JP6634287B2

JP6634287B2 - 免疫療法の臨床効果の予測法

Info

Publication number: JP6634287B2
Application number: JP2015517076A
Authority: JP
Inventors: 治夫杉山; 祐介尾路
Original assignee: International Institute of Cancer Immunology Inc
Current assignee: International Institute of Cancer Immunology Inc
Priority date: 2013-05-13
Filing date: 2014-05-12
Publication date: 2020-01-22
Anticipated expiration: 2034-05-12
Also published as: EP2998740A1; US20160084841A1; US10408840B2; KR20160007579A; EP2998740A4; CN105378479A; EP2998740B1; WO2014185387A1; CA2912514A1; AU2014266396A1; ES2954899T3; CN111781359A; JPWO2014185387A1

Description

本願は、２０１３年５月１３日に出願された日本特許出願２０１３−１０１５６６号の優先権を主張するものであり、その明細書、特許請求の範囲、図面及び要約書の内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。

本発明は、ＷＴ１ペプチド免疫療法における臨床効果の予測法などに関する。

ＷＴ１遺伝子（Ｗｉｌｍｓ’ ｔｕｍｏｒ１ｇｅｎｅ）は、小児の腎癌であるウイルムス腫瘍の責任遺伝子として同定された遺伝子であり（非特許文献１および２）、ジンクフィンガー構造を有する転写因子である。当初、ＷＴ１遺伝子は癌抑制遺伝子であるとされたが、その後の研究（非特許文献３〜６）により、造血器腫瘍や固形癌においてはむしろ癌遺伝子として働くことが示された。

近年、ＷＴ１遺伝子産物あるいはその断片を用いたＷＴ１ペプチド免疫療法が行われている。免疫療法開始後の長期にわたる治療戦略を立案するために、臨床効果の程度を予測することは、臨床的に重要な意義を有している。そのため、精度の高い臨床効果の予測法の確立が望まれている。

特許第３７２８４３９号明細書

ＤａｎｉｅｌＡ．Ｈａｂｅｒｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９９０Ｊｕｎ２９；６１（７）：１２５７−６９．ＣａｌｌＫＭｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９９０Ｆｅｂ９；６０（３）：５０９−２０．ＭｅｎｋｅＡＬｅｔａｌ．，ＩｎｔＲｅｖＣｙｔｏｌ．１９９８；１８１：１５１−２１２．Ｒｅｖｉｅｗ．ＹａｍａｇａｍｉＴｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９６Ａｐｒ１；８７（７）：２８７８−８４．ＩｎｏｕｅＫｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９８Ａｐｒ１５；９１（８）：２９６９−７６．ＴｓｕｂｏｉＡｅｔａｌ．，ＬｅｕｋＲｅｓ．１９９９Ｍａｙ；２３（５）：４９９−５０５．ＦｕｊｉｋｉＦｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００７Ａｐｒ；３０（３）：２８２−９３．

本発明の解決課題は、ＷＴ１ペプチドワクチンを投与される被験者の長期的な臨床効果を、より高精度に予測する方法を提供することである。また、臨床効果をより高精度に予測するためのキットを提供することである。

本発明者らは、被験者に投与されたＷＴ１ペプチドワクチンに対応するＷＴ１抗原ペプチドを用いて、ＷＴ１ペプチドに対するＩｇＧ抗体を測定する系を確立し、本発明を完成させた。特に、ＷＴ１抗原ペプチドに対するＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４抗体価を測定し、その値を指標とする系を確立した。

すなわち、本発明は、以下のものを提供するものである：
（１）以下の工程：
ａ）被験者由来の試料を、ＷＴ１抗原ペプチドまたはその変異体と接触させる工程；および
ｂ）前記試料と前記ＷＴ１抗原ペプチドまたはその変異体との結合を検出し、それにより前記試料中に存在する抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価を測定する工程
を含む、ＷＴ１ペプチド免疫療法における被験者に対する臨床効果を予測するための方法であって、
被験者における抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価が上昇していることが、臨床効果が良好であると判定することを特徴とする、方法；
（２）測定される抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体のサブクラスがＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４であり、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３がそれぞれＩｇＧ４の２倍以上であることが、臨床効果が良好であると判定することを特徴とする、（１）に記載の方法；
（３）ＩｇＧ１がＩｇＧ３の２倍未満であり、かつＩｇＧ３がＩｇＧ１の２倍未満であることが、臨床効果が良好であると判定することを特徴とする、（２）に記載の方法；
（４）ＷＴ１ペプチドワクチン投与から８−１４週後の抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価が測定される、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法；
（５）ＷＴ１ペプチドワクチン投与から１２−１４週後の抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価が測定される、（４）に記載の方法；
（６）被験者に投与されるＷＴ１ペプチドワクチンが配列番号２〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法；
（７）ＷＴ１抗原ペプチドが配列番号７〜７１のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法；
（８）ＷＴ１抗原ペプチドが配列番号２０、２１、２７、３１、３２、４２、４３または５７〜７１のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、（７）に記載の方法；
（９）試料が、血液サンプル、血漿サンプル、血清サンプルまたは尿サンプルである、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法；
（１０）試料が血清サンプルである、（９）に記載の方法；
（１１）被験者がＷＴ１関連疾患患者である、（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法；
（１２）ＷＴ１関連疾患が、慢性骨髄性白血病などの白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、または食道癌、胃癌、大腸癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、胆道癌、頭頸部癌、皮膚癌、肉腫、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、甲状腺癌、カルチノイド、肺芽腫、肝芽腫、脳腫瘍あるいは胸腺癌などの固形癌である、（１１）に記載の方法；
（１３）ＷＴ１関連疾患が、再発悪性神経膠腫、胸腺癌または膵臓癌である、（１２）に記載の方法；および
（１４）ＷＴ１抗原ペプチドまたはその変異体を含む、（１）〜（１３）のいずれかに記載の方法を実施するためのキット。

本発明によれば、ＷＴ１ペプチドワクチンを投与された被験者の長期臨床効果を、従来法に比べて、より高精度に予測する方法を提供することが可能になる。また、臨床効果をより高精度に予測するためのキットを提供することができる。これにより、ＷＴ１ペプチドワクチンの継続投与の是非などを、より適切に判断することができる。

図１は、再発悪性神経膠腫患者について、ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン投与後の抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価の推移を表すグラフである。図２は、再発悪性神経膠腫患者について、ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン投与８−９週後の抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価の上昇と、全生存率の関係を表すグラフである。黒四角は抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価が上昇した群（抗体価上昇群）、白四角は抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価が上昇しなかった群（抗体価非上昇群）を示す。図３は、再発悪性神経膠腫患者について、ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン投与１２−１４週後の抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価の上昇と、全生存率の関係を表すグラフである。黒四角は抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価が上昇した群（抗体価上昇群）、白四角は抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価が上昇しなかった群（抗体価非上昇群）を示す。図４は、再発悪性神経膠腫患者について、ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン投与８−９週後の抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価の上昇と、無増悪生存率の関係を表すグラフである。黒四角は抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価が上昇した群（抗体価上昇群）、白四角は抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価が上昇しなかった群（抗体価非上昇群）を示す。図５は、再発悪性神経膠腫患者について、ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン投与１２−１４週後の抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価の上昇と、無増悪生存率の関係を表すグラフである。黒四角は抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価が上昇した群（抗体価上昇群）、白四角は抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価が上昇しなかった群（抗体価非上昇群）を示す。図６は、再発悪性神経膠腫患者について、ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン投与８−９週後の抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価の上昇と、ＷＴ１ペプチドワクチン投与継続率の関係を表すグラフである。黒四角は抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価が上昇した群（抗体価上昇群）、白四角は抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価が上昇しなかった群（抗体価非上昇群）を示す。図７は、再発悪性神経膠腫患者について、ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン投与１２−１４週後の抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価の上昇と、ＷＴ１ペプチドワクチン投与継続率の関係を表すグラフである。黒四角は抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価が上昇した群（抗体価上昇群）、白四角は抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価が上昇しなかった群（抗体価非上昇群）を示す。図８は、再発悪性神経膠腫患者について、ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン投与１２−１４週後の抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体のタイプと、全生存率の関係を表すグラフである。黒四角はＴｈ１タイプ、白四角は非Ｔｈ１タイプを示す。図９は、再発悪性神経膠腫患者について、ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン投与１２−１４週後の抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体のタイプと、無増悪生存率の関係を表すグラフである。黒四角はＴｈ１タイプ、白四角は非Ｔｈ１タイプを示す。図１０は、再発悪性神経膠腫患者について、ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン投与１２−１４週後の抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価を測定した場合における、Ｔｈ１タイプ／非Ｔｈ１タイプそれぞれのＷＴ１ペプチドワクチン投与継続率を表すグラフである。黒四角はＴｈ１タイプ、白四角は非Ｔｈ１タイプを示す。図１１は、再発悪性神経膠腫患者について、ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン投与１２−１４週後の抗体価を測定した場合における、ＩｇＧ１タイプ／ＩｇＧ３タイプ／ＩｇＧ１＆ＩｇＧ３タイプそれぞれの全生存率を表すグラフである。黒四角はＩｇＧ１タイプ、黒丸はＩｇＧ３タイプ、黒三角はＩｇＧ１＆ＩｇＧ３タイプを示す。図１２は、再発悪性神経膠腫患者について、ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン投与１２−１４週後の抗体価を測定した場合における、ＩｇＧ１タイプ／ＩｇＧ３タイプ／ＩｇＧ１＆ＩｇＧ３タイプそれぞれの無増悪生存率を表すグラフである。黒四角はＩｇＧ１タイプ、黒丸はＩｇＧ３タイプ、黒三角はＩｇＧ１＆ＩｇＧ３タイプを示す。図１３は、再発悪性神経膠腫患者について、ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン投与１２−１４週後の抗体価を測定した場合における、ＩｇＧ１タイプ／ＩｇＧ３タイプ／ＩｇＧ１＆ＩｇＧ３タイプそれぞれのＷＴ１ペプチドワクチン投与継続率を表すグラフである。黒四角はＩｇＧ１タイプ、黒丸はＩｇＧ３タイプ、黒三角はＩｇＧ１＆ＩｇＧ３タイプを示す。図１４は、再発悪性神経膠腫患者について、ＷＴ１_２３５ペプチドワクチンおよびＷＴ１_３３２（ヘルパー）ペプチドワクチン併用投与４−８週後の抗体価を測定した場合における、抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価上昇群／非上昇群それぞれのＷＴ１ペプチドワクチン投与継続率を表すグラフである。黒四角は抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価が上昇した群（抗体価上昇群）、白四角は抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価が上昇しなかった群（抗体価非上昇群）を示す。図１５は、再発悪性神経膠腫患者について、ＷＴ１_２３５ペプチドワクチンおよびＷＴ１_３３２（ヘルパー）ペプチドワクチン併用投与４−８週後の抗体価を測定した場合における、抗ＷＴ１−３２５ペプチドＩｇＧ抗体価上昇群／非上昇群それぞれのＷＴ１ペプチドワクチン投与継続率を表すグラフである。黒四角は抗ＷＴ１−３２５ペプチドＩｇＧ抗体価が上昇した群（抗体価上昇群）、白四角は抗ＷＴ１−３２５ペプチドＩｇＧ抗体価が上昇しなかった群（抗体価非上昇群）を示す。図１６は、再発悪性神経膠腫患者について、ＷＴ１_３３２（ヘルパー）ペプチドワクチン投与１２−１４週後の抗体価を測定した場合における、抗ＷＴ１−３２５ペプチドＩｇＧ抗体価上昇群／非上昇群それぞれのＷＴ１ペプチドワクチン投与継続率を表すグラフである。黒四角は抗ＷＴ１−３２５ペプチドＩｇＧ抗体価が上昇した群（抗体価上昇群）、白四角は抗ＷＴ１−３２５ペプチドＩｇＧ抗体価が上昇しなかった群（抗体価非上昇群）を示す。図１７は、胸腺癌患者について、ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン投与１２−１４週後の抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価の上昇と、ＷＴ１ペプチドワクチン投与継続率の関係を表すグラフである。黒四角は抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価が上昇した群（抗体価上昇群）、白四角は抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価が上昇しなかった群（抗体価非上昇群）を示す。図１８は、ＷＴ１_３３２（ヘルパー）ペプチドワクチンの投与を受けた悪性神経膠腫患者における、変異型ＷＴ１抗原ペプチドを用いた抗ＷＴ１_３３２ペプチドＩｇＧ抗体価の測定結果を表すグラフである。白四角はＷＴ１−ｆｒｇ３、黒丸はＷＴ３２５−３４２、白三角はＷＴ３３２−３４７、黒四角はＷＴ３３４−３４２、白丸はＷＴ３３２−３３８を、それぞれ抗原として用いたＥＬＩＳＡの結果を示す。図１９は、ＷＴ１_２３５ペプチドワクチンの投与を受けた胸腺癌患者における、変異型ＷＴ１抗原ペプチドを用いた抗ＷＴ１_２３５ペプチドＩｇＧ抗体価の測定結果を表すグラフである。白四角はＷＴ１−ｆｒｇ２、黒丸はＷＴ２３５−２５２、白三角はＷＫ２３５−２４３、黒四角はＷＴ２３７−２４３を、それぞれ抗原として用いたＥＬＩＳＡの結果を示す。図２０は、ＷＴ１_１２６ペプチドワクチンと抗癌剤の併用療法を受けた膵臓癌患者における、変異型ＷＴ１抗原ペプチドを用いた抗ＷＴ１_１２６ペプチドＩｇＧ抗体価の測定結果を表すグラフである。白四角はＷＴ１−ｆｒｇ１、黒丸はＷＴ１１８−１３５、黒三角はＷＫ１２６−１３４、黒四角はＷＴ１２６−１３１、白丸はＷＴ１２９−１３４、白三角はＷＴ１２６−１３０を、それぞれ抗原として用いたＥＬＩＳＡの結果を示す。

１つの態様において、本発明は、以下の工程：ａ）被験者由来の試料を、ＷＴ１抗原ペプチドまたはその変異体と接触させる工程；およびｂ）前記試料と前記ＷＴ１抗原ペプチドまたはその変異体との結合を検出し、それにより前記試料中に存在する抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価を測定する工程を含む、ＷＴ１ペプチド免疫療法における被験者に対する臨床効果を予測するための方法であって、被験者における抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価が上昇していることが、臨床効果が良好であると判定することを特徴とする、方法に関する。

さらなる態様において、本発明は、前記ａ）工程およびｂ）工程を含む、ＷＴ１ペプチド免疫療法における被験者に対する臨床効果を予測するための方法であって、測定される抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体のサブクラスがＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４であり、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３がそれぞれＩｇＧ４の２倍以上であることが、臨床効果が良好であると判定することを特徴とする、方法に関する。好ましくは、前記方法は、ＩｇＧ１がＩｇＧ３の２倍未満であり、かつＩｇＧ３がＩｇＧ１の２倍未満であることが、臨床効果が良好であると判定することを特徴とする。

好ましい実施形態において、ＷＴ１ペプチドワクチン投与から８−１４週後の抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価の測定が行われる。より好ましい実施形態において、ＷＴ１ペプチドワクチン投与から１２−１４週後の抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価の測定が行われる。

本発明において、用語「ＷＴ１ペプチドワクチン」とは、ＷＴ１ペプチド免疫療法においてワクチンとして被験者に投与される、ＷＴ１遺伝子産物（配列番号１）由来のペプチドおよびそれらの改変ペプチドをさす。ＷＴ１ペプチドワクチンには、例えば、ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン（配列番号２）、ＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３）ワクチン（配列番号３）（特許文献１）、ＷＴ１_１２６ペプチドワクチン（配列番号４）、ＷＴ１_１８７ペプチドワクチン（配列番号５）などが挙げられる。あるいは、ＷＴ１ペプチドワクチンはＷＴ１_３３２ヘルパーペプチドワクチン（配列番号６）（非特許文献７）であってもよい。ＷＴ１ペプチドワクチンは、特に制限されることなく、ＷＴ１ペプチド免疫療法で用いられるワクチンとして当業者によく知られたもの、または将来使用され得るものを用いることができる。

本発明において、用語「ＷＴ１ペプチドワクチンに対応するＷＴ１抗原ペプチド」および「ＷＴ１抗原ペプチド」は同義的に用いられる。ＷＴ１抗原ペプチドは、被験者に投与されるＷＴ１ペプチドワクチンのアミノ酸配列由来の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むペプチドであり、かかるＷＴ１ペプチドワクチンに対する抗体を検出することができるペプチドである。連続するアミノ酸とは、数個、例えば、５、６、７、８、９個またはそれ以上の連続するアミノ酸である。本発明におけるＷＴ１抗原ペプチドは、上記特徴を有する限り、そのアミノ酸配列および長さは特に限定されないが、例えば５〜２００アミノ酸、５〜１９０アミノ酸、５〜１８５アミノ酸、５〜１８４アミノ酸、５〜１８３アミノ酸、５〜１８２アミノ酸、５〜１８１アミノ酸、５〜１８０アミノ酸、５〜１７０アミノ酸、５〜１６０アミノ酸、５〜１５０アミノ酸、５〜１４０アミノ酸、５〜１３０アミノ酸、５〜１２０アミノ酸、５〜１１０アミノ酸、５〜１００アミノ酸、５〜９０アミノ酸、５〜８０アミノ酸、５〜７０アミノ酸、５〜６０アミノ酸、５〜５０アミノ酸、５〜４０アミノ酸、５〜３０アミノ酸、６〜２７アミノ酸、７〜２４アミノ酸である。「ＷＴ１抗原ペプチド」は、被験者に投与されるＷＴ１ペプチドワクチンのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドであってもよい。あるいは、ＷＴ１抗原ペプチドは、被験者に投与されるＷＴ１ペプチドワクチンのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。すなわち、ＷＴ１抗原ペプチドは、被験者に投与されるＷＴ１ペプチドワクチンのアミノ酸配列からなるペプチドそのものであってもよく、あるいはかかるＷＴ１ペプチドワクチンのアミノ酸配列の全部または一部分を含むペプチドであってもよい。

さらに本発明において、ＷＴ１抗原ペプチドは、被験者に投与されるＷＴ１ペプチドワクチンの変異体も包含する。変異体は、例えば、ＷＴ１ペプチドワクチンのアミノ酸配列において、数個、例えば、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、好ましくは、４個、３個、さらに好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が、置換および／もしくは欠失された、ならびに／または２００個、１９０個、１８０個、１７０個、１６０個、１５０個、１４０個、１３０個、１２０個、１１０個、１００個、９０個、８０個、７０個、６０個、５０個、４０個、３０個、２０個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、好ましくは、４個、３個、さらに好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有するペプチドを含み得る。変異体は、被験者に投与されるＷＴ１ペプチドワクチンのアミノ酸配列に対してローカルアラインメント（ＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔ）を実施した場合に、５０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より一層好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上（例えば、９５、９６、９７、９８または９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質またはペプチドである。アミノ酸配列の相同性は、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング（株）製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（（株）ジェネティクス製）を用いて測定することができる。あるいは、単純に配列を比較し、計算することもできる。変異体の長さは特に限定されないが、例えば５〜２００アミノ酸、５〜１９０アミノ酸、５〜１８５アミノ酸、５〜１８４アミノ酸、５〜１８３アミノ酸、５〜１８２アミノ酸、５〜１８１アミノ酸、５〜１８０アミノ酸、５〜１７０アミノ酸、５〜１６０アミノ酸、５〜１５０アミノ酸、５〜１４０アミノ酸、５〜１３０アミノ酸、５〜１２０アミノ酸、５〜１１０アミノ酸、５〜１００アミノ酸、５〜９０アミノ酸、５〜８０アミノ酸、５〜７０アミノ酸、５〜６０アミノ酸、５〜５０アミノ酸、５〜４０アミノ酸、５〜３０アミノ酸、６〜２７アミノ酸、７〜２４アミノ酸である。本明細書において、かかる変異体は「変異型ＷＴ１抗原ペプチド」とも称される。

また、本発明において、ＷＴ１抗原ペプチドとして、本発明のＷＴ１抗原ペプチドの変異体を用いてもよい。かかる変異体は、例えば、本発明のＷＴ１抗原ペプチドのアミノ酸配列において、数個、例えば、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、好ましくは、４個、３個、さらに好ましくは２個、より好ましくは１個のアミノ酸が、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有するペプチドを含み得る。

好ましい実施形態において、ＷＴ１抗原ペプチドは配列番号７〜７１のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むペプチドであり、例えば、配列番号７〜７１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。より好ましい実施形態において、ＷＴ１抗原ペプチドは、配列番号２０、２１、２７、３１、３２、４２、４３または５７〜７１のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むペプチドであり、例えば、配列番号２０、２１、２７、３１、３２、４２、４３または５７〜７１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。さらに好ましい実施形態において、ＷＴ１抗原ペプチドは配列番号２０、３２、４２、または５７〜７１のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むペプチドであり、例えば、配列番号２０、３２、４２、または５７〜７１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。本発明において、ＷＴ１抗原ペプチドを構成するアミノ酸のいずれかのアミノ酸が適宜修飾されたものであってもよい。アミノ酸残基の修飾は、公知の方法にて実施することができる。

本明細書において、「抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価が上昇した」とは、（１）ＷＴ１ワクチン投与後の抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価が、予め設定された値以上となった場合、あるいは、（２）ＷＴ１ワクチン投与前と比較してＷＴ１ワクチン投与後の抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価が、予め設定された値以上増加した場合をいう。本発明におけるこの値は、測定対象（被験者の数、年齢、性別、体重、状態等）や測定方法、測定条件、統計的手法などの諸条件により変動するものであるため、これらに応じて予め設定する必要がある。かかる値は集積したデータに基づいて経験的に決められる。したがって、本発明の属する技術分野に属する当業者であれば、通常の実験を行うことで、所望の特異性と感度、使用する試料の種類、その調製法等、および、本明細書に記載した他の要因に基づいて、特定の値を選択することができるということを、当然に理解できるだろう。例えば、抗ＷＴ１ペプチドＩｇＧ抗体価が陰性であると考えられる試料を用いて抗ＷＴ１ペプチドＩｇＧ抗体価を測定し、その結果に基づき計算された、平均値＋標準偏差の２倍の値を参照して、このような特定の値を決定することができる。当業者であればまた、上述のＷＴ１抗原ペプチドを用いて行う抗ＷＴ１抗原ペプチド抗体の測定が、前記ＷＴ１抗原ペプチドが対応するＷＴ１ペプチドワクチンに対する抗体の測定を意味するものであることを、当然に理解することができるだろう。

本発明の方法において、試料としては、被験者由来のサンプルであって、一般に抗体が存在することが知られている体液を用いることができる。好ましくは、血液サンプル、血漿サンプル、血清サンプルまたは尿サンプルである。より好ましくは、血清サンプルである。かかる試料は、例えばバッファーなどを用いて、本発明の方法において用いるために適した状態へと調製されてもよい。

本発明の１つの態様において、被験者はＷＴ１関連疾患患者である。好ましい実施形態において、被験者は慢性骨髄性白血病などの白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、または食道癌、胃癌、大腸癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、胆道癌、頭頸部癌、皮膚癌、肉腫、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、甲状腺癌、カルチノイド、肺芽腫、肝芽腫、脳腫瘍あるいは胸腺癌などの固形癌の患者である。より好ましい実施形態において、被験者は、再発悪性神経膠腫（ＧＢＭ）、胸腺癌または膵臓癌の患者である。

本発明の方法における抗体価の測定は、抗体の測定技術において慣用されている様々な方法を用いて実施することができる。かかる方法には免疫学的測定法が挙げられる。具体例として、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などが挙げられる。

ＥＬＩＳＡは、例えば以下のように実施される。まず、測定対象とする抗ＷＴ１抗原ペプチド抗体と特異的に抗原抗体反応し得るＷＴ１抗原ペプチドを固相化する。これに試料を加える。これにより、固相化されたＷＴ１抗原ペプチドと試料中の抗体との間で、抗原抗体反応が起こり、試料中に存在する抗ＷＴ１抗原ペプチド抗体が固相化されたＷＴ１抗原ペプチドに結合する。次に、結合した抗ＷＴ１抗原ペプチド抗体を、抗体検出試薬を用いて検出し、試料中に存在する抗体量を測定する。

あるいは、抗体検出試薬を固相化し、これにより試料中の抗体を補足し、次いでＷＴ１抗原ペプチドを加えて補足された抗体中の抗ＷＴ１抗原ペプチド抗体に結合させ、さらに該抗原に対する特異的抗体の標識体を結合させることにより、試料中に存在する目的の抗ＷＴ１抗原ペプチド抗体を検出、測定することもできる。

これらの測定手法における手段の選択、改変などは、いずれも当業者によく知られている。本発明において、上記に挙げられた方法に制限されることなく、様々な手法を採用し得る（「臨床検査法提要」（改訂第３３版）、金原出版、２０１０年など参照）。

抗ＷＴ１抗原ペプチド抗体を検出するための抗体検出試薬は、特に制限されることなく、一般に使用されている様々な試薬を用いることができる。例えば、測定対象とするヒトＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３および／またはＩｇＧ４などに特異的に結合する抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＧ１抗体、抗ヒトＩｇＧ３抗体および／または抗ヒトＩｇＧ４抗体からなる調製物を用いることができる。これらは市販品として入手でき、また調製することもできる。このような抗体検出試薬の調製法は、当業者によく知られている。好ましい実施形態において、本発明で用いられる抗体検出試薬は、標識された二次抗体である。より好ましい実施形態では、本発明で用いられる抗体検出試薬は、標識された二次抗体と、該二次抗体を検出する標識された三次抗体との組み合わせである。

本発明の方法において、ＷＴ１抗原ペプチドまたはその変異体は、固相法や液相法などに従って化学的に合成してもよい。固相法の場合、ペプチドは、Ｎ末端保護アミノ酸の活性化、カップリング、洗浄、脱保護基、活性化の操作を、所望のペプチドが完成するまで繰り返し、固相上で合成される。該産物は、固相から脱離され、ＨＰＬＣ等を用いて精製される。次いで、配列検定および生物学的試験のようなさらなる研究に移される。

あるいは、ＷＴ１抗原ペプチドまたはその変異体は、無細胞翻訳系により合成してもよい。また、ＷＴ１抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列に基づき、遺伝子工学的に製造してもよい。また、これらの方法を組み合わせて得てもよい。遺伝子工学的手法によるＷＴ１抗原ペプチドの製造は、一般的な遺伝子組換え技術に従うことができる。より詳細には、所望の、ＷＴ１抗原ペプチドをコードする遺伝子が宿主細胞中で発現できるような組換えＤＮＡ分子を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養することにより、形質転換体の細胞内または細胞外に所望のＷＴ１抗原を発現産物として生産させることができる。

ここで採用され得る各操作、例えば遺伝子断片の化学合成、切断、削除、付加および結合を目的とする酵素処理、単離、精製、選択など、組換えＤＮＡの宿主細胞への導入および形質転換細胞の培養などは、いずれも当業者によく知られている（例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ｂｙＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）など参照）。

また所望により、ＷＴ１抗原ペプチドまたはその変異体は、その物理的・化学的性質などを利用した各種分離操作に従って、上記発現産物などから分離、精製することもできる。

本発明の方法において、試料中の抗ＷＴ１抗原ペプチド抗体量の測定は、さらに、公知の手法、手段、それらで使用される測定試薬などを好適に利用することができる。

例えば、上記測定法において、固相法を採用する場合、測定系の抗原または抗体は、当業者によく知られた方法に従って固相に固定化される。該固相には、通常使用される不溶性、不活性の担体が広く利用され得る。これには、例えばガラス、セルロース粉末、セファデックス、セファロース、ポリスチレン、濾紙、カルボキシメチルセルロース、イオン交換樹脂、デキストラン、プラスチックフィルム、プラスチックチューブ、ナイロン、ガラスビーズ、絹、ポリアミン−メチルビニルエーテル−マレイン酸共重合体、アミノ酸共重合体、エチレン−マレイン酸共重合体などの種々の素材からなるスティック、ビーズ、マイクロプレート、試験管などが包含される。

抗原あるいは抗体の固定化方法も、特に制限されることなく、物理的結合および化学的結合のいずれも利用できる。代表的には、例えば共有結合法としてジアゾ法、ペプチド法（酸アミド誘導体法、カルボキシルクロライド樹脂法、カルボジイミド樹脂法、無水マレイン酸誘導体法、イソシアナート誘導体法、臭化シアン活性化多糖体法、セルロースカルボナート誘導体法、縮合試薬を使用する方法など）、アルキル化法、架橋試薬による担体結合法（架橋試薬としてグルタルアルデヒド、ヘキサメチレンイソシアナートなどを用いる）、Ｕｇｉ反応による担体結合法などの化学的反応を利用する方法：イオン交換樹脂のような担体を用いるイオン結合法：ガラスビーズなどの多孔性ガラスを担体として用いる物理的吸着法などが挙げられる。

各測定系における標識剤も、特に制限されることなく、当業者によく知られたもの、または将来使用され得るもののいずれを用いることができる。具体例としては、免疫測定法において慣用の各種放射性同位元素類、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）などの酵素類、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）などの蛍光物質類、その他、１Ｎ−（２，２，６，６−テトラメチル−１−オキシル−４−ピペリジル）−５Ｎ−（アスパルテート）−２，４−ジニトロベンゼン（ＴＯＰＡ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、マイクロペルオキシダーゼ、キモトリプシノーゲン、プロカルボキシペプチダーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、アミラーゼ、ホスホリラーゼ、Ｄ−ナーゼ、Ｐ−ナーゼなどを用いてもよい。これらの標識物質による標識方法は、公知の方法に従って実施できる。

また、酵素活性の測定も、使用する酵素の種類に応じて公知の方法に従って実施することができる。例えば標識酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合は、基質としてＡＢＴＳＪ（２，２’−アジノ−ビ（３’−エチルベンツチアゾリンスルホン酸））を用いて、アルカリホスファターゼを用いる場合は、基質としてｐ−ニトロフェニルホスフェートを用いて、各基質の分解を分光光度計などを用いて測定する方法などによることができる。

上記酵素標識の代わりに、放射性同位元素、蛍光物質などを標識体として用いる場合も、当該標識体の測定は、当業者によく知られた方法に従って実施することができる。

上記測定系において使用される溶媒としては、反応に悪影響を与えないものであれば一般的に使用されるものを用いることができる。具体的にはクエン酸バッファー、リン酸バッファー、トリスバッファー、酢酸バッファーなどのｐＨ約５−９程度のバッファーが好適に利用され得る。

免疫反応（結合）条件も、特に制限されることなく、一般にこの種の測定法で用いられる通常の条件が採用され得る。一般には４５℃以下、好ましくは約４−４０℃の温度条件下で約１−４０時間程度反応させる。

本発明の方法は、上記のようにして測定された、試料における抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価を、ＷＴ１ペプチド免疫療法における臨床効果を予測するための臨床指標とすることを最大の特徴とする。

特に、本発明者らは、ＷＴ１ペプチド免疫療法を受けている被験者では、投与されたＷＴ１ペプチドに対して抗ＷＴ１ペプチドＩｇＧ抗体が産生され、ある時点での抗ＷＴ１ペプチドＩｇＧ抗体価と臨床効果に相関関係があることを見出した。すなわち、投与されたＷＴ１ペプチドに対応するＷＴ１抗原ペプチドまたはその変異体を用いて測定された抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価が、ＷＴ１ペプチド免疫療法における臨床効果の予測に有効な指標となることを見出した。また、本発明者らは、産生された抗ＷＴ１ペプチドＩｇＧ抗体のサブクラスを解析し、非Ｔｈ１タイプよりもＴｈ１タイプの方が、ＷＴ１ペプチド免疫療法における臨床効果が良好であることを見出した。さらに、本発明者らは、Ｔｈ１タイプをさらに詳細に解析し、ＩｇＧ１タイプおよびＩｇＧ３タイプよりもＩｇＧ１＆ＩｇＧ３タイプの方が、ＷＴ１ペプチド免疫療法における臨床効果が良好であることを見出した。

用語「Ｔｈ１タイプ」とは、Ｔｈ１タイプサブクラスであるＩｇＧ１抗体もしくはＩｇＧ３抗体が、Ｔｈ２タイプサブクラスであるＩｇＧ４抗体の２倍以上であるものをさす。すなわち、「Ｔｈ１タイプ」とは、下記式（Ｉ）または式（ＩＩ）を満たす場合をいう。
（Ｉ）抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ１抗体価／抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ４抗体価≧２．０
（ＩＩ）抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ３抗体価／抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ４抗体価≧２．０

用語「非Ｔｈ１タイプ」とは、上記式（Ｉ）および式（ＩＩ）のいずれも満たさない場合をいう。

用語「ＩｇＧ１タイプ」とは、Ｔｈ１タイプのうち、ＩｇＧ１抗体がＩｇＧ３抗体の２倍以上のものをさす。すなわち、Ｔｈ１タイプのうち、下記式（ＩＩＩ）を満たす場合をいう。
（ＩＩＩ）抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ１抗体価／抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ３抗体価≧２．０

用語「ＩｇＧ３タイプ」とは、Ｔｈ１タイプのうち、ＩｇＧ３抗体がＩｇＧ１抗体の２倍以上のものをさす。すなわち、Ｔｈ１タイプのうち、下記式（ＩＶ）を満たす場合をいう。
（ＩＶ）抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ３抗体価／抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ１抗体価≧２．０

用語「ＩｇＧ１＆ＩｇＧ３タイプ」とは、Ｔｈ１タイプのうち、上記式（ＩＩＩ）および式（ＩＶ）のいずれも満たさない場合をいう。

さらなる態様において、本発明は、ＷＴ１抗原ペプチドを含む、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。かかるキットは、ＷＴ１抗原ペプチドを有効成分として含み、該ＷＴ１抗原ペプチドは測定対象である抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体と抗原抗体反応するものである。また、かかるキットは、本発明の方法における測定系に利用される抗体検出試薬などの任意の試薬を含んでもよい。さらに、測定の実施を簡便にするための適当な試薬、例えば抗体希釈液、反応希釈液、バッファー、洗浄剤、標識体検出試薬などを含んでもよい。またさらに、本発明の方法の実行に必要な説明書などの資材を含んでもよい。前記キットは、好ましくは免疫学的測定法に基づきＩｇＧ抗体価を測定するものである。より好ましくは、前記キットはＥＬＩＳＡに基づきＩｇＧ抗体価を測定するものである。このようなキットのために、上述されるＷＴ１抗原ペプチドの変異体を用いてもよい。また、ＷＴ１抗原ペプチドあるいはその変異体を構成するアミノ酸のいずれかのアミノ酸が適宜修飾されたものであってもよい。アミノ酸残基の修飾は、公知の方法にて実施することができる。

以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。

ＷＴ１抗原ペプチドの合成
表１−１および表１−２に示されるＷＴ１抗原ペプチドを、株式会社ピーエイチジャパンにて合成した。表１−１および表１−２において、開始部位および終了部位とは、野生型ヒトＷＴ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）における対応するアミノ酸残基の位置を示す。

再発悪性神経膠腫（ＧＢＭ）患者におけるＷＴ１ペプチドワクチン投与後の抗ＷＴ１抗原ペプチド抗体価と臨床効果
本発明者らは、ＧＢＭ患者について、ＷＴ１ペプチドワクチン投与後の抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価と臨床効果の関係を確認するために、以下の検討を行った。

１．材料および方法
１−１ＧＢＭ患者７２名を対象に、ＷＴ１_２３５ペプチド（ＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３）（配列番号３））をＷＴ１ペプチドワクチンとして、ＷＴ１ペプチド免疫療法を実施した。３ｍｇのＷＴ１_２３５ペプチド（ＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３）を不完全アジュバントであるモンタナイドＩＳＡ５１と重量比１：１で混合し、エマルジョンを調製した。このエマルジョンを１週間ごとに１回、皮内投与によって、１２週間投与した。ワクチン投与前および投与後の所定の時期に患者より採血し、遠心分離により血清を得た。得られた血清は−８０℃以下で凍結保存し、測定時に融解して用いた。なお、効果が見られた場合には、１２週間を超えて、２〜４週ごとにＷＴ１ペプチドワクチンの投与を継続した。

１−２抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体（抗ＷＴ１_２３５ペプチドＩｇＧ抗体）の測定（ＥＬＩＳＡ）
底面にアミノ基が表出したペプチドコーティングキット（ＴａＫａＲａ）付属９６ウェルリアクションプレートに、ペプチドコーティングキット付属リアクションバッファーに溶解したＷＴ１−２３５ペプチド溶液（４μｇ／ｍＬ）を１ウェルあたり５０μＬ添加した。カップリング試薬を１ウェルあたり３０μＬ添加し、室温で２時間反応させた。蒸留水で洗浄し、抗原を固相化した。ブロッキングワン（ナカライテスク）を用いて、室温で２時間振盪させることにより、ブロッキングを行った。次いで、０．０５％ＴＢＳＴ（４０ｍＭトリス、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ８．０）で洗浄した。その後、ペプチドコーティングキット付属ブロッキング液で１００倍希釈した血清を、１ウェルあたり１００μＬ入れた。４℃で一晩反応させた。０．０５％ＴＢＳＴで洗浄した後、二次抗体と室温で２時間反応させた。二次抗体として、ペプチドコーティングキット付属ブロッキング液で１０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ｓｃ−２７６９、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４００μｇ／ｍＬ）を用いた。次いで、０．０５％ＴＢＳＴで洗浄した。その後、三次抗体と室温で２時間反応させた。三次抗体として、０．０５％ＴＢＳＴで１０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ｓｃ−２００４、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４００μｇ／ｍＬ）を用いた。０．０５％ＴＢＳＴで洗浄した後、ＴＭＢキット（ＫＰＬ）を用いて発色させた。１ＮＨＣｌで反応を停止後、マイクロプレートリーダー（ＣＯＲＯＮＡＥＬＥＣＴＲＩＣＭＴＰ−３１０Ｌａｂ）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。

さらに、本発明者らは、抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体レベルの上昇により検出されるＷＴ１特異的免疫応答の誘導が、Ｔｈ１タイプであるのか非Ｔｈ１タイプであるのかを確認するため、以下の方法によって、抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体のＩｇＧサブクラスを解析した。

１−３ＷＴ１−２３５ペプチドに対するＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の測定（ＥＬＩＳＡ）
上記１−２と同様の方法でＥＬＩＳＡを行った。二次抗体として、それぞれ、ペルオキシダーゼ標識マウス抗ヒトＩｇＧ１（＃９０５２−０５ｍｏｕｓｅｍＡｂｃｌｏｎｅ４Ｅ３、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）、ペルオキシダーゼ標識マウス抗ヒトＩｇＧ３（＃９２１０−０５ｍｏｕｓｅｍＡｂｃｌｏｎｅＨＰ６０５０、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）またはペルオキシダーゼ標識マウス抗ヒトＩｇＧ４抗体（＃９１９０−０５ｍｏｕｓｅｍＡｂｃｌｏｎｅＨＰ６０２３、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を用いた。ペルオキシダーゼ標識マウス抗ヒトＩｇＧ１およびペルオキシダーゼ標識マウス抗ヒトＩｇＧ４はペプチドコーティングキット付属ブロッキング液で２０００倍希釈して、ペルオキシダーゼ標識マウス抗ヒトＩｇＧ３はペプチドコーティングキット付属ブロッキング液で１０００倍希釈して用いた。また、三次抗体として、０．０５％ＴＢＳＴで２５００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｗ４０２８、１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。

２．統計学的解析
二群間の比較はマン・ホイットニ検定を用いて行った。レスポンダー群、ノンレスポンダー群における抗ＷＴ１抗原ペプチド抗体上昇率の違いについて、２方向の要因の関連性の検定をフィッシャーの直接確率計算法を用いて行った。また、ＷＴ１ペプチドワクチン継続率、無増悪生存率および全生存率の比較を、ログランク検定を用いて行った。なお、抗ＷＴ１抗原ペプチド抗体が陰性である血清（ＷＴ１ペプチド免疫療法開始前の患者血清）を用いて抗ＷＴ１抗原ペプチド抗体価を測定したところ、平均値＋標準偏差の２倍＝０．０４５であった。これより、（１）ＷＴ１ワクチン投与後の抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価が０．０５以上となった場合、あるいは、（２）ＷＴ１ワクチン投与前と比較してＷＴ１ワクチン投与後の抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価が０．０５以上増加した場合を、「抗ＷＴ１抗原ペプチド抗体価が上昇した」と定義した。

３．結果
（Ｉ）抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価（抗ＷＴ１_２３５ペプチドＩｇＧ抗体価）の上昇と臨床効果
（ｉ）抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価の推移（図１）
ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン（ＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３））投与後の抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価を表すグラフを図１に示す。ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン（ＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３））投与前と比較して、投与後の日数の経過（治療の経過）に伴い、抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価が上昇した。投与２ヶ月後および３ヶ月後では、投与前に比べ、抗体価が有意に上昇した。

（ｉｉ）抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価の上昇と全生存率（図２および図３）
ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン（ＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３））投与後の抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価の上昇と、全生存率の関係を表すグラフを図２および図３に示す。観察期間中、投与８−９週後の抗体価を指標とした場合（図２）および１２−１４週後の抗体価を指標とした場合（図３）のいずれも、抗体価上昇群が抗体価非上昇群に比べ、有意に高い全生存率を示した。また、投与８−９週後よりも投与１２−１４週後の抗体価を指標とした場合の方が、抗体価上昇群と抗体価非上昇群との間の差がより明確であった。

（ｉｉｉ）抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価の上昇と無増悪生存率（図４および図５）
ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン（ＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３））投与後の抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価の上昇と、無増悪生存率の関係を表すグラフを図４および図５に示す。観察期間中、投与８−９週後の抗体価を指標とした場合では、抗体価上昇群が抗体価非上昇群に比べ、より高い無増悪生存率を示す傾向が見られた（図４）。投与１２−１４週後の抗体価を指標とした場合では、抗体価上昇群が抗体価非上昇群に比べ、有意に高い無増悪生存率を示した（図５）。

（ｉｖ）抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価の上昇とＷＴ１ペプチドワクチン投与継続率（図６および図７）
ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン（ＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３））投与後の抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価の上昇と、ＷＴ１ペプチドワクチン投与継続率の関係を表すグラフを図６および図７に示す。観察期間中、投与８−９週後の抗体価を指標とした場合では、抗体価上昇群が抗体価非上昇群に比べ、より高いワクチン投与継続率を示す傾向が見られた（図６）。投与１２−１４週後の抗体価を指標とした場合では、抗体価上昇群が抗体価非上昇群に比べ、有意に高いワクチン投与継続率を示した（図７）。

（ＩＩ）抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体（抗ＷＴ１_２３５ペプチドＩｇＧ抗体）のタイプ（Ｔｈ１タイプ／非Ｔｈ１タイプ）と臨床効果
（ｉ）Ｔｈ１タイプ／非Ｔｈ１タイプと全生存率（図８）
ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン（ＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３））投与１２−１４週後の抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価を指標とした場合における、Ｔｈ１タイプ／非Ｔｈ１タイプそれぞれの全生存率を図８に示す。観察期間中、Ｔｈ１タイプが非Ｔｈ１タイプに比べ、より高い全生存率を示す傾向が見られた。

（ｉｉ）Ｔｈ１タイプ／非Ｔｈ１タイプと無増悪生存率（図９）
ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン（ＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３））投与１２−１４週後の抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価を指標とした場合における、Ｔｈ１タイプ／非Ｔｈ１タイプそれぞれの無増悪生存率を図９に示す。観察期間中、Ｔｈ１タイプが非Ｔｈ１タイプに比べ、より高い無増悪生存率を示す傾向が見られた。

（ｉｉｉ）Ｔｈ１タイプ／非Ｔｈ１タイプとＷＴ１ペプチドワクチン投与継続率（図１０）
ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン（ＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３））投与１２−１４週後の抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価を指標とした場合における、Ｔｈ１タイプ／非Ｔｈ１タイプそれぞれのＷＴ１ペプチドワクチン投与継続率を図１０に示す。観察期間中、Ｔｈ１タイプが非Ｔｈ１タイプに比べ、有意に高いワクチン投与継続率を示した（図１０）。

（ＩＩＩ）ＩｇＧサブクラスの解析
（ｉ）抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧサブクラス抗体価の上昇と全生存率（図１１）
ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン（ＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３））投与１２−１４週後の抗体価を指標とした場合における、ＩｇＧ１タイプ／ＩｇＧ３タイプ／ＩｇＧ１＆ＩｇＧ３タイプそれぞれの全生存率を図１１に示す。観察期間中、ＩｇＧ１＆ＩｇＧ３タイプが、有意に高い全生存率を示した。

（ｉｉ）抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧサブクラス抗体価の上昇と無増悪生存率（図１２）
ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン（ＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３））投与１２−１４週後の抗体価を指標とした場合における、ＩｇＧ１タイプ／ＩｇＧ３タイプ／ＩｇＧ１＆ＩｇＧ３タイプそれぞれの無増悪生存率を図１２に示す。観察期間中、ＩｇＧ１＆ＩｇＧ３タイプが、より高い無増悪生存率を示す傾向が見られた。

（ｉｉｉ）抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧサブクラス抗体価の上昇とＷＴ１ペプチドワクチン投与継続率（図１３）
ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン（ＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３））投与１２−１４週後の抗体価を指標とした場合における、ＩｇＧ１タイプ／ＩｇＧ３タイプ／ＩｇＧ１＆ＩｇＧ３タイプそれぞれのＷＴ１ペプチドワクチン投与継続率を図１３に示す。観察期間中、ＩｇＧ１＆ＩｇＧ３タイプが、有意に高いＷＴ１ペプチドワクチン投与継続率を示した。

再発悪性神経膠腫（ＧＢＭ）患者におけるＷＴ１ペプチドワクチンおよびＷＴ１ヘルパーペプチドワクチン併用投与後の抗ＷＴ１抗原ペプチド抗体価と臨床効果
本発明者らは、ＧＢＭ患者について、ＷＴ１ペプチドワクチンおよびヘルパーペプチドワクチン併用投与後の抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価と臨床効果の関係を確認するために、以下の検討を行った。

１．材料および方法
１−１ＧＢＭ患者１５名を対象に、ＷＴ１ペプチドワクチンとしてＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３）（配列番号３）を、ヘルパーペプチドワクチンとしてＷＴ１_３３２ペプチド（配列番号６）を用い、ＷＴ１ペプチド免疫療法を実施した。ＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３）は３ｍｇ／ｂｏｄｙで、１週間ごとに１回、皮内投与によって、計５回投与した。ＷＴ１_３３２ヘルパーペプチドは、０．７５ｍｇ（ｎ＝７）、１．５ｍｇ（ｎ＝４）または３ｍｇ（ｎ＝４）で、用量増加（ｄｏｓｅｅｓｃａｌａｔｉｏｎ）を行い、２週間ごとに１回、皮内投与によって、計３回投与した。なお、ＷＴ１ヘルパーペプチドワクチンの投与は、ＷＴ１−ＣＴＬペプチドと混合して投与された。ワクチン投与前および投与後の所定の時期に患者より採血し、遠心分離により血清を得た。得られた血清は−８０℃以下で凍結保存し、測定時に融解して用いた。なお、効果が見られた場合には、その後、２〜４週間ごとに、ＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３）の単独投与、ならびにＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３）およびＷＴ１_３３２ヘルパーペプチドの併用投与を交互に繰り返した。

１−２抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体（抗ＷＴ１_２３５ペプチドＩｇＧ抗体）および抗ＷＴ１−３２５ペプチドＩｇＧ抗体（抗ＷＴ１_３３２ペプチドＩｇＧ抗体）の測定（ＥＬＩＳＡ）
実施例２と同様の方法で抗体価を測定した。抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体を測定する際には、ＷＴ１抗原ペプチドとしてＷＴ１−２３５ペプチドを、抗ＷＴ１−３２５ペプチドＩｇＧ抗体を測定する際には、ＷＴ１抗原ペプチドとしてＷＴ１−３２５ペプチドを、それぞれ用いた。ＷＴ１-３２５ペプチドは、投与したＷＴ１_３３２ペプチドの一部分（１〜１１番目のアミノ酸）を含むペプチドである。従って、抗ＷＴ１−３２５ペプチドＩｇＧ抗体の測定は、投与したＷＴ１_３３２ペプチドに対する抗体（抗ＷＴ１_３３２ペプチドＩｇＧ抗体）の測定を意味する。

２．統計学的解析
実施例２と同様の方法で統計学的解析を行った。なお、臨床試験脱落症例数（０．７５ｍｇ投与群のうち３例、および３ｍｇ投与群のうち１例）を除く１１例についての解析を行った。また、実施例２と同様に、（１）ＷＴ１ワクチン投与後の抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価が０．０５以上となった場合、あるいは、（２）ＷＴ１ワクチン投与前と比較してＷＴ１ワクチン投与後の抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価が０．０５以上増加した場合を、「抗ＷＴ１抗原ペプチド抗体価が上昇した」と定義した。

３．結果
（Ｉ）抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価（抗ＷＴ１_２３５ペプチドＩｇＧ抗体価）の上昇と臨床効果
（ｉ）抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価の上昇とＷＴ１ペプチドワクチン投与継続率（図１４）
ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン（ＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３））およびＷＴ１_３３２（ヘルパー）ペプチドワクチン併用投与４−８週後の抗体価を指標とした場合における、抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価上昇群／非上昇群それぞれのＷＴ１ペプチドワクチン投与継続率を図１４に示す。観察期間中、抗体価上昇群が非上昇群に比べ、より高いＷＴ１ペプチドワクチン投与継続率を示す傾向が見られた。

（ＩＩ）抗ＷＴ１−３２５ペプチドＩｇＧ抗体価（抗ＷＴ１_３３２ペプチドＩｇＧ抗体価）の上昇と臨床効果
（ｉ）抗ＷＴ１−３２５ペプチドＩｇＧ抗体価の上昇とＷＴ１ペプチドワクチン投与継続率（図１５）
ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン（ＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３））およびＷＴ１_３３２（ヘルパー）ペプチドワクチン併用投与４−８週後の抗体価を指標とした場合における、抗ＷＴ１−３２５ペプチドＩｇＧ抗体価上昇群／非上昇群それぞれのＷＴ１ペプチドワクチン投与継続率を図１５に示す。観察期間中、上昇群が非上昇群に比べ、より高いＷＴ１ペプチドワクチン投与継続率を示す傾向が見られた。

再発悪性神経膠腫（ＧＢＭ）患者におけるＷＴ１ヘルパーペプチドワクチン投与後の抗ＷＴ１抗原ペプチド抗体価と臨床効果
本発明者らはさらに、ＧＢＭ患者について、ＷＴ１ヘルパーペプチドワクチン投与後の抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価と臨床効果の関係を確認するために、以下の検討を行った。

１．材料および方法
１−１ＧＢＭ患者１４名を対象に、ＷＴ１ヘルパーペプチドワクチンとしてＷＴ１_３３２ペプチドを用い、ＷＴ１ペプチド免疫療法を実施した。０．７５ｍｇ（ｎ＝４）、１．５ｍｇ（ｎ＝４）、３ｍｇ（ｎ＝６）のいずれかのＷＴ１_３３２ペプチドを不完全アジュバントであるモンタナイドＩＳＡ５１と重量比１：１で混合し、エマルジョンを調製した。このエマルジョンを２週間ごとに１回、皮内投与によって、計３回投与した。ワクチン投与前および投与後の所定の時期に患者より採血し、遠心分離により血清を得た。得られた血清は−８０℃以下で凍結保存し、測定時に融解して用いた。なお、効果が見られた場合には、その後、２〜４週間ごとにＷＴ１_３３２ヘルパーペプチドの投与を継続した。

１−２抗ＷＴ１−３２５ペプチドＩｇＧ抗体（抗ＷＴ１_３３２ペプチドＩｇＧ抗体）の測定（ＥＬＩＳＡ）
実施例２と同様の方法で抗体価を測定した。ＷＴ１抗原ペプチドとしてＷＴ１−３２５ペプチドを用いた。ＷＴ１-３２５ペプチドは、投与したＷＴ１_３３２ペプチドの一部分（１〜１１番目のアミノ酸）を含むペプチドである。従って、抗ＷＴ１−３２５ペプチドＩｇＧ抗体の測定は、投与したＷＴ１_３３２ペプチドに対する抗体（抗ＷＴ１_３３２ペプチドＩｇＧ抗体）の測定を意味する。

２．統計学的解析
実施例２と同様の方法で統計学的解析を行った。なお、臨床試験脱落症例数（１．５ｍｇ投与群のうち２例、および３ｍｇ投与群のうち４例）を除く８例についての解析を行った。また、実施例２と同様に、（１）ＷＴ１ワクチン投与後の抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価が０．０５以上となった場合、あるいは、（２）ＷＴ１ワクチン投与前と比較してＷＴ１ワクチン投与後の抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価が０．０５以上増加した場合を、「抗ＷＴ１抗原ペプチド抗体価が上昇した」と定義した。

３．結果
（Ｉ）抗ＷＴ１−３２５ペプチドＩｇＧ抗体価（抗ＷＴ１_３３２ペプチドＩｇＧ抗体価）の上昇と臨床効果
（ｉ）抗ＷＴ１−３２５ペプチドＩｇＧ抗体価の上昇とＷＴ１ペプチドワクチン投与継続率（図１６）
ＷＴ１_３３２（ヘルパー）ペプチドワクチン投与１２−１４週後の抗体価を指標とした場合における、抗ＷＴ１−３２５ペプチドＩｇＧ抗体価上昇群／非上昇群それぞれのＷＴ１ペプチドワクチン投与継続率を図１６に示す。観察期間中、上昇群が非上昇群に比べ、より高いＷＴ１ペプチドワクチン投与継続率を示す傾向が見られた。

胸腺癌患者におけるＷＴ１ペプチドワクチン投与後の抗ＷＴ１抗原ペプチド抗体価と臨床効果
本発明者らは胸腺癌患者について、同様に、ＷＴ１ペプチドワクチン投与後の抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価と臨床効果の関係を確認するため、以下の検討を行った。

１．材料および方法
１−１胸腺癌患者１０名を対象に、実施例２と同様に、ＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３）（配列番号３）をＷＴ１ペプチドワクチンとして、ＷＴ１ペプチド免疫療法を実施した。ワクチン投与前および投与後の所定の時期に患者より採血し、遠心分離により血清を得た。実施例２と同様の方法（ＥＬＩＳＡ）で、得られた血清中に含まれる抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価を測定した。

２．統計学的解析
実施例２と同様の方法で統計学的解析を行った。なお、実施例２と同様に、（１）ＷＴ１ワクチン投与後の抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価が０．０５以上となった場合、あるいは、（２）ＷＴ１ワクチン投与前と比較してＷＴ１ワクチン投与後の抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価が０．０５以上増加した場合を、「抗ＷＴ１抗原ペプチド抗体価が上昇した」と定義した。

３．結果
（Ｉ）抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価（抗ＷＴ１_２３５ペプチドＩｇＧ抗体価）の上昇と臨床効果
（ｉ）抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価の上昇とＷＴ１ペプチドワクチン投与継続率（図１７）
ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン（ＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３））投与１２−１４週後の抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価を指標とした場合における、抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価上昇群／非上昇群それぞれのＷＴ１ペプチドワクチン投与継続率を図１７に示す。観察期間中、抗体価上昇群が抗体価非上昇群に比べ、より高いワクチン投与継続率を示す傾向が見られた（図１７）。

考察
ＷＴ１_２３５ペプチド（ＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３））を用いたＷＴ１ペプチド免疫療法において、ＷＴ１_２３５ペプチドワクチンの投与後に抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体価の上昇が見られた群が、良好な臨床効果を示すことがわかった。またこれは、ワクチン投与から８−９週後の抗体価およびワクチン投与から１２−１４週後の抗体価のいずれにも当てはまることであった。その中でも、ワクチン投与から１２−１４週後の抗体価に基づく場合、臨床効果との相関性がより高いことがわかった。

さらに、抗ＷＴ１−２３５ペプチドＩｇＧ抗体のうち、ＩｇＧ４よりもＩｇＧ１またはＩｇＧ３が上昇する群（Ｔｈ１タイプ）が、良好な臨床効果を示すことがわかった。その中でもさらに、ＩｇＧ１＆ＩｇＧ３タイプがより良好な臨床効果を示すことがわかった。

また、ＷＴ１_３３２ヘルパーペプチドをＷＴ１_２３５ペプチド（ＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３））ワクチンと併用投与した場合、あるいはＷＴ１_３３２ヘルパーペプチドを単独投与した場合でも、同様の結果が得られることがわかった。

変異型ＷＴ１抗原ペプチドを用いた抗ＷＴ１ _３３２ペプチドＩｇＧ抗体の測定（図１８）
本発明者らは、変異型ＷＴ１抗原ペプチドを用いても抗ＷＴ１_３３２ペプチドＩｇＧ抗体の測定が可能であるかを確認するため、以下の検討を行った。

１．材料および方法
１−１血清
ＷＴ１_３３２ペプチドワクチン（配列番号６）を投与された悪性神経膠腫の患者１名から、ワクチン投与前、投与後４週目、投与後１年２ヶ月目に、血清検体を得た。陰性対照として、ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン（ＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３）（配列番号３））のみを投与された胸腺悪性腫瘍の患者１名から、同様に血清検体を得た。血清検体は測定まで−２０℃で保管した。

１−２変異型ＷＴ１抗原ペプチドの作製
以下の表に示される変異型ＷＴ１抗原ペプチドを作製した。

ＷＴ３３２−３４７（配列番号５８）、ＷＴ３３４−３４２（配列番号５９）およびＷＴ３３２−３３８（配列番号６０）は、ＧＬＢｉｏｃｈｅｍにて合成した。ＷＴ１−ｆｒｇ３（配列番号５７）は、以下の方法により作製した。

（方法）
ＷＴ１−ｆｒｇ３（配列番号５７）をＧＳＴタグ付タンパク質として発現するベクターを、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３ベクター（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて構築した。作製したベクターは、コンピテントセルＤＨ５αにヒートショックにて導入した。ベクターを導入した大腸菌を培養し、ＯＤ_６００値が０．４〜０．６となった時点で、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を終濃度１ｍＭとなるよう培地に加え、タンパク発現を誘導した。さらに３時間培養した。遠心分離により集菌後、ＳＤＳサンプルバッファー（０．１２５Ｍトリス−ＨＣｌ、０．１ＭＤＴＴ、４％ＳＤＳ、１０％スクロース、ブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８）で溶解した。これをディスク型電気泳動装置ＮＡ−１８００（日本エイドー）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量分画を行った。採取した各分画の一部分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＣＢＢ染色を行い、ＷＴ１が含まれている分画を回収した。精製したタンパクをＥＬＩＳＡ用固相バッファー（１０ｍＭＮａＣＯ_３、３０ｍＭＮａＨＣＯ_３、０．０２％ＮａＮ_３、ｐＨ９．６）に溶解し、ＥＬＩＳＡ用の抗原として用いた。

１−３抗体価の測定
１−３−１ＷＴ１−ｆｒｇ３（配列番号５７）を用いた抗体価の測定
ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに、ＧＳＴ−ＷＴ１ｆｒａｇ１タンパク溶液（１０ｎｇ／μＬ）を１ウェルあたり１００μＬ入れた。３７℃で一晩放置して抗原を固相した。０．０５％ＴＢＳＴで洗浄後、ブロッキングバッファー（１％ゼラチン／０．０５％ＴＢＳＴ）で室温２時間振盪し、ブロッキングを行った。その後、０．０５％ＴＢＳＴで１００倍希釈した血清を１ウェルあたり１００μＬ入れた。４℃で一晩反応させた。二次抗体として、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を室温で２時間反応させた。その後、ＴＭＢキット（ＫＰＬ）を用いて発色させた。１ＮＨＣｌで反応を停止後、マイクロプレートリーダー（ＣＯＲＯＮＡＥＬＥＣＴＲＩＣＭＴＰ−３２）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。

１−３−２ＷＴ３３２−３４７（配列番号５８）、ＷＴ３３４−３４２（配列番号５９）またはＷＴ３３２−３３８（配列番号６０）を用いた抗体価の測定
底面にアミノ基（−ＮＨ_２）が表出したペプチドコーティングキット（ＴａＫａＲａ）付属９６ウェルリアクションプレートに、ペプチドコーティングキット付属リアクションバッファーに溶解したＷＴ１ペプチド溶液（４μｇ／ｍＬ）を１ウェルあたり５０μＬ添加した。カップリング試薬をウェルあたり３０μＬ添加し、室温で２時間反応させた。蒸留水で洗浄し、抗原を固相化した。ブロッキングワン（ナカライテスク）を用いて、室温で２時間振盪させることにより、ブロッキングを行った。次いで、０．０５％ＴＢＳＴで洗浄した。その後、ペプチドコーティングキット付属ブロッキング液で１００倍希釈した血清を、１ウェルあたり１００μＬ入れた。４℃で一晩反応させた。０．０５％ＴＢＳＴで洗浄した後、二次抗体として、ペプチドコーティングキット付属ブロッキング液で１０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体ｓｃ−２７６９、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４００μｇ／ｍＬ）を室温で２時間反応させた。０．０５％ＴＢＳＴで洗浄した後、ＴＭＢキット（ＫＰＬ）を用いて発色させた。１ＮＨＣｌで反応を停止後、マイクロプレートリーダー（ＣＯＲＯＮＡＥＬＥＣＴＲＩＣＭＴＰ−３１０Ｌａｂ）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。

２．結果
（Ｉ）ＷＴ１−ｆｒｇ３（配列番号５７）を用いた抗体価の測定
ＷＴ１_３３２ペプチドで免疫した１名の患者およびＷＴ１_２３５ペプチド（ＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３）（配列番号３））のみで免疫した１名の患者の、免疫前および免疫後の時点での血清中の抗ＷＴ１_３３２ＩｇＧ抗体価を、ＷＴ１−ｆｒｇ３（配列番号５７）を抗原とするＥＬＩＳＡで測定した。その結果、ＷＴ１_３３２ペプチドで免疫した患者では、免疫後、抗ＷＴ１_３３２ＩｇＧ抗体価が上昇していた（図１８）。一方、ＷＴ１_３３２ペプチドで免疫をしていない患者では、抗ＷＴ１_３３２ＩｇＧ抗体価は上昇していなかった。これらの結果から、ＷＴ１−ｆｒｇ３（配列番号５７）をＷＴ１抗原ペプチドとして用いるＥＬＩＳＡにより、患者血清中の抗ＷＴ１_３３２ＩｇＧ抗体レベルを測定できることが示された。

（ＩＩ）ＷＴ３３２−３４７（配列番号５８）、ＷＴ３３４−３４２（配列番号５９）またはＷＴ３３２−３３８（配列番号６０）を用いた抗体価の測定
いずれのペプチドを用いたＥＬＩＳＡによる測定でも、ＷＴ１_３３２ペプチドで免疫した患者では、免疫後、抗ＷＴ１_３３２ＩｇＧ抗体価が上昇していた（図１８）。一方、ＷＴ１_３３２ペプチドで免疫をしていない患者では、抗ＷＴ１_３３２ＩｇＧ抗体価は上昇していなかった。これらの結果から、ＷＴ３３２−３４７（配列番号５８）、ＷＴ３３４−３４２（配列番号５９）およびＷＴ３３２−３３８（配列番号６０）をＷＴ１抗原ペプチドとして用いるＥＬＩＳＡにより、患者血清中の抗ＷＴ１_３３２ＩｇＧ抗体レベルを測定できることが示された。

変異型ＷＴ１抗原ペプチドを用いた抗ＷＴ１ _２３５ペプチドＩｇＧ抗体の測定（図１９）
本発明者らは、変異型ＷＴ１抗原ペプチドを用いても抗ＷＴ１_２３５ペプチドＩｇＧ抗体の測定が可能であるかを確認するため、以下の検討を行った。

１．材料および方法
１−１血清
ＷＴ１_２３５ペプチドワクチン（ＷＴ１−ＣＴＬペプチド（改変型ｍｐ２３５−２４３）（配列番号３））の投与を受けた胸腺悪性腫瘍の患者１名から、ワクチン投与後４週目、投与後７ヶ月目に、血清検体を得た。血清検体は測定まで−２０℃で保管した。

ＷＫ２３５−２４３（配列番号６２）およびＷＴ２３７−２４３（配列番号６３）は、ＧＬＢｉｏｃｈｅｍにて合成した。ＷＴ１−ｆｒｇ２（配列番号６１）は、上述したＷＴ１−ｆｒｇ３（配列番号５７）と同様の方法により作製した。

１−３抗体価の測定
ＷＴ１−ｆｒｇ２（配列番号６１）を用いた抗体価の測定は、上述したＷＴ１−ｆｒｇ３（配列番号５７）と同様の方法により行った。ＷＫ２３５−２４３（配列番号６２）またはＷＴ２３７−２４３（配列番号６３）を用いた抗体価の測定は、上述したＷＴ３３２−３４７（配列番号５８）等と同様の方法により行った。

２．結果
（Ｉ）ＷＴ１−ｆｒｇ２（配列番号６１）を用いた抗体価の測定
ＷＴ１−ｆｒｇ２（配列番号６１）を抗原とし、ＷＴ１_２３５ペプチドを投与された患者における抗ＷＴ１_２３５ＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡにより測定した。その結果、抗ＷＴ１_２３５ＩｇＧ抗体価の上昇が検出された（図１９）。また、上述の実施例で用いられたＷＴ１−２３５ペプチド（ＷＴ２３５−２４３）を抗原として用いた場合と、同様の結果が示された。これらの結果から、ＷＴ１−ｆｒｇ２（配列番号６１）をＷＴ１抗原ペプチドとして用いるＥＬＩＳＡにより、患者血清中の抗ＷＴ１_２３５ＩｇＧ抗体レベルを測定できることが示された。

（ＩＩ）ＷＫ２３５−２４３（配列番号６２）またはＷＴ２３７−２４３（配列番号６３）を用いた抗体価の測定
これらのペプチドを抗原として用いた場合も、抗ＷＴ１_２３５ＩｇＧ抗体価の上昇が検出された（図１９）。また、上述の実施例で用いられたＷＴ１−２３５ペプチド（ＷＴ２３５−２４３）を抗原として用いた場合と、同様の結果が示された。これらの結果から、ＷＫ２３５−２４３（配列番号６２）またはＷＴ２３７−２４３（配列番号６３）をＷＴ１抗原ペプチドとして用いるＥＬＩＳＡにより、患者血清中の抗ＷＴ１_２３５ＩｇＧ抗体レベルを測定できることが示された。

変異型ＷＴ１抗原ペプチドを用いた抗ＷＴ１ _１２６ペプチドＩｇＧ抗体の測定（図２０）
本発明者らは、変異型ＷＴ１抗原ペプチドを用いても抗ＷＴ１_１２６ペプチドＩｇＧ抗体の測定が可能であるかを確認するため、以下の検討を行った。

１．材料および方法
１−１血清
ＷＴ１_１２６ペプチドと抗癌剤の併用療法を受けた膵臓癌患者から、ワクチン投与前、投与後７ヶ月目に、血清検体を得た。血清検体は測定まで−２０℃で保管した。

１−２変異ＷＴ１抗原ペプチドの作製
以下の表に示される変異型ＷＴ１抗原ペプチドを作製した。

ＷＴ１２６−１３４（配列番号６５）、ＷＫ１２６−１３４（配列番号６６）、ＷＴ１２８−１３４（配列番号６７）、ＷＴ１２６−１３２（配列番号６８）、ＷＴ１２９−１３４（配列番号６９）、ＷＴ１２６−１３１（配列番号７０）およびＷＴ１２６−１３０（配列番号７１）は、ＧＬＢｉｏｃｈｅｍにて合成した。ＷＴ１−ｆｒｇ１（配列番号６４）は、上述したＷＴ１−ｆｒｇ３（配列番号５７）と同様の方法により作製した。

１−３抗体価の測定
ＷＴ１−ｆｒｇ１（配列番号６４）を用いた抗体価の測定は、上述したＷＴ１−ｆｒｇ３（配列番号５７）と同様の方法により行った。ＷＴ１２６−１３４（配列番号６５）、ＷＫ１２６−１３４（配列番号６６）、ＷＴ１２８−１３４（配列番号６７）、ＷＴ１２６−１３２（配列番号６８）、ＷＴ１２９−１３４（配列番号６９）、ＷＴ１２６−１３１（配列番号７０）またはＷＴ１２６−１３０（配列番号７１）を用いた抗体価の測定は、上述したＷＴ３３２−３４７（配列番号５８）等と同様の方法により行った。

２．結果
（Ｉ）ＷＴ１−ｆｒｇ１（配列番号６４）を用いた抗体価の測定
ＷＴ１−ｆｒｇ１（配列番号６４）を抗原とし、ＷＴ１_１２６ペプチドを投与された患者における抗ＷＴ１_１２６ＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡにより測定した。その結果、ワクチン投与後に抗ＷＴ１_１２６ＩｇＧ抗体価の上昇が検出された（図２０）。これらの結果から、ＷＴ１−ｆｒｇ１（配列番号６４）をＷＴ１抗原ペプチドとして用いるＥＬＩＳＡにより、患者血清中の抗ＷＴ１_１２６ＩｇＧ抗体レベルを測定できることが示された。

（ＩＩ）ＷＴ１２６−１３４（配列番号６５）、ＷＫ１２６−１３４（配列番号６６）、ＷＴ１２８−１３４（配列番号６７）、ＷＴ１２６−１３２（配列番号６８）、ＷＴ１２９−１３４（配列番号６９）、ＷＴ１２６−１３１（配列番号７０）またはＷＴ１２６−１３０（配列番号７１）を用いた抗体価の測定
これらのペプチドを抗原として用いた場合も、ワクチン投与後に抗ＷＴ１_１２６ＩｇＧ抗体価の上昇が検出された（図２０）。これらの結果から、上記ペプチドをＷＴ１抗原ペプチドとして用いるＥＬＩＳＡにより、患者血清中の抗ＷＴ１_１２６ＩｇＧ抗体レベルを測定できることが示された。

以上より、ＷＴ１ペプチドワクチン投与後に、投与されたＷＴ１ペプチドワクチンに対応するＷＴ１抗原ペプチドを用いて抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体の抗体価を測定することで、ＷＴ１ワクチン療法の臨床効果を予測することが可能であることが示された。また、ＩｇＧ抗体をサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）別に測定することで、より精度の高い予測が可能であることが示された。また、変異型ＷＴ１抗原ペプチドを用いても抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体の抗体価を測定することができ、同様に、ＷＴ１ワクチン療法の臨床効果を予測することが可能であることが示された。

本発明によれば、ＷＴ１ワクチン療法における臨床効果を予測する、より精度の高い予測方法の提供が可能になる。被験体における抗ＷＴ１抗原ペプチド抗体を測定し、その値を指標とすることで、より精度の高い予測を行うことができる。したがって、本発明は、ＷＴ１関連疾患患者に対するＷＴ１ワクチン療法の是非についての検査、その臨床効果の予測において利用可能である。

Claims

下記（１）〜（４）の工程を含む、ＷＴ１ペプチド免疫療法における臨床効果を判定するための方法：
（１）ＷＴ１ペプチドワクチン投与被験者由来の試料を、前記被験者に投与したＷＴ１ペプチドワクチンと同一配列を含み、かつアミノ酸数が５〜３０である、あるいは該ＷＴ１ペプチドワクチンのアミノ酸配列由来の５以上の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を含み、かつアミノ酸数が５〜３０である、ＷＴ１抗原ペプチドまたはその変異体に接触する工程、
（２）前記試料と前記ＷＴ１抗原ペプチドまたはその変異体とを結合させる工程、
（３）前記試料中の抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価を測定する工程、
（４）工程（３）の抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価が上昇していることが、臨床効果が良好であると判定するための指標とする工程。
測定される抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体のサブクラスがＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４であり、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３がそれぞれＩｇＧ４の２倍以上であることが、臨床効果が良好であると判定するための指標とすることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
ＩｇＧ１がＩｇＧ３の２倍未満であり、かつＩｇＧ３がＩｇＧ１の２倍未満であることが、臨床効果が良好であると判定するための指標とすることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
ＷＴ１ペプチドワクチン投与から８−１４週後の抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価が測定される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
ＷＴ１ペプチドワクチン投与から１２−１４週後の抗ＷＴ１抗原ペプチドＩｇＧ抗体価が測定される、請求項４に記載の方法。
被験者に投与されるＷＴ１ペプチドワクチンが配列番号２〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
ＷＴ１抗原ペプチドが配列番号７〜５６、５８〜６０、６２、６３、および６５〜７１のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
ＷＴ１抗原ペプチドが配列番号２０、２１、２７、３１、３２、４２、４３、５８〜６０、６２、６３、および６５〜７１のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
試料が、血液サンプル、血漿サンプル、血清サンプルまたは尿サンプルである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
試料が血清サンプルである、請求項９に記載の方法。
被験者がＷＴ１関連疾患患者である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
ＷＴ１関連疾患が、白血病、造血器腫瘍、または固形癌である、請求項１１に記載の方法。
ＷＴ１関連疾患が、再発悪性神経膠腫、胸腺癌または膵臓癌である、請求項１２に記載の方法。
ＷＴ１抗原ペプチドまたはその変異体を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法を実施するためのキット。