KR100545064B1

KR100545064B1 - 인간 원암단백질에 특이적인 항체를 포함하는 간경변증진단 키트

Info

Publication number: KR100545064B1
Application number: KR1020030033308A
Authority: KR
Inventors: 김진우
Original assignee: 김현기; 이혜영
Priority date: 2003-05-26
Filing date: 2003-05-26
Publication date: 2006-01-24
Also published as: JP2007502427A; EP1636587B1; DE602004026869D1; WO2004104598A1; EP1636587A4; CN1795388A; KR20040101633A; TW200510725A; ATE466285T1; US20070141633A1; CA2526661A1; EP1636587A1

Abstract

본 발명은 인간 원암유전자 HCCR-2로부터 발현된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 항원-항체 결합반응으로 검체 시료 중의 HCCR-2 단백질을 검출하는 방법 및 이를 이용한 간경변증 진단 키트에 관한 것으로, 본 발명의 HCCR-2 특이적인 항체를 이용한 검출방법 및 진단 키트는 간경변증에 대한 진단의 정확도 및 재현성이 높아 간경변증의 조기진단에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인간 원암단백질에 특이적인 항체를 포함하는 간경변증 진단 키트{DIAGNOSTIC KIT FOR LIVER CIRRHOSIS COMPRISING AN ANTIBODY SPECIFIC FOR HUMAN PROTOONCOGENIC PROTEIN}

도 1은 pMAL-p2X/HCCR-2 벡터로 형질전환된 대장균 BL21 균주로부터 분리·정제된 HCCR-2 재조합 단백질의 면역 블롯팅 결과를 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명의 HCCR-2 다중클론 항체를 이용한 진단키트로 간경변증환자 및 정상인의 혈액을 대상으로 HCCR-2 단백질의 발현을 검출한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 인간 원암유전자 HCCR-2로부터 발현된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 항원-항체 결합반응으로 혈액 시료 중의 HCCR-2 단백질을 검출하는 방법 및 이를 이용한 간경변증 진단키트에 관한 것이다.

간경변증은 간에 결절을 형성하는 광범위한 섬유화증을 일컬으며, 만성 간질 환의 말기 병변으로 지속적이고 반복적인 미만성 간손상과 그 결과로 섬유화와 간세포의 재생결절이 형성되는 질환이다(Ikeda et al., Hepatology 18:47-53, 1993; Minami H and Okanoue T, Int Med. 80: 646-649, 1997; Kiyosawa K, Hepatology Research 24: S40-S45, 2002). 간염의 주요 요인으로서는 일반적으로 바이러스, 약제, 알코올, 대사성 질환, 만성담즙울체, 간-정맥혈류폐색 등이 있다. 이 중 B형 바이러스 간염은 만성간염 또는 간경변증의 위험을 증가시키는데 성인에서 급성간염을 앓는 경우 10% 정도에서, 부모로부터 출생직후 수직 감염되는 경우에는 90% 이상에서 만성 B형 간염 보균자가 되며 성인이 된 후 40-50대에 많은 수가 만성간염이나 간경변증으로 이행된다(Velazquez et al., Hepatology, 37(3): 520-527, 2003). 한편 C형 바이러스 간염도 만성간염과 간경변증의 주요요인으로 추정되고 있으며 전체 간암환자의 16.6%에서 C형 간염 바이러스 항체에 양성을 보인다. 또한 간경변증은 간암환자의 60-90%에서 관찰되고, 간경변증 환자의 5-20%에서 간암이 발생하는 것은 간경변증이 간암의 주요 위험인자라는 것을 시사한다. 따라서 간경변증의 조기 발견 및 간경변증을 야기하는 인자의 제거가 필요하다(Velazquez et al., Hepatology 37(3): 520-527, 2003). 간경변을 일으킬 수 있는 인자로는 바이러스성 인자 이외에도 지속적인 폭음으로 인한 알코올 섭취, 약제, 혈색소증(血色素症) 등이 있다. 따라서 이들 질환과 위험인자의 조기감별과 제거, 예방접종 및 전염의 차단이 중요하다.

간경변증은 간의 염증이 오래 지속된 결과 간의 표면이 우둘두둘해지는 증상을 나타내는데, 이는 임상적으로는 범위가 넓어서 외관상 정상인과 별 차이가 없고 멀쩡한 환자에서부터 병색이 완연하고 수척하고 복수가 차 있는 환자에 이르기까지 증상이 다양하다. 간경변증은 있으나 합병증을 동반하지 않고 임상적으로는 정상인 전자(前者)와 같은 상태를 대상성(代償性) 간경변증이라 하고, 각종 합병증을 동반하는 후자(後者)와 같은 상태의 간경변증을 비대상성(非代償性) 간경변증이라 한다.

간경변증에 대한 가장 확실한 검사는 복강경(腹腔鏡)검사 또는 간 조직검사를 통해 이루어지며, 복강경검사는 배에 조그만 구멍을 내고 내시경을 넣어서 간을 직접 관찰하는 검사로서 간의 표면이 우둘두둘한 경변의 소견을 보이면 그것으로 진단을 내릴 수 있다. 또한 조직검사에서 간 섬유화 등의 소견이 관찰되면 간경변증 진단을 내릴 수 있다. 그러나 이런 검사들은 환자에게 매우 부담스러울 뿐만 아니라, 대개 진찰 소견, 혈액검사, 초음파나 CT 소견 등을 종합함으로써 진단될 수 있다. 간경변증의 경우 혈청 알라닌 아미노전이효소(serum alanine aminotransferase, ALT) (종래의 GOT, GPT) 수치, 즉 간염 수치는 그리 높지 않고, 대개 정상이거나 정상의 2배 이내인 경우가 많아서 진단에 유효하게 적용되지 못하고 있다. 대상성 간경변증의 경우는 제기능을 할 수 있는 간세포가 어느 정도 충분하기 때문에 알부민, 빌리루빈 등의 수치는 정상에서 크게 벗어나지 않으나, 비대상성 간경변증의 경우는 그렇지 않기 때문에 알부민이 감소하거나 빌리루빈이 증가하는 소견을 보일 수 있다. 간경변증 또는 진행된 상태의 만성간질환이 있는 환자들에서는 기능을 하는 간세포가 어느 정도 존재하느냐가 중요하며, 알부민이나 빌리루빈은 이를 대략적으로만 짐작하게 해 주는 지표이다. 또한 간세포에서는 혈 액응고인자들을 만들어내는데 기능을 하는 간세포가 충분치 않으면 이것들이 충분히 만들어지지 않아서 혈액응고가 지연될 수 있다. 프로트롬빈 시간(prothrombin time 또는 PT)이라는 검사는 혈액응고 시간을 직접 측정하는 검사이고 역시 잔여 간기능을 평가하는 지표 중의 하나이다. 간경변이 되면 비장이 커지고 커진 비장 내에 혈소판이 많이 갇혀 있어 일반 혈액검사상 혈소판 수치가 낮게 나오게 된다. 원인 모르게 혈소판이 저하되어 있다면 간경변증의 가능성을 의심해 보아야 한다. 만성간염에서와 같이 간염바이러스에 대한 혈청학적 표지자 검사도 중요하게 작용한다. 우리나라 간경변증의 60% 가량이 B형 간염바이러스에 기인하고, 20% 가량이 C형 간염바이러스에 기인하고 있다. 따라서 B형이나 C형 간염바이러스 표지자가 양성이라면 만성간질환을 갖고 있을 가능성이 높고, 여기에 간경변증을 시사하는 다른 소견들이 있다면 임상적으로 간경변증이라는 진단을 붙이는데 크게 무리가 없다.

간암의 조기발견을 위한 선별검사 중 하나인 혈청 알파-태아단백 (alpha-fetoprotein; AFP) 수치가 간경변증에서 비특이적으로 증가되기도 한다 (Adinolfi A et al., J Med Genet. 12(2): 138-151, 1975; Lok AS and Lai CL. Hepatology 9(1),110-115, 1989; Johnson PJ. Clin Liver Dis. 5(1):145-159, 2001). AFP 수치는 정상 성인의 혈청에는 존재하지 않지만 많은 간암 환자에게서 증가되기 때문에 간암 진단에 유용하게 이용되고 있다. 그러나, 이는 간암 외에 만성간염, 간경변증 등의 양성질환이나 융모막암종, 간모세포종 등의 악성질환 및 임산부에서도 증가될 수 있다(Collier J and Sherman M, Hepatology 27:273-278, 1998; Okuda K, J. Hepatol. 32(1 Suppl):225-237, 2000). 즉, 간암을 동반하지 않은 만성 간염과 간경변증 환자의 일부에서는 혈청 AFP 수치가 비특이적으로 상승될 수 있다. 이런 이유 때문에 AFP는 만성 간질환 환자의 간암 선별을 위해 꼭 필요한 검사이지만, 그 수치를 해석하여 간암 여부를 진단할 때는 고려해야 할 사항들이 많다. 따라서, 이러한 연구의 일환으로 간경변증 환자의 조기진단을 위해서는 기존의 AFP 검사법 등에 비하여 민감도와 특이도가 보다 높은 새로운 혈청학적 검사방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 간경변증의 효과적인 조기진단을 위한 검사방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 인간 원암유전자인 HCCR-2 (대한민국 특허공개 제2002-41550호, GenBank Accession No. AF315598)로부터 발현되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 항원-항체 결합반응으로 간경변증을 효과적으로 검출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 간경변증의 효과적인 조기진단을 위하여 혈청 중 인간 원암단백질을 검출하는 방법 및 이를 이용한 간경변증 진단 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 인간 원암유전자 HCCR-2로부터 발현된 단백질에 특이적인 항체를 포함하며, 항원-항체 결합반응을 통해 생체 시료 중 HCCR-2 단 백질의 발현을 검출하는 방법 및 이를 이용한 간경변증 진단키트를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 인간 원암유전자 HCCR-2 (GenBank Accession No. AF315598; 대한민국 특허공개 제2002-41550호)은 포유동물에서 과발현되어 암을 유발하는 발암 유전자로서 염색체 12번 장완 (12q)에 위치하고 하나의 전사 해독 프레임 (open reading frame)을 가지며, 이로부터 약 36 kDa 크기의 단백질 (이하, HCCR-2 단백질이라 함)이 유추된다.

HCCR-2 단백질에 특이적인 항체는 HCCR-2 항원 단백질을 동물에 면역시켜 얻은 항혈청 또는 난(卵)으로부터 정제한 것이 바람직하고, 특히 토끼에 면역시켜 얻은 혈청에서 정제한 다중클론 (polyclonal) 항체가 바람직하다.

HCCR-2 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 제조하기 위해서는, 우선 HCCR-2 단백질을 입수하여야 한다. HCCR-2 단백질은 공지된 아미노산 서열을 이용하여 합성하거나 유전공학적 방법에 의해 재조합 단백질의 형태로 생산할 수 있다. 예를 들면, NIH 프로그램 GenBank 상에 등록된 HCCR-2 유전자의 염기서열을 이용하여 HCCR-2 단백질을 재조합 단백질 형태로 발현하는 발현벡터를 제조하는 단계; 상기 발현벡터를 대장균에 형질전환시켜 HCCR-2 재조합 단백질을 생산하는 형질전환체를 얻는 단계; 및 상기 형질전환체를 배양하여 인간 원암유전자 HCCR-2 재조합 단백질을 분리·정제하는 단계에 의해 HCCR-2 재조합 단백질을 제조할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는, HCCR-2 유전자의 아미노산 서열 112-304를 함유하는 pMAL-p2X/HCCR-2112-304 벡터로 형질전환된 대장균 BL21로부터 N-말단 에 말토오스 (maltose)가 융합된 재조합 단백질을 생산한 후, 적절한 효소를 처리하여 말토오스를 분리·정제한 HCCR-2112-304 단백질을 항원 단백질로 사용한다. 상기와 같이 대장균 형질전환체로부터 생산된 단백질이 HCCR-2112-304 재조합 단백질임을 확인하기 위하여 웨스턴 블럿 분석을 수행한 결과, 약 66 kDa의 분자량(pMAL 의 45 kDa + HCCR-2112-304 의 16 kDa)을 가지는 HCCR-2 재조합 단백질이 특이적으로 검출됨을 확인하였다.

대장균 형질전환체로부터 분리·정제된 HCCR-2 재조합 단백질은 토끼의 면역화를 통해 다중클론 항체를 생산하기 위한 항원으로 사용된다.

다중항체의 개발에 필요한 면역화된 토끼는 상기에서 분리·정제된 HCCR-2 재조합 단백질과 동량의 프로인트 완전 보조항원 (Freund's complete adjuvant)을 유상화될 때까지 잘 혼합하여 토끼의 피하에 주사한 후 생쥐의 면역성을 높이기 위하여 추가로 항원 주입 (booster injection)하여 얻어진다. 이때, 완전 보조항원을 사용하지 않고 HCCR-2 재조합 단백질을 프로인트 불완전 보조항원 (Freund's incomplete adjuvant)에 유상화시켜 토끼의 피하 내에 추가로 3회 이상에 걸쳐 주사하는 것이 바람직하다. 이와 같이 HCCR-2 재조합 단백질 항원이 주사되어 면역화된 토끼로부터 혈청을 채취하여 항체의 역가를 측정한다.

상기와 같이 생산된 HCCR-2 특이적인 항체를 이용하여 항원-항체 결합반응으로 암을 진단하는 방법은 당분야에 공지된 효소결합 면역흡착 분석법 (enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선 면역측정법 (radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법 (sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블럿, 면역 블럿 분석 또는 면역 조직화학염색 (immunohistochemical staining) 등의 방법에 의해 대상자의 생체 시료(검체) 중에 상기 단백질이 발현되었는지를 확인함으로써 진단할 수 있다.

생체 시료(검체)로서는 조직, 혈청 또는 혈장을 사용할 수 있고, 혈청이 가장 바람직하다.

본 발명의 바람직한 일례로서, HCCR-2 단백질에 특이적인 항체를 이용한 효소결합 면역흡착 분석법은

1) 검체 및 대조군이 코팅된 반응기에 HCCR-2 특이적인 항체를 넣어 반응시키는 단계;

2) 상기 반응을 통해 생성된 항원-항체 반응물을 2차 항체-접합체 (conjugate) 및 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및

3) 검체와 대조군에 대한 검출 결과를 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, ELISA 방법과 더불어, 상기 HCCR-2 특이적인 항체를 생물학적 마이크로칩 (biological microchip) 상에 고정시킨 후 대상자로부터 분리된 생체 시료와 반응시켜 상기 항체 단백질에 대한 항원을 검출할 수 있는 생물학적 마이크로칩 (biological microchip) 및 자동화된 미세배열 시스템 (microarray system)을 이용하면 대량으로 시료를 분석할 수 있다.

또한, 본 발명은 간경변증을 효과적으로 조기에 진단하기 위하여 상기 HCCR-2 단백질에 특이적으로 반응하는 항체를 구성요소로 포함하는 간경변증 진단키트를 제공한다.

본 발명의 진단키트는

1) HCCR-2 단백질에 특이적인 항체;

2) HCCR-2 표준항원을 포함하는 양성 대조군과 상기 항원이 주입되지 않은 동물의 항혈청을 포함하는 음성 대조군;

3) 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체;

4) 상기 표지체와 발색 반응할 발색기질 용액;

5) 각 반응단계에 사용할 세척액; 및

6) 효소반응 정지용액을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 진단키트는 항원-항체 결합반응을 통하여 항체 단백질에 대한 항원을 정량분석 또는 정성분석함으로써 간경변증을 진단할 수 있으며, 상기 항원-항체 결합반응은 통상의 ELISA, RIA, 샌드위치 측정법, 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블럿, 면역 블럿 분석 또는 면역 조직화학염색 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 검체 및 대조군을 표면에 코팅시킨 96 웰 마이크로타이터 플레이트 등을 이용하여 상기 재조합 단일클론 항체 단백질과 반응하는 ELISA를 수행하도록 상기 진단키트를 제공할 수 있다.

상기 항원-항체 결합 반응을 위한 반응기로는 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐 (Polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌 (Polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트 (well plate) 및 유리로 된 슬라이드 글래스 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 항체는 전술한 바와 같이 HCCR-2 단백질 항원을 동물에 면역시켜 얻은 항혈청으로부터 정제하는 것이 바람직하다. 본 발명의 HCCR-2 특이적인 항체 는 반응기 당 1 내지 10 ㎍/ 100 ㎕로 첨가는 것이 바람직하다.

본 발명의 진단키트에 포함되는 대조군은 양성 대조군과 음성 대조군이 있는데, 양성 대조군은 HCCR-2 단백질 표준항원을 포함하는 혼합물이고 음성 대조군은 HCCR-2 단백질 항원으로 감염되지 않은 동물의 혈청이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 단백질 농도가 각각 0 ng/㎖ (A), 20 ng/㎖ (B), 40 ng/㎖ (C), 80 ng/㎖ (D), 160 ng/㎖ (E), 320 ng/㎖ (F) 및 640 ng/㎖ (G)인 HCCR-2 단백질 표준항원 용액을 준비하여 사용하였다.

상기 2차 항체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP (horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소 (alkaline phosphatase), 콜로이드 골드 (coloid gold), FITC (poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC (rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질 (fluorescein) 및 색소 (dye) 등의 표지체가 사용될 수 있다. 본 발명에서는, 예를 들어 염소 유래의 항-토끼 IgG-HRP 접합체 (goat anti-rabbit IgG-HRP conjugate)를 사용한다.

상기 발색을 유도하는 기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD (o-phenylenediamine) 등을 사용할 수 있다. 이 때, 발색제 기질은 완충용액 (0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 2차 항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고 그 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 HCCR-2 단백질 항원의 존재 유무를 검출한다.

상기 세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액 (phosphate buffer), 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20 (Tween 20)으로 구성된 완충용액이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 반응기에 넣어 3 내지 6회 세척한다. 블로킹 용액은 0.1% BSA를 함유하는 인산염 완충용액이, 반응 정지용액은 2 N의 황산용액이 바람직하다.

상기 진단키트를 이용하여 검체 시료 내 HCCR-2 항원을 검출함으로써 간경변증을 조기에 진단하는 방법은 양성 및 음성 대조군과 검체 시료에 HCCR-2 다중클론 항체를 각각 반응시키고, 세척액으로 세척한 후 기질과의 반응에 의해서 발색을 나타내는 표지체가 표지된 2차 항체 접합체를 가하고, 다시 세척액으로 세척한 후 상기 기질함유 용액을 첨가하여 발색 반응시키고, 450 ㎚에서의 흡광도를 측정하는 것을 특징으로 한다. 이 때, 표준항원 용액 A의 흡광도는 평균값이 0.000 이상 0.200 이하이어야 하고, F의 흡광도는 1.200 이상 3.000 이하이어야 한다. 표준항원 용액 A 및 F의 흡광도 중간값을 역치값 (cut-off value)으로 하여 검체를 양성 또는 음성으로 판정하는 기준으로 삼는다. 검체의 흡광도가 표준항원 용액 F의 흡광도보다 클 경우에는 검체를 희석한 후 다시 측정한다. 검체의 흡광도가 역치값 이상인 경우를 양성으로 판단하고 이하인 경우를 음성으로 판단한다.

본 발명에 따른 인간 원암유전자 HCCR-2에 특이적인 항체를 포함하는 간경변증 진단키트는 환자의 혈액을 이용하는 새로운 면역학적 진단 도구로서 정확도 및 재현성이 높다는 사실이 확인되었다. 기존에 간경변증에 대한 혈청학 진단도구로 는 간암에서 사용되고 있는 AFP 간암 진단제가 이용되고 있었으나 진단적 정확도가 간경변증에서는 매우 낮다.

그러나, 간경변증의 조기진단을 위한 혈청 HCCR-2 검사법은 기존의 AFP 검사법을 이용한 간경변증 진단보다 진단적 정확도가 통계적으로 유의하게 높았다 (95.1%). 따라서, 본 발명에 따른 인간 원암유전자 HCCR-2를 이용한 간경변증 검출방법 및 간경변증 진단키트는 진단의 정확도 및 재현성이 높아 간경변증의 조기진단에 매우 유용한 도구로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> HCCR-2 다중클론 항체의 생산

<1-1> HCCR-2 재조합 단백질의 생산

간암 진단을 위한 종양 표지물질로서 인간 원암유전자 HCCR-2에 특이적인 항체를 생산하기 위하여 인간 원암유전자 HCCR-2의 일부 (GenBank Accession No. AF315598의 아미노산 서열 112 내지 304에 해당)를 pMALTM-p2X 발현벡터 (New England Biolabs, MA)의 다중 클로닝 부위에 삽입하여 pMALTM-p2X/HCCR-2112-304 벡터를 제작하였다. 상기 벡터를 대장균 BL21(DE3)(Novagen, WI)에 형질전환한 후 1 mM IPTG (isopropyl β-D-thiogalacto-pyranoside, Sigama) 처리로 발현을 유도하여 약 45 KDa의 말토오스 결합 단백질이 융합된 66 KDa의 HCCR-2112-304 융합단백질을 생산하였고, 이를 아밀로스 수지 키트 (New England Biolabs)로 정제하였다 (국제출원 공개 제 WO 02/44370 A1호). 정제된 재조합 단백질을 면역 블롯팅한 결과, 약 66 kDa의 융합단백질이 다량 함유되어 있음을 확인하였다 (도 1). 이와 같이 분리·정제된 HCCR-2 재조합 단백질은 토끼의 면역화 및 다중클론 항체를 생산하기 위한 항원-항체 결합반응의 항원으로 사용되었다.

<1-2> 토끼의 면역화

상기 <1-1>에서 획득한 HCCR-2 재조합 단백질에 특이적인 항체 생산을 위한 동물은 약 2.5 kg 중량의 NZW 토끼를 사용하였다. HCCR-2 재조합 단백질 (200 ㎍/㎖)과 프로인트 완전 보조제 (Sigma Chemical Co.)를 각각 동량 혼합하여 유화시켰다. 상기 유화액 2 ㎖를 토끼의 피하에 각각 0.25 ㎖씩 8곳에 근육 주사하여 1차 접종하였다. 추가 항원주입 (Booster injection)은 1차 접종 후 2주 간격으로 수차 실시하였으며, 면역항원을 프로인트 불완전 보조제 (Sigma Chemical Co.)로 유화하여 1차 접종과 동일한 방법으로 실시하였다.

<1-3> 토끼 혈청 (Rabbit serum)의 분리 및 특이 다중항체의 선별

<1-2>와 같이 면역화된 토끼의 이동맥에서 최종 접종 후 5일째부터 2주 간격으로 혈액을 채취하여 혈청을 분리한 후 -20℃에 보관하여 각종 실험측정에 이용하 였다. 상기 혈청은 항체특이성을 조사하였을 때 인간 원암유전자 HCCR-2 단백질에만 특이적으로 반응하였다. 채취한 혈청들 중에서 인간 원암유전자 HCCR-2 재조합 단백질 항원에만 특이적으로 반응하는 혈청들을 선별하기 위하여, 상기 <1-1>의 대장균 형질전환체로부터 분리·정제된 HCCR-2 재조합 단백질을 항원으로 사용한 ELISA를 수행하였다.

구체적으로, 비특이성 면역 반응을 억제하기 위하여 96 웰 플레이트 (Falcon Co., USA)를 1% 탈지분유 (skim milk)-PBS를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 노출시켜 코팅한 후, 웰당 1 ug의 재조합 단백질들을 코팅하였다. 상기 웰에 토끼혈청 원액을 2% BSA를 함유한 PBS 용액으로 각각 1 X 103, 1 X 104, 1 X 105, 1 X 106, 1 X 107의 농도별로 희석시킨 후 희석액들을 웰당 각각 100 ㎕ 씩 첨가한 후 37℃에서 2시간 동안 항원-항체 결합반응을 진행시켰으며 이후 PBS 용액으로 3회 세척하였다. 이후 2% (W/V) BSA를 함유하는 PBS 완충용액으로 희석 (1 : 10,000)된 염소 유래의 항-토끼 IgG-HRP (Sigma Co., USA) 2차 항체를 웰당 100 ㎕씩 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.

이후, 0.1 M 시트레이트 인산염 완충용액 (phosphate buffered citrate, pH 5.0) 10 ㎖에 1 ㎎의 TMB (3.3', 5.5'-tetramethylbenzidine, Sigma Co., USA) 와 20 ㎕의 35% 과산화수소를 혼합하여 제조한 기질용액을 웰당 100 ㎕씩 첨가하여 효소반응을 유도하였다. 실온에서 15분간 효소반응을 유지시킨 후 동량의 2 N 황산용액을 첨가하여 효소 반응을 중단시킨 다음 발색 반응의 정도를 450 ㎚에서 측정하였다. 이로부터 HCCR-2 항원에 대한 특이항체를 가지고 있는 다중클론 항체를 ELISA로 분석시 항체 역가가 음성 대조군보다 10배 이상 높은 혈청을 다시 선별하여 특성분석을 시작하였다.

<실시예 2> HCCR-2 다중클론 항체를 이용한 ELISA

HCCR-2 다중클론 항체를 이용한 ELISA에 의해 간경변증을 진단하는 방법은 ① 검체 시료를 처리하여 웰에 코팅시키는 단계; ② ELISA 플레이트의 웰에 토끼로부터 분리·정제한 HCCR-2 다중클론 항체를 코팅하는 단계; 및 ③ 검체 시료 내 존재하는 HCCR-2 항원이 웰의 항체에 결합되어 있는 것을 검출하는 단계에 의해 수행되었다.

<2-1> 웰에 검체 시료의 코팅

검체 시료는 간경변증 환자로부터 추출한 혈액, 간염 환자로부터 추출한 혈액, 정상인의 혈액으로부터 혈청을 분리하여 준비하였고, 역치값 (cut-off value) 측정을 위한 표준곡선 (standard curve)은 HCCR-2 재조합 단백질을 각각 0 ng/㎖, 20 ng/㎖, 40 ng/㎖, 80 ng/㎖, 160 ng/㎖, 320 ng/㎖ 및 640 ng/㎖ 농도로 희석한 표준항원 용액 A, B, C, D, E, F 및 G를 이용하였다. 바닥이 평편한 96웰 ELISA 플레이트의 웰에 검체 시료를 100 ㎕씩 분주한 후 37℃에서 4시간 동안 반응시키고 각 웰을 세척용 완충용액(0.05% 트윈 20을 포함한 PBS, pH 7.4)으로 4회 세척하였다. 이때, 양성 대조군으로는 상기에서 준비한 표준항원 용액을, 음성 대조군으로는 정상 토끼의 혈청을 동량 첨가하였다.

<2-2> HCCR-2 다중클론 항체의 첨가

검체가 코팅된 플레이트의 각 웰에 상기 <1-3>에서 준비한 HCCR-2 다중클론 항체를 주입하고 덮개로 덮은 후, 4℃에서 16 내지 18시간 동안 방치하였다. 이때, 다중클론 항체는 5 ㎍/㎖ 농도로 0.5 M 탄산염 완충용액 (pH 9.6)에 희석한 후 100 ㎕씩 웰에 첨가하였다. 대조군으로 HCCR-2 단백질로 면역되지 않은 토끼의 혈청 (정상 토끼 혈청)을 탄산염 완충용액에 500배 희석하여 100 ㎕씩 웰에 분주하였다.

그런 다음, 플레이트의 웰을 세척용 완충용액으로 4회 세척하고 비특이적 단백질 결합부위를 차단하기 위하여 블로킹 용액 (2% BSA를 포함한 PBS (pH 7.4) 완충용액)을 300 ㎕씩 분주한 다음, 37℃에서 2시간 동안 방치하였다.

<2-3> 항원-항체 결합체의 검출

고추냉이 퍼옥시다제 (horsedarish peroxidase)로 표지된 염소 유래의 항-토끼 IgG 2차 항체를 1:10,000으로 희석시켜 상기의 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였고 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 정치한 후 각 웰을 세척용 완충용액으로 4회 세척하였다. 이어서, 기질인 TMB (3.3',5.5'-tetramethylbenzidine, Sigma Co., USA) 1 ㎎을 기질용 완충용액 (구연산 완충용액, pH 5.0) 10 ㎖에 용해시키고, 35% 과산화수소를 2 ㎕ 되도록 첨가하여 기질용액을 제조하였다. 상기 기질용액 100 ㎕씩을 웰에 넣고 빛을 차단하여 실온에서 15분간 반응시킨 후, 2 N H2SO4 용액을 50 ㎕씩 첨가하여 반응을 정지시켰다. 기질용액의 발색 반응정도는 450 ㎚ 파장에서의 흡광도를 측정함으로써 결정하였다.

각 검체 시료의 흡광도에서 양성 대조군인 HCCR-2 융합단백질만이 코팅된 웰의 흡광도와 음성 대조군인 PBS만을 넣은 웰의 흡광도를 감하고 남은 나머지를 HCCR-2 항원에 의한 흡광도로 추정하였다. 또한, 동일한 방법으로 표준액의 흡광도를 계산한 후 표준액 A와 F의 흡광도의 중간값을 역치값으로 정하고 흡광도가 역치값 이상인 검체는 양성으로, 이하인 검체는 음성으로 판정하였다. 이 때, 표준액 A의 흡광도는 평균값이 0.000 이상 0.200 이하여야 하고, 표준액 F의 흡광도는 평균값이 1.200 이상 3.000 이하여야 한다.

HCCR-2 표준항원 용액을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 역치값을 10 ㎍/㎖로 결정하였고, 이를 기준으로 각 검체의 흡광도를 비교하여 양/음성을 판정하였다. 간경변증 환자 및 정상인에서 ELISA 방법에 의해 HCCR-2 단백질의 혈중 농도를 측정한 결과는 도 3에 나타내었다.

<실시예 3> HCCR-2 다중클론 항체를 이용한 ELISA에 의한 간견병증 진단의 효율성 확인

<3-1> 간경변증 환자군에서 AFP와 HCCR-2 키트의 진단 정확도 비교

본 발명에 따른 HCCR-2 다중클론 항체를 이용한 ELISA 진단키트 및 검출방법에 의한 간경변증 진단의 효율성을 확인하기 위하여, 실시예 2에 기재된 HCCR-2 특이적인 항체를 이용한 ELISA 방법과 기존에 간암 또는 간경변증 진단을 위해 사용 되어 온 혈청 알파-태아단백 (alpha-fetoprotein, AFP) 수치 측정방법을 비교하였다. 이 때, AFP 수치는 시판되고 있는 ELSA2-AFP 측정키트 (CIS Bio International, France)를 사용하여 측정하였다.

진단 결과의 양/음성은 AFP의 경우에는 20 ng/㎖을, HCCR-2의 경우에는 표준곡선 (standard curve)에서 얻어진 10 ㎍/㎖을 각각의 역치값 (cut-off value)으로 하여 결정하였다. 간경변증군, 그리고 정상군의 각 집단 내에서 AFP와 HCCR-2간의 양성반응율의 차이는 멕나마르 (McNemar) 검정으로 비교하였으며, 간경변증군과 정상군으로부터 HCCR-2의 민감도, 특이도, 위양/음성율과 각각의 95% 신뢰구간을 추정하였다. HCCR-2의 집단간 양성반응율의 차이는 피셔의 정확도 테스트 (Fisher's exact test)로, 각 집단 내에서 AFP와 HCCR-2간의 양성반응율의 차이는 멕나마르 검정으로 비교하였다. 모든 통계적 분석에는 SAS 분산 6.12 (SAS. SAS/STAT Software: Changes and Enhancements through Release 6.12. Cary, NC: SAS Institute, 1997)가 사용되었고, 검정의 유의수준은 0.05로 하였다.

하기 표 1에 62명의 간경변증 환자군에서 AFP 수치를 확인하지 못한 1명의 간경변증 환자를 제외한 61명에서 HCCR-2와 AFP 키트의 진단 정확도를 비교하였다. 그 결과, HCCR-2의 진단 정확도는 95.1%로, AFP의 18.0%에 비해 유의하게 높게 나타났다 (

df=1, P=0.0001, 멕나마르 테스트).

<3-2> HCCR-2 키트의 간경변증 진단도구로서의 유용성 확인

하기 표 2 및 표 3에서 보는 바와 같이, 62명의 간경변증 환자와 138명의 정상인을 대상으로 하여 실시예 2의 HCCR-2 특이적 항체를 이용한 ELISA 방법으로 간경변증을 진단했을 때, 본원 발명의 HCCR-2 키트의 민감도는 95.2%, 특이도는 91.3%였으며, 위양성율과 위음성율은 각각 16.9%와 2.3%로 나타났다. 또한, 전체 진단의 정확도는 92.5%로 나타나, 진단도구로서의 유용성이 매우 높음을 확인하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 인간 원암유전자 HCCR-2에 특이적인 항체를 포함하는 간경변증 진단키트는 환자의 혈액을 이용하는 새로운 면역학적 간경변증 진단 도구로서 간경변증에 대한 진단적 정확도 및 재현성이 높아 간경변증의 조기진단에 유용하게 사용될 수 있다.

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인간 HCCR-2 단백질 (GenBank Accession No. AF315598)에 특이적인 항체를 포함하며 항원-항체 결합반응을 통해 검체 시료 중 HCCR-2 단백질의 발현 정도를 측정하여 간경변증을 진단하기 위한 진단 키트.
제 7 항에 있어서,

1) HCCR-2 단백질에 특이적인 항체;

2) HCCR-2 표준항원을 포함하는 양성 대조군과 상기 항원이 주입되지 않은 동물의 항혈청을 포함하는 음성 대조군;

3) 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체;

4) 상기 표지체와 발색 반응할 발색기질 용액;

5) 각 반응단계에 사용할 세척액; 및

6) 효소반응 정지용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
제 8 항에 있어서,

2차 항체 접합체의 표지체가 HRP (horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소 (alkaline phosphatase), 콜로이드 골드 (coloid gold), 형광물질 (fluorescein) 및 색소 (dye)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
제 8 항에 있어서,

발색기질이 TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 및 OPD (o-phenylenediamine)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
제 7 항에 있어서,

항원-항체 결합반응을 효소결합 면역흡착 분석법 (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선 면역측정법 (radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법 (sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블럿, 면역 블럿 분석법 또는 면역조직화학염색 방법으로 측정하는 것을 특징으로 하는 진단키트.
제 7 항에 있어서,

HCCR-2 단백질에 특이적인 항체가 인간 HCCR-2 단백질을 동물에 면역시켜 얻은 항혈청 또는 난(卵)으로부터 정제하여 얻은 것임을 특징으로 하는 진단 키트.
제 7 항에 있어서,

상기 검체가 조직, 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 진단 키트.