JPWO2013039166A1 - 抗ｗｔ１抗体の測定方法 - Google Patents

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Abstract

検体中抗ＷＴ１抗体をより正確に測定・評価可能な、当該抗ＷＴ１抗体の測定方法、及びその利用に係る発明の提供。配列番号１における第２９４〜４４９番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、当該ポリペプチドの部分ポリペプチド、及びこれらのポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される、抗ＷＴ１抗体に対して抗原性を有するポリペプチド、及び／又は配列番号１における第１８１〜３２４番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、当該ポリペプチドの部分ポリペプチド、及びこれらのポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される抗ＷＴ１抗体に対して抗原性を有するポリペプチドを用いることを特徴とする、検体中の抗ＷＴ１抗体の測定方法。

Description

本発明は、ＷＴ１フラグメントを用いた、検体中の抗ＷＴ１抗体の測定方法に関する。
ＷＴ１遺伝子（Wilms tumor gene）は、ウイルムス（Wilms）腫瘍の原因遺伝子として単離されたジンクフィンガー（zinc finger）型の転写因子である。その後、急性骨髄性白血病をはじめ各種の固形癌でもＷＴ１遺伝子の異常な高発現が確認され（非特許文献１−３）、したがって、ＷＴ１タンパク質はペプチドワクチンとしての応用が試みられている。
また近年、ＷＴ１タンパク質は、抑制領域（repression domein）、活性化領域（activation domein）及びＤＮＡ結合ドメインであるジンクフィンガー領域（Zinc finger domain）からなる構造を有し、ＥＧＲ−１（Early Growth Response Protein 1；初期増殖応答タンパク質1）部位に結合して遺伝子の発現調節を行っていることが明らかにされ、癌抑制遺伝子としての機能を有することも報告されている（非特許文献４及び５）。
一方、ＷＴ１タンパク質に対する自己抗体の存在も明らかとなってきた。特に血液癌や肺癌（小細胞癌）で患者血液中のＷＴ１タンパク質に対する自己抗体価が高いことが報告されている（非特許文献６−８）。また、ＷＴ１ ｍＲＮＡは、発現が高いほど予後不良の傾向があるのに対して、抗ＷＴ１抗体は血中濃度が高いほど予後が良好な傾向を示すことが報告されている（非特許文献７）。したがって、患者血中の抗ＷＴ１抗体を正確に測定することは治療法の選択または治療経過のモニタリングに有用であると考えられ、例えば、抑制領域及び活性化領域を含みジンクフィンガーを欠くＷＴ１タンパク質を抗原として抗ＷＴ１抗体を測定することが報告されている（特許文献１及び２）。
しかしながら、生体内タンパク質が異物として認識されるようになり、自己抗体が形成されるメカニズムは未だ不明であり、しかもその抗体量は僅かであり、自己抗体を高感度で検出する方法は確立されていない。抗ＷＴ１抗体についても、これまでのＷＴ１タンパク質抗原を用いる方法では検出抗体の抗体価の分布が狭く、必ずしも正確に評価されていないという問題があった。
特開２００２−４８７９３号公報 特開２００６−２６７１２４号公報
Inoue K, Sugiyama H, Ogawa H, et al. WT1 as a new prognostic factor and new marker for the detection of minimal residual disease in acute leukemia. Blood 1994;84:3071-9 Oji Y, Miyoshi S, Maeda H, et al. Overexpression of the Wilms' tumor gene WT1 in de novo lung cancers. Int J Cancer 2002;100:297-303 Miyoshi Y, Ando A, Egawa C, et al. High expression of Wilms' tumor suppressor gene predicts poor prognosis in breast cancer patients. Clin Cancer Res 2002;8:1167-71 Haber DA, Sohn RL, Buckler AJ, et al. Alternative splicing and genomic structure of the Wilms' tumor gene WTl. Proc Natl Acad Sci USA 88;9618:1991 Madden SL, Cook DM, Morris JF, et al. Transcriptional repression mediated by the WTI Wilms tumor gene product. Science 2.53; 1550:1991 Olga AEl, Oka Y, Tsuboi A, et al. Humoral immune responses againstWilms tumor gene WT1 product in patients with hematopoietic malignancies. Blood 2002;99:3272-3279 Oji Y, Kitamura Y, Kamino K, et al. WT1 IgG antibody for early detection of nonsmall cell lung cancer and as its prognostic factor. Int J Cancer 2009;125:381-7 Tamura H, Dan K, Yokose N, et al. Prognostic significance of WT1 mRNA and anti-WT1 antibody levels in peripheral blood in patients with myelodysplastic syndromes. Leukemia Res 2010;34:986-990
本発明は、ＷＴ１関連疾患患者の抗ＷＴ１抗体をより正確に測定・評価可能な、当該抗ＷＴ１抗体の測定方法、及びその利用に係る発明を提供することに関する。
本発明者らは、ＷＴ１関連疾患患者の血中抗ＷＴ１抗体の検出について検討を進める過程で、生体内における自己抗体は、自己抗体認識抗原が立体構造的に変化を来してエピトープ部分が表面に露出した場合に異物として認識され、形成されることを見出した。そしてＷＴ１の場合、主要エピトープは、ヒトＷＴ１タンパク質を構成するアミノ酸配列（配列番号１）の中央領域（アミノ酸番号：１８１−３２４番目）及びＣ末端領域（アミノ酸番号：２９４−４４９番目）にあり、特にＷＴ１のＤＮＡ結合ドメインであるＣ末端領域（ジンクフィンガー領域）に相当するポリペプチド断片を抗原として用いて抗ＷＴ１抗体を測定した場合、その抗体価は全長ＷＴ１を抗原として用いて測定した場合と高い相関を示すことを見出した。そして更に、健常者と癌患者でその抗体価の分布を比較すると、癌患者における抗体価の分布が健常者の分布より広くその差が顕著であり、癌患者のような抗ＷＴ１抗体価の高値群を、的確に感度良く測定できることを見出した。
すなわち、本発明は、以下の１）〜９）に係るものである。
１）配列番号１における第２９４〜４４９番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、当該ポリペプチドの部分ポリペプチド、及びこれらのポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される抗ＷＴ１抗体に対して抗原性を有するポリペプチド、及び／又は配列番号１における第１８１〜３２４番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、当該ポリペプチドの部分ポリペプチド、及びこれらのポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される抗ＷＴ１抗体に対して抗原性を有するポリペプチドを用いることを特徴とする、検体中の抗ＷＴ１抗体の測定方法。
２）前記ポリペプチドの少なくとも１種を固相に固定し、該固定したポリペプチドと検体中に存在する抗ＷＴ１抗体との反応産物を検出することにより抗体量を測定する、上記１）の測定方法。
３）配列番号１における第２９４〜４４９番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、当該ポリペプチドの部分ポリペプチド、及びこれらのポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される抗ＷＴ１抗体に対して抗原性を有するポリペプチド、及び／又は配列番号１における第１８１〜３２４番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、当該ポリペプチドの部分ポリペプチド、及びこれらのポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される抗ＷＴ１抗体に対して抗原性を有するポリペプチドを用いることを特徴とする、ＷＴ１関連疾患の検査方法。
４）白血病の予後を判定するものである上記３）の検査方法。
５）配列番号１における第２９４〜４４９番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、当該ポリペプチドの部分ポリペプチド、及びこれらのポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される抗ＷＴ１抗体に対して抗原性を有するポリペプチド、及び／又は配列番号１における第１８１〜３２４番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、当該ポリペプチドの部分ポリペプチド、及びこれらのポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される抗ＷＴ１抗体に対して抗原性を有するポリペプチドを用いることを特徴とする、癌のＷＴ１ワクチン療法における奏功者の予測又は治療モニタリング方法。
６）癌が脳腫瘍又は大腸癌である上記５）の方法。
７）配列番号１における第２９４〜４４９番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、当該ポリペプチドの部分ポリペプチド、及びこれらのポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される抗ＷＴ１抗体に対して抗原性を有するポリペプチド、及び／又は配列番号１における第１８１〜３２４番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、当該ポリペプチドの部分ポリペプチド、及びこれらのポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される抗ＷＴ１抗体に対して抗原性を有するポリペプチドを含有する、検体中の抗ＷＴ１抗体の測定試薬。
８）配列番号１における第２９４〜４４９番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、当該ポリペプチドの部分ポリペプチド、及びこれらのポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される、抗ＷＴ１抗体に対して抗原性を有するポリペプチド、及び／又は配列番号１における第１８１〜３２４番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、当該ポリペプチドの部分ポリペプチド、及びこれらのポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される抗ＷＴ１抗体に対して抗原性を有するポリペプチドを含有する、ＷＴ１関連疾患の検査用試薬。
９）生体内タンパク質に対してエピトープ部分が表面に露出するように改変し、当該改変タンパク質を自己抗体認識抗原として用いることを特徴とする自己抗体の検出方法。
本発明の抗ＷＴ１抗体の測定方法によれば、ＷＴ１関連疾患患者に存在する抗ＷＴ１抗体をより的確に感度良く測定できることから、抗ＷＴ１抗体価の変動を良好に把握でき、ＷＴ１関連疾患の診断、治療効果のモニタリング、予後の判定、ワクチン療法施行前の奏功者の予測やワクチン療法施行後の奏功モニタリング等を、容易に且つ精度良く行うことが可能となる。
全長WT1抗原に対する癌患者血中抗体価を示す図。 全長WT1抗原に対する抗体価と分割WT1抗原に対する抗体価の比較を示す図。（a）はFr.1抗原に対する抗体価の比較、（b）はFr.2抗原に対する抗体価の比較、及び（c）はFr.3抗原に対する抗体価の比較した結果。縦軸は分割WT1抗原に対する抗体価（unit）、横軸は全長WT1抗原に対する抗体価（WRU）を示す。 Fr.2抗原に対する抗体価とFr.3抗原に対する抗体価の比較を示す図。縦軸はFr.3抗原に対する抗体価（unit）、横軸はFr.2抗原に対する抗体価（WRU）を示す。 分割WT1抗原に対する抗体価の分布を示す図。分割WT1抗原に対する健常者の抗体価分布と癌患者の抗体価分布を示す。Nは健常者54例の分布、Cは癌患者20例の分布。（a）はFr.1抗原、（b）はFr.２抗原、（c）はFr.3抗原の結果。 Fr.3抗原に対する抗原阻害試験の結果を示す図。Fr.3に対する抗体反応性をFr.1及びFr.2で阻害した結果を示す。C-19はFr.3に対するPoAb、No.3, No.7, No.9はFr.1及びFr.2に対する抗体価が低く、Fr.3に対する抗体価が高い患者血清。白色バーはFr.1抗原添加、黒色バーはFr.2抗原添加の結果。 各抗原に対するIgG抗体価の推移を示す図。黒色バーはFr.1に対する抗体価、白色バーはFr.2に対する抗体価、横線バーはFr.3に対する抗体価、斜線バーは全長WT1抗原に対する抗体価の推移。黒丸棒線は、MRIに測定による腫瘍径の変動を示す。 ワクチン投与前のIgG抗体価を比較した図。 ワクチン投与後のIgG抗体価の比較した図。 ワクチン投与前のIgM抗体価を示す図。Ａ：Fr.2に対するIgM抗体価、Ｂ：Fr.3に対するIgM抗体価。 ワクチン投与前のIgM及びIgG抗体価を示す図。 脳腫瘍患者におけるIgM及びIgG抗体価を示す図。縦軸はIgM抗体価、横軸はIgG抗体価、○はSD患者及び●はPD患者を示す。点線は仮の基準値を示す。 大腸癌患者におけるIgM及びIgG抗体価を示す図。縦軸はIgM抗体価、横軸はIgG抗体価、○はSD患者及び●はPD患者を示す。点線は仮の基準値を示す。
本発明において、抗ＷＴ１抗体とは、ウイルムス腫瘍の原因遺伝子（Wilms tumor gene）として単離されたジンク・フィンガー型の転写因子ＷＴ１の遺伝子産物、具体的には、４４９個のアミノ酸からなるヒトＷＴ１タンパク質（配列番号１）に対する抗体をいう。斯かる抗体にはＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体などの各種の免疫グロブリンが含まれるが、本発明においては当該抗体の全てが包含される。
生体内タンパクは、元来免疫システムによりこれを異物として認識しない。したがって抗体形成は生じないのが通常である。本発明者らは、自己抗体は、自己抗体認識抗原が立体構造的に変化を来してエピトープ部分が表面に露出した場合に異物として認識され、形成されるものと考えた。したがって、自己抗体認識抗原の調製には、例えば、表面部分を一部欠失させたタンパク質を遺伝子工学的に発現させる、プロテアーゼなどペプチド結合を切断する、或いは、酸、アルカリ、界面活性剤、熱変性等の各処理、尿素及び塩酸グアニジンなどカオトロピック試薬による処理等、タンパク質の改変を行なって、分子内に隠れたエピトープ部分を表面に露出させることが必要であると考えられる。
本発明者らは、後記実施例に示すように、ＷＴ１タンパク質において、自己抗体認識抗原となり得る分子を検討し、主要エピトープが、ヒトＷＴ１タンパク質を構成するアミノ酸配列（配列番号１）の中央領域（アミノ酸番号：１８１−３２４番目）及びＣ末端領域（アミノ酸番号：２９４−４４９番目）にあり、特にＣ末端領域のペプチドを抗体検出抗原とすることにより全長ＷＴ１抗原を用いるより抗体検出感度を向上できること（実施例１）、また、Ｃ末端側領域における抗体反応性は、Ｎ末端側領域（アミノ酸番号：１−１８２番目）及び中央領域の抗原により阻害されること（実施例２）、を見出し、上記の点を立証した。
本発明の抗ＷＴ１抗体の測定方法において用いられる、抗ＷＴ１抗体に対して抗原性を有するポリペプチドは、配列番号１における第２９４〜４４９番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１における第１８１〜３２４番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、当該ポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、及びこれらの部分ポリペプチドから選択されるものである。
配列番号１における第２９４〜４４９番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＷＴ１タンパク質において、ＤＮＡ結合ドメインであるジンクフィンガー領域（Zinc finger domain）に相当する。本発明においては、Ｃ末端領域とも称する。
配列番号１における第１８１〜３２４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＷＴ１タンパク質において、Ｎ末端側領域（アミノ酸番号：１−１８２番目）と前記Ｃ末端領域との間に位置する領域で、中央領域とも称する。
抗原ポリペプチドとしては、当該配列番号１における第２９４〜４４９番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、第１８１〜３２４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いるのが好ましいが、抗ＷＴ１抗体に対する抗原性を有し、抗ＷＴ１抗体を検出し得る限りにおいて、当該ポリペプチドの部分ポリペプチド、これらのポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドも使用することができる。
上記ポリペプチドの部分ポリペプチドとしては、配列番号１における第２９４〜４４９番のアミノ酸配列からなるポリペプチド又は第１８１〜３２４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドのうちの、連続する６〜８個、好ましくは１０〜２０個からなるペプチドが挙げられ、具体的には、配列番号１における２９４〜４４９番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１における３４８〜４４９番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１における１８１〜３２４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド等が挙げられる。
上記の配列番号１において第２９４〜４４９番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、第１８１〜３２４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはその部分ポリペプチドは、抗ＷＴ１抗体に対する抗原性を有する限りにおいて、それらを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていてもよい。
ここで、欠失、付加または置換され得るアミノ酸の数は、１個以上でありその数は特に限定されないが、部位特異的変異導入法などの周知の技術により、欠失、付加または置換できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
ここで、アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、付加または置換があることを意味し、欠失、付加または置換が同時に生じてもよく、欠失、付加または置換されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない。
尚、「抗ＷＴ１抗体に対して抗原性を有する」とは、ＷＴ１タンパク質を認識する抗体に対して反応性を有することを意味する。ＷＴ１関連疾患患者が産生しうる自己抗体は、ポリクローナル抗体であるため、本発明の抗原ポリペプチドは、それ自体が複数の反応箇所（エピトープ）を有するものであってもよい。
本発明の方法において用いられるポリペプチドは、上記のポリペプチドから選択される少なくとも１種のポリペプチドである。特異性及び測定感度を向上させるために、複数種のポリペプチドを組み合わせて使用してもよい。
上記ポリペプチドは、既知のＷＴ１遺伝子を利用した遺伝子工学的手法により、例えば、後述の実施例に記載した方法、及びこれに準じる方法により製造することができ、また、化学合成によって製造することもできる。
ＷＴ１遺伝子を利用した遺伝子工学的手法による上記ポリペプチドの製造は、従来公知の一般的な遺伝子組換え技術に従うことができる。より詳細には、所望のＷＴ１遺伝子が宿主細胞中で発現できるような組換えＤＮＡを作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養することにより、形質転換体の細胞内または細胞外に、発現産物として所望のポリペプチドを生産させることができる。
ここで採用され得る各種操作、例えば一部遺伝子の化学合成、同切断、削除、付加乃至結合を目的とする酵素処理、同単離、精製、選択など、組換えDNAの宿主細胞への導入及び形質転換細胞の培養などはいずれも常法に従うことができる（例えば「分子遺伝学実験法」、共立出版株式会社1993年発行；「PCRテクノロジー」、宝酒造株式会社1990年発行、Science, 224, 1431 (1984)；Biochem.Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80,5990 (1983); Moplecular Cloning, by T.Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory (1982)など参照）。
また所望により、ポリペプチドは、その物理的・化学的性質などを利用した各種分離操作（例えば「生化学データーブックII」、1175-1259頁、第1版第1刷、1980年6月23日、株式会社東京化学同人発行など参照）に従い、上記発現産物などから分離、精製することもできる。
本発明において、検体（サンプル）としては、ＷＴ１関連疾患患者またはその治療後患者由来の検体であって、一般に抗体が存在することが知られている、例えば血液、尿などの各種の体液を制限なく例示することができる。
ＷＴ１関連疾患としては、例えば白血病、固形癌、骨髄異形成症候群などのＷＴ１関連疾患として既知の各種疾患を挙げることができる。また、将来見出されるＷＴ１関連疾患をも包含する。
本発明の抗ＷＴ１抗体の測定方法において、抗ＷＴ１抗体（抗体量）の測定は、上記のポリペプチドを用いた、免疫学的測定法に従って実施することができる。免疫学的測定法としては、任意の公知の免疫学的測定方法があげられ、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、間接蛍光抗体法（Indirect Fluorescence assay）、発光免疫測定法（Luminescent immunoassay）、物理化学的測定法（ＴＩＡ、ＬＡＰＩＡ、ＰＣＩＡ）、ウェスタンブロッティング法などがあげられるが、ＥＬＩＳＡ法が好ましく用いられる。
ＥＬＩＳＡ法は、固相に固定化した抗原と抗体とを反応させ、さらに抗原に結合した抗体にペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの酵素標識などを施した二次抗体を反応させた後、酵素標識を適当な方法で測定する方法であり、例えば、競合法、サンドイッチ法が挙げられ、中でもサンドイッチ法（固相化サンドイッチ法）が好適に例示できる。
固相化サンドイッチ法は、例えば次の如くして実施される。即ち、まず本発明のポリペプチドを固相化しておき、これに被検試料としての検体を加える。その結果、固相化抗原と試料中の抗体との間で抗原抗体反応が起こり、検体中に存在する抗ＷＴ１抗体は固相化抗原に結合する。次にこの結合した抗体を、抗体検出試薬を用いて検出して、被検試料中に存在する抗ＷＴ１抗体を測定する。
上記においては、また抗体検出試薬を固相化し、これにより検体中の抗体を捕捉し、次いで本発明のポリペプチドを加えて捕捉された抗体中の抗WT1抗体に結合させ、更に該抗原の特異抗体の標識体を結合させることにより、被検試料中に存在する目的の抗WT1抗体を検出、測定することもできる。
これら測定手法における各種手段の選択、それらの改変などはいずれも当業者のよく知るところであり、本発明においても特に制限されるところはなく、それら各手法のいずれをも採用することができる〔「臨床検査法提要」、金原出版、1995年など参照〕。
例えば、上記固相法における固相としては、通常使用される不溶性、不活性の担体が広く利用できる。これには、例えばガラス、セルロース粉末、セファデックス、セファロース、ポリスチレン、濾紙、カルボキシメチルセルロース、イオン交換樹脂、デキストラン、プラスチックフィルム、プラスチックチューブ、ナイロン、ガラスビーズ、絹、ポリアミン−メチルビニルエーテル−マレイン酸共重合体、アミノ酸共重合体、エチレン−マレイン酸共重合体などの種々の素材からなるスティック、ビーズ、マイクロプレート、試験管などが包含される。
抗原あるいは抗体の固定化方法も特に制限はなく、物理的結合及び化学的結合のいずれをも利用できる。代表的には、例えば共有結合法としてジアゾ法、ペプチド法（酸アミド誘導体法、カルボキシルクロライド樹脂法、カルボジイミド樹脂法、無水マレイン酸誘導体法、イソシアナート誘導体法、臭化シアン活性化多糖体法、セルロースカルボナート誘導体法、縮合試薬を使用する方法など）、アルキル化法、架橋試薬による担体結合法（架橋試薬としてグルタールアルデヒド、ヘキサメチレンイソシアナートなどを用いる）、Ugi反応による担体結合法などの化学的反応を利用する方法：イオン交換樹脂のような担体を用いるイオン結合法：ガラスビーズなどの多孔性ガラスを担体として用いる物理的吸着法などを例示できる。
各測定系における標識剤としても、特に制限はされず、従来公知のものまたは将来使用され得るもののいずれをも用いることができる。具体例としては、免疫測定法において慣用の各種放射性同位元素類、アルカリホスファターゼ（ALP）、パーオキシダーゼ（POX）などの酵素類、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（RITC）などの蛍光物質類、その他、1N-(2,2,6,6-テトラメチル-1-オキシル-4-ピペリジル)-5N-(アスパルテート)-2,4-ジニトロベンゼン（TOPA）などを制限なく例示できる。
尚、酵素標識のための酵素標識物質としては、例えば上記例示のものに加えて、マイクロパーオキシダーゼ、キモトリプシノーゲン、プロカルボキシペプチダーゼ、グリセロアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素、アミラーゼ、ホスホリラーゼ、D-ナーゼ、P-ナーゼなどを例示できる。これらの標識物質による標識方法は、公知の方法に従って実施できる（例えば、「単クローン抗体」、岩崎辰夫他著、講談社サイエンティフィック、1984年；「酵素免疫測定法」第2版、石川栄治他著、医学書院、1982年など参照）。
また、酵素活性の測定も、使用する酵素の種類に応じて公知の方法に従って実施することができる。例えば標識酵素としてパーオキシダーゼを用いる場合は、基質としてABTSJ(2,2'-アジノ−ビ(3'-エチルベンツチアゾリンスルホン酸))を用いて、またアルカリホスファターゼを用いる場合は、基質としてp-ニトロフェニルホスフェートを用いて、各基質の分解を分光光度計などを用いて測定する方法などによることができる（「酵素免疫測定法」、第2版、石川栄治他著、医学書院、1982年など参照）。
尚、上記酵素標識の代わりに、放射性同位元素、蛍光物質などによる標識体を用いる場合も、当該標識体の測定は、公知の方法に従って実施することができる。
上記測定系において使用される溶媒としては、反応に悪影響を与えないものであれば一般的に使用されるもののいずれでもよく、具体的にはクエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩緩衝液、酢酸緩衝液などのｐＨ約５−９程度の緩衝液が好適に利用できる。
免疫反応（結合）条件も特に制限はなく、一般にこの種の測定法で用いられる通常の条件が採用される。一般には４５℃以下、好ましくは約４−４０℃程度の温度条件下に、約１−４０時間程度を要して反応を行うことができる。
斯くして、本発明のポリペプチドを抗原としても用いる測定方法によれば、ＷＴ１関連疾患患者に存在する抗ＷＴ１抗体をより的確に感度良く測定でき、抗ＷＴ１抗体価の変動を良好に把握できる。
ＷＴ１関連疾患患者における抗ＷＴ１抗体の抗体量は、健常者におけるそれと比して、有意に増加しており、また、当該患者の治療に伴って低下する。従って、斯かるＷＴ１抗体量、好ましくはその経時的変化を臨床指標として、ＷＴ１関連疾患の存在や治療経過及び予後を判定することが可能となる。例えば、白血病などのＷＴ１関連疾患が完全寛解になれば、抗ＷＴ１抗体が消失し、この抗体の消失を経時的に調べることによって、完全寛解状態の維持を確認できる。
また、ＷＴ１関連疾患患者における抗ＷＴ１抗体の検出、即ち、ＷＴ１抗体陽性患者の確認は、同患者がＷＴ１に対する液性免疫応答を起こしていることの確認を意味する。したがって、抗ＷＴ１抗体の検出それ自体は、ＷＴ１関連疾患における当該患者の免疫応答能を判定又は診断する上で有用である。ＷＴ１に対して免疫応答を起こしている患者は、起こしていない患者に比し免疫応答が高い分、その予後が良い可能性があることより、かかる判定又は診断は、ＷＴ１関連疾患の予後判断の指標と成り得る。
したがって、本発明の抗ＷＴ１抗体の測定方法は、ＷＴ１関連疾患の存在、治療経過及び予後の判定、殊に各種の癌患者における（癌に対する）免疫応答能の検査、診断等に有用である。
また、本発明の抗ＷＴ１抗体の測定方法は、癌のＷＴ１ワクチン療法において、その施行前に予め奏功者を予測したり、施行後の奏功モニタリングに応用することが可能である。例えば、脳腫瘍や大腸癌等の癌ＷＴ１ワクチンの投与前において、Ｃ末端側領域のペプチド（配列番号１における第２９４〜４４９番のアミノ酸配列からなるポリペプチド等）に対するＩｇＧ抗体価もしくはＩｇＭ抗体価、中央領域のペプチド（配列番号１における第１８１〜３２４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド等）に対するＩｇＭ抗体価が高い患者はＷＴ１ワクチンの高い治療効果が予測できる。一方、ＷＴ１ワクチン投与後、奏功者は、中央領域に対するＩｇＧ抗体価が上昇してくる。また、僅かではあるが、Ｃ末端側領域に対するＩｇＧ抗体価が上昇する傾向が確認できる。これらのことより、中央領域及びＣ末端側領域に対するＩｇＧ抗体価の推移を指標として治療奏功モニタリングを行うことができる。
本発明の抗ＷＴ１抗体の測定方法、或いはこれを用いる各種検査方法の実施に際しては、本発明のポリペプチドを測定試薬として用いることが簡便であり、本発明は斯かる測定試薬等をも提供する。当該測定試薬は、ＷＴ１関連疾患の存在や治療経過、或いは予後を判定するための検査用試薬（キット）となり得る。
本発明の測定試薬或いは検査用試薬は、本発明の抗原ポリペプチドを有効成分として含むものであり、当該測定試薬等には、更に、当該測定系に利用される抗体検出試薬などの任意の試薬の他、測定の実施に必要な試薬類、例えば抗体希釈液、反応希釈液、緩衝液、洗浄液、標識体検出試薬などが含まれていてもよい。
以下に本発明の実施例を示すが、これに限定されるべきものではない。
実施例１
１．材料と方法
１−１．血清検体
癌患者血清は、大阪大学にて採取された20例を用いた。健常者血清は、市販の血清検体54例を用いた。また、WT1ワクチン治療患者血清は、大阪大学にて投与前及び投与後の数ポイントにおいて採血した。
１−２．全長WT１抗原に対する抗体価測定
癌患者血清の全長WT１抗原に対する抗体価はOjiらにより確立されたELISAにより測定した（前記非特許文献７：Oji Y, Kitamura Y, Kamino K, et al. WT1 IgG antibody for early detection of nonsmall cell lung cancer and as its prognostic factor. Int J Cancer 2009;125:381-7）。
１−３．分割WT1抗原発現ベクターの構築
全長WT1 cDNAを、WT１（配列番号１）のN末端領域1-182番目（Fr.1）、中央領域181-324（Fr.2）、C末端領域294-449（Fr.3）に分割し、Fr.1増幅用プライマ−（配列番号２及び配列番号３）、Fr.2増幅用プライマ−（配列番号４及び配列番号５）、Fr.3増幅用プライマ−（配列番号６及び配列番号７）を用いて、PCRにて増幅した。Fr.1及びFr.2を発現用ベクターpET-42a(+) (Merck社)、Fr.3を発現ベクターpQE-80L (QIAGEN社)にクローニングした。
配列番号２：ATGCGCGGTACCATGGGCTCCGACGTGCGGGACCTG
配列番号３：ATGCGCGCGGCCGCCATGGGATCCTCATGCTTGAAT
配列番号４：ATGCGCGGTACCCCCATGGGCCAGCAGGGCTCGC
配列番号５：ATGCGCGCGGCCGCCATGAAGGGGCGTTTCTCACTGG
配列番号６：ATGCGCGGATCCTTCAGAGGCATTCAGGATGTGC
配列番号７：ATGCGCAAGCTTCAAAGCGCCAGCTGGAGTTTGGTC
１−４．Fr.1抗原の作製
Fr.1発現ベクターを大腸菌BL21(DE3)に形質転換後、1mM IPTG、16℃、16時間の条件下でリコンビナントhWT1 Fr.1 の発現誘導を行った。遠心による集菌後、0.2% Triton X-100を含むD-PBS(-)にて懸濁して超音波破砕し、遠心操作により可溶画分を回収した。可溶画分をD-PBS(-)で2倍希釈し、平衡化用緩衝液B1-1(0.1% Triton X-100を含むD-PBS(-))にて平衡化済みのGST融合タンパク質精製用カラム(Glutatione Sepharose HP, GE Healthcare社)へ結合させ、平衡化用緩衝液で洗浄後、溶出用緩衝液B1-1(50mM Tris-HCl, 0.2% Triton X-100l, 10mM 還元型Glutathione, pH8.0)で溶出した。更に平衡化用緩衝液B1-2(20mM NaPi, 0.5M NaCl, 0.2% Triton X-100, pH7.4)で3倍希釈し、平衡化用緩衝液B1-2で平衡化済みのHisタグ精製用カラム(Ni Sepharose HP, GE Healthcare社)へ結合させ、平衡化用緩衝液B1-2、洗浄用緩衝液B1-2(20mM NaPi, 0.5M NaCl, 0.2% Triton X-100, 250mM Imidazole, pH7.4)で順次洗浄後、溶出用緩衝液1-2(20mM NaPi, 0.5M NaCl, 0.2% Triton X-100, 500mM Imidaole, pH7.4)で溶出した。精製後のFr.1抗原はBradford法にてタンパク定量を行った。
１−５．Fr.2抗原の調製
hWT1 Fr.2発現ベクターを大腸菌BL21(DE3)に形質転換後、1mM IPTG、37℃、3時間の条件下でFr.2抗原 の発現誘導を行った。遠心による集菌後、0.2% Triton X-100を含むD-PBS(-)にて懸濁して超音波破砕し、遠心操作により不溶画分を回収した。更にD-PBS(-)にて懸濁して遠心操作により不溶画分を回収し、この操作を2回繰り返すことで洗浄した。洗浄した不溶画分を2M ureaを含むD-PBS(-)にて懸濁して4℃、16時間の条件下でインキュベートし、遠心操作により不溶画分を回収後、更に6M ureaを含むD-PBS(-)で懸濁して4℃、16時間の条件下でインキュベートし、可溶画分を得た。平衡化用緩衝液B2(20mM NaPi, 0.5M NaCl, 6M urea, 5mM 2-mercaptoethanol, pH7.4)で3倍希釈し、平衡化用緩衝液B2で平衡化済みのHisタグ精製用カラム(Ni Sepharose HP, GE Healthcare社)へ結合させ、平衡化用緩衝液B2、洗浄用緩衝液B2(20mM NaPi, 0.5M NaCl, 6M urea, 5mM 2-mercaptoethanol, 200mM ImidazolepH7.4)で順次洗浄後、溶出用緩衝液B2(20mM NaPi, 0.5M NaCl, 6M urea, 5mM 2-mercaptoethanol, 500mM Imidazole, pH7.4)で溶出した。精製後のFr.2抗原はBradford法にてタンパク定量を行った。
１−６．Fr.3抗原の調製
Fr.3抗原発現ベクターを大腸菌BL21(DE3)に形質転換後、1mM IPTG、16℃、16時間の条件下でFr.3抗原の発現誘導を行った。遠心による集菌後、30μM ZnCl2, 0.2% Triton X-100を含むD-PBS(-)にて懸濁して超音波破砕し、遠心操作により可溶画分を回収した。平衡化用緩衝液B5(20mM Tris-HCl, 1M NaCl, 0.1% Triton X-100, 30μM ZnCl2、pH8.0)で2倍希釈し、平衡化用緩衝液にて平衡化済みのHisタグ精製用カラム(TALON superflow, Clontech社)へ結合させ、平衡化用緩衝液5、洗浄用緩衝液B5(10mM Tris-HCl, 1M NaCl, 30μM ZnCl2, 0.1% Triton X-100, 25mM Imidazole, pH8.0)で順次洗浄後、溶出用緩衝液B(10mM Tris-HCl, 0.72M NaCl, 30μM ZnCl2, 0.1% Triton X-100, 200mM Imidazole, pH8.0)で溶出した。精製後のFr.3抗原はBradford法にてタンパク定量を行った。
１−７．抗原固相プレート作製
精製したFr.1抗原、Fr.2抗原又はFr.3抗原をそれぞれD-PBS(-)で10μg/mlの濃度に調整し、96ウェルマイクロタイタープレート(96-Well EIA/RIA Stripwel Plate, CORNING社)へ100μL添加して4℃、16時間インキュベートし、固相した。
洗浄液(0.05% Tween20を含むD-PBS(-))で1回洗浄後、プレートブロッキング液(1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むD-PBS(-))を300μL添加して4℃、16時間インキュベートしてブロッキングした。プレートブロッキング液を除去し、25℃インキュベーターで乾燥し、使用まで4℃で保存した。
１−８．Fr.1抗原を用いたIgG測定ELISA法
洗浄液で1回洗浄した抗原固相プレートに対し、検体希釈液1(20mM NaPi, 0.65M NaCl, 0.05% Tween20, 0.05% ProClin300, 1% BSA, pH8.0)で適宜段階希釈した市販抗体(hWT1 H-290, SANTA CRUZ社)又は希釈した血清100μLを添加し、25℃、1時間振盪反応させた。次に、プレートを洗浄液で3回洗浄後、2次反応液希釈液(0.05% Tween20, 0.05% ProClin300, 0.5% BSAを含むD-PBS(-))で50000倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識Protein G(Acris社)を100μL添加し、25℃、1時間振盪反応させた。最後に、プレートを洗浄液で3回洗浄後、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)100μL添加し、室温で10分間発色させ、1N硫酸100μLを添加して反応を停止させた。マイクロプレートリーダーにて450mn(参照波長650nm)の吸光度を測定した。
１−９．Fr.2抗原を用いたIgG測定ELISA法
検体希釈液1で適宜段階希釈した市販抗体(hWT1 H-290)又は希釈した血清にGST発現大腸菌抽出液を5μg/mlになるように添加して25℃、1時間振盪反応させた。これをFr.2検体液とした。洗浄液で1回洗浄した抗原固相プレートに対し、上記のように調整したFr.2検体液100μLを添加し、25℃、1時間振盪反応させた。次に、プレートを洗浄液で3回洗浄後、2次反応液希釈液で50000倍希釈したHRP標識Protein Gを100μL添加し、25℃、1時間振盪反応させた。最後に、プレートを洗浄液で3回洗浄後、TMB 100μL添加し、室温で10分間発色させ、1N硫酸100μLを添加して反応を停止させた。マイクロプレートリーダーにて450mn(参照波長650nm)の吸光度を測定した。
１−１０．Fr.3抗原を用いたIgG測定ELISA法
洗浄液で1回洗浄した抗原固相プレートに対し、検体希釈液2(20mM NaPi, 0.05% Tween20, 0.05% ProClin300, 1% BSA, pH8.0)で適宜段階希釈した市販抗体(hWT1 H-290)又は希釈した血清100μLを添加し、25℃、1時間振盪反応させた。次に、プレートを洗浄液で3回洗浄後、2次反応液希釈液で50000倍希釈したHRP標識Protein Gを100μL添加し、25℃、1時間振盪反応させた。最後に、プレートを洗浄液で3回洗浄後、TMB 100μL添加し、室温で10分間発色させ、1N硫酸100μLを添加して反応を停止させた。マイクロプレートリーダーにて450mn(参照波長650nm)の吸光度を測定した。
１−１１．各抗原を用いたIgM測定ELISA法
IgM抗体の測定は、IgG抗体の測定に準じて行った。検出はHRP標識抗ヒトIgM特異的抗体を50000倍希釈して反応させた。
２．結果
２−１．全長WT1抗原に対する抗体価
Ojiらの方法により測定した癌患者血清検体の血中抗WT1抗体価を表１及び図１に示した。Ojiらの報告から、全長WT1抗原に対する健常者抗体価の分布は、10−3664 WRUで、中心値は392 WRUである（前記非特許文献７）。今回用いた癌患者血清20例の抗体価の分布は、7−1682 WRUで、全検体が健常者の範囲であった。
Figure 2013039166
２−２．分割WT1抗原に対する癌患者の抗体価
分割WT1抗原を用いたELISA法にて血中抗体価の測定を行った。血中の抗体価は、段階希釈して測定した市販抗体をスタンダードとして濃度に対する吸光度の検量線を作成し、算出した。癌患者の各抗原に対する血中抗体価を前記表1に示した。
各分割WT1抗原に対する抗体価と、全長WT1抗原に対する抗体価を比較した結果を図２に示す。Fr.2抗原及びFr.3抗原に対する抗体価は、全長WT1抗原に対する抗体価と高い相関性を示した。また、Fr.2抗原に対する抗体価とFr.3抗原に対する抗体価の相関性も高い結果であった(図３)。
これらの結果より、全長WT1抗原に対する抗体価は、Fr.3に対する抗体価を反映しており、Fr.3が血中抗体の主要エピトープであることが示唆された。
２−３．分割WT1抗原に対する抗体価の分布
分割WT1抗原に対する健常者54例（N)の抗体価と癌患者20例（C）の抗体価の分布を比較し、図４に示した。Fr.1抗原に対する抗体価は健常者及び癌患者でほとんど同じ分布であったのに対して、Fr.2抗原及びFr.3抗原に対する癌患者の抗体価の分布は、健常者の抗体価の分布と比較した場合、高い結果を示した。特に、Fr.3抗原に対する抗体価の分布が最も広い結果であり、６例の癌患者検体は健常者の５倍以上の抗体価を示した。
以上の結果より、Fr.3抗原は、全長WT1抗原に対する抗体価と比較した場合においても、より明確に高値群を分類できることが示された。
実施例２ 抗原阻害試験
Fr.3抗原に対する抗体価が、全長WT1抗原に対する抗体価に比し高感度に検出される現象を解明するために、Fr.3抗原にFr.1抗原またはFr.2抗原を反応させることで、Fr.3抗原の抗体エピトープがマスクされるか否かを確認した。検体はFr.3に対するポリクローナル抗体（PoAb）とFr.3に対する高い抗体価を有する３例の患者血清（検体No.3、No.7、No.9）を用いた。
１．方法
洗浄液で1回洗浄したFr.3抗原固相プレート又に、2次反応希釈液で希釈したFr.1抗原又はFr.2抗原100μLを添加し、25℃、1時間振盪反応させた。次に、検体希釈液１で希釈した市販抗体(hWT1 C-19, SANTA CRUZ社))又は希釈した血清100μLを添加し、25℃、1時間振盪反応させた。更に、プレートを洗浄液で3回洗浄後、2次反応液希釈液で50000倍希釈したHRP標識Protein Gを100μL添加し、25℃、1時間振盪反応させた。最後に、プレートを洗浄液で3回洗浄後、TMB 100μL添加し、室温で10分間発色させ、1N硫酸100μLを添加して反応を停止させた。マイクロプレートリーダーにて450mn(参照波長650nm)の吸光度を測定し、反応阻害率（B/B0）を、抗原無添加の値を100%として算出した。
２．結果
結果を図５に示した。
Fr.3に対するPoAbの反応性は、Fr.1で25%、Fr.2で50%阻害された。同様に、各血清検体のFr.3に対する抗体価もFr.1もしくはFr.2によって阻害された。検体No.3はFr.1では阻害されないがFr.2で70%阻害され、検体No.9はFr.2では阻害されないがFr.1で40%阻害された。検体N0.7はFr.1で10%、Fr.2で20%と弱いがそれぞれの抗原により反応が阻害された。
以上の結果より、Fr.1及びFr.2は、Fr.3と結合する機能を有しており、さらに結合することによりFr.3に対する抗体エピトープをマスクしていることが示唆される。
実施例３ WT1ワクチン投与脳腫瘍患者における抗体価評価
改変型WT1235ペプチドワクチン｛アミノ酸配列（YTWNQMNL）｝投与患者のFr.1抗原、Fr.2抗原及びFr.3抗原に対するIgG及びIgM抗体価を評価した。患者検体はSD（Stable Disease；安定）群5例、PD（Progression Disease；進行）群4例を用いた。癌組織はMRIに評価した。
WT1 235ペプチド投与患者のIgG抗体価の推移を図６にまとめた。
Fr.1に対するIgG抗体価は全ての患者において殆ど検出されなかった。Fr.3に対する抗体価は、明らかに高値群と低値群に分類でき、投与前後での変動は殆ど確認されなかった。また、全長WT1抗原とほとんど相関を示さなかった。一方、Fr.2に対する抗体価はワクチン投与後に経時的に上昇してくる患者が存在する。本抗体価は全長WT1抗原に対する抗体価と相関が高いことが確認された。
各抗原に対するワクチン投与前のIgG抗体価と治療奏功性について比較した結果を図７にまとめた。
その結果、ＳＤ群では５例中４例がFr.3に対して100 unit以上の抗体価を示し、PD群4例は全て100 unit未満であった。他の抗原に対する抗体価では傾向は確認されなかった。以上の結果は、ワクチン投与前にFr.3に対するIgG抗体価が高値である患者は、ワクチン療法が奏功する患者であることを示すものである。
各抗原に対するワクチン投与後のIgG抗体価と治療奏功性について比較した結果を図８にまとめた。その結果、ＳＤ群では５例中３例がFr.2及び全長WT1抗原に対してワクチン投与前に比し投与後３ヵ月に２倍以上の抗体価の上昇が認められた。しかしながら、ＰＤ群４例においては、ほとんど上昇は認められなかった。以上の結果は、ワクチン投与後にFr.2に対するIgG抗体価が上昇する患者は、ワクチン療法が奏功する患者であることを示すものである。
Fr.2及びFr.3に対するIgM抗体価の評価を、ワクチン投与前の検体を用いて行った。IgM抗体価と治療奏功性について比較した結果を図９にまとめた。その結果、ＳＤ群では５例全部がFr.2に対して200 unit以上の抗体価を示し、PD群4例は全て200 unit未満であった。また、ＳＤ群では５例中3例がFr.3に対して80unit以上の抗体価を示し、PD群4例は全て80 unit未満であった。以上の結果は、ワクチン投与前にFr.2及びFr.3に対するIgM抗体価が高値である患者は、ワクチン療法が奏功する患者であることを示すものである。
実施例４ WT1ワクチン投与大腸癌患者における抗体価評価
各抗原に対する WT1 235ペプチド投与患者のIgG及びIgM抗体価を評価した。患者検体はSD群８例、PD群14例を用いた。Fr.2及びFr.3に対する抗体価の評価をワクチン投与前の検体を用いて行った。結果を図１０にまとめた。
Fr.3に対するIgG及びIgM抗体価は、PD群に比しSD群では明らかに高い傾向が示された。SD群8例中4例が、Fr.3に対するIgG抗体価が140 unit以上であるのに対して、PD群14例は全て140 unit以下であった。また、SD群8例中6例が、Fr.3に対するIgM抗体価が140 unit以上であるのに対して、PD群14例中10例が140 unit以下であった。以上の結果は、ワクチン投与前にFr.3に対するIgM及びIgG抗体価が高値である患者は、ワクチン療法が奏功する患者であることを示すものである。
実施例５ WT1ワクチン治療奏功者の治療前層別化法
各抗原に対するIgM及びIgG抗体価の評価の結果、脳腫瘍患者及び大腸癌患者の両方において、ワクチン投与前の抗体価と治療奏功性が関連していたのはFr.3に対する抗体価であった。そこで、Fr.3に対するワクチン投与前のIgM及びIgG抗体価を脳腫瘍患者と大腸癌患者に分けてまとめた。脳腫瘍患者の結果を図１１に示す。
脳腫瘍患者においては、IgG抗体価100 unit、IgM抗体価100 unitを基準値と規定すると、SD群の全例が、IgMもしくはIgG抗体価のどちらが基準値以上となり、PD群の全例がIgM及びIgG抗体価ともに基準値以下で、層別化が可能となる。すなわち、ワクチン投与前の奏功者選別における感度・特異度は100%である。大腸癌患者の結果を図１２に示す。基準値をIgG抗体価150 unit、IgM抗体価150 unitと規定した場合、SD群8例中7例が、IgMもしくはIgG抗体価のどちらが基準値以上となる。一方、PD群14例中10例がIgM及びIgG抗体価ともに基準値以下で、層別化が可能となる。すなわち、ワクチン投与前の奏功者選別における感度が85%、特異度が71%である。
以上の結果は、ワクチン投与前にFr.3に対するIgM及びIgG抗体価を測定することで、異なる癌種においても治療奏功者の前層別が可能であることを示すものである。

Claims (9)

  1. 配列番号１における第２９４〜４４９番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、当該ポリペプチドの部分ポリペプチド、及びこれらのポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される抗ＷＴ１抗体に対して抗原性を有するポリペプチド、及び／又は配列番号１における第１８１〜３２４番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、当該ポリペプチドの部分ポリペプチド、及びこれらのポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される抗ＷＴ１抗体に対して抗原性を有するポリペプチドを用いることを特徴とする、検体中の抗ＷＴ１抗体の測定方法。
  2. 前記ポリペプチドの少なくとも１種を固相に固定し、該固定したポリペプチドと検体中に存在する抗ＷＴ１抗体との反応産物を検出することにより抗体量を測定する、請求項１記載の測定方法。
  3. 配列番号１における第２９４〜４４９番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、当該ポリペプチドの部分ポリペプチド、及びこれらのポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される抗ＷＴ１抗体に対して抗原性を有するポリペプチド、及び／又は配列番号１における第１８１〜３２４番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、当該ポリペプチドの部分ポリペプチド、及びこれらのポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される抗ＷＴ１抗体に対して抗原性を有するポリペプチドを用いることを特徴とする、ＷＴ１関連疾患の検査方法。
  4. 白血病の予後を判定するものである請求項３に記載の検査方法。
  5. 配列番号１における第２９４〜４４９番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、当該ポリペプチドの部分ポリペプチド、及びこれらのポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される抗ＷＴ１抗体に対して抗原性を有するポリペプチド、及び／又は配列番号１における第１８１〜３２４番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、当該ポリペプチドの部分ポリペプチド、及びこれらのポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される抗ＷＴ１抗体に対して抗原性を有するポリペプチドを用いることを特徴とする、癌のＷＴ１ワクチン療法における奏功者の予測又は治療モニタリング方法。
  6. 癌が脳腫瘍又は大腸癌である請求項５記載の方法。
  7. 配列番号１における第２９４〜４４９番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、当該ポリペプチドの部分ポリペプチド、及びこれらのポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される抗ＷＴ１抗体に対して抗原性を有するポリペプチド、及び／又は配列番号１における第１８１〜３２４番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、当該ポリペプチドの部分ポリペプチド、及びこれらのポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される抗ＷＴ１抗体に対して抗原性を有するポリペプチドを含有する、検体中の抗ＷＴ１抗体の測定試薬。
  8. 配列番号１における第２９４〜４４９番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、当該ポリペプチドの部分ポリペプチド、及びこれらのポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される、抗ＷＴ１抗体に対して抗原性を有するポリペプチド、及び／又は配列番号１における第１８１〜３２４番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、当該ポリペプチドの部分ポリペプチド、及びこれらのポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される抗ＷＴ１抗体に対して抗原性を有するポリペプチドを含有する、ＷＴ１関連疾患の検査用試薬。
  9. 生体内タンパク質に対してエピトープ部分が表面に露出するように改変し、当該改変タンパク質を自己抗体認識抗原として用いることを特徴とする自己抗体の検出方法。
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