KR20070059373A - Ｎｄｒｇ2 단백질에 대한 단일클론항체 및 단백질 칩을이용한 정량 측정법 - Google Patents
Ｎｄｒｇ2 단백질에 대한 단일클론항체 및 단백질 칩을이용한 정량 측정법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인간 말초혈액의 단핵구 세포에서 분화된 수지상 세포 특이적으로 발현되며 암화 관련 인자인 NDRG2 (N-myc downstream regulated gene 2)에 대한 단일 클론 항체와 그 세포주, NDRG2의 정량분석을 위한 단백질칩에 관한 것이다. 이 단일클론 항체와 단백질 칩을 이용한 NDRG2 정량법은 수지상 세포의 특성연구는 물론 NDRG2 관련연구에 유용하게 사용할 수 있을 것으로 사료되며, 더 나아가 난치성 질환 및 항암치료에 수지상 세포를 임상적으로 이용하기 위한 연구에 도움이 될 수 있다.
NDRG2 (N-myc downstream regulated gene 2), 웨스턴 블랏팅 (Western blotting), 세포주, 단일클론 항체, 단백질 칩, 정량분석
Description
도 1은 NDRG2 재조합 단백질 발현 및 분리, 정제를 보여주는 전기영동 사진.
도 2는 NDRG2 단일클론 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅으로 NDRG2 재조합 단백질에 대한 반응성을 확인한 전기영동 사진.
도 3은 NDRG2 단백질과 시료가 처리된 단백질칩을 NDRG2와 반응하고 발색시킨 후의 사진.
도 4a는 NDRG2 표준액의 농도에 따른 발색정도를 보여주는 단백질칩의 발색 사진.
도 4b는 NDRG2 농도에 따른 발색강도를 나타낸 표준 곡선.
도 4c는 NDRG2 표준액과 세포주 시료의 웨스턴 블럿의 결과를 보여주는 전기영동사진.
도 5a는 각 세포주 시료의 희석 농도별 발색정도를 보여주는 단백질칩의 사진.
도 5b는 각 세포주 시료의 희석 농도별 발색강도를 수치로 나타낸 그래프.
도 6a는 각 간암세포와 정상세포들의 단백질칩 발색결과.
도 6b는 간암세포와 정상세포를 25배 희석한 시료의 발색강도를 수치로 나타낸 그래프.
도 6c 은 간암세포와 정상세포에 대한 웨스턴 블럿의 결과를 보여주는 전기영동 사진.
본 발명은 면역분석 분야에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인간의 면역세포 중 수지상세포에서 특이적으로 발현되어지며 암 억제 유전자(tumor suppressor gene)의 후보물인 N-myc downstream regulated gene 2(NDRG2)단백질에 대한 단일클론항체와 이를 이용하여 NDRG2의 양을 정량적으로 분석하는 방법에 관한 것이다.
NDRG2 유전자는 주로 뇌, 심장, 근육, 또는 신장세포와 같은 다양한 종류의 조직세포에서 발현되어지는 유전자이다(Qu et al., 2002; Mol Cell Biochem. 229:35-44, Kokame et al., 1996; J Biol Chem. 271:29659-29665, Ulrix et al. 1999; FEBS Lett. 455:23-26). NDRG 유전자는 서로 다른 4종류의 유전자가 보고되어 있는데, 이들은 높은 유사성(homology)을 가지며, 개체의 발달과 성장에 따라 발현 형태가 달라진다. NDRG1은 비교적 모든 조직과 세포에서 발현되어지는 반면, NDRG2와 NDRG3의 경우에는 뇌, 심장, 근육, 신장세포에서 발현되고, NDRG4는 오직 뇌와 심장세포에서 제한적으로 발현되어진다. 따라서, 이들 유전자들이 서로 다른 기능을 할 것으로 예상되어지고 있으나, 아직 이들의 정확한 기능에 관한 보고는 없었다.
한편 수지상 세포는 항원을 제시해주는 세포(APC; antigen-presenting cell)로서 항원 제시와 면역세포의 기능조절에 필수적인 세포이다. 또한, 이 수지상 세포는 항원을 접한 적이 없는 미접촉 T세포(naive T 세포)를 자극시킬 수 있는 일차면역반응(Primary immune response)을 유도할 수 있는 독특한 면역세포이다. 따라서 감염질환(Infectious disease)과 종양면역(Tumor immunity)에서 수지상 세포의 역할에 대한 연구가 활발히 진행되어지고 있다. 특히 별다른 예방 및 치료수단이 없는 난치성 질환의 경우, 수지상 세포를 응용한 특이적 면역반응 유도용 백신의 개발을 위해 수지상 세포에 대한 유전적 연구(Genomic study)로서, 이 세포의 생물학적 기능을 밝히기 위해 노력하고 있다. 최근 연구에 의하면 자연살해세포(NK cell)와 수지상 세포를 같이 주입함으로서 항암 치료의 효과가 큼이 입증되고 있으므로 세포제 치료제 개발에 있어 NK 세포와 함께 성숙(mature)된 수지상 세포의 역할이 매우 크다. 그러므로 세포제 치료제의 효과를 극대화하기 위해 성숙된 수지상세포에 대한 마커개발의 중요성이 대두되고 있다.
그러나, 다량의 수지상 세포를 얻는 어려움과 이 세포에만 특이적으로 존재하는 표지자가 아직 발견되어있지 않은 문제점이 있다. 또한 수지상 세포의 특성을 완전히 이해하지 못하고 있어 임상적인 어려움이 있다. 따라서, 수지상 세포의 특성에 대한 연구가 심도 깊게 이루어지고, 특이적으로 발현되는 유전자나 단백질을 검색하고, 그 기능에 대한 연구를 통해 효과적인 방법으로 임상에서 수지상 세포를 이용한 다양한 질병의 치료와 예방에 이용할 수 있을 것이다.
본 발명진은 NDRG2 유전자가 인간 말초혈액의 단핵구 세포에서 분화된 수지상 세포에 특이적으로 발현되는 것을 발견, 이 유전자를 형질도입 시킨 세포주와 NDRG2 단백질의 폴리클론 항체를 제조하고 이에 대한 내용을 보고한바 있다(국제특허 PCT/KR2004/000634, Choi SC et al., 2003, FEBS Lett. 553(3): 413-418).
또한 NDRG2는 암 억제 유전자로서 암화작용에 관련할거라는 보고가 있으며 암화된 세포에서는 NDRG2의 발현이 감소하고 특히 악성인 경우 감소되는 정도가 크다는 보고가 있다. 예를 들어 최근 유전정보 분석(genomic analysis)을 통해 공격적 뇌수막종(aggressive meningioma)에서 NDRG2의 발현이 현저히 저하됨이 보고되었으며(Lusis EA et al, Canser Res. 2005, 65; 7121-6) 간암과 췌장암(pancreatic cancer)에서 NDRG2 의 mRNA 양이 현저히 저하됨이 보고되었다(Hu XL et al., 2004, World J Gastroenterol., 10; 3518-21). 이와같이 암화된 세포에서는 NDRG2가 현저히 감소하고 있으며 강력한 암 억제 유전자으로 대두되고 있으므로 NDRG2의 발현을 조절함으로서 암 치료를 할 수 있을 것으로 기대된다.
그러나 현재까지는 NDRG2에 대한 연구가 미비하며 이제 시작단계에 있으며 이와 같은 연구를 위한 NDRG2 단백질에 대한 단일클론 항체 및 정량적인 측정법이 전무하다. 본 연구팀에 의해 폴리클론 항체가 만들어져(국제특허 PCT/KR2004/000634, Choi SC et al., 2003, FEBS Lett. 553(3): 413-418) 수지상 세포의 특성연구에 이용하고 있으며, 세포 또는 조직에서의 NDRG2의 존재는 웨스턴 블럿 또는 immunostaing과 같은 정성적인 방법에 의존하여 측정하고 있다. 그러나 더군다나 조직에서의 immunostaing은 background가 높아 측정에 어려움이 있는 등 연구에 제약이 따른다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 수지상 세포에서 발현되는 NDRG2의 기능과 암세포에서의 NDRG2의 기능을 연구하기 위하여 NDRG2 단백질에 대한 단일클론 항체와 상기 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일 클론 항체를 이용한 NDRG2에 대한 단백질 칩과 이를 이용하여 NDRG2의 발현 양을 정성 또는 정량적으로 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 사람의 말초혈액 단핵구, 또는 제대혈의 줄기세포에서 분화된 수지상 세포에서 특이적으로 발현되는 인간 NDRG2(N-myc downstream regulated gene 2) 단백질에 특이성을 가지는 단일클론항체 및 이를 분비하는 하이브리도마를 제공한다.
또한 이를 이용하여 단백질 칩으로 정량분석함으로써 각 세포와 조직에서의 NDRG2 단백질의 발현을 비교하는 것을 그 특징으로 한다.
국제특허 PCT/KR2004/000634에서 인간 말초혈액의 단핵구 세포에서 분화된 수지상 세포 특이적으로 발현되는 NDRG2 유전자를 발견하고, 이 유전자를 형질도입 시킨 세포주와 NDRG2 단백질의 폴리클론 항체를 제조하였다. 본 발명에서는 선행 연구에서 얻어진 NDRG2 재조합 단백질을 면역주사하여 NDRG2에 대한 단일클론 항체를 제조하였으며 상기 항체를 함유하는 단백질칩을 만들어 NDRG2 단백질을 정량적으로 분석할 수 있음을 확인하였다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
단일클론항체는 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있는 융합 방법(fusion method)에 의해 만들어질 수 있다(Kohler et al. European Journal of Immunology 6;511-519). 일반적으로, 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마 세포는 항원 단백질을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 면역 세포와 암 세포주를 융합함으로서 만들어진다. 이런 두 집단의 세포 융합은 폴리에틸렌 글리콜과 같이 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있는 방법을 이용하여 융합시키고 항체 생산 세포를 표준적인 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution)에 의한 서브 클로닝을 실시하여 균일한 세포 집단을 수득하고 난 뒤 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포를 시험관 또는 생체내에서 대량으로 배양한다.
세포 융합에 사용되는 골수종 세포로는 마우스 유래의 p3/x63-Ag8, p3-U1, NS-1, MPC-11, SP-2/0, F0, P3x63 Ag8, V653, S194, 랫트 유래의 R210 등 다양한 세포주를 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적 실시예 사용된 세포주는 골수종 세포 NS-1이다.
구체적으로 본 발명자는 인간 NDRG2 단백질을 고친화적으로 특이하게 인식하는 단일클론항체를 제조하고자, NDRG2라는 유전자(GenBank 등록번호: NM_016250)가 특이적으로 발현되는 수지상 세포의 cDNA 라이브러리를 주형으로 염기서열이 5'-AAGGTCTTGTCCTCATCAAC-3'(서열번호1)과 3'-TCAACAGGAGACCTCCAT-5'(서열번호 2)인 프라이머를 이용하여 35 사이클(95℃ 1분, 57℃ 1분, 72℃ 1분)의 NDRG2의 연쇄중합반응(RT-PCR)을 통해 얻어진 627bp의 NDRG2 유전자를 획득한 후 pEZ 벡터를 이용하여 클로닝하고 염기 서열을 확인하여 NDRG2 유전자임을 확인하였다. pEZ 벡터에 클로닝되어 있는 NDRG2 유전자를 Xho I과 BamH I의 잘라낸 후 대장균 발현 벡터인 pET28a 벡터에 접합하고, BL21 대장균에 형질전환(Transformation)시켜 207개의 아미노액시드로 구성된 NDRG2 재조합 단백질을 얻었다.
발현된 단백질을 이용하여 마우스를 면역화하고 이로부터 적출한 비장 세포와 골수종 세포를 융합하였으며 하이브리도마 중 인간 NDRG2 항원에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포주를 선별하였다. 수득된 하이브리도마 NDRG2-19C-4는 2005년 10월 5일자로 국제기탁기관인 대전시 유성구 어은동 52번지 소재의 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 수탁번호 KCTC10854BP로 기탁하였다. 서브클래스 타입을 확인한 결과 클론 NDRG2-19C-4는 IgG2a으로 판명되었다. 인간 NDRG2에 특이적으로 반응하는 단일클론항체의 항원 반응성을 웨스턴 블 랏팅 방법을 사용하여 NDRG2 항원과의 고친화적 특이 반응성을 확인하였다.
NDRG2를 선택적으로 인식하는 단일 클론을 선별하기 위하여 통상 사용되는 방법으로는 특이항체를 이용하여 방사능면역분석법(RIA), 효소면역흡착법(ELISA), 웨스턴 블로팅(Western blotting) 및 유세포 분석법등이 있으며 조직에서의 면역조직화학법(Immunohistochemistry), ELISPOT을 이용한 분석들이 있다. 일반적으로 생물학적 시료가 세포용출액이나 혈액인 경우 ELISA 기법으로 정량하고 있으며 조직인 경우는 면역조직화학법를 사용하고 있으며 세포인 경우는 ELISPOT이나 유세포 분석법을 사용하고 있다. NDRG2 의 경우 분비단백질이 아니므로 세포를 용해시킨 후 방사능면역분석법, 효소면역흡착법, 웨스턴 블로팅법을 적용하거나 조직에서의 면역조직화학법을 행하여야 한다. 웨스턴 블로팅(Western blotting)을 하거나 조직에서의 면역조직화학법의 경우 정량분석이 안되며 효소면역흡착법(ELISA)의 경우 시료양이 많이 필요하며 단일 test 만을 측정할 수 있다는 단점이 있다.
상기의 하이브리도마 세포가 생산하는 단일클론항체는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며, 또한 다양한 통상의 방법, 예를 들면 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마트그래피, 친화성 크로마트그래피 등을 이용하여 고순도로 정제하여 사용될 수 있다.
본 발명에서는 NDRG2 단백질과 생물학적 시료가 처리된 새로운 개념의 단백질칩을 이용하여 NDRG2를 측정하였다. 기존의 항체를 집적화 시킨 후 검체와 반응을 시키는 항체 칩과는 달리 직접 검체를 집적화하는 역상 단백질칩(reverse-phase protein microarray)으로서 항체칩보다 안정성이 높고, 직접 검체를 집적화시킨 후 여러 종류의 항체를 반응시켜 항원, 항체 반응을 볼 수 있다는 장점이 있다. 또한 집접적시킬 시 소량의 시료(nl)로도 많은 수의 동일한 슬라이드를 만들 수 있어 반복실험 및 시간차를 둔 실험, 다양한 항목의 물질에 대한 분석을 동시에 할 수 있으며 한 슬라이드에 필요한 시료는 수개의 세포만 있으면 된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "생물학적 시료"란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 뇨 등을 포함한다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체 또는 동일한 에피토프를 특이성을 가지는 항체와 반응시켜서 NDRG2의 발현 정도를 측정할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 생물학적 시료중의 NDRG2의 발현 여부를 확인하기 위하여 반응시킨 상기 NDRG2 단백질과 단일클론항체의 결합물을 의미한다. 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.
본 명세서상의 "검출"은 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용한다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 그러나 반드시 이들로만 국한되지는 않는다. 검출 표지체로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu3 +, Eu3 +킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I, 125I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다.
상기 단백질칩에 의해 발명에서 제조된 단일클론 항체를 이용하여 생물학적 시료에서 NDRG2 의 양을 검출하는 실 예로, NDRG2 재조합 단백질 희석액과 조직 또는 세포 추출액을 protein array를 이용하여 membrane이 처리된 슬라이드에 처리하고 제작된 항체로 반응시켰다. 증폭단계를 거친 후 DAB(3,3'-diaminobenzidine tertahydrochoride) 발색제로 발색시켰으며 발색된 슬라이드는 scanning 한 후 GenePix program에 의해 발색된 색의 강도를 분석하였다. 표준 NDRG2 액의 발색강도에 따라 표준곡선을 그린 후 검체 시료에 포함된 NDRG2의 양을 정량하였다. 상기와 같은 분석에 의해 NDRG2의 농도를 50pg/ml까지 측정이 가능하였다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적인 목적일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1 : 인간 NDRG2 재조합 단백질 합성
NDRG2 유전자(GenBank 등록번호: NM_016250)가 특이적으로 발현되는 수지상 세포의 cDNA 라이브러리를 주형으로 염기서열이 서열번호 1과 서열번호 2인 프라이머를 이용하여 35 사이클(95℃ 1분, 57℃ 1분, 72℃ 1분)의 NDRG2의 연쇄중합반응 (RT-PCR)을 통해 627bp의 NDRG2 유전자를 획득한 후 pEZ 벡터(RNA, Korea)를 이용하여 클로닝하고 염기 서열을 확인하여 NDRG2 유전자임을 확인하였다.
서열번호 1 : 5'-AAGGTCTTGTCCTCATCAAC-3'
서열번호 2 : 3'-TCAACAGGAGACCTCCAT-5'
pEZ 벡터에 클로닝되어 있는 NDRG2 유전자를 Xho I과 BamH I의 제한효소를 사용하여 잘라낸 후 대장균 발현 벡터인 pET28a 벡터(Novagen, Medison, WI, USA)에 접합하고, BL21 대장균(Novagen, Medison, WI, USA)에 형질전환(Transformation)시켜 207개의 아미노산으로 구성된 NDRG2 재조합 단백질을 얻었다.
도 1은 NDRG2 재조합 단백질 발현 및 분리, 정제를 보여주는 전기영동 사진이다. NDRG2 재조합 단백질을 대장균으로부터 발현시킨 후 Ni-NTA column 에 통과시킨 후 Ni-resin에 붙은 NDRG2 재조합 단백질을 imidazole 농도를 변화를 주면서 정제하였다. Immidazol 농도 300-1000 mM 사이에 NDRG2 재조합 단백질이 정제되어 용출되었다.
실시예 2 : 인간 NDRG2 재조합 단백질에 대한 하이브리도마 세포주 및 단일클론항 체 생산
1. 생쥐의 항원 면역화
하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화 된 생쥐를 얻기 위하여, 실시예 1에서 얻은 재조합 NDRG2 융합단백질 50 ㎍과 동량의 면역보조항원(MPL+TDM Adjuvant)(Sigma, USA)을 혼합하여 40 내지 45℃에서 30분간 중탕한 뒤 4내지 6주된 Balb/c 마우스의 복강 내에 주사하였다. 2 주 후에 25㎍씩의 NDRG2 융합 단백질과 동량의 면역보조항원(MPL+TDM Adjuvant)(Sigma, USA)을 잘 혼합하여 마우스의 복강 내로 다시 부스터(booster)주사하였다. 그 후 4~5 일 후에 생쥐 안구정맥에서 소량의 피를 뽑아내어 역가를 확인한 후 세포융합 실험 3일 전에 상기 면역보조항원과 혼합한 NDRG2 단백질을 복강 내에 마지막으로 다시 한번 주사하였다.
2. 세포융합에 의한 하이브리도마의 제조
하이브리도마 세포의 제조에 필요한 세포 융합을 실시하기 위하여, 상기 실시예 2의 1단계에서 제조한 면역원을 주사하여 얻은 생쥐의 비장세포 107개와 골수종 세포(myeloma cell, NS-1) 106개를 50 ml의 시험관에 모았다. 세포융합의 모(parent)세포로는 NS-1을 사용하였다. 이 모세포는 10% FBS를 함유하는 DMEM배지에서 최대밀도 5×105/㎖ 정도로 항상 유지시켰다.
상기 실시예 2의 1단계에서 면역화 된 생쥐를 에테르로 마취한 후 몸통의 좌측에 위치한 비장을 꺼내서 그물망(mesh)에 곱게 갈아서 현탁액을 만들고, 이 때 얻어진 비장세포를 15 ml의 원심분리관에 넣어서 원심분리한 후, 이 방법을 2회 반복하여 비장 세포를 충분히 세척하였다. 비장세포와 NS-1 세포를 각각 10 ㎖씩 재현탁시킨 후 각자의 세포 수를 세어서 비장세포와 NS-1을 10 : 1 이 되도록 50 ㎖의 원심분리관에서 섞고 다시 원심분리하여 침전시켰다. 원심분리된 침전물을 손가락으로 가볍게 두드려서 분산시키고, 37℃에서 1 분간 유지시킨 후에 한스 완충액(HBSS)에 들어있는 45% 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol, PEG)의 융합촉진물(fusogen) 1 ㎖를 1 분간에 걸쳐 넣고 또 다시 1분간 약간 흔들어 주었다. 그 후 배양배지(DMEM) 9 ㎖을 1 분간에 걸쳐 첨가하고, 30 ml이 될 때까지 흔들어 주면서 서서히 DMEM을 첨가하였다. 이 현탁액을 다시 원심분리한 후 세포 침전물을 분리배지(HAT 배지)에 1 내지 2×105/㎖ 정도로 재현탁시키고, 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 0.2 ㎖씩 분주한 후 37℃ 습윤 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.
3. 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별
상기 실시예 2의 2단계에서 제조한 융합세포 군 중에서 NDRG2 항원에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위해 his 및 상기 실시예 1에서 제조한 NDRG2 재조합 단백질에 his 가 포함된 his-NDRG2 항원을 이용한 효소면역흡착법(ELISA) 분석 방법으로 스크리닝 하였다.
마이크로타이터 플레이트에 his 또는 his-NDRG2 항원을 한 웰당 각각 50 μ l(2 μg/ml)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. 하이브리도마 세포의 배양액을 각각 웰에 50 μl씩을 가하여 1 시간 동안 반응시킨 후 인산 완충용액-트윈 20(PBST) 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)(Sigma, USA)를 가하여 1 시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, PBST 용액으로 충분히 세척하였다. 다음 퍼옥시다제의 기질용액(OPD)을 넣어 반응시키고, 그 반응정도는 490nm에서 흡광도로 측정하였다.
그 결과로 NDRG2 항원에 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 선별하였고, 여러 번 반복 실험을 통하여 NDRG2 항원에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포주를 선별하였다. 단일클론이 되도록 제한 희석(limiting dilution)하고 단일클론항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 선별하여 NDRG2-19C-4를 최종적으로 얻었다. 하이브리도마 NDRG2-19C-4는 2005 년 10월 5일자로 국제기탁기관인 대전시 유성구 어은동 52번지 소재의 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 수탁번호 KCTC10854BP 로 기탁하였다.
또한, 이들 클론을 클로닝하여 동결하였고 상등액을 효소면역흡착법으로 역가를 측정하고, 서브클래스 타입(subclass type)을 확인하였다. 클론 NDRG2-19C-4는 IgG2a으로 판명되었으며 NDRG2에 특이적으로 높은 결합력을 보여 주었다.
4. 단일클론항체의 대량 생산
상기 실시예 2의 3에서 얻은 하이브리도마 NDRG2-19C-4로부터 단일클론성 항 체를 대량 생산하기 위하여 마우스(Balb/c)에 0.5㎖의 불완전 보조항원 (Incomplete Freund Adjuvant)(Sigma, USA)을 복강 내로 주사하였다. 1 주일 후에 각각의 하이브리도마들을 실험쥐의 복강 내에 마리당 2×106씩 주사하고, 7 내지 10일 후 복강이 부풀어 오른 실험쥐에서 복수액을 채취하였다. 이 복수액에 함유된 고농도의 하이브리도마 세포는 10,000 rpm에서 원심분리하여 제거하고 얻어진 상층액을 취하여 일부는 정제될 때까지 -70℃에서 보관하고 일부는 친화성 칼럼(Protein A&G agarose column)을 이용 분리 정제하였다.
5. 웨스턴 블랏팅에 의한 NDRG2 단백질 항체의 특이성 확인
NDRG2 단백질에 대한 단일클론 항체의 특이적 항원 반응성을 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동과 웨스턴 블랏팅 방법을 사용하여 확인하고 전기영동 사진을 도 2에 나타내었다(도 2). NDRG2 단백질 (0.1ug/ml, 0.5 ug/ml)을 10% SDS-폴리아크릴아마이드 젤로 전기영동을 한 후 membrane에 transfer 시키고 4항에서 제조된 단일클론 항체와 반응시킨 결과 특정 위치에서 NDRG2를 확인할 수 있었다.
실시 예 3 : NDRG2 측정용 단백질칩 제조 및 NDRG2 단백질 측정
1. 단백질칩 제조
재조합 NDRG2 단백질 표준액과 검체시료가 spotting 된 단백질 칩을 제조하 였다. 재조합 단백질과 검체시료를 각각 희석용액(T-per tissue extraction 용액)으로 희석하였다. 검체시료로서는 세포주, 조직 lysate 및 혈청을 각각 시료로 사용하였다. Protein arrayer(Proteagen사 제품, Korea)를 사용하여 나이트로 셀룰로우즈 멤브레인이 처리된 슬라이드(S&S, FAST slide)위에 핀을 이용하여 각각의 sample을 각각의 위치에 spotting하였다. 이때 재조합 NDRG2 단백질 표준액은 표준곡선을 구하기 위하여 사용되어졌다.
2. 항체-항원 반응
실시예 3의 1에서 제조한 NDRG2 단백질과 시료가 처리된 단백질칩은 세척용액(PBST)으로 세척한 후 BSA용액으로 blocking하였다. Dakocytomation의 CAS(Catalyzed Signal Amplication System, code, K1500) kit을 이용하여 매뉴얼에 따라 차례로 반응, 슬라이드를 발색시켰다. 시약의 반응순서는 다음과 같았다.
1) hydrogen peroxide 용액을 처리, 5분후 세척
2) protein block용액 처리. 5분 방치
3) NDRG2 항체 처리, 1시간 방치, 세척액으로 3회 세척
4) Biotinylated link 항체 처리, 1시간 방치, 세척액으로 3회세척
5) Streptavidin-biotin complex 용액 처리, 15분 방치, 세척액으로 3회세척
6) amplication 용액 처리, 15분 방치, 세척액으로 3회세척
7) Streptavidin-peroxidase 용액 처리, 15분 방치, 세척액으로 3회세척
8) DAB 기질액 처리, 발색
9) 발색정지
도 3은 발색이 완료된 후의 슬라이드의 사진이다.
실시예 4 : 단백질 칩에 의한 NDRG2 단백질 정량
1. NDRG2 표준곡선 작성
각 NDRG2 표준액의 spot의 발색강도를 이용하여 검정곡선을 작성하였다.
먼저 실시예 3의 1의 방법에 따라 0, 0,05, 0,25, 1.25, 6.2, 32, 160, 80, 400 및 2000 NDRG2 ng/ml 표준액을 제조한 후 셀룰로우즈 멤브레인이 처리된 슬라이드(S&S, FAST slide)위에 duplicate로 1 nl씩 spotting하였다. 실시예 3의 2의 방법에 따라 발색시킨 후 발색된 슬라이드를 실온에서 건조시키고 스캔너(HPscanjet 5470, USA)로 스캔닝하였다. 스캐닝된 파일을 GenePix 프로그램(Axon, USA)을 이용하여 각 spot의 발색강도(intensity)를 측정하였다.
도 4a는 NDRG2 표준액의 농도에 따른 발색정도를 보여주는 단백질칩의 발색 사진이다. 상단 사진은 발색된 단백질칩의 사진이며, 하단의 표는 해당 위치의 단백질칩의 표준액 시료의 농도를 기재한 것이다. 도 4b는 NDRG2 농도에 따른 발색강도를 나타낸 표준 곡선이다. 측정감도는 50 pg/ml 이하이다. 도 4c는 같은 시료를 이용하여 웨스턴 블럿한 결과이다. 이때 측정감도는 약 100 ng/ml 정도였다.
2. 세포주에서의 NDRG2 농도 측정
세포 시료로 NDRG2가 발현이 잘 되는 세포주(SNU 620)(서울대 한국 세포주은 행에서 분양), 이 세포주에서 NDRG2의 발현을 억제한 세포주(SNU 620-N, Retro virus를 이용하여NDRG2 siRNA로 NDRG2 유전자를 억제시킨 세포주), NDRG2가 발현되지 않는 세포주(U937)(ACTT, USA), 이세포주에서 NDRG2를 과잉발현한 세포주(U937+N, NDRG2 유전자를 pcDNA3.1 벡터에 클로닝 한 후, U937 세포주에 전기자극 으로 형질도입시킨 세포주)를 사용하였다. 각 세포주의 lysate의 단백질 농도를 1mg/ml로 고정시킨 후 각각의 세포주 시료를 희석용액(T-per tissue extraction 용액)으로 5배, 25배 및 125배로 희석한 용액을 제조한 후 각 용액을 상기 실시예 4의 1의 표준곡선 작성시와 동일하게 셀룰로우즈 멤브레인이 처리된 슬라이드(S&S, FAST slide)위에 duplicate로 spotting 하였다. 상기 표준곡선 작성시와 동일한 공정에 의해 발색시킨 후 각 시료의 spot의 발색정도를 GenePix 프로그램을 이용하여 각 측정하고 표준 검정곡선에 의해 각 시료에서의 NDRG2 의 농도를 환산하였다.
도 5a는 각 세포주 시료의 희석 농도별 발색정도를 보여주는 단백질칩의 사진이다. 상단 사진은 발색된 단백질칩의 사진이며, 하단의 표는 해당 위치의 단백질칩의 세포주의 종류 및 희석배수를 나타낸다. 5b는 각 세포주 시료의 희석 농도별 발색강도를 수치로 나타낸 그래프이며, 도 5c는 웨스턴 블럿의 결과를 보여주는 전기영동 사진이다. 웨스턴의 결과와 유사하게 단백질칩으로 세포주를 테스트한 결과 SNU 620에서는 많은 양의 NDRG2가 측정되었고 NDRG2의 발현이 억제된 SNU 620-N 세포주에서는 적은양의 NDRG2 가 측정되었다. U937에서는 NDRG2가 거의 측정되지 않았으며 NDRG2 가 형질전환 된 U937+N 세포주에서는 NDRG2가 측정되었다.
표 1은 단백질칩을 이용하여 각 세포주를 반응시킨 후 NDRG2 표준 곡선에 따라 각세포주 내에서의 NDRG2의 농도를 측정한 결과를 웨스턴 블럿 결과와 비교한 표이다.
1mg/ml 농도의 세포주 lysate를 125배 희석한 시료에서도 NDRG2는 반응을 일으켰으며 spotting 된 시료의 양이 nl 수준인 것을 감안하면 세포수로 환산한다면 spot 당 수개-수십개의 세포만 있어도 NDRG2 의 농도를 측정할 수 있다는 결론이다. 또한 정성적으로 웨스턴 블럿을 했을 때와 유사한 결과를 얻으면서도 pg/ml 단위의 농도까지 측정이 가능하였다.
3. 간암 조직에서의 NDRG2 농도 측정
조직 시료로 세명의 간암환자(2235, 2327, 2278번 환자)의 간조직으로부터 간암세포조직과 정상 간조직을 각각 축출, 용해시킨 후 전체 단백질 양을 1mg/ml로 희석한 후 실시예 4의 2와 동일한 방법으로 희석용액으로 5배씩 5배, 25배 및 125배로 각각 희석한 후 duplicate로 슬라이드에 spotting 하였다. 이때 정상세포는 N2235, N2327, N2278로, 간암세포는 T2235, T2327, T2278로 각각 명명하였다. 실시예 4의 3에서와 같이 발색시킨 후 각 시료의 spot의 발색정도를 GenePix 프로그램을 이용하여 각각 측정하고, NDRG2 표준곡선에 의해 각 시료에서의 NDRG2 의 농도를 환산하였다.
도 6a는 각 간암세포와 정상세포들의 단백질칩 발색결과이다. 상단 사진은 발색된 단백질칩의 사진이며, 하단의 표는 해당 위치의 단백질칩의 세포의 종류 및 희석배수를 나타낸다. 실시예 4의 2의 세포주 실험에서와 마찬가지로 125배 희석한 시료에서도 NDRG2의 검출이 가능하였다. 도 6b는 상기 25배 희석한 각 시료의 발색강도를 수치로 나타낸 그래프이며 도 6c 은 웨스턴 블럿의 결과이다. 도 6c에서 레인 1은 N2235, 레인 2는 T2235, 레인 3은 N2327, 레인 4는 2327, 레인 5는 N2278 및 레인6은 T2278을 나타낸다.
웨스턴과 단백질칩을 이용하여 실험한 결과 RT-PCR의 결과와 유사하게 간암조직세포보다 정상조직에서 NDRG2의 발현이 적었다. 발현 정도는 웨스턴과 단백질칩이 비슷한 경향을 보였다.
표 2는 단백질칩을 이용하여 각 간조직을 반응시킨 후 NDRG2 표준 곡선에 따라 조직 중 NDRG의 농도를 측정한 결과이다. 표 2의 결과에 따르면, 간암 세포조직에서 NDRG2의 농도는 정상 간세포조직에 비해 현저하게 낮음을 알 수 있다. 따라서, 간암 세포조직과 정상 간세포조직의 NDRG2 농도를 비교함에 의해 간암여부를 진단할 수 있다.
4. 간암 환자의 혈청에서의 NDRG2 농도 측정
세명의 간암환자(2235, 2327, 2278번 환자)의 혈청 시료와 3명의 정상인의 혈청시료를 희석용액으로 2배씩 희석한 후 duplicate로 슬라이드에 spotting 하였다. 이때 정상 혈청, 간암혈청 모두 NDRG2 가 발현되지 않았으며 이는 Immunodot blotting 한 결과와 일치하였다.
이상과 같이 본 발명의 NDRG2 단백질에 대한 단일클론 항체와 단백질 칩에 의하면 생물학적 시료 내의 NDRG2의 양을 정량적으로 측정할 수 있으므로 수지상 세포의 특성 및 암화에 관련된 NDRG2 관련연구에 유용하게 사용할 수 있으며, 수지상 세포를 이용한 세포치료제 개발 및 암을 진단하는 진단제로서 활용도가 크다.
또한 한번에, 같은시료가 처리된 다량의 슬라이드 제작이 가능하므로 근본적이 기초연구에 활용이 가능하며 cell-cell networking 연구에 편리하며 시료의 양에 제약을 받거나 동일시료를 구하기 어려운 시료의 test에 활용도가 크다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
<120> Preparation of monoclonal antibody to N-mycdownstream regulated
gene 2 and determination of NDRG2 using protein chip
<160> 2
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
aaggtcttgt cctcatcaac 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
tcaacaggag acctccat 18
Claims (9)
- 사람의 말초혈액 단핵구, 또는 제대혈의 줄기세포에서 분화된 수지상 세포에서 발현되는 NDRG2(N-myc downstream regulated gene 2) 단백질에 특이적으로 반응하는 단일클론 항체.
- 제 1 항에 있어서,항체의 서브클래스(subclass)가 IgG2a인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
- 제1항에 의한 단일클론 항체를 대량생산하는 하이브리도마 세포주.
- 제 3 항에 있어서,하이브리도마 세포주 NDRG2-19C-4(수탁번호 KCTC 10854BP).
- 생물학적 시료가 집적된 역상 단백질칩(reverse-phase protein microarray)에 제1항에 의한 단일클론 항체를 처리하는 것을 특징으로 하는 생물학적 시료 중 의 NDRG2 단백질의 정량·정성 분석방법.
- 제 5 항에 있어서,상기 단일클론 항체는 하이브리도마 세포주 NDRG2-19C-4(수탁번호 KCTC 10854BP)의 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 생물학적 시료 중의 NDRG2 단백질의 정량·정성 분석방법.
- 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨인 것을 특징으로 하는 생물학적 시료 중의 NDRG2 단백질의 정량·정성 분석방법.
- 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,정량·정성 분석을 위한 표지체는 효소, 형광물, 리간드, 발광물 또는 방사성 동위원소인 것을 특징으로 하는 생물학적 시료 중의 NDRG2 단백질의 정량·정성 분석방법.
- 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,정량·정성 분석을 위한 검출 방법은 비색법, 전기화학법, 형광법, 발광법, 입자계수법, 육안측정법 또는 섬광계수법인 것을 특징으로 하는 생물학적 시료 중의 NDRG2 단백질의 정량·정성 분석방법.
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