CN103797369B - 抗wt1抗体的测定方法 - Google Patents

抗wt1抗体的测定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103797369B
CN103797369B CN201280044353.0A CN201280044353A CN103797369B CN 103797369 B CN103797369 B CN 103797369B CN 201280044353 A CN201280044353 A CN 201280044353A CN 103797369 B CN103797369 B CN 103797369B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
polypeptide
amino acid
value
acid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201280044353.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103797369A (zh
Inventor
杉山治夫
尾路祐介
葛城肃典
田中秀明
十河真司
后藤义博
大本安
大本安一
岩田房子
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
International Institute of Cancer Immunology Inc
Original Assignee
Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
International Institute of Cancer Immunology Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Otsuka Pharmaceutical Co Ltd, International Institute of Cancer Immunology Inc filed Critical Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Publication of CN103797369A publication Critical patent/CN103797369A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103797369B publication Critical patent/CN103797369B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001152—Transcription factors, e.g. SOX or c-MYC
    • A61K39/001153—Wilms tumor 1 [WT1]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57426—Specifically defined cancers leukemia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明提供一种能够更正确测定、评价被检测体中抗WT1抗体的、该抗WT1抗体的测定方法及其应用的发明。一种被检测体中的抗WT1抗体的测定方法，其特征在于，使用选自由序列号1中第294～449号的氨基酸序列组成的多肽、该多肽的部分多肽、以及由在构成这些多肽的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代或者添加的氨基酸序列组成的多肽中的、对抗WT1抗体具有抗原性的多肽，和/或选自由序列号1中第181～324号的氨基酸序列组成的多肽、该多肽的部分多肽、以及由在构成这些多肽的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代或者添加的氨基酸序列组成的多肽中的、对抗WT1抗体具有抗原性的多肽。

Description

抗WT1抗体的测定方法
技术领域
本发明涉及一种利用WT1片段的、测定被检测体中的抗WT1抗体的方法。
背景技术
WT1基因（Wilms tumor gene）是作为Wilms肾肿瘤的致病基因被分离的锌指（zincfinger）型的转录因子。其后，在以急性骨髓系白血病为首的各种实体癌中也发现了WT1基因的异常的高表达（非专利文献1-3）。因此，已经开始尝试将WT1蛋白质作为肽疫苗进行应用。
另外，近年已明确WT1蛋白质具有由抑制区域（repression domein）、活化区域（activation domein）以及属于DNA结合区域的锌指区域（Zinc finger domain）组成的结构，其与EGR-1（Early Growth Response Protein1；初期增殖应答蛋白1）部位结合，进行基因的表达调节，并且，还报道有其具有作为癌抑制基因的功能（非专利文献4和5）。
另一方面，已表明也存在对WT1蛋白质的自身抗体。已报道特别是在血液癌、肺癌（小细胞癌）中，患者血液中的对WT1蛋白质的自身抗体值高（非专利文献6-8）。另外，报道有对于WT1mRNA而言，表达越高越具有预后不良的倾向，与此相对，对于抗WT1抗体而言，血中浓度越高越显示预后良好的倾向（非专利文献7）。因此，被认为正确测定患者血中的抗WT1抗体，对于治疗法的选择或者治疗经过的监测是有用的，例如，已报道有将含有抑制区域和活化区域且缺少锌指的WT1蛋白质作为抗原来测定抗WT1抗体的技术（专利文献1和2）。
但是，将生物体内蛋白质作为异物进行识别，形成自身抗体的机制尚不明确，而且其抗体量微少，还未确立以高灵敏度检测自身抗体的方法。关于抗WT1抗体，目前为止的使用WT1蛋白质抗原的方法中，检测抗体的抗体值的分布狭窄，存在未必能正确进行评价的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2002-48793号公报
专利文献2:日本特开2006-267124号公报
非专利文献
非专利文献1:Inoue K，Sugiyama H，Ogawa H，et al.WT1as a new prognosticfactor and new marker for the detection of minimal residual disease in acuteleukemia.Blood1994;84:3071-9
非专利文献2:Oji Y，Miyoshi S，Maeda H，et al.Overexpression of theWilms'tumor gene WT1in de novo lung cancers.Int J Cancer2002;100:297-303
非专利文献3:Miyoshi Y，Ando A，Egawa C，et al.High expression of Wilms'tumor suppressor gene predicts poor prognosis in breast cancer patients.ClinCancer Res2002;8:1167-71
非专利文献4:Haber DA，Sohn RL，Buckler AJ，et al.Alternative splicingand genomic structure of the Wilms'tumor gene WTl.Proc Natl Acad Sci USA88;9618:1991
非专利文献5:Madden SL，Cook DM，Morris JF，et al.Transcriptionalrepression mediated by the WTI Wilms tumor gene product.Science2.53;1550:1991
非专利文献6:Olga AEl，Oka Y，Tsuboi A，et al.Humoral immune responsesagainstWilms tumor gene WT1product in patients with hematopoieticmalignancies.Blood2002;99:3272-3279
非专利文献7:Oji Y，Kitamura Y，Kamino K，et al.WT1IgG antibody for earlydetection of nonsmall cell lung cancer and as its prognostic factor.Int JCancer2009;125:381-7
非专利文献8:Tamura H，Dan K，Yokose N，et al.Prognostic significance ofWT1mRNA and anti-WT1antibody levels in peripheral blood in patients withmyelodysplastic syndromes.Leukemia Res2010;34:986-990
发明内容
本发明涉及一种能够更正确测定、评价WT1关联疾病患者的抗WT1抗体的、该抗WT1抗体的测定方法及其应用的发明。
本发明人等，在进行与WT1关联疾病患者的血中抗WT1抗体的检测的研究的过程中，发现生物体内的自身抗体在自身抗体识别抗原的立体结构上带来变化而表位部分在表面露出的情况下，将作为异物被识别、形成。而且，在WT1的情况下，主要表位位于构成人WT1蛋白质的氨基酸序列（序列号1）的中央区域（氨基酸号：第181-324位）以及C末端区域（氨基酸号：第294-449位），特别是将与属于WT1的DNA结合区域的C末端区域（锌指区域）相当的多肽片段作为抗原使用而测定抗WT1抗体的情况下，其抗体值显示与将全长的WT1作为抗原使用而测定的情况的高度相关性。而且进一步比较健康人和癌患者的抗体值的分布，发现癌患者的抗体值的分布与健康人的分布相比更宽，其差异显著，能够确切灵敏度良好地进行癌患者这样的抗WT1抗体值高值组。
即，本发明涉及以下的1）～9）的发明。
1）一种被检测体中的抗WT1抗体的测定方法，其特征在于，使用选自由序列号1中第294～449号的氨基酸序列组成的多肽、该多肽的部分多肽、以及由在构成这些多肽的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代或者添加的氨基酸序列组成的多肽中的、对抗WT1抗体具有抗原性的多肽，和/或选自由序列号1中第181～324号的氨基酸序列组成的多肽、该多肽的部分多肽、以及由在构成这些多肽的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代或者添加的氨基酸序列组成的多肽中的、对抗WT1抗体具有抗原性的多肽。
2）上述1）的测定方法，其中，将所述多肽的至少1种固定在固相上，通过检测该固定的多肽与被检测体中存在的抗WT1抗体的反应产物来测定抗体量。
3）一种WT1关联疾病的检查方法，其特征在于，使用选自由序列号1中第294～449号的氨基酸序列组成的多肽、该多肽的部分多肽、
以及由在构成这些多肽的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代或者添加的氨基酸序列组成的多肽中的、对抗WT1抗体具有抗原性的多肽，和/或选自由序列号1中第181～324号的氨基酸序列组成的多肽、该多肽的部分多肽、以及由在构成这些多肽的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代或者添加的氨基酸序列组成的多肽中的、对抗WT1抗体具有抗原性的多肽。
4）上述3）的检查方法，其中，该方法是判定白血病预后的方法。
5）一种癌的WT1疫苗疗法中奏效者的预测或治疗监测方法，其特征在于，使用选自由序列号1中第294～449号的氨基酸序列组成的多肽、该多肽的部分多肽、以及由在构成这些多肽的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代或者添加的氨基酸序列组成的多肽中的、对抗WT1抗体具有抗原性的多肽，和/或序列号1中第181～324号的氨基酸序列组成的多肽、该多肽的部分多肽、以及由在构成这些多肽的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代或者添加的氨基酸序列组成的多肽中的、对抗WT1抗体具有抗原性的多肽。
6）上述5）的方法，其中癌是脑肿瘤或大肠癌。
7）一种被检测体中的抗WT1抗体的测定试剂，其含有选自由序列号1中第294～449号的氨基酸序列组成的多肽、该多肽的部分多肽、以及由在构成这些多肽的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代或者添加的氨基酸序列组成的多肽中的、对抗WT1抗体具有抗原性的多肽，和/或序列号1中第181～324号的氨基酸序列组成的多肽、该多肽的部分多肽、以及由在构成这些多肽的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代或者添加的氨基酸序列组成的多肽中的、对抗WT1抗体具有抗原性的多肽。
8）一种WT1关联疾病的检查用试剂，其含有选自由序列号1中第294～449号的氨基酸序列组成的多肽、该多肽的部分多肽、以及由在构成这些多肽的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代或者添加的氨基酸序列组成的多肽中的、对抗WT1抗体具有抗原性的多肽，和/或序列号1中第181～324号的氨基酸序列组成的多肽、该多肽的部分多肽、以及由在构成这些多肽的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代或者添加的氨基酸序列组成的多肽中的、对抗WT1抗体具有抗原性的多肽。
9）一种自身抗体的检测方法，其特征在于，对生物体内蛋白质进行改性以使表位部分在表面露出，将该改性蛋白质作为自身抗体识别抗原进行使用。
根据本发明的抗WT1抗体的测定方法，由于能够更确切灵敏度良好地测定存在于WT1关联疾病患者的抗WT1抗体，能够良好地把握抗WT1抗体值的变动，能够容易且精度良好地进行WT1关联疾病的诊断、治疗高效的监测、预后的判定、疫苗疗法施行前的奏效者的预测、疫苗疗法施行后的奏效监测等。
附图说明
图1是表示对于全长WT1抗原的癌患者血中抗体值的图。
图2是表示对于全长WT1抗原的抗体值和对于分割的WT1抗原的抗体值的比较的图。（a）是对于Fr.1抗原的抗体值的比较，（b）是对于Fr.2抗原的抗体值的比较，以及（c）是对于Fr.3抗原的抗体值的比较的结果。纵轴表示对于分割WT1抗原的抗体值（unit），横轴表示对于全长WT1抗原的抗体值（WRU）。
图3是表示对于Fr.2抗原的抗体值和对于Fr.3抗原的抗体值的比较的图。纵轴表示对于Fr.3抗原的抗体值（unit），横轴表示对于Fr.2抗原的抗体值（WRU）。
图4是表示对于分割WT1抗原的抗体值的分布的图。表示对于分割WT1抗原的健康人的抗体值分布和癌患者的抗体值分布。N是健康人54例的分布，C是癌患者20例的分布。（a）是Fr.1抗原，（b）是Fr.2抗原，（c）是Fr.3抗原的结果。
图5是表示对于Fr.3抗原的抗原抑制试验的结果的图。表示由Fr.1和Fr.2抑制对Fr.3的抗体反应性的结果。C-19是对Fr.3的PoAb，No.3，No.7，No.9是对Fr.1和Fr.2的抗体值降低、对Fr.3的抗体值高的患者血清。白色条是Fr.1抗原添加，黑色条是Fr.2抗原添加的结果。
图6是表示对于各抗原的IgG抗体值的推移的图。黑色条是对于Fr.1的抗体值，白色条是对于Fr.2的抗体值，横线条是对于Fr.3的抗体值，斜线条是对于全长WT1抗原的抗体值的推移。黑圆棒线表示通过MRI进行测定的肿瘤径的变化。
图7是疫苗给药前的IgG抗体值的比较图。
图8是疫苗给药后的IgG抗体值的比较图。
图9是表示疫苗给药前的IgM抗体值的图。A是对于Fr.2的IgM抗体值，B是对于Fr.3的IgM抗体值。
图10是表示疫苗给药前的IgM和IgG抗体值的图。
图11是表示脑肿瘤患者的IgM和gG抗体值的图。纵轴是IgM抗体值，横轴是IgG抗体值，○表示SD患者、●表示PD患者。点线表示假设的基准值。
图12是表示大肠癌患者的IgM和IgG抗体值的图。纵轴是IgM抗体值，横轴是IgG抗体值，○表示SD患者、●表示PD患者。点线表示假设的基准值。
具体实施方式
本发明中，抗WT1抗体是指作为Wilms肾肿瘤的致病基因（Wilms tumor gene）被分离的锌指型的转录因子WT1的基因产物，具体的是指对于由449个氨基酸组成的人WT1蛋白质（序列号1）的抗体。所述抗体中包括IgG抗体、IgA抗体、IgＭ抗体等各种免疫球蛋白，本发明中包含该抗体的全部。
生物体内蛋白因原来的免疫系统不会将其作为异物识别。因此，通常不会发生抗体形成。本发明人等考虑自身抗体在自身抗体识别抗原在立体结构上带来变化而表位部分在表面露出的情况下将会作为异物被识别、形成。由此，认为自身抗体识别抗原的配制中，需要例如将表面部分的一部缺失的蛋白质进行基因工学表达或切断蛋白酶等肽键，或者，利用酸、碱、表面活性剂、热变性等各种处理、尿素和盐酸胍等离液试剂来进行处理等，从而进行蛋白质改性，将分子内隐藏的表位部分露出到表面。
如后面的实施例所示，本发明人等研究了WT1蛋白质中能成为自身抗体识别抗原的分子，结果发现通过将主要表位位于构成人WT1蛋白质的氨基酸序列（序列号1）的中央区域（氨基酸号：第181-324位）以及C末端区域（氨基酸编号：第294-449位），特别是C末端区域的肽作为抗体检测抗原，能使抗体检测灵敏度提高到比使用全长WT1抗原还高（实施例1），并且，C末端侧区域中的抗体反应性，被Ｎ末端侧区域（氨基酸号：第1-182位）以及中央区域的抗原所抑制（实施例2），从而证明了上述观点。
本发明的抗WT1抗体的测定方法中所用的对抗WT1抗体具有抗原性的多肽，是选自由序列号1中第294～449位的氨基酸序列组成的多肽、由序列号1中第181～324位的氨基酸序列组成的多肽、由在构成该多肽的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代或者添加的氨基酸序列组成的多肽、以及这些多肽的部分多肽。
由序列号1中第294～449位的氨基酸序列组成的多肽，相当于WT1蛋白质中作为DNA结合区域的锌指区域（Zinc finger domain）。本发明中也称为C末端区域。
由序列号1中第181～324位的氨基酸序列组成的多肽，是位于WT1蛋白质中Ｎ末端侧区域（氨基酸号：第1-182位）和上述的C末端区域之间的区域，也称为中央区域。
作为抗原多肽，优选使用由该序列号1中第294～449位的氨基酸序列组成的多肽、由第181～324位的氨基酸序列组成的多肽，只要对于抗WT1抗体具有抗原性，能够检测抗WT1抗体，也可使用该多肽的部分多肽以及由在构成这些多肽的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代或者添加的氨基酸序列组成的多肽。
作为上述多肽的部分多肽，可举出以由序列号1中第294～449位的氨基酸序列组成的多肽或由第181～324位的氨基酸序列组成的多肽中的、连续的6～8个，优选10～20个组成的肽，具体的可举出由序列号1中第294～449位的氨基酸序列组成的多肽、序列号1中第348～449位的氨基酸序列组成的多肽、序列号1中第181～324位的氨基酸序列组成的多肽等。
上述的由序列号1中第294～449位的氨基酸序列组成的多肽、第181～324位的氨基酸序列组成的多肽或其部分多肽，只要对于抗WT1抗体具有抗原性，也可以在构成这些多肽的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代或者添加。
此处，缺失、添加或取代的氨基酸的数量是1个以上，对其数量无特别限制，是通过位点特异性突变导入法等周知的技术可进行缺失、添加或取代的程度的数，例如是1～数十个，优选1～20个，更优选1～10个，进一步优选1～5个。
此处，氨基酸序列中1个以上的氨基酸残基发生缺失、添加或取代意指同一序列中的任意一个或者多个氨基酸序列中有1个或多个氨基酸残基的缺失、添加或取代，缺失、添加或取代可同时发生，缺失、添加或取代的氨基酸残基可以是天然型也可以是非天然型。
此外，“对抗WT1抗体具有抗原性”意指对识别WT1蛋白质的抗体具有反应性。由于WT1关联疾病患者能产生的自身抗体是多克隆抗体，本发明的抗原多肽也可以是其自身具有多个反应位（表位）的多肽。
本发明的方法中所用的多肽是选自上述的多肽的至少1种的多肽。为了提高特异性和测定灵敏度，也可以将多种的多肽组合使用。
上述多肽可通过利用已知的WT1基因的基因工学手法，例如，利用后述的实施例记载的方法以及以其为基准的方法进行制造，另外，也可通过化学合成进行制造。
基于利用WT1基因的基因工学的手法的上述多肽的制造，可按照现有公知的一般的基因重组技术进行。更详细而言，制成所需的WT1基因在宿主细胞中能够表达的重组DNA，将其导入宿主细胞进行转化，通过培养该转化子，在转化子的细胞内或细胞外，生产作为表达产物的所需的多肽。
此处，所采用的各种操作，例如，以部分基因的化学合成、其切断、删除、添加或结合为目的的酶处理、其分离、精制、选择等，以及将重组DNA导入宿主细胞以及转化细胞的培养等均可按照常规方法进行（例如，参见“分子遗传学实验法”，共立出版株式会社1993年发行；“PCR技术”，宝酒造株式会社1990年发行，Science，224，1431（1984）；Biochem.Biophys.Res.Comm.，130，692（1985）;Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，80，5990（1983）;Moplecular Cloning，by T.Maniatis et al.，Cold Spring Harbor Laboratory（1982）等）。
另外，根据所需，多肽也可按照利用其物理化学性质等的各种分离操作（例如，参照“生化学数据手册Ⅱ”，1175-1259页，第1版第1次印刷，1980年6月23日，株式会社东京化学同人发行等），将其从上述表达产物等进行分离、精制。
本发明中，作为被检测体（试样）是源自WT1关联疾病患者或其治疗后患者的被检测体，例如，可无限制地例示已知通常存在抗体的血液、尿等各种体液。
作为WT1关联疾病，例如，可举出作为白血病、实体癌、骨髓增生异常综合征等WT1关联疾病而已知的各种疾患。另外，也包括将来发现的WT1关联疾病。
本发明的抗WT1抗体的测定方法中，抗WT1抗体（抗体量）的测定，可按照免疫学的测定法使用上述的多肽实施。作为免疫学的测定法，可举出任意的公知的免疫学的测定方法，例如，可举出放射免疫测定法（RIA）、酶免疫测定法（EIA或ELISA）、荧光免疫测定法（FIA）、间接荧光抗体法（Indirect Fluorescence assay）、发光免疫测定法（Luminescentimmunoassay）、物理化学测定法（TIA、LAPIA、PCIA）、Western印迹法等，优选使用ELISA法。
ELISA法是使固定于固相的抗原和抗体反应，进一步地将结合于抗原的抗体与实施过氧化酶、碱磷酸酶等酶标记等的二次抗体反应，然后，通过适当的方法测定酶标记的方法，例如，可举出竞争法、夹心法，其中优选例示夹心法（固相化夹心法）。
固相化夹心法，例如，可按照如下进行实施。即，首先将本发明的多肽固相化，向其加入作为被检试样的被检测体。其结果，固相化抗原和试样中的抗体之间发生抗原抗体反应，被检测体中存在的抗WT1抗体与固相化抗原结合。其次对该结合的抗体，使用抗体检测试剂进行检测，测定被检试样中存在的抗WT1抗体。
上述中，还可以将抗体检测试剂固相化，通过其捕捉被检测体中的抗体，然后加入本发明的多肽，使其与被捕捉的抗体中的抗WT1抗体结合，进而使该抗原的特异抗体的标识体结合，从而检测·测定被检试样中存在的目标抗WT1抗体。
这些测定手法中各种手段的选择、其改变等均是本领域技术人员周知的技术，本发明中无特别限制，可采用这些各手法的任意一个（参见“临床检查法提要”金原出版、1995年等）。
例如，作为上述固相法中的固相，可广泛利用通常使用的不溶性、惰性的载体。其中，例如包括由玻璃、纤维素粉末、葡聚糖凝胶、琼脂糖、聚苯乙烯、滤纸、羧甲基纤维素、离子交换树脂、葡聚糖、塑料薄膜、塑料管、尼龙、玻璃珠、丝、聚胺-甲基乙烯基醚-马来酸共聚物、氨基酸共聚物、乙烯-马来酸共聚物等各种素材构成的棒、珠、微孔板、试管等。
抗原或者抗体的固定化方法也没有特别限制，可利用物理结合和化学结合的任意一个。代表性的例如可例示出作为共价键法的重氮法、肽法（羧酸酰胺衍生物法、羧基氯树脂法、碳二亚胺树脂法、马来酸酐衍生物法、异氰酸酯衍生物法、溴化氰活性多糖法、纤维素碳酸盐衍生物法、使用缩聚试剂的方法等）、烷基化法、利用交联试剂的载体结合法（作为交联试剂使用戊二醛、六亚甲基异氰酸酯等）、基于Ugi反应的载体结合法等利用化学反应的方法、使用离子交换树脂这样的载体的离子结合法、使用玻璃珠等多孔玻璃作为载体的物理吸附法等。
作为各测定系中标识剂，无特别是限制，可使用现有公知的标识剂或将来可能使用的标识剂的任意一个。作为具体例，可无限制地例示免疫测定法中惯用的各种放射性同位素类、碱磷酸酶（ALP）、过氧化酶（POX）等酶类、异硫氰酸荧光素（FITC）、四甲基异硫氰酸罗丹明（RITC）等荧光物质类，此外，1N-（2，2，6，6-四甲基-1-氧基-4-哌啶基）-5N-（天门冬氨酸）-2，4-二硝基苯（TOPA）等。
此外，作为用于酶标记的酶标记物质，例如，在上述例示的物质的基础上，可例示出微过氧化酶、胰凝乳蛋白酶原、羧肽酶原、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、淀粉酶、磷酸化酶、D-Nase、P-Nase等。利用这些标识物质的标识方法，可按照公知的方法实施（例如，参见“单克隆抗体”，岩崎辰夫等著、讲谈社Scientific，1984年；“酶免疫测定法”第2版、石川荣治等著、医学书院，1982年等）。
另外，酶活性的测定也可以根据使用的酶的种类按照公知的方法实施。例如，作为标识酶使用过氧化酶时，作为底物使用ABTSJ（2，2'-联苯-双（3'-乙基苯并噻唑啉磺酸）），另外，利用碱磷酸酶时，作为底物使用对硝基苯磷酸，各底物的分解可通过使用分光光度计等来测定的方法等（参见“酶免疫测定法”第2版、石川荣治等著、医学书院，1982年等）。
此外，代替上述酶标记，使用放射性同位素、荧光物质等标识体时，该标识体的测定，可按照公知的方法进行实施。
作为上述测定系中使用的溶剂，只要是对反应不产生坏的影响，可使用通常使用的任意溶剂，具体而言可很好地利用柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、Tris盐缓冲液、乙酸缓冲液等pH约5-9左右的缓冲液。
免疫反应（结合）条件也没有特别限制，一般采用可在这种测定法中所用的通常条件。一般为45℃以下，优选约4-40℃左右的温度条件下，需要约1-40小时左右进行反应。
这样，根据使用本发明的多肽作为抗原的测定方法，能够更确切灵敏度好地测定WT1关联疾病患者中存在的抗WT1抗体，能够良好地把握抗WT1抗体值的变动。
与健康人的抗WT1抗体的抗体量相比，WT1关联疾病患者的抗WT1抗体的抗体量显著添加，并且，伴随该患者的治疗降低。因此，该WT1抗体量优选其经时变化，可作为临床指标判定WT1关联疾病的存在、治疗经过以及预后。例如，如果白血病等WT1关联疾病完全缓解，抗WT1抗体消失，通过经时考察该抗体消失情况，能够确认完全缓解状态的维持。
另外，WT1关联疾病患者的抗WT1抗体的检出，即，WT1抗体阳性患者的确认意指确认该患者对WT1发生体液免疫应答。因此，抗WT1抗体的检测本身在判定或诊断对WT1关联疾病的该患者的免疫应答能力方面是有用的。而对WT1发生免疫应答的患者而言，与未发生的患者相比，其免疫应答高出的部分对应地具有预后良好的可能性，因此，这样的判定或诊断能够成为WT1关联疾病的预后判断的指标。
因此，本发明的抗WT1抗体的测定方法，对于WT1关联疾病的存在、治疗经过以及预后的判定、特别是各种癌患者的（对癌的）免疫应答能力的检查、诊断等有用。
另外，本发明的抗WT1抗体的测定方法，在癌的WT1疫苗疗法中，能够在其施行前预先预测奏效者，并能够应用于施行后的奏效监测。例如，脑肿瘤、大肠癌等的癌WT1疫苗的给药前，对于C末端侧区域的肽（由序列号1中第294～449位的氨基酸序列组成的多肽等）的IgG抗体值或者IgＭ抗体值、对于中央区域的肽（由序列号1中第181～324位的氨基酸序列组成的多肽等）的IgＭ抗体值高的患者，能够预测WT1疫苗具有高的治疗效果。另一方面，WT1疫苗给药后，奏效者的对于中央区域的IgG抗体值上升。另外，尽管微少但能够确认对于C末端侧区域的IgG抗体值有上升的倾向。根据这些事实，能够将对于中央区域和C末端侧区域的IgG抗体值的推移作为指标进行治疗奏效监测。
在实施本发明的抗WT1抗体的测定方法或者应用其的各种检查方法之际，将本发明的多肽作为测定试剂使用是简便的，本发明也提供了该测定试剂等。该测定试剂能够作为用于判定WT1关联疾病的存在、治疗经过或者预后的检查用试剂（试剂盒）。
本发明的测定试剂或者检查用试剂含有本发明的抗原多肽作为有效成分，该测定试剂等中，除了被利用于该测定系的抗体检测试剂等任意试剂之外，还可以含有实施测定所必要的试剂类，例如抗体稀释液、反应稀释液、缓冲液、洗净液、标识体检测试剂等。
实施例
以下示出本发明的实施例，但本发明并不局限于此。
实施例1
1.材料和方法
1-1.血清被检测体
癌患者血清使用在大阪大学采取的20例。健康人血清使用市售的血清被检测体54例。另外，WT1疫苗治疗患者血清是在大阪大学给药前和给药后的数个点采血得到。
1-2.对于全长WT1抗原的抗体值测定
对于癌患者血清的全长WT1抗原的抗体值，通过由Oji等确立的ELISA进行测定（上述非专利文献7：Oji Y，Kitamura Y，Kamino K，et al.WT1IgG antibody for earlydetection of nonsmall cell lung cancer and as its prognostic factor.Int JCancer2009;125:381-7）。
1-3.分割WT1抗原表达载体的构筑
将全长WT1cDNA分割为WT1（序列号1）的N末端区域第1-182位（Fr.1）、中央区域181-324（Fr.2）、C末端区域294-449（Fr.3），利用Fr.1扩增用引物（序列号2和序列号3）、Fr.2扩增用引物（序列号4和序列号5）、Fr.3扩增用引物（序列号6和序列号7），通过PCR进行扩增。将Fr.1和Fr.2克隆于表达用载体pET-42a（+）（Merck公司），将Fr.3克隆于表达载体pQE-80L（QIAGEN公司）。
序列号2：ATGCGCGGTACCATGGGCTCCGACGTGCGGGACCTG
序列号3：ATGCGCGCGGCCGCCATGGGATCCTCATGCTTGAAT
序列号4：ATGCGCGGTACCCCCATGGGCCAGCAGGGCTCGC
序列号5：ATGCGCGCGGCCGCCATGAAGGGGCGTTTCTCACTGG
序列号6：ATGCGCGGATCCTTCAGAGGCATTCAGGATGTGC
序列号7：ATGCGCAAGCTTCAAAGCGCCAGCTGGAGTTTGGTC
1-4.Fr.1抗原的制作
将Fr.1表达载体转化于大肠菌BL21（DE3）之后，在1mM IPTG、16℃、16小时的条件下进行重组hWT1Fr.1的表达诱导。通过离心收集细菌后，混悬于含有0.2%Triton X-100的D-PBS（-），超声破碎，通过离心操作回收可溶部分。将可溶部分由D-PBS（-）稀释2倍，向经平衡化用缓冲液B1-1（含有0.1%Triton X-100的D-PBS（-））平衡化处理的GST融合蛋白质精制用柱（Glutatione Sepharose HP，GEHealthcare公司）结合，使用平衡化用缓冲液洗净后，由洗脱用缓冲液B1-1（50mM Tris-HCl，0.2%Triton X-100l，10mM还原型Glutathione，pH8.0）洗脱。进一步由平衡化用缓冲液B1-2（20mM NaPi，0.5M NaCl，0.2%Triton X-100，pH7.4）稀释3倍，向经平衡化用缓冲液B1-2平衡化处理后的His Tag精制用柱（NiSepharose HP，GE Healthcare公司）结合，由平衡化用缓冲液B1-2、洗净用缓冲液B1-2（20mM NaPi，0.5MNaCl，0.2%Triton X-100，250mM Imidazole，pH7.4）依次洗净后，由洗脱用缓冲液1-2（20mM NaPi，0.5M NaCl，0.2%Triton X-100，500mM Imidaole，pH7.4）洗脱。精制后的Fr.1抗原可通过Bradford法进行蛋白定量。
1-5.Fr.2抗原的调制
将hWT1Fr.2表达载体转化于大肠菌BL21（DE3）后，在1mMIPTG、37℃、3小时的条件下，进行Fr.2抗原的表达诱导。通过离心收集细菌后，混悬于含有0.2%Triton X-100的D-PBS（-），超声破碎，通过离心操作回收不溶成分。进一步由D-PBS（-）混悬，通过离心操作回收不溶成分，重复2次该操作而将其洗净。将洗净的不溶成分混悬于含有2M urea的D-PBS（-）中，在4℃、16小时的条件下培育，通过离心操作回收不溶成分后，进一步混悬于含有6Murea的D-PBS（-），4℃、16小时的条件下培育，得到可溶部分。由平衡化用缓冲液B2（20mMNaPi，0.5M NaCl，6M urea，5mM2-mercaptoethanol，pH7.4）稀释3倍，向经平衡化用缓冲液B2平衡化处理的His Tag精制用柱（NiSepharose HP，GE Healthcare公司）结合，由平衡化用缓冲液B2、洗净用缓冲液B2（20mM NaPi，0.5M NaCl，6M urea，5mM2-mercaptoethanol，200mM Imidazole，pH7.4）依次洗净后，由洗脱用缓冲液B2（20mM NaPi，0.5M NaCl，6M urea，5mM2-mercaptoethanol，500mM Imidazole，pH7.4）洗脱。精制后的Fr.2抗原通过Bradford法进行蛋白定量。
1-6.Fr.3抗原的调制
将Fr.3抗原表达载体转化于大肠菌BL21（DE3）后，在1mM IPTG、16℃、16小时的条件下进行Fr.3抗原的表达诱导。通过离心收集细菌后，混悬于含有30μM ZnCl2，0.2%TritonX-100的D-PBS（-），超声破碎，通过离心操作回收可溶部分。由平衡化用缓冲液B5（20mMTris-HCl，1M NaCl，0.1%Triton X-100，30μM ZnCl2，pH8.0）稀释2倍，与经过平衡化用缓冲液平衡化处理的His Tag精制用柱（TALON superflow，Clontech公司）结合，由平衡化用缓冲液5、洗净用缓冲液B5（10mM Tris-HCl，1M NaCl，30μM ZnCl2，0.1%Triton X-100，25mMImidazole，pH8.0）依次洗净后，由洗脱用缓冲液B（10mM Tris-HCl，0.72M NaCl，30μMZnCl2，0.1%Triton X-100，200mM Imidazole，pH8.0）洗脱。精制后的Fr.3抗原通过Bradford法进行蛋白定量。
1-7.抗原固相板制作
将精制的Fr.1抗原、Fr.2抗原或Fr.3抗原分别由D-PBS（-）调整为10μg/ml的浓度，向96孔微孔板（96-Well EIA/RIA Stripwel Plate，CORNING公司）添加100μL，4℃培育16小时，将其固相化。
由洗净液（含有0.05%Tween20的D-PBS（-））洗净1次后，添加板封闭液（含有1%牛血清白蛋白（BSA）的D-PBS（-））300μL，4℃培育16小时进行封闭。除去板封闭液，25℃培育箱中干燥，使用为止在4℃进行保存。
1-8.使用Fr.1抗原的IgG测定ELISA法
对于由洗净液洗净1次后的抗原固相板，添加由被检测体稀释液1（20mM NaPi，0.65M NaCl，0.05%Tween20，0.05%ProClin300，1%BSA，pH8.0）适当梯度稀释的市售抗体（hWT1H-290，SANTA CRUZ公司）或稀释的血清100μL，25℃振荡反应1小时。接下来，将板由洗净液洗净3次后，添加由2次反应液稀释液（含有0.05%Tween20，0.05%ProClin300，0.5%BSA的D-PBS（-））稀释50000倍的辣根过氧化酶（HRP）标识Protein G（Acris公司）100μL，25℃振荡反应1小时。最后，将板由洗净液洗净3次后，添加3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（TMB）100μL，室温下显色10分钟，添加1N硫酸100μL停止反应。通过微孔酶标仪测定450mn（参考波长650nm）的吸光度。
1-9.使用Fr.2抗原的IgG测定ELISA法
向由被检测体稀释液1适宜梯度稀释的市售抗体（hWT1H-290）或稀释的血清中添加GST表达大肠菌提取液使其成为5μg/ml，25℃振荡反应1小时。将其作为Fr.2被检测体液。对由洗净液洗净1次的抗原固相板，添加上述调整的Fr.2被检测体液100μL，25℃振荡反应1小时。接下来将板由洗净液洗净3次后，由2次反应液稀释液稀释50000倍的HRP标识ProteinG100μL，25℃振荡反应1小时。最后，将板由洗净液洗净3次后，添加TMB100μL，室温下显色10分钟，添加1N硫酸100μL停止反应。通过微孔酶标仪测定450mn（参照波长650nm）的吸光度。
1-10.使用Fr.3抗原的IgG测定ELISA法
对由洗净液洗净1次后的抗原固相板，添加由被检测体稀释液2（20mM NaPi，0.05%Tween20，0.05%ProClin300，1%BSA，pH8.0）适宜梯度稀释的市售抗体（hWT1H-290）或稀释的血清100μL，25℃振荡反应1小时。接下来，将板由洗净液洗净3次后，添加由2次反应液稀释液稀释50000倍的HRP标识Protein G100μL，25℃振荡反应1小时。最后，将板由洗净液洗净3次后，添加TMB100μL，室温下显色10分钟，添加1N硫酸100μL停止反应。通过微孔酶标仪测定450mn（参照波长650nm）的吸光度。
1-11.使用各抗原的IgM测定ELISA法
IgM抗体的测定按照IgG抗体的测定进行。检测是将HRP标识抗人IgM特异性抗体稀释50000倍后进行反应。
2.结果
2-1.对于全长WT1抗原的抗体值
将通过Oji等的方法测定的癌患者血清被检测体的血中抗WT1抗体值在表1和图1示出。从Oji等的报道可知对于全长WT1抗原的健康人抗体值的分布是10-3664WRU，其中心值是392WRU（上述非专利文献7）。本次使用的癌患者血清20例的抗体值的分布是7-1682WRU，全部被检测体都在健康人的范围。
[表1]
2-2.对于分割WT1抗原的癌患者的抗体值
通过使用分割WT1抗原的ELISA法进行血中抗体值的测定。将梯度稀释测定的市售抗体作为标准品制作对于浓度的吸光度的检量线，算出血中的抗体值。对于癌患者的各抗原的血中抗体值在上述表1示出。
将比较对于各分割WT1抗原的抗体值和对于全长WT1抗原的抗体值的结果在图2示出。对于Fr.2抗原和Fr.3抗原的抗体值与对于全长WT1抗原的抗体值显示高的相关性。另外，对于Fr.2抗原的抗体值与对于Fr.3抗原的抗体值的相关性也高（图3）。
这些结果表明对于全长WT1抗原的抗体值反映了对于Fr.3的抗体值，Fr.3是血中抗体的主要表位。
2-3.对于分割WT1抗原的抗体值的分布
比较对于分割WT1抗原的健康人54例（N）的抗体值和癌患者20例（C）的抗体值的分布，结果由图4示出。对于Fr.1抗原的抗体值在健康人和癌患者中是基本相同的分布，与此相对，对于Fr.2抗原和Fr.3抗原的癌患者的抗体值的分布，与健康人的抗体值的分布相比，显示高的结果。特别是对于Fr.3抗原的抗体值的分布是最为宽的结果，6例癌患者被检测体显示健康人的5倍以上的抗体值。
根据以上结果可知，Fr.3抗原即使在与对于全长WT1抗原的抗体值比较的情况下，也能够更明确地分类高值组。
实施例2抗原抑制试验
为了阐明与对于全长WT1抗原的抗体值相比，对于Fr.3抗原的抗体值能高灵敏度被检测的现象，通过将Fr.3抗原与Fr.1抗原或Fr.2抗原反应，确认Fr.3抗原的抗体表位是否被遮蔽。被检测体使用对Fr.3的多克隆抗体（PoAb）和对Fr.3具有高的抗体值的3例患者血清（被检测体No.3、No.7、No.9）。
1.方法
向由洗净液洗净1次后的Fr.3抗原固相板中添加由2次反应稀释液稀释的Fr.1抗原或Fr.2抗原100μL，25℃振荡反应1小时。接下来，添加由被检测体稀释液1稀释的市售抗体（hWT1C-19，SANTA CRUZ公司））或稀释的血清100μL，25℃振荡反应1小时。进一步将板由洗净液洗净3次后，添加由2次反应液稀释液稀释50000倍的HRP标识Protein G100μL，25℃振荡反应1小时。最后，将板由洗净液洗净3次后，添加TMB100μL，室温下显色10分钟，添加1N硫酸100μL停止反应。通过微孔酶标仪测定450mn（参照波长650nm）的吸光度，反应抑制率（B/B0）以抗原未添加的值为100%进行算出。
2.结果
结果由图5示出。
对于Fr.3的PoAb的反应性，被Fr.1抑制25%、被Fr.2抑制50%。同样，各血清被检测体的对于Fr.3的抗体值也被Fr.1或者Fr.2抑制。被检测体No.3没有被Fr.1抑制，而被Fr.2抑制70%；被检测体No.9没有被Fr.2抑制而被Fr.1抑制40%。被检测体N0.7虽然较弱，但被Fr.1抑制10%，被Fr.2抑制20%，因各抗原而反应被抑制。
以上结果表明Fr.1和Fr.2具有与Fr.3结合的功能，通过进一步地结合而对Fr.3的抗体表位进行遮蔽。
实施例3WT1疫苗给药脑肿瘤患者的抗体值评价
评价修饰型WT1235肽疫苗｛氨基酸序列（YTWNQMNL）｝给药患者的对于Fr.1抗原、Fr.2抗原和Fr.3抗原的IgG和IgM抗体值。患者被检测体使用SD（Stable Disease；稳定）组5例、PD（Progression Disease；进展）组4例。癌组织以MRI评价。
WT1235肽给药患者的IgG抗体值的推移汇总于图6。
对于Fr.1的IgG抗体值在全部的患者中基本没有检测出来。对于Fr.3的抗体值，明确地分类高值组和低值组，而在给药前后基本没有确认到有变动。另外，基本没有显示与全长WT1抗原的相关性。另一方面，存在对于Fr.2的抗体值在疫苗给药后经时上升的患者。可确认本抗体值与对于全长WT1抗原的抗体值高度相关。
关于对各抗原的疫苗给药前的IgG抗体值和治疗奏效性的比较的结果汇总于图7。
其结果，SD组中5例中有4例显示对于Fr.3的100unit以上的抗体值，PD组4例均小于100unit。对于其他抗原的抗体值中未确认到倾向。以上的结果表明疫苗给药前对于Fr.3的IgG抗体值是高值的患者为疫苗疗法奏效的患者。
关于对各抗原的疫苗给药后的IgG抗体值和治疗奏效性的比较结果汇总于图8。其结果，SD组种5例中有3例，与疫苗给药前相比给药后3个月时对于Fr.2和全长WT1抗原确认到2倍以上的抗体值的上升。但是，PD组4例中，基本没有确认到上升。以上结果表明疫苗给药后对于Fr.2的IgG抗体值上升的患者为疫苗疗法奏效的患者。
对于Fr.2和Fr.3的IgM抗体值的评价，使用疫苗给药前的被检测体进行。关于IgM抗体值和治疗奏效性的比较结果汇总于图9。该结果显示SD组全部5例对于Fr.2具有200unit以上的抗体值，PD组4例均小于200unit。另外，SD组中5例中有3例对于Fr.3显示80unit以上的抗体值，PD组4例均小于80unit。以上结果显示疫苗给药前对于Fr.2和Fr.3的IgM抗体值是高值的患者为疫苗疗法奏效的患者。
实施例4WT1疫苗给药大肠癌患者的抗体值评价
评价对于各抗原WT1235肽给药患者的IgG和IgM抗体值。患者被检测体使用SD组8例，PD组14例。使用疫苗给药前的被检测体进行对于Fr.2和Fr.3的抗体值的评价。结果汇总于图10。
对于Fr.3的IgG和IgM抗体值，与PD组相比SD组中有明显增高的倾向。SD组8例中有4例，其对于Fr.3的IgG抗体值是140unit以上，与此相对，PD组14例均是140unit以下。另外，SD组8例中有6例，其对于Fr.3的IgM抗体值是140unit以上，与此相对，PD组14例中有10例是140unit以下。以上结果表明，疫苗给药前对于Fr.3的IgM和IgG抗体值是高值的患者为疫苗疗法奏效的患者。
实施例5WT1疫苗治疗奏效者的治疗前分类化法
对于各抗原的IgM和IgG抗体值评价的结果，脑肿瘤患者和大肠癌患者这两种情况中，疫苗给药前的抗体值与治疗奏效性相关联的是对于Fr.3是抗体值。因此，将对于Fr.3的疫苗给药前的IgM和IgG抗体值以脑肿瘤患者和大肠癌患者进行了分类。脑肿瘤患者的结果由图11示出。
脑肿瘤患者中，规定IgG抗体值100unit、IgM抗体值100unit为基准值，则SD组的全部例子的IgM或IgG抗体值的一个在基准值以上，PD组的全部例子的IgM和IgG抗体值均在基准值以下，因此能够将其分类化。即，疫苗给药前的奏效者选别中的灵敏度·特异度为100%。大肠癌患者的结果由图12示出。将基准值规定为IgG抗体值150unit、IgM抗体值150unit时，SD组8例中有7例的IgM或IgG抗体值的一个在基准值以上。另一方面，PD组14例中有10例的IgM和IgG抗体值均在基准值以下，因此能够将其分类化。即，疫苗给药前的奏效者选别中的灵敏度是85%、特异度是71%。
以上结果表明，通过疫苗给药前测定对于Fr.3的IgM和IgG抗体值，即使是对于不同的癌种类，也能够进行治疗奏效者的前分类。

Claims (8)

1.多肽在制备抗WT1抗体的检测试剂中的应用，其特征在于，所述多肽为由序列号1中第294～449号的氨基酸序列组成的对抗WT1抗体具有抗原性的多肽。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，将所述多肽固定在固相上，通过检测该固定的多肽与被检测体中存在的抗WT1抗体的反应产物来测定抗体量。
3.多肽在制备WT1关联疾病的检查试剂中的应用，其特征在于，所述多肽为由序列号1中第294～449号的氨基酸序列组成的对抗WT1抗体具有抗原性的多肽。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，该应用是判定白血病预后的方法。
5.多肽在制备癌的WT1疫苗疗法中奏效者的预测试剂或治疗监测试剂中的应用，其特征在于，所述多肽为由序列号1中第294～449号的氨基酸序列组成的对抗WT1抗体具有抗原性的多肽。
6.根据权利要求5所述的应用，其中，癌是脑肿瘤或大肠癌。
7.一种被检测体中的抗WT1抗体的测定试剂，其含有由序列号1中第294～449号的氨基酸序列组成的对抗WT1抗体具有抗原性的多肽。
8.WT1改性蛋白质在制备自身抗体的检测试剂中的应用，其特征在于，对WT1蛋白质进行改性以使位于由序列号1中第294～449号的氨基酸序列组成的对抗WT1抗体具有抗原性的多肽的表位部分在表面露出，将该改性蛋白质作为自身抗体识别抗原使用。
CN201280044353.0A 2011-09-14 2012-09-13 抗wt1抗体的测定方法 Expired - Fee Related CN103797369B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011-200620 2011-09-14
JP2011200620 2011-09-14
PCT/JP2012/073512 WO2013039166A1 (ja) 2011-09-14 2012-09-13 抗ｗｔ１抗体の測定方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103797369A CN103797369A (zh) 2014-05-14
CN103797369B true CN103797369B (zh) 2017-09-19

Family

ID=47883383

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280044353.0A Expired - Fee Related CN103797369B (zh) 2011-09-14 2012-09-13 抗wt1抗体的测定方法

Country Status (10)

Country Link
US (2) US9851356B2 (zh)
EP (1) EP2757373A4 (zh)
JP (1) JP6122779B2 (zh)
KR (1) KR20140083986A (zh)
CN (1) CN103797369B (zh)
AU (1) AU2012309417B2 (zh)
BR (1) BR112014002747A2 (zh)
CA (1) CA2846479A1 (zh)
RU (1) RU2633068C2 (zh)
WO (1) WO2013039166A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014157692A1 (ja) 2013-03-29 2014-10-02 大日本住友製薬株式会社 Ｗｔ１抗原ペプチドコンジュゲートワクチン
EP2980097A4 (en) 2013-03-29 2017-03-08 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. Conjugate vaccine using trimming function of erap1
CA2912514A1 (en) * 2013-05-13 2014-11-20 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Method for predicting clinical effect of immunotherapy

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1288661A1 (en) * 2000-05-24 2003-03-05 Haruo Sugiyama Method for examining wt1-related disease
CN1505526A (zh) * 2000-10-06 2004-06-16 用于wt1特异性免疫疗法的组合物和方法
CN1671733A (zh) * 2001-10-30 2005-09-21 科里克萨有限公司 用于wt1特异性免疫疗法的组合物和方法
CN101384716A (zh) * 2006-02-22 2009-03-11 株式会社癌免疫研究所 Hla-a*3303限制性wt1肽和包含此肽的药物组合物
CN101573448A (zh) * 2006-12-28 2009-11-04 株式会社癌免疫研究所 Hla-a*1101限制的wt1肽及含有其的药物组合物
CN101622344A (zh) * 2007-02-27 2010-01-06 株式会社癌免疫研究所 活化辅助t细胞的方法以及用于该方法的组合物
CN101888852A (zh) * 2007-12-05 2010-11-17 株式会社癌免疫研究所 癌症疫苗组合物

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7063854B1 (en) * 1998-09-30 2006-06-20 Corixa Corporation Composition and methods for WTI specific immunotherapy
JP4592641B2 (ja) 2000-05-24 2010-12-01 治夫 杉山 Ｗｔ１関連疾患の検査方法
US20030138863A1 (en) 2000-05-24 2003-07-24 Haruo Sugiyama Method for examining wt1-related disease
AR076349A1 (es) 2009-04-23 2011-06-01 Int Inst Cancer Immunology Inc Peptido auxiliar del antigeno del cancer

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1288661A1 (en) * 2000-05-24 2003-03-05 Haruo Sugiyama Method for examining wt1-related disease
CN1505526A (zh) * 2000-10-06 2004-06-16 用于wt1特异性免疫疗法的组合物和方法
CN1671733A (zh) * 2001-10-30 2005-09-21 科里克萨有限公司 用于wt1特异性免疫疗法的组合物和方法
CN101384716A (zh) * 2006-02-22 2009-03-11 株式会社癌免疫研究所 Hla-a*3303限制性wt1肽和包含此肽的药物组合物
CN101573448A (zh) * 2006-12-28 2009-11-04 株式会社癌免疫研究所 Hla-a*1101限制的wt1肽及含有其的药物组合物
CN101622344A (zh) * 2007-02-27 2010-01-06 株式会社癌免疫研究所 活化辅助t细胞的方法以及用于该方法的组合物
CN101888852A (zh) * 2007-12-05 2010-11-17 株式会社癌免疫研究所 癌症疫苗组合物

Also Published As

Publication number Publication date
EP2757373A4 (en) 2015-07-01
CN103797369A (zh) 2014-05-14
BR112014002747A2 (pt) 2020-10-27
JP6122779B2 (ja) 2017-04-26
WO2013039166A1 (ja) 2013-03-21
AU2012309417B2 (en) 2017-09-14
EP2757373A1 (en) 2014-07-23
AU2012309417A1 (en) 2014-02-13
JPWO2013039166A1 (ja) 2015-03-26
CA2846479A1 (en) 2013-03-21
RU2633068C2 (ru) 2017-10-11
RU2014114532A (ru) 2015-10-20
US20170138958A1 (en) 2017-05-18
KR20140083986A (ko) 2014-07-04
US9851356B2 (en) 2017-12-26
US20140227799A1 (en) 2014-08-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2718707C (en) Method for detection of liver cancer cell using anti-glypican-3 antibody
CN108107218A (zh) 抗体测定
EP2754672A1 (en) Antibody capable of binding to specific region of periostin, and method for measuring periostin using same
CN110873711B (zh) 一种基于全自动化学发光分析仪的血清tk1检测试剂盒
CN107991485A (zh) 用于检测可溶性st2蛋白的试剂盒
CN103797369B (zh) 抗wt1抗体的测定方法
KR20150041620A (ko) Pivka-ⅱ 측정 방법, 측정 시약 및 측정 키트
US6759204B2 (en) Method and kit for early diagnosis of cancer
CN107110848B (zh) 以脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶基因作为指标使用的动脉硬化及癌的检测方法
EP3928096A1 (en) Use of bmmf1 rep protein as a biomarker for prostate cancer
CN106220722B (zh) Dkk1自身抗体识别的抗原多肽及其用途
JP6797427B2 (ja) 被検者が膵臓癌に罹患している可能性を試験する方法
US7718780B2 (en) Preparation of monoclonal antibody to N-myc downstream regulated gene 2 and determination of NDRG2 using protein chip
EP3928095A1 (en) Use of bmmf1 rep protein as a biomarker for breast cancer
JP6873460B2 (ja) 被検者が膵臓癌に罹患している可能性を試験する方法
CN110865184B (zh) Srsp蛋白和srsp抗原表位肽的应用及诊断和治疗肿瘤的产品
JP2024022933A (ja) 原発性アルドステロン症のサブタイプの検査方法
US8313917B2 (en) Methods of diagnosing latent and active malignancies
JPH1194831A (ja) ホルモンレセプターに対する自己抗体の測定による癌の検出方法
WO2012065071A2 (en) Methods of predicting response to egfr antibody therapy
JP2011117922A (ja) アレルギー疾患の検査方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20170919

Termination date: 20190913

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee