JP2008502368A - Ｓｉｇｌｅｃ−６関連疾患の診断および処置 - Google Patents

Ｓｉｇｌｅｃ−６関連疾患の診断および処置 Download PDF

Info

Publication number
JP2008502368A
JP2008502368A JP2007527720A JP2007527720A JP2008502368A JP 2008502368 A JP2008502368 A JP 2008502368A JP 2007527720 A JP2007527720 A JP 2007527720A JP 2007527720 A JP2007527720 A JP 2007527720A JP 2008502368 A JP2008502368 A JP 2008502368A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
siglec
seq
cell
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2007527720A
Other languages
English (en)
Inventor
シェン−ウー ワン，
グアンフイ フー，
チョンビン ヤオ，
Original Assignee
タノックス， インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by タノックス， インコーポレイテッド filed Critical タノックス， インコーポレイテッド
Publication of JP2008502368A publication Critical patent/JP2008502368A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)

Abstract

本発明は、肥満細胞上でＳＩＧＬＥＣ−６に特異的に結合するアゴニストやアンタゴニストなどの分子、それらを、喘息、その他のＳＩＧＬＥＣ−６媒介性の疾患または障害に使用すること、そのような疾患または障害を診断する方法、および、肥満細胞におけるＳＩＧＬＥＣ−６活性を中和することができる候補化合物をスクリーニングする方法に関する。また、本発明は、ＳＩＧＬＥＣ−６に結合し、および／またはそれを調節する化合物を用いて、Ｂ細胞関連疾患を診断および治療することにも関する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮特許出願番号６０／５７８，１９４号（２００４年６月９日出願）および米国仮特許出願番号６０／５８０，４２２号（２００４年６月１７日出願）（これらのいずれも、その全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。
（発明の分野）
本発明は、肥満細胞および循環血液中単球（ＣＢＭＣ）の表面上で大量に発現されるＳｉｇｌｅｃ−６に関連し、また、それを肥満細胞に関連する疾患または障害の治療に利用することに関連する。また、白血病およびＢ細胞リンパ腫Ｂ細胞に関連する疾患または障害の診断および治療にＳｉｇｌｅｃ−６を利用することにも関係する。
（発明の背景）
免疫グロブリン様分子のスーパーファミリーの中の一群のシアル酸依存性接着分子について記載されている（非特許文献１）。このファミリーを表すために「Ｓｉｇｌｅｃ」という用語が使われてきた（シアル酸結合性Ｉｇ関連レクチン）。今までのところ、このグループのメンバーには、Ｓｉｇｌｅｃ−１（シアロアドヘシン）、Ｓｉｇｌｅｃ−２（ＣＤ２２）、Ｓｉｇｌｅｃ−３（ＣＤ３３）、Ｓｉｇｌｅｃ−４（ミエリン関連糖タンパク質またはＭＡＧ）、Ｓｉｇｌｅｃ−４ｂ（シュワン細胞ミエリンタンパク質またはＳＭＰ）、Ｓｉｇｌｅｃ−５（ＯＢ−ＰＢ２）、Ｓｉｇｌｅｃ−６（ＯＢ−ＢＰ１，ＣＤ３３Ｌ）、Ｓｉｇｌｅｃ−７、Ｓｉｇｌｅｃ−８、Ｓｉｇｌｅｃ−９、Ｓｉｇｌｅｃ−１０、Ｓｉｇｌｅｃ−１１、およびＳｉｇｌｅｃ−１２が含まれる。
Ｓｉｇｌｅｃグループに属するタンパク質の生物活性は、造血、神経発達、および免疫などの多様な生物過程に関与していると考えられている（Ｖｉｎｓｏｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９６ 前掲）。研究によって、これらのタンパク質が、シアル化細胞表面グルカンの認識を介した細胞接着／細胞シグナル伝達に介在することが示唆されている（非特許文献２；非特許文献１；非特許文献３）。
公知のＳｉｇｌｅｃタンパク質は、多様な造血細胞型で発現されているが、皆共通して、単一のＮ末端Ｖセットドメイン（膜遠位）、その後ろに続くさまざまな数の細胞外Ｃ２セットドメイン、膜貫通ドメイン、および短い細胞質尾部を含む類似した構造を有する。さらに、末端のＶセットドメインは、このＩｇスーパーファミリーのメンバーに独特の珍しいシート内ジスルフィド結合を有する（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。
切断型変異体（非特許文献７）、部位特異的突然変異誘発（非特許文献３；非特許文献８）、Ｘ線結晶構造解析およびＮＲＭ（非特許文献９において論じられている）など、さまざまな研究アプローチの結果、公知のＳｉｇｌｅｃタンパク質のＮ末端ＶセットドメインのＧＦＣＣ’Ｃ”面がシアル酸と相互作用することが実証された。すなわち、Ｖセットドメインはシアル酸と相互作用して、細胞間接着を媒介する。
公知のＳｉｇｌｅｃタンパク質に対するリガンドと言われているものは、糖類またはシアル酸を含むよう修飾された、他の細胞上の、または場合によっては同一細胞上の糖タンパク質または糖脂質である。天然に存在する約４０のシアル酸（Ｓｉａ）が、細胞表面糖タンパク質の構造的多様性を増加させている。最もありふれているのは、ＮｅｕＳＡｃ、Ｎｅｕ９Ａｃ２およびＮｅｕ５Ｇｃであり、糖タンパク質または糖脂質上の末端位置で、Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ、およびＳｉａ自体など、他の糖に結合している。特定の細胞型におけるシアル酸の発現パターンは、シアル酸転移酵素の特異的発現によって調節されていると考えられている（非特許文献１０）。Ｓｉｇｌｅｃタンパク質は、末端のシアル酸だけでなく、これらの部分の前後関係も、それらが付着している末端直前の糖に基づいて認識している可能性がある（非特許文献２）。
Ｓｉｇｌｅｃは、シアル酸型、およびそれと末端付近にある糖との結合に対し異なった特異性をもつシアル酸依存性レクチンとして機能することにより、細胞間接着を媒介する可能性がある（Ｋｅｌｍ，Ｓ．，１９９４ 前出；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。シアロアドヘシン（ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｎ）と炭水化物との構造的相互作用が解析されている（例えば、非特許文献１４参照；非特許文献１５も参照）。Ｓｉｇｌｅｃは、同族分子上の特異的シアル酸化複合糖質を介した機能的なタンパク質−炭水化物認識を示し、なかには、α−２，３結合シアル酸を末端にもつグリカンと結合する（非特許文献１６）。シアル酸結合活性は通常、Ｎ末端ＶセットＩｇ様ドメイン上に存在し、最後から２番目のＩｇ様ドメインも含むことができる。このグループのメンバーには、シアル酸の型、および末端付近の糖との結合について異なった特異性を示すものがあることが報告されている。
いくつかのＳｉｇｌｅｃタンパク質の細胞質尾部のアミノ酸配列は、それらが細胞間シグナル伝達に関与していることを強く示唆している。例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−２は、細胞質ドメインに６つのチロシンをもち、そのうち２つは、活性化に介在するＩＴＡＭ（免疫受容活性化チロシンモチーフ）モチーフ内部に存在し、４つは、阻害に介在するＩＴＩＭ（免疫受容阻害性チロシンモチーフ）モチーフ内部に存在する（非特許文献１７）。ＩＴＡＭモチーフのチロシンがリン酸化されると、Ｓｒｃの補充が行われるのに対して、ＩＴＩＭモチーフのチロシンがリン酸化されると、ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２の補充が行われる。Ｓｉｇｌｅｃ−３は、リン酸化されるとＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２を補充するＩＴＩＭを２つ含んでいる（非特許文献１７）。Ｓｉｇｌｅｃ−６も、細胞質尾部にＳＬＡＭ様と推定されるシグナル伝達モチーフをもっているが、ＳＬＡＭはリンパ球活性化シグナル伝達分子（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の頭文字である（非特許文献１８）。
炎症性細胞浸潤が組織に損傷を与えて炎症誘発性因子を放出して、喘息その他のアレルギー性疾患を発症させるのに重要な役割を果たしているという証拠が山積している。活性化された好酸球、好中球、マクロファージ、肥満細胞およびリンパ球の数が炎症部位において増加し、それぞれが炎症反応全体を変化させる能力がある（非特許文献１９）。好酸球は、アレルゲンによって生じた炎症部位に見られる顕著な外観のせいで、喘息およびアレルギーにおいて特に問題となる（非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２）。毒性顆粒タンパク質、炎症誘発性脂質メディエーター、およびサイトカインを放出するため、好酸球は、喘息における気道のリモデリングおよび過敏反応で主要な役割を果たすとされている（非特許文献２３）。
多くのタンパク質が、阻害エフェクター機能の伝達に関与する細胞質阻害シグナル伝達モチーフ、例えば、「免疫レセプター阻害性チロシンモチーフ」すなわち「ＩＴＩＭ」を含むと報告されている（非特許文献２４）。ＩＴＩＭは、コンセンサス配列Ｉ／ＶｘＹｘｘＬ／Ｖをもち、免疫系の多様なシグナル伝達タンパク質の細胞質部分に存在し、その多くは、ｓｉｇｌｅｃと同様、Ｉｇスーパーファミリー、またはＩＩ型の二量体Ｃ型レクチンのファミリーに属している（非特許文献２４参照）。ＩＴＩＭを含むタンパク質には、「キラー細胞Ｉｇ様レセプター」すなわち「ＫＩＲ」、および白血球Ｉｇ様レセプターすなわち「ＬＩＲ」ファミリーのタンパク質がいくつか含まれる（非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６）。ＩＴＩＭによるシグナル伝達は、標的となる細胞活性、例えば、細胞表面タンパク質の発現などを下方制御すると考えられている。Ｒｅｎａｒｄらは、複雑な細胞機能の調節が、ＩＴＩＭによる阻害シグナル伝達と、１６〜１８アミノ酸の活性化モチーフ、または、他のタンパク質に存在する「ＩＴＡＭ」配列による同一機能の活性化との相互作用によって微調整されていると提唱している。
ｓｉｇｌｅｃには、細胞質部分に１つ以上のＩＴＩＭを含むものがあることが報告されている。ＣＤ２２は１つ以上のＩＴＩＭをもち、Ｂ細胞活性化の負の調節因子と特徴づけられている。ＣＤ３３およびｓｉｇｌｅｃ８も細胞質ドメインにＩＴＩＭモチーフを含むことが報告されている（非特許文献２７；Ｆｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，２０００，前掲）。ＩＴＩＭは、ＣＤ８＋ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のサブセット上で有意なレベル発現されるタンパク質であるｐ７５／ＡＩＲＭ１／ｓｉｇｌｅｃ７の細胞質尾部にも存在する（Ｎｉｃｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９，前掲）。
ｓｉｇｌｃの発現は、ほとんど免疫系の骨髄性細胞に限られ、骨髄細胞の相互作用、例えば、（大膠細胞を含む）マクロファージまたは樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）と、Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞など、細胞媒介性免疫に関与する他の細胞との接着などの調節に関与していると考えられている。これらのポリペプチドは、ＡＰＣ上で発現されると、抗原の捕捉および吸収において機能するため、細胞を用いた腫瘍ワクチンを強化するための標的を提供することができる。多くのｓｉｇｌｅｃが、主として特定のタイプの造血細胞のサブセット上で発現しているのが観察されている。ＣＤ３３の発現は、ほとんどが骨髄単球系に限られ、成熟型単核白血球および組織マクロファージ上に存在する（Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，前掲）。ＣＤ２２は主としてＢ細胞上に発現されるが、ｓｉｇｌｅｃ−８は好酸性顆粒球上で特異的に発現される（非特許文献２８）。シアロアドヘシンは、慢性の炎症性症状および腫瘍があるときにマクロファージ上で高レベルに発現されるが、このことは宿主の防御機構における役割を示唆している。また、インビトロにおいて細胞と基質間および細胞と細胞間の特異的な相互作用を媒介することもできる（Ｃｒｏｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４；非特許文献９）。Ｕｍａｎｓｋｙらは、シアロアドヘシン陽性マクロファージが、腫瘍転移に対する宿主の耐性に寄与していること、これらのマクロファージが抗原提示細胞として機能できこと、また、シアロアドヘシンの発現が副腎皮質ステロイド、リンフォカインおよびサイトカインに反応したものであることを報告している（Ｕｍａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６ ａｎｄ １９９６）。
公知のＳｉｇｌｅｃファミリーの他のメンバー（ＣＤ２２、ＣＤ３３、ミエリン関連糖タンパク質、およびシアロアドヘシン）と比較すると、ＯＢ−ＢＰ１／Ｓｉｇｌｅｃ−６、ＯＢ−ＢＰ２／Ｓｉｇｌｅｃ−５およびＣＤ３３／Ｓｉｇｌｅｃ−３が、高レベルで全体的なアミノ酸同一性をもつユニークな近縁サブグループを構成していることが示される。すなわち、Ｓｉｇｌｅｃ−６対Ｓｉｇｌｅｃ−５（５９％）、Ｓｉｇｌｅｃ−６対ＣＤ３３（６３％）、およびＳｉｇｌｅｃ−６／Ｓｉｇｌｅｃ−５対ＣＤ３３（５６％）である。細胞質ドメインはそれほど高度に保存されていないが、免疫レセプターチロシンキナーゼ阻害モチーフ、並びに、ＳＬＡＭおよびＳＬＡＭ様タンパク質に存在するモチーフを含む、チロシンリン酸化の推定部位である新規のモチーフを示している。
Ｓｉｇｌｅｃ−６（ＯＢ−ＢＰ１）は、ＴＦ−１ヒト赤白血病細胞株から単離されたものである（非特許文献１８）。Ｓｉｇｌｅｃ−６は、アミノ酸の数個の違いを除けば、ＣＤ３３−Ｌ１と実質的に同一である。ヒトの組織は、胎盤において、高レベルのＳｉｇｌｅｃ−６ｍＲＮＡを示し、脾臓、末梢血白血球、および小腸において、緩やかな発現を示した。Ｓｉｇｌｅｃ−６に特異的なモノクローナル抗体によって、胎盤の細胞栄養膜細胞および合胞体栄養細胞における高度な発現を確認した。この抗体を末梢血白血球に対して使用したところ、ほぼ例外なくＢ細胞上で発現されるパターンが示された。レプチンの特異的結合について、Ｓｉｇｌｅｃ−６、Ｓｉｇｌｅｃ−５、およびＣＤ３３／Ｓｉｇｌｅｃ−３の細胞外ドメインの組み換え型の測定を行った。Ｓｉｇｌｅｃ−６は強い結合を示した（Ｋ（ｄ）９１ｎＭ）が、他の２つはＫ（ｄ）値が１〜２μＭの範囲となり、弱い結合を示した。シアル酸化リガンドを用いた研究によって、Ｓｉｇｌｅｃ−６が選択的にＮｅｕ５Ａｃａｌｐｈａ２−６ＧａｌＮＡｃａｌｐｈａに結合することが（シアリル−Ｔｎ）示されたため、Ｓｉｇｌｅｃ−６と正式に呼ばれるようになった。Ｓｉｇｌｅｃ−６は、その限定的発現パターンのせいで、特定の細胞集団上に発現されるシアル酸化糖タンパク質リガンドと相互作用することによって細胞間認識事象を媒介しうることが示唆されている。
本発明者らは、Ｓｉｇｌｅｃ−６が、初代の単球、好中球、またはＴリンパ球ではなく、肥満細胞およびＢ細胞の小サブ集団上で高度に発現されることを発見した。このため、ＳＩＧＬＥＣ−６は、肥満細胞の増殖に関連した疾患を治療したり、喘息などの炎症性もしくはアレルギー性の疾患をもたらす肥満細胞メディエーターを阻害したりするための特異的かつ指向的な標的として有益である可能性がある。さらに、ＳＩＧＬＥＣ−６は、白血病およびＢ細胞リンパ腫などのＢ細胞媒介性疾患を診断および治療するための特異的かつ指向的な標的として有益である可能性もある。
Ｋｅｌｍ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９８，２５５：６６３−６７２ Ｋｅｌｍ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．，１９９６，１３：９１３−９２６ Ｖｉｎｓｏｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１：９２６７−９２７２ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．Ｆ．およびＢａｒｃｌａｙ，Ａ．Ｎ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８８，６：３８１−４０５ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ，１９８９，５４：６３７−６４７ Ｐｅｄｒａｚａ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，１１１：２６５１−２６６１ Ｎａｔｈ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２６１８４−２６１９１ Ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｒｗｅ、Ｐ．ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１：９２７３−９２８０ Ｃｒｏｋｅｒ，Ｐ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．，１９９７，１４：６０１−６０９ Ｐａｕｌｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，２６４：１０９３１−１０９３４ Ｐｏｗｅｌｌ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，２６９：１０６２８−１０６３６ Ｓｊｏｂｅｒｇ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９４，１２６：５４９−５６２ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｂ．，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２：１２４８−１２５５ Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２：１６８８９−９５ Ｍａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，１９９８，１：７１９−２８ Ｋｅｌｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，１９９４，４：９６５−７２ Ｔａｙｌｏｒ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，２７４：１１５０５−１１５１２ Ｐａｔｅｌ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，２７４：２２７２９−２２７３８ Ｂｕｓｓｅ，Ｗ．Ｗ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，１０２：Ｓ１７−２２ Ｋｒｏｅｇｅｌ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．，１９９４，７：５１９−５４３ Ｈａｃｚｋｕ，Ａ．，Ａｃｔａ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｈｕｎｇ．，１９９８，４５：１９−２９ Ｂｏｙｃｅ，Ｊ．Ａ．，Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｏｍａ Ｐｒｏｃ．，１９９７，１８：２９３−３００ Ｄｕｒｈａｍ，Ｓ．Ｒ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ，１９９８，２８ 補遺２：１１−６ Ｒｅｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎ Ｒｅｖ，１９９７，１５５：２０５−２２１ Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９７，７：２７３−８２ Ｂｏｒｇｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９７，１５９：５１９２−９６ Ｕｌｙａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９９，２９：３４４０−４９ Ｆｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００，２７５：８６１−８６６
（発明の要旨）
本発明は、Ｓｉｇｌｅｃ−６発現肥満細胞によって誘導される免疫反応を調節する方法に関する。本発明は、Ｓｉｇｌｅｃ−６に対するアゴニストを用いて、喘息などのアレルギー性疾患を含む免疫性疾患、および炎症性疾患を治療することを含む。Ｓｉｇｌｅｃ−６は、免疫レセプター阻害性チロシンモチーフである「ＩＴＩＭ」を含むため、抗体など、Ｓｉｇｌｅｃ−６に結合するアゴニスト分子は、ＩＴＩＭを刺激して、一定の肥満細胞機能を阻害すると思われる。また、この分子は、Ｓｉｇｌｅｃ−６のＩＴＩＭを、ＦｃｅＲＩなどのＩＴＡＭに架橋して、ＩＴＡＭを含むレセプターの作用を阻害する二重特異性分子であってもよい。
本発明は、その細胞表面上にＳＩＧＬＥＣ−６を発現するＢ細胞に関連する疾患を診断および治療する方法にも関する。本発明は、白血病およびＢ細胞リンパ腫などのＢ細胞関連疾患を治療することを含む。ＳＩＧＬＥＣ−６が免疫レセプター阻害性チロシンモチーフである「ＩＴＩＭ」を含むため、ＳＩＧＬＥＣ−６に結合する抗体などのアゴニスト分子は、ＩＴＩＭを刺激してＢ細胞の機能を阻害させるであろう。この分子は、ＳＩＧＬＥＣ−６のＩＴＩＭを、ＦｃｅＲＩなどのＩＴＡＭと架橋して、ＩＴＡＭを含むレセプターの作用を阻害する二重特異性分子である可能性もある。
本発明は、アゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、Ｆｃ媒介性細胞傷害活性を有する抗体、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）など、抗体結合体、ＳＩＧＬＥＣ−６への結合をブロックする抗体、およびＳＩＧＬＥＣ−６発現Ｂ細胞を検出して診断同定するためにＳｉｇｌｅｃ−６に特定的に結合する抗体など、ＳＩＧＬＥＣ−６に特異的に結合する抗体を含む。これらの抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル、およびそれらの機能的結合フラグメントであってもよい。また、抗体は、ただ１つの重鎖または軽鎖をもつ単一ドメイン抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、ヒト化型、ヒト型、キメラ型、二重特異型、または結合型であってもよい。本発明は一本鎖抗体も含む。
抗体結合体は肥満細胞を枯渇させるか、または肥満細胞のアポトーシスを誘導するために利用することができる。抗体結合体は、病的Ｂ細胞を枯渇させるため、またはＳＩＧＬＥＣ−６発現Ｂ細胞においてアポトーシスを誘導するためにも利用される。結合成分は、毒素、放射性同位元素、光反応性成分などの標識、または、例えば、Ｂａｘ−α、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｅｒｋ、およびＢｏｋから選択されるＢｃｌ−２ファミリーのプロアポトーシスメンバーなどのアポトーシス誘導性成分などがある。
本発明は、診断および／または治療の際に利用されるこれらの抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体の組成物を含む。組成物は、適切なキャリア、アジュバント、希釈剤、賦形剤、および／または添加剤と併用した抗体を含む。
本発明の別の態様は、ＳＩＧＬＥＣ−６タンパク質に結合し（例えば、リガンド）、および／または、ＳＩＧＬＥＣ−６タンパク質の生物学的活性を調節する、目的とする因子を同定するためのスクリーニング法にも関する。ＳＩＧＬＥＣ−６タンパク質が肥満細胞の中で発現されるため、これらの因子は、肥満細胞の調節、または、他の免疫細胞の成熟、移動、活性化、または他の細胞との情報伝達に関与する可能性がある。さらに、ＳＩＧＬＥＣ−６は一定のＢ細胞の表面上に発現されるので、これらの因子は、このＢ細胞集団を枯渇させるか死滅させるために利用することができる。このように、ＳＩＧＬＥＣ−６に結合して、その生物学的活性を調節する因子は、喘息その他のアレルギー性疾患、白血病の一定の症状、または炎症を軽減させる可能性がある。
本発明は、抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体を用いて、肥満細胞媒介性の疾患および障害を診断する法も含む。ＳＩＧＬＥＣ−６は肥満細胞に対して高度に特異的であるため、ＳＩＧＬＥＣ−６に対する抗体によって、例えば、組織生検片などの所定のサンプルにおける肥満細胞の存在および頻度を検出することができる。サンプル中で肥満細胞が相対的に増加したことが、肺の平滑筋組織中で肥満細胞のレベルが増加した患者において喘息などがあることを示しうる。抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体は、ＳＩＧＬＥＣ−６発現細胞が存在、または増加／減少したことを検出するためにも使用することができる。
また、本発明は、抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体を用いて、ＳＩＧＬＥＣ−６を発現するＢ細胞に関連する疾患および障害を診断する方法も含む。ＳＩＧＬＥＣ−６は、例えば、病気の患者に由来する血液サンプルのような所定のサンプルにおいて、ＳＩＧＬＥＣ−６に対する抗体によってＳＩＧＬＥＣ−６発現Ｂ細胞の存在および頻度を検出するために利用することができる。サンプル中にＳＩＧＬＥＣ−６発現Ｂ細胞が存在すると、Ｂ細胞リンパ腫などのＢ細胞媒介性疾患があることを示している可能性がある。抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体を用いて、ＳＩＧＬＥＣ−６発現細胞の存在、または増加／減少を検出することができる。
本発明の抗体は、組織または体液中のＳＩＧＬＥＣ−６発現細胞を検出する診断法で使用することができる。この方法は、患者のサンプルを本発明の抗体に曝露すること、および、その抗体がサンプル中の細胞に結合するか否かを測定することを含む。当該分野において知られているさまざまな診断法、例えば、競合結合アッセイ法、直接または間接サンドイッチアッセイ法、および、不均一な段階または均一な段階で行われ免疫沈殿アッセイ法などを用いることができる。体液または組織におけるＳＩＧＬＥＣ−６発現を、免疫蛍光法、ＦＡＣＳ染色法、または、抗ＳＩＧＬＥＣ−６ ｍＡｂを用いる免疫組織化学法によって検出することができる。
（発明の詳細な説明）
（定義）
本出願を通じて使用される用語は、当業者にとって通常かつ一般的な意味を以て理解されるものであるが、本出願人は、以下の用語については、下記に定義したような具体的な定義を与えられるべきものと考える。
本明細書において、「因子」という用語は、化合物、化合物の混合物、生体高分子（核酸、抗体、タンパク質、またはその一部、例えば、ペプチドなど）、または、例えば、細菌、植物、菌類、もしくは動物（特に哺乳動物）の細胞もしくは組織など生体材料から作られた抽出物を意味する。このような因子は、その活性によって、被験体の局所または全身に作用する、生物学的、生理学的、または薬理学的に活性のある物質である「治療因子」として適したものとなる。
「配列同一性」または「配列相同性」という用語は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、いかなる保存的置換も配列同一性の一部であると見なすことなく、配列全体について最大の一致率が得られるようにした後に、候補配列のアミノ酸残基が、比較されている対応配列の残基と同じある割合（％）を意味するものと解されるべきである。Ｎ末側またはＣ末側にある伸長も挿入も、同一性や相同性を減ずるものと解してはならない。アラインメントを行うための方法およびプログラムは、当該分野において周知されている。配列同一性は、配列解析ソフトウエアを用いて測定することも可能である。
抗体鎖ポリペプチド配列について「実質的に同一である」という語句は、抗体鎖が、参照ポリペプチド配列に対して、少なくとも７０％、または８０％、または９０％、または９５％の配列同一性を示すことと解することができる。
「変異体」という用語は、例えば、抗体配列などのポリペプチド配列を説明するために使用される場合には、修飾、置換、挿入、および欠失などによって、その天然の対応配列と１つ以上のアミノ酸で異なっているが、その天然対応配列と同一または同様の生物学的機能を保持しているアミノ酸配列を意味する。変異体は、天然対応配列と比較すると、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、および／または少なくとも９５％の配列同一性があるポリペプチドを含む。変異体は、例えば、保存的アミノ酸置換をもつポリペプチドなどである。
「保存的アミノ酸置換」という用語は、ポリペプチド内のアミノ酸が、類似の側鎖をもつアミノ酸で置換されていることを意味する。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンは脂肪族側鎖をもち、セリンおよびスレオニンは脂肪族ヒドロキシル側鎖をもち、アスパラギンおよびグルタミンはアミド含有側鎖をもち、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンは芳香族側鎖をもち、リジン、アルギニン、およびヒスチジンは塩基性側鎖をもち、そして、システインおよびメチオニンは硫黄含有側鎖をもつ。好ましい保存的アミノ酸置換はバリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。
「フラグメント」という用語は、ポリペプチドを説明するために使用される場合、その本来の対応配列のいずれかの生物活性を保持する、本来の対応配列のアミノ酸配列サブセットを意味する。フラグメントは、その本来の配列の少なくとも１０〜２０個の連続したアミノ酸からなるアミノ酸配列、または本来の配列の少なくとも２０〜３０個の連続したアミノ酸からなるアミノ酸配列を含む。
「アゴニスト」という用語は、ＳＩＧＬＥＣ−６の正常な機能を直接的または間接的に、促進、強化、または刺激する任意の分子を意味する。あるタイプのアゴニストは、リガンドを模倣するという方法でＳＩＧＬＥＣ−６と相互作用する分子であって、抗体または抗体フラグメントなどであるが、これらに限定されない。
「アンタゴニスト」という用語は、ＳＩＧＬＥＣ−６の正常な機能を遮断、阻止、阻害、または中和する任意の分子を意味する。あるタイプのアンタゴニストはＳＩＧＬＥＣ−６とそのリガンドとの相互作用を妨害する分子であって、抗体または抗体フラグメントなどであるが、これらに限定されない。別のタイプのアンタゴニストは、天然のＳＩＧＬＥＣ−６の適正な転写を阻害するアンチセンスヌクレオチド、本来の転写物に結合するｓｉＲＮＡである。
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリンの免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を意味する。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のいずれのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであってよい。さらに、「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）という用語は、完全な分子、および、タンパク質に特異的に結合する能力がある抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントなど）を含むものである。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは完全な抗体のＦｃフラグメントを欠失しており、完全抗体よりも急速に動物および植物の循環系から消失し、完全抗体よりも弱く非特異的組織に結合する可能性がある（Ｗａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））。このため、これらのフラグメントは、ＦＡＢまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物と同じように好適である。さらに、本発明の抗体は、キメラ抗体、一本鎖抗体、およびヒト化抗体などがある。天然の抗体および免疫グロブリンは、通常、２本の同じ軽鎖（Ｌ）、および２本の同じ重鎖（Ｈ）からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。各重鎖は、片側の末端に可変ドメイン（ＶＨ）およびそれに続くいくつかの定常ドメインをもつ。各軽鎖は、片側の末端に可変ドメイン（ＶＬ）を、反対側の末端に定常ドメインをもつ。抗体は、少なくとも約１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２Ｍの結合アフィニティー（Ｋｄ）でＳＩＧＬＥＣ−６タンパク質に結合することができる。本発明の抗体には、国際公開番号ＷＯ０４０８１０２６およびＷＯ０４０４１８６５に記載されているもののように、機能的な抗体が、重鎖または軽鎖を１本しか含ない単一ドメイン抗体もある。
抗体の可変ドメインに関して「可変」という用語は、その可変ドメインのある部位の配列が抗体間で大きく異なっているため、特定の抗体がそれぞれ、その特定の標的に対して結合し、特異性を示すのに利用されるという事実を意味する。しかし、可変性が、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているわけではない。可変性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれ、超可変領域としても知られる、軽鎖および重鎖ドメイン内の３つのセグメントに集中している。可変領域のより高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、ほとんどがβシート構造をとり、３つのＣＤＲによって連結された４つのＦＲ領域を含み、βシート構造を連結するループを形成し、場合によってはその一部分形成している。各鎖内でＣＤＲは、ＦＲ領域の近くの非常に近いところにまとまっており、他の鎖由来のＣＤＲとともに、抗体の標的結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．参照）。本明細書において、免疫グロブリンのアミノ酸残基のナンバリングは、別段の記載がない限り、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．の免疫グロブリンアミノ酸残基ナンバリングシステムに従って行われている（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．１９８７）。
「抗体フラグメント」という用語は、完全長抗体の一部分を意味し、一般に標的結合部位または可変領域を意味する。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメントなどである。抗体の「機能的フラグメント」という語句は、完全長抗体と共通した、定性的な生物活性をもつ化合物である。例えば、抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体の機能的フラグメントまたはアナログは、天然リガンドと同じように作用し、ＩＴＩＭを活性化して、肥満細胞の機能を阻害するように、ＳＩＧＬＥＣ−６に結合することができるものである。本明細書において、抗体に関する「機能的抗体」は、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２フラグメントなどである。「Ｆｖ」フラグメントは、完全な標的認識部位および標的結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、１つの重鎖および１つの軽鎖が堅固に非共有結合している二量体から成る（ＶＨ−ＶＬ二量体）。このような構造が、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体上の標的結合部位を画定する。６つのＣＤＲが集合的して、抗体に対する標的結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（あるいは、標的に対して特異的な３つのＣＤＲだけを含むＦｖの半分）でも、標的を認識して、全結合部位より弱いアフィニティーではあるが、これに結合する能力がある。「単鎖Ｆｖ」すなわち「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、単一のポリペプチド鎖内に存在する、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが標的に結合するために望ましい構造を形成することができるようにする、ＶＨとＶＬドメインを結ぶポリペプチドリンカーをさらに含む。
Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の定常ドメイン、および重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体のヒンジ領域に由来する１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に少数の残基が添加されている点で、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆ（ａｂ’）フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２のペプシン消化産物のヒンジシステインにおけるジスルフィド結合が切断されて産生される。抗体フラグメントのさらに別の化学的結合については当業者に周知されている。
本明細書において、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団、すなわち、各集団に含まれる個々の抗体が、少量ではあるが天然に生じる可能性のある突然変異体を除いて、同一である集団から得られる抗体を意味する。モノクローナル抗体は高度に特異的であって、単一の標的部位を指向する。さらに、一般的には、さまざまな決定基（エピトープ）を指向する異なった抗体を含む従来型（ポリクローナル）抗体調製物とはコントロール的に、各モノクローナル抗体は、標的上の単一決定基を指向する。モノクローナル抗体は、その特異性に加えて、他の免疫グロブリンの混入が起きないハイブリドーマ培養によって合成できるという利点がある。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体の特徴を示すものであり、いずれかの特定の方法によって抗体が産生される必要があると解釈されるべきではない。例えば、本発明とともに使用されるモノクローナル抗体は、周知の技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することができる。本発明に従って使用される親モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５（１９７５）によって最初に記述されたハイブリドーマ法によって、または組み換え法によって作製することができ。
本明細書において、「ＳＩＧＬＥＣ−６媒介性疾患」という用語は、ＳＩＧＬＥＣ−６阻害の欠如、および肥満細胞の活性化、増殖、またはヒスタミン放出という特徴をもつ症状または疾患を意味する。具体的には、この疾患は、例えば、喘息、アレルギー性鼻炎および結膜炎（花粉症）、湿疹、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、および食物アレルギーなど、アナフィラキシー性過敏症およびアトピー性アレルギーに関連した症状を含むものと解釈されよう。例えば、ハチ刺傷、ヘビ咬傷、食物または薬剤によって引き起こされるアナフィラキシー性ショックによる重篤な生理学的状態もこの用語の範囲に含まれる。
本明細書において、「Ｂ細胞関連疾患」という用語は、ＳＩＧＬＥＣ−６を発現し、異常な発現、活性化、またはサイトカイン放出を行うＢ細胞を特徴とする症状または疾病を意味する。具体的には、Ｂ細胞リンパ腫など、病気Ｂ細胞の特徴に結びつく症状を含むものと解釈されよう。
「ＳＩＧＬＥＣ−６の生物学的に活性なフラグメント」は、その生物活性の少なくとも１つ、例えば、脱顆粒を媒介するのに十分なＳＩＧＬＥＣ−６のフラグメントを意味する。生物学的に活性なフラグメントは、好ましくは、ＩＴＩＭドメイン、場合によってはＳＬＡＭドメイン、これら保存ドメインの両方を含む、細胞内ドメインなどの部分を含む。また、ＳＩＧＬＥＣ−６の生物学的に活性なフラグメントは、細胞外ドメインのすべてまたは１つを含むこともでき、膜貫通ドメインを含むこともできる。
方法、プロトコル、細胞株、ベクター、および試薬は多様であるから、本発明は、本明細書に記載の特定のものに限定されるものではない。さらに、本明細書で用いられている専門用語は特定の実施形態を記述するためのものにすぎず、本発明の範囲を限定しようとするものではない。本明細書および添付した請求の範囲において、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の明確な記載がない限り複数形を含み、例えば、「１つの宿主細胞」というのは、複数の宿主細胞を含むものである。
本明細書中に用いられている技術用語および科学用語ならびにいかなる頭字語も、別段の記載がない限り、本発明の分野における当業者によって普通に理解される意味と同一の意味をもつ。本明細書に記載された方法および材料と類似または同等のものを、本発明を実施する際に使用することができるが、その方法、装置、および材料は本明細書中に記載されている。
本明細書に記載されたすべての特許および刊行物は、そこで報告されているタンパク質、酵素、ベクター、宿主細胞および方法であって、本発明で利用できるものを説明および開示するため、法によって許される限度まで参考として本明細書に援用される。しかし、本明細書の如何なる記載も、本発明が、先行発明であるとして、そのような開示内容に先行できないと認めているものと解さるべきではない
本発明は、以下の本発明の詳細な説明、および本明細書に含まれる実施例を参照することによってより容易に理解することができる。ＳＩＧＬＥＣ−６は他の細胞型と比べて、ヒトの初代肥満細胞において示差的に発現されることが発見されており、また、ＳＩＧＬＥＣ−６は循環血中単球（ＣＢＭＣ）においても発現された。したがって、ＳＩＧＬＥＣ−６は、炎症性およびアレルギー性反応に関して、気道、および／または周辺組織または結合組織において肥満細胞の活性を刺激するのに重要な役目を果たしている可能性がある。
このように、ＳＩＧＬＥＣ−６は、肥満細胞介在疾患、例えば、アレルギー性および非アレルギー性喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシー、アレルギー性胃腸疾患、アトピー性皮膚炎、関節リウマチ、全身性硬化症、ならびに他のアレルギー性、自己免疫性および炎症性の疾患などを治療するための治療標的として利用することが可能である。このような治療用のＳＩＧＬＥＣ−６のアクチベーター／インヒビターは、抗体、リガンドのペプチド模倣体、低分子、アンチセンス、またはＲＮＡｉであってよい。
（ＳＩＧＬＥＣ−６の同定）
遺伝子マイクロアレイ技術を用いて、肥満細胞（臍帯血ＣＤ３４＋細胞から培養されたもの）、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）、およびＴＨＰ−１（急性単球性白血病；リンパ球）の間でｍＲＮＡ発現量を比較して、まず、ヒト肥満細胞において示差的に発現される遺伝子を同定した。（以下の例を参照。）肥満細胞においてＳＩＧＬＥＣ−６が示差的に発現されることは、いくつかの異なった細胞型およびヒト組織を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲによって確認された。
（アゴニストおよびアンタゴニスト）
本発明は、ＳＩＧＬＥＣ−６の発現または作用を直接的または間接的に活性化または阻害するか、または検出目的で結合するアゴニストおよびアンタゴニストを提供する。アゴニストおよびアンタゴニストの種類は、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、ヌクレオチド、有機分子、生体分子、ペプチド模倣体、薬理学的作用物質およびそれらの代謝産物、ならびに、転写および翻訳の調節配列などを含むが、これらに限定されるものではない。
一実施形態において、アゴニストは、配列番号２の細胞外ドメインと効率的に結合する抗体でもよい。これらの抗体はＳＩＧＬＥＣ−６に結合してＩＴＩＭを活性化し、それによって肥満細胞が活性化するのを阻害し、および／またはＢ細胞を阻害して、Ｂ細胞関連疾患を緩和する。
アゴニストはＳＩＧＬＥＣ−６に特異的に結合し、生物学的な作用および機能に影響を与えて、例えば、サイトカインの産生を活性化または阻害する抗体を含むこともできる。アゴニスト抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよく、または、キメラ、ヒト、ヒト化、または脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）したものでもよい。
アゴニスト抗体は、肥満細胞の増殖および／または脱顆粒を特徴とする疾患を予防および治療するために使用することができる。アゴニストは、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症および蕁麻疹などのアレルギー性疾患；移植片拒絶反応および移植片対宿主疾患などの移植関連疾患；水疱性皮膚疾患、多形性紅斑および接触性皮膚炎、乾癬などの自己免疫性または免疫媒介性疾患；関節リウマチ、若年慢性関節炎；炎症性腸疾患（すなわち、潰瘍性大腸炎、クローン病）；全身性紅斑性狼瘡；脊椎関節症；全身性硬化症（強皮症）；特発性炎症性筋障害（皮膚筋炎、多発性筋炎）；シェーグレン症候群；全身性脈管炎；サルコイドーシス；自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症）、自己免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介性血小板減少症）；甲状腺炎（バセドウ病、橋本病、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）；真性糖尿病、免疫媒介性腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）；多発性硬化症、特発性脱髄性多発ニューロパシーすなわちギラン・バレー症候群、および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシーなどの中枢および末梢神経系の脱髄疾患；感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎および他の非肝指向性（ｎｏｎ−ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｃ）ウイルス）、自己免疫性の慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、および硬化性胆管炎などの肝胆汁性疾患；嚢胞性繊維症、グルテン過敏性腸疾患、およびウィップル病などの炎症性および線維性の肺疾患；好酸球性肺炎、特突発性肺線維症および過敏性肺炎などの肺の免疫性疾患などを含むが、これらに限定されない、さまざまな免疫性疾患を治療するために使用される。
本発明の抗体を診断目的で使用して、患者のサンプル、例えば、組織生検または痰サンプルにおけるＳＩＧＬＥＣ−６結合を測定することによって肥満細胞の存在および／または量を検出することもできる。
（ポリペプチド）
別の態様において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２の変異配列、または配列番号２の細胞外ドメインフラグメントを有するＳＩＧＬＥＣ−６の単離ポリペプチドを利用する治療法を提供する。一実施形態において、単離ポリペプチドは、天然リガンドが肥満細胞の表面上でＳＩＧＬＥＣ−６に結合するのを阻止するのに有用である可能性がある。耐性を破綻させるために、このペプチドをいずれかのＴ細胞エピトープ、例えば、破傷風毒素、ジフテリア毒素または百日咳に結合させることができる。
（ポリヌクレオチドをコードする抗体）
本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、例えば、上記に定義されているように、ストリンジェントな、または、低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＳＩＧＬＥＣ−６に特異的に結合する抗体、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、具体的には配列番号２の細胞外ドメインに結合する抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドも含む。
当該分野において周知で、広く利用されている核酸配列決定法によって、ポリヌクレオチドが得られ、該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。抗体のヌクレオチド配列が公知のものなら、該抗体をコードするポリヌクレオチドは、（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９４）に記載されているように）化学合成オリゴヌクレオチドから組み立てることができるが、これは、その抗体をコードする配列の部位を含む重複オリゴヌクレオチドを合成すること、それらのオリゴヌクレオチドをアニーリングし連結すること、および、その後、連結されたオリゴヌクレオチドをＰＣＲによって増幅することを含む。
あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドを、適切な由来源の核酸から作製することができる。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは利用できないが、該抗体分子の配列が公知のものであれば、その免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成するか、適切な由来源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または、本発明の抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞など、その抗体を発現する任意の組織または細胞から作製されたｃＤＮＡライブラリー、または、それらから単離された核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から、配列の３’および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いるＰＣＲ増幅によって、または、例えば、その抗体をコードするｃＤＮＡライブラリー由来のｃＤＮＡクローンを同定するために、特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いるクローニングによって得ることができる。そして、ＰＣＲによって作製された増幅核酸は、当該分野において周知の任意の方法を用いて複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。
一旦抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、その抗体のヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列を操作するための当該分野で周知の方法、例えば、組み換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載された技術を参照。これらは両方とも全体を参照として本明細書に組み込まれる）を用いて操作して、さまざまなアミノ酸配列をもつ抗体を作製すること、例えばアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を作製することができる。
特定の実施形態において、当該分野における周知の方法、例えば、他の重鎖および軽鎖の可変領域の公知のアミノ酸配列と比較して、配列の超可変性領域を決定する方法によって、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列を調べて相補性決定領域（ＣＤＲ）を同定することができる。日常的な組み換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲをフレームワーク領域内、例えば、ヒトフレームワーク領域内に挿入して、上記したように、非ヒト抗体をヒト化することができる。このフレームワーク領域は、天然に存在するものでも、共通フレームワーク領域でもよく、好ましくはヒトフレームワーク領域である（ヒトフレームワーク領域のリストに関しては、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）参照）。好ましくは、このフレームワーク領域とＣＤＲを組み合わせて作製されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記したように、１つ以上のアミノ酸置換をフレームワーク領域内で行うことができ、好ましくは、そのアミノ酸置換によって、抗体の抗原に対する結合が向上する。さらに、このような方法を用いて、鎖間のジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域システイン残基を置換または欠失させて、１つ以上の鎖間ジスルフィド結合を持たない抗体分子を作製することができる。ポリヌクレオチドのその他の改変も本発明および当該分野の範囲に含まれる。
さらに、適切な抗原特異性をもつマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物活性をもつヒト抗体分子由来の遺伝子につなぎ合わせて「キメラ抗体」（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４（１９８５））を作製するために開発された技術を利用することもできる。上記したように、キメラ抗体は、例えば、ヒト化抗体のように、マウスｍＡｂに由来する可変領域、およびヒト免疫グロブリンの定常領域をもつものなど、さまざまな部分がさまざまな動物種に由来している分子である。
あるいは、一本鎖抗体の産生について記述された技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４−５４（１９８９））を、一本鎖抗体を産生するように適合させることも可能である。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントとを連結することによって形成され、一本鎖のポリペプチドが得られる。大腸菌内で機能的Ｆｖ領域を構築するための技術を使用することもできる（Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
（ベクター）
別の態様において、本発明は、本発明の抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体をコードするヌクレオチド配列を含むベクター、および、そのようなベクターを含む宿主細胞を提供する。細菌系において、発現されている抗体分子の利用法に応じて、いくつかの発現ベクターを都合のよいように選択することができる。例えば、タンパク質を大量に製造しようとする場合、抗体分子の薬学的組成物を作製するためには、容易に精製される融合タンパク質産物を大量に発現させるベクターが望ましいかもしれない。このようなベクターには、各抗体コード配列をｌａｃ Ｚコード領域とインフレームでベクターにライゲーションして、融合タンパク質を産生させる、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１（１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ＆ Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））などがあるが、これらに限定されるものではない。また、ｐＧＥＸベクターを用いて、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させることも可能である。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、基質グルタチオンアガロースビーズに吸着および結合させた後、遊離グルタチオンの存在下で溶離させることによって、溶解細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から遊離できるよう、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼによる切断部位が含まれるように設計されている。
昆虫系では、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。このウイルスはスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の細胞内で増殖する。抗体コード配列を、このウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の調節下に配置することができる。
哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルスベースの発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして利用する場合には、目的とする抗体コード配列を、アデノウイルス転写／翻訳調節複合体、例えば、後期プロモーターおよび３つの部分を含むリーダー配列に連結することができる。次に、このキメラ遺伝子を、インビトロまたはインビボでの組み換えによってアデノウイルスのゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１またはＥ３領域）への挿入によって、生存力があり、感染宿主において抗体分子を発現できる組み換えウイルスが得られる。（例えば、Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９（１９８４）参照）。挿入された抗体コード配列を効率的に翻訳するためには、特異的開始シグナルも必要とされよう。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、開始コドンを、所望のコード配列のリーディングフレームと同相になるようにして、全挿入配列が確実に翻訳されるようにしなければならない。これらの外来性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然でも合成でもよく、多様な起源のものであってよい。発現効率は、適切な翻訳エンハンサー因子、転写終結因子などを含ませることによって促進させることが可能である（Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）参照）。
組み換えタンパク質を長期的に高収率で産生させるためには、安定に発現させることが好ましい。例えば、抗体分子を安定して発現する細胞株を操作改造することができる。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現調節因子（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位など）によって調節されるＤＮＡ、および選択マーカーによって宿主細胞を形質転換することもできる。外来ＤＮＡを導入した後、操作された細胞を富化培地中で１〜２日間増殖させてから、選択培地に切り替える。組み換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を与えて、細胞が、その染色体中にプラスミドを安定に組み込み、増殖して増殖巣を形成することを可能にし、次にそれをクローニングして細胞株に拡大することができる。この方法は、抗体分子を発現する細胞株を操作改造するために都合よく使用することができる。
それぞれ、ｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−細胞、またはａｐｒｔ−細胞で使用することができる単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン‐グアニン‐ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））などであるが、これらに限定されない多くの選抜システムを利用することができる。また、抗代謝物質耐性を以下の遺伝子の選択基準として利用することもできる。すなわち、メトトレキサート耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２７（１９８１））；ミコフェノール酸耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））、アミノグリコシドＧ−４１８耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，１９９３，ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５）、およびハイグロマイシン耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））。組み換えＤＮＡ技術の術分野で周知の方法を日常的に適用して、所望の組み換えクローンを選択することができ、そのような方法が、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；およびＣｈａｐｔｅｒｓ １２ ａｎｄ １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載されており、それら全体が参考として本明細書に援用される。
抗体分子の発現量が、ベクターを増幅することによって増加することがある（概説については、Ｂｅｂｂｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）参照）。抗体を発現するベクター系のマーカーを増幅することができる場合には、宿主細胞の培養物中に存在するインヒビターの量が増加すると、マーカー遺伝子コピー数も増加する。増幅領域は抗体遺伝子に結合しているため、抗体の産生量も増加する（Ｃｒｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
宿主細胞は、本発明の２つ発現ベクター、すなわち、重鎖由来のポリペプチドをコードする第１のベクター、および軽鎖由来のポリペプチドをコードする第２のベクターによって同時形質転換することができる。この２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの同等な発現を可能にする同一の選択マーカーを含むことができる。あるいは、重鎖および軽鎖のポリペプチドをコードして、それらを発現することができる単一ベクターを使用することもできる。その場合、軽鎖を重鎖の前に配置して、有毒な遊離重鎖が過剰になることを避けなければならない（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖に対するコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含むことができる。
さらに、自然ではＳＩＧＬＥＣ−６に結合していない適切なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベクターに組み込むこともできる。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）に対するヌクレオチド配列をインフレームでポリペプチド配列に融合させて、抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体が最初からシグナルペプチドを含む融合タンパク質として翻訳されるようにすることも可能である。目的の宿主細胞において機能するシグナルペプチドは、適切なポリペプチドが細胞外に分泌されるのを促進する。このシグナルペプチドは、細胞から分泌されると、ポリペプチドから切断される。
（宿主細胞）
ＳＩＧＬＥＣ−６および抗ＳＩＧＬＥＣ−６ポリペプチドを発現させるのに適した宿主細胞は、原核生物、酵母菌、およびその他の真核細胞などである。本発明における宿主細胞として有用な原核生物は、グラム陰性またはグラム陽性の生物、例えば、大腸菌または桿菌などである。原核細胞宿主において、ポリペプチドは、原核宿主細胞内での組み換えポリペプチドの発現を促進するためにＮ末端メチオニン残基を含むことができる。Ｎ末端Ｍｅｔは、発現された組み換えＳＩＧＬＥＣ−６レセプターポリペプチドから切断することができる。組み換え原核宿主細胞発現ベクターに共通して使用されるプロモーター配列は、βラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系などである。
本発明における宿主細胞として有用な酵母菌は、サッカロミセス属、ピキア属、Ｋ．アクチノミセテス属およびクルイベロミセス属由来のものなどである。酵母ベクターは、２μ酵母プラスミド由来の複製起点配列、自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化配列、転写終結配列、および選択マーカー遺伝子をしばしば含む。酵母ベクターに適したプロモーター配列は、とりわけ、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３，（１９８０））または他の糖分解酵素に対するプロモーターなどである。酵母および酵母形質転換プロトコルに適したその他のプロモーターおよびベクターも当該分野において周知されている。
当該分野で周知の哺乳動物または昆虫の宿主細胞培養系を使用して、組み換えＳＩＧＬＥＣ−６を発現させることも可能であり、例えば、昆虫細胞において異種タンパク質を産生するバキュロウイルス系（Ｌｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８））、または、哺乳動物における産生にはＮＳ０またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用することができる。哺乳動物の宿主細胞発現ベクターに対する転写および翻訳の調節配列はウイルスゲノムから切り出すことが可能である。通常使われるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびヒトサイトメガロウイルスに由来するものである。
さらに、挿入配列の発現を調節するか、所望の特定の態様で遺伝子産物を修飾および加工する宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物をそのように修飾（例えば、グリコシル化）し加工（例えば、切断）することはタンパク質の機能にとって重要である。さまざまな宿主細胞が、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後のプロセッシングおよび修飾のための特徴的で特異的な機構をもっている。適切な細胞株または宿主系を選択して、発現された外来タンパク質の正確な修飾および加工を確保することができる。このために、一次転写産物を適切に加工し、遺伝子産物をグリコシル化およびリン酸化するための細胞機構をもつ真核細胞宿主を使用することができる。このような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ，ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ，ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８などであり、具体的には、例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０、およびＴ４７Ｄなどの乳ガン細胞株、ならびに、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔなどの正常な乳腺細胞株などであるが、これらに限定されない。
（抗体）
本発明は、ＳＩＧＬＥＣ−６に結合する抗体、および、そのような抗体を産生させる方法を提供し、未変性のＳＩＧＬＥＣ−６アゴニスト、アンタゴニスト、または表面結合因子（ｓｕｒｆａｃｅ ｂｉｎｄｅｒ）として機能する抗体を含む。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一価抗体、二重特異性抗体、ヘテロ結合抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体など）、および上記のもののいずれかのエピトープ結合フラグメントなどであるが、これらに限定されない。
一実施形態において、本方法は、抗体を産生させる公知のプロトコルにおいて、単離されたエピトープ担持ＳＩＧＬＥＣ−６ポリペプチド、または、その抗原性フラグメントを、ＳＩＧＬＥＣ−６に結合する抗体を産生させる免疫原として使用することを含む。当該分野において周知の方法は、インビボ免疫化、インビトロ免疫化、およびファージディスプレイ法などであるが、これらに限定されない。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ ｅｔ ａｌ．，前掲；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，前掲、およびＢｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：２３４７−２３５４（１９８５）参照。さらに、ＳＩＧＬＥＣ−６のポリペプチドを使用して、特異的な抗体抗原結合をアッセイする当該分野で周知の免疫アッセイ法によって決定された、配列番号２のポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、または変異体、および／またはエピトープに免疫特異的に結合する抗体を産生することができる。
ヒトｓｃＦｖのライブラリーをパニングして、ＳＩＧＬＥＣ−６に結合するものを選択することも可能である（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３））。特定のクローンの特異性および活性を、公知のアッセイ法を用いて評価することができる（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６４２−６４８（１９９１））。第１のパニング工程の後、ＳＩＧＬＥＣ−６に対する結合が改善された複数の異なる一本鎖抗体をファージ上に提示されて含むファージライブラリーが得られる。これに続くパニング工程によって、より高い結合アフィニティーをもつライブラリーが得られる。ファージミドおよびヘルパーファージを用いて一価ディスプレイを行うことができる。適切なファージは、Ｍ１３、ｆｌおよびｆｄなどの繊維状ファージである。ウイルスコートタンパク質との融合タンパク質ディスプレイも公知のものであり、本発明で使用することができる。
目的とする抗原上の特定のエピトープに結合する抗体（例えば、ＳＩＧＬＥＣ−６に対する本明細書に記載の抗体のいずれの結合をブロックするもの）をスクリーニングするために、通常のクロスブロッキングアッセイ法、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されたものを行うことができる。あるいは、例えば、Ｃｈａｍｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４（１９９５）に記載されているようなエピトープマッピングを行って、抗体が目的とするエピトープに結合するか否かを決定することができる。
この抗体は、本発明に係るヒト抗原結合性抗体であってもよく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ならびに、ＶＬまたはＶＨドメインを含むフラグメントなどを含むが、これらに限定されない。一本鎖抗体などの抗原結合性抗体フラグメントは、可変領域を、単独で、またはヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの全部または一部と合わせて含むことができる。また、可変領域をヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインと任意に組み合わせて含む抗原結合フラグメントも本発明に含まれる。
本発明の抗体は、トリおよび哺乳動物などの動物起源のものでもよい。好ましくは、該抗体は、ヒト、マウス（例えば、マウスおよびラット）、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリの抗体である。本明細書において「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸をもつ抗体などであり、また、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離されたか、下記、および、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，９３９，５９８号に記載されているように、１つ以上のヒト免疫グロブリンについて形質導入され、かつ内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体などである。
本発明の抗体は、単一特異性のもの、二重特異性のもの、三重特異性のもの、または多重特異性がより高いものでもよい。多重特異性抗体は、本発明のポリペプチドのさまざまなエピトープに特異的であるか、本発明のポリペプチド、および、異種エピトープ、例えば、異種ポリペプチドまたは固定支持体材料などに対して特異的であってもよい。例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９３／１７７１５、ＷＯ９２／０８８０２、ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）、米国特許第４，４７４，８９３号、第４，７１４，６８１号、第４，９２５，６４８号、第５，５７３，９２０号、第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）参照。
本発明の抗体は、それらが認識するか、特異的に結合する、本発明のエピトープ、またはポリペプチドの一部との関係で説明または特定することができる。該エピトープまたはポリペプチド部分は、本明細書に記載されているようにして、例えば、Ｎ末端側およびＣ末端側の位置、または連続したアミノ酸残基のサイズによって特定することができる。
本発明の抗体は、交差反応性との関係で説明または特定することもできる。本発明のポリペプチドの他のいかなるアナログ、オルソログ、またはホモログにも結合しない抗体も含まれる。本発明のポリペプチドに対して、（当該分野周知であって、本明細書に記載されている方法を用いて計算すると）少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％満、少なくとも５５％、少なくとも５０％の同一性をもつポリペプチドに結合する抗体も本発明に含まれる。
本発明のポリペプチドに対して、（当該分野周知であって、本明細書に記載されている方法を用いて計算すると）９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満の同一性をもつポリペプチドに結合しない抗体も本発明に含まれる。特定の実施形態において、上記の交差反応性は、いずれかの単一の特異的な抗原性または免疫原性をもつポリペプチド、または本明細書に開示された特異的な抗原性および／または免疫原性をもつポリペプチドを２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上組み合わせたものに関するものである。さらに、（本明細書に記載されているような）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに結合する抗体も本発明に含まれる。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドに対する結合アフィニティーとの関係で説明または特定することもできる。好ましい結合アフィニティーは、解離定数すなわちＫｄで１０−２Ｍから１０−１５Ｍの範囲にあればよい。
本発明の抗体は、ＳＩＧＬＥＣ−６のアゴニスト、アンタゴニスト、または特異的結合因子として機能することができる。例えば、本発明は、ＳＩＧＬＥＣとそのリガンドとの間のレセプター／リガンド相互作用を部分的または完全に破壊する抗体を含む。レセプターの活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本明細書に記載の方法または当該分野周知の他の方法によって測定することができる。例えば、レセプターの活性化は、免疫沈降、次いでウエスタンブロット解析（例えば、前掲記載）による該レセプターまたはその基質のリン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／トレオニン）を検出して測定することができる。さらに、このレセプターを活性化する抗体も本発明に含まれる。これらの抗体は、レセプターゴニストとして機能する、すなわち、リガンドを介するレセプターの活性化の生物活性の全部または一部を増強するか、活性化することができる。これらの抗体は、特異的生物活性を含む、生物活性に対するアゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニストとして特定することができる。上記のアゴニスト抗体は、当該分野で周知の方法を用いてつくることができる。例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１−１９８８（１９９８）；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６７８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１７９４（１９９８）；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１５）３２０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）：２３３−２４１（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：７５５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１１５３−１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１４−２０（１９９６）参照（これらはすべて、全体が参考として本明細書に援用される）。
以下でより詳細に検討するように、本発明の抗体は単独、または、他の化合物または組成物と組み合わせて使用することができる。これらの抗体はさらに、Ｎ末端またはＣ末端において組み換えによって異種ポリペプチドに融合させるか、ポリペプチドまたは他の組成物に化学的に結合（共有結合および非共有結合など）させることができる。例えば、本発明の抗体は、診断用または検出用のアッセイにおいて標識として有用な分子、およびエフェクター分子、例えば、異種ポリペプチド、薬剤、放射性ヌクレオチド、または毒素などに組み換えによって融合または結合することができる。例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９２／０８４９５、ＷＯ９１／１４４３８、ＷＯ８９／１２６２４、米国特許第５，３１４，９９５号、およびＥＰ３９６，３８７参照。
本発明の抗体は、例えば、任意のタイプの分子を抗体に共有結合させて、該抗体が抗イディオタイプ反応を生じるのを共有的結合によって妨げられないようにすることによって修飾された誘導体を含む。例えばであって、限定するものではないが、抗体の誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護遮断基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐｓ）、タンパク質分解切断、細胞リガンド、またはアルブミンなど別のタンパク質との連結などによって修飾されている抗体を含む。多数の化学的修飾の任意のものを、特異的な化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などであるが、これらに限定されない公知の技術によって行うことができる。さらに、誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含むこともできる。
（ＳＩＧＬＥＣ−６に対する抗体を作製する方法）
本発明の抗体は任意の公知の方法で作ることができる。典型的には、ＳＩＧＬＥＣ−６のポリペプチドフラグメントまたはタンパク質を、ウサギ、マウス、ネズミなどであるが、これらに限定されないさまざまな宿主動物に投与して、ＳＩＧＬＥＣ−６に対して特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導することができる。ＳＩＧＬＥＣ−６ポリペプチドの投与は、免疫剤、および、所望であればアジュバントの１回以上の注射を必要とするかもしれない。宿主種に応じて、さまざまなアジュバントを使用して、免疫反応を増強することができ、フロイント（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機質ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および、ＢＣＧ（カルメットゲラン菌）およびコリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）など有用な可能性があるヒトアジュバントなどがあるが、これらに限定されない。このようなアジュバントも当該分野において周知のものである。本発明の目的のため、「免疫剤」は、本発明のポリペプチドであって、異種ポリペプチドとの融合体、およびその他本明細書に記載の形態のポリペプチドのほかに、本発明のポリペプチドのフラグメント、変異体、および／または誘導体であると定義することができる。
典型的には、免疫剤および／またはアジュバントは、複数回の皮下注射または腹腔内注射によって哺乳動物に注入されるが、筋肉内および／またはＩＶ（静脈内）経由で投与してもよい。免疫剤は、ＳＩＧＬＥＣ−６のポリペプチド、またはその融合タンパク質もしくは変異体を含む。ポリペプチドの性質（すなわち、パーセント疎水性、パーセント親水性、安定性、正味電荷、等電点など）に応じて、免疫される哺乳動物内で免疫原性があることが知られているタンパク質に免疫剤を結合させることが有用であるかもしれない。このような結合は、活性化学官能基を本発明のポリペプチド、および免疫原性タンパク質の両方に対して誘導体化して共有結合を形成させることによる化学結合法、または、融合タンパク質に基づく方法、またはその他当業者周知の方法によるものなどである。このような免疫原性タンパク質の例は、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、および大豆トリプシンインヒビターなどであるが、これらに限定されない。宿主種に応じて、フロイント（完全および不完全）アジュバント、例えば、水酸化アルミニウムなどの無機質ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および、ＢＣＧ（カルメットゲラン菌）およびコリネバクテリウム・パルブムなど有用な可能性があるヒトアジュバントなどがあるが、これらに限定されない。使用可能なアジュバントのさらなる例は、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノマイコレート）などである。
動物を全細胞を用いて免疫化することができる。一般的に、ヒト起源の細胞が所望であれば、抹消血リンパ球（「ＰＢＬ」）を使用するか、または、非ヒト哺乳動物源が所望であれば、脾臓細胞またはリンパ節細胞を使用する。また、宿主動物を、所望の免疫原性タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを用いて免疫することができる。免疫化プロトコルは、過度の実験なしに当業者が選択することができる。
本発明の抗体はモノクローナル抗体を含むことができる。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）および米国特許第４，３７６，１１０号、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２．ｓｕｐ．ｎｄ ｅｄ．（１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（Ｅｌｓｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８１））に記載された方法、または当業者に公知の他の方法を用いて調製することができる。モノクローナル抗体を産生するために使用することができる方法の別例は、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２；Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０）、およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）などであるが、これらに限定されない。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびこれらの任意のサブクラスを含む任意の免疫グロブリンクラスのものであろう。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロおよびインビボで培養することができる。高力価のｍＡｂをインビボで産生すると、現在好ましい産生法となる。
ハイブリドーマ法において、マウス、ヒト化マウス、ヒト免疫系をもつマウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を、一般的には免疫剤で免疫して、この免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するか、産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫することができる。
次に、リンパ球を、適切な融合剤、例えば、ポリエチレングリコールなどを用いて不死化細胞株と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６），ｐｐ．５９−１０３）。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、具体的には、齧歯動物、ウシ、およびヒトに由来するミエローマ細胞である。通常、ラットまたはマウスのミエローマ細胞株が利用される。ハイブリドーマ細胞は、未融合の不死化細胞の増殖および生存を阻害する１種以上の物質を好ましくは含む適切な培養培地の中で培養する。例えば、親細胞がヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠失している場合、ハイブリドーマ用の培地は、一般的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、これらの物質がＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻止する。
好適な不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体発現細胞によって抗体が安定して高レベルで発現するのを助け、ＨＡＴ培地などの培地に対し感受性である。より好適な不死化細胞株はマウスミエローマ細胞株であり、例えば、ｔｈｅ Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．およびｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．などから入手可能である。本明細書全体から推論されるように、ヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生についても記述されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８７）ｐｐ．５１−６３）。
次に、ハイブリドーマを培養する培地をアッセイして、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在について調べることができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈殿、またはインビトロ結合アッセイ、例えば、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定する。このような技術は当該分野において周知のものであり、当該分野の技術の範囲内のものである。モノクローナル抗体の結合アフィニティーは、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ ａｎｄ Ｐｏｌｌａｒｔ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード解析法によって測定することができる。
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法によって増殖することができる（Ｇｏｄｉｎｇ、前掲）。この目的に適した培養培地は、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０などである。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、哺乳動物において腹水としてインビボで増殖することも可能である。
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体を、通常の免疫グロブリン精製法、例えば、プロテインＡセファロース、ハイドロオキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動クロマトグラフィー、透析法、またはアフィニティークロマトグラフィーなどによって、培養培地または腹水から単離または精製することができる。
当業者は、モノクローナル抗体を産生するために多様な方法が当該分野には存在するため、本発明を、ハイブリドーマそれらを産生するだけに限定するものではない。例えば、モノクローナル抗体は、組み換えＤＮＡ法、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されたものなどにより作製することができる。これに関連して、「モノクローナル抗体」という用語は、真核生物、ファージ、または原核生物の単一クローンに由来する抗体を意味する。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖、またはヒト、ヒト化、または他の由来源の鎖に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブ使用して）容易に単離し、配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。ＤＮＡを、単離したところで発現ベクターに入れてから、例えば、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または、形質転換されなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないミエローマ細胞などの宿主細胞に形質転換して、組み換え宿主細胞の中でモノクローナル抗体を合成させることができる。ＤＮＡは、例えば、ヒトの重鎖および軽鎖の不変ドメインを、相同なマウス配列に置換する（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ，上記）か、または、免疫グロブリンをコードする配列に非免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列の全部または一部を共有結合することによって修飾することも可能である。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の不変領域と置換するか、本発明の抗体の抗原結合部位の可変領域と置換して、キメラ二価抗体を作製することができる。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体を調製する方法は当該分野において周知のものである。例えば、一つの方法は、免疫グロブリンの軽鎖および修飾重鎖を組み換え発現させることを含む。この重鎖は、通常、Ｆｃ領域の任意の位置で切り詰めて、重鎖が架橋できないようにする。あるいは、関係するシステイン残基を別のアミノ酸で置換するか、欠失させて架橋できないようにする。
インビトロでの方法も、一価抗体を調製するのに適している。抗体を分解して、そのフラグメント、具体的にはＦａｂフラグメントを産生することは、当該分野で知られている日常的な技術を用いて行うことができる。ハイブリドーマ技術、組み換え技術、およびファージディスプレイ技術、またはこれらを組み合わせて用いるなど、当該分野において公知のさまざまな方法を用いて、モノクローナル抗体を調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で周知の技術や、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）（これらの参考文献は、全体が参考として本明細書に援用される）に教示されている技術を含むハイブリドーマ技術を用いて製造することができる。本明細書において「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術により産生される抗体に限定されるものではない。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核生物、原核生物、またはファージのクローンなど、単一のクローンに由来する抗体を意味するものであって、それを産生する方法を意味するものではない。
ハイブリドーマ技術を用いて、特異抗体を産生してスクリーニングする方法は、日常的なものであって、当該分野において周知されており、本明細書中の実施例において詳細に検討されている。非限定的な例において、本発明のポリペプチド、または、このペプチドを発現する細胞によってマウスを免疫することができる。例えば、抗原に対して特異的な抗体がマウス血清中に検出されるなど、免疫反応が検出されたところで、マウス脾臓を採取して、脾細胞を単離する。そして、この脾細胞を、周知技術によって、任意の適切なミエローマ細胞、例えば、ＡＴＣＣから入手可能なＳＰ２０細胞株由来の細胞に融合させる。ハイブリドーマを選択して、限界希釈法によってクローニングする。次に、ハイブリドーマクローンを当該分野周知の方法によってアッセイして、本発明のポリペプチドに結合する能力がある抗体を分泌する細胞を調べる。腹水液は、一般に大量の抗体を含むが、陽性のハイブリドーマクローンでマウスを免疫して作製することができる。
別の実施形態において、本発明の抗体は、当該分野周知のさまざまなファージディスプレイ法を用いても作製することができる。ファージディスプレイ法では、機能的な抗体ドメインが、これらをコードするポリペプチド配列をもつファージ粒子の表面上に提示される。特定の実施形態において、このようなファージを利用して、（例えば、ヒトまたはマウスの）レパートリー、またはコンビナトリアル抗体ライブラリーから発現される抗原結合ドメインを提示することができる。目的とする抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージを、抗原によって、例えば、標識抗原、または固体表面または固体ビーズに結合または捕捉された抗原を用いて選択または同定することができる。これらの方法で使用されるファージは、一般的には、ファージ遺伝子ＩＩＩまたはファージ遺伝子ＶＩＩＩに組換えによって融合されたＦａｂ抗体ドメイン、Ｆｖ抗体ドメイン、またはジスルフィドによって安定化されたＦｖ抗体ドメインをもつファージから発現された、ｆｄおよびＭ１３などの繊維状ファージの結合ドメインである。本発明の抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ法の例は、Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８７ ９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公報ＷＯ９０／０２８０９，ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；および米国特許第５，６９８，４２６号；第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５８０，７１７号；第５，４２７，９０８号；第５，７５０，７５３号；第５，８２１，０４７号；第５，５７１，６９８号；第５，４２７，９０８号；第５，５１６，６３７号；第５，７８０，２２５号；第５，６５８，７２７号；第５，７３３，７４３号および第５，９６９，１０８号に記載されたものなどであり、これらはそれぞれ全体が参考として本明細書に援用される。
上記の参考文献に記載されているように、ファージを選択した後、このファージの抗体コード領域を単離および使用して、ヒト抗体などの全抗体、または他の所望の抗原結合フラグメントを作製することができ、いずれかの所望の宿主、例えば、以下で詳細に記載されているような、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌、および細菌などで発現させることができる。例えば、組換えによってＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製する技術を、当該分野周知の方法、例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，ＡＪＲＩ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）（これらの参考文献は全体が参考として本明細書に援用される）に開示されたものを用いて利用することも可能である。一本鎖Ｆｖおよび抗体を作製するために使うことができる技術の例は、米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９０：：７９９５−７９９９（１９９３）；およびＳｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載されたものなどである。
ヒトにおける抗体のインビボでの使用、およびインビトロ検出アッセイなど、いくつかの用途にとっては、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体を使うことが好ましい。キメラ抗体は、抗体のさまざまな部分がさまざまな動物種に由来する分子で、例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域、およびヒト免疫グロブリンの定常領域とを有する抗体などである。キメラ抗体を作製する方法は当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５号；第４，８１６，５６７号；および第４，８１６，３９７号参照。これらは全体が参考として本明細書に援用される。ヒト化抗体は、非ヒト生物種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）、およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域をもつ所望の抗原に結合する非ヒト生物種抗体に由来する抗体分子である。しばしば、ヒトのフレームワーク領域内にあるフレームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体の対応残基で置換されて、抗原結合を変化、好ましく向上させる。これらのフレームワーク置換は、当該分野において周知の方法によって同定することができる、例えば、抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を同定するためにＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用をモデリングし、かつ、特定の位置にある異常なフレームワーク残基を同定するために配列比較することによって同定することができる。（例えば、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）参照。これらは全体が参考として本明細書に援用される。）。抗体は、当該分野において公知のさまざまな技術、例えば、ＣＤＲ移植法（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公報ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号および第５，５８５，０８９号）、ベニアリング法（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェシング法（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｎｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９１：９６９−９７３（１９９４））、および鎖シャフリング法（米国特許第５，５６５，３３２号）を用いてヒト化することができる。一般的に、ヒト化抗体は、ヒト以外の由来源から導入された１つ以上のアミノ酸残基をもつ。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「インポート」残基と呼ばれることが多く、典型的には「インポート」可変ドメインから取られる。ヒト化は、本質的には、Ｗｉｎｔｅｒらの方法（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って、齧歯動物のＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応配列を置換することによって行うことができる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、１つよりも少ない完全なヒト可変領域が、非ヒト生物種由来の対応配列によって実質的に置換されているキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基、および、いくつかの可能なＦＲ残基が、齧歯動物抗体の類似部位で置換されるヒト抗体である。
一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含むが、この可変ドメイン内では、ＣＤＲ領域の全部または実質的に全部が、非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応しており、また、ＦＲ領域の全部または実質的に全部がヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のそれらに対応している。ヒト化抗体は、最適には、少なくとも免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の一部も含むであろう（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
本発明の好適な抗体の可変領域の核酸配列（配列番号７および配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号８および配列番号１０）を図６Ａおよび６Ｂに示す。配列番号７および配列番号８は、それぞれ、軽鎖可変領域の核酸およびアミノ酸であって、配列番号９および配列番号１０は、それぞれ重鎖可変領域の核酸およびアミノ酸であり、これらの配列中のＣＤＲすなわち相補性決定領域（超可変領域）が下線で示されている。
本発明のさらなる好適な抗体は、図６Ａおよび６Ｂに示された軽鎖または重鎖の配列の一方または両方に対して実質的な配列同一性をもつはずである。より具体的には、好適な抗体は、配列番号８および／または配列番号１０に対して少なくとも約７０パーセントの相同性（配列同一性）、より好ましくは配列番号８および／または配列番号１０に対して少なくとも約８０パーセント以上の相同性、さらにより好ましくは配列番号８および／または配列番号１０に対して少なくとも約８５、９０、または９５パーセント以上の相同性を有するものを含む。
本発明の好適な抗体は、配列番号８および／または配列番号１０のＣＤＲ領域（図６ｂの下線部）に対して高い配列同一性をもつ。本発明の特に好適な抗体は、Ｍａｂ２３９−９０の軽鎖可変領域の対応ＣＤＲの１つ、２つ、または３つに対して高い配列同一性（少なくとも９０％または９５％の配列同一性）をもつか、これらと同一のものである軽鎖可変領域の１つ、２つ、または３つのＣＤＲをもち、以下のとおりである：１）ＫＡＳＱＮＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号１２）、２）ＡＡＳＮＬＥＳ（配列番号１４）、および３）ＱＱＳＮＥＤＰＷＴ（配列番号１６）。
また、本発明の特に好適な抗体は、Ｍａｂ２３９−９０の重鎖可変領域の対応ＣＤＲの１つ、２つ、または３つに対して高い配列同一性（少なくとも９０％または９５％の配列同一性）をもつか、これらと同一のものである重鎖可変領域の１つ、２つ、または３つのＣＤＲをもち、以下のとおちである：１）ＡＹＴＦＬＴＹＹＭＮ（配列番号１８）、２）ＱＩＦＰＡＳＧＳＴＮＹＮＥＭＦＫＧ（配列番号２０）、および３）ＳＦＧＧＧＦＡＹ（配列番号２２）。
本発明の一般に好適な核酸は、本明細書に開示されているような好的な結合アフィニティーおよびその他の特性を示す、本発明の抗体を発現する。
また、本発明の好適な核酸は、図６Ａに示された軽鎖または重鎖配列の一方または両方に対して実質的な配列同一性をもつ。より具体的には、好適な抗体は、配列番号７および／または配列番号９に対して少なくとも約７０パーセントの相同性（配列同一性）、より好ましくは配列番号７および／または配列番号９に対して少なくとも約８０パーセント以上の相同性、さらに好ましくは配列番号７および／または配列番号９に対して少なくとも約８５、９０または９５パーセント以上の相同性をもつ配列を含む。
本発明の特に好適な核酸配列は、配列番号７および／または配列番号９の（図６Ａで下線を付して示された）ＣＤＲに対して高い配列同一性をもつ。本発明の特に好適な核酸は、抗体の軽鎖可変領域をコードし、ＣＤＲをコードする１つ、２つ、または３つの配列をもち、Ｍａｂ２３９−９０の対応ＣＤＲをコードする、１つ、２つ、または３つの配列に対して高い配列同一性（少なくとも９０％または９５％の配列同一性）をもつか、それらと同一の核酸を含む（図６中下線を付して示された超可変領域であり、以下のものである：１）ａａｇｇｃｃａｇｃｃａａａａｔｇｔｔｇａｔｔａｔｇａｔｇｇｔｇａｃａｇｔｔａｔａｔｇａａｃ（配列番号１１）；２）ｇｃｔｇｃｇｔｃｃａａｔｃｔａｇａａｔｃｔ（配列番号１３）；および３）ｃａｇｃａａａｇｔａａｔｇａｇｇａｔｃｃｇｔｇｇａｃｇ（配列番号１５））。
特に好適な核酸は、抗体の重鎖可変領域もコードし、ＣＤＲをコードする１つ、２つ、または３つの配列であって、Ｍａｂ２３９−９０の対応するＣＤＲをコードする、１つ、２つ、または３つの配列に対して高い配列同一性（少なくとも９０％または９５％の配列同一性）をもつか、これらと同一である配列をもつ（これらのＣＤＲは図６中で下線を付して示されており、以下のものである：１）ｇｃｃｔａｔａｃｃｔｔｃｃｔｃａｃｃｔａｃｔａｃａｔｇａａｃ（配列番号１７）、２）ｃａｇａｔｔｔｔｔｃｃｔｇｃａａｇｔｇｇｔａｇｔａｃｔａａｃｔａｃａａｔｇａｇａｔｇｔｔｃａａｇｇｇｃ（配列番号１９）、および３）ｔｃｔｔｔｃｇｇｇｇｇｇｇｇｇｔｔｔｇｃｔｔａｃ（配列番号２１））。
また、抗体は、１つ以上のアミノ酸が（例えば、保存的アミノ酸で）置換されているか、欠失または付加されている、本明細書に記載のＣＤＲも１つ以上含む。
完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療上の処置にとって特に望ましいものである。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンの配列に由来する抗体ライブラリーを用いる上記のファージディスプレイ法など、当該分野において周知のさまざまな方法によって作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号および第４，７１６，１１１号；ならびにＰＣＴ公報ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、およびＷＯ９１／１０７４１も参照。これらは、それぞれ全体が参考として本明細書に援用される。Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．およびＢｏｅｒｄｅｒ ｅｔ ａｌ．の技術もヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｒｉｓｓ，（１９８５）；およびＢｏｅｒｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５，（１９９１）））。
ヒト抗体は、機能的な内因性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いても作製することができる。例えば、ヒトの重鎖および軽鎖の免疫グロブリン遺伝子複合体を無作為または相同組み換えによってマウス胚性幹細胞に導入することができる。あるいは、ヒトの重鎖および軽鎖の遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域をマウス胚性幹細胞に導入することができる。マウスの重鎖および軽鎖の免疫グロブリン遺伝子を、相同組み換えによってヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入するのとは別々に、または同時に非機能化することができる。具体的には、ＪＨ領域のホモ接合型欠失によって内因性抗体の産生を阻止する。改変された胚性幹細胞を増殖させ、胚盤胞にマイクロインジェクションしてキメラマウスを作製する。そして、このキメラマウスを交配してヒト抗体を発現するホモ接合型の子孫を産ませる。このトランスジェニックマウスを、選択された抗原、例えば、本発明のポリペプチドの全部または一部によって、通常のやり方で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体を、免疫されたトランスジェニックマウスから通常のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウスがもつヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞の分化の過程で再配列し、その後、クラス変換および体細胞変異を受ける。このように、こうした技術を用いて、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を作製することが可能である。ヒト抗体を産生するための技術の概説に関しては、Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）参照。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生する技術、および、そのような抗体を産生するプロトコルの詳細な考察に関しては、例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０５９８８７７号；米国特許第５，４１３，９２３号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，５６９，８２５号；第５，６６１，０１６号；第５，５４５，８０６号；第５，８１４，３１８号；第５，８８５，７９３号；第５，９１６，７７１号；および第５，９３９，５９８号参照。これらは全体が参考として本明細書に援用される。さらに、例えば、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｇｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）、およびＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）などの会社は、上記したものに類似した技術を用いて、選択された抗原に対するヒト抗体を提供する業務を行っている可能性がある。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、その内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているトランスジェニック動物、例えば、マウスに導入して作ることができる。抗原投与すると、ヒト抗体の産生が観察されるが、それは、遺伝子の再配列、構築、および抗体レパートリーの創出など、あらゆる点でヒトで見られるものに非常によく似ている。このようなアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，１０６号、および、以下の科学文献に記載されている。Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚｅｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３：６５−９３（１９９５）。
選択されたエピトープを認識する完全なヒト抗体は、「誘導選択」と呼ばれる技術を用いて作製することができる。この方法では、選択された非ヒト型モノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を用いて、同一のエピトープを認識する完全なヒト抗体の選択を誘導する。（Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８））。
さらに、ＳＩＧＬＥＣ−６に対する抗体を次に利用し、当業者によく知られた技術を用いて、レセプターを「模倣」する抗イディオタイプ抗体を作製することができる。（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ ＆ Ｂｏｎａ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．７（５）：４３７−４４４；（１９８９）およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１））。例えば、ポリペプチドに結合して、ポリペプチドの多量体化、および／またはＳＩＧＬＥＣ−６のリガンドへの結合を競合的に阻害する抗体を用いて、ポリペプチドの多量体化および／または結合ドメインを「模倣」し、その結果、ＳＩＧＬＥＣ−６および／またはそのリガンドに結合して中和する抗イディオタイプを作製することができる。このような中和抗イディオタイプ、または、このような抗イディオタイプのＦａｂフラグメントを治療計画で使用して、ポリペプチドリガンドを中和することができる。例えば、このような抗イディオタイプ抗体を使用して、本発明のポリペプチドを結合、および／または、そのリガンド／レセプターを結合し、それによってその生物活性をブロックすることができる。
本発明の抗体は二重特異性抗体であってよい。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性をもつモノクローナル抗体、好ましくはヒト型またはヒト化された抗体である。本発明において、結合特異性の１つは、本発明のポリペプチドを指向するものであってもよく、もう１つは、他の任意の抗原、好ましくは、細胞表面タンパク質、レセプター、レセプターサブユニット、組織特異抗原、ウイルス由来のタンパク質、ウイルスによってコードされるエンベロープタンパク質、細菌由来のタンパク質、または細菌表面タンパク質などに対するものであってもよい。
二重特異性抗体を作る方法は当該分野において周知されている。従来、２つの重鎖が異なった特異性をもつ場合、二重特異性抗体の組換えによる産生は、２組の免疫グロブリン重鎖／軽鎖の同時発現に基づくものである（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖が無作為に組み合わされているため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種類の異なった抗体分子の混合物を産生する可能性があり、そのうちのただ１つが正しい二重特異性構造をもつ。この正しい分子の精製は、通常、アフィニティークロマトグラフィー工程によって行われる。同様の手順が、１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）をもつ抗体の可変ドメインを、免疫グロブリンの定常配列に融合することができる。この融合は、好ましくは、少なくともヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の一部を含む、免疫グロブリン重鎖の定常ドメインとで行われる。融合体の少なくとも１つに存在する軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）をもつことが好ましい。免疫グロブリン重鎖の融合体、および、所望であれば、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別々の発現ベクターに挿入して、適切な宿主生物に同時形質導入する。二重特異性抗体作製の詳細に関しては、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｉｎ Ｅｎｚｙｍ．，１２１：２１０（１９８６）参照。
ヘテロ結合抗体も本発明によって意図されている。ヘテロ結合抗体は、共有結合で連結した２つの抗体から構成される。このような抗体は、例えば、不要な細胞に対して免疫系細胞を標的するため（米国特許第４，６７６，９８０号）、および、ＨＩＶ感染を治療するために（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２０３７３；およびＥＰ０３０８９）提案されてきた。抗体を、架橋剤を含む方法など、タンパク質合成化学法における公知の方法を用いてインビボで調製することが考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を用いるか、チオエステル結合を形成することによって、イムノトキシンを構築することができる。このための適切な試薬の例は、イミノチオール酸およびメチル−４−メルカプトブチルイミデート（ｍｅｔｈｙｌ−４−ｍｅｒｃａｐｔｏｂｕｔｙｒｉｍｉｄａｔｅ）、ならびに、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されたものなどである。
（抗体を産生する方法）
本発明の抗体は、当該分野において公知の抗体を生成または合成する方法、具体的には、化学合成法または組換え発現技術によって作製することができる。
本発明の抗体、そのフラグメント、その誘導体または類似体（例えば、本発明に係る抗体の重鎖もしくは軽鎖、または本発明に係る一本鎖抗体）の組換え発現は、抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを構築することを含む。抗体分子、または抗体の重鎖もしくは軽鎖、または本発明に係るそれらの一部（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含む）が得られたら、当該分野において周知の技術を用いた組換えＤＮＡ技術によって、抗体分子を産生するベクターを作製することができる。そのため、抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現させて、タンパク質を調製する方法をここで説明する。当業者に周知の方法を用いて、抗体をコードする配列、および適切な転写および翻訳を調節するシグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらに方法は、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換え法などである。このように、本発明は、本発明の抗体分子、または、その重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに機能できるよう結合しているものを含む複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ８６／０５８０７；ＰＣＴ公報ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号参照）を含むことができ、重鎖または軽鎖全体を発現させるために、そのようなベクターに抗体の可変ドメインをクローニングすることができる。
従来の技術によって発現ベクターを宿主細胞に移行させてから、形質転換細胞を従来の方法で培養して、本発明の抗体を産生させる。したがって、本発明は、異種プロモーターに機能できるよう結合した、本発明の抗体、またはその重鎖もしくは軽鎖、または本発明の一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二本鎖抗体を発現させる好適な実施形態において、下記で詳しく述べるように、全免疫グロブリン分子を発現させるため、重鎖および軽鎖をともにコードするベクターを宿主細胞中で同時発現させることができる。
さまざまな宿主−発現ベクター系を利用して、本発明の抗体分子を発現させることができる。そのような宿主−発現系は、目的とするコード配列を産生して、引き続き精製することができる媒体のことであるが、また、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換または形質移入されると、本発明の抗体分子をインサイチュで発現することができる細胞でもある。これらは、抗体をコードする配列を含む、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡの発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌、枯草菌）；抗体をコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母菌（例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ））；抗体をコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；抗体をコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染したか、組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）によって形質転換された植物細胞系；または、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、もしくは哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を含む哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞）などであるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、大腸菌などの細菌細胞、より好ましくは、特に、組換え抗体分子全体を発現させるための真核細胞が、組換え抗体分子を発現させるために用いられる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞が、ヒトサイトメガロウイルスの主要な中早期（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子プロモーター要素などのベクターと併せて、抗体にとって有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（１９９０））。
一旦動物によって本発明の抗体が産生されたか、化学的に合成されたか、または組換え発現されたら、免疫グロブリン分子を精製するために当該分野において知られている任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー、特に、プロテインＡの後で特異的抗原に対するアフィニティーによるクロマトグラフィー、およびサイズ分画カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、分別可溶性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）などによって、またはその他、タンパク質を精製する標準的な技術によって精製することができる。さらに、本発明の抗体、またはそのフラグメントを、本明細書に記載されているか、当該分野において公知の異種ポリペプチド配列に融合させて、精製を容易にすることができる。
本発明は、融合タンパク質を作製するために、本発明のポリペプチド（またはその一部であって、好ましくは、ポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個のアミノ酸）に組換えによって融合したか、化学的に結合した抗体を含む。この融合は、必ずしも直接的なものでなくてもよく、リンカー配列を介して生じたものでもよい。抗体は、本発明のポリペプチド（またはその一部であって、好ましくは、ポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個のアミノ酸）以外の抗原に特異的なものでもよい。例えば、抗体を用いて、本発明のポリペプチドを、特定の細胞表面レセプターに特異的な抗体に融合または結合させて、本発明のポリペプチドを、インビトロまたはインビボで特定の細胞型に向かわせることができる。また、本発明のポリペプチドに融合または結合した抗体は、当該分野において公知の方法を用いたインビトロ免疫アッセイ法および精製法で使用することも可能である。例えば、以下参照：Ｈａｒｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，前掲、およびＰＣＴ公報ＷＯ９３／２１２３２；ＥＰ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１−９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２（１９９１）。これらは、全体が参考として本明細書に援用される。
本発明は、さらに、可変領域以外の抗体ドメインに融合または結合した本発明のポリペプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリペプチドは、抗体のＦｃ領域、またはその一部に融合または結合させることができる。本発明のポリペプチドに融合した抗体部位は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、またはこれらの全ドメインまたは一部を組み合わせたものを含むことができる。これらのポリペプチドを上記抗体部位に融合または結合させて多量体を形成させることもできる。例えば、本発明のポリペプチドに融合したＦｃ部位は、Ｆｃ部位間のジスルフィド結合によって二量体を形成することができる。ポリペプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部位に融合させて、より多い多量体型を作ることもできる。本発明のポリペプチドを抗体部位に融合または結合させる方法は、当該分野において公知である。例えば、以下参照：米国特許第５，３３６，６０３号、第５，６２２，９２９号、第５，３５９，０４６号、第５，３４９，０５３号、第５，４４７，８５１号、第５，１１２，９４６号；ＥＰ３０７，４３４；ＥＰ３６７，１６６；ＰＣＴ公報ＷＯ９６／０４３８８；ＷＯ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１９９５）；およびＶｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１１３３７−１１３４１（１９９２）（上記参考文献は、それら全体が参考として本明細書に援用される）。
上記で検討したように、ポリペプチドのインビボでの半減期を延長させるか、当該分野において公知の方法を用いた免疫アッセイ法で使用するために、配列番号２のポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、または変異体に相当するポリペプチドを上記抗体部位に融合または結合することができる。さらに、配列番号２に相当するポリペプチドを上記抗体部位に融合または結合させて、精製を容易にすることができる。一つの報告された例には、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメイン、および哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域のさまざまなドメインからなるキメラタンパク質が記載されている。（ＥＰ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９９８））。また、（ＩｇＧのせいで）ジスルフィド結合した二量体構造を有する抗体に融合または結合した本発明のポリペプチドは、単量体の分泌タンパク質、またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子に結合して中和するのにもより効率的であるかもしれない。（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。多くの場合、融合タンパク質のＦｃ部分は、治療および診断において有益であるため、例えば、より優れた薬物速度論的特性をもたらす可能性がある。（ＥＰ Ａ ２３２，２６２）。あるいは、融合タンパク質が発現され、検出され、精製された後、Ｆｃ部分を欠失させることが望ましい。例えば、融合タンパク質を免疫用の抗原として使用する場合、Ｆｃ部位は、治療および診断を遅らせるかもしれない。例えば、創薬において、ｈＩＬ−５などのヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイを行うためにＦｃ部位と融合されてきた。（Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｊｏｈａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）参照）。
さらに、本発明の抗体またはフラグメントを、精製を容易にするためのペプチドなどのマーカー配列に融合させることも可能である。好適な態様において、マーカーのアミノ酸配列は、六量体ヒスチジンペプチド、例えば、他に多くが市販されている中でも取り分け、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅａｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ．，９１３１１）で提供されているタグなどである。例えば、Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されているように、ヒスチジンの六量体は、融合タンパク質の簡便な精製法を提供する。この他に精製に有用なペプチドタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに相当する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４））、および「ｆｌａｇ」タグなどであるが、これらに限定されない。
本発明は、診断剤または治療剤に結合した抗体またはそのフラグメントをさらに含む。抗体を治療用に用いて、例えば、所定の治療計画の効果を決定するための臨床試験手続の一部として、腫瘍の発生または進行を観察することが可能である。抗体を検出用物質に結合することによって検出を容易にすることができる。検出用物質の例は、さまざまな酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、陽電子放射型断層撮影法を用いるポジトロン発光金属、および非放射性の常磁性金属イオンなどである。検出用物質は、抗体（またはそのフラグメント）に直接共役または結合させるか、または、中間体（例えば、当該分野において公知のリンカー）を介し、当該分野において公知の技術を用いて間接的に共役または結合させることができる。本発明に係る診断薬として使用するための抗体に結合させることができる金属イオンについては、例えば、米国特許第４，７４１，９００号参照。適切な酵素の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどであり、適切な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチン、およびアビジン／ビオチンなどであり、適切な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオロセイン、フルオロセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオロセイン、ダンシルクロライド、またはフィコエリトリンなどであり、発光物質の例は、ルミノールなどであり、生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどであり、適切な放射性物質の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、または９９Ｔｃなどである。
さらに、抗体、またはそのフラグメントを、サイトトキシンなどの治療成分、例えば、細胞増殖阻害剤または細胞破壊剤など、治療剤、または放射性金属イオン、例えば、２１３Ｂｉなどのα放射体に結合させることができる。サイトトキシンまたは細胞毒性剤は、細胞に有害な薬剤を含む。実例は、パクリタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシン（ａｎｔｈｒａｃｉｎ）ジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−ジヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびに、これらのアナログまたはホモログなどである。治療薬は、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾシン、マイトマイシンＣ、ならびにシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（かつてはダウノマイシン）、およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（かつてはアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアンスラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、およびビンブラスチン）などである。
本発明の結合体は、所定の生体反応を変えるために使用することができ、治療薬または薬剤成分を、古典的な化学治療剤に限定されると解すべきではない。例えば、薬剤成分は、所望の生物活性を処理するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質は、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、またはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス因子、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ Ｉ（国際公報ＷＯ９７／３３８９９参照）、ＡＩＭ ＩＩ（国際公報ＷＯ９７／３４９１１参照）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：１５６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公報ＷＯ９９／２３１０５参照）、血栓剤または血管新生阻害剤、例えば、アンギオスタチンまたはエンドスタチン；または生体反応修飾物質、例えば、リンフォカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、またはその他の成長因子などを含むことができる。
抗体も固体支持体に付着することができ、特に、標的抗原の免疫アッセイまたは精製に役立つ。このような固体支持体は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンなどであるが、これらに限定されない。
このような治療成分を抗体に結合する技術は周知されおり、例えば、Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）； Ｔｈｏｒｐｅ，”Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；”Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５），ａｎｄ Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，”Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）参照。
あるいは、抗体を第２の抗体に結合させて、米国特許第４，６７６，９８０号においてＳａｇａｌによって記載されているような抗体のヘテロ結合体を形成させることができる。この文献は、その全体が参考として本明細書に援用される。
抗体は、それに結合した治療成分があってもなくても、単独、または、細胞傷害性因子および／またはサイトカインとともに、治療薬として投与することができる。
また、本発明は、本発明のポリペプチドに対する抗体を作製することも含む。合成抗体の一例が、Ｒａｄｒｉｚｚａｎｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄｉｃｉｎａ，（Ａｉｒｅｓ），５９（６）：７５３−８，（１９９９）に記載されている。最近、新しい種類の合成抗体が記載されており、分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）と呼ばれている（Ｓｅｍｏｒｅｘ，Ｉｎｃ．）。抗体、ペプチド、および酵素は、しばしば、化学センサーおよび生物センサーにおける分子認識成分として使用されている。しかし、これらは安定性に欠け、シグナル伝達機構が、それらを検出装置として使用するのを制限している。分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）は、生体レセプターの機能を模倣することができるが、安定性が低いという制約がある。このようなポリマーは、高い温度安定性と物理的安定性を保ちつつ、高い感度と選択性を提供する。ＭＩＰは、低分子に結合することができ、天然の抗体の能力と同じか、それよりも高い能力をもって、有機物やタンパク質などの分子を標的とすることができる。これらの「超」ＭＩＰは、それらの標的に対してより高いアフィニティーをもつため、有効な結合のために低い濃度を必要とする。
合成の過程で、標的分子そのもの（ポリペプチド、抗体など）、または非常によく似た構造をもつ物質を「プリント」または「鋳型」として用いて、ＭＩＰをインプリントして、選択された標的の相補的なサイズ、形、電荷、および官能基を持たせる。抗体のための試薬と同じものでＭＩＰを誘導体化することができる。例えば、蛍光性の「超」ＭＩＰをビーズまたはウェル上にコートして、高感度の分離または測定に使用するか、または、タンパク質のハイスループットスクリーニングに使用することができる。
さらに、本発明のポリペプチドに構造に基づくＭＩＰが、本発明のポリペプチドに結合する化合物をスクリーニングするのに有用かもしれない。そのようなＭＩＰは、ポリペプチドの本来の構造を模倣することで、合成「レセプター」の役割を果たすと思われる。実際、合成レセプターの役割を果たすことができることは、エストロゲンレセプターについて既に明らかにされている（Ｙｅ，Ｌ．，Ｙｕ，Ｙ．，Ｍｏｓｂａｃｈ，Ｋ，Ａｎａｌｙｓｔ．，１２６（６）：７６０−５，（２００１）；Ｄｉｃｋｅｒｔ，Ｆ，Ｌ．，Ｈａｙｄｅｎ，Ｏ．，Ｈａｌｉｋｉａｓ，Ｋ，Ｐ，Ａｎａｌｙｓｔ．，１２６（ｂ）：７６６−７１，（２００１））。合成レセプターも、その全体を模倣される（例えば、完全なタンパク質として）か、そのタンパク質に対応する一連の短いペプチドとして模倣されることが可能である（Ｒａｃｈｋｏｖ，Ａ．，Ｍｉｎｏｕｒａ，Ｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ａｃｔａ．，１５４４（１−２）：２５５−６６，（２００１））。このような合成レセプターＭＩＰを、本明細書別項に記載のいずれか１つ以上のスクリーニング法において利用することが可能である。
また、ＭＩＰは、その模倣された分子の存在を「感知」するのに役立つことが分かっている（Ｃｈｅｎｇ，Ｚ．，Ｗａｎｇ，Ｅ．，Ｙａｎｇ，Ｘ，Ｂｉｏｓｅｎｓ，Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，１６（３）：１７９−８５，（２００１）；Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ａ，Ｌ．，Ｙｉｎ，Ｒ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｊ．Ｌ，Ａｎａｌｙｓｔ．，１２６（６）：７９８−８０２，（２００１）；Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ａ，Ｌ．，Ｙｉｎ，Ｒ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｊ．Ｌ，Ａｎａｌｙｓｔ．，１２６（６）：７９８−８０２， （２００１））。例えば、本発明のポリペプチドを用いて設計されたＭＩＰを、サンプル中の該ポリペプチドの量を同定し、可能なら定量するために設計されたアッセイ法において使用することができる。このようなＭＩＰは、本明細書に記載されたアッセイ法、またはキット（例えば、ＥＬＩＳＡなど）に記載された構成成分の代わりとして使用することができる。
いくつかの方法を用いて、特異的なレセプター、リガンド、ポリペプチド、ペプチド、有機分子などに対するＭＩＰを作製することができる。いくつかの好適な方法が、Ｅｓｔｅｂａｎ ｅｔ ａｌ ｉｎ Ｊ．Ａｎａｌ，Ｃｈｅｍ．，３７０（７）：７９５−８０２，（２００１）に記載されている。そして、本文献は、本明細書で引用されている参考文献に加えて、その全体が参考として本明細書に援用される。さらに別の方法が当該分野において知られており、本明細書に含まれる。例えば、Ｈａｒｔ，Ｂ，Ｒ．，Ｓｈｅａ，Ｋ，Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ，Ｓｏｃ．，１２３（９）：２０７２−３，（２００１）；ａｎｄ Ｑｕａｇｌｉａ，Ｍ．，Ｃｈｅｎｏｎ，Ｋ．，Ｈａｌｌ，Ａ，Ｊ．，Ｄｅ，Ｌｏｒｅｎｚｉ，Ｅ．，Ｓｅｌｌｅｒｇｒｅｎ，Ｂ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ，Ｓｏｃ．，１２３（１０）：２１４６−５４，（２００１）であり、これらは全体が参考として本明細書に援用される。
（アゴニストのスクリーニング）
別の態様において、本発明は、ＳＩＧＬＥＣ−６のアゴニストを同定するためのスクリーニング法を提供する。このスクリーニング法は、ＳＩＧＬＥＣ−６を、ＳＩＧＬＥＣ−６のアゴニストの可能性があるものに曝露すること、および、この潜在的アゴニストがＩＴＩＭを活性化し、それによってサイトカインまたはヒスタミンが肥満細胞から放出されるのを阻害するか否かを決定することを含む。（実施例１１参照）。この潜在的アゴニストがＳＩＧＬＥＣ−６に結合すれば、この潜在的アゴニストは、患者にインビボ投与されたとき、アゴニストとして実際に機能すると強く推定される。この方法を用いて同定されたＳＩＧＬＥＣ−６アゴニストは、肥満細胞をこのアゴニストに曝露し、サイトカインまたはヒスタミンの放出を、このアゴニスト非存在下で活性化させた細胞と比較して測定することによって、アゴニストとしての特徴を調べることができる。アゴニストは、ＩＴＩＭを活性化することによって、脱顆粒および／またはヒスタミン放出を阻止する。別のスクリーニング法は、細胞を、ＳＩＧＬＥＣ−６を含むレセプター遺伝子構築物で形質転換することを含む。アゴニストの可能性があるものは、抗体などの有機分子またはポリペプチドであろう。
本明細書に記載のＳＩＧＬＥＣ−６の調節因子を検出するためには、ハイスループットスクリーニング法が考えられる。このハイスループットスクリーニング法は、一般的には、多数の潜在的な治療用化合物（例えば、リガンドまたは調節因子化合物）を含むコンビナトリアル化学物質またはペプチドのライブラリーを提供することを含む。そして、このようなコンビナトリアル化学物質ライブラリーまたはリガンドライブラリーを１つ以上のアッセイ法でスクリーニングして、所望の特徴的活性を示すライブラリー構成分子（例えば、特定の化学物質種またはサブクラス分子）を同定する。このようにして同定された化合物は、通常のリード化合物として役に立つか、それ自体で潜在的なまたは実際の治療薬として使用することができる。
コンビナトリアル化学物質ライブラリーは、いくつかの化学的構成単位（すなわち、アミノ酸などの試薬）を組み合わせることによって、化学合成法または生物学的合成法により生成される多様な化合物の集合である。一例としては、直鎖型コンビナトリアルライブラリー、例えば、ポリペプチドライブラリーまたはペプチドライブラリーは、所定の化合物長（すなわち、ポリペプチドまたはペプチド化合物のアミノ酸数）に対して考えられうるすべての方法で化学的構成単位を組み合わせることによって作り出すことができる。化学的構成単位をこのようにコンビナトリアル混合することによって、何百万という化合物を合成することができる。
コンビナトリアル化学物質ライブラリーの調製およびスクリーニングについては、当業者に周知されている。コンビナトリアルライブラリーは、ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号；Ｆｕｒｋａ，１９９１，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，３７：４８７−４９３； ａｎｄ Ｈｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８４−８８）などであるが、限定はない。化学的に多様なライブラリーを作製する別の化学法を使用することも可能である。化学物質多様ライブラリー化学の非限定的な例は、ペプチド（ＰＣＴ公報番号：ＷＯ９１／０１９７３５）、コードされたペプチド（ＰＣＴ公報番号：ＷＯ９３／２０２４２）、ランダム生体オリゴマー（ＰＣＴ公報番号：ＷＯ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドなどのディバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）（Ｈｏｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ，９０：６９０９−６９１３）、ビニル性ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａ ｅｔ ａ１．，１９９２，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：６５６８）、グルコース骨格をもつ非ペプチド性ペプチド模倣物質（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：９２１７−９２１８）、低分子化合物ライブラリーの類似有機化合物合成（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａ１．，１９９４，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．，１１６：２６６１）、オリゴカルバメート（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１：１３０３）、および／またはホスホン酸ペプチジル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５９：６５８）、核酸ライブラリー（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｂｅｒｇｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、すべて前掲）、ペプチド核酸ライブラリー（米国特許第５，５３９，０８３号）、抗体ライブラリー（例えば、Ｖａｕｇｈｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（３）：３０９−３１４）およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７）糖質ライブラリー（例えば、Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７４−１５２０−１５２２）および米国特許第５，５９３，８５３号）、低分子有機分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Ｂａｕｍ Ｃ＆ＥＮ，Ｊａｎ．１８，１９９３，ｐａｇｅ３３；および米国特許第５，２８８，５１４号；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および第５，５１９，１３４号；モルフォリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号など）などである。
コンビナトリアルライブラリーを調製する装置は市販されている（例えば、３５７ ＭＰＳ，３９０ＭＰＳ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ Ｋｙ．；Ｓｙｍｐｈｏｎｙ，Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ， Ｍａｓｓ．；４３３Ａ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａ１ｉｆ．；９０５０ Ｐｌｕｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリーが市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．；Ａｓｉｎｅｘ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ；Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．；ＣｈｅｍＳｔａｒ， Ｌｔｄ．，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ；３Ｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｔｏｎ，Ｐａ．；Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｍｄ．など）。
一実施形態において、本発明は、ハイスループット方式の固相によるインビトロアッセイ法であって、細胞または組織が固相基質に結合している方法を提供する。このようなハイスループットアッセイ法では、最大数百までの異なった調節因子またはリガンドを一日でスクリーニングすることが可能である。具体的には、マイクロタイタープレートの各ウェルを用いて、選択された潜在的な調節因子に対して別々のアッセイを行うことができ、また、濃度または定温放置時間の効果を観察する場合には、５〜１０ウェルずつで、１つの調節因子を調べることができる。したがって、単本位制のマイクロタイタープレートは９６のモジュレータをアッセイすることができる。１５３６ウェルプレートを使用すれば、１個のプレートで約１００から約１５００の異なった化合物を簡単にアッセイすることができる。１日当り数個の異なったプレートをアッセイすることが可能であるから、説明した統合システムを用いて、例えば、約６，０００〜２０，０００種類までの化合物をアッセイスクリーニングすることが可能である。
その別の態様において、本発明は、ＳＩＧＬＥＣ−６ポリペプチドまたはペプチドに結合することができる低分子を検出または同定することを含む、スクリーニングおよび低分子（例えば薬剤）検出のアッセイ法を含む。特に好適なのは、ハイスループットスクリーニング法に適したアッセイ法である。
このような結合ベースの検出、同定、またはスクリーニングのアッセイ法において、機能的アッセイ法は一般的には必要でない。必要なものは、好ましくは、実質的に精製されている標的タンパク質、ならびに化合物（例えば、リガンド、薬剤、低分子）のライブラリーもしくはパネル、またはタンパク質標的への結合をスクリーニングもしくはアッセイすべき生物学的存在だけである。好ましくは、標的タンパク質に結合するほとんどの低分子は、タンパク質上の機能的な領域もしくは部位に選択的に高アフィニティー結合することによって、何らかの態様で活性を調節する。
このようなアッセイ法の一例が、Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．，らの米国特許第６，０２０，１４１号および第６，０３６，９２０号に記載されているような、蛍光による熱変化アッセイ法（３−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，３ＤＰ，Ｅｘｔｏｎ，Ｐａ．）である。また、Ｊ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，２０００，Ｇｅｎ．Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ，２０（８）参照。このアッセイ法によって、発現され、かつ好ましくは、精製されたポリペプチドに結合する低分子（例えば、薬剤、ｓｔリガンドなど）を、タンパク質と薬剤またはリガンドとの複合体の温度によるアンフォールディング曲線の解析による結合アフィニティー測定に基づいて検出することが可能になる。この技術によって決定された薬剤または結合分子は、さらに、所望であれば、本明細書に記載されているような、その分子が標的タンパク質の機能または活性に影響をあたえるか調節するかを決定するための方法によってアッセイすることができる。
ＳＩＧＬＥＣ−６ポリペプチドまたはペプチドを精製して生物学的結合活性またはリガンド結合活性を測定するためには、由来源は、標準的なプロテアーゼインヒビター存在下で凍結融解を連続して繰り返す（例えば１回から３回）して調製することができる全細胞溶解物であってもよい。ＳＩＧＬＥＣ−６ポリペプチドは、標準的なタンパク質精製法、例えば、上記の特異的抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、または、これも本明細書に記載されているように、組換えＳＩＧＬＥＣ−６ポリペプチド分子の中に組み込まれたエピトープタグに特異的なリガンドによって、部分的または完全に精製することができる。
本明細書に記載の方法に従って同定され、かつ、本発明に記載のＳＩＧＬＥＣ−６ポリペプチドの生物活性または生理学的機能を調節または制御する化合物が、本発明の好適な実施形態である。ＳＩＧＬＥＣ−６ポリペプチドによってもたらされる症状を治療するための治療および治療法において、このような治療を必要とする個体に、本明細書に記載の方法によって同定された化合物の治療的有効量を投与することによって、このような調節化合物を使用することが意図されている。
さらに、本発明は、本発明のＳＩＧＬＥＣ−６ポリペプチドによってもたらされる疾患、障害、または状態の治療を必要とする個体を治療する方法であって、個体に、本明細書に記載の方法によって同定された、治療上有効量のＳＩＧＬＥＣ−６調節化合物を投与する工程を包含する、方法を提供する。
（抗体の治療的用途）
本発明は、さらに、１つ以上の開示された疾患、障害、または状態を治療するために、本発明の抗体を動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトに投与することを含む抗体による治療法を目的とする。本発明の治療用組成物は、本発明の抗体（本明細書に記載したとおり、そのフラグメント、アナログ、および誘導体を含む）、および本発明の抗体（本明細書に記載した通り、そのフラグメント、アナログ、および誘導体、ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）をコードする核酸などであるが、これらに限定されない。本発明の抗体を用いて、Ｓｉｇｌｅｃ−６または本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾患、障害、または状態であって、本明細書に記載された１つ以上の疾患、障害、または状態などであるが、これらに限定されないものを治療、阻害、または予防することができる。Ｓｉｇｌｅｃ−６、または本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾患、障害、または状態の治療および／または予防とは、これらの疾患、障害、または状態に関連した病徴を軽減すること、Ｓｉｇｌｅｃ−６を発現するＢ細胞の集団を除去すること、または、Ｓｉｇｌｅｃ−６を発現するＢ細胞を枯渇させることであるが、これらに限定されない。本発明の抗体は、当該分野において知られているか、本明細書に記載されている薬学的に許容される組成物に入れて提供することができる。
本発明の抗体を治療に利用する方法を要約すると、Ｓｉｇｌｅｃ−６、または本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを体内で局所または全身に結合させること、または、例えば、補体（ＣＤＣ）もしくはエフェクター細胞（ＡＤＣＣ）によって仲介されながら、抗体の直接的な細胞傷害性によることなどがある。これらのアプローチには、以下でさらに詳しく説明されているものがある。本明細書に記載された教示内容を備えることによって、当業者は、どのようにして本発明の抗体を、過度な実験を行うことなく診断、監視、または治療のために使用できるかが分かるはずである。
本発明の抗体は、別のモノクローナル抗体もしくはキメラ抗体、またはリンフォカインもしくは造血成長因子（例えばＩＬ−２、ＩＬ−３、およびＩＬ−７など）と併用して有利に利用することができ、これらの抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活性を高めるのに役立つ。
本発明の抗体は、単独、または別のタイプの治療法（例えば、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、および抗癌剤）と併用して投与することができる。一般的に、患者の生物種と同じ生物種である生物種に由来する産物、またはその生物種の反応性（抗体の場合）を投与することが好適である。したがって、好適な態様では、治療または予防のためにヒト型またはヒト化された抗体、フラグメント、誘導体、アナログ、または核酸をヒト患者に投与する。
高いアフィニティーおよび／または効能で、インビボで阻害および／または中和する抗体であって、Ｓｉｇｌｅｃ−６または本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、それらのフラグメントもしくは領域に対する抗体を、フラグメントを含むＳｉｇｌｅｃ−６または本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドに関係した疾患のための免疫アッセイ法および治療法を行うために使用することが好ましい。このような抗体、フラグメント、または領域は、好ましくは、フラグメントを含むＳｉｇｌｅｃ−６または本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドに対するアフィニティーを有する。
本発明のポリペプチドに対する抗体は、動物におけるアレルギー反応を阻害するのに有用である。例えば、治療上許容できる用量の本発明の抗体、または本発明の抗体の混合液、またはさまざまな由来源の他の抗体との併用剤を投与することによって、動物は、抗体に対するアレルギー反応を誘発できなくなる。
同様に、ある生物においてアレルギー反応および／または免疫反応を誘発する可能性がある本発明のポリペプチドに対する抗体をコードする遺伝子をクローニングして、その生物を該抗体遺伝子で形質転換して、その生物の中でそれが（例えば、構成的、誘導的になど）発現されるようにすることが想定できよう。それによって、この生物は、そのような免疫／アレルギー反応ポリペプチドの摂取または存在によって生じるアレルギー反応に対して効果的に耐性になろう。さらに、本発明の抗体をこのように使用することは、自己免疫疾患および／または障害を予防および／または軽減するのに特に便利である。というのは、そのような症状は、一般的には、内因性タンパク質に対する抗体がある結果起こるからである。例えば、本発明のポリペプチドが、自己抗原に対する免疫反応の調節に関与する場合には、本発明のポリペプチドに対する抗体をコードするポリヌクレオチド以外に、本明細書に開示されているか、当該分野において公知の任意のプロモーターを含む構築物で、その生物および／または個体を形質転換することによって、その生物の免疫系が、その抗原に対する免疫反応を誘発するのを効果的に阻害することができよう。本発明に係る治療および／または遺伝子治療への応用法の詳細な説明は、本明細書の別項に記載されている。
あるいは、本発明の抗体は、植物に産生させることができ（例えば、本発明のポリペプチドに対する抗体の遺伝子をクローニングし、植物内で抗体を構成的に発現させるのに適した、該遺伝子を含むベクターで植物を形質転換する）、その後、動物がこの植物を摂食し、それによって、その抗体が指向する特異的抗原に対する動物の一時的免疫を付与することができるかもしれない（例えば、米国特許第５，９１４，１２３号および第６，０３４，２９８号参照）。
（抗体ベースの遺伝子治療）
特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含む核酸は、遺伝子治療によって、肥満細胞媒介性の疾患または障害を予防、治療、または阻害するために投与される。遺伝子治療は、発現されているか、発現可能な核酸を被験体に投与することによって行われる治療法を意味する。本発明のこの実施形態では、核酸は、それらがコードする、治療効果をもたらす抗体を生み出す。
別の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含む核酸が、Ｂ細胞媒介性の疾患または障害を予防、治療、または阻害するために投与されるが、そこでは、Ｂ細胞が遺伝子治療によって発現されている。
当該分野において利用可能な任意の遺伝子治療の方法を本発明に従って利用することができる。例示的は方法を以下に説明する。遺伝子治療法の概略については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ ｅｔ ａ１．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ， Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）； Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）； およびＭｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ， ＴＩＢＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（１９９３）参照。当該分野において一般的に知られている利用可能な組換えＤＮＡ技術の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉ１ｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載されている。
本発明によれば、抗体をコードする核酸配列は、抗体またはそのフラグメントまたはキメラタンパク質または重鎖または軽鎖を適切な宿主で発現する発現ベクターの一部である。具体的には、この核酸配列は、抗体コード配列に機能できるように連結しているプロモーターをもち、該プロモーターは誘導的または構成的、あるいは場合によっては組織特異的である。別の特定の実施形態においては、抗体をコードする配列およびその他所望の配列が、ゲノム内の所望の部位で相同的組換えを促進する領域に隣接している核酸分子を用いて、抗体をコードする核酸の染色体内発現をもたらす（Ｋｏ１１ｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９）。特定の実施形態において、発現された抗体分子は一本鎖抗体であり、あるいは、この核酸配列は、抗体の重鎖および軽鎖をともにコードする配列、またはそのフラグメントを含む。
患者への核酸の送達は、直接的、すなわち、患者を核酸または核酸担持ベクターに直接曝露してもよく、間接的、すなわち、まずインビトロで核酸によって細胞を形質転換してから患者に移植してもよい。これら２通りの方法が、それぞれインビボまたはエクスビボの遺伝子治療法として知られている。
特定の実施形態において、核酸配列をインビボで直接投与して、そこで発現させてコードされた産物を産生させる。これは、当該分野において公知の多くの方法のいずれか、例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、それらが細胞内になるよう投与することによって、例えば、欠損したか弱毒化されたレトロウイルスベクターまたはその他のウイルスベクターを用いた感染によって（米国特許第４，９８０，２８６号参照）、または、裸のＤＮＡを直接注入することによって、または、微粒子衝撃法（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）を利用することによって、または、脂質もしくは細胞表面レセプターもしくは形質転換因子で被覆すること、リポソーム、微小粒子、もしくはマイクロカプセルに封入すること、または、それらを、核に進入することが分かっているペプチドに連結して投与することによって、レセプターを介したエンドサイトーシスを受けるリガンドに連結して投与することによって（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．．．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）参照）（このレセプターを特異的に発現する細胞型を標的するために使用することができる）などして行うことができる。別の実施形態において、リガンドが、エンドソームを破壊するための融合性ウイルスペプチドを含む核酸リガンド複合体を形成して、核酸がリソソーム分解されないようにすることができる。さらに別の実施形態において、特異的レセプターを標的することによって、細胞特異的な摂取および発現をさせるために核酸を標的とすることができる（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９２／０６１８０；ＷＯ９２／２２６３５；ＷＯ９２／２０３１６；ＷＯ９３／１４１８８；ＷＯ９３／２０２２１参照）。あるいは、核酸を細胞内に導入し、発現させるために宿主細胞のＤＮＡ内に取り込ませることができる（Ｋｏ１１ｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９））。
特定の実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターを用いる。例えば、レトロウイルスベクターを用いることができる（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３））。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正確なパッケージング、および宿主細胞ＤＮＡに組み込むために必要な構成成分を含む。遺伝子治療で使用される抗体をコードする核酸配列を、１つ以上のベクターにクローニングして、遺伝子を患者に送達しやすくする。レトロウイルスベクターについての詳細は、Ｂｏｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２（１９９４）に記載されており、幹細胞を化学療法に対してより耐性にするために、レトロウイルスベクターを使用して、ｍｄｒｌ遺伝子を造血幹細胞に送達することが記載されている。遺伝子治療においてレトロウイルスベクターを使用することが説明されている他の参考文献は、Ｃｌｏｗｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９９４）；Ｋｉｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３（１９９４）：Ｓａｌｍｏｎｓ ａｎｄ Ｇｒｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９−１４１（１９９３）；およびＧｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４（１９９３）。
アデノウイルスは、遺伝子治療で使用できる別のウイルスベクターである。アデノウイルスは、特に、遺伝子を呼吸上皮に送達するための魅力的な媒体である。アデノウイルスは、呼吸上皮に自然感染して、そこで軽い病気を引き起こす。アデノウイルスによる送達系のその他の標的は、肝臓、中枢神経系、上皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染できるという利点をもつ。Ｋｏｚａｒｓｋｙ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９９−５０３（１９９３）には、アデノウイルスに基づく遺伝子治療についての概説が記載されている。Ｂｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３−１０（１９９４）は、アデノウイルスベクターを使用して、アカゲザルのコキュ上皮に遺伝子を移入したことを明らかにした。遺伝子治療におけるアデノウイルスの用途の他の例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４（１９９３）；ＰＣＴ公報ＷＯ９４／１２６４９；およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３（１９９５）に記載されている。好適な実施形態において、アデノウイルスベクターを使用する。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）も、遺伝子治療で使用することが提唱されている（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号）。
遺伝子治療に対する別の方法は、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム仲介性トランスフェクション、またはウイルス感染などの方法によって、組織培養中の細胞に遺伝子を移入することを含む。通常、この移入法は、選択マーカーを細胞に移入することを含む。そして、細胞を選抜下に置いて、移入遺伝子を摂取して発現する細胞を単離する。次に、これらの細胞を患者に送達する。
この実施形態において、得られた組換え細胞をインビボ投与する前に核酸を細胞に導入する。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体仲介による遺伝子導入、ミクロ細胞仲介による遺伝子導入、スフェロプラスト融合などを含むが、これらに限定されない方法によって行うことができる。外来遺伝子を細胞に導入するための数多くの技術が当該分野において知られており（例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｅｈｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３）；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９９３）；Ｃｌｉｎｅ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２ｍ（１９８５）参照）、受容細胞の必要な発生学的および生理学的な機能が破壊されていなければ、本発明に従って利用することができる。この技術は、核酸の細胞への安定的な移入をもたらして、その細胞によって核酸が発現可能となり、また、好ましくは、その細胞の後代に遺伝して発現可能となるはずである。
得られた組換え細胞は、当該分野において公知のさまざまな方法によって患者に送達することができる。好ましくは、組換え血液細胞（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）を静脈内に投与する。使用するために想定される細胞の量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、当業者が決定することができる。
遺伝子治療の目的で核酸を導入することができる細胞は、任意の所望で利用可能な細胞型を含み、上皮細胞、内皮細胞、角化細胞、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞；さまざまな幹細胞または前駆細胞、特に造血幹細胞または造血前駆細胞、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから得られたものなどであるが、これらに限定されない。
好適な実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は、患者にとって自家性のものである。組換え細胞が遺伝子治療で使用される実施形態では、抗体をコードする核酸を細胞に導入して、それらが、細胞またはその後代細胞によって発現されるようにし、次に、治療効果を求めて組換え細胞をインビボで投与する。特定の実施形態において、幹細胞または前駆細胞を使用する。本発明のこの実施形態に従って、インビトロで単離および維持できる任意の幹細胞および／または前駆細胞を使用できる可能性がある（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９４／０８５９８；Ｓｔｅｍｐｌｅ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５（１９９２）；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ． ２１Ａ：２２９（１９８０）；およびＰｉｔｔｅｌｋｏｗ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．６１：７７１（１９８６）。
特定の実施形態において、遺伝子治療目的で導入される核酸は、この核酸の発現を、適切な転写インデューサーの存否を調節することによって調節できるようにするために、コード領域に機能できるように結合した誘導型プロモーターを含む。
一実施形態において、治療を喘息患者の肺に局在化させて、サイトカインの誘導および放出を介して気道のリモデリングと喘息症状を引き起こしている肥満細胞を減少または除去する。嚢胞性線維症患者の遺伝子治療に使用される現在の技術を本発明に応用することも可能であろう。
（抗体による診断および画像化）
ＳＩＧＬＥＣ−６に特異的に結合する標識された抗体、およびその誘導体およびアナログを、治療目的で、Ｓｉｇｌｅｃ−６を発現するＢ細胞に関連するか、および／またはＳＩＧＬＥＣ−６の異常な発現および／または活性に関連する病気、疾患、および／または症状を検出、診断または監視するために使用することができる。この方法は、（ａ）１つ以上の本発明の抗体を用いて、個体の細胞または体液の中でのＳＩＧＬＥＣ−６の発現をアッセイすること、および（ｂ）標準的な発現量に対してアッセイされた発現量が増加または減少することが、Ｂ細胞関連性の病気または症状、および／または異常発現の指標となるよう、標準的な発現量とその発現量を比較することを含む。
本発明は、疾患を診断する診断アッセイ法であって、（ａ）１つ以上の本発明の抗体を用いて、個体の細胞または体液の中でのＳＩＧＬＥＣ−６の発現をアッセイすること、および（ｂ）標準的な発現量に対してアッセイされた発現量が増加または減少することが、特定の疾患の指標となるよう、標準的な発現量とその発現量を比較することを含むアッセイ法を提供する。
本発明の抗体を用い、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を用いて、生物学的サンプルにおけるタンパク質量をアッセイすることができる（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）参照）。この他に抗体に基づく方法で発現を検出するのに有用なものは、免疫アッセイ法、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）および放射性免疫測定法（ＲＩＡ）などである。適切な抗体アッセイ用標識は、当該分野において公知であり、グルコースオキシダーゼなどの酵素標識；ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ）などの放射性同位元素；ルミノールなどの発光標識；ならびにフルオロセインおよびローダミンなどの蛍光標識、ならびにビオチンなどである。
本発明の一つの態様は、ヒトなどの動物における肥満細胞媒介性の疾患または障害のインビボでの検出および診断を含む。一実施形態において、診断は、ａ）被験体に、肥満細胞の表面に特異的に結合する有効量の標識抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体を（例えば、非経口、皮下、または腹腔内）投与すること；ｂ）投与した後、標識抗体を、被験体の体内にある、ポリペプチドが発現される部位に選択的に集中させるため（かつ、未結合の標識分子がバックグラウンド量まで除去されるよう）にしばらくの間待つこと；ｃ）バックグウランド量を測定すること；およびｄ）標識分子の検出量がバックグウランド量よりも多いことが、被験体が、目的とするペプチドの異常発現に関連した特定の疾患または障害を患っていることが示されるよう、被験体の体内で標識分子を検出することを含む。検出された標識分子の量を、予め具体的な系について決められた標準値と比較することなど、さまざまな方法によってバックグウランド量を決定することができる。
本発明の別の態様は、ヒトなどの動物におけるＢ細胞媒介性の疾患または障害のインビボでの検出および診断を含む。一実施形態において、診断は、ａ）被験体に、肥満細胞の表面に特異的に結合する有効量の標識抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体を（例えば、非経口、皮下、または腹腔内）投与すること；ｂ）投与した後、標識抗体を、被験体の体内にある、ポリペプチドが発現される部位に選択的に集中させるため（かつ、未結合の標識分子がバックグラウンド量まで除去されるよう）にしばらくの間待つこと；ｃ）バックグウランド量を測定すること；およびｄ）標識分子の検出量がバックグウランド量よりも多いことが、被験体が、ＳＩＧＬＥＣ−６を発現するＢ細胞に関連した特定の疾患または障害を患っていることが示されるよう、被験体の体内で標識分子を検出することを含む。検出された標識分子の量を、予め具体的な系について決められた標準値と比較することなど、さまざまな方法によってバックグウランド量を決定することができる。
当該分野においては、被験体の大きさ、および使用される画像化システムによって、診断用画像を作成するのに必要な画像成分の量が決定されると解されよう。放射性同位元素の場合、ヒト被験体にとって、注入される放射能の量は、通常、約５から２０ミリキューリーの９９ｍＴｃである。そして、標識された抗体または抗体フラグメントが、特異的タンパク質を含む肥満細胞の位置に選択的に蓄積する。インビボでの画像化については、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，”Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ”（Ｃｈａｐｔｅｒ １３ ｉｎ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌ ａｎｄ Ｂ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ，ｅｄｓ．，Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２）に記載されている。
使用される標識の種類、および投与方法など、いくつかの変数によって、投与した後、標識抗体を、被験体の体内にある、ポリペプチドが発現される部位に選択的に集中させるため、また、未結合の標識分子をバックグラウンド量まで除去するための時間は、６〜４８時間、または６〜２４時間、または６〜１２時間である。別の実施形態において、投与後の時間は５〜２０日間、または５〜１０日間である。
一実施形態では、疾患または障害の監視は、疾患または障害を診断する方法を繰り返すことによって、例えば、最初の診断から１ヶ月後、最初の診断から６ヶ月後、最初の診断から１年後などに行われる。
インビボで走査するための当該分野において公知の方法を用いて、患者の体内で標識抗体の存在を検出することができる。これらの方法は、使用される標識の種類に依存する。当業者は、具体的な標識を検出するのに適した方法を決定することができるはずである。本発明の診断方法に使用できる方法および装置は、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）、全身走査法、例えば、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、超音波診断法などである。
特定の実施形態において、分子を放射性同位元素で標識し、放射線反応性外科機器（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，４４１，０５０号）を用いて患者の体内で検出する。別の実施形態では、抗体を蛍光性化合物で標識し、放射線反応性外科機器を用いて患者の体内で検出する。別の実施形態では、抗体をポジトロン放出金属で標識し、ポジトロン放出断層撮影法を用いて患者の体内で検出する。さらに別の実施形態では、抗体を常磁性標識で標識し、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を用いて患者の体内で検出する。
（病気の素因診断）
別の態様において、本発明は、Ｂ細胞媒介性の病気、および／またはサイトカインの無秩序な発現が原因の病気に対する患者の素因を診断する方法を提供する。本発明は、一定の患者の細胞、組織、または体液の中にＳＩＧＬＥＣ−６レセプターが存在するか、その量が増加していると、一定のＢ細胞媒介性疾患または免疫疾患になりやすいことを示す可能性があるという発見に基づいている。
一実施形態において、この方法は、患者から、肥満細胞を含んでいることを有すると疑われる細胞、組織、または体液のサンプルを集めること、その組織または体液をＳＩＧＬＥＣ−６の調節された発現について解析すること、および、その組織または体液におけるＳＩＧＬＥＣ−６レセプターの発現量に基づいて、一定の免疫疾患に対する患者の素因を予測することを含む。
別の実施形態において、この方法は、患者から、ＳＩＧＬＥＣ−６発現Ｂ細胞を含んでいることを有すると疑われる細胞、組織、または体液のサンプルを集めること、その組織または体液をＳＩＧＬＥＣ−６の調節された発現について解析すること、および、その組織または体液におけるＳＩＧＬＥＣ−６レセプターの発現量に基づいて、一定の免疫疾患に対する患者の素因を予測することを含む。
別の実施形態において、この方法は、患者から、ＳＩＧＬＥＣ−６発現Ｂ細胞を含んでいることが分かっている細胞、組織、または体液のサンプルを集めること、その組織または体液を解析して、組織内のＳＩＧＬＥＣ−６レセプター量を調べること、および、正常な細胞、組織、または体液について確立された規定の、または試験済みの量に対して、その組織または体液におけるＳＩＧＬＥＣ−６レセプターの量が変化したことに基づいて、一定の免疫疾患に対する患者の素因を予測することを含む。規定のＳＩＧＬＥＣ−６量とは、文献に記載の数値に基づいた公知の量でもよく、あるいは、正常な細胞、組織、または体液における量を予め測定して決定することも可能である。具体的には、一定の組織または体液におけるＳＩＧＬＥＣ−６レセプター量を決定すると、特異的かつ早期の、好ましくは、病気を発症する前に、患者の免疫疾患を検出することが可能になる。本発明の方法を用いて診断することができる免疫疾患は、本明細書に記載の免疫疾患を含むが、それらに限定されない。好適な実施形態において、組織または体液は末梢血液、末梢血白血球、肺または皮膚などの生検組織、ならびに滑液および滑膜組織である。
（Ｂ細胞媒介性および／またはＳＩＧＬＥＣ−６媒介性の病気の予防および治療）
別の態様において、本発明は、哺乳動物におけるＳＩＧＬＥＣ−６媒介性疾患を治療する方法を提供する。この方法は、病気を治療する量のＳＩＧＬＥＣ−６調節化合物、例えば、抗ＳＩＧＬＥＣ−６アゴニスト抗体を哺乳動物に投与することを含む。このアゴニスト抗体はＳＩＧＬＥＣ−６レセプターに結合し、サイトカインおよび／または細胞レセプターの発現を制御して、非病気状態の特徴であるサイトカイン量にする。ＳＩＧＬＥＣ−６媒介性疾患は、アレルギー、喘息、自己免疫、またはその他の炎症性疾患、ならびに肥満細胞症などである。
別の態様において、本発明は、哺乳動物におけるＢ細胞媒介性疾患を治療する方法を提供する。この方法は、病気を治療する量のＳＩＧＬＥＣ−６調節化合物、例えば、抗ＳＩＧＬＥＣ−６アゴニスト抗体、またはＳＩＧＬＥＣ−６に対する天然のリガンドを模倣する低分子を哺乳動物に投与することを含む。このアゴニスト抗体はＳＩＧＬＥＣ−６レセプターに結合し、サイトカインおよび／または細胞レセプターの発現を制御して、非病気状態の特徴であるサイトカイン量にする。Ｂ細胞媒介性疾患は、白血病およびＢ細胞リンパ腫などであるが、これらに限定されない。
これらの病気の予防および治療に用いられる抗体も、肥満細胞および／またはＳＩＧＬＥＣ−６発現Ｂ細胞を死滅させるエフェクター機能を含むよう改造し、または、サイトトキシンもしくはアポトーシス誘導分子のような成分に結合させることができる。
ＳＩＧＬＥＣ−６調節化合物の用量は、具体的な哺乳動物の年齢、サイズ、および性質、ならびに病気によって変わる。当業者は、これらの要素に基づいて投薬量を決めることができる。ＳＩＧＬＥＣ−６調節化合物は、病気に合った治療計画の中で投与することが可能であり、例えば、１回量または数回量を１日から数日かけて投与して病状を緩和したり、アレルギーや喘息を予防するために定期的な用量を長期間にわたって投与したりすることが可能である。
ＳＩＧＬＥＣ−６調節化合物は、経口投与、注入、インプラントの使用、肺の中へのエアロゾルなど、許容できるやり方で哺乳動物に投与することができる。注入およびインプラントによって、投与に使用されるタイミングと投薬量を厳格に調節することが可能になる。ＳＩＧＬＥＣ−６調節化合物は非経口的に投与することも可能である。本明細書において、非経口投与は、静脈内、筋内、または腹腔内への注入によるもの、または皮下インプラントによるものを意味する。
注入によって投与する場合は、ＳＩＧＬＥＣ−６調節化合物を、生体適合剤、および、さまざまな賦形剤、アジュバント、添加剤、および希釈剤などの適合キャリアを含む注入可能な製剤にして哺乳動物に投与することができる。
（治療用／予防用の投与および組成物）
本発明は、被験体に対し、有効量の本発明の化合物または組成物、好ましくは抗体を投与して、治療、阻害、および予防する方法を提供する。被験体は、好ましくは動物であり、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物であるが、これらに限定されず、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用できる製剤および投与方法について以下に述べる。
さまざまな送達系が知られており、本発明の化合物を投与するために利用することができる。例えば、リポソームへの封入、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現することができる組換え細胞、レセプターを介したエンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）参照）、レトロウイルスまたはその他のベクターの一部として核酸を構築することなど。
導入方法は、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口などの経路を含むが、これらに限定されない。化合物または組成物は、任意の便利な経路、例えば、輸液またはボーラス注射によって、上皮または皮膚粘膜の裏層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸の粘膜など）を介する吸収によって投与することができ、また、別の生物活性剤とともに投与することができる。投与は全身でも局部でもよい。さらに、本発明の薬学的化合物および組成物を、脳室内およびくも膜下への注射など適切な経路によって中枢神経系に導入することが望ましいかもしれない。脳室内注射は、例えば、オンマヤ槽などのリザーバに結合した脳室内カテーテルによって容易になるかもしれない。例えば、吸入器または噴霧器、およびエアロゾル化剤入りの製剤を用いることによって、肺への投与も利用することができる。
特定の実施形態において、本発明の化合物または組成物を、治療が必要な領域へ局所的に投与することが望ましいかもしれないが、これは、例えばであって、限定しようとするものではないが、局所輸液によって、または、多孔性、無孔性のインプラント、または、シラスティックなどの膜を含むゼラチン状物質、または繊維によって行うことができる。好ましくは、抗体など本発明のタンパク質を投与するときには、そのタンパク質が吸着しない材料を使用するよう注意しなければならない。
別の実施形態において、化合物または組成物は、賦形剤、特にリポソーム（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａ１．，ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ３５３−３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ， ｉｂｉｄ．， ｐｐ．３１７−３２７参照；一般的には、同書参照）に入れて送達することができる。
さらに別の実施形態において、化合物または組成物は、制御された放出装置に入れて送達することができる。一実施形態において、ポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ，前掲；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ ａ１．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）。別の実施形態では、ポリマー物質を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａ１１（ｅｄｓ．），Ｗｉ１ｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ，２３：６１ （１９８３）参照；また、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａ１．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｘｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）参照）。さらに別の実施形態では、制御された放出装置を治療標的、すなわち脳の近くに設置することができ、それによって、全身投与量の一部しか必要でなくなる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ， ｉｎ． Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，前掲， ｖｏｌ．２， ｐｐ．１１５−１３５（１９８４））。別の制御された放出装置については、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３ （１９９０））によって概説されている。
本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸であるという特定の実施形態では、それを、適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、例えば、レトロウイルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号）を使用して、または直接注射によって、または微小粒子衝撃（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）、または脂質もしくは細胞表面レセプターまたは形質導入剤で被覆すること、または核に進入することが知られているホメオボックス様ペプチド（例えば、Ｊｏｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８６４−１８６８（１９９１）参照）に連結して投与することによって、それを細胞内になるように投与することによって、核酸をインビボで投与して、コードされているタンパク質の発現を促進することができる。あるいは、核酸を細胞内に導入し、発現させるため、相同的組換えによって、宿主細胞ＤＮＡの中に組み込むことができる。
また、本発明は組成物も提供する。この組成物は、治療上有効量の化合物、および許容されるキャリアを含む。「キャリア」という用語は、それとともに治療剤が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体を意味する。このようなキャリアは、滅菌された脂質、例えば、水および油でもよく、石油、動物、植物、または合成物に由来する油、例えば、ピーナッツオイル、鉱油、ゴマ油などがある。組成物を静脈内から投与する場合には、水が好適なキャリアである。食塩水、ならびに水性のデキストロースおよびグリセロールの溶液も液体キャリアとして、特に注射溶液として利用することができる。適切な賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどである。所望であれば、この組成物は、少量の湿潤剤および乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むこともできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、ピル、カプセル、粉剤、徐放性製剤などの形状を採ることができる。この組成物は、伝統的な結合剤、およびトリグリセリドのようなキャリアとともに坐薬として調合することもできる。経口製剤は、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、などでもよい。適切なキャリアの例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ” ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎに記載されている。このような組成物は、治療的有効量の化合物、好ましくは精製された形のものを適切な量のキャリアとともに含み、患者に適正に投与するための形状を提供することができる。製剤は、投与方法に適合していなければならない。
好適な実施形態において、組成物を通常の手順にしたがって、ヒトに静脈内投与するのに適した組成物として調合する。一般的には、静脈内投与するための組成物は、滅菌した等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合には、組成物は、溶解補助剤、および、注入部位の痛みを軽減するためにリグノカインのような局所麻酔剤も含むことが可能である。通常、成分は、単位投薬形態、例えば、密閉された容器、例えば、活性物質の量を表示したアンプルまたはサシェなどの密封容器に入った乾燥した凍結乾燥粉末、または無水濃縮液の形態で、別々か、または一緒に混合されて供給される。組成物を輸液によって投与すべき場合には、滅菌した医薬品等級の水または食塩水を含む輸液ボトルで分注することができる。組成物を注入によって投与する場合には、投与する前に成分を混合できるよう、注入用滅菌水または食塩水のアンプルを提供することができる。不揮発性の発熱物質を含まない水、滅菌水、および静菌水などの水性媒体も、注入液を作成するのに適している。これらの形態の水以外にも、いくつか別の水性媒体を使用することができる。これらは、滅菌することができる等張注射液組成物、例えば、塩化ナトリウム、リンガー、デキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、および乳酸加リンガーなどである。綿実油、ゴマ油、またはピーナッツオイルなどの非水性媒体、およびミリスチン酸イソプロピルなどのエステル類も、組成物の溶媒系として使用することができる。さらに、抗菌剤、保存剤、抗酸化剤、キレート剤、および緩衝液など、組成物の安定性、無菌性、および等張性を増進するさまざまな添加剤を加えることも可能である。
ＳＩＧＬＥＣ−６の発現に関連するＢ細胞媒介性の疾患または障害、または異常な発現および／または活性に関連するＳＩＧＬＥＣ−６媒介性の疾患または障害を治療、阻害、または予防するのに有効な本発明化合物の量を、標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに、場合によっては、インビトロアッセイ法を用いて、最適な用量範囲を同定することができる。製剤で使用すべき正確な用量も、投与経路、および疾患または障害の重篤度に依存するため、医師の判断と各患者の状況に従って決定されるべきである。有効量は、インビトロまたは動物モデル系から得られた用量応答曲線から推定することができる。
抗体については、患者に投与される投薬量は、一般的には、患者の体重当り０．１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患者の体重当り０．１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇの間であり、より好ましくは、患者に投与される投薬量は、患者の体重当り１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの間である。外来ペプチドに対する免疫反応のせいで、ヒト抗体は、通常、ヒトの体内では、別の生物種の抗体よりも半減期が長い。したがって、低投薬量のヒト抗体をより低い頻度で投与することが、しばしば可能である。
（ＳＩＧＬＥＣ−６レセプタータンパク質の精製）
また、本発明の抗体は、組換え細胞培養、夾雑物、および天然の環境からＳＩＧＬＥＣ−６レセプタータンパク質を単離および精製する方法で使用することもできる。この方法は、ＳＩＧＬＥＣ−６レセプタータンパク質および夾雑物を含む組成物を、このレセプターに結合することができる抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体に曝露すること、ＳＩＧＬＥＣ−６レセプタータンパク質を抗体に結合させること、抗体−レセプター複合体を夾雑物から分離すること、およびこの複合体からＳＩＧＬＥＣ−６レセプタータンパク質を回収することを含む。
また、当該分野において公知のさまざまな精製法、例えば、組換え細胞培養または天然の由来源からＳＩＧＬＥＣ−６レセプタータンパク質を回収するアフィニティー精製法を用いることができる。この方法では、ＳＩＧＬＥＣ−６に対する抗体を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂または濾紙など適切な支持体上に、当該分野において周知された方法を用いて固定する。そして、固定された抗体を、精製すべきＳＩＧＬＥＣ−６レセプタータンパク質を含むサンプル組成物または溶液と接触させる。次に、固定された抗体に結合したＳＩＧＬＥＣ−６レセプタータンパク質以外のサンプル中の物質を実質的にすべて除去できる適切な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、抗体からＳＩＧＬＥＣ−６レセプタータンパク質を取り出すのに適した別の溶媒で支持体を洗浄する。
（ノックアウト動物）
別の態様において、本発明は、生物学的に機能するＳＩＧＬＥＣ−６レセプタータンパク質の発現を阻害または阻止する、内生ＳＩＧＬＥＣ−６レセプター遺伝子のヘテロ接合破壊またはホモ接合破壊をもつゲノムを含むノックアウト動物を提供する。好ましくは、本発明のノックアウト動物は、その内生ＳＩＧＬＥＣ−６レセプター遺伝子にホモ接合破壊をもつ。好ましくは、本発明のノックアウト動物はマウスである。ノックアウト動物は、当該分野において公知の技術を用いて簡単に作製することができる。遺伝子破壊は、いくつかの方法で行うことができ、生物学的に不活性なポリペプチドもたらす終止コドンを、ポリペプチドをコードする配列の任意の部分に導入すること、ポリペプチドの発現を阻害または阻止する突然変異体をプロモーター、またはその他の調節配列の中に導入すること、遺伝子を不活性化する外来配列を遺伝子に挿入すること、および、遺伝子から配列を欠失させることなどが含まれる。
哺乳動物の生殖細胞系列の中に特定のＤＮＡ配列を導入するため、および、これらの配列（導入遺伝子）を各々次の世代に安定して伝達するためにいくつかの技術を利用することができる。もっとも一般的に使用されている技術は、受精した卵母細胞の前核の中にＤＮＡを直接マイクロインジェクションすることである。このような卵母細胞から得られたマウスまたはその他の動物は、約１０〜２０％の頻度で、交配によってさまざまなトランスジェニックマウス系統を生み出すトランスジェニック創始者になる。胚操作およびマイクロインジェクションによってトランスジェニック動物、特にマウスなどの動物を作製する方法は、当該分野において常法となっている。例えば、米国特許第４，７３６，８６６号、第４，８７０，００９号、および第４，８７３，１９１号、およびＨｏｇａｎ，Ｂ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）。同様の方法が、その他のトランスジェニック動物を作製するために用いられる。
胚幹細胞（「ＥＳ細胞」）技術を用いて、特異的に欠失した遺伝子をもつノックアウトマウス（および、それ以外の動物）を作製することができる。インビトロで培養することができ、遺伝子改変されている全能胚幹細胞を凝集させるか、マウス胚にマイクロインジェクションして、この遺伝子改変を子孫に伝えることができるキメラマウスを作製することができる。こうして、指向性をもった交配によって、この遺伝子を持たないマウスを獲ることができる。遺伝子改変された動物を作製するために、いくつかの別法を利用することも可能であり、例えば、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）を、トランスジェニックマウス作製に使用することができる。この方法は、未受精の卵母細胞の細胞質の中に精母細胞の頭部をマイクロインジェクションし、卵母細胞の受精を起こさせ、次には、着床前胚の適切な細胞分裂を活性化させる必要がある。このようにして得られたマウス胚を偽妊娠受容雌動物に移入する。この雌はマウスの仔を産む。トランスジェニックマウスの作製に応用されたＩＣＳＩでは、精子または精母細胞の頭部の懸濁液を、所望のＤＮＡ分子（導入遺伝子）を含む溶液とともにインキュベートする。これらは、マイクロインジェクションされると外来ＤＮＡの担持媒体として作用する精子と相互作用する。卵母細胞の中に入ると、このＤＮＡはゲノムの中に組み込まれてトランスジェニックマウスを誕生させる。この方法は、今まで従来の前核マイクロインジェクションプロトコルを用いて得られたよりも高いトランスジェニックマウスの收率（８０％超）をもたらす。
以下の実施例で本発明をさらに詳しく説明するが、当然ながら、これらの実施例は、単に例示する目的で含まれるのであって、別途具体的な記載がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。
（実施例１：ＳＩＧＬＥＣ−６が異なって発現される肥満細胞の同定）
ヒトタンパク質非冗長データベースＩＰＩ（国際タンパク質インデックス：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｄｅｘ）を、１）少なくとも１つの免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン、２）少なくとも１つの免疫レセプター阻害性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）、および３）膜貫通ドメインを含む新規の分子について検索した。これらの特徴は、免疫系機能に介在する多くのシグナル活性化レセプターに共通している。Ｉｇ−ドメイン検索には隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）に基づく方法を用いた。ＨＭＭは、１１３個の確実にＩｇ−ドメインと思われるもののアラインメントから構成され、Ｐｆａｍ（バージョン６．６）データベースから得られたＨＭＭＥＲプログラムを用いて修正されたもので。
ＩＴＩＭモチーフを含むタンパク質を検索するために、まず、ＩＴＩＭモチーフに共通した特徴に基づいてＰＲＯＳＩＴＥ形式のモチーフプロフィールを構築し、「シードトップ（ｓｅｅｄｔｏｐ）ソフトウエア（ＮＣＢＩ）を用いて検索を実行した。
すべてのＩＰＩタンパク質について、ＴＭＨＭＭバージョン２．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ／）ソフトウエアを用いて、大規模な膜貫通領域予測を行った。
Ｓｉｇｌｅｃ−６のｃＤＮＡ配列が、３つの基準すべてに合致することが分かった。
（実施例２：マイクロアレイ解析）
リバースノザンのマイクロアレイ実験（Ｂ．Ｐｈｉｍｉｓｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，２１：１，１９９９）を行っていたエクスプレッションアナリシス社（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）にＲＮＡサンプルを送付した。そのｃＤＮＡサンプルを標識して、ヒトゲノムＵ１３３プラス２．０アレイ・ジーンチップにハイブリダイズさせた。最初のデータは、各ハイブリダイゼーションについて白黒の画素化された画像として受け取り、その後、アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）５．０アレイスーツ（ＡｒｒａｙＳｕｉｔｅ）ソフトウエアに移して解析した。このソフトウエアは、アレイ上の各転写産物に対する定量値（シグナル強度）および定性値（有無）を計算するために統計的アルゴリズムを用いている。
（実施例３：Ｓｉｇｌｅｃ−６のｍＲＮＡ発現のリアルタイム定量ＰＣＲ解析）
プライマーエクスプレス２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いた選抜後、Ｓｉｇｌｅｃ−６のヌクレオチド配列に基づいて２つのオリゴヌクレオチドプライマー：５’ＴＧＧＡＧＣＴＧＣＣＴＣＡＡＧＴＡＧＧＧ３’（配列番号３）および５’ＣＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＡＡＡＴＣＴＣＣＴ３’（配列番号４）を合成し、次に、それらを用いてＳｉｇｌｅｃ−６の発現を観察した。
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）配列検出システムで、ＳＹＢＲグリーン試薬を用い、製造業者の指示通りにリアルタイム定量ＰＣＲを行った。以下の細胞におけるＳｉｇｌｅｃ−６のｍＲＮＡ量を測定するために全ＲＮＡを単離した：Ｄａｕｄｉ（バーキットリンパ腫に由来するＢリンパ芽球細胞株、ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２１３）、ＴＨＰ−１（単球性白血病細胞株、ＡＴＣＣ番号：ＴＩＢ２０２）、ＨＭＣ−１（肥満細胞性白血病細胞株）、末梢血単核細胞株（ＰＢＭＣ）、初代単球細胞、初代Ｂ細胞、初代好中球細胞、インビトロ培養８〜９週目の肥満細胞。脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、脾臓、胸腺、および気管に由来する第１鎖ｃＤＮＡは、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から得られたものであった。
上記細胞から得られた各ＲＮＡの等量を逆転写反応に用いて第１鎖ｃＤＮＡを作製し、それらを定量ＰＣＲ反応における鋳型として使用して、限界（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）増幅サイクル（Ｃｔ）を得た。このＣｔを、１８ＳＲＮＡのコントロールＣｔを用いて標準化して、ΔＣｔを得た。さまざまな細胞および組織におけるＳＩＧＬＥＣ−６の遺伝子発現の相対量を比較するために、最も低い発現量を基準に用いてΔΔＣｔ値を計算し、次に、それらを相対的な発現差の値に変換した。
定量ＲＴ−ＰＣＲ解析によって、ＳＩＧＬＥＣ−６のｍＲＮＡが、ヒトの肥満細胞、初代培養細胞および肥満細胞性白血病細胞株のどちらにおいても、非常に高レベルで発現されることが示された（表１）。
（定量ＲＴ−ＰＣＲによって測定したＳＩＧＬＥＣ−６ ｍＲＮＡの発現プロフィール）
Figure 2008502368
 。
（実施例４：ＳＩＧＬＥＣ−６の発現構築物）
ＳＩＧＬＥＣ−６のコード配列（配列番号１）を、Ｓｉｇｌｅｃ−６の配列に由来する以下の２つのオリゴヌクレオチドプライマー：
５’ＣＡＣＣＡＴＧＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡ（配列番号５）
３’ＴＣＡＣＴＴＧＴＧＴＡＴＣＴＴＧＡＴＴＴＣＴＧ（配列番号６）
を用いて増幅し、Ｃ末端にＶ５タグを融合しているｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。得られたクローンｐＳｉｇｌｅｃ−６−Ｖ５を一過的に２９３Ｔ細胞に形質転換した。形質転換してから４８時間後、形質転換された細胞を回収し、ホモジナイズ法または凍結融解法によって膜画分とサイトゾル画分に分けた。抗Ｖ５ ＭＡｂと抗マウスＩｇＧの結合体を用いてウエスタンブロット解析を行った。ＳＩＧＬＥＣ−６は、主に５５ｋＤａのタンパク質として発現されたが、これは、５０ｋＤａの分子量と計算されたよりも大きく、ＳＩＧＬＥＣ−６が、例えば、グリコシル化などによって翻訳後に修飾される可能性を示唆しえいる。Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，前掲）は、細胞外ドメイン内に７つのグリコシル化可能部位があることを報告した。（図２ ボールド配列（Ｂｏｌｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）参照。）
ＳＩＧＬＥＣ−６発現構築物の配列は、ＮＭ＿００１２４５（ＧｅｎＢａｎｋ整理番号）に一致していることを確認した。
（実施例５：ＳＩＧＬＥＣ−６の診断アッセイ）
ＳＩＧＬＥＣ−６タンパク質が細胞の中で発現しているか否かを決定するために、全血、単離された末梢血単核細胞を用いて、またはリンパ節などの組織内で免疫蛍光実験を行うことができる。約２５，０００細胞をガラススライド上にサイトスピンして風乾する。細胞をカルノア固定液（６０％エタノール、３０％クロロホルム、および１０％酢酸）によって室温で１０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄する。ブロック用溶液（ＰＢＳ中１％ウマ血清、２％ウサギ血清、１％ＢＳＡ、および１％ヤギ血清）を用いて、氷上で３０分間予備ブロックしてから、抗ＳＩＧＬＥＣ−６ ｍＡｂ（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ中１μｇ／ｍｌ）とともに室温で３０分間インキュベートする。そして、細胞を３回洗浄してから、１：１００の希釈率でヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｌａｂ）とともに室温で３０分間インキュベートする。細胞を洗浄し、風乾してからカバースライドをかける。蛍光顕微鏡を使用して蛍光染色を調べ、スナップショット（Ｓｎａｐ−Ｓｈｏｔ）ソフトウエアを用いて結果を記録する。
ＦＡＣＳ染色を行うために、単離した細胞を洗浄し、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中１％ウマ血清、２％ウサギ血清、１％ＢＳＡ、および１％ヤギ血清）とともに４℃で３０分間インキュベートする。次に、細胞をＦＩＴＣ−結合抗ＳＩＧＬＥＣ−６ ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）と、または同じバッファーで３０分間インキュベートする。あるいは、細胞を、まず非結合抗ＳＩＧＬＥＣ−６ ｍＡｂの後、ＦＩＴＣまたはＰＥを結合した抗マウスＩｇＧで染色することもできる。３回洗浄した後、１％パラホルムアルデヒド入りの１×ＰＢＳで細胞を固定する。サンプルをＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）で解析する。
免疫組織化学法を行うには、１０％ホルマリンで固定された上、パラフィン包埋されたか、クリオスタット−アセトン固定された、ヒト組織の連続切片を用いる。パラフィン包埋された組織サンプルを脱パラフィンし、再水和し、２％正常ヤギ血清を含むＰＢＳの中で、室温にて３０分間インキュベートしてから、１０μｇ／ｍｌの精製抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体または０．５μｇ／ｍｌの細胞マーカー（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ クローン番号：Ｇ３，ＭＡＢ１２２２）に対するｍＡｂのいずれかを含むバッファー中、４℃で一晩インキュベートする。サンプルを洗浄し、ＡＰ標識したヤギ抗マウスＩｇＧを含むバッファーの中で室温にて１時間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、アルカリホスファターゼ基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ；カタログ番号：３４０３４）の中で室温にて１５分間インキュベートする。抗体染色された組織切片をギルヘマトキシリンで対比染色し、Ｉｍｍｕ−Ｍｏｕｎｔ（Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，ＰＡ）で覆う。
（実施例６：免疫組織化学法）
細胞を分画したところ、ＳＩＧＬＥＣ−６は膜画分に存在したが、サイトゾルにはほとんど存在しなかった。細胞表面上でのＳＩＧＬＥＣ−６発現を確認するために、３つの細胞株（ＣＢＭＣ、ＬＡＤ２、およびＨＭＣ−１）をＰＥ結合マウス抗ヒトＳＩＧＬＥＣ−６抗体で免疫染色した。ＦＡＣＳ解析の結果が図４に示されているが、ＳＩＧＬＥＣ−６がこれらの細胞の表面上で発現されることが確かめられた。
また、Ｃｏｏｒｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ），Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｄｉｖｉｓｉｏｎ，ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌａｂａｍａ ａｔ Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍから入手した、ヒトの肺および気管の組織サンプル中の肥満細胞を解析して、ＳＩＧＬＥＣ−６が存在するかを調べた。１０％ホルマリンで固定された上、パラフィン包埋されたか、クリオスタット−アセトン固定された、ヒトの気管および肺の組織の連続切片を用いた。パラフィン包埋された各組織標本を脱パラフィンし、再水和し、２％正常ヤギ血清を含むＰＢＳの中で、室温にて３０分間インキュベートしてから、１０μｇ／ｍｌの精製抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体（ＢＤ 商標Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ クローン番号：Ｅ２０−１２３２）または０．５μｇ／ｍｌの抗ヒトトリプターゼ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ クローン番号：Ｇ３，ＭＡＢ１２２２）を含むバッファーの中で、４℃にて一晩インキュベートした。サンプルを洗浄し、ＡＰ標識したヤギ抗マウスＩｇＧを含むバッファー中で室温にて１時間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄してから、アルカリホスファターゼ基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ；カタログ番号：３４０３４）の中で室温にて１５分間インキュベートした。抗体染色された組織切片をギルヘマトキシリンで対比染色し、Ｉｍｍｕ−Ｍｏｕｎｔ（Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，ＰＡ）で封入した。
抗ＳＩＧＬＥＣ−６で染色した細胞も、肥満細胞に対する有力な細胞マーカーである抗トリプターゼによる染色を示し、ＳＩＧＬＥＣ−６がこれら組織サンプル中の肥満細胞上で発現されたことが明らかになった。組織肥満細胞上でＳＩＧＬＥＣ−６が検出されたことは、以前ＦＡＣＳで、このタンパク質の発現が培養ヒト肥満細胞およびＬＡＤ２細胞において示された結果と一致した。
（実施例７：抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体の作製およびスクリーニング）
本発明に係る抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体は、当該分野において周知されている従来からのハイブリドーマ技術によって作製することができる。要するに、マウスを、上記実施例４で作製された発現構築物からインビトロで合成したＳＩＧＬＥＣ−６で免疫した。この免疫原は、完全フロインドアジュバントで乳化し、１０〜１００μｇの量を皮下または腹腔内に注射した。１０から１５日後、免疫した動物を、完全フロインドアジュバントで乳化したＳＩＧＬＥＣ−６でさらに追加免疫する。その後、毎週ないし週２回の免疫化スケジュールで定期的にマウスを追加免疫した。
さらに、実施例４のｃＤＮＡ構築物を投与することによっても抗体を作製したところ、インビトロでＳＩＧＬＥＣ−６を発現させると、このタンパク質に対する免疫反応が、免疫したマウスで誘導された。
次に、両タイプのマウスを用いてハイブリドーマを作製した。各融合のために、免疫したマウスの脾臓から単一細胞懸濁液を調製し、ＳＰ２／０ミエローマ細胞との融合に用いた。ＳＰ２／０細胞（１×１０８）および脾臓細胞（１×１０８）は、５０％ポリエチレングリコール（Ｍ．Ｗ．１４５０）（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）および５％ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む培地の中で融合させた。そして、この細胞を、懸濁液１ｍｌ当り１．７×１０５という濃度になるよう、５％ウシ胎仔血清およびＨＡＴ（１０ｍＭヒポキサンチンナトリウム、４０μＭアミノプテリン、および１．６ｍＭチミジン）を補充したＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で調製した。２５０μｌの細胞懸濁液を、約９６ウェルの微量試験用プレートに加えた。約１０日後、ヒトＳＩＧＬＥＣ−６との反応性をＥＬＩＳＡによってスクリーニングするために培養上清を取り出した。
Ｉｍｍｌｏｎ ＩＩ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）微量試験用プレートのウェルを、０．１μｇ／ｍｌ（５０μｌ／ウェル）のヒトＳＩＧＬＥＣ−６で一晩コートした。そして、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中５％のＢＬＯＴＴＯ（脱脂粉乳）、２００μｌと１時間インキュベートして、ウェル中の非特異的結合部位を飽和させた。次に、ウェルをＰＢＳＴバッファー（０．０５％の登録商標ＴＷＥＥＮ ２０を含むＰＢＳ）で洗浄した。各融合ウェルから５０μｌの培養上清を、コートしたウェルに５０μｌのＢＬＯＴＴＯと一緒に加え、室温で１時間置いた。ウェルをＰＢＳＴで洗浄した。そして、希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）と室温で１時間反応させて、結合した抗体を検出した。次に、ウェルをＰＢＳＴで洗浄した。発色させるため、０．１Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０の中に０．１％３，３，５，５，テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および０．００３％過酸化水素（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むペルオキシダーゼ基質溶液をウェルに加えて３０分置いた。ウェル当り５０μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。ＥＬＩＳＡ読み取り装置（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）を用いて４５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を読み取った。
ＳＩＧＬＥＣ−６との反応性について陽性のウェルの中のハイブリドーマを限界希釈法によって単一細胞クローン化した。そして、モノクローナルハイブリドーマの規模を拡大し、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製するために培養上清を回収した。次に、ＢＩＡｃｏｒｅによってアフィニティーおよび結合速度の定数を決定するため、また、肥満細胞からのヒスタミン放出に対する効果について、精製された抗体の特徴を調べた。
当該分野において使用されている標準的なプロトコルに従って、単離されたモノクローナル抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体の配列を決定した。モノクローナル抗体２３９−９０の軽鎖（カッパ鎖）および重鎖（Ｈ）可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を施しつつ以下に示す：
軽鎖可変領域（カッパ）：
Figure 2008502368
 重鎖可変領域：
Figure 2008502368
 下線部は、以下に示すようなカバットのＣＤＲに相当する。軽鎖（カッパ）について：
Figure 2008502368
 そして重鎖について：
Figure 2008502368
 。
（実施例８：肥満細胞の脱顆粒に対するＳＩＧＬＥＣ−６の作用）
ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞（Ｂｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、２ｍＬのＬ−グルタミン、５０μＭの２−ＭＥ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６、および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１０を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなる培養培地の中で７週間培養した。細胞を抗トリプターゼｍＡｂで染色して、肥満細胞の割合を測定した。細胞懸濁液を、まず５×１０５細胞／ｍｌの密度で接種し、サイトカイン添加培地を週に１回交換した。
以下のプロトコルを用いて、ＦｃγＲＩの架橋を介してＳＩＧＬＥＣ−６によってヒトＣＢＭＣを活性化した。ＣＢＭＣを、上記したように培養して、１０，０００細胞・１００μｌ／ウェルで微量滴定プレートに接種した。細胞を、１５ｎｇ／ｍｌのヒトｒＩＦＮ−γで４８時間処理した。そして、細胞を、抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体（２または１０μｇ／ｍｌ）の存在下、または、陰性コントロールとして無関係の肥満細胞特異的タンパク質存在下で、マウス抗ヒトＦｃγＲＩＦ（ａｂ’）２とともに３７℃で１時間インキュベートした。プレートを１０００ｒｐｍで２分間遠心して上清を取り除いた。１００μｌの新しい培地を加えてから、１０μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ’）２を加え、プレートを２時間インキュベートした。上清を回収して、架橋によって放出されたヒスタミンの量を測定した。
Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）から入手した標準的な試薬およびプロトコルを用いてヒスタミン放出アッセイを行った。要するに、活性化ＣＢＭＣ上清を回収し、それらのヒスタミン含量を、ヒスタミン免疫アッセイキット（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｐａｌａｔｉｎｅ，ＩＬ）を用い、製造業者の指示に従って測定した。この免疫アッセイ法は、測定すべきヒスタミンとヒスタミン−アルカリホスファターゼ結合体との競合に基づいていた。細胞上清に存在するヒスタミンを、僅かにアルカリｐＨのところでアシル化試薬によってアシル化し、抗ヒスタミン抗体でコートされた微量滴定用ウェル上に加えた。微量滴定用ウェルは、サンプルの中で結合体とアシル化ヒスタミンとの間に競合が生じるように限られた数の抗体でコートされていた。４℃で２時かインキュベートした後、ウェルをリンスして未結合の成分を除去した。発色基質（ｐＮＰＰ）を加えて結合酵素活性を測定した。発色強度は、サンプル中のヒスタミン濃度に反比例していた。キットに含まれていた標準について得られた標準曲線に基づいて、放出されたヒスタミンを計算した。
この架橋実験の結果を図５に示す。架橋が起きれば、ヒスタミンがＣＢＭＣから放出される。観察されているように、Ｃ−Ｋｉｔ（ＣＢＭＣ上で発現される）および無関係な抗体は、ＦｃγＲＩの有無に関わらず、細胞から放出されるヒスタミンの量に影響を与える。これに対し、抗ＳＩＧＬＥＣ−６は、放出されるヒスタミンの量を用量依存的に阻害することができた。
（実施例９：ＡＤＣＣアッセイ）
ＡＤＣＣ機能アッセイ法が、抗ＳＩＧＬＥＣ−６モノクローナル抗体候補をスクリーニングするために確立された。標的細胞（ＣＢＭＣまたはＬＡＤ２など）は、１００μＣｉ５１Ｃｒで６０分間標識され、ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として用いられる。さまざまなＥ：Ｔ比の標的細胞（５×１０３／ウェル）とエフェクター細胞を、ＳＩＧＬＥＣ−６（２μｇ／ウェル；Ｒｏｃｈｅ）またはコントロール抗体のいずれかとともに、９６穴Ｕ底プレートに入れた２００μｌのＲＰＭＩ１６４０の中で３回反復して３７℃で６時間同時にインキュベートする。そして、ガンマカウンターで上清（１００μｌ）の放射活性を測定する。特異的溶解（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｓｉｓ）の割合を、式：特異的溶解％＝１００×（実験のｃｐｍ−自発性のｃｐｍ）／（最大のｃｐｍ−自発性のｃｐｍ）に従って計算する。コントロールは、標的細胞を抗体なしでインキュベートするか、無関係な抗体とインキュベートすることを含む。
（実施例１０：増殖／阻害アッセイ）
抗ＳＩＧＬＥＣ−６モノクローナル抗体について肥満細胞株ＬＡＤ２細胞で試験して、細胞増殖および阻害への効果を測定する。さまざまな濃度の抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体存在下で７日間、Ｈ３−ｄＣＴＰをＬＡＤ２細胞培養培地に加える。シンチレーションカウンターで取り込み量を測定する前に、細胞を洗浄して、取り込まれなかったＨ３−ｄＣＴＰを除去し、１０％ＴＣＡで細胞を固定する。Ｈ３−ｄＣＴＰの取り込みが増加すれば、抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体がヒト肥満細胞に対して増殖効果をもつことを示すが、Ｈ３−ｄＣＴＰの取り込みが減少すれば、ヒト肥満細胞に対して抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体が阻害効果をもつことを示す。
（実施例１１：肥満細胞のアポトーシス）
細胞アポトーシスの細胞マーカーであるアネキシンＶを用いて、抗ＳＩＧＬＥＣ−６モノクローナル抗体が、肥満細胞のアポトーシス過程に生物学的な影響を与えるか否かを検出することができる。ＦＩＴＣ結合抗アネキシンＶを用いて、抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体候補と２４時間インキュベートした後、ヒトＣＢＭＣに対してＦＡＣＳ染色を行う。どのような量であっても細胞表面にアネキシンＶの発現があれば、肥満細胞のアポトーシス対して抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体が効果をもつことを示している。
（実施例１２：アゴニストのスクリーニング）
ＳＩＧＬＥＣ−６分子には、ｃ末端をもつチロシン部位（ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｂｅａｒｉｎｇ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｓｉｔｅ）に２つのＩＴＩＭドメインがあるため、抗体によってチロシンがリン酸化されれば、アゴニストであることが示されたことになろう。
この実験は、肥満細胞、またはＬＡＤ２などの肥満細胞株を抗ＳＩＧＬＥＣ−６モノクローナル抗体候補で５分間処理して行われ、その後、細胞を溶解し、細胞溶解液をウエスタンブロット用に泳動し、ブロットをモノクローナル抗ホスホチロシンによってプローブする。抗体非存在下で増殖させた同じ細胞培養物と比較して、結合するとＳＩＧＬＥＣ−６サイトプラストドメインタンパク質のチロシンリン酸化をもたらす抗体候補がアゴニストであると考えられる。
Ｓｉｇｌｅｃ−６の核酸配列（配列番号１）を示す。 シグナル配列（下線部）、およびＩＴＩＭ領域ならびにＳＬＡＭ領域と推定される３’末端側領域を含む、ＳＩＧＬＥＣ−６タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。 さまざまな組織および細胞株におけるＳｉｇｌｅｃ−６のｍＲＮＡの相対的発現量を示す。 細胞表面上でＳｉｇｌｅｃ−６が発現することを明らかにした、ＣＢＭＣ、ＬＡＤ２、およびＨＭＣ−１のＦＡＣＳ染色を示す。 ＦｃγＲＩを介するＣＢＭＣ活性化に対する抗ＳＩＧＬＥＣ−６の効果を示す。 ６Ａおよび６Ｂは、Ｍａｂ２３９−９０の軽鎖および重鎖の可変領域の核酸配列（配列番号７および配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号８および配列番号１０）を示し、相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を付した。 ６Ａおよび６Ｂは、Ｍａｂ２３９−９０の軽鎖および重鎖の可変領域の核酸配列（配列番号７および配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号８および配列番号１０）を示し、相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を付した。

Claims (74)

  1. 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、または配列番号２２に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有する超可変領域を含む、ＳＩＧＬＥＣ−６に結合する抗体またはそのフラグメント。
  2. 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、または配列番号２２に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する超可変領域を含む、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
  3. 前記軽鎖が、Ｖｋ−ＣＤＲ１（配列番号１２）、Ｖｋ−ＣＤＲ１（配列番号１４）、およびＶｋ−ＣＤＲ３（配列番号１６）からなる群より選択される超可変領域を含む、請求項２に記載の抗体またはそのフラグメント。
  4. 前記重鎖が、Ｖｈ−ＣＤＲ１（配列番号１８）、Ｖｈ−ＣＤＲ１（配列番号２０）、およびＶｈ−ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群より選択される超可変領域を含む、請求項２に記載の抗体またはそのフラグメント。
  5. 前記重鎖が、Ｖｈ−ＣＤＲ１（配列番号１８）、Ｖｈ−ＣＤＲ１（配列番号２０）、およびＶｈ−ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群より選択される超可変領域を含む、請求項３に記載の抗体またはそのフラグメント。
  6. 前記軽鎖が、Ｖｋ−ＣＤＲ１（配列番号１２）、Ｖｋ−ＣＤＲ１（配列番号１４）、およびＶｋ−ＣＤＲ３（配列番号１６）を含む、請求項２に記載の抗体またはそのフラグメント。
  7. 前記重鎖が、Ｖｈ−ＣＤＲ１（配列番号１８）、Ｖｈ−ＣＤＲ１（配列番号２０）、およびＶｈ−ＣＤＲ３（配列番号２２）を含む、請求項２に記載の抗体またはそのフラグメント。
  8. 前記重鎖が、Ｖｈ−ＣＤＲ１（配列番号１８）、Ｖｈ−ＣＤＲ１（配列番号２０）、およびＶｈ−ＣＤＲ３（配列番号２２）を含む、請求項６に記載の抗体またはそのフラグメント。
  9. 前記重鎖および軽鎖がヒトフレームワーク領域を含む、請求項１または２に記載の抗体またはそのフラグメント。
  10. 前記軽鎖が、配列番号８に示される軽鎖可変領域を含む、請求項８に記載の抗体またはそのフラグメント。
  11. 前記重鎖が、配列番号１０に示される重鎖可変領域を含む、請求項８に記載の抗体またはそのフラグメント。
  12. 前記重鎖が、配列番号１０に示される重鎖可変領域を含む、請求項１０に記載の抗体またはそのフラグメント。
  13. さらに定常領域を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
  14. 前記軽鎖可変領域および前記重鎖可変領域が定常領域に連結している、請求項１３に記載の抗体またはそのフラグメント。
  15. 請求項１に記載の抗体またはそのフラグメントの可変軽鎖または可変重鎖。
  16. 請求項１５に記載の可変軽鎖および／または可変重鎖をコードする単離された核酸。
  17. 請求項１６に記載の単離された核酸を含む組成物。
  18. 請求項１６に記載の単離された核酸を含む細胞。
  19. 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６のＣＤＲを有する軽鎖と、配列番号１８、配列番号２０、および配列番号２２のＣＤＲを有する重鎖とを含む抗体と同じＳＩＧＬＥＣ−６のエピトープに特異的に結合する抗体またはそのフラグメント。
  20. ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、または単一ドメイン抗体である、請求項１または２に記載の抗体。
  21. 請求項１または２に記載の抗体と、適切なキャリア、アジュバント、希釈剤、賦形剤、および／または添加剤とを含む組成物。
  22. 重鎖もしくは軽鎖、またはそのフラグメントを作製する方法であって、請求項１８に記載の細胞を、該重鎖もしくは軽鎖を発現させるのに適した条件下で培養する工程、および、該細胞培養物から該重鎖もしくは軽鎖を精製する工程を包含する、方法。
  23. 重鎖および軽鎖、またはそのフラグメントを作製する方法であって、請求項１８に記載の細胞を、該重鎖および軽鎖を発現させるのに適した条件下で培養する工程、および、該細胞培養物から該重鎖および軽鎖を精製する工程を包含する、方法。
  24. 抗体またはそのフラグメントを作製する方法であって、請求項１８に記載の細胞を、該抗体を発現させるのに適した条件下で培養する工程、および、該細胞培養物から該抗体を精製する工程を包含する、方法。
  25. 被験体において肥満細胞媒介性の疾患または障害を予防および／または処置する方法であって、それを必要とする被験体にＳＩＧＬＥＣ−６レセプター調節因子を投与する工程を包含する、方法。
  26. 前記ＳＩＧＬＥＣ−６レセプター調節因子がＳＩＧＬＥＣ−６アゴニストである、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記ＳＩＧＬＥＣ−６レセプター調節因子がＳＩＧＬＥＣ−６アンタゴニストである、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記ＳＩＧＬＥＣ−６レセプター調節因子が抗体である、請求項２５に記載の方法。
  29. 被験体において肥満細胞媒介性の疾患または障害を予防および／または処置する方法であって、それを必要とする被験体に請求項１に記載の抗体またはそのフラグメントを投与する工程を包含する、方法。
  30. 前記肥満細胞媒介性の疾患または障害が喘息である、請求項２９に記載の方法。
  31. 被験体において肥満細胞媒介性の疾患または障害を予防および／または処置する方法であって、それを必要とする被験体に、肥満細胞を死滅させるエフェクター機能を有する抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体またはそのフラグメントを投与する工程を包含する、方法。
  32. 前記エフェクター機能が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）である、請求項３１に記載の方法。
  33. 被験体において肥満細胞媒介性の疾患または障害を予防および／または処置する方法であって、それを必要とする被験体に、肥満細胞を死滅させるエフェクター機能を有する請求項１に記載の抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体またはそのフラグメントを投与する工程を包含する、方法。
  34. 肥満細胞においてアポトーシスを誘導するために、アポトーシス誘導部分に結合した抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体またはそのフラグメントを投与する工程を包含する、肥満細胞媒介性の疾患または障害を予防および／または処置する方法。
  35. 前記アポトーシス誘導部分が、Ｂａｘ−α、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｅｒｋ、およびＢｏｋからなる群より選択されるＢｃｌ−２ファミリーのプロアポトーシスメンバーである、請求項３４に記載の方法。
  36. 被験体においてＢ細胞媒介性の疾患または障害を予防および／または処置する方法であって、それを必要とする被験体に請求項１に記載の抗体またはそのフラグメントを投与する工程を包含する、方法。
  37. 生物学的サンプルにおいてＳＩＧＬＥＣ−６の存在を決定するための方法であって、生物学的サンプルを請求項１に記載の抗体またはそのフラグメントと接触させる工程、および該抗体またはそのフラグメントの存在を決定する工程を包含する、方法。
  38. 哺乳動物において肥満細胞媒介性障害を診断する方法であって、
    肥満細胞媒介性障害を有すると疑われる哺乳動物からサンプルを採取する工程、
    該サンプルを検出可能量の抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体とともにインキュベートする工程、
    結合した抗体の量を測定する工程、
    該疑われたサンプル中の結合抗体量を正常なコントロールに対して比較する工程
    を包含し、ここで、肥満細胞媒介性障害を有すると疑われる哺乳動物に由来するサンプル中の結合抗体の量が正常なコントロールと比べて異なることは、該哺乳動物が肥満細胞媒介性障害を有するか、肥満細胞媒介性障害を発症する可能性が高いことを示す、方法。
  39. 請求項１に記載の抗体を含む、ＳＩＧＬＥＣ−６の存在を検出するためのキット。
  40. 抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体を含む、ＳＩＧＬＥＣ−６媒介性の疾患または障害を診断するためのキット。
  41. ＳＩＧＬＥＣ−６レセプター活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
    配列番号２のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントをコードする核酸配列を含む細胞を調製する工程、
    該細胞を、ＳＩＧＬＥＣ−６レセプター活性を調節する能力が決定されようとしている少なくとも１つの化合物と接触させる工程、
    ＳＩＧＬＥＣ−６レセプター活性の調節について該細胞をモニタリングする工程
    を包含する、方法。
  42. 前記細胞が安定的にトランスフェクトされる、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記細胞が一過性にトランスフェクトされる、請求項４１に記載の方法。
  44. 前記細胞が肥満細胞である、請求項４１に記載の方法。
  45. 前記化合物がアゴニストである、請求項４１に記載の方法。
  46. 前記化合物がアンタゴニストである、請求項４１に記載の方法。
  47. 前記化合物が抗体である、請求項４１に記載の方法。
  48. 工程（ａ）で使用される前記細胞がレポータータンパク質をコードするＤＮＡをさらに含み、該ＤＮＡは、ＳＩＧＬＥＣ−６反応性転写エレメントに作動可能に連結されている、請求項４１に記載の方法。
  49. 工程（ｂ）が、前記レセプタータンパク質のシグナル伝達活性を阻害する能力が決定されようとしている少なくとも１つの化合物の濃度が増大する中で行われる、請求項４１に記載の方法。
  50. 工程（ｃ）が、前記細胞における前記レポータータンパク質の発現レベルを前記化合物の濃度の関数としてモニタリングし、それによって、該化合物がシグナル伝達活性を阻害する能力を示す工程を包含する、請求項４８に記載の方法。
  51. ＳＩＧＬＥＣ−６活性のアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法であって、
    ＳＩＧＬＥＣ−６を発現する細胞を候補化合物と接触させる工程、
    細胞の反応をアッセイする工程、および
    該細胞の反応を、候補化合物の非存在下でなされる標準的な細胞反応と比較する工程
    を包含し、それによって、該標準的な細胞反応よりも高い細胞反応は、該化合物がアゴニストであることを示し、該標準的な細胞反応よりも低い細胞反応は、該化合物がアンタゴニストであることを示す、方法。
  52. 哺乳動物において肥満細胞媒介性炎症性疾患を治療するための候補化合物を同定する方法であって、
    該化合物を肥満細胞に適用する工程、
    ＳＩＧＬＥＣ−６の発現／機能を測定する工程、
    該化合物が、該化合物を適用していない肥満細胞と比較して、肥満細胞媒介性炎症性疾患に関係するＳＩＧＬＥＣ−６の該発現／機能を低下させるか否かを確認する工程、および
    発現／機能を低下させる化合物を、肥満細胞媒介性炎症性疾患を治療するための候補化合物として同定する工程
    を包含する、方法。
  53. 前記候補化合物がＳＩＧＬＥＣ−６アゴニストである、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記候補化合物がＳＩＧＬＥＣ−６アンタゴニストである、請求項５２に記載の方法。
  55. 前記候補化合物が抗体である、請求項５２に記載の方法。
  56. ＳＩＧＬＥＣ−６の生物活性を阻害する因子を同定するための方法であって、
    ＳＩＧＬＥＣ−６のＩＴＩＭドメインを含むポリペプチドを因子と接触させる工程、
    該因子が、ＳＩＧＬＥＣ−６のＩＴＩＭドメインに結合するか否かを決定する工程、および
    上記工程でＩＴＩＭドメインに結合すると確認された因子が、活性化肥満細胞のヒスタミン放出を阻害するか否かを決定する工程
    を包含する、方法。
  57. 前記ＳＩＧＬＥＣ−６タンパク質の生物活性を決定する工程が、ヒスタミン放出のレベルを決定する工程を包含し、ここで、前記試験因子の非存在下に比べて、該試験因子の存在下での肥満細胞からのヒスタミン放出のレベルが高いことは、該試験因子が、ＳＩＧＬＥＣ−６の生物活性を促進する因子であることを示すのに対し、該試験因子の非存在下に比べて、該試験因子の存在下での肥満細胞からのヒスタミン放出のレベルが低いことは、該試験因子が、ＳＩＧＬＥＣ−６の生物活性を阻害する因子であることを示す、請求項５６に記載の方法。
  58. 哺乳動物においてＳＩＧＬＥＣ−６を発現するＢ細胞関連疾患を診断するための方法であって、
    Ｂ細胞関連疾患を有すると疑われる哺乳動物からサンプルを採取する工程、
    該サンプルを検出可能量の抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体とともにインキュベートする工程、
    結合した抗体の量を測定する工程、および
    該疑われたサンプル中の結合抗体量を正常なコントロールに対して比較する工程
    を包含する、方法。
  59. 前記抗体が標識されている、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記標識が蛍光部分、放射性部分、酵素、または発光部分である、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体が二次抗体で検出される、請求項５８に記載の方法。
  62. 前記抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体がＥＬＩＳＡで検出される、請求項５８に記載の方法。
  63. 前記抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体を含む、Ｂ細胞関連疾患を診断するためのキット。
  64. 固体表面に結合した抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体を含む、Ｂ細胞関連疾患を診断するためのキット。
  65. 患者においてＳＩＧＬＥＣ−６を発現するＢ細胞関連疾患を予防および／または処置するための方法であって、そのような処置を必要とする患者に、ＳＩＧＬＥＣ−６レセプター調節因子を投与する工程を包含する、方法。
  66. 前記前記ＳＩＧＬＥＣ−６レセプター調節因子が、ＳＩＧＬＥＣ−６アゴニストである、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記ＳＩＧＬＥＣ−６レセプター調節因子が抗体である、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記Ｂ細胞関連疾患がＢ細胞リンパ腫である、請求項６５に記載の方法。
  69. 前記ＳＩＧＬＥＣ−６レセプター調節因子が、ＳＩＧＬＥＣ−６を発現するＢ細胞を死滅させるエフェクター機能を有する抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体である、請求項６５に記載の方法。
  70. 前記エフェクター機能が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）である、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記ＳＩＧＬＥＣ−６レセプター調節因子が、ＳＩＧＬＥＣ−６を発現するＢ細胞においてアポトーシスを誘導するためのアポトーシス誘導部分に結合した抗ＳＩＧＬＥＣ−６抗体である、請求項６５に記載の方法。
  72. 前記アポトーシス誘導部分が、Ｂａｘ−α、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｅｒｋ、およびＢｏｋからなる群より選択されるＢｃｌ−２ファミリーのプロアポトーシスメンバーである、請求項７１に記載の方法
  73. 肥満細胞媒介性の疾患または障害を治療するための治療用または診断用の組成物を調製するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体の使用。
  74. Ｂ細胞リンパ腫のようなＢ細胞関連性の疾患または障害を治療するための治療用または診断用の組成物を調製するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体の使用。
JP2007527720A 2004-06-09 2005-06-09 Ｓｉｇｌｅｃ−６関連疾患の診断および処置 Withdrawn JP2008502368A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US57819404P 2004-06-09 2004-06-09
US58042204P 2004-06-17 2004-06-17
PCT/US2005/020271 WO2005124358A2 (en) 2004-06-09 2005-06-09 Diagnosis and treatment of siglec-6 associated diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2008502368A true JP2008502368A (ja) 2008-01-31

Family

ID=35510373

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2007527720A Withdrawn JP2008502368A (ja) 2004-06-09 2005-06-09 Ｓｉｇｌｅｃ−６関連疾患の診断および処置

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20080267973A1 (ja)
EP (1) EP1773882A4 (ja)
JP (1) JP2008502368A (ja)
AU (1) AU2005255423A1 (ja)
CA (1) CA2570034A1 (ja)
MX (1) MXPA06014388A (ja)
WO (1) WO2005124358A2 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022215566A1 (ja) * 2021-04-05 2022-10-13 国立大学法人筑波大学 アレルギー性疾患の予防又は治療剤

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11243213B2 (en) * 2015-11-05 2022-02-08 Wayne State University Kits and methods for prediction and treatment of preeclampsia
WO2018044238A1 (en) * 2016-08-31 2018-03-08 Agency For Science, Technology And Research Methods for the identification, targeting and isolation of human dendritic cell (dc) precursors "pre-dc" and their uses thereof
BR112020012830A2 (pt) * 2017-12-29 2021-01-26 Cornell University terapia genética para distúrbios eosinofílicos
CA3190797A1 (en) * 2020-08-10 2022-02-17 Julius-Maximilians-Universitat Wurzburg Siglec-6-binding polypeptides
CA3232225A1 (en) * 2021-09-16 2023-03-23 Allakos Inc. Anti-siglec-6 antibodies and methods of use thereof
WO2023086897A1 (en) * 2021-11-12 2023-05-19 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Siglec-6 antibodies, derivative compounds and related uses
WO2023240272A2 (en) * 2022-06-09 2023-12-14 Santa Ana Bio, Inc. Antibodies targeting c-kit and/or siglec and uses thereof
CN118127076A (zh) * 2024-04-30 2024-06-04 深圳华瑞模式生物科技有限公司 一种先兆子痫模型小鼠的构建方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001066126A1 (en) * 2000-03-07 2001-09-13 Smithkline Beecham Corporation Sialoadhesin factor-2 antibodies
EP1305417A2 (en) * 2000-07-21 2003-05-02 Bristol-Myers Squibb Company Siglec (sialic acid-binding ig-related lectin) polypeptides and uses thereof

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022215566A1 (ja) * 2021-04-05 2022-10-13 国立大学法人筑波大学 アレルギー性疾患の予防又は治療剤

Also Published As

Publication number Publication date
WO2005124358A3 (en) 2007-01-11
CA2570034A1 (en) 2005-12-29
AU2005255423A1 (en) 2005-12-29
US20080267973A1 (en) 2008-10-30
EP1773882A2 (en) 2007-04-18
WO2005124358A2 (en) 2005-12-29
MXPA06014388A (es) 2007-03-12
EP1773882A4 (en) 2008-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2022081543A (ja) 抗ｔｒｅｍ２抗体及びその使用方法
ES2848052T3 (es) Anticuerpos de unión dual anti-PD-L1 y PD-L2 de agente individual y métodos de uso
AU2007309229B2 (en) Anti-Notch3 agonist antibodies and their use in the treatment of Notch3-related diseases
US20100136030A1 (en) Antagonist ox40 antibodies and their use in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases
US20190085076A1 (en) Anti-cd33 antibodies and methods of use thereof
JP2008502368A (ja) Ｓｉｇｌｅｃ−６関連疾患の診断および処置
JP2010017187A (ja) Ａ３３抗原およびｊａｍ−ｉｔの使用
JP2010229156A (ja) 早期活性化分子のターゲティングに基づく免疫調節
WO2010085643A1 (en) Targeting il-7 signaling as a therapy for multiple sclerosis and other il-7 signaling dependent disorders
KR20230029611A (ko) T 세포를 선택적으로 조절하기 위한 이중특이적 분자
Fan et al. A humanized anti-osteopontin antibody protects from Concanavalin A induced-liver injury in mice
JP2007526747A (ja) ヒトマスト細胞発現膜タンパク質
WO2024073111A2 (en) Affinity binding entities directed to b7h6 and methods of use thereof
WO2024035953A9 (en) Affinity binding entities directed to psma and methods of use thereof
IL198079A (en) Anti-3 Notch Agonist Antibodies and Their Use in Preparing Drugs for the Treatment of 3 Notch

Legal Events

Date Code Title Description
A300 Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300

Effective date: 20080902