WO2022215566A1 - アレルギー性疾患の予防又は治療剤 - Google Patents

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WO2022215566A1
WO2022215566A1 PCT/JP2022/014790 JP2022014790W WO2022215566A1 WO 2022215566 A1 WO2022215566 A1 WO 2022215566A1 JP 2022014790 W JP2022014790 W JP 2022014790W WO 2022215566 A1 WO2022215566 A1 WO 2022215566A1
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clec12b
antibody
cells
allergic diseases
therapeutic agent
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PCT/JP2022/014790
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彰 澁谷
和正 金丸
綾菜 飯島
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国立大学法人筑波大学
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Definitions

  • the present invention relates to preventive or therapeutic agents for allergic diseases.
  • Mast cells are present in various organs such as skin, abdominal cavity, lungs, and intestines, and are involved in the development of allergic diseases and host defense against infectious diseases.
  • Mast cell precursors are generated in the bone marrow and then migrate to peripheral tissues where they differentiate into tissue-resident mast cells.
  • Mast cells can be classified into connective tissue type and mucosal type, and are present in various peripheral tissues such as nose, skin, peritoneal cavity, lung, and intestine not only in humans but also in mice (Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2).
  • Mast cells have cytoplasmic granules containing inflammatory molecules such as cytokines, histamines, proteases, chemokines and lipid mediators (Non-Patent Document 1). It has been suggested that mast cells in each organ have different functions, and that the components of inflammatory molecules contained in the granules are also different (Non-Patent Documents 2 and 3). Mast cells are stimulated by immune complexes of allergens and IgE, pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), damage-associated molecular patterns (DAMPs), inflammatory molecules, etc., causing activation and degranulation of mast cells, leading to peripheral It releases inflammatory molecules into tissues (Non-Patent Document 1).
  • PAMPs pathogen-associated molecular patterns
  • DAMPs damage-associated molecular patterns
  • inflammatory molecules etc.
  • Non-Patent Documents 2 and 4 Excessive activation of mast cells is known to be one of the causes of allergic diseases, but the regulatory mechanism of mast cell activation has not been fully elucidated. In addition, there are few reports on molecules selectively expressed in mast cells. In particular, among the molecules expressed in mast cells, molecules that are selectively expressed in tissues or cells are almost unknown. Antiallergic drugs that suppress the release of inflammatory molecules such as histamine from mast cells, antihistamine drugs that suppress the action of histamine, steroid drugs that suppress inflammation, and the like are known as prophylactic or therapeutic agents for allergic diseases. There is However, no approach targeting mast cells itself is known.
  • the Clec12b gene encodes the C-type lectin receptor family 12B (Clec12b; C-type lectin domain family 12 member B).
  • the C-type lectin receptor family is a type of immunoreceptor that binds sugar chains in a calcium-dependent manner.
  • recognition of fungal lectins contributes to host defense against fungi (Non-Patent Document 5).
  • Clec12b has an immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif (ITIM), and human CLEC12b has been shown to recruit phosphatases (SHP-1 and SHP-2) to the ITIM (non WO 2004/010200, Clec12b has been suggested to be an inhibitory receptor.
  • ITIM immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif
  • SHP-1 and SHP-2 phosphatases
  • the immune complex CTA1-DD/IgG adjuvant specifically targets connective tissue mast cells through Fc ⁇ RIIIA and augments anti -HPV immunity after nasal immunization.
  • an object of the present invention is to find a molecule that is selectively expressed in mast cells and to provide a preventive or therapeutic agent for allergic diseases that targets the molecule.
  • the present inventors have diligently studied to solve the above problems. As a result, the inventors have found that the above problems can be solved by having the following configuration, and have completed the present invention.
  • the present invention relates to, for example, the following [1] to [8].
  • the preventive or therapeutic agent for allergic diseases of [2] wherein the Clec12b-expressing cells are mast cells.
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • the agent for preventing or treating an allergic disease of [7], wherein the allergic skin disease is at least one selected from atopic dermatitis, contact dermatitis, and urticaria.
  • a preventive or therapeutic agent for allergic diseases can be provided.
  • FIG. 1 is a photograph showing the expression of Clec12b in human skin mast cells.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable region of TX109.
  • FIG. 3 shows the amino acid sequence of the light chain variable region of TX109.
  • FIG. 4 is a graph showing the binding properties of TX109 by ELISA.
  • FIG. 5 is a histogram showing the binding profile of TX109 to mouse Clec12b by flow cytometry.
  • FIG. 6 is a histogram showing the results of isotype analysis of TX109 by flow cytometry.
  • FIG. 7 shows the results of immunoprecipitation and Western blotting using TX109.
  • FIG. 8-1 is a dot plot and histogram showing the analysis of immune system cells expressing mouse Clec12b.
  • FIG. 8-1 is a dot plot and histogram showing the analysis of immune system cells expressing mouse Clec12b.
  • FIG. 8-2 is a continuation of FIG. 8-1.
  • FIG. 8-3 is a continuation of FIG. 8-2.
  • FIG. 8-4 is a continuation of FIG. 8-3.
  • FIG. 8-5 is a continuation of FIG. 8-4.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of evaluating the cytotoxic activity of TX109 against Clec12b-expressing RMA cells.
  • FIG. 10 shows an experimental schedule for efficacy of anti-Clec12b in a dermatitis model induced by mite antigen application.
  • FIG. 11 is a photomicrograph of a hematoxylin-eosin-stained or toluidine blue-stained skin section.
  • FIG. 12 is a graph showing epidermal thickness and mast cell number per unit area (mm 2 ).
  • FIG. 13 is a graph showing scores for skin inflammation symptoms. The horizontal axis of the graph is the number of days (days), and the vertical axis is the score.
  • Clec12b antibody or antibody fragment thereof The origin of Clec12b (C-type lectin domain family 12 member B) in the present invention is not particularly limited as long as it is an organism expressing Clec12b, and may be mice, rats, hamsters, guinea pigs, dogs, pigs, monkeys or humans. including those derived from primate mammals, including Clec12b is preferably human Clec12b or mouse Clec12b, more preferably human Clec12b.
  • the anti-Clec12b antibody is not particularly limited as long as it has activity to specifically bind to Clec12b.
  • a commercially available or known anti-Clec12b antibody may be used, TX109, which is an anti-Clec12b antibody established in the examples of the present specification, may be used, or newly prepared by various known methods.
  • Known anti-Clec12b antibodies include rabbit anti-human Clec12b polyclonal antibody (NO.ab211452) manufactured by Abcam, mouse anti-human Clec12b monoclonal antibody disclosed in Non-Patent Document 6, and the like.
  • TX109 established in the Examples herein, is an anti-Clec12b antibody having a heavy chain variable region having the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 and a light chain variable region having the amino acid sequence of SEQ ID NO:2.
  • the activity of specifically binding to Clec12b means the activity of specifically binding to Clec12b protein.
  • “specifically bind” means that it binds to Clec12b protein but does not bind to protein other than Clec12b protein.
  • the binding activity can be measured by known methods such as immunoprecipitation, Western blotting, EIA (enzyme immunoassay), ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), flow cytometry, pull-down assay, and the like.
  • the anti-Clec12b antibody may be an antibody that inhibits the binding of Clec12b to its ligand or an antibody that does not inhibit the binding of Clec12b to its ligand, but an antibody that inhibits the binding of Clec12b to its ligand is preferred.
  • the anti-Clec12b antibody may be an antibody that inhibits or reduces Clec12b signaling (anti-Clec12b neutralizing antibody) or an antibody that does not inhibit or reduce Clec12b signaling. Non-reducing antibodies are preferred.
  • An anti-Clec12b antibody may be an antibody that does not inhibit or reduce Clec12b signaling mediated by the ITIM of Clec12b.
  • Clec12b consists of an intracellular domain, a transmembrane domain, and an extracellular domain.
  • the anti-Clec12b antibody is preferably an antibody that binds to all or part of the extracellular domain of Clec12b.
  • the extracellular region of Clec12b is, for example, the 65th to 276th amino acids in the amino acid sequence (276 amino acids) of human Clec12b, and the 65th to 275th amino acids in the amino acid sequence (275 amino acids) of mouse Clec12b. be.
  • the anti-Clec12b antibody preferably binds to a site with high affinity for Clec12b.
  • Anti-Clec12b antibodies may be mouse antibodies, rat antibodies, guinea pig antibodies, hamster antibodies, rabbit antibodies, monkey antibodies, dog antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, or human antibodies.
  • the animals to be immunized to be used for the production of anti-Clec12b antibodies are not particularly limited, but are, for example, mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, monkeys and dogs, preferably mice, rats and rabbits.
  • Immunized animals used for the preparation of anti-Clec12b antibodies are genetically modified non-human animals in which expression of the Clec12b gene is lost by introducing mutations into the Clec12b gene or the expression control region of the Clec12b gene in the genome, so-called Clec12b knockouts. It may be a non-human animal.
  • Clec12b knockout non-human animal is used as an immunized animal
  • Clec12b of the same animal species can be used as an antigen.
  • a mouse anti-mouse Clec12b antibody can be produced using mouse Clec12b as an antigen.
  • Antigens suitable for the preparation of anti-Clec12b antibodies include, for example, cells in which Clec12b is forcibly expressed by an expression vector, Clec12b expression plasmid vectors, Clec12b recombinant proteins prepared using Clec12b expression virus vectors (such as adenovirus vectors), and the like. etc.
  • the Clec12b recombinant protein may be fused with other proteins, tagged, or the like. From the viewpoint of protein stability, the Clec12b recombinant protein is preferably fused with IgGFc or the like to form a chimeric protein.
  • Antigens used for preparation of anti-Clec12b antibodies may be used singly or in combination of two or more.
  • a cell in which Clec12b is forcibly expressed may be used in combination with a Clec12b recombinant protein.
  • the anti-Clec12b antibody may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody because it is easy to keep the titer constant.
  • a polyclonal antibody can be produced by a known method. For example, by immunizing an appropriate animal with an antigen protein or a mixture of an antigen protein and a carrier protein, collecting an antibody-containing material against the antigen protein from the immunized animal, and separating and purifying the antibody as necessary. can be made. Animals used generally include mice, rats, sheep, goats, rabbits and guinea pigs. Complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, or the like can be administered together with the antigen protein in order to enhance antibody-producing ability. Administration is generally carried out about once every two weeks, for a total of about 3 to 10 times. Polyclonal antibodies can be collected from blood, ascitic fluid, etc.
  • the polyclonal antibody titer in antiserum can be measured by ELISA method. Separation and purification of polyclonal antibodies are performed by, for example, a purification method using an antigen-binding solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G, a salting-out method, an alcohol precipitation method, an isoelectric precipitation method, an electrophoresis method, and an ion exchange method. It can be carried out according to immunoglobulin separation and purification methods such as adsorption/desorption by the body, ultracentrifugation, and gel filtration.
  • a monoclonal antibody can be produced by a known method. Specifically, the antigen is injected subcutaneously, intramuscularly, intravenously, in the footpad or intraperitoneally into mammals, preferably mice, rats, hamsters, guinea pigs or rabbits, optionally together with an adjuvant, once to several times. Immunization is given by injection.
  • Adjuvants are not particularly limited, and complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, sodium hydroxide, aluminum hydroxide (Alum), calcium phosphate, aluminum phosphate, alum, Hepes, carboxyvinyl polymer, etc. can be used.
  • Aluminum oxide (Alum) is preferred.
  • immunizations are performed about every month after the first immunization, and antibody-producing cells can be obtained from the immunized mammal about 3 to 4 days after the final immunization.
  • the number of immunizations and the time interval may be appropriately changed depending on the properties of the immunogen used.
  • a hybridoma that secretes a monoclonal antibody can be prepared according to the method of Koehler and Milstein et al. (Nature, 1975, vol. That is, antibody-producing cells contained in spleen, lymph node, bone marrow, tonsil, etc., preferably spleen obtained from mammals immunized as described above, and preferably mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, humans, etc. mammals, more preferably mouse, rat or human-derived myeloma cells that are incapable of producing autoantibodies.
  • mice As myeloma cells used for cell fusion, established cell lines obtained from mice, such as P3-U1, NS-1, SP2/0, 653, X63, AP-1, etc. can be used.
  • Hybridoma clones producing monoclonal antibodies are screened by culturing the hybridomas in, for example, a microtiter plate, and measuring the reactivity of the culture supernatant of wells in which proliferation is observed with the antigen used in the mouse immunization described above by RIA, It is measured by an assay method such as ELISA, FACS, etc., and is performed by selecting clones that produce monoclonal antibodies that specifically bind to the antigen. Then, a method is usually used in which the antigen is immobilized and the antibody in the culture supernatant that binds thereto is detected with a secondary antibody labeled with a radioactive substance, a fluorescent substance, an enzyme, or the like.
  • a hybridoma culture supernatant is added to the cells, followed by reaction with a fluorescently-labeled secondary antibody.
  • Monoclonal antibodies capable of binding to the antigen of the present invention can be detected by measuring fluorescence intensity.
  • Monoclonal antibodies can be produced from selected hybridoma clones by culturing hybridomas in vitro or in ascitic fluid of mice, rats, guinea pigs, hamsters or rabbits, preferably mice or rats, more preferably mice, and It can be performed by isolating from the obtained culture supernatant or mammalian ascitic fluid.
  • hybridomas are grown, maintained and preserved according to various conditions such as the characteristics of the cell type to be cultured, the purpose of the test research and the culture method, and monoclonal antibodies are produced in the culture supernatant. Any nutrient medium derived from a known nutrient medium or a known basal medium, such as those used for the method, can be used.
  • Isolation and purification of the monoclonal antibody is performed by subjecting the above-mentioned culture supernatant or ascites to saturated ammonium sulfate, ion exchange chromatography (DEAE or DE52, etc.), anti-immunoglobulin column, protein A column, protein G column, or other affinity column chromatography. It can be done by providing it to
  • an antibody gene is cloned from an antibody-producing cell such as a hybridoma, incorporated into an appropriate vector, introduced into a host, and a recombinant antibody produced using genetic recombination technology is used. good too.
  • mRNA encoding the antibody variable region is isolated from hybridomas that produce the antibody of interest or immune cells that produce the antibody, such as sensitized lymphocytes that have been immortalized by oncogenes or the like. do.
  • total RNA is prepared by a known method such as guanidine ultracentrifugation, and mRNA is prepared using mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia) or the like.
  • cDNA of the antibody variable region is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase. cDNA synthesis can be performed using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit or the like.
  • a 5'-Ampli FINDER RACE Kit manufactured by Clontech
  • a 5'-RACE method using PCR can be used to synthesize and amplify cDNA.
  • a DNA fragment of interest is purified from the resulting PCR product and ligated with vector DNA.
  • a recombinant vector is prepared from this, introduced into Escherichia coli or the like, colonies are selected, and the desired recombinant vector is prepared.
  • the base sequence of the DNA of interest is confirmed by a known method such as the deoxy method.
  • DNA encoding the variable region of the antibody of interest can be ligated with the DNA encoding the desired antibody constant region and incorporated into an expression vector.
  • DNA encoding the antibody variable region may be incorporated into an expression vector containing antibody constant region DNA.
  • the antibody gene is incorporated into an expression vector such that it is expressed under the control of an expression control region, eg, an enhancer/promoter. This expression vector can then be used to transform a host cell to express the antibody.
  • Antibody gene expression may be carried out by incorporating antibody heavy or light chains separately into expression vectors and simultaneously transforming the host, or by incorporating DNAs encoding the heavy and light chains into a single expression vector. may be used to transform the host.
  • phage display method As a method for producing antibodies, the so-called phage display method (Nature Biotechnology 23, 1105 (2005)) may be used. Specifically, for example, an antibody gene library prepared by a known method using human or animal (eg, rabbit, mouse, rat, hamster, etc.) B lymphocytes, or human or animal Germ Line sequences are selected. , and modified and completely synthesized antibody gene libraries are displayed on the cell surface of bacteriophage, E. coli, yeast, animal cells, etc., or on ribosomes. At this time, the forms of antibodies to be displayed on the cell surface include IgG molecules, IgM molecules, Fab fragments, single-chain Fv (scFv) fragments, and the like.
  • the antibody fragment gene thus obtained can be recombined with the corresponding region of the IgG antibody gene by a known method to obtain the antibody gene. Then, the gene thus obtained can be incorporated into an appropriate vector, introduced into a host, and an antibody produced using gene recombination technology.
  • the anti-Clec12b antibody is an antibody containing a human Fc region, an antibody containing a human constant region, a human chimeric antibody (hereinafter simply referred to as a chimeric antibody), a humanized antibody (human Also referred to as CDR-grafted antibodies) and genetically engineered antibodies such as human antibodies.
  • a chimeric antibody comprises a non-human animal antibody heavy chain variable region (hereinafter also referred to as VH) and a light chain variable region (hereinafter also referred to as VL) and a human antibody heavy chain constant region (hereinafter also referred to as CH). and a light chain constant region (hereinafter also referred to as CL).
  • VH non-human animal antibody heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • CH human antibody heavy chain constant region
  • CL light chain constant region
  • the type of animal for the variable region is not particularly limited as long as it is an animal such as mouse, rat, hamster, rabbit, etc. in which hybridomas can be produced.
  • Anti-Clec12b human chimeric antibody obtains cDNAs encoding VH and VL of a non-human animal antibody that specifically binds to human Clec12b, and inserts them into expression vectors having genes encoding human antibody CH and CL, respectively. It can be produced by inserting to construct a human chimeric antibody expression vector, introducing it into animal cells, and expressing it.
  • the CH of the human chimeric antibody is not particularly limited as long as it is a human immunoglobulin (hereinafter also referred to as hIg), but is preferably of the hIgG class.
  • the CL of the human chimeric antibody is not particularly limited as long as it belongs to hIgG.
  • a humanized antibody is an antibody in which the VH and VL CDRs of a non-human animal antibody are grafted into the appropriate positions of the VH and VL of a human antibody.
  • An anti-Clec12b humanized antibody is a variable region obtained by grafting the VH and VL CDRs of a non-human animal antibody that specifically binds to Clec12b into the VH and VL frameworks (hereinafter also referred to as FRs) of any human antibody. (hereinafter also referred to as the V region), constructing a humanized antibody expression vector by inserting it into an expression vector having DNA encoding the CH and CL of a human antibody, and introducing it into an animal cell. It can be produced by expression.
  • the amino acid sequences of FRs of VH and VL of human antibodies are not particularly limited as long as they are amino acid sequences derived from human antibodies.
  • the CH of the humanized antibody is not particularly limited as long as it is hIg, but is preferably of the hIgG class.
  • the CL of the humanized antibody is not particularly limited as long as it belongs to hIg.
  • Anti-Clec12b antibodies preferably have effector activity.
  • Effective activity is an activity expressed through the Fc region of an antibody, antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity, complement-dependent cytotoxicity (CDC) activity such as cytotoxic activity, macrophages, dendritic cells
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • ADCP antibody-dependent cell-mediated phagocytosis
  • the anti-Clec12b antibody is preferably an antibody having cytotoxic activity against Clec12b-expressing cells, more preferably an antibody having antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity against Clec12b-expressing cells.
  • Anti-Clec12b antibodies typically have effector activity, particularly ADCC activity, provided that the isotype of the antibody is IgG.
  • the strength of the effector activity varies depending on the isotype of the antibody and the species from which the antibody is derived, but IgG, especially IgG1, has high activity.
  • the effector activity of anti-Clec12b antibodies may be regulated by known methods.
  • the anti-Clec12b antibody is preferably an antibody that removes Clec12b-expressing cells.
  • anti-Clec12b antibodies include antibodies having activity (also referred to as neutralizing activity or antagonist activity) to suppress activation of Clec12b-expressing cells (cell proliferation, migration, invasion and/or degranulation, etc.), or Clec12b Antibodies having apoptosis-inducing activity and/or cytotoxic activity for expressing cells are included.
  • the anti-Clec12b antibody is preferably an antibody that eliminates Clec12b-expressing cells by cytotoxic activity.
  • the anti-Clec12b antibody may be an antibody that inhibits Clec12b-dependent signal transduction, thereby causing cell growth inhibition and/or apoptosis induction of Clec12b-expressing cells, and eliminating Clec12b-expressing cells by cytotoxic activity.
  • the anti-Clec12b antibody may be a recycling antibody, a sweeping antibody, a bispecific antibody, a T-cell redirecting antibody modified for the purpose of improving blood retention of the antibody or antigen, or polyethylene glycol. It may be a modified antibody bound to various molecules such as (PEG)
  • anti-Clec12b antibody commercially available or known anti-Clec12b antibody variants, chimeric antibodies, humanized antibodies, etc. may be used.
  • the anti-Clec12b antibody or antibody fragment thereof may be mixed with one or more pharmaceutically acceptable carriers to prepare a pharmaceutical composition containing the anti-Clec12b antibody or antibody fragment thereof.
  • the isotype of the anti-Clec12b antibody is not particularly limited.
  • the heavy chain constant region of the anti-Clec12b antibody may be any one of IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, etc., but is preferably IgG, more preferably IgG1, since it has high effector activity. belongs to.
  • the light chain constant region of the anti-Clec12b antibody may be either Ig ⁇ chain or Ig ⁇ chain, preferably Ig ⁇ chain.
  • One anti-Clec12b antibody may be used alone, or two or more may be used in combination.
  • the method for evaluating ADCC activity is not particularly limited, and a known method, for example, coexistence of effector cells (NK cells, PBMC; peripheral blood mononuclear cells, etc.) and target cells (Clec12b-expressing cells), effector cells, target cells can be evaluated by a method that detects cytotoxicity of cells.
  • Effector cells may be cells stimulated with, for example, IL-2, Poly(I:C), and the like. Cytotoxicity of target cells is measured, for example, by allowing the target cells to incorporate a radioactive isotope (Cr 51 ) or a fluorescent substance (calcein), and measuring the amount of the radioactive isotope or fluorescent substance released from the lysed target cells.
  • ADCC activity may be evaluated by the cytotoxic activity of effector cells, for example, the expression level of degranulation markers such as CD107a, or the expression level or production level of cytokines such as IFN- ⁇ in effector cells is measured. can be evaluated in a way that
  • ADCC activity instead of effector cells, using cells introduced luciferase gene driven by Fc ⁇ receptor variant and NFAT (Nuclear Factor of Activated T cells) response element, measuring the luminescence signal of firefly luciferase, etc. can also be measured with a reporter assay.
  • an anti-Clec12b antibody can be said to have ADCC activity if it induces cytotoxicity of target cells by effector cells.
  • an anti-Clec12b antibody increases the expression level of CD107a or IFN- ⁇ in effector cells in the presence of target cells, it can be said that the anti-Clec12b antibody has ADCC activity.
  • the method for evaluating CDC activity is not particularly limited, and a known method, for example, coexisting complement (complement derived from human serum, etc.) and target cells (Clec12b-expressing cells), and detecting cytotoxicity of target cells by complement.
  • Cytotoxicity of target cells is detected by a method in which a radioactive isotope (Cr 51 ) or a fluorescent substance (calcein) is incorporated into the target cells and the amount of the radioactive isotope or fluorescent substance released from the lysed target cells is measured.
  • CDC activity can also be measured by a reporter assay using reporter gene-introduced cells instead of effector cells.
  • an anti-Clec12b antibody can be said to have CDC activity if the anti-Clec12b antibody induces the cytotoxic activity of complement against target cells.
  • the method for evaluating ADCP activity is not particularly limited, and is evaluated by a known method, for example, coexistence of effector cells (macrophages, etc.) and target cells (Clec12b-expressing cells), and detection of phagocytosis of target cells by effector cells.
  • Phagocytosis of target cells by effector cells can be evaluated by a method of fluorescently labeling effector cells and target cells and measuring uptake of target cells by effector cells by flow cytometry or by microscopic observation.
  • ADCP activity instead of effector cells, using cells introduced luciferase gene driven by Fc ⁇ receptor variant and NFAT (Nuclear Factor of Activated T cells) response element, measuring the luminescence signal of firefly luciferase, etc. can also be measured with a reporter assay.
  • an anti-Clec12b antibody can be said to have ADCP activity if it induces phagocytosis of target cells by effector cells.
  • the anti-Clec12b antibody fragment is not particularly limited as long as it is a fragment of each anti-Clec12b antibody described above and has activity to specifically bind to Clec12b, that is, a fragment having antigen-binding activity.
  • Types of antibody fragments include, for example, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, diabodies, dsFv, and peptides containing CDRs.
  • Anti-Clec12b antibody Fab is an antibody fragment with a molecular weight of about 50,000 and having antigen-binding activity, among the fragments obtained by treating IgG with papain (proteolytic enzyme).
  • Anti-Clec12b antibody Fab can be produced by treating the anti-Clec12b antibody with papain, or by inserting DNA encoding the Fab of the antibody into an expression vector, introducing this vector into a prokaryote or eukaryote and expressing it. can be made.
  • F(ab')2 is an antibody fragment with a molecular weight of about 100,000 and having antigen-binding activity among fragments obtained by treating IgG with pepsin (proteolytic enzyme).
  • F(ab')2 of the anti-Clec12b antibody can be generated by treating the anti-Clec12b antibody with pepsin or by linking Fab' (described below) with a thioether bond or disulfide bond.
  • Fab' is an antibody fragment having a molecular weight of about 50,000 and having antigen-binding activity, which is obtained by cleaving the disulfide bond of the hinge region of F(ab')2.
  • Fab' of anti-Clec12b antibody can be obtained by treating F(ab')2 of anti-Clec12b antibody with dithiothreitol, or inserting DNA encoding Fab' of the antibody into an expression vector, and using this vector as a prokaryotic or eukaryotic organism. It can be produced by introducing into nuclear organisms and expressing them.
  • a scFv is an antibody fragment having antigen-binding activity in which one VH and one VL are linked using an appropriate peptide linker.
  • the scFv of anti-Clec12b antibody is obtained by obtaining cDNA encoding VH and VL of anti-Clec12b antibody, constructing DNA encoding scFv, inserting this DNA into an expression vector, and inserting this expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism. It can be produced by introducing into and expressing.
  • a diabody is an antibody fragment obtained by dimerizing scFv and having bivalent antigen-binding activity.
  • Anti-Clec12b antibody diabody obtains cDNA encoding VH and VL of anti-Clec12b antibody, constructs DNA encoding diabody, inserts this DNA into an expression vector, and inserts this expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism It can be produced by introducing into and expressing.
  • a dsFv is an antibody fragment in which polypeptides in which one amino acid residue in each of VH and VL is substituted with a cysteine residue are linked via a disulfide bond between cysteine residues.
  • Anti-Clec12b antibody dsFv is obtained by obtaining cDNA encoding VH and VL of anti-Clec12b antibody, constructing DNA encoding dsFv, inserting this DNA into an expression vector, and inserting this expression vector into a prokaryote or eukaryote It can be produced by introducing into and expressing.
  • a peptide containing CDRs is a peptide containing at least one region or more of CDRs of VH or VL.
  • a peptide containing the CDRs of the anti-Clec12b antibody constructs DNA encoding the VH and VL CDRs of the anti-Clec12b antibody, inserts this DNA into an expression vector, and introduces this expression vector into a prokaryote or eukaryote. It can be produced by expression.
  • Peptides containing the CDRs of the anti-Clec12b antibody can also be produced by chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). Preferred are peptides containing 6 CDRs derived from anti-Clec12b antibody.
  • Anti-Clec12b antibody fragments may be used singly or in combination of two or more. Alternatively, an anti-Clec12b antibody and a fragment thereof may be used in combination.
  • the Clec12b-expressing cell is not particularly limited as long as it is a cell expressing Clec12b.
  • Clec12b-expressing cells include, for example, immune-related cells, more specifically Pro-B cells, Pre-B cells, B cells, Pre-T cells, T cells, NK cells, ⁇ T cells, ILC (Innate Lymphoid Cell) , dendritic cells, macrophages, monocytes, mast cell lineage cells (mast cells and mast cell precursors (c-Kit ⁇ Fc ⁇ RI ⁇ ⁇ cells)), eosinophils, basophils and the like.
  • immune-related cells more specifically Pro-B cells, Pre-B cells, B cells, Pre-T cells, T cells, NK cells, ⁇ T cells, ILC (Innate Lymphoid Cell) , dendritic cells, macrophages, monocytes, mast cell lineage cells (mast cells and mast cell precursors (c-Kit ⁇ Fc ⁇ RI ⁇ ⁇ cells
  • Clec12b-expressing cells are preferably colon, heart, kidney, liver, lung, mammary gland, ovary, spleen, testis, or skin Pro-B cells, Pre-B cells, B cells, Pre-T cells, T cells, NK cells, ⁇ T cells, ILCs (Innate Lymphoid Cells), dendritic cells, macrophages, monocytes, mast cell lineage cells (mast cells and mast cell precursors (c-Kit ⁇ Fc ⁇ RI ⁇ ⁇ cells)), eosinophils spheres, or basophils.
  • Clec12b-expressing cells are preferably mast cell lineage cells (mast cells and mast cell precursors (c-Kit ⁇ Fc ⁇ RI ⁇ ⁇ cells)), more preferably obesity, since Clec12b is highly expressed. are cells.
  • Clec12b-expressing cells are preferably skin mast cell lineage cells (skin mast cells and skin mast cell precursors (c-Kit ⁇ Fc ⁇ RI ⁇ ⁇ cells)). , more preferably skin mast cells.
  • Mast cells are divided into mucosal-type mast cells (mast cells containing only tryptase) and connective tissue-type mast cells (mast cells containing tryptase, chimase, carboxypeptidase, and cathepsin G-like proteases) based on the difference in proteases present in granules. It is classified into two subtypes. Said skin mast cells are preferably connective tissue type mast cells, since most human skin mast cells are connective tissue type mast cells.
  • Clec12b-expressing cells may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • the method for confirming the expression of Clec12b is not particularly limited, and includes known methods such as detection of the Clec12b gene by PCR and detection of the Clec12b protein by Western blotting, ELISA, flow cytometry, and the like.
  • the preventive or therapeutic agent for allergic diseases of the present invention contains an anti-Clec12b antibody or antibody fragment thereof, and is effective for preventing or treating allergic diseases. As shown in the Examples, the inventors found that the expression of Clec12b is selective for mast cells among immune-related cells, especially for cutaneous mast cells.
  • mast cells are greatly involved in the onset and exacerbation of allergic diseases. For example, the number of mast cells is increased in the skin of patients with atopic dermatitis (Yoshimichi Okayama, Role of Mast Cells in Human Skin Allergic Diseases, Veterinary Clinical Dermatology 21 (3): 137-141 2015). Therefore, when an anti-Clec12b antibody or an antibody fragment thereof binds to Clec12b on the cell membrane of Clec12b-expressing cells, the effector function of the anti-Clec12b antibody eliminates Clec12b-expressing cells, thereby preventing or treating allergic diseases. .
  • the preventive or therapeutic agent for allergic diseases of the present invention containing an anti-Clec12b antibody or an antibody fragment thereof hardly acts on other immune-related cells, and is selective for mast cells. , especially on cutaneous mast cells. Therefore, the preventive or therapeutic agent for allergic diseases of the present invention is presumed to have few side effects.
  • the prophylactic or therapeutic agent for allergic diseases of the present invention may be any pharmaceutical composition containing an anti-Clec12b antibody or antibody fragment thereof as an active ingredient, but usually one or more pharmaceutically acceptable It is desired to provide a pharmaceutical formulation prepared by any method well known in the art of pharmaceutical science by mixing with a carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, physiological saline, phosphate-buffered saline, phosphate-buffered saline glucose solution, and buffered saline.
  • Antibodies may be lyophilized (freeze-dried) and reconstituted when needed by the addition of an aqueous buffer solution as described above.
  • the administration route of the preventive or therapeutic agent for allergic diseases of the present invention is not particularly limited, and includes intravenous injection, intraperitoneal, oral, nasal, transmucosal, intramuscular or subcutaneous, intranasal, intratracheal, dermal, transdermal or Administration can be by intradermal routes. Intravenous administration or intraperitoneal administration is preferred.
  • the dosage form of the preventive or therapeutic agent for allergic diseases of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include tablet, granule, spray, capsule, syrup, emulsion, suppository, injection, ointment, and tape. mentioned.
  • Capsules, tablets, powders, granules, etc. contain excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol; disintegrants such as starch and sodium alginate; lubricants such as magnesium stearate and talc; It can be produced using binders such as propylcellulose and gelatin; surfactants such as fatty acid esters; plasticizers such as glycerin, etc., as additives.
  • Liquid preparations such as emulsions and syrups may contain water, sugars such as sucrose, sorbitol, fructose; glycols such as polyethylene glycol, propylene glycol; oils such as sesame oil, olive oil, soybean oil; Preservatives such as esters; flavors such as strawberry flavor and peppermint can be used as additives for production.
  • sugars such as sucrose, sorbitol, fructose
  • glycols such as polyethylene glycol, propylene glycol
  • oils such as sesame oil, olive oil, soybean oil
  • Preservatives such as esters
  • flavors such as strawberry flavor and peppermint can be used as additives for production.
  • Injections include water, sugars such as sucrose, sorbitol, xylose, trehalose and fructose; sugar alcohols such as mannitol, xylitol and sorbitol; buffers such as phosphate buffers, citrate buffers and glutamic acid buffers; fatty acid esters Surfactants such as can be used as additives.
  • the dose (effective dose) of the preventive or therapeutic agent for allergic diseases of the present invention is not particularly limited, but is preferably 0.1 to 100 mg, more preferably 0.5 mg to 50 mg, per 1 kg body weight per administration. More preferably, 1 mg to 10 mg of anti-Clec12b antibody may be administered once to several times a day.
  • the total number of administrations and administration frequency are also not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the type of allergic disease, severity of symptoms, administration subject (age, sex, body weight, etc.), administration route, and the like.
  • the administration may be a single dose, may be carried out continuously every day, or may be carried out at intervals of several days for one to several weeks.
  • Allergic diseases that can be treated with the preventive or therapeutic agent for allergic diseases of the present invention are not particularly limited, and include all allergic diseases.
  • the allergic diseases include, for example, anaphylactic shock, bronchial asthma, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, drugs, insect allergies, food allergies, contact dermatitis, urticaria, atopic dermatitis, allergic diseases including hay fever. Examples include rhinitis.
  • Allergic diseases that can be treated with the preventive or therapeutic agent for allergic diseases of the present invention are preferably allergic diseases involving mast cells, since Clec12b is highly expressed in mast cells.
  • Allergic diseases involving mast cells include, for example, anaphylactic shock, bronchial asthma, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, drug allergy, food allergy, urticaria, contact dermatitis, and atopic dermatitis.
  • allergic diseases treatable by the preventive or therapeutic agent for allergic diseases of the present invention are preferably skin allergic diseases involving mast cells.
  • Skin allergic diseases involving mast cells include, for example, atopic dermatitis, contact dermatitis and urticaria.
  • Treatment includes curing a disease or symptom as well as alleviating (relieving) it. It also includes preventing its recurrence later.
  • the subject of administration of the preventive or therapeutic agent for allergic diseases of the present invention may be human or non-human (for example, mammals such as mice), preferably human, more preferably allergic disease.
  • the preventive or therapeutic agent for allergic diseases of the present invention can be used in combination with other drugs, for example, other preventive or therapeutic agents for allergic diseases.
  • the preventive or therapeutic agent for allergic diseases of the present invention is used in combination with another preventive or therapeutic agent for allergic diseases, the preventive or therapeutic agent for allergic diseases is more effective than the preventive or therapeutic agent for allergic diseases of the present invention alone. effect is likely to increase.
  • the types of agents for preventing or treating other allergic diseases are not limited, for example, antihistamines, chemical mediator release inhibitors, antileukotriene agents, thromboxane A2 inhibitors, Th2 cytokine inhibitors, nasal steroid drops, and vasoconstrictors.
  • ⁇ 2 receptor stimulant LABA
  • ⁇ 2 receptor stimulant SABA
  • steroid inhalant theophylline preparation
  • anticholinergic drug adrenaline
  • immunosuppressant anaphylaxis co-therapeutic agent (adrenaline).
  • Other preventive or therapeutic agents for allergic diseases may be used singly or in combination of two or more.
  • One embodiment of the present invention is a method of preventing or treating allergic disease comprising administering to a subject an effective amount of an anti-Clec12b antibody or antibody fragment thereof. Further, one embodiment of the present invention provides a method for preventing or treating allergic diseases, comprising administering to a subject an effective amount of an anti-Clec12b antibody or antibody fragment thereof that has cytotoxic activity against Clec12b-expressing cells. be. Furthermore, one embodiment of the present invention provides a method for preventing or treating skin allergic diseases, comprising administering to a subject an effective amount of an anti-Clec12b antibody or antibody fragment thereof having cytotoxic activity against skin mast cells. is.
  • One embodiment of the invention is an anti-Clec12b antibody or antibody fragment thereof for use in the prevention or treatment of allergic diseases. Also one embodiment of the present invention is an anti-Clec12b antibody or antibody fragment thereof having cytotoxic activity against Clec12b-expressing cells for use in the prevention or treatment of allergic diseases. Further, one embodiment of the present invention is an anti-Clec12b antibody or antibody fragment thereof having cytotoxic activity against cutaneous mast cells for use in the prevention or treatment of skin allergic diseases.
  • Example 1 Expression of Clec12b in human skin mast cells (Methods) In accordance with the Declaration of Helsinki, subjects provided written informed consent prior to testing. In addition, this test was conducted with the approval of the Ethics Committee of the University of Tsukuba. Human skin specimens obtained from healthy volunteers (University of Tsukuba Hospital) were treated with control mIgG, or anti-human b-tryptase monoclonal antibody (Abcam, NO.ab2378, clone AA1) and anti-human Clec12b polyclonal antibody (Abcam). , NO.ab211452) was used as a primary antibody, stained with Opal 4-Color Automation IHC Kit (manufactured by PerkinElmer), and observed under a fluorescence microscope.
  • FIG. Scale bar is 100 ⁇ m.
  • the image stained with anti-human Clec12b polyclonal antibody green, hCLEC12B
  • overlapped with the image stained with anti-human b-tryptase monoclonal antibody red, ⁇ -tryptase
  • b-Tryptase is an enzyme in mast cell granules that is specifically expressed in human cutaneous mast cells.
  • Human skin tissue contains more macrophages and the like than mast cells, but almost all of the cells stained with anti-human Clec12b polyclonal antibody are cells stained with anti-human b-tryptase monoclonal antibody.
  • hClec12b is not expressed in human skin cells other than mast cells (eg, macrophages), or the expression level is extremely low. That is, it was revealed that hClec12b is selectively expressed in mast cells in human skin.
  • Example 2 Establishment of anti-mouse Clec12b monoclonal antibody (TX109) (1) Mouse C57BL/6N mice were obtained from CLEA Japan, Inc.; (Tokyo) and reared under specific pathogen-free conditions at the Animal Resource Center, University of Tsukuba.
  • RMA cells stably expressing Flag-tagged mouse Clec12b (mouse Clec12b with a Flag tag attached to its C-terminus) were used as mouse Clec12b-expressing RMA cells.
  • non-transfected RMA cells were used as parental RMA cells.
  • Mouse Clec12b-expressing RMA cells or parental RMA cells were stained with hybridoma culture supernatants, analyzed by flow cytometry, screened for hybridomas producing antibodies that specifically bind to mClec12b, and selected clones were identified as clone TX109. and The antibody produced by clone TX109 is referred to as TX109.
  • Anti-Clec12b antibody was purified using HiTrap Protein G (manufactured by Merck, NO. also called).
  • Example 3 Characterization of TX109 (1) Evaluation of binding characteristics of TX109 by ELISA method (Method) A chimeric protein (Clec12a-Fc) obtained by fusing the extracellular portion of mouse Clec12a (65th to 267th amino acids out of 267 amino acids of mouse Clec12a full length) and the N-terminal Fc portion of human IgG (Kanemaru et al, Science Immunol 4: prepared according to the method described in aax6908, 2019).
  • a chimeric protein (Clec1b-Fc) obtained by fusing the extracellular portion of mouse Clec1a (74th to 280th amino acids out of the total 280 amino acids of mouse Clec1a) and the N-terminal Fc portion of human IgG (Kanemaru et al, Science Immunol 4: aax6908, 2019).
  • a chimeric protein (Clec1b-Fc) obtained by fusing the extracellular portion of mouse Clec1b (65th to 275th amino acids of mouse Clec1b full-length 275 amino acids) and the N-terminal Fc portion of human IgG (Kanemaru et al, Science Immunol 4: aax6908, 2019).
  • Human IgG (manufactured by Cosmo Bio, NO.EVHM-C02-100) or chimeric protein (Clec12b-Fc, Clec12a-Fc, Clec1a-Fc, or Clec1b-Fc, 1 ⁇ g, in 200 ⁇ L of PBS) was added to a 96-well plate. and coated overnight at 4°C. After washing with 0.05% Tween diluted in PBS, purified TX109 (0 ⁇ g, 0.1 ⁇ g, 0.01 ⁇ g, or 0.001 ⁇ g in 100 ⁇ L PBS) was added and incubated for 2 hours at room temperature.
  • HRP horseradish peroxidase
  • HRP horseradish peroxidase
  • HRP horseradish peroxidase
  • HRP horseradish peroxidase-labeled anti-mouse IgG1 secondary antibody
  • Cytiva NO.NA931V
  • TX109 did not bind to Human IgG (hIgG), Clec12a-Fc (Clec12a), Clec1a-Fc (Clec1a), and Clec1b-Fc (Clec1b), but only Clec12b-Fc (Clec12b). .
  • TX109 bound to Clec12b-Fc (Clec12b) depending on the amount of TX109 added (Amount of TX109). TX109 was found to bind specifically to Clec12b.
  • the results are shown in FIG. Data representative of 2 or 3 independent experiments are shown.
  • the vertical axis of the upper histogram is the number of cells, and the horizontal axis is anti-Flag.
  • the vertical axis of the lower histogram is the number of cells and the horizontal axis is TX-109.
  • TX109 did not bind to parental RMA cells, but specifically bound to mouse Clec12b-expressing RMA cells. TX109 was found to bind specifically to mouse Clec12b.
  • TX109 Isotype analysis of TX109 by flow cytometry (Method) 0.5 ⁇ g of purified TX109 was added to 1 ⁇ 10 5 cells of mouse Clec12b-expressing RMA cells and incubated on ice for 30 minutes. After washing with PBS, anti-mIgG1 antibody (manufactured by BD bioscience, No.555749), anti-mIgG2a antibody (manufactured by BD bioscience, No.553390), anti-mIgG2b antibody (manufactured by BD bioscience, No.553395), anti-mIgG3 Antibody (manufactured by BD bioscience, NO.553403), anti-mIg ⁇ antibody (manufactured by BD bioscience, NO550003), or anti-mIg ⁇ antibody (manufactured by BD bioscience, NO.553434) was added and incubated on ice for 30 minutes. and analyzed by flow cytometer.
  • TX109 for Immunoprecipitation and Western Blotting (Method) (immunoprecipitation)
  • Purified TX109 or protein G beads (manufactured by Thermo Fisher, No. 10004D) bound to anti-Flag antibody (manufactured by SIGMA, No. F1804) were incubated with lysates of mouse Clec12b-expressing RMA cells or parental RMA cells at 4°C for 2 hours. Incubate and wash with lysis buffer. After adding a non-reducing SDS buffer to the protein G beads, they were boiled, and the supernatant was used as a sample for Western blotting (Non-Reducing). In addition, the supernatant obtained when the reducing SDS buffer was added to the protein G beads and then boiled was used as the reducing sample.
  • biotinylated TX109 membranes incubated with biotinylated anti-Flag antibody (Sigma, NO.F9291-1MG) or biotinylated TX109 for 1 hour at room temperature were washed, followed by SA-HRP (Cytiva, NO.RPN1231V). ) for 45 minutes at room temperature. After washing, the membrane was reacted with a mixture of SuperSignal TM West Pico PLUS Luminal/Enhancer solution (Thermo Fisher, No. 34579) and a stable peroxide solution (Thermo scientific, No. 1863096). Fluorescence was detected with a LAS4000.
  • TX109 Proteins from mouse Clec12b-expressing RMA cells were immunoprecipitated (IP) with TX109 and immunoblotted (IB) with an anti-Flag antibody, yielding 60 KDa in both non-reducing and reducing conditions. A nearby specific band was observed (Fig. 7A). This result suggested that the molecular weight of mouse Clec12b was about 60 KDa. When mouse Clec12b-expressing RMA cells were immunoprecipitated (IP) with TX109 and immunoblotted (IB) with anti-Flag antibody or TX109, a specific band of the same molecular weight was detected (Fig. 7B). These results demonstrate that TX109 is an antibody that can be used for both immunoprecipitation and immunoblotting.
  • Example 4 Analysis of immune-related cells expressing Clec12b (1) Isolation of immune-related cells from tissues (Method) (Back Skin) Skin tissue ( ⁇ 12 cm 2 ) taken from the back of wild-type mice after shaving was cut into small pieces and treated with 2 mg/mL collagenase D (Sigma, No. 11088882001), 1 ⁇ L/mL deoxyribonuclease I (Worthington). , NO.LS002139) and RPMI Medium (cRPMI) containing 10% fetal bovine serum (FBS) at 37°C for 1 hour.
  • spleen From wild-type mice, spleens were removed, decapsulated in RPMI Medium (cRPMI), and cells were induced into single cell suspensions.
  • cRPMI RPMI Medium
  • Peritoneal exudate cells PEC
  • PEC Peritoneal exudate cells
  • Wild-type mouse colon tissue was cut into small pieces and digested with 0.5 M EDTA at 37° C. for 15 minutes to remove the epithelial layer. After removing the epithelial layer, the tissue was further treated with cRPMI containing 2 mg/mL collagenase D and 1 ⁇ L/mL deoxyribonuclease I at 37° C. for 1 hour, and then filtered through a nylon mesh. Digestion and filtration were repeated two more times to obtain a single cell suspension.
  • Heart tissue taken from wild-type mice was reperfused with PBS, immediately washed with Hank's balanced salt solution (HBSS), cut into small pieces, and treated with 2 mg/mL collagenase D, 1 ⁇ L/mL deoxyribonuclease I and 100 ⁇ M cromolyn. It was digested in cRPMI containing sodium salt (Sigma, NO. C0399-1G) for 1 hour at 37° C., then filtered through a 100 ⁇ m nylon mesh filter and centrifuged. The pellet was resuspended in 100 ⁇ M cromolyn sodium salt solution and then subjected to density gradient centrifugation with 40% Percoll to collect the pellet.
  • cRPMI containing sodium salt Sigma, NO. C0399-1G
  • Figure 8-1 for skin results
  • Figure 8-2 for spleen
  • Figure 8-3 for peritoneal exudate cells (PEC)
  • Figure 8-3 for colonic lamina propria (Colon LP)
  • Figure 8-5 Data representative of 2 or 3 independent experiments are shown.
  • the vertical axis of each histogram is the number of cells, and the horizontal axis is Clec12b.
  • Clec12b is expressed in the skin by CD45.2 + , CD64 ⁇ , CD3 ⁇ , c-Kit + , Fc ⁇ RI ⁇ ⁇ cell populations (c-Kit + Fc ⁇ RI ⁇ ⁇ ), and CD45.2 + , CD64 ⁇ , CD3 ⁇ , c ⁇ It was highly expressed in Kit + and Fc ⁇ RI ⁇ + cell populations (c-Kit + Fc ⁇ RI ⁇ + ) (Fig. 8-1). Clec12b-positive cells were 83% of c-Kit + Fc ⁇ RI ⁇ ⁇ and 84% of c-Kit + Fc ⁇ RI ⁇ + .
  • c-Kit + Fc ⁇ RI ⁇ ⁇ and c-Kit + Fc ⁇ RI ⁇ + also express CD200R, which is selectively expressed on mast cells, suggesting that these cell populations are cutaneous mast cells.
  • CD200R-positive cells were 89% of c-Kit + Fc ⁇ RI ⁇ ⁇ and 100% of c-Kit + Fc ⁇ RI ⁇ + .
  • c-Kit + Fc ⁇ RI ⁇ ⁇ is considered to be a precursor of mast cells in the skin.
  • Clec12b was not expressed in any cell population in spleen (Spleen), colonic lamina intestinal (Colon LP), and heart (Heart) (FIGS. 8-2, 8-4, 8-5). . From FIG. 8-3, Clec12b was slightly expressed in peritoneal exudate cell (PEC) mast cells, but Clec12b-positive cells accounted for only 39.7% of peritoneal exudate cell (PEC) mast cells. I didn't.
  • PEC peritoneal exudate cell
  • Clec12b is highly expressed on skin mast cells and weakly expressed on peritoneal exudate cell (PEC) mast cells, but the proportion of mast cells expressing Clec12b (Clec12b mast cells/mast cells) were found to be larger in skin than in PEC. That is, Clec12b was selectively expressed in skin mast cell lineage cells, and most of the skin mast cell lineage cells expressed Clec12b. Clec12b was found to be selectively expressed in mast cells in mouse skin as well as in human skin.
  • PEC peritoneal exudate cell
  • mice NK cells are obtained from mouse splenocytes, biotinylated anti-CD4 antibody (BioLegend, clone GK1.5), biotinylated anti-CD5 antibody (BioLegend, clone 53-7.3 ), biotinylated anti-CD8a antibody (BioLegend, clone 53-6.7), biotinylated anti-CD19 antibody (BioLegend, clone 1D3), biotinylated anti-Gr-1 antibody (BioLegend, clone 1D3), Separation was performed by negative selection using a biotinylated anti-Ter-119 antibody (BioLegend, clone RB6-8C5) and Dynabeads MyOne Streptavidin C1 (Thermo Fisher Scientific).
  • mice NK cells were incubated with recombinant human IL-2 (1000 U/mL, BD Biosciences, No. 54603) for 1 day to obtain IL-2-stimulated NK cells (IL-2-primed NK).
  • IL-2-primed NK IL-2-primed NK cells
  • NK cells isolated by the above method from mice injected with 500 ⁇ g of Poly (I: C) one day before the assay were transformed into Poly (I: C)-stimulated NK cells (Poly (I: C)-primed NK).
  • ADCC activity evaluation Using IL-2-stimulated NK cells or Poly(I:C)-stimulated NK cells as effector cells and mouse Clec12b-expressing RMA cells established in Example 2 or parent RMA cells as target cells, ADCC of TX109 Activity was evaluated by the following method.
  • Mouse Clec12b-expressing RMA cells or parental RMA cells were treated with purified TX109 (100 ⁇ g/mL, indicated as TX109 in the graph) or control mouse IgG1, ⁇ (manufactured by BioLegend, clone: MOPC-21, 100 ⁇ g/mL, Isotype in the graph).
  • IL-2-stimulated NK cells co-cultured with IL-2-stimulated NK cells or Poly(I:C)-stimulated NK cells for 5 hours.
  • Expression of CD107a and interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ) on IL-2-stimulated NK cells or Poly(I:C)-stimulated NK cells was analyzed by flow cytometry.
  • the anti-CD107a antibody was BioLegend, clone: 1D4B, and the anti-interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ) antibody was BioLegend, clone: XMG1.2.
  • TX109 whether using IL-2-stimulated NK cells (IL-2 primed NK) or Poly (I: C)-stimulated NK cells (Poly (I: C)-primed NK), NK cell mouse It significantly enhanced the cytotoxic activity against Clec12b-expressing RMA cells. TX109 was found to have ADCC activity. This indicates that anti-Clec12b antibodies such as TX109 can kill Clec12b-expressing cells, thereby preventing or treating allergic diseases.
  • Example 8 Efficacy of anti-Clec12b in a model of dermatitis caused by mite antigen application (Method) A schematic of the experimental schedule is shown in FIG. Wild-type BALB/c mice (obtained from CLEA Japan, Inc., wild-type, female, 10-13 weeks old, 6 mice per group) were shaved with an electric shaver to remove hair from the back of the neck, and a depilatory cream (Kracie "Epilat Remover”) was applied. Hair cream”). This day was designated as Day-1.
  • TX109 or a control antibody (“Ultra-LEAF TM Purified Mouse IgG1, ⁇ Ctrl Antibody (clone: MOPC-1)”, BioLegend, Cat. No. 400197) was applied to both auricles. 2 ⁇ g/20 ⁇ L each, and 5 ⁇ g/50 ⁇ L each in 4 corners within a 2 cm ⁇ 2 cm square area of the upper neck area (that is, the total amount applied to 4 locations within a 2 cm ⁇ 2 cm square area of the upper neck area is 20 ⁇ g/200 ⁇ L). Administered intradermally. PBS was used as the antibody solvent.
  • mite antigen (Ointment containing ingredients derived from Dermatophagoides farinae, atopic dermatitis inducing reagent "Biosta AD” manufactured by Biosta Co., Ltd., Cat. No. 303-34131) was applied to the entire back of the neck. applied one by one.
  • the mite antigen was applied once daily for a total of 5 times in the same manner as on Day 1, and the antibody was intradermally administered once every 2 days in the same manner as on Day 0 for a total of 3 times.
  • Scoring of skin inflammation symptoms was performed every day from Day 0 onwards. Scoring was performed by the following method. 1) Itch score, 2) Redness/bleeding score, 3) Face edema score, 4) Abrasion/erosion score, 5) Scab formation/dryness ( Crust formation/drying score) were rated as 0 points for no symptoms, 1 point for mild symptoms, 2 points for moderate symptoms, and 3 points for severe symptoms. The sum total of these five scores was made into the total score. The itching sensation was evaluated based on the number of scratchings for 5 minutes after 10 minutes of acclimation. 0-3 innings were scored as 0 points, 4-6 innings as 1 point, 7-9 innings as 2 points, and 10 or more innings as 3 points.
  • Redness/hemorrhage was evaluated based on the degree of redness and the number of bleeding sites in the auricle and back of the neck, excluding uncoagulated bleeding. Edema was evaluated based on the degree of facial swelling. Abrasions and erosions were counted and evaluated on the back of the auricle and neck skin. Scab formation/dryness was evaluated by counting the degree of dryness and the number of crusts on the skin on the face and back of the neck.
  • a skin sample was taken from the back of the neck on Day6. The collected skin samples were fixed and then embedded in paraffin. A 4 ⁇ m-thick section was prepared with a microtome, and hematoxylin and eosin staining and toluidine blue staining were performed by the following method.
  • Hematoxylin and eosin staining As staining reagents, hematoxylin solution (Modified Mayer's) (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., #131-09665) and 0.25% Eosin Y solution (0.5% eosin-Y solution (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Co., Ltd. #054-06505) was diluted with 99.5% EtOH at a ratio of 1:1). The slide glass on which the section was attached was heated at 60° C. for 10 minutes to make the section difficult to peel off.
  • toluidine blue staining A 0.5% toluidine blue solution (#209-14545, Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used as a staining reagent. The slide glass on which the section was attached was heated at 60° C. for 10 minutes to make the section difficult to peel off. Next, deparaffinization (xylene for 5 min x 3) followed by rehydration (99.5% EtOH for 2 min x 2, 90% EtOH for 1 min, 70% EtOH for 1 min, dH 2 O for 1 minute), then immersed in 200 mL of 0.5% toluidine blue solution and incubated at room temperature for 60 minutes for staining.
  • Sections were then washed briefly in dH 2 O, dehydrated (70% EtOH briefly, 90% EtOH briefly, 99.5% EtOH for 1 min x 2 times), and then cleared (xylene for 5 min x 3 times), mounted with Mount Quick, and subjected to microscopic observation.
  • the hematoxylin and eosin-stained skin section was observed under a microscope, 5 1 mm 2 epidermis layers were randomly selected, the thickness of the epidermis layer was measured using a Keyence BZ-X analyzer, and the average value of the 5 locations was obtained. was taken as the thickness of the epidermis layer.
  • the toluidine blue-stained skin sections were observed under a microscope, and the number of metachromatic mast cells per 1 mm 2 per field of view was counted.
  • FIG. 12 shows the epidermal thickness and the number of mast cells per unit area (mm 2 ). Scores for dermatitis symptoms are shown in FIG. When mite antigens are applied to induce dermatitis, the epidermis thickens and more mast cells are found in the dermis. However, administration of TX109 improved epidermal thickness and the number of mast cells per unit area (mm 2 ) compared to control antibody (cIg) administration (FIGS. 11 and 12).
  • TX109 when TX109 was administered, itching (Itch Score), edema (Face edema score), redness/bleeding score (Redness/bleeding score), abrasion/erosion score (Abrasion/erosion score), scab
  • Itch Score edema score
  • redness/bleeding score Redness/bleeding score
  • abrasion/erosion score Abrasion/erosion score
  • scab The dermatitis score was improved in all items of Crust Formation/drying score and Total Score of these five scores. It was revealed that TX109 reduces skin mast cells and attenuates skin inflammation symptoms.

Abstract

［課題］肥満細胞に選択的に発現している分子を見つけ、その分子をターゲットとした、アレルギー性疾患の予防又は治療剤を提供することを課題とする。 ［解決手段］本発明は、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体又はその抗体断片を含む、アレルギー性疾患の予防又は治療剤である。

Description

アレルギー性疾患の予防又は治療剤
　本発明は、アレルギー性疾患の予防又は治療剤に関する。
　肥満細胞（ＭＣ、マスト細胞ともいう）は、皮膚、腹腔、肺、腸など様々な臓器に存在し、アレルギー性疾患の発症や感染症に対する宿主の防御に関与している。肥満細胞の前駆体は骨髄で生成され、その後、末梢組織に移動して組織常在型肥満細胞に分化する。肥満細胞は結合組織型と粘膜型に分類でき、ヒトだけでなくマウスでも鼻、皮膚、腹腔、肺、腸など様々な末梢組織に存在している（非特許文献１、非特許文献２）。肥満細胞は、サイトカイン、ヒスタミン、プロテアーゼ、ケモカイン、脂質メディエーターなどの炎症性分子を含む細胞質顆粒を有する（非特許文献１）。各臓器の肥満細胞はそれぞれ異なる機能を持ち、顆粒に含まれる炎症性分子の成分も異なることが示唆されている（非特許文献２、非特許文献３）。肥満細胞は，アレルゲンとＩｇＥの免疫複合体、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰｓ）、炎症性分子などの刺激を受けると、肥満細胞の活性化と脱顆粒を引き起こし、末梢組織に炎症性分子を放出する（非特許文献１）。この過程は、アレルギー性疾患の発症や感染に対する宿主の防御に重要な役割を果たしている（非特許文献２、４）。
　肥満細胞の過剰な活性化はアレルギー性疾患の原因の一つとして知られているが、肥満細胞の活性化制御機構はまだ十分に解明されていない。また、肥満細胞に選択的に発現している分子についてもあまり報告はなく、特に肥満細胞に発現している分子のうち、組織又は細胞選択的に発現している分子はほとんど知られていない。
　アレルギー性疾患の予防又は治療剤としては、肥満細胞からのヒスタミン等の炎症性分子の放出を抑制する抗アレルギー薬、ヒスタミンの作用を抑制する抗ヒスタミン薬、炎症を抑えるステロイド薬等が知られている。しかし、肥満細胞自体をターゲットとしたアプローチは知られていない。
　ところで、Ｃｌｅｃ１２ｂ遺伝子はＣ型レクチン受容体ファミリー１２Ｂ（Ｃｌｅｃ１２ｂ；Ｃ－ｔｙｐｅ　ｌｅｃｔｉｎ　ｄｏｍａｉｎ　ｆａｍｉｌｙ　１２　ｍｅｍｂｅｒ　Ｂ）をコードしている。Ｃ型レクチン受容体ファミリーは、カルシウム依存的に糖鎖と結合する免疫受容体の一種である。例えば、真菌由来のレクチンを認識することで、真菌からの宿主防御に寄与していることが示唆されている（非特許文献５）。Ｃｌｅｃ１２ｂは免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を有していること、また、ヒトＣＬＥＣ１２ｂは、ホスファターゼ（ＳＨＰ－１及びＳＨＰ－２）をＩＴＩＭにリクルートすることが明らかになっており（非特許文献６）、Ｃｌｅｃ１２ｂは、阻害性の受容体であることが示唆されている。また、Ｕｎｉｐｒｏｔによれば、推定分子量は約３１ＫＤａであることが示されている。Ｃｌｅｃ１２ｂは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで活性化させたマクロファージ及びＵ９３７細胞株(ヒト単球由来)には発現しているものの、ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）には発現していないことが報告されている（非特許文献６）。しかし、Ｃｌｅｃ１２ｂの機能及びＣｌｅｃ１２ｂが発現する組織及び細胞種はわかっていないことが多い。
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　本発明者らは、肥満細胞に選択的に発現している分子を見つけ、その分子に特異的に結合する抗体を用いて肥満細胞を除去できれば、アレルギー性疾患の予防又は治療に有効であると考えた。そこで、本発明は、肥満細胞に選択的に発現している分子を見つけ、その分子をターゲットとした、アレルギー性疾患の予防又は治療剤を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した。その結果、以下の構成を有することにより上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、例えば以下の〔１〕～〔８〕に関する。
〔１〕　抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体又はその抗体断片を含む、アレルギー性疾患の予防又は治療剤。
〔２〕　前記抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体が、Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞に対する細胞障害活性を有する、〔１〕に記載のアレルギー性疾患の予防又は治療剤。
〔３〕　前記Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞が、肥満細胞である、〔２〕に記載のアレルギー性疾患の予防又は治療剤。
〔４〕　前記Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞が、皮膚肥満細胞である、〔２〕又は〔３〕に記載のアレルギー性疾患の予防又は治療剤。
〔５〕　前記細胞障害活性が、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）活性である、〔２〕～〔４〕のいずれかに記載のアレルギー性疾患の予防又は治療剤。
〔６〕　前記抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体が、Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞を除去する抗体である、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載のアレルギー性疾患の予防又は治療剤。
〔７〕　前記アレルギー性疾患が、皮膚アレルギー性疾患である、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のアレルギー性疾患の予防又は治療剤。
〔８〕　前記皮膚アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、蕁麻疹から選ばれる少なくとも１つである、〔７〕に記載のアレルギー性疾患の予防又は治療剤。
　本発明によれば、アレルギー性疾患の予防又は治療剤を提供することができる。
図１は、ヒト皮膚肥満細胞におけるＣｌｅｃ１２ｂの発現を観察した写真である。 図２は、ＴＸ１０９の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図である。 図３は、ＴＸ１０９の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図である。 図４は、ＥＬＩＳＡ法によるＴＸ１０９の結合特性を示すグラフである。 図５は、フローサイトメトリーによる、ＴＸ１０９のマウスＣｌｅｃ１２ｂへの結合特性を示すヒストグラムである。 図６は、フローサイトメトリーによるＴＸ１０９のアイソタイプ解析結果を示すヒストグラムである。 図７は、ＴＸ１０９を用いて免疫沈降及びウェスタンブロッティングを行った結果を示す図である。 図８－１は、マウスＣｌｅｃ１２ｂを発現する免疫系細胞の解析結果を示すドットプロットとヒストグラムである。 図８－２は、図８－１の続きである。 図８－３は、図８－２の続きである。 図８－４は、図８－３の続きである。 図８－５は、図８－４の続きである。 図９は、Ｃｌｅｃ１２ｂを発現させたＲＭＡ細胞に対する、ＴＸ１０９の細胞障害活性を評価した結果を示すグラフである。 図１０は、ダニ抗原塗布による皮膚炎モデルにおける抗Ｃｌｅｃ１２ｂの有効性に関する実験スケジュールを示す図である。 図１１は、ヘマトキシリンエオジン染色又はトルイジンブルー染色した皮膚切片の顕微鏡写真である。 図１２は、表皮厚さ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）及び単位面積（ｍｍ2）当たりの肥満細胞数（Ｍａｓｔ　ｃｅｌｌ　ｎｕｍｂｅｒ）を示すグラフである。 図１３は、皮膚炎症状のスコアを示すグラフである。グラフの横軸は、日数（ｄａｙｓ）、縦軸はスコアである。
　次に本発明について具体的に説明する。
　＜抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体又はその抗体断片＞
（抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体）
　本発明におけるＣｌｅｃ１２ｂ（Ｃ－ｔｙｐｅ　ｌｅｃｔｉｎ　ｄｏｍａｉｎ　ｆａｍｉｌｙ　１２　ｍｅｍｂｅｒ　Ｂ）の由来は、Ｃｌｅｃ１２ｂを発現している生物であれば特に制限されず、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、ブタ、サル又はヒトを含む霊長類の哺乳動物を由来とするものを含む。Ｃｌｅｃ１２ｂは、好ましくはヒトＣｌｅｃ１２ｂ、又はマウスＣｌｅｃ１２ｂであり、より好ましくはヒトＣｌｅｃ１２ｂである。
　抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体は、Ｃｌｅｃ１２ｂに特異的に結合する活性を有する抗体であれば、特に制限されない。市販又は公知の抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体を用いてもよいし、本明細書の実施例で樹立した抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体であるＴＸ１０９を用いてもよいし、種々の公知の方法により新たに作製してもよい。
　公知の抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体としては、Ａｂｃａｍ社製のウサギ抗ヒトＣｌｅｃ１２ｂポリクローナル抗体（ＮＯ．ａｂ２１１４５２）、非特許文献６に開示されたマウス抗ヒトＣｌｅｃ１２ｂモノクローナル抗体等が挙げられる。
　本明細書の実施例で樹立したＴＸ１０９は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体である。
　Ｃｌｅｃ１２ｂに特異的に結合する活性とは、Ｃｌｅｃ１２ｂタンパク質に特異的に結合する活性を意味する。また、特異的に結合するとは、Ｃｌｅｃ１２ｂタンパク質には結合するが、Ｃｌｅｃ１２ｂタンパク質以外には結合しないことを意味する。前記結合活性は、公知の方法、例えば免疫沈降法、ウェスタンブロッティング、ＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ）、フローサイトメトリー、プルダウンアッセイ等の方法により測定することができる。
　抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体は、Ｃｌｅｃ１２ｂとそのリガンドとの結合を阻害する抗体でも、Ｃｌｅｃ１２ｂとそのリガンドとの結合を阻害しない抗体であってもよいが、Ｃｌｅｃ１２ｂとそのリガンドとの結合を阻害する抗体が好ましい。また、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体は、Ｃｌｅｃ１２ｂのシグナル伝達を阻害又は低減する抗体（抗Ｃｌｅｃ１２ｂ中和抗体）でも、Ｃｌｅｃ１２ｂのシグナル伝達を阻害又は低減しない抗体であってもよいが、Ｃｌｅｃ１２ｂのシグナル伝達を阻害又は低減しない抗体が好ましい。抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体は、Ｃｌｅｃ１２ｂのＩＴＩＭにより媒介されるＣｌｅｃ１２ｂシグナル伝達を阻害又は低減しない抗体であってもよい。
　Ｃｌｅｃ１２ｂは、細胞内領域、膜貫通領域、及び細胞外領域からなる。抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体は、Ｃｌｅｃ１２ｂの細胞外領域の全部又は一部と結合する抗体であることが好ましい。前記Ｃｌｅｃ１２ｂの細胞外領域は、例えば、ヒトＣｌｅｃ１２ｂのアミノ酸配列（２７６アミノ酸）のうち、６５～２７６番目のアミノ酸であり、マウスＣｌｅｃ１２ｂのアミノ酸配列（２７５アミノ酸）のうち、６５～２７５番目のアミノ酸である。抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体は、Ｃｌｅｃ１２ｂとのアフィニティが高くなる部位と結合することが好ましい。
　抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体は、マウス抗体、ラット抗体、モルモット抗体、ハムスター抗体、ウサギ抗体、サル抗体、イヌ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体のいずれであってもよい。
　抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体の作製に用いる免疫動物は、特に制限されないが、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、サル、及びイヌであり、好ましくはマウス、ラット、及びウサギである。
　抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体の作製に用いる免疫動物は、ゲノム中のＣｌｅｃ１２ｂ遺伝子又はＣｌｅｃ１２ｂ遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、Ｃｌｅｃ１２ｂ遺伝子の発現が喪失されている遺伝子改変非ヒト動物、いわゆるＣｌｅｃ１２ｂノックアウト非ヒト動物であってもよい。Ｃｌｅｃ１２ｂノックアウト非ヒト動物を免疫動物とすれば、抗原として同じ動物種のＣｌｅｃ１２ｂを用いることができる。例えば、Ｃｌｅｃ１２ｂノックアウトマウスを免疫動物とすれば、抗原としてマウスＣｌｅｃ１２ｂを用いて、マウス抗マウスＣｌｅｃ１２ｂ抗体を作製することができる。
　抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体の作製に適した抗原としては、例えば発現ベクターなどによりＣｌｅｃ１２ｂを強制発現させた細胞、Ｃｌｅｃ１２ｂ発現プラスミドベクター、Ｃｌｅｃ１２ｂ発現ウイルスベクター等（アデノウイルスベクターなど）等を用いて作製したＣｌｅｃ１２ｂリコンビナントタンパク質等があげられる。Ｃｌｅｃ１２ｂリコンビナントタンパク質は、他のタンパク質と融合させてもよいし、タグ等をつけてもよい。タンパク質の安定性の観点から、Ｃｌｅｃ１２ｂリコンビナントタンパク質は、ＩｇＧＦｃ等と融合させてキメラタンパク質とすることが好ましい。抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体の作製に用いる抗原は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。Ｃｌｅｃ１２ｂを強制発現させた細胞と、Ｃｌｅｃ１２ｂリコンビナントタンパク質を組み合わせて用いてもよい。
　抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれであってもよいが、力価を一定に保つことが容易であることから、好ましくはモノクローナル抗体である。
　ポリクローナル抗体は、公知の方法によって作製することができる。例えば、抗原タンパク質あるいは抗原タンパク質とキャリアータンパクとの混合物で、適当な動物に免疫を行ない、その免疫動物から抗原タンパク質に対する抗体含有物を採取して、必要に応じて抗体の分離精製を行なうことにより作製することができる。用いられる動物としては、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモットが一般的に挙げられる。抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバント又は不完全フロイントアジュバント等を抗原タンパク質と共に投与することができる。投与は、通常約２週毎に１回ずつ、計約３～１０回程度行なうのが一般的である。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された動物の血液、腹水などから採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、ＥＬＩＳＡ法によって測定することができる。ポリクローナル抗体の分離精製は、例えば、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤を用いた精製法、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法などの免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
　モノクローナル抗体は、公知の方法によって作製することができる。具体的には、抗原を必要に応じてアジュバントとともに、哺乳動物、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、モルモット又はウサギの皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１～数回注射することにより免疫感作を施す。アジュバントは、特に制限されず、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、水酸化ナトリウム、水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ）、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン、ヘペス、カルボキシビニルポリマーなどを用いることができるが、水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ）が好ましい。通常、初回免疫から約１ヶ月毎に２～６回免疫を行って、最終免疫より約３、４日後に免疫感作された哺乳動物から抗体産生細胞を取得することができる。免疫を施す回数及び時間的インターバルは、使用する免疫原の性質などにより、適宜変更すればよい。
　モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法（Ｎａｔｕｒｅ、１９７５、ｖｏｌ．２５６、ｐ４９５～４９７）及びそれに準じた方法に従って行うことができる。即ち、前述したように免疫された哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ又はヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラット又はヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞を細胞融合させることによってハイブリドーマを調製することができる。
　細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、マウスから得られた株化細胞、例えばＰ３－Ｕ１、ＮＳ－１、ＳＰ２／０、６５３、Ｘ６３、ＡＰ－１などを使用することができる。
　モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の、前述のマウス免疫で用いた抗原に対する反応性を、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ等の測定法によって測定し、当該抗原に対して特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって行う。そして、通常は抗原を固相化しそこに結合する培養上清中の抗体を、放射性物質、蛍光物質、酵素などで標識した二次抗体で検出する方法が用いられる。また、抗原の発現細胞を用いる場合には、該細胞にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に蛍光で標識した二次抗体を反応させた後、フローサイトメーター等の蛍光検出装置で該細胞の蛍光強度を測定することにより、本発明の抗原に結合できるモノクローナル抗体を検出することができる。
　選択したハイブリドーマクローンからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養するか、又はマウス、ラット、モルモット、ハムスター又はウサギ等、好ましくはマウス又はラット、より好ましくはマウスの腹水中等で培養し、得られた培養上清、又は哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。ｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような公知の栄養培地あるいは公知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することができる。
　モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ又はＤＥ５２等）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム、プロテインＧカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。
　抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体としては、抗体遺伝子を抗体産生細胞、例えばハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いてもよい。
　具体的には、目的とする抗体を産生するハイブリドーマ又は抗体を産生する免疫細胞、例えば感作リンパ球等を癌遺伝子等により不死化させた細胞から、抗体の可変領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えばグアニジン超遠心法等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ(ファルマシア社製）等を使用してｍＲＮＡを調製する。得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体可変領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ等を用いて行うことができる。また、ｃＤＮＡの合成及び増幅を行うには５'－Ａｍｐｌｉ　ＦＩＮＤＥＲ　ＲＡＣＥ　Ｋｉｔ(クローンテック社製）及びＰＣＲを用いた５'－ＲＡＣＥ法を使用することができる。得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、デオキシ法により確認する。
　目的とする抗体の可変領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込むことができる。又は、抗体の可変領域をコードするＤＮＡを、抗体定常領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。目的とする抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー／プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
　抗体遺伝子の発現は、抗体の重鎖又は軽鎖を別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時に形質転換させてもよいし、あるいは重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主を形質転換させてもよい。
　抗体の作製方法としては、いわゆるファージディスプレイ法（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２３、１１０５（２００５））を用いてもよい。具体的には、例えばヒト又は動物（例えば、ウサギ、マウス、ラット、ハムスターなど）のＢリンパ球を材料として公知の方法により作製された抗体遺伝子ライブラリー、若しくはヒト又は動物のＧｅｒｍ　Ｌｉｎｅ配列から選別、及び改変して完全合成した抗体遺伝子ライブラリーを、バクテリオファージ、大腸菌、酵母、動物細胞等の細胞表面又はリボソーム上等に提示させる。このとき、細胞表面に提示させる抗体の形態としてはＩｇＧ分子、ＩｇＭ分子、Ｆａｂフラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント等が挙げられる。
　こうして得た抗体フラグメント遺伝子は公知の方法によりＩｇＧ抗体遺伝子の対応領域と組替えることにより、抗体遺伝子を得ることができる。そして、このようにして得られた遺伝子を適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて抗体を産生することができる。
　抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体は、ヒトにおいて免疫原性を低下させるために、ヒトＦｃ領域を含む抗体、ヒト定常領域を含む抗体、ヒト型キメラ抗体（以下、単にキメラ抗体ともいう）、ヒト化抗体（ヒト型ＣＤＲ移植抗体ともいう）及びヒト抗体などの遺伝子組換え抗体であってもよい。
　キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域（以下、ＶＨともいう）及び軽鎖可変領域（以下、ＶＬともいう）と、ヒト抗体の重鎖定常領域（以下、ＣＨともいう）及び軽鎖定常領域（以下、ＣＬともいう）とからなる抗体である。可変領域についての動物の種類は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなどのハイブリドーマを作製しうる動物であれば特に限定されない。
　抗Ｃｌｅｃ１２ｂヒト型キメラ抗体は、ヒトＣｌｅｃ１２ｂに特異的に結合するヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子を有する発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入して発現させることで作製できる。
　ヒト型キメラ抗体のＣＨは、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇともいう）であれば特に限定されないが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましい。ヒト型キメラ抗体のＣＬは、ｈＩｇＧに属すれば特に限定されない。
　ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをヒト抗体のＶＨ及びＶＬの適切な位置に移植した抗体である。抗Ｃｌｅｃ１２ｂヒト化抗体は、Ｃｌｅｃ１２ｂに特異的に結合するヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲを任意のヒト抗体のＶＨ及びＶＬのフレームワーク（以下、ＦＲともいう）に移植した可変領域（以下、Ｖ領域ともいう）をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡを有する発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入して発現させることで、作製することができる。ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸配列は、ヒト抗体由来のアミノ酸配列であれば特に限定されない。ヒト化抗体のＣＨは、ｈＩｇであれば特に限定されないが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましい。ヒト化抗体のＣＬは、ｈＩｇに属すれば特に限定されない。
　抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体は、エフェクター活性を有することが好ましい。「エフェクター活性」は、抗体のＦｃ領域を介して発現する活性であり、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性等の細胞障害活性、マクロファージ、樹状細胞などの食細胞による抗体依存性ファゴサイトーシス（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ、ＡＤＣＰ）活性などが知られている。
　抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体は、Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞に対する細胞障害活性を有する抗体であることが好ましく、Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する抗体であることがより好ましい。
　抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体は、抗体のアイソタイプがＩｇＧであれば、通常、エフェクター活性、特にＡＤＣＣ活性を有する。
　エフェクター活性の強さは、抗体のアイソタイプ及び抗体が由来する種によっても異なるが、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１が高い活性を有する。
　抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体のエフェクター活性は、公知の方法により制御してもよい。
　抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体は、好ましくはＣｌｅｃ１２ｂ発現細胞を除去する抗体である。このような抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体としては、Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞の活性化（細胞増殖、遊走、浸潤及び／又は脱顆粒など）を抑制する活性（中和活性、又はアンタゴニスト活性ともいう）を有する抗体、又はＣｌｅｃ１２ｂ発現細胞のアポトーシス誘導活性及び／又は細胞傷害活性を有する抗体が挙げられる。
　抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体は、好ましくは、細胞傷害活性によってＣｌｅｃ１２ｂ発現細胞を除去する抗体である。
　抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体は、Ｃｌｅｃ１２ｂ依存的なシグナル伝達を阻害した結果、Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞の細胞増殖阻害及び／又はアポトーシス誘導を引き起こすと共に、Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞を細胞傷害活性によって除去する抗体であってもよい。
　抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体は、抗体又は抗原の血中滞留性等を改良すること等を目的として改変した、リサイクリング抗体、スイーピング抗体、バイスペシフィック抗体、Ｔ細胞リダイレクティング抗体であってもよいし、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体修飾物であってもよい
　抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体としては、市販又は公知の抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体の変異体、キメラ抗体、ヒト化抗体等を用いてもよい。
　抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体又はその抗体断片は、薬学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体又はその抗体断片を含む、医薬組成物としてもよい。
　抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体のアイソタイプは特に制限されない。
　抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体の重鎖定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等のいずれのものであってもよいが、エフェクター活性が高いことから、好ましくはＩｇＧのものであり、より好ましくはＩｇＧ１のものである。抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体の軽鎖定常領域は、Ｉｇκ鎖、Ｉｇλ鎖のいずれのものであってもよいが、好ましくはＩｇκ鎖のものである。
　抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
（エフェクター活性の評価方法）
　ＡＤＣＣ活性を評価する方法は特に制限されず、公知の方法、例えばエフェクター細胞（ＮＫ細胞、ＰＢＭＣ；抹消血単核細胞等）とターゲット細胞（Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞）を共存させ、エフェクター細胞による、ターゲット細胞の細胞障害を検出する方法で評価することができる。エフェクター細胞は、例えば、ＩＬ－２、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）等により刺激した細胞を用いてもよい。
　ターゲット細胞の細胞障害は、例えば、ターゲット細胞に放射線同位元素（Ｃｒ51）、又は蛍光物質（カルセイン）を取り込ませ、溶解したターゲット細胞から放出される放射線同位元素又は蛍光物質の量を測定する方法で検出することができる。また、ＡＤＣＣ活性は、エフェクター細胞の細胞障害活性で評価してもよく、例えば、エフェクター細胞における、ＣＤ１０７ａ等の脱顆粒マーカーの発現量、又はＩＦＮ－γ等のサイトカインの発現量又は産生量を測定する方法で評価することができる。また、ＡＤＣＣ活性は、エフェクター細胞の代わりに、Ｆｃγ受容体バリアントとＮＦＡＴ（Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｆａｃｔｏｒ　ｏｆ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ）応答配列により駆動するルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞を使用し、ホタルルシフェラーゼの発光シグナルを測定する等のレポーターアッセイでも測定することができる。
　例えば、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体が、エフェクター細胞によるターゲット細胞の細胞傷害を誘導した場合は、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体はＡＤＣＣ活性を有するということができる。また、例えば、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体が、ターゲット細胞存在下で、エフェクター細胞におけるＣＤ１０７ａ又はＩＦＮ－γの発現量を増加させた場合は、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体はＡＤＣＣ活性を有するということができる。
　ＣＤＣ活性を評価する方法は特に制限されず、公知の方法、例えば補体（ヒト血清由来の補体等）とターゲット細胞（Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞）を共存させ、補体によるターゲット細胞の細胞障害を検出することで評価することができる。ターゲット細胞の細胞障害は、ターゲット細胞に放射線同位元素（Ｃｒ51）又は蛍光物質（カルセイン）を取り込ませ、溶解したターゲット細胞から放出される放射線同位元素又は蛍光物質の量を測定する方法で検出することができる。また、ＣＤＣ活性は、エフェクター細胞の代わりに、レポータ遺伝子を導入した細胞を使用する、レポーターアッセイでも測定することができる。
　例えば、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体が、ターゲット細胞に対する補体の細胞傷害活性を誘導した場合は、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体はＣＤＣ活性を有するということができる。
　ＡＤＣＰ活性を評価する方法は特に制限されず、公知の方法、例えばエフェクター細胞（マクロファージ等）とターゲット細胞（Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞）を共存させ、エフェクター細胞による、ターゲット細胞の貪食を検出することで評価することができる。エフェクター細胞による、ターゲット細胞の貪食は、エフェクター細胞及びターゲット細胞を蛍光標識し、エフェクター細胞による、ターゲット細胞の取り込みをフローサイトメトリーで測定、又は顕微鏡で観察する方法で評価することができる。また、ＡＤＣＰ活性は、エフェクター細胞の代わりに、Ｆｃγ受容体バリアントとＮＦＡＴ（Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｆａｃｔｏｒ　ｏｆ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ）応答配列により駆動するルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞を使用し、ホタルルシフェラーゼの発光シグナルを測定する等のレポーターアッセイでも測定することができる。
　例えば、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体が、エフェクター細胞によるターゲット細胞の貪食を誘導した場合は、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体はＡＤＣＰ活性を有するということができる。
（抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体の断片）
　抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体の断片は、上記各抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体の断片であって、Ｃｌｅｃ１２ｂに特異的に結合する活性を有する、すなわち抗原結合活性を有する断片である限り特に限定されない。抗体断片の種類としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
　Ｆａｂは、ＩｇＧをパパイン（タンパク質分解酵素）で処理して得られる断片のうち、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体のＦａｂは、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体をパパインで処理するか、前記抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、このベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入して発現させることで、作製することができる。
　Ｆ（ａｂ'）２は、ＩｇＧをペプシン（タンパク質分解酵素）で処理して得られる断片のうち、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体のＦ（ａｂ'）２は、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体をペプシンで処理するか、Ｆａｂ'（後述）をチオエーテル結合又はジスルフィド結合で結合させることで、作製することができる。
　Ｆａｂ'は、Ｆ（ａｂ'）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体のＦａｂ'は、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体のＦ（ａｂ'）２をジチオスレイトールで処理するか、前記抗体のＦａｂ'をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、このベクターを原核生物又は真核生物へ導入して発現させることで、作製することができる。
　ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカーを用いて連結した抗原結合活性を有する抗体断片である。抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体のｓｃＦｖは、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入して発現させることで、作製することができる。
　ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体のｄｉａｂｏｄｙは、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｉａｂｏｄｙをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入して発現させることで、作製することができる。
　ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させた抗体断片である。抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体のｄｓＦｖは、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入して発現させることで、作製することができる。
　ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨ又はＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含むペプチドである。抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体のＣＤＲを含むペプチドは、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入して発現させることで、作製することができる。また、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体のＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ－ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によっても作製することができる。好ましくは、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体由来の６個のＣＤＲを含むペプチドがあげられる。
　抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体の断片は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。また、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体とその断片を組み合わせて用いてもよい。
　＜Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞＞
　Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞は、Ｃｌｅｃ１２ｂを発現している細胞であれば、特に制限されない。Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞としては、例えば、免疫関連細胞、より具体的にはＰｒｏ－Ｂ細胞、Ｐｒｅ-Ｂ細胞、Ｂ細胞、Ｐｒｅ－Ｔ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、γδＴ細胞、ＩＬＣ（Ｉｎｎａｔｅ　Ｌｙｍｐｈｏｉｄ　Ｃｅｌｌ）、樹状細胞、マクロファージ、単球、肥満細胞系列の細胞（肥満細胞及び肥満細胞の前駆体（ｃ－Ｋｉｔ-ＦｃεＲＩα-の細胞））、好酸球、好塩基球等が挙げられる。
　Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞は、好ましくは、大腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、乳腺、卵巣、脾臓、精巣、又は皮膚のＰｒｏ－Ｂ細胞、Ｐｒｅ-Ｂ細胞、Ｂ細胞、Ｐｒｅ－Ｔ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、γδＴ細胞、ＩＬＣ（Ｉｎｎａｔｅ　Ｌｙｍｐｈｏｉｄ　Ｃｅｌｌ）、樹状細胞、マクロファージ、単球、肥満細胞系列の細胞（肥満細胞及び肥満細胞の前駆体（ｃ－Ｋｉｔ-ＦｃεＲＩα-の細胞））、好酸球、又は好塩基球である。
　Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞は、Ｃｌｅｃ１２ｂが高度に発現していることから、好ましくは肥満細胞系列の細胞（肥満細胞及び肥満細胞の前駆体（ｃ－Ｋｉｔ-ＦｃεＲＩα-の細胞））であり、より好ましくは肥満細胞である。
　また、Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞は、Ｃｌｅｃ１２ｂが高度に発現していることから、好ましくは皮膚肥満細胞系列の細胞（皮膚肥満細胞及び皮膚肥満細胞の前駆体（ｃ－Ｋｉｔ-ＦｃεＲＩα-の細胞））であり、より好ましくは皮膚肥満細胞である。
　肥満細胞は、顆粒中に存在するプロテアーゼの違いから、粘膜型肥満細胞（トリプターゼのみを含む肥満細胞）と結合組織型肥満細胞（トリプターゼ、カイメース、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシンＧ様プロテアーゼを含む肥満細胞）の２つのサブタイプに分類される。ヒト皮膚肥満細胞の大部分は結合組織型肥満細胞であることから、前記皮膚肥満細胞は、好ましくは結合組織型肥満細胞である。
　Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　Ｃｌｅｃ１２ｂの発現を確認する方法は特に制限されず、公知の方法、例えばＰＣＲ等によるＣｌｅｃ１２ｂ遺伝子の検出、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメーター等によるＣｌｅｃ１２ｂタンパク質の検出が挙げられる。
　＜アレルギー性疾患の予防又は治療剤＞
　本発明のアレルギー性疾患の予防又は治療剤は、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体又はその抗体断片を含むものであり、アレルギー性疾患の予防又は治療に有効である。実施例で示すように、Ｃｌｅｃ１２ｂの発現は、免疫関連細胞の中でも肥満細胞に選択的であり、中でも皮膚肥満細胞に選択的であることを本発明者らは見出した。
　アレルギー性疾患の発症、憎悪には、肥満細胞が大きく関与している。例えば、アトピー性皮膚炎の患者の皮膚では、肥満細胞の数が増加している（岡山吉道、ヒトの皮膚アレルギー性疾患におけるマスト細胞の役割、獣医臨床皮膚科 21 (3): 137-141, 2015）と報告されている。したがって、Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞の細胞膜上のＣｌｅｃ１２ｂに抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体又はその抗体断片が結合すれば、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体のエフェクター機能により、Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞を除去し、アレルギー性疾患の予防又は治療を行うことができる。
　また、Ｃｌｅｃ１２ｂの発現を解析した結果から、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体又はその抗体断片を含む本発明のアレルギー性疾患の予防又は治療剤は、他の免疫関連細胞にはほとんど作用せず、肥満細胞に選択的、特に皮膚肥満細胞に選択的に作用すると考えられる。そのため、本発明のアレルギー性疾患の予防又は治療剤は、副作用が少ないと推測される。　　　
　本発明のアレルギー性疾患の予防又は治療剤は、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体又はその抗体断片を有効成分として含む医薬組成物であればいかなるものでもよいが、通常は薬学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供することが望ましい。
　薬学的に許容される担体としては、例えば生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、及び緩衝生理食塩水が挙げられる。抗体は凍結乾燥（フリーズドライ）し、必要とされるときに上記のような緩衝水溶液を添加することにより再構成して使用してもよい。
　本発明のアレルギー性疾患の予防又は治療剤の投与経路は特に制限されず、静脈注射、腹腔内、経口、経鼻、経粘膜、筋肉内又は皮下、鼻腔内、気管内、皮膚、経皮又は皮内の各経路によって投与できる。好ましくは静脈投与又は腹腔内投与である。
　本発明のアレルギー性疾患の予防又は治療剤の剤型は特に制限されず、例えば、錠剤、顆粒剤、噴霧剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などが挙げられる。
　カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤；デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤；ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤；脂肪酸エステルなどの界面活性剤；グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
　乳剤及びシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類；ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類；ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類；ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤；ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。
　注射剤は、水、ショ糖、ソルビトール、キシロース、トレハロース、果糖などの糖類；マンニトール、キシリトール、ソルビトールなどの糖アルコール；リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グルタミン酸緩衝液などの緩衝液；脂肪酸エステルなどの界面活性剤などを添加剤として用いることができる。
　本発明のアレルギー性疾患の予防又は治療剤の投与量（有効量）は、特に制限されないが、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、好ましくは０．１～１００ｍｇ、より好ましくは０．５ｍｇ～５０ｍｇ、さらに好ましくは１ｍｇ～１０ｍｇの抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体を１日１回～数回投与すればよい。合計投与回数及び投与頻度も特に制限されず、アレルギー性疾患の種類、症状の程度、投与対象（年齢、性別、体重等）、投与経路などによって適宜選択すればよい。投与は単回でもよく、毎日連続行ってもよいし、数日の間隔をあけて１～数週間にわたり行ってもよい。
　本発明のアレルギー性疾患の予防又は治療剤により治療可能なアレルギー性疾患は、特に制限されず、アレルギー性疾患全般である。前記アレルギー性疾患としては、例えば、アナフィラキシーショック、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、薬物、昆虫アレルギー、食物アレルギー、接触性皮膚炎、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、花粉症を含むアレルギー性鼻炎などが挙げられる。
　本発明のアレルギー性疾患の予防又は治療剤により治療可能なアレルギー性疾患は、Ｃｌｅｃ１２ｂの発現が肥満細胞に多いことから、好ましくは肥満細胞が関与するアレルギー性疾患である。肥満細胞が関与するアレルギー性疾患としては、例えば、アナフィラキシーショック、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、薬物アレルギー、食物アレルギー、蕁麻疹、接触性皮膚炎、及びアトピー性皮膚炎が挙げられる。
　また、Ｃｌｅｃ１２ｂの発現が皮膚肥満細胞に多いことから、本発明のアレルギー性疾患の予防又は治療剤により治療可能なアレルギー性疾患は、好ましくは肥満細胞が関与する皮膚アレルギー性疾患である。肥満細胞が関与する皮膚アレルギー性疾患としては、例えば、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎及び蕁麻疹が挙げられる。
　なお、「治療」には疾病又は症状を治癒することと共に、それを緩和（軽快）することも含まれ、また「予防」には、疾病又は症状を未然に防ぐことと共に、疾病又は症状の治癒後にその再発を防ぐことも含まれる。
　本発明のアレルギー性疾患の予防又は治療剤の投与対象は、ヒトであるか、ヒト以外であるか（例えばマウス等の哺乳類）を問わないが、好ましくはヒトであり、さらに好ましくはアレルギー性疾患に罹患しているか又は罹患のおそれのあるヒトである。
　本発明のアレルギー性疾患の予防又は治療剤は、他の薬剤、例えば他のアレルギー性疾患の予防又は治療剤と併用して用いることができる。本発明のアレルギー性疾患の予防又は治療剤を他のアレルギー性疾患の予防又は治療剤と併用した場合、本発明のアレルギー性疾患の予防又は治療剤単独のときよりもアレルギー性疾患の予防又は治療効果が上昇しやすい。他のアレルギー性疾患の予防又は治療剤の種類は限定されず、例えば抗ヒスタミン薬、ケミカルメディエーター遊離抑制薬、抗ロイコトリエン薬、トロンボキサンＡ２阻害薬、Ｔｈ２サイトカイン阻害薬、ステロイド点鼻薬、血管収縮薬、β２受容体刺激薬：ＬＡＢＡ、β２受容体刺激薬：ＳＡＢＡ、ステロイド吸入薬、テオフィリン製剤、抗コリン薬、免疫抑制剤、アナフィラキシー補助治療剤（アドレナリン）が挙げられる。他のアレルギー性疾患の予防又は治療剤は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　本発明の一実施形態は、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体又はその抗体断片の有効量を、対象に投与することを含む、アレルギー性疾患を予防又は治療する方法である。
　また、本発明の一実施形態は、Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞に対する細胞障害活性を有する、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体又はその抗体断片の有効量を、対象に投与することを含む、アレルギー性疾患を予防又は治療する方法である。
　さらに、本発明の一実施形態は、皮膚肥満細胞に対する細胞障害活性を有する、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体又はその抗体断片の有効量を、対象に投与することを含む、皮膚アレルギー性疾患を予防又は治療する方法である。
　本発明の一実施形態は、アレルギー性疾患の予防又は治療における使用のための、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体又はその抗体断片である。
　また、本発明の一実施形態は、アレルギー性疾患の予防又は治療における使用のための、Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞に対する細胞障害活性を有する、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体又はその抗体断片である。
　さらに、本発明の一実施形態は、皮膚アレルギー性疾患の予防又は治療における使用のための、皮膚肥満細胞に対する細胞障害活性を有する、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体又はその抗体断片である。
　次に本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
　すべての実験は、筑波大学実験動物資源センターの動物倫理委員会のガイドラインに従って行った。
　〔実施例１〕ヒト皮膚肥満細胞におけるＣｌｅｃ１２ｂの発現
　（方法）
　ヘルシンキ宣言に従い、被験者から試験前に書面によるインフォームドコンセントを得た。また、本試験は筑波大学医の倫理委員会の承認を得て行った。健康なボランティアから得たヒト皮膚標本（筑波大学附属病院）を、コントロールｍＩｇＧ、又は抗ヒトｂ－トリプターゼモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ社製、ＮＯ．ａｂ２３７８、クローンＡＡ１）及び抗ヒトＣｌｅｃ１２ｂポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ社製、ＮＯ．ａｂ２１１４５２）を一次抗体として用い、Ｏｐａｌ　４－Ｃｏｌｏｒ　Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ　ＩＨＣ　Ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で染色し、蛍光顕微鏡で観察した。
（結果）
　結果を図１に示す。スケールバーは１００μｍである。抗ヒトＣｌｅｃ１２ｂポリクローナル抗体による染色像（緑色、ｈＣＬＥＣ１２Ｂ）は、抗ヒトｂ－トリプターゼモノクローナル抗体による染色像（赤色、β－ｔｒｙｐｔａｓｅ）とは重なっており、同じ細胞が染まっていた。ｂ－トリプターゼはヒト皮膚肥満細胞に特異的に発現している、肥満細胞顆粒内の酵素である。ヒト皮膚組織には肥満細胞よりも多数のマクロファージ等も存在するが、抗ヒトＣｌｅｃ１２ｂポリクローナル抗体により染色された細胞は、ほぼ全てが抗ヒトｂ－トリプターゼモノクローナル抗体により染色された細胞であり、抗ヒトｂ－トリプターゼモノクローナル抗体により染色されない細胞はほとんど存在しなかった。つまり、ｈＣｌｅｃ１２ｂは、ヒトの皮膚において、肥満細胞以外の細胞（例；マクロファージ）では発現していない、又は、発現量は極めて僅かであることが明らかになった。すなわち、ｈＣｌｅｃ１２ｂは、ヒト皮膚において、肥満細胞に選択的に発現していることが明らかになった。
　〔実施例２〕抗マウスＣｌｅｃ１２ｂモノクローナル抗体（ＴＸ１０９）の樹立
（１）マウス
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスは、ＣＬＥＡ　Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ．（東京都）より購入し、筑波大学動物資源センターにおいて特定病原体を含まない条件下で飼育した。
（２）Ｆｌａｇタグ付きマウスＣｌｅｃ１２を安定発現するＲＭＡ細胞の作製
　マウスＣｌｅｃ１２ｂ（ｍＣｌｅｃ１２ｂ）ｃＤＮＡの３'末端にＦｌａｇタグをコードする配列を付加して、レトロウイルスベクターｐＭｘ（Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．社製）に挿入し、Ｆｌａｇタグ付きマウスＣｌｅｃ１２遺伝子発現ｐＭｘベクターを構築した。Ｆｌａｇタグ付きマウスＣｌｅｃ１２遺伝子発現ｐＭｘベクターを作製し、これをＲＭＡ細胞にトランスフェクションした。アンピシリンを用いて薬剤選抜を行った。Ｆｌａｇタグ付きマウスＣｌｅｃ１２ｂ（マウスＣｌｅｃ１２ｂのＣ末側にＦｌａｇタグが付いている）を安定発現するＲＭＡ細胞を、マウスＣｌｅｃ１２ｂ発現ＲＭＡ細胞とした。また、トランスフェクションしていないＲＭＡ細胞を、親ＲＭＡ細胞とした。
（３）融合タンパク質（Ｃｌｅｃ１２ｂ－Ｆｃ）の作製
　マウスＣｌｅｃ１２ｂの細胞外部分（マウスＣｌｅｃ１２ｂ全長２７５アミノ酸のうち、６５～２７５番目のアミノ酸）とヒトＩｇＧのＮ末端のＦｃ部分を融合させたキメラタンパク質（Ｃｌｅｃ１２ｂ－Ｆｃ）を文献 (Kanemaru et al, Science Immunol 4: aax6908, 2019)に記載された方法に従って作製した。
（４）ハイブリドーマの樹立
　Ｃｌｅｃ１２ｂ－Ｆｃ（１００μｇ、ＰＢＳ５００μＬ中）をＡＬＵＭ（水酸化アルミニウムゲルアジュバント）と混合し、Ｃｌｅｃ１２ｂ-/-マウス（大阪大学、山崎晶先生が樹立したものを入手）に腹腔内注射した。その後、ＡＬＵＭなしで、Ｃｌｅｃ１２ｂ－Ｆｃのみの腹腔内注射を月１回、合計４回行った。最後の注射の３日後に、免疫した３匹のマウスから脾臓細胞を収集し、ＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを得た。ハイブリドーマは、ＨＡＴ培地（シグマ社製、ＮＯ．Ｈ０１３７－１０ＶＬ）で培養し、コロニーをピックアップし、ｍｅｄｉｕｍ　Ｅ（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｅｓ社製）で増殖させた。マウスＣｌｅｃ１２ｂ発現ＲＭＡ細胞又は親ＲＭＡ細胞を、ハイブリドーマの培養上清で染色し、フローサイトメトリーで分析し、ｍＣｌｅｃ１２ｂと特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングし、選ばれたクローンをクローンＴＸ１０９とした。クローンＴＸ１０９が産生する抗体をＴＸ１０９と称す。クローンＴＸ１０９の培養上清あるいはクローンＴＸ１０９をマウス腹腔内に接種した得られた腹水から、ＨｉＴｒａｐ　ＰｒｏｔｅｉｎＧ（Ｍｅｒｃｋ社製、ＮＯ．ＧＥ１７－０４０４－０１）を用いて、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体を精製した（精製ＴＸ１０９とも称す）。
（５）ＴＸ１０９の配列決定
　ＴＸ１０９の重鎖（ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ）及び軽鎖（ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ）の可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ　ｒｅｇｅｉｏｎ）のＤＮＡ配列をＰＣＲ法により決定した。方法の詳細は、Ｔｈｏｍａｓ　Ｔｉｌｌｅｒ　ｅｔ．ａｌ．、Ｊｏｒｎａｌ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄｓ、３５０、２００９、１８３－１９３に記載の通りである。
　ＴＸ１０９の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（それぞれ配列番号１、配列番号２）を図２、図３に示す。
　〔実施例３〕ＴＸ１０９の特性評価
（１）ＥＬＩＳＡ法によるＴＸ１０９の結合特性評価
（方法）
　マウスＣｌｅｃ１２ａの細胞外部分（マウスＣｌｅｃ１２ａ全長２６７アミノ酸のうち６５～２６７番目のアミノ酸）とヒトＩｇＧのＮ末端のＦｃ部分を融合させたキメラタンパク質（Ｃｌｅｃ１２ａ－Ｆｃ）を文献(Kanemaru et al, Science Immunol 4: aax6908, 2019)に記載された方法に従って作製した。
　マウスＣｌｅｃ１ａの細胞外部分（マウスＣｌｅｃ１ａ全長２８０アミノ酸のうち、７４～２８０番目のアミノ酸）とヒトＩｇＧのＮ末端のＦｃ部分を融合させたキメラタンパク質（Ｃｌｅｃ１ｂ－Ｆｃ）を文献(Kanemaru et al, Science Immunol 4: aax6908, 2019)に記載された方法に従って作製した。
　マウスＣｌｅｃ１ｂの細胞外部分（マウスＣｌｅｃ１ｂ全長２７５アミノ酸のうち、６５～２７５番目のアミノ酸）とヒトＩｇＧのＮ末端のＦｃ部分を融合させたキメラタンパク質（Ｃｌｅｃ１ｂ－Ｆｃ）を文献(Kanemaru et al, Science Immunol 4: aax6908, 2019)に記載された方法に従って作製した。
　９６ウェルプレートにＨｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｃｏｓｍｏ　Ｂｉｏ社製、ＮＯ．ＥＶＨＭ－Ｃ０２－１００）、又はキメラタンパク質（Ｃｌｅｃ１２ｂ－Ｆｃ、Ｃｌｅｃ１２ａ－Ｆｃ、Ｃｌｅｃ１ａ－Ｆｃ、又はＣｌｅｃ１ｂ－Ｆｃ、１μｇ、ＰＢＳ２００μＬ中）を添加して４℃で一晩コーティングした。その後、ＰＢＳで希釈した０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、精製ＴＸ１０９（０μｇ、０．１μｇ、０．０１μｇ、又は０．００１μｇ、ＰＢＳ１００μＬ中）を添加して、２時間室温でインキュベートした。次いでワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ヒトＩｇＧ１（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｒｏｔａｏｒｉｅｓ社製、ＮＯ．１０９－０３５－００８）又はワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ１二次抗体（Ｃｙｔｉｖａ社製、ＮＯ．ＮＡ９３１Ｖ）を添加して１時間室温でインキュベートした。ＰＢＳで希釈した０．０５％Ｔｗｅｅｎで各ウェルを洗浄した後、ＡＢＴＳTM　１－Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｋｉｔ（セラケア社製、ＮＯ．５１２０－００４１）を添加し、ＯＤ４０５値を測定した。ｎ＝３で実験を行った。
（結果）
　結果を図４に示す。図４より、ＴＸ１０９は、Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（ｈＩｇＧ）、Ｃｌｅｃ１２ａ－Ｆｃ（Ｃｌｅｃ１２ａ）、Ｃｌｅｃ１ａ－Ｆｃ（Ｃｌｅｃ１ａ）、及びＣｌｅｃ１ｂ－Ｆｃ（Ｃｌｅｃ１ｂ）には結合せず、Ｃｌｅｃ１２ｂ－Ｆｃ（Ｃｌｅｃ１２ｂ）のみに結合した。また、ＴＸ１０９は、添加したＴＸ１０９の量（Ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ＴＸ１０９）に依存的に、Ｃｌｅｃ１２ｂ－Ｆｃ（Ｃｌｅｃ１２ｂ）に結合した。ＴＸ１０９は、Ｃｌｅｃ１２ｂに特異的に結合することが明らかになった。
（２）フローサイトメトリーによるＴＸ１０９のマウスＣｌｅｃ１２ｂへの結合特性評価
（方法）
　１×１０5ｃｅｌｌｓのマウスＣｌｅｃ１２ｂ発現ＲＭＡ細胞（Ｆｌａｇ－ｍＣｌｅｃ１２ｂ－ＲＭＡ）又は親ＲＭＡ細胞（ＲＭＡ）に、０．５μｇの精製ＴＸ１０９又は抗Ｆｌａｇ抗体（ＳＩＧＭＡ社製、ＮＯ．Ｆ１８０４）を添加し、ｏｎ　ｉｃｅで３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、ＰＥ－ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、ＮＯ．４０５３０７）を添加して、ｏｎ　ｉｃｅで３０分間インキュベートして染色し、フローサイトメーターで解析した。
（結果）
　結果を図５に示す。２又は３の独立した実験の代表的なデータを示した。上のヒストグラムの縦軸は細胞数であり、横軸はａｎｔｉ－Ｆｌａｇである。下のヒストグラムの縦軸は細胞数であり、横軸はＴＸ－１０９である。
　ＴＸ１０９は、親ＲＭＡ細胞には結合せず、マウスＣｌｅｃ１２ｂ発現ＲＭＡ細胞に特異的に結合した。ＴＸ１０９は、マウスＣｌｅｃ１２ｂに特異的に結合することが明らかになった。
（３）フローサイトメトリーによるＴＸ１０９のアイソタイプ解析
（方法）
　１×１０5ｃｅｌｌｓのマウスＣｌｅｃ１２ｂ発現ＲＭＡ細胞に、０．５μｇの精製ＴＸ１０９を添加し、ｏｎ　ｉｃｅで３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、抗ｍＩｇＧ１抗体（ＢＤ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＮＯ．５５５７４９）、抗ｍＩｇＧ２ａ抗体（ＢＤ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＮＯ．５５３３９０）、抗ｍＩｇＧ２ｂ抗体（ＢＤ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＮＯ．５５３３９５）、抗ｍＩｇＧ３抗体（ＢＤ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＮＯ．５５３４０３）、抗ｍＩｇκ抗体（ＢＤ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＮＯ５５０００３）、又は抗ｍＩｇλ抗体（ＢＤ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＮＯ．５５３４３４）を添加して、ｏｎ　ｉｃｅで３０分間インキュベートして染色し、フローサイトメーターで解析した。
（結果）
　結果を図６に示す。２又は３の独立した実験の代表的なデータを示した。各ヒストグラムの縦軸は細胞数であり、横軸はそれぞれ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、Ｉｇκ、Ｉｇλである。
　ＴＸ１０９のサブタイプはＩｇＧ１であり、κ型軽鎖を有することが明らかになった。
（４）ＴＸ１０９の免疫沈降及びウェスタンブロッティングへの使用
（方法）
（免疫沈降）
　精製ＴＸ１０９又は抗Ｆｌａｇ抗体（ＳＩＧＭＡ社製、ＮＯ．Ｆ１８０４）を結合させたプロテインＧビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社製、ＮＯ．１０００４Ｄ）をマウスＣｌｅｃ１２ｂ発現ＲＭＡ細胞又は親ＲＭＡ細胞のライセートと４℃で２時間インキュベートし、ライシスバッファーで洗浄した。プロテインＧビーズに非還元性ＳＤＳ緩衝液を添加した後、ボイルし、その上清をウェスタンブロッティングのサンプルとした（Ｎｏｎ－Ｒｅｄｕｃｉｎｇ）。また、プロテインＧビーズに還元性ＳＤＳ緩衝液を添加した後、ボイルした場合の、その上清をＲｅｄｕｃｉｎｇのサンプルとした。
（ウェスタンブロッティング）
　サンプルは、１０％ＴＧＸゲル上で電気泳動した後、ポリビニリデンジフルオライドメンブレンに転写した。転写後のメンブレンは、３％ＢＳＡと０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝生理食塩水を添加して１時間室温でインキュベートしてブロッキングした後、抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ社製、ＮＯ．Ｆ７４２５－２ＭＧ）を添加し、１時間室温でインキュベートし、洗浄後、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｎａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、ＮＯ．ＭＦＣＤ００１６２７８８）を添加して４５分間室温でインキュベートした。
　精製ＴＸ１０９を、ビオチン標識キット（Ｄｏｊｉｎｄｏ社、Ｎｏ．ＬＫ０３）を用いてビオチン化し、ビオチン化ＴＸ１０９とした。
　図７Ｂでは、ビオチン化抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ社製、ＮＯ．Ｆ９２９１－１ＭＧ）又はビオチン化ＴＸ１０９を用いて１時間室温でインキュベートしたメンブレンを、洗浄後、ＳＡ－ＨＲＰ（Ｃｙｔｉｖａ社製、ＮＯ．ＲＰＮ１２３１Ｖ）を用いて４５分間室温でインキュベートした。洗浄後、メンブレンをＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌTM　Ｗｅｓｔ　Ｐｉｃｏ　ＰＬＵＳ　Ｌｕｍｉｎａｌ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社製、ＮＯ．３４５７９）と安定な過酸化物溶液（Ｔｈｅｒｍｏ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、ＮＯ．１８６３０９６）の混合物と反応させた。蛍光はＬＡＳ４０００で検出した。
（結果）
　結果を図７に示す。２又は３の独立した実験の代表的なデータを示した。左（Ａ）は、免疫沈降（ＩＰ）にＴＸ１０９を用い、イムノブロット（ＩＢ）に抗Ｆｌａｇ抗体（αＦｌａｇ）を用いた結果である。右（Ｂ）は、免疫沈降（ＩＰ）に抗Ｆｌａｇ抗体（αＦｌａｇ）を用い、イムノブロット（ＩＢ）にビオチン化抗Ｆｌａｇ抗体（αＦｌａｇ－ｂｉｏ）又はビオチン化ＴＸ１０９（ＴＸ１０９－ｂｉｏ）を用いた結果である。用いた細胞（Ｃｅｌｌ）は、Ｔｆ（マウスＣｌｅｃ１２ｂ発現ＲＭＡ細胞）、Ｐ（親ＲＭＡ細胞）で示した。
　マウスＣｌｅｃ１２ｂ発現ＲＭＡ細胞のタンパク質をＴＸ１０９を用いて免疫沈降（ＩＰ）し、抗Ｆｌａｇ抗体でイムノブロット（ＩＢ）したところ、非還元条件（ｎｏｎ－Ｒｅｄｕｃｉｎｇ）、還元条件（Ｒｅｄｕｃｉｎｇ）の両方において、６０ＫＤａ付近の特異的なバンドが観察された（図７Ａ）。この結果から、マウスＣｌｅｃ１２ｂの分子量は６０ＫＤａ程度であることが示唆された。また、マウスＣｌｅｃ１２ｂ発現ＲＭＡ細胞をＴＸ１０９で免疫沈降（ＩＰ）し、抗Ｆｌａｇ抗体又はＴＸ１０９でイムノブロット（ＩＢ）したところ、同じ分子量の特異的なバンドが検出された（図７Ｂ）。これらの結果から、ＴＸ１０９は、免疫沈降にもイムノブロットにも使用できる抗体であることが明らかになった。
　〔実施例４〕Ｃｌｅｃ１２ｂを発現する免疫関連細胞の解析
（１）組織からの免疫関連細胞の単離
（方法）
　（背部皮膚（Ｂａｃｋ　Ｓｋｉｎ））
　剃毛後の野生型マウスの背部から採取した皮膚組織（～１２ｃｍ2）を小片に切断し、２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＤ（Ｓｉｇｍａ社製、ＮＯ．１１０８８８８２００１）、１μＬ／ｍＬデオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製、ＮＯ．ＬＳ００２１３９）、及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ　Ｍｅｄｉｕｍ（ｃＲＰＭＩ）中で３７℃１時間消化した。
　（脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ））
　野生型マウスから、脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ　Ｍｅｄｉｕｍ（ｃＲＰＭＩ）中で被膜を剥離し、細胞を誘出し単細胞懸濁液とした。
　（腹腔滲出液細胞（ＰＥＣ））
　野生型マウスの腹腔を１ｍＬのＰＢＳで洗浄して腹腔滲出液細胞（ＰＥＣ）を採取した。
　（結腸粘膜固有層（Ｃｏｌｏｎ　ＬＰ））
　野生型マウス結腸の組織を小片に切断し、０．５Ｍ　ＥＤＴＡを添加して３７℃で１５分間消化し、上皮層を除去した。上皮層の除去後、組織をさらに２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＤと１μＬ／ｍＬデオキシリボヌクレアーゼＩを含むｃＲＰＭＩで３７℃１時間処理した後、ナイロンメッシュでろ過した。消化と濾過を２回以上繰り返して、単細胞懸濁液とした。
　（心臓（Ｈｅａｒｔ））
　野生型マウスから採取した心臓組織をＰＢＳで再灌流した後、直ちにＨａｎｋ'ｓ　ｂａｌａｎｃｅｄ　ｓａｌｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）で洗浄し、小片に切り、２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＤ、１μＬ／ｍＬデオキシリボヌクレアーゼＩ及び１００μＭクロモリンナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ社製、ＮＯ．Ｃ０３９９－１Ｇ）を含むｃＲＰＭＩ中で３７℃１時間消化し、次いで１００μｍナイロンメッシュフィルターで濾過し、遠心分離を行った。ペレットを１００μＭのクロモリンナトリウム塩溶液に再懸濁し、次いで４０％パーコールで密度勾配遠心し、ペレットを回収した。
　（２）フローサイトメトリーによる解析
　Ｃｌｅｃ１２ｂの内因性の発現を解析するために、皮膚、脾臓、腹腔滲出液、結腸粘膜固有層、心臓から抽出した細胞を、細胞表面マーカーに対する抗体、ビオチン化ＴＸ１０９又はビオチン化ｍＩｇＧ１（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＮＯ．５５３４４１）を一次抗体として染色し、次いでストレプトアビジン共役ＡＰＣａｓ二次抗体（Ａｂｃａｍ社製、ＮＯ．ａｂ２４３０９９）を用いて染色した。
　細胞表面マーカーに対する抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製の以下の抗マウス抗体を用いた。かっこ内にクローン名を示す。Ｂ２２０（ＲＡ３－６Ｂ２）、ＦｃεＲＩα（ＭＡＲ１）、ＣＤ４９ｂ（ＤＸ５）、Ｆ４／８０（ＢＭ８）、ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）、ｍＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、ＭＨＣＩＩ（Ｍ５／１１４．１５．２）、ｃ－Ｋｉｔ（２Ｂ８）、ＣＤ４５．２（１０４）、ＣＤ６４（Ｘ５４－５／７．１）、Ｌｙ６Ｃ（ＨＫ１．４）、ＣＤ２００Ｒ（ＯＸ－１１０）。
　抗マウスＣＤ３ε抗体は、ＢＤ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、クローン１４５－２Ｃ１１を用いた。
　ゲーティングは以下に示すように行った。
Ｂａｃｋ　Ｓｋｉｎ
　ＤＣ；ＣＤ４５．２+ＣＤ６４-ＭＨＣＩＩ+
　Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ（ＭＰ）；ＣＤ４５．２+ＣＤ６４+ＭＨＣＩＩ+
　Ｔ　ｃｅｌｌ；ＣＤ４５．２+ＣＤ６４-ＭＨＣＩＩ-ＣＤ３ε+
　Ｍｏｎｏｃｙｔｅ；ＣＤ４５．２+ＣＤ６４-ＭＨＣＩＩ-ＣＤ３ε-Ｌｙ６Ｃ+
　Ｍａｓｔ　Ｃｅｌｌ；ＣＤ４５．２+ＣＤ６４-ＭＨＣＩＩ-ｃｋｉｔ+ＦｃεＲＩα+
Ａ）Ｓｐｌｅｅｎ
　Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌ（ＤＣ）；ＣＤ１１ｃ+ＭＨＣＩＩ+
　Ｂａｓｏｐｈｉｌ；ＣＤ４９+ＦｃεＲＩα+
　Ｔ　ｃｅｌｌ；ＣＤ３ε+
　Ｂ　ｃｅｌｌ；Ｂ２２０+
Ｂ）ＰＥＣ
　ＤＣ；ＣＤ１１ｃ+ＭＨＣＩＩ+
　ｌａｒｇｅ　ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ（ＬＰＭ）；ＣＤ１１ｂhiＦ４／８０hiＭＨＣＩＩ+
　ｓｍａｌｌ　ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ（ＳＰＭ）；ＣＤ１１ｂhiＦ４／８０midＭＨＣＩＩ+
　Ｔ　ｃｅｌｌｓ；ＣＤ３ε+Ｂ　ｃｅｌｌｓ；Ｂ２２０+
　Ｍａｓｔ　ｃｅｌｌ；ＣＤ１１ｂloＦ４／８０loＭＨＣＩＩ-ｃｋｉｔ+ＦｃεＲＩα+
Ｃ）Ｃｏｌｏｎ
　ＬＰＬｙ６Ｃ＋　Ｍｏｎｏｃｙｔｅ（Ｍｏ）；ＣＤ４５．２+ＭＨＣＩＩ-Ｌｙ６Ｃ+
　ＤＣ；ＣＤ４５．２+ＭＨＣＩＩ+
　Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ（ＭＰ）；ＣＤ４５．２+ＭＨＣＩＩ+ＣＤ１１ｃ-ＣＤ１１ｂ+
　Ｍａｓｔ　Ｃｅｌｌ；ＣＤ４５．２+ＭＨＣＩＩ-ＣＤ１１ｃ-ｃｋｉｔ+ＦｃεＲＩα+
Ｄ）　Ｈｅａｒｔ
　ＣＤ１１ｂ+；ＣＤ４５．２+ＣＤ１１ｂ+
　Ｔ　ｃｅｌｌ；ＣＤ４５．２+ＣＤ１１ｂ-ｃｋｉｔ－ＦｃεＲＩα－ＣＤ３ε+
　Ｍａｓｔ　Ｃｅｌｌ；ＣＤ４５．２+ＣＤ１１ｂ-ｃｋｉｔ＋ＦｃεＲＩα+
（結果）
　皮膚での結果を図８－１、脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）での結果を図８－２、腹腔滲出液細胞（ＰＥＣ）での結果を図８－３、結腸粘膜固有層（Ｃｏｌｏｎ　ＬＰ）での結果を図８－４、心臓（Ｈｅａｒｔ）の結果を図８－５に示す。２又は３の独立した実験の代表的なデータを示した。各ヒストグラムの縦軸は細胞数であり、横軸はＣｌｅｃ１２ｂである。
　Ｃｌｅｃ１２ｂは、皮膚において、ＣＤ４５．２+、ＣＤ６４-、ＣＤ３-、ｃ－Ｋｉｔ+、ＦｃεＲＩα-の細胞集団（ｃ－Ｋｉｔ+ＦｃεＲＩα-）、及びＣＤ４５．２+、ＣＤ６４-、ＣＤ３-、ｃ－Ｋｉｔ+、ＦｃεＲＩα+の細胞集団（ｃ－Ｋｉｔ+ＦｃεＲＩα+）に高度に発現していた（図８－１）。Ｃｌｅｃ１２ｂ陽性細胞は、ｃ－Ｋｉｔ+ＦｃεＲＩα-の８３％、ｃ－Ｋｉｔ+ＦｃεＲＩα+の８４％であった。
　ｃ－Ｋｉｔ+ＦｃεＲＩα-及びｃ－Ｋｉｔ+ＦｃεＲＩα+は、肥満細胞に選択的に発現しているＣＤ２００Ｒも発現していることから、これらの細胞集団は皮膚肥満細胞であることが示唆された。ＣＤ２００Ｒ陽性細胞は、ｃ－Ｋｉｔ+ＦｃεＲＩα-の８９％、ｃ－Ｋｉｔ+ＦｃεＲＩα+の１００％であった。なお、ｃ－Ｋｉｔ+ＦｃεＲＩα-は、皮膚において肥満細胞の前駆体であると考えられている。
　Ｃｌｅｃ１２ｂは、脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）、結腸粘膜固有層（Ｃｏｌｏｎ　ＬＰ）、心臓（Ｈｅａｒｔ）においては、どの細胞集団にも発現していなかった（図８－２、図８－４、図８－５）。
　図８－３より、腹腔滲出液細胞（ＰＥＣ）の肥満細胞においては、Ｃｌｅｃ１２ｂがわずかに発現していたが、Ｃｌｅｃ１２ｂ陽性細胞は、腹腔滲出液細胞（ＰＥＣ）肥満細胞の３９．７％に過ぎなかった。
　以上の結果から、Ｃｌｅｃ１２ｂは、皮膚肥満細胞上に高度に発現し、腹腔滲出液細胞（ＰＥＣ）肥満細胞上にもわずかに発現しているが、Ｃｌｅｃ１２ｂを発現している肥満細胞の割合（Ｃｌｅｃ１２ｂ発現肥満細胞／肥満細胞）は、ＰＥＣよりも皮膚の方が大きいことが明らかになった。すなわち、Ｃｌｅｃ１２ｂは、皮膚肥満細胞系列の細胞に選択的に発現しており、皮膚肥満細胞系列の細胞の大部分がＣｌｅｃ１２ｂを発現していることが明らかになった。
　Ｃｌｅｃ１２ｂは、ヒト皮膚と同様に、マウス皮膚においても肥満細胞に選択的に発現していることが明らかになった。
　〔実施例５〕マウスＣｌｅｃ１２ｂ発現ＲＭＡ細胞に対する、ＴＸ１０９のＡＤＣＣ活性
（方法）
（１）マウスＮＫ細胞の分離
　マウスＮＫ細胞は、マウス脾臓細胞から、ビオチン化抗ＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、クローンＧＫ１．５）、ビオチン化抗ＣＤ５抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、クローン５３－７．３）、ビオチン化抗ＣＤ８ａ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、クローン５３－６．７）、ビオチン化抗ＣＤ１９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、クローン１Ｄ３）、ビオチン化抗Ｇｒ－１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、クローン１Ｄ３）、ビオチン化抗Ｔｅｒ－１１９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、クローンＲＢ６－８Ｃ５）、及びＤｙｎａｂｅａｄｓ　ＭｙＯｎｅ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ｃ１（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いたネガティブセレクションにより分離した。分離したマウスＮＫ細胞は、リコンビナントヒトＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＮＯ．５４６０３）と１日間インキュベートし、ＩＬ－２刺激ＮＫ細胞（ＩＬ－２－ｐｒｉｍｅｄ　ＮＫ）とした。
　また、アッセイの１日前にＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）５００μｇを注射したマウスから、上記の方法で分離したＮＫ細胞を、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激ＮＫ細胞（Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）－ｐｒｉｍｅｄ　ＮＫ）とした。
（２）ＡＤＣＣ活性評価
　エフェクター細胞をＩＬ－２刺激ＮＫ細胞又はＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激ＮＫ細胞とし、ターゲット細胞を実施例２で樹立したマウスＣｌｅｃ１２ｂ発現ＲＭＡ細胞又は親ＲＭＡ細胞として、ＴＸ１０９のＡＤＣＣ活性を以下の方法により評価した。
　マウスＣｌｅｃ１２ｂ発現ＲＭＡ細胞又は親ＲＭＡ細胞を、精製ＴＸ１０９（１００μｇ／ｍＬ、グラフ中ではＴＸ１０９と表記）又はコントロールマウスＩｇＧ１，κ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、クローン：ＭＯＰＣ－２１、１００μｇ／ｍＬ、グラフ中ではＩｓｏｔｙｐｅと表記）で前処理した後、ＩＬ－２刺激ＮＫ細胞又はＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激ＮＫ細胞と共に５時間共培養した。ＩＬ－２刺激ＮＫ細胞又はＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激ＮＫ細胞における、ＣＤ１０７ａ及びインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）の発現をフローサイトメトリーで分析した。抗ＣＤ１０７ａ抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、クローン：１Ｄ４Ｂ、抗インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、クローン：ＸＭＧ１．２を用いた。
（結果）
　結果を図９に示す。グラフ縦軸は、ＮＫ細胞中のＩＦＮ－γ陽性細胞の割合（％）、又はＮＫ細胞中のＣＤ１０７ａ陽性細胞の割合（％）を示す。
　ＴＸ１０９は、ＩＬ－２刺激ＮＫ細胞（ＩＬ－２　ｐｒｉｍｅｄ　ＮＫ）又はＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激ＮＫ細胞（Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）－ｐｒｉｍｅｄ　ＮＫ）のいずれを用いた場合においても、ＮＫ細胞のマウスＣｌｅｃ１２ｂ発現ＲＭＡ細胞に対する細胞障害活性を有意に亢進させた。ＴＸ１０９は、ＡＤＣＣ活性を有する事が明らかになった。このことは、ＴＸ１０９等の抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体は、Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞を殺傷することが可能であり、その結果としてアレルギー性疾患を予防又は治療することができることを示す。
　〔実施例８〕ダニ抗原塗布による皮膚炎モデルにおける抗Ｃｌｅｃ１２ｂの有効性
（方法）
　実験スケジュールの概略を図１０に示す。
　野生型ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア株式会社から入手、野生型、メス、１０～１３週齢、各群６匹ずつ）の頚背部の体毛を電気シェーバーで剃り、除毛クリーム（クラシエ「エピラット除毛クリーム」）で除毛した。この日をＤａｙ－１とした。
　除毛の翌日（Ｄａｙ０）、ＴＸ１０９又はコントロール抗体（「Ｕｌｔｒａ－ＬＥＡＦTM　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ１、κ　Ｃｔｒｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｃｌｏｎｅ：ＭＯＰＣ－１）」、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．４００１９７）を、両耳介に２μｇ／２０μＬずつ、さらに、頚背部上部２ｃｍ×２ｃｍ角の範囲内の４隅に５μｇ／５０μＬずつ（すなわち、頚背部上部２ｃｍ×２ｃｍ角の範囲内の４カ所の合計塗布量が２０μｇ／２００μＬ）皮内投与した。抗体の溶媒はＰＢＳとした。
　さらにその翌日（Ｄａｙ１）、頚背部全体にダニ抗原（コナヒョウダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ　ｆａｒｉｎａｅ）由来成分配合軟膏、アトピー性皮膚炎誘発試薬「ビオスタＡＤ」、株式会社ビオスタ製、Ｃａｔ．Ｎｏ．３０３－３４１３１）を１００ｍｇずつ塗布した。
　ダニ抗原は、Ｄａｙ１と同様の手法で毎日１回、計５回塗布し、抗体はＤａｙ０と同様の手法で２日に１回、計３回皮内投与した。
　Ｄａｙ０以降毎日、皮膚炎症状のスコアリングを行った。スコアリングは以下の方法で行った。　１）痒覚（Ｉｔｃｈ　ｓｃｏｒｅ）、２）発赤・出血（Ｒｅｄｎｅｓｓ／ｂｌｅｅｄｉｎｇ　ｓｃｏｒｅ）、３）浮腫（Ｆａｃｅ　ｅｄｅｍａ　ｓｃｏｒｅ）、４）擦過傷・びらん（Ａｂｒａｓｉｏｎ／ｅｒｏｓｉｏｎ　ｓｃｏｒｅ）、５）痂皮形成・乾燥（Ｃｒｕｓｔ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ｄｒｙｉｎｇ　ｓｃｏｒｅ）の５つの評価項目に対し、それぞれ、無症状を０点、軽度を１点、中等度を２点、重度を３点として評点付けを行った。これらの５つのスコアの総計をＴｏｔａｌ　ｓｃｏｒｅとした。
　なお、痒覚は、馴化１０分後の５分間の掻爬回数をもとに評価を行った。０－３回は０点、４－６回は１点、７－９回は２点、１０回以上は３点とした。
　発赤・出血は、凝固していない出血は評価の対象外とし、耳介と頚背部における発赤の程度及び出血箇所の数をもとに評価を行った。
　浮腫は、顔面の膨張の程度をもとに評価を行った。
　擦過傷・びらんは、耳介裏及び頚背部皮膚において、その数をカウントし、評価を行った。
　痂皮形成・乾燥は、顔面と頚背部の皮膚における乾燥の程度及び痂皮の数をカウントし、評価を行った。
　Ｄａｙ６に頚背部から皮膚試料を採取した。
　採取した皮膚試料は固定した後、パラフィン包埋した。ミクロトームで厚さ４μｍの切片を作製し、以下の方法でヘマトキシリンエオジン染色及びトルイジンブルー染色を行った。
（ヘマトキシリンエオジン染色）
　染色試薬として、ヘマトキシリン溶液（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｍａｙｅｒ’ｓ）（富士フイルム和光純薬株式会社、＃１３１－０９６６５）、及び０．２５％Ｅｏｓｉｎ　Ｙ溶液（０．５％エオシン－Ｙ溶液（富士フイルム和光純薬株式会社、＃０５４－０６５０５）を９９．５％ＥｔＯＨで１：１の割合で希釈して作製した）を用いた。
　切片を張り付けたスライドガラスを６０℃で１０分間加熱し、切片を剥がれにくくした。次に、脱パラフィン（キシレンで５分×３回）した後、再水和（９９．５％ＥｔＯＨで３分×２回、９０％ＥｔＯＨで１分×２回、７０％ＥｔＯＨで１分×２回）してから、ヘマトキシリン溶液２００ｍＬに浸漬し、室温で５分間インキュベートして、核を染色した。次に、切片を流水で５分間洗浄した後、０．２５％Ｅｏｓｉｎ　Ｙ溶液２００ｍＬに５分間浸漬し、細胞質を染色した。水道水で軽く洗浄した後、脱水（７０％ＥｔＯＨで１分、９０％ＥｔＯＨで１分、９９．５％ＥｔＯＨで３分×２回）した後、透徹（キシレンで５分×３回）し、マウントクイックでマウントし、顕微鏡観察に供した。
（トルイジンブルー染色）
　染色試薬として０．５％トルイジンブルー溶液（富士フイルム和光純薬株式会社、＃２０９－１４５４５）を用いた。
　切片を張り付けたスライドガラスを６０℃で１０分間加熱し、切片を剥がれにくくした。次に、脱パラフィン（キシレンで５分×３回）した後、再水和（９９．５％ＥｔＯＨで２分×２回、９０％ＥｔＯＨで１分、７０％ＥｔＯＨで１分、ｄＨ2Ｏで１分）してから、０．５％トルイジンブルー溶液２００ｍＬに浸漬し、室温で６０分間インキュベートして、染色した。次に、切片をｄＨ2Ｏで軽く洗浄した後、脱水（７０％ＥｔＯＨで軽く、９０％ＥｔＯＨで軽く、９９．５％ＥｔＯＨで１分×２回）した後、透徹（キシレンで５分×３回）し、マウントクイックでマウントし、顕微鏡観察に供した。
　ヘマトキシリンエオジン染色した皮膚切片を顕微鏡観察し、１ｍｍ2の表皮層を無作為に５か所選定して、Ｋｅｙｅｎｃｅ　ＢＺ－Ｘ　ａｎａｌｙｚｅｒを用いて表皮層の厚さを計測し、５か所の平均値を表皮層の厚さとした。
　トルイジンブルー染色した皮膚切片を顕微鏡観察し、１視野、１ｍｍ2当たりの異染性を示す肥満細胞数を計測した。
（結果）
　ヘマトキシリンエオジン染色（ＨＥ）又はトルイジンブルー染色（Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ　ｂｌｕｅ）した皮膚切片の顕微鏡写真を図１１に示す。各群の代表的な３匹の写真を示す。表皮厚さ及び単位面積（ｍｍ2）当たりの肥満細胞数を図１２に示す。皮膚炎症状のスコアを図１３に示す。
　ダニ抗原を塗布して皮膚炎を惹起すると、表皮が厚くなり、より多くの肥満細胞が真皮内に見られるようになる。しかし、ＴＸ１０９を投与すると、コントロール抗体（ｃＩｇ）投与に比べて、表皮の厚さ及び単位面積（ｍｍ2）当たりの肥満細胞数が改善していた（図１１、図１２）。
　また、ＴＸ１０９を投与すると、コントロール抗体投与に比べて、痒覚（Ｉｔｃｈ　Ｓｃｏｒｅ）、浮腫（Ｆａｃｅ　ｅｄｅｍａ　ｓｃｏｒｅ）、発赤・出血（Ｒｅｄｎｅｓｓ／ｂｌｅｅｄｉｎｇ　ｓｃｏｒｅ）、擦過傷・びらん（Ａｂｒａｓｉｏｎ／ｅｒｏｓｉｏｎ　ｓｃｏｒｅ）、痂皮形成・乾燥（Ｃｒｕｓｔ　Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ｄｒｙｉｎｇ　ｓｃｃｏｒｅ）、これらの５つのスコアの総計（Ｔｏｔａｌ　Ｓｃｏｒｅ）の全ての項目において、皮膚炎スコアが改善していた。
　ＴＸ１０９により、皮膚の肥満細胞が減少し、皮膚炎症状が減弱されることが明らかになった。
　これらの結果から、抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体は、アレルギー性疾患の予防又は治療剤として有用であることが示された。

Claims (8)

  1. 　抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体又はその抗体断片を含む、アレルギー性疾患の予防又は治療剤。
  2. 　前記抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体が、Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞に対する細胞障害活性を有する、請求項１に記載のアレルギー性疾患の予防又は治療剤。
  3. 　前記Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞が、肥満細胞である、請求項２に記載のアレルギー性疾患の予防又は治療剤。
  4. 　前記Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞が、皮膚肥満細胞である、請求項２又は３に記載のアレルギー性疾患の予防又は治療剤。
  5. 　前記細胞障害活性が、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）活性である、請求項２～４のいずれか１項に記載のアレルギー性疾患の予防又は治療剤。
  6. 　前記抗Ｃｌｅｃ１２ｂ抗体が、Ｃｌｅｃ１２ｂ発現細胞を除去する抗体である、請求項１～５のいずれか１項に記載のアレルギー性疾患の予防又は治療剤。
  7. 　前記アレルギー性疾患が、皮膚アレルギー性疾患である、請求項１～６のいずれか１項に記載のアレルギー性疾患の予防又は治療剤。
  8. 　前記皮膚アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、蕁麻疹から選ばれる少なくとも１つである、請求項７に記載のアレルギー性疾患の予防又は治療剤。
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