KR20030092378A - 고형암의 진행 정도를 진단하는 방법 및 키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 동물로부터 분리된 고형암 시편에서 Hsp 단백질과 Bcl-2 단백질의 수준을 검정하고, Hsp 단백질 수준이 높은 경우 진행성암으로 판정하고 반대로 Bcl-2 단백질의 수준이 높은 경우 조기암으로 판정함을 특징으로 하여, 고형암의 진행 정도를 진단하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 동물로부터 분리된 고형암 시편에서 채취한 시료중에서 Hsp 단백질과 Bcl-2 단백질의 상대적 양을 검정할 수 있도록 양 단백질에 대한 항체를 포함함을 특징으로 하여 고형암의 진행 정도를 진단하는 키트에 관한 것이다.

Description

고형암의 진행 정도를 진단하는 방법 및 키트{Method and Kit for Diagnosis of Progress Stage of Solid Cancer}
본 발명은 고형암의 진행 정도를 진단하는 방법 및 키트에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 동물로부터 분리된 고형암 시편에서 Hsp(heat shock protein) 단백질과 Bcl(B cell lymphoma)-2 단백질의 수준을 검정하고, Hsp 단백질 수준이 높은 경우 진행성암으로 판정하고 반대로 Bcl-2 단백질의 수준이 높은 경우 조기암으로 판정함을 특징으로 하여, 고형암의 진행 정도를 진단하는 방법에 관한 것이다. 또한, 동물로부터 분리된 고형암 시편에서 채취한 시료중에서 Hsp 단백질과 Bcl-2 단백질의 상대적 양을 검정할 수 있도록 양 단백질에 대한 항체를 포함함을 특징으로 하여 고형암의 진행 정도를 진단하는 키트에 관한 것이다.
암 연구의 중요한 관심사 중 하나는 세포사멸기전에서 기능을 하거나 또는 고형암에서 저산소 상태와 같이 미세환경과 같은 여러 가지 조건 하에서 세포사멸이 유도되는 것을 저해하는 단백질을 동정하는 것이다. 특히 고형암에서 저산소 종양세포(hypoxic tumor cell)의 존재는 암 치료에 큰 문제가 되어왔다. 저산소 종양세포는 전이성이 강한 암을 만들뿐만 아니라 종양의 악성화를 촉진하는데 큰영향을 미친다. 이는 많은 고형암들이 정상적이지 않은 혈관망상조직으로 되어있기 때문이다(Moulder, J.E. et al., Cancer Metastasis Rev., 5, 313-341 (1978)). 저산소 종양세포들은 산소가 정상적으로 공급되는 종양세포에 비해 방사선 치료와 일반적인 화학치료에 저항성이 큰 것으로 알려져 있다(Teicher,B. et al., Cancer Res., 41, 73-81 (1981); Koong, A.C. et al., Cancer Res., 60, 883-887 (2000)). 문헌에 의하면 고형암 내에서 저산소증(hypoxia)은 세포사멸에 대해 저항성을 갖게 하는 역할을 하며(Graeber T.G. et al., Nature(Lond), 379, 88-91 (1996)) 또한, 저산소증이 종양세포의 전이능력을 증가시킨다고 제시하고 있다(Young, S.D. et al., J. Natl. Cancer Inst., 82, 371-380 (1990)). 이러한 연구결과는 저산소증이 유전자 발현을 조절함으로써 종양세포가 증식하는데 영향을 준다는 것을 시사한다. 저산소 종양세포가 진행되고 전이능력을 얻기 위해서 필요한 과정으로서 생존력을 늘려야 하고 전이능(metastatic potential)을 발전시켜야 한다. 이와 관련하여, 시험관내 및 생체내 실험에서 저산소증에 의해 열충격 단백질(heat shock protein, Hsp)이 유도된다는 것이 확인되었고(Guttman, S.D. et al., Cell, 22, 229-307 (1980), 쥐의 종양 세포에서 저산소증에 의해 열충격 전사인자(heat shock transcription factor, HSF)가 활성화되고 Hsp 단백질이 발현된다는 것이 밝혀졌다(Back, B.H. et al., J. Cell Physiol., 32, 112-118 (1999)). 또한, 본 발명자들은 저산소증에 의한 신호가 HSF 및 저산소 유도인자-1(hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)에 동시에 전달되어 수 종의 Hsp 단백질, 조혈인자(hematopoietic factor) 및 혈관형성인자(angiogenic factor)들이 유의성있게 축적된다는 것을 증명하였다(Back, B.H. et al., J. Cell Physiol., 32, 112-118 (1999); Back, B.H. et al., J. Cell Physiol., 188, 223-235 (1999)).
종양 운동성(Tumor kinetics)에 관한 연구결과에서 종양성 대장 상피 세포(neoplastic colonic epithelial cell)가 생체 내에서 늘어나게 되는 이유는 세포증식 뿐 아니라 세포사멸율이 줄어들기 때문이다. 양성의 선종성 폴립(adenomatous polyp)들이 침입성 종양(invasive tumor)으로 진행되는 중에도 사멸세포의 비율이 줄어든다고 보고되고 있다(Bedi, A. et al., Cancer Res., 55, 1811-1816 (1995)). 이러한 현상을 본 분야의 연구자들은 Hsp 단백질이 항-세포자살(anti-apoptotic) 기능을 나타내기 때문이라고 언급하고 있다. 즉, Hsp 단백질들이 증가되어있는 세포들은 여러 종류의 스트레스에 저항성이 강하다는 것이다. 이들 작용의 기전에 관한 최근 결과들을 보면 Hsp 단백질의 주종인 Hsp70이 세포자살의 효과적인 저해제라는 것을 증명하고 있다(Mosser, D.D. et al., Mol. Cell Biol., 20, 7146-7159 (1997); Ravagnan, L. et al., Nal. Cell Biol., 3, 839-843 (2001); Beere, H.M, et al., Nal. Cell Biol., 2, 469-475 (2000)). 또한, 다양한 종류의 생체내, 시험관내 시스템에서 Hsp27, 알파 B 크리스탈린(alpha B crystallin), Hsp90, 및 Hsp60과 같은 다른 종류의 Hsp 단백질들의 항-세포자살 기능에 대해서도 알려져 있다.
항-세포자살 기능을 갖는 단백질로서, Bcl-2 또는 Bcl-XL단백질이 저산소증에 의하여 유도되는 세포사멸을 저해하는 것으로 알려져 있다(Kinoshita, M. etal., Int. J. Cancer, 91, 322-326 (2001)). Bcl-2 또는 Bcl-XL단백질을 과발현시키면 세포자살이 지연되고, 화학요법제, 방사능, 성장인자 고갈 등의 다양한 자극 후에도 세포의 생존률이 높아진다는 것이 밝혀졌다(Lock R.B. et al., Cancer Res., 4006-4012 (1996)).
암을 진단하는 방법으로서 일반적으로 분자생물학, 생화학적 연구를 통하여 종양표지자(tumor marker)에 관한 연구가 많이 이루어져 왔다. 예를 들면, 암 유발인자(oncogene; ras 등), 종양 억제인자(tumor suppressor; p53 등), 암세포 표면에 특이적으로 발현하는 항원물질(tumor-specific antigen; CA 125, CEA, PSA 등) 및 암의 특이적 효소(methotrexate 등)의 DNA 와 단백질의 이상유무를 동정하는 연구들이다. 예를 들면, 미국특허 제 6090546호에는 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 암 유발인자인 ras를 찾는 방법이 기술되어 있고 국제특허공개 WO 94/10575호에는 혈청시료에서 암억제인자인 p53의 돌연변이체를 검정하여 암을 진단하는 방법에 대해 기술되어 있다. 이러한 방법들은 낮은 정확성으로 인해 암 진단의 보조적인 방법으로 이용되고 있다. 또한 각종 발암과정에 관련되어 있는 유전자(예, proto-oncogenes 또는 tumor suppressor genes)의 상태나 종양성장에 관여하는 조절인자를 직접적 혹은 간접적인 방법으로 조사하여 종양의 예후를 예측하는 방법도 있는데 여기에 주로 활용이 되는 분자 표지자(molecular markers)로서 CD44, CK-19, PRL 등이 비교적 의미가 있는 것으로 되어 있고 이외에도 p21, p53, c-Myc, AA, Cyclin D1 등이 있기는 하지만 이런 것들 중에서 뚜렷이 독립적인 의미를 가진 예후인자로 증명이 되어 임상적으로 활용이 되고 있지는 않다.
상기에서 설명한 암 조직이나 암 세포에서 발현되는 특정 종양표지자(tumor marker) 또는 분자 표지자(molecular markers)와 같은 물질을 정석 또는 정량함으로써 이루어지는 진단 키트가 빠른 속도로 발전하고 있다. 1950년대 방사선 동위원소를 이용한 방사능면역분석법(RIA)이 처음으로 도입된 이래 효소면역분석법(ELISA)이 70년대와 80년대에 개발되고 발전되었다. 현재 ELISA 면역분석법은 가장 많이 사용되고 있는 방법 중의 하나이며 의학이나 생명과학의 연구에서 필수적인 도구가 되었다. 최근에는 변형된 ELISA 분석법이 개발되었는데, 96-웰 내부에 다수의 항체를 고정화하여 한꺼번에 많은 수의 시료를 분석하는 방법도 이들 중의 하나이다. 또한, 면역크로마토그라피 방법을 진단 키트로 암, 전혈, 혈청, 뇨 등의 생검물을 고안된 기구에 적용하여 빠르게 검사결과를 확인할 수 있다. 이와 같은 면역진단법을 이용한 진단 키트는 암진단, 임신진단, 미생물탐지 등 다양한 분야에서 널리 사용되고 아주 간편하게 진단할 수 있다. 따라서, 진단하기어려운 암과 같은 질병을 보다 빠르게 확인하고 분석하여 질병의 상태를 진단할 수 있을 것이다.
본 발명자들은 동물로부터 고형암 시편을 분리하여 Hsp 단백질 또는 Bcl-2 단백질의 발현 수준을 연구하던 중 진행성암과 조기암에서 발현되는 Hsp 단백질 또는 Bcl-2 단백질 수준이 차이가 있음을 발견하고 또한 임상적으로 확인하였다.
따라서, 본 발명은 동물로부터 분리된 고형암 시편에서 Hsp 단백질과 Bcl-2 단백질의 수준을 검정하고, Hsp 단백질 수준이 높은 경우 진행성암으로 판정하고반대로 Bcl-2 단백질의 수준이 높은 경우 조기암으로 판정함을 특징으로 하여, 고형암의 진행 정도를 진단하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 시료에서 Hsp 단백질과 Bcl-2 단백질의 상대적 양을검정할 수 있도록 양 단백질에 대한 항체를 포함함을 특징으로 하는 고형암의 진행 정도를 진단하는 키트를 제공한다.
도 1은 웨스턴 블럿 분석으로 대장암 세포에서 Hsp 단백질군의 발현을 조사한 것이다.
도 2는 웨스턴 블럿 분석으로 대장암 세포에서 Bcl-2 단백질군의 발현을 조사한 것이다.
도 3은 면역조직화학적 염색으로 대장암 조직에서 Hsp70 단백질의 발현을 광학현미경(정상조직 x100, 암조직 x400)으로 관찰한 것이다.
도 4는 면역조직화학적 염색으로 대장암 조직에서 Hsp110 단백질의 발현을 광학현미경(정상조직 x100, 암조직 x400)으로 관찰한 것이다.
도 5는 면역조직화학럴적 염색으로 대장암 조직에서 Bcl-2 단백질의 발현을 광학현미경(정상조직 x100, 암조직 x400)으로 관찰한 것이다.
도 6은 측방 유동 정량 검정 스트립의 사시도이다.
도 7은 측방 유동 정량 검정 스트립의 평면도이다.
<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>
1. 측방 유동 정량 검정 스트립2. 샘플 패드
3. 결합체 방출 패드4. 크로마토그래피 매질
5. 흡수 패드6. 지지대
7. 접착제8. 제 1 표준선
9. 제 2 표준선10. 시험선
본 발명은 동물의 고형암 진행 정도를 진단하는 방법 및 키트에 관한 것으로, 고형암의 진행 정도, 즉 고형암이 진행성 단계에 있는 암인지 아니면 초기 단계에 있는 조기암인지를 고형암의 시편, 예를 들면 고형암 조직 또는 고형암 세포에 발현된 Hsp 단백질과 Bcl-2 단백질의 수준을 진단 키트를 이용하여 상대적으로 결정함으로써 판단할 수 있다. 동물의 고형암 진행 정도와 관련하여 사용된 용어“진행성암”이란 전이 능력이 높은 암으로서 임상병리학적 지표 중에서 분화정도, 림프혈관 침투, 신경주의 침투, 국조적 림프절 전이, 아스틀러-콜러의 변형된 듀크스 병기 등에서 양성반응을 나타내는 암을 의미하며 이러한 의미는 당업자에게는 잘 인식되어 있다. 또한, 고형암의 진행 정도를 나타내기 위하여 상기 “진행성암”이란 용어와 함께 상대적으로 통상 사용되는 용어인 “조기암”은 전이 능력이 낮은 암으로서 임상병리학적 지표 중에서 분화정도, 림프혈관 침투, 신경주의 침투, 국조적 림프절 전이, 아스틀러-콜러의 변형된 듀크스 병기 등에서 음성반응을 나타내는 암을 의미한다.
본 발명의 방법에 따라 동물의 고형암의 진행 정도를 판단하기 위한 지표로사용되는 Hsp 단백질과 Bcl-2 단백질은 저산소증에 의해 유도되는 세포사멸을 저해하는 단백질로 알려져 있다. 고형암에서 저산소 종양세포는 전이성이 강한 암을 만들뿐만 아니라 종양의 악성화를 촉진하는데 큰 영향을 미친다. 문헌(Graeber T.G. et al., Nature(Lond), 379, 88-91 (1996))에 의하면 고형암 내에서 저산소증(hypoxia)은 세포사멸에 대해 저항성을 갖게 하는 역할을 하며 또한, 저산소증이 종양세포의 전이능력을 증가시킨다고 제시하고 있다(Young, S.D. et al., J. Natl. Cancer Inst., 82, 371-380 (1990)). 이러한 연구결과는 저산소증이 유전자 발현을 조절함으로써 종양세포가 증식하는데 영향을 준다는 것을 시사한다. 저산소 종양세포가 진행되고 전이능력을 얻기 위해서 필요한 과정으로서 생존력을 늘려야 하고 전이능(metastatic potential)을 발전시켜야 한다. 이와 관련하여, 시험관 내 및 생체 내 실험에서 저산소증에 의해 열충격 단백질(heat shock protein, Hsp)이 유도된다는 것이 확인되었고(Guttman, S.D. et al., Cell, 22, 229-307 (1980), 쥐의 종양 세포에서 저산소증에 의해 열충격 전사인자(heat shock transcription factor, HSF)가 활성화되고 Hsp 단백질이 발현된다는 것이 밝혀졌다(Back, B.H. et al., J. Cell Physiol., 32, 112-118 (1999)). 또한, 본 발명자들은 저산소증에 의한 신호가 HSF 및 저산소 유도인자-1(hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)에 동시에 전달되어 수 종의 Hsp 단백질, 조혈인자(hematopoietic factor) 및 혈관형성인자(angiogenic factor)들이 축적된다는 것을 증명하였다(Back, B.H. et al., J. Cell Physiol., 32, 112-118 (1999); Back, B.H. et al., J. Cell Physiol., 188, 223-235 (1999)). 또한 항-세포자살 기능을갖는 단백질로서, Bcl-2 또는 Bcl-XL단백질이 저산소증에 의하여 유도되는 세포사멸을 저해하는 것으로 알려져 있다(Kinoshita, M. et al., Int. J. Cancer, 91, 322-326 (2001)). Bcl-2 단백질의 과발현은 여포 B 세포 림프종(follicular B cell lymphoma)에서 처음으로 확인되었다. Bcl-2 단백질이 세포자살을 억제한다는 기능이 밝혀지면서 세포자살의 역치(threshold)가 증가되는 것이 발암(carcinogenesis)의 가장 중요한 과정이라는 개념을 형성하게 되었다. Bcl-2 단백질에 의한 암 발생 가능성은 여러 종류의 배양세포와 형질전환된 마우스에서 보고되었다. Bcl-2 단백질을 과발현시키면 세포자살이 지연되고, 화학요법제, 방사능, 성장인자 고갈 등의 다양한 자극 후에도 세포의 생존률이 높아진다는 것이 밝혀졌다(Lock R.B. et al., Cancer Res., 55, 4006-4012 (1996)).
본 발명의 방법에서 고형암의 진행 정도를 판단하기 위한 지표로 사용된 Hsp 단백질 및 Bcl-2 단백질은 모든 포유동물의 각종 고형암에서 발현되는 것으로 알려져 있으므로, 본 발명의 방법은 사람을 포함한 각종 포유동물, 예를 들면 소, 돼지, 양, 말, 개, 원숭이, 고양이 등에 동일하게 적용될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 방법의 바람직한 적용 대상은 사람이다.
본 발명에 있어서, “고형암”이란 덩어리로 이루어진 암을 의미하며 이들로 한정되는 것은 아니지만 다음과 같은 여러 고형암의 진행 정도를 진단하는데 유용하다: 방광, 유방, 장, 신장, 간, 폐(소세포폐암 포함), 뇌, 식도, 쓸개, 난소, 췌장, 위, 경부, 갑상선, 전립선 및 피부(편평상피 세포 암종 포함)와 같은 암종; 섬유육종 및 횡문근육종을 포함한 간충직 발원의 종양; 성상세포종, 신경모세포증,신경교종 및 신경초종을 포함한 중추 및 말초 신경계의 종양; 및 흑색종, 정상피종, 기형종, 골육종, 색소건피증, 각화극세포종, 갑상선 여포상암 및 카포시 육종을 포함한 기타 종양.
바람직한 양태로서, 본 발명은 폐암, 뇌암, 유방암, 난소암 및 대장암의 진행 정도를 진단하는데 유용하며, 특히 바람직하게는 대장암의 진행 정도를 진단하는데 유용하다.
본 발명은 고형암의 시편, 즉 고형암 조직 또는 고형암 세포내에 발현된 Hsp 단백질 및 Bcl-2 단백질의 수준을 검정하며 이러한 검정은 본 분야에서 통상적으로 사용되거나 당업자에게 잘 알려진 방법을 통해 달성할 수 있다. 예를 들면, 웨스턴 블럿 또는 면역조직화학 분석법 등을 이용할 수 있다.
본 발명에서는 종양세포의 세포자살을 저해하고 악성화에 영향을 미치는 Hsp 단백질 및 Bcl-2 단백질의 발현을 측정하기 위해 대장암 세포주를 이용하였다. 대장암은 다양한 성장속도와 전이능(metastatic potential)을 가진 암 세포로 이루어진 이질적인 종양(heterogeneous neoplasm)으로 알려져 있다(Fearon, E.R. et al., Cell, 61, 759-767 (1990); Filder, I.J., Cancer Res., 50, 6130-6138 (1990)). 이러한 이유로 동일한 병원성(pathologic) 또는 임상적 병기(clinical stage)로 분류된 환자간에도 매우 다른 임상적 작용(clinical behavior)을 보인다. 여러 종의 전-암 유발인자(proto-oncogene), 암 유발인자(oncogene), 조절인자, 그리고 종양 억제 유전자들이 대장암의 진행에 영향을 미칠 것이다(Fearon, E.R. et al., Cell, 61, 759-767 (1990); Kinzler, K.W. et al., Nature, 386-761 (1996); Hoops, T.C.et al., Hemaatol. Oncol. Clin. North Am., 11, 609-633 (1997)). 따라서, 대장암 진행에 영향을 미치는 요인 중에서 세포사멸을 억제하는 작용을 나타내는 Hsp 단백질군 또는 Bcl-2 단백질군의 발현을 웨스턴 블럿 방법으로 분석하였다. 웨스턴 블럿 분석은 항원-항체 작용을 이용하여 여러 단백질 혼합물 중에서 원하는 특정 단백질만을 찾아내는 방법으로써 당업계에서 일반적으로 알려진 분석방법이다. 단백질의 발현을 분석하기 위해 사용된 대장암 세포주로는 전이 능력이 낮은 사람의 클론 A 및 MIP-101 세포주를 이용하였고, 반면 전이능력이 높은 사람의 CX-1과 HT-29 세포주를 이용하였다(Edmiston, K.H. et al., Cancer Res., 58, 1524-1531 (1998)). Hsp 단백질군 및 Bcl-2 단백질군의 발현 패턴을 분석한 결과, 전이 능력이 높은 대장암 세포주에서 Hsp 단백질군의 발현이 증가함을 보였고(도 1), 전이 능력이 낮은 대장암 세포주에서 Bcl-2 단백질군의 발현이 증가함을 보였다(도 2). 이의 결과로 볼 때 Hsp 단백질군의 발현과 Bcl-2 단백질군의 발현의 차이점은 대장암의 전이 능력에 따라 이들 단백질의 발현이 변화되었다고 볼 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 대장암 환자의 대장암 조직을 분리하여 면역조직화학분석을 통해 Hsp70 및 Hsp110 단백질 또는 Bcl-2 단백질의 발현을 조사하였다. 면역조직화학분석은 세포나 조직의 박막을 헤마톡실린과 에이오신(H & E)등과 같은 염색물질을 이용하여 항체와 결합된 특이적인 단백질을 조사하는 방법으로서 당업계에서 일반적으로 알려진 분석방법이다. 대장암 조직에서 발현되는 Hsp70 및 Hsp110 단백질 또는 Bcl-2 단백질의 발현 실험 결과를 임상병리학적 지표에 따라 분류하여 하기 표 2, 3, 4에 나타내었다. 하기 표 2, 3, 4에서 대장암의 진행 정도의 특성을 나타내기 위해 일반적으로 사용되는“아스틀러-콜러의 변형 듀크스 병기”로 대장암의 진행정도를 나타내었다. “아스틀러-콜러의 변형 듀크스 병기”는 1930년에 발표된 듀크스병기를 아스틀러와 콜러가 변형한 병기 정도로서 대장암의 진행정도를 총 8정도로 세분화하였다. 즉, A 정도는 암세포가 점막층에 국한된 경우를 나타낸다. B1 정도는 암세포가 장벽내에 머물고 임파선 전이가 없는 경우이고, B2 정도는 암세포가 장벽외로 나갔으나 임파선 전이가 없는 경우이며, B3 정도는 임파선 전이가 없고 이웃장기를 침범한 경우를 나타낸다. C1 정도는 암세포가 장벽내에 머물고 있으나 임파선 전이가 있는 경우이고, C2 정도는 암세포가 장벽외로 나가고 임파선 전이가 있는 경우이며, C3 정도는 임파선 전이가 있으며 이웃장기를 침범한 경우를 나타낸다. 마지막으로 D 정도는 간, 폐, 뼈 등의 원격전이가 있는 경우를 나타낸다.
대장암 조직에서 Hsp70, Hsp110 단백질 및 Bcl-2 단백질의 발현수준과 임상병리학적 지표 사이의 유의도를 통해 나타낸 결과로 볼 때, Hsp70 및 Hsp110 단백질의 발현은 국소적 림프절 전이 양성반응과 아스틀러-콜러의 변형 듀크스 병기 정도에서 유의도 수준이 의미가 있는 것을 알 수 있다(표 2, 표 3). 즉, 대장암이 진행되고 있는 정도에서 Hsp 단백질의 발현이 증가하였음을 알 수 있다. 또한, Bcl-2 단백질의 발현과 임상적 특성 사이의 유의도를 통해 나타낸 결과로 볼 때 Bcl-2 단백질의 발현은 림프혈관 침투 음성반응, 신경주의 침투 음성반응, 국소적 림프절 전이 음성반응 및 아스틀러-콜러의 변형 듀크스 병기 정도에서 유의도 수준이 의미가 있는 것을 알 수 있다(표 4). 즉 대장암이 조기 정도에서 Bcl-2 단백질의 발현이 증가하였음을 알 수 있다.
또한, 대장암 조직에서 Hsp70, Hsp110 단백질 및 Bcl-2 단백질 발현 수준을 광학현미경을 통해 관찰한 결과로 볼 때, 도 3과 도 4에서 보는 바와 같이 Hsp70 단백질과 Hsp110 단백질의 세포 내 분포는 이들 Hsp 단백질 발현이 세포질과 핵 모두에서 퍼져있는 형태를 보인다. Bcl-2 단백질 발현과는 달리, Hsp70 및 Hsp110 단백질의 항원항체 반응은 대장암 상피 세포에 위치해 있다. 다른 종류의 시험관 내, 생체 내 동물모델 시스템에서의 이들의 기능 구조, 조절의 유사성을 생각해 볼 때, 이들 단백질은 대장암이 진행되는 정도에서 비슷한 기능을 할 것이다. 그러나, Hsp70 및 Hsp110 단백질사이의 연관성을 조사해 보았을 때, 강한 연관성을 보이지는 않는다(표 5). 이는 Hsp70 단백질과 Hsp110 단백질 모두 고형암의 진행성 정도에 관련되어 있으나, 이 두 단백질이 대장암의 진행에 있어서 서로 다른 역할을 할 것이라고 예측할 수 있다. 정상 세포에서 Bcl-2 단백질의 세포 내 분포를 보면, Bcl-2 단백질의 항원항체 반응(immunoreactivity)은 도 5에서 보는 바와 같이 줄기 세포(stem cell)증식이 일어나는 소낭의 기저에 있는 상피 세포에 위치한다. 반대로 표면 상피에는 Bcl-2 단백질의 항원항체 반응이 없다. 이의 결과는 Bcl-2 단백질이 장내 세포의 분화와 전환에 있어 영향을 미친다는 것을 보여준다. 따라서, Bcl-2의 발현이 비정상적으로 지속되는 것은 장생 세포(long-living cell)가 축적되는 것이고, 초기 임상적 정도에서 발암작용(carcinogenesis)의 시작에 기여하는 것이라고 볼 수 있다. 이를 뒷받침하는 결과로서, Bcl-2 단백질 발현은 대장암의 진행성 정도와 관련이 있는 Hsp70 단백질 발현과 반대로 연관되어 있다(표6, p=0.015). 이 결과들은 대장암의 진행에 있어서 Bcl-2 및 Hsp70 단백질이 정도-의존적으로 발현된다는 것을 예측케 해준다. 한편, Bcl-2 및 Hsp70 단백질의 연관성보다는 유의도가 떨어지지만 Hsp110 및 Bcl-2 단백질 발현사이에서도 반대로 된 연관성이 보인다(표 6, p=0.077).
상술한 바와 같은 Hsp 단백질과 Bcl-2 단백질의 발현 수준의 차이에 따라 고형암의 진행 정도를 진단하기 위해서, 본 발명은 동물로부터 분리된 고형암 시편에서 채취한 시료중에서 Hsp 단백질과 Bcl-2 단백질의 상대적 양을 검정할 수 있도록 양 단백질에 대한 항체를 포함하는 키트를 사용하였다. 본 발명에서 사용될 수 있는 진단 키트는 본 발명의 진단방법을 위한 구성성분으로 이루어진 모든 키트를 말한다. 본 발명에서는 예시적으로 대표적인 타입으로 잘 알려진 측방유동분석법(lateral flow assay)을 이용한 진단 키트를 사용하였다. 이 측방유동분석 타입의 키트의 구조를 살펴보면 시료가 적용되는 샘플패드(sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출패드(releasing pad), 시료가 이동하여 분리되고 항원-항체 반응이 일어나는 전개용 막(주로, 니트로셀룰로스) 또는 스트립, 항원-항체 반응으로 생성된 결합체를 포획하는 항체가 고정되어 있는시험선(10), 그리고 시료가 계속하여 이동하기 위한 흡수패드(absorption pad)로 되어 있다. 측방유동분석용 진단 키트는 대개 샌드위치 형태로 분석물을 탐지하도록 고안되어 있다. 시료 속에 들어 있는 분석물이 샘플패드에 적용되어 이동하기 시작하면서 먼저 방출패드에 코팅되어 있는 탐지용 항체와 반응을 하여 항원-항체 결합체 형태로 계속하여 전개된다. 이동하면서 전개막에 고정되어 있는 포획 항체와 한번 더 반응을 하여 샌드위치 형태의 복합체를 만든다. 포획 항체는 전개막에 고정되어 있기 때문에 항원-항체 반응이 계속하여 일어나면 복합체의 축적이 포획 항체의 고정면에서 이루어진다. 단백질은 육안으로는 투명하기 때문에 복합체의 생성 여부와 상대적인 양을 부착된 라벨의 세기를 측정함으로써 판단한다.
도 6 및 도 7에 도시한 바와 같이 본 발명에서 사용된 측방 유동 검정 스트립(1)은 지지대(6)상의 접착층을 매개로 하여 지지대의 한쪽 말단에 Hsp 단백질과 Bcl-2 단백질이 존재하는 대장암에서 채취한 분석물을 함유한 액체 시료가 투입되는 샘플 패드(2)가 부착되어 있고, 이어서 지지대(6)의 반대쪽 말단 방향으로 1차 탐지자인 라벨-표지된 Hsp 단백질에 대한 단클론항체 및 Bcl-2 단백질에 대한 단클론항체 및 3차 탐지자인 상기 1차 탐지자와 동일한 라벨로 표지되고 1차 탐지자 및 2차 포획자와 상이한 3차 탐지자가 고정되어 있지 않고 코팅되어 있는 결합체 방출 패드(3)가 부착되어 있으며, 결합체 방출 패드(3)에서 Hsp 단백질과 Bcl-2 단백질 및 이에 특이적 결합하는 라벨-표지된 단클론항체가 항원-항체 반응하여 형성된 결합체를 포획하는 2차 포획자가 크로마토그래피 매질(4)상에 각 단백질에 대해서 두 개의 시험선(10)으로 고정되어 있고, 시험선(10)의 전방 또는 후방에 상기 1차 탐지자 및 2차 포획자와 상이하고 3차 탐지자와 동일하거나 상이한 비표지된 4차 포획자가 표준선(8,9)으로서 한 선으로 고정되거나 전후방 모두에 각각 한 선씩 고정되어 있고, 이어서 샘플 패드(2)의 반대쪽에는 흡수 패드(5)가 부착되어 있다.
결합체 방출 패드(3)상에는 액체 시료가 모세관 현상에 의해 크로마토그래피적으로 이동하면서 액체 시료중의 분석물과 반응하여 결합체를 형성할 수 있는 라벨-표지된 1차 탐지자가 비고정 흡착되어 있다. 탐지자로서 Hsp 단백질 및 Bcl-2 단백질과 결합하는 단클론항체는 통상적인 단클론항체 제조 방법에 따라 제조할 수 있다. 즉, Hsp 단백질 또는 Bcl-2 단백질을 마우스에 주사하여 마우스를 면역시키고, 면역된 마우스의 비장 세포를 SP2/0와 같은 골수종(myeloma) 세포와 융합시킨 후 하이브리도마 세포를 선별하고 이를 배양함으로써 Hsp 단백질 또는 Bcl-2 단백질에 대한 단클론항체를 얻을 수 있다. 본 발명에서 Hsp 단백질 및 Bcl-2 단백질에 대한 단클론항체는 통상적인 방법에 따라 제조된 Hsp110 단백질 항체인 #385(Dr. John Subjeck, U.S.A.), Hsp70 단백질 항체인 C92F3A-5(StressGen, Canada), Bcl-2 단백질 항체인 B 클론 124(Dako, Denmark) 사용하였다. 탐지를 표지하기 위한 라벨(label)로는 콜로이드성 금입자, 라텍스 비드(latex bead), 탄소입자, 형광물질, 발광물질(luminescence), 레독스 분자(redox molecule) 및 마그네틱 입자가 포함된다.
크로마토그래피 매질(4)상에는 결합체 방출 패드(3)에서 Hsp 단백질과 Bcl-2 단백질 및 이에 특이적 결합하는 라벨-표지된 단클론항체가 항원-항체 반응하여 형성된 결합체를 포획하는 1차 탐지자와 동일하거나 상이한 2차 포획자가 두 개의 시험선(10)으로 각 단백질에 대해서 매질(4)상에 고정되도록 분주되어 있으며, 이러한 시험선의 2차 포획자(10)는 액체 시료 및 상기 결합체 방출 패드(3)에서 형성된 결합체가 크로마토그래피적으로 이동해 오면서 화학적으로 반응하여 그 결합체를 포획한다. 이러한 포획자는 크로마토그래피 매질상에 화학적으로 결합하여 고정시킨다. 이러한 화학적 결합은 공지 방법(LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRYAND MOLECULAR BIOLOGY, Volume 15, Edited by R. H. BURDON and P. H. Van KNIPPENBERG ELSEVIER AMSTERDAM: NEW YORK, OXFORD (1985) P. 318-322)에 따라 실시될 수 있다. 또한, 포획자는 크로마토그래피 매질상에 제 2 물질(예, 항체 단백질)을 통해 결합될 수 있다. 제 2 물질이 항체(제 2 항체)이고 고정될 포획자가 마우스로부터 유래된 단클론항체인 경우 과량의 항-마우스 yG(감마 글로불린) 헤테로-동물 항체가 결합된 후 적절한 양의 포획자(단클론항체)가 면역반응에 의해 결합되는 활성화된 페이퍼 시트가 사용될 수 있다. 만일 제 2 물질이 단백질인 경우에는 예를 들면 과량의 프로테인 A가 결합된 후 적당량의 포획항체가 결합되는 활성화된 페이퍼 시트가 사용될 수 있다.
결합체 방출 패드(3) 또는 크로마토그래피 매질(4)에서 미반응된 물질 및 액체 시료는 계속해서 크로마토그래피적으로 이동하면서 지지대의 말단에 부착되어 있는 흡수 패드(5)로 흡수된다. 분석물의 양은 결합체의 양으로서 결정되며, 이러한 결합체의 양은 시료가 크로마토그래피 매질을 따라 이동하면서 상기 시험선 에서 형성된 상기 1차 탐지자, 2차 포획자 및 분석물의 상기 복합체의 라벨 세기를 상기 표준선에서 형성된 상기 1차 탐지자와 동일한 라벨로 표지되고 1차 탐지자 및 2차 포획자와 상이한 3차 탐지자, 3차 탐지자와 동일하거나 상이하고 비표지된 4차 포획자 및 표준물의 복합체의 표준 라벨 세기를 정량화하고 이를 상대적인 값으로 산정함으로써 결정된다. 라벨 세기를 측정하는 방법 및 기기는 라벨의 종류에 다르나 이는 당업자에게는 잘 알려져 있고 또한 실질적으로 널리 이용되고 있다.
본 발명은 하기 실시예로 보다 구체적으로 예시될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 단지 본 발명의 구현예이며 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
실시예 1
⑴ 세포주의 배양
전이 능력이 낮은 대장암 세포주인 사람 클론 A 와 MIP-101 및 전이 능력이 높은 대장암 세포주인 사람 CX-1 과 HT-29를(Edmiston et al., 1998) 다음과 같은 조건으로 배양하였다. 배양조건은 10% 소의 태아 혈청(fetal calf serum)을 첨가한 RPMI 1640(GIBCO-BRL, Richmond, USA)배지에 이산화탄소 5% 및 산소95%가 공급되는 상태의 37℃ 배양기에서 48시간 배양하였다. 배양 후에 배지를 제거하고 인산염 완충 염수(PBS)로 세척하여 각각의 세포를 수득하였다.
⑵ 세포의 용해
⑴ 에서 수득한 세포를 용해 완충액(lysis buffer)을 가하고 동결/해동을 5번 반복하여 용해시켰다. 사용된 용해 완충액의 조성은 50 mM 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES)-NaOH(pH 6.0), 100 mM NaCl, 0.5% 트리톤 X-100, 1 μg/ml 아프로티닌(aprotinin), 1 μg/ml 루펩틴(leupeptin), 10 mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)이며, 아르곤 가스로 1시간 버블링(bubbling)하여 산소를 제거한 후 세포에 가했다. 반응 후 20 mM의 β-머캅토에탄올을 가하여 반응을 중지시켰다.
⑶ Hsp 및 Bcl-2 단백질군 발현의 웨스턴 블럿 분석
⑵ 의 시료를 원심분리(4℃, 12000 rpm, 10분)하여 취한 상등액을 단백질 정량하고(Lowry. et al., 1951), 단백질을 5㎕ 취하여 13% SDS-PAGE 하고 쿠마시 블루(coomassie blue) 용액으로 염색하여 단백질 분리를 확인하였다. 또한, 상기와 동일한 양의 단백질을 취하여 13% SDS-PAGE 하고 트렌스-블럿 기구(BioRad, Richmond, USA)를 사용하여 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 막으로 단백질을 옮겼다. 단백질이 옮겨진 니트로셀룰로오스 막을 1% 소 혈청 알부민이 포함된 TBST[TBS(tris-buffered saline)-Tween 20]용액으로 1시간동안 블로킹시키고, 블로킹을 위해 사용된 용액을 제거하고 TBST 용액으로 막을 3회에 걸쳐 10분 간격으로 세척하였다. TBST 용액을 이용하여 적당한 농도로 희석시킨 Hsp 및 Bcl-2 단백질에 대한 항체(일차항체)를 4℃에서 1시간 처리하여 막에 옮겨진 Hsp 및 Bcl-2 단백질에 결합하도록 하였다. Hsp 단백질군의 발현을 확인하기 위해 단백질과 결합시킨 항체로서 Hsp110은 #385(Dr. John Subjeck, U.S.A.), Hsp70은 C92F3A-5(StressGen, Canada), Hsp90은 SPA-30(StressGen, Canada), Hsp60은 SPA-806(StressGen, Canada), 그리고 Hsp27은 SPA-801(StressGen, Canada)를 이용하였고, Bcl-2 단백질군의 발현을 확인하기 위해 결합시킨 항체로서 Bcl-2는 클론 124(Dako, Denmark), Bcl-XL은 YTH-2H2(Trivigen, USA), Bax는 sc7480(SantaCruz, USA), Bid는 sc6291(SantaCruz, USA), 그리고 Bad는 sc942 (SantaCruz, USA)를 이용하였다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 TBST 용액으로 막을 3회에 걸쳐 10분 간격으로 세척하였다. 항원-항체 반응이 일어난 것을 확인하기 위해 일차항체와 결합하는 이차항체로 호스래디쉬 퍼록시다아제(horseradish peroxidase)가 결합된 항-토끼 IgG를 처리하여 1시간 동안 반응시키고 TBST 용액으로 3회에 걸쳐 10분 간격으로 세척하였다. 그런 다음, TBS 용액으로 10분 동안 마지막 세척하였다. 세척한 막을 ECL 시스템을 이용하여 단백질의 발현을 확인하였다.
이의 결과는 도 1 및 도 2에 나타나 있다. 도 1에 나타낸 바와 같이 Hsp70 및 Hsp110의 발현 패턴이 전이 능력이 높은 대장암 세포인 사람 CX-1 과 HT-29에서 뚜렷하게 나타났다. 이를 제외한 다른 Hsp 단백질군의 발현 패턴은 4종류의 대장암 세포에서 차이점을 보이지 않았다.
또한, 도 2에 나타낸 바와 같이 Bcl-2의 발현 패턴은 Hsp70 및 Hsp110의 발현과는 달리 전이 능력이 낮은 대장암 세포인 사람 클론 A 와 MIP-101에서 뚜렷하게 나타났다. 이를 제외한 다른 Bcl-2 단백질군의 발현 패턴은 4종류의 대장암 세포에서 차이점을 보이지 않았다.
실시예 2
⑴ 대장암 조직의 적출 및 임상적 특징
실험군으로부터 81명의 환자에서 신선한 대장암 조직을 종양괴사가 없는 것으로 적출하였다. 단백질 발현의 분석을 비교하기 위해 대장암 조직과 인접한 정상 대장 조직도 적출하였다. 조직의 병리학적 확인은 인하대학교 의과대학 병리학교실에서 수행하였다. 실험군의 임상적 특징은 표 1에 나타내었다.
실험군의 임상적 특징
변 수 환자의 수(%)
나 이
50 미만 14(17.3)
50 이상 67(82.7)
성 별
남 성 39(48.1)
여 성 42(51.9)
초기 종양 부위
우측/좌측 결장, S상 결장 39(48.1)
직장 42(51.9)
초기 종양 크기
5㎝ 미만 23(28.4)
5㎝ 이상 58(71.6)
분화 정도
고도(Well) 29(35.9)
중간(Moderate) 37(45.7)
미약(Poor) 8(9.9)
점액성(Moderate) 7(8.6)
림프혈관 침투
음 성 37(45.7)
양 성 44(54.3)
신경주위 침투
음 성 58(71.6)
양 성 23(28.4)
국소적 림프절 전이
음 성 46(56.8)
양 성 35(43.2)
아스틀러-콜러의 변형 듀크스 병기
B 44(54.4)
C 24(29.6)
D 13(16.0)
⑵ Hsp70, Hsp110 및 Bcl-2 단백질 발현의 면역조직화학적 분석
Hsp70, Hsp110 및 Bcl-2 단백질의 발현 상태와 임상병리학적 지표(parameter)의 연관성을 조사하고, 상기 단백질의 발현 분포를 대장암 조직에서 광학현미경으로 관찰 및 각 단백질 사이의 연관성을 조사하기 위하여 면역조직화학반응을 실시하였다. ⑴의 방법으로 적출한 대장암 조직을 포르말린으로 고정하고 파라핀에 포매하였다. 포매된 조직은 인접한 정상 조직을 포함하여 차례로 5㎛ 두께로 절단하였다. 절단된 절편들을 시레인(silane)으로 코팅한 유리 슬라이드에 고정시킨 후 크실렌(xylene)으로 파라핀을 제거하고, 60% 에탄올에서 무수에탄올까지 저농도에서 고농도로 순으로 탈수하였다. 그런 다음, 10 mM 구연산나트륨 완충액(pH 6.0)에 넣어 단파(microwave) 오븐에서 가열하였다. 항원의 수복(retrieval)을 위하여, 슬라이드를 오븐에서 꺼낸 후 상온에서 30분간 두어 식혔다. 슬라이드를 증류수로 씻어낸 후, 퍼록시다아제 활성을 막기 위하여 0.3% 과산화수소가 포함된 메탄올에 30분간 처리하고 0.05M TBS(pH 7.6)으로 세척하였다. 절편들은 Hsp110에 대한 단클론항체 #385, Hsp70에 대한 단클론항체 C92F3A-5, 또는 Bcl-2에 대한 단클론항체 클론 124를 각각 처리하여 하룻밤 동안 반응시켰다. 항체가 처리된 절편들은 스트렙타빈 비오틴 면역퍼록시다아제(streptoavidine biotin immunoperoxidase) 염색시스템(LSAB kit, Dako, Milan, Italy)으로 반응시켰다. 반응산물을 3,3-디아미노벤지딘(3,3-diaminobenzidine, Dako) 발색시약으로 처리하여 확인하였다. 대조군은 각각에 대응하는 항체 대신에 정상 쥐의 면역글로불린 G를 사용하였다.
Hsp70, Hsp110 및 Bcl-2 단백질의 발현 상태와 임상병리학적 지표(parameter)의 연관성을 조사한 결과는 표 2, 표 3 및 표 4에 나타내었다. 표2에 나타낸 바와 같이 Hsp70의 발현은 81명의 환자 중에서 36명에서 발현 양성을 보였고, 대장암의 국소적 림프절 전이 양성반응(p=0.001)과 대장암의 진행성 정도(p=0.001)에서 통계적인 의의가 있음을 보였다. 이는 Hsp70 발현 양성과 대장암의 진행성 임상 정도가 연관성이 있음을 보여주는 것이다.
Hsp70 발현과 임상병리학적 지표와의 관계
변 수 환자의 수(%) 발현 상태(%) p-값
음 성 양 성
나 이
50 미만 14(17.3) 9(64.3) 5(35.7) 0.4701)
50 이상 67(82.7) 36(53.7) 31(46.3)
성 별
남 성 39(48.1) 21(53.8) 18(46.2) 0.7651)
여 성 42(51.9) 24(57.1) 18(42.9)
초기 종양 부위
우측/좌측 결장, S상 결장 39(48.1) 24(61.5) 15(38.5) 0.2961)
직장 42(51.9) 21(50.0) 21(50.0)
초기 종양 크기
5㎝ 미만 23(28.4) 10(43.5) 13(56.5) 0.1681)
5㎝ 이상 58(71.6) 35(60.3) 23(39.7)
분화 정도
고도(Well) 29(35.9) 12(41.4) 17(58.6) 0.4722)
중간(Moderate) 37(45.7) 25(67.6) 12(32.4)
미약(Poor) 8(9.9) 5(62.5) 3(37.5)
점액성(Moderate) 7(8.6) 3(42.9) 4(57.1)
림프혈관 침투
음 성 37(45.7) 24(64.9) 13(35.1) 0.1221)
양 성 44(54.3) 21(47.7) 23(52.3)
신경주위 침투
음 성 58(71.6) 34(58.6) 24(41.4) 0.3781)
양 성 23(28.4) 11(47.8) 12(52.3)
국소적 림프절 전이
음 성 46(56.8) 33(71.7) 13(28.3) 0.0011)*
양 성 35(43.2) 12(34.3) 23(65.7)
아스틀러-콜러의 변형 듀크스 병기
B 44(54.4) 32(72.7) 12(27.3) 0.0012)*
C 24(29.6) 9(37.5 15(62.5)
D 13(16.0) 4(30.8) 9(69.2)
1) 카이제곱(Chi-Square)분석
2) 선형결합에 의한 선형분석(linear by linear assoication)
*유의도(p)<0.05
표 3에 나타낸 바와 같이 Hsp110의 발현은 81명의 환자 중에서 37명에서 발현 양성을 보였고, 대장암의 국소적 림프절 전이 양성반응(p=0.024)과 대장암의 진행성 정도(p=0.001)에서 통계적인 의의가 있음을 보였다. 이는 Hsp110 발현 양성과 대장암의 진행성 임상 정도가 연관성이 있음을 보여주는 것이다.
Hsp110 발현과 임상병리학적 지표와의 관계
변 수 환자의 수(%) 발현 상태(%) p-값
음 성 양 성
나 이
50 미만 14(17.3) 9(64.3) 5(35.7) 0.4111)
50 이상 67(82.7) 35(52.2) 32(47.8)
성 별
남 성 39(48.1) 22(56.4) 17(43.6) 0.7161)
여 성 42(51.9) 22(52.4) 20(47.6)
초기 종양 부위
우측/좌측 결장, S상 결장 39(48.1) 27(64.3) 15(35.7) 0.0621)
직장 42(51.9) 17(43.6) 22(50.0)
초기 종양 크기
5㎝ 미만 23(28.4) 14(60.9) 9(39.1) 0.4561)
5㎝ 이상 58(71.6) 30(51.7) 28(48.3)
분화 정도
고도(Well) 29(35.9) 14(48.3) 15(51.7) 0.3442)
중간(Moderate) 37(45.7) 21(56.8) 16(43.2)
미약(Poor) 8(9.9) 4(50.0) 4(50.0)
점액성(Moderate) 7(8.6) 5(71.4) 2(28.6)
림프혈관 침투
음 성 37(45.7) 24(64.9) 13(35.1) 0.0811)
양 성 44(54.3) 20(45.5) 24(54.5)
신경주위 침투
음 성 58(71.6) 34(58.6) 24(41.4) 0.2171)
양 성 23(28.4) 10(43.5) 13(56.5)
국소적 림프절 전이
음 성 46(56.8) 30(65.2) 16(34.8) 0.0241)*
양 성 35(43.2) 14(40.0) 21(60.0)
아스틀러-콜러의 변형 듀크스 병기
B 44(54.4) 28(63.6) 16(36.4) 0.0332)*
C 24(29.6) 12(50.0) 12(50.0)
D 13(16.0) 4(30.8) 9(69.2)
1) 카이제곱(Chi-Square)분석
2) 선형결합에 의한 선형분석(linear by linear assoication)
*유의도(p)<0.05
표 4에 나타낸 바와 같이 Bcl-2의 발현은 81명의 환자 중에서 32명에서 발현 양성을 보였고, 대장암의 림프혈관 침투 음성반응(p=0.004), 대장암의 신경주의 침투 음성반응(p=0.039), 대장암의 국소적 림프절 전이 음성반응(p=0.008) 및 대장암의 초기 정도(p=0.000)에서 통계적인 의의가 있음을 보였다. 이는 Bcl-2 발현 양성과 대장암의 초기 임상 정도가 연관성이 있음을 보여주는 것이다.
Bcl-2 발현과 임상병리학적 지표와의 관계
변 수 환자의 수(%) 발현 상태(%) p-값
음 성 양 성
나 이
50 미만 14(17.3) 8(57.1) 6(42.9) 0.7781)
50 이상 67(82.7) 41(61.2) 26(38.8)
성 별
남 성 39(48.1) 22(56.4) 17(43.6) 0.4691)
여 성 42(51.9) 27(64.3) 15(35.7)
초기 종양 부위
우측/좌측 결장, S상 결장 39(48.1) 26(61.9) 16(38.1) 0.7871)
직장 42(51.9) 23(59.0) 16(41.0)
초기 종양 크기
5㎝ 미만 23(28.4) 16(69.6) 7(30.4) 0.2931)
5㎝ 이상 58(71.6) 33(56.9) 25(43.1)
분화 정도
고도(Well) 29(35.9) 19(65.5) 10(34.5) 0.8462)
중간(Moderate) 37(45.7) 20(54.1) 17(45.9)
미약(Poor) 8(9.9) 6(75.0) 2(25.0)
점액성(Moderate) 7(8.6) 4(57.1) 3(42.9)
림프혈관 침투
음 성 37(45.7) 16(43.3) 21(56.8) 0.0041)*
양 성 44(54.3) 33(75.0) 11(25.0)
신경주위 침투
음 성 58(71.6) 31(53.4) 27(46.6) 0.0391)*
양 성 23(28.4) 18(78.3) 5(21.7)
국소적 림프절 전이
음 성 46(56.8) 22(47.8) 24(52.2) 0.0081)*
양 성 35(43.2) 27(77.1) 8(22.8)
아스틀러-콜러의 변형 듀크스 병기
B 44(54.4) 19(43.2) 25(56.8) 0.0002)*
C 24(29.6) 18(75.0) 6(25.0)
D 13(16.0) 12(92.3) 1(7.7)
1) 카이제곱(Chi-Square)분석
2) 선형결합에 의한 선형분석(linear by linear assoication)
*유의도(p)<0.05
대장암 조직을 광학현미경으로 관찰한 결과는 도 3, 도 4 및 도 5에 나타내었다. 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이 Hsp70 및 Hsp110의 항원항체 반응은 대장 상피 세포에서 나타났고 Hsp70 및 Hsp110의 발현 분포는 세포질과 핵 모두에서 퍼져있는 형태를 보였다. 한편, Hsp70 및 Hsp110의 발현의 연관성을 조사한 결과, 뚜렷한 연관성은 보이지 않았다. 이는 상기 두 단백질이 진행성 임상 정도에 관련되어있지만 대장암의 진행에 있어서는 서로 다른 역할을 한다는 것을 의미한다. 이의 결과를 표 5에 나타내었다.
Hsp70 과 Hsp110과의 발현 관계
변 수 Hsp70(%) p-값
음 성 양 성
Hsp110
음 성 28(63.6) 16(36.4) 0.0851)
양 성 17(45.9) 20(54.1)
1) 카이제곱(Chi-Square)분석
*유의도(p)<0.05
한편, 도 5에 나타낸 바와 같이 Bcl-2의 항원항체 반응은 정상 대장 조직에서 줄기 세포의 증식이 일어나는 소낭의 기저에 있는 상피 세포에서 나타났고(화살표 표시), 정상 대장 세포의 표면 상피에는 Bcl-2의 항원항체 반응이 나타나지 않았다. 또한, 대장암 조직에서도 Bcl-2 발현이 관찰되었다. 이는 정상세포에서 증식하는 세포에서만(기저부분) 나타나는 Bcl-2 단백질이 대장암에서 분화한 상피세포에서도 발현이 된 것으로 암조직에서 정상적인 증식 조절이 잘못되어 있음을 나타내는 것이다. 한편 Bcl-2 및 Hsp70, Hsp110의 발현의 연관성을 조사한 결과, 대장암의 진행성 정도와 관련이 있는 Hsp70의 발현(표 2)과 대장암의 초기 임상 정도와 관련이 있는 Bcl-2 발현(표 4)이 반대로 연관되어 있음을 알 수 있었고 Hsp110의 발현과 Bcl-2 발현의 연관성도 나타났다. 이는 Hsp 단백질과 Bcl-2 단백질사이에 기능적인 관계가 있다는 것을 의미한다. 이의 결과를 표 6에 나타내었다.
Hsp70 및 Hsp110 발현에 대한 Bcl-2와의 발현 관계
변 수 Bcl-2(%) p-값
음 성 양 성
Hsp70
음 성 22(48.9) 23(51.1) 0.0151)
양 성 27(75.0) 9(25.0)
Hsp110
음 성 23(52.3) 21(47.7) 0.0771)
양 성 26(70.3) 11(29.7)
1) 카이제곱(Chi-Square)분석
*유의도(p)<0.05
본 발명은 동물로부터 분리된 고형암 시편에서 Hsp 단백질과 Bcl-2 단백질의 수준을 검정하여 상기 단백질의 발현정도에 따라 고형암의 진행상태를 판정하는 진단방법 및 키트에 관한 것으로서 사람을 포함한 포유동물의 고형암을 진단하는데 유용 될 수 있다.

Claims (8)

  1. 동물로부터 분리된 고형암 시편에서 채취한 시료중에서 Hsp 단백질과 Bcl-2 단백질의 상대적 양을 검정할 수 있도록 양 단백질에 대한 항체를 포함함을 특징으로 하여 고형암의 진행 정도를 진단하는 키트.
  2. 제 1항에 있어서, 키트가 측방 유동 스트립인 키트.
  3. 제 2항에 있어서, 스트립은 제 1시험선이 Hsp 단백질에 대한 항체를 포함하고, 제 2시험선이 Bcl-2 단백질에 대한 항체를 포함함을 특징으로 하는 키트.
  4. 제 1항에 있어서, 고형암이 폐암, 뇌암, 간암, 유방암, 난소암 또는 대장암인 키트.
  5. 제 4항에 있어서, 고형암이 대장암인 키트.
  6. 제 1항에 있어서, Hsp 단백질이 Hsp70 또는 Hsp110인 키트.
  7. 제 1항에 있어서, 동물이 사람인 키트.
  8. 동물로부터 분리된 고형암 시편에서 Hsp 단백질과 Bcl-2 단백질의 수준을 검정하고, Hsp 단백질 수준이 높은 경우 진행성암으로 판정하고 반대로 Bcl-2 단백질의 수준이 높은 경우 조기암으로 판정함을 특징으로 하여, 고형암의 진행 정도를 진단하는 방법.
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