KR20080113196A - 분비 프리즐드 관련 단백질-4 (ｓｆｒｐ-4)에 대한 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 일반적으로 SFRP-4-결합제의 제조 및 그의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 항-SFRP-4 항체의 제조, 및 SFRP-4 검출 및 SFRP-4-매개 기능의 조정을 위한 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법은 변경된 SFRP-4 폴리펩티드 발현에 의해 나타나는 장애의 검출, 뿐만 아니라 이를 필요로 하는 대상체에서 이러한 SFRP-4 폴리펩티드-관련 장애에 대한 치료학적 및 예방학적 완화의 영향을 미치기 위해 다양한 조직에서 사용될 수 있다.

SFRP-4, SFRP-4-결합제, 항-SFRP-4 항체, 암

Description

분비 프리즐드 관련 단백질-4 (ＳＦＲＰ-4)에 대한 항체 {ANTIBODIES AGAINST SECRETED FRIZZLED RELATED PROTEIN-4 (SFRP-4)}

본 발명은 일반적으로 이뮤노글로불린, 항체 및 그의 단편에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 분비 프리즐드(frizzled) 관련 단백질 유형 4 (SFRP-4)-결합제에 대한 항체의 제조 및 용도에 관한 것이다.

Wnt 유전자 족은 분화 및 발병에 중요한 역할을 하는 단백질을 코딩한다. Wnt 단백질은 프리즐드 족의 7개의 막횡단 수용체와 상호작용하며, 핵으로의 신호전달 경로를 활성화시킨다 (문헌 [Dennis et al., J. Cell Sci., 112(21): 3815-20 (1999)]). Wnt-1 신호전달의 일차적 생화학 효과는 세포질 (베타)-카테닌의 안정화이며, 이는 Lef/tcf 족의 전사 인자와 관련하여 유전자 발현을 조절한다. 프리즐드 단백질, 분비 프리즐드-관련 단백질 (SFRP)의 세포외 리간드-결합 도메인에 대한 유사성을 갖는 새로운 부류의 분비 단백질의 최근 확인은 추가의 메카니즘이 Wnt 신호전달을 조절할 수 있다는 것을 제안하였다.

SFRP-4는 Wnt 또는 프리즐드 수용체로의 결합에 의해 Wnt/프리즐드 경로의 신호전달 기능을 길항하는 가용성 세포외 당단백질이다. SFRP-4는 뇌, 신장, 폐, 난소, 전립선, 유선 및 자궁내막에서 발현되며, 세포 생존에 대해 복합 기능을 나 타낸다 (문헌 [Jones et al., Bioessays 24: 811-20 (2002)]). SFRP-4는 골 대사 (문헌 [Fujita et al., Geriat. and Gerontol. Intern. 4: 175-80 (2004)]), 배란 (문헌 [Drake et al., Apoptosis 8: 389-97 (2003)]), 종양 억제 (문헌 [Hrzenjak et al., J. Path. 204: 19-27 (2004)]; [Horvath et al., Clin. Cancer Res. 10: 615-25 (2004)])과 관련된 것으로 제안되었고, 골연화증과 관련된 종양에 의해 발현된 순환하는 인산염요증 인자로서 특징화되었다 (문헌 [Berndt et al., J Clin Invest 112: 785-94 (2003)]). 이들 생물학적 프로세스와의 관련성으로 인해, SFRP-4는 암, 호르몬-관련 생식 조직의 질환 및 신경변성의 분야에서 잠재적 바이오마커 (즉, 생물학적 마커)로서 고려되었다. 따라서, 당분야에는 SFRP-4 폴리펩티드를 표적화 (예를 들어, 결합)하고/거나 조정하는데 유용한 추가 작용제에 대한 필요성이 있다.

<발명의 요약>

본 발명은 SFRP-4 폴리펩티드를 표적화하고/거나 조정하는데 유용한 작용제를 제공한다. 본 발명은 서열 3, 서열 4 및 서열 5로 구성된 군에서 선택된 SFRP-4 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하고; 서열 2의 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체 조성물을 제공한다. 항체는 폴리클로날 항체; 모노클로날 항체; 키메라 항체; 인간화 항체 및 항체-관련 폴리펩티드일 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체의 제조 방법 및 사용 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 제약상 허용되는 담체 중에 본 발명의 항체를 함유하는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 SFRP-4 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체 또 는 그의 단편을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 함유하는 숙주 세포 및 벡터를 제공한다.

본 발명은 추가로 분비 프리즐드 관련 폴리펩티드 유형 4-관련 장애의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 장애는 뇌암; 유방암; 전립선암; 자궁암; 비장암; 췌장암; 결장암; 직장암; 소장암; 위암; 식도암; 허혈, 심부전으로부터 기인한 세포자멸(apoptosis); 심근경색증; 뇌졸중; 신경변성 장애; 헌팅톤병; 말초 탈수초성 질환; 다발성 경화증; 알츠하이머병; 근위축성 측삭 경화증; 파킨슨병; 외상; 관상 심장 질환; 염증; 또는 염증성 장 질환일 수 있다. 본 발명은 본 발명의 항체의 투여에 의한 폴리펩티드의 발현 또는 활성의 조정 방법을 제공한다.

따라서, 본 발명은 분비 프리즐드 관련 폴리펩티드 유형 4-관련 장애의 치료용 의약의 제조를 위한 항체 조성물의 용도를 제공한다.

도면은 제한하는 방식이 아닌 예시하는 방식으로 바람직한 실시양태를 나타낸다.

도 1은 His-태그가 부착된 SFRP-4 폴리펩티드의 웨스턴 블럿팅 분석을 나타낸다. 패널 A는 배양의 48시간 후 (좌측 레인) 및 144시간 후 (우측 레인)의 10 ㎕ 배양 상등액에서 검출된 면역반응성 His-태그가 부착된 SFRP-4 폴리펩티드를 나타낸다. 패널 B는 His-태그가 부착된 SFRP-4-함유 배양 상등액 (48시간 샘플)의 탈글리코실화 처리의 효과를 나타낸다. 레인 1: His-태그가 부착된 SFRP-4-함유 배양 상등액 (48시간 샘플)에서 관찰된 SFRP-4 면역반응성 단백질; 레인 2: 모의- 처리된 His-태그가 부착된 SFRP-4-함유 배양 상등액 (48시간 샘플)에서 관찰된 SFRP-4 면역반응성 단백질; 레인 3: PNGase 처리된 His-태그가 부착된 SFRP-4-함유 배양 상등액 (48시간 샘플)에서 관찰된 SFRP-4 면역반응성 단백질.

도 2는 SFRP-4 ELISA 표준 곡선을 나타내는 그래프이다.

도 3은 조직의 스팟의 크기를 나타내는 차트가 있는 고처리량 웨스턴 블럿팅의 사진이다. 분석된 조직은 다음과 같다: 1, 태반; 2, 빈 레인; 3, 지방조직; 4, 방광; 5, 뇌; 6, 유방: 7, 소뇌; 8, 자궁경부; 9, 결장; 10, 횡격막; 11, 십이지장; 12, 식도; 13, 담낭; 14, 심장; 15, 회장; 16, 공장; 17, 신장; 18, 간; 19, 폐; 20, 난소; 21, 췌장; 22, 태반; 23, 직장; 24, 골격근; 25, 피부: 26, 비장; 27, 위; 28, 고환; 29, 흉선; 30, 갑상선; 31, 편도; 32, 자궁.

명명법 및 정의. 달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 일반적으로 본 발명이 속한 당업계의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에서 사용되는 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 대상물을 포함한다. 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 2개 이상의 세포 등의 조합을 포함한다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 명명법 및 하기 기재된 세포 배양, 분자 유전학, 유기 화학 및 핵산 화학 및 혼성화에서의 실험적 절차는 당분야에 익히 공지되어 있으며 통상적으로 사용된다. 표준 기술은 핵산 및 펩티드 합성에서 사용된다. 또한, 본원에서 사용되는 명명법 및 하기 기재된 분석 화학 및 유기 합성에서의 실험적 절차는 당분야에 익히 공지되어 있으며 통상적으로 사용된다. 표준 기술 또는 그의 변형은 화학적 합성 및 화학적 분석에서 사용된다. 본원에 인용된 모든 참고문헌은 각 개별 공보, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 각각 그 전문이 본원에 참고로 도입되는 바와 동일한 정도로 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.

본 명세서에서 사용되는 특정 용어의 정의는 하기 제공된다. 다른 용어의 정의는 문헌 [Illustrated Dictionary of Immunology, 2nd Edition, Cruse, J.M. and Lewis, R.E., eds. (CRC Press, Boca Raton, Florida, 1995)]에서 찾을 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "분비 프리즐드 관련 단백질-4" (SFRP-4)는 천연 SFRP-4 뿐만 아니라 합성 또는 재조합 SFRP-4를 포함한다. 또한, 용어 "분비 프리즐드 관련 단백질-4"는 대립유전자 변이체, 종 변이체, 스플라이스 변이체 및 보존된 아미노산 치환 변이체를 포함한다. SFRP-4 유전자의 발현은 포유동물에서 SFRP-4 스플라이스 변이체를 야기한다 (문헌 [Yam et al. Gene PMID: 16005582 (Epub ahead of print, July 7, 2005)]). 상기 용어는 또한 전장 SFRP-4 뿐만 아니라 SFRP-4 단편을 포함한다. SFRP-4는 인간 SFRP-4 및 뮤린 SFRP-4를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는 대상체 또는 대상체들로의 작용제 또는 약물의 투여는 자가투여 및 타인에 의한 투여를 포함한다. 기재된 바와 같은 의학적 상태의 치료 또는 예방의 여러 방식은 전체 치료 또는 예방 및 또한 전체보다 덜한 치료 또는 예방을 포함하고, 몇몇 생물학적으로 또는 의학적으로 관련된 결과가 성취되는 "실질적으로"를 의미하도록 의도된다는 것이 또한 이해될 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "아미노산"은 천연 아미노산 및 합성 아미노산, 뿐만 아니라 천연 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 포함한다. 천연 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩되는 아미노산, 뿐만 아니라 이후 변형되는 아미노산, 예를 들어 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린을 포함한다. 아미노산 유사체는 천연 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소, 카르복실기, 아미노기 및 R 기에 결합된 α-탄소를 갖는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기 (예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 주쇄를 가지나, 천연 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 가지나, 천연 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 지칭한다. 아미노산은 본원에서 그의 통상적으로 공지된 세글자 심볼에 의해 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 추천되는 한글자 심볼에 의해 지칭될 수 있다. 뉴클레오티드는 이와 유사하게 그의 통상적으로 허용되는 한글자 코드에 의해 지칭될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "항체"는 항원, 예를 들어 SFRP-4 폴리펩티드를 인식하고 특이적으로 결합하는 이뮤노글로불린 유전자 또는 그의 단편으로부터의 프레임워크 영역을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 용어 항체의 사용은 단일쇄 온전한 항체를 비롯한 온전한 항체, 및 그의 항원-결합 단편을 포함하는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "항체-관련 폴리펩티드"는 단일쇄 항체를 비롯한 항원-결합 항체 단편을 의미하며, 이는 가변 영역을 단독으로 또는 하기 폴리펩티드 요소의 전체 또는 부분과 조합되어 포함할 수 있다: 항체 분자의 힌지 영역, CH₁, CH₂ 및 CH₃ 도메인. 가변 영역 및 힌지 영역, CH₁, CH₂ 및 CH₃ 도메인의 임의의 조합이 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명의 결합제로서 유용한 항체-관련 분자로는 예를 들어 Fab, Fab' 및 F(ab')₂, Fd, 단일쇄 Fv (scFv), 단일쇄 항체, 디술피드-연결된 Fv (sdFv) 및 V_L 또는 V_H 도메인을 포함하는 단편이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 예로는 (i) Fab 단편, V_L, V_H, C_L 및 CH₁ 도메인으로 구성된 일가 단편; (ii) F(ab')₂ 단편, 힌지 영역에서 디술피드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 이가 단편; (iii) V_H 및 CH₁ 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 V_L 및 V_H 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) V_H 도메인으로 구성된 dAb 단편 (문헌 [Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989]); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 들 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "생물학적 샘플"은 살아있는 세포로부터 유래되거나 또는 살아있는 세포에 의해 접촉된 샘플 물질을 의미한다. 용어 "생물학적 샘플"은 대상체로부터 단리된 조직, 세포 및 생물학적 체액, 뿐만 아니라 대상체 내에 존재하는 조직, 세포 및 체액을 포함하도록 의도된다.

본원에서 사용되는 용어 "CDR-그라프팅된 항체"는 "수용체" 항체의 하나 이상의 CDR이 바람직한 항원 특이성을 갖는 "공여" 항체로부터의 CDR "그라프트"에 의해 대체된 항체를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "키메라 항체"는 하나의 종으로부터의 모노클로날 항체의 Fc 불변 영역 (예를 들어, 마우스 Fc 불변 영역)이 재조합 DNA 기술을 사용하여 다른 종의 항체로부터의 Fc 불변 영역 (예를 들어, 인간 Fc 불변 영역)으로 대체된 항체를 의미한다. 일반적으로, 로빈슨(Robinson) 등의 제PCT/US86/02269호; 아키라(Akira) 등의 유럽 특허 출원 제184,187호; 타니구치(Taniguchi)의 유럽 특허 출원 제171,496호; 모리슨(Morrison) 등의 유럽 특허 출원 제173,494호; 노이베르거(Neuberger) 등의 제WO 86/01533호; 카빌리(Cabilly) 등의 미국 특허 제4,816,567호; 카빌리 등의 유럽 특허 출원 제125,023호; 문헌 [Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988)]; [Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA 84: 3439-3443 (1987)]; [Liu et al., J Immunol 139: 3521-3526 (1987)]; [Sun et al., Proc Natl Acad Sci USA 84: 214-218 (1987)]; [Nishimura et al., Cancer Res 47: 999-1005 (1987)]; [Wood et al., Nature 314: 446-449 (1985)]; 및 [Shaw et al., J Natl Cancer Inst 80: 1553-1559, (1988)]을 참조한다.

본원에서 사용되는 용어 "비교 창"은 두 서열이 최적으로 정렬된 후 서열이 인접 위치의 동일한 번호의 기준 서열과 비교될 수 있는, 20 내지 600개, 통상적으로 약 50 내지 약 200개, 보다 통상적으로 약 100 내지 약 150개의 아미노산 또는 뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택된 인접 위치의 번호 중 임의의 하나의 절편을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "컨센서스 FR"은 컨센서스 이뮤노글로불린 서열 중 프레임워크 (FR) 항체 영역을 의미한다. 항체의 FR 영역은 항원과 접촉하지 않는다.

본원에서 사용되는 용어 "컨센서스 서열"은 관련 서열의 족에서 가장 흔히 발생되는 아미노산 (또는 뉴클레오티드)으로부터 형성된 서열을 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987] 참조). 즉, 단백질의 족에서, 컨센서스 서열에서의 각 위치는 족에서 상기 위치에서 가장 흔히 발생되는 아미노산에 의해 점령된다. 두가지 아미노산이 동일한 빈도로 발생되는 경우, 둘 중 임의의 것이 컨센서스 서열에 포함될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "접촉된"은 세포에 적용될 경우, 본 발명의 SFRP-4-결합제 (예를 들어, 항체, 항체 조성물, 세포독성제 또는 세포독성 잔기, 유전자, 단백질 및/또는 안티센스 서열)를 표적 세포로 전달하거나 또는 표적 세포와 직접적으로 근접한 곳에 위치시키는 프로세스를 지칭한다. 상기 전달은 시험관내 또는 생체내일 수 있으며, 재조합 벡터 시스템의 사용을 수반할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "세포독성 잔기"는 세포로 근접하거나 또는 세포에 의해 흡착되는 경우 세포 성장을 억제하거나 또는 세포 사멸을 촉진하는 잔기를 의미한다. 세포독성 잔기는 비제한적 예시에 의해 화학요법제, 광활성화 독소 또는 방사성제일 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "디아바디"는 동일한 폴리펩티드 쇄 (V_H V_L) 중 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함하는, 2개의 항원-결합 부위을 갖는 작은 항체 단편을 지칭한다. 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이에 쌍을 형성하기에 너무 짧은 링커(linker)의 사용으로 인해, 도메인은 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하도록 강요되고 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 디아바디는 예를 들어 제EP 404,097호; 제WO 93/11161호; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)]에 보다 상세히 기재되어 있다.

본원에서 사용되는 용어 "이펙터 세포"는 면역 반응의 인지기 및 활성화기와 대조적으로 면역 반응의 이펙터기에 포함된 면역 세포를 의미한다. 면역 세포의 예로는 골수 또는 림프 기원의 세포, 예를 들어 림프구 (예를 들어, B 세포, 및 세포용해 T 세포 (CTL)를 비롯한 T 세포), 살해 세포, 자연 살해 세포, 대식세포, 단핵구, 호산구, 호중구, 다형핵 세포, 과립구, 비만 세포 및 호염기구를 들 수 있다. 이펙터 세포는 특이적 Fc 수용체를 발현하며, 특이적 면역 기능을 수행한다. 이펙터 세포는 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 유도할 수 있으며, 예로는 ADCC를 유도할 수 있는 호중구가 있다. 예를 들어, FcαR을 발현하는 단핵구, 대식세포, 호중구, 호산구 및 림프구는 표적 세포의 특이적 살해 및 면역계의 다른 성분으로의 항원의 제시, 또는 항원을 제시하는 세포로의 결합과 관련되어 있다. 이펙터 세포는 또한 표적 항원, 표적 세포, 전이성 암 세포 또는 미생물을 식작용할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위를 의미한다. 에피토프는 통상적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자로 구성된 화학적으로 활성인 표면으로 구성되며, 통상적으로 특이적 삼차원 구조 특징, 뿐만 아니라 특정 전하 특징을 갖는다. 형태 에피토프로의 결합은 변성 용매의 존재하에 손실되나 비-형태 에피토프로의 결합은 그렇지 않다는 점에서 형태 에피토프와 비-형태 에피토프는 구별된다.

본원에서 사용되는 용어 조성물의 "유효량"은 원하는 치료학적 효과 및/또는 예방학적 효과를 성취하는데 충분한 양, 예를 들어 치료될 질환, 예를 들어 본원에 나열된 표적 폴리펩티드와 관련된 질환과 관련된 증상의 예방 또는 감소를 야기하는 양이다. 대상체에 투여되는 본 발명의 조성물의 양은 질환의 유형 및 중증도, 및 개체의 특징, 예컨대 전반적인 건강, 연령, 성별, 체중 및 약물에 대한 내용력에 따라 달라질 것이다. 또한, 질환의 정도, 중증도 및 유형에 따라 달라질 것이다. 당업자는 이들 인자 및 다른 인자에 따라 적절한 용량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명의 조성물은 또한 서로 조합되어, 또는 1종 이상의 추가의 치료 화합물과 조합되어 투여될 수 있다.

본원에서 사용되는 "발현"은 유전자의 전구체 mRNA로의 전사; 성숙 mRNA의 생성을 위한 전구체 mRNA의 스플라이싱 및 다른 프로세싱; mRNA 안정성; 성숙 mRNA의 단백질로의 번역 (코돈 사용 및 tRNA 유효성 포함); 및 적절한 발현 및 기능을 위해 필요하다면 번역 생성물의 글리코실화 및/또는 다른 변형 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는 "융합 폴리펩티드"는 SFRP-4 폴리펩티드와 실질적으로 상동성이 없는 폴리펩티드에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 SFRP-4 폴리펩티드, 예를 들어 SFRP-4 폴리펩티드와 상이하고, 동일한 또는 상이한 유기체로부터 유래된 폴리펩티드를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "유전자"는 발현을 제어하는 프로모터, 엑손, 인트론 및 다른 비번역 영역을 포함하는, RNA 생성물의 조절된 생합성에 대한 모든 정보를 함유하는 DNA의 절편을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "유전자형"은 개체에서 상동 염색체 쌍 상의 유전자좌 중 하나 이상의 다형 또는 돌연변이체 부위에서 발견되는 뉴클레오티드 쌍의 언페이스드(unphased) 5' 내지 3' 서열을 의미한다. 본원에서 사용되는 유전자형은 전체-유전자형 및/또는 하위-유전자형을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "인간 서열 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역 (존재하는 경우)을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 서열 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 이러한 항체는 예를 들어 PCT 공보 제WO 01/14424호 및 제WO 00/37504호에 기재된 바와 같이 비인간 트랜스제닉 동물에서 생성될 수 있다. 그러나, 본원에서 사용되는 용어 "인간 서열 항체"는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열로 그라프팅된 항체 (예를 들어, 인간화 항체)를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.

본원에서 사용되는 용어 "동일한" 또는 "동일성" 백분율은 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 내용에서 사용되는 경우, 하기 기재된 디폴트 파라미터를 갖는 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘의 사용에 의해, 또는 수동 정렬 및 시각적 검사 (예를 들어, NCBI 웹 사이트 참조)에 의해 측정되는 바와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 백분율을 갖거나 또는 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다 (즉, 비교 창 또는 지칭된 영역에 대해 최대 상응성으로 정렬되고 비교되는 경우 특정 영역 (예를 들어, 본원에 기재된 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 본원에 기재된 항체의 아미노산 서열)에 대해 약 60%의 동일성, 바람직하게는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성). 그 후, 이러한 서열은 "실질적으로 동일한"이라고 지칭된다. 상기 용어는 또한 시험 서열을 지칭하거나, 또는 시험 서열에 대한 언급에 적용될 수 있다. 상기 용어는 또한 결실 및/또는 첨가를 갖는 서열, 뿐만 아니라 치환을 갖는 서열을 포함한다. 하기 기재된 바와 같이, 바람직한 알고리즘은 갭(gap) 등에 대해 설명할 수 있다. 바람직하게는, 동일성은 약 25개 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이인 영역, 또는 보다 바람직하게는 50 내지 100개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이인 영역 상에 존재한다.

"단리된" 또는 "정제된" 폴리펩티드 또는 그의 생물학적-활성 부분은 SFRP-4-결합제가 유래되는 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포 물질 또는 다른 오염 폴리펩티드를 실질적으로 함유하지 않거나, 또는 화학적으로 합성되는 경우 화학 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 함유하지 않는다. 예를 들어, 항-SFRP-4 항체인 단리된 SFRP-4-결합제는 작용제의 진단 또는 치료 사용을 방해하는 물질을 함유하지 않을 것이다. 이러한 방해 물질은 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 및 비단백질성 용질을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "무손상 항체"는 디술피드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 폴리펩티드 및 2개의 경쇄(L) 폴리펩티드를 갖는 항체를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "면역 반응"은 암성 세포, 전이성 종양 세포, 악성 흑색종, 침윤성 병원체, 병원체에 의해 감염된 세포 또는 조직, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우 정상적인 인간 세포 또는 조직의 인체에 대한 선택적인 손상, 인체의 파괴 또는 인체로부터의 제거를 야기하는, 림프구, 항원 제시 세포, 식세포, 과립구, 및 상기 세포 또는 간에 의해 생성되는 가용성 거대분자 (항체, 사이토카인 및 보체 포함)의 협동 작용을 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "면역학적 교차-반응성" 및 "면역학적 반응성"은 동일한 ("면역학적 반응성") 또는 상이한 ("면역학적 교차-반응성") 항원을 사용하여 생성되는 항체와 특이적으로 반응하는 항원을 의미하는데 상호교환적으로 사용된다. 일반적으로, 항원은 SFRP-4, 그의 변이체 또는 하위서열이다.

본원에서 사용되는 용어 "면역학적 반응성 조건"은 항원의 특정 에피토프에 대해 생성되는 항체가 실질적으로 모든 다른 에피토프에 결합하는 항체보다 검출가능하게 큰 정도로, 일반적으로 적어도 2배 초과의 백그라운드 결합, 바람직하게는 적어도 5배 초과의 백그라운드 결합으로 에피토프에 결합하게 하는 조건을 의미한다. 면역학적 반응성 조건은 항체 결합 반응의 형식에 의존적이며, 전형적으로 면역검정법 프로토콜에서 사용된다. 면역검정법 형식 및 조건에 대한 기재에 대해서는 문헌 [Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988)]을 참조한다.

본원에서 사용되는 용어 "림프구"는 혈액, 림프 및 림프양 조직에서 발견되는 임의의 단핵의 비식작용성 백혈구, 예를 들어 B 및 T 림프구를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "의학적 상태"는 치료 및/또는 예방이 바람직한 하나 이상의 물리적 및/또는 심리적 증상으로서 나타나는 임의의 상태 또는 질환을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 이전 및 최근 확인된 질환 및 다른 장애를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "조정제"는 억제제 및 액티베이터를 포함한다. 억제제는 예를 들어 결합하여 SFRP-4 폴리펩티드의 자극을 부분적으로 또는 전체적으로 차단하거나, 활성화를 감소시키거나 방지하거나 지연시키거나, 활성을 불활성화시키거나 탈감작화하거나 또는 하향조절하는 작용제, 예를 들어 길항제이다. 액티베이터는 예를 들어 결합하여, SFRP-4 폴리펩티드의 활성화를 자극하거나 증가시키거나 개방시키거나 활성화시키거나 촉진하거나 향상시키거나, 상기 활성을 감작화하거나 또는 상향조절하는 작용제, 예를 들어 효능제(agonist)이다. 조정제는 예를 들어 단백질, 펩티드, 지질, 탄수화물, 다당류, 또는 이들의 조합, 예를 들어 지단백질, 당단백질 등을 비롯한, 액티베이터 또는 억제제, 수용체에 결합하는 단백질과 SFRP-4 폴리펩티드의 상호작용을 변경하는 작용제를 포함한다. 조정제는 천연 SFRP-4 폴리펩티드의 유전자 변형된 버젼, 예를 들어 변경된 활성을 갖는 버젼, 뿐만 아니라 천연 및 합성 리간드, 길항제, 효능제, 화학 소분자 등을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 임의의 진핵, 원핵 또는 파지 클론을 비롯한 단일 클론으로부터 유래된 항체를 의미하며, 이를 제조하는 방법이 아니다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다. 모노클로날 항체는 예를 들어 하이브리도마, 재조합 및 파지 디스플레이 기술을 포함하나 이에 제한되지 않는, 당분야에 공지된 광범위한 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "중화 항체"는 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드의 생물학적 기능 중 하나(1) 이상을 제거하거나 또는 유의하게 감소시킬 수 있는 항체 분자를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드 쌍"은 2개의 뉴클레오티드 가닥 사이에 서로 결합된 2개의 뉴클레오티드를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "제약상 허용되는 담체"는 제약 투여에 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항세균 화합물, 항진균 화합물, 등장성 화합물, 흡수 지연 화합물 등을 포함하도록 의도된다.

본원에서 사용되는 용어 "폴리클로날 항체"는 2종 이상의 상이한 항체를 생성하는 세포주로부터 유래된 항체의 제제를 의미한다. 상기 용어의 사용은 상이한 에피토프 또는 항원의 영역에 특이적으로 결합하는 항체를 함유하는 2종 이상의 항체의 제제를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 임의의 RNA 또는 DNA를 의미하며, 이는 비변형된 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 중합체, 즉 펩티드 동배체를 의미하도록 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 폴리펩티드는 통상적으로 펩티드, 글리코펩티드 또는 올리고머라고 지칭되는 단쇄, 및 일반적으로 단백질이라고 지칭되는 장쇄 둘 모두를 지칭한다. 폴리펩티드는 20개의 유전자-코딩된 아미노산이 아닌 아미노산을 함유할 수 있다. 폴리펩티드는 번역후 프로세싱과 같은 천연 프로세스에 의해, 또는 당분야에 익히 공지된 화학적 변형 기술에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 변형은 기본 문헌 및 보다 상세한 논문, 뿐만 아니라 대형 연구 문헌에 잘 기재되어 있다.

본원에서 사용되는 용어 "재조합"은 세포 또는 핵산, 단백질, 또는 벡터와 관련하여 사용되는 경우, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입, 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되었거나, 또는 물질이 이렇게 변형된 세포로부터 유래되었음을 지시한다.

본원에서 사용되는 용어 "단일 쇄 항체" 또는 "단일 쇄 Fv (scFv)"는 Fv 단편, V_L 및 V_H의 2개의 도메인의 항체 융합 분자를 지칭한다. Fv 단편, V_L 및 V_H의 2개의 도메인은 개별 유전자에 의해 코딩되나, 이들은 V_L 및 V_H 영역이 쌍을 형성하여 단일 쇄 Fv (scFv)라고 공지된 일가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 제조할 수 있는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Bird et al., Science 242: 423-426 (1988)]; 및 [Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988)]을 참조한다. 이러한 단일 쇄 항체는 용어 "항체" 단편의 언급에 의해 포함되며, 재조합 기술, 또는 무손상 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "소분자"는 약 5 kDa 미만, 보다 바람직하게는 약 2 kDa 미만의 분자량을 갖는 조성물을 의미한다. 소분자는 예를 들어 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 글리코펩티드, 펩티드모방체, 탄수화물, 지질, 지다당류, 이들의 조합, 또는 다른 유기 또는 무기 분자일 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "특이적 결합"은 10^-6 M 이상의 결합 친화성으로 항원과 SFRP-4-결합제 사이의 접촉을 의미한다. 바람직한 결합제는 약 10^-7 M, 바람직하게는 10^-8 M 내지 10^-9 M, 10^-10 M, 10^-11 M 또는 10^-12 M 이상의 친화성으로 결합한다.

본원에서 사용되는 문구 "엄격한 혼성화 조건"은 프로브가 전형적으로 핵산의 복합체 혼합물에서 그의 표적 하위서열로 혼성화하나 다른 서열로는 혼성화하지 않는 조건을 의미한다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며, 상이한 환경에서 상이할 것이다. 더 긴 서열은 더 높은 온도에서 특이적으로 혼성화한다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 지침은 문헌 [Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays", Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - hybridization with Nucleic Probes (1993)]에 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 한정된 이온 강도 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점 (T_m)보다 약 5-1O℃ 낮은 온도로 선택된다. T_m은 (한정된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에) 표적에 상보적인 프로브의 50%가 평형에서 표적 서열로 혼성화하는 온도이다 (표적 서열이 T_m에서 과량으로 존재하기 때문에, 프로브의 50%는 평형에서 점거됨). 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 탈안정화제의 첨가에 의해 성취될 수 있다. 선택적인 또는 특이적 혼성화를 위해, 양성 신호는 2배 이상의 백그라운드, 바람직하게는 10배의 백그라운드 혼성화이다. 엄격한 혼성화 조건의 예로는 50% 포름아미드, 5x SSC, 및 1% SDS, 42℃에서의 인큐베이션, 또는 5x SSC, 1% SDS, 65℃에서의 인큐베이션, 0.2x SSC에서의 세척 및 65℃에서 0.1% SDS를 들 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 바람직하게는 대상체가 인간과 같은 포유동물인 것을 의미하나, 또한 동물, 예를 들어 가축 (예를 들어, 개, 고양이 등), 농장 동물 (예를 들어, 소, 양, 돼지, 말 등) 및 실험 동물 (예를 들어, 원숭이, 래트, 마우스, 토끼, 기니아 피그 등)일 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "표적 세포"는 본 발명의 SFRP-4-결합제에 의해 표적화될 수 있는 대상체 (예를 들어, 인간 또는 동물)의 임의의 세포를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "치료제"는 유효량으로 존재하는 경우 이를 필요로 하는 대상체에서 원하는 치료 효과를 나타내는 화합물 (예를 들어, SFRP-4 결합제)을 의미하도록 의도된다.

본 발명의 하나 이상의 실시양태의 상세한 내용은 하기 상세한 설명에 기재되어 있다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있으나, 바람직한 방법 및 물질은 이하 기재되어 있다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 장점은 본 명세서 및 청구의 범위로부터 명백할 것이다. 일반적으로, 효소적 반응 및 정제 단계는 제조자의 세부사항에 따라 수행된다. 기술 및 절차는 일반적으로 당분야에 통상적인 방법 및 여러 일반적인 기준에 따라 수행된다. 일반적으로, 본 명세서를 통해 제공된 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)]을 참조한다.

본 발명의 조성물

일반. 본 발명은 SFRP-4 폴리펩티드, 그의 단편 및 변이체로 지정되는 SFRP-4 결합제를 제공한다. SFRP-4는 프리즐드 단백질의 추정상의 Wnt-결합 부위에 상동적인 시스테인-풍부 도메인을 함유하는 SFRP 족의 구성원이다. Wnt 네트워크는 발생의 세포 운명, 세포 극성 및 접착으로부터 종양발생 및 세포자멸에 이르기까지의 범위의 생물학적 프로세스에 영향을 미친다 (문헌 [Jones et al., Bioessays 24: 811-20 (2002)]). SFRP는 Wnt 신호전달의 가용성 조정제로서 작용한다. 다중 단백질 생성물은 대안적 스플라이싱 메카니즘에 의한 SFRP-4 유전자의 포유동물 발현으로부터 유래될 수 있다 (문헌 [Yam et al. Gene PMID: 16005582 (Epub ahead of print, July 7 (2005)]). 인간 SFRP-4를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (NM_003014.2; 서열 1)은 하기 표 1에 나타낸다.

인간 SFRP-4 폴리펩티드의 아미노산 서열 (NP_OO3OO5.1; 서열 2)은 하기 표 2에 나타낸다.

한 측면에서, 본 발명의 SFRP-4 결합제의 제조에 유용한 면역원성 조성물을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 그 때문에, 인간 SFRP-4 폴리펩티드의 아미노산 서열은 본 발명의 결합제에 대한 표적으로서 유용한 SFRP-4 도메인을 확인하기 위해 생명공학 정보 국립 센터 (National Center for Biotechnology Information)에서의 BLAST 네트워크 서비스 및 바이오벤치2(Biobench2) (노파르티스(Novartis))를 사용하여 분석하였다 (실시예 I 참조). 상기 분석은 하기 표 3에 요약되어 있는 4개의 SFRP-4 도메인을 확인하였다.

인간 분비 프리즐드 관련 단백질의 표적 도메인

표적 도메인	아미노산	아미노산 서열	서열
1	305-319	AGRTSRSNPPKPKGK	3
2	292-305	QEQRRTVQDKKKTA	4
3	103-116	RARDDCEPLMKMYN	5
4	228-239	SPIPRTQVPLIT	6

표적 도메인은 폴리펩티드의 제조에 유용한 임의의 기술, 예를 들어 화학적 합성, 분자 생물학적 기술, SFRP-4 폴리펩티드의 단백질 분해 또는 화학적 분해에 의해 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, SFRP-4 표적 도메인은 화학적 합성에 의해 제조된다. 펩티드의 화학적 합성 방법은 당분야에 익히 공지되어 있다. 한 실시양태에서, SFRP-4 표적 도메인은 다른 화합물, 예를 들어 난알부민, 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌으로의 접합을 촉진하도록 변형된다. 일반적으로 하기 폴리클로날 항혈청 및 면역원의 제조를 참조한다. 다른 실시양태에서, 시스테인 잔기는 SFRP-4 표적 도메인의 다른 화합물로의 접합을 촉진하기 위해 SFRP-4 표적 도메인의 C-말단으로 혼입된다. 본 발명의 표적 도메인을 포함하고 다른 화합물로의 접합에 유용한 서열은 하기 표 4에 상세하게 기재되어 있다.

인간 분비 프리즐드 관련 단백질

표적 도메인	ID No.	아미노산 서열	서열
1	EP040755	AGRTSRSNPPKPKGKC	7
2	EP040756	QEQRRTVQDKKKTAC	8
3	EP040757	RARDDCEPLMKMYNC	9
4	EP040758	SPIPRTQVPLITC	10

SFRP-4 표적 도메인 1 내지 4는 본 발명의 SFRP-4-결합제의 제조를 위한 면역원으로서 단독으로 또는 조합으로 유용하다 (실시예 I 참조). 한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9 및 서열 10으로 구성된 군에서 선택된 하나(1) 이상의 폴리펩티드를 포함한다.

SFRP-4는 많은 인간 및 동물 종양, 예를 들어 유방, 전립선, 자궁, 비장, 결장 및 다른 조직의 종양에 의해 생성된다. 따라서, SFRP-4 발현은 암 (예를 들어, 뇌, 유방, 전립선, 자궁, 비장, 췌장, 위장관 (예를 들어, 결장, 직장, 소장, 위, 식도); 허혈 (예를 들어, 심부전, 심근경색증; 뇌졸중)로부터 기인한 세포자멸; 신경변성 질환 (예를 들어, 헌팅톤병, 말초 탈수초성 질환, 다발성 경화증, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병; 외상); 관상 심장 질환, 염증 (예를 들어, 염증성 장 질환)과 같은 병리학적 상태의 생물학적 마커이다. 일반적으로, 문헌 [Wong, S et al., J. Pathol. 196: 145-153 (2002)]; [Schumann J et al., Cardiovascular Res. 45: 720-728 (2002)]; [Jones et al., Bioessays 24: 811-20 (2002)]; [Horvath LG et al., (2004) Clin. Cancer Res. 10: 615-25 (2004)]; [Abuh Jawdeh et al. Lab Invest. 79: 439-47 (1999)], 뿐만 아니라 실시예 III을 참조한다. 따라서, 본 발명의 여러 측면은 SFRP-4-결합제의 제조, 발현 및 특징화에 관한 것이다. 표적 결합 도메인 1 내지 4 각각에 대한 SFRP-4-결합제는 시험 샘플 (예를 들어, 생물학적 샘플) 중 SFRP-4 폴리펩티드 (즉, 표적 폴리펩티드)의 검출, 뿐만 아니라 SFRP-4-매개 기능의 조정에 단독으로 또는 조합으로 유용하다. 이와 같이, 본 발명의 여러 측면은 추가로 의학적 상태에 걸리기 쉬운 개체를 확인하기 위해 또는 약물 반응성, 부작용, 또는 최적의 약물 투여량에 대해 개체를 분류하기 위해 본 발명의 SFRP-4-결합제를 사용하는, 진단/예후진단 방법 및 키트에 관한 것이다. SFRP-4는 단독으로, 또는 다른 생물학적 마커, 예를 들어 세포자멸 또는 증식-관련 마커 (예를 들어, c-myc, 사이클린-D1); Wnt-경로 마커 (예를 들어, 문헌 [Etheredge et al., Stem Cells 22:849-860 (2004)] 참조); Erb1; 또는 전립선 특이적 항원과의 조합으로 사용될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 SFRP-4-매개 장애의 예방 또는 치료, 뿐만 아니라 SFRP-4 폴리펩티드에 결합하는 리간드, 예를 들어 소분자의 스크리닝 및/또는 검증을 위한 SFRP-4-결합제의 사용 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 SFRP-4-결합제는 SFRP-4 폴리펩티드 발현의 변화, 예를 들어 증가 또는 감소에 의해 나타나는 장애, 예를 들어 암 (예를 들어, 뇌, 유방, 전립선, 자궁, 비장, 췌장, 위장관 (예를 들어, 결장, 직장, 소장, 위, 식도); 허혈 (예를 들어, 심부전, 심근경색증; 뇌졸중)로부터 기인한 세포자멸; 신경변성 질환 (예를 들어, 헌팅톤병, 말초 탈수초성 질환, 다발성 경화증, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병; 외상); 관상 심장 질환, 염증 (예를 들어, 염증성 장 질환)의 예방학적 치료 또는 치료학적 치료에 유용하다. 이들 측면을 예시하는 여러 특정 실시양태는 하기 기재되어 있다.

본 발명의 SFRP-4-결합제. 한 측면에서, 본 발명은 SFRP-4-결합제 조성물, 즉 결합제를 제공한다. 본 발명의 결합제는 결합제에 의해 인식되거나 또는 특이적으로 결합된 본 발명의 폴리펩티드의 부분 또는 에피토프, 예를 들어 폴리펩티드의 표면에 위치된 SFRP-4 폴리펩티드의 영역 (예를 들어, 친수성 영역)에 대해 기재되거나 구체화될 수 있다. 항체 제조의 표적화 수단으로서, 친수성 및 소수성의 영역을 나타내는 친수성도 플롯은 푸리어(Fourier) 형질전환에 의한 또는 의하지 않는, 예를 들어 카이트-둘리틀(Kyte-Doolittle) 또는 홉-우즈(Hopp-Woods) 방법을 비롯한, 당분야에 익히 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hopp & Woods, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828 (1981)]; [Kyte & Doolittle, J. Mol. Biol. 157: 105-142 (1982)] 참조). 에피토프 또는 폴리펩티드 부분은 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어 N-말단 및 C-말단 위치에 의해, 인접 아미노산 잔기에 크기에 의해 구체화될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 결합제를 포함하며, 상기의 배제를 허용한다.

본 발명의 결합제는 또한 그의 교차-반응성에 대해 기재되거나 구체화될 수 있다. 본 발명의 표적 폴리펩티드의 임의의 다른 유사체, 오르토로그 또는 상동체에 결합하지 않는 결합제가 포함된다. 본 발명의 표적 폴리펩티드에 대한 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만 및 50% 미만의 동일성 (당분야에 공지된 방법 및 본원에 기재된 방법을 사용하여 계산됨)을 갖는 폴리펩티드에 결합하지 않는 결합제가 또한 본 발명에 포함된다. 엄격한 혼성화 조건하에 본 발명의 폴리뉴클레오티드로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드에만 결합하는 결합제가 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명의 결합제는 또한 그의 결합 친화성에 대해 기재되거나 또는 구체화될 수 있다. 바람직한 결합 친화성은 10^-6 M, 5 X 10^-6 M, 10^-7 M, 5 X 10^-7 M, 10^-8 M, 5 X 10^-8 M, 10^-9 M, 5 X 10^-9 M, 10^-10 M, 5 X 10^-10 M, 10^-11 M, 5 X 10^-11 M, 10^-12 M, 5 X 10^-12 M, 10^-13 M, 5 X 10^-13 M, 10^-14 M, 5 X 10^-14 M, 10^-15 M, 및 5 X 10^-15 M 미만의 해리 상수 또는 K_d를 갖는 친화성을 포함한다.

본 발명의 범위 내의 SFRP-4-결합제로는 예를 들어, 표적 폴리펩티드, 그의 동족체, 유도체 또는 단편에 특이적으로 결합하는, 모노클로날, 폴리클로날, 키메라, 인간화, 디아바디, 및 인간 모노클로날 및 인간 폴리클로날 항체가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 "SFRP-4-유사" 폴리펩티드는 SFRP-4 폴리펩티드와 상이하나 본 발명의 SFRP-4-결합제와 면역학적으로 반응성인 폴리펩티드를 의미한다. SFRP-4-유사 폴리펩티드는 SFRP-4 폴리펩티드로서 동일한 유기체 또는 상이한 유기체로부터 유래될 수 있다. SFRP-4-유사 폴리펩티드는 동일한 유전자 또는 상이한 유전자에 의해 SFRP-4 폴리펩티드로서 코딩될 수 있다. 본 발명의 결합제로서 유용한 항체에는 예를 들어 IgG (IgG₁, IgG₂, IgG₃ 및 IgG₄ 포함), IgA (IgA₁ 및 IgA₂ 포함), IgD, IgE 또는 IgM, 및 IgY가 포함되나 이에 제한되지 않는다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 결합제는 SFRP-4 폴리펩티드, 그의 동족체 또는 유도체로 지정된 항체-관련 폴리펩티드이다. 전형적으로, 결합제의 항원-결합 영역, 예를 들어 항-SFRP-4-결합 영역은 본 발명의 결합제의 결합의 특이성 및 친화성에서 가장 중요할 것이다. 몇몇 실시양태에서, SFRP-4-결합제는 예를 들어 항체의 부분의 결실, 첨가 또는 치환에 의해 변형된, 항-SFRP-4 폴리펩티드 항체, 예컨대 항-SFRP-4 폴리펩티드 모노클로날 항체, 항-SFRP-4 폴리펩티드 키메라 항체 및 항-SFRP-4 폴리펩티드 인간화 항체이다. 예를 들어, 항-SFRP-4 폴리펩티드 항체는 항체의 반감기, 예를 들어 혈청 반감기, 안정성 또는 친화성을 증가시키기 위해 변형될 수 있다.

한 실시양태에서, SFRP-4 폴리펩티드의 특정 도메인에 특이적인 항체의 선택은 이러한 도메인을 프로세싱하는 SFRP-4 폴리펩티드의 단편에 결합하는 하이브리도마의 생성에 의해 촉진된다. 따라서, SFRP-4 폴리펩티드, 또는 그의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체 내의 원하는 도메인에 대해 특이적인 항체인 SFRP-4-결합제가 또한 본원에서 제공된다.

본 발명은 본 발명의 결합제에 대해 항-이디오타입인 항체를 추가로 포함한다. 본 발명의 결합제는 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적 또는 그 이상의 다중특이적일 수 있다. 다중특이적 결합제는 본 발명의 SFRP-4 폴리펩티드의 상이한 에피토프에 대해 특이적일 수 있거나, 또는 본 발명의 폴리펩티드 뿐만 아니라 이종 조성물, 예컨대 이종 폴리펩티드 또는 고체 지지 물질에 대해 특이적일 수 있다. 예를 들어, 제WO 93/17715호; 제WO 92/08802호; 제WO 91/00360호; 제WO 92/05793호; 문헌 [Tutt et al., J. Immunol. 147: 60- 69 (1991)]; 미국 특허 제5,573,920호, 제4,474,893호, 제5,601,819호, 제4,714,681호, 제4,925,648호; 제6,106,835호; 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992)]을 참조한다. 본 발명의 결합제는 조류 및 포유동물을 비롯한 임의의 동물로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 결합제는 인간, 뮤린, 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 말 또는 닭이다.

본 발명의 결합제는 예를 들어 SFRP-4 기능의 조정에 바람직한 경우 대상체에게 투여하기에 적합하다. 따라서, SFRP-4 조정제, 예를 들어 SFRP-4 폴리펩티드의 관능성 길항제 또는 관능성 효능제인 SFRP-4-결합제 조성물을 제공하는 것이 본 발명의 추가 목적이다. 또한, SFRP-4 폴리펩티드의 부분 길항제 및 부분 효능제인 SFRP-4-결합제 조성물을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 유사하게, SFRP-4 폴리펩티드에 결합하는 중화 항-SFRP-4 항체가 포함된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합제는 (1) 로우리(Lowry) 방법 (문헌 [Lowry et al., J. Biol. Chem. 193: 265. 1951])에 의해 결정되는 항체의 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과로, (2) 스피닝 컵 서열분석기의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루, 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 조건 또는 비환원 조건하에 SDS-PAGE에 의한 동질성으로 정제될 것이다. 항체의 자연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 단리된 결합제는 계내(in situ) 재조합 세포 내의 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상적으로 SFRP-4-결합제, 예를 들어 단리된 항-SFRP-4 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

본 발명은 추가로 SFRP-4 폴리펩티드의 조정제로서 작용하는 화합물의 확인, 설계 및 제조에 유용한 구조-기재 방법에 관한 것이다.

본 발명의 결합제는 단독으로 또는 다른 조성물과 조합되어 사용될 수 있다. 본 발명의 SFRP-4-결합제는 추가로 이종 폴리펩티드로 N- 또는 C-말단에서 재조합적으로 융합되거나, 또는 폴리펩티드 또는 다른 조성물로 화학적으로 접합될 수 있다 (공유결합 및 비공유결합 접합을 포함함). 예를 들어, 본 발명의 SFRP-4-결합제는 검출 검정법에서 표지로서 유용한 분자, 및 이펙터 분자, 예컨대 이종 폴리펩티드, 약물 또는 독소로 재조합적으로 융합되거나 또는 접합될 수 있다. 예를 들어, 제WO 92/08495호; 제WO 91/14438호; 제WO 89/12624호; 미국 특허 제5,314,995호; 및 제EP 0 396 387호를 참조한다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 SFRP-4-결합제는 본 발명의 SFRP-4-결합제 접합체 단백질을 수득하기 위해 하나 이상의 치료 잔기 또는 세포독성 잔기로 커플링되거나 또는 접합된 항-SFRP-4 항체 또는 항-SFRP-4 항체-관련 폴리펩티드이다. 본 발명의 SFRP-4-결합제 접합체 단백질은 주어진 생물학적 반응을 변형하거나 또는 생물학적 반응을 생성하기 위해 (예를 들어, 이펙터 세포를 동원하기 위해) 사용될 수 있다. 치료 잔기는 전통적인 화학 치료제로 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 치료 잔기는 원하는 생물학적 활성을 프로세싱하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질로는 예를 들어 효소적으로 활성인 독소, 또는 그의 활성 단편, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예컨대 종양 괴사 인자 또는 인터페론-알파; 또는 생물학적 반응 변형제, 예를 들어 림포카인, 인터루킨-1 ("IL-1"), 인터루킨-2 ("IL-2"), 인터루킨-6 ("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 ("GM- CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF"), 또는 다른 성장 인자를 들 수 있다.

본 발명의 SFRP-4-결합제의 제조 방법

일반적인 개요. 초기에 표적 폴리펩티드는 결합제 (예를 들어, 항-SFRP-4 항체)가 증가될 수 있도록 선택된다. 표적 폴리펩티드로 지정된 결합제의 제조 기술은 당업자에게 익히 공지되어 있다.

천연 항체만이 본 명세서에 따라 사용하기 위한 결합제로서 적합한 것이 아니라, SFRP-4 폴리펩티드로 지정된, 재조합적으로 조작된 항체 및 항체 단편, 예를 들어 항체-관련 폴리펩티드가 또한 적합하다는 것이 이해되어야 한다.

본원에 나열된 기술로 처리될 수 있는 결합제, 예를 들어 항-SFRP-4 항체로는 모노클로날 및 폴리클로날 항체, 및 항체 단편, 예컨대 Fab, Fab', F(ab')₂, Fd, scFv, 디아바디, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 항체 단편이 포함된다. 항체 Fv-함유 폴리펩티드, 예를 들어 Fab' 및 F(ab')₂ 항체 단편의 고수율 제조에 유용한 방법이 기재되어 있다. 미국 특허 제5,648,237호를 참조한다.

기원 종은 본 발명의 결합제 또는 결합제의 라이브러리의 제조에 유용한 임의의 종, 예를 들어 래트, 마우스, 토끼, 닭, 원숭이, 인간 등이다.

바람직한 실시양태에서, SFRP-4-결합제는 항-SFRP-4 항체이다. 파지 또는 파지미드 디스플레이 기술은 본 발명의 결합제를 유도하는데 유용한 기술이다. 본 발명에 유용한 항-SFRP-4 항체는 "인간 항체" (예를 들어, 인간으로부터 단리된 항체) 또는 "인간 서열 항체"이다. 인간 항체는 파지 디스플레이 방법을 비롯한 당분야에 공지된 각종 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 미국 특허 제4,444,887호, 제4,716,111호, 제5,545,806호 및 제5,814,318호; 및 제WO 98/46645호, 제WO 98/50433호, 제WO 98/24893호, 제WO 98/16654호, 제WO 96/34096호, 제WO 96/33735호 및 제WO 91/10741호를 참조한다. 폴리파지 입자의 스크리닝에 의한 다합체 폴리펩티드 복합체의 구성원을 코딩하는 핵산 서열의 확인에 유용한 방법은 루더트(Rudert) 등의 미국 특허 제6,667,150호에 기재되어 있다. 재조합 이뮤노글로불린이 또한 제조될 수 있다 (카빌리의 미국 특허 제4,816,567; 카빌리 등의 미국 특허 제6,331,415호 및 문헌 [Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033, 1989]). 모노클로날 항체의 제조 기술 및 클로닝 기술은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 본 발명의 SFRP-4-결합제는 바람직하게는 높은 면역반응성, 즉 그의 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있도록 올바르게 폴딩된 항체 분자의 백분율을 갖는다. 결합제, 예를 들어 본 발명의 항체를 코딩하는 서열의 발현은 하기 기재된 바와 같이 이. 콜라이(E. coli)에서 수행될 수 있다. 이러한 발현은 통상적으로 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 면역반응성을 야기한다.

폴리클로날 항혈청 및 면역원의 제조. 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 제조 방법은 전형적으로 대상체 (일반적으로 비인간 대상체, 예컨대 마우스 또는 토끼)를 정제된 SFRP-4 폴리펩티드로 또는 SFRP-4 폴리펩티드를 발현하는 세포로 면역화하는 것을 포함한다. SFRP-4의 임의의 면역원성 부분은 면역원으로서 사용될 수 있다. 적절한 면역원성 제제는 예를 들어 재조합적으로-발현된 SFRP-4 폴리펩티드 또는 화학적으로-합성된 SFRP-4 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 단리된 SFRP-4 폴리펩티드, 또는 그의 부분 또는 단편은 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 제조를 위한 표준 기술을 사용하여 SFRP-4 폴리펩티드, 또는 그의 부분 또는 단편에 결합하는 SFRP-4-결합제의 제조를 위해 면역원으로서 사용될 수 있다. 전장 SFRP-4 폴리펩티드가 사용될 수 있거나, 또는 대안으로 본 발명은 면역원으로서 SFRP-4 폴리펩티드 단편의 용도를 제공한다. SFRP-4 폴리펩티드는 서열 1에 나타낸 아미노산 서열의 4개 이상의 아미노산 잔기를 포함하며, SFRP-4 폴리펩티드의 에피토프를 포함하여, 펩티드에 대해 증가된 항체가 SFRP-4 폴리펩티드와 특이적 면역 복합체를 형성하게 한다. 바람직하게는, 항원성 펩티드는 5, 8, 10, 15, 20 또는 30개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 용도에 따라 및 당업자에게 익히 공지된 방법에 따라 긴 항원성 펩티드가 짧은 항원성 펩티드보다 종종 바람직하다. 전형적으로, 면역원은 약 8개 이상의 아미노 아실 잔기 길이, 및 바람직하게는 약 10개 이상의 아실 잔기 길이이다. 주어진 에피토프의 다합체는 종종 단량체보다 더 효과적이다.

필요하다면, SFRP-4 (또는 그의 단편)의 면역원성은 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌 (KLH) 또는 난알부민 (OVA)과 같은 합텐으로의 융합 또는 접합에 의해 증가될 수 있다. 많은 이러한 합텐은 당분야에 공지되어 있다. 또한, 폴리펩티드에 대한 대상체의 면역 반응을 증가시키기 위해 SFRP-4 폴리펩티드를 통상적인 아쥬반트, 예컨대 프로인트의 완전 또는 불완전 아쥬반트와 합할 수 있다. 면역학적 반응의 증가에 사용되는 여러 아쥬반트로는 프로인트의 (완전 및 불완전), 광물 겔 (예를 들어, 수산화알루미늄), 계면활성제 (예를 들어, 리졸레시틴, 플루로닉 폴리올, 다음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 디니트로페놀 등), 인간 아쥬반트, 예컨대 바실러스 칼메트-구에린 및 코리네박테륨 파르붐(Corynebacterium parvum), 또는 유사한 면역자극 화합물이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 이들 기술은 당분야에 표준이다.

적절한 면역화 후, SFRP-4-결합제, 예를 들어 항-SFRP-4 폴리클로날 항체는 대상체의 혈청으로부터 제조될 수 있다. 원한다면, SFRP-4 폴리펩티드에 대해 지정된 항체 분자는 포유동물로부터 (예를 들어, 혈액으로부터) 단리되고, 익히 공지된 기술, 예컨대 폴리펩티드 A 크로마토그래피에 의해 추가로 정제되어, IgG 분획을 얻을 수 있다.

모노클로날 항체. 본 발명의 한 실시양태에서, 결합제는 항-SFRP-4 모노클로날 항체이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항-SFRP-4 모노클로날 항체는 인간 항-SFRP-4 모노클로날 항체이다. 특정 SFRP-4 폴리펩티드, 또는 그의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체에 대해 지정된 모노클로날 항체의 제조를 위해, 연속 세포주 배양에 의한 항체 분자의 제조를 제공하는 임의의 기술이 사용될 수 있다. 이러한 기술로는 하이브리도마 기술 (예를 들어, 문헌 [Kohler & Milstein, 1975. Nature 256: 495-497] 참조); 트리오마 기술; 인간 B-세포 하이브리도마 기술 (예를 들어, 문헌 [Kozbor, et al., 1983. Immunol. Today 4: 72] 참조) 및 인간 모노클로날 항체의 제조를 위한 EBV 하이브리도마 기술 (예를 들어, 문헌 [Cole, et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Alan R. Liss, Inc., 1985) pp. 77-96] 참조)이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 인간 모노클로날 항체는 본 발명의 실시에 사용될 수 있으며, 인간 하이브리도마를 사용함으로써 (예를 들어, 문헌 [Cote, et al., Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030 (1983)] 참조) 또는 인간 B-세포를 엡스타인 바르 바이러스에 의해 시험관내 형질전환함으로써 (예를 들어, 문헌 [Cole, et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Alan R. Liss, Inc., 1985) pp. 77-96] 참조) 제조될 수 있다. 대안으로, 항-SFRP-4 모노클로날 항체를 발현하는 하이브리도마는 대상체를 면역화한 후, 통상적인 방법을 사용하여 대상체의 비장으로부터 하이브리도마를 단리함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Galfre & Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)]을 참조한다. 표준 방법을 사용하는 하이브리도마의 스크리닝은 다양한 특이성 (즉, 상이한 에피토프에 대해) 및 친화성을 갖는 모노클로날 항체를 제조할 것이다. 원하는 특성, 예를 들어 SFRP-4 결합성을 갖는 선택된 모노클로날 항체는 하이브리도마에 의해 발현된 바와 같이 사용될 수 있거나, 또는 그의 특성을 변경하는 분자, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 결합될 수 있거나, 또는 이를 코딩하는 cDNA는 여러 방법으로 단리되고, 서열분석되고 조작될 수 있다. 하이브리도마 기술에는 당분야에 공지되고 문헌 [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 349 (1988)]; [Hammerling et al., Monoclonal Antibodies And T-Cell Hybridomas, 563-681 (1981)]에 교시된 기술이 포함된다. 하이브리도마 및 모노클로날 항체의 다른 제조 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있다.

파지 디스플레이 기술. 상기 주목된 바와 같이, 본 발명의 결합제는 재조합 DNA 및 파지 디스플레이 기술의 적용을 통해 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 결합제, 예를 들어 항-SFRP-4 항체는 당분야에 공지된 여러 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 파지 디스플레이 방법에서, 관능성 항체 도메인은 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 운반하는 파지 입자의 표면 상에 디스플레이된다. 원하는 결합 특성을 갖는 파지는 항원, 전형적으로 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 또는 포획된 항원으로 직접적으로 선택함으로써 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리 (예를 들어, 인간 또는 뮤린)로부터 선택된다. 이들 방법에서 사용되는 파지는 전형적으로 Fab를 갖는 fd 및 M13을 비롯한 섬유상 파지이며, Fv 또는 디술피드 안정화된 Fv 항체 도메인은 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합적으로 융합된다. 또한, 방법은 SFRP-4 폴리펩티드, 예를 들어 폴리펩티드 또는 그의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체에 대한 원하는 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편의 빠르고 효과적인 확인을 위한, Fab 발현 라이브러리 (예를 들어, 문헌 [Huse, et al., Science 246: 1275-1281, 1989] 참조)의 구축을 위해 채택될 수 있다. 본 발명의 결합제의 제조에 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 다른 예로는 문헌 [Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85: 5879-5883, 1988]; [Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 87: 1066-1070, 1990]; [Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182: 41-50, 1995]; [Ames et al., J. Immunol. Methods 184: 177-186, 1995]; [Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24: 952-958, 1994]; [Persic et al., Gene 187: 9-18, 1997]; [Burton et al., Advances in Immunology 57: 191-280, 1994]; 제PCT/GB91/01134호; 제WO 90/02809호; 제WO 91/10737호; 제WO 92/01047호; 제WO 92/18619호; 제WO 93/11236호; 제WO 95/15982호; 제WO 95/20401호; 제WO 96/06213호; 제WO 92/01047호 (메디컬 리써치 카운실(Medical Research Council) 등); 제WO 97/08320호 (모르포시스(Morphosys)); 제WO 92/01047호 (CAT/MRC); 제WO 91/17271호 (아피맥스(Affymax)); 및 미국 특허 제5,698,426호, 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,580,717호, 제5,427,908호, 제5,750,753호, 제5,821,047호, 제5,571,698, 제5,427,908호, 제5,516,637호, 제5,780,225호, 제5,658,727호 및 제5,733,743호에 개시된 것이 포함된다. 디술피드 결합을 통한 폴리펩티드의 부착에 의한 박테리오파지 입자의 표면 상의 폴리펩티드의 디스플레이에 유용한 방법은 로닝(Lohning)의 미국 특허 제6,753,136호에 기재되어 있다. 상기 참고문헌에 기재된 바와 같이, 파지 선택 후, 파지로부터의 항체 코딩 영역은 단리되고, 인간 항체를 비롯한 온전한 항체, 또는 임의의 다른 원하는 항원 결합 단편의 제조를 위해 사용되고, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아를 비롯한 임의의 원하는 숙주에서 발현될 수 있다. 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')₂ 단편의 재조합적 제조 기술은 또한 당분야에 공지된 방법, 예컨대 제WO 92/22324호; 문헌 [Mullinax et al., BioTechniques 12: 864-869, 1992]; 및 [Sawai et al., AJRI 34: 26-34, 1995]; 및 [Better et al., Science 240: 1041-1043, 1988]에 개시된 방법을 사용하여 사용될 수 있다.

일반적으로, 디스플레이 벡터로 클로닝된 하이브리드 항체 또는 하이브리드 항체 단편은 양호한 결합 활성을 유지하는 변이체를 확인하기 위해 적절한 항원에 대해 선택될 수 있으며, 이는 항체 또는 항체 단편이 파지 또는 파지미드 입자의 표면 상에 존재할 것이기 때문이다. 예를 들어, 문헌 [Barbas III et al., Pharge Display, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001)]을 참조한다. 그러나, 다른 벡터 형식은 상기 프로세스, 예컨대 선택 및/또는 스크리닝을 위한 용균성 파지 벡터 (변형된 T7 또는 람다 Zap 시스템)로의 항체 단편 라이브러리의 클로닝에 사용될 수 있다.

Sfrp-4-결합제를 코딩하는 핵산의 라이브러리. 상기 방법은 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드에 대한 특이적 친화성을 갖는 SFRP-4-결합제, 예를 들어 항-SFRP-4 항체 쇄를 코딩하는 핵산 서열의 라이브러리를 야기한다. 핵산의 라이브러리는 전형적으로 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸ 또는 10⁹개 이상의 상이한 구성원을 갖는다. 통상적으로, 단일 구성원은 라이브러리에서 총 서열의 25% 또는 50% 초과를 차지하지 않는다. 전형적으로, 라이브러리 구성원의 25%, 50%, 75%, 90%, 95%, 99% 또는 99.9% 이상은 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드에 대한 특이적 친화성을 갖는 SFRP-4-결합제를 코딩한다. 이중 쇄 항-SFRP-4 항체 라이브러리의 경우, 중쇄 및 경쇄를 각각 코딩하는 핵산 절편의 쌍은 라이브러리 구성원이라고 여겨진다. 핵산 라이브러리는 임의의 벡터의 성분으로서 유리 형태로 또는 벡터의 성분으로서 숙주 세포로 형질감염된 형태로 존재할 수 있다. 생체내 절차를 요구하지 않는, 항원 조합 분자 또는 항체를 코딩하는 유전자의 라이브러리의 제조에 유용한 방법은 위글러(Wigler) 등의 미국 특허 제6,303,313호 및 제6,479,243호에 기재되어 있다.

재조합 SFRP-4-결합제의 발현. 상기 주목된 바와 같이, 본 발명의 결합제는 재조합 DNA 기술의 적용을 통해 제조될 수 있다. 본 발명의 SFRP-4-결합제를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 구축물은 전형적으로 천연-관련 또는 이종 프로모터 영역을 비롯한 항-SFRP-4 항체 쇄의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함한다. 이와 같이, 본 발명의 다른 측면은 본 발명의 SFRP-4-결합제를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 함유하는 벡터를 포함한다. 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드의 재조합 발현을 위해, SFRP-4-결합제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전체 또는 부분을 함유하는 핵산은 당분야에 익히 공지되고 하기 상세히 기재된 재조합 DNA 기술에 의해 적절한 클로닝 벡터 또는 발현 벡터 (즉, 삽입된 폴리펩티드 코딩 서열의 전사 및 번역을 위한 필수적 요소를 함유하는 벡터)로 삽입된다. 벡터의 다양한 집단의 제조 방법은 러너(Lerner) 등의 미국 특허 제6,291,160호 및 제6,680,192호에 기재되어 있다.

일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 벡터가 적절한 숙주로 혼입되면, 숙주는 SFRP-4-결합제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 높은 수준 발현, 및 SFRP-4-결합제, 예를 들어 교차-반응 항-SFRP-4 항체의 수집 및 정제에 적합한 조건하에 유지된다. 일반적으로 미국 출원 제20020199213호를 참조한다. 벡터는 또한 세포외 항체 단편의 분비의 지시에 유용한 신호 펩티드, 예를 들어 펙트산 분해효소(lyase)를 코딩할 수 있다. 미국 특허 제5,576,195호를 참조한다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 SFRP-4-결합 특성을 갖는 화합물을 코딩하는 핵산을 포함하며, 이는 재조합 발현 벡터가, 발현되는 핵산 서열로 작동가능하게 연결된, 발현을 위해 사용되는 숙주 세포를 기준으로 선택된 하나 이상의 조절 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 이러한 조절 서열은 예를 들어 문헌 [Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, 185 (Academic Press, San Diego, Calif., 1990)]에 기재되어 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 SFRP-4-결합제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 ara B 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있으며, 숙주 세포에서 발현가능하다. 미국 특허 제5,028,530호를 참조한다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포로 도입될 수 있으며, 이에 의해 본원에 기재된 바와 같이 핵산에 의해 코딩되는 융합 폴리펩티드를 비롯한 폴리펩티드 또는 펩티드 (예를 들어, SFRP-4-결합제 등)가 제조된다.

본 발명의 다른 측면은 하나 이상의 SFRP-4-결합제를 코딩하는 핵산을 함유하는 SFRP-4-결합제-발현 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 SFRP-4-결합제의 발현을 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, SFRP-4-결합제는 박테리아 세포, 예컨대 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 곤충 세포 (바쿨로바이러스 발현 벡터를 사용함), 진균 세포, 예를 들어 효모, 효모 세포 또는 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 추가로 문헌 [Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, 185 (Academic Press, San Diego, Calif., 1990)]에 논의되어 있다. 대안으로, 재조합 발현 벡터는 예를 들어 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 폴리머라제를 사용하여 시험관내에서 전사되고 번역될 수 있다. 확률적으로 생성된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 통한, 예정된 특성을 갖는 폴리펩티드, 예를 들어 SFRP-4-결합제의 제조 스크리닝에 유용한 방법이 기재되어 있다. 미국 특허 제5,763,192호; 제5,723,323호; 제5,814,476호; 제5,817,483호; 제5,824,514호; 제5,976,862호; 제6,492,107호; 제6,569,641호를 참조한다.

원핵생물에서의 폴리펩티드의 발현은 가장 흔히 이. 콜라이에서 융합 또는 비-융합 폴리펩티드의 발현을 지정하는 구성적(constitutive) 또는 유도가능한 프로모터를 함유하는 벡터로 수행된다. 전형적인 융합 발현 벡터로는 글루타치온 S-트랜스퍼라제 (GST), 말토스 E 결합 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드 A 각각을 표적 재조합 폴리펩티드로 융합시키는 pGEX (파마시아 바이오테크 인크(Pharmacia Biotech Inc); 문헌 [Smith & Johnson, Gene 67: 31-40 (1988)]), pMAL (미국 매사추세츠주 비버리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)) 및 pRIT5 (미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재의 파마시아(Pharmacia))가 포함된다.

적합한 유도가능한 비-융합 이. 콜라이 발현 벡터의 예로는 pTrc (문헌 [Amrann et al., (1988) Gene 69: 301-315]) 및 pET 11d (문헌 [Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, 185 (Academic Press, San Diego, Calif., 1990) pp. 60-89])를 들 수 있다. 폴리펩티드 융합을 통해 다관능성 폴리펩티드를 수득하기 위한 별개의 활성 펩티드 또는 단백질 도메인의 표적화된 어셈블리 방법은 팩(Pack) 등의 미국 특허 제6,294,353호 및 제6,692,935호에 기재되어 있다. 이. 콜라이에서 재조합 폴리펩티드 (예를 들어, SFRP-4-결합제) 발현을 최대화하기 위한 전략 중 하나는 재조합 폴리펩티드를 단백질분해적으로 절단하는 손상된 성능을 갖는 숙주 박테리아에서 폴리펩티드를 발현하는 것이다. 예를 들어, 문헌 [Gottesman, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, 185 (Academic Press, San Diego, Calif., 1990) pp. 119-128]을 참조한다. 다른 전략은 발현 벡터로 삽입되는 핵산의 핵산 서열을 변경하여, 각 아미노산에 대한 개별 코돈이 발현 숙주, 예를 들어 이. 콜라이에서 우선적으로 사용되게 하는 것이다 (예를 들어, 문헌 [Wada, et al., Nucl. Acids Res. 20: 2111-2118, 1992]). 본 발명의 핵산 서열의 이러한 변경은 표준 DNA 합성 기술에 의해 수행될 수 있다.

다른 실시양태에서, SFRP-4-결합제 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)에서의 발현을 위한 벡터의 예로는 pYepSec1 (문헌 [Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234]), pMFa (문헌 [Kurjan & Herskowitz, Cell 30: 933-943, 1982]), pJRY88 (문헌 [Schultz et al., Gene 54: 113-123, 1987]), pYES2 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corporation)) 및 picZ (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 인비트로겐 코포레이션)을 들 수 있다. 대안으로, SFRP-4-결합제는 바쿨로바이러스 발현 벡터를 사용하여 곤충 세포에서 발현될 수 있다. 곤충 세포 (예를 들어, SF9 세포)에서 배양된, 폴리펩티드, 예를 들어 SFRP-4-결합제의 발현에 이용가능한 바쿨로바이러스 벡터로는 pAc 시리즈 (문헌 [Smith, et al., Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165, 1983]) 및 pVL 시리즈 (문헌 [Lucklow & Summers, Virology 170: 31-39 (1989)])를 들 수 있다.

또다른 실시양태에서, 본 발명의 SFRP-4-결합제를 코딩하는 핵산은 포유동물 발현 벡터를 사용하여 포유동물 세포에서 발현된다. 포유동물 발현 벡터의 예로는 예를 들어 pCDM8 (문헌 [Seed,. Nature 329: 840, 1987]) 및 pMT2PC (문헌 [Kaufman et al., EMBO J. 6: 187-195, 1987])가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 포유동물 세포에서 사용되는 경우, 발현 벡터의 제어 기능은 종종 바이러스 조절 요소에 의해 제공된다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스 및 시미안 바이러스 40으로부터 유래된다. 본 발명의 SFRP-4-결합제의 발현에 유용한 원핵 및 진핵 세포 둘 모두를 위한 다른 적합한 발현 시스템에 대해서는 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)]의 제16장 및 제17장을 참조한다.

다른 실시양태에서, 재조합 포유동물 발현 벡터는 특정 세포 유형에서의 핵산의 우선적 발현을 지정할 수 있다 (예를 들어, 조직-특이적 조절 요소는 핵산을 발현하는데 사용됨). 조직-특이적 조절 요소는 당분야에 공지되어 있다. 적합한 조직-특이적 프로모터의 비제한적 예로는 알부민 프로모터 (간-특이적; 문헌 [Pinkert, et al., Genes Dev. 1: 268-277 (1987)]), 림프양-특이적 프로모터 (문헌 [Calame & Eaton, Adv. Immunol. 43: 235-275 (1988)]), 특히 T 세포 수용체의 프로모터 (문헌 [Winoto & Baltimore, EMBO J. 8: 729-733 (1989)]) 및 이뮤노글로불린 (문헌 [Banerji, et al., Cell 33: 729-740 (1983)]; [Queen & Baltimore, Cell 33: 741-748 (1983)]), 신경세포-특이적 프로모터 (예를 들어, 신경필라멘트 프로모터; 문헌 [Byrne & Ruddle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477 (1989)]), 췌장-특이적 프로모터 (문헌 [Edlund et al., Science 230: 912-916 (1985)]), 및 유선-특이적 프로모터 (예를 들어, 유장 프로모터; 미국 특허 제4,873,316호 및 유럽 출원 공보 제264,166호)를 들 수 있다. 발생적으로-조절된 프로모터, 예를 들어 뮤린 hox 프로모터 (문헌 [Kessel & Gruss, Science 249: 374-379 (1990)]) 및 α-태아단백질 프로모터 (문헌 [Campes & Tilghman,. Genes Dev. 3: 537-546 (1989)])가 또한 포함된다.

본 발명의 다른 측면은 본 발명의 재조합 발현 벡터가 도입되는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 임의의 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, SFRP-4-결합제는 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이, 곤충 세포, 효모 또는 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 포유동물 세포는 이뮤노글로불린 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 절편의 발현에 바람직한 숙주이다. 문헌 [Winnacker, From Genes To Clones, (VCH Publishers, NY, 1987)]을 참조한다.

숙주 세포의 형질전환 또는 형질감염에 적합한 방법은 문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)] 및 다른 실험 안내서에서 찾을 수 있다.

재조합 폴리펩티드의 정제는 당분야에 익히 공지되어 있으며, 황산암모늄 침전, 친화성 크로마토그래피 정제 기술, 컬럼 크로마토그래피, 이온 교환 정제 기술, 겔 전기영동 등 (일반적으로, 문헌 [Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982)] 참조)이 포함된다.

폴리클로날 항-SFRP-4 항체의 라이브러리를 제공하기 위한 핵산의 발현. 핵산 라이브러리는 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드에 대한 특이적 친화성을 갖는 SFRP-4-결합제, 예를 들어 항-SFRP-4-결합 항체의 폴리클로날 라이브러리의 제조를 위해 발현될 수 있다. 이러한 라이브러리의 조성물은 뉴클레오티드 라이브러리의 조성물로부터 결정된다. 따라서, 이러한 라이브러리는 전형적으로 상이한 아미노산 조성물과 함께 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸ 또는 10⁹개 이상의 구성원을 갖는다. 통상적으로, 단일 구성원은 라이브러리에서 총 폴리펩티드의 25% 또는 50% 초과를 차지하지 않는다. SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드에 대한 특이적 친화성을 갖는 항-SFRP-4 항체 쇄 라이브러리 중 항-SFRP-4 항체 쇄의 백분율은 전형적으로 항-SFRP-4 항체 쇄를 코딩하는 상응하는 핵산의 백분율 미만이다. 상이함은 모든 폴리펩티드가 적절한 폴딩을 지지하는 적절한 일차 아미노산 서열을 갖지만 결합에 적절한 구조로 폴딩하는 것은 아니라는 사실 때문이다. 몇몇 라이브러리에서, 항-SFRP-4 항체 쇄의 25%, 50%, 75%, 90%, 95%, 99% 또는 99.9% 이상은 표적 분자에 대한 특이적 친화성을 갖는다. 다시, 다연쇄 항체의 라이브러리에서, 항-SFRP-4 항체 (예컨대, Fab 또는 무손상 항체) 각각은 라이브러리 구성원이라고 여겨진다. 상이한 항-SFRP-4 항체 쇄는 표적에 대한 양호한 결합 특이성 및 친화성의 측면에서 서로 상이하다. 이러한 라이브러리 몇몇은 동일한 항원, 예를 들어 SFRP-4 폴리펩티드 상의 상이한 에피토프에 결합하는 구성원을 포함한다. 이러한 라이브러리는 서로 경쟁하지 않고 동일한 항원에 결합하는 2종 이상의 구성원을 포함할 수 있다.

상기 방법으로부터 기인된 인간 항-SFRP-4 항체의 폴리클로날 라이브러리는 상기 라이브러리에서 고친화성 결합제의 높은 백분율에 의해 인간 항체의 천연 집단과 구별되며, 상기 라이브러리는 전형적으로 천연 집단에 존재하는 항체의 동일한 다양성을 나타내지 않는다. 감소된 다양성의 라이브러리는 모든 인간 이뮤노글로불린 유전자를 포함하지 않는 공급원 물질을 제공하는 비인간 트랜스제닉 동물로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 폴리클로날 항체 라이브러리는 람다 경쇄를 갖는 항-SFRP-4 항체를 포함하지 않는다. 본 발명의 몇몇 항-SFRP-4 폴리클로날 항체 라이브러리는 10, 20, 30 또는 40개 미만의 V_H 유전자에 의해 코딩된 항체 중쇄를 갖는다. 본 발명의 몇몇 폴리클로날 항-SFRP-4 항체 라이브러리는 10, 20, 30 또는 40개 미만의 V_L 유전자에 의해 코딩된 항체 경쇄를 갖는다.

단일 쇄 항체. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합제는 단일 쇄 항-SFRP-4 항체이다. 본 발명에 따라, 기술은 SFRP-4 폴리펩티드에 특이적인 단일쇄 항체의 제조를 위해 채택될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,946,778호 참조). 본 발명의 단일쇄 Fv 및 항체의 제조에 사용될 수 있는 기술의 예로는 미국 특허 제4,946,778호 및 제5,258,498호; 문헌 [Huston et al., Methods in Enzymology, 203: 46-88, 1991]; [Shu, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7995-7999, 1993]; 및 [Skerra et al., Science 240: 1038-1040, 1988]에 기재된 기술을 들 수 있다.

키메라 및 인간화 항체. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합제는 키메라 항-SFRP-4 항체이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합제는 인간화 항-SFRP-4 항체이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 공여 항체 및 수용 항체는 상이한 종으로부터의 모노클로날 항체이다. 예를 들어, 수용 항체는 인간 항체 (인간에서 그의 항원성을 최소화함)이며, 이 경우 얻어진 CDR-그라프팅된 항체는 "인간화" 항체라고 지칭된다.

인간 및 비인간 부분 둘 모두를 포함하는 재조합 항-SFRP-4 항체, 예컨대 키메라 및 인간화 모노클로날 항체는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있으며, 본 발명의 범위 내에 포함된다. 인간에서 본 발명의 결합제의 생체내 용도, 뿐만 아니라 시험관내 검출 검정법에서 이들 작용제의 용도를 비롯한 몇몇 용도에서, 키메라, 인간화 또는 인간 항-SFRP-4 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 키메라 및 인간화 모노클로날 항체는 당분야에 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 이러한 유용한 방법으로는 예를 들어 국제 출원 제PCT/US86/02269호; 미국 특허 제5,225,539호; 유럽 특허 출원 제184,187호; 유럽 특허 출원 제171,496호; 유럽 특허 출원 제173,494호; PCT 국제 공보 제WO 86/01533호; 미국 특허 제4,816,567호; 제5,225,539호; 유럽 특허 출원 제125,023호; 문헌 [Better, et al., 1988. Science 240: 1041-1043]; [Liu, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443]; [Liu, et al., 1987. J. Immunol. 139: 3521-3526]; [Sun, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218]; [Nishimura, et al., 1987. Cancer Res. 47: 999-1005]; [Wood, et al., 1985. Nature 314: 446-449]; [Shaw, et al., 1988. J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559)]; [Morrison (1985) Science 229: 1202-1207]; [Oi, et al. (1986) BioTechniques 4: 214]; [Jones, et al., 1986. Nature 321: 552-525]; [Verhoeyan, et al., 1988. Science 239: 1534]; [Morrison, Science 229: 1202, 1985]; [Oi et al., BioTechniques 4: 214, 1986]; [Gillies et al., J. Immunol. Methods, 125: 191-202, 1989]; 미국 특허 제5,807,715호; 및 문헌 [Beidler, et al., 1988. J. Immunol. 141: 4053-4060]에 기재된 방법이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 항체는 CDR-그라프팅 (제EP 0 239 400호; 제WO 91/09967호; 미국 특허 제5,530,101호: 제5,585,089호; 제5,859,205호; 제6,248,516호; 제EP460167호), 베니어링(veneering) 또는 재표면화 (제EP 0 592 106호; 제EP 0 519 596호; 문헌 [Padlan E. A., Molecular Immunology, 28: 489-498, 1991]; [Studnicka et al., Protein Engineering 7: 805-814, 1994]; [Roguska et al., PNAS 91: 969-973, 1994]) 및 연쇄 셔플링 (미국 특허 제5,565,332)을 비롯한 각종 기술을 사용하여 인간화될 수 있다. 한 실시양태에서, 뮤린 항-SFRP-4 모노클로날 항체를 코딩하는 cDNA는 Fc 불변 영역을 코딩하는 서열을 제거하기 위해 특이적으로 선택된 제한 효소에 의해 소화되고, 인간 Fc 불변 영역을 코딩하는 cDNA의 등가 부분은 치환된다 (로빈슨(Robinson) 등의 제PCT/US86/02269호; 아키라(Akira) 등의 유럽 특허 출원 제184,187호; 타니구치(Taniguchi)의 유럽 특허 출원 제171,496호; 모리슨(Morrison) 등의 유럽 특허 출원 제173,494호; 노이베르거 등의 제WO 86/01533호; 카빌리 등의 미국 특허 제4,816,567호; 카빌리 등의 유럽 특허 출원 제125,023호; 문헌 [Better et al. (1988) Science 240: 1041-1043]; [Liu et al. (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84: 3439-3443]; [Liu et al. (1987) J Immunol 139: 3521-3526]; [Sun et al. (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84: 214-218]; [Nishimura et al. (1987) Cancer Res 47: 999-1005]; [Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449]; 및 [Shaw et al. (1988) J Natl Cancer Inst 80: 1553-1559]; 미국 특허 제6,180,370호; 미국 특허 제6,300,064호; 제6,696,248호; 제6,706,484호; 제6,828,422호 참조).

CDR 항체. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합제는 항-SFRP-4 CDR 항체이다. 일반적으로, 항-SFRP-4 CDR 항체의 제조에 사용되는 공여 항체 및 수용 항체는 상이한 종으로부터의 모노클로날 항체이며; 전형적으로, 수용 항체는 인간 항체 (인간에서 그의 항원성을 최소화함)이며, 이 경우 얻어진 CDR-그라프팅된 항체는 "인간화" 항체라고 지칭된다. 그라프트는 수용 항체의 단일 V_H 또는 V_L 내의 단일 CDR (또는 단일 CDR의 부분 조차)일 수 있거나, 또는 V_H 또는 V_L 중 하나 또는 둘 모두 내의 다중 CDR (또는 그의 부분)일 수 있다. 흔히 수용 항체의 모든 가변 도메인 중 세가지 CDR 모두는 상응하는 공여 CDR로 대체될 것이나, MetAp3으로의 얻어진 CDR-그라프팅된 항체의 적절한 결합에 필수적으로 많은 만큼만 대체하는 것이 필요로 된다. CDR-그라프팅된 및 인간화 항체의 제조 방법은 퀸(Queen) 등의 미국 특허 제5,585,089호, 미국 특허 제5,693,761호; 미국 특허 제5,693,762호; 및 윈터(Winter)의 미국 특허 제5,225,539호; 및 제EP 0682040호에 교시되어 있다. V_H 및 V_L 폴리펩티드의 제조에 유용한 방법은 윈터 등의 미국 특허 제4,816,397호; 제6,291,158호; 제6,291,159호; 제6,291,161호; 제6,545,142호; 제EP 0368684호; 제EP0451216호; 제EP0120694호에 교시되어 있다.

동일한 족 및/또는 동일한 족 구성원으로부터 적합한 프레임워크 영역 후보를 선택한 후, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 중 하나 또는 둘 모두는 기원 종으로부터의 CDR을 하이브리드 프레임워크 영역으로 그라프팅함으로써 제조된다. 상기 측면에 대한 하이브리드 가변 쇄 영역을 갖는 하이브리드 항체 또는 하이브리드 항체 단편의 어셈블리는 당업자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 성취될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 하이브리드 가변 도메인을 코딩하는 DNA 서열 (즉, 표적 종에 기초한 프레임워크 및 기원 종으로부터의 CDR)은 올리고뉴클레오티드 합성 및/또는 PCR에 의해 제조될 수 있다. CDR 영역을 코딩하는 핵산은 또한 적합한 제한 효소를 사용하여 기원 종 항체로부터 단리되고, 적합한 라이게이션 효소에 의한 라이게이션에 의해 표적 종 프레임워크로 라이게이션될 수 있다. 대안으로, 기원 종 항체의 가변 쇄의 프레임워크 영역은 부위-지정 돌연변이유발에 의해 변화될 수 있다.

하이브리드가 각 프레임워크 영역에 상응하는 다중 후보 중에서 선택되어 구축되기 때문에, 본원에 기재된 원리에 따른 구축에 용이한 서열의 많은 조합이 존재한다. 따라서, 하이브리드의 라이브러리는 개체 프레임워크 영역의 상이한 조합을 갖는 구성원을 갖도록 어셈블리될 수 있다. 이러한 라이브러리는 서열의 전자 데이타베이스 수집 또는 하이브리드의 또는 물리적 수집일 수 있다.

상기 프로세스는 전형적으로 그라프팅된 CDR을 플랭킹하는 수용 항체의 FR을 변경하지 않는다. 그러나, FR을 공여 항체의 상응하는 FR과 보다 유사하게 제조하기 위해 주어진 FR의 특정 잔기를 대체함으로써 얻어진 항-SFRP-4 CDR 그라프팅된 항체의 항원 결합 친화성을 때로는 개선시킬 수 있다. 치환의 바람직한 위치는 CDR에 인접한 아미노산 잔기, 또는 CDR과 상호작용할 수 있는 잔기 (예를 들어, 제US 5,585,089호, 특히 컬럼 12 내지 16)를 포함한다. 또는, 공여 FR로 개시하고, 이를 수용체 FR 또는 인간 컨센서스 FR과 보다 유사하도록 변형할 수 있다. 이들 변형의 제조 기술은 당분야에 공지되어 있다. 특히, 얻어진 FR이 상기 위치에 대한 인간 컨센서스 FR과 맞거나, 또는 이러한 컨센서스 FR과 보다 동일하거나 또는 90% 이상 동일한 경우, 이렇게 하는 것은 전체 인간 FR을 갖는 동일한 항체와 비교하여 얻어진 변형된 항-SFRP-4 CDR 항체의 항원성을 유의하게 증가시키지 않을 수 있다.

T 세포 에피토프 변형에 의한 치료 단백질의 탈면역화. 임상에서 사용되는 많은 치료 단백질은 원하지 않는 항체 반응을 유발하는 것으로 나타났으며, 이는 몇몇 경우에 유해 사건으로 연결되었다. 본 발명의 한 실시양태에서, 재조합 항-SFRP-4 항체, SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-결합제는 그의 아미노산 서열에서 주어진 종의 T-세포에 대한 하나 이상의 잠재적 에피토프를 확인함으로써, 및 아미노산 서열을 변형하여 하나 이상의 T-세포 에피토프를 제거함으로써 주어진 종에 대해 비-면역원성 또는 덜 면역원성이 된다. 이는 주어진 종의 면역계에 노출되는 경우 폴리펩티드 또는 단백질의 면역원성을 제거하거나 또는 감소시킨다. 모노클로날 항체 및 다른 이뮤노글로불린-유사 분자는 특히 상기 방법으로 탈면역화되는 이점을 가질 수 있다. 예를 들어, 마우스-유래 이뮤노글로불린은 인간 치료 용도를 위해 탈면역화될 수 있다. 당분야에서 폴리펩티드 또는 단백질의 탈면역화 방법에 대해서는 예를 들어, 카르(Carr) 등의 미국 특허 출원 제20030153043호; 및 문헌 [De Groot, et al., AIDS Res. and Human Retroviruses 13: 539-541 (1997)]; [Schafer, et al., Vaccine 16: 1880-1884 (1998)]; [De Groot, et al., Dev. Biol. 112: 71-80 (2003)]; [De Groot, et al., Vaccine 19: 4385-4395 (2001)]; [Reijonen and Kwok Methods 29: 282-288]; [Novak, et al., J. Immunology 166: 6665-6670 (2001)]을 참조한다.

이디오타입 항체. SFRP-4 폴리펩티드에 대한 이디오타입을 함유하는 항체 단편은 (i) 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성된 F(ab')₂ 단편; (ii) F(ab')₂ 단편의 디술피드 브릿지의 환원에 의해 생성된 Fab 단편; (iii) 항체 분자의 파파인에 의한 처리 및 화합물의 환원에 의해 생성된 Fab 단편; 및 (iv) Fv 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는, 당분야에 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Greenspan et al., FASEB J. 7: 437-444, 1993] 및 [Nissinoff, J. Immunol. 147: 2429-2438, 1991]을 참조한다. 예를 들어, 폴리펩티드 다합체화 및/또는 본 발명의 폴리펩티드의 리간드로의 결합을 경쟁적으로 억제하고 이에 결합하는 항체는 폴리펩티드 다합체화 및/또는 결합 도메인을 "모방하여", 결과로서 표적 폴리펩티드 및/또는 그의 리간드에 결합하고 이를 중화시키는 항-이디오타입을 제조하는데 사용될 수 있다. 이러한 항-이디오타입 또는 이러한 항-이디오타입의 Fab 단편의 중화는 표적 폴리펩티드 리간드를 중화시키는 치료 요법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 항-이디오타입 항체는 본 발명의 폴리펩티드에 결합하고/거나 그의 리간드/수용체에 결합하여, 이에 의해 항-이디오타입 항체의 부재하에 관찰된 생물학적 활성의 수준에 대해 표적 폴리펩티드 생물학적 활성을 조정하는데, 예를 들어 증가시키거나 또는 감소시키는데 사용될 수 있다.

융합 단백질. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합제는 융합 단백질이다. 폴리펩티드의 취급을 용이하게 하는 펩티드 잔기의 첨가는 당분야에서 익숙하고 통상적인 기술이다. 본 발명의 SFRP-4-결합제, 예컨대 융합된 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하는 펩티드는 마커 서열로 융합될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 마커 아미노산 서열은 상업적으로 이용가능한 다른 많은 것들 중 헥사-히스티딘 펩티드, 예컨대 pQE 벡터에 제공된 태그 (미국 캘리포니아주 채스워스 에톤 애비뉴 9259 소재의 퀴아겐 인크.(QIAGEN, Inc.))이다. 문헌 [Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824, 1989]에 기재된 바와 같이, 예를 들어 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩티드 태그, "HA" 태그는 인플루엔자 혈구응집소 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응한다 (문헌 [Wilson et al., Cell 37: 767, 1984]).

따라서, 이들 상기 융합물 중 임의의 것은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 사용하여 조작될 수 있다. 또한, 융합 단백질은 증가된 생체내 반감기를 나타낼 수 있다.

디술피드-연결된 이량체 구조를 갖는 (IgG로 인해) 융합 단백질은 단량체 분비 단백질 또는 단백질 단편 단독보다 다른 분자의 결합 및 중화에 더 효율적일 수 있다 (문헌 [Fountoulakis et al., J. Biochem. 270: 3958-3964, 1995]).

유사하게, 제EP-A-O 464 533호 (캐나다 대응특허 제2045869호)에는 이뮤노글로불린 분자의 불변 영역의 여러 부분을 다른 인간 단백질 또는 그의 부분과 함께 포함하는 융합 단백질이 개시되어 있다. 많은 경우에, 융합 단백질 중 Fc 부분은 치료요법 및 진단에 이롭고, 따라서 예를 들어 개선된 약동학 특성을 야기할 수 있다. 제EP-A 0232 262호를 참조한다. 대안으로, 융합 단백질이 발현되고 검출되고 정제된 후 Fc 부분의 결실이 바람직할 것이다. 예를 들어, 융합 단백질이 면역화를 위한 항원으로서 사용되는 경우 Fc 부분은 치료요법 및 진단을 방해할 수 있다. 약물 개발에서, 예를 들어 hIL-5와 같은 인간 단백질은 hIL-5의 길항제를 확인하기 위한 고처리량 스크리닝 검정법을 위해 Fc 부분과 융합되었다 (문헌 [Bennett et al., J. Molecular Recognition 8: 52-58, 1995]; [K. Johanson et al., J. Biol. Chem., 270: 9459-9471, 1995]).

한 실시양태에서, 본 발명의 SFRP-4-결합제는 숙주 세포에서 발현시 봉입체를 형성하는 융합 단백질의 부분으로서 후보 결합제를 코딩하는 게놈 DNA 또는 EST를 사용하여 제조된다. 숙주 세포에서 발현시 봉입체를 형성하는 융합 단백질의 부분으로서 후보 결합제를 코딩하는 게놈 DNA 또는 EST의 제조에 유용한 방법이 기재되어 있다. 미국 특허 제6,653,068호; 미국 출원 일련번호 제20040157291호를 참조한다. 예를 들어, 봉입체는 표적 (폴리)펩티드에 특이적으로 결합하는 결합 파트너, 예를 들어 SFRP-4-결합제의 제조에 유용하다.

SFRP-4-결합제 접합체 단백질. 상기 주목된 바와 같이, 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 SFRP-4-결합제는 본 발명의 SFRP-4-결합제 접합체 단백질의 수득을 위해 하나 이상의 치료 잔기 또는 세포독성 잔기에 커플링되거나 또는 접합된 항-SFRP-4 항체이다. 임의로, 본 발명의 SFRP-4-결합제는 신생물 질환의 치료를 위한 투여에 의해 예시되는 바와 같이 SFRP-4-결합제-세포독소 접합체 분자로서 유용하다. 각종 이관능성 또는 다관능성 시약 (호모- 및 헤테로-관능성 둘 모두)(예컨대, 미국 일리노이주 락포드 소재의 피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Co.)의 카탈로그에 기재됨)이 링커기로서 사용될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 커플링은 예를 들어 아미노기, 카르복실기, 술프히드릴기 또는 산화된 탄수화물 잔기를 통해 영향을 받을 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,671,958호 참조).

대안적 커플링 방법으로서, 잔기는 예를 들어 미국 특허 제5,057,313호 및 제5,156,840호에 기재된 바와 같이 글리코실화 부위에서 산화된 탄수화물기를 통해 본 발명의 SFRP-4-결합제로 커플링될 수 있다. SFRP-4-결합제의 잔기로의 커플링의 또다른 대안적 방법은 비공유결합 결합 쌍, 예컨대 스트렙타비딘/바이오틴 또는 아비딘/바이오틴의 사용에 의한 방법이다. 이들 실시양태에서, 쌍의 한 구성원은 SFRP-4-결합제에 공유결합으로 커플링되고, 결합 쌍의 다른 구성원은 잔기로 공유결합으로 커플링된다.

절단가능한 링커. 세포독성 잔기 또는 치료 잔기가 본 발명의 면역접합체의 SFRP-4-결합제 부분으로부터 유리시 더 강력한 경우, 세포로의 내부화 도중 또는 상기 내부화 시점에 절단가능하거나 또는 세포외 환경에서 시간에 따라 점차적으로 절단가능한 링커기를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 많은 상이한 절단가능한 링커기가 기재되어 있다. 이들 링커기로부터의 세포독성 잔기의 세포내 방출의 예로는 예를 들어 디술피드 결합의 환원에 의한 절단 (예를 들어, 미국 특허 제4,489,710호), 광불안정성 결합의 조사에 의한 절단 (예를 들어, 미국 특허 제4,625,014호), 유도체화된 아미노산 측쇄의 가수분해에 의한 절단 (예를 들어, 미국 특허 제4,638,045호), 혈청 보체-매개 가수분해에 의한 절단 (예를 들어, 미국 특허 제4,671,958), 및 산-촉매된 가수분해에 의한 절단 (예를 들어, 미국 특허 제4,569,789)이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

한 실시양태에서, 본 발명의 SFRP-4-결합제는 하나 이상의 치료 잔기, 세포독성 잔기 및/또는 영상화 잔기로 커플링된다. 본 발명의 SFRP-4-결합제의 다중유도체화에 의해, 여러 세포독성 전략은 동시에 실시될 수 있거나, SFRP-4-결합제는 여러 시각화 기술을 위한 조영제로서 유용하게 제조될 수 있거나, 또는 치료 항체는 시각화 기술에 의한 트랙킹을 위해 표지될 수 있다. 한 실시양태에서, 세포독성 잔기의 다중 분자는 한 SFRP-4-결합제로 커플링된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 SFRP-4-결합제는 세포독성 잔기; 치료 잔기; 및 표지화/영상화 잔기로 구성된 군에서 선택된 2종 이상의 잔기의 혼합물로 커플링된다. 즉, 1종 초과의 유형의 잔기가 하나의 SFRP-4-결합제에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 치료 잔기, 예컨대 폴리뉴클레오티드 또는 안티센스 서열은 화학요법 또는 방사선독성요법의 효과를 증가시킬 뿐만 아니라 원하는 치료 효과를 얻기 위해 필수적인 요구되는 용량을 저하시키기 위해, 화학독성 잔기 또는 방사선독성 잔기와 함께 SFRP-4-결합제에 접합될 수 있다. 특정 실시양태와 무관하게, 1개 초과의 잔기를 갖는 면역접합체는 각종 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 1개 초과의 잔기는 SFRP-4-결합제로 직접적으로 커플링될 수 있거나, 또는 부착을 위한 다중 부위를 제공하는 링커 (예를 들어, 덴드리머)가 사용될 수 있다. 대안으로, 1개 초과의 세포독성 잔기를 보유하는 성능을 갖는 담체가 사용될 수 있다.

상기 설명된 바와 같이, SFRP-4-결합제는 직접적으로 또는 링커기를 통한 공유결합, 및 비공유결합을 비롯한 각종 방법으로 잔기를 보유할 수 있다. 한 실시양태에서, SFRP-4-결합 커플링된 단백질은 캡슐화 담체와 조합될 수 있다. 이는 화학독성요법 실시양태에서 특히 유용한데, 이는 치료 조성물이 표적 세포의 근처에 이를 농축시키는 동안 시간에 따라 SFRP-4-결합제 화학독성 잔기를 점차적으로 방출하게 할 수 있기 때문이다.

방사선핵종과 접합된 SFRP-4-결합제. 한 실시양태에서, 본 발명의 SFRP-4-결합제는 방사선핵종인 세포독성 잔기와 커플링된다. 본 발명의 세포독성 잔기로서 사용하기에 바람직한 방사선핵종은 약리학적 투여에 적합한 방사선핵종이다.

화학독성 잔기. 한 실시양태에서, 본 발명의 SFRP-4-결합제는 화학독성 잔기와 커플링된다. 본 발명에 유용한 바람직한 화학독성제로는 소분자 약물, 예컨대 메토트렉세이트, 피리미딘 유사체 및 퓨린 유사체가 포함되나 이에 제한되지 않는다.

단백질 독소. 한 실시양태에서, 본 발명의 SFRP-4-결합제는 단백질 독소 잔기와 커플링된다. 본 발명의 세포독성 잔기로서 사용하기에 바람직한 독소 단백질로는 예를 들어 악티노미세테스(Actinomycetes) 또는 스트렙토미세스(Streptomyces) 항생제, 듀오카르마이신, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜치신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신, 및 그의 유사체 또는 상동체가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 세포독성 잔기로서 사용하기에 바람직한 독소 단백질로는 추가로 리신, 아브린, 디프테리아 독소, 콜레라 독소, 겔로닌, 슈도모나스 외독소, 시겔라(Shigella) 독소, 억새풀 항바이러스 단백질, 및 의약 생화학 분야에 공지된 다른 독소 단백질이 포함된다. 이들 독소 작용제는 대상체에서 바람직하지 않은 면역 반응을 유발할 수 있기 때문에, 특히 혈관내로 주사되는 경우 이는 본 발명의 SFRP-4-결합제, 예를 들어 본 발명의 항-SFRP-4 항체 및 항체-관련 폴리펩티드로의 커플링을 위한 담체에 캡슐화되는 것이 바람직하다.

효소적-활성 독소. 한 실시양태에서, 본 발명의 SFRP-4-결합제는 효소적-활성 독소와 커플링된다. 효소적-활성 독소는 박테리아 또는 식물 기원이거나, 이러한 독소의 효소적-활성 단편 ("A 쇄")일 수 있다. 본 발명에 유용한 효소적-활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolacca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(Momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신 및 에노마이신이다. 세포독성 잔기를 갖는 본 발명의 SFRP-4-결합제의 접합체는 각종 이관능성 단백질 커플링제를 사용하여 제조된다. 이러한 시약의 예는 SPDP, IT, 이미도에스테르의 이관능성 유도체, 예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCl, 활성 에스테르, 예컨대 디숙신이미딜 수베레이트, 알데히드, 예컨대 글루타르알데히드, 비스-아지도 화합물, 예컨대 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민, 비스-디아조늄 유도체, 예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민, 디이소시아네이트, 예컨대 톨릴렌 2,6-디이소시아네이트, 및 비스-활성 불소 화합물, 예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠이다. 독소의 용균 부분은 항체, 예를 들어 SFRP-4-결합제의 Fab 단편으로 연결될 수 있다.

치료 잔기. 한 실시양태에서, 본 발명의 SFRP-4-결합제는 치료 잔기와 커플링된다. 이러한 치료 잔기를 본 발명의 SFRP-4-결합제로 접합하는 기술은 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)]; [Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed), Robinson et al (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)]; [Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)]; ["Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)], 및 [Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982)]을 참조한다.

표지된 SFRP-4-결합제. 한 실시양태에서, 본 발명의 SFRP-4-결합제는 표지 잔기, 즉 검출가능한 기와 커플링된다. 본 발명의 SFRP-4-결합제에 접합된 특정 표지 또는 검출가능한 기는 본 발명의 SFRP-4-결합제의 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드로의 특이적 결합을 유의하게 방해하지 않는 한, 본 발명의 중요한 측면이 아니다. 검출가능한 기는 검출가능한 물리적 또는 화학적 특성을 갖는 임의의 물질일 수 있다. 이러한 검출가능한 표지는 면역검정법 및 영상화의 분야에서 익히 개발되었으며, 일반적으로, 이러한 방법에 가장 유용한 임의의 표지는 본 발명에 적용될 수 있다. 따라서, 표지는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물이다. 본 발명에 유용한 표지로는 자기 비드 (예를 들어, 디나비즈(Dynabeads)™), 형광 염료 (예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 덱사스 레드, 로다민 등), 방사성표지 (예를 들어, ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ¹²⁵I, ¹²¹I, ¹¹²In, ⁹⁹mTc), 다른 영상화제, 예컨대 마이크로버블 (초음파 영상화를 위함), ¹⁸F, ¹¹C, ¹⁵O, (양전자 방출 단층촬영을 위함), ^99mTC, ¹¹¹In (단일 광자 방출 단층촬영), 효소 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제 및 ELISA에서 통상적으로 사용되는 다른 것), 및 열량측정 표지, 예컨대 콜로이드상 금 또는 유색 유리 또는 플라스틱 (예를 들어, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드가 포함된다. 이러한 표지의 용도가 기재된 특허로는 그 전문이 각각 본원에 참고로 도입된, 미국 특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호; 및 제4,366,241호가 포함된다. 또한 문헌 [Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6^th Ed., Molecular Probes, Inc., Eugene OR.)]을 참조한다.

표지는 당분야에 익히 공지된 방법에 따라 검정법의 원하는 성분으로 직접적으로 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 상기 명시된 바와 같이, 요구되는 민감성, 화합물과의 접합의 용이성, 안정성 요구조건, 이용가능한 장치 및 처리 설비에 따른 표지의 선택으로 광범위한 표지가 사용될 수 있다.

비-방사성 표지는 종종 간접적 수단에 의해 부착된다. 일반적으로, 리간드 분자 (예를 들어, 바이오틴)는 분자에 공유결합으로 결합된다. 그 후, 리간드는 신호 시스템, 예컨대 검출가능한 효소, 형광 화합물 또는 화학발광 화합물에 공유결합으로 결합되거나 또는 원칙적으로 검출가능한 항-리간드 (예를 들어, 스트렙타비딘) 분자에 결합한다. 많은 리간드 및 항-리간드가 사용될 수 있다. 리간드가 천연 항-리간드, 예를 들어 바이오틴, 티록신 및 코르티졸을 갖는 경우, 이는 표지된 천연 항-리간드와 함께 사용될 수 있다. 대안으로, 임의의 합텐성 또는 항원성 화합물은 항체, 예를 들어 항-SFRP-4 항체와 조합되어 사용될 수 있다.

분자는 또한, 예를 들어 효소 또는 형광단과의 접합에 의해 신호 생성 화합물로 직접적으로 접합될 수 있다. 표지로서 관심있는 효소는 주로 히드롤라제, 특히 포스파타제, 에스테라제 및 글리코시다제, 또는 산화환원효소, 특히 퍼옥시다제일 것이다. 표지화 잔기로서 유용한 형광 화합물로는 예를 들어 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지화 잔기로서 유용한 화학발광 화합물로는 예를 들어 루시페린 및 2,3-디히드로프탈라진디온, 예를 들어 루미놀이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 여러 표지화 또는 신호 생성 시스템에 대해서는 미국 특허 제4,391,904호를 참조한다.

표지를 검출하는 수단은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 따라서, 예를 들어 표지가 방사성 표지인 경우, 검출 수단으로는 섬광 계수기 또는 자기방사법에서 사진 필름을 들 수 있다. 표지가 형광 표지인 경우, 이는 적절한 광파장으로 형광색소를 여기시키고, 얻어진 형광을 검출함으로써 검출될 수 있다. 형광은 사진 필름에 의해, 전자 검출기, 예컨대 전하 커플링된 장치 (CCD) 또는 광증폭기 등의 사용에 의해 시각적으로 검출될 수 있다. 유사하게, 효소적 표지는 효소에 대한 적절한 기질을 제공하고, 얻어진 반응 생성물을 검출함으로써 검출될 수 있다. 최종적으로, 단순한 비색성 표지는 표지와 관련된 색상을 관찰함으로써 간단하게 검출될 수 있다. 따라서, 여러 딥스틱 검정법에서, 접합된 금은 종종 분홍색으로 보이는 반면, 여러 접합된 비드는 비드의 색상으로 보인다.

몇몇 검정법 형식은 표지된 성분의 사용을 요구하지 않는다. 예를 들어, 응집 검정법은 표적 항체, 예를 들어 항-SFRP-4 항체의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 이 경우, 항원-코팅된 입자는 표적 항체를 포함하는 샘플에 의해 응집된다. 상기 형식에서, 성분은 표지될 필요가 없으며, 표적 항체의 존재는 단순한 시각적 검사에 의해 검출된다.

제약 조성물의 제제. 본 발명의 SFRP-4-결합제는 투여에 적합한 제약 조성물로 혼입될 수 있다. 제약 조성물은 일반적으로 대상체에게 투여하기에 적합한 형태로 하나(1) 이상의 SFRP-4-결합제 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 제약상 허용되는 담체는 투여될 특정 조성물에 의해, 뿐만 아니라 조성물의 투여에 사용되는 특정 방법에 의해 부부적으로 결정된다. 따라서, 항체 조성물의 투여에 적합한 광범위한 제약 조성물의 제제가 있다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1990] 참조). 제약 조성물은 일반적으로 멸균이고, 실질적으로 등장성이며, 미국 식약청의 의약품제조관리기준 (GMP)에 완전히 순응하여 제제화된다.

조성물, 담체, 희석제 및 시약을 지칭하는 경우 용어 "제약상-허용되는", "생리적으로-관용되는" 및 그의 문법적 변형체는 상호교환적으로 사용되며, 물질이 조성물의 투여를 방해하는 정도로 바람직하지 않은 생리적 효과를 생성하지 않으면서 대상체에게 투여될 수 있다는 것을 나타낸다. 예를 들어, "제약상 허용되는 부형제"는 일반적으로 안전하고 비-독성이며 바람직한, 제약 조성물의 제조에 유용한 부형제를 의미하며, 인간 제약 사용 뿐만 아니라 수의학적 사용에 허용되는 부형제를 포함한다. 이러한 부형제는 고체, 액체, 반고체일 수 있거나, 또는 에어로졸 조성물의 경우 기체일 수 있다. "제약상 허용되는 염 및 에스테르"는 제약상 허용되는 염 및 에스테르를 의미하며, 원하는 약리학적 특성을 갖는다. 당업자는 본 발명의 특정 약물 및 조성물의 투여에 적절한 시점, 순서 및 용량을 결정하는데 어려움이 없을 것이다.

이러한 담체 또는 희석제의 바람직한 예로는 물, 염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 리포좀 및 비수성 비히클, 예컨대 고정유가 또한 사용될 수 있다. 제약상 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 화합물의 사용은 당분야에 익히 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 및 화합물이 SFRP-4-결합제에 부적합한 경우를 제외하고는 조성물에서의 그의 사용이 고려된다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.

한 실시양태에서, SFRP-4-결합제는 인체로부터의 급속한 제거에 대해 SFRP-4-결합제를 보호할 담체, 예컨대 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 비롯한 제어 방출 제제와 함께 제조된다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 다무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 물질은 또한 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼스, 인크.(Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 상업적으로 수득될 수 있다. 리포좀 현탁액 (바이러스 항원에 대한 모노클로날 항체를 갖는 감염된 세포로 표적화된 리포좀 포함)은 또한 제약상 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 당업자에게 공지된 방법에 따라, 예를 들어 미국 특허 제4,522,811호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.

투여의 용이성 및 용량의 균일성을 위해 경구 또는 비경구 조성물을 용량 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 이롭다. 본원에서 사용되는 용량 단위 형태는 치료되는 대상체에 대한 단위 용량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며, 각 단위는 요구되는 제약 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 결합제의 예정된 양을 함유한다. 본 발명의 용량 단위 형태에 대한 세부사항은 대상체의 치료를 위해 결합제의 고유 특징 및 성취되는 특정 치료 효과, 및 이러한 SFRP-4-결합제의 배합의 당분야에 원칙적인 제한에 의해 지시되고 직접적으로 의존한다.

본 발명의 핵산 분자는 벡터에 삽입되고, 유전자 치료요법 벡터로서 사용될 수 있다. 유전자 치료요법 벡터는 예를 들어, 정맥내 주사, 국소 투여 (예를 들어, 미국 특허 제5,328,470호 참조) 또는 정위 주사 (예를 들어, 문헌 [Chen, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057] 참조)에 의해 대상체에게 전달될 수 있다. 유전자 치료요법 벡터의 제약 제제는 허용되는 희석제 중 유전자 치료요법 벡터를 포함할 수 있거나, 또는 유전자 전달 비히클이 포매된 서방 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안으로, 완전 유전자 전달 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 벡터가 재조합 세포로부터 무손상으로 제조될 경우, 제약 제제는 유전자 전달 시스템을 제조하는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다. 제약 조성물은 투여에 대한 지시사항과 함께 용기, 팩 또는 투약기에 포함될 수 있다.

본 발명의 SFRP-4-결합제의 확인 및 특징화

본 발명의 결합제의 확인 및/또는 스크리닝 방법. SFRP-4 폴리펩티드에 대한 원하는 특이성을 갖는 결합제, 예를 들어 항-SFRP-4 항체 및 항-SFRP-4 항체-관련 폴리펩티드의 확인 및/또는 스크리닝에 유용한 방법으로는 당분야에 공지된 임의의 면역학적-매개 기술이 포함된다. 면역 반응의 성분은 당업자에게 익히 공지된 여러 방법에 의해 시험관내 검출될 수 있다. 예를 들어, (1) 세포독성 T 림프구를 방사성 표지된 표적 세포와 인큐베이션하여, 이들 표적 세포의 분해(lysis)를 방사성의 방출에 의해 검출할 수 있음, (2) 조력 T 림프구를 항원 및 항원 제시 세포와 인큐베이션하여, 사이토카인의 합성 및 분비를 표준 방법에 의해 측정할 수 있음 (문헌 [Windhagen A; et al., Immunity, 2: 373-80, 1995]), (3) 항원 제시 세포를 온전한 단백질 항원과 인큐베이션하여, MHC 상의 상기 항원의 제시를 T 림프구 활성화 검정법 또는 생물리적 방법에 의해 검출할 수 있음 (문헌 [Harding et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 4230-4, 1989]), (4) 비만 세포를 그의 Fc-엡실론 수용체를 교차-연결하는 시약과 인큐베이션하여, 히스타민 방출을 효소 면역검정법에 의해 측정할 수 있음 (문헌 [Siraganian et al., TIPS, 4: 432-437, 1983]), 및 (5) 효소 결합 면역흡착 검정법 (ELISA).

유사하게, 모델 유기체 (예를 들어, 마우스) 또는 인간 대상체에서의 면역 반응의 생성물은 또한 당업자에게 익히 공지된 여러 방법에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, (1) 예방접종에 대한 항체의 생성은 임상 실험에서 현재 사용되는 표준 방법, 예를 들어 ELISA에 의해 용이하게 검출될 수 있고; (2) 면역 세포의 염증 부위로의 이동은 피부의 표면을 스크래칭하고 멸균 용기로 이동시킴으로써 스크래치 부위 상으로 이동하는 세포를 포획하여 검출될 수 있고 (문헌 [Peters et al., Blood, 72: 1310-5, 1988]); (3) 유사분열촉진인자 또는 혼합된 림프구 반응에 대한 말초 혈액 단핵 세포의 증식은 ³H-티미딘을 사용하여 측정될 수 있고; (4) PBMC 중 과립구, 대식세포 및 다른 식세포의 식작용 능력은 PMBC를 표지된 입자와 함께 웰에 위치시킴으로써 측정될 수 있고 (문헌 [Peters et al., Blood, 72: 1310-5, 1988]); 및 (5) 면역계 세포의 분화는 PBMC를 CD 분자, 예컨대 CD4 및 CD8에 대한 항체로 표지화하고, 이들 마커를 발현하는 PBMC의 분획을 측정함으로써 측정될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 SFRP-4-결합제는 복제가능한 유전자 패키지의 표면 상의 후보 결합제의 디스플레이를 사용하여 선택된다. 예를 들어, 미국 특허 제5,514,548호; 제5,837,500호; 제5,871,907호; 제5,885,793호; 제5,969,108호; 제6,225,447호; 제6,291,650호; 제6,492,160호; 제EP 585 287호; 제EP 605522호; 제EP 616640호; 제EP 1024191호; 제EP 589 877호; 제EP 774 511호; 제EP 844 306호를 참조한다. 원하는 특이성을 갖는 결합 분자를 코딩하는 파지미드 게놈을 함유하는 섬유상 박테리오파지 입자의 유용한 제조/선택 방법이 기재되어 있다. 예를 들어, 제EP 774 511호; 제US 5871907호; 제US 5969108호; 제US 6225447호; 제US 6291650호; 제US 6492160호를 참조한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 SFRP-4-결합제는 효모 숙주 세포의 표면 상의 후보 결합제의 디스플레이를 사용하여 선택된다. 효모 표면 디스플레이에 의한 scFv 폴리펩티드의 유용한 단리 방법은 문헌 [Kieke et al., Protein Eng. 1997 Nov; 10(11): 1303-10]에 기재되어 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 SFRP-4-결합제는 리보좀 디스플레이를 사용하여 선택된다. 리보좀 디스플레이를 사용하는 펩티드 라이브러리 중 리간드의 유용한 확인 방법은 문헌 [Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9022-26, 1994]; 및 [Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4937-42, 1997]에 기재되어 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 SFRP-4-결합제는 후보 결합제의 tRNA 디스플레이를 사용하여 선택된다. tRNA 디스플레이를 사용하는 리간드의 유용한 시험관내 선택 방법은 문헌 [Merryman et al., Chem. Biol., 9: 741-46, 2002]에 기재되어 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 SFRP-4-결합제는 RNA 디스플레이를 사용하여 선택된다. RNA 디스플레이 라이브러리를 사용하는 펩티드 및 단백질의 유용한 선택 방법은 문헌 [Roberts et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 94: 12297-302, 1997]; 및 [Nemoto et al., FEBS Lett., 414: 405-8, 1997]에 기재되어 있다. 비천연 RNA 디스플레이 라이브러리를 사용하는 펩티드 및 단백질의 유용한 선택 방법은 문헌 [Frankel et al., Curr. Opin. Struct. Biol., 13: 506-12, 2003]에 기재되어 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 SFRP-4-결합제는 그램 음성 박테리아의 주변세포질에서 발현되고, 표지된 SFRP-4 폴리펩티드와 혼합된다. 제WO 02/34886호를 참조한다. SFRP-4 폴리펩티드에 대한 친화성을 갖는 재조합 폴리펩티드를 발현하는 클론에서, 결합제에 결합된 표지된 SFRP-4의 농도는 증가되고, 세포가 라이브러리의 나머지로부터 단리되도록 한다 (문헌 [Harvey et al., Proc. Natl Acad. Sci. 22: 9193-98 2004] 및 미국 특허 제2004/0058403호에 기재된 바와 같음).

원하는 SFRP-4-결합제의 선택 후, 당업자에게 공지된 임의의 기술, 예를 들어 원핵 세포 또는 진핵 세포 발현 등에 의해 큰 부피로 제조될 수 있다는 것이 고려된다. 예를 들어 항-SFRP-4 하이브리드 항체 또는 그의 단편인 SFRP-4-결합제는 CDR, 및 필요하다면 가변 영역 프레임워크의 최소 부분 (본래 종 항체 결합 특이성을 유지하는데 요구됨)(본원에 기재된 기술에 따라 조작됨)이 기원 종 항체로부터 유래되고, 항체의 나머지 부분이 본원에 기재된 바와 같이 조작될 수 있는 표적 종 이뮤노글로불린으로부터 유래되는, 항체 중쇄를 코딩하는 발현 벡터를 구축하는 통상적인 기술을 사용하여 제조될 수 있으며, 이에 의해 하이브리드 항체 중쇄의 발현을 위한 벡터를 제조할 수 있다.

SFRP-4 결합의 측정. 한 실시양태에서, SFRP-4 결합 검정법은 SFRP-4 폴리펩티드 및 SFRP-4-결합제가 SFRP-4 폴리펩티드와 SFRP-4-결합제 간의 결합에 적합하고 SFRP-4 폴리펩티드와 SFRP-4-결합제 간의 결합량의 분석에 적합한 조건하에 혼합되는 검정법 형식을 지칭한다. 결합량은 적합한 대조군과 비교되며, 상기 대조군은 SFRP-4 폴리펩티드의 부재하의 결합량, 또는 비-특이적 이뮤노글로불린 조성물의 존재하의 결합량, 또는 둘 모두일 수 있다. 결합량은 임의의 적합한 방법에 의해 분석될 수 있다. 결합 검정법으로는 예를 들어 ELISA, 방사선수용체 결합 검정법, 섬광 근접 검정법, 세포 표면 수용체 결합 검정법, 형광 에너지 전이 검정법, 액체 크로마토그래피, 막 여과 검정법 등을 들 수 있다. SFRP-4-결합제에 결합하는 SFRP-4의 직접적 측정을 위한 생물리적 검정법은 예를 들어 핵자기 공명, 형광, 형광 편광, 표면 플라즈먼 공명 (비아코르(BIACOR) 칩) 등이다. 특이적 결합은 당분야에 공지된 표준 검정법, 예를 들어 방사선리간드 결합 검정법, ELISA, FRET, 면역침전, SPR, NMR (2D-NMR), 질량 분광법 등에 의해 결정된다. 후보 SFRP-4-결합제의 특이적 결합이 후보 SFRP-4-결합제의 부재하에 관찰된 결합보다 1 백분율 이상 큰 경우, 후보 SFRP-4-결합제는 본 발명의 SFRP-4-결합제로서 유용하다.

SFRP-4 폴리펩티드 및 SFRP-4-결합제의 공결정이 분자 상호작용의 결정 방법으로서 본 발명에 의해 또한 제공된다. SFRP-4-결합제와 SFRP-4 간의 결합에 적합한 조건은 화합물 및 그의 리간드에 따라 달라질 것이며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

SFRP-4-결합제 생물학적 활성의 측정. 본 발명의 SFRP-4-결합제, 예를 들어 항-SFRP-4 항체 및 항-SFRP-4 항체-관련 폴리펩티드는 본원에 개시된 특이적 활성을 포함하는 생물학적 활성에 대한 효능제 또는 길항제로서 구체화될 수 있다. 예를 들어, SFRP-4-결합제인 SFRP-4 효능제 및 길항제는 당분야에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 제WO 96/40281호; 미국 특허 제5,811,097호; 문헌 [Deng et al., Blood 92: 1981-1988, 1998]; [Chen et al., Cancer Res., 58: 3668-3678, 1998]; [Harrop et al., J. Immunol. 161:1786-1794, 1998]; [Zhu et al., Cancer Res., 58: 3209-3214, 1998]; [Yoon et al., J. Immunol., 160: 3170-3179, 1998]; [Prat et al., J. Cell. Sci., 111: 237-247, 1998]; [Pitard et al., J. Immunol. Methods, 205: 177-190, 1997]; [Liautard et al., Cytokinde, 9: 233-241, 1997]; [Carlson et al., J. Biol. Chem., 272: 11295-11301, 1997]; [Taryman et al., Neuron, 14: 755-762, 1995]; [Muller et al., Structure, 6: 1153-1167, 1998]; [Bartunek et al., Cytokinem, 8: 14-20, 1996]을 참조한다. SFRP-4-결합제의 생물학적 활성, 즉 효능제 또는 길항제 특성은 SFRP-4 폴리펩티드의 생물학적 활성의 측정을 위해 개발된 임의의 통상적인 생체내 및 시험관내 검정법을 사용하여 특징화될 수 있다.

본 발명의 SFRP-4-결합제의 용도

일반. 본 발명의 결합제는 SFRP-4 폴리펩티드의 국소화 및/또는 정량에 대해 당분야에 공지된 방법에 유용하다 (예를 들어, 적절한 생리적 샘플 내의 SFRP-4 폴리펩티드의 수준의 측정에서의 사용, 진단 방법에서의 사용, 폴리펩티드의 영상화에서의 사용 등). 한 실시양태에서, 항체 유래 결합 도메인을 함유하는 SFRP-4-결합제는 약리학적-활성 조성물로서 유용하다. 본 발명의 결합제는 표준 기술, 예컨대 친화성 크로마토그래피 또는 면역침전에 의한 SFRP-4 폴리펩티드의 단리에 유용하다. 본 발명의 SFRP-4-결합제는 생물학적 샘플, 예를 들어 세포로부터의 천연 면역반응성 SFRP-4 폴리펩티드 또는 면역반응성 SFRP-4-유사 폴리펩티드, 뿐만 아니라 숙주 시스템에서 발현된 재조합적으로 제조된 면역반응성 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드의 정제를 용이하게 할 수 있다. 또한, SFRP-4-결합제는 면역반응성 폴리펩티드의 발현의 패턴 및 과다를 평가하기 위해 면역반응성 SFRP-4 폴리펩티드 또는 면역반응성 SFRP-4-유사 폴리펩티드 (예를 들어, 세포 용해물 또는 세포 상등액 중)의 검출에 사용될 수 있다. 본 발명의 SFRP-4-결합제는 임상 시험 절차의 부분으로서 (예를 들어 주어진 치료 요법의 효능의 결정) 조직 중 면역반응성 SFRP-4 폴리펩티드 수준 및/또는 면역반응성 SFRP-4-유사 폴리펩티드 수준의 진단적 모니터링에 사용될 수 있다. 상기 주목된 바와 같이, 검출은 본 발명의 SFRP-4-결합제를 검출가능한 물질로 커플링함으로써 (즉, 물리적으로 연결함으로써) 용이하게 될 수 있다.

SFRP-4 폴리펩티드 발현의 검출. 생물학적 샘플 중 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드의 존재 또는 부재의 예시적 검출 방법은 시험 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻고, SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드를 검출할 수 있는 본 발명의 SFRP-4-결합제와 생물학적 샘플을 접촉시켜, 생물학적 샘플 중 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드의 존재를 검출하는 것을 포함한다. SFRP-4-결합제의 예는 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드에 결합할 수 있는 서열 1에 대해 증가된 항체, 바람직하게는 검출가능한 표지를 갖는 항체이다. 결합제와 관련된 용어 "표지된"은 검출가능한 물질의 결합제로의 커플링 (즉, 물리적 연결)에 의한 결합제의 직접적 표지화, 뿐만 아니라 직접적으로 표지된 다른 화합물과의 반응에 의한 결합제의 간접적 표지화를 포함하는 것으로 의도된다. 간접적 표지화의 예로는 형광-표지된 이차 항체를 사용하는 일차 항체의 검출, 및 바이오틴에 의한 DNA 프로브의 말단-표지화 (이에 의해 형광-표지된 스트렙타비딘으로 검출될 수 있음)을 들 수 있다.

본 발명의 검출 방법은 생물학적 샘플 중 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드의 시험관내 및 생체내 검출에 사용될 수 있다. SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드의 시험관내 검출 기술로는 효소 결합 면역흡착 검정법 (ELISA), 웨스턴 블럿팅, 면역침전 및 면역형광법을 들 수 있다. 또한, SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드의 생체내 검출 기술은 표지된 SFRP-4-결합제, 예를 들어 항-SFRP-4 항체를 대상체에 도입하는 것을 포함한다. 예를 들어, 항체는 대상체에서의 존재 및 위치가 표준 영상화 기술에 의해 검출될 수 있는 방사성 마커로 표지될 수 있다. 한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 시험 대상체로부터의 폴리펩티드 분자를 함유한다.

면역검정법 및 영상화. 본 발명의 SFRP-4-결합제는 항체-기재 기술을 사용하는 생물학적 샘플 중 SFRP-4 단백질 수준 또는 SFRP-4-유사 단백질 수준의 검정에 사용될 수 있다. 예를 들어, 조직에서의 단백질 발현은 전통적인 면역조직학적 방법에 의해 연구될 수 있다 (문헌 [Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 101: 976-985, 1985]; [Jalkanen, M. et al. J. Cell. Biol. 105: 3087-3096, 1987]). 단백질 유전자 발현의 검출에 유용한 다른 항체-기재 방법으로는 면역검정법, 예컨대 효소 결합 면역흡착 검정법 (ELISA) 및 방사선면역검정법 (RIA)이 포함된다. 적합한 항체 검정 표지는 당분야에 공지되어 있으며, 효소 표지, 예컨대 글루코스 산화효소, 및 방사선동위원소 또는 다른 방사성제, 예컨대 요오드 (¹²³I, ¹²¹I), 탄소 (¹⁴C), 황 (³⁵S), 삼중수소 (³H), 인듐 (¹¹²In), 및 테크네튬 (⁹⁹mTc), 및 형광 표지, 예컨대 플루오레세인 및 로다민, 및 바이오틴이 포함된다.

생물학적 샘플 중 분비 SFRP-4 단백질 수준 또는 SFRP-4-유사 단백질 수준의 분석 이외에, 분비 SFRP-4 단백질 수준 또는 SFRP-4-유사 단백질 수준은 또한 영상화에 의해 생체내 검출될 수 있다. 예를 들어 SFRP-4 단백질 수준 또는 SFRP-4-유사 단백질 수준의 생체내 영상화를 위한 SFRP-4-결합제, 항-SFRP-4 항체 표지 또는 마커로는 X-방사기록, NMR 또는 ESR에 의해 검출가능한 것이 포함된다. X-방사기록에 적합한 표지로는 검출가능한 방사선을 방출하나 대상체에게 과도하게 유해하지 않은 방사선동위원소, 예컨대 바륨 또는 세슘이 포함된다. NMR 및 ESR에 적합한 마커로는 관련된 클론 발현 SFRP-4-결합제를 위한 영양소의 표지화에 의해 SFRP-4-결합제로 혼입될 수 있는, 검출가능한 특징적 스핀을 갖는 마커, 예컨대 중수소가 포함된다.

적절한 검출가능한 영상화 잔기, 예컨대 방사선동위원소 (예를 들어, ¹³¹I, ¹¹²In, ⁹⁹mTc), 방사선불투과성 물질, 또는 핵자기 공명에 의해 검출가능한 물질로 표지된 SFRP-4-결합제가 대상체에게 (예를 들어, 비경구로, 피하로 또는 복강내로) 도입된다. 대상체의 크기 및 사용되는 영상화 시스템이 진단 이미지를 만드는데 필요한 영상화 잔기의 양을 결정할 것이라는 것은 당분야에서 이해될 것이다. 방사선동위원소 잔기의 경우, 인간 대상체에서, 주사된 방사선 양은 정상적으로 ⁹⁹mTc의 약 5 내지 20 밀리큐리의 범위일 것이다. 그 후, 표지된 SFRP-4-결합제는 우선적으로 특이적 표적 폴리펩티드를 함유하는 세포의 위치에서 축적될 것이다. 예를 들어, 생체내 종양 영상화는 문헌 [S. W. Burchiel et al., Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer 13 (1982)]에 기재되어 있다.

따라서, 본 발명은 (a) 개체의 세포 또는 체액 중 본 발명의 SFRP-4-결합제의 결합을 측정함으로써 폴리펩티드의 발현을 분석하고; (b) 표준 SFRP-4 폴리펩티드 발현 수준과 유전자 발현 수준을 비교하는 (이에 의해 표준 발현 수준과 비교된 분석된 SFRP-4 폴리펩티드 발현 수준의 증가 또는 감소가 의학적 상태의 지표임) 것을 포함하는, 의학적 상태, 예를 들어 SFRP-4 관련된 장애의 진단 방법을 제공한다.

진단 용도. 본 발명의 SFRP-4-결합 조성물은 진단 방법에 유용하다. 이와 같이, 본 발명은 대상체에서의 SFRP-4-관련 의학적 상태의 진단에 유용한 본 발명의 결합제의 사용 방법을 제공한다. 본 발명의 결합제는 임의의 수준의 에피토프 결합 특이성 및 SFRP-4 폴리펩티드에 대한 매우 높은 결합 친화성을 갖도록 선택될 수 있다. 일반적으로, 결합제의 결합 친화성이 높을수록, 보다 엄격한 세척 조건이 표적 폴리펩티드의 제거없이 비특이적으로 결합된 물질의 제거를 위해 면역검정법에서 수행될 수 있다. 따라서, 진단 검정법에 유용한 본 발명의 SFRP-4-결합제는 통상적으로 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹ 또는 10¹² M^-1 이상의 결합 친화성을 갖는다. 추가로, 진단 시약으로서 사용되는 SFRP-4-결합제가 표준 조건하에 12시간 이상, 바람직하게는 5시간 이상, 및 보다 바람직하게는 1시간 이상에 평형에 도달하기에 충분한 동력학적 결합속도를 갖는 것이 바람직하다.

본 발명의 몇몇 방법은 본 발명의 항-SFRP-4 항체 및 항-SFRP-4 항체 관련 폴리펩티드 조성물의 폴리클로날 제제를 진단 시약으로서 사용하며, 다른 방법은 모노클로날 단리물을 사용한다. 폴리클로날 혼합물의 사용은 하나의 모노클로날 항-SFRP-4 항체로 제조된 조성물에 비해 많은 이점을 갖는다. SFRP-4 폴리펩티드 상의 다중 부위로의 결합에 의해, 폴리클로날 항-SFRP-4 항체 또는 다른 폴리펩티드는 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드 상의 단일 부위에 결합하는 모노클로날보다 (진단을 위한) 더 강한 신호를 생성할 수 있다. 추가로, 폴리클로날 제제는 원형적 표적 서열의 수많은 변이체 (예를 들어, 대립유전자 변이체, 종 변이체, 균주 변이체, 약물-유래 탈출 변이체)에 결합할 수 있는 반면, 모노클로날 항체는 원형적 서열 또는 그에 대한 좁은 범위의 변이체에만 결합할 수 있다. 그러나, 모노클로날 항-SFRP-4 항체는 밀접하게 관련된 항원의 존재 또는 잠재적 존재하에 단일 항원의 검출에 이롭다.

상기 기재된 방법에 따라 제조된 폴리클로날 인간 항-SFRP-4 항체의 사용 방법에서, 제제는 전형적으로 SFRP-4-결합제, 예를 들어 표적 폴리펩티드에 대한 상이한 에피토프 특이성을 갖는 항체의 분류를 함유한다. 모노클로날 항체의 몇몇 사용 방법에서, 상이한 에피토프 결합 특이성의 두가지 항체를 갖는 것이 바람직하다. 에피토프 결합 특이성의 상이함은 경쟁 결합 검정법에 의해 결정될 수 있다.

인간 항체인 SFRP-4-결합제가 임의의 종류의 샘플에 대한 진단 시약으로서 사용될 수 있지만, 이는 인간 생물학적 샘플에 대한 진단 시약으로서 가장 유용하다. SFRP-4-결합제는 각종 표준 검정법 형식에서 주어진 SFRP-4 폴리펩티드의 검출에 사용될 수 있다. 이러한 형식으로는 면역침전, 웨스턴 블럿팅, ELISA, 방사선면역검정법 및 면역계량 검정법을 들 수 있다. 문헌 [Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988)]; 미국 특허 제3,791,932호; 제3,839,153호; 제3,850,752호; 제3,879,262호; 제4,034,074호, 제3,791,932호; 제3,817,837호; 제3,839,153호; 제3,850,752호; 제3,850,578호; 제3,853,987호; 제3,867,517호; 제3,879,262; 제3,901,654호; 제3,935,074호; 제3,984,533호; 제3,996,345호; 제4,034,074; 및 제4,098,876호를 참조한다. 생물학적 샘플은 대상체의 임의의 조직 또는 체액으로부터 얻을 수 있다.

면역계량 검정법 또는 샌드위치 검정법은 본 발명의 진단 방법에 바람직한 형식이다. 미국 특허 제4,376,110호, 제4,486,530호, 제5,914,241호 및 제5,965,375호를 참조한다. 이러한 검정법은 하나의 SFRP-4-결합제, 예를 들어 항-SFRP-4 항체, 또는 고체상에 고정화된 항-SFRP-4 항체와 다른 항-SFRP-4 항체의 집단, 또는 항-SFRP-4 항체의 집단을 사용한다. 전형적으로, 용액 항-SFRP-4 항체 또는 항-SFRP-4 항체의 집단은 표지된다. 항체 집단이 사용되는 경우, 집단은 전형적으로 표적 폴리펩티드 내의 상이한 에피토프 특이성에 결합하는 항체를 함유한다. 따라서, 동일한 집단이 고체상 및 용액 항체 둘 모두에 사용될 수 있다. 항-SFRP-4 모노클로날 항체가 사용되는 경우, 상이한 결합 특이성을 갖는 제1 및 제2 SFRP-4 모노클로날 항체가 고체 및 용액 상에 사용된다. 고체상 및 용액 항체는 순서대로 또는 동시에 표적 항원과 접촉될 수 있다. 고체상 항체가 먼저 접촉되는 경우, 검정법은 전방향 검정법이라고 지칭된다. 반대로, 용액 항체가 먼저 접촉되는 경우, 검정법은 역방향 검정법이라고 지칭된다. 표적이 항체 둘 모두와 동시에 접촉되는 경우, 검정법은 동시 검정법이라고 지칭된다. SFRP-4 폴리펩티드를 항-SFRP-4 항체와 접촉시킨 후, 샘플은 통상적으로 약 10분 내지 약 24시간, 및 통상적으로 약 1시간의 다양한 기간 동안 인큐베이션된다. 그 후, 진단 시약으로서 사용되는 항-SFRP-4 항체에 특이적으로 결합되지 않은 샘플의 성분을 제거하기 위해 세척 단계가 수행된다. 고체상 및 용액 항체가 별도의 단계에서 결합되는 경우, 세척은 결합 단계 중 한 단계 또는 두 단계 모두 후에 수행될 수 있다. 세척 후, 결합은 전형적으로 표지된 용액 항체의 결합을 통해 고체상에 연결된 표지의 검출에 의해 정량된다. 통상적으로, 항체의 주어진 쌍 또는 항체의 집단 및 주어진 반응 조건에 대해, 보정 곡선은 공지된 농도의 표적 항원을 함유하는 샘플로부터 제조된다. 그 후, 시험되는 샘플 중 SFRP-4 폴리펩티드의 농도는 보정 곡선으로부터 내삽에 의해 판독된다. 분석 대상물은 평형에서 결합된 표지된 용액 항체의 양으로부터, 또는 평형에 도달하기 전에 일련의 시점에서 결합된 표지된 용액 항체의 동력학 측정에 의해 측정될 수 있다. 이러한 곡선의 기울기는 샘플 중 SFRP-4 폴리펩티드의 농도의 측정이다.

상기 방법에서 사용하기에 적합한 지지물로는 예를 들어 니트로셀룰로스 막, 나일론 막, 및 유도체화된 나일론 막, 및 또한 입자, 예컨대 아가로스, 덱스트란-기재 겔, 딥스틱, 미립자, 미세구, 자기 입자, 시험 튜브, 마이크로역가 웰, 세파덱스(SEPHADEX)™를 들 수 있다 (미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재의 아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech) 등). 고정화는 흡수에 의해 또는 공유결합 부착에 의한 것일 수 있다. 임의로, 항-SFRP-4 항체는 아비딘과 같은 표면 결합된 링커로의 부착을 위한 바이오틴과 같은 링커 분자에 연결될 수 있다.

예상 의약. 본 발명은 또한 진단 검정법, 예후 검정법, 약물유전학, 및 모니터링 임상 시험이 대상체의 예방학적 치료를 위한 예후 (예상) 목적으로 사용되는 예상 의약의 분야에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 대상체가 질환 또는 장애를 앓고 있는가, 또는 대상체가 이상 SFRP-4 폴리펩티드 발현과 관련된 장애의 발병 위험이 있는가를 결정하기 위한, 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈액, 혈청, 세포, 조직) 중 SFRP-4 폴리펩티드 발현의 결정을 위한 진단 검정법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 개체가 SFRP-4 폴리펩티드 발현 또는 활성과 관련된 장애의 발병 위험이 있는가를 결정하기 위한 예후 (또는 예상) 검정법을 제공한다. 이러한 검정법은 예후 또는 예상 목적으로 사용되어, 이에 의해 SFRP-4 폴리펩티드를 특징으로 하는 장애 또는 이와 관련된 장애의 발병 전에 개체를 예방학적으로 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 개체가, 예를 들어 본 발명의 SFRP-4-결합제가 그의 다형 형태에 대한 SFRP-4 폴리펩티드에 대한 더 큰 친화성을 갖는 경우 (또는 반대로) SFRP-4 또는 SFRP-4의 다형 형태를 발현하는가를 분석하기 위해 사용될 수도 있다.

대상체의 특정 조직 (또는 혈액) 중 특정 폴리펩티드의 수준은 대상체에게 투여되는 경우 주어진 약물의 독성, 효능, 청소 속도 또는 대사 속도의 지표일 수 있다. 본원에 기재된 방법은 또한 이들 약물에 대한 이러한 대상체의 반응을 예측하는 것을 보조하기 위해, 대상체 중 이러한 폴리펩티드의 수준을 결정하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 측면은 개체에서의 SFRP-4 발현의 결정 방법을 제공하며, 이에 의해 상기 개체를 위한 적절한 치료 또는 예방적 화합물을 선택한다 ("약물유전학"이라고 지칭함). 약물유전학은 개체의 유전자형 (예를 들어, 특정 화합물에 반응하는 개체의 능력을 결정하기 위해 시험된 개체의 유전자형)을 기초로 개체의 치료학적 또는 예방학적 치료를 위한 화합물 (예를 들어, 약물)을 선택하게 한다.

SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드로의 본 발명의 SFRP-4-결합제의 결합은, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드 발현 또는 활성과 관련된 장애를 앓고 있거나 또는 상기 장애의 발병 위험이 있는 대상체를 확인하는데 사용될 수 있다. 대안으로, 질환 또는 장애를 앓고 있거나 또는 상기 장애의 발병 위험이 있는 대상체를 확인하기 위해 예후 검정법이 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 시험 샘플을 대상체로부터 얻고, SFRP-4-결합제 결합을 검출하는, 이상 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드 발현 또는 활성과 관련된 질환 또는 장애의 확인 방법을 제공하며, 여기서 SFRP-4-폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드의 변경의 존재는 이상 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드 발현 또는 활성과 관련된 질환 또는 장애를 앓고 있거나 또는 상기 장애의 발병 위험이 있는 대상체를 위한 진단이다. 본원에서 사용되는 "시험 샘플"은 관심있는 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플을 지칭한다.

또한, 본원에 기재된 예후 검정법은 이상 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드 발현 또는 활성과 관련된 질환 또는 장애를 치료하기 위해 대상체에게 화합물 (예를 들어, 효능제, 길항제, 펩티드모방체, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 소분자 또는 다른 약물 후보)을 투여할 수 있는가를 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 대상체가 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드-관련 장애를 위한 화합물로 효과적으로 치료될 수 있는가를 결정하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 시험 샘플을 얻고, SFRP-4-결합제를 사용하여 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드를 검출하는, 대상체가 이상 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드 발현 또는 활성과 관련된 장애를 위한 화합물로 효과적으로 치료될 수 있는가를 결정하는 방법을 제공한다 (예를 들어, SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드의 존재는 이상 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드 발현 또는 활성과 관련된 장애를 치료하기 위한 화합물이 투여될 수 있는 대상체에 대한 진단임).

대상체로부터 얻은 혈액 또는 조직 샘플 중 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드의 수준은 결정되고, 상기 질환이 없는 개체로부터 얻은 혈액 샘플 또는 동일한 조직 유형으로부터의 샘플에서 발견된 수준과 비교된다. 건강한 대상체로부터 얻은 샘플과 비교된, SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드-관련 질환이 있는 것으로 의심되는 대상체로부터 얻은 샘플 중 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드의 과다존재 (또는 과소존재)는 시험되는 대상체에서 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드-관련 질환의 지표이다. 양성 진단을 만들기 위해 추가 시험이 요구될 수 있다.

공지된 특정 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드 분자의 과다발현 (또는 과소발현)의 정도가 질환이 있는 대상체가 특정 유형의 치료요법 또는 치료에 반응하기 쉬운가의 지표인 많은 질환이 있다. 따라서, 샘플 중 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드의 검출 방법은 예를 들어 대상체가 치료요법 또는 치료에 반응할 가능성을 평가하기 위해 예후 방법으로서 사용될 수 있다. 대상체로부터의 적합한 조직 또는 혈액 샘플 중 관련된 예후 폴리펩티드의 수준은 결정되고, 적합한 대조군, 예를 들어 동일한 질환이 있으나 치료에 유리하게 반응하는 대상체 중 수준과 비교된다. 대조군과 비교하여 예후 폴리펩티드가 샘플에서 과다발현된 (또는 과소발현된) 정도는 대상체가 치료 또는 치료요법에 유리하게 반응하기 않을 가능성으로 예상될 수 있다. 대조군에 비해 과다발현 (또는 과소발현)이 클수록 대상체가 치료에 반응할 가능성이 작다.

본원에서 "예상 폴리펩티드"라고 지칭되는 특정 표적 폴리펩티드의 과다발현 (또는 과소발현) 정도가 대상체가 질환을 발병할 것인가의 지표로 공지된 많은 질환이 있다. 따라서, 샘플 중 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드의 검출 방법은 대상체가 질환을 발병할 것인가의 예상 방법으로서 사용될 수 있다. 질환의 발병 위험이 있는 대상체로부터의 적합한 조직 또는 혈액 샘플 중 관련된 예상 폴리펩티드의 수준은 적합한 대조군, 예를 들어 질환의 발병 위험이 없는 대상체 중 수준과 비교된다. 대조군과 비교하여 예상 폴리펩티드가 샘플에서 과다발현된 (또는 과소발현된) 정도는 대상체가 질환을 발병할 가능성으로 예상될 수 있다. 대조군에 비해 과다발현 (또는 과소발현)이 클수록 대상체가 질환을 발병할 가능성이 크다.

본원에 기재된 방법은 예를 들어 하나 이상의 프로브 시약, 예를 들어 본원에 기재된 SFRP-4-결합제를 포함하는 예비포장된 진단 키트를 사용함으로써 수행될 수 있으며, 이는 예를 들어 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드와 관련된 질환 또는 질병의 증상 또는 가족력을 나타내는 대상체의 진단을 위한 임상적 환경에서 편리하게 사용될 수 있다. 또한, SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드가 발현된 임의의 세포 유형 또는 조직은 본원에 기재된 예후 검정법에서 사용될 수 있다.

SFRP-4-결합제의 예방학적 및 치료학적 사용

일반. 본 발명의 SFRP-4-결합제는 질환의 예방 또는 치료에 유용하다. 구체적으로, 본 발명은 이상 SFRP-4-결합제 발현 또는 활성과 관련된 장애를 앓고 있거나 상기 장애의 위험이 있는 (또는 걸리기 쉬운) 대상체의 예방학적 및 치료학적 치료 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 유효량의 SFRP-4-결합제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 SFRP-4-관련 의학적 상태, 예를 들어 EFRP-4-장애의 관련된 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 예를 들어, SFRP-4 폴리펩티드 (예를 들어, 인슐린)의 부재 또는 감소된 수준을 대체하거나, 상이한 폴리펩티드 (예를 들어, 항-SFRP-4 항체)의 부재 또는 감소된 수준을 보충하거나, 폴리펩티드 (예를 들어, 종양유전자)의 활성을 억제하거나, SFRP-4 폴리펩티드의 활성을 활성화시키거나 (예를 들어, 수용체로의 결합에 의해), 유리 리간드에 대한 경쟁에 의해 막 결합된 수용체 (예를 들어, 염증의 감소에 사용되는 가용성 TNF 수용체)의 활성을 감소시키거나, 또는 원하는 반응 (예를 들어, 혈관 성장)을 유발하기 위한 노력으로 본 발명의 SFRP-4-결합제 조성물을 대상체에게 투여할 수 있다.

본 발명의 SFRP-4-결합제는 대상체에서 골 세포의 발생, 분화 및 활성화와 관련된 장애; 혈액 순환의 세포, 예컨대 적혈구 및 혈소판의 질환 또는 병리; 여러 면역학적 장애 및/또는 병리; 폐 질환 및 장애; 자가면역 및 염증성 질환; 심혈관 질환; 대사 질환; 생식기 질환, 신장 질환, 당뇨병, 뇌 외상, 암 성장 및 전이 (예를 들어, 뇌, 유방, 전립선, 자궁, 비장, 췌장, 위장관 (예를 들어, 결장, 직장, 소장, 위, 식도)의 암; 바이러스 감염, 암 치료요법, 치주 질환; 조직 재생성 (예를 들어, 신경 및 뼈); 급성 림프모세포성 백혈병; 신경교종; 신경계 질환; 신경변성 장애; 조혈계 장애; 허혈 (예를 들어, 심부전, 심근경색증; 뇌졸중)로부터 기인한 세포자멸; 신경변성 질환 (예를 들어, 헌팅톤병, 말초 탈수초성 질환, 다발성 경화증, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병; 외상); 관상 심장 질환; 및 염증 (예를 들어, 염증성 장 질환)을 포함하나 이에 제한되지 않는, 각종 장애에 관련된 잠재적 예방학적 및 치료학적 적용에서 유용하다.

치료요법을 위해 생체내에서 사용되는 경우, 본 발명의 SFRP-4-결합제, 예를 들어 항-SFRP-4 항체는 유효량 (즉, 원하는 치료 효과를 갖는 양)으로 대상체에게 투여된다. 이는 통상적으로 비경구로 투여될 것이다. 투여량 및 용량 요법은 SFRP-4- 관련 질환 또는 장애의 정도, 사용되는 특정 SFRP-4-결합제의 특징, 예를 들어 그의 치료 지수, 대상체, 및 대상체의 이력에 따라 달라질 것이다. 이롭게는, SFRP-4-결합제는 혈관계에서 세포를 치료하기 위해 정맥내로, 국소 림프절을 치료하기 위해 피하로 및 복강내로 1 내지 2주의 기간에 걸쳐 연속적으로 투여된다. 임의로, 보조 치료요법, 예컨대 방사선조사, 화학요법 치료, 또는 종양 괴사 인자, 인터페론 또는 다른 세포보호제 또는 면역조정제의 투여의 조합된 주기의 과정 중에 투여된다.

비경구 투여를 위해, SFRP-4-결합제는 제약상 허용되는 비경구 비히클과 함께 단위 용량 주사가능한 형태 (용액, 현탁액, 에멀젼)로 제제화될 것이다. 이러한 비히클은 원칙적으로 비독성이고 비-치료요법이다.

항-SFRP-4 IgM 항체의 사용은 특정 적용에서 바람직할 수 있으나, 그러나 IgG 분자는 더 작은 크기에 의해 IgM 분자보다 특정 유형의 감염된 세포로 더 많이 편재화될 수 있다. 생체내 보체 활성화가 염증 반응의 유도 및 대식세포의 활성화를 비롯한 각종 생물학적 효과를 유발한다는 증거가 있다 (문헌 [Unanue & Benecerraf, Textbook of Immunology, 2nd Edition (Williams & Wilkins 1984) p. 218]). 염증을 수반하는 증가된 혈관확장은 감염된 세포에서 편재화하는 여러 작용제 능력을 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해 특정된 유형의 SFRP-4-항체 조합은 다양한 방법으로 치료학적으로 사용될 수 있다. 또한, 항원, 예를 들어 정제된 SFRP-4 폴리펩티드, 그의 단편 또는 유사체 (문헌 [Hakomori, Ann. Rev. Immunol. 2: 103, 1984]), 또는 이러한 항원과 관련된 항-이디오타입 항체 (문헌 [Nepom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2864, 1985]; [Koprowski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 216, 1984])는 인간 대상체에서 활성 면역 반응을 유도하는데 사용될 수 있다. 이러한 반응은 바람직한 생물학적 효과, 예를 들어 표적 세포 파괴를 위해 인간 보체를 활성화할 수 있는 항체의 형성을 포함한다.

질환 및 장애. SFRP-4 폴리펩티드의 증가된 (질환 또는 장애를 앓지 않는 대상체와 비교하여) 수준 또는 생물학적 활성을 특징으로 하는 질환 및 장애는 활성을 길항하는 (즉, 감소시키거나 또는 억제하는) SFRP-4-결합제-기재 치료 화합물에 의해 치료될 수 있으며, 이는 치료학적 또는 예방학적 방식으로 투여될 수 있다. 사용될 수 있는 치료 화합물로는 (i) 상기 언급된 SFRP-4-결합제; 및 (ii) SFRP-4-결합제를 코딩하는 핵산이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

SFRP-4 폴리펩티드의 감소된 (질환 또는 장애를 앓지 않는 대상체와 비교하여) 수준 또는 생물학적 활성을 특징으로 하는 질환 및 장애는 SFRP-4 활성을 증가시키는 SFRP-4-결합제-기재 치료 화합물 (즉, SFRP-4 활성에 대한 효능제)에 의해 치료될 수 있다. 활성을 상향조절하는 치료제는 치료학적 또는 예방학적 방식으로 투여될 수 있다. 사용될 수 있는 치료제로는 생체이용율을 증가시키는 SFRP-4-결합제가 포함되나 이에 제한되지 않는다.

증가된 또는 감소된 수준은 SFRP-4-결합제-유래 펩티드 및/또는 RNA의 정량에 의해, 대상체의 조직 샘플 (예를 들어, 생검 조직으로부터)의 획득에 의해, 및 RNA 또는 펩티드 수준, 발현된 SFRP-4 폴리펩티드 (또는 상기 언급된 폴리펩티드의 mRNA)의 구조 및/또는 활성에 대한 시험관내 분석에 의해 용이하게 검출될 수 있다. 당분야에 익히 공지된 방법으로는 면역검정법 (예를 들어, 웨스턴 블럿팅 분석, 면역침전 후 나트륨 도데실 술페이트 (SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 면역세포화학 등에 의해) 및/또는 mRNA의 발현을 검출하기 위한 혼성화 검정법 (예를 들어, 노던 검정법, 도트 블럿팅, 계내 혼성화 등)이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

SFRP-4는 수많은 질환 및 장애와 관련되어 있으며, 이들 모두는 SFRP-4 결합제의 개발에 의해 영향을 받을 수 있다.

본 발명은 SFRP-4-매개 장애의 검출, 예방 또는 치료를 위한 SFRP-4-결합제의 사용 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 SFRP-4-결합제는 SFRP-4 폴리펩티드 발현의 변화, 예를 들어 증가 또는 감소에 의해 나타나는 장애, 예를 들어 암 (예를 들어, 뇌, 유방, 전립선, 자궁, 비장, 췌장, 위장관 (예를 들어, 결장, 직장, 소장, 위, 식도); 허혈 (예를 들어, 심부전, 심근경색증; 뇌졸중)로부터 기인한 세포자멸; 신경변성 질환 (예를 들어, 헌팅톤병, 말초 탈수초성 질환, 다발성 경화증, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병; 외상); 관상 심장 질환, 염증 (예를 들어, 염증성 장 질환)의 예방학적 치료 또는 치료학적 치료에 유용하다.

본 발명의 SFRP-4 결합제는 유방암의 검출, 예방학적 또는 치료학적 치료에 유용하다. 옹(Wong)과 동료들은 유방암에서 SFRP의 역할 및 Wnt-신호전달 경로에 대한 그의 관계를 시험하였다. SFRP, Wnt-1, APC, 베타-카테닌 및 그의 표적 유전자 c-myc 및 사이클린 D1의 계내 혼성화 및 면역조직화학적 분석을 인간 유방의 침습성 관상 암종의 70개의 표본에서 수행하였다. SFRP mRNA은 인접한 정상적인 조직과 비교하여 62개의 종양 표본에서 하향조절되었으며, 8개의 종양 표본에서 증가하였다. 그러나, 종양 진행의 과정에서, SFRP mRNA는 종양 및 인접한 조직 둘 모두에서 계속 증가하였다. 흥미롭게, 액와 림프절 전이의 많은 경우는 감소된 SFRP의 군에서보다 증가된 SFRP의 군에서 유의하게 적었으며, 이는 SFRP가 침습성 유방암에서 예후 인자로서 기여할 수 있다는 것을 제안하였다 (문헌 [Wong et al., J. Pathol. 196: 145-153, 2002]).

본 발명의 SFRP-4 결합제는 세포자멸 감수성 근세포 표현형을 갖는 대상체에서 과부하 유도 심부전, 심근 비대증 및 세포자멸의 검출, 예방학적 또는 치료학적 치료에 유용하다. 슈만(Schumann) 및 동료들은 SFRP의 심근 mRNA 발현 및 비심부전증 심장과 심부전증 심장으로부터의 조직 샘플 중 가용성 베타-카테닌의 수준을 비교하였다 (문헌 [Schumann, et al. (2002) Cardiovascular Res 45: 720-728, 2002]). sFRP 1 및 2의 mRNA 수준이 아닌, 조기세포사멸 sFRP 3 및 4의 mRNA 수준은 공여자 심장과 비교하여 심부전증 심실에서 증가되었다. 확장 심근병증 또는 관상 심장 질환을 앓고 있는 환자 사이의 유의한 차이점은 없었다. sFRP 3 및 4는 심근세포에서 발현되었으며, 그의 발현은 조기세포사멸 Fas/Fas-길항제 비율의 mRNA 발현과 상관관계가 있었으나, 항세포사멸 bcl-xL의 mRNA 수준과는 반대로 상관관계가 없었다. 상기 결과는 심부전증 인간 심근에서 Wnt/베타-카테닌 경로가 2종의 내인성 Wnt-길항제의 향상된 발현에 의해 약독화된다는 가설을 지지한다. 이는 과부하 인간 심근의 세포자멸 감수성 표현형에 기여할 수 있다.

본 발명의 SFRP-4 결합제는 자궁암, 예를 들어 자궁내막암의 검출, 예방학적 또는 치료학적 치료에 유용하다. 흐르젠작(Hrzenjak) 및 동료들은 자궁내막 간질 육종에서 분비 프리즐드-관련 단백질 4 및 베타-카테닌 발현의 역 상관관계를 관찰하였다 (문헌 [Hrzenjak et al., J Pathol. 204(1): 19-27, 2004]). cDNA 어레이 분석 후, 자궁내막 간질 육종에서 탈조절된 300개 초과의 유전자가 선택되고 서열분석되었다. 이들 중에서 가장 유의하게 탈조절된 유전자는 SFRP, 특히 SFRP4의 유전자였다. 정상적인 자궁내막과 비교하여, SFRP4의 발현은 저등급 자궁내막 간질 육종 (ESS; n = 10) 및 미분화 자궁내막 육종 (UES; n = 4) 둘 모두에서 감소되었으며, 더 공격적 형태인 후자에서 더 낮았다. 이들 결과는 파라핀 왁스에 묻힌 조직 상에서 정량 실시간 PCR 분석 및 계내 혼성화에 의해 입증되었다. 또한, Wnt-신호전달 경로의 중요한 성분인 베타-카테닌의 발현은 SFRP4에 대향하는 방식으로 조절되었으며, 미분화 육종에서 특히 증가되었다. Wnt-신호전달 경로의 활성화는 또한 베타-카테닌이 UES에서 핵으로 전위되었다는 면역조직화학적 입증에 의해 지지되었다. 따라서, SFRP4는 Wnt 경로의 탈조절 및 ESS 및 UES의 발병기전에 관련된 추정상의 종양 서프레서일 수 있다.

본 발명의 SFRP-4 결합제는 자궁암, 예를 들어 자궁내막암 및 유방암의 검출, 예방학적 또는 치료학적 치료에 유용하다. 아부-자우드(Abuh-Jawdeh) 및 동료들은 정상적인 자궁내막과 비교하여 인간 자궁내막암종에서 차별적으로 발현된 유전자, 및 클로닝된 SFRP를 확인하기 위해 시차 디스플레이 기술을 사용하였다 (문헌 [Abuh-Jawdeh, G et al., Lab Invest. 79: 439-47, 1999]). 계내 혼성화를 사용하여, SFRP는 상피 세포에 의해서가 아니라 간엽 세포에 의해 발현된 것으로 결정되었다. SFRP의 발현은 자궁내막 주기 동안 조정되었다: 이는 증식성 자궁내막의 간질에서 발현되고, 분비성 또는 월경성 자궁내막에서 유의하게 검출가능하지 않았으며, 이는 SFRP가 호르몬 조절하에 있다는 것을 제안하였다. 또한, SFRP mRNA의 발현은 자궁내막 과형성 및 암종의 간질에서 및 계내 및 침윤성 유방 암종의 간질에서 현저하게 상향조절되었다. 이들 결과는 SFRP가 Wnt-프리즐드 신호전달 경로의 조절인자로서 기능하고, 자궁내막 생리 및 암형성과 관련되어 있다는 것을 나타낸다.

본 발명의 SFRP-4 결합제는 전립선암의 검출, 예방학적 또는 치료학적 치료에 유용하다. 호르바트(Horvath) 및 동료들은 분비 프리즐드-관련 단백질 4의 막성 발현이 국소 전립선암에서 양호한 예후에 대해 예측하고 시험관내 PC3 세포 증식을 억제한다는 것을 입증하였다 (문헌 [Horvath et al., Clin. Cancer Res. 10: 615-25, 2004]). SFRP-4 mRNA가 전립선암 (PC)에서 과다발현되기 때문에, 호르바트의 연구의 목적은 정상 인간 전립선 조직 및 악성 인간 전립선 조직에서 SFRP-4 단백질 발현의 패턴을 정의하고, 발현의 변화가 질환 진행 및 예후와 관련되었는가를 결정하고, PC의 시험관내 모델에서 SFRP-4-과다발현의 표현형을 정의하는 것이었다. 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 분석은 세포의 >20%에서 PC 발현된 막성 SFRP-4를 갖는 환자가 </=20% 막성 발현과 비교시 (P = 0.002) 재발없는 생존을 개선하였다는 것을 밝혔다. 또한, 막성 SFRP-4 발현 (P = 0.04)은 글리슨(Gleason) 점수 (P = 0.006), 병리학적 단계 (P = 0.002), 및 수술전 전립선-특이적 항원 수준 (P = 0.004)으로 모델링하는 경우 재발의 독립적 예측변수이었다. 또한, 시험관내 연구는 대조군 PC3-빈 벡터 세포와 비교하여 (P < 0.0001) SFRP-4로 형질감염된 PC3 세포의 증식 속도의 감소를 입증하였다. PC3-SFRP-4 세포에서 포스포릴화 글리코겐 신타제 키나제 3베타의 감소된 수준은 상기 표현형이 "Wnt/베타-카테닌" 경로에 의해 매개된다는 것을 제안하였다. 이들 데이타는 SFRP4 발현이 잠재적으로 PC 세포 증식에 대한 억제 효과의 결과로서 국소 PC에 대한 예후일 수 있다는 것을 제안한다.

예방학적 방법. 한 측면에서, 본 발명은 SFRP-4 폴리펩티드 발현 또는 하나 이상의 SFRP-4 폴리펩티드 활성을 조정하는 SFRP-4-결합제를 대상체에게 투여함으로써 상기 대상체에서 이상 SFRP-4 발현 또는 활성과 관련된 질환 또는 상태를 예방하는 방법을 제공한다.

이상 SFRP-4 폴리펩티드 발현 또는 활성에 의해 기인되거나 또는 이에 기여되는 질환의 위험이 있는 대상체는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 진단 또는 예후 검정법 중 임의의 방법 또는 이들의 조합에 의해 확인될 수 있다. 예방학적 적용에서, SFRP-4-결합제의 제약 조성물 또는 의약은 질환 또는 상태 (즉, 면역 질환)에 감수성이 있거나 또는 이와 달리 위험이 있는 대상체에게 상기 위험을 제거하거나 또는 감소시키거나, 중증도를 약화시키거나, 또는 질환 (질환의 생화학, 조직학적 및/또는 행동적 증상, 그의 합병증, 및 질환의 발병 중에 나타나는 중간 병리학적 표현형을 포함)의 개시를 지연시키는데 충분한 양으로 투여된다. 예방학적 SFRP-4-결합제는 이소성의 증상 특징의 증세발현 전에 투여되어, 질환 또는 장애가 예방되거나 또는 대안으로 그의 진행이 지연되도록 할 수 있다. 이소성의 유형에 따라, 예를 들어 SFRP-4 효능제 또는 SFRP-4 길항제로서 작용하는 SFRP-4-결합제가 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있다. 적절한 화합물은 본원에 기재된 스크리닝 검정법을 기초로 결정될 수 있다.

치료 방법. 본 발명의 다른 측면은 치료학적 목적을 위해 대상체에서 SFRP-4 폴리펩티드 발현 또는 활성을 조정하는 방법을 포함한다. 본 발명의 조정 방법은 세포와 관련된 SFRP-4 폴리펩티드 활성의 하나 이상의 활성을 조정하는 본 발명의 SFRP-4-결합제와 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 치료학적 적용에서, 조성물 또는 의약은 이러한 질환이 의심되거나 또는 이미 상기 질환을 앓고 있는 대상체에게 질환의 발병에서 그의 합병증 및 중간 병리학적 표현형을 비롯한 질환의 증상 (생화학, 조직학적 및/또는 행동적)을 치유하거나, 또는 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 투여된다. 치료학적 또는 예방학적 치료를 성취하기에 적절한 양은 치료학적으로 또는 예방학적으로 효과적인 투여량으로서 정의된다.

SFRP-4 폴리펩티드 활성을 조정하는 화합물은 본원에 기재되어 있으며, 예를 들어 SFRP-4-결합제 또는 SFRP-4-결합제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, SFRP-4-결합제는 하나 이상의 SFRP-4 폴리펩티드 활성을 자극한다. 이러한 자극성 화합물의 예로는 SFRP-4-결합제, 및 세포에 도입된 SFRP-4-결합제를 코딩하는 핵산 분자 (즉, 폴리뉴클레오티드)를 들 수 있다. 다른 실시양태에서, SFRP-4-결합제는 하나 이상의 SFRP-4 폴리펩티드 활성을 억제한다. 이들 조정 방법은 시험관내에서 (예를 들어, 세포를 SFRP-4-결합제와 배양함으로써), 또는 대안으로 생체내에서 (예를 들어, SFRP-4-결합제를 대상체에게 투여함으로써) 수행될 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 SFRP-4 폴리펩티드, 또는 SFRP-4 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 이상 발현 또는 활성을 특징으로 하는 SFRP-4-관련 질환 또는 장애를 앓고 있는 개체의 치료 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 SFRP-4 발현 또는 활성을 조정하는 (예를 들어, 상향조절하거나 또는 하향조절하는) SFRP-4-결합제 (예를 들어, 본원에 기재된 스크리닝 검정법에 의해 확인된 화합물) 또는 조합 SFRP-4-결합제를 투여하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 방법은 감소된 또는 이상 SFRP-4 발현 또는 활성을 보상하는 치료요법으로서 SFRP-4-결합제, 또는 SFRP-4-결합제를 코딩하는 핵산 분자를 투여하는 것을 포함한다. SFRP-4 활성의 자극은 SFRP-4 폴리펩티드가 비정상적으로 하향조절된 상황에서 바람직하다.

SFRP-4-결합제-기재 치료제의 생물학적 효과의 결정. 본 발명의 여러 실시양태에서, 적합한 시험관내 또는 생체내 검정법은 특이적 SFRP-4-결합제-기재 치료제의 효과 및 그의 투여가 대상체에서 영향받는 조직의 치료에 적응증이 되는가를 결정하기 위해 수행된다.

여러 실시양태에서, 시험관내 검정법은 주어진 SFRP-4-결합제-기재 치료제가 세포 유형에 대해 원하는 효과를 발휘하는가를 결정하기 위해, 대상체의 장애에 수반되는 유형의 대표적인 세포로 수행될 수 있다. 치료요법에서 사용하기 위한 SFRP-4-결합제는 인간 대상체에서 시험하기 전에 적합한 동물 모델 시스템 (래트, 마우스, 닭, 소, 원숭이, 토끼 등을 포함하나 이에 제한되지 않음)에서 시험될 수 있다. 유사하게, 생체내 시험을 위해, 당분야에 공지된 임의의 동물 모델 시스템은 인간 대상체에게 투여하기 전에 사용될 수 있다.

치료 요법 및 효과적인 용량. 몇몇 조성물은 본 발명의 여러종 (예를 들어, 2종 이상)의 SFRP-4-결합제의 조합을 포함한다. 몇몇 조성물에서, 조성물의 그의 SFRP-4-결합제 각각은 SFRP-4 폴리펩티드의 별개의 예비-선택된 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체 또는 인간 서열 항체이다.

본원에 기재된 SFRP-4-관련 상태 및 질환의 치료를 위한, 본 발명의 SFRP-4-결합제, 예를 들어 항-SFRP-4 항체 또는 항-SFRP-4 항체 세포독소 접합체의 효과적인 투여량은 투여 수단, 표적 부위, 대상체의 생리적 상태, 대상체가 인간인가 또는 동물인가, 투여되는 다른 의약, 및 치료가 예방학적 치료인가 또는 치료학적 치료인가를 비롯한 많은 상이한 인자에 따라 달라진다. 통상적으로, 대상체는 인간이나, 트랜스제닉 포유동물을 비롯한 비인간 포유동물이 또한 치료될 수 있다. 치료 용량은 안전성 및 효능의 최적화를 위해 적정되는 것이 필요하다.

전형적으로, 치료학적 또는 예방학적 효과를 성취하기에 충분한 본 발명의 조성물의 유효량은 일일 약 0.000001 mg/체중 kg 내지 일일 약 10,000 mg/체중 kg의 범위이다. 바람직하게는, 용량 범위는 일일 약 0.0001 mg/체중 kg 내지 일일 약 100 mg/체중 kg이다. SFRP-4-결합제, 예를 들어 항-SFRP-4 항체와의 투여에서, 용량은 일일 약 0.0001 내지 100 mg/숙주 체중 kg, 및 보다 통상적으로 0.01 내지 5 mg/숙주 체중 kg의 범위이다. 예를 들어, 용량은 일일 1 mg/체중 kg 또는 10 mg/체중 kg이거나, 또는 일일 1 내지 10 mg/kg의 범위내에 있을 수 있다. 예시적 치료 요법은 2주마다 1회 투여 또는 1개월마다 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여를 수반한다. 몇몇 방법에서, 상이한 결합 특이성을 갖는 2종 이상의 SFRP-4 결합제가 동시에 투여되며, 이 경우 투여되는 각 항체의 용량은 표시된 범위 내에 포함된다. SFRP-4-결합제, 예를 들어 항-SFRP-4 항체는 통상적으로 수회 투여된다. 단일 용량 사이의 간격은 1주, 1개월 또는 1년일 수 있다. 간격은 또한 대상체 중 항체의 혈액 수준의 측정에 의해 지시되는 바와 같이 불규칙할 수 있다. 몇몇 방법에서, 용량은 1 내지 1000 ㎍/ml 및 몇몇 방법에서 25 내지 300 ㎍/ml의 혈장 SFRP-4-결합제, 예를 들어 항-SFRP-4 항체 농도를 성취하도록 조절된다. 대안으로, SFRP-4-결합제, 예를 들어 항-SFRP-4 항체는 서방형 제제로서 투여될 수 있으며, 이 경우 덜 잦은 투여가 요구된다. 용량 및 빈도는 대상체에서 SFRP-4-결합제의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간 항-SFRP-4 항체는 가장 긴 반감기를 나타내며, 이어서 인간화 항-SFRP-4 항체, 키메라 항-SFRP-4 항체, 및 비인간 항-SFRP-4 항체 순이다. 투여의 용량 및 빈도는 치료가 예방학적 치료인가 또는 치료학적 치료인가에 따라 달라질 수 있다. 예방학적 적용에서, 상대적으로 낮은 용량이 긴 기간에 걸쳐 상대적으로 드문 간격으로 투여된다. 몇몇 대상체는 그의 남은 여생 동안 계속 치료받는다. 치료학적 적용에서, 질환의 진행이 감소되거나 또는 종료될 때까지, 및 바람직하게는 대상체가 질환의 증상의 부분 또는 완전 완화를 나타낼 때까지, 상대적으로 짧은 간격으로 상대적으로 고용량이 때로 요구된다. 그 후, 예방학적 요법이 환자에게 투여될 수 있다. SFRP-4 면역원을 코딩하는 핵산에 대한 투여량은 대상체 당 약 10 ng 내지 1 g, 100 ng 내지 100 mg, 1 ㎍ 내지 10 mg, 또는 30 내지 300 ㎍ DNA의 범위이다. 감염성 바이러스 벡터에 대한 투여량은 투여 당 10 내지 100개 이상의 비리온으로 다양하다.

독성. 바람직하게는, 본원에 기재된 SFRP-4-결합제의 효과적인 투여량은 대상체에게 실질적으로 독성을 유발하지 않으면서 치료학적 이점을 제공할 것이다. 본원에 기재된 SFRP-4-결합제의 독성은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 제약 절차에 의해, 예를 들어 LD₅₀ (집단의 50%에 대한 치사 투여량) 또는 LD₁₀₀ (집단의 100%에 대한 치사 투여량)의 결정에 의해 결정될 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 투여량 비율이 치료 지수이다. 이들 세포 배양 검정법 및 동물 연구로부터 얻은 데이타는 인간에서 사용시 독성이 없는 용량 범위를 제제화하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 SFRP-4-결합제의 용량은 바람직하게는 독성이 없거나 또는 거의 없는 효과적인 투여량을 포함하는, 순환 농도의 범위 내에 있다. 용량은 사용되는 용량 형태 및 사용되는 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 달라질 수 있다. 정확한 제제, 투여 경로 및 용량은 대상체의 상태를 검진하는 개별 의사에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Fingl et al., In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1 (1975)]을 참조한다.

키트. 또한, 본 발명의 SFRP-4-결합제 조성물 (예를 들어, 항체 세포독소 접합체, 모노클로날 항체, 인간 서열 항체, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자) 및 사용에 대한 지시사항을 포함하는 키트가 본 발명의 범위 내에 있다. 키트는 생물학적 샘플 중 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드의 존재를 검출하는데 유용하다. 예를 들어, 키트는 생물학적 샘플 중 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드를 검출할 수 있는 표지된 SFRP-4-결합제; 샘플 중 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드의 양을 결정하는 수단; 및 샘플 중 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드의 양을 표준과 비교하는 수단을 포함할 수 있다. 배합물 또는 배합물들은 적합한 용기에 포장될 수 있다. 키트는 SFRP-4 폴리펩티드 또는 SFRP-4-유사 폴리펩티드를 검출하기 위해 키트를 사용하는 것에 대한 지시사항을 추가로 포함할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태를 보다 충분히 예시하기 위해 제공된다. 본 실시예는 첨부된 청구의 범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 I

항-SFRP-4 항체 제조.

SFRP-4 폴리펩티드 항원의 클로닝. 전장-인간 SFRP-4 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 클론을 얻었다 (미국 매릴랜드주 락빌 소재의 오리진(OriGene); 10K 선택 B061-B064_O09_gi|8400733|ref|NM_003014.2). 호프만-라 로슈 인크.(Hoffmann-La Roche Inc.; 뉴저지주 뉴틀리 소재; 제품 번호 1732650)로부터의 고충실도 DNA 폴리머라제를 사용하여 65℃에서 오픈 리딩 프레임 마이너스 정지 코돈을 증폭시켰 다. 인간 SFRP-4 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 증폭시키는데 하기 프라이머를 사용하였다: 센스 프라이머 5'CCCAAGCTTGCAGTGCCATGTTCCTCTCCATCC3' (서열 11); 안티센스 프라이머 5'GCTCTAGATCATCAATGGTGATGGTGATGATGCACTCTTTTCGGGTTTGTTCTC3' (서열 12). 앰플리콘을 겔 정제하고 (미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아겐 인크.(Qiagen Inc.); 제품 번호 28704), 제조자의 지시사항에 따라 pCR-XL-TOPO로 라이게이션하였다 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐; 제품 번호 45-0008). 스위스 바젤 소재의 솔비아스 아게(Solvias AG)에 의해 서열 충실도를 확인하였다. 숙주 균주 이. 콜라이 Top 10 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐; 제품 번호 44-0301)에서 TOPO-구축물을 증폭시켰다. 삽입물을 HindIII 및 XbaI에 의해 절제하고, 정제하고, T4 DNA 리가제 (미국 뉴저지주 뉴틀리 소재의 로슈 파마슈티칼스, 인크.(Roche Pharmaceuticals, Inc.); 제품 번호 481220)를 사용하여 pRS5a (공급원: 노파르티스)로 라이게이션하였다. pRS5a 구축물을 "pSFRP4fullHis" (플라스노바(PlasNova) 도입 번호: NPL006815)라고 지칭하였다. pSFRP4fullHis 구축물을 천연 Kozac 및 리더 서열로 코딩하고, 완전 코딩 서열 (CDS) 및 His-태그를 인간 SFRP-4 폴리펩티드의 최종 아미노산에 직접적으로 부착하였다. 생명공학 정보 국립 센터에서의 BLAST 네트워크 서비스를 사용하여 DNA 및 아미노산 서열을 분석하였다.

SFRP-4 항원의 형질감염 및 발현. HEK293 Ebna 세포를 표준 성장 조건하에 6 웰-클러스터 (10⁶ 세포/웰)에서 접종하고, 밤새 인큐베이션하고; 95% 전면 생장에 서, 제조자 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐; 제품 번호 11668-027)의 지시사항에 따라 리포펙타민 2000을 사용하여 pSFRP4fullHis 또는 pRS5a 대조군 2 ㎍으로 각 웰 중 세포를 형질감염시켰다. 각 웰은 2.5 ml 배지를 함유하였다. 일시적 생성을 위해, FCS 비함유 DMEM (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐-깁코; 제품 번호 31966-021)에서 48시간 후 세포를 옮겼다. 배양 상등액을 72시간 마다 샘플링하고, His-태그가 부착된 재조합 SFRP-4의 존재에 대해 웨스턴 블럿팅에 의해 분석하였다. 제조자의 지시사항에 따라 HRP-표지된 항-His-태그 항체 (퀴아겐, No. 34460) 및 화학발광생성 기질 (로슈, No. 2015196)을 사용하여 단백질을 검출하였다. 안정한 세포주를 선택하기 위해, 10% (v/v) FCS 및 250 ㎍/ml 제오신을 함유하는 둘베코(Dulbecco)의 변형된 이글스(Eagles) 배지 (DMEM)에서 48시간 후 세포를 옮겼다. 재조합 SFRP-4 생성을 상기 기재된 바와 같이 분석하였다. β-갈락토시다제 (노파르티스 파마 아게(Novartis Pharma AG))를 코딩하는 pRK-LacZ-1로 대조군 형질감염을 수행하였다. 발색성 기질 (미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트라타겐(Stratagene); 제품 번호 200384-2)로 염색함으로써 효소 활성을 세포 수준으로 48시간 후 시각화하였다.

SFRP-4 생성. Hek293 Ebna 세포를 pRK-LacZ-1, pRS5a 또는 pSFRP4fullHis로 형질감염시켰다. 형질감염 효율은 pRK-LacZ-1 대조군의 계내 β-갈락토시다제 염색에 의해 추정된 바와 같이 대략 60%이었다. pSFRP4fullHis로 형질감염된 세포는 변경된 성장 행동을 나타내었다. 이들은 응집물을 형성하였으며, FCS 비함유 배지로 옮긴 후 72시간부터 사멸하였다. 선택의 8 내지 10주 후 몇몇의 안정한 세포주 만을 얻었다. 대조적으로, 벡터 단독을 함유하는 대조군은 정상적인 성장 행동을 나타내었다.

FCS 비함유 배양 상등액의 웨스턴 블럿팅 분석은 재조합 SFRP-4가 형질감염된 세포에 의해 성공적으로 생성되고 분비되었음을 나타내었다. 55 kDa에서 밴드가 관찰되었으며, 이는 글리코실화 단백질의 분자량에 상응하였다 (도 1, 패널 A, 48시간 레인; 또한, 도 1, 패널 B, 레인 1 참조). 72시간 이후의 시점에서 SFRP-4 폴리펩티드 생성 수준이 감소되었으며, 단백질을 55 내지 40 kDa 크기 범위의 도말표본으로서 검출하였다 (도 1, 패널 A, 144시간 레인).

PNGase F에 의한 SFRP-4의 탈글리코실화. 저분자량 단편의 형성이 부분적 글리코실화 또는 단백질분해로 인한 것인가를 연구하기 위해, SFRP-4 생성 세포 배양의 FCS 비함유 배양 상등액을 48시간 및 144시간에 샘플링하였다. 48시간 상등액을 제조자의 지시사항에 따라 펩티드: N-글리코시다제 F (PNGase F) (미국 매사추세츠주 입스위치 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스, 제품 번호 P0704L)로 처리하였다 (도 1 참조). 탈글리코실화 실험에서, 48시간에 취한 샘플을 PNGase F로 처리하였다 (도 1, 패널 B, 레인 1 내지 3). 펩티드: N-글리코시다제 F (또한 PNGase F라고 공지됨)는 가장내부의 GlcNAc와 N-연결 당단백질로부터의 고 만노스, 하이브리드 및 복합체 올리고당류의 아스파라긴 잔기 사이를 절단하는 아미다제이다 (문헌 [Maley et al., Anal. Biochem., 180, 195-204, 1989]). SFRP-4-함유 배양 상등액의 PNGase F 처리는 55 kDa 밴드 SFRP-4 면역반응성 폴리펩티드를 40 kDa에서 별개의 밴드로서 이동된 폴리펩티드로 전환하였다 (도 1, 패널 B, 레인 1 및 레인 2 대 레인 3). 본 실험은 시간에 걸쳐 발생되는 단편 형성이 부분적 글리코실화에 의한 것이며, 단백질분해에 의한 것이 아니라는 것을 나타내었다.

손상된 세포 생리가 분비 SFRP-4의 관찰된 부분적 글리코실화에 의해 반영될 수 있다는 것을 가정하였다. 안정한 세포주는 매우 불량한 SFRP-4 생산자였다. 따라서, ELISA 현상을 위한 물질을 일시적 시스템으로 제조하였다. 여기에, 72시간 동안 형질감염된 Hek293 Ebna 세포에 의해 SFRP-4를 제조하였다. 항생제에 의한 선택적인 압력을 사용하지 않았다. 배양 상등액 200 ml로부터 전체 글리코실화된 천연 SFRP-4 폴리펩티드 50 ㎍의 총 수율을 얻었다.

SFRP-4 폴리펩티드 항원의 정제 및 정량. FCS 비함유 배지에서 72시간 배양 후 SFRP-4 생성 세포의 배양 상등액을 수집하였다. 상등액 200 ml로부터 Ni-NTA 컬럼 (미국 소재의 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich); 제품 번호 H8286) 1.25 ml에 의해 재조합 SFRP-4를 정제하였다. 컬럼을 1OmM 이미다졸을 함유하는 인산염 완충액 (pH 8)에 의해 평형화하였다. 배양 상등액을 대략 2 ml/min의 유속으로 주사기로 도포하였다. 재조합 SFRP-4를 250mM 이미다졸을 함유하는 인산염 완충액 (pH 8)에 희석하였다. 마이크로콘(Microcon) YM-30 (미국 매사추세츠주 베드포드 소재의 밀리포어 코포레이션(Millipore Corporation); 제품 번호 42409) 0.5 ml를 사용하여 희석물을 300 ㎕로 농축하였다.

BCA 방법 (미국 일리노이주 락포드 소재의 피어스 케미칼 캄파니, 제품 번호 23235)에 의해 단백질 농도를 결정하였다. 누페이지(NuPAGE) 4-12% 비스-트리스 겔 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐, 제품 번호 NP0323BOX) 상에서 10% 베타-머캅토에탄올을 함유하는 라엠리(Laemmli) 샘플 완충액 (미국 캘리포니아주 헤르쿨레스 소재의 바이오-라드(Bio-Rad), 제품 번호 161-0737), 누페이지 전개 완충액 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 바이오-라드; 제품 번호 NP0002) 및 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250 (미국 캘리포니아주 헤르쿨레스 소재의 바이오라드 래보러토리즈, 제품 번호 161-0436)을 사용하여 단백질의 순도를 결정하였다. 누페이지 전기영동 시스템 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐)에서 겔을 전개시켰다.

폴리클로날 항체 생성을 위한 SFRP-4 펩티드 제조. 바이오벤치2 (노파르티스) 및 생명공학 정보 국립 센터에서의 BLAST 네트워크 서비스를 사용하여 SFRP-4의 아미노산 서열을 분석하였다. 아미노산 잔기 292-305 및 아미노산 305-319에 상응하는 인간 SFRP-4의 2종의 펩티드는 그의 잠재적 항원성, 소수성, 표면 확률, 글리코실화 확률 및 특이성을 기초로 선택된 면역원이었다. 선택된 펩티드는 인간 및 시노몰거스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)) SFRP-4에서 동일하였다.

펩티드 합성 및 커플링. 선택된 펩티드 H₂N-QEQRRTVQDKKKTAC-CONH₂ (즉, EP040756; 서열 8) 및 H₂N-AGRTSRSNPPKPKGKC-CONH₂ (즉, EP040755; 서열 7)을 합성하고, 유로젠텍 게엠베하(Eurogentec GmbH)(벨기에 리지 소재)에서 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌 (KLH) 또는 난알부민 (OVA)로 접합하였다.

항체 생성. 2마리의 뉴질랜드 백색 토끼 (벨기에 리지 소재의 유로젠텍) SZ2067 및 SZ2068을 각각 0, 14, 28, 56일째에 200 ㎍/ml KLH-접합된 EP040755 및 EP040756의 혼합물로 면역화하였다. 면역 혈청을 87일째에 수거하였다. 각 펩티드에 대해, 87일째로부터 면역 혈청 10 ml (토끼 각각으로부터 5 ml)를 수지 컬럼 (벨기에 리지 소재의 유로젠텍 게엠베하) 상에서 친화성-정제하였다.

컬럼 제조 및 항체 정제 (벨기에 리지 소재의 유로젠텍). 각 펩티드에 대해, 표준 절차에 따라 각각의 유리 펩티드 (EP040755 또는 EP040756) 5 mg을 시스테인을 통해 AF-아미노 토요펄(TOYOPEARL) 650 M (토소(Tosoh))로 접합시킴으로써 소규모 친화성 컬럼 (수지 1 ml)을 제조하였다. NaCl 0.2 g을 항혈청 10 ml에 첨가하였다. 100 mM 글리신 (pH 2.5) 2 * 5 ml, 이어서 20 g/l NaCl에 의해 보충된 3 * 5 ml PBS에 의해 사용 전에 친화성 컬럼을 세척하였다. 혈청을 컬럼 상에 적용하고, 유동물을 회수하였다. 이를 5회 반복하였다. 그 후, 20 g/l NaCl이 보충된 PBS 3 * 5 ml에 의해 컬럼을 세척하고, 100 mM 글리신 (pH 2.5) 1 ml로 희석하였다. 항체를 1M 트리스 완충액 (pH 8.5) 100 ㎕를 함유하는 튜브에 회수하였다. 용출물을 각각 4시간 동안 PBS 5 L에 대해 2회 투석하였다. BSA를 1%로 첨가하고, 아지드화나트륨을 0.1% 최종 농도로 첨가하였다.

항체 생성의 검출. 표준 방법을 사용하여 직접적 ELISA에 의해 항-SFRP-4 항체 생성을 분석하였다. 요약하여, OVA-접합된 펩티드 EP040755 및 EP040756을 1 ㎍/ml의 농도로 맥시소르브(Maxisorb)™ (눈크(Nunc)) 상에 개별적으로 코팅하였다. 플레이트를 세척하고, 슈퍼블록(Superblock)™ (피어스) 차단 배지로 차단하였다. 여러 희석물에서 혈청 샘플 및 친화성-정제된 항체를 첨가하고, 3시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. HRP-접합된 염소-항-토끼 IgG Fc 항체 (미국 펜실베니아주 웨스트 그로브 소재의 잭슨 이뮤노리써치(Jackson ImmunoResearch); 제품 번호 111-035-046) 및 발색성 기질 (미국 캘리포니아주 알메다 소재의 로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics) (즉, 로슈 몰레큘라 시스템즈, 인크.(Roche Molecular Systems, Inc.)); 제품 번호 1484281)에 의해 결합된 토끼 항체를 검출하였다. 신호 강도를 분자 장치 써모맥스 마이크로플레이트 판독기에 의해 검출하고, 데이타를 소프트맥스 프로(Softmax Pro) 3.1을 사용하여 분석하였다.

항체 특징화. 표준 방법을 사용하여 직접적 ELISA에 의해 항체 품질을 분석하였다. 재조합 SFRP-4를 0 내지 300 ng/ml의 농도에서 맥시소르브™ (눈크) 상에 코팅하였다. 플레이트를 세척하고, 배지를 차단하는 슈퍼블록™ (피어스)으로 차단하였다. 여러 희석물에서 혈청 샘플 및 친화성-정제된 항체를 첨가하고, 3시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. HRP-접합된 염소-항-토끼 IgG Fc 항체 (미국 펜실베니아주 웨스트 그로브 소재의 잭슨 이뮤노리써치; 제품 번호 111- 035-046) 및 발색성 기질 (미국 캘리포니아주 알메다 소재의 로슈 다이아그노스틱스 (즉, 로슈 몰레큘라 시스템즈, 인크.); 제품 번호 1484281)에 의해 결합된 토끼 항체를 검출하였다. 신호 강도를 분자 장치 써모맥스 마이크로플레이트 판독기에 의해 검출하고, 데이타를 소프트맥스 프로 3.1을 사용하여 분석하였다.

검출을 위해 HRP-접합된 염소-항-토끼 IgG Fc 항체 (미국 펜실베니아주 웨스트 그로브 소재의 잭슨 이뮤노리써치; 제품 번호 111-035-046) 및 화학발광생성 기질 (미국 뉴저지주 뉴틀리 소재의 호프만-라 로슈 인크.; 제품 번호 2015196)을 사 용하여 웨스턴 블럿팅 (WB)에 의해 항-EP040755를 또한 평가하였다.

폴리클로날 항체 생성. 직접적 ELISA에서 각 OVA-커플링된 펩티드를 검출하는 토끼-항혈청 및 친화성 정제된 항-EP040755 및 항-EP040756의 능력을 예비면역 혈청과 비교하였다. 토끼의 항혈청은 항원 및 재조합 SFRP-4 폴리펩티드를 검출하였다. 친화성 정제된 항체는 그의 각 항원을 검출하였다. 그러나, 정제된 항-EP040755만이 또한 재조합 SFRP-4 폴리펩티드를 검출하였다. 항체 (1 ㎍/ml)는 8 ng/ml 재조합 SFRP-4 폴리펩티드를 검출하였다. 인간에서 5.5 내지 80 ng/ml SFRP-4 폴리펩티드의 공지된 혈청/혈장 농도를 기초로, 상기 항체는 원숭이 혈장 중 SFRP-4를 측정하기에 충분한 민감성을 갖는 것으로 고려되었다. 원숭이 혈장에서 항-SFRP-4 ELISA를 설정하는데 친화성 정제된 항-EP040755를 사용하였다. 웨스턴 블럿팅 분석에서, 항-EP040755를 사용하는 SFRP-4의 검출 한계는 75 ng 절대량이었다.

결론. 천연 재조합 SFRP-4 및 SFRP-4-특이적 폴리클로날 항체를 제조하였다. 하기 실시예 II에 상세히 기재된 바와 같이 AFI030 연구 (BMD R0250736-04)의 시노몰거스 혈장 샘플을 측정하기 위해 ELISA를 설정하는데 상기 물질을 성공적으로 사용하였다.

실시예 II

생물학적 샘플에서 면역반응성 SFRP-4 폴리펩티드의 정량에 유용한 SFRP-4의 정량을 위한 SFRP-4 ELISA의 개발

본 연구의 목적은 생물학적 샘플에서 SFRP-4 면역반응성 폴리펩티드를 검출 하는데 유용한 SFRP-4 ELISA 검정법을 구축하는 것이었다. 구체적으로, 4주 기간에 걸쳐 난소절제된 암컷 시노몰거스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스)의 혈청에서 SFRP-4 면역반응성 폴리펩티드를 검출하기 위해 SFRP-4-ELISA 검정법을 개발하고 사용하였다.

ELISA에 의한 혈장 중 SFRP-4의 정량. 특이적 샌드위치 ELISA 검정법을 사용하여 SFRP-4를 결정하였다. SFRP-4에 대한 샌드위치 ELISA는 상기 단백질에 대한 2종의 특이적 폴리클로날 항체, 상기 실시예 I에 상세히 기재된 바와 같은 SFRP-4 펩티드에 대한 친화성 정제된 토끼 항체, 및 R&D 시스템 (cat no. A1827)으로부터의 염소-항-SFRP-4 항체를 사용하였다. 공지된 농도의 SFRP-4 폴리펩티드를 함유하는 보정 표준을 각 마이크로역가 플레이트 상에서 실행하였다. 비공지된 샘플의 농도는 보정 곡선으로부터 얻었다 (도 2 참조). 시약 및 검정법 파라미터는 하기 표 5 내지 7에 상세히 기재되어 있다.

화학 시약:
PBS 완충액	로슈 No. 166789
BSA	소 혈청 알부민; 시그마: No. A-7888-50G
트윈® 20	액손 랩 아게(Axon Lab AG) No. A-1389,0500
코팅 완충액	피어스 No. 28382
분석 완충액	인산염-완충액 + 0.05% 트윈 20 + 1% BSA
세척 완충액	인산염-완충액 + 0.05% 트윈 20
차단 완충액	인산염-완충액 + 0.05% 트윈 20 + 2% BSA
BM 블루 POD-기질	로슈 No. 1484281
H2SO4 2N	노파르티스 No. N43
생물학적 시약:
시노몰거스 혈장	기원: 사내 컨트롤 매트릭스 뱅크 (In-house control matrix bank) Cs는 시노몰거스 혈장의 동일 부분의 풀에서 제조함, 로트 번호: CmoPla002, CmoPla042, CmoPla043, CmoPla044, CmoPla45.
특이적 시약:
SFRP-4-rec. 단백질	기원: MAD (CH)에서 사내 제조
코팅 항체	염소-항-SFRP-4, R&D 시스템 No. A1827
검출 항체	토끼-항-SFRP-4 (기원: 유로젠텍), SFRP-4 펩티드 EP040755에 대한 친화성 정제된 pAb
이차 항체	염소-항-토끼 IgG Fc-HRP, 잭슨 No. 111-035-046
검정법:
검정법의 작용 범위	15.7 내지 1000 ng/ml
검정법의 한계	LLOQ: 허용 기준을 충족하는 최저 C-값으로서 정의된 15.7 ng/ml ULOQ: 허용 기준을 충족하는 최고 C-값으로서 정의된 1000 ng/ml
허용 기준	평균 정확도 : 80% 내지 120% (LLOQ 및 ULOQ에서 70% 내지 130%) 평균 정밀도: CV ≤ 15% (LLOQ 및 ULOQ에서 20%)
특이성	검정법은 SFRP-4에 대해 특이적임

샘플 제조. 시험 기간의 시작 (1일째) 및 부검 직전 (29일째 또는 30일째)에 난소절제된 암컷 시노몰거스 원숭이 각각으로부터 혈액을 얻었다. 혈장을 각 시험 샘플로부터 얻고, 사용 때까지 동결하였다. SFRP-4 ELISA 분석 일에, 동결된 혈장 샘플 (헤파린-함유 튜브)을 실온에서 해동하였다. 비희석된 모든 샘플을 분석하였다. 보정 표준 및 비공지물을 이중으로 실행하고, 각 값에 대해 산술 평균을 계산하였다.

검정 절차. 각 인큐베이션 단계 후, 마이크로역가 플레이트를 세척 완충액으로 3 순환으로 자동적으로 세척하였다 (표 6 참조).

코팅	염소-항-SFRP-4, 코팅 완충액 중 3 ㎍/ml 100 ㎕/웰, 4℃에서 밤새
차단	차단 완충액 200 ㎕/웰, 실온에서 1시간
Cs 및 비공지물의 인큐베이션	Cs 또는 비공지물의 50 ㎕/웰 실온에서 3시간
검출 항체의 인큐베이션	토끼-항-SFRP-4-EP040755, 분석 완충액 중 2 ㎍/ml 50 ㎕/웰, 실온에서 1시간
이차 항체의 인큐베이션	염소-항-토끼 IgG Fc-HRP, 분석 완충액 중 1:5000 50 ㎕/웰, 암실에서 실온에서 1시간
효소적 반응 및 검출	POD-기질 50 ㎕/웰, 암실에서 실온에서 20분 50 ㎕/웰 H2SO4 2N을 첨가하여 반응을 정지시킴

SFRP-4 ELISA 보정 곡선. 모든 표준에 대한 정확도를 체크하고 우리의 허용 기준에 맞추었다 (표 7 참조).

보정 모델	4-파라미터 로지스틱 (4PL) 피트 y = ((A-D)/(x/C)＾B))+D
y	비-특이적 결합(NSB)의 광학적 밀도의 공제 후 광학적 밀도
x	C 샘플 중 SFRP-4의 농도
A	X 축의 낮은 값에서 점근선에 상응하는 Y-값
B	곡선이 얼마나 빠르게 곡선의 중심에서 점근선으로부터 그의 전이를 제조하는가를 기재함
C	A와 D 사이의 중심점에 상응하는 X-값
D	X 축의 높은 값에서 점근선에 상응하는 Y-값
보정 및 데이타 획득을 위한 소프트웨어	소프트맥스프로(SoftMaxPro) 버젼 3.1.1 (S1)

모든 표준에 대한 정확도를 우리의 허용 기준에 맞추도록 검증하였다.

결과 요약. 비희석된 시노몰거스 혈장 중 SFRP-4를 결정하기 위해 15.7 ng/ml의 민감성을 갖는 샌드위치 ELISA를 개발하였다. 모든 동물의 혈장에서 SFRP-4를 검출하였다 (표 8 참조).

SFRP-4 혈장 농도 (ng/ml)

동물 id	1일째	30일째
B611551	35.05	34.16
B611552	32.55	35.75
B611553	32.57	28.04
B611554	33.71	32.42
B611555	54.26	53.83
B611556	42.57	40.06
B611557	36.20	39.37
B611558	34.22	44.00

시노몰거스 혈장 중 SFRP-4를 정량하는 샌드위치 ELISA를 성공적으로 개발하였다. 기준 단백질 및 항-SFRP-4 항체는 이전에 사내에서 개발하였다 (BMD R0250736-03; 일반적으로, 실시예 I 참조). 검정법은 생물학적 샘플, 예를 들어 혈장 중 SFRP-4 면역반응성 폴리펩티드의 분석에 적용하기에 충분히 민감성이었다.

실시예 III

고처리량 웨스턴 블럿팅 분석에 의한 선택 조직 중 SFRP-4 면역반응성 단백질의 정량

고처리량 웨스턴 블럿팅. 고처리량 웨스턴 블럿팅 - 31명의 인간 성인의 정상적인 조직 (Cat. No. W8234480-B)을 제조자의 지시사항 (독일 하이델베르그 소재의 바이오캣 게엠베하(BioCAT GmbH))에 따라 수행하였다. 일차 항체로서 2 ㎍/ml 친화성 정제된 토끼 항-SFRP4 EP040755 (실시예 I 참조)를 사용하였다. 검출 항체로서 20 ng/mL 염소 항-토끼 IgG (H+L)-HRP (피어스 cat no. 34075)를 사용하였다. 도 3을 참조한다.

31명의 상이한 개체 인간 조직에 의한 고처리량 웨스턴 블럿팅은 심장에서 최고 SFRP-4 단백질 수준을 나타내었다. 이는 심장 경색증, 근육병증 또는 관상 심장 질환에 대한 질환 바이오마커 (진단, 예후, 질환 단계, 약물 효과)로서 SFRP-4의 검출에 유용하다.

고처리량 웨스턴 블럿팅은 결장, 직장, 십이지장에서 높은 SFRP-4 수준을 나타내었으나, 회장, 공장, 식도에서의 평균 발현보다 미만이었다. 이는 소화관의 결장직장암 및 다른 암에 대한 질환 바이오마커 (진단, 예후, 질환 단계, 약물 효과)로서 및 소화관의 염증성 질환의 등급에 대한 마커로서 SFRP-4의 검출에 유용하다.

고처리량 웨스턴 블럿팅은 비장 및 췌장에서 SFRP-4의 평균 수준 초과를 나타내었다. 이는 비장암 또는 췌장암에 대한 질환 바이오마커 (진단, 예후, 질환 단계 및 약물 효과)로서 SFRP-4의 검출에 유용하다.

고처리량 웨스턴 블럿팅은 자궁에서 SFRP-4의 평균 수준 초과를 나타내었다. 이는 자궁암에 대한 질환 바이오마커 (진단, 예후, 질환 단계 및 약물 효과)로서 SFRP-4의 검출에 유용하다.

고처리량 웨스턴 블럿팅은 뇌에서 SFRP-4의 평균 수준 초과를 나타내었다. 이는 신경변성 질환 (예를 들어, 헌팅톤병, ALS, 알츠하이머병, MS, 파킨슨병, 말초 탈수초성 질환) 및 뇌 종양에 대한 질환 바이오마커 (진단, 예후, 질환 단계 및 약물 효과)로서 SFRP-4의 검출에 유용하다.

등가물

본 발명은 본원에 기재된 특정 실시양태에 의해 제한되지 않으며, 상기 실시양태는 본 발명의 각 측면의 단순한 예시를 위한 것이다. 본 발명의 많은 변형물 및 변화물이 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않고 제조될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 본원에 나열된 관능적 등가 방법 및 장치가 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다는 것은 상기 기재로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형물 및 변화물은 첨부된 청구의 범위 내에 포함되도록 의도된다. 본 발명은 이러한 청구의 범위가 표제된 등가물의 전체 범위와 함께 첨부된 청구의 범위에 의해서만 제한된다. 본 발명은 특정 방법, 시약, 화합물, 조성물 또는 생물학적 시스템 (이들은 물론 변할 수 있음)에 제한되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 본원에서 사용되는 용어는 특정 실시양태의 기재만을 위한 것이며, 제한하려는 의도가 아님이 또한 이해될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> NOVARTIS AG Zaar, Annette Hillenbrand, Rainer Vitaliti, Alessandra <120> SECRETED FRIZZLED RELATED PROTEIN-4 (SFRP-4) PROTEIN BINDING AGENTS <130> 50037-KR-PCT <140> <141> 2007-02-08 <150> PCT/EP07/051229 <151> 2007-02-08 <150> 60/771,651 <151> 2006-02-08 <160> 12 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 2820 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)...(2820) <223> Human Secreted Frizzled Related Protein <400> 1 ggcgggttcg cgccccgaag gctgagagct ggcgctgctc gtgccctgtg tgccagacgg 60 cggagctccg cggccggacc ccgcggcccc gctttgctgc cgactggagt ttgggggaag 120 aaactctcct gcgccccaga agatttcttc ctcggcgaag ggacagcgaa agatgagggt 180 ggcaggaaga gaaggcgctt tctgtctgcc ggggtcgcag cgcgagaggg cagtgccatg 240 ttcctctcca tcctagtggc gctgtgcctg tggctgcacc tggcgctggg cgtgcgcggc 300 gcgccctgcg aggcggtgcg catccctatg tgccggcaca tgccctggaa catcacgcgg 360 atgcccaacc acctgcacca cagcacgcag gagaacgcca tcctggccat cgagcagtac 420 gaggagctgg tggacgtgaa ctgcagcgcc gtgctgcgct tcttcttctg tgccatgtac 480 gcgcccattt gcaccctgga gttcctgcac gaccctatca agccgtgcaa gtcggtgtgc 540 caacgcgcgc gcgacgactg cgagcccctc atgaagatgt acaaccacag ctggcccgaa 600 agcctggcct gcgacgagct gcctgtctat gaccgtggcg tgtgcatttc gcctgaagcc 660 atcgtcacgg acctcccgga ggatgttaag tggatagaca tcacaccaga catgatggta 720 caggaaaggc ctcttgatgt tgactgtaaa cgcctaagcc ccgatcggtg caagtgtaaa 780 aaggtgaagc caactttggc aacgtatctc agcaaaaact acagctatgt tattcatgcc 840 aaaataaaag ctgtgcagag gagtggctgc aatgaggtca caacggtggt ggatgtaaaa 900 gagatcttca agtcctcatc acccatccct cgaactcaag tcccgctcat tacaaattct 960 tcttgccagt gtccacacat cctgccccat caagatgttc tcatcatgtg ttacgagtgg 1020 cgttcaagga tgatgcttct tgaaaattgc ttagttgaaa aatggagaga tcagcttagt 1080 aaaagatcca tacagtggga agagaggctg caggaacagc ggagaacagt tcaggacaag 1140 aagaaaacag ccgggcgcac cagtcgtagt aatcccccca aaccaaaggg aaagcctcct 1200 gctcccaaac cagccagtcc caagaagaac attaaaacta ggagtgccca gaagagaaca 1260 aacccgaaaa gagtgtgagc taactagttt ccaaagcgga gacttccgac ttccttacag 1320 gatgaggctg ggcattgcct gggacagcct atgtaaggcc atgtgcccct tgccctaaca 1380 actcactgca gtgctcttca tagacacatc ttgcagcatt tttcttaagg ctatgcttca 1440 gtttttcttt gtaagccatc acaagccata gtggtaggtt tgccctttgg tacagaaggt 1500 gagttaaagc tggtggaaaa ggcttattgc attgcattca gagtaacctg tgtgcatact 1560 ctagaagagt agggaaaata atgcttgtta caattcgacc taatatgtgc attgtaaaat 1620 aaatgccata tttcaaacaa aacacgtaat ttttttacag tatgttttat taccttttga 1680 tatctgttgt tgcaatgtta gtgatgtttt aaaatgtgat gaaaatataa tgtttttaag 1740 aaggaacagt agtggaatga atgttaaaag atctttatgt gtttatggtc tgcagaagga 1800 tttttgtgat gaaaggggat tttttgaaaa attagagaag tagcatatgg aaaattataa 1860 tgtgtttttt taccaatgac ttcagtttct gtttttagct agaaacttaa aaacaaaaat 1920 aataataaag aaaaataaat aaaaaggaga ggcagacaat gtctggattc ctgttttttg 1980 gttacctgat ttccatgatc atgatgcttc ttgtcaacac cctcttaagc agcaccagaa 2040 acagtgagtt tgtctgtacc attaggagtt aggtactaat tagttggcta atgctcaagt 2100 attttatacc cacaagagag gtatgtcact catcttactt cccaggacat ccaccctgag 2160 aataatttga caagcttaaa aatggccttc atgtgagtgc caaattttgt ttttcttcat 2220 ttaaatattt tctttgccta aatacatgtg agaggagtta aatataaatg tacagagagg 2280 aaagttgagt tccacctctg aaatgagaat tacttgacag ttgggatact ttaatcagaa 2340 aaaaagaact tatttgcagc attttatcaa caaatttcat aattgtggac aattggaggc 2400 atttatttta aaaaacaatt ttattggcct tttgctaaca cagtaagcat gtattttata 2460 aggcattcaa taaatgcaca acgcccaaag gaaataaaat cctatctaat cctactctcc 2520 actacacaga ggtaatcact attagtattt tggcatatta ttctccaggt gtttgcttat 2580 gcacttataa aatgatttga acaaataaaa ctaggaacct gtatacatgt gtttcataac 2640 ctgcctcctt tgcttggccc tttattgaga taagttttcc tgtcaagaaa gcagaaacca 2700 tctcatttct aacagctgtg ttatattcca tagtatgcat tactcaacaa actgttgtgc 2760 tattggatac ttaggtggtt tcttcactga caatactgaa taaacatctc accggaattc 2820 <210> 2 <211> 346 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)...(283) <223> SFRP-4 Polypeptide <400> 2 Met Phe Leu Ser Ile Leu Val Ala Leu Cys Leu Trp Leu His Leu Ala 1 5 10 15 Leu Gly Val Arg Gly Ala Pro Cys Glu Ala Val Arg Ile Pro Met Cys 20 25 30 Arg His Met Pro Trp Asn Ile Thr Arg Met Pro Asn His Leu His His 35 40 45 Ser Thr Gln Glu Asn Ala Ile Leu Ala Ile Glu Gln Tyr Glu Glu Leu 50 55 60 Val Asp Val Asn Cys Ser Ala Val Leu Arg Phe Phe Phe Cys Ala Met 65 70 75 80 Tyr Ala Pro Ile Cys Thr Leu Glu Phe Leu His Asp Pro Ile Lys Pro 85 90 95 Cys Lys Ser Val Cys Gln Arg Ala Arg Asp Asp Cys Glu Pro Leu Met 100 105 110 Lys Met Tyr Asn His Ser Trp Pro Glu Ser Leu Ala Cys Asp Glu Leu 115 120 125 Pro Val Tyr Asp Arg Gly Val Cys Ile Ser Pro Glu Ala Ile Val Thr 130 135 140 Asp Leu Pro Glu Asp Val Lys Trp Ile Asp Ile Thr Pro Asp Met Met 145 150 155 160 Val Gln Glu Arg Pro Leu Asp Val Asp Cys Lys Arg Leu Ser Pro Asp 165 170 175 Arg Cys Lys Cys Lys Lys Val Lys Pro Thr Leu Ala Thr Tyr Leu Ser 180 185 190 Lys Asn Tyr Ser Tyr Val Ile His Ala Lys Ile Lys Ala Val Gln Arg 195 200 205 Ser Gly Cys Asn Glu Val Thr Thr Val Val Asp Val Lys Glu Ile Phe 210 215 220 Lys Ser Ser Ser Pro Ile Pro Arg Thr Gln Val Pro Leu Ile Thr Asn 225 230 235 240 Ser Ser Cys Gln Cys Pro His Ile Leu Pro His Gln Asp Val Leu Ile 245 250 255 Met Cys Tyr Glu Trp Arg Ser Arg Met Met Leu Leu Glu Asn Cys Leu 260 265 270 Val Glu Lys Trp Arg Asp Gln Leu Ser Lys Arg Ser Ile Gln Trp Glu 275 280 285 Glu Arg Leu Gln Glu Gln Arg Arg Thr Val Gln Asp Lys Lys Lys Thr 290 295 300 Ala Gly Arg Thr Ser Arg Ser Asn Pro Pro Lys Pro Lys Gly Lys Pro 305 310 315 320 Pro Ala Pro Lys Pro Ala Ser Pro Lys Lys Asn Ile Lys Thr Arg Ser 325 330 335 Ala Gln Lys Arg Thr Asn Pro Lys Arg Val 340 345 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)...(15) <223> SFRP-4 Amino Acids 305-319 <400> 3 Ala Gly Arg Thr Ser Arg Ser Asn Pro Pro Lys Pro Lys Gly Lys 1 5 10 15 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)...(13) <223> SFRP-4 Amino Acids 292-305 <400> 4 Gln Glu Gln Arg Arg Thr Val Gln Asp Lys Lys Lys Thr Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)...(4) <223> SFRP-4 Amino Acid 103-116 <400> 5 Arg Ala Arg Asp Asp Cys Glu Pro Leu Met Lys Met Tyr Asn 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)...(12) <223> SFRP-4 Amino Acids 103-116 <400> 6 Ser Pro Ile Pro Arg Thr Gln Val Pro Leu Ile Thr 1 5 10 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)...(16) <223> SFRP-4 Amino Acid ID NO. EP040755 <400> 7 Ala Gly Arg Thr Ser Arg Ser Asn Pro Pro Lys Pro Lys Gly Lys Cys 1 5 10 15 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)...(15) <223> SFRP-4 Amino Acid Sequence ID No. EP040756 <400> 8 Gln Glu Gln Arg Arg Thr Val Gln Asp Lys Lys Lys Thr Ala Cys 1 5 10 15 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)...(15) <223> SFRP-4 Sequence ID No. EP040757 <400> 9 Arg Ala Arg Asp Asp Cys Glu Pro Leu Met Lys Met Tyr Asn Cys 1 5 10 15 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)...(13) <223> SFRP-4 Amino Acid Sequence ID No. EP040758 <400> 10 Ser Pro Ile Pro Arg Thr Gln Val Pro Leu Ile Thr Cys 1 5 10 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)...(33) <223> SFRP-4 anti-sense primer <400> 11 cccaagcttg cagtgccatg ttcctctcca tcc 33 <210> 12 <211> 54 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)...(54) <223> SFRP-4 Anti-sense primer <400> 12 gctctagatc atcaatggtg atggtgatga tgcactcttt tcgggtttgt tctc 54

Claims (19)

1. 서열 3, 서열 4 및 서열 5로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하고; 서열 2의 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체 조성물.
2. 제1항에 있어서, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 항체-관련 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되는 항체.
3. 제1항의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
4. 서열 3, 서열 4 및 서열 5로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하고; 서열 2의 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 단리된 핵산.
5. 제4항의 핵산을 포함하는 벡터.
6. 제5항에 있어서, 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하는 벡터.
7. 제5항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
8. (a) 항체 또는 그의 단편의 발현을 제공하는 조건하에 제6항에 따른 벡터를 함유하는 세포를 배양하는 단계; 및

   (b) 발현된 항체 또는 그의 단편을 회수하는 단계

   를 포함하는, 서열 3, 서열 4 및 서열 5로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하고; 서열 2의 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편의 제조 방법.
9. (a) 샘플을 제공하는 단계;

   (b) 샘플을 제1항의 항체 조성물과 접촉시키는 단계; 및

   (c) 면역반응성 폴리펩티드에 결합된 항체 조성물의 존재 또는 양을 결정하고, 이에 의해 샘플 중 면역반응성 폴리펩티드의 존재 또는 양을 결정하는 단계

   를 포함하는, 샘플 중 면역반응성 폴리펩티드의 존재 또는 양을 결정하는 방법.
10. 유효량의 제1항의 항체 조성물을 대상체에서 분비 프리즐드(frizzled) 관련 폴리펩티드 유형 4-관련 장애의 치료 또는 예방에 충분한 양으로 상기 치료 또는 예방이 바람직한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 분비 프리즐드 관련 폴리펩티드 유형 4-관련 장애의 치료 또는 예방 방법.
11. 제10항에 있어서, 분비 프리즐드 관련 폴리펩티드 유형 4-관련 장애가 뇌암; 유방암; 전립선암: 자궁암; 비장암; 췌장암; 결장암; 직장암; 소장암; 위암; 식도암; 허혈, 심부전으로부터 기인한 세포자멸(apoptosis); 심근경색증; 뇌졸중; 신경변성 장애; 헌팅톤병; 말초 탈수초성 질환; 다발성 경화증; 알츠하이머병; 근위축성 측삭 경화증; 파킨슨병; 외상; 관상 심장 질환; 염증; 및 염증성 장 질환으로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
12. 제4항의 핵산을 대상체에서 서열 2의 폴리펩티드의 발현과 관련된 의학적 상태의 치료 또는 예방을 위한 유효량으로 상기 치료 또는 예방이 바람직한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 분비 프리즐드 관련 폴리펩티드 유형 4-관련 장애의 치료 또는 예방 방법.
13. 제12항에 있어서, 분비 프리즐드 관련 폴리펩티드 유형 4-관련 장애가 뇌암; 유방암; 전립선암; 자궁암; 비장암; 췌장암; 결장암; 직장암; 소장암; 위암; 식도암; 허혈, 심부전으로부터 기인한 세포자멸; 심근경색증; 뇌졸중; 신경변성 장애; 헌팅톤병; 말초 탈수초성 질환; 다발성 경화증; 알츠하이머병; 근위축성 측삭 경화증; 파킨슨병; 외상; 관상 심장 질환; 염증; 및 염증성 장 질환으로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
14. 포유동물에게 하나 이상의 제1항의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 서열 2의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 발현 또는 활성의 조정 방법.
15. 분비 프리즐드 관련 폴리펩티드 유형 4-관련 장애의 치료용 의약의 제조를 위한 제1항의 항체 조성물의 용도.
16. 하나 이상의 용기, 제3항의 제약 조성물, 및 내용물의 사용에 대한 지시사항을 포함하는 키트.
17. 하나 이상의 용기, 제5항의 제약 조성물, 및 내용물의 사용에 대한 지시사항을 포함하는 키트.
18. (a) 시험 샘플을 제공하는 단계;

    (b) 항체가 분비 프리즐드 관련 폴리펩티드 유형 4 폴리펩티드 생물학적 마커와 복합체를 형성하는 조건하에 시험 샘플을 제1항의 항체와 접촉시켜, 항체/분비 프리즐드 관련 폴리펩티드 유형 4 폴리펩티드 생물학적 마커 복합체를 형성하는 단계;

    (c) 항체/분비 프리즐드 관련 폴리펩티드 유형 4 폴리펩티드 생물학적 마커 복합체를 검출하는 단계; 및

    (d) 시험 샘플 중 항체/분비 프리즐드 관련 폴리펩티드 유형 4 폴리펩티드 생물학적 마커 복합체를 정량하는 단계

    를 포함하는, 분비 프리즐드 관련 폴리펩티드 유형 4 폴리펩티드 생물학적 마커의 검출 방법.
19. (a) 제1 포유동물 대상체로부터 시험 샘플을 제공하는 단계;

    (b) 항체가 분비 프리즐드 관련 폴리펩티드 유형 4 폴리펩티드 생물학적 마커와 복합체를 형성하는 조건하에 제1 포유동물 대상체로부터의 시험 샘플을 제1항의 항체와 접촉시켜, 항체/분비 프리즐드 관련 폴리펩티드 유형 4 폴리펩티드 생물학적 마커 복합체를 형성하는 단계;

    (c) 항체/분비 프리즐드 관련 폴리펩티드 유형 4 폴리펩티드 생물학적 마커 복합체의 수준을 검출하는 단계;

    (d) 제1 포유동물 대상체로부터의 샘플 중 분비 프리즐드 관련 폴리펩티드 유형 4 폴리펩티드의 발현의 수준을 정량하는 단계; 및

    (e) 질환을 앓고 있지 않거나 또는 상기 질환에 소질이 없다고 공지된 제2 포유동물 대상체로부터의 대조군 샘플에 존재하는 분비 프리즐드 관련 폴리펩티드 유형 4 폴리펩티드의 수준과, 단계 (a)의 샘플 중 분비 프리즐드 관련 폴리펩티드 유형 4 폴리펩티드의 수준을 비교하는 단계

    를 포함하며, 제2 포유동물 대상체로부터의 대조군 샘플과 비교된 제1 대상체 중 분비 프리즐드 관련 폴리펩티드 유형 4 폴리펩티드의 발현 수준의 변경이 질 환의 존재 또는 상기 질환에 대한 소질을 표시하는 것인, 제1 포유동물 대상체 중 분비 프리즐드 관련 폴리펩티드 유형 4 폴리펩티드의 변경된 수준과 관련된 질환의 존재 또는 상기 질환에 대한 소질의 결정 방법.

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