JP2022548057A - Ｈｅｒ３抗原結合性分子を使用したがんの処置および予防 - Google Patents

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Abstract

対象におけるがんを処置または予防するための方法であって、がんが、ＨＥＲ３に対するリガンドの増加した発現を生じる突然変異を有する細胞を含み、ＨＥＲ３に結合することができる治療または予防有効量の抗原結合性分子を対象に投与するステップを含む、方法が開示される。【選択図】図１Ａ

Description

本出願は、２０１９年９月１１日に出願されたＧＢ１９１３０７９．８からの優先権を主張し、その内容および要素は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の分野
本発明は、分子生物学の分野に関し、より具体的には、抗体技術ならびに医学的な処置および予防の方法に関する。
ＨＥＲ３発現の増大は、乳がん、胃がん、頭頸部がん、膵がん、卵巣がん、および肺がんを含む、複数の固形腫瘍における予後不良と連関する。ＨＥＲ３媒介性シグナル伝達は、腫瘍の進行に有害な帰結をもたらし、ＨＥＲ３の上方調節は、抗ＨＥＲ２および抗ＥＧＦＲ療法に対する耐性と関連し、抗ＰＤ－１療法に対して不応性の固形腫瘍は、抗ＰＤ－１療法に対する応答者と比較して、高度にＨＥＲ３を発現することが示されている。
ＨＥＲ３結合性抗体は、例えば、Ｚｈａｎｇら、Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ（２０１６）４８（１）：３９～４８に記載されている。抗ＨＥＲ３抗体である、ＬＪＭ－７１６は、ＨＥＲ３細胞外ドメインのサブドメインＩＩおよびＩＶ上のエピトープに結合し、ＨＥＲ３を不活性コンフォメーションにロックする（Ｇａｒｎｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０１３）７３：６０２４～６０３５）。ＭＭ－１２１（セリバンツマブとしても公知である）は、ヘレグリン（ＨＲＧ）のＨＥＲ３への結合を遮断することにより、ＨＥＲ３媒介性シグナル伝達を阻害することが示されている（Ｓｃｈｏｅｂｅｒｌら、Ｓｃｉ．Ｓｉｇｎａｌ．（２００９）２（７７）：ｒａ３１）。パトリツマブ（Ｕ－１２８７およびＡＭＧ－８８８としても公知である）もまた、ヘレグリンのＨＥＲ３への結合を遮断する（例えば、Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２０１７）、７９（３）：４８９～４９５を参照されたい）。ＲＧ７１１６（ルムレツズマブおよびＲＯ－５４７９５９９としても公知である）は、ＨＥＲ３細胞外ドメインのサブドメインＩ内のエピトープを認識する（例えば、Ｍｉｒｓｃｈｂｅｒｇｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１３）７３（１６）５１８３～５１９４を参照されたい）。ＫＴＮ３３７９は、サブドメインＩＩＩ内のアミノ酸残基（配列番号１の以下の位置：Ｇｌｙ４７６、Ｐｒｏ４７７、Ａｒｇ４８１、Ｇｌｙ４５２、Ａｒｇ４７５、Ｓｅｒ４５０、Ｇｌｙ４２０、Ａｌａ４５１、Ｇｌｙ４１９、Ａｒｇ４２１、Ｔｈｒ３９４、Ｌｅｕ４２３、Ａｒｇ４２６、Ｇｌｙ４２７、Ｌｙｓ３５６、Ｌｅｕ３５８、Ｌｅｕ３５８、Ｌｙｓ３５６、Ａｌａ３３０、Ｌｙｓ３２９、およびＧｌｙ３３７に対応する）、ならびにサブドメインＩＩのＭｅｔ３１０、Ｇｌｕ３１１、およびＰｒｏ３２８（Ｌｅｅら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１５年１０月２７日、１１２（４３）：１３２２５を参照されたい）との相互作用を介して、ＨＥＲ３に結合する。ＡＶ－２０３（ＣＡＮ－０１７としても公知である）は、ＮＲＧ１のＨＥＲ３への結合を遮断し、ＨＥＲ３の分解を促進することが示されている（Ｍｅｅｔｚｅら、Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２０１２、４８：１２６を参照されたい）。ＲＥＧＮ１４００もまた、リガンドのＨＥＲ３への結合を阻害する（Ｚｈａｎｇら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ（２０１４）１３：１３４５～１３５５を参照されたい）。ＲＧ７５９７（ドゥリゴツズマブ）は、ＨＥＲ３およびＥＧＦＲの両方に結合することができる二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）であり、ＨＥＲ３のサブドメインＩＩＩに結合する（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ（２０１１）２０（４）：４７２～４８６を参照されたい）。ＭＭ－１１１およびＭＭ－１４１は、ＨＲＧリガンドのＨＥＲ３への結合を阻害する、ＨＥＲ３結合性アームを有する二特異性抗体である（ＭｃＤｏｎａｇｈら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ（２０１２）１１：５８２～５９３およびＦｉｔｚｇｅｒａｌｄら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ（２０１４）１３：４１０～４２５を参照されたい）。
本発明は、対象におけるがんを処置または予防する方法における使用のための、本明細書に記載される任意の実施形態に係るＨＥＲ３に結合することができる抗原結合性分子であって、がんが、ＨＥＲ３リガンドの発現／過剰発現によって特徴付けられる細胞を含む、抗原結合性分子を提供する。
また、対象におけるがんを処置または予防する方法における使用のための医薬の製造における、本明細書に記載される任意の実施形態に係るＨＥＲ３に結合することができる抗原結合性分子の使用であって、がんが、ＨＥＲ３リガンドの発現／過剰発現によって特徴付けられる細胞を含む、使用も提供する。
また、対象におけるがんを処置または予防する方法であって、がんが、ＨＥＲ３リガンドの発現／過剰発現によって特徴付けられる細胞を含み、本明細書に記載される任意の実施形態に係るＨＥＲ３に結合することができる治療または予防有効量の抗原結合性分子を対象に投与するステップを含む、方法も提供する。
本発明の多様な態様に従う、一部の実施形態では、がんは、ＨＥＲ３に対するリガンドの増大した発現を生じる突然変異を有する細胞を含む。
より具体的には、本発明は、対象におけるがんを処置または予防する方法における使用のための、ＨＥＲ３に結合することができる抗原結合性分子であって、がんが、ＨＥＲ３に対するリガンドの増大した発現を生じる突然変異を有する細胞を含み、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号４６のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号５１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる重鎖可変（ＶＨ）領域、および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号９１のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号９４のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号９９のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、抗原結合性分子を提供する。
また、対象におけるがんを処置または予防する方法における使用のための医薬の製造における、ＨＥＲ３に結合することができる抗原結合性分子の使用であって、がんが、ＨＥＲ３に対するリガンドの増大した発現を生じる突然変異を有する細胞を含み、抗原結合性分子が、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号４６のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号５１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる重鎖可変（ＶＨ）領域、および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号９１のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号９４のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号９９のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、使用も提供する。
また、対象におけるがんを処置または予防する方法であって、がんが、ＨＥＲ３に対するリガンドの増大した発現を生じる突然変異を有する細胞を含み、方法が、ＨＥＲ３に結合することができる治療または予防有効量の抗原結合性分子を対象に投与するステップを含み、抗原結合性分子が、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号４６のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号５１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる重鎖可変（ＶＨ）領域、および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号９１のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号９４のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号９９のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、方法も提供する。
本発明の多様な態様に従う、一部の実施形態では、ＨＥＲ３に対するリガンドは、ＮＲＧのＥＧＦ様ドメインに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、がんは、ＮＲＧ遺伝子融合体を有する細胞を含む。一部の実施形態では、ＮＲＧ遺伝子融合体は、ＣＬＵ－ＮＲＧ１、ＣＤ７４－ＮＲＧ１、ＤＯＣ４－ＮＲＧ１、ＳＬＣ３Ａ２－ＮＲＧ１、ＲＢＰＭＳ－ＮＲＧ１、ＷＲＮ－ＮＲＧ１、ＳＤＣ４－ＮＲＧ１、ＲＡＢ２ＩＬ１－ＮＲＧ１、ＶＡＭＰ２－ＮＲＧ１、ＫＩＦ１３Ｂ－ＮＲＧ１、ＴＨＡＰ７－ＮＲＧ１、ＳＭＡＤ４－ＮＲＧ１、ＭＤＫ－ＮＲＧ１、ＴＮＣ－ＮＲＧ１、ＤＩＰ２Ｂ－ＮＲＧ１、ＭＲＰＬ１３－ＮＲＧ１、ＰＡＲＰ８－ＮＲＧ１、ＲＯＣＫ１－ＮＲＧ１、ＤＰＹＳＬ２－ＮＲＧ１、ＡＴＰ１Ｂ１－ＮＲＧ１、ＣＤＨ６－ＮＲＧ１、ＡＰＰ－ＮＲＧ１、ＡＫＡＰ１３－ＮＲＧ１、ＴＨＢＳ１－ＮＲＧ１、ＦＯＸＡ１－ＮＲＧ１、ＰＤＥ７Ａ－ＮＲＧ１、ＲＡＢ３ＩＬ１－ＮＲＧ１、ＣＤＫ１－ＮＲＧ１、ＢＭＰＲＩＢ－ＮＲＧ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ－ＮＲＧ１、ＭＣＰＨ１－ＮＲＧ１およびＳＬＣ１２Ａ２－ＮＲＧ２から選択される。一部の実施形態では、ＮＲＧ遺伝子融合体は、ＣＬＵ－ＮＲＧ１、ＣＤ７４－ＮＲＧ１、ＳＬＣ３Ａ２－ＮＲＧ１またはＶＡＭＰ２－ＮＲＧ１から選択される。
一部の実施形態では、がんは、肺、乳房、頭部、頸部、腎臓、卵巣、膵臓、前立腺、子宮、胆嚢、結腸、直腸、膀胱、軟部組織または鼻咽頭に由来する。
一部の実施形態では、がんは、肺がん、非小細胞肺がん、肺線癌、浸潤性粘液性肺線癌、肺扁平上皮癌、乳がん、乳癌、浸潤性乳癌、頭頸部がん、頭頸部扁平上皮癌、腎がん、腎明細胞癌、卵巣がん、卵巣漿液性嚢胞腺癌、膵がん、膵腺癌、膵管腺癌、前立腺がん、前立腺腺癌、子宮内膜がん、子宮癌肉腫、胆嚢がん、胆管癌、結腸直腸がん、膀胱がん、尿路上皮膀胱がん、肉腫、軟部組織肉腫、神経内分泌腫瘍および鼻咽頭神経内分泌腫瘍から選択される。一部の実施形態では、がんは、肺がん、非小細胞肺がん、肺線癌、浸潤性粘液性肺線癌および肺扁平上皮癌から選択される。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号４５のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号４８のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいるＶＨ領域、および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号８８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号９２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号９５のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいるＶＬ領域
を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
配列番号３６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および
配列番号８３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域
を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
以下のフレームワーク領域（ＦＲ）：
配列番号５３のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ１
配列番号５９のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ２
配列番号６６のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ３
配列番号７１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ４
を組み込んでいるＶＨ領域
を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
以下のフレームワーク領域（ＦＲ）：
配列番号１０４のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ１
配列番号１１０のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ２
配列番号１２０のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ３
配列番号１２５のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ４
を組み込んでいるＶＬ領域
を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号１７１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号１７７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
公知の抗ＨＥＲ３抗体は大きく２つのクラスに分類される。第１のクラスの抗体はＨＥＲ３のドメインＩおよび／またはＩＩＩに結合し、それによってＨＥＲ３へのリガンド結合を競合的に阻害する。セリバンツマブ（ＭＭ－１２１）はこのクラスの代表的なメンバーであり、他のメンバーには、パトリツマブ（Ｕ３－１２８７またはＡＭＧ－８８８）、ルムレツズマブ（ＲＧ－７１１６）、ＡＶ－２０３、ＧＳＫ２８４９３３０およびＲＥＧＮ１４００が含まれる。第２のクラスの抗体は、ドメインＩＩとＩＶとの間、またはドメインＩＩとＩＩＩとの間の界面への結合を介して、不活性なコンフォメーションにＨＥＲ３をロックする。ＬＪＭ－７１６は、ＫＴＮ３３７９と同様に、このクラスの代表的な例である。
本発明は、公知の抗ＨＥＲ３抗体と比較して、改善された特性を有する、新規のＨＥＲ３結合性分子に関する。
本発明者らは、ＨＥＲ３の細胞外領域内の特定の目的の領域に結合する抗原結合性分子の標的化された生成を企図した。本発明のＨＥＲ３結合性分子は、先行技術において開示された抗原結合性分子と比較して、所望の生物物理的および／または機能的特性の組合せを備える。
本発明の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３の細胞外領域のサブドメインＩＩ（配列番号１６）に結合することができ、結合しているＨＥＲ３分子の、相互作用パートナーとの会合を阻害する。
特に、本明細書で記載されるＨＥＲ３結合性抗原結合性分子は、ＨＥＲ３のエピトープに結合し、（ｉ）ＨＥＲ３の、相互作用パートナー（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２）との会合の強力な阻害、および（ｉｉ）ＮＲＧリガンドの存在下および非存在下の両方でのＨＥＲ３への高親和性結合をもたらすことが実証される。この特性の特有の組合せにより、下流のシグナル伝達の強力な阻害、および広範ながんに対する例外的な抗がん活性がもたらされる。
ＨＥＲ３
ＨＥＲ３（例えば、ＥＲＢＢ３ ＬＣＣＳ２、ＭＤＡ－ＢＦ－１としても公知である）は、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ２１８６０により同定されたタンパク質である。ヒトＥＲＢＢ３遺伝子によりコードされるｍＲＮＡの選択的スプライシングは、５つの異なるアイソフォーム：アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２１８６０－１、ｖ１；配列番号１）；１４１位において配列番号１と異なる配列を含み、配列番号１の１８３～１３４２位に対応するアミノ酸配列を欠く、アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２１８６０－２；配列番号２）；配列番号１と比べた置換Ｃ３３１Ｆを含み、配列番号１の３３２～１３４２位に対応するアミノ酸配列を欠く、アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２１８６０－３；配列番号３）；配列番号１の１～５９位に対応するアミノ酸配列を欠く、アイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２１８６０－４；配列番号４）；および配列番号１の１～６４３位に対応するアミノ酸配列を欠く、アイソフォーム５（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２１８６０－５；配列番号５）をもたらす。
配列番号１～３のＮ末端の１９アミノ酸はシグナルペプチドを構成するので、ＨＥＲ３アイソフォーム１、２および３（すなわち、シグナルペプチドを除去するプロセシング後）の成熟形態は、それぞれ、配列番号６、７および８に示されるアミノ酸配列を有する。
ＨＥＲ３の構造および機能は、例えば、ＣｈｏおよびＬｅａｈｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）２９７（５５８５）：１３３０～１３３３、Ｓｉｎｇｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１）２７６、４４２６６～４４２７４、Ｒｏｓｋｏｓｋｉら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．（２０１４）７９：３４～７４、ＢａｚｌｅｙおよびＧｕｌｌｉｃｋ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ（２００５）Ｓ１７～Ｓ２７、ならびにＭｕｊｏｏら、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ（２０１４）５（２１）：１０２２２～１０２３６に記載されており、それらの各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ＨＥＲ３は、２つのロイシンリッチサブドメイン（それぞれ、配列番号１５および１７に示される、ドメインＩおよびＩＩＩ）と、２つのシステインリッチサブドメイン（それぞれ、配列番号１６および１８に示される、ドメインＩＩおよびＩＶ）とを含む、Ｎ末端細胞外領域（配列番号９）を有する１回膜貫通型ＥｒｂＢ受容体チロシンキナーゼである。ドメインＩＩは、他のＨＥＲ受容体分子との分子間相互作用に関与する、βヘアピン二量体化ループ（配列番号１９）を含む。細胞外領域は、膜貫通領域（配列番号１０）を介して、細胞質領域（配列番号１１）へと連結される。細胞質領域は、膜近接セグメント（配列番号１２）、タンパク質キナーゼドメイン（配列番号１３）、およびＣ末端セグメント（配列番号１４）を含む。
ＨＥＲ３を介するシグナル伝達は、受容体のホモ二量体化（すなわち、他のＨＥＲ３受容体との）またはヘテロ二量体化（他のＨＥＲ受容体、例えば、ＨＥＲ２との）と、その帰結としての、細胞質領域のチロシンのタンパク質キナーゼドメインの自己リン酸化とを伴う。リン酸化チロシン残基は、ｓｒｃ相同性ドメイン２（ＳＨ２）またはホスホチロシン結合性（ＰＴＢ）ドメインを含有する、アダプター／エフェクタータンパク質（例えば、Ｇｒｂ２およびホスホリパーゼＣγ（ＰＬＣγ）を動員する。
ＨＥＲ３を介するシグナル伝達は、リガンド依存的に活性化される場合もあり、リガンド非依存的に活性化される場合もある。リガンドの非存在下では、ＨＥＲ３受容体分子は通常、細胞表面において、受容体の二量体化を阻止するコンフォメーションであって、サブドメインＩＩの二量体化ループが、サブドメインＩＶ上のポケットと分子内接触する、コンフォメーションを伴う、単量体として発現される。ニューレグリン（ＮＲＧ）、例えば、ＮＲＧ１（ヘレグリン、ＨＲＧとしても公知である）またはＮＲＧ２などのＨＥＲ３リガンドの細胞外領域のサブドメインＩおよびＩＩＩへの結合は、コンフォメーション変化を引き起こす結果として、サブドメインＩＩの二量体化ループの曝露をもたらし、受容体の二量体化およびシグナル伝達を容易とする。一部のＨＥＲ３内のがん関連突然変異は、不活性の「閉鎖型」コンフォメーションの形成に要求される、サブドメインＩＩとＩＶとの相互作用を破壊し得、これにより、二量体化ループの構成的提示、およびリガンド結合の非存在下における、ＨＥＲ３媒介性シグナル伝達の活性化を引き起こし得る（例えば、Ｊａｉｓｗａｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ（２０１３）２３（５）：６０３～６１７を参照されたい）。
本明細書では、「ＨＥＲ３」とは、任意の種に由来するＨＥＲ３を指し、任意の種に由来する、ＨＥＲ３のアイソフォーム、断片、バリアント（突然変異体を含む）、または相同体を含む。
本明細書で使用される場合、タンパク質の「断片」、「バリアント」、または「相同体」は、任意選択で、参照タンパク質（例えば、参照アイソフォーム）のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、好ましくは、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有することとして特徴付けられ得る。一部の実施形態では、参照タンパク質の断片、バリアント、アイソフォーム、および相同体は、参照タンパク質により果たされる機能を果たす能力により特徴付けられ得る。
「断片」とは、一般に、参照タンパク質の部分を指す。「バリアント」とは、一般に、参照タンパク質のアミノ酸配列と比べて、１つまたは複数のアミノ酸の置換、挿入、欠失、または他の修飾を含むが、参照タンパク質のアミノ酸配列に対する、かなりの程度の配列同一性（例えば、少なくとも６０％）を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。「アイソフォーム」とは、一般に、参照タンパク質の種と同じ種により発現される、参照タンパク質のバリアントを指す（例えば、ＨＥＲ３アイソフォーム１～５は全て互いのアイソフォームである）。「相同体」とは、一般に、参照タンパク質の種と比較して、異なる種により産生される、参照タンパク質のバリアントを指す。例えば、ヒトＨＥＲ３アイソフォーム１（Ｐ２１８６０－１、ｖ１；配列番号１）と、アカゲザルＨＥＲ３（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｆ７ＨＥＨ３－１、ｖ２；配列番号２０）とは、互いの相同体である。相同体は、オルソログを含む。
参照タンパク質の「断片」は、任意の長さ（アミノ酸の数による）であり得るが、任意選択で、参照タンパク質（すなわち、断片が由来するタンパク質）の長さの少なくとも２０％であってもよく、参照タンパク質の長さの５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のうちの１つの最大の長さを有してもよい。
ＨＥＲ３の断片は、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００アミノ酸のうちの１つの最小の長さを有してもよく、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、または１３００アミノ酸のうちの１つの最大の長さを有してもよい。
一部の実施形態では、ＨＥＲ３は、哺乳動物に由来するＨＥＲ３（例えば、霊長動物（アカゲザル、カニクイザル、非ヒト霊長動物、またはヒト）、および／または齧歯動物（例えば、ラットまたはマウス）のＨＥＲ３）である。ＨＥＲ３のアイソフォーム、断片、バリアント、または相同体は、任意選択で、所与の種、例えば、ヒトに由来する、未成熟または成熟のＨＥＲ３アイソフォームのアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有することとして特徴付けられ得る。
アイソフォーム、断片、バリアント、または相同体は、任意選択で、例えば、機能的特性／活性に適切なアッセイによる解析により決定する場合、参照ＨＥＲ３（例えば、ヒトＨＥＲ３アイソフォーム１）の機能的特性／活性を有する、機能的なアイソフォーム、断片、バリアント、または相同体であり得る。例えば、ＨＥＲ３のアイソフォーム、断片、バリアント、または相同体は、ＨＥＲ２、ＮＲＧ１（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、またはＶＩ型）、またはＮＲＧ２（αまたはβ）のうちの１つまたは複数との会合を呈し得る。
一部の実施形態では、ＨＥＲ３は、配列番号１～８のうちの１つに対して、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる。
一部の実施形態では、ＨＥＲ３の断片は、配列番号９～１９のうちの１つ、例えば、配列番号９、１６、または１９のうちの１つに対して、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる。
標的分子上の特定の目的の領域
本発明の抗原結合性分子は、特定の目的のＨＥＲ３の領域を標的化するように、特異的に設計された。２ステップ法では、予測される抗原性、機能、および安全性についての解析に従い、標的化されるＨＥＲ３領域が選択された。次いで、標的領域に対応するペプチドを、特異的モノクローナル抗体を惹起するための免疫原として使用して、ＨＥＲ３の標的領域に特異的な抗体を調製し、後続するスクリーニングにより、ナイーブ状態において、ＨＥＲ３に結合することができる抗体を同定した。この手法は、抗体エピトープに対する精緻な制御をもたらす。
本発明の抗原結合性分子は、それらが結合するＨＥＲ３の領域を参照することにより規定され得る。本発明の抗原結合性分子は、ＨＥＲ３の特定の目的の領域に結合し得る。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、アミノ酸の連続配列（すなわち、アミノ酸の一次配列）からなる、ＨＥＲ３の直鎖状エピトープに結合し得る。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、アミノ酸配列のうちのアミノ酸の不連続配列からなる、ＨＥＲ３のコンフォメーションエピトープに結合し得る。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＨＥＲ３に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３の細胞外領域（例えば、配列番号９に示される領域）に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３の細胞外領域のサブドメインＩＩ（例えば、配列番号１６に示される領域）に結合する。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２２９に示される、ＨＥＲ３の領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２２９に示される、ＨＥＲ３の領域の１つまたは複数のアミノ酸残基に接触する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３０および２３１に示される、ＨＥＲ３の領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３０および２３１に示される、ＨＥＲ３の領域の１つまたは複数のアミノ酸残基に接触する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３０に示される、ＨＥＲ３の領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３０に示される、ＨＥＲ３の領域の１つまたは複数のアミノ酸残基に接触する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３１に示される、ＨＥＲ３の領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３１に示される、ＨＥＲ３の領域の１つまたは複数のアミノ酸残基に接触する。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３に示される、ＨＥＲ３の領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３に示される、ＨＥＲ３の領域の１つまたは複数のアミノ酸残基に接触する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２１に示される、ＨＥＲ３の領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２１に示される、ＨＥＲ３の領域の１つまたは複数のアミノ酸残基に接触する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号１９に示される、ＨＥＲ３の領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号１９に示される、ＨＥＲ３の領域の１つまたは複数のアミノ酸残基に接触する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２２に示される、ＨＥＲ３の領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２２に示される、ＨＥＲ３の領域の１つまたは複数のアミノ酸残基に接触する。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号１の２６０～２７９位に対応する、ＨＥＲ３の領域に結合しない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号１の２６０～２７９位に対応する、ＨＥＲ３の領域のアミノ酸残基に接触しない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３に示される、ＨＥＲ３の領域に結合しない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３に示される、ＨＥＲ３の領域のアミノ酸残基に接触しない。
抗体が結合する、ペプチド／ポリペプチドの領域は、抗体－抗原複合体についてのＸ線共結晶構造解析、ペプチド走査、突然変異誘発マッピング、質量分析による水素－重水素交換解析、ファージディスプレイ、競合ＥＬＩＳＡ、およびタンパク質分解ベースの「保護」法を含む、当技術分野で周知の多様な方法を使用して、当業者により決定され得る。このような方法については、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｅｒｓｈｏｎｉら、ＢｉｏＤｒｕｇｓ、２００７、２１（３）：１４５～１５６において記載されている。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、本明細書で記載される抗体クローンである、１０Ｄ１、１０Ｄ１＿ｃ７５、１０Ｄ１＿ｃ７６、１０Ｄ１＿ｃ７７、１０Ｄ１＿ｃ７８ｖ１、１０Ｄ１＿ｃ７８ｖ２、１０Ｄ１＿１１Ｂ、１０Ｄ１＿ｃ８５ｖ１、１０Ｄ１＿ｃ８５ｖ２、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２、１０Ｄ１＿ｃ８７、１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿ｃ９０、１０Ｄ１＿ｃ９１、１０Ｄ１＿ｃ９２、１０Ｄ１＿ｃ９３、１０Ａ６、４－３５－Ｂ２、または４－３５－Ｂ４のうちの１つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含む抗体が結合するＨＥＲ３の領域と同じＨＥＲ３の領域、または重複するＨＥＲ３の領域に結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、抗体クローンである、１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿ｃ９０、または１０Ｄ１＿ｃ９１のうちの１つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含む抗体が結合するＨＥＲ３の領域と同じＨＥＲ３の領域、または重複するＨＥＲ３の領域に結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、抗体クローンである、１０Ｄ１＿ｃ８９のＶＨ配列およびＶＬ配列を含む抗体が結合するＨＥＲ３の領域と同じＨＥＲ３の領域、または重複するＨＥＲ３の領域に結合することができる。
本明細書で使用される場合、「ペプチド」とは、ペプチド結合により連結された、２つ以上のアミノ酸単量体による鎖を指す。ペプチドは、典型的に、領域内に、約２～５０アミノ酸の長さを有する。「ポリペプチド」とは、２つ以上のペプチドによるポリマー鎖である。ポリペプチドは、典型的に、約５０アミノ酸を超える長さを有する。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、配列番号１、３、４、６、または８のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドに結合することができる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号９のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドに結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドに結合することができる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２２９のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるペプチド／ポリペプチドに結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３０および２３１のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるペプチド／ポリペプチドに結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３０のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるペプチド／ポリペプチドに結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３１のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるペプチド／ポリペプチドに結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるペプチド／ポリペプチドに結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるペプチド／ポリペプチドに結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるペプチド／ポリペプチドに結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるペプチド／ポリペプチドに結合することができる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号１の２６０～２７９位に対応するアミノ酸配列からなるペプチドに結合することができない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３のアミノ酸配列からなるペプチドに結合することができない。
抗原結合性分子が、所与のペプチド／ポリペプチドに結合する能力は、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット（例えば、ウェスタンブロット）、免疫沈降、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；例えば、Ｈｅａｒｔｙら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２０１２）９０７：４１１～４４２を参照されたい）、またはバイオレイヤー干渉法（例えば、Ｌａｄら、（２０１５）Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ ２０（４）：４９８～５０７を参照されたい）による解析を含む、当業者に周知の方法により解析され得る。
抗原結合性分子が、参照アミノ酸配列を含むペプチド／ポリペプチドに結合することができる実施形態では、ペプチド／ポリペプチドは、参照アミノ酸配列の一方または両方の末端において、１つまたは複数のさらなるアミノ酸を含み得る。一部の実施形態では、ペプチド／ポリペプチドは、参照アミノ酸配列の一方または両方の末端において、例えば、１～５、１～１０、１～２０、１～３０、１～４０、１～５０、５～１０、５～２０、５～３０、５～４０、５～５０、１０～２０、１０～３０、１０～４０、１０～５０、２０～３０、２０～４０、または２０～５０のさらなるアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、ＨＥＲ３のアミノ酸配列の文脈では、参照配列の一方または両方の末端（すなわち、Ｎ末端およびＣ末端）においてもたらされる、さらなるアミノ酸は、参照配列の末端における位置に対応する。例を目的として述べると、抗原結合性分子が、配列番号２３の配列、および配列番号２３のＣ末端における、さらなる２つのアミノ酸を含むペプチドに結合することができる場合、さらなる２つのアミノ酸は、配列番号１の２７８および２７９位に対応する、スレオニンおよびリジンであり得る。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、本明細書で記載される抗体クローンである、１０Ｄ１、１０Ｄ１＿ｃ７５、１０Ｄ１＿ｃ７６、１０Ｄ１＿ｃ７７、１０Ｄ１＿ｃ７８ｖ１、１０Ｄ１＿ｃ７８ｖ２、１０Ｄ１＿１１Ｂ、１０Ｄ１＿ｃ８５ｖ１、１０Ｄ１＿ｃ８５ｖ２、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２、１０Ｄ１＿ｃ８７、１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿ｃ９０、１０Ｄ１＿ｃ９１、１０Ｄ１＿ｃ９２、１０Ｄ１＿ｃ９３、１０Ａ６、４－３５－Ｂ２、または４－３５－Ｂ４のうちの１つのＶＨおよびＶＬ配列を含む抗体が結合するペプチド／ポリペプチドに結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、抗体クローンである、１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿ｃ９０、または１０Ｄ１＿ｃ９１のうちの１つのＶＨおよびＶＬ配列を含む抗体が結合するペプチド／ポリペプチドに結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、抗体クローンである、１０Ｄ１＿ｃ８９のＶＨおよびＶＬ配列を含む抗体が結合するペプチド／ポリペプチドに結合することができる。
抗原結合性分子
本発明は、ＨＥＲ３に結合することができる抗原結合性分子を提供する。
「抗原結合性分子」とは、標的抗原に結合することができる分子を指し、それらが、関連する標的分子への結合を呈する限りにおいて、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体および多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、ならびに抗体断片（例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ２、ダイアボディー、トリアボディー、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ミニボディー、単一ドメイン抗体（例えば、ＶｈＨ）など）を包含する。
本発明の抗原結合性分子は、標的抗原に結合することができる部分を含む。一部の実施形態では、標的抗原に結合することができる部分は、標的抗原に特異的に結合することができる抗体の抗体重鎖可変領域（ＶＨ）と、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、標的抗原に結合することができる部分は、標的抗原に結合することできるアプタマー、例えば、核酸アプタマー（例えば、ＺｈｏｕおよびＲｏｓｓｉ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１７ １６（３）：１８１～２０２に概説されている）を含むか、またはこれらからなる。一部の実施形態では、標的抗原に結合することができる部分は、抗原結合性ペプチド／ポリペプチド、例えば、ペプチドアプタマー、チオレドキシン、モノボディー、アンチカリン、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、ノッティン（ｋｎｏｔｔｉｎ）、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、アトリマー（ａｔｒｉｍｅｒ）、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディー、ナノボディー（すなわち、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ））、アフィリン、アルマジロリピートタンパク質（ＡｒｍＲＰ）、ＯＢｏｄｙ、またはフィブロネクチン（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｖｅｒｄａｔｔｏら、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．、２０１５；１５（１２）：１０８２～１１０１に概説されている（例えば、Ｂｏｅｒｓｍａら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２０１１）２８６：４１２７３～８５およびＥｍａｎｕｅｌら、Ｍａｂｓ（２０１１３：３８～４８もまた参照されたい））を含むか、またはこれらからなる。
本発明の抗原結合性分子は、一般に、標的抗原に特異的に結合することができる抗体のＶＨおよびＶＬを含む、抗原結合性ドメインを含む。本明細書では、ＶＨおよびＶＬにより形成される抗原結合性ドメインはまた、Ｆｖ領域とも称され得る。
抗原結合性分子は、抗原結合性ポリペプチド、または抗原結合性ポリペプチド複合体であってもよいか、またはこれらを含んでもよい。抗原結合性分子は、併せて、抗原結合性ドメインを形成する、１つを超えるポリペプチドを含んでもよい。ポリペプチドは、共有結合的に会合する場合もあり、非共有結合的に会合する場合もある。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドを含む、より大型ポリペプチドの一部を形成する（例えば、ＶＨおよびＶＬを含むｓｃＦｖの場合、またはＶＨ－ＣＨ１およびＶＬ－ＣＬを含むｓｃＦａｂの場合）。
抗原結合性分子は、１つを超えるポリペプチド（例えば、２つ、３つ、４つ、６つ、または８つのポリペプチド）、例えば、２つの重鎖ポリペプチドと、２つの軽鎖ポリペプチドとを含む、ＩｇＧ様抗原結合性分子の非共有結合的または共有結合的複合体を指す場合がある。
本発明の抗原結合性分子は、ＨＥＲ３に結合することができるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の配列を使用して、設計および調製され得る。単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）２断片などの抗体の抗原結合性領域もまた、使用され得る／もたらされ得る。「抗原結合性領域」とは、所与の抗体が特異的である標的に結合することができる抗体の任意の断片である。
抗体は、一般に、重鎖可変（ＶＨ）領域内の３つ：ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、およびＨＣ－ＣＤＲ３、ならびに軽鎖可変（ＶＬ）領域内の３つ：ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、およびＬＣ－ＣＤＲ３である、６つの相補性決定領域であるＣＤＲを含む。６つのＣＤＲは、併せて、標的抗原に結合する抗体の部分である抗体のパラトープを規定する。
ＶＨ領域およびＶＬ領域は、各ＣＤＲのいずれの側にも、ＣＤＲのための足場をもたらすフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。Ｎ末端からＣ末端へと、ＶＨ領域は以下の構造：Ｎ末端－［ＨＣ－ＦＲ１］－［ＨＣ－ＣＤＲ１］－［ＨＣ－ＦＲ２］－［ＨＣ－ＣＤＲ２］－［ＨＣ－ＦＲ３］－［ＨＣ－ＣＤＲ３］－［ＨＣ－ＦＲ４］－Ｃ末端を含み、ＶＬ領域は、以下の構造：Ｎ末端－［ＬＣ－ＦＲ１］－［ＬＣ－ＣＤＲ１］－［ＬＣ－ＦＲ２］－［ＬＣ－ＣＤＲ２］－［ＬＣ－ＦＲ３］－［ＬＣ－ＣＤＲ３］－［ＬＣ－ＦＲ４］－Ｃ末端を含む。
Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１～９１７（１９８７）に記載されているもの、ならびにＲｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００５）３３（ｓｕｐｐｌ １）：Ｄ６７１～Ｄ６７４に記載されているＶＢＡＳＥ２などの、抗体のＣＤＲおよびＦＲを規定するためのいくつかの異なる慣例が存在する。本明細書で記載される抗体クローンのＶＨ領域およびＶＬ領域のＣＤＲおよびＦＲは、Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）２７：５５～７７に記載されているＩＭＧＴ Ｖドメイン番号付け規則を使用する、国際的ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）情報システム（ＬｅＦｒａｎｃら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１５）４３（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ４１３～２２）に従い規定された。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３に結合することができる抗原結合性分子のＣＤＲを含む。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３に結合することができる抗原結合性分子のＦＲを含む。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３に結合することができる抗原結合性分子のＣＤＲおよびＦＲを含む。すなわち、一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３に結合することができる抗原結合性分子のＶＨ領域およびＶＬ領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、本明細書で記載されるＨＥＲ３結合性抗体クローン（すなわち、抗ＨＥＲ３抗体クローンである、１０Ｄ１＿ｃ７５、１０Ｄ１＿ｃ７６、１０Ｄ１＿ｃ７７、１０Ｄ１＿ｃ７８ｖ１、１０Ｄ１＿ｃ７８ｖ２、１０Ｄ１＿１１Ｂ、１０Ｄ１＿ｃ８５ｖ１、１０Ｄ１＿ｃ８５ｖ２、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２、１０Ｄ１＿ｃ８７、１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿ｃ９０、１０Ｄ１＿ｃ９１、１０Ｄ１＿ｃ９２、１０Ｄ１＿ｃ９３、１０Ｄ１、１０Ａ６、４－３５－Ｂ２、または４－３５－Ｂ４；例えば、１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿ｃ９０、または１０Ｄ１＿ｃ９１；例えば、１０Ｄ１＿ｃ８９）のＶＨ／ＶＬ領域であるか、またはこれらに由来する、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、下記の（１）～（１０）のうちの１つに従うＶＨ領域を含む。
（１）（１０Ｄ１由来）以下のＣＤＲ：
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号４６のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号５１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３、
またはＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、もしくはＨＣ－ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＨ領域。
（２）（１０Ｄ１、１０Ｄ１＿ｃ７５、１０Ｄ１＿ｃ７６、１０Ｄ１＿ｃ７７、１０Ｄ１＿ｃ７８ｖ１、１０Ｄ１＿ｃ７８ｖ２、１０Ｄ１＿１１Ｂ、１０Ｄ１＿ｃ８７、１０Ｄ１＿ｃ９２、１０Ｄ１＿ｃ９３）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号４４のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号４７のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３、
またはＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、もしくはＨＣ－ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＨ領域。
（３）（１０Ｄ１＿ｃ８５ｖ１、１０Ｄ１＿ｃ８５ｖ２）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号４５のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号４７のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３、
またはＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、もしくはＨＣ－ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＨ領域。
（４）（１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号４５のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号４９のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３、
またはＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、もしくはＨＣ－ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＨ領域。
（５）（１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号４５のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号５０のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３、
またはＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、もしくはＨＣ－ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＨ領域。
（６）（１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿ｃ９０）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号４５のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号４８のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３、
またはＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、もしくはＨＣ－ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＨ領域。
（７）（１０Ｄ１＿ｃ９１）以下のＣＤＲ：
配列番号４２のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号４５のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号４８のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３、
またはＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、もしくはＨＣ－ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＨ領域。
（８）（１０Ａ６）以下のＣＤＲ：
配列番号１５８のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号１５９のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３、
またはＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、もしくはＨＣ－ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＨ領域。
（９）（４－３５－Ｂ２）以下のＣＤＲ：
配列番号１２８のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号１２９のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号１３０のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３、
またはＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、もしくはＨＣ－ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＨ領域。
（１０）（４－３５－Ｂ４）以下のＣＤＲ：
配列番号１４４のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号１４５のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号１４６のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３、
またはＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、もしくはＨＣ－ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＨ領域。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、下記の（１１）～（２４）のうちの１つに従うＶＨ領域を含む。
（１１）（１０Ｄ１）以下のＦＲ：
配列番号５５のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ１
配列番号５８のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ２
配列番号６９のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ３
配列番号７３のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ４、
またはＨＣ－ＦＲ１、ＨＣ－ＦＲ２、ＨＣ－ＦＲ３、もしくはＨＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＨ領域。
（１２）（１０Ｄ１＿ｃ７５、１０Ｄ１＿ｃ９２）以下のＦＲ：
配列番号５２のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ１
配列番号５６のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ２
配列番号６１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ３
配列番号７０のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ４、
またはＨＣ－ＦＲ１、ＨＣ－ＦＲ２、ＨＣ－ＦＲ３、もしくはＨＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＨ領域。
（１３）（１０Ｄ１＿ｃ７６、１０Ｄ１＿ｃ７７、１０Ｄ１＿ｃ７８ｖ１）以下のＦＲ：
配列番号５２のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ１
配列番号５６のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ２
配列番号６２のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ３
配列番号７０のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ４、
またはＨＣ－ＦＲ１、ＨＣ－ＦＲ２、ＨＣ－ＦＲ３、もしくはＨＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＨ領域。
（１４）（１０Ｄ１＿ｃ７８ｖ２）以下のＦＲ：
配列番号５２のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ１
配列番号５７のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ２
配列番号６２のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ３
配列番号７０のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ４、
またはＨＣ－ＦＲ１、ＨＣ－ＦＲ２、ＨＣ－ＦＲ３、もしくはＨＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＨ領域。
（１５）（１０Ｄ１＿１１Ｂ）以下のＦＲ：
配列番号２２４のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ１
配列番号６０のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ２
配列番号６３のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ３
配列番号７０のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ４、
またはＨＣ－ＦＲ１、ＨＣ－ＦＲ２、ＨＣ－ＦＲ３、もしくはＨＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＨ領域。
（１６）（１０Ｄ１＿ｃ８５ｖ１）以下のＦＲ：
配列番号５２のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ１
配列番号５６のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ２
配列番号６４のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ３
配列番号７０のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ４、
またはＨＣ－ＦＲ１、ＨＣ－ＦＲ２、ＨＣ－ＦＲ３、もしくはＨＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＨ領域。
（１７）（１０Ｄ１＿ｃ８５ｖ２、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２）以下のＦＲ：
配列番号５２のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ１
配列番号５７のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ２
配列番号６４のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ３
配列番号７０のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ４、
またはＨＣ－ＦＲ１、ＨＣ－ＦＲ２、ＨＣ－ＦＲ３、もしくはＨＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＨ領域。
（１８）（１０Ｄ１＿ｃ８７、１０Ｄ１＿ｃ９３）以下のＦＲ：
配列番号５２のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ１
配列番号５６のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ２
配列番号６５のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ３
配列番号７０のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ４、
またはＨＣ－ＦＲ１、ＨＣ－ＦＲ２、ＨＣ－ＦＲ３、もしくはＨＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＨ領域。
（１９）（１０Ｄ１＿ｃ８９）以下のＦＲ：
配列番号５３のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ１
配列番号５９のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ２
配列番号６６のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ３
配列番号７１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ４、
またはＨＣ－ＦＲ１、ＨＣ－ＦＲ２、ＨＣ－ＦＲ３、もしくはＨＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＨ領域。
（２０）（１０Ｄ１＿ｃ９０）以下のＦＲ：
配列番号５４のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ１
配列番号５９のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ２
配列番号６７のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ３
配列番号７１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ４、
またはＨＣ－ＦＲ１、ＨＣ－ＦＲ２、ＨＣ－ＦＲ３、もしくはＨＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＨ領域。
（２１）（１０Ｄ１＿ｃ９１）以下のＦＲ：
配列番号５３のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ１
配列番号５９のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ２
配列番号６８のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ３
配列番号７２のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ４、
またはＨＣ－ＦＲ１、ＨＣ－ＦＲ２、ＨＣ－ＦＲ３、もしくはＨＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＨ領域。
（２２）（１０Ａ６）以下のＦＲ：
配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ１
配列番号１６２のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ２
配列番号１６３のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ３
配列番号７３のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ４、
またはＨＣ－ＦＲ１、ＨＣ－ＦＲ２、ＨＣ－ＦＲ３、もしくはＨＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＨ領域。
（２３）（４－３５－Ｂ２）以下のＦＲ：
配列番号１３１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ１
配列番号１３２のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ２
配列番号１３３のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ３
配列番号１３４のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ４、
またはＨＣ－ＦＲ１、ＨＣ－ＦＲ２、ＨＣ－ＦＲ３、もしくはＨＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＨ領域。
（２４）（４－３５－Ｂ４）以下のＦＲ：
配列番号１４７のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ１
配列番号１４８のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ２
配列番号１４９のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ３
配列番号７３のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ４、
またはＨＣ－ＦＲ１、ＨＣ－ＦＲ２、ＨＣ－ＦＲ３、もしくはＨＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＨ領域。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、上記の（１）～（１０）のうちの１つに従うＣＤＲと、上記の（１１）～（２４）のうちの１つに従うＦＲとを含む、ＶＨ領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、下記の（２５）～（４１）のうちの１つに従うＶＨ領域を含む。
（２５）（１）に従うＣＤＲと、（１１）、（１２）、（１３）、（１４）、（１５）、（１６）、（１７）、（１８）、（１９）、（２０）、または（２１）に従うＦＲとを含む、ＶＨ領域。
（２６）（２）に従うＣＤＲと、（１１）に従うＦＲとを含む、ＶＨ領域。
（２７）（２）に従うＣＤＲと、（１２）に従うＦＲとを含む、ＶＨ領域。
（２８）（２）に従うＣＤＲと、（１３）に従うＦＲとを含む、ＶＨ領域。
（２９）（２）に従うＣＤＲと、（１４）に従うＦＲとを含む、ＶＨ領域。
（３０）（２）に従うＣＤＲと、（１５）に従うＦＲとを含む、ＶＨ領域。
（３１）（２）に従うＣＤＲと、（１８）に従うＦＲとを含む、ＶＨ領域。
（３２）（３）に従うＣＤＲと、（１６）に従うＦＲとを含む、ＶＨ領域。
（３３）（３）に従うＣＤＲと、（１７）に従うＦＲとを含む、ＶＨ領域。
（３４）（４）に従うＣＤＲと、（１７）に従うＦＲとを含む、ＶＨ領域。
（３５）（５）に従うＣＤＲと、（１７）に従うＦＲとを含む、ＶＨ領域。
（３６）（６）に従うＣＤＲと、（１９）に従うＦＲとを含む、ＶＨ領域。
（３７）（６）に従うＣＤＲと、（２０）に従うＦＲとを含む、ＶＨ領域。
（３８）（７）に従うＣＤＲと、（２１）に従うＦＲとを含む、ＶＨ領域。
（３９）（８）に従うＣＤＲと、（２２）に従うＦＲとを含む、ＶＨ領域。
（４０）（９）に従うＣＤＲと、（２３）に従うＦＲとを含む、ＶＨ領域。
（４１）（１０）に従うＣＤＲと、（２４）に従うＦＲとを含む、ＶＨ領域。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、下記の（４２）～（６１）のうちの１つに従うＶＨ領域を含む。
（４２）配列番号２４のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（４３）配列番号２５のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（４４）配列番号２６のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（４５）配列番号２７のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（４６）配列番号２８のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（４７）配列番号２９のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（４８）配列番号３０のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（４９）配列番号３１のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（５０）配列番号３２のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（５１）配列番号３３のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（５２）配列番号３４のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（５３）配列番号３５のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（５４）配列番号３６のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（５５）配列番号３７のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（５６）配列番号３８のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（５７）配列番号３９のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（５８）配列番号４０のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（５９）配列番号１２７のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（６０）配列番号１４３のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（６１）配列番号１５７のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、下記の（６２）～（７１）のうちの１つに従うＶＬ領域を含む。
（６２）（１０Ｄ１由来）以下のＣＤＲ：
配列番号９１のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号９４のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号９９のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３；
またはＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、もしくはＬＣ－ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＬ領域。
（６３）（１０Ｄ１、１０Ｄ１＿ｃ７５、１０Ｄ１＿ｃ７８ｖ１、１０Ｄ１＿ｃ７８ｖ２、１０Ｄ１＿１１Ｂ、１０Ｄ１＿ｃ８７、１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿ｃ９１、１０Ｄ１＿ｃ９３）以下のＣＤＲ：
配列番号８８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号９２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号９５のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３；
またはＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、もしくはＬＣ－ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＬ領域。
（６４）（１０Ｄ１＿ｃ７６）以下のＣＤＲ：
配列番号８９のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号９２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号９５のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３；
またはＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、もしくはＬＣ－ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＬ領域。
（６５）（１０Ｄ１＿ｃ７７）以下のＣＤＲ：
配列番号９０のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号９２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号９６のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３；
またはＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、もしくはＬＣ－ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＬ領域。
（６６）（１０Ｄ１＿ｃ８５ｖ１、１０Ｄ１＿ｃ８５ｖ２、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２）以下のＣＤＲ：
配列番号８８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号９３のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号９５のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３；
またはＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、もしくはＬＣ－ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＬ領域。
（６７）（１０Ｄ１＿ｃ９０）以下のＣＤＲ：
配列番号８８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号９２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号９７のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３；
またはＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、もしくはＬＣ－ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＬ領域。
（６８）（１０Ｄ１＿ｃ９２）以下のＣＤＲ：
配列番号８８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号９２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号９８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３；
またはＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、もしくはＬＣ－ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＬ領域。
（６９）（１０Ａ６）以下のＣＤＲ：
配列番号１６５のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号１６６のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号１６７のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３；
またはＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、もしくはＬＣ－ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＬ領域。
（７０）（４－３５－Ｂ２）以下のＣＤＲ：
配列番号１３６のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号１３７のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３；
またはＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、もしくはＬＣ－ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＬ領域。
（７１）（４－３５－Ｂ４）以下のＣＤＲ：
配列番号１５１のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号１５２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３；
またはＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、もしくはＬＣ－ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＬ領域。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、下記の（７２）～（８６）のうちの１つに従うＶＬ領域を含む。
（７２）（１０Ｄ１）以下のＦＲ：
配列番号１０６のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ１
配列番号１１３のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ２
配列番号１２３のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ３
配列番号１２６のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ４、
またはＬＣ－ＦＲ１、ＬＣ－ＦＲ２、ＬＣ－ＦＲ３、もしくはＬＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＬ領域。
（７３）（１０Ｄ１＿ｃ７５）以下のＦＲ：
配列番号１００のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ１
配列番号１０７のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ２
配列番号１１４のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ３
配列番号１２４のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ４、
またはＬＣ－ＦＲ１、ＬＣ－ＦＲ２、ＬＣ－ＦＲ３、もしくはＬＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＬ領域。
（７４）（１０Ｄ１＿ｃ７６）以下のＦＲ：
配列番号１０１のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ１
配列番号１０８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ２
配列番号１１５のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ３
配列番号１２４のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ４、
またはＬＣ－ＦＲ１、ＬＣ－ＦＲ２、ＬＣ－ＦＲ３、もしくはＬＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＬ領域。
（７５）（１０Ｄ１＿ｃ７７）以下のＦＲ：
配列番号１０２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ１
配列番号１０８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ２
配列番号１１６のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ３
配列番号１２４のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ４、
またはＬＣ－ＦＲ１、ＬＣ－ＦＲ２、ＬＣ－ＦＲ３、もしくはＬＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＬ領域。
（７６）（１０Ｄ１＿ｃ７８ｖ１、１０Ｄ１＿ｃ７８ｖ２、１０Ｄ１＿１１Ｂ）以下のＦＲ：
配列番号１０３のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ１
配列番号１０８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ２
配列番号１１７のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ３
配列番号１２４のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ４、
またはＬＣ－ＦＲ１、ＬＣ－ＦＲ２、ＬＣ－ＦＲ３、もしくはＬＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＬ領域。
（７７）（１０Ｄ１＿ｃ８５ｖ１、１０Ｄ１＿ｃ８５ｖ２、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２）以下のＦＲ：
配列番号１０３のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ１
配列番号１０８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ２
配列番号１１８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ３
配列番号１２４のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ４、
またはＬＣ－ＦＲ１、ＬＣ－ＦＲ２、ＬＣ－ＦＲ３、もしくはＬＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＬ領域。
（７８）（１０Ｄ１＿ｃ８７）以下のＦＲ：
配列番号１０３のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ１
配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ２
配列番号１１９のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ３
配列番号１２４のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ４、
またはＬＣ－ＦＲ１、ＬＣ－ＦＲ２、ＬＣ－ＦＲ３、もしくはＬＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＬ領域。
（７９）（１０Ｄ１＿ｃ８９）以下のＦＲ：
配列番号１０４のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ１
配列番号１１０のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ２
配列番号１２０のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ３
配列番号１２５のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ４、
またはＬＣ－ＦＲ１、ＬＣ－ＦＲ２、ＬＣ－ＦＲ３、もしくはＬＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＬ領域。
（８０）（１０Ｄ１＿ｃ９０）以下のＦＲ：
配列番号１０５のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ１
配列番号１１０のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ２
配列番号１２１のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ３
配列番号１２４のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ４、
またはＬＣ－ＦＲ１、ＬＣ－ＦＲ２、ＬＣ－ＦＲ３、もしくはＬＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＬ領域。
（８１）（１０Ｄ１＿ｃ９１）以下のＦＲ：
配列番号１０４のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ１
配列番号１１１のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ２
配列番号１２２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ３
配列番号１２５のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ４、
またはＬＣ－ＦＲ１、ＬＣ－ＦＲ２、ＬＣ－ＦＲ３、もしくはＬＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＬ領域。
（８２）（１０Ｄ１＿ｃ９２）以下のＦＲ：
配列番号１００のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ１
配列番号１１２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ２
配列番号１１４のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ３
配列番号１２４のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ４、
またはＬＣ－ＦＲ１、ＬＣ－ＦＲ２、ＬＣ－ＦＲ３、もしくはＬＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＬ領域。
（８３）（１０Ｄ１＿ｃ９３）以下のＦＲ：
配列番号１０３のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ１
配列番号１０８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ２
配列番号１１９のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ３
配列番号１２４のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ４、
またはＬＣ－ＦＲ１、ＬＣ－ＦＲ２、ＬＣ－ＦＲ３、もしくはＬＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＬ領域。
（８４）（１０Ａ６）以下のＦＲ：
配列番号１６８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ１
配列番号１６９のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ２
配列番号１７０のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ３
配列番号１４２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ４、
またはＬＣ－ＦＲ１、ＬＣ－ＦＲ２、ＬＣ－ＦＲ３、もしくはＬＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＬ領域。
（８５）（４－３５－Ｂ２）以下のＦＲ：
配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ１
配列番号１４０のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ２
配列番号１４１のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ３
配列番号１４２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ４、
またはＬＣ－ＦＲ１、ＬＣ－ＦＲ２、ＬＣ－ＦＲ３、もしくはＬＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＬ領域。
（８６）（４－３５－Ｂ４）以下のＦＲ：
配列番号１５４のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ１
配列番号１５５のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ２
配列番号１５６のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ３
配列番号１４２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ４、
またはＬＣ－ＦＲ１、ＬＣ－ＦＲ２、ＬＣ－ＦＲ３、もしくはＬＣ－ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている、これらのバリアントを組み込んでいるＶＬ領域。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、上記の（６２）～（７１）のうちの１つに従うＣＤＲと、上記の（７２）～（８６）のうちの１つに従うＦＲとを含む、ＶＬ領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、下記の（８７）～（１０２）のうちの１つに従うＶＬ領域を含む。
（８７）（６２）に従うＣＤＲと、（７２）、（７３）、（７４）、（７５）、（７６）、（７７）、（７８）、（７９）、（８０）、（８１）、（８２）、または（８３）に従うＦＲとを含む、ＶＬ領域。
（８８）（６３）に従うＣＤＲと、（７２）に従うＦＲとを含む、ＶＬ領域。
（８９）（６３）に従うＣＤＲと、（７３）に従うＦＲとを含む、ＶＬ領域。
（９０）（６３）に従うＣＤＲと、（７６）に従うＦＲとを含む、ＶＬ領域。
（９１）（６３）に従うＣＤＲと、（７８）に従うＦＲとを含む、ＶＬ領域。
（９２）（６３）に従うＣＤＲと、（７９）に従うＦＲとを含む、ＶＬ領域。
（９３）（６３）に従うＣＤＲと、（８１）に従うＦＲとを含む、ＶＬ領域。
（９４）（６３）に従うＣＤＲと、（８３）に従うＦＲとを含む、ＶＬ領域。
（９５）（６４）に従うＣＤＲと、（７４）に従うＦＲとを含む、ＶＬ領域。
（９６）（６５）に従うＣＤＲと、（７５）に従うＦＲとを含む、ＶＬ領域。
（９７）（６６）に従うＣＤＲと、（７７）に従うＦＲとを含む、ＶＬ領域。
（９８）（６７）に従うＣＤＲと、（８０）に従うＦＲとを含む、ＶＬ領域。
（９９）（６８）に従うＣＤＲと、（８２）に従うＦＲとを含む、ＶＬ領域。
（１００）（６９）に従うＣＤＲと、（８４）に従うＦＲとを含む、ＶＬ領域。
（１０１）（７０）に従うＣＤＲと、（８５）に従うＦＲとを含む、ＶＬ領域。
（１０２）（７１）に従うＣＤＲと、（８６）に従うＦＲとを含む、ＶＬ領域。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、下記の（１０３）～（１１９）のうちの１つに従うＶＬ領域を含む。
（１０３）配列番号７４のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１０４）配列番号７５のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１０５）配列番号７６のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１０６）配列番号７７のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１０７）配列番号７８のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１０８）配列番号７９のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１０９）配列番号８０のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１１０）配列番号８１のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１１１）配列番号８２のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１１２）配列番号８３のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１１３）配列番号８４のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１１４）配列番号８５のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１１５）配列番号８６のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１１６）配列番号８７のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１１７）配列番号１３５のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１１８）配列番号１５０のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１１９）配列番号１６４のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、上記の（１）～（６１）のうちのいずれか１つに従うＶＨ領域と、上記の（６２）～（１１９）のうちのいずれか１つに従うＶＬ領域とを含む。
１つまたは複数のアミノ酸が、別のアミノ酸で置換される本発明に従う実施形態では、置換は、例えば、以下の表に従う、保存的置換であり得る。一部の実施形態では、中欄の同じブロック内のアミノ酸が置換される。一部の実施形態では、最も右の欄の同じ連なりのアミノ酸が置換される。
Figure 2022548057000002
 一部の実施形態では、置換は機能的に保存的であり得る。すなわち、一部の実施形態では、置換は、同等の非置換分子と比較して置換を含む抗原結合性分子の１つまたは複数の機能的特性（例えば、標的への結合）に影響を及ぼさない場合がある（または実質的に影響を及ぼさない場合がある）。
抗体の抗原結合性領域のＶＨおよびＶＬ領域は、併せて、Ｆｖ領域を構成する。一部の実施形態では、本発明に従う抗原結合性分子は、ＨＥＲ３に結合するＦｖ領域を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、ＦｖのＶＨおよびＶＬ領域は、リンカー領域により接合された、単一のポリペプチド、すなわち、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として提供される。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、免疫グロブリンの重鎖定常配列の１つまたは複数の領域を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンの重鎖定常配列は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭの重鎖定常配列であるか、またはこれらに由来する。
一部の実施形態では、免疫グロブリンの重鎖定常配列は、ヒト免疫グロブリンＧ１定常（ＩＧＨＧ１；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０１８５７－１、ｖ１；配列番号１７１）である。配列番号１７１の１～９８位は、ＣＨ１領域（配列番号１７２）を形成する。配列番号１７１の９９～１１０位は、ＣＨ１とＣＨ２領域との間のヒンジ領域（配列番号１７３）を形成する。配列番号１７１の１１１～２２３位は、ＣＨ２領域（配列番号１７４）を形成する。配列番号１７１の２２４～３３０位は、ＣＨ３領域（配列番号１７５）を形成する。
例示される抗原結合性分子は、ＣＨ３領域内に置換Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ（ＥＵ番号付けに従い番号付けされた位置）を含む、ｐＦＵＳＥ－ＣＨＩｇ－ｈＧ１を使用して調製され得る。ｐＦＵＳＥ－ＣＨＩｇ－ｈＧ１によりコードされるＣＨ３領域のアミノ酸配列を配列番号１７６に示す。ＣＨ３領域は、本明細書で記載される抗原結合性分子のＦｃ領域への修飾に従い、さらなる置換を施され得ることが理解されるであろう。
一部の実施形態では、ＣＨ１領域は、配列番号１７２の配列、または配列番号１７２のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、好ましくは、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有する配列を含むか、またはこれらからなる。一部の実施形態では、ＣＨ１－ＣＨ２間のヒンジ領域は、配列番号１７３の配列、または配列番号１７３のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、好ましくは、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有する配列を含むか、またはこれらからなる。一部の実施形態では、ＣＨ２領域は、配列番号１７４の配列、または配列番号１７４のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、好ましくは、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有する配列を含むか、またはこれらからなる。一部の実施形態では、ＣＨ３領域は、配列番号１７５もしくは１７６の配列、または配列番号１７５もしくは１７６のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、好ましくは、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有する配列を含むか、またはこれらからなる。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、免疫グロブリンの軽鎖定常配列の１つまたは複数の領域を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンの軽鎖定常配列は、ヒト免疫グロブリンカッパ定常（ＩＧＫＣ；Ｃκ；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０１８３４－１、ｖ２；配列番号１７７）である。一部の実施形態では、免疫グロブリンの軽鎖定常配列は、ヒト免疫グロブリンラムダ定常（ＩＧＬＣ；Ｃλ）、例えば、ＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ６、またはＩＧＬＣ７である。一部の実施形態では、ＣＬ領域は、配列番号１７７の配列、または配列番号１７７のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、好ましくは、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有する配列を含むか、またはこれらからなる。
抗体の抗原結合性領域のＶＬおよび軽鎖定常（ＣＬ）領域、ならびにＶＨ領域および重鎖定常１（ＣＨ１）領域は、併せて、Ｆａｂ領域を構成する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、およびＣＬ（例えば、ＣκまたはＣλ）を含むＦａｂ領域を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ領域は、ＶＨとＣＨ１とを含むポリペプチド（例えば、ＶＨ－ＣＨ１融合ポリペプチド）、およびＶＬとＣＬとを含むポリペプチド（例えば、ＶＬ－ＣＬ融合ポリペプチド）を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ領域は、ＶＨとＣＬとを含むポリペプチド（例えば、ＶＨ－ＣＬ融合ポリペプチド）、およびＶＬとＣＨとを含むポリペプチド（例えば、ＶＬ－ＣＨ１融合ポリペプチド）を含み、すなわち、一部の実施形態では、Ｆａｂ領域は、ＣｒｏｓｓＦａｂ領域である。一部の実施形態では、ＦａｂまたはＣｒｏｓｓＦａｂのＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、およびＣＬ領域は、リンカー領域により接合された、単一のポリペプチド、すなわち、単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）または単鎖ＣｒｏｓｓＦａｂ（ｓｃＣｒｏｓｓＦａｂ）として提供される。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＨＥＲ３に結合するＦａｂ領域を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、本明細書で記載される抗原結合性分子は、ＨＥＲ３に結合する全抗体を含むか、またはこれからなる。本明細書で使用される場合、「全抗体」とは、免疫グロブリン（Ｉｇ）の構造と、実質的に同様の構造を有する抗体を指す。異なる種類の免疫グロブリン、およびそれらの構造は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＣａｖａｃｉｎｉ、Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１０）１２５（２０２）：Ｓ４１～Ｓ５２に記載されている。
Ｇ型の免疫グロブリン（すなわち、ＩｇＧ）は、２つの重鎖と、２つの軽鎖とを含む、約１５０ｋＤａの糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端へと、重鎖は、ＶＨに続き、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を含む、重鎖定常領域を含み、同様に、軽鎖は、ＶＬに続き、ＣＬを含む。重鎖に応じて、免疫グロブリンは、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭと分類され得る。軽鎖は、カッパ（κ）の場合もあり、ラムダ（λ）の場合もある。
一部の実施形態では、本明細書で記載される抗原結合性分子は、ＨＥＲ３に結合するＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭを含むか、またはこれらからなる。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＨＥＲ３に対して少なくとも一価の結合である。結合価とは、所与の抗原決定基についての抗原結合性分子内の結合性部位の数を指す。したがって、一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３に対する少なくとも１つの結合性部位を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３に対する、１つを超える結合性部位、例えば、２つ、３つ、または４つの結合性部位を含む。結合性部位は、同じ場合もあり、異なる場合もある。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３に対して、例えば、二価、三価、または四価である。
本発明の態様は、多特異性の抗原結合性分子に関する。「多特異性」とは、抗原結合性分子が、１つを超える標的への特異的結合を呈することを意味する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、二特異性の抗原結合性分子である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、少なくとも２つの異なる抗原結合性ドメイン（すなわち、例えば、同一でないＶＨおよびＶＬを含む、少なくとも２つの抗原結合性ドメイン）を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３、および別の標的（例えば、ＨＥＲ３以外の抗原）に結合するので、少なくとも二特異性である。「二特異性」という用語は、抗原結合性分子が、少なくとも２つの別個の抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。
本発明に従う抗原結合性分子（例えば、多特異性抗原結合性分子）は、抗原結合性分子が特異的である標的に結合することができる抗原結合性分子を含み得ることが理解されるであろう。例えば、ＨＥＲ３およびＨＥＲ３以外の抗原に結合することができる抗原結合性分子は、（ｉ）ＨＥＲ３に結合することができる抗原結合性分子、および（ｉｉ）ＨＥＲ３以外の抗原に結合することができる抗原結合性分子を含み得る。
また、本発明に従う抗原結合性分子（例えば、多特異性抗原結合性分子）は、抗原結合性分子が特異的である標的に結合することができる、抗原結合性ポリペプチド、または抗原結合性ポリペプチド複合体を含み得ることも理解されるであろう。例えば、本発明に従う抗原結合性分子は、例えば、（ｉ）軽鎖ポリペプチド（構造ＶＬ－ＣＬを含む）と、重鎖ポリペプチド（構造ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を含む）とを含む、ＨＥＲ３に結合することができる抗原結合性ポリペプチド複合体、および（ｉｉ）軽鎖ポリペプチド（構造ＶＬ－ＣＬを含む）と、重鎖ポリペプチド（構造ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を含む）とを含む、ＨＥＲ３以外の抗原に結合することができる抗原結合性ポリペプチド複合体を含み得る。
一部の実施形態では、より大型の抗原結合性分子（例えば、多特異性抗原結合性分子）の構成要素である抗原結合性分子は、より大型の抗原結合性分子の、例えば、「抗原結合性ドメイン」または「抗原結合性領域」と称され得る。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３に結合することができる抗原結合性分子と、ＨＥＲ３以外の抗原に結合することができる抗原結合性分子とを含む。一部の実施形態では、ＨＥＲ３以外の抗原は、免疫細胞の表面分子である。一部の実施形態では、ＨＥＲ３以外の抗原は、がん細胞抗原である。一部の実施形態では、ＨＥＲ３以外の抗原は、受容体分子、例えば、細胞表面受容体である。一部の実施形態では、ＨＥＲ３以外の抗原は、細胞シグナル伝達分子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、またはリンホカインである。一部の実施形態では、ＨＥＲ３以外の抗原は、増殖因子またはホルモンである。
がん細胞抗原は、がん細胞により発現または過剰発現される抗原である。がん細胞抗原は、任意のペプチド／ポリペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、グリカン、糖脂質、脂質、またはこれらの断片であり得る。がん細胞抗原の発現は、がんと関連し得る。がん細胞抗原は、がん細胞により異常に発現される場合もあり（例えば、がん細胞抗原は、異常な局在化を伴って発現され得る）、またはがん細胞による異常な構造を伴って発現される場合もある。がん細胞抗原は、免疫応答を誘発することが可能であり得る。一部の実施形態では、抗原は、がん細胞の細胞表面において発現される（すなわち、がん細胞抗原は、がん細胞表面抗原である）。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原結合性分子が結合する、抗原の部分は、がん細胞の外部表面上に呈示される（すなわち、細胞外にある）。がん細胞抗原は、がん関連抗原であり得る。一部の実施形態では、がん細胞抗原は、その発現が、がんの発症、進行、または症状の重症度と関連する抗原である。がん関連抗原は、がんの原因または病理と関連する場合もあり、がんの帰結として、異常に発現される場合もある。一部の実施形態では、がん細胞抗原は、その発現が、がんの細胞により、例えば、同等な非がん性細胞（例えば、同じ組織／細胞型に由来する、非がん性細胞）による発現レベルと比較して、上方調節される（例えば、ＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルで）抗原である。一部の実施形態では、がん関連抗原は、がん性細胞により優先的に発現され、同等な非がん性細胞（例えば、同じ組織／細胞型に由来する、非がん性細胞）により発現されない場合がある。一部の実施形態では、がん関連抗原は、突然変異したがん遺伝子、または突然変異した腫瘍サプレッサー遺伝子の産物であり得る。一部の実施形態では、がん関連抗原は、過剰発現された細胞内タンパク質の産物の場合もあり、発がん性ウイルス、がん胎児抗原、または細胞表面糖脂質もしくは糖タンパク質により産生されたがん抗原の場合もある。
一部の実施形態では、ＨＥＲ３以外の抗原は、ＨＥＲ３関連がんの細胞により発現される抗原である。ＨＥＲ３関連がんは、ＨＥＲ３を発現する（例えば、細胞表面において、ＨＥＲ３タンパク質を発現する）がんであり得、このようながんは、「ＨＥＲ３陽性」がんと称され得る。ＨＥＲ３関連がんは、ＨＥＲ３遺伝子／タンパク質の発現が、危険性因子であり、かつ／あるいはがんの発生、発症、進行、もしくは症状の重症度、および／または転移と正に関連するがんを含む。ＨＥＲ３関連がんは、それらのいずれもが、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｚｈａｎｇら、Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ（２０１６）４８（１）：３９～４８、ならびにＳｉｔｈａｎａｎｄａｍおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ（２００８）１５（７）：４１３～４４８に記載されているがんを含む。一部の実施形態では、ＨＥＲ３関連がんは、肺がん（例えば、ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、乳がん、膵がん、前立腺がん、卵巣がん、胃がん、結腸がん、または口腔がんであり得る。
免疫細胞の表面分子は、免疫細胞の細胞表面において、または細胞表面上で発現される、任意のペプチド／ポリペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、グリカン、糖脂質、脂質、またはこれらの断片であり得る。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子が結合する、免疫細胞の表面分子の部分は、免疫細胞の外部表面上にある（すなわち、細胞外にある）。免疫細胞の表面分子は、任意の免疫細胞の細胞表面において発現され得る。一部の実施形態では、免疫細胞は、造血細胞由来の細胞、例えば、好中球、好酸球、好塩基球、樹状細胞、リンパ球、または単球であり得る。リンパ球は、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、もしくは自然リンパ球細胞（ＩＬＣ）、またはこれらの前駆細胞（例えば、胸腺細胞またはプレＢ細胞）であり得る。一部の実施形態では、免疫細胞の表面分子は、共刺激分子（例えば、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、またはＣＤ２７）またはこれらのリガンドであり得る。一部の実施形態では、免疫細胞の表面分子は、チェックポイント分子（例えば、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、またはＢＴＬＡ）またはこれらのリガンドであり得る。
本発明に従う、多特異性抗原結合性分子は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＢｒｉｎｋｍａｎｎおよびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＭＡｂｓ（２０１７）９（２）：１８２～２１２に記載されているフォーマットなどの任意の適切なフォーマットで提供され得る。適切なフォーマットは、ＢｒｉｎｋｍａｎｎおよびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＭＡｂｓ（２０１７）９（２）：１８２～２１２の図２に示されたフォーマット：抗体コンジュゲート、例えば、ＩｇＧ２、Ｆ（ａｂ’）２、またはＣｏｖＸ－Ｂｏｄｙ；ＩｇＧまたはＩｇＧ様分子、例えば、ＩｇＧ、キメラＩｇＧ、κλ－ｂｏｄｙの共通ＨＣ；ＣＨ１／ＣＬ融合タンパク質、例えば、ｓｃＦｖ２－ＣＨ１／ＣＬ、ＶＨＨ２－ＣＨ１／ＣＬ；「可変ドメインだけの」二特異性抗原結合性分子、例えば、タンデムｓｃＦｖ（ｔａＦＶ）、トリプルボディー、ダイアボディー（Ｄｂ）、ｄｓＤｂ、Ｄｂ（ｋｉｈ）、ＤＡＲＴ、ｓｃＤＢ、ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ、ｔａｎｄＡｂ、トリプルヘッド、タンデムｄＡｂ／ＶＨＨ、四価ｄＡｂ．ＶＨＨ；非Ｉｇ融合タンパク質、例えば、ｓｃＦｖ２－アルブミン、ｓｃＤｂ－アルブミン、ｔａＦｖ－アルブミン、ｔａＦｖ－毒素、ミニ抗体、ＤＮＬ－Ｆａｂ２、ＤＮＬ－Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ、ＤＮＬ－Ｆａｂ２－ＩｇＧ－サイトカイン２、ＩｍｍＴＡＣ（ＴＣＲ－ｓｃＦｖ）；修飾ＦｃおよびＣＨ３融合タンパク質、例えば、ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ｋｉｈ）、ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ＣＨ３電荷対）、ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ＥＷ－ＲＶＴ）、ｓｃＦｖ－ｆｃ（ＨＡ－ＴＦ）、ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）、ｔａＦｖ－Ｆｃ（ｋｉｈ）、ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ｋｉｈ）－Ｆｖ、Ｆａｂ－Ｆｃ（ｋｉｈ）－ｓｃＦｖ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ｋｉｈ）、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ＢＥＡＴ）、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ－ＣＨ３（ｋｉｈ）、ＴｒｉＦａｂ；Ｆｃ融合体、例えば、ジダイアボディー、ｓｃＤｂ－Ｆｃ、ｔａＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ、ＨＣＡｂ－ＶＨＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ４－Ｉｇ、ｓｃＦｖ２－Ｆｃａｂ；ＣＨ３融合体、例えば、ダイア－ダイアボディー、ｓｃＤｂ－ＣＨ３；ＩｇＥ／ＩｇＭ ＣＨ２融合体、例えば、ｓｃＦｖ－ＥＨＤ２－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖＭＨＤ２－ｓｃＦｖ；Ｆａｂ融合タンパク質、例えば、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ（バイボディー）、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ２（トリボディー）、Ｆａｂ－Ｆｖ、Ｆａｂ－ｄｓＦｖ、Ｆａｂ－ＶＨＨ、直交型Ｆａｂ－Ｆａｂ；非Ｉｇ融合タンパク質、例えば、ＤＮＬ－Ｆａｂ３、ＤＮＬ－Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ、ＤＮＬ－Ｆａｂ２－ＩｇＧ－サイトカイン２；非対称ＩｇＧまたはＩｇＧ様分子、例えば、ＩｇＧ（ｋｉｈ）、ＩｇＧ（ｋｉｈ）共通ＬＣ、ＺＷ１ＩｇＧ共通ＬＣ、Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ共通ＬＣ、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＭａｂ（ｋｉｈ）、ｓｃＦａｂ－ＩｇＧ（ｋｉｈ）、Ｆａｂ－ｓｃＦａｂ－ＩｇＧ（ｋｉｈ）、直交型Ｆａｂ ＩｇＧ（ｋｉｈ）、ＤｕｅｔＭａｂ、ＣＨ３電荷対＋ＣＨ１／ＣＬ電荷対、ヒンジ／ＣＨ３電荷対、ＳＥＥＤ－ｂｏｄｙ、デュオボディー（Ｄｕｏｂｏｄｙ）、ｆｏｕｒ－ｉｎ－ｏｎｅ－ＣｒｏｓｓＭａｂ（ｋｉｈ）、ＬＵＺ－Ｙ共通ＬＣ；ＬＵＺ－Ｙ ｓｃＦａｂ－ＩｇＧ、ＦｃＦｃ＊；アペンデッドおよびＦｃ修飾ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ（ｋｉｈ）－Ｆｖ、ＩｇＧ ＨＡ－ＴＦ－Ｆｖ、ＩｇＧ（ｋｉｈ）ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ（ｋｉｈ）－ｓｃＦｖ２、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ（ｋｉｈ）－ｓｃＦｖ、ｈａｌｆＤＶＤ－Ｉｇ、ＤＶＩ－Ｉｇ（ｆｏｕｒ－ｉｎ－ｏｎｅ）、ＣｒｏｓｓＭａｂ－Ｆａｂ；修飾ＦｃおよびＣＨ３融合タンパク質、例えば、Ｆａｂ－Ｆｃ（ｋｉｈ）－ｓｃＦｖ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ｋｉｈ）、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ＢＥＡＴ）、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ－ＳＥＥＤｂｏｄｙ、ＴｒｉＦａｂ；アペンデッドＩｇＧ－ＨＣ融合体、例えば、ＩｇＧ－ＨＣ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－ｄＡｂ、ＩｇＧ－ｔａＦＶ、ＩｇＧ－ＣｒｏｓｓＦａｂ、ＩｇＧ－直交型Ｆａｂ、ＩｇＧ－（ＣαＣβ）Ｆａｂ、ｓｃＦｖ－ＨＣ－ＩｇＧ、タンデムＦａｂ－ＩｇＧ（直交型Ｆａｂ）Ｆａｂ－ＩｇＧ（ＣαＣβＦａｂ）、Ｆａｂ－ＩｇＧ（ＣＲ３）、Ｆａｂ－ヒンジ－ＩｇＧ（ＣＲ３）；アペンデッドＩｇＧ－ＬＣ融合体、例えば、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ（ＬＣ）、ｓｃＦｖ（ＬＣ）－ＩｇＧ、ｄＡｂ－ＩｇＧ；アペンデッドＩｇＧ－ＨＣおよびＬＣ融合体、例えば、ＤＶＤ－Ｉｇ、ＴＶＤ－Ｉｇ、ＣＯＤＶ－Ｉｇ、ｓｃＦｖ４－ＩｇＧ、Ｚｙｂｏｄｙ；Ｆｃ融合体、例えば、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ４－Ｉｇ；Ｆ（ａｂ’）２融合体、例えば、Ｆ（ａｂ’）２－ｓｃＦｖ２；ＣＨ１／ＣＬ融合タンパク質、例えば、ｓｃＦｖ２－ＣＨ１－ヒンジ／ＣＬ；修飾ＩｇＧ、例えば、ＤＡＦ（ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅ－ＩｇＧ）、ＤｕｔａＭａｂ、Ｍａｂ２；ならびに非Ｉｇ融合体、例えば、ＤＮＬ－Ｆａｂ４－ＩｇＧを含む。
当業者は、二特異性の抗原結合性分子を設計し、調製することができる。二特異性の抗原結合性分子を産生するための方法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＳｅｇａｌおよびＢａｓｔ、２００１．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１４：ＩＶ：２．１３：２．１３．１～２．１３．１６に記載されている通りに、例えば、還元性ジスルフィド結合または非還元性チオエーテル結合により、抗原結合性分子または抗体断片を化学的に架橋するステップを含む。例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（－２－ピリジルジチオ）－プロピオネート（ＳＰＤＰ）は、例えば、ヒンジ領域のＳＨ－基を介して、Ｆａｂ断片を化学的に架橋して、ジスルフィドにより連結された二特異性Ｆ（ａｂ）２ヘテロ二量体を創出するのに使用され得る。
二特異性の抗原結合性分子を産生するための他の方法は、抗体産生ハイブリドーマを、例えば、ポリエチレングリコールと融合させて、例えば、Ｄ．Ｍ．およびＢａｓｔ，Ｂ．Ｊ．２００１．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１４：ＩＶ：２．１３：２．１３．１～２．１３．１６に記載されている、二特異性抗体を分泌することができるクァドローマ細胞を産生するステップを含む。
本発明に従う、二特異性抗原結合性分子はまた、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２０１２）、４０章：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔａｎｄｅｍ ｓｃＦｖ（ＨｏｒｎｉｇおよびＦａｒｂｅｒ－Ｓｃｈｗａｒｚ）、またはＦｒｅｎｃｈ、Ｈｏｗ ｔｏ ｍａｋｅ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２０００；４０：３３３～３３９に記載されている、抗原結合性分子のためのポリペプチドをコードする核酸構築物からの組換えによる発現によっても産生することができ、これらの両方の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、２つの抗原結合性断片のための軽鎖および重鎖可変ドメイン（すなわち、ＨＥＲ３に結合することができる抗原結合性断片のための軽鎖および重鎖可変ドメイン、ならびに別の標的タンパク質に結合することができる抗原結合性断片のための軽鎖および重鎖可変ドメイン）をコードし、抗原結合性断片の間の適切なリンカーまたは二量体化ドメインをコードする配列を含むＤＮＡ構築物は、分子クローニング技法により調製され得る。その後、組換え二特異性抗体は、適切な宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）内の構築物の発現（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける）により産生され、次いで発現された組換え二特異性抗体は任意選択で精製され得る。
Ｆｃ領域
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、Ｆｃ領域を含む。
ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤのアイソタイプでは、Ｆｃ領域は、１つのポリペプチドに由来するＣＨ２およびＣＨ３領域と、別のポリペプチドに由来するＣＨ２およびＣＨ３領域とから構成される。２つのポリペプチドに由来するＣＨ２およびＣＨ３領域が、併せて、Ｆｃ領域を形成する。ＩｇＭおよびＩｇＥのアイソタイプでは、Ｆｃ領域は、３つの定常ドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）を含有し、２つのポリペプチドに由来するＣＨ２～ＣＨ４が、併せて、Ｆｃ領域を形成する。
本開示の多様な態様に従う、好ましい実施形態では、Ｆｃ領域は、各ポリペプチドが、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む、２つのポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＣＨ２およびＣＨ３領域のうちの１つまたは複数における、Ｆｃ領域の会合を促進する修飾を含むＦｃ領域を含む。抗原結合性分子の構成要素であるポリペプチドの組換え共発現、および後続する会合は、いくつかの可能な組合せをもたらす。組換え産生において、抗原結合性分子内の所望の組合せのポリペプチドの収率を改善するために、所望の組合せの、重鎖ポリペプチドの会合を促進する、Ｆｃ領域の修飾を導入することが有利である。修飾は、例えば、異なるポリペプチド鎖のＣＨ２および／またはＣＨ３領域の間の疎水性および／または静電相互作用を促進し得る。適切な修飾は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｈａら、Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｎｏｌ（２０１６）７：３９４に記載されている。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、Ｈａら、Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｎｏｌ（２０１６）７：３９４の表１において示される、以下のフォーマット：ＫｉＨ、ＫｉＨＳ－Ｓ、ＨＡ－ＴＦ、ＺＷ１、７．８．６０、ＤＤ－ＫＫ、ＥＷ－ＲＶＴ、ＥＷ－ＲＶＴＳ－Ｓ、ＳＥＥＤ、またはＡ１０７のうちの１つに従う、Ｆｃ領域のＣＨ３領域内に対をなす置換を含むＦｃ領域を含む。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、例えば、ＵＳ７，６９５，９３６およびＣａｒｔｅｒ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８、７～１５（２００１）に記載されている、例えば、「ノブ－イントゥ－ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）」または「ＫｉＨ」修飾を含む。このような実施形態では、Ｆｃ領域のうちのＣＨ３領域の１つは、「ノブ」修飾を含み、他のＣＨ３領域は、「ホール」修飾を含む。「ノブ」が、ポリペプチドのヘテロ二量体化を促進し（およびホモ二量体化を阻害し）、および／またはヘテロ二量体を安定化させるために、「ホール」内に配置され得るように、「ノブ」および「ホール」修飾は、それぞれのＣＨ３領域内に配置される。ノブは、小型鎖を有するアミノ酸を、より大型の側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）を有するアミノ酸で置換することにより構築される。ホールは、大型側鎖を有するアミノ酸を、より小型の側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）を有するアミノ酸で置換することにより創出される。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子のＦｃ領域のうちのＣＨ３領域の１つは、置換（本明細書における、Ｆｃ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の位置／置換の番号付けは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１に記載されているＥＵ番号付けシステムに従う）Ｔ３６６Ｗを含み、Ｆｃ領域のうちの他のＣＨ３領域は、置換Ｙ４０７Ｖを含む。一部の実施形態では、抗原結合性分子のＦｃ領域のうちのＣＨ３領域の１つは、置換Ｔ３６６Ｗを含み、Ｆｃ領域のうちの他のＣＨ３領域は、置換Ｔ３６６ＳおよびＬ３６８Ａを含む。一部の実施形態では、抗原結合性分子のＦｃ領域のうちのＣＨ３領域の１つは、置換Ｔ３６６Ｗを含み、Ｆｃ領域のうちの他のＣＨ３領域は、置換Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｓ、およびＬ３６８Ａを含む。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、例えば、ＷＯ２０１４／１３１６９４Ａ１に記載されている、「ＤＤ－ＫＫ」修飾を含む。一部の実施形態では、ＣＨ３領域の１つは、置換Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄを含み、Ｆｃ領域のうちの他のＣＨ３領域は、置換Ｅ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋを含む。修飾は、ＣＨ３領域の間の静電相互作用を促進する。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、Ｌａｂｒｉｊｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（２０１３）１１０（１３）：５１４５～５０に記載されている通りに修飾され、「デュオボディー」フォーマットと称されるＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、ＣＨ３領域の１つは、置換Ｋ４０９Ｒを含み、Ｆｃ領域のうちの他のＣＨ３領域は、置換Ｋ４０５Ｌを含む。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、Ｓｔｒｏｐら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２０１２）４２０（３）：２０４～１９に記載されている、「ＥＥＥ－ＲＲＲ」修飾を含むＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、ＣＨ３領域の１つは、置換Ｄ２２１Ｅ、Ｐ２２８Ｅ、およびＬ３６８Ｅを含み、Ｆｃ領域のうちの他のＣＨ３領域は、置換Ｄ２２１Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、およびＫ４０９Ｒを含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、Ｃｈｏｉら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ（２０１３）１２（１２）：２７４８～５９に記載されている、「ＥＷ－ＲＶＴ」修飾を含むＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、ＣＨ３領域の１つは、置換Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗを含み、Ｆｃ領域のうちの他のＣＨ３領域は、置換Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、およびＦ４０５Ｔを含む。
一部の実施形態では、ＣＨ３領域の１つは、置換Ｓ３５４Ｃを含み、Ｆｃ領域のうちの他のＣＨ３領域は、置換Ｙ３４９Ｃを含む。これらのシステイン残基の導入は、Ｆｃ領域の２つのＣＨ３領域の間のジスルフィド架橋の形成を結果としてもたらし、ヘテロ二量体をさらに安定化させる（Ｃａｒｔｅｒ（２００１）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４８、７～１５）。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、「ＫｉＨＳ－Ｓ」修飾を含む。一部の実施形態では、ＣＨ３領域の１つは、置換Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含み、Ｆｃ領域のうちの他のＣＨ３領域は、置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＹ３４９Ｃを含む。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、Ｄａｖｉｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ（２０１０）２３（４）：１９５～２０２に記載されている、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３のβ鎖セグメントと、ヒトＩｇＡ ＣＨ３のβ鎖セグメントとが交換される、「ＳＥＥＤ」修飾を含むＦｃ領域を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ３領域の１つは、置換Ｓ３６４ＨおよびＦ４０５Ａを含み、Ｆｃ領域のうちの他のＣＨ３領域は、置換Ｙ３４９ＴおよびＴ３９４Ｆ（例えば、Ｍｏｏｒｅら、ＭＡｂｓ（２０１１）３（６）：５４６～５７を参照されたい）を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ３領域の１つは、置換Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、Ｆｃ領域のうちの他のＣＨ３領域は、置換Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗ（例えば、Ｖｏｎ Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎら、ＭＡｂｓ（２０１３）５（５）：６４６～５４を参照されたい）を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ３領域の１つは、置換Ｋ３６０Ｄ、Ｄ３９９Ｍ、およびＹ４０７Ａを含み、Ｆｃ領域のうちの他のＣＨ３領域は、置換Ｅ３４５Ｒ、Ｑ３４７Ｒ、Ｔ３６６Ｖ、およびＫ４０９Ｖ（例えば、Ｌｅａｖｅｒ－Ｆａｙら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（２０１６）２４（４）：６４１～５１を参照されたい）を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ３領域の１つは、置換Ｋ３７０ＥおよびＫ４０９Ｗを含み、Ｆｃ領域のうちの他のＣＨ３領域は、置換Ｅ３５７Ｎ、Ｄ３９９Ｖ、およびＦ４０５Ｔ（例えば、Ｃｈｏｉら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（２０１５）１０（１２）：ｅ０１４５３４９を参照されたい）を含む。
Ｆｃ媒介性機能は、Ｆｃ受容体への結合、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成、細胞からの脱顆粒、サイトカインおよび／またはケモカインの産生、ならびに抗原のプロセシングおよび提示を含む。
当技術分野では、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、例えば、Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ（２０１８）９（１）：６３～７３に記載されている修飾などの、Ｆｃ媒介性機能に影響を及ぼす抗体のＦｃ領域への修飾が公知である。抗体のエフェクター機能に影響を及ぼすことが公知である、例示的なＦｃ領域の修飾は、Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ（２０１８）９（１）：６３～７３の表１にまとめられている。
置換の組合せである、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌは、Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００７）において、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を増大させ、これにより、ＡＤＣＣを増強することが記載されている。置換の組合せである、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥまたはＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌは、Ｌａｚａｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（２００６）１０３：４００５～４０１０において、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を増大させ、これにより、ＡＤＣＣを増大させることが記載されている。置換の組合せである、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌはまた、ＦｃγＲＩＩｂへの結合を減少させ、これにより、ＡＤＣＣを増大させることも記載されている。置換の組合せである、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａは、Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６：６５９１～６６０４において、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を増大させ、これにより、ＡＤＣＣを増大させることが記載されている。１つの重鎖における置換の組合せである、Ｌ２３４Ｙ／Ｌ２３５Ｑ／Ｇ２３６Ｗ／Ｓ２３９Ｍ／Ｈ２６８Ｄ／Ｄ２７０Ｅ／Ｓ２９８Ａ、および他の重鎖における置換の組合せである、Ｄ２７０Ｅ／Ｋ３２６Ｄ／Ａ３３０Ｍ／Ｋ３３４Ｅは、Ｍｉｍｏｔｏら、ＭＡｂｓ．（２０１３）：５：２２９～２３６において、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を増大させ、これにより、ＡＤＣＣを増大させることが記載されている。置換の組合せである、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅは、Ｒｉｃｈａｒｄｓら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．（２００８）７：２５１７～２５２７において、ＦｃγＲＩＩａへの結合を増大させ、かつ、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を増大させ、これにより、ＡＤＣＰを増大させることが記載されている。
置換の組合せである、Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓは、Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）１６６（４）：２５７１～５において、Ｃ１ｑへの結合を増大させ、これにより、ＣＤＣを増大させることが記載されている。置換の組合せである、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔは、Ｍｏｏｒｅら、ＭＡｂｓ．（２０１０）２（２）：１８１～９において、Ｃ１ｑへの結合を増大させ、これにより、ＣＤＣを増大させることが記載されている。Ｎａｔｓｕｍｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００８）６８（１０）：３８６３～７２に記載されている置換の組合せは、Ｃ１ｑへの結合を増大させ、これにより、ＣＤＣを増大させることが報告されている。置換の組合せである、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙは、Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１４）３４３（６１７６）：１２６０～３において、六量体化を増大させ、これにより、ＣＤＣを増大させることが記載されている。
置換の組合せである、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅは、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００２）１６９：５１７１～５１８０において、ｐＨ６．０における、ＦｃＲｎへの結合を増大させ、これにより、抗原結合性分子の半減期を延長することが記載されている。置換の組合せである、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓは、Ｚａｌｅｖｓｋｙら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１０）２８：１５７～１５９において、ｐＨ６．０における、ＦｃＲｎへの結合を増大させ、これにより、抗原結合性分子の半減期を延長することが記載されている。
本明細書で、重鎖定常領域／Ｆｃ領域／ＣＨ２－ＣＨ３領域／ＣＨ２領域／ＣＨ３領域が、参照の位置／置換「に対応する」位置／置換を含むものとして記載されている場合、相同な重鎖定常領域／Ｆｃ領域／ＣＨ２－ＣＨ３領域／ＣＨ２領域／ＣＨ３領域内の同等の位置／置換が想定される。
Ｆｃ領域が、特定の位置／置換を含むものとして記載される場合、位置／置換は、併せて、Ｆｃ領域を形成する、ポリペプチド鎖の一方または両方に存在し得る。
別途に指定されない限りにおいて、本明細書における位置は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１に記載されている、ＥＵ番号付けシステムに従い番号付けされた、ヒト免疫グロブリン定常領域のアミノ酸配列の位置を指す。例示を目的として述べると、ヒトＩｇＧ１における置換Ｌ２４２ＣおよびＫ３３４Ｃは、配列番号１７１に従い番号付けされた、ヒトＩｇＧ１定常領域の１２５位におけるＬ＞Ｃ置換と、２１７位におけるＫ＞Ｃ置換とに対応する。
相同な重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１（すなわち、配列番号１７１に示されるアミノ酸配列）の重鎖定常領域に対して、少なくとも６０％、好ましくは、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含む、重鎖定常領域である。相同なＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１（すなわち、配列番号１７４および１７５に示されるアミノ酸配列）のＣＨ２－ＣＨ３領域に対して、少なくとも６０％、好ましくは、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドから構成されるＦｃ領域である。相同なＣＨ２領域は、ヒトＩｇＧ１（すなわち、配列番号１７４に示されるアミノ酸配列）のＣＨ２領域に対して、少なくとも６０％、好ましくは、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含む、ＣＨ２領域である。相同なＣＨ３領域は、ヒトＩｇＧ１（すなわち、配列番号１７５に示されるアミノ酸配列）のＣＨ３領域に対して、少なくとも６０％、好ましくは、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含む、ＣＨ３領域である。
ヒトＩｇＧ１内で同定される位置に対応する位置は、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａ（Ｓｏｄｉｎｇ、Ｊ．２００５、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２１、９５１～９６０）などの配列アラインメントソフトウェアを使用して実施され得る、配列アラインメントにより同定され得る。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、Ｆｃ媒介性機能を増大させる修飾を含むＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣを増大させる修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＰを増大させる修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＣＤＣを増大させる修飾を含む。Ｆｃ媒介性機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ）を増大させる修飾を含むＦｃ領域を含む抗原結合性分子は、対応する非修飾のＦｃ領域を含む抗原結合性分子と比較して、関連するエフェクター機能のレベルの上昇を誘導する。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、１つまたは複数のＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ）に対する親和性を増大させる修飾を含むＦｃ領域を含む。Ｆｃ受容体に対する親和性を増大させる修飾は、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）および／または抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）などのＦｃ媒介性のエフェクター機能を増大させ得る。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、Ｃ１ｑに対する親和性を低減する修飾を含むＦｃ領域を含み、このような修飾は、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を低減し、これは、所望であり得る。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、六量体の形成を増大させる修飾を含むＦｃ領域を含む。１つまたは複数のＦｃ受容体に対する親和性を増大させ、Ｃ１ｑに対する親和性を低減し、かつ／または六量体の形成を増大させることができるＦｃ領域に対する修飾は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＳａｘｅｎａおよびＷｕ Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１６）７：５８０に記載されている。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＳａｘｅｎａおよびＷｕ Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１６）７：５８０の表１に示された置換のうちの１つまたは複数を含むＣＨ２／ＣＨ３を含むＦｃ領域を含む。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、Ｆｃ受容体への結合を増大させる修飾を含むＦｃを含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｆｃγ受容体への結合を増大させる修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩｂのうちの１つまたは複数への結合を増大させる修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を増大させる修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩＩａへの結合を増大させる修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩＩｂへの結合を増大させる修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃＲｎへの結合を増大させる修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、補体タンパク質への結合を増大させる修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｃ１ｑへの結合を増大させるか、または低減する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、抗原結合性分子の六量体化を促進する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、抗原結合性分子の半減期を延長する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、コエンゲージメントを増大させる修飾を含む。
本明細書では、「Ｆｃγ受容体」は、任意の種に由来してもよく、任意の種に由来する、アイソフォーム、断片、バリアント（突然変異体を含む）、または相同体を含む。同様に、「ＦｃγＲＩ」、「ＦｃγＲＩＩａ」、「ＦｃγＲＩＩｂ」、「ＦｃγＲＩＩｃ」、「ＦｃγＲＩＩＩａ」、および「ＦｃγＲＩＩＩｂ」とは、それぞれ、任意の種に由来する、ＦｃγＲＩ／ＦｃγＲＩＩａ／ＦｃγＲＩＩｂ／ＦｃγＲＩＩｃ／ＦｃγＲＩＩＩａ／ＦｃγＲＩＩＩｂを指し、任意の種に由来する、アイソフォーム、断片、バリアント（突然変異体を含む）、または相同体を含む。ヒトは、Ｆｃγ受容体の６つの異なるクラス（マウスオルソログを括弧内に示す）：ＦｃγＲＩ（ｍＦｃγＲＩ）、ＦｃγＲＩＩａ（ｍＦｃγＲＩＩＩ）、ＦｃγＲＩＩｂ（ｍＦｃγＲＩＩｂ）、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ（ｍＦｃγＲＩＶ）、およびＦｃγＲＩＩＩｂを有する。バリアントのＦｃγ受容体は、例えば、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの１５８Ｖおよび１５８Ｆの多型、ならびにヒトＦｃγＲＩＩａの１６７Ｈおよび１６７Ｒの多型を含む。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、以下：２４２位に対応する位置におけるＣ；３３４位に対応する位置におけるＣ；２３６位に対応する位置におけるＡ；２３９位に対応する位置におけるＤ；３３２位に対応する位置におけるＥ；３３０位に対応する位置におけるＬ；３４５位に対応する位置におけるＫ；および４３０位に対応する位置におけるＧのうちの１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つ）を含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、またはＣＨ２－ＣＨ３領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）Ｆｃ領域を含む。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、以下の置換（または対応する置換）：Ｌ２４２Ｃ、Ｋ３３４Ｃ、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｌ、Ｅ３４５Ｋ、およびＥ４３０Ｇのうちの１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つ）を含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、またはＣＨ２－ＣＨ３領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）Ｆｃ領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、２４２位に対応する位置におけるＣを含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、３３４位に対応する位置におけるＣを含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、２４２位に対応する位置におけるＣ、および３３４位に対応する位置におけるＣを含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、２３６位に対応する位置におけるＡを含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、２３９位に対応する位置におけるＤを含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、２３６位に対応する位置におけるＡ、および２３９位に対応する位置におけるＤを含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、３３２位に対応する位置におけるＥを含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、２３６位に対応する位置におけるＡ、２３９位に対応する位置におけるＤ、および３３２位に対応する位置におけるＥを含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、３３０位に対応する位置におけるＬを含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、２３６位に対応する位置におけるＡ、２３９位に対応する位置におけるＤ、３３２位に対応する位置におけるＥ、および３３０位に対応する位置におけるＬを含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、３４５位に対応する位置におけるＫを含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ３領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、４３０位に対応する位置におけるＧを含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ３領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、３４５位に対応する位置におけるＫ、および４３０位に対応する位置におけるＧを含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、２４２位に対応する位置におけるＣ、３３４位に対応する位置におけるＣ、２３６位に対応する位置におけるＡ、および２３９位に対応する位置におけるＤを含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）Ｆｃ領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、２４２位に対応する位置におけるＣ、３３４位に対応する位置におけるＣ、２３６位に対応する位置におけるＡ、２３９位に対応する位置におけるＤ、および３３２位に対応する位置におけるＥを含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）Ｆｃ領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、２４２位に対応する位置におけるＣ、３３４位に対応する位置におけるＣ、２３６位に対応する位置におけるＡ、２３９位に対応する位置におけるＤ、３３２位に対応する位置におけるＥ、および３３０位に対応する位置におけるＬを含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）Ｆｃ領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、２４２位に対応する位置におけるＣ、３３４位に対応する位置におけるＣ、３４５位に対応する位置におけるＫ、および４３０位に対応する位置におけるＧを含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、またはＣＨ２－ＣＨ３領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）Ｆｃ領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、置換Ｌ２４２Ｃ（または同等の置換）を含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、置換Ｋ３３４Ｃ（または同等の置換）を含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、置換Ｌ２４２Ｃ（または同等の置換）、および置換Ｋ３３４Ｃ（または同等の置換）を含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、置換Ｇ２３６Ａ（または同等の置換）を含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、置換Ｓ２３９Ｄ（または同等の置換）を含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、置換Ｇ２３６Ａ（または同等の置換）、および置換Ｓ２３９Ｄ（または同等の置換）を含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、置換Ｉ３３２Ｅ（または同等の置換）を含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、置換Ｇ２３６Ａ（または同等の置換）、置換Ｓ２３９Ｄ（または同等の置換）、および置換Ｉ３３２Ｅ（または同等の置換）を含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、置換Ａ３３０Ｌ（または同等の置換）を含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、置換Ｇ２３６Ａ（または同等の置換）、置換Ｓ２３９Ｄ（または同等の置換）、置換Ｉ３３２Ｅ（または同等の置換）、および置換Ａ３３０Ｌ（または同等の置換）を含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、置換Ｅ３４５Ｋ（または同等の置換）を含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ３領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、置換Ｅ４３０Ｇ（または同等の置換）を含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ３領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、置換Ｅ３４５Ｋ（または同等の置換）、および置換Ｅ４３０Ｇ（または同等の置換）を含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、置換Ｌ２４２Ｃ（または同等の置換）、置換Ｋ３３４Ｃ（または同等の置換）、置換Ｇ２３６Ａ（または同等の置換）、および置換Ｓ２３９Ｄ（または同等の置換）を含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）Ｆｃ領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、置換Ｌ２４２Ｃ（または同等の置換）、置換Ｋ３３４Ｃ（または同等の置換）、置換Ｇ２３６Ａ（または同等の置換）、置換Ｓ２３９Ｄ（または同等の置換）、および置換Ｉ３３２Ｅ（または同等の置換）を含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）Ｆｃ領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、置換Ｌ２４２Ｃ（または同等の置換）、置換Ｋ３３４Ｃ（または同等の置換）、置換Ｇ２３６Ａ（または同等の置換）、置換Ｓ２３９Ｄ（または同等の置換）、置換Ｉ３３２Ｅ（または同等の置換）、および置換Ａ３３０Ｌ（または同等の置換）を含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、ＣＨ２－ＣＨ３領域、またはＣＨ２領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）Ｆｃ領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、置換Ｌ２４２Ｃ（または同等の置換）、置換Ｋ３３４Ｃ（または同等の置換）、置換Ｅ３４５Ｋ（または同等の置換）、および置換Ｅ４３０Ｇ（または同等の置換）を含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、またはＣＨ２－ＣＨ３領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）Ｆｃ領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、以下：２４３位に対応する位置におけるＬ、２９２位に対応する位置におけるＰ、３００位に対応する位置におけるＬ、３０５位に対応する位置におけるＩ、および３９６位に対応する位置におけるＬ；２３９位に対応する位置におけるＤ、および３３２位に対応する位置におけるＥ；２３９位に対応する位置におけるＤ、３３２位に対応する位置におけるＥ、および３３０位に対応する位置におけるＬ；２９８位に対応する位置におけるＡ、３３３位に対応する位置におけるＡ、および３３４位に対応する位置におけるＡ；２３４位に対応する位置におけるＹ、２３５位に対応する位置におけるＱ、２３６位に対応する位置におけるＷ、２３９位に対応する位置におけるＭ、２６８位に対応する位置におけるＤ、２７０位に対応する位置におけるＥ、および２９８位に対応する位置におけるＡ；２７０位に対応する位置におけるＥ、３２６位に対応する位置におけるＤ、３３０位に対応する位置におけるＭ、および３３４位に対応する位置におけるＥ；２３６位に対応する位置におけるＡ、２３９位に対応する位置におけるＤ、および３３２位に対応する位置におけるＥ；３２６位に対応する位置におけるＷ、および３３３位に対応する位置におけるＳ；２６７位に対応する位置におけるＥ、２６８位に対応する位置におけるＦ、および３２４位に対応する位置におけるＴ；３４５位に対応する位置におけるＲ、４３０位に対応する位置におけるＧ、および４４０位に対応する位置におけるＹ；２５２位に対応する位置におけるＹ、２５４位に対応する位置におけるＴ、および２５６位に対応する位置におけるＥ；および４２８位に対応する位置におけるＬ、および４３４位に対応する位置におけるＳのうちの１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、または１２個）を含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、またはＣＨ２－ＣＨ３領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）Ｆｃ領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、以下の置換（または対応する置換）の組合せ：Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ；Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ；Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ；Ｌ２３４Ｙ／Ｌ２３５Ｑ／Ｇ２３６Ｗ／Ｓ２３９Ｍ／Ｈ２６８Ｄ／Ｄ２７０Ｅ／Ｓ２９８Ａ；Ｄ２７０Ｅ／Ｋ３２６Ｄ／Ａ３３０Ｍ／Ｋ３３４Ｅ；Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ；Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓ；Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ；Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ；Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ；およびＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓのうちの１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、または１２個）を含む（例えば、これらを含む、重鎖定常領域、またはＣＨ２－ＣＨ３領域を含む、さらに１つのポリペプチドを含む）Ｆｃ領域を含む。
ポリペプチド
本発明はまた、抗原結合性分子のポリペプチド構成要素も提供する。ポリペプチドは、単離形態で提供される場合もあり、実質的な精製形態で提供される場合もある。
本発明の抗原結合性分子は、ポリペプチドの複合体であり得るか、またはこれを含み得る。
ポリペプチドが１つを超えるドメインまたは領域を含む本明細書では、複数のドメイン／領域が、同じポリペプチド鎖内に存在することが好ましいことが理解されるであろう。すなわち、１つを超えるドメインまたは領域を含むポリペプチドは、ドメイン／領域を含む融合ポリペプチドである。
一部の実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、本明細書で記載されるＶＨを含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、本明細書で記載されるＶＬを含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、１つまたは複数の抗体の重鎖定常領域（ＣＨ）をさらに含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、１つまたは複数の抗体の軽鎖定常領域（ＣＬ）をさらに含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ）のＣＨ１、ＣＨ２領域、および／またはＣＨ３領域を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、免疫グロブリンの重鎖定常配列の１つまたは複数の領域を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書で記載されるＣＨ１領域を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書で記載されるＣＨ１－ＣＨ２ヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書で記載されるＣＨ２領域を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書で記載されるＣＨ３領域を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書で記載されるＣＨ２－ＣＨ３領域を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、以下のアミノ酸置換／アミノ酸置換の組合せ（例えば、参照により本明細書の上記に組み込まれている、Ｈａら、Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｎｏｌ（２０１６）７：３９４の表１に示される）：Ｔ３６６Ｗ；Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ；Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃ；Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＹ３４９Ｃ；Ｓ３６４ＨおよびＦ４０５Ａ；Ｙ３４９ＴおよびＴ３９４Ｆ；Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖ；Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗ；Ｋ３６０Ｄ、Ｄ３９９Ｍ、およびＹ４０７Ａ；Ｅ３４５Ｒ、Ｑ３４７Ｒ、Ｔ３６６Ｖ、およびＫ４０９Ｖ；Ｋ４０９ＤおよびＫ３９２Ｄ；Ｄ３９９ＫおよびＥ３５６Ｋ；Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ；Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、およびＦ４０５Ｔ；Ｋ３６０Ｅ、Ｋ４０９Ｗ、およびＹ３４９Ｃ；Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、Ｆ４０５Ｔ、およびＳ３５４Ｃ；Ｋ３７０ＥおよびＫ４０９Ｗ；ならびにＥ３５７Ｎ、Ｄ３９９Ｖ、およびＦ４０５Ｔのうちのいずれか１つを含むＣＨ３領域を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドのＣＨ２および／またはＣＨ３領域は、ポリペプチドの、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域を含む別のポリペプチドとの会合を促進するための１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、免疫グロブリンの軽鎖定常配列の１つまたは複数の領域を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書で記載されるＣＬ領域を含む。
一部の実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へと、以下：
（ｉ）ＶＨ
（ｉｉ）ＶＬ
（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ１
（ｉｖ）ＶＬ－ＣＬ
（ｖ）ＶＬ－ＣＨ１
（ｖｉ）ＶＨ－ＣＬ
（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３
（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＬ－ＣＨ２－ＣＨ３
（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３
（ｘ）ＶＨ－ＣＬ－ＣＨ２－ＣＨ３
のうちの１つに従う構造を含む。
また、本発明により、本発明のポリペプチドから構成される抗原結合性分子も提供される。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、以下のポリペプチドの組合せ：
（Ａ）ＶＨ＋ＶＬ
（Ｂ）ＶＨ－ＣＨ１＋ＶＬ－ＣＬ
（Ｃ）ＶＬ－ＣＨ１＋ＶＨ－ＣＬ
（Ｄ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３＋ＶＬ－ＣＬ
（Ｅ）ＶＨ－ＣＬ－ＣＨ２－ＣＨ３＋ＶＬ－ＣＨ１
（Ｆ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３＋ＶＨ－ＣＬ
（Ｇ）ＶＬ－ＣＬ－ＣＨ２－ＣＨ３＋ＶＨ－ＣＨ１
（Ｈ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３＋ＶＬ－ＣＬ－ＣＨ２－ＣＨ３
（Ｉ）ＶＨ－ＣＬ－ＣＨ２－ＣＨ３＋ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３
のうちの１つを含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、上記の（Ａ）～（Ｉ）に示された組合せのポリペプチドのうちの１つより多くを含む。例を目的として述べると、上記の（Ｄ）を参照すると、一部の実施形態では、抗原結合性分子は、構造ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を含む２つのポリペプチドと、構造ＶＬ－ＣＬを含む２つのポリペプチドとを含む。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、以下のポリペプチドの組合せ：
（Ｊ）ＶＨ（抗ＨＥＲ３）＋ＶＬ（抗ＨＥＲ３）
（Ｋ）ＶＨ（抗ＨＥＲ３）－ＣＨ１＋ＶＬ（抗ＨＥＲ３）－ＣＬ
（Ｌ）ＶＬ（抗ＨＥＲ３）－ＣＨ１＋ＶＨ（抗ＨＥＲ３）－ＣＬ
（Ｍ）ＶＨ（抗ＨＥＲ３）－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３＋ＶＬ（抗ＨＥＲ３）－ＣＬ
（Ｎ）ＶＨ（抗ＨＥＲ３）－ＣＬ－ＣＨ２－ＣＨ３＋ＶＬ（抗ＨＥＲ３）－ＣＨ１
（Ｏ）ＶＬ（抗ＨＥＲ３）－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３＋ＶＨ（抗ＨＥＲ３）－ＣＬ
（Ｐ）ＶＬ（抗ＨＥＲ３）－ＣＬ－ＣＨ２－ＣＨ３＋ＶＨ（抗ＨＥＲ３）－ＣＨ１
（Ｑ）ＶＨ（抗ＨＥＲ３）－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３＋ＶＬ（抗ＨＥＲ３）－ＣＬ－ＣＨ２－ＣＨ３
（Ｒ）ＶＨ（抗ＨＥＲ３）－ＣＬ－ＣＨ２－ＣＨ３＋ＶＬ（抗ＨＥＲ３）－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３
のうちの１つを含み、ここで、「ＶＨ（抗ＨＥＲ３）」とは、本明細書で記載される、例えば、上記の（１）～（６１）のうちの１つにおいて規定される、ＨＥＲ３に結合することができる抗原結合性分子のＶＨを指し；「ＶＬ（抗ＨＥＲ３）」とは、本明細書で記載される、例えば、上記の（６２）～（１１９）のうちの１つにおいて規定される、ＨＥＲ３に結合することができる抗原結合性分子のＶＬを指す。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１８７～２２３のうちの１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる。
リンカーおよびさらなる配列
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子およびポリペプチドは、ヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＨ１領域と、ＣＨ２領域との間にもたらされる。一部の実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＬ領域と、ＣＨ２領域との間にもたらされる。一部の実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号１７３のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子およびポリペプチドは、アミノ酸配列の間に１つまたは複数のリンカー配列を含む。リンカー配列は、抗原結合性分子／ポリペプチドのＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１－ＣＨ２ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域のうちの１つまたは複数の一方または両方の末端にもたらされ得る。
当業者には、リンカー配列は公知であり、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｎら、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ（２０１３）６５（１０）：１３５７～１３６９に記載されている。一部の実施形態では、リンカー配列は、可動性リンカー配列であり得る。可動性リンカー配列は、リンカー配列により連結されたアミノ酸配列の相対的運動を可能とする。当業者には、可動性リンカーは公知であり、いくつかは、Ｃｈｅｎら、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ（２０１３）６５（１０）：１３５７～１３６９において同定されている。可動性リンカー配列は、しばしば、高比率のグリシン残基および／またはセリン残基を含む。
一部の実施形態では、リンカー配列は、少なくとも１つのグリシン残基、および／または少なくとも１つのセリン残基を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、グリシンおよびセリン残基からなる。一部の実施形態では、リンカー配列は、１～２、１～３、１～４、１～５、または１～１０アミノ酸の長さを有する。
本発明の抗原結合性分子およびポリペプチドは、さらなるアミノ酸またはアミノ酸の配列をさらに含み得る。例えば、抗原結合性分子およびポリペプチドは、抗原結合性分子／ポリペプチドの発現、フォールディング、輸送、プロセシング、精製、または検出を容易にするアミノ酸配列を含み得る。例えば、抗原結合性分子／ポリペプチドは、任意選択で、抗原結合性分子／ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端において、Ｈｉｓ（例えば、６×Ｈｉｓ）、Ｍｙｃ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｅ、またはビオチンタグをコードする配列を含み得る。一部の実施形態では、抗原結合性分子／ポリペプチドは、検出可能部分、例えば、蛍光、発光、免疫検出可能、放射性、化学、核酸、または酵素標識を含む。
本発明の抗原結合性分子およびポリペプチドは、シグナルペプチド（リーダー配列またはシグナル配列としても公知である）をさらに含み得る。シグナルペプチドは通常、単一のアルファヘリックスを形成する、５～３０の疎水性アミノ酸の配列からなる。細胞表面で分泌されるタンパク質および発現されるタンパク質は、しばしば、シグナルペプチドを含む。
シグナルペプチドは、抗原結合性分子／ポリペプチドのＮ末端に存在することができ、新たに合成される抗原結合性分子／ポリペプチド内に存在し得る。シグナルペプチドは、抗原結合性分子／ポリペプチドの効率的な輸送および分泌をもたらす。シグナルペプチドは、しばしば、切断により除去されるため、抗原結合性分子／ポリペプチドを発現する細胞から分泌される、成熟抗原結合性分子／ポリペプチド内に含まれない。
シグナルペプチドは、多くのタンパク質について公知であり、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ、ＴｒＥＭＢＬ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ、Ｅｎｓｅｍｂｌ、およびＩｎｔｅｒＰｒｏなどのデータベースに記録されており、かつ／または例えば、ＳｉｇｎａｌＰ（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、２０１１ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８：７８５～７８６）またはＳｉｇｎａｌ－ＢＬＡＳＴ（ＦｒａｎｋおよびＳｉｐｐｌ、２００８ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２４：２１７２～２１７６）などのアミノ酸配列解析ツールを使用して同定／予測され得る。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子／ポリペプチドのシグナルペプチドは、配列番号１７８～１８６のうちの１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる。
標識およびコンジュゲート
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、検出可能部分をさらに含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、検出可能部分、例えば、蛍光標識、リン光標識、発光標識、免疫検出可能標識（例えば、エピトープタグ）、放射性標識、化学、核酸、または酵素標識を含む。抗原結合性分子は、検出可能部分で、共有結合的に標識付けされる場合もあり、非共有結合的に標識付けされる場合もある。
蛍光標識は、例えば、フルオレセイン、ローダミン、アロフィコシアニン、エオシン、およびＮＤＢ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）、およびサマリウム（Ｓｍ）などの希土類のキレート剤、テトラメチルローダミン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、４－メチルウンベリフェロン、７－アミノ－４－メチルクマリン、Ｃｙ３、およびＣｙ５を含む。放射性標識は、ヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１２６、ヨウ素１３１、ヨウ素１３３、臭素７７、テクネチウム９９ｍ、インジウム１１１、インジウム１１３ｍ、ガリウム６７、ガリウム６８、ルテニウム９５、ルテニウム９７、ルテニウム１０３、ルテニウム１０５、水銀２０７、水銀２０３、レニウム９９ｍ、レニウム１０１、レニウム１０５、スカンジウム４７、テルリウム１２１ｍ、テルリウム１２２ｍ、テルリウム１２５ｍ、ツリウム１６５、ツリウム１６７、ツリウム１６８、銅６７、フッ素１８、イットリウム９０、パラジウム１００、ビスマス２１７、およびアンチモン２１１などの放射性同位体を含む。発光標識は、放射性発光標識、化学発光標識（例えば、アクリジニウムエステル、ルミノール、イソルミノール）、および生物発光標識を含む。免疫検出可能標識は、ハプテン、ペプチド／ポリペプチド、抗体、受容体、およびビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、またはジゴキシゲニンなどのリガンドを含む。核酸標識は、アプタマーを含む。酵素標識は、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、およびルシフェラーゼを含む。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、化学的部分にコンジュゲートされる。化学的部分は、治療効果をもたらすための部分であり得る。抗体－薬物コンジュゲートは、例えば、Ｐａｒｓｌｏｗら、Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ．２０１６年９月；４（３）：１４に概説されている。一部の実施形態では、化学的部分は、薬物部分（例えば、細胞傷害剤）であり得る。一部の実施形態では、薬物部分は、化学療法剤であり得る。一部の実施形態では、薬物部分は、カリケアマイシン、ＤＭ１、ＤＭ４、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、ＳＮ－３８、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、Ｄ６．５、およびＰＢＤから選択される。
抗原結合性分子の特定の例示的な実施形態
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号１８７のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド、および
（ｉｉ）配列番号１８８のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号１８９のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド、および
（ｉｉ）配列番号１９０のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号１９１のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド、および
（ｉｉ）配列番号１９２のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号１９３のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド、および
（ｉｉ）配列番号１９５のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号１９４のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド、および
（ｉｉ）配列番号１９５のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号１９６のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド、および
（ｉｉ）配列番号１９５のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号１９７のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド、および
（ｉｉ）配列番号１９９のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号１９８のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド、および
（ｉｉ）配列番号１９９のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド、および
（ｉｉ）配列番号２０１のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２０２のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド、および
（ｉｉ）配列番号２０３のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２０４のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド、および
（ｉｉ）配列番号２０５のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２０６のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド、および
（ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド、および
（ｉｉ）配列番号２０９のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２１０のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド、および
（ｉｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド、および
（ｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２１４のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド、および
（ｉｉ）配列番号２１５のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド、および
（ｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２１８のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド、および
（ｉｉ）配列番号２１９のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２２０のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド、および
（ｉｉ）配列番号２２１のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２２２のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド、および
（ｉｉ）配列番号２２３のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２２５のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド、および
（ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２２６のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド、および
（ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２２７のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド、および
（ｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２２８のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド、および
（ｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
抗原結合性分子の機能的特性
本明細書で記載される抗原結合性分子は、ある特定の機能的特性に言及することにより特徴付けられ得る。一部の実施形態では、本明細書で記載される抗原結合性分子は、以下の特性：
ＨＥＲ３（例えば、ヒト、マウス、ラット、またはカニクイザルＨＥＲ３）に結合すること；
ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２に結合しないこと；
ＨＥＲ３発現細胞に結合すること；
ＨＥＲ３の細胞外領域のサブドメインＩＩに結合すること；
ＨＥＲ３が、開放型および閉鎖型コンフォメーションにある場合、ＨＥＲ３に結合すること；
ＮＲＧ非依存的に、ＨＥＲ３に結合すること；
ＨＥＲ３への結合について、ＭＭ－１２１および／またはＬＪＭ－７１６と競合しないこと；
ＨＥＲ３への結合について、Ｍ－０５－７４および／またはＭ－０８－１１と競合しないこと；
ＨＥＲ３と、ＨＥＲ３の相互作用パートナー（例えば、ＨＥＲ３、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ４、ＨＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、および／またはｃＭｅｔ）との相互作用を阻害すること；
ＨＥＲ３媒介性シグナル伝達を阻害すること；
ＨＥＲ３発現細胞の増殖（例えば、ＮＲＧによる刺激に応答する）を阻害すること；
ＨＥＲ３発現細胞によるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ、および／またはＭＡＰＫシグナル伝達（例えば、ＮＲＧによる刺激に応答する）を阻害すること；
活性化型Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＩａ）に結合すること；
活性化型Ｆｃγ受容体への結合の増大；
配列番号１７４～１７５のアミノ酸配列を有するＣＨ２－ＣＨ３から構成されるＦｃ領域を有する、同等の抗原結合性分子と比較した、活性化型Ｆｃγ受容体への結合の増大；
配列番号１７４～１７５のアミノ酸配列を有するＣＨ２－ＣＨ３から構成されるＦｃ領域を有する、同等の抗原結合性分子と比較した、阻害型Ｆｃγ受容体への結合の減少；
配列番号１７４～１７５のアミノ酸配列を有するＣＨ２－ＣＨ３から構成されるＦｃ領域を有する、同等の抗原結合性分子と比較した、活性化型Ｆｃγ受容体への結合の、阻害型Ｆｃγ受容体への結合を上回る増大；
配列番号１７４～１７５のアミノ酸配列を有するＣＨ２－ＣＨ３から構成されるＦｃ領域を有する、同等の抗原結合性分子と比較した、補体タンパク質（例えば、Ｃ１ｑ）への結合の増大または減少；
配列番号１７４～１７５のアミノ酸配列を有するＣＨ２－ＣＨ３から構成されるＦｃ領域を有する、同等の抗原結合性分子と比較した、六量体化の増大；
配列番号１７４～１７５のアミノ酸配列を有するＣＨ２－ＣＨ３から構成されるＦｃ領域を有する、同等の抗原結合性分子と比較した、ＡＤＣＣ活性の増大；
配列番号１７４～１７５のアミノ酸配列を有するＣＨ２－ＣＨ３から構成されるＦｃ領域を有する、同等の抗原結合性分子と比較した、ＡＤＣＰ活性の増大；
配列番号１７４～１７５のアミノ酸配列を有するＣＨ２－ＣＨ３から構成されるＦｃ領域を有する、同等の抗原結合性分子と比較した、ＣＤＣ活性の増大または減少；
配列番号１７４～１７５のアミノ酸配列を有するＣＨ２－ＣＨ３から構成されるＦｃ領域を有する、同等の抗原結合性分子と比較して、同様であるか、または増大した熱安定性；
ＨＥＲ３発現細胞の殺滅を増大させること；
ＨＥＲ３発現細胞の数／比率を低減すること；
ならびに
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるがんの発症および／または進行を阻害すること
のうちの１つまたは複数を有し得る。
本明細書で記載される抗原結合性分子は、好ましくは、ＨＥＲ３への特異的結合を呈する。本明細書で使用される場合、「特異的結合」とは、抗原に対して選択的であり、非標的抗原への非特異的結合から区別され得る結合を指す。標的分子に特異的に結合する抗原結合性分子は、好ましくは、他の非標的分子に結合するより、大きな親和性および／または長い持続時間で、標的に結合する。
所与のポリペプチドが、所与の分子に特異的に結合する能力は、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；例えば、Ｈｅａｒｔｙら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２０１２）９０７：４１１～４４２を参照されたい）、バイオレイヤー干渉法（例えば、Ｌａｄら、（２０１５）Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ ２０（４）：４９８～５０７を参照されたい）、フローサイトメトリー、または放射性標識抗原結合性アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定アッセイによる方法などの、当技術分野で公知の方法に従う解析により決定され得る。このような解析によって、所与の分子への結合が測定および定量され得る。一部の実施形態では、結合は、所与のアッセイにおいて検出される応答であり得る。
一部の実施形態では、非標的分子への抗原結合性分子の結合の程度は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、バイオレイヤー干渉法により、またはＲＩＡにより測定される標的分子への抗体の結合の約１０％未満である。代替的に、結合特異性は、抗原結合性分子が、非標的分子への抗原結合性分子のＫＤより、少なくとも０．１の桁数（すなわち、０．１×１０ｎ、式中、ｎは、桁数を表す整数である）多い解離定数（ＫＤ）で結合する、結合親和性に関して反映され得る。これは、任意選択で、少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、または２．０のうちの１つであり得る。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ヒトＨＥＲ３、マウスＨＥＲ３、ラットＨＥＲ３、および／またはカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＨＥＲ３への結合を呈する。すなわち、一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ヒトＨＥＲ３、マウスＨＥＲ３、ラットＨＥＲ３、および／またはカニクイザルＨＥＲ３に対して交差反応性である。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、非ヒト霊長動物のＨＥＲ３との交差反応性を呈する。モデル種におけるＨＥＲ３に対する交差反応性は、サロゲート分子に依拠せずに同系モデルにおける有効性のｉｎ ｖｉｖｏでの調査を可能にする。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ヒトＨＥＲ３、マウスＨＥＲ３、ラットＨＥＲ３、および／またはカニクイザルＨＥＲ３に結合し、ＨＥＲ２および／またはＥＧＦＲ（例えば、ヒトＨＥＲ２および／またはヒトＥＧＦＲ）に結合しない。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＥＧＦＲ（例えば、ヒトＥＧＦＲ）への特異的結合を呈さない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ２（例えば、ヒトＨＥＲ２）への特異的結合を呈さない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３以外のタンパク質のＥＧＦＲファミリーのメンバーへの特異的結合を呈さない（すなわち、これらと交差反応しない）。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２および／またはＨＥＲ４への特異的結合を呈さない。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、１０μＭ以下、好ましくは、≦５μＭ、≦２μＭ、≦１μＭ、≦５００ｎＭ、≦４００ｎＭ、≦３００ｎＭ、≦２００ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦９５ｎＭ、≦９０ｎＭ、≦８５ｎＭ、≦８０ｎＭ、≦７５ｎＭ、≦７０ｎＭ、≦６５ｎＭ、≦６０ｎＭ、≦５５ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦４５ｎＭ、≦４０ｎＭ、≦３５ｎＭ、≦３０ｎＭ、≦２５ｎＭ、≦２０ｎＭ、≦１５ｎＭ、≦１２．５ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦９ｎＭ、≦８ｎＭ、≦７ｎＭ、≦６ｎＭ、≦５ｎＭ、≦４ｎＭ、≦３ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、≦９００ｐＭ、≦８００ｐＭ、≦７００ｐＭ、≦６００ｐＭ、≦５００ｐＭ、≦４００ｐＭ、≦３００ｐＭ、≦２００ｐＭ、≦１００ｐＭ、≦９０ｐＭ、≦８０ｐＭ、≦７０ｐＭ、≦６０ｐＭ、≦５０ｐＭ、≦４０ｐＭ、≦３０ｐＭ、≦２０ｐＭ、≦１０ｐＭ、≦９ｐＭ、≦８ｐＭ、≦７ｐＭ、≦６ｐＭ、≦５ｐＭ、≦４ｐＭ、≦３ｐＭ、≦２ｐＭ、≦１ｐＭのうちの１つのＫＤで、ＨＥＲ３（例えば、ヒトＨＥＲ３）に結合する。
本発明の抗原結合性分子は、ＨＥＲ３の特定の目的の領域に結合し得る。本発明に従う抗原結合性分子の抗原結合性領域は、アミノ酸の連続配列（すなわち、アミノ酸の一次配列）からなる、ＨＥＲ３の直鎖状エピトープに結合し得る。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、アミノ酸配列のうちのアミノ酸の不連続配列からなる、ＨＥＲ３のコンフォメーションエピトープに結合し得る。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＨＥＲ３に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３の細胞外領域（例えば、配列番号９に示される領域）に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３の細胞外領域のサブドメインＩＩ（例えば、配列番号１６に示される領域）に結合する。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２２９に示される、ＨＥＲ３の領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２２９に示される、ＨＥＲ３の領域の１つまたは複数のアミノ酸残基に接触する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３０および２３１に示される、ＨＥＲ３の領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３０および２３１に示される、ＨＥＲ３の領域の１つまたは複数のアミノ酸残基に接触する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３０に示される、ＨＥＲ３の領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３０に示される、ＨＥＲ３の領域の１つまたは複数のアミノ酸残基に接触する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３１に示される、ＨＥＲ３の領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３１に示される、ＨＥＲ３の領域の１つまたは複数のアミノ酸残基に接触する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３に示される、ＨＥＲ３の領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３に示される、ＨＥＲ３の領域の１つまたは複数のアミノ酸残基に接触する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２１に示される、ＨＥＲ３の領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２１に示される、ＨＥＲ３の領域の１つまたは複数のアミノ酸残基に接触する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号１９に示される、ＨＥＲ３の領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号１９に示される、ＨＥＲ３の領域の１つまたは複数のアミノ酸残基に接触する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２２に示される、ＨＥＲ３の領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２２に示される、ＨＥＲ３の領域の１つまたは複数のアミノ酸残基に接触する。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、配列番号１、３、４、６、または８のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドに結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号９のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドに結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドに結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２２９のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるペプチド／ポリペプチドに結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３０および２３１のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるペプチド／ポリペプチドに結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３０のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるペプチド／ポリペプチドに結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３１のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるペプチド／ポリペプチドに結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるペプチド／ポリペプチドに結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるペプチド／ポリペプチドに結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるペプチド／ポリペプチドに結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるペプチド／ポリペプチドに結合することができる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号１の２６０～２７９位に対応する、ＨＥＲ３の領域に結合しない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号１の２６０～２７９位に対応する、ＨＥＲ３の領域のアミノ酸残基に接触しない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３に示される、ＨＥＲ３の領域に結合しない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３に示される、ＨＥＲ３の領域のアミノ酸残基に接触しない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号１の２６０～２７９位に対応するアミノ酸配列からなるペプチドに結合することができない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２３のアミノ酸配列からなるペプチドに結合することができない。
本明細書で使用される場合、「ペプチド」とは、ペプチド結合により連結された、２つ以上のアミノ酸単量体による鎖を指す。ペプチドは、典型的に、領域内に、約２～５０アミノ酸の長さを有する。「ポリペプチド」とは、２つ以上のペプチドによるポリマー鎖である。ポリペプチドは、典型的に、約５０アミノ酸を超える長さを有する。
抗原結合性分子が、所与のペプチド／ポリペプチドに結合する能力は、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット（例えば、ウェスタンブロット）、免疫沈降、表面プラズモン共鳴、およびバイオレイヤー干渉法による解析を含む、当業者に周知の方法により解析され得る。
ＨＥＲ３へのリガンドの結合は、ＨＥＲ３が、ホモまたはヘテロ二量体化することを可能とする、コンフォメーション変化を促進する結果として、下流経路の活性化をもたらす。ＨＥＲ３は、「閉鎖型」および「開放型」コンフォメーションを示す。閉鎖型コンフォメーションとは、ＨＥＲ３が、テザリングコンフォメーションにあり、受容体のホモまたはヘテロ二量体化のために利用できないことを意味する。開放型コンフォメーションとは、ＨＥＲ３が、伸長コンフォメーションにあり、受容体のホモまたはヘテロ二量体化のために利用できることを意味する。
一部の実施形態では、ＨＥＲ３が、開放型コンフォメーションにある場合、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３に結合することができる。一部の実施形態では、ＨＥＲ３が、閉鎖型コンフォメーションにある場合、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３に結合することができる。一部の実施形態では、ＨＥＲ３が、開放型および／または閉鎖型コンフォメーションにある場合、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３に結合することができる。一部の実施形態では、ＨＥＲ３が、開放型および／または閉鎖型コンフォメーションにある場合、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３の細胞外ドメインに結合することができる。一部の実施形態では、ＨＥＲ３が、開放型および／または閉鎖型コンフォメーションにある場合、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３の二量体化アームに結合することができる。二量体化アームへの結合は、抗原結合性分子が、ＨＥＲ３と、例えば、本明細書で記載される、ＨＥＲ３の相互作用パートナーとの相互作用を阻止することを可能とする。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３に対するリガンドの存在下および／または非存在下において、ＨＥＲ３に結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３に対するリガンドに依存せずに、ＨＥＲ３に結合することができる。一部の実施形態では、リガンドは、ＮＲＧ、ＮＲＧ－１、および／またはＮＲＧ－２である。ＨＥＲ３は、ＨＥＲ３が、ホモまたはヘテロ二量体化することを可能とする、コンフォメーション変化を促進する、リガンドの、その細胞外ドメインへの結合により活性化される。ＨＥＲ３への抗原結合性分子の結合は、リガンド非存在下およびリガンド存在下のコンフォメーション状態のいずれにおいても、リガンドの結合に依存せずに、抗原結合性分子が、ＨＥＲ３の作用を阻害することを可能とする。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３へ結合するリガンドと競合しない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、リガンド結合性部位において、ＨＥＲ３に結合しない。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３に対するリガンドの存在下または非存在下で十分に同様にＨＥＲ３に結合する（すなわち、ＨＥＲ３がリガンド結合または非結合形態で提供されているかどうかに関係なく）。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３に対するリガンドの非存在下でのＨＥＲ３への抗原結合性分子の結合についての親和性と同様の親和性でＨＥＲ３に対するリガンドの存在下でＨＥＲ３に結合する。本開示の実施例８．１０ならびに図７８Ａおよび７８Ｂは、１０Ｄ１Ｆが、ＨＥＲ３がＮＲＧ１結合形態、およびＮＲＧ１の非存在下の両方で提供される場合、ピコモル以下の親和性でヒトＨＥＲ３に結合することを実証する。
本明細書では、参照結合親和性と「同様」の結合親和性とは、同等の条件下で決定して、参照結合親和性の５０％以内、例えば、４０％、４５％、３０％、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％のうちの１つ以内の結合親和性を意味する。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、（同等の条件下で決定して）リガンドの非存在下でのＨＥＲ３への結合についての抗原結合性分子のＫＤの５０％以内、例えば、４０％、４５％、３０％、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％のうちの１つ以内のＫＤでＨＥＲ３に対するリガンド（例えば、ＮＲＧ１またはＮＲＧ２）の存在下でＨＥＲ３に結合する。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、（同等の条件下で決定して）リガンドの非存在下でのＨＥＲ３への結合についての抗原結合性分子のＫｏｎの５０％以内、例えば、４０％、４５％、３０％、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％のうちの１つ以内のＫｏｎでＨＥＲ３に対するリガンド（例えば、ＮＲＧ１またはＮＲＧ２）の存在下でＨＥＲ３に結合する。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、（同等の条件下で決定して）リガンドの非存在下でのＨＥＲ３への結合についての抗原結合性分子のＫｏｆｆの５０％以内、例えば、４０％、４５％、３０％、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％のうちの１つ以内のＫｏｆｆでＨＥＲ３に対するリガンド（例えば、ＮＲＧ１またはＮＲＧ２）の存在下でＨＥＲ３に結合する。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、クローンである、１０Ｄ１、１０Ｄ１＿ｃ７５、１０Ｄ１＿ｃ７６、１０Ｄ１＿ｃ７７、１０Ｄ１＿ｃ７８ｖ１、１０Ｄ１＿ｃ７８ｖ２、１０Ｄ１＿１１Ｂ、１０Ｄ１＿ｃ８５ｖ１、１０Ｄ１＿ｃ８５ｖ２、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２、１０Ｄ１＿ｃ８７、１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿ｃ９０、１０Ｄ１＿ｃ９１、１０Ｄ１＿ｃ９２、１０Ｄ１＿ｃ９３、１０Ａ６、４－３５－Ｂ２、または４－３５－Ｂ４のうちの１つのＶＨおよびＶＬ配列を含む抗体が結合するＨＥＲ３の領域と同じＨＥＲ３の領域、または重複するＨＥＲ３の領域に結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、クローンである、１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿ｃ９０、または１０Ｄ１＿ｃ９１のうちの１つのＶＨおよびＶＬ配列を含む抗体が結合するＨＥＲ３の領域と同じＨＥＲ３の領域、または重複するＨＥＲ３の領域に結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、クローンである、１０Ｄ１＿ｃ８９のＶＨおよびＶＬ配列を含む抗体が結合するＨＥＲ３の領域と同じＨＥＲ３の領域、または重複するＨＥＲ３の領域に結合することができる。
抗体が結合する、ペプチド／ポリペプチドの領域は、抗体－抗原複合体についてのＸ線共結晶構造解析、ペプチド走査、突然変異誘発マッピング、質量分析による水素－重水素交換解析、ファージディスプレイ、競合ＥＬＩＳＡ、およびタンパク質分解ベースの「保護」法を含む、当技術分野で周知の多様な方法を使用して、当業者により決定され得る。このような方法については、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｅｒｓｈｏｎｉら、ＢｉｏＤｒｕｇｓ、２００７、２１（３）：１４５～１５６において記載されている。このような方法はまた、抗原結合性分子が、異なるコンフォメーションにあるタンパク質に結合することができるかどうかを決定するのにも使用され得る。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、抗ＨＥＲ３抗体クローンである、ＭＭ－１２１（例えば、Ｓｃｈｏｅｂｅｒｌら、Ｓｃｉ．Ｓｉｇｎａｌ．（２００９）２（７７）：ｒａ３１に記載されている）、および／またはＬＪＭ－７１６（例えば、Ｇａｒｎｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０１３）７３：６０２４～６０３５に記載されている）のＶＨおよびＶＬ配列を含む抗体と、同じＨＥＲ３の領域、または重複するＨＥＲ３の領域においてＨＥＲ３に結合しない。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、例えば、ＳＰＲ解析により決定される、抗ＨＥＲ３抗体クローンである、ＭＭ－１２１および／またはＬＪＭ－７１６のＶＨおよびＶＬ配列を含む抗体との、ＨＥＲ３への結合についての競合を呈さない。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＨＥＲ３が、細胞表面（すなわち、細胞膜内または細胞膜）において発現される場合、抗原結合性分子（すなわち、細胞外抗原結合性分子）にアクセス可能な領域内のＨＥＲ３に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３を発現する細胞の細胞表面において発現されるＨＥＲ３に結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３発現細胞（例えば、ＨＥＲ３＋細胞、例えば、ＨＥＲ３＋がん細胞）に結合することができる。
抗原結合性分子が、所与の細胞型に結合する能力は、例えば、結合しなかった抗原結合性分子を除去する洗浄ステップの後で、細胞を抗原結合性分子と接触させ、細胞に結合した抗原結合性分子を検出することにより解析され得る。抗原結合性分子が、免疫細胞表面分子発現細胞および／またはがん細胞抗原発現細胞に結合する能力は、フローサイトメトリーおよび免疫蛍光顕微鏡法などの方法により解析され得る。
本発明の抗原結合性分子は、ＨＥＲ３のアンタゴニストであり得る。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３および／またはＨＥＲ３の結合パートナー（例えば、ＨＥＲ３（すなわち、ホモ二量体化の場合における）、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ４、ＨＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒおよび／またはｃＭｅｔ）により媒介される、機能または過程（例えば、相互作用、シグナル伝達、または他の活性）を阻害することができる。本明細書では、「阻害」とは、対照条件と比べた、低減、減少、または低下を指す。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＨＥＲ３と、ＨＥＲ３の相互作用パートナーとの相互作用を阻害することができる。ＨＥＲ３の相互作用パートナーは、ＨＥＲ３と同じ細胞により発現され得る。相互作用パートナーまたはＨＥＲ３は、細胞表面（すなわち、細胞膜内または細胞膜）において発現され得る。一部の実施形態では、ＨＥＲ３の相互作用パートナーは、タンパク質のＥＧＦＲファミリーのメンバー、例えば、ＨＥＲ３、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ４、ＨＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、および／またはｃＭｅｔであり得る。一部の実施形態では、ＨＥＲ３の相互作用パートナーは、ＩＧＦ１Ｒおよび／またはｃＭｅｔであり得る。ＨＥＲ３と、ＨＥＲ３の相互作用パートナーとの相互作用は、ポリペプチド複合体の形成を結果としてもたらし得る。ポリペプチド複合体を形成する、ＨＥＲ３と、ＨＥＲ３の相互作用パートナーとの相互作用は、多量体化と称され得る。多量体化が、ポリペプチド単量体の間の多量体化である場合、二量体化と称され得る。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３単量体の間の相互作用を阻害することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３とＨＥＲ２との相互作用を阻害することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３とＥＧＦＲとの相互作用を阻害することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３とＨＥＲ４との相互作用を阻害することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３とＨＧＦＲとの相互作用を阻害することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３とＩＧＦ１Ｒとの相互作用を阻害することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３とｃＭｅｔとの相互作用を阻害することができる。
相互作用の阻害は、ＨＥＲ３と、ＨＥＲ３の相互作用パートナーとの相互作用に要求されるＨＥＲ３の領域（例えば、配列番号１９に示されるＨＥＲ３の二量体化ループ）への抗原結合性分子の結合により達成され得る。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３と、ＨＥＲ３の相互作用パートナーとの相互作用に必要なＨＥＲ３の１つまたは複数の残基に接触し、このようにして、抗原結合性分子は、領域を利用できないようにし、これにより、相互作用を阻害する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３と、ＨＥＲ３の相互作用パートナーとの相互作用を阻害／阻止する様式でＨＥＲ３に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３と、ＨＥＲ３の相互作用パートナーとの相互作用に要求されるＨＥＲ３の領域へのＨＥＲ３の相互作用パートナーのアクセスを阻害／阻止し、これは、抗原結合性分子が、ＨＥＲ３と、ＨＥＲ３の相互作用パートナーとの相互作用に要求されるＨＥＲ３の領域に接触しない場合でも、例えば、ＨＥＲ３と、相互作用パートナーとの相互作用に要求されるＨＥＲ３の領域へのＨＥＲ３の相互作用パートナーのアクセスの立体的阻害によって達成され得る。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３単量体のホモ二量体化を阻害することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３とＨＥＲ２との二量体化を阻害することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３とＥＧＦＲとの二量体化を阻害することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３とＨＥＲ４との二量体化を阻害することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３とＨＧＦＲとの二量体化を阻害することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３とＩＧＦ１Ｒとの二量体化を阻害することができる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３とｃＭｅｔとの二量体化を阻害することができる。
抗原結合性分子が、２つの因子の間の相互作用を阻害する能力は、例えば、抗体／断片の存在下で、または抗体／断片との相互作用パートナーの一方もしくは両方のインキュベーションの後で、相互作用を解析することにより決定され得る。所与の抗原結合性分子が、２つの相互作用パートナーの間の相互作用を阻害することができるかどうかを決定するためのアッセイは、競合ＥＬＩＳＡアッセイおよびＳＰＲによる解析を含む。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３と、ＨＥＲ３の相互作用パートナーとの相互作用の競合的阻害剤である。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、適切なアッセイにおいて、ＨＥＲ３と、ＨＥＲ３の相互作用パートナー（例えば、ＨＥＲ３、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ４、ＨＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、および／またはｃＭｅｔ）との相互作用を、抗原結合性分子の非存在下（または適切な対照抗原結合性分子の存在下）における、ＨＥＲ３と、ＨＥＲ３の相互作用パートナーとの相互作用のレベルの、１倍未満、例えば、≦０．９９倍、≦０．９５倍、≦０．９倍、≦０．８５倍、≦０．８倍、≦０．７５倍、≦０．７倍、≦０．６５倍、≦０．６倍、≦０．５５倍、≦０．５倍、≦０．４５倍、≦０．４倍、≦０．３５倍、≦０．３倍、≦０．２５倍、≦０．２倍、≦０．１５倍、≦０．１倍、≦０．０５倍、または≦０．０１倍に阻害することができる。
抗原結合性分子が、相互作用パートナー間の相互作用を阻害する能力はまた、このような相互作用の下流における機能的帰結を解析することによっても決定され得る。例えば、ＨＥＲ３と、ＨＥＲ３の相互作用パートナーとの相互作用の下流における機能的帰結は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ、および／またはＭＡＰＫシグナル伝達を含む。例えば、抗原結合性分子が、ＨＥＲ３と、ＨＥＲ３の相互作用パートナーとの相互作用を阻害する能力は、抗原結合性分子の存在下における、ＮＲＧによる処理の後で、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ、および／またはＭＡＰＫシグナル伝達を解析することにより決定され得る。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ、および／またはＭＡＰＫシグナル伝達は、例えば、シグナル伝達経路のリン酸化メンバーを検出することができる抗体を使用して、検出および定量され得る。
抗原結合性分子が、ＨＥＲ３と、ＨＥＲ３の相互作用パートナーとの相互作用を阻害する能力はまた、抗原結合性分子の存在下における、ＮＲＧによる処理の後で、ＨＥＲ３を発現する細胞の増殖を解析することによっても決定され得る。細胞増殖は、例えば、細胞数の変化を時間経過にわたって検出することにより決定され得るか、または３Ｈ－チミジンの取込みについてのｉｎ ｖｉｔｒｏ解析により決定され得るか、または例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＦｕｌｃｈｅｒおよびＷｏｎｇ、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９９９）７７（６）：５５９～５６４に記載されている、ＣＦＳＥ希釈アッセイにより決定され得る。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＢＲＡＦのＶ６００に対する突然変異を保有する細胞、例えば、ＢＲＡＦのＶ６００ＥまたはＶ６００Ｋ突然変異を含む細胞（実施例１０を参照されたい）の増殖を阻害することができる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３媒介性シグナル伝達を阻害する。ＨＥＲ３媒介性シグナル伝達は、例えば、ＨＥＲ３媒介性シグナル伝達の相関因子、例えば、細胞増殖、ならびに／またはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ、および／もしくはＭＡＰＫのシグナル伝達経路の１つもしくは複数のシグナル伝達分子のリン酸化についてのアッセイを使用して解析され得る。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＨＥＲ３発現細胞によるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ、および／またはＭＡＰＫシグナル伝達を阻害することができる。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ、および／またはＭＡＰＫシグナル伝達のレベルは、例えば、ＮＲＧによる刺激の後、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ、および／またはＭＡＰＫ経路の構成要素のうちの１つまたは複数のリン酸化を検出し、このレベルを定量することにより解析され得る（実施例４．３を参照されたい）。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、例えば、ＮＲＧによる刺激に応答する、ＨＥＲ３発現細胞の増殖を阻害することができる。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、適切なアッセイにおいて、ＨＥＲ３発現細胞の増殖を、抗原結合性分子の非存在下（または適切な対照抗原結合性分子の存在下）における、ＨＥＲ３発現細胞の増殖のレベルの、１倍未満、例えば、≦０．９９倍、≦０．９５倍、≦０．９倍、≦０．８５倍、≦０．８倍、≦０．７５倍、≦０．７倍、≦０．６５倍、≦０．６倍、≦０．５５倍、≦０．５倍、≦０．４５倍、≦０．４倍、≦０．３５倍、≦０．３倍、≦０．２５倍、≦０．２倍、≦０．１５倍、≦０．１倍、≦０．０５倍、または≦０．０１倍に阻害することができる。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、適切なアッセイにおいて、ＨＥＲ３発現細胞によるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ、および／またはＭＡＰＫシグナル伝達を、抗原結合性分子の非存在下（または適切な対照抗原結合性分子の存在下）における、ＨＥＲ３発現細胞によるシグナル伝達のレベルの、１倍未満、例えば、≦０．９９倍、≦０．９５倍、≦０．９倍、≦０．８５倍、≦０．８倍、≦０．７５倍、≦０．７倍、≦０．６５倍、≦０．６倍、≦０．５５倍、≦０．５倍、≦０．４５倍、≦０．４倍、≦０．３５倍、≦０．３倍、≦０．２５倍、≦０．２倍、≦０．１５倍、≦０．１倍、≦０．０５倍、または≦０．０１倍に阻害することができる。
ＨＥＲ３媒介性シグナル伝達は、例えば、実施例８．９に記載される通り、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて調べることができるか、または例えば、実施例１１に記載される通り、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて調べることができる。
ＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１６）６：１９７７２（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている方法に従って解析され得るか、または例えば、Ｊｅｄｅｍａら、Ｂｌｏｏｄ（２００４）１０３：２６７７～８２（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている、５１Ｃｒ放出アッセイによって解析され得る。ＡＤＣＣ活性はまた、製造業者の指示書に従って（本明細書の実施例５に記載される）、Ｐｉｅｒｃｅ ＬＤＨ細胞傷害作用アッセイキットを使用しても解析され得る。
ＡＤＣＰは、例えば、Ｋａｍｅｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１７）１９８（１ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）１５７．１７（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている方法に従って解析され得る。
ＣＤＣを誘導する能力は、例えば、Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（２０１６）、２９（１０）：４５７～４６６（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている、例えば、Ｃ１ｑ結合アッセイを使用して解析され得る。
抗原結合性分子の熱安定性は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｈｅら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．（２０１０）に記載されている、示差走査蛍光測定および示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を含む、当業者に周知の方法により解析され得る。熱安定性は、溶融温度（Ｔｍ）、アンフォールディング温度、または分解温度（例えば、℃またはＦ°で表される）の観点から反映され得る。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＦｃ領域を含む抗原結合性分子は、活性化型Ｆｃγ受容体（例えば、ｈＦｃγＲＩＩａ（例えば、ｈＦｃγＲＩＩａ１６７Ｈ、ｈＦｃγＲＩＩａ１６７Ｒ）、ｈＦｃγＲＩＩＩａ（例えば、ｈＦｃγＲＩＩＩａ１５８Ｖ、ｈＦｃγＲＩＩＩａ１５８Ｆ）、ｍＦｃγＲＩＶ、ｍＦｃγＲＩＩＩ）に、配列番号１７４～１７５のアミノ酸配列を有するＣＨ２－ＣＨ３から構成されるＦｃ領域を有する、同等の抗原結合性分子による、活性化型Ｆｃγ受容体に対する結合親和性の、１倍を超える、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５倍を超える、または２０倍を超える、結合親和性で結合する。一部の実施形態では、活性化型Ｆｃγ受容体への結合についての、本明細書で記載されるＦｃ領域を含む抗原結合性分子のＫＤは、活性化型Ｆｃγ受容体についての、配列番号１７４～１７５のアミノ酸配列を有するＣＨ２－ＣＨ３から構成されるＦｃ領域を有する同等の抗原結合性分子のＫＤの、１倍未満、例えば、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６倍未満、または０．０５倍未満である。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＦｃ領域を含む抗原結合性分子は、１０００ｎＭ以下、好ましくは、≦５００ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦７５ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦４０ｎＭ、≦３０ｎＭ、≦２０ｎＭ、≦１５ｎＭ、≦１２．５ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦９ｎＭ、≦８ｎＭ、≦７ｎＭ、≦６ｎＭ、≦５ｎＭ、≦４ｎＭ、≦３ｎＭ、≦２ｎＭ、または≦１ｎＭのうちの１つのＫＤで、活性化型Ｆｃγ受容体（例えば、ｈＦｃγＲＩＩａ（例えば、ｈＦｃγＲＩＩａ１６７Ｈ、ｈＦｃγＲＩＩａ１６７Ｒ）、ｈＦｃγＲＩＩＩａ（例えば、ｈＦｃγＲＩＩＩａ１５８Ｖ、ｈＦｃγＲＩＩＩａ１５８Ｆ）、ｍＦｃγＲＩＶ、ｍＦｃγＲＩＩＩ）に結合する。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＦｃ領域を含む抗原結合性分子は、ＦｃＲｎ（例えば、ｈＦｃＲｎ、ｍＦｃＲｎ）に、配列番号１７４～１７５のアミノ酸配列を有するＣＨ２－ＣＨ３から構成されるＦｃ領域を有する同等の抗原結合性分子によるＦｃＲｎに対する結合親和性の、１倍を超える、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５倍を超える、または２０倍を超える、結合親和性で結合する。一部の実施形態では、ＦｃＲｎへの結合についての、本明細書で記載されるＦｃ領域を含む抗原結合性分子のＫＤは、ＦｃＲｎについての、配列番号１７４～１７５のアミノ酸配列を有するＣＨ２－ＣＨ３から構成されるＦｃ領域を有する同等の抗原結合性分子のＫＤの、１倍未満、例えば、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６倍未満、または０．０５倍未満である。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＦｃ領域を含む抗原結合性分子は、１０００ｎＭ以下、好ましくは、≦５００ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦７５ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦４０ｎＭ、≦３０ｎＭ、≦２０ｎＭ、≦１５ｎＭ、≦１２．５ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦９ｎＭ、≦８ｎＭ、≦７ｎＭ、≦６ｎＭ、≦５ｎＭ、≦４ｎＭ、≦３ｎＭ、≦２ｎＭ、または≦１ｎＭのうちの１つのＫＤで、ＦｃＲｎ（例えば、ｈＦｃＲｎ、ｍＦｃＲｎ）に結合する。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＦｃ領域を含む抗原結合性分子は、阻害型Ｆｃγ受容体（例えば、ｈＦｃγＲＩＩｂ、ｍＦｃγＲＩＩｂ）に、配列番号１７４～１７５のアミノ酸配列を有するＣＨ２－ＣＨ３から構成されるＦｃ領域を有する同等の抗原結合性分子による阻害型Ｆｃγ受容体に対する結合親和性の、１倍未満、例えば、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２倍未満、または０．１倍未満の結合親和性で結合する。一部の実施形態では、阻害型Ｆｃγ受容体への結合についての、本明細書で記載されるＦｃ領域を含む抗原結合性分子のＫＤは、阻害型Ｆｃγ受容体についての、配列番号１７４～１７５のアミノ酸配列を有するＣＨ２－ＣＨ３から構成されるＦｃ領域を有する同等の抗原結合性分子のＫＤの、１倍を超える、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９倍を超える、または１０倍を超える。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＦｃ領域を含む抗原結合性分子は、阻害型Ｆｃγ受容体（例えば、ｈＦｃγＲＩＩｂ、ｍＦｃγＲＩＩｂ）に、１ｎＭ以上、好ましくは、≧５ｎＭ、≧１０ｎＭ、≧５０ｎＭ、≧１００ｎＭ、≧５００ｎＭ、≧１０００ｎＭ、≧２０００ｎＭ、≧３０００ｎＭ、≧４０００ｎＭ、または≧５０００ｎＭのうちの１つのＫＤで結合する。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＦｃ領域を含む抗原結合性分子についての、阻害型Ｆｃγ受容体（例えば、ｈＦｃγＲＩＩｂ）と比べた、活性化型Ｆｃγ受容体（例えば、ｈＦｃγＲＩＩａ）に対する結合の選択性は、配列番号１７４～１７５のアミノ酸配列を有するＣＨ２－ＣＨ３から構成されるＦｃ領域を有する同等の抗原結合性分子により呈される結合の選択性の、１倍を超える、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５倍を超える、または２０倍を超える。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＦｃ領域を含む抗原結合性分子は、配列番号１７４～１７５のアミノ酸配列を有するＣＨ２－ＣＨ３から構成されるＦｃ領域を有する同等の抗原結合性分子により呈されるＡＤＣＣの、１倍を超える、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５倍を超える、または２０倍を超えるＡＤＣＣを呈する。
一部の実施形態では、ＡＤＣＣ活性のアッセイにおいて、本明細書で記載されるＦｃ領域を含む抗原結合性分子について決定されるＥＣ５０（ｎｇ／ｍｌ）は、配列番号１７４～１７５のアミノ酸配列を有するＣＨ２－ＣＨ３から構成されるＦｃ領域を有する同等の抗原結合性分子について決定されるＥＣ５０（ｎｇ／ｍｌ）の、１倍未満、例えば、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２倍未満、または０．１倍未満である。
一部の実施形態では、ＡＤＣＣ活性のアッセイにおいて、本明細書で記載されるＦｃ領域を含む抗原結合性分子についてのＥＣ５０（ｎｇ／ｍｌ）は、５００ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは、≦４００ｎｇ／ｍｌ、≦３００ｎｇ／ｍｌ、≦２００ｎｇ／ｍｌ、≦１００ｎｇ／ｍｌ、≦９０ｎｇ／ｍｌ、≦８０ｎｇ／ｍｌ、≦７０ｎｇ／ｍｌ、≦６０ｎｇ／ｍｌ、≦５０ｎｇ／ｍｌ、≦４０ｎｇ／ｍｌ、≦３０ｎｇ／ｍｌ、≦２０ｎｇ／ｍｌ、または≦１０ｎｇ／ｍｌのうちの１つである。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＦｃ領域を含む抗原結合性分子は、配列番号１７４～１７５のアミノ酸配列を有するＣＨ２－ＣＨ３から構成されるＦｃ領域を有する同等の抗原結合性分子の溶融温度、アンフォールディング温度、または分解温度の≧０．７５倍、かつ、≦１．２５倍、例えば、≧０．８倍、かつ、≦１．２倍、≧０．８５倍、かつ、≦１．１５倍、≧０．９倍、かつ、≦１．１倍、≧０．９１倍、かつ、≦１．０９倍、≧０．９２倍、かつ、≦１．０８倍、≧０．９３倍、かつ、≦１．０７倍、≧０．９４倍、かつ、≦１．０６倍、≧０．９５倍、かつ、≦１．０５倍、≧０．９６倍、かつ、≦１．０４倍、≧０．９７倍、かつ、≦１．０３倍、≧０．９８倍、かつ、≦１．０２倍、または≧０．９９倍、かつ、≦１．０１倍である、溶融温度、アンフォールディング温度、または分解温度を有し得る。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＨＥＲ３発現細胞の殺滅を増大させることができる。ＨＥＲ３発現細胞の殺滅は、抗原結合性分子のエフェクター機能を介して増大させることができる。抗原結合性分子が、Ｆｃ領域を含む実施形態では、抗原結合性分子は、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、および抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）のうちの１つまたは複数を介して、ＨＥＲ３発現細胞の殺滅を増大させることができる。
ＨＥＲ３発現細胞の殺滅を増大させることができる抗原結合性分子は、適切なアッセイにおいて、抗原結合性分子の非存在下（または適切な対照抗原結合性分子の存在下）で検出される細胞殺滅のレベルと比較した、抗原結合性分子の存在下（または抗原結合性分子とのＨＥＲ３発現細胞のインキュベーションの後）でのＨＥＲ３発現細胞の殺滅のレベルの上昇の観察により同定され得る。当業者には、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、およびＡＤＣＰのアッセイが周知である。ＨＥＲ３発現細胞の殺滅のレベルはまた、異なる処置条件への曝露後のＨＥＲ３発現細胞の生存および／または非生存の数／比率を測定することによっても決定され得る。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＨＥＲ３発現細胞（例えば、ＨＥＲ３発現がん細胞）の殺滅を、抗原結合性分子の非存在下（または適切な対照抗原結合性分子の存在下）において観察される殺滅のレベルの、１倍を超えて、例えば、≧１．０１倍、≧１．０２倍、≧１．０３倍、≧１．０４倍、≧１．０５倍、≧１．１倍、≧１．２倍、≧１．３倍、≧１．４倍、≧１．５倍、≧１．６倍、≧１．７倍、≧１．８倍、≧１．９倍、≧２倍、≧３倍、≧４倍、≧５倍、≧６倍、≧７倍、≧８倍、≧９倍、または≧１０倍に増大させることができる。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、同等のアッセイにおいて、ＨＥＲ３発現細胞（例えば、ＨＥＲ３発現がん細胞）の数を、抗原結合性分子の非存在下におけるインキュベーションの後（または適切な対照の抗原結合性分子の存在下におけるインキュベーションの後）に検出されるＨＥＲ３発現細胞（例えば、ＨＥＲ３発現がん細胞）の数の、１倍未満、例えば、≦０．９９倍、≦０．９５倍、≦０．９倍、≦０．８５倍、≦０．８倍、≦０．７５倍、≦０．７倍、≦０．６５倍、≦０．６倍、≦０．５５倍、≦０．５倍、≦０．４５倍、≦０．４倍、≦０．３５倍、≦０．３倍、≦０．２５倍、≦０．２倍、≦０．１５倍、≦０．１倍、≦０．０５倍、または≦０．０１倍に低減することができる。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるがんの発症および／または進行を阻害する。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、例えば、エフェクター免疫細胞により、がん細胞の殺滅の増大を引き起こす。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、例えば、適切な対照条件と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるがん細胞の数の低減を引き起こす。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、例えば、時間経過にわたって腫瘍サイズ／体積を測定することにより決定される、腫瘍増殖を阻害する。
本発明の抗原結合性分子は、適切なｉｎ ｖｉｖｏモデル、例えば、細胞株由来異種移植モデルにおいて、がんの発症および／または進行を阻害する能力について解析され得る。細胞株由来異種移植モデルは、ＨＥＲ３発現がん細胞に由来し得る。一部の実施形態では、モデルは、Ｎ８７細胞由来モデル、ＳＮＵ１６細胞由来モデル、ＦａＤｕ細胞由来モデル、ＯｖＣＡＲ８細胞由来モデル、ＨＣＣ９５細胞由来モデル、Ａ５４９細胞由来モデル、ＡＣＨＮ細胞由来モデル、またはＨＴ２９細胞由来モデルである。
がんは、本明細書で記載される、ＨＥＲ３関連がん（すなわち、ＨＥＲ３遺伝子／タンパク質の発現が、危険性因子であり、かつ／あるいはがんの発生、発症、進行、もしくは症状の重症度、および／または転移と正に関連するがん）であり得る。がんは、ＨＥＲ３発現細胞を含み得る。一部の実施形態では、がんは、ＨＥＲ３＋腫瘍を含む。
一部の実施形態では、本発明に従う抗原結合性分子の投与は、がんの発症／進行の阻害、がんの発生までの遅延／がんの発生の予防、腫瘍増殖の低減／腫瘍増殖までの遅延／腫瘍増殖の予防、転移の低減／転移までの遅延／転移の予防、がんの症状の重症度の低減、がん細胞数の低減、腫瘍サイズ／体積の低減、および／または、例えば、適切なＨＥＲ３発現がん細胞株由来異種移植モデルにおいて決定される、生存期間（例えば、無増悪生存期間）の延長のうちの１つまたは複数を引き起こし得る。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＨＥＲ３発現がん細胞株由来異種移植モデルにおける腫瘍増殖を、抗原結合性分子による処置の非存在下で（または適切な陰性対照の抗原結合性分子による処置の後に）観察される腫瘍増殖の、１倍未満、例えば、≦０．９９倍、≦０．９５倍、≦０．９倍、≦０．８５倍、≦０．８倍、≦０．７５倍、≦０．７倍、≦０．６５倍、≦０．６倍、≦０．５５倍、≦０．５倍、≦０．４５倍、≦０．４倍、≦０．３５倍、≦０．３倍、≦０．２５倍、≦０．２倍、≦０．１５倍、≦０．１倍、≦０．０５倍、または≦０．０１倍に阻害することができる。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本発明はまた、本発明の抗原結合性分子またはポリペプチドを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も提供する。
ＣＡＲは、抗原結合およびＴ細胞活性化機能の両方をもたらす、組換え受容体である。ＣＡＲの構造および操作は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｏｔｔｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ（２０１４）２５７（１）に概説されている。ＣＡＲは、細胞膜アンカー領域およびシグナル伝達領域に連結された抗原結合性領域を含む。任意選択のヒンジ領域は、抗原結合性領域と、細胞膜アンカー領域との間の分離をもたらすことができ、可動性リンカーとして作用し得る。
本発明のＣＡＲは、本発明の抗原結合性分子を含むか、もしくはこれからなるか、または本発明に従うポリペプチドを含むか、もしくはこれからなる、抗原結合性領域を含む。
細胞膜アンカー領域は、ＣＡＲの抗原結合性領域とシグナル伝達領域との間にもたらされ、細胞外腔に抗原結合性領域を伴い、細胞内部にシグナル伝達領域を伴う、ＣＡＲを発現する細胞の細胞膜へのＣＡＲのアンカリングをもたらす。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３－ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、またはＣＤ２８のうちの１つについての膜貫通領域のアミノ酸配列を含むか、これからなるか、またはこれに由来するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる細胞膜アンカー領域を含む。本明細書で使用される場合、参照アミノ酸配列「に由来する」領域は、参照配列に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含む。
ＣＡＲのシグナル伝達領域は、Ｔ細胞の活性化を可能とする。ＣＡＲのシグナル伝達領域は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞のリン酸化および活性化のための免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）をもたらす、ＣＤ３－ζの細胞内ドメインのアミノ酸配列を含み得る。ＣＡＲでは、ＦｃγＲＩなどの他のＩＴＡＭ含有タンパク質の配列を含むシグナル伝達領域もまた利用されている（Ｈａｙｎｅｓら、２００１ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６（１）：１８２～１８７）。ＣＡＲのシグナル伝達領域はまた、標的タンパク質への結合時にＣＡＲ発現Ｔ細胞の活性化を促進するように、共刺激分子のシグナル伝達領域に由来する共刺激配列も含み得る。適切な共刺激分子は、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、およびＣＤ２７を含む。場合によって、ＣＡＲは、異なる細胞内シグナル伝達経路の共刺激をもたらすように操作される。例えば、ＣＤ２８の共刺激と関連するシグナル伝達が、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（Ｐ１３Ｋ）経路を優先的に活性化させるのに対して、４－１ＢＢ媒介性シグナル伝達は、ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）アダプタータンパク質を介する。したがって、ＣＡＲのシグナル伝達領域は、場合によって、１つを超える共刺激分子のシグナル伝達領域に由来する共刺激配列を含有する。一部の実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、およびＣＤ２７のうちの１つまたは複数の細胞内ドメインのアミノ酸配列を含むか、これからなるか、またはこれに由来するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、１つまたは複数の共刺激配列を含む。
任意選択のヒンジ領域は、抗原結合性ドメインと、膜貫通ドメインとの間の分離をもたらすことができ、可動性リンカーとして作用し得る。ヒンジ領域は、ＩｇＧ１に由来し得る。一部の実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＩｇＧ１のヒンジ領域のアミノ酸配列を含むか、これからなるか、またはこれに由来するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるヒンジ領域を含む。
また、本発明に従うＣＡＲを含む細胞も提供される。本発明に従うＣＡＲは、ＣＡＲ発現免疫細胞、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＣＡＲ－ＮＫ細胞を生成するために使用され得る。免疫細胞へのＣＡＲの操作は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養の間に実施され得る。
本発明のＣＡＲの抗原結合性領域は、例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂなどの任意の適切なフォーマットでもたらされ得る。
核酸およびベクター
本発明は、本発明に従う抗原結合性分子、ポリペプチド、またはＣＡＲをコードする、１つの核酸または複数の核酸を提供する。
一部の実施形態では、核酸は、例えば、他の核酸、または天然に存在する生物物質から精製または単離される。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むか、またはこれらからなる。
本発明はまた、本発明に従う１つの核酸または複数の核酸を含む、１つのベクターまたは複数のベクターも提供する。
ヌクレオチド配列は、ベクター、例えば、発現ベクター内に含有され得る。本明細書で使用される場合、「ベクター」は、外因性核酸を細胞内に移入するためのビヒクルとして使用される核酸分子である。ベクターは、細胞内で核酸を発現させるためのベクターであり得る。このようなベクターは、発現される配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含み得る。ベクターはまた、終止コドンおよび発現エンハンサーも含み得る。当技術分野で公知である、任意の適切なベクター、プロモーター、エンハンサー、および終止コドンが、本発明に従うベクターからペプチドまたはポリペプチドを発現させるために使用され得る。
「作動可能に連結された」という用語は、調節配列の影響下または制御下に核酸配列の発現を置く（これにより、発現カセットを形成する）ように、選択された核酸配列、および調節核酸配列（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）が、共有結合的に連結された状況を含み得る。したがって、調節配列が、核酸配列の転写を実行することができる場合、調節配列は、選択された核酸配列に作動可能に連結されている。次いで、結果として得られる転写産物は、所望のペプチド／ポリペプチドに翻訳され得る。
適切なベクターは、プラスミド、バイナリーベクター、ＤＮＡベクター、ｍＲＮＡベクター、ウイルスベクター（例えば、ガンマレトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来ベクター）、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、およびヘルペスウイルスベクター）、トランスポゾンベースのベクター、および人工染色体（例えば、酵母人工染色体）を含む。
一部の実施形態では、ベクターは、真核生物ベクター、例えば、真核細胞内のベクターからのタンパク質の発現に必要なエレメントを含むベクターであり得る。一部の実施形態では、ベクターは、例えば、タンパク質の発現を駆動するためのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはＳＶ４０プロモーターを含む、哺乳動物ベクターであり得る。
本発明に従う抗原結合性分子の構成要素であるポリペプチドは、複数の核酸のうちの異なる核酸、または複数のベクターのうちの異なるベクターによりコードされ得る。
抗原結合性分子およびポリペプチドを含む／発現する細胞
本発明はまた、本発明に従う抗原結合性分子、ポリペプチド、またはＣＡＲを含むか、またはこれらを発現する細胞も提供する。また、本発明に従う１つの核酸、複数の核酸、１つのベクター、または複数のベクターを含むか、またはこれらを発現する細胞も提供される。
細胞は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞であり得る。哺乳動物は、霊長動物（アカゲザル、カニクイザル、非ヒト霊長動物、またはヒト）、または非ヒト哺乳動物（例えば、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、または他の齧歯動物（ネズミ目内の任意の動物を含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、畜牛（ウシ、例えば、乳牛、またはウシ目内の任意の動物を含む）、ウマ（ウマ目内の任意の動物を含む）、ロバ、および非ヒト霊長動物）であり得る。
本発明はまた、本発明に従う核酸またはベクターを含む細胞を産生するための方法であって、本発明に従う１つの核酸、複数の核酸、１つのベクター、または複数のベクターを細胞内に導入するステップを含む、方法も提供する。一部の実施形態では、本発明に従う単離された核酸またはベクターを細胞内に導入するステップは、形質転換、トランスフェクション、電気穿孔、または形質導入（例えば、レトロウイルスによる形質導入）を含む。
本発明はまた、本発明に従う抗原結合性分子、ポリペプチド、またはＣＡＲを発現する／含む細胞を産生するための方法であって、本発明に従う１つの核酸、複数の核酸、１つのベクター、または複数のベクターを細胞内に導入するステップを含む、方法も提供する。一部の実施形態では、方法は、細胞による核酸またはベクターの発現に適する条件下で細胞を培養するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。
本発明はまた、本発明に従う方法により得られるか、または得られ得る細胞も提供する。
抗原結合性分子およびポリペプチドの産生
本発明に従う抗原結合性分子およびポリペプチドは、当業者に公知のポリペプチドを産生するための方法に従って調製され得る。
ポリペプチドは、化学合成、例えば、液相または固相合成により調製され得る。例えば、ペプチド／ポリペプチドは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｎｄｒｕｄｕら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０１３）、１８：４３７３～４３８８に記載されている方法を使用して合成され得る。
代替的に、抗原結合性分子およびポリペプチドは、組換え発現によっても産生され得る。当技術分野では、ＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、２０１２、ならびにＮａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００８）；５（２）：１３５～１４６（これらの両方は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）において示されている分子生物学的技法などの、ポリペプチドの組換え産生に適した分子生物学的技法が周知である。抗原結合性分子の組換え産生のための方法はまた、Ｆｒｅｎｚｅｌら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１３）；４：２１７、ならびにＫｕｎｅｒｔおよびＲｅｉｎｈａｒｔ、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１６）１００：３４５１～３４６１（これらの両方は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）においても記載されている。
場合によって、本発明の抗原結合性分子は、１つを超えるポリペプチド鎖から構成される。このような場合に、抗原結合性分子の産生は、抗原結合性分子を形成するのに、１つを超えるポリペプチドの転写および翻訳と、後続するポリペプチド鎖の会合とを含み得る。
本発明に従う組換え産生のために、ポリペプチドの発現に適した任意の細胞が使用され得る。細胞は、原核細胞であってもよいか、または真核細胞であってもよい。一部の実施形態では、細胞は、古細菌または細菌の細胞などの原核細胞である。一部の実施形態では、細菌は、腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）科の細菌、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などのグラム陰性菌であり得る。一部の実施形態では、細胞は、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ（例えば、ＨＥＫ２９３）、ＨｅＬａ、またはＣＯＳ細胞などの真核細胞である。一部の実施形態では、細胞は、一過性に、または安定的にポリペプチドを発現するＣＨＯ細胞である。
場合によって、一部の原核細胞は、真核細胞と同じフォールディング、または翻訳後修飾をできないため、細胞は、原核細胞ではない。加えて、真核細胞内では、極めて高度の発現レベルが可能であり、タンパク質は、適切なタグを使用して真核細胞からの精製を容易にすることができる。培地へのタンパク質の分泌を増強する特定のプラスミドもまた利用され得る。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｚｅｍｅｌｌａら、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ（２０１５）１６（１７）：２４２０～２４３１に記載されているシステムを使用することに従って、無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）により調製され得る。
産生は、目的のポリペプチドを発現するように修飾された真核細胞の培養または発酵を伴い得る。培養または発酵は、栄養物、空気／酸素、および／または増殖因子の適切な供給がなされたバイオリアクター内で実施され得る。分泌されたタンパク質は、培養培地／発酵培養液を細胞から分別し、タンパク質含有物を抽出し、個別のタンパク質を分離して、分泌されたポリペプチドを単離することにより回収され得る。当業者には、培養、発酵、および分離技法が周知であり、例えば、ＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４版；参照により本明細書の上記に組み込まれる）に記載されている。
バイオリアクターは、細胞が培養され得る、１つまたは複数の反応槽を含む。バイオリアクター内の培養は、反応物のリアクターへの持続的な流入、および培養された細胞のリアクターからの持続的な流出により持続的に行われ得る。代替的に、培養はバッチ内で行われ得る。バイオリアクターは、培養される細胞に最適の条件がもたらされるように、ｐＨ、酸素、反応槽への流入および反応槽からの流出の流量、ならびに反応槽内の撹拌などの環境条件をモニタリングし、制御する。
抗原結合性分子／ポリペプチドを発現する細胞の培養の後、目的のポリペプチドが単離され得る。当技術分野で公知の細胞からタンパク質を分離するための任意の適切な方法が使用され得る。ポリペプチドを単離するために、細胞を栄養培地から分離することが必要であり得る。ポリペプチドが細胞から分泌される場合、細胞は、分泌された目的のポリペプチドを含有する培養培地から遠心分離により分離され得る。目的のポリペプチドが細胞内に集まる場合、タンパク質の単離は、細胞を細胞培養培地から分離するための遠心分離、溶解緩衝液による細胞ペレットの処理、および例えば、超音波処理、急速な凍結－融解、または浸透圧溶解による細胞の破壊を含み得る。
次いで、目的のポリペプチドを、他のタンパク質および非タンパク質成分を含有し得る、上清または培養培地から単離することが所望され得る。タンパク質成分を、上清または培養培地から分離するための一般的な手法は沈殿による。可溶性が異なるタンパク質は、硫酸アンモニウムなどの異なる濃度の沈殿剤で沈殿する。例えば、低濃度の沈殿剤では、水溶性のタンパク質が抽出される。したがって、増大させる異なる濃度の沈殿剤を添加することにより、可溶性の異なるタンパク質が識別され得る。その後、分離されたタンパク質から硫酸アンモニウムを除去するために透析が使用され得る。
当技術分野では、異なるタンパク質を識別するための他の方法、例えば、イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズクロマトグラフィーが公知である。これらは、沈殿に対する代替法として使用され得るか、または沈殿に後続して実施され得る。
目的のポリペプチドが培養物から単離されると、ポリペプチドを濃縮することが所望され得るか、または必要であり得る。当技術分野では、限外濾過または凍結乾燥などのタンパク質を濃縮するための多数の方法が公知である。
組成物
本発明はまた、本明細書で記載される、抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸、発現ベクター、および細胞を含む組成物も提供する。
本明細書で記載される、抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸、発現ベクター、および細胞は、臨床使用のための医薬組成物または医薬として製剤化されてもよく、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはアジュバントを含み得る。組成物は、注射または注入を含み得る、局所、非経口、全身、腔内、静脈内、動脈内、筋内、髄腔内、眼内、結膜内、腫瘍内、皮下、皮内、髄腔内、経口、または経皮投与経路のために製剤化され得る。
適切な製剤は、滅菌媒体中または等張性媒体中の抗原結合性分子を含み得る。医薬および医薬組成物は、ゲル形態を含む、流体中で製剤化され得る。流体製剤は、ヒトまたは動物体内の選択された領域への注射または注入（例えば、カテーテルを介する）による投与のために製剤化され得る。
一部の実施形態では、組成物は、例えば、血管または腫瘍内への注射または注入のために製剤化される。
また、本明細書で記載される本発明に従って、薬学的に有用な組成物を産生するための方法も提供され、このような産生方法は、本明細書で記載される、抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸（または複数の核酸）、発現ベクター（または複数の発現ベクター）、もしくは細胞を産生するステップ；本明細書で記載される、抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸（または複数の核酸）、発現ベクター（または複数の発現ベクター）、もしくは細胞を単離するステップ；および／または本明細書で記載される、抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸（または複数の核酸）、発現ベクター（または複数の発現ベクター）、もしくは細胞を、薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、もしくは希釈剤と混合するステップから選択される、１つまたは複数のステップを含み得る。
例えば、本明細書で記載される本発明のさらなる態様は、疾患／状態（例えば、がん）の処置における使用のための医薬または医薬組成物を製剤化または産生する方法であって、本明細書で記載される、抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸（または複数の核酸）、発現ベクター（または複数の発現ベクター）、または細胞を、薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、または希釈剤と混合することにより、医薬組成物または医薬を製剤化するステップを含む、方法に関する。
治療適用および予防適用
本明細書で記載される、抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸、発現ベクター、細胞、および組成物は、治療方法および予防方法において使用される。
本発明は、医学的処置または予防の方法における使用のための本明細書で記載される、抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸（または複数の核酸）、発現ベクター（または複数の発現ベクター）、細胞、または組成物を提供する。また、疾患または状態を処置または予防するための医薬の製造における本明細書で記載される、抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸（または複数の核酸）、発現ベクター（または複数の発現ベクター）、細胞、または組成物の使用も提供される。また、疾患または状態を処置または予防する方法であって、治療または予防有効量の、本明細書で記載される、抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸（または複数の核酸）、発現ベクター（または複数の発現ベクター）、細胞、または組成物を対象に投与するステップを含む、方法も提供される。
方法は、疾患／状態の発症もしくは進行の低減、疾患／状態の症状の緩和、または疾患／状態の病態の低減に効果的であり得る。方法は、疾患／状態の進行を予防する、例えば、疾患／状態の増悪を予防するか、または疾患／状態の発症速度を遅くするのに効果的であり得る。一部の実施形態では、方法は、疾患／状態の改善、例えば、疾患／状態の症状の低減、または疾患／状態の重症度／活動性の他の一部の相関因子の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、方法は、疾患／状態の後期（例えば、慢性期または転移）の発症を予防し得る。
本発明の物品が、ＨＥＲ３を発現する細胞の数および／または活性の低減から治療または予防利益を引き出す、任意の疾患／状態の処置／予防のために使用され得ることが理解されるであろう。例えば、疾患／状態は、ＨＥＲ３を発現する細胞が、病理学的に関与する疾患／状態、例えば、ＨＥＲ３を発現する細胞の数／比率の増大が、疾患／状態の発生、発症、もしくは進行、および／または疾患／状態の１つもしくは複数の症状の重症度と正に関連するか、あるいはＨＥＲ３を発現する細胞の数／比率の増大が、疾患／状態の、発生、発症、または進行の危険性因子である、疾患／状態であり得る。
一部の実施形態では、本発明に従って処置／予防される疾患／状態は、例えば、疾患／状態の非存在下におけるＨＥＲ３を発現する細胞の数／比率／活性と比較した、ＨＥＲ３を発現する細胞の数／比率／活性の増大により特徴付けられる疾患／状態である。
一部の実施形態では、処置／予防される疾患／状態は、がんである。
がんは、任意の望ましくない細胞増殖（または望ましくない細胞増殖によりそれ自体で現れる任意の疾患）、新生物、または腫瘍であり得る。がんは、良性であってもよいか、または悪性であってもよく、原発性であってもよいか、または続発性（転移性）であってもよい。新生物または腫瘍は、細胞の任意の異常な成長または増殖である場合があり、任意の組織内に位置し得る。がんは、例えば、副腎、副腎髄質、肛門、虫垂、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、盲腸、中枢神経系（脳を含むか、または除外する）、小脳、子宮頸部、結腸、十二指腸、子宮内膜、上皮細胞（例えば、腎臓上皮）、胆嚢、食道、神経膠細胞、心臓、回腸、空腸、腎臓、涙腺、喉頭、肝臓、肺、リンパ、リンパ節、リンパ芽球、顎、縦隔、腸間膜、子宮筋層、鼻咽頭、網、口腔、卵巣、膵臓、耳下腺、末梢神経系、腹膜、胸膜、前立腺、唾液腺、Ｓ字結腸、皮膚、小腸、軟部組織、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、舌、扁桃腺、気管、子宮、外陰、および／または白血球に由来する組織／細胞のがんであり得る。
処置される腫瘍は、神経系、または非神経系腫瘍であり得る。神経系腫瘍、例えば、神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、神経線維腫、上衣腫、シュワン細胞腫、神経線維肉腫、星状細胞腫、および希突起神経膠腫は、中枢、または末梢神経系に由来し得る。非神経系がん／腫瘍は、他の任意の非神経組織に由来する場合があり、例は、黒色腫、中皮腫、リンパ腫、骨髄腫、白血病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、肝がん、類表皮癌、前立腺癌、乳がん、肺がん、結腸がん、卵巣がん、膵がん、胸腺癌、ＮＳＣＬＣ、血液がん、および肉腫を含む。
ＨＥＲ３、ならびにがんとのその関連、およびがんにおけるその役割は、例えば、Ｋａｒａｃｈａｌｉｏｕら、ＢｉｏＤｒｕｇｓ．（２０１７）３１（１）：６３～７３、およびＺｈａｎｇら、Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ（２０１６）４８（１）：３９～４８に概説されており、これらの両方は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、がんは、ＨＥＲ３を発現する細胞を含むがん、固形腫瘍、乳がん、乳癌、乳管癌、胃がん、胃癌、胃腺癌、結腸直腸がん、結腸直腸癌、結腸直腸腺癌、頭頸部がん、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、肺がん、肺腺癌、扁平上皮肺癌、卵巣がん、卵巣癌、漿液性卵巣腺癌、腎がん、腎細胞癌、腎明細胞癌、腎細胞腺癌、乳頭状腎細胞癌、膵がん、膵腺癌、膵管腺癌、子宮頸がん、子宮頸部扁平上皮癌、皮膚がん、黒色腫、食道がん、食道腺癌、肝がん、肝細胞癌、胆管癌、子宮がん、子宮体内膜癌、甲状腺がん、甲状腺癌、褐色細胞腫、傍神経節腫、膀胱がん、膀胱尿路上皮癌、前立腺がん、前立腺腺癌、肉腫、および胸腺腫から選択される。
一部の実施形態では、本発明に従って処置されるがんは、ＨＥＲ３発現がん、胃がん（例えば、胃癌、胃腺癌、消化管腺癌）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮癌）、乳がん、卵巣がん（例えば、卵巣癌）、肺がん（例えば、ＮＳＣＬＣ、肺腺癌、扁平上皮肺細胞癌）、黒色腫、前立腺がん、口腔がん（例えば、口腔咽頭がん）、腎臓がん（例えば、腎細胞癌）、または結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、食道がん、膵がん、固形がん、および／もしくは液性がんから選択される。
処置／予防は、がんの症状の発生／進行を遅延させる／予防すること、がんの症状の重症度を低減すること、がんの細胞の生存期間／成長／浸潤／転移を低減すること、がんの細胞の数を低減すること、および／または対象の生存期間を延長することのうちの１つまたは複数を目標とし得る。
一部の実施形態では、処置／予防されるがんは、ＥＧＦＲファミリーメンバー（例えば、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、またはＨＥＲ４）を発現する細胞、および／またはＥＧＦＲファミリーメンバーに対するリガンドを発現する細胞を含む。一部の実施形態では、処置／予防されるがんは、ＥＧＦＲファミリーメンバーについて陽性であるがんである。一部の実施形態では、がんは、ＥＧＦＲファミリーメンバー、および／またはＥＧＦＲファミリーメンバーに対するリガンドを過剰発現する。過剰発現は、同等の非がん性細胞／非腫瘍組織による発現のレベルを超える発現のレベルを検出することにより決定され得る。
発現は、任意の適切な手段により決定され得る。発現は、遺伝子発現であり得るか、またはタンパク質発現であり得る。遺伝子発現は、例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）により、例えば、ＨＥＲ３をコードするｍＲＮＡの検出により決定され得る。例えば、タンパク質の発現は、例えば、抗体ベースの方法、例えば、ウェスタンブロット、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、またはＥＬＩＳＡにより決定され得る。
一部の実施形態では、処置／予防されるがんは、ＨＥＲ３を発現する細胞を含む。一部の実施形態では、処置／予防されるがんは、ＨＥＲ３について陽性であるがんである。一部の実施形態では、がんは、ＨＥＲ３を過剰発現する。ＨＥＲ３の過剰発現は、同等の非がん性細胞／非腫瘍組織による発現のレベルを超える、ＨＥＲ３の発現レベルを検出することにより決定され得る。
一部の実施形態では、患者は、例えば、対象から得られた試料中の、ＨＥＲ３を発現するか、またはＨＥＲ３を過剰発現するがんの検出に基づき、本明細書で記載される処置のために選択され得る。
一部の実施形態では、処置／予防されるがんは、ＨＥＲ３に対するリガンド（例えば、ＮＲＧ１および／またはＮＲＧ２）を発現する細胞を含む。一部の実施形態では、処置／予防されるがんは、同等の非がん性細胞／非腫瘍組織による発現のレベルを超えるＮＲＧ１および／またはＮＲＧ２の発現レベルを発現する細胞を含む。
本明細書で記載されるＨＥＲ３結合抗原結合性分子は、ＨＥＲ３がＮＲＧに結合している場合（すなわち、ＨＥＲ３が「開放型」コンフォメーションで提供される場合）、およびまた、ＨＥＲ３がＮＲＧに結合していない場合（すなわち、ＨＥＲ３が「閉鎖型」コンフォメーションで提供される場合）、極度に高い親和性でＨＥＲ３に結合することが実証される。
したがって、本発明の抗原結合性分子は、ＨＥＲ３リガンド発現／過剰発現によって特徴付けられるがん、例えば、ＨＥＲ３に対するリガンドを発現／過剰発現する細胞を含むがん／腫瘍の処置／予防に特に有用である。
一部の実施形態では、本発明に従って処置されるがんは、遺伝的バリアントを含まない参照対立遺伝子（例えば、非突然変異、または「野生型」対立遺伝子）を保有する同等の細胞と比べて、ＨＥＲに対するリガンドの増大した（遺伝子および／またはタンパク質）発現を引き起こす遺伝的バリアント（例えば、突然変異）を保有する細胞を含む。遺伝的バリアントは、参照対立遺伝子に対するヌクレオチド配列の挿入、欠失、置換、またはより大規模な転座／再配列であってもよいか、またはこれらを含んでもよい。
ＨＥＲ３に対するリガンドの増大した発現を「生じる」突然変異は、ＨＥＲ３に対するリガンドの増大した遺伝子／タンパク質発現を引き起こすことが知られ得るか、もしくは予測され得るか、またはこれらと関連し得る。ＨＥＲ３に対するリガンドの増大した発現を生じる突然変異は、「活性化」突然変異と称され得る。
ＨＥＲ３に対するリガンドの増大した発現を引き起こす突然変異は、突然変異を保有しない同等の細胞のゲノム核酸によって発現されない、かつ／またはコードされないＨＥＲ３に対するリガンドの遺伝子またはタンパク質発現を生じ得る。すなわち、ＨＥＲ３に対するリガンドは、突然変異の結果として発生する新抗原であり得るので、「増大した発現」は、発現由来でなくてもよい。例示を目的として述べると、ＣＤ４７－ＮＲＧ１遺伝子融合体を含む細胞は、ＣＤ４７－ＮＲＧ１遺伝子融合体を欠く細胞と比べて、遺伝子融合体によってコードされるＣＤ４７－ＮＲＧ１融合ポリペプチドの増大した発現を呈する。
ＨＥＲ３に対するリガンドの増大した発現を引き起こす突然変異は、突然変異を含まない同等の細胞のゲノム核酸によって発現される、かつ／またはコードされるＨＥＲ３に対するリガンドの増大した遺伝子またはタンパク質発現を生じ得る。例示を目的として述べると、細胞は、突然変異を含まない同等の細胞によってＮＲＧ１をコードする核酸の転写のレベルと比べて、ＮＲＧ１をコードする核酸の転写のレベルの増大を生じる突然変異を含み得る。
一部の実施形態では、ＨＥＲ３に対するリガンドの増大した発現を引き起こす突然変異は、突然変異を含まない同等の細胞と比べて、ＨＥＲ３に対するリガンドの遺伝子発現の増大を引き起こし得る。一部の実施形態では、ＨＥＲ３に対するリガンドの増大した発現を引き起こす突然変異は、突然変異を含まない同等の細胞と比べて、ＨＥＲ３に対するリガンドのタンパク質発現の増大を引き起こし得る。
一部の実施形態では、ＨＥＲ３に対するリガンドの増大した発現を引き起こす突然変異は、突然変異を含まない同等の細胞と比べて、突然変異を含む細胞の細胞表面上または細胞表面においてＨＥＲ３に対するリガンドのレベルの増大を引き起こし得る。一部の実施形態では、ＨＥＲ３に対するリガンドの増大した発現を引き起こす突然変異は、突然変異を含まない同等の細胞と比べて、突然変異を含む細胞からのＨＥＲ３に対するリガンドの分泌のレベルの増大を引き起こし得る。
参照細胞による（例えば、突然変異の結果として）ＨＥＲ３に対するリガンドの発現のレベルと比べて、ＨＥＲ３に対するリガンドの増大した発現を有する細胞は、ＨＥＲ３に対するリガンドを「過剰発現する」、またはＨＥＲ３に対するリガンドの「上方調節された発現」を有すると記載され得る。例えば、突然変異を欠く同等の細胞と比べて、ＨＥＲ３に対するリガンドの増大した発現を生じる突然変異を保有する細胞を含むがんは、ＨＥＲ３に対するリガンドの過剰発現／上方調節された発現を呈する細胞を含むがんと記載され得る。一部の実施形態では、突然変異を欠く参照細胞は、（例えば、同等の細胞型の）非がん性細胞、または（例えば、同等のがん型の）がん性細胞であり得る。
本明細書では、「ＨＥＲ３に対するリガンド」は、一般に、ＨＥＲ３のドメインＩおよびＩＩＩによって形成されるＨＥＲ３のリガンド結合性領域を介してＨＥＲ３に結合することができる分子を指すことを意図する。一部の実施形態では、ＨＥＲ３に対するリガンドは、ＨＥＲ３のドメインＩおよび／またはＩＩＩとの相互作用によりＨＥＲ３に結合する。ＨＥＲ３に対する例示的なリガンドは、ＮＲＧ１およびＮＲＧ２などのニューレグリンを含み、これは、それらのＥＧＦ様ドメインと、ＨＥＲ３のリガンド結合性領域との相互作用によりＨＥＲ３に結合する。
ＨＥＲ３リガンドは、好ましくは、ＨＥＲ３受容体および／またはＨＥＲ３を含む受容体複合体に結合し、それらを通じてシグナル伝達を誘発することができる。本開示から明らかなように、ＨＥＲ３を含む受容体複合体は、本明細書で記載されるＨＥＲ３に対する相互作用パートナー、例えば、ＨＥＲ３、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ４、ＨＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、および／またはｃＭｅｔ）をさらに含み得る。
一部の実施形態では、ＨＥＲ３に対するリガンドは、ＨＥＲ３リガンドの増大した発現を有する細胞以外の細胞によって発現されるＨＥＲ３受容体／受容体複合体に結合することができる。例えば、一部の実施形態では、ＨＥＲ３に対するリガンドは、ＨＥＲ３発現がん細胞に結合することができる。
一部の実施形態では、ＨＥＲ３に対するリガンドは、ＨＥＲ３リガンドの増大した発現を有する細胞によって発現されるＨＥＲ３受容体／受容体複合体に結合することができる。
一部の実施形態では、処置されるがんは、（ｉ）ＨＥＲ３を発現する細胞、および（ｉｉ）ＨＥＲ３に対するリガンドを発現する（例えば、ＨＥＲ３に対するリガンドの増大した発現を生じる突然変異の結果として、例えば、ＨＥＲ３に対するリガンドの増大した発現を有する）細胞を含む。
一部の実施形態では、処置されるがんは、（ｉ）ＨＥＲ３を発現する、および（ｉｉ）ＨＥＲ３に対するリガンドも発現する（例えば、ＨＥＲ３に対するリガンドの増大した発現を生じる突然変異の結果として、例えば、ＨＥＲ３に対するリガンドの増大した発現を有する）細胞を含む。
一部の実施形態では、ＨＥＲ３に対するリガンドは、ＨＥＲ３に対するリガンドのＨＥＲ３結合性領域のアミノ酸配列、またはＨＥＲ３に対するリガンドのＨＥＲ３結合性領域に由来するアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる。ＨＥＲ３に対するリガンドのＨＥＲ３結合性領域に由来するアミノ酸配列は、それが由来するアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）のアミノ酸配列同一性を含み得る。
一部の実施形態では、ＨＥＲ３に対するリガンドは、ＨＥＲ３に結合することができるＥＧＦ様ドメイン、またはそのＨＥＲ３結合断片を含む。一部の実施形態では、ＨＥＲ３結合ＥＧＦ様ドメイン／断片は、ＥＧＦファミリーメンバー（例えば、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ－ＥＧＦ）、形質転換増殖因子－α（ＴＧＦ－α）、アンフィレグリン（ＡＲ）、エピレグリン（ＥＰＲ）、エピジェン、ベータセルリン（ＢＴＣ）、ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、またはＮＲＧ４）であるか、またはこれらに由来する。
ＥＧＦファミリーメンバーは、配列番号２４０に示される保存アミノ酸配列のうちの１つまたは複数のリピートを含有し、これは、それらの同族受容体に対する高親和性結合に必要とされる３個の構造的ループをもたらす、３個の分子内ジスルフィド結合を形成する６個のシステイン残基を含有する（Ｈａｒｒｉｓら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００３）２８４（１）：２～１３を参照されたい）。一部の実施形態では、ＨＥＲ３に対するリガンドは、配列番号２４０に示されるコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列のうちの１つまたは複数のコピーを含む。
ＨＥＲ３に対する例示的なリガンドは、ニューレグリン（ＮＲＧ）を含む。ニューレグリンは、ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、およびＮＲＧ４を含む。ヒトＮＲＧ１（アルファアイソフォーム）のアミノ酸配列は、配列番号２３２に示される。アルファアイソフォームおよびヒトＮＲＧ１のいくつかの他のアイソフォーム（アルファ１ａアイソフォーム（ＵｎｉｔＰｒｏｔ：Ｑ０２２９７－２を参照されたい）、アルファ２ｂアイソフォーム（ＵｎｉｔＰｒｏｔ：Ｑ０２２９７－３を参照されたい）、およびアルファ３アイソフォーム（ＵｎｉｔＰｒｏｔ：Ｑ０２２９７－４を参照されたい）を含む）は、配列番号２３３に示されるＥＧＦ様ドメインを含み、このＥＧＦ様ドメインを介して、これらはＨＥＲ３に結合する。ヒトＮＲＧ２（アイソフォーム１）のアミノ酸配列は、配列番号２３４に示される。アイソフォーム１およびいくつかの他のヒトＮＲＧ２のアイソフォーム（アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｏ１４５１１－３を参照されたい）、アイソフォーム５（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｏ１４５１１－５を参照されたい）、アイソフォーム６（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｏ１４５１１－６を参照されたい）、アイソフォームＤＯＮ－１Ｂ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｏ１４５１１－７を参照されたい）、およびアイソフォームＤＯＮ－１Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｏ１４５１１－８を参照されたい）を含む）は、配列番号２３５に示されるＥＧＦ様ドメインを含み、このＥＧＦ様ドメインを介して、これらはＨＥＲ３に結合する。ヒトＮＲＧ３のアミノ酸配列は、配列番号２３６に示され、ヒトＮＲＧ３のＥＧＦ様ドメインは、配列番号２３７に示される。ヒトＮＲＧ４のアミノ酸配列は、配列番号２３８に示され、ヒトＮＲＧ３のＥＧＦ様ドメインは、配列番号２３９に示される。一部の実施形態では、ＮＲＧは、ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、およびＮＲＧ４から選択される。一部の実施形態では、ＮＲＧは、ＮＲＧ１、およびＮＲＧ２から選択される。
一部の実施形態では、ＥＧＦ様ドメイン／断片は、ＮＲＧ（ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、またはＮＲＧ４）のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも６０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、ＥＧＦ様ドメイン／断片は、配列番号２３３、２３５、２３７、または２３９のうちの１つに対して、少なくとも６０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、ＨＥＲ３に対するリガンドは、ＮＲＧ（例えば、ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、またはＮＲＧ４、例えば、ＮＲＧ１、またはＮＲＧ２）であるか、またはＮＲＧのアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含む（すなわち、ＮＲＧのアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む）。
一部の実施形態では、ＨＥＲ３に対するリガンドは、ＨＥＲ３に対するリガンド（例えば、ＮＲＧ、例えば、ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、またはＮＲＧ４、例えば、ＮＲＧ１、またはＮＲＧ２）のＨＥＲ３結合性領域に対して、少なくとも６０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、ＨＥＲ３に対するリガンドは、ＮＲＧ（例えば、ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、またはＮＲＧ４、例えば、ＮＲＧ１、またはＮＲＧ２）のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも６０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、ＨＥＲ３に対するリガンドは、ＥＧＦＲファミリータンパク質（例えば、ＨＥＲ３、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ４、ＨＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ｃＭｅｔ）ではない。
一部の実施形態では、ＨＥＲ３に対するリガンドの発現の増大を生じる突然変異は、ＮＲＧ遺伝子融合体である。一部の実施形態では、ＨＥＲ３に対するリガンドは、ＮＲＧ遺伝子融合体の産物（すなわち、ＮＲＧ遺伝子融合体によってコードされるポリペプチド）である。一部の実施形態では、がんは、ＮＲＧ遺伝子融合体を有する細胞を含む。
本明細書で使用される場合、「ＮＲＧ遺伝子融合体」とは、（ｉ）ＮＲＧタンパク質（例えば、ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、またはＮＲＧ４、例えば、ＮＲＧ１、またはＮＲＧ２）のアミノ酸配列、および（ｉｉ）ＮＲＧタンパク質以外のタンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝的バリアントを指す。
ＮＲＧ遺伝子融合体が、好ましくは、本明細書で記載されるＨＥＲ３リガンドをコードすることは理解されるであろう。一部の実施形態では、ＮＲＧ遺伝子融合体は、ＮＲＧタンパク質のＨＥＲ３結合性領域を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ＮＲＧ遺伝子融合体は、ＮＲＧタンパク質のＥＧＦ様ドメインを含むポリペプチド、またはＨＥＲ３に結合し、ＮＲＧタンパク質のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも６０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）のアミノ酸配列同一性を有することができるアミノ酸配列をコードする。
一部の実施形態では、ＮＲＧ遺伝子融合体は、膜貫通ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ＮＲＧ遺伝子融合体は、ＮＲＧタンパク質以外のタンパク質の膜貫通ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、ＮＲＧ遺伝子融合体は、ＮＲＧ１遺伝子融合体である。一部の実施形態では、ＮＲＧ１遺伝子融合体は、ＮＲＧ１のＥＧＦ様ドメインを含むポリペプチド、またはＨＥＲ３に結合し、ＮＲＧ１のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも６０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）のアミノ酸配列同一性を有することができるアミノ酸配列をコードする。
ＮＲＧ１遺伝子融合体は、例えば、ＷＯ２０１８／１８２４２２ Ａ１、ＷＯ２０１９／０５１１５５ Ａ１、Ｄｈａｎａｓｅｋａｒａｎら、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．（２０１４）５：５８９３、Ｄｒｉｌｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．（２０１８）８（６）：６８６～６９５、Ｎａｇａｓａｋａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２０１９）１４（８）：１３５４～１３５９、およびＪｏｎｎａら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１９）２５（１６）：４９６６～４９７２に記載されており、これらの全てはそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＮＲＧ１遺伝子融合体の多様性は、特に、ゲノム転座イベントを受けやすい、第８染色体に位置するＮＲＧ１に起因し得る（Ａｄｅｌａｉｄｅら、Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ．（２００３）３７（４）：３３３～４５）。
一部の実施形態では、ＮＲＧ１遺伝子融合体は、ＣＬＵ－ＮＲＧ１、ＣＤ７４－ＮＲＧ１、ＤＯＣ４－ＮＲＧ１、ＳＬＣ３Ａ２－ＮＲＧ１、ＲＢＰＭＳ－ＮＲＧ１、ＷＲＮ－ＮＲＧ１、ＳＤＣ４－ＮＲＧ１、ＲＡＢ２ＩＬ１－ＮＲＧ１、ＶＡＭＰ２－ＮＲＧ１、ＫＩＦ１３Ｂ－ＮＲＧ１、ＴＨＡＰ７－ＮＲＧ１、ＳＭＡＤ４－ＮＲＧ１、ＭＤＫ－ＮＲＧ１、ＴＮＣ－ＮＲＧ１、ＤＩＰ２Ｂ－ＮＲＧ１、ＭＲＰＬ１３－ＮＲＧ１、ＰＡＲＰ８－ＮＲＧ１、ＲＯＣＫ１－ＮＲＧ１、ＤＰＹＳＬ２－ＮＲＧ１、ＡＴＰ１Ｂ１－ＮＲＧ１、ＣＤＨ６－ＮＲＧ１、ＡＰＰ－ＮＲＧ１、ＡＫＡＰ１３－ＮＲＧ１、ＴＨＢＳ１－ＮＲＧ１、ＦＯＸＡ１－ＮＲＧ１、ＰＤＥ７Ａ－ＮＲＧ１、ＲＡＢ３ＩＬ１－ＮＲＧ１、ＣＤＫ１－ＮＲＧ１、ＢＭＰＲＩＢ－ＮＲＧ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ－ＮＲＧ１、およびＭＣＰＨ１－ＮＲＧ１から選択される。一部の実施形態では、ＮＲＧ１遺伝子融合体は、ＣＬＵ－ＮＲＧ１である。ＣＤ７４－ＮＲＧ１遺伝子融合体は、例えば、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｃｕｅｓｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．（２０１４）４：４１５～２２、およびＮａｋａｏｋｕら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０１４）２０：３０８７～９３に記載されている。ＤＯＣ４－ＮＲＧ１遺伝子融合体は、例えば、Ｌｉｕら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．（１９９９）１８（５０）：７１１０～４およびＷａｎｇら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．（１９９９）１８（４１）：５７１８～２１に記載されている。ＳＬＣ３Ａ２－ＮＲＧ１遺伝子融合体は、例えば、Ｎａｋａｏｋｕら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０１４）２０：３０８７～９３、Ｓｈｉｎら、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ（２０１６）７：６９４５０～６５、およびＳｈｉｎら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．（２０１８）１７（９）：２０２４～２０３３に記載されている。ＲＢＰＭＳ－ＮＲＧ１、ＷＲＮ－ＮＲＧ１、ＲＡＢ２ＩＬ１－ＮＲＧ１、およびＳＤＣ４－ＮＲＧ１遺伝子融合体は、例えば、Ｄｈａｎａｓｅｋａｒａｎら、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．（２０１４）５：５８９３に記載されている。ＶＡＭＰ２－ＮＲＧ１遺伝子融合体は、例えば、Ｊｕｎｇら、Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｏｎｃｏｌ．（２０１５）１０（７）：１１０７～１１、およびＳｈｉｍら、Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｏｎｃｏｌ．（２０１５）１０（８）：１１５６～６２に記載されている。ＫＩＦ１３Ｂ－ＮＲＧ１遺伝子融合体は、例えば、Ｘｉａら、Ｉｎｔ Ｊ Ｓｕｒｇ Ｐａｔｈｏｌ．（２０１７）２５（３）：２３８～２４０に記載されている。ＳＭＡＤ４－ＮＲＧ１、ＡＫＡＰ１３－ＮＲＧ１、ＴＨＢＳ１－ＮＲＧ１、ＦＯＸＡ１－ＮＲＧ１、ＰＤＥ７Ａ－ＮＲＧ１、ＲＡＢ３ＩＬ１－ＮＲＧ１、およびＴＨＡＰ７－ＮＲＧ１遺伝子融合体は、例えば、Ｄｒｉｌｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．（２０１８）８（６）：６８６～６９５に記載されている。ＭＤＫ－ＮＲＧ１、ＴＮＣ－ＮＲＧ１、ＤＩＰ２Ｂ－ＮＲＧ１、ＭＲＰＬ１３－ＮＲＧ１、ＰＡＲＰ８－ＮＲＧ１、ＲＯＣＫ１－ＮＲＧ１、およびＤＰＹＳＬ２－ＮＲＧ１遺伝子融合体は、例えば、Ｊｏｎｎａら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１９）２５（１６）：４９６６～４９７２に記載されている。ＡＴＰ１Ｂ１－ＮＲＧ１遺伝子融合体は、例えば、Ｄｒｉｌｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．（２０１８）８（６）：６８６～６９５、およびＪｏｎｅｓら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２０１７）２８：３０９２～３０９７に記載されている。ＣＬＵ－ＮＲＧ１遺伝子融合体は、例えば、Ｄｒｉｌｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．（２０１８）８（６）：６８６～６９５、およびＮａｇａｓａｋａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２０１９）１４（８）：１３５４～１３５９に記載されている。
一部の実施形態では、ＮＲＧ遺伝子融合体は、ＮＲＧ２遺伝子融合体である。一部の実施形態では、ＮＲＧ２遺伝子融合体は、ＮＲＧ２のＥＧＦ様ドメインを含むポリペプチド、またはＨＥＲ３に結合し、ＮＲＧ２のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも６０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）のアミノ酸配列同一性を有することができるアミノ酸配列をコードする。
ＮＲＧ２遺伝子融合体は、例えば、ＷＯ２０１５／０９３５５７ Ａ１に記載されているＳＬＣ１２Ａ２－ＮＲＧ２、およびＤｕｐａｉｎら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．（２０１９）２７（１）：２００～２１８に記載されているＺＮＦ２０８－ＮＲＧ２を含む。
ＨＥＲ３に対するリガンドの増大した発現を生じる突然変異を有する細胞を含む（例えば、ＮＲＧ遺伝子融合体、例えば、ＮＲＧ１遺伝子融合体、またはＮＲＧ２遺伝子融合体を有する細胞を含む）がんは、本明細書で記載される任意のがんであり得る。一部の実施形態では、このようながんは、肺、乳房、頭部、頸部、腎臓、卵巣、膵臓、前立腺、子宮、胆嚢、結腸、直腸、膀胱、軟部組織または鼻咽頭に由来する組織／細胞のがんであり得る。
一部の実施形態では、ＨＥＲ３に対するリガンドの増大した発現を生じる突然変異を有する細胞を含む（例えば、ＮＲＧ遺伝子融合体、例えば、ＮＲＧ１遺伝子融合体、またはＮＲＧ２遺伝子融合体を有する細胞を含む）がんは、肺がん、非小細胞肺がん、肺線癌、浸潤性粘液性肺線癌、肺扁平上皮癌、乳がん、乳癌、浸潤性乳癌、頭頸部がん、頭頸部扁平上皮癌、腎がん、腎明細胞癌、卵巣がん、卵巣漿液性嚢胞腺癌、膵がん、膵腺癌、膵管腺癌、前立腺がん、前立腺腺癌、子宮内膜がん、子宮癌肉腫、胆嚢がん、胆管癌、結腸直腸がん、膀胱がん、尿路上皮膀胱がん、肉腫、軟部組織肉腫、神経内分泌腫瘍および鼻咽頭神経内分泌腫瘍から選択される。
特定の実施形態では、本発明に従って処置されるがんは、ＮＲＧ１遺伝子融合体を有する細胞を含む肺がん（例えば、非小細胞肺がん、肺線癌、浸潤性粘液性肺線癌、または肺扁平上皮癌）である。
本明細書の実施形態では、特定の特徴を有する細胞を含むがんは、これらの特徴を有する細胞を含む腫瘍であり得るか、またはこれを含み得ることは理解されるであろう。
当技術分野で一般的であるように、特定の特徴を有する細胞を含むがん／腫瘍は、本明細書では、これらの特徴を有するがん／腫瘍と単に称され得る。例示を目的として述べると、ＮＲＧ１遺伝子融合体を有する細胞を含むがん／腫瘍は、「ＮＲＧ１遺伝子融合体を含むがん／腫瘍」、または「ＮＲＧ１遺伝子融合がん／腫瘍」と単に称され得る。
本発明の物品の投与は、好ましくは、「治療有効」または「予防有効」量であり、これは、対象に対して、治療または予防利益を示すのに十分な量である。投与される実際の量、および速度、ならびに投与の時間経過は、疾患／状態の性質および重症度、ならびに投与される特定の物品に依存するであろう。処置の処方、例えば、投与量についての決定などは、一般的な従事者および他の医師の責任の範囲内にあり、典型的に、処置される疾患／障害、個々の対象の状態、送達部位、投与方法、および従事者に公知の他の因子を考慮に入れる。上記で言及された技法およびプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２０版、２０００、ｐｕｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓに見出され得る。
投与は、処置される状態に応じて、単独でなされてもよいか、または他の処置と同時に、もしくは逐次的に組み合わせてなされてもよい。本明細書で記載される抗原結合性分子または組成物、および治療剤は、同時に、または逐次的に投与されてもよい。
一部の実施形態では、方法は、例えば、がんの処置／予防のための、さらなる治療的または予防的介入を含む。一部の実施形態では、治療的または予防的介入は、化学療法、免疫療法、放射線療法、手術、ワクチン接種、および／またはホルモン療法から選択される。一部の実施形態では、治療的または予防的介入は、白血球除去療法を含む。一部の実施形態では、治療的または予防的介入は、幹細胞移植を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＥＧＦＲファミリーメンバーにより媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤と組み合わせて投与される。
したがって、本発明は、本発明に従う物品（例えば、本発明に従う抗原結合性分子）と、ＥＧＦＲファミリーメンバー（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４）により媒介されるシグナル伝達を阻害することができる別の薬剤とを含む組成物を提供する。また、本明細書で記載される疾患／状態の医学的な処置および予防の方法における、このような組成物の使用も提供される。
また、本明細書で記載される疾患／状態を処置／予防するための方法であって、本発明に従う物品の本発明の物品（例えば、本発明に従う抗原結合性分子）と、ＥＧＦＲファミリーメンバーにより媒介されるシグナル伝達を阻害することができる別の薬剤とを投与するステップを含む、方法も提供される。
当技術分野では、ＥＧＦＲファミリーメンバーにより媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤が公知であり、例えば、低分子阻害剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）、モノクローナル抗体（およびこの抗原結合性断片）、ペプチド／ポリペプチド阻害剤（例えば、デコイリガンド／受容体またはペプチドアプタマー）、および核酸（例えば、アンチセンス核酸、スプライススイッチング核酸、または核酸アプタマー）を含む。ＥＧＦＲファミリーメンバーにより媒介されるシグナル伝達の阻害剤は、ＥＧＦＲファミリーメンバーである、相互作用パートナーに対する直接的な効果を介して、シグナル伝達を阻害し、したがって、かつ／または、ＥＧＦＲファミリーメンバーにより媒介されるシグナル伝達に関与する下流の因子も阻害する薬剤を含む。
一部の実施形態では、ＥＧＦＲファミリーメンバーにより媒介されるシグナル伝達のアンタゴニストは、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ４、およびＨＥＲ３のうちの１つまたは複数により媒介されるシグナル伝達を阻害する。ＥＧＦＲファミリーメンバーにより媒介されるシグナル伝達の阻害剤については、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｙａｍａｏｋａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．（２０１８）、１９、３４９１に記載されている。一部の実施形態では、アンタゴニストは、ｐａｎ－ＥｒｂＢ阻害剤である。一部の実施形態では、アンタゴニストは、ＥＧＦＲにより媒介されるシグナル伝達の阻害剤（例えば、セツキシマブ、パニツムマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、アファチニブ、ブリガチニブ、イコチニブ、オシメルチニブ、ザルツムマブ、バンデタニブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ダコミチニブ、ドゥリゴツズマブ、またはマツズマブ）である。一部の実施形態では、アンタゴニストは、ＨＥＲ２により媒介されるシグナル伝達の阻害剤（例えば、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ラパチニブ、ネラチニブ、アファチニブ、ダコミチニブ、ＭＭ－１１１、ＭＣＬＡ－１２８、またはマルゲツキシマブ）である。一部の実施形態では、アンタゴニストは、ＨＥＲ３により媒介されるシグナル伝達の阻害剤（例えば、セリバンツマブ、ルムレツズマブ、エルゲムツマブ、ＫＴＮ３３７９、ＡＶ－２０３、ＧＳＫ２８４９３３０、ＲＥＧＮ１４００、ＭＰ－ＲＭ－１、ＥＶ２０、ドゥリゴツズマブ、ＭＭ－１１１、イスチラツマブ、ＭＣＬＡ－１２８、パトリツマブ、ＥＺＮ－３９２０、ＲＢ２００、またはＵ３－１４０２）である。一部の実施形態では、アンタゴニストは、ＨＥＲ４により媒介されるシグナル伝達の阻害剤（例えば、ラパチニブ、イブルチニブ、アファチニブ、ダコミチニブ、またはネラチニブ）である。
一部の実施形態では、ＥＧＦＲファミリーメンバーにより媒介されるシグナル伝達のアンタゴニストは、ＥＧＦＲファミリーメンバーによるシグナル伝達の下流のエフェクターを阻害する。ＥＧＦＲファミリーメンバーによるシグナル伝達の下流のエフェクターは、例えば、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＭＥＫ／ＥＲＫ、およびｍＴＯＲを含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲファミリーメンバーにより媒介されるシグナル伝達のアンタゴニストは、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤である。一部の実施形態では、ＥＧＦＲファミリーメンバーにより媒介されるシグナル伝達のアンタゴニストは、ＰＩ３Ｋ／ＡＴＫ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤である。一部の実施形態では、アンタゴニストは、ＰＩ３Ｋ阻害剤（例えば、ピクチリシブ、ブパルリシブ、イデラリシブ、コパンリシブ、またはドゥベリシブ）である。一部の実施形態では、アンタゴニストは、ＡＫＴ阻害剤（例えば、ＭＫ－２２０６、ＡＺＤ５３６３、イパタセルチブ、ＶＱＤ－００２、ペリホシン、またはミルテホシン）である。一部の実施形態では、アンタゴニストは、ＢＲＡＦ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、ＳＢ５９０８８５、ＸＬ２８１、ＲＡＦ２６５、エンコラフェニブ、ＧＤＣ－０８７９、ＰＬＸ－４７２０、ソラフェニブ、またはＬＧＸ８１８）である。一部の実施形態では、アンタゴニストは、ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤（例えば、トラメチニブ、コビメチニブ、ビニメチニブ、セルメチニブ、ＰＤ－３２５９０１、ＣＩ－１０４０、ＰＤ０３５９０１、またはＴＡＫ－７３３）である。一部の実施形態では、アンタゴニストは、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン、デフォロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、リダホロリムス、またはサパニセルチブ）である。
一部の実施形態では、本発明の態様（単剤療法または併用療法を含む）に従って処置されるがんは、ＥＧＦＲファミリーメンバー（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ４、および／またはＨＥＲ３）により媒介されるシグナル伝達のアンタゴニスト、例えば、前出の３つの段落において記載されたアンタゴニストによる処置に対して耐性であるがんである。一部の実施形態では、処置される対象は、ＥＧＦＲファミリーメンバーにより媒介されるシグナル伝達のアンタゴニストによる処置に対して耐性であるがんを有する。一部の実施形態では、処置される対象は、ＥＧＦＲファミリーメンバーにより媒介されるシグナル伝達のアンタゴニストによる処置に対して耐性を発生させたがんを有する。一部の実施形態では、処置される対象は、かつては、ＥＧＦＲファミリーメンバーにより媒介されるシグナル伝達のアンタゴニストによる処置に応答したが、現在は、アンタゴニストによる処置に対して耐性であるがんを有する。一部の実施形態では、処置される対象は、ＥＧＦＲファミリーメンバーにより媒介されるシグナル伝達のアンタゴニストによる処置の後で、再発および／または進行したがんを有する。一部の実施形態では、処置される対象は、初期には、ＥＧＦＲファミリーメンバーにより媒介されるシグナル伝達のアンタゴニストによる処置に応答したが、その後、前記処置で進行したがんを有する。
一部の実施形態では、本発明に従って処置される対象は、（例えば、本明細書で記載される）ＨＥＲ３に対するリガンドの増大した発現を引き起こす突然変異を有する細胞を含むがんを有することが決定されている場合がある（すなわち、有すると診断されている場合がある）。一部の実施形態では、本発明の方法は、対象が、ＨＥＲ３に対するリガンドの増大した発現を引き起こす突然変異を有する細胞を含むがんを有するかどうかを決定するステップを含み得る。一部の実施形態では、方法は、がんの細胞由来の核酸を解析するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、ＨＥＲ３に対するリガンドの増大した発現を引き起こす突然変異を検出するステップを含む。
当業者は、本明細書で記載されるがんおよび対象を容易に特定することができる。このようながんおよび対象は、例えば、ＥＧＦＲファミリーメンバーにより媒介されるシグナル伝達のアンタゴニストによる処置の経過の間、例えば、がん（および／またはこの相関因子）の発症／進行の経時的なモニタリングによって特定され得る。一部の実施形態では、このような対象／がんの特定は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける試料（例えば、生検）の解析を含み得る。一部の実施形態では、がんは、アンタゴニストによる処置に対する、感受性の低減および／または耐性と関連する突然変異を有する細胞を含むことが決定され得る。一部の実施形態では、がんは、ＥＧＦＲファミリーメンバーの発現を上方調節した細胞を含むことが決定され得る。
特定の実施形態では、処置されるがんは、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２により媒介されるシグナル伝達のアンタゴニストによる処置に対して耐性であるがんである。一部の実施形態では、処置される対象は、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２により媒介されるシグナル伝達のアンタゴニストによる処置に対して耐性であるがんを有する。一部の実施形態では、処置される対象は、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２により媒介されるシグナル伝達のアンタゴニストによる処置に対して耐性を発生させたがんを有する。一部の実施形態では、処置される対象は、かつては、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２により媒介されるシグナル伝達のアンタゴニストによる処置に応答したが、現在は、アンタゴニストによる処置に対して耐性であるがんを有する。一部の実施形態では、処置される対象は、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２により媒介されるシグナル伝達のアンタゴニストによる処置の後で、再発および／または進行したがんを有する。一部の実施形態では、処置される対象は、初期には、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２により媒介されるシグナル伝達のアンタゴニストによる処置に応答したが、その後、前記処置で進行したがんを有する。
特定の実施形態では、処置されるがんは、ＢＲＡＦの阻害剤による処置に対する耐性を付与する突然変異を含む。一部の実施形態では、突然変異は、ＢＲＡＦのＶ６００における突然変異である。一部の実施形態では、突然変異は、ＢＲＡＦのＶ６００ＥまたはＶ６００Ｋである。
特定の実施形態では、処置されるがんは、ＢＲＡＦの阻害剤による処置に対する耐性を付与する突然変異（例えば、ＢＲＡＦのＶ６００における突然変異）を含み、処置は、ベムラフェニブまたはダラフェニブの投与を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、免疫チェックポイント分子により媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤と組み合わせて投与される。一部の実施形態では、免疫チェックポイント分子は、例えば、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、またはＢＴＬＡである。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、共刺激受容体により媒介されるシグナル伝達を促進することができる薬剤と組み合わせて投与される。一部の実施形態では、共刺激受容体は、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８６、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、またはＩＣＯＳである。
したがって、本発明は、本発明に従う物品（例えば、本発明に従う抗原結合性分子）と、免疫チェックポイント分子により媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤とを含む組成物を提供する。また、本発明の物品と、共刺激受容体により媒介されるシグナル伝達を促進することができる薬剤とを含む組成物も提供される。また、本明細書で記載される疾患／状態の医学的な処置および予防の方法におけるこのような組成物の使用も提供される。
また、本明細書で記載される疾患／状態を処置／予防するための方法であって、本発明に従う物品の本発明の物品（例えば、本発明に従う抗原結合性分子）と、免疫チェックポイント分子により媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤とを投与するステップを含む、方法も提供される。また、本明細書で記載される疾患／状態を処置／予防するための方法であって、本発明に従う物品の本発明の物品（例えば、本発明に従う抗原結合性分子）と、共刺激受容体により媒介されるシグナル伝達を促進することができる薬剤とを投与するステップを含む、方法も提供される。
当技術分野では、免疫チェックポイント分子により媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤が公知であり、例えば、免疫チェックポイント分子、またはそれらのリガンドに結合し、免疫チェックポイント分子により媒介されるシグナル伝達を阻害することができる抗体を含む。免疫チェックポイント分子により媒介されるシグナル伝達を阻害することができる他の薬剤は、免疫チェックポイント分子、または免疫チェックポイント分子に対するリガンドの遺伝子／タンパク質の発現を低減すること（例えば、免疫チェックポイント分子／リガンドをコードする遺伝子の転写を阻害すること、免疫チェックポイント分子／リガンドをコードするＲＮＡの転写後プロセシングを阻害すること、免疫チェックポイント分子／リガンドをコードするＲＮＡの安定性を低減すること、免疫チェックポイント分子／リガンドをコードするＲＮＡの分解を促進すること、免疫チェックポイント分子／リガンドの翻訳後プロセシングを阻害すること、免疫チェックポイント分子／リガンドの安定性を低減すること、または免疫チェックポイント分子／リガンドの分解を促進することを介して）ができる薬剤、および低分子阻害剤を含む。
当技術分野では、共刺激受容体により媒介されるシグナル伝達を促進することができる薬剤が公知であり、例えば、共刺激受容体に結合し、共刺激受容体により媒介されるシグナル伝達を誘発するか、または増大させることができるアゴニスト抗体を含む。共刺激受容体により媒介されるシグナル伝達を促進することができる他の薬剤は、共刺激受容体、または共刺激受容体に対するリガンドの遺伝子／タンパク質の発現を増大させる（例えば、共刺激受容体／リガンドをコードする遺伝子の転写を促進すること、共刺激受容体／リガンドをコードするＲＮＡの転写後プロセシングを促進すること、共刺激受容体／リガンドをコードするＲＮＡの安定性を増大させること、共刺激受容体／リガンドをコードするＲＮＡの分解を阻害すること、共刺激受容体／リガンドの翻訳後プロセシングを促進すること、共刺激受容体／リガンドの安定性を増大させること、または共刺激受容体／リガンドの分解を阻害することを介して）ことができる薬剤、および低分子アゴニストを含む。
特定の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＰＤ－１により媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤と組み合わせて投与される。ＰＤ－１により媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤は、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１を標的化した薬剤であり得る。ＰＤ－１により媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤は、例えば、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１に結合し、ＰＤ－１媒介性シグナル伝達を阻害することができる抗体であり得る。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＣＴＬＡ－４により媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤と組み合わせて投与される。ＣＴＬＡ－４により媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤は、ＣＴＬＡ－４を標的化した薬剤、またはＣＤ８０もしくはＣＤ８６などの、ＣＴＬＡ－４に対するリガンドに対して標的化した薬剤であり得る。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ－４により媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤は、例えば、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ８０またはＣＤ８６に結合し、ＣＴＬＡ－４媒介性シグナル伝達を阻害することができる抗体であり得る。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＬＡＧ－３により媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤と組み合わせて投与される。ＬＡＧ－３により媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤は、ＬＡＧ－３を標的化した薬剤、またはＭＨＣクラスＩＩなどの、ＬＡＧ－３に対するリガンドに対して標的化した薬剤であり得る。一部の実施形態では、ＬＡＧ－３により媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤は、例えば、ＬＡＧ－３またはＭＨＣクラスＩＩに結合し、ＬＡＧ－３媒介性シグナル伝達を阻害することができる抗体であり得る。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡにより媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤と組み合わせて投与される。ＶＩＳＴＡにより媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤は、ＶＩＳＴＡを標的化した薬剤、またはＶＳＩＧ－３もしくはＶＳＩＧ－８などの、ＶＩＳＴＡに対するリガンドに対して標的化した薬剤であり得る。一部の実施形態では、ＶＩＳＴＡにより媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤は、例えば、ＶＩＳＴＡ、ＶＳＩＧ－３、またはＶＳＩＧ－８に結合し、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害することができる抗体であり得る。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＴＩＭ－３により媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤と組み合わせて投与される。ＴＩＭ－３により媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤は、ＴＩＭ－３を標的化した薬剤、またはガレクチン９などの、ＴＩＭ－３に対するリガンドに対して標的化した薬剤であり得る。一部の実施形態では、ＴＩＭ－３により媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤は、例えば、ＴＩＭ－３またはガレクチン９に結合し、ＴＩＭ－３媒介性シグナル伝達を阻害することができる抗体であり得る。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＴＩＧＩＴにより媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤と組み合わせて投与される。ＴＩＧＩＴにより媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤は、ＴＩＧＩＴを標的化した薬剤、またはＣＤ１１３、ＣＤ１１２、もしくはＣＤ１５５などの、ＴＩＧＩＴに対するリガンドに対して標的化した薬剤であり得る。一部の実施形態では、ＴＩＧＩＴにより媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤は、例えば、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＣＤ１１２、またはＣＤ１５５に結合し、ＴＩＧＩＴ媒介性シグナル伝達を阻害することができる抗体であり得る。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＢＴＬＡにより媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤と組み合わせて投与される。ＢＴＬＡにより媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤は、ＢＴＬＡを標的化した薬剤、またはＨＶＥＭなどの、ＢＴＬＡに対するリガンドに対して標的化した薬剤であり得る。一部の実施形態では、ＢＴＬＡにより媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤は、例えば、ＢＴＬＡまたはＨＶＥＭに結合し、ＢＴＬＡ媒介性シグナル伝達を阻害することができる抗体であり得る。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子と、免疫チェックポイント分子により媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤（例えば、ＰＤ－１）との組合せを利用する方法は、いずれかの薬剤が、単剤療法として使用される場合に観察される効果と比較して、処置効果の改善をもたらす。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子と、免疫チェックポイント分子により媒介されるシグナル伝達を阻害することができる薬剤（例えば、ＰＤ－１）との組合せは、相乗的（すなわち、相加効果を超える）処置効果をもたらす。
同時投与とは、抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸（または複数の核酸）、発現ベクター（または複数の発現ベクター）、細胞、または組成物と、治療剤との、併せた投与、例えば、両方の薬剤を含有する医薬組成物（組合せ調製物）としての投与、または互いの直後における、任意選択で、同じ投与経路を介する、例えば、同じ動脈、静脈、または他の血管への投与を指す。逐次投与とは、抗原結合性分子／組成物または治療剤のうちの１つの投与に後続する、所与の時間間隔の後における、他の薬剤の別個の投与を指す。２つの薬剤が同じ経路により投与されることは要求されないが、一部の実施形態では、これが該当する。時間間隔は、任意の時間間隔であり得る。
化学療法および放射線療法は、それぞれ、薬物またはイオン化放射線（例えば、Ｘ線またはγ線を使用する放射線療法）によるがんの処置を指す。薬物は、化学的実体、例えば、低分子医薬、抗生物質、ＤＮＡ挿入剤、タンパク質阻害剤（例えば、キナーゼ阻害剤）、または生物学的薬剤、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質であり得る。薬物は、医薬組成物または医薬として製剤化され得る。製剤は、１つまたは複数の薬物（例えば、１つまたは複数の活性の薬剤）を、１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体と併せて含み得る。
処置は、１つを超える薬物の投与を伴い得る。薬物は、処置される状態に応じて、単独で、または他の処置と、同時に、もしくは逐次的に組み合わせて投与され得る。例えば、化学療法は、それらのうちの１つまたは複数が、がんを処置することを意図され得る、２つ薬物の投与を伴う併用療法であり得る。
化学療法は、１つまたは複数の投与経路、例えば、非経口、静脈内注射、経口、皮下、皮内、または腫瘍内により投与され得る。
化学療法は、処置レジメに従い投与され得る。処置レジメは、医師または医療従事者により作成され得る、化学療法投与についての所定の時程表、計画、スキーム、またはスケジュールであり得、処置を要求する患者に適するように調整され得る。処置レジメは、患者に投与するための化学療法の種類；各薬物の用量または放射線の線量；投与の間の時間間隔；各処置の長さ；存在する場合、任意の休薬日の数および性質などのうちの１つまたは複数を示し得る。併用療法では、各薬物が、どのようにして投与されるべきであるのかを示す、単一の処置レジメが提示され得る。
化学療法薬は、アベマシクリブ、アビラテロン酢酸塩、アビトレキサート（メトトレキサート）、Ａｂｒａｘａｎｅ（パクリタキセルのアルブミン安定化ナノ粒子製剤）、ＡＢＶＤ、ＡＢＶＥ、ＡＢＶＥ－ＰＣ、ＡＣ、アカラブルチニブ、ＡＣ－Ｔ、Ａｄｃｅｔｒｉｓ（ブレンツキシマブ・ベドチン）、ＡＤＥ、Ａｄｏ－トラスツズマブ・エムタンシン、アドリアマイシン（ドキソルビシン塩酸塩）、アファチニブジマレイン酸塩、アフィニトール（エベロリムス）、Ａｋｙｎｚｅｏ（ネツピタントおよびパロノセトロン塩酸塩）、Ａｌｄａｒａ（イミキモド）、アルデスロイキン、Ａｌｅｃｅｎｓａ（アレクチニブ）、アレクチニブ、アレムツズマブ、Ａｌｉｍｔａ（ペメトレキセド二ナトリウム）、Ａｌｉｑｏｐａ（コパンリシブ塩酸塩）、Ａｌｋｅｒａｎ注射剤（メルファラン塩酸塩）、Ａｌｋｅｒａｎ錠（メルファラン）、Ａｌｏｘｉ（パロノセトロン塩酸塩）、Ａｌｕｎｂｒｉｇ（ブリガチニブ）、Ａｍｂｏｃｈｌｏｒｉｎ（クロランブシル）、Ａｍｂｏｃｌｏｒｉｎ（クロランブシル）、アミホスチン、アミノレブリン酸、アナストロゾール、アプレピタント、Ａｒｅｄｉａ（パミドロネート二ナトリウム）、Ａｒｉｍｉｄｅｘ（アナストロゾール）、Ａｒｏｍａｓｉｎ（エキセメスタン）、Ａｒｒａｎｏｎ（ネララビン）、三酸化ヒ素、Ａｒｚｅｒｒａ（オファツムマブ）、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来のアスパラギナーゼ、アテゾリズマブ、Ａｖａｓｔｉｎ（ベバシズマブ）、アベルマブ、アキシカブタゲン・シロロイセル、アキシチニブ、アザシチジン、Ｂａｖｅｎｃｉｏ（アベルマブ）、ＢＥＡＣＯＰＰ、Ｂｅｃｅｎｕｍ（カルムスチン）、Ｂｅｌｅｏｄａｑ（ベリノスタット）、ベリノスタット、ベンダムスチン塩酸塩、ＢＥＰ、Ｂｅｓｐｏｎｓａ（イノツズマブ・オゾガマイシン）、ベバシズマブ、ベキサロテン、Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブおよびヨウ素Ｉ－１３１トシツモマブ）、ビカルタミド、ＢｉＣＮＵ（カルムスチン）、ブレオマイシン、ブリナツモマブ、Ｂｌｉｎｃｙｔｏ（ブリナツモマブ）、ボルテゾミブ、Ｂｏｓｕｌｉｆ（ボスチニブ）、ボスチニブ、ブレンツキシマブ・ベドチン、ブリガチニブ、ＢｕＭｅｌ、ブスルファン、Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（ブスルファン）、カバジタキセル、Ｃａｂｏｍｅｔｙｘ（カボザンチニブ－Ｓ－リンゴ酸塩）、カボザンチニブ－Ｓ－リンゴ酸塩、ＣＡＦ、Ｃａｌｑｕｅｎｃｅ（アカラブルチニブ）、Ｃａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ）、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（イリノテカン塩酸塩）、カペシタビン、ＣＡＰＯＸ、Ｃａｒａｃ（外用フルオロウラシル）、カルボプラチン、カルボプラチン－ＴＡＸＯＬ、カルフィルゾミブ、Ｃａｒｍｕｂｒｉｓ（カルムスチン）、カルムスチン、カルムスチンインプラント剤、Ｃａｓｏｄｅｘ（ビカルタミド）、ＣＥＭ、Ｃｅｒｉｔｉｎｉｂ、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（ダウノルビシン塩酸塩）、Ｃｅｒｖａｒｉｘ（組換えＨＰＶ二価ワクチン）、セツキシマブ、ＣＥＶ、クロランブシル、クロランブシル－ＰＲＥＤＮＩＳＯＮＥ、ＣＨＯＰ、シスプラチン、クラドリビン、Ｃｌａｆｅｎ（シクロホスファミド）、クロファラビン、Ｃｌｏｆａｒｅｘ（クロファラビン）、Ｃｌｏｌａｒ（クロファラビン）、ＣＭＦ、コビメチニブ、Ｃｏｍｅｔｒｉｑ（カボザンチニブ－Ｓ－リンゴ酸塩）、コパンリシブ塩酸塩、ＣＯＰＤＡＣ、ＣＯＰＰ、ＣＯＰＰ－ＡＢＶ、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（ダクチノマイシン）、Ｃｏｔｅｌｌｉｃ（コビメチニブ）、クリゾチニブ、ＣＶＰ、シクロホスファミド、Ｃｙｆｏｓ（イホスファミド）、Ｃｙｒａｍｚａ（ラムシルマブ）、シタラビン、シタラビンリポソーム、Ｃｙｔｏｓａｒ－Ｕ（シタラビン）、Ｃｙｔｏｘａｎ（シクロホスファミド）、ダラフェニブ、ダカルバジン、Ｄａｃｏｇｅｎ（デシタビン）、ダクチノマイシン、ダラツムマブ、Ｄａｒｚａｌｅｘ（ダラツムマブ）、ダサチニブ、ダウノルビシン塩酸塩、ダウノルビシン塩酸塩およびシタラビンリポソーム、デシタビン、デフィブロチドナトリウム、Ｄｅｆｉｔｅｌｉｏ（デフィブロチドナトリウム）、デガレリクス、デニロイキンディフチトクス、デノスマブ、ＤｅｐｏＣｙｔ（シタラビンリポソーム）、デキサメタゾン、デキスラゾキサン塩酸塩、ジヌツキシマブ、ドセタキセル、Ｄｏｘｉｌ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ドキソルビシン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸塩リポソーム、Ｄｏｘ－ＳＬ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ（ダカルバジン）、デュルバルマブ、Ｅｆｕｄｅｘ（外用フルオロウラシル）、Ｅｌｉｔｅｋ（ラスブリカーゼ）、Ｅｌｌｅｎｃｅ（エピルビシン塩酸塩）、エロツズマブ、Ｅｌｏｘａｔｉｎ（オキサリプラチン）、エルトロンボパグオラミン、Ｅｍｅｎｄ（アプレピタント）、Ｅｍｐｌｉｃｉｔｉ（エロツズマブ）、エナシデニブメシル酸塩、エンザルタミド、エピルビシン塩酸塩、ＥＰＯＣＨ、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）、エリブリンメシル酸塩、Ｅｒｉｖｅｄｇｅ（ビスモデジブ）、エルロチニブ塩酸塩、Ｅｒｗｉｎａｚｅ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来のアスパラギナーゼ）、Ｅｔｈｙｏｌ（アミホスチン）、Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ（エトポシドリン酸塩）、エトポシド、エトポシドリン酸塩、Ｅｖａｃｅｔ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、エベロリムス、Ｅｖｉｓｔａ（ラロキシフェン塩酸塩）、Ｅｖｏｍｅｌａ（メルファラン塩酸塩）、エキセメスタン、５－ＦＵ（フルオロウラシル注射）、５－ＦＵ（外用フルオロウラシル）、Ｆａｒｅｓｔｏｎ（トレミフェン）、Ｆａｒｙｄａｋ（パノビノスタット）、Ｆａｓｌｏｄｅｘ（フルベストラント）、ＦＥＣ、Ｆｅｍａｒａ（レトロゾール）、フィルグラスチム、Ｆｌｕｄａｒａ（フルダラビンリン酸塩）、フルダラビンリン酸塩、Ｆｌｕｏｒｏｐｌｅｘ（外用フルオロウラシル）、フルオロウラシル注射剤、外用フルオロウラシル、フルタミド、Ｆｏｌｅｘ（メトトレキサート）、Ｆｏｌｅｘ ＰＦＳ（メトトレキサート）、ＦＯＬＦＩＲＩ、ＦＯＬＦＩＲＩ－ベバシズマブ、ＦＯＬＦＩＲＩ－セツキシマブ、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ、ＦＯＬＦＯＸ、Ｆｏｌｏｔｙｎ（プララトレキサート）、ＦＵ－ＬＶ、フルベストラント、Ｇａｒｄａｓｉｌ（組換えＨＰＶ四価ワクチン）、Ｇａｒｄａｓｉｌ９（組換えＨＰＶ九価ワクチン）、Ｇａｚｙｖａ（オビヌツズマブ）、ゲフィチニブ、ゲムシタビン塩酸塩、ゲムシタビン－シスプラチン、ゲムシタビン－オキサリプラチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、Ｇｅｍｚａｒ（ゲムシタビン塩酸塩）、Ｇｉｌｏｔｒｉｆ（アファチニブジマレイン酸塩）、Ｇｌｅｅｖｅｃ（イマチニブメシル酸塩）、Ｇｌｉａｄｅｌ（カルムスチンインプラント剤）、Ｇｌｉａｄｅｌウェハー剤（カルムスチンインプラント剤）、グルカルピダーゼ、ゴセレリン酢酸塩、Ｈａｌａｖｅｎ（エリブリンメシル酸塩）、Ｈｅｍａｎｇｅｏｌ（プロプラノロール塩酸塩）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）、ＨＰＶ二価ワクチン、組換えＨＰＶ九価ワクチン、組換えＨＰＶ四価ワクチン、組換えＨｙｃａｍｔｉｎ（トポテカン塩酸塩）、Ｈｙｄｒｅａ（ヒドロキシウレア）、ヒドロキシウレア、Ｈｙｐｅｒ－ＣＶＡＤ、Ｉｂｒａｎｃｅ（パルボシクリブ）、イブリツモマブチウキセタン、Ｉｂｒｕｔｉｎｉｂ、ＩＣＥ、Ｉｃｌｕｓｉｇ（ポナチニブ塩酸塩）、Ｉｄａｍｙｃｉｎ（イダルビシン塩酸塩）、イダルビシン塩酸塩、イデラリシブ、Ｉｄｈｉｆａ（エナシデニブメシル酸塩）、Ｉｆｅｘ（イホスファミド）、イホスファミド、Ｉｆｏｓｆａｍｉｄｕｍ（イホスファミド）、ＩＬ－２（アルデスロイキン）、イマチニブメシル酸塩、Ｉｍｂｒｕｖｉｃａ（イブルチニブ）、Ｉｍｆｉｎｚｉ（デュルバルマブ）、イミキモド、Ｉｍｌｙｇｉｃ（タリモジェン・ラヘルパレプベク）、Ｉｎｌｙｔａ（アキシチニブ）、イノツズマブ・オゾガマイシン、インターフェロンアルファ－２ｂ、組換え、インターロイキン－２（アルデスロイキン）、Ｉｎｔｒｏｎ Ａ（組換えインターフェロンアルファ－２ｂ）、ヨウ素Ｉ－１３１トシツモマブおよびトシツモマブ、イピリムマブ、Ｉｒｅｓｓａ（ゲフィチニブ）、イリノテカン塩酸塩、イリノテカン塩酸塩リポソーム、Ｉｓｔｏｄａｘ（ロミデプシン）、イキサベピロン、イキサゾミブクエン酸塩、Ｉｘｅｍｐｒａ（イキサベピロン）、Ｊａｋａｆｉ（ルキソリチニブリン酸塩）、ＪＥＢ、Ｊｅｖｔａｎａ（カバジタキセル）、Ｋａｄｃｙｌａ（Ａｄｏ－トラスツズマブ・エムタンシン）、Ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ（ラロキシフェン塩酸塩）、Ｋｅｐｉｖａｎｃｅ（パリフェルミン）、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（ペムブロリズマブ）、Ｋｉｓｑａｌｉ（リボシクリブ）、Ｋｙｍｒｉａｈ（チサゲンレクロイセル）、Ｋｙｐｒｏｌｉｓ（カルフィルゾミブ）、ランレオチド酢酸塩、ラパチニブジトシル酸塩、Ｌａｒｔｒｕｖｏ（オララツマブ）、レナリドミド、レンバチニブメシル酸塩、Ｌｅｎｖｉｍａ（レンバチニブメシル酸塩）、レトロゾール、ロイコボリンカルシウム、Ｌｅｕｋｅｒａｎ（クロランブシル）、ロイプロリド酢酸塩、Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（クラドリビン）、Ｌｅｖｕｌａｎ（アミノレブリン酸）、Ｌｉｎｆｏｌｉｚｉｎ（クロランブシル）、ＬｉｐｏＤｏｘ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ロムスチン、Ｌｏｎｓｕｒｆ（トリフルリジンおよびチピラシル塩酸塩）、Ｌｕｐｒｏｎ（ロイプロリド酢酸塩）、Ｌｕｐｒｏｎデポ剤（ロイプロリド酢酸塩）、Ｌｕｐｒｏｎ小児用デポ剤（ロイプロリド酢酸塩）、Ｌｙｎｐａｒｚａ（オラパリブ）、Ｍａｒｑｉｂｏ（ビンクリスチン硫酸塩リポソーム）、Ｍａｔｕｌａｎｅ（プロカルバジン塩酸塩）、メクロレタミン塩酸塩、メゲストロール酢酸塩、Ｍｅｋｉｎｉｓｔ（トラメチニブ）、メルファラン、メルファラン塩酸塩、メルカプトプリン、メスナ、Ｍｅｓｎｅｘ（メスナ）、Ｍｅｔｈａｚｏｌａｓｔｏｎｅ（テモゾロミド）、メトトレキサート、メトトレキサートＬＰＦ（メトトレキサート）、メチルナルトレキソン臭化物、Ｍｅｘａｔｅ（メトトレキサート）、Ｍｅｘａｔｅ－ＡＱ（メトトレキサート）、ミドスタウリン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン塩酸塩、Ｍｉｔｏｚｙｔｒｅｘ（マイトマイシンＣ）、ＭＯＰＰ、Ｍｏｚｏｂｉｌ（プレリキサフォル）、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（メクロレタミン塩酸塩）、Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（マイトマイシンＣ）、Ｍｙｌｅｒａｎ（ブスルファン）、Ｍｙｌｏｓａｒ（アザシチジン）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（ゲムツズマブオゾガマイシン）、ナノ粒子パクリタキセル（パクリタキセルのアルブミン安定化ナノ粒子製剤）、ナベルビン（ビノレルビン酒石酸塩）、ネシツムマブ、ネララビン、Ｎｅｏｓａｒ（シクロホスファミド）、ネラチニブマレイン酸塩、Ｎｅｒｌｙｎｘ（ネラチニブマレイン酸塩）、ネツピタントおよびパロノセトロン塩酸塩、Ｎｅｕｌａｓｔａ（ペグフィルグラスチム）、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（フィルグラスチム）、Ｎｅｘａｖａｒ（ソラフェニブトシル酸塩）、Ｎｉｌａｎｄｒｏｎ（ニルタミド）、ニロチニブ、ニルタミド、Ｎｉｎｌａｒｏ（イキサゾミブクエン酸塩）、ニラパリブトシル酸塩一水和物、ニボルマブ、Ｎｏｌｖａｄｅｘ（タモキシフェンクエン酸塩）、Ｎｐｌａｔｅ（ロミプロスチム）、オビヌツズマブ、Ｏｄｏｍｚｏ（ソニデジブ）、ＯＥＰＡ、オファツムマブ、ＯＦＦ、オラパリブ、オララツマブ、オマセタキシンメペスクシネート、Ｏｎｃａｓｐａｒ（ペガスパルガーゼ）、オンダンセトロン塩酸塩、Ｏｎｉｖｙｄｅ（イリノテカン塩酸塩リポソーム）、Ｏｎｔａｋ（デニロイキンディフチトクス）、Ｏｐｄｉｖｏ（ニボルマブ）、ＯＰＰＡ、オシメルチニブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パクリタキセルのアルブミン安定化ナノ粒子製剤、ＰＡＤ、パルボシクリブ、パリフェルミン、パロノセトロン塩酸塩、パロノセトロン塩酸塩およびネツピタント、パミドロネート二ナトリウム、パニツムマブ、パノビノスタット、Ｐａｒａｐｌａｔ（カルボプラチン）、Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（カルボプラチン）、パゾパニブ塩酸塩、ＰＣＶ、ＰＥＢ、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム。Ｐｅｇインターフェロンアルファ－２ｂ、ＰＥＧ－Ｉｎｔｒｏｎ（Ｐｅ
ｇインターフェロンアルファ－２ｂ）、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド二ナトリウム、Ｐｅｒｊｅｔａ（ペルツズマブ）、ペルツズマブ、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（シスプラチン）、Ｐｌａｔｉｎｏｌ－ＡＱ（シスプラチン）、プレリキサフォル、ポマリドミド、Ｐｏｍａｌｙｓｔ（ポマリドミド）、ポナチニブ塩酸塩、Ｐｏｒｔｒａｚｚａ（ネシツムマブ）、プララトレキサート、プレドニゾン、プロカルバジン塩酸塩、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（アルデスロイキン）、Ｐｒｏｌｉａ（デノスマブ）、Ｐｒｏｍａｃｔａ（エルトロンボパグオラミン）、プロプラノロール塩酸塩、Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（シプリューセル－Ｔ）、Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（メルカプトプリン）、Ｐｕｒｉｘａｎ（メルカプトプリン）、［未記載］、ラジウム２２３二塩化物、ラロキシフェン塩酸塩、ラムシルマブ、ラスブリカーゼ、Ｒ－ＣＨＯＰ、Ｒ－ＣＶＰ、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）二価ワクチン、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）九価ワクチン、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）四価ワクチン、組換えインターフェロンアルファ－２ｂ、レゴラフェニブ、Ｒｅｌｉｓｔｏｒ（メチルナルトレキソン臭化物）、Ｒ－ＥＰＯＣＨ、Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（レナリドミド）、Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ（メトトレキサート）、リボシクリブ、Ｒ－ＩＣＥ、Ｒｉｔｕｘａｎ（リツキシマブ）、Ｒｉｔｕｘａｎ Ｈｙｃｅｌａ（リツキシマブおよびヒトヒアルロニダーゼ）、リツキシマブ、リツキシマブおよびヒトヒアルロニダーゼ、ロラピタント塩酸塩、ロミデプシン、ロミプロスチム、Ｒｕｂｉｄｏｍｙｃｉｎ（ダウノルビシン塩酸塩）、Ｒｕｂｒａｃａ（ルカパリブカムシル酸塩）、ルカパリブカムシル酸塩、ルキソリチニブリン酸塩、Ｒｙｄａｐｔ（ミドスタウリン）、スクレロゾール胸膜内エアゾール（タルク）、シルツキシマブ、シプリューセル－Ｔ、ソマツリンデポ剤（ランレオチド酢酸塩）、ソニデジブ、ソラフェニブトシル酸塩、Ｓｐｒｙｃｅｌ（ダサチニブ）、ＳＴＡＮＦＯＲＤ Ｖ、滅菌タルク粉末（タルク）、Ｓｔｅｒｉｔａｌｃ（タルク）、Ｓｔｉｖａｒｇａ（レゴラフェニブ）、スニチニブリンゴ酸塩、Ｓｕｔｅｎｔ（スニチニブリンゴ酸塩）、Ｓｙｌａｔｒｏｎ（Ｐｅｇインターフェロンアルファ－２ｂ）、Ｓｙｌｖａｎｔ（シルツキシマブ）、Ｓｙｎｒｉｂｏ（オマセタキシンメペスクシネート）、Ｔａｂｌｏｉｄ（チオグアニン）、ＴＡＣ、Ｔａｆｉｎｌａｒ（ダブラフェニブ）、Ｔａｇｒｉｓｓｏ（オシメルチニブ）、タルク、タリモジェン・ラヘルパレプベク、タモキシフェンクエン酸塩、Ｔａｒａｂｉｎｅ ＰＦＳ（シタラビン）、Ｔａｒｃｅｖａ（エルロチニブ塩酸塩）、Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（ベキサロテン）、Ｔａｓｉｇｎａ（ニロチニブ）、Ｔａｘｏｌ（パクリタキセル）、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（ドセタキセル）、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（アテゾリズマブ）、Ｔｅｍｏｄａｒ（テモゾロミド）、テモゾロミド、テムシロリムス、サリドマイド、Ｔｈａｌｏｍｉｄ（サリドマイド）、チオグアニン、チオテパ、チサゲンレクロイセル、Ｔｏｌａｋ（外用フルオロウラシル）、トポテカン塩酸塩、トレミフェン、Ｔｏｒｉｓｅｌ（テムシロリムス）、トシツモマブおよびヨウ素Ｉ－１３１トシツモマブ、Ｔｏｔｅｃｔ（デキスラゾキサン塩酸塩）、ＴＰＦ、トラベクテジン、トラメチニブ、トラスツズマブ、Ｔｒｅａｎｄａ（ベンダムスチン塩酸塩）、トリフルリジンおよびチピラシル塩酸塩、Ｔｒｉｓｅｎｏｘ（三酸化ヒ素）、Ｔｙｋｅｒｂ（ラパチニブジトシル酸塩）、Ｕｎｉｔｕｘｉｎ（ジヌツキシマブ）、ウリジン三酢酸塩、ＶＡＣ、バルルビシン、Ｖａｌｓｔａｒ（バルルビシン）、バンデタニブ、ＶＡＭＰ、Ｖａｒｕｂｉ（ロラピタント塩酸塩）、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（パニツムマブ）、ＶｅＩＰ、Ｖｅｌｂａｎ（ビンブラスチン硫酸塩）、Ｖｅｌｃａｄｅ（ボルテゾミブ）、Ｖｅｌｓａｒ（ビンブラスチン硫酸塩）、ベムラフェニブ、Ｖｅｎｃｌｅｘｔａ（ベネトクラクス）、ベネトクラクス、Ｖｅｒｚｅｎｉｏ（アベマシクリブ）、Ｖｉａｄｕｒ（ロイプロリド酢酸塩）、Ｖｉｄａｚａ（アザシチジン）、ビンブラスチン硫酸塩、Ｖｉｎｃａｓａｒ ＰＦＳ（ビンクリスチン硫酸塩）、ビンクリスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩リポソーム、ビノレルビン酒石酸塩、ＶＩＰ、ビスモデジブ、Ｖｉｓｔｏｇａｒｄ（ウリジン三酢酸塩）、Ｖｏｒａｘａｚｅ（グルカルピダーゼ）、ボリノスタット、Ｖｏｔｒｉｅｎｔ（パゾパニブ塩酸塩）、Ｖｙｘｅｏｓ（ダウノルビシン塩酸塩およびシタラビンリポソーム）、Ｗｅｌｌｃｏｖｏｒｉｎ（ロイコボリンカルシウム）、Ｘａｌｋｏｒｉ（クリゾチニブ）、ゼローダ（カペシタビン）、ＸＥＬＩＲＩ、ＸＥＬＯＸ、Ｘｇｅｖａ（デノスマブ）、Ｘｏｆｉｇｏ（ラジウム２２３二塩化物）、Ｘｔａｎｄｉ（エンザルタミド）、Ｙｅｒｖｏｙ（イピリムマブ）、Ｙｅｓｃａｒｔａ（アキシカブタゲン・シロロイセル）、Ｙｏｎｄｅｌｉｓ（トラベクテジン）、Ｚａｌｔｒａｐ（Ｚｉｖ－アフリベルセプト）、Ｚａｒｘｉｏ（フィルグラスチム）、Ｚｅｊｕｌａ（ニラパリブトシル酸塩一水和物）、Ｚｅｌｂｏｒａｆ（ベムラフェニブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（イブリツモマブチウキセタン）、Ｚｉｎｅｃａｒｄ（デキスラゾキサン塩酸塩）、Ｚｉｖ－アフリベルセプト、Ｚｏｆｒａｎ（オンダンセトロン塩酸塩）、Ｚｏｌａｄｅｘ（ゴセレリン酢酸塩）、ゾレドロン酸、Ｚｏｌｉｎｚａ（ボリノスタット）、Ｚｏｍｅｔａ（ゾレドロン酸）、Ｚｙｄｅｌｉｇ（イデラリシブ）、Ｚｙｋａｄｉａ（セリチニブ）、およびＺｙｔｉｇａ（アビラテロン酢酸塩）から選択され得る。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、トラスツズマブ、セツキシマブ、シスプラチン、５－ＦＵ、またはカペシタビンのうちの１つまたは複数と組み合わせて投与される。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、トラスツズマブおよびシスプラチン、ならびに５－ＦＵまたはカペシタビンと組み合わせて投与される。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、セツキシマブと組み合わせて投与される。特に、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）の処置のために、セツキシマブと組み合わせた投与が想定される。
抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸（または複数の核酸）、発現ベクター（または複数の発現ベクター）、細胞、または組成物の複数回投与が提供され得る。１回もしくは複数回、または各回の投与は、別の治療剤の同時または逐次的投与に随伴され得る。
複数回投与は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、もしくは３１日間、または１、２、３、４、５、もしくは６カ月間のうちの１つであるように選択され得る、所定の時間間隔により隔てられ得る。例を目的として述べると、投与は、７、１４、２１、または２８日（±３、２、または１日）ごとに与えられ得る。
検出方法
本発明はまた、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ３を発現する細胞を検出、位置特定、またはイメージングする方法における使用のための本発明の物品も提供する。
本明細書で記載される抗原結合性分子は、ＨＥＲ３に対する抗原結合性分子を伴う方法において使用され得る。このような方法は、抗原結合性分子とＨＥＲ３との結合複合体の検出を伴い得る。
このように、ＨＥＲ３を含有するか、またはこれを含有することが疑われる試料を接触させるステップと、抗原結合性分子とＨＥＲ３との複合体の形成を検出するステップとを含む、方法が提供される。また、ＨＥＲ３を発現する細胞を含有するか、またはこれを含有することが疑われる試料を接触させるステップと、抗原結合性分子と、ＨＥＲ３を発現する細胞との複合体の形成を検出するステップとを含む、方法も提供される。
当技術分野では、サンドイッチアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイを含む、適する方法フォーマットが周知である。方法は、検出可能部分、例えば、本明細書で記載される、蛍光標識、リン光標識、発光標識、免疫検出可能標識、放射性標識、化学、核酸、または酵素標識により、抗原結合性分子、もしくは標的、またはこれらの両方を標識付けするステップを伴い得る。当業者には、検出技法が周知であり、標識化剤と対応するように選択され得る。
この種の方法は、疾患または状態、例えば、がんについての診断的および／または予後診断的評価のための方法のベースをもたらし得る。このような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの患者試料に対して実施され得るか、または患者試料の処理後に実施され得る。試料が回収されると、患者は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法の実施に立ち会うことを要求されないため、方法は、ヒトまたは動物体内に対しては行われない方法であり得る。一部の実施形態では、方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで実施される。
試料中の検出は、疾患／状態（例えば、がん）、疾患／状態に対する素因の診断を目的として使用され得るか、または疾患／状態、例えば、本明細書で記載される疾患／状態について予後診断する（予知する）ために使用され得る。診断または予後診断は、既存の（既に診断された）疾患／状態に関し得る。
このような方法は、例えば、患者試料中でＨＥＲ３またはＨＥＲ３を発現する細胞を検出または定量するステップを伴い得る。方法が、関連する因子を定量するステップを含む場合、方法は、診断的または予後診断的評価の一部として、決定された量を、標準値または参照値に対して比較するステップをさらに含み得る。他の診断／予後診断検査は、診断もしくは予後診断の精度を増強するか、または本明細書で記載される検査を使用することにより得られる結果を確認するように、本明細書で記載される診断／予後診断検査と共に使用され得る。
試料は、任意の組織または体液から採取され得る。試料は、多量の血液；フィブリン塊および血液細胞を除去した後で得られる血液の流体部分を含み得る、個体の血液に由来する多量の血清；組織試料または生検；胸水；脳脊髄液（ＣＳＦ）；または前記個体から単離された細胞を含み得るか、またはこれらに由来し得る。一部の実施形態では、試料は、疾患／状態の影響を受ける、１つの組織または複数の組織（例えば、疾患の症状が顕在化するか、または疾患／状態の発症機序に関与する、１つの組織または複数の組織）から得られ得るか、またはこれらに由来し得る。
本発明はまた、ＨＥＲ３を標的化した薬剤による処置のために対象を選択／層別化するための方法も提供する。一部の実施形態では、対象は、本発明に従う処置／予防のために選択されるか、または例えば、個体から得られる試料中のＨＥＲ３、もしくはＨＥＲ３を発現する細胞の検出／定量に基づき、このような処置／予防から利益を得る対象として特定される。
対象
本明細書で記載される本発明の態様に従う対象は、任意の動物またはヒトであり得る。対象は、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトである。対象は、非ヒト哺乳動物であり得るが、より好ましくは、ヒトである。対象は、雄、または雌であり得る。対象は、患者であり得る。対象は、処置を要求する疾患もしくは状態（例えば、がん）を有すると診断されている場合があり、このような疾患／状態を有することが疑われる場合があり、またはこのような疾患／状態を発症する／このような疾患／状態に罹患する危険性がある場合がある。
本発明に従う実施形態では、対象は、好ましくは、ヒト対象である。一部の実施形態では、本明細書における本発明の治療または予防方法に従って処置される対象は、がんを有するか、またはがんを発症させる危険性がある対象である。本発明に従う実施形態では、対象は、このような疾患／状態のある特定のマーカーについての特徴付けに基づく方法に従う処置のために選択され得る。
キット
本明細書で記載される本発明の一部の態様では、部材キットが提供される。一部の実施形態では、キットは、所定数量の本明細書で記載される抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸（または複数の核酸）、発現ベクター（または複数の発現ベクター）、細胞、または組成物を有する、少なくとも１つの容器を有し得る。
一部の実施形態では、キットは、本明細書で記載される抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸（または複数の核酸）、発現ベクター（または複数の発現ベクター）、細胞、または組成物を産生するための材料を含み得る。
キットは、抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸（または複数の核酸）、発現ベクター（または複数の発現ベクター）、細胞、または組成物を、指定された疾患／状態を処置するための患者への投与のための指示書と併せて提供し得る。
一部の実施形態では、キットは、所定数量の別の治療剤（例えば、抗感染症剤または化学療法剤）を有する、少なくとも１つの容器をさらに含み得る。このような実施形態では、キットはまた、２つの医薬または医薬組成物が、特定の疾患または状態のための併用処置をもたらすように、同時に、または個別に投与され得るように、第２の医薬または医薬組成物も含み得る。治療剤はまた、腫瘍または血液への注射または注入に適するようにも製剤化され得る。
配列同一性
本明細書で使用される場合、「配列同一性」とは、配列の間で、最大の配列同一性パーセントを達成するように、配列をアライメントし、必要な場合は、ギャップを導入した後で、参照配列内のヌクレオチド／アミノ酸残基と同一である対象配列内のヌクレオチド／アミノ酸残基のパーセントを指す。２つ以上のアミノ酸配列または核酸配列の間の配列同一性パーセントを決定することを目的とするための、対での複数の配列アライメントは、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａ（Ｓｏｄｉｎｇ、Ｊ．２００５、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２１、９５１～９６０）、Ｔ－ｃｏｆｆｅｅ（Ｎｏｔｒｅｄａｍｅら、２０００、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）、３０２、２０５～２１７）、Ｋａｌｉｇｎ（ＬａｓｓｍａｎｎおよびＳｏｎｎｈａｍｍｅｒ ２００５、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、６（２９８））、およびＭＡＦＦＴ（ＫａｔｏｈおよびＳｔａｎｄｌｅｙ ２０１３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、３０（４）、７７２～７８０）ソフトウェアなどの市販のコンピュータソフトウェアを使用して、当業者に公知の様々な手段で達成され得る。このようなソフトウェアを使用する場合、例えば、ギャップペナルティーおよび伸長ペナルティーについての、デフォルトのパラメータを使用することが好ましい。
Figure 2022548057000003
Figure 2022548057000004
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Figure 2022548057000008
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 番号付けされた項目
以下の番号付けされた項目（ｐａｒａ）は、本発明の関連で想定される、特徴および特徴の組合せについての言明をさらに提示する：
１．細胞外領域サブドメインＩＩ内のＨＥＲ３に結合することができる抗原結合性分子、任意選択で、単離された抗原結合性分子。
２．ＨＥＲ３と、ＨＥＲ３の相互作用パートナーとの相互作用を阻害する、項目１に記載の抗原結合性分子。
３．配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドに結合することができる、項目１または項目２に記載の抗原結合性分子。
４．配列番号２３または配列番号２２９のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合することができる、項目１から３のいずれか一つに記載の抗原結合性分子。
５．配列番号２１または配列番号２２９のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合することができる、項目１から４のいずれか一つに記載の抗原結合性分子。
６．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号４６のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号５１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる重鎖可変（ＶＨ）領域、および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号９１のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号９４のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号９９のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から５のいずれか一つに記載の抗原結合性分子。
７．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号４４のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号４７のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる重鎖可変（ＶＨ）領域、および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号８８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号９２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号９５のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から６のいずれか一つに記載の抗原結合性分子。
８．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号４４のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号４７のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる重鎖可変（ＶＨ）領域、および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号８９のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号９２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号９５のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から６のいずれか一つに記載の抗原結合性分子。
９．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号４４のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号４７のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる重鎖可変（ＶＨ）領域、および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号９０のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号９２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号９６のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から６のいずれか一つに記載の抗原結合性分子。
１０．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号４４のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号４７のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる重鎖可変（ＶＨ）領域、および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号８８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号９２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号９８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から６のいずれか一つに記載の抗原結合性分子。
１１．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号４５のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号４７のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる重鎖可変（ＶＨ）領域、および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号８８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号９３のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号９５のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から６のいずれか一つに記載の抗原結合性分子。
１２．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号４５のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号４９のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる重鎖可変（ＶＨ）領域、および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号８８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号９３のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号９５のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から６のいずれか一つに記載の抗原結合性分子。
１３．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号４５のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号５０のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる重鎖可変（ＶＨ）領域、および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号８８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号９３のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号９５のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から６のいずれか一つに記載の抗原結合性分子。
１４．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号４５のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号４８のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる重鎖可変（ＶＨ）領域、および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号８８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号９２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号９５のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から６のいずれか一つに記載の抗原結合性分子。
１５．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号４５のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号４８のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる重鎖可変（ＶＨ）領域、および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号８８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号９２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号９７のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から６のいずれか一つに記載の抗原結合性分子。
１６．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４２のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号４５のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号４８のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる重鎖可変（ＶＨ）領域、および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号８８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号９２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号９５のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から６のいずれか一つに記載の抗原結合性分子。
１７．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１５８のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号１５９のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる重鎖可変（ＶＨ）領域、および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１６５のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号１６６のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号１６７のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から５のいずれか一つに記載の抗原結合性分子。
１８．配列番号２２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合することができる、項目１から４のいずれか一つに記載の抗原結合性分子。
１９．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１２８のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号１２９のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号１３０のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる重鎖可変（ＶＨ）領域、および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１３６のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号１３７のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から４または項目１８のいずれか一つに記載の抗原結合性分子。
２０．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１４４のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号１４５のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号１４６のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる重鎖可変（ＶＨ）領域、および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１５１のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号１５２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から４または項目１８のいずれか一つに記載の抗原結合性分子。
２１．（ｉ）配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および
配列番号７４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域、
または
（ｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および
配列番号７５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域、
または
（ｉｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および
配列番号７６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域、
または
（ｉｖ）配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および
配列番号７７のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域、
または
（ｖ）配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および
配列番号７８のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域、
または
（ｖｉ）配列番号２９のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および
配列番号７８のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域、
または
（ｖｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および
配列番号７８のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域、
または
（ｖｉｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および
配列番号７９のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域、
または
（ｉｘ）配列番号３２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および
配列番号７９のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域、
または
（ｘ）配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および
配列番号８０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域、
または
（ｘｉ）配列番号３４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および
配列番号８１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域、
または
（ｘｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および
配列番号８２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域、
または
（ｘｉｉｉ）配列番号３６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および
配列番号８３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域、
または
（ｘｉｖ）配列番号３７のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および
配列番号８４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域、
または
（ｘｖ）配列番号３８のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および
配列番号８５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域、
または
（ｘｖｉ）配列番号３９のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および
配列番号８６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域、
または
（ｘｖｉｉ）配列番号４０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および
配列番号８７のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域、
または
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１２７のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および
配列番号１３５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域、
または
（ｘｉｘ）配列番号１４３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および
配列番号１５０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域、
または
（ｘｘ）配列番号１５７のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および
配列番号１６４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域
を含む、項目１から４のいずれか一つに記載の抗原結合性分子。
２２．ヒトＨＥＲ３、ならびにマウスＨＥＲ３、ラットＨＥＲ３、およびカニクイザルＨＥＲ３のうちの１つまたは複数に結合することができる、項目１から２１のいずれか一つに記載の抗原結合性分子。
２３．（ｉ）項目１から２２のいずれか一つに記載の抗原結合性分子、および（ｉｉ）ＨＥＲ３以外の抗原に結合することが可能な抗原結合性分子を含む、抗原結合性分子、任意選択で、単離された抗原結合性分子。
２４．細胞表面においてＨＥＲ３を発現する細胞に結合することができる、項目１から２３のいずれか一つに記載の抗原結合性分子。
２５．ＨＥＲ３媒介性シグナル伝達を阻害することができる、項目１から２４のいずれか一つに記載の抗原結合性分子。
２６．Ｆｃ領域を含み、Ｆｃ領域が、（ｉ）２４２位に対応する位置におけるＣ、および３３４位に対応する位置におけるＣ、ならびに（ｉｉ）２３６位に対応する位置におけるＡ、２３９位に対応する位置におけるＤ、３３２位に対応する位置におけるＥ、３３０位に対応する位置におけるＬ、３４５位に対応する位置におけるＫ、および４３０位に対応する位置におけるＧのうちの１つまたは複数を有するポリペプチドを含む、項目１から２５のいずれか一つに記載の抗原結合性分子。
２７．Ｆｃ領域が、２４２位に対応する位置におけるＣ、３３４位に対応する位置におけるＣ、２３６位に対応する位置におけるＡ、２３９位に対応する位置におけるＤ、３３２位に対応する位置におけるＥ、および３３０位に対応する位置におけるＬを有するポリペプチドを含む、項目２６に記載の抗原結合性分子。
２８．項目１から２７のいずれか一つに記載の抗原結合性分子を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
２９．項目１から２７のいずれか一つに記載の抗原結合性分子、または項目２８に記載のＣＡＲをコードする、１つの核酸または複数の核酸、任意選択で、１つの単離された核酸または複数の単離された核酸。
３０．項目２９に記載の１つの核酸または複数の核酸を含む、１つの発現ベクターまたは複数の発現ベクター。
３１．項目１から２７のいずれか一つに記載の抗原結合性分子、項目２８に記載のＣＡＲ、項目２９に記載の１つの核酸もしくは複数の核酸、または項目３０に記載の１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクターを含む、細胞。
３２．項目２９に記載の１つの核酸もしくは複数の核酸、または項目３０に記載の１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクターを含む細胞を、核酸または発現ベクターからの抗原結合性分子またはＣＡＲの発現に適する条件下で培養するステップを含む、方法。
３３．項目１から２７のいずれか一つに記載の抗原結合性分子、項目２８に記載のＣＡＲ、項目２９に記載の１つの核酸もしくは複数の核酸、項目３０に記載の１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、または項目３１に記載の細胞を含む、組成物。
３４．医学的処置または予防の方法における使用のための、項目１から２７のいずれか一つに記載の抗原結合性分子、項目２８に記載のＣＡＲ、項目２９に記載の１つの核酸もしくは複数の核酸、項目３０に記載の１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、項目３１に記載の細胞、または項目３３に記載の組成物。
３５．がんの処置または予防の方法における使用のための、項目１から２７のいずれか一つに記載の抗原結合性分子、項目２８に記載のＣＡＲ、項目２９に記載の１つの核酸もしくは複数の核酸、項目３０に記載の１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、項目３１に記載の細胞、または項目３３に記載の組成物。
３６．がんの処置または予防の方法における使用のための医薬の製造における、項目１から２７のいずれか一つに記載の抗原結合性分子、項目２８に記載のＣＡＲ、項目２９に記載の１つの核酸もしくは複数の核酸、項目３０に記載の１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、項目３１に記載の細胞、または項目３３に記載の組成物の使用。
３７．がんを処置または予防する方法であって、治療または予防有効量の、項目１から２７のいずれか一つに記載の抗原結合性分子、項目２８に記載のＣＡＲ、項目２９に記載の１つの核酸もしくは複数の核酸、項目３０に記載の１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、項目３１に記載の細胞、または項目３３に記載の組成物を対象に投与するステップを含む、方法。
３８．方法が、ＥＧＦＲファミリーメンバーにより媒介されるシグナル伝達の阻害剤の投与をさらに含み、任意選択で、ＥＧＦＲファミリーメンバーにより媒介されるシグナル伝達の阻害剤が、ＨＥＲ２および／またはＥＧＦＲにより媒介されるシグナル伝達の阻害剤である、項目３４もしくは項目３５に記載の使用、項目３６に記載の使用、または項目３７に記載の方法のための、抗原結合性分子、ＣＡＲ、１つの核酸もしくは複数の核酸、１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、細胞、または組成物。
３９．がんが、ＥＧＦＲファミリーメンバーを発現する細胞を含むがん、ＨＥＲ３を発現する細胞を含むがん、固形腫瘍、乳がん、乳癌、乳管癌、胃がん、胃癌、胃腺癌、結腸直腸がん、結腸直腸癌、結腸直腸腺癌、頭頸部がん、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、肺がん、肺腺癌、扁平上皮肺癌、卵巣がん、卵巣癌、漿液性卵巣腺癌、腎がん、腎細胞癌、腎明細胞癌、腎細胞腺癌、乳頭状腎細胞癌、膵がん、膵腺癌、膵管腺癌、子宮頸がん、子宮頸部扁平上皮癌、皮膚がん、黒色腫、食道がん、食道腺癌、肝がん、肝細胞癌、胆管癌、子宮がん、子宮体内膜癌、甲状腺がん、甲状腺癌、褐色細胞腫、傍神経節腫、膀胱がん、膀胱尿路上皮癌、前立腺がん、前立腺腺癌、肉腫、および胸腺腫から選択される、項目３４から３８のいずれか一つに記載の、使用のための抗原結合性分子、ＣＡＲ、１つの核酸もしくは複数の核酸、１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、細胞、もしくは組成物、使用または方法。
４０．ＨＥＲ３媒介性シグナル伝達を阻害する方法であって、ＨＥＲ３発現細胞を、項目１から２７のいずれか一つに記載の抗原結合性分子と接触させるステップを含む、方法。
４１．ＨＥＲ３発現細胞の数または活性を低減する方法であって、ＨＥＲ３発現細胞を、項目１から２７のいずれか一つに記載の抗原結合性分子と接触させるステップを含む、方法。
４２．ＨＥＲ３に結合している、項目１から２７のいずれか一つに記載の抗原結合性分子を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ複合体、任意選択で、単離されたｉｎ ｖｉｔｒｏ複合体。
４３．ＨＥＲ３を含有するか、またはこれを含有することが疑われる試料を、項目１から２７のいずれか一つに記載の抗原結合性分子と接触させるステップと、抗原結合性分子とＨＥＲ３との複合体の形成を検出するステップとを含む、方法。
４４．対象を、ＨＥＲ３を標的化した薬剤による処置のために選択または層別化する方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、対象に由来する試料を、項目１から２７のいずれか一つに記載の抗原結合性分子と接触させるステップと、抗原結合性分子とＨＥＲ３との複合体の形成を検出するステップとを含む、方法。
４５．項目１から２７のいずれか一つに記載の抗原結合性分子の、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける診断または予後診断剤としての使用。
４６．任意選択で、がんが、ＥＧＦＲファミリーメンバーを発現する細胞を含むがん、ＨＥＲ３を発現する細胞を含むがん、固形腫瘍、乳がん、乳癌、乳管癌、胃がん、胃癌、胃腺癌、結腸直腸がん、結腸直腸癌、結腸直腸腺癌、頭頸部がん、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、肺がん、肺腺癌、扁平上皮肺癌、卵巣がん、卵巣癌、漿液性卵巣腺癌、腎がん、腎細胞癌、腎明細胞癌、腎細胞腺癌、乳頭状腎細胞癌、膵がん、膵腺癌、膵管腺癌、子宮頸がん、子宮頸部扁平上皮癌、皮膚がん、黒色腫、食道がん、食道腺癌、肝がん、肝細胞癌、胆管癌、子宮がん、子宮体内膜癌、甲状腺がん、甲状腺癌、褐色細胞腫、傍神経節腫、膀胱がん、膀胱尿路上皮癌、前立腺がん、前立腺腺癌、肉腫、および胸腺腫から選択される、がんを検出、位置特定、またはイメージングするための方法における、項目１から２７のいずれか一つに記載の抗原結合性分子の使用。
４７．ＨＥＲ３に結合することができる、抗原結合性分子、任意選択で、単離された抗原結合性分子であって、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号４６のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号５１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる重鎖可変（ＶＨ）領域、および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号９１のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号９４のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号９９のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、抗原結合性分子、任意選択で、単離された抗原結合性分子。
４８．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
配列番号４５のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
配列番号４８のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる重鎖可変（ＶＨ）領域、および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号８８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
配列番号９２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
配列番号９５のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３
を組み込んでいる軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目４７に記載の抗原結合性分子。
４９．配列番号３６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および
配列番号８３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域
を含む、項目４７または項目４８に記載の抗原結合性分子。
５０．（ｉ）項目４７から４９のいずれか一つに記載の抗原結合性分子と、（ｉｉ）ＨＥＲ３以外の抗原に結合することができる抗原結合性分子とを含む、抗原結合性分子、任意選択で、単離された抗原結合性分子。
５１．項目４７から５０のいずれか一つに記載の抗原結合性分子を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
５２．項目４７から５０のいずれか一つに記載の抗原結合性分子、または項目５１に記載のＣＡＲをコードする、１つの核酸または複数の核酸、任意選択で、１つの単離された核酸または複数の単離された核酸。
５３．項目５２に記載の１つの核酸または複数の核酸を含む、１つの発現ベクターまたは複数の発現ベクター。
５４．項目４７から５０のいずれか一つに記載の抗原結合性分子、項目５１に記載のＣＡＲ、項目５２に記載の１つの核酸もしくは複数の核酸、または項目５３に記載の１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクターを含む、細胞。
５５．項目５２に記載の１つの核酸もしくは複数の核酸、または項目５３に記載の１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクターを含む細胞を、核酸または発現ベクターからの抗原結合性分子またはＣＡＲの発現に適する条件下で培養するステップを含む、方法。
５６．項目４７から５０のいずれか一つに記載の抗原結合性分子、項目５１に記載のＣＡＲ、項目５２に記載の１つの核酸もしくは複数の核酸、項目５３に記載の１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、または項目５４に記載の細胞を含む、組成物。
５７．医学的処置または予防の方法における使用のための、項目４７から５０のいずれか一つに記載の抗原結合性分子、項目５１に記載のＣＡＲ、項目５２に記載の１つの核酸もしくは複数の核酸、項目５３に記載の１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、項目５４に記載の細胞、または項目５６に記載の組成物。
５８．がんの処置または予防の方法における使用のための、項目４７から５０のいずれか一つに記載の抗原結合性分子、項目５１に記載のＣＡＲ、項目５２に記載の１つの核酸もしくは複数の核酸、項目５３に記載の１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、項目５４に記載の細胞、または項目５６に記載の組成物。
５９．がんの処置または予防の方法における使用のための医薬の製造における、項目４７から５０のいずれか一つに記載の抗原結合性分子、項目５１に記載のＣＡＲ、項目５２に記載の１つの核酸もしくは複数の核酸、項目５３に記載の１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、項目５４に記載の細胞、または項目５６に記載の組成物の使用。
６０．がんを処置または予防する方法であって、治療または予防有効量の、項目４７から５０のいずれか一つに記載の抗原結合性分子、項目５１に記載のＣＡＲ、項目５２に記載の１つの核酸もしくは複数の核酸、項目５３に記載の１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、項目５４に記載の細胞、または項目５６に記載の組成物を対象に投与するステップを含む、方法。
６１．方法が、ＥＧＦＲファミリーメンバーにより媒介されるシグナル伝達の阻害剤の投与をさらに含み、任意選択で、ＥＧＦＲファミリーメンバーにより媒介されるシグナル伝達の阻害剤が、ＨＥＲ２および／またはＥＧＦＲにより媒介されるシグナル伝達の阻害剤である、項目５７もしくは項目５８に記載の使用、項目５９に記載の使用、または項目６０に記載の方法のための、抗原結合性分子、ＣＡＲ、１つの核酸もしくは複数の核酸、１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、細胞、または組成物。
６２．がんが、ＥＧＦＲファミリーメンバーを発現する細胞を含むがん、ＨＥＲ３を発現する細胞を含むがん、固形腫瘍、乳がん、乳癌、乳管癌、胃がん、胃癌、胃腺癌、結腸直腸がん、結腸直腸癌、結腸直腸腺癌、頭頸部がん、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、肺がん、肺腺癌、扁平上皮肺癌、卵巣がん、卵巣癌、漿液性卵巣腺癌、腎がん、腎細胞癌、腎明細胞癌、腎細胞腺癌、乳頭状腎細胞癌、膵がん、膵腺癌、膵管腺癌、子宮頸がん、子宮頸部扁平上皮癌、皮膚がん、黒色腫、食道がん、食道腺癌、肝がん、肝細胞癌、胆管癌、子宮がん、子宮体内膜癌、甲状腺がん、甲状腺癌、褐色細胞腫、傍神経節腫、膀胱がん、膀胱尿路上皮癌、前立腺がん、前立腺腺癌、肉腫、および胸腺腫から選択される、項目５７から６１のいずれか一つに記載の、使用のための抗原結合性分子、ＣＡＲ、１つの核酸もしくは複数の核酸、１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、細胞、もしくは組成物、使用または方法。
６３．ＨＥＲ３媒介性シグナル伝達を阻害する方法であって、ＨＥＲ３発現細胞を、項目４７から５０のいずれか一つに記載の抗原結合性分子と接触させるステップを含む、方法。
６４．ＨＥＲ３発現細胞の数または活性を低減する方法であって、ＨＥＲ３発現細胞を、項目４７から５０のいずれか一つに記載の抗原結合性分子と接触させるステップを含む、方法。
６５．ＨＥＲ３に結合している、項目４７から５０のいずれか一つに記載の抗原結合性分子を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ複合体、任意選択で、単離されたｉｎ ｖｉｔｒｏ複合体。
６６．ＨＥＲ３を含有するか、またはこれを含有することが疑われる試料を、項目４７から５０のいずれか一つに記載の抗原結合性分子と接触させるステップと、抗原結合性分子とＨＥＲ３との複合体の形成を検出するステップとを含む、方法。
６７．対象を、ＨＥＲ３を標的化した薬剤による処置のために選択または層別化する方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、対象に由来する試料を、項目４７から５０のいずれか一つに記載の抗原結合性分子と接触させるステップと、抗原結合性分子とＨＥＲ３との複合体の形成を検出するステップとを含む、方法。
６８．項目４７から５０のいずれか一つに記載の抗原結合性分子の、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける診断または予後診断剤としての使用。
６９．任意選択で、がんが、ＥＧＦＲファミリーメンバーを発現する細胞を含むがん、ＨＥＲ３を発現する細胞を含むがん、固形腫瘍、乳がん、乳癌、乳管癌、胃がん、胃癌、胃腺癌、結腸直腸がん、結腸直腸癌、結腸直腸腺癌、頭頸部がん、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、肺がん、肺腺癌、扁平上皮肺癌、卵巣がん、卵巣癌、漿液性卵巣腺癌、腎がん、腎細胞癌、腎明細胞癌、腎細胞腺癌、乳頭状腎細胞癌、膵がん、膵腺癌、膵管腺癌、子宮頸がん、子宮頸部扁平上皮癌、皮膚がん、黒色腫、食道がん、食道腺癌、肝がん、肝細胞癌、胆管癌、子宮がん、子宮体内膜癌、甲状腺がん、甲状腺癌、褐色細胞腫、傍神経節腫、膀胱がん、膀胱尿路上皮癌、前立腺がん、前立腺腺癌、肉腫、および胸腺腫から選択される、がんを検出、位置特定、またはイメージングするための方法における、項目４７から５０のいずれか一つに記載の抗原結合性分子の使用。
本発明は、このような組合せが、明らかに許容されないか、または明示的に回避される場合を除き、記載される態様と好ましい特徴との組合せを含む。
本明細書で使用される節の小見出しは、構成上の目的だけのものであり、記載される対象物を限定するものと見なすべきではない。
ここで、付属の図面を参照しながら、例を目的として、本発明の態様および実施形態が例示される。当業者には、さらなる態様および実施形態が明らかであろう。本文で言及される全ての文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
後続の特許請求の範囲を含む、本明細書を通して、文脈によりそうでないことが要求されない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと」などの変化形は、言明された整数またはステップまたは整数もしくはステップの群の包含を含意し、他の任意の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の除外は含意しないように理解される。
そうでないことが文脈により明確に指示されない限り、本明細書および付属の特許請求の範囲において使用される単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」は、複数の指示対象を含むことに注意されたい。本明細書では、範囲は、「約」１つの特定の値から、かつ／または「約」別の特定の値までの範囲として表され得る。このような範囲が表される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、かつ／または他の特定の値までの範囲を含む。同様に、値が、先行詞である「約」の使用により、近似値として表される場合、特定の値は、別の実施形態を形成することが理解されるであろう。
本明細書で核酸配列が開示される場合、その逆相補体もまた、明示的に想定される。
本明細書で記載される方法は、好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて実施され得る。「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語が、培養物中の細胞に対して実施される手順を包含することが意図されるのに対し、「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は、無傷の多細胞生物に対する／上の手順を包含することが意図される。
ここで、付属の図を参照しながら、本発明の原理を例示する実施形態および実験が論じられる。
フローサイトメトリーにより決定される、抗ＨＥＲ３抗体による細胞の染色を示すヒストグラムである。ヒストグラムは、（１Ａ、１Ｂ）抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１、および（１Ｂ）抗ＨＥＲ３抗体クローンＬＪＭ７１６による、ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＲ３を発現しない）、またはＨＥＫ２９３ ＨＥＲ３過剰発現細胞（ＨＥＫ２９３ ＨＥＲ３ Ｏ／Ｅ）の染色を示す。 フローサイトメトリーにより決定される、抗ＨＥＲ３抗体による細胞の染色を示すヒストグラムである。ヒストグラムは、（２Ａ、２Ｂ）抗ＨＥＲ３抗体クローン４－３５－Ｂ２、および（２Ｂ）抗ＨＥＲ３抗体クローンＬＪＭ７１６による、ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＲ３を発現しない）、またはＨＥＫ２９３ ＨＥＲ３過剰発現細胞（ＨＥＫ２９３ ＨＥＲ３ Ｏ／Ｅ）の染色を示す。 フローサイトメトリーにより決定される、抗ＨＥＲ３抗体による細胞の染色を示すヒストグラムである。ヒストグラムは、（３Ａ、３Ｂ）抗ＨＥＲ３抗体クローン４－３５－Ｂ４、および（３Ｂ）抗ＨＥＲ３抗体クローンＬＪＭ７１６による、ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＲ３を発現しない）、またはＨＥＫ２９３ ＨＥＲ３過剰発現細胞（ＨＥＫ２９３ ＨＥＲ３ Ｏ／Ｅ）の染色を示す。 フローサイトメトリーにより決定される、抗ＨＥＲ３抗体による細胞の染色を示すヒストグラムである。ヒストグラムは、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ａ６によるＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＲ３を発現しない）、またはＨＥＫ２９３ ＨＥＲ３過剰発現細胞（ＨＥＫ２９３ ＨＥＲ３ Ｏ／Ｅ）の染色を示す。 （５Ａ）ヒト、マウス、ラット、およびカニクイザルＨＥＲ３、ならびに（５Ｂ）ヒトＥＧＦＲおよびヒトＨＥＲ２への抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１の結合についてのＥＬＩＳＡ解析の結果を示すグラフである。ＥＣ５０値を示す。 （５Ａ）ヒト、マウス、ラット、およびカニクイザルＨＥＲ３、ならびに（５Ｂ）ヒトＥＧＦＲおよびヒトＨＥＲ２への抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１の結合についてのＥＬＩＳＡ解析の結果を示すグラフである。ＥＣ５０値を示す。 （６Ａ）ヒト、マウス、ラット、およびカニクイザルＨＥＲ３、ならびに（６Ｂ）ヒトＥＧＦＲおよびヒトＨＥＲ２への抗ＨＥＲ３抗体クローン４－３５－Ｂ２の結合についてのＥＬＩＳＡ解析の結果を示すグラフである。 （６Ａ）ヒト、マウス、ラット、およびカニクイザルＨＥＲ３、ならびに（６Ｂ）ヒトＥＧＦＲおよびヒトＨＥＲ２への抗ＨＥＲ３抗体クローン４－３５－Ｂ２の結合についてのＥＬＩＳＡ解析の結果を示すグラフである。 （７Ａ）ヒトＨＥＲ３、ヒトＥＧＦＲ、およびヒトＨＥＲ２、ならびに（７Ｂ）ヒト、マウス、ラット、およびカニクイザルＨＥＲ３への抗ＨＥＲ３抗体クローン４－３５－Ｂ４の結合についてのＥＬＩＳＡ解析の結果を示すグラフである。 （７Ａ）ヒトＨＥＲ３、ヒトＥＧＦＲ、およびヒトＨＥＲ２、ならびに（７Ｂ）ヒト、マウス、ラット、およびカニクイザルＨＥＲ３への抗ＨＥＲ３抗体クローン４－３５－Ｂ４の結合についてのＥＬＩＳＡ解析の結果を示すグラフである。 ヒトＨＥＲ３に対する抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１の結合親和性についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムである。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。 ヒトＨＥＲ３に対する抗ＨＥＲ３抗体クローン４－３５－Ｂ２の結合親和性についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムである。 ヒトＨＥＲ３に対する抗ＨＥＲ３抗体クローン４－３５－Ｂ４の結合親和性についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムである。 示差走査蛍光測定解析による抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１の安定性についての解析の結果を示すグラフである。 サイズ排除クロマトグラフィーによる組換え発現された抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１についての解析の結果を示すグラフである。 ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによる抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１の発現についての解析の結果を示す画像である。レーン：Ｍ１＝型番３４５２のＴａＫａＲａタンパク質マーカー；Ｍ２＝型番Ｍ００５２１のＧｅｎＳｃｒｉｐｔタンパク質マーカー；１＝還元条件；２＝非還元条件；Ｐ＝陽性対照：ヒトＩｇＧ１、カッパ（Ｓｉｇｍａ型番Ｉ５１５４）。ウェスタンブロットに関して、使用した一次抗体は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ型番Ａ００１６６）、およびヤギ抗ヒトカッパ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｅｒｈｎＢｉｏｔｅｃｈ型番２０６０－０５）であった。 ＨＥＲ３への結合についての異なる抗ＨＥＲ３抗体クローンの間の競合についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムおよび表である。 ＨＥＲ３への結合についての異なる抗ＨＥＲ３抗体クローンの間の競合についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムおよび表である。 ＥＬＩＳＡにより決定される、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１による、ＨＥＲ３とＨＥＲ２との相互作用の阻害についての解析の結果を示すグラフである。 異なるがん細胞株によるＥＧＦＲタンパク質ファミリーメンバーおよびそれらのリガンドの遺伝子およびタンパク質の発現を示す表およびヒストグラムである。 異なるがん細胞株によるＥＧＦＲタンパク質ファミリーメンバーおよびそれらのリガンドの遺伝子およびタンパク質の発現を示す表およびヒストグラムである。 ホスホウェスタンブロットによる、Ｎ８７およびＦａＤｕ細胞におけるＨＥＲ３媒介性シグナル伝達に対する、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１による処置の効果についての解析の結果を示す画像である。ＵＮ＝無処置；Ｔ＝抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１による処置。 Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙアッセイキットを使用した、ＦａＤｕ細胞におけるＨＥＲ３媒介性シグナル伝達に対する、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１による処置の効果についての解析の結果を示す画像およびグラフである。無処置＝無処置ＦａＤｕ細胞；処置＝抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１により処置したＦａＤｕ細胞。 抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１の存在下でのインキュベーション後、ＣＣＫ８アッセイにより決定される、示した細胞株についての、無処置対照条件（１００％）と比べた、細胞のコンフルエンスのパーセントを示すグラフである。（１９Ａ）Ｎ８７細胞について得られた結果を示し、（１９Ｂ）ＦａＤｕ細胞について得られた結果を示す。 Ｎ８７細胞株に由来するマウス胃癌モデルにおける経時的な腫瘍体積についての解析の結果を示すグラフである。抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１を、投与１回当たり５００μｇ、隔週で、合計１０回の投与でＩＰ投与した。対照処置群には、等容積のＰＢＳ（ビヒクル）を与えた。 Ｎ８７細胞株に由来するマウス胃癌モデルにおける経時的な腫瘍体積についての解析の結果を示すグラフである。抗ＨＥＲ３抗体クローン４－３５－Ｂ２を、投与１回当たり１１ｍｇ／ｋｇ、毎週で、合計４回の投与でＩＰ投与した。対照処置群には、等量のアイソタイプ対照抗体（アイソタイプ）を与えた。 ＳＮＵ１６細胞株に由来するマウス胃癌モデルにおける経時的な腫瘍体積についての解析の結果を示すグラフである。抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１を、投与１回当たり５００μｇ、隔週で、合計９回の投与でＩＰ投与した。対照処置群には、等容積のＰＢＳ（ビヒクル）を与えた。 ＦａＤｕ細胞株に由来する頭頸部扁平上皮癌のマウスモデルにおける経時的な腫瘍体積についての解析の結果を示すグラフである。抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１を、投与１回当たり５００μｇ、毎週で、合計４回の投与でＩＰ投与した。対照処置群には、等容積のＰＢＳ（ビヒクル）、または同用量のアイソタイプ対照抗体（アイソタイプ）を与えた。 ＦａＤｕ細胞株に由来する頭頸部扁平上皮癌のマウスモデルにおける経時的な腫瘍体積についての解析の結果を示すグラフである。抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１を、投与１回当たり５００μｇ、隔週で、合計８回の投与でＩＰ投与した。対照処置群には、等容積のＰＢＳ（ビヒクル）を与えた。 ＯｖＣＡＲ８細胞株に由来する卵巣癌のマウスモデルにおける経時的な腫瘍体積についての解析の結果を示すグラフである。抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１を、投与１回当たり５００μｇ、隔週で、合計９回の投与でＩＰ投与した。対照処置群には、等容積のＰＢＳ（ビヒクル）を与えた。 ＨＣＣ－９５細胞株に由来する扁平上皮肺細胞癌のマウスモデルにおける経時的な腫瘍体積についての解析の結果を示すグラフである。抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１を、投与１回当たり５００μｇ、隔週で、合計４回の投与でＩＰ投与した。対照処置群には、等容積のＰＢＳ（ビヒクル）を与えた。 Ａ５４９細胞株に由来する肺腺癌のマウスモデルにおける経時的な腫瘍体積についての解析の結果を示すグラフである。抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１を、投与１回当たり５００μｇ、隔週で、合計１０回の投与でＩＰ投与した。対照処置群には、等容積のＰＢＳ（ビヒクル）を与えた。 Ａ５４９細胞株に由来する肺腺癌のマウスモデルにおける経時的な腫瘍体積についての解析の結果を示すグラフである。抗ＨＥＲ３抗体クローン４－３５－Ｂ２を、投与１回当たり５００μｇ、隔週で、合計４回の投与でＩＰ投与した。対照処置群には、等容積のＰＢＳ（ビヒクル）を与えた。 ＡＣＨＮ細胞株に由来する腎細胞癌のマウスモデルにおける経時的な腫瘍体積についての解析の結果を示すグラフである。抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１を、投与１回当たり５００μｇ、隔週で、合計７回の投与でＩＰ投与した。対照処置群には、等容積のＰＢＳ（ビヒクル）を与えた。 フローサイトメトリーにより決定される、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１＿ｃ８９による細胞の染色を示すヒストグラムである。ヒストグラムは、ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＲ３を発現しない）、またはＨＥＫ２９３ ＨＥＲ３過剰発現細胞（ＨＥＫ２９３ ＨＥＲ３ Ｏ／Ｅ）の染色を示す。 フローサイトメトリーにより決定される、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１＿ｃ９０による細胞の染色を示すヒストグラムである。ヒストグラムは、ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＲ３を発現しない）、またはＨＥＫ２９３ ＨＥＲ３過剰発現細胞（ＨＥＫ２９３ ＨＥＲ３ Ｏ／Ｅ）の染色を示す。 フローサイトメトリーにより決定される、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１＿ｃ９１による細胞の染色を示すヒストグラムである。ヒストグラムは、ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＲ３を発現しない）、またはＨＥＫ２９３ ＨＥＲ３過剰発現細胞（ＨＥＫ２９３ ＨＥＲ３ Ｏ／Ｅ）の染色を示す。 ヒトＨＥＲ３への抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１のバリアントクローンの結合についてのＥＬＩＳＡ解析の結果を示すグラフである。（３３Ａ）は、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１（１０Ｄ１Ｐと称される）、１０Ｄ１＿ｃ７５、１０Ｄ１＿ｃ７６、１０Ｄ１＿ｃ７７、１０Ｄ１＿ｃ７８、１０Ｄ１＿１１Ｂ（ｖ１１ｂ７８Ｌと称される）、１０Ｄ１＿ｃ８５、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２、１０Ｄ１＿ｃ８７、１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿ｃ９０、１０Ｄ１＿ｃ９１、１０Ｄ１＿ｃ９３、ＬＪＭ７１６、およびｈＩｇＧ（陰性対照）の結合を示す。（３３Ｂ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿ｃ９０、１０Ｄ１＿ｃ９１、およびＬＪＭ７１６だけである点を除き、３３Ａと同じデータを示す。 ヒトＨＥＲ３への抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１のバリアントクローンの結合についてのＥＬＩＳＡ解析の結果を示すグラフである。（３３Ａ）は、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１（１０Ｄ１Ｐと称される）、１０Ｄ１＿ｃ７５、１０Ｄ１＿ｃ７６、１０Ｄ１＿ｃ７７、１０Ｄ１＿ｃ７８、１０Ｄ１＿１１Ｂ（ｖ１１ｂ７８Ｌと称される）、１０Ｄ１＿ｃ８５、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２、１０Ｄ１＿ｃ８７、１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿ｃ９０、１０Ｄ１＿ｃ９１、１０Ｄ１＿ｃ９３、ＬＪＭ７１６、およびｈＩｇＧ（陰性対照）の結合を示す。（３３Ｂ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿ｃ９０、１０Ｄ１＿ｃ９１、およびＬＪＭ７１６だけである点を除き、３３Ａと同じデータを示す。 サイズ排除クロマトグラフィーによる、組換え発現された抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１のバリアントクローンについての解析の結果を示すグラフである。（３４Ａ）は、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１＿ｃ９３、１０Ｄ１＿ｃ７５、１０Ｄ１＿ｃ７６、１０Ｄ１＿ｃ７７、１０Ｄ１＿ｃ７８、１０Ｄ１＿１１Ｂ（Ｃ７８ ｖ１１ｂと称される）、１０Ｄ１＿ｃ８５、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２、１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿ｃ９０、１０Ｄ１＿ｃ９１、および１０Ｄ１＿ｃ９３についての結果を示す。（３４Ｂ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿ｃ９０、１０Ｄ１＿ｃ９１だけである点を除き、３３Ａと同じデータを示す。 サイズ排除クロマトグラフィーによる、組換え発現された抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１のバリアントクローンについての解析の結果を示すグラフである。（３４Ａ）は、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１＿ｃ９３、１０Ｄ１＿ｃ７５、１０Ｄ１＿ｃ７６、１０Ｄ１＿ｃ７７、１０Ｄ１＿ｃ７８、１０Ｄ１＿１１Ｂ（Ｃ７８ ｖ１１ｂと称される）、１０Ｄ１＿ｃ８５、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２、１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿ｃ９０、１０Ｄ１＿ｃ９１、および１０Ｄ１＿ｃ９３についての結果を示す。（３４Ｂ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿ｃ９０、１０Ｄ１＿ｃ９１だけである点を除き、３３Ａと同じデータを示す。 示差走査蛍光測定解析による、抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１のバリアントクローンの安定性についての解析の結果を示すグラフである。（３５Ａ）は、抗ＨＥＲ３抗体クローンＬＪＭ７１６（エルゲムツマブとも称される）、１０Ｄ１（１０Ｄ１（親）と称される）、１０Ｄ１＿ｃ７５、１０Ｄ１＿ｃ７６、１０Ｄ１＿ｃ７７、および１０Ｄ１＿ｃ７８についての結果を示す。（３５Ｂ）は、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２、１０Ｄ１＿ｃ８７、１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿１１Ｂ（ｃ７８＿Ｖ１１Ｂと称される）、１０Ｄ１＿ｃ８５、および１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１についての結果を示す。（３５Ｃ）は、１０Ｄ１＿ｃ９０、１０Ｄ１＿ｃ９１、および１０Ｄ１＿ｃ９３についての結果を示す。 示差走査蛍光測定解析による、抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１のバリアントクローンの安定性についての解析の結果を示すグラフである。（３５Ａ）は、抗ＨＥＲ３抗体クローンＬＪＭ７１６（エルゲムツマブとも称される）、１０Ｄ１（１０Ｄ１（親）と称される）、１０Ｄ１＿ｃ７５、１０Ｄ１＿ｃ７６、１０Ｄ１＿ｃ７７、および１０Ｄ１＿ｃ７８についての結果を示す。（３５Ｂ）は、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２、１０Ｄ１＿ｃ８７、１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿１１Ｂ（ｃ７８＿Ｖ１１Ｂと称される）、１０Ｄ１＿ｃ８５、および１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１についての結果を示す。（３５Ｃ）は、１０Ｄ１＿ｃ９０、１０Ｄ１＿ｃ９１、および１０Ｄ１＿ｃ９３についての結果を示す。 示差走査蛍光測定解析による、抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１のバリアントクローンの安定性についての解析の結果を示すグラフである。（３５Ａ）は、抗ＨＥＲ３抗体クローンＬＪＭ７１６（エルゲムツマブとも称される）、１０Ｄ１（１０Ｄ１（親）と称される）、１０Ｄ１＿ｃ７５、１０Ｄ１＿ｃ７６、１０Ｄ１＿ｃ７７、および１０Ｄ１＿ｃ７８についての結果を示す。（３５Ｂ）は、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２、１０Ｄ１＿ｃ８７、１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿１１Ｂ（ｃ７８＿Ｖ１１Ｂと称される）、１０Ｄ１＿ｃ８５、および１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１についての結果を示す。（３５Ｃ）は、１０Ｄ１＿ｃ９０、１０Ｄ１＿ｃ９１、および１０Ｄ１＿ｃ９３についての結果を示す。 ヒトＨＥＲ３に対する抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１のバリアントクローンの親和性についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムである。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。（３６Ａ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８９についての結果を示し、（３６Ｂ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９０についての結果を示し、（３６Ｃ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９１についての結果を示し、（３６Ｄ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ１１Ｂについての結果を示し、（３６Ｅ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２についての結果を示し、（３６Ｆ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８７についての結果を示し、（３６Ｇ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９３についての結果を示し、（３６Ｈ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７６についての結果を示し、（３６Ｉ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７７についての結果を示し、（３６Ｊ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７８についての結果を示し、（３６Ｋ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７５についての結果を示し、（３６Ｌ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５についての結果を示し、（３６Ｍ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１についての結果を示す。 ヒトＨＥＲ３に対する抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１のバリアントクローンの親和性についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムである。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。（３６Ａ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８９についての結果を示し、（３６Ｂ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９０についての結果を示し、（３６Ｃ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９１についての結果を示し、（３６Ｄ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ１１Ｂについての結果を示し、（３６Ｅ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２についての結果を示し、（３６Ｆ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８７についての結果を示し、（３６Ｇ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９３についての結果を示し、（３６Ｈ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７６についての結果を示し、（３６Ｉ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７７についての結果を示し、（３６Ｊ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７８についての結果を示し、（３６Ｋ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７５についての結果を示し、（３６Ｌ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５についての結果を示し、（３６Ｍ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１についての結果を示す。 ヒトＨＥＲ３に対する抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１のバリアントクローンの親和性についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムである。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。（３６Ａ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８９についての結果を示し、（３６Ｂ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９０についての結果を示し、（３６Ｃ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９１についての結果を示し、（３６Ｄ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ１１Ｂについての結果を示し、（３６Ｅ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２についての結果を示し、（３６Ｆ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８７についての結果を示し、（３６Ｇ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９３についての結果を示し、（３６Ｈ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７６についての結果を示し、（３６Ｉ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７７についての結果を示し、（３６Ｊ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７８についての結果を示し、（３６Ｋ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７５についての結果を示し、（３６Ｌ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５についての結果を示し、（３６Ｍ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１についての結果を示す。 ヒトＨＥＲ３に対する抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１のバリアントクローンの親和性についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムである。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。（３６Ａ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８９についての結果を示し、（３６Ｂ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９０についての結果を示し、（３６Ｃ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９１についての結果を示し、（３６Ｄ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ１１Ｂについての結果を示し、（３６Ｅ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２についての結果を示し、（３６Ｆ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８７についての結果を示し、（３６Ｇ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９３についての結果を示し、（３６Ｈ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７６についての結果を示し、（３６Ｉ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７７についての結果を示し、（３６Ｊ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７８についての結果を示し、（３６Ｋ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７５についての結果を示し、（３６Ｌ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５についての結果を示し、（３６Ｍ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１についての結果を示す。 ヒトＨＥＲ３に対する抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１のバリアントクローンの親和性についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムである。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。（３６Ａ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８９についての結果を示し、（３６Ｂ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９０についての結果を示し、（３６Ｃ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９１についての結果を示し、（３６Ｄ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ１１Ｂについての結果を示し、（３６Ｅ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２についての結果を示し、（３６Ｆ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８７についての結果を示し、（３６Ｇ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９３についての結果を示し、（３６Ｈ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７６についての結果を示し、（３６Ｉ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７７についての結果を示し、（３６Ｊ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７８についての結果を示し、（３６Ｋ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７５についての結果を示し、（３６Ｌ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５についての結果を示し、（３６Ｍ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１についての結果を示す。 ヒトＨＥＲ３に対する抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１のバリアントクローンの親和性についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムである。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。（３６Ａ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８９についての結果を示し、（３６Ｂ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９０についての結果を示し、（３６Ｃ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９１についての結果を示し、（３６Ｄ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ１１Ｂについての結果を示し、（３６Ｅ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２についての結果を示し、（３６Ｆ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８７についての結果を示し、（３６Ｇ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９３についての結果を示し、（３６Ｈ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７６についての結果を示し、（３６Ｉ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７７についての結果を示し、（３６Ｊ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７８についての結果を示し、（３６Ｋ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７５についての結果を示し、（３６Ｌ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５についての結果を示し、（３６Ｍ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１についての結果を示す。 ヒトＨＥＲ３に対する抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１のバリアントクローンの親和性についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムである。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。（３６Ａ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８９についての結果を示し、（３６Ｂ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９０についての結果を示し、（３６Ｃ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９１についての結果を示し、（３６Ｄ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ１１Ｂについての結果を示し、（３６Ｅ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２についての結果を示し、（３６Ｆ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８７についての結果を示し、（３６Ｇ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９３についての結果を示し、（３６Ｈ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７６についての結果を示し、（３６Ｉ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７７についての結果を示し、（３６Ｊ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７８についての結果を示し、（３６Ｋ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７５についての結果を示し、（３６Ｌ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５についての結果を示し、（３６Ｍ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１についての結果を示す。 ヒトＨＥＲ３に対する抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１のバリアントクローンの親和性についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムである。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。（３６Ａ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８９についての結果を示し、（３６Ｂ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９０についての結果を示し、（３６Ｃ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９１についての結果を示し、（３６Ｄ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ１１Ｂについての結果を示し、（３６Ｅ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２についての結果を示し、（３６Ｆ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８７についての結果を示し、（３６Ｇ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９３についての結果を示し、（３６Ｈ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７６についての結果を示し、（３６Ｉ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７７についての結果を示し、（３６Ｊ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７８についての結果を示し、（３６Ｋ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７５についての結果を示し、（３６Ｌ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５についての結果を示し、（３６Ｍ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１についての結果を示す。 ヒトＨＥＲ３に対する抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１のバリアントクローンの親和性についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムである。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。（３６Ａ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８９についての結果を示し、（３６Ｂ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９０についての結果を示し、（３６Ｃ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９１についての結果を示し、（３６Ｄ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ１１Ｂについての結果を示し、（３６Ｅ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２についての結果を示し、（３６Ｆ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８７についての結果を示し、（３６Ｇ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９３についての結果を示し、（３６Ｈ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７６についての結果を示し、（３６Ｉ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７７についての結果を示し、（３６Ｊ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７８についての結果を示し、（３６Ｋ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７５についての結果を示し、（３６Ｌ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５についての結果を示し、（３６Ｍ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１についての結果を示す。 ヒトＨＥＲ３に対する抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１のバリアントクローンの親和性についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムである。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。（３６Ａ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８９についての結果を示し、（３６Ｂ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９０についての結果を示し、（３６Ｃ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９１についての結果を示し、（３６Ｄ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ１１Ｂについての結果を示し、（３６Ｅ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２についての結果を示し、（３６Ｆ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８７についての結果を示し、（３６Ｇ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９３についての結果を示し、（３６Ｈ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７６についての結果を示し、（３６Ｉ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７７についての結果を示し、（３６Ｊ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７８についての結果を示し、（３６Ｋ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７５についての結果を示し、（３６Ｌ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５についての結果を示し、（３６Ｍ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１についての結果を示す。 ヒトＨＥＲ３に対する抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１のバリアントクローンの親和性についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムである。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。（３６Ａ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８９についての結果を示し、（３６Ｂ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９０についての結果を示し、（３６Ｃ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９１についての結果を示し、（３６Ｄ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ１１Ｂについての結果を示し、（３６Ｅ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２についての結果を示し、（３６Ｆ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８７についての結果を示し、（３６Ｇ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９３についての結果を示し、（３６Ｈ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７６についての結果を示し、（３６Ｉ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７７についての結果を示し、（３６Ｊ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７８についての結果を示し、（３６Ｋ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７５についての結果を示し、（３６Ｌ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５についての結果を示し、（３６Ｍ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１についての結果を示す。 ヒトＨＥＲ３に対する抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１のバリアントクローンの親和性についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムである。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。（３６Ａ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８９についての結果を示し、（３６Ｂ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９０についての結果を示し、（３６Ｃ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９１についての結果を示し、（３６Ｄ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ１１Ｂについての結果を示し、（３６Ｅ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２についての結果を示し、（３６Ｆ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８７についての結果を示し、（３６Ｇ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９３についての結果を示し、（３６Ｈ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７６についての結果を示し、（３６Ｉ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７７についての結果を示し、（３６Ｊ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７８についての結果を示し、（３６Ｋ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７５についての結果を示し、（３６Ｌ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５についての結果を示し、（３６Ｍ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１についての結果を示す。 ヒトＨＥＲ３に対する抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１のバリアントクローンの親和性についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムである。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。（３６Ａ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８９についての結果を示し、（３６Ｂ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９０についての結果を示し、（３６Ｃ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９１についての結果を示し、（３６Ｄ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ１１Ｂについての結果を示し、（３６Ｅ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２についての結果を示し、（３６Ｆ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８７についての結果を示し、（３６Ｇ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ９３についての結果を示し、（３６Ｈ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７６についての結果を示し、（３６Ｉ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７７についての結果を示し、（３６Ｊ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７８についての結果を示し、（３６Ｋ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ７５についての結果を示し、（３６Ｌ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５についての結果を示し、（３６Ｍ）は、クローン１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１についての結果を示す。 安全性および開発可能性に関する抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１のバリアントクローンの特性をまとめている表である。 ＣＨ２領域内にＧＡＳＤＡＬＩＥおよびＬＣＫＣ置換を含む、Ｆｃ修飾抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１についてのバイオレイヤー干渉解析（３８Ａ）および熱安定性解析（３８Ｂ）を示す図である。（３８Ａ）ＢＬＩは、Ｆｃ修飾抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１によるＦｃγＲＩＩＩａに対する結合親和性についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムを示す。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。 （３９Ａ）非Ｆｃ修飾抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１、および（３９Ｂ）ＣＨ２領域内にＧＡＳＤ置換を含むＦｃ修飾抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１によるＦｃγＲＩＩＩａに対する結合親和性についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムである。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。 示差走査蛍光測定解析による抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１のＧＡＳＤバリアントの安定性についての解析の結果を示すグラフである。 抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡおよび１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢ（ＧＡＳＤＡＬＩＥ－ＬＣＫＣバリアント）のマウスおよびヒトＦｃ受容体に対する結合親和性を、サイレントバリアントＮ２９７Ｑ、アイソフォームバリアント、および市販の抗体と比較して示す表である。ＮＤ＝低結合親和性のために決定されていないＫＤ。 抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡおよび１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢ（ＧＡＳＤＡＬＩＥ－ＬＣＫＣバリアント）のマウスおよびヒトＦｃ受容体に対する結合親和性を、サイレントバリアントＮ２９７Ｑ、アイソフォームバリアント、および市販の抗体と比較して示す表である。ＮＤ＝低結合親和性のために決定されていないＫＤ。 フローサイトメトリーにより決定される抗ＨＥＲ３抗体による細胞の染色を示すヒストグラムである。ヒストグラムは、（４２Ａ）抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、ならびに（４２Ｂ）抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１およびＬＪＭ－７１６による、ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＲ３を発現しない）、またはＨＥＫ２９３ ＨＥＲ３過剰発現細胞（ＨＥＫ２９３ ＨＥＲ３ Ｏ／Ｅ）の染色を示す。 フローサイトメトリーにより決定される抗ＨＥＲ３抗体による細胞の染色を示すヒストグラムである。ヒストグラムは、（４２Ａ）抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、ならびに（４２Ｂ）抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１およびＬＪＭ－７１６による、ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＲ３を発現しない）、またはＨＥＫ２９３ ＨＥＲ３過剰発現細胞（ＨＥＫ２９３ ＨＥＲ３ Ｏ／Ｅ）の染色を示す。 ヒトＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）およびヒトＨＥＲ２への抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡの結合についてのＥＬＩＳＡ解析の結果を示すグラフである。ＥＣ５０値を示す。 フローサイトメトリーにより決定される抗ＨＥＲ３および抗ＨＥＲ４抗体による細胞の染色を示すヒストグラムである。ヒストグラムは、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、抗ＨＥＲ３抗体ＬＪＭ－７１６およびＭＭ－１２１、ならびに市販の抗ＨＥＲ４抗体によるＨＥＫ２９３ ＨＥＲ４過剰発現細胞の染色を示す。 ヒト、マウス、ラット、およびカニクイザルＨＥＲ３への抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡの結合についてのＥＬＩＳＡ解析の結果を示すグラフである。ＥＣ５０値を示す。 ヒトＨＥＲ３に対する抗ＨＥＲ３抗体クローン（４６Ａ）１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、および（４６Ｂ）１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢの結合親和性についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムである。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。 ヒトＨＥＲ３に対する抗ＨＥＲ３抗体クローン（４６Ａ）１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、および（４６Ｂ）１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢの結合親和性についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムである。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。 示差走査蛍光測定解析による抗ＨＥＲ３抗体クローン（４７Ａ）１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、および（４７Ｂ）１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢについての安定性の解析の結果を示すグラフである。 サイズ排除クロマトグラフィーによる抗ＨＥＲ３抗体クローン（４８Ａ）１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、および（４８Ｂ）１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢについての純度解析の結果を示すグラフである。 抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡと抗ＨＥＲ３抗体Ｍ－０５－７４およびＭ－０８－１１との間のＨＥＲ３への結合についての競合の解析の結果を示す代表的なセンサーグラムおよび表である。 抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡと抗ＨＥＲ３抗体Ｍ－０５－７４およびＭ－０８－１１との間のＨＥＲ３への結合についての競合の解析の結果を示す代表的なセンサーグラムおよび表である。 マウスにおける抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１についての薬物動態解析の結果を示すグラフおよび表である。 マウスにおける血球数（５１Ａ）、電解質指標（５１Ｂ）、ならびに肝毒性、腎毒性、および膵毒性の指標（５１Ｃ～５１Ｆ）に対する、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１による処置の効果を示すグラフである。左バーはビヒクル対照を表し、右バーは１０Ｄ１による処置を表す。点線は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒによる参照範囲の端点を示す。肝毒性、腎毒性、および膵毒性の指標は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（ＣＲＥＡ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルコース（ＧＬＵ）、カルシウム（ＣＡＬ）、総ビリルビン（ＢＩＬ）、総タンパク質（ＴＰＲ）、およびアルブミン（ＡＬＢ）を含む。 マウスにおける血球数（５１Ａ）、電解質指標（５１Ｂ）、ならびに肝毒性、腎毒性、および膵毒性の指標（５１Ｃ～５１Ｆ）に対する、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１による処置の効果を示すグラフである。左バーはビヒクル対照を表し、右バーは１０Ｄ１による処置を表す。点線は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒによる参照範囲の端点を示す。肝毒性、腎毒性、および膵毒性の指標は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（ＣＲＥＡ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルコース（ＧＬＵ）、カルシウム（ＣＡＬ）、総ビリルビン（ＢＩＬ）、総タンパク質（ＴＰＲ）、およびアルブミン（ＡＬＢ）を含む。 マウスにおける血球数（５１Ａ）、電解質指標（５１Ｂ）、ならびに肝毒性、腎毒性、および膵毒性の指標（５１Ｃ～５１Ｆ）に対する、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１による処置の効果を示すグラフである。左バーはビヒクル対照を表し、右バーは１０Ｄ１による処置を表す。点線は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒによる参照範囲の端点を示す。肝毒性、腎毒性、および膵毒性の指標は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（ＣＲＥＡ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルコース（ＧＬＵ）、カルシウム（ＣＡＬ）、総ビリルビン（ＢＩＬ）、総タンパク質（ＴＰＲ）、およびアルブミン（ＡＬＢ）を含む。 マウスにおける血球数（５１Ａ）、電解質指標（５１Ｂ）、ならびに肝毒性、腎毒性、および膵毒性の指標（５１Ｃ～５１Ｆ）に対する、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１による処置の効果を示すグラフである。左バーはビヒクル対照を表し、右バーは１０Ｄ１による処置を表す。点線は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒによる参照範囲の端点を示す。肝毒性、腎毒性、および膵毒性の指標は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（ＣＲＥＡ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルコース（ＧＬＵ）、カルシウム（ＣＡＬ）、総ビリルビン（ＢＩＬ）、総タンパク質（ＴＰＲ）、およびアルブミン（ＡＬＢ）を含む。 マウスにおける血球数（５１Ａ）、電解質指標（５１Ｂ）、ならびに肝毒性、腎毒性、および膵毒性の指標（５１Ｃ～５１Ｆ）に対する、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１による処置の効果を示すグラフである。左バーはビヒクル対照を表し、右バーは１０Ｄ１による処置を表す。点線は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒによる参照範囲の端点を示す。肝毒性、腎毒性、および膵毒性の指標は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（ＣＲＥＡ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルコース（ＧＬＵ）、カルシウム（ＣＡＬ）、総ビリルビン（ＢＩＬ）、総タンパク質（ＴＰＲ）、およびアルブミン（ＡＬＢ）を含む。 マウスにおける血球数（５１Ａ）、電解質指標（５１Ｂ）、ならびに肝毒性、腎毒性、および膵毒性の指標（５１Ｃ～５１Ｆ）に対する、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１による処置の効果を示すグラフである。左バーはビヒクル対照を表し、右バーは１０Ｄ１による処置を表す。点線は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒによる参照範囲の端点を示す。肝毒性、腎毒性、および膵毒性の指標は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（ＣＲＥＡ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルコース（ＧＬＵ）、カルシウム（ＣＡＬ）、総ビリルビン（ＢＩＬ）、総タンパク質（ＴＰＲ）、およびアルブミン（ＡＬＢ）を含む。 ＥＬＩＳＡにより決定される、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、ならびに抗体ＭＭ－１２１、ＬＪＭ－７１６、およびＲｏｃｈｅ Ｍ０５によるＨＥＲ２とＨＥＲ３との相互作用の阻害についての解析の結果を示すグラフおよび表である。 ＥＬＩＳＡにより決定される、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、ならびに抗体ＭＭ－１２１およびＬＪＭ７１６によるＥＧＦＲとＨＥＲ３との相互作用の阻害についての解析の結果を示すグラフおよび表である。 抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ（１０Ｄ１Ｆ．Ａ）、１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢ（１０Ｄ１Ｆ．Ｂ）、１０Ｄ１Ｆ－ｈＩｇＧ１（Ｎ２９７Ｑ）、ならびに抗ＨＥＲ３抗体ＬＪＭ－７１６およびセリバンツマブ（ＭＭ－１２１）が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を誘導する能力についての解析の結果を示すグラフおよび表である。ＥＣ５０値を示す。 ホスホウェスタンブロットによる、（５５Ａ）Ｎ８７、（５５Ｂ）ＦａＤｕ、および（５５Ｃ）ＯｖＣａｒ８細胞内のＨＥＲ３媒介性シグナル伝達に対する抗ＨＥＲ３抗体による処置の効果についての解析の結果を示す画像である。 ホスホウェスタンブロットによる、（５５Ａ）Ｎ８７、（５５Ｂ）ＦａＤｕ、および（５５Ｃ）ＯｖＣａｒ８細胞内のＨＥＲ３媒介性シグナル伝達に対する抗ＨＥＲ３抗体による処置の効果についての解析の結果を示す画像である。 ホスホウェスタンブロットによる、（５５Ａ）Ｎ８７、（５５Ｂ）ＦａＤｕ、および（５５Ｃ）ＯｖＣａｒ８細胞内のＨＥＲ３媒介性シグナル伝達に対する抗ＨＥＲ３抗体による処置の効果についての解析の結果を示す画像である。 マウスにおける抗ＨＥＲ３抗体クローン（５６Ａ）１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、および（５６Ｂ）１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢについての薬物動態解析の結果を示すグラフおよび表である。パラメータ：最大濃度（Ｃｍａｘ）、Ｔｍａｘ、ＡＵＣ（０～３３６時間）、ＡＵＣ（０～無限大）、半減期（ｔ１／２）、クリアランス（ＣＬ）、定常状態における分布容積（Ｖｓｓ）。 ラットにおける、（５７Ａ）１０ｍｇ／ｋｇ、（５７Ｂ）２５ｍｇ／ｋｇ、（５７Ｃ）１００ｍｇ／ｋｇ、および（５７Ｄ）２５０ｍｇ／ｋｇの抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡおよび１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢについての薬物動態解析の結果を示すグラフおよび表である。パラメータ：最大濃度（Ｃｍａｘ）、Ｔｍａｘ、ＡＵＣ（０～３３６時間）、ＡＵＣ（０～無限大）、半減期（ｔ１／２）、クリアランス（ＣＬ）、定常状態における分布容積（Ｖｓｓ）。 ラットにおける、（５７Ａ）１０ｍｇ／ｋｇ、（５７Ｂ）２５ｍｇ／ｋｇ、（５７Ｃ）１００ｍｇ／ｋｇ、および（５７Ｄ）２５０ｍｇ／ｋｇの抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡおよび１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢについての薬物動態解析の結果を示すグラフおよび表である。パラメータ：最大濃度（Ｃｍａｘ）、Ｔｍａｘ、ＡＵＣ（０～３３６時間）、ＡＵＣ（０～無限大）、半減期（ｔ１／２）、クリアランス（ＣＬ）、定常状態における分布容積（Ｖｓｓ）。 ラットにおける、（５７Ａ）１０ｍｇ／ｋｇ、（５７Ｂ）２５ｍｇ／ｋｇ、（５７Ｃ）１００ｍｇ／ｋｇ、および（５７Ｄ）２５０ｍｇ／ｋｇの抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡおよび１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢについての薬物動態解析の結果を示すグラフおよび表である。パラメータ：最大濃度（Ｃｍａｘ）、Ｔｍａｘ、ＡＵＣ（０～３３６時間）、ＡＵＣ（０～無限大）、半減期（ｔ１／２）、クリアランス（ＣＬ）、定常状態における分布容積（Ｖｓｓ）。 ラットにおける、（５７Ａ）１０ｍｇ／ｋｇ、（５７Ｂ）２５ｍｇ／ｋｇ、（５７Ｃ）１００ｍｇ／ｋｇ、および（５７Ｄ）２５０ｍｇ／ｋｇの抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡおよび１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢについての薬物動態解析の結果を示すグラフおよび表である。パラメータ：最大濃度（Ｃｍａｘ）、Ｔｍａｘ、ＡＵＣ（０～３３６時間）、ＡＵＣ（０～無限大）、半減期（ｔ１／２）、クリアランス（ＣＬ）、定常状態における分布容積（Ｖｓｓ）。 （５８Ａ、５８Ｂ）赤血球指標、（５８Ｃ）白血球指標、（５８Ｄ）肝毒性指標、（５８Ｅ）腎臓および膵臓指標、ならびに（５８Ｆ）電解質指標に対する、２００ｕｇ（約１０ｍｇ／ｋｇ）、５００ｕｇ（約２５ｍｇ／ｋｇ）、２ｍｇ（約１００ｍｇ／ｋｇ）、または５ｍｇ（約２５０ｍｇ／ｋｇ）の抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡまたは１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢの処置の効果を示すグラフである。 （５８Ａ、５８Ｂ）赤血球指標、（５８Ｃ）白血球指標、（５８Ｄ）肝毒性指標、（５８Ｅ）腎臓および膵臓指標、ならびに（５８Ｆ）電解質指標に対する、２００ｕｇ（約１０ｍｇ／ｋｇ）、５００ｕｇ（約２５ｍｇ／ｋｇ）、２ｍｇ（約１００ｍｇ／ｋｇ）、または５ｍｇ（約２５０ｍｇ／ｋｇ）の抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡまたは１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢの処置の効果を示すグラフである。 （５８Ａ、５８Ｂ）赤血球指標、（５８Ｃ）白血球指標、（５８Ｄ）肝毒性指標、（５８Ｅ）腎臓および膵臓指標、ならびに（５８Ｆ）電解質指標に対する、２００ｕｇ（約１０ｍｇ／ｋｇ）、５００ｕｇ（約２５ｍｇ／ｋｇ）、２ｍｇ（約１００ｍｇ／ｋｇ）、または５ｍｇ（約２５０ｍｇ／ｋｇ）の抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡまたは１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢの処置の効果を示すグラフである。 （５８Ａ、５８Ｂ）赤血球指標、（５８Ｃ）白血球指標、（５８Ｄ）肝毒性指標、（５８Ｅ）腎臓および膵臓指標、ならびに（５８Ｆ）電解質指標に対する、２００ｕｇ（約１０ｍｇ／ｋｇ）、５００ｕｇ（約２５ｍｇ／ｋｇ）、２ｍｇ（約１００ｍｇ／ｋｇ）、または５ｍｇ（約２５０ｍｇ／ｋｇ）の抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡまたは１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢの処置の効果を示すグラフである。 （５８Ａ、５８Ｂ）赤血球指標、（５８Ｃ）白血球指標、（５８Ｄ）肝毒性指標、（５８Ｅ）腎臓および膵臓指標、ならびに（５８Ｆ）電解質指標に対する、２００ｕｇ（約１０ｍｇ／ｋｇ）、５００ｕｇ（約２５ｍｇ／ｋｇ）、２ｍｇ（約１００ｍｇ／ｋｇ）、または５ｍｇ（約２５０ｍｇ／ｋｇ）の抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡまたは１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢの処置の効果を示すグラフである。 （５８Ａ、５８Ｂ）赤血球指標、（５８Ｃ）白血球指標、（５８Ｄ）肝毒性指標、（５８Ｅ）腎臓および膵臓指標、ならびに（５８Ｆ）電解質指標に対する、２００ｕｇ（約１０ｍｇ／ｋｇ）、５００ｕｇ（約２５ｍｇ／ｋｇ）、２ｍｇ（約１００ｍｇ／ｋｇ）、または５ｍｇ（約２５０ｍｇ／ｋｇ）の抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡまたは１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢの処置の効果を示すグラフである。 （５９Ａおよび５９Ｂ）抗ＨＥＲ３抗体セリバンツマブおよびＬＪＭ－７１６、ならびに（５９Ｃおよび５９Ｄ）ＥＧＦＲファミリー療法である、セツキシマブ、トラスツズマブ、およびペルツズマブと比較した、Ｎ８７細胞（胃がん）、ＨＣＣ９５細胞（肺がん）、ＦａＤｕ細胞（頭頸部がん）、ＳＮＵ－１６細胞（胃がん）、Ａ５４９細胞（肺がん）、ＯｖＣａｒ８細胞（卵巣がん）、ＡＣＨＮ細胞（腎がん）、およびＨＴ２９細胞（結腸直腸がん）を使用した、ｉｎ ｖｉｔｒｏマウスがんモデルにおける腫瘍阻害百分率に対する、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡによる処置の効果を示すグラフである。 （５９Ａおよび５９Ｂ）抗ＨＥＲ３抗体セリバンツマブおよびＬＪＭ－７１６、ならびに（５９Ｃおよび５９Ｄ）ＥＧＦＲファミリー療法である、セツキシマブ、トラスツズマブ、およびペルツズマブと比較した、Ｎ８７細胞（胃がん）、ＨＣＣ９５細胞（肺がん）、ＦａＤｕ細胞（頭頸部がん）、ＳＮＵ－１６細胞（胃がん）、Ａ５４９細胞（肺がん）、ＯｖＣａｒ８細胞（卵巣がん）、ＡＣＨＮ細胞（腎がん）、およびＨＴ２９細胞（結腸直腸がん）を使用した、ｉｎ ｖｉｔｒｏマウスがんモデルにおける腫瘍阻害百分率に対する、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡによる処置の効果を示すグラフである。 （５９Ａおよび５９Ｂ）抗ＨＥＲ３抗体セリバンツマブおよびＬＪＭ－７１６、ならびに（５９Ｃおよび５９Ｄ）ＥＧＦＲファミリー療法である、セツキシマブ、トラスツズマブ、およびペルツズマブと比較した、Ｎ８７細胞（胃がん）、ＨＣＣ９５細胞（肺がん）、ＦａＤｕ細胞（頭頸部がん）、ＳＮＵ－１６細胞（胃がん）、Ａ５４９細胞（肺がん）、ＯｖＣａｒ８細胞（卵巣がん）、ＡＣＨＮ細胞（腎がん）、およびＨＴ２９細胞（結腸直腸がん）を使用した、ｉｎ ｖｉｔｒｏマウスがんモデルにおける腫瘍阻害百分率に対する、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡによる処置の効果を示すグラフである。 （５９Ａおよび５９Ｂ）抗ＨＥＲ３抗体セリバンツマブおよびＬＪＭ－７１６、ならびに（５９Ｃおよび５９Ｄ）ＥＧＦＲファミリー療法である、セツキシマブ、トラスツズマブ、およびペルツズマブと比較した、Ｎ８７細胞（胃がん）、ＨＣＣ９５細胞（肺がん）、ＦａＤｕ細胞（頭頸部がん）、ＳＮＵ－１６細胞（胃がん）、Ａ５４９細胞（肺がん）、ＯｖＣａｒ８細胞（卵巣がん）、ＡＣＨＮ細胞（腎がん）、およびＨＴ２９細胞（結腸直腸がん）を使用した、ｉｎ ｖｉｔｒｏマウスがんモデルにおける腫瘍阻害百分率に対する、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡによる処置の効果を示すグラフである。 示した濃度の抗体による、隔週で、６週間にわたる処置後のＡ５４９細胞株に由来する肺腺癌のマウスモデルにおける経時的な腫瘍体積についての解析の結果を示すグラフである（ｎ＝６、ビヒクル対照ｎ＝８）。抗体投与は、ｘ軸に沿う三角により示される。 示した濃度の抗体による、毎週で、６週間にわたる処置後のＦａＤｕ細胞株に由来する頭頸部扁平上皮癌のマウスモデルにおける経時的な腫瘍体積についての解析の結果を示すグラフである（ｎ＝６）。抗体投与は、ｘ軸に沿う三角により示される。 示した濃度の抗体による、毎週で、６週間にわたる処置後のＯｖＣＡＲ８細胞株に由来する卵巣癌のマウスモデルにおける経時的な腫瘍体積の解析の結果を示すグラフである（ｎ＝６）。抗体投与は、ｘ軸に沿う三角により示される。 ｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化アッセイにおける、１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、ＬＪＭ－７１６、またはセリバンツマブにより処置されたがん細胞株についての遺伝子セットエンリッチメント解析による経路活性化についての解析の結果を示す箱髭図である。６３Ａは、Ｎ８７細胞から得られた結果を示し、６３Ｂは、Ａ５４９細胞から得られた結果を示し、６３Ｃは、ＯｖＣａｒ８細胞から得られた結果を示し、６３Ｄは、ＦａＤｕ細胞から得られた結果を示す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化アッセイにおける、１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、ＬＪＭ－７１６、またはセリバンツマブにより処置されたがん細胞株についての遺伝子セットエンリッチメント解析による経路活性化についての解析の結果を示す箱髭図である。６３Ａは、Ｎ８７細胞から得られた結果を示し、６３Ｂは、Ａ５４９細胞から得られた結果を示し、６３Ｃは、ＯｖＣａｒ８細胞から得られた結果を示し、６３Ｄは、ＦａＤｕ細胞から得られた結果を示す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化アッセイにおける、１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、ＬＪＭ－７１６、またはセリバンツマブにより処置されたがん細胞株についての遺伝子セットエンリッチメント解析による経路活性化についての解析の結果を示す箱髭図である。６３Ａは、Ｎ８７細胞から得られた結果を示し、６３Ｂは、Ａ５４９細胞から得られた結果を示し、６３Ｃは、ＯｖＣａｒ８細胞から得られた結果を示し、６３Ｄは、ＦａＤｕ細胞から得られた結果を示す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化アッセイにおける、１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、ＬＪＭ－７１６、またはセリバンツマブにより処置されたがん細胞株についての遺伝子セットエンリッチメント解析による経路活性化についての解析の結果を示す箱髭図である。６３Ａは、Ｎ８７細胞から得られた結果を示し、６３Ｂは、Ａ５４９細胞から得られた結果を示し、６３Ｃは、ＯｖＣａｒ８細胞から得られた結果を示し、６３Ｄは、ＦａＤｕ細胞から得られた結果を示す。 示した時点における、ホスホウェスタンブロットによるＡ５４９細胞内のＨＥＲ３媒介性シグナル伝達に対する抗ＨＥＲ３抗体による処置の効果についての解析の結果を示す画像である。 ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ Ｂｉｏａｓｓａｙにより決定される、１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡまたはペルツズマブによるＨＥＲ２：ＨＥＲ３相互作用の阻害についての解析の結果を示すグラフである。ＩＣ５０（Ｍ）値を示す。 （６６Ａ）ＢＣＰＡＰ細胞、（６６Ｂ）ＢＨＴ１０１細胞、および（６６Ｃ）ＳＷ１７３６細胞によるＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３の発現についての解析の結果を示すヒストグラムである。１＝無染色細胞、２＝アイソタイプ対照、３＝セツキシマブ、４＝トラスツズマブ、および５＝１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ。 （６６Ａ）ＢＣＰＡＰ細胞、（６６Ｂ）ＢＨＴ１０１細胞、および（６６Ｃ）ＳＷ１７３６細胞によるＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３の発現についての解析の結果を示すヒストグラムである。１＝無染色細胞、２＝アイソタイプ対照、３＝セツキシマブ、４＝トラスツズマブ、および５＝１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ。 （６６Ａ）ＢＣＰＡＰ細胞、（６６Ｂ）ＢＨＴ１０１細胞、および（６６Ｃ）ＳＷ１７３６細胞によるＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３の発現についての解析の結果を示すヒストグラムである。１＝無染色細胞、２＝アイソタイプ対照、３＝セツキシマブ、４＝トラスツズマブ、および５＝１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ。 ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異体甲状腺がん細胞株の増殖を阻害する、異なる抗ＥｒｂＢ抗体の能力についての解析の結果を示すグラフである。６７Ａは、ＢＨＴ１０１細胞について得られた結果を示し、６８７は、ＢＣＰＡＰ細胞について得られた結果を示し、６７Ｃは、ＳＷ１７３６細胞について得られた結果を示す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異体甲状腺がん細胞株の増殖を阻害する、異なる抗ＥｒｂＢ抗体の能力についての解析の結果を示すグラフである。６７Ａは、ＢＨＴ１０１細胞について得られた結果を示し、６８７は、ＢＣＰＡＰ細胞について得られた結果を示し、６７Ｃは、ＳＷ１７３６細胞について得られた結果を示す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異体甲状腺がん細胞株の増殖を阻害する、異なる抗ＥｒｂＢ抗体の能力についての解析の結果を示すグラフである。６７Ａは、ＢＨＴ１０１細胞について得られた結果を示し、６８７は、ＢＣＰＡＰ細胞について得られた結果を示し、６７Ｃは、ＳＷ１７３６細胞について得られた結果を示す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異体甲状腺がん細胞株の増殖を阻害する、単独の、またはベムラフェニブと組み合わせた１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡの能力についての解析の結果を示すグラフである。６８Ａは、ＢＨＴ１０１細胞について得られた結果を示し、６８Ｂは、ＳＷ１７３６細胞について得られた結果を示し、６８Ｃは、ＢＣＰＡＰ細胞について得られた結果を示す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異体甲状腺がん細胞株の増殖を阻害する、単独の、またはベムラフェニブと組み合わせた１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡの能力についての解析の結果を示すグラフである。６８Ａは、ＢＨＴ１０１細胞について得られた結果を示し、６８Ｂは、ＳＷ１７３６細胞について得られた結果を示し、６８Ｃは、ＢＣＰＡＰ細胞について得られた結果を示す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異体甲状腺がん細胞株の増殖を阻害する、単独の、またはベムラフェニブと組み合わせた１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡの能力についての解析の結果を示すグラフである。６８Ａは、ＢＨＴ１０１細胞について得られた結果を示し、６８Ｂは、ＳＷ１７３６細胞について得られた結果を示し、６８Ｃは、ＢＣＰＡＰ細胞について得られた結果を示す。 １０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、もしくは２５０ｍｇ／ｋｇの１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡまたは等容積のＰＢＳの投与後のＢＡＬＢ／ｃマウスの代表的な血液学的プロファイルを示す表である。６９Ａは、赤血球コンパートメントについての解析の結果を示し、６９Ｂは、白血球コンパートメントについての解析の結果を示し、６９Ｃは、肝機能、腎機能、および膵機能、ならびに電解質レベルの相関因子についての解析の結果を示す。ＲＢＣ＝赤血球、ＭＶＣ＝平均赤血球容積、ＭＣＨ＝平均赤血球ヘモグロビン、ＭＣＨＣ＝平均赤血球ヘモグロビン濃度、ＷＢＣ＝白血球、ＡＬＢ＝アルブミン、ＡＬＴ＝アラニンアミノトランスフェラーゼ、ＡＬＰ＝アルカリホスファターゼ、ＣＲＥＡ＝クレアチニン、ＢＵＮ＝血中尿素窒素、ＧＬＵ＝グルカゴン、ＡＭＹ＝アミラーゼ、ＮＡ＝ナトリウム、Ｋ＝カリウム、Ｐ＝リン、およびＣＡ＝カルシウム。 １０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、もしくは２５０ｍｇ／ｋｇの１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡまたは等容積のＰＢＳの投与後のＢＡＬＢ／ｃマウスの代表的な血液学的プロファイルを示す表である。６９Ａは、赤血球コンパートメントについての解析の結果を示し、６９Ｂは、白血球コンパートメントについての解析の結果を示し、６９Ｃは、肝機能、腎機能、および膵機能、ならびに電解質レベルの相関因子についての解析の結果を示す。ＲＢＣ＝赤血球、ＭＶＣ＝平均赤血球容積、ＭＣＨ＝平均赤血球ヘモグロビン、ＭＣＨＣ＝平均赤血球ヘモグロビン濃度、ＷＢＣ＝白血球、ＡＬＢ＝アルブミン、ＡＬＴ＝アラニンアミノトランスフェラーゼ、ＡＬＰ＝アルカリホスファターゼ、ＣＲＥＡ＝クレアチニン、ＢＵＮ＝血中尿素窒素、ＧＬＵ＝グルカゴン、ＡＭＹ＝アミラーゼ、ＮＡ＝ナトリウム、Ｋ＝カリウム、Ｐ＝リン、およびＣＡ＝カルシウム。 １０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、もしくは２５０ｍｇ／ｋｇの１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡまたは等容積のＰＢＳの投与後のＢＡＬＢ／ｃマウスの代表的な血液学的プロファイルを示す表である。６９Ａは、赤血球コンパートメントについての解析の結果を示し、６９Ｂは、白血球コンパートメントについての解析の結果を示し、６９Ｃは、肝機能、腎機能、および膵機能、ならびに電解質レベルの相関因子についての解析の結果を示す。ＲＢＣ＝赤血球、ＭＶＣ＝平均赤血球容積、ＭＣＨ＝平均赤血球ヘモグロビン、ＭＣＨＣ＝平均赤血球ヘモグロビン濃度、ＷＢＣ＝白血球、ＡＬＢ＝アルブミン、ＡＬＴ＝アラニンアミノトランスフェラーゼ、ＡＬＰ＝アルカリホスファターゼ、ＣＲＥＡ＝クレアチニン、ＢＵＮ＝血中尿素窒素、ＧＬＵ＝グルカゴン、ＡＭＹ＝アミラーゼ、ＮＡ＝ナトリウム、Ｋ＝カリウム、Ｐ＝リン、およびＣＡ＝カルシウム。 ２５０ｍｇ／ｋｇの１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡまたは等容積のＰＢＳの投与後の示した時点におけるＳＤラットについての代表的な血液学的プロファイルを示す表である。７０Ａは、赤血球コンパートメントについての解析の結果を示し、７０Ｂは、白血球コンパートメントについての解析の結果を示し、７０Ｃは、肝機能、腎機能、および膵機能、ならびに電解質レベルの相関因子についての解析の結果を示す。ＲＢＣ＝赤血球、ＭＶＣ＝平均赤血球容積、ＭＣＨ＝平均赤血球ヘモグロビン、ＭＣＨＣ＝平均赤血球ヘモグロビン濃度、ＷＢＣ＝白血球、ＡＬＢ＝アルブミン、ＡＬＰ＝アルカリホスファターゼ、ＣＲＥＡ＝クレアチニン、ＢＵＮ＝血中尿素窒素、ＧＬＵ＝グルカゴン、ＡＭＹ＝アミラーゼ、ＮＡ＝ナトリウム、Ｋ＝カリウム、Ｐ＝リン、およびＣＡ＝カルシウム。 ２５０ｍｇ／ｋｇの１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡまたは等容積のＰＢＳの投与後の示した時点におけるＳＤラットについての代表的な血液学的プロファイルを示す表である。７０Ａは、赤血球コンパートメントについての解析の結果を示し、７０Ｂは、白血球コンパートメントについての解析の結果を示し、７０Ｃは、肝機能、腎機能、および膵機能、ならびに電解質レベルの相関因子についての解析の結果を示す。ＲＢＣ＝赤血球、ＭＶＣ＝平均赤血球容積、ＭＣＨ＝平均赤血球ヘモグロビン、ＭＣＨＣ＝平均赤血球ヘモグロビン濃度、ＷＢＣ＝白血球、ＡＬＢ＝アルブミン、ＡＬＰ＝アルカリホスファターゼ、ＣＲＥＡ＝クレアチニン、ＢＵＮ＝血中尿素窒素、ＧＬＵ＝グルカゴン、ＡＭＹ＝アミラーゼ、ＮＡ＝ナトリウム、Ｋ＝カリウム、Ｐ＝リン、およびＣＡ＝カルシウム。 ２５０ｍｇ／ｋｇの１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡまたは等容積のＰＢＳの投与後の示した時点におけるＳＤラットについての代表的な血液学的プロファイルを示す表である。７０Ａは、赤血球コンパートメントについての解析の結果を示し、７０Ｂは、白血球コンパートメントについての解析の結果を示し、７０Ｃは、肝機能、腎機能、および膵機能、ならびに電解質レベルの相関因子についての解析の結果を示す。ＲＢＣ＝赤血球、ＭＶＣ＝平均赤血球容積、ＭＣＨ＝平均赤血球ヘモグロビン、ＭＣＨＣ＝平均赤血球ヘモグロビン濃度、ＷＢＣ＝白血球、ＡＬＢ＝アルブミン、ＡＬＰ＝アルカリホスファターゼ、ＣＲＥＡ＝クレアチニン、ＢＵＮ＝血中尿素窒素、ＧＬＵ＝グルカゴン、ＡＭＹ＝アミラーゼ、ＮＡ＝ナトリウム、Ｋ＝カリウム、Ｐ＝リン、およびＣＡ＝カルシウム。 ホスホウェスタンブロットにより決定される、ＦａＤｕまたはＯｖＣａｒ８細胞由来の腫瘍の細胞におけるｉｎ ｖｉｖｏでのＨＥＲ３媒介性シグナル伝達に対する、１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡによる処置の効果についての解析の結果を示す画像である。 示した細胞株による異なる抗ＥｒｂＢ抗体の内在化についての解析の結果を示す箱髭図である。 フローサイトメトリーにより決定される、異なる時点における示した細胞株による１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡまたはトラスツズマブの内在化についての解析の結果を示すヒストグラムおよび表である。７３Ｂは、７３Ａに示されたヒストグラムから決定されるＰＥ陽性細胞の蛍光強度中央値および百分率を示す。 フローサイトメトリーにより決定される、異なる時点における示した細胞株による１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡまたはトラスツズマブの内在化についての解析の結果を示すヒストグラムおよび表である。７３Ｂは、７３Ａに示されたヒストグラムから決定されるＰＥ陽性細胞の蛍光強度中央値および百分率を示す。 示した濃度の示した抗ＥｒｂＢ抗体による、隔週で、６週間にわたる処置後のＮ８７細胞株に由来する胃がんのマウスモデルにおける経時的な腫瘍体積についての解析の結果を示すグラフである（ｎ＝６）。抗体投与は、ｘ軸に沿う三角により示される。 １０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡを使用した、悪性および正常ヒト組織についての免疫組織化学染色を示す画像である。７５Ａおよび７５Ｂは、異なる組織の染色を示す。 １０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡを使用した、悪性および正常ヒト組織についての免疫組織化学染色を示す画像である。７５Ａおよび７５Ｂは、異なる組織の染色を示す。 示した拡大率における、１０Ｄ１Ｆまたはウサギポリクローナル抗ＨＥＲ３抗体によるＡ５４９腫瘍異種移植凍結切片についての免疫組織化学染色を示す画像である。二次抗体だけによる対照染色を示す。 ２５ｍｇ／ｋｇにおけるマウスへのＩＰ投与後のＣｍａｘで、抗体が到達する血清濃度において示したがん細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖を阻害する、示した抗ＥｒｂＢ抗体の能力についての解析の結果を示す棒グラフである。７７Ａおよび７７Ｂは、異なる細胞株を使用して得られた結果を示す。 ２５ｍｇ／ｋｇにおけるマウスへのＩＰ投与後のＣｍａｘで、抗体が到達する血清濃度において示したがん細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖を阻害する、示した抗ＥｒｂＢ抗体の能力についての解析の結果を示す棒グラフである。７７Ａおよび７７Ｂは、異なる細胞株を使用して得られた結果を示す。 ヒトＮＲＧ１（７８Ａ、７８Ｃ、７８Ｅ）の非存在下、およびヒトＮＲＧ１（７８Ｂ、７８Ｄ、７８Ｆ）の存在下における、抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１Ｆ．Ａ（７８Ａ、７８Ｂ）、ＭＭ－１２１（７８Ｃ、７８Ｄ）、およびＬＪＭ－７１６（７８Ｅ、７８Ｆ）によるヒトＨＥＲ３に対する結合親和性についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムである。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。 ヒトＮＲＧ１（７８Ａ、７８Ｃ、７８Ｅ）の非存在下、およびヒトＮＲＧ１（７８Ｂ、７８Ｄ、７８Ｆ）の存在下における、抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１Ｆ．Ａ（７８Ａ、７８Ｂ）、ＭＭ－１２１（７８Ｃ、７８Ｄ）、およびＬＪＭ－７１６（７８Ｅ、７８Ｆ）によるヒトＨＥＲ３に対する結合親和性についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムである。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。 ヒトＮＲＧ１（７８Ａ、７８Ｃ、７８Ｅ）の非存在下、およびヒトＮＲＧ１（７８Ｂ、７８Ｄ、７８Ｆ）の存在下における、抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１Ｆ．Ａ（７８Ａ、７８Ｂ）、ＭＭ－１２１（７８Ｃ、７８Ｄ）、およびＬＪＭ－７１６（７８Ｅ、７８Ｆ）によるヒトＨＥＲ３に対する結合親和性についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムである。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。 ヒトＮＲＧ１（７８Ａ、７８Ｃ、７８Ｅ）の非存在下、およびヒトＮＲＧ１（７８Ｂ、７８Ｄ、７８Ｆ）の存在下における、抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１Ｆ．Ａ（７８Ａ、７８Ｂ）、ＭＭ－１２１（７８Ｃ、７８Ｄ）、およびＬＪＭ－７１６（７８Ｅ、７８Ｆ）によるヒトＨＥＲ３に対する結合親和性についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムである。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。 ヒトＮＲＧ１（７８Ａ、７８Ｃ、７８Ｅ）の非存在下、およびヒトＮＲＧ１（７８Ｂ、７８Ｄ、７８Ｆ）の存在下における、抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１Ｆ．Ａ（７８Ａ、７８Ｂ）、ＭＭ－１２１（７８Ｃ、７８Ｄ）、およびＬＪＭ－７１６（７８Ｅ、７８Ｆ）によるヒトＨＥＲ３に対する結合親和性についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムである。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。 ヒトＮＲＧ１（７８Ａ、７８Ｃ、７８Ｅ）の非存在下、およびヒトＮＲＧ１（７８Ｂ、７８Ｄ、７８Ｆ）の存在下における、抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１Ｆ．Ａ（７８Ａ、７８Ｂ）、ＭＭ－１２１（７８Ｃ、７８Ｄ）、およびＬＪＭ－７１６（７８Ｅ、７８Ｆ）によるヒトＨＥＲ３に対する結合親和性についての解析の結果を示す代表的なセンサーグラムである。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。 隔週で、２５ｍｇ／ｋｇの１０Ｄ１Ｆまたはアイソタイプが一致した対照抗体による処置後のＣＬＵ－ＮＲＧ１融合体を含む、卵巣がんの患者に由来する異種移植モデルの経時的な腫瘍体積についての解析の結果を示すグラフである（処置群当たりｎ＝１０）。抗体投与は、ｘ軸に沿う三角により示される。
以下の実施例では、本発明者らは、ＨＥＲ３分子内の目的の特異的領域へ標的化される新規の抗ＨＥＲ３抗体クローンの生成、ならびにこれらの抗原結合性分子についての生物物理的および機能的特徴付け、ならびに治療的評価について記載する。
実施例１
ＨＥＲ３標的の設計および抗ＨＥＲ３抗体ハイブリドーマの産生
本発明者らは、ＨＥＲ３結合性モノクローナル抗体を惹起するために、ヒトＨＥＲ３（配列番号９）の細胞外領域内の２つの領域を選択した。
１．１ ハイブリドーマの産生
約６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＩｎＶｉｖｏｓ（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）から得た。動物は、特定の無病原体条件下で飼育し、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）ガイドラインに準拠して処置した。
ハイブリドーマの産生のために、マウスを、抗原性ペプチド、組換え標的タンパク質、または標的タンパク質を発現する細胞の本発明者らに所有権がある混合物で免疫化した。
融合のための脾臓を採取する前に、マウスに、抗原混合物を、連続３日間にわたり、または１日間だけにわたり追加免役した。最終追加免役の２４時間後、全脾臓細胞を単離し、製造業者の指示書（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｎａｄａ）に従って、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ－ＨＹハイブリドーマクローニングキットを使用して、ＰＥＧにより、骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３．Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）と融合させた。
融合細胞を、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で一晩、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ－ＨＹ培地Ｃ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｎａｄａ）中で培養した。翌日、融合細胞を遠心分離し、１０ｍｌのＣｌｏｎａＣｅｌｌ－ＨＹ培地Ｃ中に再懸濁し、次いで、ＨＡＴ成分を含有する、９０ｍｌの半固体メチルセルロースベースのＣｌｏｎａＣｅｌｌ－ＨＹ培地Ｄ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｎａｄａ）と静かに混合し、これにより、ハイブリドーマの選択とクローニングとを１つのステップに組み合わせた。
次いで、融合細胞を９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で増殖させた。７～１０日後、単一のハイブリドーマクローンを単離し、抗体産生ハイブリドーマを、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって、上清をスクリーニングすることにより選択した。
１．２ 抗体可変領域の増幅およびシーケンシング
製造業者のプロトコールを使用する、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を使用して、全ＲＮＡをハイブリドーマ細胞から抽出した。製造業者の指示書に従って、ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ５’／３’キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（商標）、ＵＳＡ）を使用して、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。簡潔に述べると、５’－ＲＡＣＥ ＣＤＳプライマー（キット内に提供された）、および５’アダプター（ＳＭＡＲＴｅｒ ＩＩ Ａプライマー）を使用して全長ｃＤＮＡを生成するのに、１μｇの全ＲＮＡを使用し、次いで、製造業者の指示書に従って各ｃＤＮＡに組み込んだ。ｃＤＮＡ合成反応物は、５倍濃度のＦｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ緩衝液、ＤＴＴ（２０ｍＭ）、ｄＮＴＰミックス（１０ｍＭ）、ＲＮアーゼ阻害剤（４０Ｕ／μｌ）、およびＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素（１００Ｕ／μｌ）を含有した。
ＳｅｑＡｍｐ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（商標）、ＵＳＡ）を使用して、ｒａｃｅの準備ができたｃＤＮＡを増幅させた。増幅反応物は、ＳｅｑＡｍｐ ＤＮＡポリメラーゼ、２倍濃度のＳｅｑ ＡＭＰ緩衝液、５’ＳＭＡＲＴｅｒ Ｒａｃｅキットで提供される、アダプター配列に相補的な５’ユニバーサルプライマー、およびそれぞれの重鎖定常領域または軽鎖定常領域のプライマーにアニーリングする３’プライマーを含有した。５’定常領域は、Ｋｒｅｂｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９７；２０１：３５～５５、Ｗａｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０００、２３３；１６７～１７７、またはＴｉｌｌｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００９；３５０：１８３～１９３により、既に報告されたプライマーミックスに基づき設計した。以下の熱プロトコール：９４℃で、１分間にわたる、前変性サイクル；９４℃で、３０秒間、５５℃で、３０秒間、および７２℃で、４５秒間にわたる、３５サイクル；７２℃で、３分間にわたる、最終伸長を使用した。
ＣｌｏｎｅＪＥＴ ＰＣＲクローニングキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を使用して、結果として得られる約５５０ｂｐのＶＨおよびＶＬのＰＣＲ産物を、ｐＪＥＴ１．２／ｂｌｕｎｔベクターにクローニングし、高度にコンピテントのＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換するのに使用した。Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、結果として得られる形質転換体から、プラスミドＤＮＡを調製し、シーケンシングした。ＤＮＡシーケンシングは、ＡＩＴｂｉｏｔｅｃｈにより行われた。ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＬｅＦｒａｎｃら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１５）４３（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ４１３～２２）を使用して、これらのシーケンシングデータを解析して、個々のＣＤＲおよびフレームワーク配列を特徴付けた。ＶＨおよびＶＬの５’末端におけるシグナルペプチドは、ＳｉｇｎａｌＰ（ｖ４．１；Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｋｉｈａｒａ，Ｄ（ｅｄ）：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１６１１）５９～７３、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ２０１７）により同定した。
４つのモノクローナル抗ＨＥＲ３抗体クローン：１０Ｄ１、１０Ａ６、４－３５－Ｂ２、および４－３５－Ｂ４を、さらなる開発のために選択した。
１０Ｄ１のヒト化バージョンを、相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒト抗体フレームワーク領域を含むＶＨおよびＶＬにグラフトすることにより、コンピュータで設計し、酵母ディスプレイ法により、抗原への結合についてさらに最適化した。
酵母ディスプレイのために、ヒト化配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により単鎖断片可変（ｓｃＦｖ）フォーマットに転換し、ランダム突然変異誘発により突然変異体ライブラリーを生成するための鋳型として使用した。次いで、突然変異体ＰＣＲライブラリーを、直鎖化ｐＣＴｃｏｎ２ベクターと併せて、酵母に電気穿孔して、酵母ライブラリーを生成した。ライブラリーをヒトＨＥＲ３抗原で染色し、上位の結合剤について選別した。４～５ラウンドの選別の後、個々の酵母クローンをシーケンシングして、固有の抗体配列を同定した。
Figure 2022548057000019
 実施例２
抗体の産生および精製
２．１ 発現ベクターへのＶＨおよびＶＬのクローニング：
ヒト－マウスキメラ抗体を構築するために、抗ＨＥＲ３抗体クローンの重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列を、ｐｍＡｂＤＺ＿ＩｇＧ１＿ＣＨおよびｐｍＡｂＤＺ＿ＩｇＧ１＿ＣＬ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、ＵＳＡ）の真核生物発現ベクターにサブクローニングした。
代替的に、ヒト－マウスキメラ抗体を構築するために、抗ＨＥＲ３抗体クローンの重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列を、ｐＦＵＳＥ－ＣＨＩｇ－ｈＧ１およびｐＦＵＳＥ２ｓｓ－ＣＬＩｇ－ｈｋ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、ＵＳＡ）の真核生物発現ベクターにサブクローニングした。ｐＦＵＳＥ－ＣＨＩｇ－ｈＧ１によりコードされるヒトＩｇＧ１定常領域は、ＣＨ３領域内に、ヒトＩｇＧ１定常領域（ＩＧＨＧ１；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０１８５７－１、ｖ１；配列番号１７６）と比べた置換Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ（ＥＵ番号付けに従い番号付けされた位置）を含む。ｐＦＵＳＥ２ｓｓ－ＣＬＩｇ－ｈｋは、ヒトＩｇＧ１軽鎖カッパ定常領域（ＩＧＣＫ；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０１８３４－１、ｖ２）をコードする。
製造業者のプロトコールに従って、ＳｅｑＡｍｐ酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（商標）、ＵＳＡ）を使用して、可変領域をシグナルペプチドと共にクローニングベクターから増幅させた。ＶＨまたはＶＬ内の適切な領域と重複する１５～２０ｂｐに加えて、制限部位として５’末端に６ｂｐを有するフォワードおよびリバースプライマーを使用した。ＤＮＡインサートおよびベクターを、製造業者により推奨される制限酵素で消化して、フレームシフトが導入されていないことを確認し、Ｔ４リガーゼ酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を使用して、そのそれぞれのプラスミドにライゲーションした。ベクターに対するＤＮＡインサートの３：１のモル比を、ライゲーションのために使用した。
２．２ 哺乳動物細胞内の抗体の発現
製造業者の指示書に従って、１）Ｅｘｐｉ２９３一過性発現系キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）、または２）ＨＥＫ２９３－６Ｅ一過性発現系（ＣＮＲＣ－ＮＲＣ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、抗体を発現させた。
１）Ｅｘｐｉ２９３一過性発現系：
細胞株の維持：
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｅｘｐｉ２９３Ｆ）は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ（ＵＳＡ）から得た。細胞を、３７℃、８％ＣＯ２、振とう型プラットフォームを伴う、８０％の加湿式インキュベーター内で、５０ＩＵ／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）を補充した、無血清、無タンパク質の既知組成培地（Ｅｘｐｉ２９３発現培地、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＵＳＡ）中で培養した。
トランスフェクション：
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に、その製造業者のプロトコールに従って、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３試薬キット（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）を使用して、発現プラスミドをトランスフェクトした。簡潔に述べると、培養物をスピンダウンすることによって抗生物質を除去するように維持状態の細胞を培地交換にかけ、細胞ペレットを、トランスフェクションの１日前に、抗生物質を含まない新鮮な培地中に再懸濁した。トランスフェクション日に、各トランスフェクションのために、２．５×１０６／ｍｌの生存細胞を、シェーカーフラスコ内に播種した。細胞に添加する前に、血清低減培地である、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）中、室温で、２５分間にわたり、ＤＮＡ－ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ複合体を形成した。トランスフェクションの１６～１８時間後に、転写促進因子を、トランスフェクトされた細胞に添加した。トランスフェクションの４日後に、等量の培地をトランスフェクタントの上にかけ、細胞の凝集を防止した。トランスフェクタントを、４０００×ｇで１５分間の遠心分離によって７日目に採取し、０．２２μｍの滅菌フィルターユニットを通して濾過した。
２）ＨＥＫ２９３－６Ｅ一過性発現系
細胞株の維持：
ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｃａｎａｄａから得た。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２、振とう型プラットフォームを伴う、８０％の加湿式インキュベーター内で、０．１％のＫｏｌｌｉｐｈｏｒ－Ｐ１８８および４ｍＭのＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）および２５μｇ／ｍｌのＧ－４１８を補充した、無血清、無タンパク質、既知組成のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）中で培養した。
トランスフェクション：
ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞に、その製造業者のプロトコールに従って、ＰＥＩｐｒｏ（商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ、ＵＳＡ）を使用して、発現プラスミドをトランスフェクトした。簡潔に述べると、遠心分離によって抗生物質を除去するように維持状態の細胞を培地交換にかけ、細胞ペレットを、トランスフェクションの１日前に、抗生物質を含まない新鮮な培地と共に再懸濁した。トランスフェクション日に、各トランスフェクションのために、１．５～２×１０６細胞／ｍｌの生存細胞を、シェーカーフラスコ内に播種した。ＤＮＡとＰＥＩｐｒｏ（商標）とを、１：１の比で混合し、細胞に添加する前に、ＲＴで５分間、Ｆ１７培地中で複合体を形成させた。トランスフェクションの２４～４８時間後に、０．５％（ｗ／ｖ）のトリプトンＮ１をトランスフェクタントに与えた。トランスフェクタントを、４０００×ｇで１５分間の遠心分離によって６～７日目に採取し、上清を、０．２２μｍの滅菌フィルターユニットを通して濾過した。
細胞に、以下の組合せのポリペプチドをコードするベクターをトランスフェクトした。
Figure 2022548057000020
Figure 2022548057000021
 ２．３ 抗体の精製
親和性精製、緩衝液交換、および保管：
培養物上清にトランスフェクトされた細胞により分泌された抗体は、液体クロマトグラフィーシステムＡＫＴＡ Ｓｔａｒｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）を使用して精製した。具体的には、上清を、５ｍｌ／分の結合速度でＨｉＴｒａｐプロテインＧカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）にロードし、続いて、１０カラム容積の洗浄緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）でカラムを洗浄した。結合したｍＡｂを、溶出緩衝液（０．１Ｍのグリシン、ｐＨ２．７）により溶出させ、溶出液を、適量の中和緩衝液（１Ｍのトリス、ｐＨ９）を含有する回収チューブに分画した。３０ＫのＭＷＣＯタンパク質濃縮器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＵＳＡ）または３．５ＫのＭＷＣＯ透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＵＳＡ）を使用して、精製されたｍＡｂを含有する中和溶出緩衝液をＰＢＳに交換した。０．２２μｍのフィルターを通すことにより、モノクローナル抗体を滅菌し、アリコート分割し、保管のために－８０℃で凍結させた。
２．４ 抗体純度解析
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）：
抗体純度を、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ液体クロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）上の、ＰＢＳランニング緩衝液中でＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３０ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）を使用する、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により解析した。５００μｌのＰＢＳ ｐＨ７．２中に１５０μｇの抗体を、室温、０．７５ｍｌ／分の流量でカラムに注入した。タンパク質を、それらの分子量に従って溶出させた。
抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１（実施例２．２の［１］）についての結果を図１２に示す。
異なる１０Ｄ１バリアントクローンについて得られた結果を図３４に示す。
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）：
抗体純度もまた、標準的な方法に従って、還元条件下および非還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥにより解析した。簡潔に述べると、Ｍｉｎｉ－Ｐｒｏｔｅａｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＵＳＡ）を使用して、タンパク質を分解するのに４％～２０％のＴＧＸタンパク質ゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＵＳＡ）を使用した。非還元条件のために、ゲルにロードする前に、２倍濃度のＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＵＳＡ）と混合することによりタンパク質試料を変性させ、９５℃で、５～１０分間煮沸した。還元条件のために、５％のβ－メルカプトエタノール（βＭＥ）、または４０ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）を含有する、２倍濃度の試料緩衝液を使用した。電気泳動は、１５０Ｖの一定電圧下、ＳＤＳランニング緩衝液（２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン、１％のＳＤＳ、ｐＨ８．３）中で１時間行った。
ウェスタンブロット：
タンパク質試料（３０μｇ）を、上記で記載した通りにＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分画し、ニトロセルロース膜に転写した。次いで、膜をブロッキングし、４℃で一晩、抗体による免疫ブロットにかけた。次いで、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄した後、膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。結果を、化学発光によるＰｉｅｒｃｅ ＥＣＬ基質ウェスタンブロット検出システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）によって視覚化し、オートラジオグラフィーフィルム（Ｋｏｄａｋ ＸＡＲフィルム）に曝露した。
検出のために使用した一次抗体は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ型番Ａ００１６６）、およびヤギ抗ヒトカッパ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｅｒｈｎＢｉｏｔｅｃｈ型番２０６０－０５）であった。
抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１（実施例２．２の［１］）についての結果を図１３に示す。１０Ｄ１は、高濃度で、容易に発現され、精製され、処理された。
実施例３
生物物理学的特徴付け
３．１ フローサイトメトリーによる細胞表面の抗原結合についての解析
野生型ＨＥＫ２９３細胞（高レベルのＨＥＲ３を発現しない）、およびヒトＨＥＲ３をコードするベクターをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（すなわち、ＨＥＫ２９３ ＨＥＲ Ｏ／Ｅ細胞）を、４℃で１．５時間、２０μｇ／ｍｌの抗ＨＥＲ３抗体またはアイソタイプ対照抗体とインキュベートした。抗ＨＥＲ３抗体クローンＬＪＭ７１６（例えば、Ｇａｒｎｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０１３）７３：６０２４～６０３５に記載されている）を、陽性対照として解析に組み入れた。
細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（５ｍＭのＥＤＴＡと、０．５％のＢＳＡとを伴うＰＢＳ）で３回洗浄し、２～８℃で４０分間、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＦＣ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）中に再懸濁した。細胞を再度洗浄し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、フローサイトメトリー解析のために、２００μＬのＦＡＣＳフロー緩衝液（５ｍＭのＥＤＴＡを伴うＰＢＳ）中に再懸濁した。収集の後、Ｆｌｏｗｌｏｇｉｃソフトウェアを使用して、全ての生データを解析した。前方散乱および側方散乱のプロファイルを使用して、細胞にゲートをかけ、陽性細胞の百分率を、天然および過剰発現細胞集団について決定した。
結果を図１～４および３０～３２に示す。抗ＨＥＲ３抗体は、ヒトＨＥＲ３に、高度の特異性で結合することが示された。１０Ｄ１およびＬＪＭ７１６は、ヒトＨＥＲ３発現細胞に、同程度に結合することが示された。
３．２ 抗体の特異性および交差反応性を決定するためのＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡを使用して、抗体の結合特異性を決定した。抗体を、ヒトＨＥＲ３ポリペプチド、ならびにＨＥＲ３のそれぞれのマウス、ラット、およびサルの相同体（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｎａ）への結合について解析した。抗体はまた、ヒトＥＧＦＲおよびヒトＨＥＲ２（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｎａ）に結合する、それらの能力についても解析した。
ＥＬＩＳＡを、標準的なプロトコールに従って行った。簡潔に述べると、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を、４℃で１６時間、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）中の０．１μｇ／ｍｌの標的ポリペプチドによりコーティングした。トリス緩衝液生理食塩液（ＴＢＳ）中の１％のＢＳＡによる室温で１時間のブロッキングの後、抗ＨＥＲ３抗体を、最高濃度を１０μｇ／ｍｌとして系列希釈し、プレートに添加した。室温で１時間のインキュベーション後、プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含有するＴＢＳ（ＴＢＳ－Ｔ）で３回洗浄し、次いで、室温で１時間、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）とインキュベートした。洗浄の後、プレートを、比色検出基質である、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（Ｔｕｒｂｏ－ＴＭＢ；Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）で１０分間現像した。２ＭのＨ２ＳＯ４で反応を停止させ、４５０ｎｍでＯＤを測定した。
ＥＬＩＳＡについての結果を図５～７および図３３に示す。
抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１は、高抗体濃度であってもなお、ヒトＨＥＲ２またはヒトＥＧＦＲに結合しないことが見出された（図５Ａ）。抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１はまた、マウスＨＥＲ３、ラットＨＥＲ３、およびカニクイザルＨＥＲ３との実質的な交差反応性を呈することも見出された（図５Ｂ）。
抗ＨＥＲ３抗体クローン４－３５－Ｂ２は、ヒトＨＥＲ２およびヒトＥＧＦＲに結合することが見出された（図６Ａ）。抗ＨＥＲ３抗体クローン４－３５－Ｂ２はまた、マウスＨＥＲ３、ラットＨＥＲ３、およびカニクイザルＨＥＲ３との実質的な交差反応性も呈した（図６Ｂ）。
抗ＨＥＲ３抗体クローン４－３５－Ｂ４は、ヒトＨＥＲ２およびヒトＥＧＦＲに結合することが見出された（図７Ａ）。抗ＨＥＲ３抗体クローン４－３５－Ｂ４はまた、マウスＨＥＲ３、ラットＨＥＲ３、およびカニクイザルＨＥＲ３との実質的な交差反応性も呈した（図７Ｂ）。
１０Ｄ１バリアントの全ては、ヒトＨＥＲ３に結合することが実証された（図３３Ａおよび３３Ｂ）。
３．３ Ｏｃｔｅｔ ＱＫ３８４システムを使用したグローバル親和性研究
ＩｇＧ１フォーマットにおける抗ＨＥＲ３抗体クローンを、ヒトＨＥＲ３に対する結合親和性について解析した。
Ｏｃｔｅｔ ＱＫ３８４システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）実験を実施した。抗ヒトＩｇＧ捕捉（ＡＨＣ）Ｏｃｔｅｔセンサーチップ（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ、ＵＳＡ）を、抗ＨＥＲ３抗体（２５ｎＭ）に対して使用した。全ての測定は、２５℃、１０００ｒｐｍで撹拌しながら実施した。抗原の結合についての反応速度の測定は、異なる濃度で１２０秒間、Ｈｉｓタグ付けヒトＨＥＲ３抗原をロードし、続いて、１２０秒間の解離時間を置き、バイオセンサーを、アッセイ緩衝液を含有するウェルに導入することにより実施した。緩衝液効果について、センサーグラムを参照し、次いで、Ｏｃｔｅｔ ＱＫ３８４ユーザーソフトウェア（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ、ＵＳＡ）を使用して当てはめた。反応速度応答は、１部位結合モデルを使用するグローバルフィッティングにかけて、会合速度定数（Ｋｏｎ）、解離速度定数（Ｋｏｆｆ）、および平衡解離定数（ＫＤ）についての値を得た。ソフトウェアにより、確実に当てはめることができる曲線（Ｒ２＞０．９０）だけを、解析に組み入れた。
クローン１０Ｄ１についての解析のための代表的なセンサーグラムを図８に示す。クローン１０Ｄ１は、ＫＤ＝９．５８ｎＭの親和性でヒトＨＥＲ３に結合することが見出された。
ヒト化／最適化された１０Ｄ１バリアントは、ヒトＨＥＲ３に、極めて高度の親和性で結合する。代表的なセンサーグラムを図３６Ａ～３６Ｍに示す。
１０Ｄ１クローンバリアントについて決定された親和性を下記に示す。
Figure 2022548057000022
 クローン４－３５－Ｂ２は、ＫＤ＝８０．９ｎＭの親和性でヒトＨＥＲ３に結合することが見出され（図９）、クローン４－３５－Ｂ４は、ＫＤ＝５０．３ｎＭの親和性でヒトＨＥＲ３に結合することが見出された（図１０）。
３．４ 示差走査蛍光測定法による熱安定性についての解析
簡潔に述べると、０．２ｍｇ／ｍＬの３連の抗体反応ミックス、およびＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、２５μＬのＰＢＳ中で調製し、ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６ウェル反応プレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）のウェルに移し、ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｆｉｌｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でシールした。ＴＡＭＲＡをレポーターとして選択し、ＲＯＸを受動参照として選択して、溶融曲線を、７５００ ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において実行した。熱プロファイルは、傾斜率を１．２％として、２５℃で２分間の初期ステップと、９９℃で２分間の最終ステップとを含んだ。生データの一次微分を、温度の関数としてプロットして、微分溶融曲線を得た。抗体の溶融温度（Ｔｍ）は、微分曲線のピークから抽出した。
抗体クローン１０Ｄ１の熱安定性についての示差走査蛍光測定解析のために得られた生データの一次微分を図１１に示す。抗体の３つの異なる試料を解析した。Ｔｍを７０．３℃であると決定した。
解析はまた、１０Ｄ１バリアントクローンおよびＬＪＭ７１６についても実施した。生データの一次微分、および決定されたＴｍを図３５Ａ～３５Ｃに示す。
３．５ 抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１のエピトープについての解析
抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１を解析して、それが、ＨＥＲ３への結合について、抗ＨＥＲ３抗体ＭＭ－１２１および／またはＬＪＭ－７１６と競合するのかどうかを決定した。ＭＭ－１２１のエピトープは、ＨＥＲ３のドメインＩにマッピングされており、ＮＲＧリガンド結合性部位を遮断する。ＬＪＭ－７１６のエピトープは、ドメインＩＩおよびＩＶにわたり分布するコンフォメーションエピトープにマッピングされており、ＨＥＲ３を不活性コンフォメーションにロックする。
Ｏｃｔｅｔ ＱＫ３８４システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）実験を実施した。抗Ｐｅｎｔａ－ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ）でコーティングされたバイオセンサーチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、ＵＳＡ）を使用して、Ｈｉｓタグ付けヒトＨＥＲ３を捕捉した（７５ｎＭ；３００秒）。飽和抗体による結合（４００ｎＭ；６００秒）を検出し、続いて解離ステップ（１２０秒）、続いて競合抗体との結合（３００ｎＭ；３００秒）の検出、続いて解離ステップ（１２０秒）にかけた。ＭＭ－１２１抗体の可変領域を、ヒトＩｇＧ２およびＩｇカッパのＦｃ骨格を有するＰＤＺベクター内にクローニングした。ＬＪＭ－７１６抗体の可変領域を、ヒトＩｇＧ１およびＩｇカッパのＦｃ骨格を有するＰＤＺベクター内にクローニングした。
解析の結果を図１４Ａおよび１４Ｂに示す。抗ＨＥＲ３抗体は、ＨＥＲ３への結合について、ＭＭ－１２１および／またはＬＪＭ－７１６と競合しないことが見出された。
１０Ｄ１は、ＭＭ－１２１および／またはＬＪＭ－７１６とは別個であり、位相的に離れたＨＥＲ３のエピトープに結合することが見出された。
重複する１５マーのアミノ酸を使用して、全ＨＥＲ３細胞外ドメインをカバーするように１０Ｄ１のエピトープをマッピングした。各固有の１５マーを、Ｃ末端およびＮ末端においてＧＳリンカーにより伸長させ、３８４ウェルプレート内の固有のウェルにコンジュゲートさせ、プレートを、４℃で、１６時間、０．１、１、１０、および１００ｕｇ／ｍｌの１０Ｄ１抗体とインキュベートした。プレートを洗浄し、次いで、２０℃で１時間、ＰＯＤコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧとインキュベートした。最後に、ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙイメージングシステムを使用する、４２５ｎｍにおける化学発光の測定により、結合を査定する前にＰＯＤ基質溶液を、ウェルに２０分間にわたり添加し、定量および解析は、ＰｅｐＳｌｉｄｅ Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェアパッケージを使用して実施した。実験は、２連で実施した。
１０Ｄ１のエピトープは、ドメインＩＩに位置するＨＥＲ３二量体化アームのβヘアピン構造には直接位置せず、代わりにＮ末端からβヘアピンの二量体化界面に位置することが見出された。
１０Ｄ１および１０Ｄ１由来クローンが結合することが決定されたＨＥＲ３の部位は、ヒトＨＥＲ３のアミノ酸配列（例えば、配列番号１に示される）の２１８～２３５位に対応し、ＨＥＲ３のこの領域についてのアミノ酸配列を配列番号２２９に示す。この領域内では、２つのコンセンサスの結合性部位のモチーフが同定され、これを配列番号２３０および２３１に示す。
ＨＥＲ３のこの位置への結合は、ＨＥＲファミリーのヘテロ二量体化と、この帰結としての下流のシグナル伝達経路を妨げるように作用する（実施例４を参照されたい）。結合はリガンド（ＮＲＧ）非依存的である。１０Ｄ１結合性部位は、開放型および閉鎖型のいずれのＨＥＲ３コンフォメーションにおいても溶媒にアクセス可能であり、ＨＥＲ３と他のＨＥＲファミリーメンバーとの間で保存されず、ヒト、マウス、ラット、およびサルのＨＥＲ３オルソログの間で１００％保存される。
実施例４
機能的特徴付け
４．１ ＨＥＲ２とＨＥＲ３との二量体化の阻害
抗ＨＥＲ３抗体を、ＨＥＲ３とＨＥＲ２とのヘテロ二量体化を阻害する、それの能力について解析した。
簡潔に述べると、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を、４℃で１６時間、ＰＢＳ中の０．１μｇ／ｍｌのＨｉｓタグ付けＨＥＲ２タンパク質によりコーティングした。室温でＰＢＳ中の１％のＢＳＡによる１時間のブロッキングの後、組換えビオチニル化ヒトＨＥＲ３タンパク質を、異なる濃度の抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１の存在下で添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。その後、プレートを３回洗浄し、次いで、室温で１時間、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体とインキュベートした。洗浄の後、プレートを、比色検出基質である、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（Ｔｕｒｂｏ－ＴＭＢ；Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）で１０分間現像した。２ＭのＨ２ＳＯ４で反応を停止させ、４５０ｎｍでＯＤを測定した。
結果を図１５に示す。抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１は、ＨＥＲ２とＨＥＲ３との相互作用を用量依存的に阻害することが見出された。
さらなる実験では、ＨＥＲ２：ＨＥＲ３二量体化の阻害について解析した。
さらなる実験では、ＨＥＲ２：ＨＥＲ３二量体化の阻害は、製造業者の指示書に従って、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ Ｂｉｏａｓｓａｙキット（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）を使用して評価した。
簡潔に述べると、１ｍｌのあらかじめ加熱したＣＰ５培地を使用して、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３を過剰発現するＵ２ＯＳ細胞を融解させ、ウェル当たりの５，０００個の細胞を播種し、５％ＣＯ２の雰囲気中、３７℃で４時間培養した。次いで、細胞を、２５μｇ／ｍｌから開始して、１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡまたはペルツズマブの８点の系列希釈で処理した。
インキュベーションの４時間後、３０ｎｇ／ｍｌのヘレグリンβ２を各ウェルに添加し、細胞をさらに１６時間インキュベートした。１０μＬのＰａｔｈＨｕｎｔｅｒバイオアッセイ検出試薬１をウェルに添加し、暗所内、室温で１５分間インキュベートした。これに続き、４０μＬのＰａｔｈＨｕｎｔｅｒバイオアッセイ検出試薬２を添加し、暗所内、室温で６０分間インキュベートした。次いで、遅延を１秒間とする、Ｓｙｎｅｒｇｙ４ Ｂｉｏｔｅｋを使用して、プレートを読み取った。
結果を図６５に示す。１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡは、その低ＩＣ５０により反映される通り、ペルツズマブより大きな効率で、ＨＥＲ２：ＨＥＲ３二量体化を阻害することが見出された。
４．２ 解析のためのがん細胞株の同定
本発明者らは、ＨＥＲ３の阻害について調べるのに適切な細胞を同定するために、がん細胞株によるＥＧＦＲタンパク質ファミリーメンバーの発現を特徴付けた。
図１６Ａは、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ（ＣＣＬＥ；Ｂａｒｒｅｔｉｎａら、Ｎａｔｕｒｅ（２０１２）４８３：６０３～６０７、およびＴｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ＆ Ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、Ｎａｔｕｒｅ（２０１５）５２８：８４～８７）に従って、Ｎ８７、ＳＮＵ１６、ＨＴ２９、ＦａＤｕ、Ａ５４９、ＨＣＣ９５、ＯｖＣＡＲ８、およびＡＨＣＮ細胞によるＥＧＦＲファミリーメンバーおよびリガンドのｍＲＮＡ発現データを示す。図１６Ａはまた、ＦｌｏｗＬｏｇｉｃにより決定される、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３についてのタンパク質発現データも示す。
実験で使用される細胞株は、ＡＴＣＣから購入し、推奨されるとおりに培養した。簡潔に述べると、細胞株は、１０％のＦＢＳおよび１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充した、示した細胞培養培地中で維持した。細胞は、３７℃、５％のＣＯ２中のインキュベーター内で培養した。培養した細胞は、９６ウェルプレート内に適切な播種密度で播種した：ＨＴ２９、ＨＣＣ９５、ＦａＤｕ、およびＯｖＣａｒ８細胞は、２０００細胞／ウェルで播種し、ＮＣｌ－Ｎ８７細胞は、５０００細胞／ウェルで播種し、ＳＮＵ－１６、ＡＣＨＮおよび細胞は、１５００細胞／ウェルで播種し、Ａ５４９細胞は、１２００細胞／ウェルで播種した。
図１６Ｂは、フローサイトメトリーにより決定される、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３の表面発現を示す。簡潔に述べると、５００，０００細胞を、０．５％のＢＳＡと、２ｍＭのＥＤＴＡとを含有する染色緩衝液中で、４℃で１．５時間、一次抗体（２０μｇ／ｍｌ）により染色した。使用した二次抗体は、４℃で２０分間、１０μｇ／ｍｌの抗ヒトＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８であった。
４．３ ＨＥＲ３媒介性シグナル伝達の阻害
抗ＨＥＲ３抗体である１０Ｄ１を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＨＥＲ－３媒介性シグナル伝達を阻害する、その能力について解析した。
簡潔に述べると、Ｎ８７およびＦａＤｕ細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で１０％の血清と共に６ウェルプレートのウェル内に播種した。１６時間後、細胞を１％のＦＢＳ細胞培養培地中で一晩の培養により（血清中の増殖因子により誘発されるシグナル伝達を低減するように）飢餓させた。翌日、細胞を、５０μｇ／ｍｌの抗ＨＥＲ３抗体である１０Ｄ１で、４時間処理するのに続き、ＮＲＧ（１００ｎｇ／ｍｌ）による１５分間の刺激にかけた。次いで、タンパク質を抽出し、標準的なＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを使用して定量し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分画し、ニトロセルロース膜に転写した。次いで、膜をブロッキングし、４℃で一晩、以下の抗体、抗ｐＨＥＲ３、抗ｐＡＫＴ、ｐａｎ抗ＨＥＲ３、ｐａｎ抗ＡＫＴ、および抗ベータ－アクチンによる免疫ブロットにかけた。ブロットは、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｃｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ基質によって視覚化し、バンドは、光学濃度測定解析を使用して定量し、データは、ベータアクチン対照に対して正規化した。
結果を図１７に示す。抗ＨＥＲ３抗体である１０Ｄ１は、ＨＥＲ３のリン酸化、および下流のシグナル伝達を阻害することが見出された。
さらなる実験では、本発明者らは、ＨＥＲ３の抗ＨＥＲ３抗体媒介性阻害に影響を受ける、細胞内シグナル伝達経路について調べた。
ＦａＤｕ細胞は、３７℃、５％ＣＯ２で、１０％の血清と共に６ウェルプレートのウェル内に播種した。１６時間後、細胞を１％のＦＢＳ細胞培養培地中で一晩の培養により飢餓させた。翌日、細胞を、５０μｇ／ｍｌの抗ＨＥＲ３抗体である１０Ｄ１で４時間処理し、続いて、ＮＲＧ（１００ｎｇ／ｍｌ）による１５分間の刺激にかけた。次いで、タンパク質を抽出し、標準的なＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを使用して定量し、あらかじめブロッキングされたＰｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ膜（Ｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と、４℃で一晩インキュベートした。次いで、膜を洗浄緩衝液で洗浄し、室温で２時間、検出抗体カクテルとインキュベートし、続いて、ＨＲＰコンジュゲート抗ＩｇＧと洗浄し、インキュベートした。２時間後、膜を洗浄し、キットの検出緩衝液を使用して、プロービングした。Ｓｙｎｇｅｎｅ Ｇｂｏｘイメージングシステムにより、画像を捕捉し、各ドット／リンタンパク質の強度を測定し、抗体の非存在下で、同様に処理された細胞について測定された強度との比較により、阻害パーセントを計算した。
結果を図１８に示す。抗ＨＥＲ３抗体である１０Ｄ１は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲおよびＭＡＰＫシグナル伝達を阻害することが見出された。
さらなる実験では、本発明者らは、ＨＥＲ３発現細胞の増殖に対する、抗ＨＥＲ３抗体である１０Ｄ１による処理の効果について調べた。
簡潔に述べると、Ｎ８７およびＦａＤｕ細胞を、１００μｇ／ｍｌから開始して、９点の半対数希釈により系列希釈された濃度の抗ＨＥＲ３抗体である１０Ｄ１で処理した。細胞増殖は、５日の期間後に、製造業者の指示書に従って、ＣＣＫ－８増殖アッセイ（Ｄｏｊｉｎｄｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して測定した。簡潔に述べると、１倍濃度のＣＣＫ－８溶液を各ウェルに添加し、続いて、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、４５０ｎｍでＯＤを測定した。
図１９Ａおよび１９Ｂは、非処理対照細胞と比べた細胞コンフルエンスのパーセントを示す（データ点は３連の平均である）。
抗ＨＥＲ３抗体である１０Ｄ１は、Ｎ８７およびＦａＤｕ細胞による細胞増殖の用量依存性阻害を呈した。
実施例５
ｉｎ ｖｉｖｏにおける解析
５．１ 薬物動態解析
約６～８週齢の雌ＮＣｒヌードマウスを特定の無病原体条件下で飼育し、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）ガイドラインに準拠して処置した。
５００μｇの抗ＨＥＲ３抗体を投与し、血液は、ベースライン（－２時間）、投与の０．５時間、６時間、２４時間、９６時間、１６８時間、および３３６時間後に得た。血清中の抗体を、ＥＬＩＳＡにより定量した。
結果を図５０に示す。抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１は、ＮＣｒヌードマウスにおいて１６．３日の半減期を有することが見出された。
５．２ 安全性免疫毒性
抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１を、ＩＭＧＴ ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ（Ｅｈｒｅｎｍａｎｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３８、Ｄ３０１～３０７（２０１０））およびＩＥＤＢ脱免疫化（Ｄｈａｎｄａら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．（２０１８）１５３（１）：１１８～１３２）ツールを使用して安全性および免疫原性についてコンピュータにより解析した。
抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１は、潜在的な免疫原性ペプチドの数が、安全であると考えるのに十分なほど少なく、潜在的な開発可能性の問題を引き起こし得る他の特性を所有しなかった。
図３７の表は、安全性および開発可能性に関する１０Ｄ１バリアントクローンの特性についての概観を提示する。
実施例５．３に記載される実験において、抗ＨＥＲ３抗体で処置されたマウスを、体重の変化および肉眼剖検についてモニタリングした。これらのマウスでは、ビヒクルだけで処置されたマウスと比較して、差が検出されなかった。
血液毒性を、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（２０～２５ｇ）に、１０００μｇの抗ＨＥＲ３ １０Ｄ１抗体または等容積のＰＢＳの単回投与用量を腹腔内注射する実験において調べた。血液試料は、注射の９６時間後に得、フローサイトメトリーにより異なる種類の白血球の数、ならびにＮＡ＋、Ｋ＋、およびＣｌ－の電解質指標について解析した。
図５１Ａおよび５１Ｂは、異なる細胞型の数および電解質指標が、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒの参照範囲内にある（３匹のマウス）ことが見出され、ＰＢＳ処置群（３匹のマウス）と有意に異ならないことを示す。左バーはビヒクルを表し、右バーは１０Ｄ１による処置を表し、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒの参照範囲の端点は点線で示される。異なる群間で、臨床徴候、肉眼剖検、または体重の差違は検出されなかった。
マウスをまた、注射の９６時間後に、肝毒性、腎毒性、および膵毒性の相関因子についても解析した。１０００μｇの抗ＨＥＲ３抗体の単回用量の投与の後で検出される、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（ＣＲＥＡ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルコース（ＧＬＵ）、カルシウム（ＣＡＬ）、総ビリルビン（ＢＩＬ）、総タンパク質（ＴＰＲ）、およびアルブミン（ＡＬＢ）のレベルは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒの参照範囲内にあることが見出され、ＰＢＳ処置群におけるこれらのマーカーのレベルと有意に異ならない。これらを図５１Ｃ～５１Ｆに示す。左バーはビヒクルを表し、右バーは１０Ｄ１による処置を表し、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒの参照範囲の端点は点線で示される。１０Ｄ１による処置は、腎臓指標、肝臓指標、または膵臓指標に影響を及ぼさず、従って、正常な腎臓、肝臓、または膵臓の機能に影響しない。
５．３ ｉｎ ｖｉｖｏでのがんを処置する有効性についての解析
約６～８週齢の雌ＮＣｒヌードマウスを、ＩｎＶｉｖｏｓ（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）から購入した。動物は、特定の無病原体条件下で飼育し、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）ガイドラインに準拠して処置した。
使用した細胞株は、Ｎ８７細胞（胃がん）、ＦａＤｕ細胞（頭頸部がん）、ＯｖＣＡＲ８細胞（卵巣がん）、ＳＮＵ１６細胞（胃がん）、ＨＴ２９細胞（結腸直腸がん）、Ａ５４９細胞（肺がん）、ＨＣＣ９５細胞（肺がん）、およびＡＨＣＮ細胞（腎がん）を含んだ。
腫瘍体積は、デジタル式キャリパーを使用して毎週３回測定し、式［Ｌ×Ｗ２／２］を使用して計算した。対照アームの腫瘍が、１．５ｃｍ超の長さと測定されたら、研究の終点に到達したとみなした。
５．３．１ Ｎ８７モデル
図２０は、抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１（実施例２．２の［１］）の抗がん効果を、Ｎ８７細胞株に由来するマウス胃癌モデルにおいて調べる実験において得られた結果を示す。モデルは、右脇腹への１×１０６個のＮ８７細胞の皮下注入により確立した（処置群当たりｎ＝６のマウス）。
１０Ｄ１を、投与１回当たり５００μｇで、隔週（合計１０回の投与）でＩＰ投与し、対照処置群には、等容積のＰＢＳを与えた。
このモデルでは、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１は、効力が大きく、腫瘍の増殖を約７６％阻害することができることが見出された。
図２１は、抗ＨＥＲ３抗体クローン４－３５－Ｂ４を、１１ｍｇ／ｋｇ（合計４回の投与）の用量で毎週ＩＰ投与する、同様の実験において得られた結果を示す。このモデルでは、抗ＨＥＲ３抗体クローン４－３５－Ｂ４は、効力が大きく、腫瘍の増殖を約６０％阻害することができることが同様に見出された。
５．３．２ ＳＮＵ１６モデル
図２２は、抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１（実施例２．２の［１］）の抗がん効果を、ＳＮＵ１６細胞株に由来するマウス胃癌モデルにおいて調べる実験において得られた結果を示す。モデルは、右脇腹への１×１０６個のＳＮＵ１６細胞の皮下注入により確立した（処置群当たりｎ＝６のマウス）。
１０Ｄ１を、投与１回当たり５００μｇで、隔週（合計９回の投与）でＩＰ投与し、対照処置群には、等容積のＰＢＳを与えた。
このモデルでは、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１は、効力が大きく、腫瘍の増殖を約６８％阻害することができることが見出された。
５．３．３ ＦａＤｕモデル
図２３は、抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１（実施例２．２の［１］）の抗がん効果を、ＦａＤｕ細胞株に由来する頭頸部扁平上皮癌のマウスモデルにおいて調べる実験において得られた結果を示す。モデルは、雌ＮＰＧマウスの右脇腹への１×１０６個のＦａＤｕ細胞の皮下注入により確立した（ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマの表現型；処置群当たりｎ＝６のマウス）。
１０Ｄ１を、投与１回当たり５００μｇで、毎週（合計４回の投与）でＩＰ投与した。対照処置群には、等容積のＰＢＳ、または同じ用量のアイソタイプ対照抗体を与えた。
このモデルでは、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１は、効力が大きく、腫瘍の増殖を約８５％阻害することができることが見出された。
図２４は、抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１（実施例２．２の［１］）の抗がん効果を、ＦａＤｕ細胞株に由来する頭頸部扁平上皮癌のマウスモデルにおいて調べる実験において得られた結果を示す。モデルは、雌ＮＣｒヌードマウスの右脇腹への１×１０６個のＦａＤｕ細胞の皮下注入により確立した（処置群当たりｎ＝６のマウス）。
１０Ｄ１を、投与１回当たり５００μｇで、隔週（合計８回の投与）でＩＰ投与し、対照処置群には、等容積のＰＢＳを与えた。
このモデルでは、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１は、効力が大きく、腫瘍の増殖を約８６％阻害することができることが見出された。
５．３．４ ＯｖＣＡＲ８モデル
図２５は、抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１（実施例２．２の［１］）の抗がん効果を、ＯｖＣＡＲ８細胞株に由来する卵巣癌のマウスモデルにおいて調べる実験において得られた結果を示す。モデルは、雌ＮＣｒヌードマウスの右脇腹への１×１０６個のＯｖＣＡＲ８細胞の皮下注入により確立した（処置群当たりｎ＝６のマウス）。
１０Ｄ１を、投与１回当たり５００μｇで、隔週（合計９回の投与）でＩＰ投与し、対照処置群には、等容積のＰＢＳを与えた。
このモデルでは、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１は、効力が大きく、腫瘍の増殖を約７４％阻害することができることが見出された。
５．３．５ ＨＣＣ－９５モデル
図２６は、抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１（実施例２．２の［１］）の抗がん効果を、ＨＣＣ－９５細胞株に由来する扁平上皮肺癌のマウスモデルにおいて調べる実験において得られた結果を示す。モデルは、雌ＮＣｒヌードマウスの右脇腹への１×１０６個のＨＣＣ－９５細胞の皮下注入により確立した（処置群当たりｎ＝６のマウス）。
１０Ｄ１を、投与１回当たり５００μｇで、隔週（合計４回の投与）でＩＰ投与し、対照処置群には、等容積のＰＢＳを与えた。
このモデルでは、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１は、効力が大きく、腫瘍の増殖を約９０％阻害することができることが見出された。
５．３．６ Ａ５４９モデル
図２７は、抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１（実施例２．２の［１］）の抗がん効果を、Ａ５４９細胞株に由来する肺腺癌のマウスモデルにおいて調べる実験において得られた結果を示す。モデルは、雌ＮＣｒヌードマウスの右脇腹への１×１０６個のＡ５４９細胞の皮下注入により確立した（処置群当たりｎ＝６のマウス）。
１０Ｄ１を、投与１回当たり５００μｇで、隔週（合計１０回の投与）でＩＰ投与し、対照処置群には、等容積のＰＢＳを与えた。
このモデルでは、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１は、効力が大きく、腫瘍の増殖を約９１％阻害することができることが見出された。
図２８は、抗ＨＥＲ３抗体クローン４－３５－Ｂ２の抗がん効果を、雌ＮＰＧマウス（ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマの表現型）の右脇腹への１×１０６個のＡ５４９細胞の注入により確立したＡ５４９細胞株に由来するモデルにおいて調べる、同様の実験において得られた結果を示す。抗ＨＥＲ３抗体クローン４－３５－Ｂ２を、投与１回当たり５００μｇの用量で、毎週（合計４回の投与）でＩＰ投与した。対照処置群には、等容積のＰＢＳを与えた（処置群当たり６匹のマウス）。
このモデルでは、抗ＨＥＲ３抗体クローン４－３５－Ｂ２は、効力が大きく、腫瘍の増殖を約６３％阻害することができることが同様に見出された。
５．３．６ ＡＣＨＮモデル
図２９は、抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１（実施例２．２の［１］）の抗がん効果をＡＣＨＮ細胞株に由来する腎細胞癌のマウスモデルにおいて調べる実験において得られた結果を示す。モデルは、雌ＮＣｒヌードマウスの右脇腹への１×１０６個のＡＣＨＮ細胞の皮下注入により確立した（処置群当たりｎ＝６のマウス）。
１０Ｄ１を、投与１回当たり５００μｇで、隔週（合計７回の投与）でＩＰ投与し、対照処置群には、等容積のＰＢＳを与えた。
このモデルでは、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１は、効力が大きく、腫瘍の増殖を約６１％阻害することができることが見出された。
５．４ 胃癌の処置
ヒトにおける第一段階
トラスツズマブが奏効しなかったか、またはこれを与えることができない、ＨＥＲ２＋進行型胃がんを有する患者を、安全性補正型「Ｍｉｎｉｍａｌ Ａｎｔｉｃｉｐａｔｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｆｆｅｃｔ Ｌｅｖｅｌ」（ＭＡＢＥＬ）手法に従って計算した用量における、１０Ｄ１、１０Ｄ１＿ｃ７５、１０Ｄ１＿ｃ７６、１０Ｄ１＿ｃ７７、１０Ｄ１＿ｃ７８ｖ１、１０Ｄ１＿ｃ７８ｖ２、１０Ｄ１＿１１Ｂ、１０Ｄ１＿ｃ８５ｖ１、１０Ｄ１＿ｃ８５ｖ２、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２、１０Ｄ１＿ｃ８７、１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿ｃ９０、１０Ｄ１＿ｃ９１、１０Ｄ１＿ｃ９２、および１０Ｄ１＿ｃ９３から選択される抗ＨＥＲ３抗体の静脈内注射により処置する。投与後２８日間にわたり患者をモニタリングする。
次いで、有害事象共通用語規準（Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ）（ＣＴＣＡＥ）に従って患者を評価して、処置の安全性および忍容性を決定し、分子の薬物動態を決定した。
抗ＨＥＲ３抗体による処置は、安全かつ忍容性であることが見出される。
用量漸増－単剤療法
トラスツズマブが奏効しなかったか、またはこれを与えることができない、ＨＥＲ２＋進行型胃がんを有する１２～４８人の患者を、３＋３モデルベースの過大用量制御を伴う増量（ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｏｖｅｒｄｏｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）（ＥＷＯＣ）型用量漸増に従って、１０Ｄ１、１０Ｄ１＿ｃ７５、１０Ｄ１＿ｃ７６、１０Ｄ１＿ｃ７７、１０Ｄ１＿ｃ７８ｖ１、１０Ｄ１＿ｃ７８ｖ２、１０Ｄ１＿１１Ｂ、１０Ｄ１＿ｃ８５ｖ１、１０Ｄ１＿ｃ８５ｖ２、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２、１０Ｄ１＿ｃ８７、１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿ｃ９０、１０Ｄ１＿ｃ９１、１０Ｄ１＿ｃ９２、および１０Ｄ１＿ｃ９３（例えば、１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿ｃ９０、または１０Ｄ１＿ｃ９１；例えば、１０Ｄ１＿ｃ８９）から選択される抗ＨＥＲ３抗体の静脈内注射により処置する。
次いで、有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）に従って患者を評価して、処置の安全性および忍容性を決定し、分子の薬物動態および処置の有効性を評価する。最大耐量（ＭＴＤ）および最大投与量（ＭＡＤ）も決定する。
用量漸増－併用療法
トラスツズマブが奏効しなかったＨＥＲ２＋進行型胃がんを有する９～１８人の患者を、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（３ｍｇ／ｋｇ）を伴う、３＋３モデルベースの漸増に従って、トラスツズマブと組み合わせた、１０Ｄ１、１０Ｄ１＿ｃ７５、１０Ｄ１＿ｃ７６、１０Ｄ１＿ｃ７７、１０Ｄ１＿ｃ７８ｖ１、１０Ｄ１＿ｃ７８ｖ２、１０Ｄ１＿１１Ｂ、１０Ｄ１＿ｃ８５ｖ１、１０Ｄ１＿ｃ８５ｖ２、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２、１０Ｄ１＿ｃ８７、１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿ｃ９０、１０Ｄ１＿ｃ９１、１０Ｄ１＿ｃ９２、および１０Ｄ１＿ｃ９３（例えば、１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿ｃ９０、または１０Ｄ１＿ｃ９１；例えば、１０Ｄ１＿ｃ８９）から選択される抗ＨＥＲ３抗体の静脈内注射により処置する。
次いで、有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）に従って患者を評価して、処置の安全性および忍容性を決定し、分子の薬物動態および処置の有効性を評価する。
用量拡大
トラスツズマブが最近奏効せず、患者の腫瘍が遺伝子的に、かつ組織学的に十分に特徴付けられているＨＥＲ２＋進行型胃がんを有する患者を、トラスツズマブ、シスプラチン、および５－ＦＵまたはカペシタビンのいずれかと組み合わせた、１０Ｄ１、１０Ｄ１＿ｃ７５、１０Ｄ１＿ｃ７６、１０Ｄ１＿ｃ７７、１０Ｄ１＿ｃ７８ｖ１、１０Ｄ１＿ｃ７８ｖ２、１０Ｄ１＿１１Ｂ、１０Ｄ１＿ｃ８５ｖ１、１０Ｄ１＿ｃ８５ｖ２、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ１、１０Ｄ１＿ｃ８５ｏ２、１０Ｄ１＿ｃ８７、１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿ｃ９０、１０Ｄ１＿ｃ９１、１０Ｄ１＿ｃ９２、１０Ｄ１＿ｃ９３（例えば、１０Ｄ１＿ｃ８９、１０Ｄ１＿ｃ９０、または１０Ｄ１＿ｃ９１；例えば、１０Ｄ１＿ｃ８９）から選択される抗ＨＥＲ３抗体により処置する。
抗ＨＥＲ３抗体は、安全かつ忍容性であり、がん細胞の数／比率を低減し、腫瘍細胞マーカーの発現を低減し、無増悪生存期間を延長し、全生存期間を延長することができることが見出される。
実施例６
親和性成熟させ、ヒト化したクローン
親マウス抗体１０Ｄ１Ｐの可変領域のヒト化を、ＣＤＲグラフティングにより行った。グラフティングのためのヒトフレームワーク配列を、ヒトＶドメインデータベースに対して親アミノ酸配列をｂｌａｓｔ解析する（ｂｌａｓｔｉｎｇ）ことによって同定し、親配列に対する同一性が最大である遺伝子を選択した。マウスＣＤＲを、選択したヒトフレームワーク内にグラフトすると、フレームワークのカノニカルの位置における残基を、抗原への結合を保存するように親マウス配列に復帰突然変異させた。１０Ｄ１Ｐの合計９つのヒト化バリアントを設計した。
酵母ディスプレイを使用する、２ラウンドの親和性成熟により、ヒトＨＥＲ３に対する親和性を増大させた。第１ラウンドでは、設計した９つのバリアントの混合ライブラリーをランダム突然変異誘発により構築し、ビオチン化抗原を使用するフローサイトメトリーによりスクリーニングした。第２ラウンドでは、第１ラウンドで単離した１つの重鎖および１つの軽鎖クローンを鋳型として使用して、第２のライブラリーを生成し、スクリーニングした。合計１０個のヒト化し、親和性成熟させたクローンを単離した。
１０Ｄ１Ｐを設計し、単離したヒト化バリアントの可変領域内の潜在的不安定性（免疫原性、グリコシル化部位、露出した反応性残基、凝集可能性）を、コンピュータ予測ツールを使用して査定した。ＩＥＤＢ脱免疫化ツールを使用して、配列を脱免疫化した。１０Ｄ１Ｆの最終配列を、その開発可能性特徴、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏでの物理化学的および機能的特性に基づいて最適化バリアントの間で選択した。
クローン１０Ｄ１Ｆは、配列番号３６のＶＨと、配列番号８３のＶＬとを含む。１０Ｄ１Ｆは、ヒト重鎖との８９．９％の相同性、およびヒト軽鎖との８５．３％の相同性を呈する。
１０Ｄ１Ｆの可変領域と、ヒトＩｇＧ１の定常領域とを含み、配列番号２０６および２０７のポリペプチドから構成される抗原結合性分子を、１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ（本明細書では、場合によってまた、「１０Ｄ１Ｆ．Ａ」または「抗ＨＥＲ３クローン１０Ｄ１＿ｃ８９ ＩｇＧ１」とも称し、例えば、実施例２．２の［１６］を参照されたい）と指定する。
実施例７
Ｆｃの操作
抗体の効力を増大させる、例えば、Ｆｃエフェクター機能を最適化し、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）および／または抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）を増強し、半減期を改善する突然変異をＣＨ２および／またはＣＨ３領域内に含むように、１０Ｄ１および１０Ｄ１バリアントを操作した。
ＣＨ２領域内に、修飾「ＧＡＳＤＡＬＩＥ」（Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ）および「ＬＣＫＣ」（Ｌ２４２Ｃ、Ｋ３３４Ｃ）を含むように、クローン１０Ｄ１および１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡのＦｃ領域を修飾した。ＧＡＳＤＡＬＩＥ置換は、ＦｃγＲＩＩａ（ＧＡ）およびＦｃγＲＩＩＩａ（ＳＤＡＬＩＥ）受容体に対する親和性を増大させ、ＡＤＣＰおよびＮＫ媒介性ＡＤＣＣ（実施例８．８を参照されたい）を増強する一方で、Ｃ１ｑに対する親和性を低下させ（ＡＬ）、ＣＤＣを低減することが見出された。ＬＣＫＣ置換は、新たな分子内ジスルフィド架橋を創出することにより、Ｆｃ領域の熱安定性を増大させることが見出された。
ＧＡＳＤＡＬＩＥおよびＬＣＫＣ突然変異を含む、１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ重鎖ポリペプチドの修飾型を配列番号２２５に示す。配列番号２２５および２０７のポリペプチドから構成される抗原結合性分子を、１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢ（本明細書では、場合によってまた、「１０Ｄ１Ｆ．Ｂ」とも称する）と指定する。
ＣＨ２領域内に、ＧＡＳＤＡＬＩＥおよびＬＣＫＣ置換を含む１０Ｄ１の修飾型を調製し、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａに結合するその能力を、バイオレイヤー干渉法により解析した。Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅと、Ｌ２４２Ｃ、Ｋ３３４Ｃとに対応する置換ＧＡＳＤＡＬＩＥおよびＬＣＫＣを含む、１０Ｄ１ ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３の配列を配列番号２２７に示す。
簡潔に述べると、抗Ｐｅｎｔａ－ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ）でコーティングしたバイオセンサーチップ（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ、ＵＳＡ）を使用して、Ｈｉｓタグ付けＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）（２７０ｎＭ）を１２０秒捕捉した。全ての測定は、２５℃、１０００ｒｐｍで撹拌しながら実施した。抗原への結合についての会合反応速度の測定は、抗ＨＥＲ３抗体を異なる濃度（５００ｎＭ～１５．６ｎＭ）で６０秒間インキュベートし、続いて、１２０秒の解離時間を置き、バイオセンサーを、アッセイ緩衝液（ｐＨ７．２）を含有するウェルに導入することにより実施した。緩衝液効果について、センサーグラムを参照し、次いで、Ｏｃｔｅｔ ＱＫ３８４ユーザーソフトウェア（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ、ＵＳＡ）を使用して当てはめた。反応速度応答は、１部位結合モデルを使用するグローバルフィッティングにかけて、会合速度定数（Ｋｏｎ）、解離速度定数（Ｋｏｆｆ）、および平衡解離定数（ＫＤ）についての値を得た。ソフトウェアにより、確実に当てはめることができる曲線（Ｒ２＞０．９０）だけを、解析に組み入れた。
バリアントの熱安定性もまた、実施例３．４で記載した通りに、示差走査蛍光測定解析により解析した。
図３８Ａおよび３８Ｂは、それぞれ、ＧＡＳＤＡＬＩＥおよびＬＣＫＣ Ｆｃ置換を含む１０Ｄ１について、ＢＬＩ解析および熱安定性解析を示す。Ｆｃ操作１０Ｄ１バリアントは、非Ｆｃ操作１０Ｄ１と比較して、ＦｃγＲＩＩＩａに対する顕著に改善された結合（親和性の約９倍の増大）を示し（図３９Ａを参照されたい）、熱安定性は６０℃を上回っても維持された。
ＣＨ２領域内にＧＡＳＤ置換を含む１０Ｄ１についての構築物も調製し、Ｇ２３６ＡおよびＳ２３９Ｄに対応する置換を含む、１０Ｄ１ ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３の配列を配列番号２２８に示す。
抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１（実施例２．２の［１］）、およびこのＧＡＳＤバリアントの親和性を、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合親和性についてのバイオレイヤー干渉法により解析した。ＢＬＩを、上記で記載した通りに実施した。
図３９Ａおよび３９Ｂは、代表的なセンサーグラム、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤ値を示す。予測される通り、１０Ｄ１ ＧＡＳＤバリアント（３９Ｂ）は、１０Ｄ１（３９Ａ）と比較して、ＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性の劇的な増大を呈した。
１０Ｄ１ ＧＡＳＤバリアントの熱安定性もまた、実施例３．４で記載した通りに、示差走査蛍光測定解析により解析した。結果を図４０に示す。
さらなる１０Ｄ１Ｆ Ｆｃバリアント
ＣＨ２領域内にＮ２９７Ｑ置換を含む、別の抗体バリアントを創出した。Ｎ２９７Ｑ置換を含む、１０Ｄ１Ｆ ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３のための代表的な配列を配列番号２２６に示す。この「サイレント形態」は、Ｆｃ領域のＮ結合型グリコシル化、およびＦｃγ受容体へのＦｃの結合の両方を阻止し、陰性対照として使用される。
図４１Ａおよび４１Ｂは、上記で記載した通りに決定された、ヒトおよびマウスＦｃ受容体に対する、１０Ｄ１Ｆ ｈＩｇＧ１ Ｆｃバリアント１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡおよび１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢの結合親和性を示す。１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢは、非修飾の１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡまたは市販の抗体と比較して、ヒトおよびマウスのＦｃγおよびＦｃＲｎ受容体に対する顕著に改善された結合を示すことが見出された。ＮＤ＝低結合親和性のために決定されていないＫＤ。
実施例８
ヒト化および修飾クローンの特徴付け
８．１ フローサイトメトリーによる細胞表面の抗原結合についての解析
野生型（ＷＴ）ＨＥＫ２９３細胞（高レベルのＨＥＲ３を発現しない）、およびヒトＨＥＲ３をコードするベクターをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（すなわち、ＨＥＫ２９３ ＨＥＲ Ｏ／Ｅ細胞）を、１０μｇ／ｍｌのヒト化抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ（１０Ｄ１Ｆ）、抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１（１０Ｄ１Ｐ）、またはアイソタイプ対照抗体と、４℃で１．５時間インキュベートした。抗ＨＥＲ３抗体クローンＬＪＭ７１６（例えば、Ｇａｒｎｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０１３）７３：６０２４～６０３５、および実施例３．５に記載されている）を、陽性対照として解析に組み入れた。
細胞を、緩衝液（２ｍＭのＥＤＴＡおよび０．５％のＢＳＡを含むＰＢＳ）で洗浄し、４℃で２０分間、１０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣコンジュゲート抗ＦＣ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）中に再懸濁した。細胞を再度洗浄し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、フローサイトメトリー解析のために、２００μＬのＦＡＣＳフロー緩衝液（５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ）中に再懸濁した。無染色のＷＴおよびトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、陰性対照として解析に組み入れた。収集の後、Ｆｌｏｗｌｏｇｉｃソフトウェアを使用して全ての生データを解析した。前方散乱および側方散乱プロファイルを使用して、細胞にゲートをかけ、陽性細胞の百分率を、天然および過剰発現細胞集団について決定した。
結果を図４２Ａおよび４２Ｂに示す。抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡは、高度の特異性でヒトＨＥＲ３に結合することが示された（４２Ａ）。１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、１０Ｄ１Ｐ、およびＬＪＭ７１６は、ヒトＨＥＲ３発現細胞に、同程度に結合することが示された（４２Ｂ）。
８．２ 抗体の特異性および交差反応性を決定するためのＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡを使用して、１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ抗体の結合特異性を確認した。抗体を、ヒトＨＥＲ３ポリペプチド、ならびにヒトＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）およびヒトＨＥＲ２（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｎａ）に結合する、それらの能力について解析した。ヒトＩｇＧアイソタイプおよび無関係な抗原を、陰性対照として組み入れた。
ＥＬＩＳＡを、標準的なプロトコールに従って行った。プレートを、４℃で１６時間、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）中の０．１μｇ／ｍｌの標的ポリペプチドによりコーティングした。室温でトリス緩衝液生理食塩液（ＴＢＳ）中の１％のＢＳＡによる１時間のブロッキングの後、抗ＨＥＲ３抗体を、最高濃度を１０μｇ／ｍｌとして系列希釈し、プレートに添加した。室温で１時間のインキュベーション後、プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含有するＴＢＳ（ＴＢＳ－Ｔ）で３回洗浄し、次いで、室温で１時間、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）とインキュベートした。洗浄の後、プレートを、比色検出基質である、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（Ｔｕｒｂｏ－ＴＭＢ；Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）で１０分間現像した。２ＭのＨ２ＳＯ４で反応を停止させ、４５０ｎｍでＯＤを測定した。
結果を図４３に示す。抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡは、高抗体濃度であってもなお、ヒトＨＥＲ２またはヒトＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）に結合しないことが見出された。
フローサイトメトリーを使用して、１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡが、ＨＥＲ４に結合する能力を解析した。野生型（ＷＴ）ＨＥＫ２９３細胞（高レベルのＨＥＲ４を発現しない）、およびヒトＨＥＲ４をコードするベクターをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（すなわち、ＨＥＫ２９３ ＨＥＲ Ｏ／Ｅ細胞）を、４℃で１．５時間、１０μｇ／ｍｌの抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ（１０Ｄ１Ｆ）、またはアイソタイプ対照抗体（陰性対照）とインキュベートした。抗ＨＥＲ３抗体クローンＬＪＭ７１６（例えば、Ｇａｒｎｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０１３）７３：６０２４～６０３５に記載されている）、および実施例３．５に記載されているＭＭ－１２１（セリバンツマブ）を、陽性対照として解析に組み入れた。また、市販の抗ＨＥＲ４抗体（Ｎｏｖｕｓ、型番：ＦＡＢ１１３１１Ｐ）も組み入れた。無染色のＨＥＫ２９３細胞を、陰性対照として解析に組み入れた。
ＨＥＫ２９３細胞を、４℃で１時間、１０μｇ／ｍｌの各抗体と共に、インキュベートした。フローサイトメトリーを、上記で記載した通りに実施した。細胞を、４℃で３０分間、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＦＣ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）と接触させた。
結果を図４４に示す。抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡは、細胞表面に発現されたＨＥＲ４に結合しないことが見出された。
加えて、抗体１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡを、マウス、ラット、およびサル（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｎａ）に由来するＨＥＲ３ポリペプチド相同体に結合する、その能力について解析した。ハツカネズミ（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ドブネズミ（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、およびカニクイザル（Ｍ．ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）のＨＥＲ３相同体は、それぞれ、ヒトＨＥＲ３と、９１．１、９１．０、および９８．９％の配列同一性を共有し、ＨＥＲ３シグナル伝達経路は、４つの種の間で保存されている。
ＥＬＩＳＡを、上記の通りに実施した。
結果を図４５に示す。１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ抗体は、ＨＥＲ３のカニクイザル、マウス、ラット、およびヒトオルソログに高親和性で結合し、これにより、種間の実質的な交差反応性を呈することが見出された。
８．３ Ｏｃｔｅｔ ＱＫ３８４システムを使用するグローバル親和性研究
抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡおよび１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢを、ヒトＨＥＲ３に対する結合親和性について解析した。
Ｏｃｔｅｔ ＱＫ３８４システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）実験を実施した。抗ヒトＩｇＧ捕捉（ＡＨＣ）Ｏｃｔｅｔセンサーチップ（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ、ＵＳＡ）を、抗体（２５ｎＭ）でコーティングした。結合を、ベースライン（６０秒）、ローディング（１２０秒）、ベースライン２（６０秒）、会合（１２０秒）、解離（ＦｃＡ１２０秒、ＦｃＢ６００秒）、および再生（１５秒）のステップにおいて、ＨＩＳタグ付けヒトＨＥＲ３の滴定を使用して検出した。抗原濃度を、図４６Ａおよび４６Ｂにおける表に示す。センサーグラムを、実施例３．３に記載した通りに解析した。値は、会合速度定数（Ｋｏｎ）、解離速度定数（Ｋｏｆｆ）、および平衡解離定数（ＫＤ）について得た。
クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡおよび１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢについての解析のための代表的なセンサーグラムを図４６Ａおよび４６Ｂに示す。１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡは、ＫＤ＝７２．６ｐＭの高親和性でヒトＨＥＲ３に結合する（４６Ａ）。１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢは、ＫＤ＝２２．２ｐＭの高親和性でヒトＨＥＲ３に結合する（４６Ｂ）。
８．４ 示差走査蛍光測定法による熱安定性についての解析
示差走査蛍光測定法は、抗体１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡおよび１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢについて、実施例３．４に記載される通りに実施した。
抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡの熱安定性についての示差走査蛍光測定解析のために得られた生データの一次微分を図４７Ａに示す。抗体の３つの異なる試料を解析し、Ｔｍを７０．０℃であると決定した。
抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢの熱安定性についての示差走査蛍光測定解析のために得られた生データの一次微分を図４７Ｂに示す。抗体の３つの異なる試料を解析し、Ｔｍを６２．７℃であると決定した。
８．５ 抗体純度解析
抗体１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡおよび１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢの純度を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により解析した。５００μｌのＰＢＳ ｐＨ７．２中の１５０μｇの１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、または５００μｌのＰＢＳ ｐＨ７．４５中の１５０μｇの１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢを、室温で、それぞれ、０．７５分／ｍｌまたは０．５分／ｍｌの流量で、ＰＢＳランニング緩衝液中にＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３０ ＧＬカラム上で注入し、フロースルーのＡ２８０を記録した。
結果を、図４８Ａ（１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ）および４８Ｂ（１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢ）に示す。
８．６ 抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡのエピトープについての解析
抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡを解析して、それが、ＨＥＲ３への結合について、抗ＨＥＲ３抗体Ｍ－０５－７４またはＭ－０８－１１（Ｒｏｃｈｅ）と競合するのかどうかを決定した。Ｍ－０５－７４およびＭ－０８－１１のエピトープは、いずれも、ドメインＩＩに位置するＨＥＲ３二量体化アームのβ－ヘアピン構造にマッピングされた。Ｍ－０８－１１が、ＨＥＲ４に結合しないのに対し、Ｍ－０５－７４は、ＨＥＲ４二量体化アームを認識する。ＨＥＲ３へのＭ－０５－７４およびＭ－０８－１１の結合は、リガンド（ＮＲＧ）非依存的である。
ＢＬＩ実験は、１つの変更：４００ｎＭの競合抗体を使用したことを伴いながら、実施例３．５に記載した通りに実施した。Ｍ－０５－７４およびＭ－０８－１１抗体の可変領域を、ヒトＩｇＧ１およびＩｇカッパのＦｃ骨格を有するＰＤＺベクター内にクローニングした。
解析の結果を、図４９Ａおよび４９Ｂに示す。抗ＨＥＲ３ １０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ抗体は、ＨＥＲ３への結合について、Ｍ－０５－７４またはＭ－０８－１１と競合しないことが見出された。１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡは、Ｍ－０５－７４およびＭ－０８－１１とは別個であり、それらと比較して位相的に離れたＨＥＲ３のエピトープに結合することが見出された。ＨＥＲ３への１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡの結合は、リガンド（ＮＲＧ）非依存的である。
結論：
・ ヒトＨＥＲ３への１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡの結合は、リガンドに依存しない方法で達成され得る。
・ １０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡが結合するエピトープは、Ｍ－０５－７４およびＭ－０８－１１のエピトープとは別個であり、それらから位相的に離れている。
８．７ ＨＥＲ２－ＨＥＲ３およびＥＧＦＲ－ＨＥＲ３の二量体化の阻害
抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡを、ＨＥＲ３とＨＥＲ２とのヘテロ二量体化を阻害する、その能力について解析した。
プレートベースのＥＬＩＳＡ二量体化アッセイを、標準的なプロトコールに従って行った。プレートを、１μｇ／ｍｌのＨＥＲ２－Ｆｃタンパク質でコーティングした。ブロッキングおよび洗浄の後、プレートを、異なる濃度の候補抗体１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、ＭＭ－１２１、ＬＪＭ７１６、ペルツズマブ、Ｒｏｃｈｅ Ｍ０５、Ｒｏｃｈｅ Ｍ０８、またはアイソタイプ対照、ならびに２μｇ／ｍｌの定常ＨＥＲ３ Ｈｉｓ、および０．１μｇ／ｍｌのＮＲＧと、１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、二次抗ＨＩＳ ＨＲＰ抗体と、１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＴＭＢで１０分間処理し、２ＭのＨ２ＳＯ４停止溶液を使用して反応を停止させた。吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
結果を図５２に示す。抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡは、ＨＥＲ２とＨＥＲ３との相互作用を用量依存的に直接阻害することが見出された。
別のアッセイでは、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＵＳＡ）を使用して、二量体化の阻害を検出した。１ｍｌのあらかじめ加熱したＣＰ５培地を使用して、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３を過剰発現するＵ２０Ｓ細胞を融解させ、５Ｋの細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で４時間播種した。細胞を、２５μｇ／ｍｌから開始して、８点の系列希釈により系列希釈した濃度の１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、セリバンツマブ、またはペルツズマブで処理した。インキュベーションの４時間後、３０ｎｇ／ｍｌのヘレグリン－β２を各ウェルに添加し、プレートをさらに１６時間インキュベートした。インキュベーション後、１０μＬのＰａｔｈＨｕｎｔｅｒバイオアッセイ検出試薬１を添加し、暗所内、室温で１５分間インキュベートし、続いて、４０μＬのＰａｔｈＨｕｎｔｅｒバイオアッセイ検出試薬２を添加し、次いで、これを、暗所内、室温で６０分間インキュベートした。遅延を１秒間とする、Ｓｙｎｅｒｇｙ４ Ｂｉｏｔｅｋを使用して、プレートを読み取った。
１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡは、ＨＥＲ２－ＨＥＲ３ヘテロ二量体化の阻害について、３．７１５ｅ－１１のＥＣ５０値を有することが見出された。同じアッセイでは、セリバンツマブ／ＭＭ－１２１についての比較ＥＣ５０値は、６．７８８ｅ－１０であることが見出され、ペルツズマブについての比較ＥＣ５０値は、２．４８１ｅ－１０であることが見出された。
抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡを、ＥＧＦＲとＨＥＲ３とのヘテロ二量体化を阻害する、その能力について解析した。
プレートベースのＥＬＩＳＡ二量体化アッセイは、標準的なプロトコールに従って実施した。プレートを、１μｇ／ｍｌのヒトＥＧＦＲ－Ｈｉｓでコーティングした。ブロッキングおよび洗浄の後、プレートを、４μｇ／ｍｌの定常ＨＥＲ３－ビオチン、および０．１μｇ／ｍｌのＮＲＧと共に、異なる濃度の候補抗体１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、ＭＭ－１２１、ＬＪＭ７１６、ペルツズマブ、またはアイソタイプ対照と、１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、二次抗アビジンＨＲＰ抗体と、１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＴＭＢで１０分間処理し、２ＭのＨ２ＳＯ４停止溶液を使用して反応を停止させた。吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
結果を図５３に示す。抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡは、ＥＧＦＲとＨＥＲ３との相互作用を用量依存的に直接阻害することが見出された。
８．８ ＡＤＣＣを誘導する能力についての解析
抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡおよび１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢを、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を誘導する、それらの能力について解析した。
標的細胞（ＨＥＲ３を過剰発現するＨＥＫ２９３）を、Ｕ字底９６ウェルプレート内に、２０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を、１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢ、１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ＿Ｎ２９７Ｑ（サイレント形態）、ＬＪＭ－７１６、セリバンツマブ（ＭＭ－１２１）のうちの１つによる系列希釈液（５０，０００ｎｇ／ｍｌ～０．１８ｎｇ／ｍｌ）で処理するか、または非処理で放置し、３７℃および５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。エフェクター細胞（Ｈｕｍａｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｎｏ－ＧＦＰ－ＣＤ１６．ＮＫ－９２；１７６Ｖ）を、６０，０００細胞／ウェルの密度で標的細胞を含有するプレートに添加した。
以下の対照：標的細胞による最大のＬＤＨ放出（標的細胞だけ）、自発的放出（抗体を伴わない標的細胞およびエフェクター細胞）、バックグラウンド（培養培地だけ）を組み入れた。プレートをスピンダウンし、３７℃および５％ＣＯ２で２１時間インキュベートした。
ＬＤＨ放出アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ ＬＤＨ細胞傷害作用アッセイキット）：アッセイの前に、１０μｌの溶解緩衝液（１０倍）を、標的細胞による最大のＬＤＨ放出対照に添加し、３７℃および５％ＣＯ２で２０分間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートをスピンダウンし、５０μＬの上清を、透明な平底９６ウェルプレートに移した。基質を含有する、５０μｌのＬＤＨアッセイミックスを、上清に添加することにより反応を開始し、３７℃で３０分間インキュベートした。５０μｌの停止溶液を添加することにより反応を停止させ、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴマイクロプレートリーダーにより、４９０ｎｍおよび６８０ｎｍにおける吸光度を記録した。
データ解析のために、試験試料からの吸光度を、バックグラウンド、ならびに標的細胞およびエフェクター細胞からの自発的放出に対して補正した。試験試料の細胞傷害作用パーセントを、標的細胞による最大のＬＤＨ放出対照と比べて計算し、抗体濃度の関数としてプロットする。
結果を図５４に示す。抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢは、ＨＥＲ３過剰発現細胞に対する強力なＡＤＣＣ活性を、用量依存的に誘導することが見出された。
８．９ ＨＥＲ３媒介性シグナル伝達の阻害
抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡを、ｉｎ ｖｉｔｒｏでがん細胞株内のＨＥＲ－３媒介性シグナル伝達を阻害する、その能力について解析した。
Ｎ８７、ＦａＤｕ、またはＯｖＣＡＲ８細胞を、５％ＣＯ２で３７℃にて一晩、１０％の血清と共に６ウェルプレートのウェル内に播種した。細胞を、０．２％のＦＢＳ培養培地で１６時間飢餓させ、次いで、細胞株に対応するＩＣ５０の異なる抗体で０．５時間処理した。試験抗体は、１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ（１０Ｄ１）、セリバンツマブ（ＳＢＴ）、エレゲムツマブ（ＬＪＭ）、ペルツズマブ（ＰＴＭ）、セツキシマブ（ＣＴＸ）、およびトラスツズマブ（ＴＺ）であった。
採取の前に、細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのＮＲＧ１で刺激した。細胞株から抽出したタンパク質を、標準的なＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを使用して定量した。タンパク質試料（５０μｇ）を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分画し、ニトロセルロース膜に転写した。次いで、膜をブロッキングし、示した抗体による免疫ブロットにかけた。結果を、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｃｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ基質によって視覚化した。光学濃度測定解析を使用してブロットを定量し、データをベータアクチンに対して正規化した。
結果を図５５Ａ～５５Ｃに示す。抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡは、Ｎ８７（５５Ａ）、ＦａＤｕ（５５Ｂ）、ＯｖＣａｒ８（５５Ｃ）、およびＡ５４９（５５Ｄ）細胞株において、ＨＥＲ３のリン酸化、および下流のシグナル伝達を阻害することが見出された。
Ｎ８７細胞、Ａ５４９細胞、ＯｖＣａｒ８細胞、およびＦａＤｕ細胞を使用する実験のために、全ＲＮＡを抗体処理の１６時間後に抽出し、遺伝子セットエンリッチメント解析により、鍵となる、シグナル伝達経路タンパク質の発現レベルに基づき、経路の活性化を決定するように解析した。
解析の結果を図６３Ａ～６３Ｄに示す。１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡは、下流のシグナル伝達の最も効果的な阻害剤であった。
Ａ５４９細胞を使用するさらなる実験では、ｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化アッセイを、細胞を異なる抗体で０．５時間または４時間処理したことを除き、上記の通りに実施した。結果を図６４に示す。
８．１０ 「開放型」および「閉鎖型」コンフォメーションで提供されるＨＥＲ３への結合についての解析
さらなる実験では、ヒトＨＥＲ３：ヒトＮＲＧ１複合体（すなわち、リガンドが結合した、「開放型」コンフォメーションで提供されるＨＥＲ３）の文脈において、ＮＲＧ１複合体の非存在下でのヒトＨＥＲ３（すなわち、非結合の「閉鎖型」コンフォメーションで提供されるＨＥＲ３）に対する結合親和性と比較した、ヒトＨＥＲ３に対する結合親和性を決定するために、抗ＨＥＲ３抗体を解析した。
ヒトＨＥＲ３に対する抗ＨＥＲ３抗体の結合を、ＢＬＩによって評価した。簡潔に述べると、抗ヒトＩｇＧ捕捉（ＡＨＣ）センサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に、抗ＨＥＲ３ ＩｇＧ抗体（２５ｎＭ）をロードした。反応速度の測定は、ＮＲＧ１の非存在下または存在下で実施した。ＮＲＧ１をＨＥＲ３と１：１のモル比で使用し、複合体をＲＴで２時間形成させた。Ｈｉｓタグ付けヒトＨＥＲ３またはＨＥＲ３－ＮＲＧ１複合体を、異なる濃度で１２０秒間、抗体によりコーティングしたＡＨＣセンサーにロードし、続いて、１２０秒間の解離時間を置いた。全ての測定は、２５℃、１０００ｒｐｍで撹拌しながらで実施した。緩衝液効果について、センサーグラムを参照し、次いで、Ｏｃｔｅｔ ＱＫ３８４－ソフトウェア（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して解析した。反応速度応答は、１部位結合モデルを使用してグローバルにフィッティングして、会合速度定数（Ｋｏｎ）、解離速度定数（Ｋｏｆｆ）、および平衡解離定数（ＫＤ）についての値を得た
以下の抗ＨＥＲ３抗体を実験で解析した：１０Ｄ１Ｆ．Ａ（実施例２．２の［１６］）、ＭＭ－１２１、およびＬＪＭ－７１６。
結果を図７８Ａ～７８Ｆに示す。１０Ｄ１Ｆ．Ａは、ＮＲＧ１の存在下または非存在下でピコモル以下の親和性でヒトＨＥＲ３に結合することが見出された（図７８Ａおよび７８Ｂ）。ＭＭ－１２１は、ＮＲＧ１の存在下または非存在下においてナノモルでヒトＨＥＲ３に結合した（図７８Ｃおよび７８Ｄ）。ＬＪＭ－７１６は、ＮＲＧ１の非存在下でピコモル以下の親和性でヒトＨＥＲ３に結合した（図７８Ｅ）。しかしながら、ＮＲＧ１の存在下で、ＨＥＲ３への結合は劇的に低減した（図７８Ｆ）。
８．１１ 結論
まとめると、結果は、（ｉ）１０Ｄ１Ｆが、ＨＥＲ３と、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２とのヘテロ二量体化を競合的に阻害し（実施例８．７、ならびに図５２および５３を参照されたい）、（ｉｉ）ＮＲＧ１の存在下または非存在下で同様に十分にＨＥＲ３に結合するという特性の特有の組合せがあるならば、１０Ｄ１Ｆを、ＨＥＲ３のエピトープに結合する抗ＨＥＲ３抗体と同定する。
実施例９
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのヒト化され、修飾されたクローンについての解析
９．１ 薬物動態解析
マウス
約６～８週齢の雌ＮＣｒヌードマウスを、特定の無病原体条件下で飼育し、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）ガイドラインに準拠して処置した。
５００μｇの抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡまたは１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢを投与し、血液を、ベースライン（－２時間）、投与の６時間、２４時間、９６時間、１６８時間、および３３６時間後に心臓穿刺により４匹のマウスから得た。血清中の抗体を、ＥＬＩＳＡにより定量した。
薬物動態解析のためのパラメータ：最大濃度（Ｃｍａｘ）、ＡＵＣ（０～３３６時間）、ＡＵＣ（０～無限大）、半減期（ｔ１／２）、クリアランス（ＣＬ）、定常状態における分布容積（Ｖｓｓ）を、非コンパートメントモデルから導出した。
結果を図５６Ａおよび５６Ｂに示す。ＮＣｒヌードマウスにおいて、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡは、２５３時間の半減期を有することが見出され（５６Ａ）、抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢは、２７３時間の半減期を有することが見出された（５６Ｂ）。
ラット
１０Ｄ１Ｆバリアントを解析して、平均体重を３２０ｇとする雌Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおける、単回投与による薬物動態プロファイルを決定した。
抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡおよび１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢを、尾静脈への緩徐なｉ．ｖ．注射を介して、４ｍｇ（約１０ｍｇ／ｋｇ）、１０ｍｇ（約２５ｍｇ／ｋｇ）、４０ｍｇ（約１００ｍｇ／ｋｇ）、または１００ｍｇ（約２５０ｍｇ／ｋｇ）の単回投与で投与した。ビヒクルを陰性対照として投与した。処置当たり２匹のラットからの血液を、ベースライン（－２４時間）、投与の６時間、２４時間、９６時間、１６８時間、および３３６時間後に得た。血清中の抗体を、ＥＬＩＳＡにより定量した。
薬物動態解析のためのパラメータ：最大濃度（Ｃｍａｘ）、ＡＵＣ（０～３３６時間）、ＡＵＣ（０～無限大）、半減期（ｔ１／２）、クリアランス（ＣＬ）、定常状態における分布容積（Ｖｄ）を、非コンパートメントモデルから導出した。
結果を、図５７Ａ（１０ｍｇ／ｋｇ）、５７Ｂ（２５ｍｇ／ｋｇ）、５７Ｃ（１００ｍｇ／ｋｇ）、および５７Ｄ（２５０ｍｇ／ｋｇ）に示す。
９．２ 安全性免疫毒性
１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡおよび１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢの毒性作用について解析した。
マウス
６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（２０～２５ｇ）に、用量：２００ｕｇ（約１０ｍｇ／ｋｇ）、５００ｕｇ（約２５ｍｇ／ｋｇ）、２ｍｇ（約１００ｍｇ／ｋｇ）、もしくは５ｍｇ（約２５０ｍｇ／ｋｇ）のうちの１つにおける１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡおよび１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢ、または等容積のＰＢＳの単回用量を腹腔内注射した。３匹のマウスに各処置を注射し、４匹のマウスにＰＢＳ対照を注射した。血液試料を注射の９６時間後に得、ＲＢＣ指標（総ＲＢＣ数、ヘマトクリット、ヘモグロビン、血小板数、平均赤血球容積、平均赤血球ヘモグロビン、平均赤血球ヘモグロビン濃度）、およびＷＢＣ指標（総ＷＢＣ数、リンパ球数、好中球数、単球数）について解析した。解析は、ＨＭ５ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｓｅｒを使用して実施した。
結果を、図５８Ａ、５８Ｂ（ＲＢＣ指標）、および５８Ｃ（ＷＢＣ指標）に示す。抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡおよび１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢは、ＲＢＣ指標に影響を及ぼさなかったが、高用量（２５０ｍｇ／ｋｇの１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、１００ｍｇ／ｋｇの１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢ、２５０ｍｇ／ｋｇの１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢ）で、ＷＢＣ指標に影響を及ぼすことが見出された。
肝毒性、腎毒性、および膵毒性もまた、注射の９６時間後に解析した。１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡおよび１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢは、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アルブミン、総タンパク質（肝臓指標；図５８Ｄ）、クレアチニン、血中尿素窒素、グルコースまたはアミラーゼ（腎臓および膵臓指標；図５８Ｅ）のレベルに対して影響を及ぼさなかった。１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡおよび１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢは、電解質指標である、ナトリウム、カリウム、カルシウム、またはリン酸にも影響を及ぼさなかった（図５８Ｆ）。
１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡまたは１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢで処置されたマウスは、９６時間後に、体重、挙動、皮膚状態、経口検査、糞便および尿検査、または眼検査で異常を示さなかった。より高用量：２５０ｍｇ／ｋｇの１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、１００ｍｇ／ｋｇの１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢ、２５０ｍｇ／ｋｇの１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢで処置されたマウスでは、正常サイズの約１．５倍の脾臓の腫大（脾腫）が観察された。
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてさらなる研究を実施して、５００μｇ（約２５ｍｇ／ｋｇ）の１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡまたは１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢの反復投与による毒性作用を査定した。抗体を、毎週１回、４週間にわたり投与した。血液を、初回投与の２８日後に得た。いずれの抗体についても、ＲＢＣ、肝臓、腎臓、膵臓、または電解質指標に対する影響は観察されず、臨床的異常の徴候も見られず、肉眼剖検における差違も検出されなかった。総ＷＢＣ数、リンパ球数、および好中球数は、１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡまたは１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢで処置されたマウスにおいて減少することが観察されたが、これは、毒性であると考えられなかった。
別の研究では、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡまたは等容積のＰＢＳ（ビヒクル対照）の単回用量を投与し、９６時間後（ビヒクル）または３３６時間後（１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ）に解析した。代表的な結果を図６９Ａ～６９Ｃに示す。
ラット
６～８週齢の雌Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（４００～４５０ｇ）に、用量：４ｍｇ（約１０ｍｇ／ｋｇ）、１０ｍｇ（約２５ｍｇ／ｋｇ）、４０ｍｇ（約１００ｍｇ／ｋｇ）、１００ｍｇ（約２５０ｍｇ／ｋｇ）のうちの１つにおける１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡまたは１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢ抗体の単回用量を腹腔内注射した。血液を、－２４時間、６時間、２４時間、９６時間、１６８時間、および３３６時間後に得た。注射の３６６時間後までに、ＲＢＣ指標に対する影響、ＷＢＣ指標に対する毒性作用、および肝臓、腎臓、膵臓、または電解質指標に対する影響は見られなかった。臨床的異常の徴候は見られず、肉眼剖検における差違も検出されなかった。
２５０ｍｇ／ｋｇの１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡを投与されたラットから得られた代表的な結果を図７０Ａ～７０Ｃに示す。
齧歯動物毒性学モデルにおける毒性徴候の非存在は、１０Ｄ１およびバリアントについて、優れた臨床的安全性を示す。
９．３ ｉｎ ｖｉｔｒｏでのがんを処置する有効性についての解析
抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡを、ｉｎ ｖｉｔｒｏの多数の腫瘍モデル：Ｎ８７細胞（胃がん）、ＨＣＣ９５細胞（肺がん）、ＦａＤｕ細胞（頭頸部がん）、ＳＮＵ－１６細胞（胃がん）、Ａ５４９細胞（肺がん）、ＯｖＣａｒ８細胞（卵巣がん）、ＡＣＨＮ細胞（腎がん）、およびＨＴ２９細胞（結腸直腸がん）において、腫瘍増殖を阻害する、その能力について解析した。１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡの有効性を、他の抗ＨＥＲ３抗体セリバンツマブ（ＭＭ－１２１）およびＬＪＭ－７１６、ならびに他のＥＧＦＲファミリー療法である、セツキシマブ、トラスツズマブ、およびペルツズマブと比較した。
細胞を、１５００ｕｇ／ｍｌから開始して、９点の希釈により系列希釈した濃度の治療用抗体で処理した。細胞生存率は、処理の３～５日後にＣＣＫ－８細胞増殖アッセイを使用して測定した。示した細胞阻害の百分率を、緩衝液（ＰＢＳ）だけで処理した細胞と比べる。データ点は３回の反復の平均を示す。
結果を図５９Ａ～５９Ｄに示す。抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡは、複数の腫瘍モデルにおいて、他のＨＥＲ３抗体（５９Ａおよび５９Ｂ）、およびＥＧＦＲファミリー療法（５９Ｃおよび５９Ｄ）と比較して、優れたｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍の阻害を実証する。
図７７Ａおよび７７Ｂは、２５ｍｇ／ｋｇの関連する抗体をＩＰ投与されたマウスにおいて達成するＣｍａｘ濃度で、異なる抗ＥｒｂＢ抗体が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて異なるがん細胞株の増殖を阻害する能力を示す。１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡは、多種多様な異なるがん細胞型の増殖を阻害する、際立った能力を呈する。
９．４ ｉｎ ｖｉｖｏでのがんを処置する有効性についての解析
抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡおよび１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢを、ｉｎ ｖｉｖｏがんモデルにおける腫瘍増殖に対するそれらの効果について評価した。
９．４．１ Ａ５４９モデル
腫瘍細胞を、雌ＮＣｒヌードマウスの右脇腹に皮下挿入した。抗体（２５ｍｇ／ｋｇの１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢ、セツキシマブ、ＬＪＭ－７１６、もしくはＭＭ－１２１；各処置について、ｎ＝６）、またはビヒクル（ｎ＝８）を、隔週で６週間投与した。
結果を図６０に示す。抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡおよび１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢは、いずれも、肺癌のＡ５４９モデルにおいて強力な有効性を呈した。１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢは、特に強力であり、腫瘍を退縮させることが見出された。
９．４．２ ＦａＤｕモデル
腫瘍細胞を、マトリゲルと共に、雌ＮＣｒヌードマウスの右脇腹に皮下挿入した。抗体（１０および２５ｍｇ／ｋｇの１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡおよび１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢ、または２５ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ＬＪＭ－７１６、もしくはＭＭ－１２１；各処置についてｎ＝６）、またはビヒクル（ｎ＝６）を、毎週１回、６週間にわたり投与した。
結果を図６１に示す。抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡおよび１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＢは、いずれも、頭頸部がんのＦａＤｕモデルにおいて腫瘍増殖を阻止するのに効果的であることが見出された。
９．４．３ ＯｖＣａｒ８モデル
腫瘍細胞を、マトリゲルと共に、雌ＮＣｒヌードマウスの右脇腹に皮下挿入した。抗体（１０および２５ｍｇ／ｋｇの１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、または２５ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ、ＬＪＭ－７１６、もしくはＭＭ－１２１；ｎ＝６）、またはビヒクル（ｎ＝６）を、毎週１回、６週間にわたり投与した。
結果を図６２に示す。抗ＨＥＲ３抗体クローン１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡは、より高用量において、腫瘍体積の低減に効果的であることが見出された。
９．４．４ Ｎ８７モデル
腫瘍細胞を、マトリゲルと共に、雌ＮＣｒヌードマウスの右脇腹に皮下挿入する。抗体（２５ｍｇ／ｋｇの１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、または５０ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ、ＬＪＭ－７１６、もしくはＭＭ－１２１；各処置についてｎ＝６）、またはビヒクル（ｎ＝６）を、隔週で、６週間にわたり投与した。
結果を図７４に示す。抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡは、胃がんのＮ８７モデルにおいて、腫瘍増殖を阻止するのに効果的であることが見出された。
実施例１０
ＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異体甲状腺がん細胞株の増殖の阻害についての解析
以下の細胞株について調べた：
Figure 2022548057000023
 細胞を、フローサイトメトリーによりＥＧＦＲファミリーメンバーの表面発現について調べた。簡潔に述べると、３００，０００個の細胞を、４℃で、１時間、２０μｇ／ｍｌの１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、セツキシマブ、またはトラスツズマブとインキュベートした。Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート抗ヒト抗体を、１０μｇ／ｍｌで、二次抗体として（４℃で、４０分）使用した。
結果を図６６Ａ～６６Ｃに示す。ＳＷ１７３６、ＢＨＴ１０１、およびＢＣＰＡＰ細胞は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３を発現することが示された。
本発明者らは、異なるＨＥＲ３結合性抗体が、Ｖ６００ＥのＢＲＡＦ突然変異を保有する異なる甲状腺がん細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖を阻害する能力について調べた。
簡潔に述べると、異なる細胞株の細胞を、１．５×１０５細胞／ウェルの密度で播種し、翌日、１０００μｇ／ｍｌの１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、セリバンツマブ、ＬＪＭ－７１６、ペルツズマブ、またはアイソタイプ対照抗体から開始して、１０点の系列希釈液で処理した。３日後、ＣＣＫ－８細胞増殖アッセイを使用して増殖を測定した。抗体ではなく、等容積のＰＢＳで処理した細胞と比べた、増殖の阻害パーセントを計算した。
結果を図６７Ａ～６７Ｃに示す。１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡは、解析される抗ＨＥＲ３抗体のうちの他のいずれよりも、ＢＲＡＦのＶ６００Ｅ突然変異を保有する細胞株の増殖の阻害において効果的であることが見出された。
さらなる実験では、１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡとベムラフェニブとの組合せが、Ｖ６００ＥのＢＲＡＦ突然変異を保有する異なる甲状腺がん細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖を阻害する能力について調べた。
細胞を、１．５×１０５細胞／ウェルの密度で播種し、翌日、２００ｎＭのベムラフェニブの存在下または非存在下で、１０００μｇ／ｍｌの１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡまたはアイソタイプ対照抗体から開始して、１０点の系列希釈液で処理した。３日後、ＣＣＫ－８細胞増殖アッセイを使用して増殖を測定した。抗体ではなく、等容積のＰＢＳで処理した細胞と比べた、増殖の阻害パーセントを計算した。
結果を図６８Ａ～６８Ｃに示す。１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡは、ベムラフェニブが、ベムラフェニブに対して感受性である、ＳＷ１７３６およびＢＨＴ１０１細胞の増殖を阻害する能力を増強することが見出された。１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡはまた、ベムラフェニブ耐性ＢＣＰＡＰ細胞の増殖に対する強力な阻害剤であることも見出された。
実施例１１
ｉｎ ｖｉｖｏでのＨＥＲ３媒介性シグナル伝達の阻害についての解析
本発明者らは、１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡが、ｉｎ ｖｉｖｏでのＨＥＲ３媒介性シグナル伝達を阻害する能力について調べた。
１×１０６個のＦａＤｕまたはＯｖＣａｒ８細胞を、ＮＣｒヌードマウスに皮下導入して、異所性異種移植腫瘍を確立した。
腫瘍が、１００ｍｍ３を超える体積に達したら、マウスを、隔週で、２５ｍｇ／ｋｇの用量の１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、または等容積のビヒクル（対照）の腹腔内注射により処置した。４週間後、腫瘍を採取した。タンパク質抽出物を腫瘍から調製し、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによって定量し、５０μｇの試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分画し、実施例４．３に記載される通りに、ＨＥＲ３およびＡＫＴのｉｎ ｖｉｖｏでのリン酸化を決定するために、抗体を使用してウェスタンブロットにより解析した。
結果を図７１に示す。１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡは、ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍細胞内でＨＥＲ３およびＡＫＴのリン酸化を阻害することが見出された。
実施例１２
抗ＨＥＲ３抗体の内在化についての解析
本発明者らは、ＨＥＲ３発現細胞による抗ＨＥＲ３抗体の内在化について調べた。
簡潔に述べると、ＨＥＲ３を発現するように操作されたＨＥＫ２９３、ＨＣＣ９５、Ｎ８７、またはＯｖＣａｒ８細胞１００，０００個を、９６ウェル組織培養プレートのウェル内に播種し、５％ＣＯ２中３７℃で一晩培養した。次いで、細胞を、１２０ｎＭの１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、ＬＪＭ－７１６、セリバンツマブ、またはトラスツズマブ、および３６０ｎＭのｐＨｒｏｄｏ ｉＦＬ Ｇｒｅｅｎ試薬で処理し、５％のＣＯ２中３７℃でインキュベートした。培養物中の細胞を、各ウェルの４つの異なる視野内で、３０分間ごと、２４時間にわたりイメージングした。各視野のＦＩＴＣチャネル内の最大シグナル強度を２４時間後に定量した。
結果を図７２に示す。ＯｖＣａｒ８細胞内では、ＬＪＭ－７１６およびセリバンツマブの低度～中程度の内在化が観察されたのに対し、トラスツズマブの低度の内在化が、Ｎ８７細胞内で観察された。
１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡの非有意の内在化が、ＨＣＣ９５、Ｎ８７、またはＯｖＣａｒ８細胞内で観察された。
予測される通り、１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、ＬＪＭ－７１６、およびセリバンツマブの有意な内在化が、ＨＥＲ３を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞内で観察された。
さらなる実験では、抗体の内在化をフローサイトメトリーにより調べた。
Ｎ８７細胞を、５０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェル組織培養プレートのウェル内に播種し、一晩（３７℃、５％ＣＯ２）接着させた。１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡまたはトラスツズマブを標識化試薬と混合し、標識付けされた複合体を細胞に添加した。試料を、０分、１０分、３０分、１時間、２時間、および４．５時間の時点で、細胞培養培地の吸引により採取し、ＰＢＳで洗浄し、アキュターゼで処理した。アキュターゼ活性を中和させ、細胞をＦＡＣｓ緩衝液中に再懸濁し、フローサイトメトリーにより解析した。
結果を図７３Ａおよび７３Ｂに示す。細胞は、１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡの最小限の内在化を呈した。対照的に、抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブの実質的な内在化が観察された。
実施例１３
免疫組織化学におけるＨＥＲ３結合性抗体の使用
ｍＩｇＧ２ａフォーマットにおける抗ＨＥＲ３抗体１０Ｄ１Ｆを、ヒトＨＥＲ３タンパク質を検出するための免疫組織化学で使用される、その能力について評価した。
切片の処理を、Ｂｏｎｄ試薬（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。市販の凍結組織切片のアレイを得た。スライドを、乾燥機内で１０分間乾燥させ、次いで、ステップの間の水による洗浄および／またはＴＢＳ－Ｔによるすすぎを伴う、以下の処理に供した：（ｉ）室温で１０分間の１００％のアセトンでの処理による固定；（ｉｉ）室温で１５分間の３％（ｖ／ｖ）のＨ２Ｏ２での処理による内因性ペルオキシダーゼのブロッキング；（ｉｉｉ）室温で３０分間の１０％のヤギ血清での処理によるブロッキング；（ｉｖ）４℃で一晩の６．２ｍｇ／ｍｌ溶液の１：２５０の希釈での１０Ｄ１Ｆ－ｍＩｇＧ２ａとのインキュベーション；（ｖ）室温で３０分間のＨＲＰ－ポリマーコンジュゲートヤギ抗マウス抗体とのインキュベーション、および（ｖｉ）室温で５分間のＢｏｎｄ Ｍｉｘｅｄ ＤＡＢ Ｒｅｆｉｎｅによる現像、続いて、反応を停止させるための、脱イオン水および１倍濃度のＢｏｎｄ洗浄液でのすすぎ。
次いで、スライドを脱水させ、合成の封入剤中でマウンティングし、高解像度で走査した。
結果を図７５Ａおよび７５Ｂに示す。１０Ｄ１Ｆは、正常組織との低度の交差反応性で、悪性ヒト組織切片を優先的に染色した。
さらなる実験では、Ａ５４９異種移植腫瘍を低温ＰＢＳ中に採取し、ＯＣＴ低温包埋媒体中に包埋し、ドライアイス中で凍結させ、－８０℃で保管した。クライオスタットを使用して１０μｍの切片を得た。
スライドを、乾燥機内で１０分間乾燥させ、次いで、ステップの間の水による洗浄および／またはＴＢＳ－Ｔによるすすぎを伴う、以下の処理に供した：（ｉ）室温で１０分間の１００％のアセトンでの処理による固定；（ｉｉ）室温で１５分間の３％（ｖ／ｖ）のＨ２Ｏ２での処理による内因性ペルオキシダーゼのブロッキング；（ｉｉｉ）室温で３０分間の１０％のヤギ血清での処理によるブロッキング；（ｉｖ）４℃で一晩の８．８ｍｇ／ｍｌ溶液の１：５０の希釈での１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ、または１：２００の希釈のＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ製のウサギ抗ＨＥＲ３（型番１０２０１－Ｔ２４）とのインキュベーション、（ｖ）室温で３０分間のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＦ（ａｂ’）２－ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ（Ａ２４４７０）（１：５００）、またはＨＲＰ－ポリマーコンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体とのインキュベーション、および（ｖｉ）室温で５分間のＢｏｎｄ Ｍｉｘｅｄ ＤＡＢ Ｒｅｆｉｎｅによる現像、続いて、反応を停止させるための、脱イオン水および１倍濃度のＢｏｎｄ洗浄液でのすすぎ。
次いで、スライドをヘマトキシリンで対比染色し、脱水させ、合成の封入剤中でマウンティングし、高解像度で走査した。
結果を図７６に示す。１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡは、Ａ５４９腫瘍異種移植凍結切片の特異的な膜および細胞質染色を呈した。
実施例１４
ＣＬＵ－ＮＲＧ１融合体を含む、患者由来の卵巣がんの異種移植モデルにおけるＨＥＲ３結合性抗体の治療効果
本発明者らは、ＣＬＵ－ＮＲＧ１融合体を含む、患者由来の卵巣がんの異種移植モデルにおける１０Ｄ１Ｆの治療効果について調べた。
約５～７週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを特定の無病原体条件下で飼育し、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）ガイドラインに準拠して処置した。
ＣＬＵ－ＮＲＧ１融合体を含む卵巣がんのモデルは、ＯＶ６３０８（Ｃｒｏｗｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）と指定された患者由来の異種移植片の４つのペレットを、マウスの右脇腹の皮下に接種することによって確立した。ＯＶ６３０８は、５１歳の女性患者に由来する卵巣の高悪性度の漿液性腺癌であり、ＣＬＵ－ＮＲＧ１遺伝子融合体を含む。
腫瘍体積は、デジタル式キャリパーを使用して毎週３回測定し、式［Ｌ×Ｗ２／２］を使用して計算した。対照アームの腫瘍が、１．５ｃｍ超の長さと測定されたら、研究の終点に到達したとみなした。
マウスに、（ｉ）２５ｍｇ／ｋｇの１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡ（すなわち、実施例２．２の［１６］）、または（ｉｉ）２５ｍｇ／ｋｇのｈＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体を腹腔内注射により隔週で投与した（各処置群についてｎ＝１０）。
結果を図７９に示す。１０Ｄ１Ｆ．ＦｃＡによる処置は、非常に有効であり、アイソタイプ対照処置群と比べて、腫瘍増殖を１１１％阻害することが見出された。

Claims (16)

  1. 対象におけるがんを処置または予防する方法における使用のための、ＨＥＲ３に結合することができる抗原結合性分子であって、がんが、ＨＥＲ３に対するリガンドの増加した発現を生じる突然変異を有する細胞を含み、
    （ｉ）以下のＣＤＲ：
    配列番号４３のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
    配列番号４６のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
    配列番号５１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３
    を組み込んでいる重鎖可変（ＶＨ）領域、および
    （ｉｉ）以下のＣＤＲ：
    配列番号９１のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
    配列番号９４のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
    配列番号９９のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３
    を組み込んでいる軽鎖可変（ＶＬ）領域
    を含む、抗原結合性分子。
  2. 対象におけるがんを処置または予防する方法における使用のための医薬の製造における、ＨＥＲ３に結合することができる抗原結合性分子の使用であって、がんが、ＨＥＲ３に対するリガンドの増加した発現を生じる突然変異を有する細胞を含み、抗原結合性分子が、
    （ｉ）以下のＣＤＲ：
    配列番号４３のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
    配列番号４６のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
    配列番号５１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３
    を組み込んでいる重鎖可変（ＶＨ）領域、および
    （ｉｉ）以下のＣＤＲ：
    配列番号９１のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
    配列番号９４のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
    配列番号９９のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３
    を組み込んでいる軽鎖可変（ＶＬ）領域
    を含む、使用。
  3. 対象におけるがんを処置または予防する方法であって、がんが、ＨＥＲ３に対するリガンドの増加した発現を生じる突然変異を有する細胞を含み、方法が、ＨＥＲ３に結合することができる治療または予防有効量の抗原結合性分子を対象に投与するステップを含み、抗原結合性分子が、
    （ｉ）以下のＣＤＲ：
    配列番号４３のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
    配列番号４６のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
    配列番号５１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３
    を組み込んでいる重鎖可変（ＶＨ）領域、および
    （ｉｉ）以下のＣＤＲ：
    配列番号９１のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
    配列番号９４のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
    配列番号９９のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３
    を組み込んでいる軽鎖可変（ＶＬ）領域
    を含む、方法。
  4. ＨＥＲ３に対するリガンドが、ＮＲＧのＥＧＦ様ドメインに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の使用のための抗原結合性分子、請求項２に記載の使用、または請求項３に記載の方法。
  5. がんが、ＮＲＧ遺伝子融合体を有する細胞を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のための抗原結合性分子、使用、または方法。
  6. ＮＲＧ遺伝子融合体が、ＣＬＵ－ＮＲＧ１、ＣＤ７４－ＮＲＧ１、ＤＯＣ４－ＮＲＧ１、ＳＬＣ３Ａ２－ＮＲＧ１、ＲＢＰＭＳ－ＮＲＧ１、ＷＲＮ－ＮＲＧ１、ＳＤＣ４－ＮＲＧ１、ＲＡＢ２ＩＬ１－ＮＲＧ１、ＶＡＭＰ２－ＮＲＧ１、ＫＩＦ１３Ｂ－ＮＲＧ１、ＴＨＡＰ７－ＮＲＧ１、ＳＭＡＤ４－ＮＲＧ１、ＭＤＫ－ＮＲＧ１、ＴＮＣ－ＮＲＧ１、ＤＩＰ２Ｂ－ＮＲＧ１、ＭＲＰＬ１３－ＮＲＧ１、ＰＡＲＰ８－ＮＲＧ１、ＲＯＣＫ１－ＮＲＧ１、ＤＰＹＳＬ２－ＮＲＧ１、ＡＴＰ１Ｂ１－ＮＲＧ１、ＣＤＨ６－ＮＲＧ１、ＡＰＰ－ＮＲＧ１、ＡＫＡＰ１３－ＮＲＧ１、ＴＨＢＳ１－ＮＲＧ１、ＦＯＸＡ１－ＮＲＧ１、ＰＤＥ７Ａ－ＮＲＧ１、ＲＡＢ３ＩＬ１－ＮＲＧ１、ＣＤＫ１－ＮＲＧ１、ＢＭＰＲＩＢ－ＮＲＧ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ－ＮＲＧ１、ＭＣＰＨ１－ＮＲＧ１およびＳＬＣ１２Ａ２－ＮＲＧ２から選択される、請求項５に記載の使用のための抗原結合性分子、使用、または方法。
  7. ＮＲＧ遺伝子融合体が、ＣＬＵ－ＮＲＧ１、ＣＤ７４－ＮＲＧ１、ＳＬＣ３Ａ２－ＮＲＧ１またはＶＡＭＰ２－ＮＲＧ１から選択される、請求項５または請求項６に記載の使用のための抗原結合性分子、使用、または方法。
  8. がんが、肺、乳房、頭部、頸部、腎臓、卵巣、膵臓、前立腺、子宮、胆嚢、結腸、直腸、膀胱、軟部組織または鼻咽頭に由来する、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用のための抗原結合性分子、使用、または方法。
  9. がんが、肺がん、非小細胞肺がん、肺線癌、浸潤性粘液性肺線癌、肺扁平上皮癌、乳がん、乳癌、浸潤性乳癌、頭頸部がん、頭頸部扁平上皮癌、腎がん、腎明細胞癌、卵巣がん、卵巣漿液性嚢胞腺癌、膵がん、膵腺癌、膵管腺癌、前立腺がん、前立腺腺癌、子宮内膜がん、子宮癌肉腫、胆嚢がん、胆管癌、結腸直腸がん、膀胱がん、尿路上皮膀胱がん、肉腫、軟部組織肉腫、神経内分泌腫瘍および鼻咽頭神経内分泌腫瘍から選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用のための抗原結合性分子、使用、または方法。
  10. がんが、肺がん、非小細胞肺がん、肺線癌、浸潤性粘液性肺線癌および肺扁平上皮癌から選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載の使用のための抗原結合性分子、使用、または方法。
  11. 抗原結合性分子が、
    （ｉ）以下のＣＤＲ：
    配列番号４１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１
    配列番号４５のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２
    配列番号４８のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３
    を組み込んでいるＶＨ領域、および
    （ｉｉ）以下のＣＤＲ：
    配列番号８８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１
    配列番号９２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２
    配列番号９５のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３
    を組み込んでいるＶＬ領域
    を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用のための抗原結合性分子、使用、または方法。
  12. 抗原結合性分子が、
    配列番号３６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および
    配列番号８３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域
    を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の使用のための抗原結合性分子、使用、または方法。
  13. 抗原結合性分子が、
    以下のフレームワーク領域（ＦＲ）：
    配列番号５３のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ１
    配列番号５９のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ２
    配列番号６６のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ３
    配列番号７１のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ４
    を組み込んでいるＶＨ領域
    を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の使用のための抗原結合性分子、使用、または方法。
  14. 抗原結合性分子が、
    以下のフレームワーク領域（ＦＲ）：
    配列番号１０４のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ１
    配列番号１１０のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ２
    配列番号１２０のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ３
    配列番号１２５のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ４
    を組み込んでいるＶＬ領域
    を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の使用のための抗原結合性分子、使用、または方法。
  15. 抗原結合性分子が、配列番号１７１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の使用のための抗原結合性分子、使用、または方法。
  16. 抗原結合性分子が、配列番号１７７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の使用のための抗原結合性分子、使用、または方法。
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