KR20160007579A

KR20160007579A - 면역요법의 임상 효과의 예측법

Info

Publication number: KR20160007579A
Application number: KR1020157034861A
Authority: KR
Inventors: 하루오 스기야마; 유스케 오지
Original assignee: 인터내셔널 인스티튜트 오브 캔서 이무놀로지 인코퍼레이티드
Priority date: 2013-05-13
Filing date: 2014-05-12
Publication date: 2016-01-20
Also published as: EP2998740A1; EP2998740B1; CA2912514A1; WO2014185387A1; ES2954899T3; EP2998740A4; AU2014266396A1; JP6634287B2; US20160084841A1; US10408840B2; CN105378479A; JPWO2014185387A1; CN111781359A

Abstract

본 발명은, a) 피험자 유래의 시료를, WT1 항원 펩티드 또는 그의 변이체와 접촉시키는 공정; 및 b) 상기 시료와 상기 WT1 항원 펩티드 또는 그의 변이체와의 결합을 검출하고, 그것에 의해 상기 시료 중에 존재하는 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가를 측정하는 공정을 포함하는, WT1 펩티드 면역요법에 있어서의 피험자에 대한 임상 효과를 예측하기 위한 방법이며, 피험자에 있어서의 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가가 상승하고 있는 것이, 임상 효과가 양호하다고 판정하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, WT1 항원 펩티드 또는 그의 변이체를 포함하는, 본 발명의 방법을 실시하기 위한 키트를 제공한다.

Description

면역요법의 임상 효과의 예측법{METHOD FOR PREDICTING CLINICAL EFFECT OF IMMUNOTHERAPY}

본원은, 2013년 5월 13일에 출원된 일본 특허 출원 2013-101566호의 우선권을 주장하는 것이며, 그 명세서, 특허청구범위, 도면 및 요약서의 내용을 여기에 인용하여, 본 발명의 명세서의 개시로서 도입하는 것이다.

본 발명은 WT1 펩티드 면역요법에 있어서의 임상 효과의 예측법 등에 관한 것이다.

WT1 유전자(윌름스 종양 1 유전자; Wilms' tumor 1 gene)는, 소아의 신장암인 윌름스 종양의 책임 유전자로서 동정된 유전자이며(비특허문헌 1 및 2), 징크 핑거 구조를 갖는 전사 인자이다. 당초, WT1 유전자는 암 억제 유전자로 여겨졌지만, 그 후의 연구(비특허문헌 3 내지 6)에 의해, 조혈기 종양이나 고형 암에 있어서는 오히려 암 유전자로서 작용하는 것으로 나타났다.

최근 들어, WT1 유전자 산물 또는 그의 단편을 사용한 WT1 펩티드 면역요법이 행하여지고 있다. 면역요법 개시 후의 장기에 걸친 치료 전략을 입안하기 위해서, 임상 효과의 정도를 예측하는 것은 임상적으로 중요한 의의를 갖고 있다. 그 때문에, 정밀도가 높은 임상 효과의 예측법의 확립이 요망되고 있다.

일본 특허 제3728439호 명세서

Daniel A. Haber et al., Cell. 1990 Jun 29; 61(7): 1257-69. Call KM et al., Cell. 1990 Feb 9; 60(3): 509-20. Menke AL et al., Int Rev Cytol. 1998; 181: 151-212. Review. Yamagami T et al., Blood. 1996 Apr1; 87(7): 2878-84. Inoue K et al., Blood. 1998 Apr 15; 91(8): 2969-76. Tsuboi A et al., Leuk Res. 1999 May; 23(5): 499-505. Fujiki F et al., J Immunother. 2007 Apr; 30(3): 282-93.

본 발명의 해결 과제는, WT1 펩티드 백신을 투여받는 피험자의 장기적인 임상 효과를, 보다 고정밀도로 예측하는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 임상 효과를 보다 고정밀도로 예측하기 위한 키트를 제공하는 것이다.

본 발명자들은, 피험자에게 투여된 WT1 펩티드 백신에 대응하는 WT1 항원 펩티드를 사용하여, WT1 펩티드에 대한 IgG 항체를 측정하는 계를 확립하여, 본 발명을 완성시켰다. 특히, WT1 항원 펩티드에 대한 IgG1, IgG3 및 IgG4 항체가를 측정하고, 그 값을 지표로 하는 계를 확립하였다.

즉, 본 발명은 이하의 것을 제공하는 것이다:

(1) 이하의 공정:

a) 피험자 유래의 시료를, WT1 항원 펩티드 또는 그의 변이체와 접촉시키는 공정; 및

b) 상기 시료와 상기 WT1 항원 펩티드 또는 그의 변이체와의 결합을 검출하고, 그것에 의해 상기 시료 중에 존재하는 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가를 측정하는 공정

을 포함하는, WT1 펩티드 면역요법에 있어서의 피험자에 대한 임상 효과를 예측하기 위한 방법이며,

피험자에 있어서의 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가가 상승하고 있는 것이, 임상 효과가 양호하다고 판정하는 것을 특징으로 하는 방법;

(2) 측정되는 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체의 서브클래스가 IgG1, IgG3 및 IgG4이며, IgG1 및 IgG3이 각각 IgG4의 2배 이상인 것이, 임상 효과가 양호하다고 판정하는 것을 특징으로 하는, (1)에 기재된 방법;

(3) IgG1이 IgG3의 2배 미만이고, 또한 IgG3이 IgG1의 2배 미만인 것이, 임상 효과가 양호하다고 판정하는 것을 특징으로 하는, (2)에 기재된 방법;

(4) WT1 펩티드 백신 투여로부터 8 내지 14주 후의 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가가 측정되는, (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 방법;

(5) WT1 펩티드 백신 투여로부터 12 내지 14주 후의 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가가 측정되는, (4)에 기재된 방법;

(6) 피험자에게 투여되는 WT1 펩티드 백신이 서열 번호 2 내지 6 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 방법;

(7) WT1 항원 펩티드가 서열 번호 7 내지 71 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 방법;

(8) WT1 항원 펩티드가 서열 번호 20, 21, 27, 31, 32, 42, 43 또는 57 내지 71 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, (7)에 기재된 방법;

(9) 시료가, 혈액 샘플, 혈장 샘플, 혈청 샘플 또는 뇨 샘플인, (1) 내지 (8) 중 어느 한 항에 기재된 방법;

(10) 시료가 혈청 샘플인, (9)에 기재된 방법;

(11) 피험자가 WT1 관련 질환 환자인, (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 방법;

(12) WT1 관련 질환이 만성 골수성 백혈병 등의 백혈병, 골수 이형성 증후군, 다발성 골수종, 악성 임파종 등의 조혈기 종양, 또는 식도암, 위암, 대장암, 췌장암, 폐암, 유방암, 배세포암, 간암, 담도암, 두경부암, 피부암, 육종, 신장암, 방광암, 전립선암, 정소암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 갑상선암, 카르시노이드, 폐아종, 간아종, 뇌종양 또는 흉선암 등의 고형 암인, (11)에 기재된 방법;

(13) WT1 관련 질환이 재발 악성 신경 교종, 흉선암 또는 췌장암인, (12)에 기재된 방법; 및

(14) WT1 항원 펩티드 또는 그의 변이체를 포함하는, (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 기재된 방법을 실시하기 위한 키트.

본 발명에 따르면, WT1 펩티드 백신을 투여받은 피험자의 장기 임상 효과를, 종래 법에 비해 보다 고정밀도로 예측하는 방법을 제공하는 것이 가능해진다. 또한, 임상 효과를 보다 고정밀도로 예측하기 위한 키트를 제공할 수 있다. 이에 의해, WT1 펩티드 백신의 계속 투여의 시비 등을 보다 적절하게 판단할 수 있다.

도 1은 재발 악성 신경 교종 환자에 대해서, WT1₂₃₅ 펩티드 백신 투여 후의 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 2는 재발 악성 신경 교종 환자에 대해서, WT1₂₃₅ 펩티드 백신 투여 8 내지 9주 후의 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가의 상승과, 전체 생존율의 관계를 나타내는 그래프이다. 흑색 사각은 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가가 상승한 군(항체가 상승군), 백색 사각은 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가가 상승하지 않은 군(항체가 비상승군)을 나타낸다.
도 3은 재발 악성 신경 교종 환자에 대해서, WT1₂₃₅ 펩티드 백신 투여 12 내지 14주 후의 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가의 상승과, 전체 생존율의 관계를 나타내는 그래프이다. 흑색 사각은 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가가 상승한 군(항체가 상승군), 백색 사각은 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가가 상승하지 않은 군(항체가 비상승군)을 나타낸다.
도 4는 재발 악성 신경 교종 환자에 대해서, WT1₂₃₅ 펩티드 백신 투여 8 내지 9주 후의 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가의 상승과, 무진행 생존율의 관계를 나타내는 그래프이다. 흑색 사각은 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가가 상승한 군(항체가 상승군), 백색 사각은 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가가 상승하지 않은 군(항체가 비상승군)을 나타낸다.
도 5는 재발 악성 신경 교종 환자에 대해서, WT1₂₃₅ 펩티드 백신 투여 12 내지 14주 후의 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가의 상승과, 무진행 생존율의 관계를 나타내는 그래프이다. 흑색 사각은 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가가 상승한 군(항체가 상승군), 백색 사각은 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가가 상승하지 않은 군(항체가 비상승군)을 나타낸다.
도 6은 재발 악성 신경 교종 환자에 대해서, WT1₂₃₅ 펩티드 백신 투여 8 내지 9주 후의 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가의 상승과, WT1 펩티드 백신 투여 계속률의 관계를 나타내는 그래프이다. 흑색 사각은 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가가 상승한 군(항체가 상승군), 백색 사각은 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가가 상승하지 않은 군(항체가 비상승군)을 나타낸다.
도 7은 재발 악성 신경 교종 환자에 대해서, WT1₂₃₅ 펩티드 백신 투여 12 내지 14주 후의 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가의 상승과, WT1 펩티드 백신 투여 계속률의 관계를 나타내는 그래프이다. 흑색 사각은 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가가 상승한 군(항체가 상승군), 백색 사각은 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가가 상승하지 않은 군(항체가 비상승군)을 나타낸다.
도 8은 재발 악성 신경 교종 환자에 대해서, WT1₂₃₅ 펩티드 백신 투여 12 내지 14주 후의 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체의 타입과, 전체 생존율의 관계를 나타내는 그래프이다. 흑색 사각은 Th1 타입, 백색 사각은 비 Th1 타입을 나타낸다.
도 9는 재발 악성 신경 교종 환자에 대해서, WT1₂₃₅ 펩티드 백신 투여 12 내지 14주 후의 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체의 타입과, 무진행 생존율의 관계를 나타내는 그래프이다. 흑색 사각은 Th1 타입, 백색 사각은 비 Th1 타입을 나타낸다.
도 10은 재발 악성 신경 교종 환자에 대해서, WT1₂₃₅ 펩티드 백신 투여 12 내지 14주 후의 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가를 측정한 경우에 있어서의, Th1 타입/비 Th1 타입 각각의 WT1 펩티드 백신 투여 계속률을 나타내는 그래프이다. 흑색 사각은 Th1 타입, 백색 사각은 비 Th1 타입을 나타낸다.
도 11은 재발 악성 신경 교종 환자에 대해서, WT1₂₃₅ 펩티드 백신 투여 12 내지 14주 후의 항체가를 측정한 경우에 있어서의, IgG1 타입/IgG3 타입/IgG1 & IgG3 타입 각각의 전체 생존율을 나타내는 그래프이다. 흑색 사각은 IgG1 타입, 흑색 원은 IgG3 타입, 흑색 삼각은 IgG1 & IgG3 타입을 나타낸다.
도 12는 재발 악성 신경 교종 환자에 대해서, WT1₂₃₅ 펩티드 백신 투여 12 내지 14주 후의 항체가를 측정한 경우에 있어서의, IgG1 타입/IgG3 타입/IgG1 & IgG3 타입 각각의 무진행 생존율을 나타내는 그래프이다. 흑색 사각은 IgG1 타입, 흑색 원은 IgG3 타입, 흑색 삼각은 IgG1 & IgG3 타입을 나타낸다.
도 13은 재발 악성 신경 교종 환자에 대해서, WT1₂₃₅ 펩티드 백신 투여 12 내지 14주 후의 항체가를 측정한 경우에 있어서의, IgG1 타입/IgG3 타입/IgG1 & IgG3 타입 각각의 WT1 펩티드 백신 투여 계속률을 나타내는 그래프이다. 흑색 사각은 IgG1 타입, 흑색 원은 IgG3 타입, 흑색 삼각은 IgG1 & IgG3 타입을 나타낸다.
도 14는 재발 악성 신경 교종 환자에 대해서, WT1₂₃₅ 펩티드 백신 및 WT1₃₃₂(헬퍼) 펩티드 백신 병용 투여 4 내지 8주 후의 항체가를 측정한 경우에 있어서의, 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가 상승군/비상승군 각각의 WT1 펩티드 백신 투여 계속률을 나타내는 그래프이다. 흑색 사각은 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가가 상승한 군(항체가 상승군), 백색 사각은 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가가 상승하지 않은 군(항체가 비상승군)을 나타낸다.
도 15는 재발 악성 신경 교종 환자에 대해서, WT1₂₃₅ 펩티드 백신 및 WT1₃₃₂(헬퍼) 펩티드 백신 병용 투여 4 내지 8주 후의 항체가를 측정한 경우에 있어서의, 항 WT1-325 펩티드 IgG 항체가 상승군/비상승군 각각의 WT1 펩티드 백신 투여 계속률을 나타내는 그래프이다. 흑색 사각은 항 WT1-325 펩티드 IgG 항체가가 상승한 군(항체가 상승군), 백색 사각은 항 WT1-325 펩티드 IgG 항체가가 상승하지 않은 군(항체가 비상승군)을 나타낸다.
도 16은 재발 악성 신경 교종 환자에 대해서, WT1₃₃₂(헬퍼) 펩티드 백신 투여 12 내지 14주 후의 항체가를 측정한 경우에 있어서의, 항 WT1-325 펩티드 IgG 항체가 상승군/비상승군 각각의 WT1 펩티드 백신 투여 계속률을 나타내는 그래프이다. 흑색 사각은 항 WT1-325 펩티드 IgG 항체가가 상승한 군(항체가 상승군), 백색 사각은 항 WT1-325 펩티드 IgG 항체가가 상승하지 않은 군(항체가 비상승군)을 나타낸다.
도 17은 흉선암 환자에 대해서, WT1₂₃₅ 펩티드 백신 투여 12 내지 14주 후의 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가의 상승과, WT1 펩티드 백신 투여 계속률의 관계를 나타내는 그래프이다. 흑색 사각은 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가가 상승한 군(항체가 상승군), 백색 사각은 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가가 상승하지 않은 군(항체가 비상승군)을 나타낸다.
도 18은 WT1₃₃₂(헬퍼) 펩티드 백신의 투여를 받은 악성 신경 교종 환자에 있어서의, 변이형 WT1 항원 펩티드를 사용한 항 WT1₃₃₂ 펩티드 IgG 항체가의 측정 결과를 나타내는 그래프이다. 백색 사각은 WT1-frg3, 흑색 원은 WT325-342, 백색 삼각은 WT332-347, 흑색 사각은 WT334-342, 흰색 원은 WT332-338을, 각각 항원으로서 사용한 ELISA의 결과를 나타낸다.
도 19는 WT1₂₃₅ 펩티드 백신의 투여를 받은 흉선암 환자에 있어서의, 변이형 WT1 항원 펩티드를 사용한 항 WT1₂₃₅ 펩티드 IgG 항체가의 측정 결과를 나타내는 그래프이다. 백색 사각은 WT1-frg2, 흑색 원은 WT235-252, 백색 삼각은 WK235-243, 흑색 사각은 WT237-243을, 각각 항원으로서 사용한 ELISA의 결과를 나타낸다.
도 20은 WT1₁₂₆ 펩티드 백신과 항암제의 병용 요법을 받은 췌장암 환자에 있어서의, 변이형 WT1 항원 펩티드를 사용한 항 WT1₁₂₆ 펩티드 IgG 항체가의 측정 결과를 나타내는 그래프이다. 백색 사각은 WT1-frg1, 흑색 원은 WT118-135, 흑색 삼각은 WK126-134, 흑색 사각은 WT126-131, 흰색 원은 WT129-134, 백색 삼각은 WT126-130을, 각각 항원으로서 사용한 ELISA의 결과를 나타낸다.

하나의 형태에 있어서, 본 발명은 이하의 공정: a) 피험자 유래의 시료를, WT1 항원 펩티드 또는 그의 변이체와 접촉시키는 공정; 및 b) 상기 시료와 상기 WT1 항원 펩티드 또는 그의 변이체와의 결합을 검출하고, 그것에 의해 상기 시료 중에 존재하는 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가를 측정하는 공정을 포함하는, WT1 펩티드 면역요법에 있어서의 피험자에 대한 임상 효과를 예측하기 위한 방법이며, 피험자에 있어서의 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가가 상승하고 있는 것이, 임상 효과가 양호하다고 판정하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 형태에 있어서, 본 발명은 상기 a) 공정 및 b) 공정을 포함하는, WT1 펩티드 면역요법에 있어서의 피험자에 대한 임상 효과를 예측하기 위한 방법이며, 측정되는 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체의 서브클래스가 IgG1, IgG3 및 IgG4이며, IgG1 및 IgG3이 각각 IgG4의 2배 이상인 것이, 임상 효과가 양호하다고 판정하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 방법은, IgG1이 IgG3의 2배 미만이고, 또한 IgG3이 IgG1의 2배 미만인 것이, 임상 효과가 양호하다고 판정하는 것을 특징으로 한다.

바람직한 실시 형태에 있어서, WT1 펩티드 백신 투여로부터 8 내지 14주 후의 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가의 측정이 행하여진다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, WT1 펩티드 백신 투여로부터 12 내지 14주 후의 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가의 측정이 행하여진다.

본 발명에 있어서, 용어 「WT1 펩티드 백신」이란, WT1 펩티드 면역요법에 있어서 백신으로서 피험자에게 투여되는, WT1 유전자 산물(서열 번호 1) 유래의 펩티드 및 그것들의 개변 펩티드를 가리킨다. WT1 펩티드 백신에는, 예를 들어 WT1₂₃₅ 펩티드 백신(서열 번호 2), WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243) 백신(서열 번호 3)(특허문헌 1), WT1₁₂₆ 펩티드 백신(서열 번호 4), WT1₁₈₇ 펩티드 백신(서열 번호 5) 등을 들 수 있다. 또는, WT1 펩티드 백신은 WT1₃₃₂ 헬퍼 펩티드 백신(서열 번호 6)(비특허문헌 7)이어도 된다. WT1 펩티드 백신은, 특별히 제한되지 않고, WT1 펩티드 면역요법으로 사용되는 백신으로서 당업자에게 잘 알려진 것 또는 장래 사용될 수 있는 것을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 용어 「WT1 펩티드 백신에 대응하는 WT1 항원 펩티드」 및 「WT1 항원 펩티드」는 동의적으로 사용된다. WT1 항원 펩티드는, 피험자에게 투여되는 WT1 펩티드 백신의 아미노산 서열 유래의 연속하는 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이며, 이러한 WT1 펩티드 백신에 대한 항체를 검출할 수 있는 펩티드이다. 연속하는 아미노산이란, 수개, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 연속하는 아미노산이다. 본 발명에서의 WT1 항원 펩티드는, 상기 특징을 갖는 한, 그 아미노산 서열 및 길이는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 5 내지 200 아미노산, 5 내지 190 아미노산, 5 내지 185 아미노산, 5 내지 184 아미노산, 5 내지 183 아미노산, 5 내지 182 아미노산, 5 내지 181 아미노산, 5 내지 180 아미노산, 5 내지 170 아미노산, 5 내지 160 아미노산, 5 내지 150 아미노산, 5 내지 140 아미노산, 5 내지 130 아미노산, 5 내지 120 아미노산, 5 내지 110 아미노산, 5 내지 100 아미노산, 5 내지 90 아미노산, 5 내지 80 아미노산, 5 내지 70 아미노산, 5 내지 60 아미노산, 5 내지 50 아미노산, 5 내지 40 아미노산, 5 내지 30 아미노산, 6 내지 27 아미노산, 7 내지 24 아미노산이다. 「WT1 항원 펩티드」는, 피험자에게 투여되는 WT1 펩티드 백신의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 펩티드이어도 된다. 또는, WT1 항원 펩티드는, 피험자에게 투여되는 WT1 펩티드 백신의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이어도 된다. 즉, WT1 항원 펩티드는, 피험자에게 투여되는 WT1 펩티드 백신의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 그 자체이어도 되고, 또는 이러한 WT1 펩티드 백신의 아미노산 서열의 전부 또는 일부분을 포함하는 펩티드이어도 된다.

또한 본 발명에 있어서, WT1 항원 펩티드는, 피험자에게 투여되는 WT1 펩티드 백신의 변이체도 포함한다. 변이체는, 예를 들어 WT1 펩티드 백신의 아미노산 서열에 있어서, 수개, 예를 들어 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 바람직하게는 4개, 3개, 더욱 바람직하게는 2개, 보다 바람직하게는 1개의 아미노산이 치환 및/또는 결실된, 및/또는 200개, 190개, 180개, 170개, 160개, 150개, 140개, 130개, 120개, 110개, 100개, 90개, 80개, 70개, 60개, 50개, 40개, 30개, 20개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 바람직하게는 4개, 3개, 더욱 바람직하게는 2개, 보다 바람직하게는 1개의 아미노산이 부가된 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 변이체는, 피험자에게 투여되는 WT1 펩티드 백신의 아미노산 서열에 대하여 로컬 얼라인먼트(Local Alignment)를 실시한 경우에, 50％ 이상, 바람직하게는 60％ 이상, 더욱 바람직하게는 70％ 이상, 보다 바람직하게는 80％ 이상, 보다 한층 바람직하게는 85％ 이상, 특히 바람직하게는 90％ 이상(예를 들어, 95, 96, 97, 98 또는 99％ 이상)의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드이다. 아미노산 서열의 상동성은, 예를 들어 FASTA, BLAST, DNASIS(히타치 소프트웨어 엔지니어링(주) 제조), GENETYX((주)제네틱스 제조)를 사용하여 측정할 수 있다. 또는, 단순하게 배열을 비교하여 계산할 수도 있다. 변이체의 길이는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 5 내지 200 아미노산, 5 내지 190 아미노산, 5 내지 185 아미노산, 5 내지 184 아미노산, 5 내지 183 아미노산, 5 내지 182 아미노산, 5 내지 181 아미노산, 5 내지 180 아미노산, 5 내지 170 아미노산, 5 내지 160 아미노산, 5 내지 150 아미노산, 5 내지 140 아미노산, 5 내지 130 아미노산, 5 내지 120 아미노산, 5 내지 110 아미노산, 5 내지 100 아미노산, 5 내지 90 아미노산, 5 내지 80 아미노산, 5 내지 70 아미노산, 5 내지 60 아미노산, 5 내지 50 아미노산, 5 내지 40 아미노산, 5 내지 30 아미노산, 6 내지 27 아미노산, 7 내지 24 아미노산이다. 본 명세서에 있어서, 이러한 변이체는 「변이형 WT1 항원 펩티드」라고도 칭해진다.

또한, 본 발명에 있어서, WT1 항원 펩티드로서, 본 발명의 WT1 항원 펩티드의 변이체를 사용해도 된다. 이러한 변이체는, 예를 들어 본 발명의 WT1 항원 펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 수개, 예를 들어 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 바람직하게는 4개, 3개, 더욱 바람직하게는 2개, 보다 바람직하게는 1개의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다.

바람직한 실시 형태에 있어서, WT1 항원 펩티드는 서열 번호 7 내지 71 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이며, 예를 들어 서열 번호 7 내지 71 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, WT1 항원 펩티드는, 서열 번호 20, 21, 27, 31, 32, 42, 43 또는 57 내지 71 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이며, 예를 들어 서열 번호 20, 21, 27, 31, 32, 42, 43 또는 57 내지 71 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이다. 더욱 바람직한 실시 형태에 있어서, WT1 항원 펩티드는 서열 번호 20, 32, 42 또는 57 내지 71 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이며, 예를 들어 서열 번호 20, 32, 42 또는 57 내지 71 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이다. 본 발명에 있어서, WT1 항원 펩티드를 구성하는 아미노산 중 어느 하나의 아미노산이 적절히 수식된 것이어도 된다. 아미노산 잔기의 수식은, 공지된 방법으로 실시할 수 있다.

본 명세서에 있어서, 「항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가가 상승한」이란, (1) WT1 백신 투여 후의 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가가, 미리 설정된 값 이상으로 된 경우, 또는 (2) WT1 백신 투여 전과 비교해서 WT1 백신 투여 후의 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가가, 미리 설정된 값 이상으로 증가한 경우를 말한다. 본 발명에서의 이 값은, 측정 대상(피험자의 수, 연령, 성별, 체중, 상태 등)이나 측정 방법, 측정 조건, 통계적 방법 등의 여러 조건에 따라 변동하는 것이기 때문에, 이것들에 따라서 미리 설정할 필요가 있다. 이러한 값은 집적한 데이터에 기초하여 경험적으로 결정된다. 따라서, 본 발명이 속하는 기술 분야에 속하는 당업자라면 통상의 실험을 행함으로써, 원하는 특이성과 감도, 사용하는 시료의 종류, 그 제조법 등, 및 본 명세서에 기재한 다른 요인에 기초하여, 특정한 값을 선택할 수 있음을 당연히 이해할 수 있을 것이다. 예를 들어, 항 WT1 펩티드 IgG 항체가가 음성이라고 생각되는 시료를 사용해서 항 WT1 펩티드 IgG 항체가를 측정하고, 그 결과에 기초하여 계산된, 평균값+표준 편차의 2배의 값을 참조하여, 이러한 특정한 값을 결정할 수 있다. 당업자라면 또한, 상술한 WT1 항원 펩티드를 사용해서 행하는 항 WT1 항원 펩티드 항체의 측정이, 상기 WT1 항원 펩티드가 대응하는 WT1 펩티드 백신에 대한 항체의 측정을 의미하는 것임을 당연히 이해할 수 있을 것이다.

본 발명의 방법에 있어서, 시료로서는, 피험자 유래의 샘플이며, 일반적으로 항체가 존재하는 것으로 알려져 있는 체액을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 혈액 샘플, 혈장 샘플, 혈청 샘플 또는 뇨 샘플이다. 보다 바람직하게는, 혈청 샘플이다. 이러한 시료는, 예를 들어 버퍼 등을 사용하여, 본 발명의 방법에서 사용하기 위해 적합한 상태로 제조되어도 된다.

본 발명의 하나의 형태에 있어서, 피험자는 WT1 관련 질환 환자이다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 피험자는 만성 골수성 백혈병 등의 백혈병, 골수 이형성증후군, 다발성 골수종, 악성 임파종 등의 조혈기 종양, 또는 식도암, 위암, 대장암, 췌장암, 폐암, 유방암, 배세포암, 간암, 담도암, 두경부암, 피부암, 육종, 신장암, 방광암, 전립선암, 정소암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 갑상선암, 카르시노이드, 폐아종, 간아종, 뇌종양 또는 흉선암 등의 고형 암의 환자이다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 피험자는, 재발 악성 신경 교종(GBM), 흉선암 또는 췌장암의 환자이다.

본 발명의 방법에서의 항체가의 측정은, 항체의 측정 기술에 있어서 관용되고 있는 다양한 방법을 사용해서 실시할 수 있다. 이러한 방법에는 면역학적 측정법을 들 수 있다. 구체예로서, ELISA, 방사 면역 측정법(RIA) 등을 들 수 있다.

ELISA는, 예를 들어 이하와 같이 실시된다. 먼저, 측정 대상으로 하는 항 WT1 항원 펩티드 항체와 특이적으로 항원 항체 반응할 수 있는 WT1 항원 펩티드를 고상화한다. 이것에 시료를 첨가한다. 이에 의해, 고상화된 WT1 항원 펩티드와 시료 중의 항체와의 사이에서 항원 항체 반응이 일어나서, 시료 중에 존재하는 항 WT1 항원 펩티드 항체가 고상화된 WT1 항원 펩티드에 결합한다. 이어서, 결합한 항 WT1 항원 펩티드 항체를, 항체 검출 시약을 사용해서 검출하여, 시료 중에 존재하는 항체량을 측정한다.

또는, 항체 검출 시약을 고상화하여, 이에 의해 시료 중의 항체를 보충하고, 계속해서 WT1 항원 펩티드를 첨가해서 보충된 항체 중의 항 WT1 항원 펩티드 항체에 결합시키고, 또한 해당 항원에 대한 특이적 항체의 표지체를 결합시킴으로써, 시료 중에 존재하는 원하는 항 WT1 항원 펩티드 항체를 검출, 측정할 수도 있다.

이들 측정 방법에 있어서의 수단의 선택, 개변 등은 모두 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명에 있어서, 상기에 예를 든 방법에 제한되지 않고, 다양한 방법을 채용할 수 있다(「임상 검사법 제요」(개정 제33판), 가네하라 출판, 2010년 등 참조).

항 WT1 항원 펩티드 항체를 검출하기 위한 항체 검출 시약은 특별히 제한되지 않고, 일반적으로 사용되고 있는 다양한 시약을 사용할 수 있다. 예를 들어, 측정 대상으로 하는 인간 IgG, IgG1, IgG3 및/또는 IgG4 등에 특이적으로 결합하는 항 인간 IgG 항체, 항 인간 IgG1 항체, 항 인간 IgG3 항체 및/또는 항 인간 IgG4 항체를 포함하는 제조물을 사용할 수 있다. 이것들은 시판품으로서 입수할 수 있고, 또한 제조할 수도 있다. 이러한 항체 검출 시약의 제조법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 발명에서 사용되는 항체 검출 시약은, 표지된 2차 항체이다. 더 바람직한 실시 형태에서는, 본 발명에서 사용되는 항체 검출 시약은, 표지된 2차 항체와, 해당 2차 항체를 검출하는 표지된 3차 항체와의 조합이다.

본 발명의 방법에 있어서, WT1 항원 펩티드 또는 그의 변이체는, 고상법이나 액상법 등에 따라서 화학적으로 합성해도 된다. 고상법의 경우, 펩티드는, N 말단 보호 아미노산의 활성화, 커플링, 세정, 탈보호기, 활성화의 조작을, 원하는 펩티드가 완성될 때까지 반복하여, 고상상으로 합성된다. 해당 산물은, 고상으로부터 탈리되어, HPLC 등을 사용해서 정제된다. 계속해서, 배열 검정 및 생물학적 시험과 같은 또 다른 연구로 옮겨진다.

또는, WT1 항원 펩티드 또는 그의 변이체는, 무세포 번역계에 의해 합성해도 된다. 또한, WT1 항원 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 기초하여, 유전자 공학적으로 제조해도 된다. 또한, 이들 방법을 조합하여 얻어도 된다. 유전자 공학적 방법에 의한 WT1 항원 펩티드의 제조는, 일반적인 유전자 재조합 기술에 따를 수 있다. 보다 상세하게는, 원하는, WT1 항원 펩티드를 코딩하는 유전자를 숙주 세포 중에서 발현할 수 있는 재조합 DNA 분자를 제작하고, 이것을 숙주 세포에 도입해서 형질 전환하고, 해당 형질 전환체를 배양함으로써, 형질 전환체의 세포내 또는 세포외에 원하는 WT1 항원을 발현 산물로서 생산시킬 수 있다.

여기서 채용될 수 있는 각 조작, 예를 들어 유전자 단편의 화학 합성, 절단, 삭제, 부가 및 결합을 목적으로 하는 효소 처리, 단리, 정제, 선택 등, 재조합 DNA의 숙주 세포로의 도입 및 형질 전환 세포의 배양 등은, 모두 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning, by T. Maniatisetal., Cold Spring Harbor Laboratory(1982)] 등 참조).

또한 원한다면, WT1 항원 펩티드 또는 그의 변이체는, 그의 물리적·화학적 성질 등을 이용한 각종 분리 조작에 따라서, 상기 발현 산물 등으로부터 분리, 정제할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 시료 중의 항 WT1 항원 펩티드 항체량의 측정은, 또한 공지된 방법, 수단, 그것들에서 사용되는 측정 시약 등을 적절하게 이용할 수 있다.

예를 들어, 상기 측정법에 있어서, 고상법을 채용하는 경우, 측정계의 항원 또는 항체는, 당업자에게 잘 알려진 방법에 따라서 고상으로 고정화된다. 해당 고상에는, 통상 사용되는 불용성, 불활성의 담체가 널리 이용될 수 있다. 이것에는, 예를 들어 유리, 셀룰로오스 분말, 세파덱스, 세파로스, 폴리스티렌, 여과지, 카르복시메틸셀룰로오스, 이온 교환 수지, 덱스트란, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 나일론, 글래스 비즈, 견, 폴리아민-메틸비닐에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체 등의 다양한 소재를 포함하는 스틱, 비즈, 마이크로 플레이트, 시험관 등이 포함된다.

항원 또는 항체의 고정화 방법도, 특별히 제한되지 않고, 물리적 결합 및 화학적 결합 모두 이용할 수 있다. 대표적으로는, 예를 들어 공유 결합법으로서 디아조법, 펩티드법(산 아미드 유도체법, 카르복실클로라이드 수지법, 카르보디이미드 수지법, 무수 말레산 유도체법, 이소시아네이트 유도체법, 브롬화시안 활성화 다당체법, 셀룰로오스 카르보네이트 유도체법, 축합 시약을 사용하는 방법 등), 알킬화법, 가교 시약에 의한 담체 결합법(가교 시약으로서 글루타르알데히드, 헥사메틸렌이소시아네이트 등을 사용함), Ugi 반응에 의한 담체 결합법 등의 화학적 반응을 이용하는 방법: 이온 교환 수지와 같은 담체를 사용하는 이온 결합법: 글래스 비즈 등의 다공성 유리를 담체로서 사용하는 물리적 흡착법 등을 들 수 있다.

각 측정계에 있어서의 표지제도, 특별히 제한되지 않고, 당업자에게 잘 알려진 것 또는 장래 사용될 수 있는 것 중 어느 하나를 사용할 수 있다. 구체예로서는, 면역 측정법에 있어서 관용의 각종 방사성 동위 원소류, 알칼리 포스파타아제(ALP), 퍼옥시다아제(POX) 등의 효소류, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 테트라메틸로다민이소티오시아네이트(RITC) 등의 형광 물질류, 그 밖에 1N-(2,2,6,6-테트라메틸-1-옥실-4-피페리딜)-5N-(아스파르테이트)-2,4-디니트로벤젠(TOPA)을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 마이크로 퍼옥시다아제, 키모트립시노겐, 프로카르복시펩티다아제, 글리세로알데히드-3-인산탈수소 효소, 아밀라아제, 포스포릴라아제, D-나아제, P-나아제 등을 사용해도 된다. 이들 표지 물질에 의한 표지 방법은, 공지된 방법에 따라서 실시할 수 있다.

또한, 효소 활성의 측정도, 사용하는 효소의 종류에 따라 공지된 방법에 따라서 실시할 수 있다. 예를 들어, 표지 효소로서 퍼옥시다아제를 사용하는 경우에는, 기질로서 ABTSJ(2,2'-아지노-비(3'-에틸벤즈티아졸린술폰산))을 사용하고, 알칼리 포스파타아제를 사용하는 경우에는, 기질로서 p-니트로페닐포스페이트를 사용하여, 각 기질의 분해를 분광 광도계 등을 사용해서 측정하는 방법 등에 의할 수 있다.

상기 효소 표지 대신에 방사성 동위 원소, 형광 물질 등을 표지체로서 사용하는 경우도, 당해 표지체의 측정은 당업자에게 잘 알려진 방법에 따라서 실시할 수 있다.

상기 측정계에 있어서 사용되는 용매로서는, 반응에 악영향을 주지 않는 것이라면 일반적으로 사용되는 것을 사용할 수 있다. 구체적으로는 시트르산 버퍼, 인산 버퍼, 트리스 버퍼, 아세트산 버퍼 등의 pH 약 5 내지 9 정도의 버퍼가 적절하게 이용될 수 있다.

면역 반응(결합) 조건도, 특별히 제한되지 않고, 일반적으로 이러한 종류의 측정법에서 사용되는 통상의 조건이 채용될 수 있다. 일반적으로는 45℃ 이하, 바람직하게는 약 4 내지 40℃의 온도 조건 하에서 약 1 내지 40시간 정도 반응시킨다.

본 발명의 방법은, 상기와 같이 해서 측정된, 시료에 있어서의 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가를, WT1 펩티드 면역요법에 있어서의 임상 효과를 예측하기 위한 임상 지표로 하는 것을 최대의 특징으로 한다.

특히, 본 발명자들은, WT1 펩티드 면역요법을 받고 있는 피험자에서는, 투여된 WT1 펩티드에 대하여 항 WT1 펩티드 IgG 항체가 산생되어, 어떤 시점에서의 항 WT1 펩티드 IgG 항체가와 임상 효과에 상관 관계가 있음을 알아내었다. 즉, 투여된 WT1 펩티드에 대응하는 WT1 항원 펩티드 또는 그의 변이체를 사용하여 측정된 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가가, WT1 펩티드 면역요법에 있어서의 임상 효과의 예측에 유효한 지표가 되는 것을 알아내었다. 또한, 본 발명자들은, 산생된 항 WT1 펩티드 IgG 항체의 서브클래스를 해석하여, 비 Th1 타입보다도 Th1 타입 쪽이, WT1 펩티드 면역요법에 있어서의 임상 효과가 양호한 것을 알아내었다. 또한, 본 발명자들은, Th1 타입을 더욱 상세하게 해석하여, IgG1 타입 및 IgG3 타입보다도 IgG1 & IgG3 타입 쪽이, WT1 펩티드 면역요법에 있어서의 임상 효과가 양호한 것을 알아내었다.

용어 「Th1 타입」이란, Th1 타입 서브클래스인 IgG1 항체 또는 IgG3 항체가, Th2 타입 서브클래스인 IgG4 항체의 2배 이상인 것을 가리킨다. 즉, 「Th1 타입」이란, 하기 식 (I) 또는 식 (II)를 만족시키는 경우를 말한다.

(I) 항 WT1 항원 펩티드 IgG1 항체가/항 WT1 항원 펩티드 IgG4 항체가≥2.0

(II) 항 WT1 항원 펩티드 IgG3 항체가/항 WT1 항원 펩티드 IgG4항체가≥2.0

용어 「비 Th1 타입」이란, 상기 식 (I) 및 식 (II) 모두 만족하지 않는 경우를 말한다.

용어 「IgG1 타입」이란, Th1 타입 중, IgG1 항체가 IgG3 항체의 2배 이상인 것을 가리킨다. 즉, Th1 타입 중, 하기 식 (III)을 만족시키는 경우를 말한다.

(III) 항 WT1 항원 펩티드 IgG1 항체가/항 WT1 항원 펩티드 IgG3 항체가≥2.0

용어 「IgG3 타입」이란, Th1 타입 중, IgG3 항체가 IgG1 항체의 2배 이상인 것을 가리킨다. 즉, Th1 타입 중, 하기 식 (IV)를 만족시키는 경우를 말한다.

(IV) 항 WT1 항원 펩티드 IgG3 항체가/항 WT1 항원 펩티드 IgG1 항체가≥2.0

용어 「IgG1 & IgG3 타입」이란, Th1 타입 중, 상기 식 (III) 및 식 (IV) 모두 만족하지 않는 경우를 말한다.

또 다른 형태에 있어서, 본 발명은 WT1 항원 펩티드를 포함하는, 본 발명의 방법을 실시하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는, WT1 항원 펩티드를 유효 성분으로서 포함하고, 해당 WT1 항원 펩티드는 측정 대상인 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체와 항원 항체 반응하는 것이다. 또한, 이러한 키트는, 본 발명의 방법에 있어서의 측정계에 이용되는 항체 검출 시약 등의 임의의 시약을 포함해도 된다. 또한, 측정의 실시를 간편하게 하기 위한 적당한 시약, 예를 들어 항체 희석액, 반응 희석액, 버퍼, 세정제, 표지체 검출 시약 등을 포함해도 된다. 또한, 본 발명의 방법의 실행에 필요한 설명서 등의 자재를 포함해도 된다. 상기 키트는, 바람직하게는 면역학적 측정법에 기초하여 IgG 항체가를 측정하는 것이다. 보다 바람직하게는, 상기 키트는 ELISA에 기초하여 IgG 항체가를 측정하는 것이다. 이러한 키트를 위해서, 상술되는 WT1 항원 펩티드의 변이체를 사용해도 된다. 또한, WT1 항원 펩티드 또는 그의 변이체를 구성하는 아미노산 중 어느 하나의 아미노산이 적절히 수식된 것이어도 된다. 아미노산 잔기의 수식은, 공지된 방법으로 실시할 수 있다.

이하에 실시예를 나타내서 본 발명을 구체적이면서 더욱 상세하게 설명하는데, 실시예는 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1

WT1 항원 펩티드의 합성

표 1-1 및 표 1-2에 나타내는 WT1 항원 펩티드를, 가부시끼가이샤 피에이치재팬에서 합성하였다. 표 1-1 및 표 1-2에서, 개시 부위 및 종료 부위란, 야생형 인간 WT1 단백질의 아미노산 서열(서열 번호 1)에 있어서의 대응하는 아미노산 잔기의 위치를 나타낸다.

[표 1-1]

[표 1-2]

실시예 2

재발 악성 신경 교종( GBM ) 환자에 있어서의 WT1 펩티드 백신 투여 후의 항 WT1 항원 펩티드 항체가와 임상 효과

본 발명자들은, GBM 환자에 대해서, WT1 펩티드 백신 투여 후의 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가와 임상 효과의 관계를 확인하기 위해서, 이하의 검토를 행하였다.

1. 재료 및 방법

1-1 GBM 환자 72명을 대상으로, WT1₂₃₅ 펩티드(WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243)(서열 번호 3))를 WT1 펩티드 백신으로 해서, WT1 펩티드 면역요법을 실시하였다. 3mg의 WT1₂₃₅ 펩티드(WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243))를 불완전 아쥬반트인 몬타나이드 ISA51과 중량비 1:1로 혼합하여, 에멀전을 제조하였다. 이 에멀전을 일주일마다 1회, 피내 투여에 의해 12주일 투여하였다. 백신 투여 전 및 투여 후의 소정의 시기에 환자로부터 채혈하여, 원심 분리에 의해 혈청을 얻었다. 얻어진 혈청은 -80℃ 이하에서 동결 보존하고, 측정시에 융해해서 사용하였다. 또한, 효과가 나타난 경우에는, 12주일을 초과하여, 2 내지 4주마다 WT1 펩티드 백신의 투여를 계속하였다.

1-2 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체(항 WT1₂₃₅ 펩티드 IgG 항체)의 측정(ELISA)

저면에 아미노기가 표출한 펩티드 코팅 키트(TaKaRa) 부속 96 웰 리액션 플레이트에, 펩티드 코팅 키트 부속 리액션 버퍼에 용해한 WT1-235 펩티드 용액(4μg/mL)을 1웰당 50μL 첨가하였다. 커플링 시약을 1웰당 30μL 첨가하고, 실온에서 2시간 반응시켰다. 증류수로 세정하고, 항원을 고상화하였다. 블로킹 원(나카라이 테스크)을 사용하여, 실온에서 2시간 진탕시킴으로써, 블로킹을 행하였다. 계속해서, 0.05％ TBST(40mM 트리스, 0.15M 염화나트륨, 0.05％ 트윈(Tween)-20, pH8.0)로 세정하였다. 그 후, 펩티드 코팅 키트 부속 블로킹 액으로 100배 희석한 혈청을, 1웰당 100μL 넣었다. 4℃에서 밤새 반응시켰다. 0.05％ TBST로 세정한 후, 2차 항체와 실온에서 2시간 반응시켰다. 2차 항체로서, 펩티드 코팅 키트 부속 블로킹 액으로 1000배 희석한 퍼옥시다아제 표지 토끼 항 인간 IgG 항체(sc-2769, 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology), 400μg/mL)를 사용하였다. 계속해서, 0.05％ TBST로 세정하였다. 그 후, 3차 항체와 실온에서 2시간 반응시켰다. 3차 항체로서, 0.05％ TBST로 1000배 희석한 퍼옥시다아제 표지 항 염소 항 토끼 IgG 항체(sc-2004, 산타 크루즈 바이오테크놀로지, 400μg/mL)를 사용하였다. 0.05％ TBST로 세정한 후, TMB 키트(KPL)를 사용해서 발색시켰다. 1N HCl로 반응을 정지시킨 후, 마이크로플레이트 리더(코로나 일렉트릭(CORONA ELECTRIC) MTP-310Lab)를 사용하여, 450nm의 흡광도를 측정하였다.

또한, 본 발명자들은, 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체 레벨의 상승에 의해 검출되는 WT1 특이적 면역 응답의 유도가 Th1 타입인 것인지 비 Th1 타입인 것인지를 확인하기 위해서, 이하의 방법에 의해, 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체의 IgG 서브클래스를 해석하였다.

1-3 WT1-235 펩티드에 대한 IgG1, IgG3 및 IgG4의 측정(ELISA)

상기 1-2와 마찬가지의 방법으로 ELISA를 행하였다. 2차 항체로서, 각각, 퍼옥시다아제 표지 마우스 항 인간 IgG1(#9052-05 마우스 mAb 클론 4E3, 서던 바이오테크(Southern Biotech)), 퍼옥시다아제 표지 마우스 항 인간 IgG3(#9210-05 마우스 mAb 클론 HP6050, 서던 바이오테크) 또는 퍼옥시다아제 표지 마우스 항 인간 IgG4 항체(#9190-05 마우스 mAb 클론 HP6023, 서던 바이오테크)를 사용하였다. 퍼옥시다아제 표지 마우스 항 인간 IgG1 및 퍼옥시다아제 표지 마우스 항 인간 IgG4는 펩티드 코팅 키트 부속 블로킹 액으로 2000배 희석하고, 퍼옥시다아제 표지 마우스 항 인간 IgG3은 펩티드 코팅 키트 부속 블로킹 액으로 1000배 희석해서 사용하였다. 또한, 3차 항체로서, 0.05％ TBST로 2500배 희석한 퍼옥시다아제 표지 항 염소 항 마우스 IgG 항체(프로메가(Promega), W4028, 1mg/mL)를 사용하였다.

2. 통계학적 해석

2군간의 비교는 만·위트니 검정을 사용해서 행하였다. 레스폰더 군, 논레스폰더 군에 있어서의 항 WT1 항원 펩티드 항체 상승률의 차이에 대하여, 2 방향의 요인의 관련성의 검정을 피셔의 직접 확률 계산법을 사용해서 행하였다. 또한, WT1 펩티드 백신 계속률, 무진행 생존율 및 전체 생존율의 비교를, 로그 랭크 검정을 사용해서 행하였다. 또한, 항 WT1 항원 펩티드 항체가 음성인 혈청(WT1 펩티드 면역요법 개시 전의 환자 혈청)을 사용해서 항 WT1 항원 펩티드 항체가를 측정한 결과, 평균값+표준 편차의 2배=0.045이었다. 이것으로부터, (1) WT1 백신 투여 후의 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가가 0.05 이상으로 된 경우, 또는 (2) WT1 백신 투여 전과 비교해서 WT1 백신 투여 후의 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가가 0.05 이상 증가한 경우를, 「항 WT1 항원 펩티드 항체가가 상승했다」라고 정의하였다.

3. 결과

(I) 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가(항 WT1₂₃₅ 펩티드 IgG 항체가)의 상승과 임상 효과

(i) 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가의 추이(도 1)

WT1₂₃₅ 펩티드 백신(WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243)) 투여 후의 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가를 나타내는 그래프를 도 1에 도시한다. WT1₂₃₅ 펩티드 백신(WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243)) 투여 전과 비교하여, 투여 후의 일수의 경과(치료의 경과)에 수반하여, 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가가 상승하였다. 투여 2개월 후 및 3개월 후에는, 투여 전에 비해 항체가가 유의미하게 상승하였다.

(ii) 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가의 상승과 전체 생존율(도 2 및 도 3)

WT1₂₃₅ 펩티드 백신(WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243)) 투여 후의 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가의 상승과, 전체 생존율의 관계를 나타내는 그래프를 도 2 및 도 3에 도시한다. 관찰 기간 중, 투여 8 내지 9주 후의 항체가를 지표로 한 경우(도 2), 및 12 내지 14주 후의 항체가를 지표로 한 경우(도 3) 모두, 항체가 상승군이 항체가 비상승군에 비해 유의미하게 높은 전체 생존율을 나타냈다. 또한, 투여 8 내지 9주 후보다도 투여 12 내지 14주 후의 항체가를 지표로 한 경우가, 항체가 상승군과 항체가 비상승군의 사이의 차가 보다 더 명확하였다.

(iii) 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가의 상승과 무진행 생존율(도 4 및 도 5)

WT1₂₃₅ 펩티드 백신(WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243)) 투여 후의 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가의 상승과, 무진행 생존율의 관계를 나타내는 그래프를 도 4 및 도 5에 도시한다. 관찰 기간 중, 투여 8 내지 9주 후의 항체가를 지표로 한 경우에는, 항체가 상승군이 항체가 비상승군에 비해, 더 높은 무진행 생존율을 나타내는 경향이 나타났다(도 4). 투여 12 내지 14주 후의 항체가를 지표로 한 경우에는, 항체가 상승군이 항체가 비상승군에 비해 유의미하게 높은 무진행 생존율을 나타냈다(도 5).

(iv) 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가의 상승과 WT1 펩티드 백신 투여 계속률(도 6 및 도 7)

WT1₂₃₅ 펩티드 백신(WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243)) 투여 후의 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가의 상승과, WT1 펩티드 백신 투여 계속률의 관계를 나타내는 그래프를 도 6 및 도 7에 나타내었다. 관찰 기간 중, 투여 8 내지 9주 후의 항체가를 지표로 한 경우에는, 항체가 상승군이 항체가 비상승군에 비해 더 높은 백신 투여 계속률을 나타내는 경향이 나타났다(도 6). 투여 12 내지 14주 후의 항체가를 지표로 한 경우에는, 항체가 상승군이 항체가 비상승군에 비해 유의미하게 높은 백신 투여 계속률을 나타냈다(도 7).

(II) 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체(항 WT1₂₃₅ 펩티드 IgG 항체)의 타입(Th1 타입/비 Th1 타입)과 임상 효과

(i) Th1 타입/비 Th1 타입과 전체 생존율(도 8)

WT1₂₃₅ 펩티드 백신(WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243)) 투여 12 내지 14주 후의 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가를 지표로 한 경우에 있어서의, Th1 타입/비 Th1 타입 각각의 전체 생존율을 도 8에 나타내었다. 관찰 기간 중, Th1 타입이 비 Th1 타입에 비해, 더 높은 전체 생존율을 나타내는 경향이 나타났다.

(ii) Th1 타입/비 Th1 타입과 무진행 생존율(도 9)

WT1₂₃₅ 펩티드 백신(WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243)) 투여 12 내지 14주 후의 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가를 지표로 한 경우에 있어서의, Th1 타입/비 Th1 타입 각각의 무진행 생존율을 도 9에 나타내었다. 관찰 기간 중, Th1 타입이 비 Th1 타입에 비해, 더 높은 무진행 생존율을 나타내는 경향이 나타났다.

(iii) Th1 타입/비 Th1 타입과 WT1 펩티드 백신 투여 계속률(도 10)

WT1₂₃₅ 펩티드 백신(WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243)) 투여 12 내지 14주 후의 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가를 지표로 한 경우에 있어서의, Th1 타입/비 Th1 타입 각각의 WT1 펩티드 백신 투여 계속률을 도 10에 도시한다. 관찰 기간 중, Th1 타입이 비 Th1 타입에 비해, 유의미하게 높은 백신 투여 계속률을 나타냈다(도 10).

(III) IgG 서브클래스의 해석

(i) 항 WT1-235 펩티드 IgG 서브클래스 항체가의 상승과 전체 생존율(도 11)

WT1₂₃₅ 펩티드 백신(WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243)) 투여 12 내지 14주 후의 항체가를 지표로 한 경우에 있어서의, IgG1 타입/IgG3 타입/IgG1 & IgG3 타입 각각의 전체 생존율을 도 11에 도시한다. 관찰 기간 중, IgG1 & IgG3 타입이 유의미하게 높은 전체 생존율을 나타냈다.

(ii) 항 WT1-235 펩티드 IgG 서브클래스 항체가의 상승과 무진행 생존율(도 12)

WT1₂₃₅ 펩티드 백신(WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243)) 투여 12 내지 14주 후의 항체가를 지표로 한 경우에 있어서의, IgG1 타입/IgG3 타입/IgG1 & IgG3 타입 각각의 무진행 생존율을 도 12에 나타내었다. 관찰 기간 중, IgG1 & IgG3 타입이 더 높은 무진행 생존율을 나타내는 경향이 나타났다.

(iii) 항 WT1-235 펩티드 IgG 서브클래스 항체가의 상승과 WT1 펩티드 백신 투여 계속률(도 13)

WT1₂₃₅ 펩티드 백신(WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243)) 투여 12 내지 14주 후의 항체가를 지표로 한 경우에 있어서의, IgG1 타입/IgG3 타입/IgG1 & IgG3 타입 각각의 WT1 펩티드 백신 투여 계속률을 도 13에 나타내었다. 관찰 기간 중, IgG1 & IgG3 타입이 유의미하게 높은 WT1 펩티드 백신 투여 계속률을 나타냈다.

실시예 3

재발 악성 신경 교종( GBM ) 환자에 있어서의 WT1 펩티드 백신 및 WT1 헬퍼 펩티드 백신 병용 투여 후의 항 WT1 항원 펩티드 항체가와 임상 효과

본 발명자들은, GBM 환자에 대해서, WT1 펩티드 백신 및 헬퍼 펩티드 백신 병용 투여 후의 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가와 임상 효과의 관계를 확인하기 위해서, 이하의 검토를 행하였다.

1. 재료 및 방법

1-1 GBM 환자 15명을 대상으로, WT1 펩티드 백신으로서 WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243)(서열 번호 3)를, 헬퍼 펩티드 백신으로서 WT1₃₃₂ 펩티드(서열 번호 6)를 사용하여, WT1 펩티드 면역 요법을 실시하였다. WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243)는 3mg/body로, 일주일마다 1회 피내 투여에 의해 총 5회 투여하였다. WT1₃₃₂ 헬퍼 펩티드는, 0.75mg(n=7), 1.5mg(n=4) 또는 3mg(n=4)으로, 용량 증가(dose escalation)를 행하여, 2주일마다 1회 피내 투여에 의해 총 3회 투여하였다. 또한, WT1 헬퍼 펩티드 백신의 투여는, WT1-CTL 펩티드와 혼합해서 투여되었다. 백신 투여 전 및 투여 후의 소정의 시기에 환자로부터 채혈하여, 원심 분리에 의해 혈청을 얻었다. 얻어진 혈청은 -80℃ 이하에서 동결 보존하고, 측정시에 융해해서 사용하였다. 또한, 효과가 나타난 경우에는, 그 후 2 내지 4주일마다, WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243)의 단독 투여, 및 WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243) 및 WT1₃₃₂ 헬퍼 펩티드의 병용 투여를 교대로 반복하였다.

1-2 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체(항 WT1₂₃₅ 펩티드 IgG 항체) 및 항 WT1-325 펩티드 IgG 항체(항 WT1₃₃₂ 펩티드 IgG 항체)의 측정(ELISA)

실시예 2와 마찬가지의 방법으로 항체가를 측정하였다. 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체를 측정할 때는, WT1 항원 펩티드로서 WT1-235 펩티드를, 항 WT1-325 펩티드 IgG 항체를 측정할 때는, WT1 항원 펩티드로서 WT1-325 펩티드를 각각 사용하였다. WT1-325 펩티드는, 투여한 WT1₃₃₂ 펩티드의 일부분(1 내지 11번째의 아미노산)을 포함하는 펩티드이다. 따라서, 항 WT1-325 펩티드 IgG 항체의 측정은, 투여한 WT1₃₃₂ 펩티드에 대한 항체(항 WT1₃₃₂ 펩티드 IgG 항체)의 측정을 의미한다.

2. 통계학적 해석

실시예 2와 마찬가지의 방법으로 통계학적 해석을 행하였다. 또한, 임상 시험 탈락 증례수(0.75mg 투여군 중 3예 및 3mg 투여군 중 1예)를 제외한 11예에 관한 해석을 행하였다. 또한, 실시예 2와 마찬가지로, (1) WT1 백신 투여 후의 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가가 0.05 이상으로 된 경우, 또는 (2) WT1 백신 투여 전과 비교해서 WT1 백신 투여 후의 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가가 0.05 이상 증가한 경우를, 「항 WT1 항원 펩티드 항체가가 상승했다」라고 정의하였다.

3. 결과

(i) 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가의 상승과 WT1 펩티드 백신 투여 계속률(도 14)

WT1₂₃₅ 펩티드 백신(WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243)) 및 WT1₃₃₂(헬퍼) 펩티드 백신 병용 투여 4 내지 8주 후의 항체가를 지표로 한 경우에 있어서의, 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가 상승군/비상승군 각각의 WT1 펩티드 백신 투여 계속률을 도 14에 도시한다. 관찰 기간 중, 항체가 상승군이 비상승군에 비해, 더 높은 WT1 펩티드 백신 투여 계속률을 나타내는 경향이 나타났다.

(II) 항 WT1-325 펩티드 IgG 항체가(항 WT1₃₃₂ 펩티드 IgG 항체가)의 상승과 임상 효과

(i) 항 WT1-325 펩티드 IgG 항체가의 상승과 WT1 펩티드 백신 투여 계속률(도 15)

WT1₂₃₅ 펩티드 백신(WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243)) 및 WT1₃₃₂(헬퍼) 펩티드 백신 병용 투여 4 내지 8주 후의 항체가를 지표로 한 경우에 있어서의, 항 WT1-325 펩티드 IgG 항체가 상승군/비상승군 각각의 WT1 펩티드 백신 투여 계속률을 도 15에 도시한다. 관찰 기간 중, 상승군이 비상승군에 비해, 더 높은 WT1 펩티드 백신 투여 계속률을 나타내는 경향이 나타났다.

실시예 4

재발 악성 신경 교종( GBM ) 환자에 있어서의 WT1 헬퍼 펩티드 백신 투여 후의 항 WT1 항원 펩티드 항체가와 임상 효과

본 발명자들은 또한, GBM 환자에 대해서, WT1 헬퍼 펩티드 백신 투여 후의 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가와 임상 효과의 관계를 확인하기 위해서, 이하의 검토를 행하였다.

1. 재료 및 방법

1-1 GBM 환자 14명을 대상으로, WT1 헬퍼 펩티드 백신으로서 WT1₃₃₂ 펩티드를 사용하여, WT1 펩티드 면역요법을 실시하였다. 0.75mg(n=4), 1.5mg(n=4), 3mg(n=6) 중 어느 하나의 WT1₃₃₂ 펩티드를 불완전 아쥬반트인 몬타나이드 ISA51과 중량비 1:1로 혼합하여, 에멀전을 제조하였다. 이 에멀전을 2주일마다 1회 피내 투여에 의해 총 3회 투여하였다. 백신 투여 전 및 투여 후의 소정의 시기에 환자로부터 채혈하여, 원심 분리에 의해 혈청을 얻었다. 얻어진 혈청은 -80℃ 이하에서 동결 보존하고, 측정시에 융해해서 사용하였다. 또한, 효과가 나타난 경우에는, 그 후 2 내지 4주일마다 WT1₃₃₂ 헬퍼 펩티드의 투여를 계속하였다.

1-2 항 WT1-325 펩티드 IgG 항체(항 WT1₃₃₂ 펩티드 IgG 항체)의 측정(ELISA)

실시예 2와 마찬가지의 방법으로 항체가를 측정하였다. WT1 항원 펩티드로서 WT1-325 펩티드를 사용하였다. WT1-325 펩티드는, 투여한 WT1₃₃₂ 펩티드의 일부분(1 내지 11번째의 아미노산)을 포함하는 펩티드이다. 따라서, 항 WT1-325 펩티드 IgG 항체의 측정은, 투여한 WT1₃₃₂ 펩티드에 대한 항체(항 WT1₃₃₂ 펩티드 IgG 항체)의 측정을 의미한다.

2. 통계학적 해석

실시예 2와 마찬가지의 방법으로 통계학적 해석을 행하였다. 또한, 임상 시험 탈락 증례수(1.5mg 투여군 중 2예 및 3mg 투여군 중 4예)를 제외한 8예에 관한 해석을 행하였다. 또한, 실시예 2와 마찬가지로, (1) WT1 백신 투여 후의 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가가 0.05 이상이 된 경우, 또는 (2) WT1 백신 투여 전과 비교해서 WT1 백신 투여 후의 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가가 0.05 이상 증가한 경우를, 「항 WT1 항원 펩티드 항체가가 상승했다」라고 정의하였다.

3. 결과

(I) 항 WT1-325 펩티드 IgG 항체가(항 WT1₃₃₂ 펩티드 IgG 항체가)의 상승과 임상 효과

(i) 항 WT1-325 펩티드 IgG 항체가의 상승과 WT1 펩티드 백신 투여 계속률(도 16)

WT1₃₃₂(헬퍼) 펩티드 백신 투여 12 내지 14주 후의 항체가를 지표로 한 경우에 있어서의, 항 WT1-325 펩티드 IgG 항체가 상승군/비상승군 각각의 WT1 펩티드 백신 투여 계속률을 도 16에 나타내었다. 관찰 기간 중, 상승군이 비상승군에 비해, 더 높은 WT1 펩티드 백신 투여 계속률을 나타내는 경향이 나타났다.

실시예 5

흉선암 환자에 있어서의 WT1 펩티드 백신 투여 후의 항 WT1 항원 펩티드 항체가와 임상 효과

본 발명자들은 흉선암 환자에 대해서, 마찬가지로, WT1 펩티드 백신 투여 후의 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가와 임상 효과의 관계를 확인하기 위해서, 이하의 검토를 행하였다.

1. 재료 및 방법

1-1 흉선암 환자 10명을 대상으로, 실시예 2와 마찬가지로, WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243)(서열 번호 3)를 WT1 펩티드 백신으로 해서, WT1 펩티드 면역요법을 실시하였다. 백신 투여 전 및 투여 후의 소정의 시기에 환자로부터 채혈하여, 원심 분리에 의해 혈청을 얻었다. 실시예 2와 마찬가지의 방법(ELISA)으로, 얻어진 혈청 중에 포함되는 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가를 측정하였다.

2. 통계학적 해석

실시예 2와 마찬가지의 방법으로 통계학적 해석을 행하였다. 또한, 실시예 2와 마찬가지로, (1) WT1 백신 투여 후의 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가가 0.05 이상이 된 경우, 또는 (2) WT1 백신 투여 전과 비교해서 WT1 백신 투여 후의 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가가 0.05 이상 증가한 경우를, 「항 WT1 항원 펩티드 항체가가 상승했다」라고 정의하였다.

3. 결과

(i) 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가의 상승과 WT1 펩티드 백신 투여 계속률(도 17)

WT1₂₃₅ 펩티드 백신(WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243)) 투여 12 내지 14주 후의 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가를 지표로 한 경우에 있어서의, 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가 상승군/비상승군 각각의 WT1 펩티드 백신 투여 계속률을 도 17에 나타내었다. 관찰 기간 중, 항체가 상승군이 항체가 비상승군에 비해, 더 높은 백신 투여 계속률을 나타내는 경향이 나타났다(도 17).

고찰

WT1₂₃₅ 펩티드(WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243))를 사용한 WT1 펩티드 면역요법에 있어서, WT1₂₃₅ 펩티드 백신의 투여 후에 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체가의 상승이 나타난 군이 양호한 임상 효과를 나타내는 것을 알았다. 또한 이것은, 백신 투여로부터 8 내지 9주 후의 항체가 및 백신 투여로부터 12 내지 14주 후의 항체가 중 어디에도 적합한 것이었다. 그 중에서도, 백신 투여로부터 12 내지 14주 후의 항체가에 기초하는 경우, 임상 효과와의 상관성이 보다 높은 것을 알았다.

또한, 항 WT1-235 펩티드 IgG 항체 중, IgG4보다도 IgG1 또는 IgG3이 상승하는 군(Th1 타입)이 양호한 임상 효과를 나타내는 것을 알았다. 그 중에서도 또한, IgG1 & IgG3 타입이 보다 양호한 임상 효과를 나타내는 것을 알았다.

또한, WT1₃₃₂ 헬퍼 펩티드를 WT1₂₃₅ 펩티드(WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243)) 백신과 병용 투여한 경우, 또는 WT1₃₃₂ 헬퍼 펩티드를 단독 투여한 경우에도, 마찬가지의 결과가 얻어지는 것을 알았다.

실시예 6

변이형 WT1 항원 펩티드를 사용한 항 WT1 ₃₃₂ 펩티드 IgG 항체의 측정(도 18)

본 발명자들은, 변이형 WT1 항원 펩티드를 사용해도 항 WT1₃₃₂ 펩티드 IgG 항체의 측정이 가능한지를 확인하기 위해서, 이하의 검토를 행하였다.

1. 재료 및 방법

1-1 혈청

WT1₃₃₂ 펩티드 백신(서열 번호 6)을 투여받은 악성 신경 교종의 환자 1명으로부터, 백신 투여 전, 투여 후 4주째, 투여 후 1년 2개월째에 혈청 검체를 얻었다. 음성 대조로서, WT1₂₃₅ 펩티드 백신(WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243)(서열 번호 3))만을 투여받은 흉선 악성 종양의 환자 1명으로부터, 마찬가지로 혈청 검체를 얻었다. 혈청 검체는 측정까지 -20℃에서 보관하였다.

1-2 변이형 WT1 항원 펩티드의 제작

이하의 표에 나타내는 변이형 WT1 항원 펩티드를 제작하였다.

[표 2]

WT332-347(서열 번호 58), WT334-342(서열 번호 59) 및 WT332-338(서열 번호 60)은 GL 바이오켐(GL Biochem)에서 합성하였다. WT1-frg3(서열 번호 57)은 이하의 방법에 의해 제작하였다.

(방법)

WT1-frg3(서열 번호 57)을 GST 태그 부착 단백질로서 발현하는 벡터를, pGEX-5X-3 벡터(GE 헬스케어(GE Healthcare))를 사용해서 구축하였다. 제작한 벡터는, 콤페턴트 셀 DH5α에 히트 쇼크로 도입하였다. 벡터를 도입한 대장균을 배양하여, OD₆₀₀값이 0.4 내지 0.6으로 된 시점에서, 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(IPTG)를 최종 농도 1mM가 되도록 배지에 가하여, 단백 발현을 유도하였다. 또한 3시간 배양하였다. 원심 분리에 의해 집균한 후, SDS 샘플 버퍼(0.125M 트리스-HCl, 0.1M DTT, 4％ SDS, 10％ 수크로오스, 브로모페놀 블루, pH 6.8)로 용해하였다. 이것을 디스크형 전기 영동 장치 NA-1800(일본 에이드)을 사용해서 SDS-PAGE에 의한 분자량 분획을 행하였다. 채취한 각 분획의 일부분을, SDS-PAGE 후, CBB 염색을 행하고, WT1이 포함되어 있는 분획을 회수하였다. 정제한 단백을 ELISA용 고상 버퍼(10mM NaCO₃, 30mM NaHCO₃, 0.02％ NaN₃, pH9.6)에 용해하여, ELISA용의 항원으로서 사용하였다.

1-3 항체가의 측정

1-3-1 WT1-frg3(서열 번호 57)을 사용한 항체가의 측정

ELISA용 96 웰 플레이트에, GST-WT1 frag1 단백 용액(10ng/μL)을 1웰당 100μL 넣었다. 37℃에서 밤새 방치하여 항원을 고상시켰다. 0.05％ TBST로 세정한 후, 블로킹 버퍼(1％ 젤라틴/0.05％ TBST)로 실온 2시간 진탕하여, 블로킹을 행하였다. 그 후, 0.05％ TBST로 100배 희석한 혈청을 1웰당 100μL 넣었다. 4℃에서 밤새 반응시켰다. 2차 항체로서, 퍼옥시다아제 표지 염소 항 인간 IgG 항체(산타 크루즈 바이오테크놀로지)를 실온에서 2시간 반응시켰다. 그 후, TMB 키트(KPL)를 사용해서 발색시켰다. 1N HCl로 반응을 정지시킨 후, 마이크로플레이트 리더(코로나 일렉트릭 MTP-32)를 사용하여, 450nm의 흡광도를 측정하였다.

1-3-2 WT332-347(서열 번호 58), WT334-342(서열 번호 59) 또는 WT332-338(서열 번호 60)을 사용한 항체가의 측정

저면에 아미노기(-NH₂)가 표출된 펩티드 코팅 키트(TaKaRa) 부속 96 웰 리액션 플레이트에, 펩티드 코팅 키트 부속 리액션 버퍼에 용해한 WT1 펩티드 용액(4μg/mL)을 1웰당 50μL 첨가하였다. 커플링 시약을 웰당 30μL 첨가하고, 실온에서 2시간 반응시켰다. 증류수로 세정하고, 항원을 고상화하였다. 블로킹 원(나카라이 테스크)을 사용하여, 실온에서 2시간 진탕시킴으로써, 블로킹을 행하였다. 계속해서, 0.05％ TBST로 세정하였다. 그 후, 펩티드 코팅 키트 부속 블로킹 액으로 100배 희석한 혈청을 1웰당 100μL 넣었다. 4℃에서 밤새 반응시켰다. 0.05％ TBST로 세정한 후, 2차 항체로서, 펩티드 코팅 키트 부속 블로킹 액으로 1000배 희석한 퍼옥시다아제 표지 토끼 항 인간 IgG 항체(sc-2769, 산타 크루즈 바이오테크놀로지, 400μg/mL)를 실온에서 2시간 반응시켰다. 0.05％ TBST로 세정한 후, TMB 키트(KPL)를 사용해서 발색시켰다. 1N HCl로 반응을 정지시킨 후, 마이크로플레이트 리더(코로나 일렉트릭 MTP-310Lab)를 사용하여, 450nm의 흡광도를 측정하였다.

2. 결과

(I) WT1-frg3(서열 번호 57)을 사용한 항체가의 측정

WT1₃₃₂ 펩티드로 면역한 1명의 환자 및 WT1₂₃₅ 펩티드(WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243)(서열 번호 3))만으로 면역한 1명의 환자의, 면역 전 및 면역 후의 시점에서의 혈청 중의 항 WT1₃₃₂IgG 항체가를, WT1-frg3(서열 번호 57)을 항원으로 하는 ELISA로 측정하였다. 그 결과, WT1₃₃₂ 펩티드로 면역한 환자에게서는, 면역 후, 항 WT1₃₃₂IgG 항체가가 상승하였다(도 18). 한편, WT1₃₃₂ 펩티드로 면역을 하지 않은 환자에서는, 항 WT1₃₃₂IgG 항체가는 상승하지 않았다. 이러한 결과로부터, WT1-frg3(서열 번호 57)을 WT1 항원 펩티드로서 사용하는 ELISA에 의해, 환자 혈청 중의 항 WT1₃₃₂IgG 항체 레벨을 측정할 수 있음이 나타났다.

(II) WT332-347(서열 번호 58), WT334-342(서열 번호 59) 또는 WT332-338(서열 번호 60)을 사용한 항체가의 측정

어느 펩티드를 사용한 ELISA에 의한 측정에서도, WT1₃₃₂ 펩티드로 면역한 환자에서는, 면역 후, 항 WT1₃₃₂IgG 항체가가 상승하였다(도 18). 한편, WT1₃₃₂ 펩티드로 면역을 하지 않은 환자에서는, 항 WT1₃₃₂IgG 항체가는 상승하지 않았다. 이러한 결과로부터, WT332-347(서열 번호 58), WT334-342(서열 번호 59) 및 WT332-338(서열 번호 60)을 WT1 항원 펩티드로서 사용하는 ELISA에 의해, 환자 혈청 중의 항 WT1₃₃₂IgG 항체 레벨을 측정할 수 있음이 나타났다.

실시예 7

변이형 WT1 항원 펩티드를 사용한 항 WT1 ₂₃₅ 펩티드 IgG 항체의 측정(도 19)

본 발명자들은, 변이형 WT1 항원 펩티드를 사용해도 항 WT1₂₃₅ 펩티드 IgG 항체의 측정이 가능한지를 확인하기 위해서, 이하의 검토를 행하였다.

1. 재료 및 방법

1-1 혈청

WT1₂₃₅ 펩티드 백신(WT1-CTL 펩티드(개변형 mp235-243)(서열 번호 3))의 투여를 받은 흉선 악성 종양의 환자 1명으로부터, 백신 투여 후 4주째, 투여 후 7개월째에 혈청 검체를 얻었다. 혈청 검체는 측정까지 -20℃에서 보관하였다.

1-2 변이형 WT1 항원 펩티드의 제작

[표 3]

WK235-243(서열 번호 62) 및 WT237-243(서열 번호 63)은 GL 바이오켐에서 합성하였다. WT1-frg2(서열 번호 61)는 상술한 WT1-frg3(서열 번호 57)과 마찬가지의 방법에 의해 제작하였다.

1-3 항체가의 측정

WT1-frg2(서열 번호 61)를 사용한 항체가의 측정은, 상술한 WT1-frg3(서열 번호 57)과 마찬가지의 방법에 의해 행하였다. WK235-243(서열 번호 62) 또는 WT237-243(서열 번호 63)을 사용한 항체가의 측정은, 상술한 WT332-347(서열 번호 58) 등과 마찬가지의 방법에 의해 행하였다.

2. 결과

(I) WT1-frg2(서열 번호 61)을 사용한 항체가의 측정

WT1-frg2(서열 번호 61)를 항원으로 하고, WT1₂₃₅ 펩티드를 투여받은 환자에 있어서의 항 WT1₂₃₅IgG 항체가를 ELISA에 의해 측정하였다. 그 결과, 항 WT1₂₃₅IgG 항체가의 상승이 검출되었다(도 19). 또한, 상술한 실시예에서 사용된 WT1-235 펩티드(WT235-243)를 항원으로서 사용한 경우와 마찬가지의 결과가 나타났다. 이러한 결과로부터, WT1-frg2(서열 번호 61)를 WT1 항원 펩티드로서 사용하는 ELISA에 의해, 환자 혈청 중의 항 WT1₂₃₅IgG 항체 레벨을 측정할 수 있음이 나타났다.

(II) WK235-243(서열 번호 62) 또는 WT237-243(서열 번호 63)을 사용한 항체가의 측정

이들 펩티드를 항원으로서 사용한 경우도, 항 WT1₂₃₅IgG 항체가의 상승이 검출되었다(도 19). 또한, 상술한 실시예에서 사용된 WT1-235 펩티드(WT235-243)를 항원으로서 사용한 경우와 마찬가지의 결과가 나타났다. 이러한 결과로부터, WK235-243(서열 번호 62) 또는 WT237-243(서열 번호 63)을 WT1 항원 펩티드로서 사용하는 ELISA에 의해, 환자 혈청 중의 항 WT1₂₃₅IgG 항체 레벨을 측정할 수 있음이 나타났다.

실시예 8

변이형 WT1 항원 펩티드를 사용한 항 WT1 ₁₂₆ 펩티드 IgG 항체의 측정(도 20)

본 발명자들은, 변이형 WT1 항원 펩티드를 사용해도 항 WT1₁₂₆ 펩티드 IgG 항체의 측정이 가능한지를 확인하기 위해서, 이하의 검토를 행하였다.

1. 재료 및 방법

1-1 혈청

WT1₁₂₆ 펩티드와 항암제의 병용 요법을 받은 췌장암 환자로부터, 백신 투여 전, 투여 후 7개월째에 혈청 검체를 얻었다. 혈청 검체는 측정까지 -20℃에서 보관하였다.

1-2 변이 WT1 항원 펩티드의 제작

[표 4-1]

[표 4-2]

WT126-134(서열 번호 65), WK126-134(서열 번호 66), WT128-134(서열 번호 67), WT126-132(서열 번호 68), WT129-134(서열 번호 69), WT126-131(서열 번호 70) 및 WT126-130(서열 번호 71)은 GL 바이오켐에서 합성하였다. WT1-frg1(서열 번호 64)은 상술한 WT1-frg3(서열 번호 57)과 마찬가지의 방법에 의해 제작하였다.

1-3 항체가의 측정

WT1-frg1(서열 번호 64)을 사용한 항체가의 측정은, 상술한 WT1-frg3(서열 번호 57)과 마찬가지의 방법에 의해 행하였다. WT126-134(서열 번호 65), WK126-134(서열 번호 66), WT128-134(서열 번호 67), WT126-132(서열 번호 68), WT129-134(서열 번호 69), WT126-131(서열 번호 70) 또는 WT126-130(서열 번호 71)을 사용한 항체가의 측정은, 상술한 WT332-347(서열 번호 58) 등과 마찬가지의 방법에 의해 행하였다.

2. 결과

(I) WT1-frg1(서열 번호 64)을 사용한 항체가의 측정

WT1-frg1(서열 번호 64)을 항원으로 하여, WT1₁₂₆ 펩티드를 투여받은 환자에 있어서의 항 WT1₁₂₆IgG 항체가를 ELISA에 의해 측정하였다. 그 결과, 백신 투여 후에 항 WT1₁₂₆IgG 항체가의 상승이 검출되었다(도 20). 이러한 결과로부터, WT1-frg1(서열 번호 64)을 WT1 항원 펩티드로서 사용하는 ELISA에 의해, 환자 혈청 중의 항 WT1₁₂₆IgG 항체 레벨을 측정할 수 있음이 나타났다.

(II) WT126-134(서열 번호 65), WK126-134(서열 번호 66), WT128-134(서열 번호 67), WT126-132(서열 번호 68), WT129-134(서열 번호 69), WT126-131(서열 번호 70) 또는 WT126-130(서열 번호 71)을 사용한 항체가의 측정

이들 펩티드를 항원으로서 사용한 경우도, 백신 투여 후에 항 WT1₁₂₆IgG 항체가의 상승이 검출되었다(도 20). 이러한 결과로부터, 상기 펩티드를 WT1 항원 펩티드로서 사용하는 ELISA에 의해, 환자 혈청 중의 항 WT1₁₂₆IgG 항체 레벨을 측정할 수 있음이 나타났다.

이상에서, WT1 펩티드 백신 투여 후에, 투여된 WT1 펩티드 백신에 대응하는 WT1 항원 펩티드를 사용해서 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체의 항체가를 측정함으로써, WT1 백신 요법의 임상 효과를 예측하는 것이 가능한 것으로 나타났다. 또한, IgG 항체를 서브클래스(IgG1, IgG3 및 IgG4)별로 측정함으로써, 더 정밀도가 높은 예측이 가능한 것으로 나타났다. 또한, 변이형 WT1 항원 펩티드를 사용해도 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체의 항체가를 측정할 수 있고, 마찬가지로 WT1 백신 요법의 임상 효과를 예측하는 것이 가능한 것으로 나타났다.

본 발명에 따르면, WT1 백신 요법에 있어서의 임상 효과를 예측하는, 더 정밀도가 높은 예측 방법의 제공이 가능해진다. 피검체에 있어서의 항 WT1 항원 펩티드 항체를 측정하고, 그 값을 지표로 함으로써 더 정밀도가 높은 예측을 행할 수 있다. 따라서, 본 발명은 WT1 관련 질환 환자에 대한 WT1 백신 요법의 시비에 관한 검사, 그 임상 효과의 예측에 있어서 이용 가능하다.

SEQUENCE LISTING <110> International Institute of Cancer Immunology, Inc. <120> Methods for predicting clinical effects in immunotherapy <130> 671938 <150> JP 2013-101566 <151> 2013-05-13 <160> 71 <210> 1 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro 1 5 10 15 Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala 20 25 30 Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr 35 40 45 Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro 50 55 60 Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly 65 70 75 80 Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe 85 90 95 Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe 100 105 110 Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe 115 120 125 Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile 130 135 140 Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr 145 150 155 160 Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe 165 170 175 Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln 180 185 190 Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser 195 200 205 Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp 210 215 220 Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln 225 230 235 240 Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser 245 250 255 Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu 260 265 270 Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile 275 280 285 His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro 290 295 300 Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys 305 310 315 320 Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys 325 330 335 Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro 340 345 350 Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp 355 360 365 Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln 370 375 380 Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr 385 390 395 400 His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys 405 410 415 Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val 420 425 430 Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala 435 440 445 Leu <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 2 Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 3 Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 4 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 5 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val 1 5 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 6 Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His 1 5 10 15 <210> 7 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 7 Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro 1 5 10 15 Ser Leu <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 8 Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala 1 5 10 15 Leu Pro <210> 9 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 9 Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp 1 5 10 15 Ala Pro <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 10 Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro 1 5 10 15 Gly Ala <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 11 Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly 1 5 10 15 GlyPro <210> 12 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 12 Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro 1 5 10 15 Pro Pro <210> 13 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 13 Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser 1 5 10 15 Phe Ile <210> 14 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 14 Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly 1 5 10 15 Gly Ala <210> 15 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 15 Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys 1 5 10 15 Leu Ser <210> 16 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 16 Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser 1 5 10 15 Gly Gln <210> 17 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 17 Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala 1 5 10 15 Cys Arg <210> 18 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 18 Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro 1 5 10 15 Pro Pro <210> 19 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 19 Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln 1 5 10 15 Ala Arg <210> 20 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 20 Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr 1 5 10 15 Leu Pro <210> 21 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 21 Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro 1 5 10 15 Ala Ile <210> 22 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 22 Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr 1 5 10 15 Val Thr <210> 23 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 23 Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Gly His <210> 24 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 24 Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala 1 5 10 15 Gln Phe <210> 25 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 25 Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His 1 5 10 15 Glu Asp <210> 26 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 26 Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser 1 5 10 15 Leu Gly <210> 27 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 27 Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro 1 5 10 15 Pro Pro <210> 28 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 28 Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala 1 5 10 15 Leu Leu <210> 29 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 29 Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser 1 5 10 15 Asp Asn <210> 30 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 30 Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln 1 5 10 15 Leu Glu <210> 31 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 31 Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met 1 5 10 15 Asn Leu <210> 32 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 32 Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val 1 5 10 15 Ala Ala <210> 33 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 33 Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys 1 5 10 15 Trp Thr <210> 34 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 34 Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser 1 5 10 15 Thr Gly <210> 35 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 35 Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr 1 5 10 15 Thr Pro <210> 36 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 36 Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr 1 5 10 15 Arg Ile <210> 37 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 37 Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg 1 5 10 15 Gly Ile <210> 38 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 38 His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro 1 5 10 15 Gly Val <210> 39 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 39 Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser 1 5 10 15 Ala Ser <210> 40 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 40 Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro 1 5 10 15 Phe Met <210> 41 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 41 Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn 1 5 10 15 Lys Arg <210> 42 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 42 Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu 1 5 10 15 Gln Met <210> 43 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 43 Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly 1 5 10 15 Glu Lys <210> 44 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 44 His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys 1 5 10 15 Asp Cys <210> 45 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 45 Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser 1 5 10 15 Asp Gln <210> 46 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 46 Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg 1 5 10 15 His Thr <210> 47 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 47 Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys Thr <210> 48 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 48 Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg 1 5 10 15 Ser Asp <210> 49 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 49 Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg 1 5 10 15 Thr His <210> 50 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 50 His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys 1 5 10 15 Pro Phe <210> 51 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 51 Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys 1 5 10 15 Gln Lys <210> 52 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 52 Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu 1 5 10 15 Leu Val <210> 53 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 53 Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met His Gln 1 5 10 15 Arg Asn <210> 54 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 54 Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala 1 5 10 15 Leu <210> 55 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 55 Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser 1 5 10 15 Asp Asn <210> 56 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 56 Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg 1 5 10 15 Trp Pro <210> 57 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 57 Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg 1 5 10 15 Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly 20 25 30 Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser 35 40 45 Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys 50 55 60 Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His 65 70 75 80 Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro 85 90 95 Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp 100 105 110 Glu Leu Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu 115 120 125 Gln Leu Ala Leu 130 <210> 58 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 58 Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His 1 5 10 15 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 59 Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met 1 5 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 60 Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser 1 5 <210> 61 <211> 145 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 61 Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val 1 5 10 15 Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly 20 25 30 Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr 35 40 45 Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu 50 55 60 Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys 65 70 75 80 Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn 85 90 95 His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His 100 105 110 Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala 115 120 125 Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe 130 135 140 Met 145 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 62 Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Lys 1 5 <210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 63 Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu 1 5 <210> 64 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 64 Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro 1 5 10 15 Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala 20 25 30 Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr 35 40 45 Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro 50 55 60 Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly 65 70 75 80 Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe 85 90 95 Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe 100 105 110 Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe 115 120 125 Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile 130 135 140 Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr 145 150 155 160 Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe 165 170 175 Lys His Glu Asp Pro Met 180 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 65 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 66 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Lys 1 5 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 67 Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 68 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 68 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro 1 5 <210> 69 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 69 Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 70 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 70 Arg Met Phe Pro Asn Ala 1 5 <210> 71 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 71 Arg Met Phe Pro Asn 1 5

Claims

이하의 공정:
a) 피험자 유래의 시료를, WT1 항원 펩티드 또는 그의 변이체와 접촉시키는 공정; 및
b) 상기 시료와 상기 WT1 항원 펩티드 또는 그의 변이체와의 결합을 검출하고, 그것에 의해 상기 시료 중에 존재하는 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가를 측정하는 공정
을 포함하는, WT1 펩티드 면역요법에 있어서의 피험자에 대한 임상 효과를 예측하기 위한 방법이며,
피험자에 있어서의 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가가 상승하고 있는 것이, 임상 효과가 양호하다고 판정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 측정되는 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체의 서브클래스가 IgG1, IgG3 및 IgG4이며, IgG1 및 IgG3이 각각 IgG4의 2배 이상인 것이, 임상 효과가 양호하다고 판정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, IgG1이 IgG3의 2배 미만이고, 또한 IgG3이 IgG1의 2배 미만인 것이, 임상 효과가 양호하다고 판정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, WT1 펩티드 백신 투여로부터 8 내지 14주 후의 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가가 측정되는 방법.
제4항에 있어서, WT1 펩티드 백신 투여로부터 12 내지 14주 후의 항 WT1 항원 펩티드 IgG 항체가가 측정되는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 피험자에게 투여되는 WT1 펩티드 백신이 서열 번호 2 내지 6 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, WT1 항원 펩티드가 서열 번호 7 내지 71 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제7항에 있어서, WT1 항원 펩티드가 서열 번호 20, 21, 27, 31, 32, 42, 43 또는 57 내지 71 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 시료가 혈액 샘플, 혈장 샘플, 혈청 샘플 또는 뇨 샘플인 방법.
제9항에 있어서, 시료가 혈청 샘플인 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 피험자가 WT1 관련 질환 환자인 방법.
제11항에 있어서, WT1 관련 질환이 만성 골수성 백혈병 등의 백혈병, 골수 이형성 증후군, 다발성 골수종, 악성 임파종 등의 조혈기 종양, 또는 식도암, 위암, 대장암, 췌장암, 폐암, 유방암, 배세포암, 간암, 담도암, 두경부암, 피부암, 육종, 신장암, 방광암, 전립선암, 정소암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 갑상선암, 카르시노이드, 폐아종, 간아종, 뇌종양 또는 흉선암 등의 고형 암인 방법.
제12항에 있어서, WT1 관련 질환이 재발 악성 신경 교종, 흉선암 또는 췌장암인 방법.
WT1 항원 펩티드 또는 그의 변이체를 포함하는, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 실시하기 위한 키트.