KR20040039597A

KR20040039597A - 인간 ｈｃｃｒ-1 단백질 검출 방법 및 이를 이용한 간암진단키트

Info

Publication number: KR20040039597A
Application number: KR1020020067716A
Authority: KR
Inventors: 김진우
Original assignee: 김진우
Priority date: 2002-11-04
Filing date: 2002-11-04
Publication date: 2004-05-12

Abstract

본 발명은 인간 원암유전자 HCCR-1로부터 발현된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 항원-항체 결합반응으로 검체 시료 중의 HCCR-1 단백질을 검출하는 방법 및 이를 이용한 간암 진단키트에 관한 것으로, 본 발명의 HCCR-1 특이적인 항체를 이용한 검출방법 및 진단키트는 기존의 AFP (alpha-fetoprotein) 검사법보다 진단의 정확도 및 재현성이 높아 간암의 조기진단 및 소간암의 진단에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인간 ＨＣＣＲ-1 단백질 검출 방법 및 이를 이용한 간암 진단키트{METHOD FOR DETECTING HUMAN HCCR-1 PROTEIN AND A KIT FOR DIAGNOSING LIVER CANCER USING SAME}

본 발명은 인간 원암유전자 HCCR-1로부터 발현된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 항원-항체 결합반응으로 검체 시료중의 HCCR-1 단백질을 검출하는 방법 및 이를 이용한 간암 진단키트에 관한 것이다.

우리나라의 간암 발생률은 10만 명당 남자는 27.7명, 여자는 7.7명 정도로 남자에게서는 위암, 폐암 다음으로 높은 발생률을 보이며 여자에게서는 위암, 자궁암, 폐암 다음으로 높은 발생률을 보이고 있다. 간암에 의한 사망률도 사망원인이 국제보건통계연감에 발표되고 있는 OECD 21개국 중 최고라는 불명예를 갖고 있다.

한국인 간암의 특징은 간암환자의 평균 연령이 50대로 위암, 폐암 등의 다른 암에 비해 낮고, 간암환자의 약 75%가 B형 간염 바이러스를, 약 20%가 C형 간염 바이러스를 보유하고 있으며, 40세 이상의 남자에게서 흔히 발생한다는 것이다. 그 외에도 조기 발견율이 매우 낮고 치료성적이 좋지 않다는 특징이 있다.

전체적으로 간암 환자들의 평균 생존기간은 2 내지 4개월로 예후가 매우 불량하다. 그러나, 간암 환자들의 예후는 매우 다양해서 병명이 같다고 해서 모두동일하게 취급되어서는 안되며 연령, 성별, 전신상태, 암의 크기와 유형, 간기능 정도에 따라 판단해야 한다.

우리나라의 경우에는 진단 당시 종양의 크기가 매우 커 전체적인 예후가 불량하므로 간암 환자의 생존율을 향상시키기 위하여 가장 중요한 일은 간암의 발생 가능성이 높은 환자들에서 정기적인 검사를 통해 조기에 간암을 발견하는 것이다.

간암이 잘 발생하는 사람들을 소위 '간암의 고위험군'이라고 부르는데, 일반적으로 간암과 연관된 위험인자에는 생리적 인자와 병리적 인자가 있다. 생리적 인자로는 연령, 성별, 인종 등이 있고 병리적 인자로는 B형 간염, C형 간염, 알콜, 아플라톡신, 드문 대사성 질환, 성호르몬, 화학물질과 간경변증 등이 있다. 우리나라에서 '간암의 고위험군'에 속하는 사람들은 우선 40세 이상의 남자로서 원인에 관계없이 모든 간경변증 환자, 만성 바이러스성 간염 환자 (B형 및 C형), 만성 B형 간염 바이러스 보유자, 간암으로 수술 받은 적이 있는 사람, 가족 중에 간암을 앓은 적이 있는 사람, 아플라톡신을 많이 섭취하는 사람, 우리나라에서는 드물지만 혈색소증 환자 등이 있다. '간암의 고위험군'에 속하는 사람들은 정기적으로 간암의 조기발견을 위한 선별검사를 받는 것이 중요한데, 이는 만일 간암이 생기더라도 치료가 가능한 상태, 즉 소간암의 상태로 발견될 수 있고, 현재까지 알려진 간암의 예방법을 적절히 시행하면 간암을 예방할 수 있기 때문이다.

이와 같이 간암의 조기발견을 위한 선별검사 중 하나인 혈청 알파-태아단백 (alpha-fetoprotein; AFP) 수치는 정상 성인의 혈청에는 존재하지 않지만 많은 간암 환자에게서 수치가 증가되기 때문에 간암 진단에 유용하게 이용되고 있다. 그러나, 이는 간암 외에 만성간염, 간경변증 등의 양성질환이나 융모막암종, 간모세포종 등의 악성질환 및 임산부에서도 증가될 수 있다. 반대로 조기 간암에서는 AFP의 수치가 정상인 경우도 흔히 나타나고 있어 AFP는 간암의 조기진단에 유용하지 않다는 보고도 있다 (Collier J and Sherman M,Hepatology27:273-278, 1998; Okuda K,J. Hepatol.32(1 Suppl):225-237, 2000). 즉, 간암을 동반하지 않은 만성 간염과 간경변증 환자의 일부에서는 혈청 AFP 수치가 비특이적으로 상승될 수 있으며, 간암 환자들 중 약 50%에서는 정상 수준을 나타낼 뿐만 아니라 직경 2 ㎝ 미만의 소간암에서는 80% 이상이 정상인과 비교가 불가능하다는 점이 문제점으로 지적되고 있다.

간암 환자의 AFP 수치에 대한 연구를 보면 5 ㎝ 이하 간암의 46.2%에서 정상 수치를 보였다는 보고도 있고, 5 ㎝ 이하 간암의 25.5%에서 정상 수치를 보였는데 그 중 3 ㎝ 이하에서는 34.8%가 정상이었다는 보고도 있다 (Collier J and Sherman M,Hepatology27:273-278, 1998; Okuda K,J. Hepatol.32(1 Suppl):225-237, 2000). 이런 이유 때문에 AFP는 만성 간질환 환자의 간암 선별을 위해 꼭 필요한 검사이지만, 그 수치를 해석하여 간암 여부를 진단할 때는 고려해야 할 사항들이 많다. 따라서, 기존의 AFP 검사법에 비하여 민감도와 특이도가 보다 높은 새로운 혈청학적 검사방법이 개발되어야 한다.

이러한 연구의 일환으로, 최근 AFP의 당연쇄구조에 따라 아형 (subtype)별로 렉틴-반응성 분획 (Lectin-reactive fraction)이 다른 것이 밝혀졌는데, 이중 AFP-L3 분획이 간암에 보다 특이적인 아형 (subtype)임이 알려지게 되었고, 이를 검사함으로써 기존의 AFP 검사법에 비하여 보다 더 특이하게 간암을 진단할 수 있다고 보고되고 있으나 (Okuno M et al.,J. Gastroenterol. Hepatol.16(12):1329-1335, 2001), 이 방법 역시 아직도 임상적 진단에 한계가 있어 그 효과를 확신할 수 없다.

이외에도, 비타민 K가 결핍된 상태에서 생성되는 이상 프로트롬빈 (prothrombin)인 PIVKA-Ⅱ (Protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ)를 이용한 방법의 민감도와 특이도는 각각 49%와 90%로 AFP L3에 비하여 유의하게 높아 AFP와 PIVUKA-Ⅱ를 상호 보완적으로 이용할 수 있다. 그러나, 소간암에서의 유용성은 AFP와 마찬가지로 진단의 정확도 및 재현성이 매우 낮다는 문제점이 있다.

또한, 초음파 선별검사는 간편하고 안전한 검사이기는 하지만 깨끗한 예상도를 얻을 수 없기 때문에 1 ㎝ 이하의 작은 병변은 찾아내기 어렵고 검사자의 숙련도에 따라서 진단의 정확도가 달라져서 그 객관성에 문제가 있다. 뿐만 아니라, 간암 발생의 위험이 높은 간경변증이 심한 환자는 초음파 투과상의 문제로 병변을 정확하게 확인하는 것이 불가능하다.

따라서, 간암 환자의 조기진단과 동시에 효과적인 예후 측정을 위해서는 기존의 AFP 검사법 등에 비하여 민감도와 특이도가 보다 높은 새로운 혈청학적 검사방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 감암의 효과적인 조기진단을 위한 검사방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 인간 원암유전자인 HCCR-1 (대한민국 특허공개 제2001-39556호, GenBank Accession No. AF19561)로부터 발현되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 항원-항체 결합반응으로 간암을 효과적으로 검출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 간암의 효과적인 조기진단을 위하여 인간 원암유전자를 이용한 간암 검출방법 및 진단키트를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명에 따라 pMAL-p2X/HCCR-1 벡터로 형질전환된 대장균 BL21 균주로부터 분리·정제된 HCCR-1 재조합 단백질의 면역 블롯팅 결과를 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명에 따라 HCCR-1 단일클론 항체를 생산하는 융합 세포주를 선별하기 위해 HCCR-1 재조합 단백질을 항원으로 이용하여 ELISA를 수행한 결과이고,

도 3은 본 발명의 HCCR-1 단일클론 항체를 이용하여 간암 조직에서 면역조직화학 분석을 수행한 결과이고,

A 및 B: 간암 환자의 조직

C: 간염 환자의 조직 D: 정상인의 간조직

도 4a및4e는 본 발명의 HCCR-1 단일클론 항체를 이용한 진단키트로 간암 환자, 간염 환자, 산모 및 정상의 혈액으로 대상으로 HCCR-1 단백질을 발현을 검출하여 간암을 진단한 결과를 나타낸 것으로,도 4a는 간암 환자,도 4b는 간염 환자,도 4c는 산모,도 4d는 정상인의 혈액을 대상으로 흡광도를 측정한 결과이고,도 4e는 표준곡선으로부터 얻은 역치값을 기준으로 각 검체의 흡광도를 비교한 결과이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 인간 원암유전자 HCCR-1로부터 발현된 단백질에 특이적인 항체를 구성요소로 하며, 항원-항체 결합반응을 통해 생체 시료 중 HCCR-1 단백질의 발현정도를 측정하여 간암을 진단하는 방법 및 이를 이용한 간암 진단키트를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 인간 원암유전자 HCCR-1 (GenBank Accession No. AF195651; 대한민국 특허공개 제2001-39556호)은 포유동물에서 과발현되어 암을 유발하는 발암 유전자로서 염색체 12번 장완 (12q)에 위치하고 하나의 전사 해독 프레임 (open reading frame)을 가지며, 이로부터 약 40 kDa 크기의 단백질 (이하, HCCR-1 단백질이라 함)이 유추된다.

HCCR-1 단백질에 특이적인 항체는 HCCR-1 항원 단백질을 동물에 면역시켜 얻은 항혈청으로부터 정제한 것이 바람직하고, 특히 산란계에 면역시켜 얻은 혈청 또는 난에서 정제하는 것이 더욱 바람직하며, 다중클론 (polyclonal) 또는 단일클론 (monoclonal) 항체일 수 있다.

HCCR-1 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 제조하기 위해서는, 우선 HCCR-1 단백질을 입수하여야 한다. HCCR-1 단백질은 공지된 아미노산 서열을 이용하여 합성하거나 유전공학적 방법에 의해 재조합 단백질의 형태로 생산할 수 있다. 예를 들면, NIH 프로그램 GenBank 상에 등재된 HCCR-1 유전자의 염기서열을 이용하여 HCCR-1 단백질을 재조합 단백질 형태로 발현하는 발현벡터를 제조하는 단계; 상기 발현벡터를 대장균에 형질전환시켜 HCCR-1 재조합 단백질을 생산하는 형질전환체를 얻는 단계; 및 상기 형질전환체를 배양하여 인간 원암유전자 HCCR-1 재조합 단백질을 분리·정제하는 단계에 의해 HCCR-1 재조합 단백질을 제조할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는, HCCR-1 유전자를 함유하는 pMAL-p2X/HCCR-1 벡터로 형질전환된 대장균 BL21로부터 N-말단에 말토오스 (maltose)가 융합된 재조합 단백질을 생산한 후, 적절한 효소를 처리하여 말토오스를 분리·정제한 HCCR-1 단백질을 항원 단백질로 사용한다. 상기와 같이 대장균 형질전환체로부터 생산된 단백질이 HCCR-1 재조합 단백질임을 확인하기 위하여 웨스턴 블럿 분석을 수행한 결과, 약 35 kDa의 분자량을 가지는 HCCR-1 재조합 단백질이 특이적으로 검출됨을 확인하였다.

대장균 형질전환체로부터 분리·정제된 HCCR-1 재조합 단백질은 생쥐의 면역화 및 세포 융합을 통해 단일클론 항체를 생산하는 융합 세포주를 선별하고 분석하기 위한 항원으로 사용된다.

융합 세포주의 개발에 필요한 면역화된 생쥐는 상기에서 분리·정제된 HCCR-1 재조합 단백질과 동량의 프로인트 완전 보조항원 (Freund' complete adjuvant)을 유상화될 때까지 잘 혼합하여 생쥐의 복강 내에 주사한 후 생쥐의 면역성을 높이기 위하여 추가로 항원 주입 (booster injection)하여 얻어진다. 이때, 보조항원을 사용하지 않고 HCCR-1 재조합 단백질만을 생쥐의 복강 내에 추가로 3회에 걸쳐 주사하는 것이 바람직하다.

이와 같이 HCCR-1 재조합 단백질 항원이 주사되어 면역화된 생쥐로부터 혈청을 채취하여 항체의 역가를 측정하고 항체의 형성이 확인된 생쥐의 비장세포와 세포 융합 모세포를 세포수를 기준으로 10 : 1의 비율로 혼합하고 폴리에틸렌글리콜을 넣어 세포 융합반응을 시킨 후 배양용 배지를 가하여 희석시킨다. 다음에 융합된 세포들을 선별용 배지에 옮겨 배양한 후 융합 세포군의 성장이 명확히 확인되는 시점에 배양용 배지를 선별용 배지로 바꾸어 세포의 증식이 촉진되도록 한다. 상기에서 세포 융합 모세포로는 SP2/0ㆍAg14 세포주, P3x653 세포주 또는 NS-1 세포주 등이 사용될 수 있고, 배양용 배지로는 RPMI 배지, DMEM 배지, IMDM 배지, 또는 F12 배지 등이 사용될 수 있으며, 선별용 배지로는 HAT 배지가 사용될 수 있다.

선별용 배지에서 성장하는 융합 세포군 중 HCCR-1 단백질 항원에만 특이적으로 반응하는 융합 세포군을 간접 ELISA 방법 (indirect enzyme-linked immunosorbant assay)을 사용하여 선별한다. 즉, ELISA 판독기 (ELISA reader)로 흡광도를 측정하여 정제된 HCCR-1 단백질과 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는융합 세포주를 선별하고, 선별된 세포가 단일클론이 되도록 제한 희석법 (limiting dilution)을 사용해 융합세포를 희석한 후 하나의 세포로부터 증식한 세포들로 이루어진 세포주를 확립한다.

이와 같이 확립된 융합 세포주를 이용하여 1) 융합 세포주를 생쥐의 복강 내로 주사하는 단계; 2) 복강이 부풀어 오른 생쥐로부터 복수액을 채취하는 단계; 및 3) 복수액으로부터 HCCR-1 단백질에 대한 단일클론 항체 단백질을 분리하는 단계를 통해 인간 원암유전자 HCCR-1 단백질에 특이적인 단일클론 항체를 대량으로 생산할 수 있다.

상기와 같이 생산된 HCCR-1 특이적인 항체를 이용하여 항원-항체 결합반응으로 암을 진단하는 방법은 당분야에 공지된 효소결합 면역흡착 분석법 (enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선 면역측정법 (radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법 (sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블럿 또는 면역 블럿 분석 등의 방법에 의해 대상자의 생체 시료 중에 상기 단백질이 발현되었는지를 확인함으로써 진단할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일례로서, HCCR-1 단백질에 특이적인 항체를 이용한 효소결합 면역흡착 분석법은

1) HCCR-1 특이적인 항체가 코팅된 반응기에 검체 및 대조군을 넣어 반응시키는 단계;

2) 상기 반응을 통해 생성된 항원-항체 반응물을 2차 항체-접합체 (conjugate) 및 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및

3) 검체와 대조군에 대한 검출 결과를 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 HCCR-1 특이적인 항체를 생물학적 마이크로칩 (biological microchip) 상에 고정시킨 후 대상자로부터 분리된 생체 시료와 반응시켜 상기 항체 단백질에 대한 항원을 검출할 수 있는 단백질 칩을 제공한다. 이를테면, ELISA 방법과 더불어 공지의 생물학적 마이크로칩 (biological microchip) 및 자동화된 미세배열 시스템 (microarray system)을 이용하여 대량으로 시료를 분석할 수 있다.

또한, 본 발명은 간암을 효과적으로 조기에 진단하기 위하여 상기 HCCR-1 단백질에 특이적으로 반응하는 항체를 구성요소로 포함하는 간암 진단키트를 제공한다.

본 발명의 진단키트는

1) HCCR-1 특이적인 항체가 코팅된 반응기;

2) HCCR-1 표준항원을 포함한 양성 대조군과 상기 항원이 주입되지 않은 동물의 항혈청을 포함하는 음성 대조군;

3) 기질과의 반응에 의해서 발색을 나타내는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체;

4) 상기 표지체와 발색 반응할 발색기질 용액;

5) 각 반응단계에 사용할 세척액; 및

6) 효소반응 정지용액을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 진단키트는 항원-항체 결합반응을 통하여 항체 단백질에 대한 항원을정량분석 또는 정성분석 함으로써 간암을 진단할 수 있으며, 상기 항원-항체 결합반응은 통상의 ELISA, RIA, 샌드위치 측정법, 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블럿 또는 면역 블럿 분석의 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 상기 재조합 단일클론 항체 단백질을 표면에 코팅시킨 96 웰 마이크로타이터 플레이트 등을 이용하여 ELISA를 수행하도록 상기 진단키트를 제공할 수 있다.

항체 단백질이 코팅될 수 있는 반응기로는 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐 (Polyvinyl) 수지로 합성된 96 웰 플레이트 (96 well plate), 폴리스티렌 (Polystyrene) 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글래스 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 항체는 전술한 바와 같이 HCCR-1 단백질 항원을 동물에 면역시켜 얻은 항혈청으로부터 정제하는 것이 바람직하다. 본 발명의 HCCR-1 특이적인 항체는 반응기 당 1 내지 10 ㎍/ 100 ㎕로 코팅하는 것이 바람직하다.

본 발명의 진단키트에 포함되는 대조군은 양성 대조군과 음성 대조군이 있는데, 양성 대조군은 HCCR-1 단백질 표준항원을 포함하는 혼합물이고 음성 대조군은 HCCR-1 단백질 항원으로 감염되지 않은 동물의 혈청이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 단백질 농도가 각각 0 ng/㎖ (A), 20 ng/㎖ (B), 40 ng/㎖ (C), 80 ng/㎖ (D), 160 ng/㎖ (E), 320 ng/㎖ (F) 및 640 ng/㎖ (G)인 HCCR-1 단백질 표준항원 용액을 준비하여 사용하였다.

상기 2차 항체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP (horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소 (alkaline phosphatase), 콜로이드 골드 (coloid gold), FITC (poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC (rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질 (fluorescein) 및 색소 (dye) 등의 표지체가 사용될 수 있다. 본 발명에서는, 예를 들어 염소 유래의 항-토끼 IgG-HRP 접합체 (goat anti-rabbit IgG-HRP conjugate)를 사용한다.

상기 발색을 유도하는 기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD (o-phenylenediamine) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색제 기질은 완충용액 (0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 2차 항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고 그 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 HCCR-1 단백질 항원의 존재 유무를 검출한다.

상기 세척액은 인산염 완추용액, NaCl 및 트윈 20을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액 (phosphate buffer), 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20 (Tween 20)으로 구성된 완충용액이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 반응기에 넣어 3 내지 6회 세척한다. 블로킹 용액은 0.1% BSA를 함유하는 인산염 완충용액이, 반응 정지용액은 2 N의 황산용액이 바람직하다.

상기 진단키트를 이용하여 검체 시료 내 HCCR-1 항원을 검출함으로써 간암을 조기에 진단하는 방법은 HCCR-1 단일클론 항체와 양성 및 음성 대조군에 검체 시료를 각각 반응시키고, 세척액으로 세척한 후 기질과의 반응에 의해서 발색을 나타내는 표지체가 표지된 2차 항체 접합체를 가하고, 다시 세척액으로 세척한 후 상기 기질함유 용액을 첨가하여 발색 반응시키고, 450 ㎚에서의 흡광도를 측정하는 것을 특징으로 한다. 이때, 표준항원 용액 A의 흡광도는 평균값이 0.000 이상 0.200 이하이어야 하고, F의 흡광도는 1.200 이상 3.000 이하이어야 한다. 표준항원 용액 A 및 F의 흡광도 중간값을 역치값 (cut-off value)으로 하여 검체를 양성 또는 음성으로 판정하는 기준으로 삼는다. 검체의 흡광도가 표준항원 용액 F의 흡광도보다 클 경우에는 검체를 희석한 후 다시 측정한다. 검체의 흡광도가 역치값 이상인 경우를 양성으로 판단하고 이하인 경우를 음성으로 판단한다.

본 발명에 따른 인간 원암유전자 HCCR-1에 특이적인 항체를 포함하는 간암 진단키트는 환자의 혈액을 이용하는 새로운 면역학적 진단 도구로서 기존에 사용하고 있는 AFP 간암 진단제와 비교하여 정확도 및 재현성이 높을 뿐만 아니라 AFP 음성인 경우에서도 간암의 진단을 예측하는 사실이 확인되었다. 결론적으로 간암의 조기진단을 위한 혈청 HCCR-1 검사법은 기존의 AFP 검사법보다 간암에 대한 진단적 정확도가 통계적으로 유의하게 높았으며 (94.9%), AFP 음성인 간암에서도 93.1%의 높은 간암 검출율을 나타내었다. 또한, 2 ㎝ 이하의 소간암에서도 AFP 보다 HCCR-1의 진단적 효능성이 높았다 (91.7%). 본 발명의 HCCR-1으로 정상 간조직, 간경변증 조직 및 간암조직들을 대상으로 면역염색한 결과, 정상간이나 간암의 전구단계인 간경변증에서는 HCCR-1에 반응하는 항원들이 발견되지 않았으나 간암조직에서만 HCCR-1에 반응하는 항원들이 발견되어 진한 갈색 (dark brown color)으로 염색되었다.

따라서, 본 발명에 따른 인간 원암유전자 HCCR-1을 이용한 간암 검출방법 및 간암 진단키트는 기존의 AFP 검사법보다 진단의 정확도 및 재현성이 높아 간암의 조기진단 및 소간암의 진단에 매우 유용한 도구로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> HCCR-1 다중클론 항체의 생산

<1-1> HCCR-1 재조합 단백질의 생산

간암 진단을 위한 종양 표지물질로서 인간 원암유전자 HCCR-1에 특이적인 항체를 생산하기 위하여 인간 원암유전자 HCCR-1의 일부 (GenBank Accession No. AF195651의 염기서열 123 내지 473에 해당하고 아미노산 서열 39 내지 155에 해당)를 포함하는 pET-32(+) 벡터 (Novagen)의 다중 클로닝 부위에 삽입하여 pET-32b(+)/HCCR-1 벡터를 제작하였다. 상기 벡터를 대장균 EL21 (ATCC 47092)에 형질전환한 후 1 mM IPTG (isopropyl β-D-thiogalacto-pyranoside, Sigama) 처리로 발현을 유도하여 20 KDa의 Trix.Tag 티오레독신 단백질이 융합된 35 KDa의 HCCR-1 융합단백질을 생산하였고 이를 His-Hind 키트 (Novagen)로 정제하였다 (국제출원 공개 제 WO 01/27149 호). 정제된 재조합 단백질을 면역 블롯팅한 결과, 약 35 kDa의 융합단백질이 다량 함유되어 있음을 확인하였다 (도 1). 이와 같이 분리·정제된 HCCR-1 재조합 단백질은 생쥐의 면역화 및 단일클론 항체를 생산하는 융합 세포주를 선별하고 분석하기 위한 항원-항체 결합반응의 항원으로 사용되었다.

<1-2> 산란계의 면역화

상기 <1-1>에서 획득한 HCCR-1 재조합 단백질에 특이적인 항체 생산을 위한 동물은 산란을 시작한 36주령의 ISA-브라운계의 산란계 15수를 사용하였다. HCCR-1 재조합 단백질 (200 ㎍/㎖)과 프로인트 완전 보조제 (Sigma Chemical Co.)를 각각 동량 혼합하여 유화시켰다. 상기 유화액 1 ㎖를 산란계의 흉근에 각각 0.25 ㎖씩 4곳에 근육 주사하여 1차 접종하였다. 추가 항원주입 (Booster injection)은 1차 접종 후 2주 간격으로 실시하였으며, 면역항원을 프로인트 불완전 보조제 (Gibco)로 유화하여 1차 접종과 동일한 방법으로 12주 동안 실시하였다.

<1-3> 난황 항체 (Egg yolk antibody; IgY)의 분리

혈액은 익하정맥 (翼下靜脈)에서 2주 간격으로 채취하여 혈청을 분리한 후 -20℃에 보관하여 각종 실험측정에 이용하였다. 난은 매일 회수하여 8℃에 저장하여 실험에 이용하였다. 난황은 김 등 (Kim JW, et al.,Korean Federation of the Societies in Animal Sciences, Proceedings 130 P97040, 1997)의 방법에 의거하여 분리하였다. 면역접종한 산란계로부터 생산된 난을 채집하여 난황을 분리한 후 증류수로 10배 희석하였다. 희석된 난황용액을 pH 5.0으로 조정 후 -20℃에서 하룻밤 동안 동결하였다. 동결된 난황을 실온에서 해동시킨 후 30분간 15℃에서 원심분리 (10,000 ×g)하여 상등액만 수거하였다. 상등액을 여과지 (Whatman No.1)로 여과하여 항체를 분리하였다. 상기 항체는 항체특이성을 조사하였을 때 인간 원암유전자 HCCR-1 단백질에만 특이적으로 반응하였다.

<실시예 2> HCCR-1 단일클론 항체의 생산

<2-1> 생쥐의 면역화

HCCR-1 단일클론 항체를 생산하는 융합 세포주의 제작에 필요한 면역화된 생쥐를 얻기 위하여, 상기 <1-1>에서 분리·정제된 HCCR-1 재조합 단백질을 프로인트 완전 보조제 (Sigma Chemical Co.)와 프로인트 불완전 보조제 (Gibco)에 혼합하여 생후 5 내지 6주된 Balb/c 생쥐의 복강 내에 2주 간격으로 3회 면역시켰으며, 항체 생성의 유무를 파악하고자 마지막 부스팅 (boosting) 직전에 생쥐 혈청 중의 항체 역가를 효소결합 면역흡착 분석법 (enzyme linked immunosorbent assay: ELISA)으로 측정하여 음성 대조군보다 5배 이상의 역가를 나타내는 경우에만 부스팅하고 3일 후 융합 (fusion) 실험을 실시하였다.

<2-2> 세포 융합실험

세포 융합의 모세포 (parent cell)로 사용된 마우스 형질 골수종세포는 SP-2 세포주 (American Type of Culture Collection; ATCC, USA)로서 융합실험 1주일 전부터 지수적 성장곡선을 보이는 경우에 사용하였으며, 이들 세포주들은 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배양액에서 성장시켰다.

상기 <2-1>에서 최종 면역 후 3일이 경과된 Balb/c 생쥐로부터 비장을 적출하여 혈청이 첨가되지 않은 DMEM 배양액에서 핀셋으로 비장세포 부유액을 제조한 후 실온에서 정체시켜 결체조직을 가라앉혀 제거하였다. 비장세포 부유액을 1,000 rpm에서 3분간 원심분리한 비장 세포액을 Tris-NH₄Cl 용액 (Tris 20.6 g/ℓ, NH₄Cl 8.3 g/ℓ)에 노출시켜 적혈구를 용해시킨 후, 배양액으로 다시 3회 원심세척(1,000 rpm에서 3분간 원심분리)한 후 세포수를 약 1 × 10⁸개/㎖로 조절하였다. 또한, 생쥐의 안와정맥총으로부터 1.5 ㏄의 혈액을 채취하여 추후 검색 실험시에 양성 대조군으로 사용하였다.

세포 융합실험은 50% (W/V) 폴리에틸렌 글리콜 1500 (polyethylene glycol 1500, Boerhinger Mannheim Co., Germany)을 이용하여 SP-2 형질 골수종세포와 비장세포를 1:10의 비율로 혼합하여 융합시킨 후, 융합된 세포만을 선별하기 위하여 세포를 15% 우태아 혈청과 HAT (50 μM 히포크산틴 [hypoxanthine], 0.4 μM 아미노프테린 [aminopterin], 16 μM 티미딘 [thymidine]) 용액이 함유된 웨이마우스 (Waymouth) 배양액으로 부유시킨 다음, 96 웰 플레이트 (Corning Co., USA)에 웰당 100 ㎕씩 분주한 후 37℃, 5% CO₂, 포화 습도하에서 배양하였다.

<2-3> 단일클론 항체를 생산하는 융합 세포주의 선별

상기 <2-2>에서 제조한 융합 세포군 중에서 인간 원암유전자 HCCR-1 재조합 단백질 항원에만 특이적으로 반응하는 융합 세포들을 선별하기 위하여, 융합 후 10일째부터 세포가 증식하는 웰의 배양 상등액을 취하여 상기 <1-1>의 대장균 형질전환체로부터 분리·정제된 HCCR-1 재조합 단백질을 항원으로 사용한 ELISA를 수행하였다.

구체적으로, 비특이성 면역 반응을 억제하기 위하여 96 웰 플레이트 (Falcon Co., USA)를 1% 탈지분유 (skim milk)-PBS를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 노출시켜 코팅한 후, 웰당 2 × 10⁵개의 배양된 간암 세포 (American Type of CultureCollection; ATCC, USA)를 첨가하였다. 상기 웰에 융합세포의 배양 상등액 50 ㎕씩을 각각 첨가한 후 4℃에서 2시간 동안 항원-항체 결합반응을 진행시켰으며 이후 PBS 용액으로 3회 세척하였다. 이후 2% (W/V) BSA를 함유하는 PBS 완충용액으로 희석 (1 : 10,000)된 염소 유래의 항-토끼 IgG-HRP (Sigma Co., USA) 2차 항체를 웰당 100 ㎕씩 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다.

이후, 0.1 M 시트레이트 인산염 완충용액 (phosphate buffered citrate, pH 5.0) 10 ㎖에 1 ㎎의 TMB (3.3', 5.5'-tetramethylbenzidine, Sigma Co., USA) 와 20 ㎕의 35% 과산화수소를 혼합하여 제조한 기질용액을 웰당 100 ㎕씩 첨가하여 효소반응을 유도하였다. 실온에서 15분간 효소반응을 유지시킨 후 동량의 2 N 황산용액을 첨가하여 효소 반응을 중단시킨 다음 발색 반응의 정도를 450 ㎚에서 측정하였다. 이로부터 단일클론 항체를 지속적으로 생성하고 세포 활성상태가 좋은 250종의 융합세포들을 얻었으며, HCCR-1 단백질에 대한 특이 항체를 분비하는 이들 융합세포들 중 ELISA로 분석시 항체 역가가 음성 대조군보다 10배 이상 높은 종을 다시 선별하여 특성분석을 시작하였다.

상기 결과로부터 HCCR-1 재조합 단백질 항원에 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 융합 세포들을 우선 선별한 후, 선별된 세포들을 대상으로 상기 과정을 여러 번 반복 실시하여 HCCR-1 재조합 단백질 항원에만 높은 결합력을 갖고 특이적으로 반응하는 융합세포 집단을 재 선별하였다. 이때, 골수종 세포의 배양액을 음성 대조군으로 하여 이보다 5배 이상의 역가를 나타내는 웰의 세포를 선별하여 24웰 배양 플레이트 및 25 ㎖ 배양 플라스크 (Corning Co., USA)로 옮겨증식시켰다. 이 과정에서 3회 이상의 검색실험을 실시하여 동일한 항체 역가를 유지하는 웰의 세포를 클로닝하였으며, 일부는 -130℃에 저장하였다. 또한, 항체를 생산하는 융합세포는 3회에 걸친 클로닝을 통해 지속적으로 높은 항체 역가를 유지하면서 세포의 증식이 활발한 융합세포만을 선별하여 이를 증식 배양한 다음 단일클론 항체의 생산에 이용하였다.도 2는 HCCR-1 단백질에 특이적인 단일클론 항체를 생산하기 위하여 선별된 융합세포들을 대상으로 HCCR-1 재조합 단백질을 항원으로 아용하여 ELISA를 수행한 결과를 나타낸 것이다.

클로닝은 한계 희석법 (limiting dilution method)을 이용하였으며, 클로닝하려는 융합세포의 수를 산정하여 4.6 ㎖의 배양액 당 230개의 융합세포가 포함되도록 조절한 후 96웰 플레이트 중 36개의 웰에 0.1 ㎖ (5 세포/웰)씩 분주하고, 나머지 1 ㎖는 4 ㎖의 배양액과 혼합하여 나머지 36개의 웰에 0.1 ㎖ (1 세포/웰)씩 분주하였다. 마지막으로 남은 1.4 ㎖의 세포 부유액에는 동량의 배양액을 혼합하여 24개의 웰에 0.1 ㎖ (0.5 세포/웰)씩 분주하였다. 14일 후 클론이 충분히 자라면 배양 상등액으로부터 다시 항체 생성여부를 확인한 후 이중 6개의 양성 클론을 24웰 플레이트에 옮겨 배양한 후 1주일 후에 항체 생성여부를 다시 최종 확인한 후 양성 클론만을 25 ㎖ 배양 플라스크로 옮겨 배양하여 대량생산에 들어갔으며 일부는 -130℃ 액체 질소 탱크에 저장하였다.

<2-4> 단일클론 항체의 대량 생산

상기 <2-3>에서 확립한 융합 세포주로부터 HCCR-1 단백질에 대한 단일클론 항체를 대량으로 생산하기 위하여, 우선 융합세포를 Balb/c 생쥐의 복강 내에 주사하기 약 10일 전에 0.5 ㎖의 프리스탄 (pristane, Sigma Co., USA)을 복강 내 주사하여 복강종양의 발생 빈도를 높였다. 이어서, 약 1 × 10⁷개의 융합세포를 복강 내 주사하여 복수 형성을 유도시킨 후 복강이 부풀어 오른 생쥐에서 복수액을 채취하였다. 상기 복수액은 고농도로 자란 융합세포를 포함하고 있으므로 채취된 복수액을 10,000 rpm에서 원심분리하여 융합세포를 침전시킨 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액은 항체 단백질을 정제할 때까지 -70℃에서 보관하였다.

상기 복수액으로부터 항체를 정제하기 위하여 단백질-A/G 아가로스 칼럼 크로마토그래피 (protein-A/G agarose column chromatography) 방법 (Pierce Co., USA)과 카프릴산 정제방법 (caprylic acid purification)을 병행하여 면역글로블린을 분리하였으며, 최종 글로블린 농도는 브래드포드 (Bradford)의 방법을 이용하는 바이오-래드 단백질 미세분석 키트 (Bio-Rad protein microassay kit, Bio-Rad Lab., USA)를 이용하여 측정하였다. 단일클론 항체 면역글로블린의 아형 (isotype)은 혈구응집반응을 이용하는 아형 분석키트 (isotyping kit, Serotec Co., England)를 사용하여 결정하였다. 그 결과, 분리한 단일클론 항체의 아형은 Ig G2b로 판명되었다.

<실시예 3> HCCR-1 단일클론 항체의 간암 조직에서의 면역조직화학 염색반응 확인

본 발명의 인간 원암유전자 HCCR-1에 대한 단일클론 항체의 특이성을 검증하기 위하여 간암 환자의 조직을 단일클론 항체를 이용하여 면역조직화학 염색법으로확인하였다.

구체적으로, HCCR-1 단일클론 항체를 이용하여 정상 간조직과 간암 조직들을 면역조직 화학적으로 관찰하기 위하여 아비딘-바이오틴 퍼옥시다제 복합체 (avidin-biotin-peroxidase complex, ABC)법을 이용하였고 면역조직화학 염색반응을 위한 신선한 종양조직들은 수술적 처치시에 채취하였으며 조직들은 액체 질소에 급속 냉동시킨 후 -70℃에 보관하였다.

우선, 간암 환자로부터 적출한 조직을 5 ㎛ 두께로 절단하여 -20℃ 아세톤에 고정시킨 후 0.5% 메탄올성 과산화수소 (methanolic hydrogen peroxide) 용액에 30분간 방치하여 내생성 퍼옥시다제 활성 (endogenous peroxidase activity)을 제거시킨 후 TBS로 세척하였다. 또한, 비특이적 면역반응을 억제하기 위하여 정상 마혈청 (normal horse serum) (Vector Lab., USA)에 조직절편을 30분간 노출시킨 후 1차 항체로는 희석된 여러 농도의 단일클론 항체를 가하여 24시간 동안 4℃에 방치하였으며, 이후 TBS로 세척한 후 2차 항체로 바이오틴화-말 항토끼 IgG (biotinylated horse anti-rabbit IgG, Vector Lab., USA) 용액을 첨가한 후 1시간 동안 방치하였다. 이를 다시 TBS 용액으로 세척한 후 3차 항체로 아비딘-바이오틴-퍼옥시다제 복합체 (avidin-biotin-peroxidase complex, Vector Lab., USA)를 가하여 40분간 방치한 후 충분히 세척하였으며 과산화수소 및 TBT (3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride)가 함유된 기질용액에 노출시켜 현미경으로 발색 유무를 관찰하였다. 이후 간암 조직 표본에서 항체에 반응하는 세포의 출현여부와 분포상태를 파악하기 위하여 면역염색이 끝난 절편들은 헤마톡실린(hematoxylin)으로 배색 염색 (counter-staining)한 후 광학 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 간암 조직에서 정상 간조직과 간암의 전단계인 간경변증 조직에 비해 훨씬 많은 양의 HCCR-1 단백질 항원이 존재하고 있음을 확인하였다 (도 3).

<실시예 4> HCCR-1 단일클론 항체를 이용한 ELISA

HCCR-1 단일클론 항체를 이용한 ELISA에 의해 간암을 진단하는 방법은 ① ELISA 플레이트의 웰에 융합세포로부터 분리·정제한 HCCR-1 단일클론 항체를 코팅하는 단계; ② 검체 시료를 처리하여 웰에 코팅된 항체와 반응시키는 단계; 및 ③ 검체 시료 내 존재하는 HCCR-1 항원이 웰의 항체에 결합되어 있는 것을 검출하는 단계에 의해 수행되었다.

<4-1> HCCR-1 단일클론 항체의 코팅

바닥이 평평한 96웰 ELISA 플레이트에 HCCR-1 단백질에 특이적인 단일클론 항체를 주입하고 덮개로 덮은 후, 4℃에서 16 내지 18시간 동안 방치하여 코팅하였다. 이때, 정제한 단일클론 항체는 5 ㎍/㎖ 농도로 0.5 M 탄산염 완충용액 (pH 9.6)에 희석한 후 100 ㎕씩 웰에 첨가하였다. 대조군으로 HCCR-1 단백질로 면역되지 않은 생쥐의 혈청 (정상 생쥐 혈청)을 탄산염 완충용액에 500배 희석하여 100 ㎕씩 웰에 분주하였다.

그런 다음, 플레이트의 웰을 세척용 완충용액 (0.05% 트윈 20을 포함한 PBS, pH 7.4)으로 4회 세척하고 비특이적 단백질 결합부위를 차단하기 위하여 블로킹 용액 2% BSA를 포함한 PBS (pH 7.4) 완충용액을 300 ㎕씩 분주한 다음, 37℃에서 2시간 동안 방치하였다. 이어서, 블로킹 용액을 제거하고 진공포장하여 4℃에 보관하였다.

<4-2> 웰에 코팅된 항체와 검체 시료와의 반응

검체 시료는 간암 환자로부터 추출한 환자의 혈액, 간염 환자로부터 추출한 환자의 혈액, 정상 및 임산부의 혈액 및 정상인의 혈액으로부터 혈청을 분리하여 준비하였고, 역치값 (cut-off value) 측정을 위한 표준곡선 (standard curve)은 표준항원 용액 A, B, C, D, E, F 및 G는 HCCR-1 재조합 단백질을 각각 0 ng/㎖, 20 ng/㎖, 40 ng/㎖, 80 ng/㎖, 160 ng/㎖, 320 ng/㎖ 및 640 ng/㎖ 농도로 희석하여 준비하였다.

상기 <4-1>에서 준비한 HCCR-1 단일클론 항체가 코팅된 플레이트 웰에 검체 시료를 100 ㎕씩 분주한 후 37℃에서 4시간 동안 반응시키고 각 웰을 세척용 완충용액으로 4회 세척하였다. 이때, 양성 대조군으로는 상기에서 준비한 표준항원 용액을, 음성 대조군으로는 정상 생쥐의 혈청을 동량 첨가하였다.

<4-3> 항원-항체 결합의 검출

고추냉이 퍼옥시다제 (horsedarish peroxidase)로 표지된 염소 유래의 항-토끼 IgG 2차 항체를 1:10,000으로 희석시켜 상기의 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였고 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 정치한 후 각 웰을 세척용 완충용액으로 4회 세척하였다. 이어서, 기질인 TMB (3.3',5.5'-tetramethylbenzidine, Sigma Co., USA)를 기질용 완충용액 10 ㎖ (구연산 완충용액, pH 5.0)에 1 ㎎을 용해시키고, 35% 과산화수소를 2 ㎕ 되도록 첨가하여 기질용액을 제조하였다. 상기 기질용액 100 ㎕씩을 웰에 넣고 빛을 차단하여 실온에서 15분간 반응시킨 후 2 N H₂SO₄용액을 50 ㎕ 첨가하여 반응을 정지시켰다. 기질용액의 발색 반응정도는 450 ㎚ 파장에서의 흡광도를 측정함으로써 결정하였다.

각 검체 시료마다 HCCR-1 항원에 대한 단일클론 항체가 코팅된 웰의 흡광도에서 양성 대조군인 정상 생쥐의 혈청이 코팅된 웰의 흡광도와 음성 대조군인 PBS만을 넣은 웰의 흡광도를 감하고 남은 나머지를 HCCR-1 항원에 의한 흡광도로 추정하였다. 또한, 동일한 방법으로 표준액의 흡광도를 계산한 후 표준액 A와 F의 흡광도의 중간값을 역치값으로 정하고 흡광도가 역치값 이상인 검체는 양성으로, 이하인 검체는 음성으로 판정하였다. 이때, 표준액 A의 흡광도는 평균값이 0.000 이상 0.200 이하여야 하고, 표준액 F의 흡광도는 평균값이 1.200 이상 3.000 이하여야 한다.

HCCR-1 표준항원 용액을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 역치값을 10 ㎍/㎖로 결정하였고, 이를 기준으로 각 검체의 흡광도를 비교하여 양/음성을 판정하였다. 간암 환자, 간염 환자, 산모 및 정상인에 대한 각각의 결과는도 4a내지4e에 나타내었다.

<실시예 5> HCCR-1 단일클론 항체를 이용한 ELISA에 의한 간암 진단의 효율성 확인

본 발명에 따른 HCCR-1 단일클론 항체를 이용한 ELISA 진단키트 및 검출방법에 의한 간암 진단의 효율성을 확인하기 위하여, 실시예 4에 기재된 HCCR-1 특이적인 항체를 이용한 ELISA 방법과 기존에 간암 진단을 위해 사용되어 온 혈청 알파-태아단백 (alpha-fetoprotein, AFP) 수치 측정방법을 비교하였다. 이때, AFP 수치는 시판되고 있는 ELSA2-AFP 측정키트 (CIS Bio International, France)를 사용하여 측정하였다.

진단 결과의 양/음성은 AFP의 경우에는 20 ng/㎖을, HCCR-1의 경우에는 표준곡선 (standard curve)에서 얻어진 10 ㎍/㎖을 각각의 역치값 (cut-off value)으로 하여 결정하였다. 간암군, 간염군 그리고 정상 산모군의 각 집단 내에서 AFP와 HCCR-1간의 양성반응율의 차이는 멕나마르 (McNemar) 검정으로 비교하였으며, 간암군과 정상군으로부터 HCCR-1의 민감도, 특이도, 위양/음성율과 각각의 95% 신뢰구간을 추정하였다.

간암군을 종양 크기 2 ㎝를 기준으로 두 집단으로 나눈 후, HCCR-1의 집단간 양성반응율의 차이는 피셔의 정확도 테스트 (Fisher's exact test)로, 각 집단 내에서 AFP와 HCCR-1간의 양성반응율의 차이는 멕나마르 검정으로 비교하였다. 모든 통계적 분석에는 SAS 분산 6.12 (SAS. SAS/STAT Software: Changes and Enhancements through Release 6.12. Cary, NC: SAS Institute, 1997)가 사용되었고, 검정의 유의수준은 0.05로 하였다.

<5-1> 간암 환자군에서 AFP와 HCCR-1 키트의 진단 정확도

하기표 1에 97명의 간암 환자군에서 HCCR-1과 AFP 키트의 진단 정확도를 비교하였다. 그 결과, HCCR-1의 진단 정확도는 94.9%로, AFP의 70.1%에 비해 유의하게 높게 나타났다 (chi_M^2=19.2, df=1, P<0.0001, 멕나마르 테스트). 특히, AFP에 의해 음성으로 진단된 총 29명의 간암 환자 중에서 27명 (93.1%)은 HCCR-1로 정확히 양성으로 진단되었고, AFP에 의해 양성으로 진단된 총 68명의 간암 환자 중에서 3명 (4.4%)은 HCCR-1에 의해 음성으로 판정되어 부정확한 결과를 보였다.

		AFP
		양성	음성	합
HCCR-1	양성	65	27	92(94.9%)
HCCR-1	음성	3	2	5
	합	68(70.1%)	29	97(100%)

<5-2> 정상 산모군에서 AFP와 HCCR-1 키트의 진단 정확도

하기표 2에 72명의 정상 산모군에서 HCCR-1과 AFP 키트의 양성 반응율을 나타내었다. AFP에 의한 진단결과 72명의 정상 산모들이 모두 양성으로 나타난 반면, HCCR-1에서는 11명 (15.3%)만이 양성으로 나타나 유의한 차이를 보였다 (chi_M^2=61, df=1, P<0.0001, 멕나마르 테스트). 따라서, 정상 산모군에 대해서는 AFP의 간암 진단능력은 거의 없다고 할 수 있으며, HCCR-1을 사용할 경우 오진율을 상당 부분 낮출 수 있음을 확인하였다.

		AFP
		양성	음성	합
HCCR-1	양성	11	0	11(15.3%)
HCCR-1	음성	61	0	61
	합	72(100%)	0	72(100%)

<5-3> 간염 환자군에서 AFP와 HCCR-1 키트의 진단 정확도

하기표 3에 제시된 72명의 간염 환자들에 대한 AFP와 HCCR-1 키트의 진단결과에서는, 52명의 간염 환자 중 2명 (3.9%)이 HCCR-1에 의해, 11명 (21.2%)이 AFP에 의해 간암으로 잘못 진단될 수 있다는 사실을 알 수 있다 (chi_M^2=7.3636, df=1, P=0.0067, 멕나마르 테스트). 특히, AFP에 의해 잘못 진단된 11명 중 10명 (90.9%)은 HCCR-1에 의해 양성으로 판명되어 AFP보다 HCCR-1이 보다 정확한 진단결과를 보임을 확인하였다.

<5-4> HCCR-1 키트의 간암 진단도구로서의 유용성 확인

하기표 4및표 5에서 보는 바와 같이, 97명의 간암 환자와 121명의 정상인을 대상으로 했을 때 본원 발명의 HCCR-1 키트의 민감도는 94.9%, 특이도는 90.1%였으며, 위양성율과 위음성율은 각각 1.5%와 4.4%에 지나지 않았다. 또한, 전체 진단의 정확도는 92.2로 나타나, 진단도구로서의 유용성이 매우 높음을 확인하였다.

		HCCR-1
		양성	음성	합
집단	간암	92	5	97
집단	정상	12	109	121
	합	104	114	218

진단척도	값 (%)	95% 신뢰구간
민감도	92/97=94.9	90.5∼99.3
특이도	109/121=90.1	84.8∼95.4
위양성율	12/104=11.5	5.4∼17.6
위음성율	5/114=4.4	0.6∼8.2
양성예측도	92/104=88.5	82.3∼94.6
음성예측도	109/114=95.6	91.8∼99.4
정확도	(92+109)/218=92.2	88.6∼95.8

<5-5> HCCR-1 키트의 간암 종양크기별 진단 정확도

하기표 6에 나타난 바와 같이, 2 ㎝ 이상의 종양을 가진 85명의 간암 환자 및 2 ㎝ 미만의 종양을 가진 간암 환자 12명을 대상으로 했을 때, AFP의 양성반응율은 2 ㎝ 이상 환자에서 72.9%, 2 ㎝ 미만 환자에서는 50%로 종양크기가 커짐에 따라 약 23%의 증가를 보인 반면, HCCR-1은 모든 종양크기에서 90%가 넘는 양성반응율을 나타내었다. 그러나, HCCR-1 및 AFP 두 진단도구 모두 종양크기에 따라 유의한 차이를 보이지는 않았다.

각 종양크기에서 HCCR-1은 AFP에 비해 유의하게 높은 양성반응율을 보였으며 (P=0.025, P=0.001), 2 ㎝ 미만의 종양에서는 HCCR-1이 AFP보다 41.7%, 2 ㎝ 이상에서는 22.4%가 각각 더 높게 나타나, 특히 작은 크기의 종양을 진단할 때는 본 발명의 HCCR-1이 유용하다는 사실을 확인하였다.

	양성반응율 (%)
종양 크기^§	AFP	HCCR-1
< 2 ㎝	6/12=50.0	11/12=91.7^*
≥ 2 ㎝	62/85=72.9	81/85=95.3^**

§P>0.05, 종양크기별 양성반응율의 차이 (AFP와 HCCR-1), χ²검정과 피셔의 정확도 테스트

*P=0.025, 2 ㎝ 미만에서 AFP와 HCCR-1간 양성반응율의 차이, 멕나마르 테스트

**P=0.001, 2 ㎝ 이상에서 AFP와 HCCR-1간 양성반응율의 차이, 멕나마르 테스트

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 인간 원암유전자 HCCR-1에 특이적인 항체를 포함하는 간암 진단키트는 환자의 혈액을 이용하는 새로운 면역학적 간암 진단 도구로서 기존에 사용하고 있는 AFP 검사법보다 간암에 대한 진단적 정확도 및 재현성이 높아 간암의 조기진단 뿐만 아니라 소간암의 진단에도 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

1) 인간 HCCR-1 단백질 (GenBank Accession No. AF19561)에 특이적인 항체가 코팅된 반응기에 검체 및 대조군을 넣어 반응시키는 단계;

2) 상기 반응을 통해 생성된 항원-항체 반응물을 2차 항체-표지체 접합체 (conjugate) 및 표지체의 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및

3) 검체와 대조군에 대한 검출 결과를 비교하는 단계를 포함하는,

검체 시료 중의 HCCR-1 단백질을 검출하는 방법.

제 1항에 있어서,

항원-항체 결합반응을 효소결합 면역흡착 분석법 (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선 면역측정법 (radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법 (sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블럿 또는 면역 블럿 분석법으로 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서,

HCCR-1 특이적인 항체가 인간 HCCR-1 단백질을 동물에 면역시켜 얻은 항혈청 또는 난으로부터 정제하여 얻은 것임을 특징으로 하는 방법.

인간 HCCR-1 단백질 (GenBank Accession No. AF19561)에 대한 단일클론 항체를 포함하며 항원-항체 결합반응을 통해 검체 시료 중 HCCR-1 단백질의 발현 정도를 측정하여 간암을 진단하기 위한 진단키트.

제 4항에 있어서,

항원-항체 결합반응을 효소결합 면역흡착 분석법 (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선 면역측정법 (radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법 (sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블럿 또는 면역 블럿 분석법으로 측정하는 것을 특징으로 하는 진단키트.

제 4항 또는 제5항에 있어서,

1) HCCR-1 단백질에 특이적인 항체가 코팅된 반응기;

4) 상기 표지체와 발색 반응할 발색기질 용액;

5) 각 반응단계에 사용할 세척액; 및

6) 효소반응 정지용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 진단키트.

제 6항에 있어서,

HCCR-1 단백질에 특이적인 항체가 인간 HCCR-1 단백질을 동물에 면역시켜 얻은 항혈청 또는 난 (卵)으로부터 정제하여 얻은 것임을 특징으로 하는 진단키트.

제 6항에 있어서,

HCCR-1 단백질에 특이적인 항체가 반응기 당 1 내지 10 ㎍/ 100 ㎕로 코팅되는 것을 특징으로 하는 진단키트.

제 6항에 있어서,

반응기가 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐 (polyvinyl) 수지로 합성된 웰 플레이트, 폴리스티렌 (polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글래스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단키트.

제 6항에 있어서,

2차 항체 접합체의 표지체가 HRP (horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소 (alkaline phosphatase), 콜로이드 골드 (coloid gold), 형광물질 (fluorescein) 및 색소 (dye)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단키트.

제 6항에 있어서,

발색기질이 TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 및 OPD (o-phenylenediamine)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단키트.