CN108732354A

CN108732354A - Rcan1.4作为诊断肝细胞癌的诊断标志物的应用

Info

Publication number: CN108732354A
Application number: CN201710243852.7A
Authority: CN
Inventors: 覃文新; 金浩杰; 王存; 汪惠; 吕远远
Original assignee: Shanghai Cancer Institute
Current assignee: Shanghai Cancer Institute
Priority date: 2017-04-14
Filing date: 2017-04-14
Publication date: 2018-11-02

Abstract

本发明涉及RCAN1.4作为诊断肝细胞癌的诊断标志物的应用。本发明公开了一种新型肝癌诊断和预后标志物，所述标志物是RCAN1.4，其可以作为肝癌病人的独立预后指标。本发明为临床上诊断肝癌和判断预后提供了一种灵敏度更高、特异性更强的方法。

Description

RCAN1.4作为诊断肝细胞癌的诊断标志物的应用

技术领域

本发明属于诊断标志领域，更具体地，本发明涉及RCAN1.4作为诊断肝细胞癌的诊断标志物的应用。

背景技术

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC，简称肝癌)是严重威胁人类健康的恶性疾病之一，全球范围内其死亡率在男性中位居第二，在女性中位居第五。世界卫生组织发表的《全球癌症报告2014》显示，中国新增癌症病例高居世界第一位，其中肝癌的新增病例和死亡人数均居世界首位。目前，中国肝癌的发病率约为25.7/10万，成为死亡率仅次于胃癌、肺癌的第三大恶性肿瘤。肝癌早期诊治较难，病情进展快且预后差。虽然肝癌的检测和治疗水平在近几十年有了一定的提高，但目前其主要治疗方法依然是手术切除，且肝癌患者的5年存活率依旧很低。因此，迫切需要发现新的肝癌诊断和预后标志物；

目前临床上对于癌前病变的不典型增生结节(dysplastic nodule，DN)与早期肝细胞肝癌(early HCC，eHCC)的鉴别诊断非常困难。主要依靠影像学诊断或病理学者的HE染色切片的镜下诊断。此外，目前主要有几种分子标志物如热休克蛋白70(Heat shockprotein 70，HSP70)，磷脂酰肌醇聚糖3(Glypican3，GPC3)、谷氨酰氨合成酶(Glutaminesynthetase，GS)、网格蛋白重链(Clathrin heavy chain，CHC)、zeste同源分子2增强子(Enhancer of zeste homologue 2，EZH2)和CD34等用于病理学免疫组化染色鉴别诊断DN和eHCC，但这些分子的诊断效率均不够理想。

钙调磷酸酶调节蛋白1(Regulator of calcineurin 1，RCAN1)是钙调神经磷酸酶(Calcineurin，CaN)的一类内源性调节因子，最早发现于唐氏综合症关键区域1(DownSyndrome Critical Region，DSCR1)的q22.12区域。RCAN1基因组有7个外显子，分别被6个内含子隔开，其中外显子1-4可被选择性剪切产生4种不同的mRNA转录产物。研究发现，在哺乳动物组织中只能检测到其中三种选择性剪接体的mRNA表达产物，且绝大多数转录产物都是以外显子1(RCAN1.1)或外显子4(RCAN1.4)起始。RCAN1的表达具有组织特异性：RCAN1.1大量表达于心脏、大脑、肌肉和胰腺中；RCAN1.2只表达于胎儿肝脏和大脑中；而RCAN1.4主要表达于心脏、肝脏、肌肉、胎盘、胰腺和肾脏中。RCAN1.4蛋白包含197个氨基酸，主要通过与CaN的调节亚基结合，调节CaN的活性进而影响下游信号通路和靶基因的表达。

然而，目前的现有技术中，对于RCAN1.4与肝细胞癌的相关性，尚无任何报道。

发明内容

本发明的目的在于提供RCAN1.4作为诊断肝细胞癌的诊断标志物的应用。

在本发明的第一方面，提供RCAN1.4蛋白或其编码基因在制备诊断肝细胞癌的诊断试剂或试剂盒中的用途。

在一个优选例中，所述的细胞癌是：早期肝细胞癌。

在本发明的另一方面，提供RCAN1.4蛋白或其编码基因在制备对肝细胞癌患者进行预后的试剂或试剂盒中的用途。

在一个优选例中，所述的诊断试剂选自：

特异性扩增RCAN1.4蛋白的编码基因的引物；或

特异性识别RCAN1.4蛋白的编码基因或其转录本的探针；或

特异性抗RCAN1.4蛋白的抗体。

在另一优选例中，所述的特异性扩增RCAN1.4蛋白的编码基因的引物是引物对。

在另一优选例中，所述的特异性抗RCAN1.4蛋白的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

在本发明的另一方面，提供一种用于诊断肝细胞癌或用于对肝细胞癌患者进行预后的试剂盒，所述的试剂盒中含有：检测RCAN1.4蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂。

在一个优选例中，所述的检测RCAN1.4蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂选自：

特异性扩增RCAN1.4蛋白的编码基因的引物；或

特异性识别RCAN1.4蛋白的编码基因或其转录本的探针；或

特异性抗RCAN1.4蛋白的抗体。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：

核酸抽提试剂；和/或

聚合酶链反应试剂；和/或

蛋白免疫印迹试剂；和/或

酶链免疫反应试剂。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：说明该试剂盒的使用方法的使用说明书。

在本发明的另一方面，提供一种测定肝细胞癌的方法，所述方法包括：检测待测样品中的RCAN1.4蛋白或其编码基因的表达情况或表达量，若结果显示RCAN1.4蛋白或其编码基因的表达量显著低于(为统计学上低于，如低10％或更低，较佳地20％或更低，更佳地低30％或更低)对照，则该待测样品的提供者为肝细胞癌高危或为肝细胞癌患者；其中，所述的对照是正常肝组织样品，或癌旁组织样品。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、RCAN1.4在正常肝组织、肝硬组织、不典型增生结节组织和早期肝癌组织的差异表达。

图2、RCAN1.4在肝癌组织及配对癌旁肝组织中的差异表达。

图3、分析RCAN1.4与肝癌患者预后的关系。

(A)免疫组化检测RCAN1.4在肝癌组织芯片中的表达情况(n＝196)，从左到右依次为；强阳性(IRS:9～12分)、中度阳性(IRS:6～8分)、弱阳性(IRS:2～4分)和阴性(IRS:0～1分)；

(B)分析RCAN1.4与肝癌患者生存(OS)的关系；

(C)分析RCAN1.4与肝癌患者复发(TTR)的关系。其中RCAN1.4^low包括阴性和弱阳性病例，RCAN1.4^high包括中度阳性和强阳性病例。

具体实施方式

本发明公开了一种新型肝癌诊断和预后标志物，所述标志物是RCAN1.4。本发明人通过免疫组织化学检测肝癌组织芯片发现，RCAN1.4蛋白在肝癌发生发展过程中逐渐降低，特别是在肝细胞不典型增生结节组织和早期肝癌中有显著的表达差异；对196例肝癌病例进行RCAN1.4检测，并结合临床数据分析显示：RCAN1.4蛋白低表达患者生存时间和复发时间都显著缩短，可以作为肝癌病人的独立预后指标。本发明的诊断和预后标志物，为临床上诊断肝癌和判断预后提供了一种灵敏度更高、特异性更强的新的诊断手段。

如本文所用，“早期肝细胞癌”是按照巴塞罗那临床肝癌标准(Barcelona ClinicLiver Cancer，BCLC)0+A级的肝细胞癌。

在本发明中，术语“RCAN1.4蛋白”的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的蛋白序列基本上相同，也包括RCAN1.4蛋白的同源蛋白。

在本发明中，术语“RCAN1.4蛋白的编码基因”的核苷酸序列与SEQ ID NO:1的核苷酸序列基本上相同或其简并的变异体，也包括RCAN1.4基因的同源基因。

目前临床上，肝癌主要分为以下几类：(1)肝细胞癌，起源于肝细胞的恶性肿瘤；(2)胆管癌，起源于肝内外胆管上皮细胞的恶性肿瘤，约占原发性肝癌的20％，近年来发病率逐年升高；(3)混合性原发性肝癌，同一肝癌肿块内，肝细胞癌与胆管细胞癌并行；(4)肝血管瘤，较为常见的肝脏良性肿瘤，占肝良性肿瘤的5-20％；(5)肝腺瘤：在肝脏良性肿瘤中，其发病率仅次于肝血管瘤，发病机理可能与性内分泌紊乱有关，主要发于女性；(6)肝脏局灶性结节性增生，肝脏良性病变，发病原因暂不清；(7)肝类癌，恶性肿瘤原发性肝类癌较少见，继发性肝类癌主要有消化道等脏器的类癌转移所致，较常见；(8)肝母细胞瘤：一种具有多种分化方式的恶性胚胎性肿瘤，是儿童中最常见的肝肿瘤；(9)转移性肝癌：原发灶在身体其它部位，转移至肝生长的恶性肿瘤。此外，还有慢性肝病(例如肝炎、肝硬化)也表现为肝部不适，易于被诊断为肝癌。根据以上肝癌以及肝病的特点可知，在临床上肝癌存在复杂性，如何进行区分认定、提高临床诊断准确性是人们亟待解决的问题，临床上非常需要能够准确诊断肝细胞癌，特别是早期肝细胞癌的标志物。临床上，AFP尽管已经被作为一种经典的肝癌标志物，但其却不能够完全解决临床上准确细分、诊断的难题，误诊率居高不下。

基于本发明人的新发现，可以以RCAN1.4蛋白或其编码基因作为测定肝细胞癌，特别是作为检测早期肝细胞癌的标志物(标记物)或作为肝细胞癌患者的预后标志物。通过分析待测样品(样本)中RCAN1.4蛋白或其编码基因的表达情况，从而得知受试者的患病状况，为疾病的诊断或预后提供依据。所述的待测样品或待测样本是患者的组织切片。

可采用各种技术来检测RCAN1.4的表达情况，这些技术均包含在本发明中。检测核酸可用的已有技术如(但不限于)：基因芯片技术、探针杂交技术、聚合酶链反应(PCR)、Northern Blot等方法。检测蛋白可借助于质谱分析仪器等，或可通过Western Blot或ELISA等方法，或可通过免疫组化，免疫沉淀等方法。

作为本发明的一种选择方式，通过定量或半定量的聚合酶链反应(PCR)法来分析样品中RCAN1.4基因的表达情况以及表达量，从而可做出判断。较佳地，通过实时定量PCR实现检测。

作为本发明的更优选的选择方式，通过免疫组化的方法，利用抗RCAN1.4蛋白的抗体来分析样品中RCAN1.4蛋白的表达情况以及表达量，从而可作出判断。

基于本发明的新发现，本发明还提供了特异性识别RCAN1.4蛋白或其编码基因的试剂。任何可识别RCAN1.4蛋白或其编码基因的试剂均包含在本发明中，用作检测肝细胞癌，尤其是早期肝细胞癌的标志物(标记物)。所述的特异性识别RCAN1.4蛋白或其编码基因的试剂例如是：特异性扩增RCAN1.4蛋白的编码基因的引物；或特异性识别RCAN1.4蛋白的编码基因或其转录本的探针；或特异性抗RCAN1.4蛋白的抗体。

本发明还提供了一种特异性识别RCAN1.4蛋白或其编码基因的试剂的用途，用于检测肝细胞癌，尤其是早期肝细胞癌。

作为本发明的一种实施方式，所述的试剂是抗RCAN1.4的抗体；更特别的例如是单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的抗原可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生，所述的动物如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。

所述的抗体可用于免疫化学技术中，检测标本中的RCAN1.4水平，从而用于诊断肝细胞癌，尤其是早期肝细胞癌或判断患病风险(易感性)；或用于对肝细胞癌患者进行预后。

作为本发明的另一种实施方式，所述的试剂是特异性扩增RCAN1.4基因的引物，在得知了RCAN1.4的核苷酸序列后，本领域技术人员通常易于基于此设计出引物。

也可利用基因芯片技术来进行RCAN1.4的检测。在得知了RCAN1.4的核苷酸序列后，人们易于基于此设计出探针。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后点样仪将其点在修饰玻片或硅片，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的基因芯片。如果寡核苷酸探针不含氨基修饰，则其制备方法也可参照现有公知技术。

利用所述的抗体、探针或引物，可以检测体液中RCAN1.4的水平，因而可用于检测肝细胞癌，尤其是早期肝细胞癌，可用于预测早期肝细胞癌的发生，或用于对肝细胞癌患者进行预后，或者用于制备临床检测制剂或试剂盒等。

尽管RCAN1.4已经证明可以作为独立的指标应用于早期肝癌的诊断或肝癌的预后。然而，在应用于临床时，还可以将其与其它的肝癌诊断标志物联合应用于诊断或预后。所述的其它的肝癌诊断标志物例如但不限于：甲胎蛋白(AFP)等。

本发明还提供了用于检测肝细胞癌(尤其是早期肝细胞癌)或用于对肝细胞癌患者进行预后的试剂盒，该试剂盒包括：特异性识别RCAN1.4蛋白或其编码基因的试剂。所述的特异性识别RCAN1.4蛋白或其编码基因的试剂例如是：特异性扩增RCAN1.4蛋白的编码基因的引物；或特异性识别RCAN1.4蛋白的编码基因或其转录本的探针；或特异性抗RCAN1.4蛋白的抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)。所述的特异性识别AFP蛋白或其编码基因的试剂例如是：特异性扩增AFP蛋白的编码基因的引物；或特异性识别AFP蛋白的编码基因或其转录本的探针；或特异性抗AFP蛋白的抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)。

所述的试剂盒中还可含有：核酸抽提试剂(如核酸抽提液)；和/或聚合酶链反应试剂(如dNTP，Taq酶)；和/或蛋白免疫印迹试剂；和/或酶链免疫反应试剂(如显色液或杂交液)。

作为一种优选方式，所述的试剂盒中还可含有：用于免疫化学分析的试剂，所述的试剂例如：第二抗体、染色剂、显色剂等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书等。

更具体地，所述的试剂盒可以是一种基于酶联免疫反应(ELISA)技术的试剂盒。ELISA技术以及基于该技术的检测试剂对于本领域的技术人员来说是显而易见的。

作为另一种优选方式，所述的试剂盒中还可含有：(A)各种PCR反应用试剂，例如但不限于：Taq酶，PCR缓冲液，dNTP，DNA聚合酶等；或(B)各种提取DNA或RNA(即制备PCR反应模板)所需的试剂，例如但不限于：酚、氯仿、异戊醇、NaCl等；或(C)提取DNA或RNA的试剂盒。

所述的特异性识别RCAN1.4蛋白或其编码基因的试剂也可固定于试纸上，制备成免疫胶体金试纸或类似检测材料。

此外，所述的试剂盒中还可含有本发明的试剂盒的使用说明书和/或标准操作程序。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

I.材料和方法

临床组织样品的收集

组织芯片采用的肝组织样本均来源于东方肝胆外科医院自1996年至2011年接受外科治疗的患者，经相关医院伦理委员会同意。且各个病例的病理标本HE染色切片均经过东方肝胆外科医院病理科的专业人员核对。标本离体后经甲醛固定、石蜡包埋和病理证实。93对人原发性肝癌患者的癌组织(Cancerous tissues from human hepatocellularcarcinomas,简称C)及癌旁肝组织(Non-cancerous liver tissues,简称N)标本于2000年至2003年期间收集自中国上海东方肝胆医院。36例正常肝组织、36例肝硬化组织、36例肝不典型增生组织、36例早期肝癌组织于2005年至2011年期间收集中国上海东方肝胆医院。196例肝癌组织样本于1996年至2001年期间收集中国上海东方肝胆医院。

免疫组化染色

1.烤片：取已构建好的肝癌组织芯片，置于60℃的烤箱中烤片0.5小时；

2.脱蜡：将组织芯片放入二甲苯I、二甲苯II、二甲苯III中各5分钟；

3.水化：100％乙醇→90％乙醇→80％乙醇→70％乙醇，各5分钟；

4.洗涤：自来水冲洗约0.5分钟，PBS洗3次，每次5分钟；

5.抗原修复：将组织芯片放入柠檬酸抗原修复液中，微波炉中火煮沸3分钟；

6.洗涤：白片冷却约1小时后，用PBS洗3次，每次5分钟；

7.封闭：3％H₂O₂阻断30分钟，室温下用含5％山羊血清封闭1小时，PBS冲洗3次，每次5分钟；

8.RCAN1.4一抗(美国Sigma-Aldrich公司)孵育：加入一抗，4℃过夜；PBS洗3次，每次5分钟；

9.二抗(抗鼠兔通用HRP二抗，获自上海基因公司)孵育：加入二抗，室温孵育1小时；

10.显色：PBS洗3次，每次5分钟，洗去二抗，DAB显色；

11.终止：显微镜下观察，自来水冲洗以终止反应；

12.复染：苏木素复染细胞核2分钟，洗去苏木素；

13.分化：0.5％盐酸酒精分化2～3秒钟；

14.拍照：自来水冲洗0.5小时后，封片拍照。

根据免疫反应积分(IRS)打分法对免疫组化结果进行评分。IRS打分法采用的是染色强度(SI)和阳性细胞百分比(PP)的积分，即IRS＝SI×PP。SI分为4级，即0级为阴性，1级弱阳性，2级中等阳性，3级强阳性。PP分为5级，即0级为阳性的细胞数<5％，1级为5～25％，2级为25～50％，3级为50～75％，4级为＞75％。当SI与PP的乘积＞4分时算免疫反应。采用Image pro plus 6.0软件分析免疫组化图片，进行光密度校正，调出count/size窗口，选择测量项目累积光密度(IOD)，测量图片中阳性染色区域的IOD值。采用SPSS16.0软件进行统计学分析，用GraphPad Prism 5软件制图。

后续实施例中，RCAN1.4^low包括阴性(IRS:0～1分)和弱阳性(IRS:2～4分)病例，RCAN1.4^high包括中度阳性(IRS:6～8分)和强阳性(IRS:9～12分)病例。

II.实施例

实施例1、早期诊断分子的确定

本实施例中，通过对东方肝胆医院收集的36例正常肝组织(Normal livertissues,NL)、36例肝硬化组织(Liver cirrhosis,LC)、36例肝不典型增生组织(Dysplastic nodules,DN)、36例早期肝癌组织(early HCC,eHCC)进行免疫组化染色，检测在肝癌发生发展过程中的不同阶段，RCAN1.4的表达变化，分析RCAN1.4能否作为eHCC的早期诊断分子。

免疫组化结果显示，相比正常肝组织，RCAN1.4在DN和eHCC中显著表达下调；相比DN，RCAN1.4在eHCC中表达量进一步更显著地下调，如图1。

以上结果均证明，RCAN1.4可以有效地为eHCC的发生提供预警，针对RCAN1.4的检测可实现肝癌的早期诊断。

实施例2、早期诊断分子的进一步验证

本实施例中，通过对东方肝胆医院收集的93对肝癌组织及配对癌旁肝组织进行免疫组化染色，进一步从组织学水平验证RCAN1.4在肝癌组织中的表达变化。

免疫组化结果显示，相比癌旁组织，RCAN1.4在肝癌组织中显著表达下调，该队列中低表达的病例数占86.0％(80/93)，如图2。

以上结果证明，RCAN1.4可以作为肝癌诊断的潜在标志分子。

实施例3、RCAN1.4可以作为肝癌患者预后的独立指标

RCAN1.4在肝癌组织中的表达分为阴性(IRS:0～1分)、弱阳性(IRS:2～4分)、中度阳性(IRS:6～8分)、强阳性(IRS:9～12分)。

本实施例中，对包含196例肝癌样本的肿瘤组织芯片进行RCAN1.4免疫组化检测。并且，分析RCAN1.4表达水平与肝癌患者预后的关系。

结果显示，RCAN1.4低表达肝癌患者(RCAN1.4^low)的术后生存率明显低于RCAN1.4高表达肝癌患者(RCAN1.4^high)，而复发率则明显高于RCAN1.4高表达肝癌患者，如图3(A，B)。其中RCAN1.4^low包括阴性和弱阳性病例，RCAN1.4^high包括中度阳性和强阳性病例。

单因素生存分析患者总体存活率(OS)发现，与肝癌患者术后OS相关的因素有血清AFP水平、TNM分期、肿瘤数目、脉管侵犯以及RCAN1.4的表达水平；多因素Cox分析发现，仅有血清AFP水平以及RCAN1.4的表达水平2项指标可独立评估肝癌患者的OS。同时，单因素分析患者复发(TTR)情况发现，TNM分期、肿瘤数目以及RCAN1.4的表达与肝癌患者的复发相关；而多因素Cox分析结果则表明，仅有RCAN1.4的表达水平1项指标可独立评估肝癌患者的复发情况，如表1。

以上结果证明，RCAN1.4可以作为肝癌患者预后的独立指标。

表1.单因素及多因素Cox生存分析

注：NA，未纳入；^aLog-rank test；^bCox模型。

实施例4、检测试剂盒的临床应用

获得5位临床患者的肝癌组织，如前所述方法制备免疫组化样本(组织芯片)，以及进行免疫组化检测。

结合RCAN1.4的表达水平，去预测患者的预后；RCAN1.4的表达水平的高低的判断方式同实施例3。

结果如下：

3位患者RCAN1.4低表达(RCAN1.4^low)，预后为高死亡率、高复发率；建议后续进行积极检查和治疗。

2位患者RCAN1.4高表达(RCAN1.4^high)，预后为低死亡率、低复发率；预后较为乐观，但需定期回访检查，必要时进行治疗。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海市肿瘤研究所

<120> RCAN1.4作为诊断肝细胞癌的诊断标志物的应用

<130> 172541

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 594

<212> DNA

<213> 智人(Homo Sapiens)

<400> 1

atgcatttta gaaactttaa ctacagtttt agctccctga ttgcctgtgt ggcaaacagt 60

gatatcttca gcgaaagtga aaccagggcc aaatttgagt ccctctttag gacgtatgac 120

aaggacatca cctttcagta ttttaagagc ttcaaacgag tcagaataaa cttcagcaac 180

cccttctccg cagcagatgc caggctccag ctgcataaga ctgagtttct gggaaaggaa 240

atgaagttat attttgctca gaccttacac ataggaagct cacacctggc tccgccaaat 300

ccagacaagc agtttctgat ctcccctccc gcctctccgc cagtgggatg gaaacaagtg 360

gaagatgcga ccccagtcat aaactatgat ctcttatatg ccatctccaa gctggggcca 420

ggggaaaagt atgaattgca cgcagcgact gacaccactc ccagcgtggt ggtccatgta 480

tgtgagagtg atcaagagaa ggaggaagaa gaggaaatgg aaagaatgag gagacctaag 540

ccaaaaatta tccagaccag gaggccggag tacacgccga tccacctcag ctga 594

<210> 2

<211> 197

<212> PRT

<213> 智人(Homo Sapiens)

<400> 2

Met His Phe Arg Asn Phe Asn Tyr Ser Phe Ser Ser Leu Ile Ala Cys

1 5 10 15

Val Ala Asn Ser Asp Ile Phe Ser Glu Ser Glu Thr Arg Ala Lys Phe

20 25 30

Glu Ser Leu Phe Arg Thr Tyr Asp Lys Asp Ile Thr Phe Gln Tyr Phe

35 40 45

Lys Ser Phe Lys Arg Val Arg Ile Asn Phe Ser Asn Pro Phe Ser Ala

50 55 60

Ala Asp Ala Arg Leu Gln Leu His Lys Thr Glu Phe Leu Gly Lys Glu

65 70 75 80

Met Lys Leu Tyr Phe Ala Gln Thr Leu His Ile Gly Ser Ser His Leu

85 90 95

Ala Pro Pro Asn Pro Asp Lys Gln Phe Leu Ile Ser Pro Pro Ala Ser

100 105 110

Pro Pro Val Gly Trp Lys Gln Val Glu Asp Ala Thr Pro Val Ile Asn

115 120 125

Tyr Asp Leu Leu Tyr Ala Ile Ser Lys Leu Gly Pro Gly Glu Lys Tyr

130 135 140

Glu Leu His Ala Ala Thr Asp Thr Thr Pro Ser Val Val Val His Val

145 150 155 160

Cys Glu Ser Asp Gln Glu Lys Glu Glu Glu Glu Glu Met Glu Arg Met

165 170 175

Arg Arg Pro Lys Pro Lys Ile Ile Gln Thr Arg Arg Pro Glu Tyr Thr

180 185 190

Pro Ile His Leu Ser

195

Claims

1.RCAN1.4蛋白或其编码基因在制备诊断肝细胞癌的诊断试剂或试剂盒中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的细胞癌是：早期肝细胞癌。

3.RCAN1.4蛋白或其编码基因在制备对肝细胞癌患者进行预后的试剂或试剂盒中的用途。

4.如权利要求1～3任一所述的用途，其特征在于，所述的诊断试剂选自：

特异性扩增RCAN1.4蛋白的编码基因的引物；或

特异性识别RCAN1.4蛋白的编码基因或其转录本的探针；或

特异性抗RCAN1.4蛋白的抗体。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的特异性扩增RCAN1.4蛋白的编码基因的引物是引物对。

6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的特异性抗RCAN1.4蛋白的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

7.一种用于诊断肝细胞癌或用于对肝细胞癌患者进行预后的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有：检测RCAN1.4蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测RCAN1.4蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂选自：

特异性扩增RCAN1.4蛋白的编码基因的引物；或

特异性识别RCAN1.4蛋白的编码基因或其转录本的探针；或

特异性抗RCAN1.4蛋白的抗体。

9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，其中还包括：

核酸抽提试剂；和/或

聚合酶链反应试剂；和/或

蛋白免疫印迹试剂；和/或

酶链免疫反应试剂。

10.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，其中还包括：说明该试剂盒的使用方法的使用说明书。