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