CN110650752A

CN110650752A - 用于治疗具有NRG1融合基因的细胞的ErbB-2和ErbB3结合双特异性抗体

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Publication number: CN110650752A
Application number: CN201880028922.XA
Authority: CN
Inventors: 马克·思罗斯比; 塞西利亚·安娜·威廉明娜·热延; 大卫·安德烈·巴普蒂斯特·毛桑-德塔耶; 敦·洛格滕伯格
Original assignee: Meares Co
Current assignee: Meares Co; Merus BV
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2018-04-03
Publication date: 2020-01-03
Also published as: KR20190140945A; EP3600413A1; WO2018182422A8; AU2018246873A1; CA3058343A1; EA201992063A1; BR112019020508A2; AU2018246873B2; PH12019550202A1; WO2018182422A1; MX2019011660A; SG11201908971RA; IL269656B1; IL310223A; IL269656A; JP2020511993A; US11780925B2; US20200102393A1

Abstract

本发明涉及抗体领域。特别地，其涉及用于治疗ErbB‑2/ErbB‑3阳性细胞的治疗性(人)抗体领域。更特别地，其涉及治疗包含NRG1融合基因的细胞，所述NRG1融合基因包含与来自不同染色体位置的序列融合的NRG1基因的至少一部分。

Description

用于治疗具有NRG1融合基因的细胞的ErbB-2和ErbB3结合双特异性抗体

本申请要求于2017年3月31日提交的EP申请No.17164292.9的优先权，其内容通过引用并入本文。

本发明涉及抗体领域。特别地，其涉及用于治疗ErbB-2/ErbB-3阳性细胞的治疗性(人)抗体领域。更特别地，其涉及治疗包含NRG1融合基因的肿瘤，所述NRG1融合基因包含与来自不同染色体位置的序列融合的NRG1基因的至少一部分。

神经调节蛋白-1(Neuregulin-1，NRG1)已被提议作为候选癌基因和作为候选肿瘤抑制基因。其可能参与上皮癌，因为其编码可与ErbB受体家族结合的配体。迄今为止，存在超过16种来源于NRG1基因的可溶性和跨膜蛋白。跨膜NRG1同种型的胞外结构域的蛋白水解过程释放可溶性因子。HRG1-β1是由该基因编码的蛋白质之一。它包含Ig结构域和EGF样结构域，这对于与受体酪氨酸激酶ErbB-3和ErbB-4直接结合是必需的。已知NRG1基因和同种型有许多不同的别名，例如：神经调节蛋白1；Pro-NRG1；HRGA；SMDF；HGL；GGF；NDF；NRG1内含子转录物2(非蛋白质编码)；调蛋白α(Heregulin，Alpha)(45kD，ERBB2 P185-激活物)；乙酰胆碱受体诱导活性因子(Acetylcholine Receptor-Inducing Activity)；前神经调节蛋白-1，膜结合同种型；感觉和运动神经元来源因子；Neu分化因子；胶质细胞生长因子2；NRG1-IT2；MSTP131；MST131；ARIA；GGF2；HRG1；以及HRG。NRG1基因的外部Id为：HGNC：7997；Entrez Gene：3084；Ensembl：ENSG00000157168；OMIM：142445和UniProtKB：Q02297。

NRG1的同种型通过选择性剪接来制备，并且包括为跨膜的、外膜结合的、脱落的、分泌的或胞内的形式(Falls，2003；Hayes和Gullick，2008)。它们与ErbB-3或ErbB-4结合，其可能与ErbB-2(HER2)一起作为异二聚体来传导信号。尽管NRG1编码的蛋白质通常被认为是促分裂原(mitogen)，但其也可具有强大地促凋亡性：特别地，在细胞中表达NRG1可引起该表达细胞的凋亡(Weinstein et al.，1998)。

NRG1基因已经在两种明显对立的背景下被鉴定为潜在的癌症关键基因。首先，它是被认为在染色体8p(8号染色体的短臂)上的重要的肿瘤抑制基因的主要候选物。染色体8p的丢失是上皮癌(包括乳腺癌、结肠癌、膀胱癌和前列腺癌)中最常见的基因组事件之一。这已先后通过杂合性丢失(loss of heterozygosity)、比较基因组杂交(comparativegenomic hybridization，CGH)和阵列-CGH研究示出(关于参考文献，参见Birnbaum etal.，2003；Pole et al.，2006)。染色体8p的这一丢失的经典解释是那里存在肿瘤抑制基因。使用荧光原位杂交和阵列-比较基因组杂交(阵列-CGH)映射癌细胞系中的染色体8p丢失。发现大多数断裂接近NRG1或实际上在NRG1内，使得NRG1和直接端粒化成NRG1的基因成为这样的肿瘤抑制基因的主要候选物(Pole et al.，2006；Cooke et al.，2008)。其次，NRG1可以是癌基因，因为它似乎是乳腺癌中染色体易位的靶标(关于综述，参见Chua et al2009)。

在本发明中，发现在染色体8p修饰的情况下肿瘤表现出响应于暴露于双特异性抗体的生长抑制，所述双特异性抗体包含可结合ErbB-2胞外部分的第一抗原结合位点和可结合ErbB-3胞外部分的第二抗原结合位点。

发明概述

在一个方面中，提供了用于治疗具有ErbB-2和ErbB-3阳性细胞的个体的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用包含可结合ErbB-2胞外部分的第一抗原结合位点和可结合ErbB-3胞外部分的第二抗原结合位点的双特异性抗体，所述方法的特征在于，细胞包含NRG1融合基因，所述NRG1融合基因包含与来自不同染色体位置的序列融合的NRG1基因的至少一部分。通常来说，所述细胞包含NRG1融合基因，所述NRG1融合基因至少包含与来自不同染色体位置的5’序列融合的NRG1基因的3’端。

所述细胞可以是癌细胞。所述癌细胞可以是与NRG1融合基因相关的癌细胞，例如由NRG1融合体(NRG1-fusion)驱动的癌细胞。

在另一方面中，提供了用于治疗患有ErbB-2和ErbB-3阳性肿瘤或处于患有所述肿瘤之风险中的个体的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用包含可结合ErbB-2胞外部分的第一抗原结合位点和可结合ErbB-3胞外部分的第二抗原结合位点的双特异性抗体，所述方法的特征在于，所述肿瘤的细胞包含NRG1融合基因，所述NRG1融合基因包含与来自不同染色体位置的序列(例如5’序列)融合的NRG1融合体的一部分(例如NRG1基因的3’端)。

处于患有ErbB-2和ErbB-3阳性肿瘤之风险中的个体可以是处于缓解期(inremission)的个体。

优选地，NRG1融合基因表达包含NRG1 EGF样结构域的蛋白质。优选地，NRG融合体是NRG1与人8号染色体上的基因的融合体。优选地，人8号染色体上的基因编码分泌蛋白质或细胞膜相关蛋白质。优选地，NRG1融合基因是NRG1基因的3’端与选自以下的基因之一的5’序列的融合体：CD74；DOC4；TNFRSF10B；CLU；VAMP2；SLC3A2；RBPMS；WRN；SDC4；KIF13B；SLECA2；PDE7A；ATP1B1；CDK1；BMPR1B；MCPH1和RAB2IL1。

优选地，所述细胞是上皮细胞。优选地，所述细胞是乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、肺癌(例如非小细胞肺癌)细胞，或其转移(metastasis)。

优选地，所述肿瘤是上皮来源的。优选地，所述肿瘤是乳腺癌、卵巢癌、肺癌，或其转移。

所述细胞可以是癌细胞，例如包含例如CLU-NRG1融合体或RAB2IL1-NRG1的卵巢癌。

所述细胞可以是癌细胞，例如包含例如DOC4-NRG1融合体的乳腺癌细胞。

所述细胞可以是癌细胞，例如NSCLC(肺)癌，例如被称侵袭性黏液腺癌的亚型，其包含例如VAMP2-NRG1、RBPMS-NRG1、WRN-NRG1、SDC4-NRG1、SLEC3A2-NRG1、KIF13B-NRG1或CD74-NRG1。

优选地，所述个体已经历了靶向EGFR抑制的治疗，优选用EGFR结合抗体进行的治疗，所述EGFR结合抗体优选为西妥昔单抗(cetuximab)。

优选地，所述方法还包括确定肿瘤的细胞上的ErbB-1细胞表面受体密度；ErbB-2细胞表面受体密度；ErbB-3细胞表面受体密度；ErbB-4细胞表面受体密度，或其组合。优选地，所述细胞或肿瘤具有少于400,000个ErbB-1细胞表面受体/细胞，优选少于200,000个ErbB-1细胞表面受体/细胞。

优选地，所述方法还包括向所述个体施用ErbB-1抑制剂，优选西妥昔单抗。

优选地，在本文中公开的方法中，ErbB-2/ErbB-3阳性细胞或肿瘤具有少于50,000个ErbB-3细胞表面受体/细胞。

优选地，在本文中公开的方法中，所述肿瘤的细胞的调蛋白表达水平高于MCF7细胞的调蛋白表达水平。

如技术人员所清楚的，本文中公开的双特异性抗体还用于制备药物和用于治疗中，如本文中所公开的那样。

特别地，包含可结合ErbB-2胞外部分的第一抗原结合位点和可结合ErbB-3胞外部分的第二抗原结合位点的双特异性抗体，其用于治疗具有ErbB-2和ErbB-3阳性细胞的个体，所述细胞包含NRG1融合基因，所述NRG1融合基因至少包含与来自不同染色体位置的5’序列融合的NRG1基因的3’端。

所述细胞可以是癌细胞。所述癌细胞可以是与NRG1融合体相关的癌细胞，例如由NRG1融合体驱动的癌细胞。

双特异性抗体还用于治疗ErbB-2/ErbB-3阳性肿瘤，其中所述肿瘤的细胞包含NRG1融合基因，所述NRG1融合基因包含与来自不同染色体位置的5’序列融合的NRG1基因的3’端。

优选地，在本文中公开的方法和用途中，所述第一抗原结合位点结合ErbB-2的结构域I，并且所述第二抗原结合位点结合ErbB-3的结构域III，优选地其中所述第一抗原结合位点对ErbB-2的亲和力低于所述第二抗原结合位点对ErbB-3的亲和力。优选地，其中所述双特异性抗体包含：i)选自以下的ErbB-2特异性重链可变区的至少CDR1、CDR2和CDR3序列：MF2926、MF2930、MF1849；MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003和MF1898，或者其中所述抗体包含与MF2926、MF2930、MF1849；MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003或MF1898的CDR1、CDR2和CDR3序列在至多3个氨基酸、优选地至多2个氨基酸、优选地至多1个氨基酸处不同的CDR序列；和/或ii)选自以下的ErbB-3特异性重链可变区的至少CDR1、CDR2和CDR3序列：MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF 6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073和MF6074，或者其中所述抗体包含与MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF 6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073或MF6074的CDR1、CDR2和CDR3序列在至多3个氨基酸、优选地至多2个氨基酸、优选地至多1个氨基酸处不同的CDR序列。优选地所述抗体包含：

i)选自以下的重链可变区序列的ErbB-2特异性重链可变区序列：MF2926、MF2930、MF1849；MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003和MF1898，或者其中所述抗体包含与以下的重链可变区序列在至多15个氨基酸处不同的重链可变区序列：MF2926、MF2930、MF1849；MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003或MF1898；和/或

ii)选自以下的重链可变区序列的ErbB-3特异性重链可变区序列：MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF 6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073和MF6074，或者其中所述抗体包含与以下的重链可变区序列在至多15个氨基酸处不同的重链可变区序列：MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF 6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073或MF6074。

优选地，所述抗体包含ErbB-2特异性重链可变区MF3958的至少CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述抗体包含ErbB-3特异性重链可变区MF3178的至少CDR1、CDR2和CDR3序列。优选地，双特异性抗体包含如序列表1D部分中所示的“用于erbB-2结合的重链”和如序列表1D部分中所示的“用于erbB-3结合的重链”。

优选地，所述第一抗原结合位点和所述第二抗原结合位点包含轻链可变区，所述轻链可变区包含IgVKl-39基因区段，最优选重排的种系人κ轻链IgVKl-39*01/IGJKl*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01。优选地，所述轻链可变区包含具有序列(RASQSISSYLN)的CDR1、具有序列(AASSLQS)的CDR2和具有序列(QQSYSTPPT)的CDR3。

发明详述

NRG1融合基因包含与来自不同染色体位置的序列融合的NRG1基因的至少一部分。“至少一部分”表示整个NRG-1基因可存在于融合体或其一部分中。融合体优选地至少具有外显子6、7和8的编码序列。限定NRG1融合基因中的NRG1部分的另一种方式是：其包含NRG1的EGF样结构域。NRG1基因的至少一部分可与来自不同染色体位置的序列融合，使得所述序列位于NRG1基因的至少一部分的5’或3’。

优选地，可将NRG1基因的3’端与来自不同染色体位置的5’序列融合。NRG1基因编码NRG1的多种同种型。Adelaide et al(2003)中描述了多种同种型及其预期功能。GGF和GGF2同种型包含三环样序列(kringle-like sequence)加Ig和EGF样结构域；并且SMDF同种型与其他同种型仅共享EGF样结构域。EGF样结构域由基因的3’端编码。EGF样结构域存在于本发明的所有NRG1融合基因中。已经发现了其中来自不同染色体位置的5’包含具有至少一个胞外结构域的细胞膜蛋白质的分泌信号和/或跨膜结构域的融合体。一个实例是CD74-NRG1融合体。来自不同染色体位置的5’序列还可插入激活NRG1转录的序列，其实例为启动子或增强子。5’序列通常是来自与NRG1不同的基因的序列。该序列可包含编码区、表达调节序列(例如启动子或增强子)，或其组合。NRG融合体包含来自不同位置的5’序列，其可来自不同的染色体或来自8号染色体的其他部分。在一个优选的实施方案中，5’序列来自人8号染色体上的基因。

融合体中的NRG1基因(例如NRG-1基因的3’端)优选至少具有外显子6、7和8的编码序列。限定NRG1融合基因中的NRG1部分的另一种方式是：其包含NRG1的EGF样结构域。该结构域由NRG1基因的3’端(外显子6至8)编码并且是与ErbB-3结合所必需的。NRG1融合体在该融合体的3’端保留了针对该EGF样结构域的框内编码区。EGF样结构域是通常长度为约30至40个氨基酸残基的序列，其原型见于表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)的序列[PMID：2288911；PMID：6334307；PMID：1522591；PMID：6607417；PMID：3282918；PMID：11498013]中。已知其以更保守或更不保守的形式存在于大量其他蛋白质(大多数是动物蛋白质)中。EGF样结构域的一个共同特征是：它们见于膜结合蛋白的胞外结构域中或者已知被分泌的蛋白质(例外：前列腺素G/H合酶)中。EGF结构域通常包含已经显示(在EGF中)参与形成二硫键的六个半胱氨酸残基。主要结构是两条链的β-折叠，随后是C端的短的两条链的折叠的环。保守的半胱氨酸之间的亚结构域的长度不同。

NRG1融合基因优选是NRG1基因的3’端与选自以下的基因之一的5’序列的融合体：CD74；DOC4；TNFRSF10B；CLU；VAMP2；SLC3A2；RBPMS；WRN；SDC4；KIF13B；SLECA2；PDE7A；ATP1B1；CDK1；BMPR1B；MCPH1和RAB2IL1。

NRG1融合基因可以是NRG1基因的至少一部分与来自不同染色体位置的定位在所述NRG1基因的3’的序列的融合体。这样的NRG1融合基因可以是NRG1基因的至少一部分与来自不同染色体位置CD74、STMN2、PMEPA1、PROSC或PSAP的定位在所述NRG1基因的3’的序列的融合体。所有NRG1同种型的受体是ErbB酪氨酸激酶跨膜受体家族。该家族也被称为人表皮生长因子(EGF)受体家族(HER)。该家族有四个成员：ErbB(成红细胞瘤(Erythroblastoma))-1、ErbB-2、ErbB-3和ErbB-4。表皮生长因子(EGF)受体(EGFR、ErbB1或HER1)。受体(在Yarden和Pines 2012中进行了综述)在上皮细胞上广泛表达。HER受体或其配体(例如调蛋白(HRG)或表皮生长因子(EGF))的上调是人癌症中的频发事件(Wilson，Fridly et al.2012)。ErbB-1和ErbB-2的过表达特别地在上皮肿瘤中发生，并且与肿瘤侵袭、转移、对化学治疗的抗性和不良预后相关(Zhang，Berezov et al.2007)。在正常乳腺中，已显示ErbB-3在腔上皮的生长和分化中是重要的。例如，ErbB-3的丢失/抑制导致基底相对于腔上皮的选择性扩增(Balko，Miller et al.2012)。配体与RTK胞外结构域的结合诱导在相同的受体亚型之间的受体二聚化(同二聚化)和在不同的受体亚型之间的受体二聚化(异二聚化)二者。二聚化可激活胞内酪氨酸激酶结构域，该结构域经历自磷酸化，并且进而可激活许多下游的促增殖信号传导途径，包括由促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)介导的那些以及促生存途径Akt(在Yarden和Pines，2012中进行了综述)。尚未鉴定出ErbB-2的特异性内源性配体，因此假定其通常通过异二聚化传导信号(Sergina，Rausch et al.2007)。ErbB-3可通过其配体的接合而被激活。这些配体包括但不限于神经调节蛋白(NRG)和调蛋白(HRG)。

已知ErbB-1有多个异名(synonym)，其中最常见的是EGFR。EGFR具有胞外结构域(extracellular domain，ECD)，该结构域由四个亚结构域构成，其中两个参与配体结合，并且其中两个参与同二聚化和异二聚化。EGFR整合来自多种配体的胞外信号，以产生多种胞内应答。EGFR激活的主要信号转导途径由Ras-促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)促分裂信号传导级联构成。通过将Grb2募集至酪氨酸磷酸化的EGFR来启动该途径的激活。这导致通过Grb2结合的Ras-鸟嘌呤核苷酸交换因子Son of Sevenless(SOS)的Ras的激活。此外，PI3-激酶-Akt信号传导途径还由EGFR激活，尽管在存在ErbB-3(HER3)的共表达的情况下这种激活强得多。EGFR与数种人上皮恶性肿瘤有关，特别是乳腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、头颈癌和脑癌。已经发现了基因中的激活突变，以及受体及其配体的过表达，导致了自分泌激活环。因此，该RTK已被广泛用作癌症治疗的靶标。靶向RTK的小分子抑制剂和针对胞外配体结合结构域的单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)二者均已被开发，并且迄今已显示出数项临床成功，尽管大部分是针对所选择的患者组。人EGFR蛋白及其编码基因的数据库登录号为(GenBank NM_005228.3)。主要给出该登录号以提供将EGFR蛋白鉴定为靶标的另外的方法，抗体结合的EGFR蛋白的实际序列可变化，例如由于编码基因中的突变而变化，所述突变例如在一些癌症等中发生的那些。

除非另有明确说明，否则本文中使用的词语“癌症”和“肿瘤”通常均指癌症。

除非另有说明，否则在本文中提及EGFR时，该提及是指人EGFR。结合EGFR的抗原结合位点结合EGFR及其多种变体，例如在一些EGFR阳性肿瘤上表达的那些。

本文中使用的术语‘ErbB-3’是指在人中由ERBB3基因编码的蛋白质。该基因或蛋白质的替代名称是：HER3；LCCS2；MDA-BF-1；c-ErbB-3；c-ErbB3；ErbB3-S；p180-ErbB3；p45-sErbB3；以及p85-sErbB3。在本文中提及ErbB-3时，该提及是指人ErbB-3。包含结合ErbB-3的抗原结合位点的抗体结合人ErbB-3。由于人与其他哺乳动物直系同源物之间的序列和三级结构相似性，ErbB-3抗原结合位点也可结合这样的直系同源物，但不一定如此。人ErbB-3蛋白及其编码基因的数据库登录号为(NP_001005915.1、NP_001973.2、NC_000012.11、NC_018923.2、NT_029419.12)。主要给出登录号以提供将ErbB-3鉴定为靶标的另外的方法，抗体结合的ErbB-3蛋白的实际序列可变化，例如由于编码基因中的突变而变化，所述突变例如在一些癌症等中发生的那些。ErbB-3抗原结合位点结合ErbB-3及其多种变体，例如由一些ErbB-3阳性肿瘤细胞表达的那些。结合ErbB-3的抗原结合位点优选结合ErbB-3的结构域III。

本文中使用的术语‘ErbB-2’是指在人中由ERBB-2基因编码的蛋白质。该基因或蛋白质的替代名称包括：CD340；HER-2；HER-2/neu；MLN 19；NEU；NGL；TKR1。ERBB-2基因通常被称为HER2(来源于人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor2))。在本文中提及ErbB-2时，该提及是指人ErbB-2。包含结合ErbB-2的抗原结合位点的抗体结合人ErbB-2。由于人和其他哺乳动物直系同源物之间的序列和三级结构相似性，ErbB-2抗原结合位点也可结合这样的直系同源物，但不一定如此。人ErbB-2蛋白及其编码基因的数据库登录号为(NP_001005862.1、NP_004439.2、NC_000017.10、NT_010783.15、NC_018928.2)。主要给出登录号以提供将ErbB-2鉴定为靶标的另外的方法，结合抗体的ErbB-2蛋白的实际序列可变化，例如由于编码基因中的突变而变化，所述突变例如在一些癌症等中发生的那些。ErbB-2抗原结合位点结合ErbB-2及其多种变体，例如由一些ErbB-2阳性肿瘤细胞表达的那些。结合ErbB-2的抗原结合位点优选结合ErbB-2的结构域I。

已知CD74有许多别名。其中一些是：CD74分子；CD74抗原(主要组织相容性复合体的恒定多肽，II类抗原相关)；CD74分子，主要组织相容性复合体，II类恒定链；HLA-DR抗原相关恒定链；II类抗原的γ链；Ia相关的恒定链；MHC HLA-DRγ链；HLA-DR-γ；DHLAG；P33；HLAII类组织相容性抗原γ链；Ia抗原相关的恒定链；Ia-GAMMA和HLADG。CD74的外部Id为：HGNC：1697；Entrez Gene：972；Ensembl：ENSG00000019582；OMIM：142790和UniProtKB：P04233。

已知DOC4或Teneurin跨膜蛋白4(Teneurin Transmembrane Protein 4，TENM4)有许多不同的名称，例如：蛋白质Odd Oz/Ten-M同源物4；生腱蛋白-M4(Tenascin-M4)；Ten-M4；Ten-4；ODZ4；TNM4；Odz；Odd Oz/Ten-M同源物4(果蝇)；Odz，Odd Oz/Ten-M同源物4；Teneurin-4；KIAA1302；Doc4；以及ETM5。DOC4的外部Id为：HGNC：29945；Entrez Gene：26011；Ensembl：ENSG00000149256；OMIM：610084和UniProtKB：Q6N022。

已知TNFRSF10B或TNF受体超家族成员10b有许多不同的名称：肿瘤坏死因子受体超家族成员10b；TNF相关的诱导凋亡配体受体2；死亡受体5；TRAIL-R2；TRAILR2；KILLER；TRICK2；ZTNFR9；DR5；P53调节的DNA损伤诱导型细胞死亡受体(Killer)；肿瘤坏死因子受体超家族成员10B；肿瘤坏死因子受体样蛋白ZTNFR9；包含死亡结构域的TRAIL/Apo-2L受体；凋亡诱导蛋白TRICK2A/2B；凋亡诱导受体TRAIL-R2；细胞毒性TRAIL受体2；Fas样蛋白；TRAIL受体2；CD262抗原；KILLER/DR5；TRICK2A；TRICK2B；TRICKB和CD262。TNFRSF10B的外部Id为：HGNC：11905；Entrez Gene：8795；Ensembl：ENSG00000120889；OMIM：603612；以及UniProtKB：O14763。

已知CLU基因或簇集素(Clusterin)有许多不同的名称，例如：睾酮阻遏前列腺信息2(Testosterone-Repressed Prostate Message 2)；载脂蛋白J；补体相关蛋白SP-40,40；补体细胞溶解抑制剂；补体裂解抑制剂；硫酸化糖蛋白2；Ku70结合蛋白1；NA1/NA2；TRPM-2；APO-J；APOJ；KUB1；CLI；簇集素(补体裂解抑制剂、SP-40，40、硫酸化糖蛋白2、睾酮阻遏前列腺信息2、载脂蛋白J)；衰老相关基因4蛋白；衰老相关蛋白4；SGP-2；SP-40；TRPM2；AAG4；CLU1；CLU2；以及SGP2。CLU的外部Id为：HGNC：2095；Entrez Gene：1191；Ensembl：ENSG00000120885；OMIM：185430；以及UniProtKB：P10909。

已知VAMP2或囊泡相关膜蛋白2有许多不同的名称，例如：小突触小泡蛋白2(synaptobrevin 2)；SYB2；囊泡相关膜蛋白2；以及小突触小泡蛋白-2。VAMP2的外部Id为：HGNC：12643；Entrez Gene：6844；Ensembl：ENSG00000220205；OMIM：185881；以及UniProtKB：P63027。

已知SLCA3A2或溶质载体家族3成员2(Solute Carrier Family3 Member2)有许多不同的名称，例如：淋巴细胞激活抗原4F2大亚基；溶质载体家族3(二碱性和中性氨基酸转运激活物)成员2；通过单克隆抗体4F2、TRA1.10、TROP4和T43鉴定的抗原；溶质载体家族3(氨基酸转运蛋白重链)成员2；4F2细胞表面抗原重链；CD98重链；4F2HC；MDU1；通过单克隆抗体4F2重链限定的抗原；通过单克隆抗体4F2限定的抗原；4F2重链抗原；4F2重链；CD98抗原；CD98HC；4T2HC；NACAE；CD98和4F2。SLC3A2的外部Id为：HGNC：11026；Entrez Gene：6520；Ensembl：ENSG00000168003；OMIM：158070；以及UniProtKB：P08195。

已知具有多个剪接的RBPMS或RNA结合蛋白有许多不同的名称，例如：具有多个剪接的RNA结合蛋白；心和RRM表达序列；HERMES；具有多个剪接的RNA结合蛋白；以及RBP-MS。RBPMS的外部Id为：HGNC：19097；Entrez Gene：11030；Ensembl：ENSG00000157110；OMIM：601558；以及UniProtKB：Q93062。

已知WRN或沃纳综合征RecQ样解旋酶(Werner Syndrome RecQ Like Helicase)有许多不同的名称，例如：沃纳综合征(Werner Syndrome)RecQ样解旋酶；DNA解旋酶，RecQ-样3型；RecQ蛋白样2；外切核酸酶WRN；RECQL2；RECQ3；沃纳综合征ATP依赖性解旋酶；沃纳综合征，RecQ解旋酶样；沃纳综合症；EC 3.6.4.12；EC 3.1.-.-；EC 3.6.1；以及RECQL3。用于WRN的外部Id为：HGNC：12791；Entrez Gene：7486；Ensembl：ENSG00000165392；OMIM：604611和UniProtKB：Q14191。

已知SDC4或黏结蛋白聚糖4(Syndecan 4)有许多不同的名称，例如：黏结蛋白聚糖4(双栖蛋白聚糖(Amphiglycan)、Ryudocan)；黏结蛋白聚糖蛋白聚糖4；Ryudocan核心蛋白；双栖蛋白聚糖；SYND4；Ryudocan双栖蛋白聚糖；以及黏结蛋白聚糖-4。SDC4的外部Id为：HGNC：10661；Entrez Gene：6385；Ensembl：ENSG00000124145；OMIM：600017；以及UniProtKB：P31431。

Dhanasekaran et al.(2014)中描述了多种NRG1融合基因。

本发明提供了具有ErbB-2和ErbB-3阳性细胞或肿瘤的个体的方法。或者，个体可处于患有肿瘤之风险中。所述方法包括向有此需要的个体施用包含可结合ErbB-2胞外部分的第一抗原结合位点和可结合ErbB-3胞外部分的第二抗原结合位点的双特异性抗体。所述方法的特征在于所述肿瘤的细胞包含NRG1融合基因，所述NRG1融合基因包含与来自不同染色体位置的5’序列融合的NRG1基因的3’端。

抗体中的抗原结合位点通常存在于可变结构域中。可变结构域包含重链可变区和轻链可变区。

所述个体优选地已经历靶向EGFR抑制的治疗，优选用EGFR结合抗体进行的治疗，所述EGFR结合抗体优选为西妥昔单抗。

本发明的治疗方法优选地还包括确定所述肿瘤的细胞上的ErbB-1细胞表面受体；ErbB-2细胞表面受体；ErbB-3细胞表面受体；ErbB-4细胞表面受体或其组合的数目。

本发明的治疗方法优选地还包括确定所述细胞是否包含NRG1融合体或所述肿瘤是否包含具有NRG1融合体的细胞。例如，这可借助于对细胞进行活检来完成。多种方法是可用的，并且许多是本领域中已知的。在已知其中在NRG1融合体的情况下染色体发生断裂的区域的情况下，对于技术人员而言确定肿瘤是否包含这样的NRG1融合体是常规的。一种方式是借助于利用跨越NRG1融合体中的接界(junction)的引物进行PCR扩增。对于已知发生的NRG1融合体，这可容易地实现。还可容易地检测新的融合体。合适的方式是例如通过用于发现例如逆转录病毒基因组的整合位点的接界克隆技术。合适的方法借助于LAM-PCR，参见Schmidt et al Nature Methods 4，1051-1057(2007)doi：10.1038/nmeth1103，并且特别参考其中的LAM技术。

优选地，本发明的治疗方法的特征在于，所述细胞或肿瘤具有少于400,000个ErbB-1细胞表面受体/细胞，优选少于200,000个ErbB-1细胞表面受体/细胞。

在一个优选的实施方案中，本发明的治疗方法还包括向所述个体施用ErbB-1抑制剂，优选西妥昔单抗。

如本文中所限定的治疗方法还可被限定为用于治疗的化合物或化合物的组合。化合物的合适组合是本文中限定的双特异性抗体以及ErbB-1抑制剂。

为了确定细胞或肿瘤是否对ErbB-2和ErbB-3呈阳性，技术人员可例如在免疫组织化学中确定ErbB-2和ErbB-3扩增和/或染色。活检中至少10％的肿瘤细胞应对ErbB-2和ErbB-3二者呈阳性。活检还可包含20％、30％、40％、50％、60％、70％或更多的阳性细胞。可类似地鉴定ErbB-1阳性肿瘤。

优选地，所述阳性癌症是乳腺癌，例如早期乳腺癌。然而，本发明可应用于广泛的ErbB-2、ErbB-3或ErbB-2/ErbB-3阳性癌症，例如胃癌、结直肠癌、结肠癌、胃食管癌、食管癌、子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、肺癌(包括非小细胞肺癌)、透明细胞肉瘤、唾液腺癌、头颈癌、脑癌、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌、黑素瘤等。所述细胞优选是上皮细胞。或者，所述细胞或肿瘤优选是上皮来源的细胞或肿瘤。在一个优选的实施方案中，所述细胞或肿瘤是乳腺癌、卵巢癌、肺癌，或其转移。优选地，所述肿瘤是上皮来源的。优选地，所述肿瘤是乳腺癌、卵巢癌、肺癌，或其转移。

具有ErbB 2阳性的细胞或肿瘤细胞的患者可基于肿瘤细胞表面的ErbB-2受体数目进行分类。在其细胞表面上具有多于1,000,000个ErbB-2受体的肿瘤通常被分类为ErbB-2[+++]，具有150,000至1,000,000个的那些被分类为ErbB-2[++]，并且具有少于150,000个的那些被分类为ErbB-2[+]。优选地，将患者分类为ErbB-2[++]或ErbB-2[+++]。优选地，ErbB-2/ErbB-3阳性肿瘤具有至少1,000,000个ErbB-2细胞表面受体/细胞。

优选地，提供了其中ErbB-2/ErbB-3阳性细胞或肿瘤具有至少150,000个ErbB-2细胞表面受体/细胞和少于50,000个ErbB-3细胞表面受体/细胞的方法。优选地，提供了其中ErbB-2/ErbB-3阳性细胞或肿瘤具有至少1,00,000个ErbB-2细胞表面受体/细胞和少于50,000个ErbB-3细胞表面受体/细胞的方法。

在一些实施方案中，本文中公开的方法的优点在于，首先基于例如ErbB-1、ErbB-2和/或ErbB-3细胞表面受体密度确定特定的患者群体。因此，本文中公开的方法优选包括确定所述细胞或肿瘤的ErbB-1细胞表面受体密度、ErbB-2细胞表面受体密度、ErbB-3细胞表面受体密度和/或ErbB-4细胞表面受体密度。本文中使用的术语“细胞表面受体密度”是指存在于细胞表面处受体的数目/细胞。

优选地，本文中公开的方法还包括确定所述细胞或肿瘤的ErbB-2细胞表面受体密度。可使用免疫组织化学或荧光原位杂交对患者进行分类。均由Dako Denmark A/S销售的HercepTest^TM和/或HER2 FISH(pharm Dx^TM)和/或使用由Monogram Biosciences销售的测定是用于确定ErbB-2或ErbB-3细胞表面受体密度的合适测定的一些实例。用于确定ErbB-2受体细胞密度的其他方法是技术人员公知的。用于确定ErbB-2的体内方法也是已知的，参见例如Chernomoridik et al.Mol Imaging.2010年8月；9(4)：192-200和Ardeshirpour et al.Technol Cancer Res Treat.2014年8月；13(5)：427-434。优选地，本文中公开的方法还包括确定所述细胞或肿瘤的ErbB-2细胞表面受体密度。这样的方法是技术人员已知的(参见例如van der Woning和van Zoelen Biochem Biophys ResCommun.2009年1月9日；378(2)：285-9)。优选地，本文中公开的方法还包括确定所述细胞或肿瘤的ErbB-1细胞表面受体密度。这样的方法是技术人员已知的(参见例如EGFRpharmDx^TMKit(Dako)和McDonagh et al.Mol Cancer Ther 2012；11：582)。可使用类似的方法来确定ErbB-4细胞表面受体密度。

在一些实施方案中，通过对活检的肿瘤细胞进行FACS分析来确定ErbB-1、ErbB-2、ErbB-3和ErbB-4细胞表面受体密度。

优选地，ErbB-2/ErbB-3阳性细胞或肿瘤的细胞具有相对高水平的调蛋白表达。调蛋白是参与ErbB 3阳性的细胞或肿瘤细胞的生长的生长因子。通常来说，当细胞或肿瘤细胞表达高水平的调蛋白(称为调蛋白应激)时，目前已知的治疗剂(例如曲妥珠单抗(trastuzumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)和拉帕替尼(lapatinib))不再能够抑制细胞或肿瘤生长。这种现象称为调蛋白抗性。特别地，调蛋白表达水平高于MCF7细胞的调蛋白表达水平。调蛋白表达水平例如使用用细胞或肿瘤RNA的qPCR来测量(例如在Shames etal.PLOS ONE，2013年2月，第8卷，第2期，第1至10页和在Yonesaka et al.，Sci.transl.Med.，第3卷，第99期(2011)；第1至11页中描述的)，或使用蛋白质检测方法(例如ELISA)，优选使用血液、血浆或血清样品来测量(例如Yonesaka et al.，Sci.transl.Med.，第3卷，第99期(2011)；第1至11页中描述的)。

在转移的形成(即细胞或肿瘤细胞或肿瘤起始细胞的迁移、侵袭、生长和/或分化)期间通常存在高的调蛋白水平。通常来说，基于干细胞标志物(例如CD44、CD24、CD133和/或ALDH1)来鉴定肿瘤起始细胞。因此，这些方法几乎不能用目前已知的治疗剂(例如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗)来抵消。本文中公开的双特异性抗体能够抵消具有细胞肿瘤的对象中的转移的形成，所述细胞肿瘤包含NRG1融合基因，所述NRG1融合基因包含与来自不同染色体位置的5’序列融合的NRG1基因的3’端。

因此，还提供了用于抵消具有ErbB-2、ErbB-3或ErbB-2/ErbB-3阳性细胞或肿瘤的对象中的转移形成的方法，所述方法包括向对象施用包含结合ErbB-2的第一抗原结合位点和结合ErbB-3的第二抗原结合位点的双特异性抗体，其中所述ErbB-2、ErbB-3或ErbB-2/ErbB-3阳性的细胞或肿瘤细胞的调蛋白表达水平为BXPC3或MCF7细胞的调蛋白表达水平的至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％或95％。还提供了包含结合ErbB-2的第一抗原结合位点和结合ErbB-3的第二抗原结合位点的双特异性抗体，其用于治疗或预防转移的形成，其中所述ErbB-2、ErbB-3或ErbB-2/ErbB-3阳性的细胞或肿瘤细胞的调蛋白表达水平为BXPC3或MCF7细胞的调蛋白表达水平的至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％或95％。还提供了根据本发明的双特异性抗体用于制备用于治疗或预防转移的形成的药物的用途，其中所述ErbB-2、ErbB-3或ErbB-2/ErbB-3阳性的细胞或肿瘤细胞的调蛋白表达水平为BXPC3或MCF7细胞的调蛋白表达水平的至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％或95％。

所述对象优选是人对象。所述对象优选是适合使用ErbB-2特异性抗体(例如曲妥珠单抗)的单克隆抗体治疗的对象。

待向患者施用的双特异性抗体的量通常在治疗窗内，这意味着使用足够的量以获得治疗效果，同时该量不超过导致不可接受程度的副作用的阈值。获得期望治疗效果所需的抗体的量越低，治疗窗通常将越大。所选的剂量水平将取决于多种因素，包括施用途径；施用时间；所用特定化合物的排泄率；治疗持续时间；组合使用的其他药物、化合物和/或材料；所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康状况和既往病史；以及医学领域中公知的类似因素。剂量可在曲妥珠单抗的给药方案范围内或更低。

双特异性抗体可被配制成包含可药用载体、稀释剂或赋形剂以及另外的任选的活性剂的药物组合物。抗体和包含抗体的组合物可通过任何途径施用，包括肠胃外、经肠和表面施用。肠胃外施用通常通过注射，并且包括例如静脉内、肌内、动脉内、鞘内、室内、囊内、眶内(intraorbital)、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、脑脊内、瘤内和胸骨内注射和输注。

在一些优选的实施方案中，ErbB-1抑制剂可与用本文中公开的双特异性抗体进行的治疗组合。ErbB-1抑制剂可与双特异性抗体同时或依次施用。用ErbB-1抑制剂进行的治疗可与用双特异性抗体进行的治疗间隔开数分钟、数小时或数天。优选地，ErbB-2/ErbB3细胞或肿瘤对ErbB1也呈阳性。优选地，组合治疗适合于具有多于5,000个表面受体/细胞、优选至少20,000个表面受体/细胞、更优选多于50,000个表面受体/细胞的ErbB-2/ErbB3细胞或肿瘤。

合适的ErbB-1抑制剂是本领域中已知的，并且是指抑制ErbB-1(EGFR)的至少一种生物学活性的化合物，特别是降低ErbB-1的表达或信号传导活性的化合物。优选的ErbB-1抑制剂与酪氨酸激酶受体分子的胞外结合位点结合并阻断天然配体(例如EGF)的结合。这样的抑制剂包括包含靶向该胞外EGF受体结合结构域的表位的抗体、抗体部分和肽。优选地，ErbB-1抑制剂是抗ErbB-1抗体，优选选自西妥昔单抗、马妥珠单抗(matuzumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、帕尼单抗或扎鲁木单抗(zalutumumab)。本发明还涉及可结合酪氨酸激酶受体分子的胞内磷酸化位点或结构域或者与其相互作用，从而阻止或降低通过酪氨酸激酶之磷酸化的ErbB-1抑制剂。这可通过小(化学)分子药物来实现。优选的抑制剂包括阿法替尼(afatinib)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、拉帕替尼(lapatinib)、奥西替尼(osimertinib)和来那替尼(neratinib)。

本公开内容提供了用于本文中所述的方法和治疗的双特异性抗体。合适的双特异性抗体包含结合ErbB-2的第一抗原结合位点和结合ErbB-3的第二抗原结合位点，其中所述双特异性抗体降低或可降低ErbB-2和ErbB-3阳性细胞上ErbB-3的配体诱导的受体功能。优选的抗体及其制备在WO 2015/130173中公开，其在此通过引用并入。WO 2015/130173中的实施例还描述了抗体的许多特性，例如配体结合和表位映射。

本文中使用的术语“抗原结合位点”是指能够与抗原结合的源自双特异性抗体并且优选存在于其上的位点。未经修饰的抗原结合位点通常由抗体的可变结构域形成并且存在于其中。可变结构域包含所述抗原结合位点。结合抗原的可变结构域是包含结合抗原的抗原结合位点的可变结构域。

在一个实施方案中，抗体可变结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。抗原结合位点可存在于组合的VH/VL可变结构域中，或存在于仅VH区或仅VL区中。当抗原结合位点存在于可变结构域的两个区域的仅一个中时，对应的可变区可有助于结合可变区的折叠和/或稳定性，但不显著促进抗原本身的结合。

本文中使用的抗原结合是指抗体与其抗原的典型结合能力。包含与ErbB-2结合的抗原结合位点的抗体与ErbB-2结合，并且在其他相同的条件下，低至少100倍地与同一物种的同源受体ErbB-1和ErbB-4结合。包含与ErbB-3结合的抗原结合位点的抗体与ErbB-3结合，并且在其他相同的条件下，不与同一物种的同源受体ErbB-1和ErbB-4结合。考虑到ErbB家族是细胞表面受体家族，通常在表达该受体的细胞上评估结合。可以以多种方法评估抗体与抗原的结合。一种方法是用抗原(优选表达抗原的细胞)孵育抗体，去除未结合的抗体(优选通过洗涤步骤)并借助于与结合的抗体结合的经标记抗体来检测结合的抗体。

与抗体的随机、非特异性黏着(sticking)相反，抗体被抗原结合通常通过抗体的互补区域以及抗原和可变结构域二者的特定三维结构来介导，从而允许这两个结构精确地(类似于锁和钥匙的相互作用)结合在一起。由于抗体通常识别抗原的表位，并且由于这样的表位也可存在于其他化合物中，所以如果这样的其他化合物包含相同表位，则根据本发明的结合ErbB-2和/或ErbB-3的抗体也可识别其他蛋白质。因此，术语“结合”不排除抗体与包含相同表位的其他蛋白质的结合。这样的其他蛋白质优选不是人蛋白质。如本文中限定的ErbB-2抗原结合位点和ErbB-3抗原结合位点通常不与出生后的、优选成年人中的细胞膜上的其他蛋白质结合。如本文中公开的双特异性抗体通常能够以至少1×10e-6M的结合亲和力结合ErbB-2和ErbB-3，如下文更详细地概述的。

本文中使用的术语“干扰结合”意指抗体针对ErbB-3上的表位，并且抗体与配体竞争与ErbB-3结合。抗体可降低配体结合、置换已与ErbB-3结合的配体，或者其可(例如通过位阻)至少部分阻止配体可与ErbB-3结合。

本文中使用的术语“抗体”意指优选属于蛋白质的免疫球蛋白类别的蛋白质分子，其包含结合抗原上的表位的一个或更多个可变结构域，其中这样的结构域来源于抗体的可变结构域或与其共享序列同源性。用于治疗用途的抗体优选尽可能接近待治疗对象的天然抗体(例如用于人对象的人抗体)。抗体结合可用特异性和亲和力来表达。特异性决定了哪种抗原或其表位被结合结构域特异性结合。亲和力是与特定抗原或表位结合的强度的量度。特异性结合被限定为以至少1×10e-6M、更优选1×10e-7M、更优选高于1×10e-9M的亲和力(KD)结合。通常来说，用于治疗应用的抗体的亲和力高至1×10e-10M或更高。抗体(例如本发明的双特异性抗体)包含天然抗体的恒定结构域(Fc部分)。本发明的抗体通常是双特异性全长抗体，优选是人IgG亚类的。优选地，本文中公开的抗体是人IgG1亚类的。这样的抗体具有良好的ADCC特性，在体内施用于人之后具有有利的半衰期，并且存在可提供经修饰的重链的CH3改造技术，所述重链在克隆细胞中共表达时相比于同二聚体优先形成异二聚体。

本文中公开的抗体优选是“全长”抗体。术语‘全长’被定义为包含基本上完全的抗体，但是其不一定具有完整抗体的所有功能。为了避免疑义，全长抗体包含两条重链和两条轻链。每条链包含恒定(C)区和可变(V)区，其可被分解成称为CH1、CH2、CH3、VH和CL、VL的结构域。抗体通过Fab部分中包含的可变结构域与抗原结合，并且在结合之后可通过恒定结构域(主要通过Fc部分)与免疫系统的分子和细胞相互作用。术语‘可变结构域’、‘VH/VL对’、‘VH/VL’在本文中可互换使用。根据本发明的全长抗体涵盖其中可存在提供期望特性的突变的抗体。这样的突变不应是任一区域的实质部分的缺失。然而，其中缺失一个或数个氨基酸残基而基本上不改变所得抗体的结合特征的抗体包含在术语“全长抗体”内。例如，IgG抗体可在恒定区中具有1至20个氨基酸残基插入、缺失或其组合。例如，当抗体本身具有低的ADCC活性时，可通过轻微修饰抗体的恒定区来改善抗体的ADCC活性(Junttila，T.T.，K.Parsons，et al.(2010).“Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumabin the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer.”Cancer Research 70(11)：4481-4489)。

全长IgG抗体是优选的，因为它们有利的半衰期，以及由于免疫原性的原因需要保持接近完全自体(人)分子。本文中公开的抗体优选是双特异性IgG抗体，优选双特异性全长IgG1抗体。基于IgG1在人中的长循环半衰期，其是有利的。为了预防在人中的任何免疫原性，优选地双特异性IgG抗体是人IgG1。

术语‘双特异性’(bispecific，bs)意指抗体的一部分(如上定义)与抗原上的一种表位结合，而第二部分与不同的表位结合。不同的表位通常存在于不同的抗原上。第一和第二抗原实际上是两种不同的蛋白质。优选的双特异性抗体是包含两种不同单克隆抗体的部分并因此与两种不同类型抗原结合的抗体。双特异性抗体的一个臂通常包含一种抗体的可变结构域，并且另外的臂包含另一抗体的可变结构域。双特异性抗体的重链可变区通常彼此不同，而轻链可变区优选是相同的。其中不同的重链可变区与相同或共同的轻链缔合的双特异性抗体也被称为具有共同轻链的双特异性抗体。

优选的双特异性抗体可通过在单一细胞中共表达两条不同的重链和共同的轻链而获得。当使用野生型CH3结构域时，两条不同的重链和共同的轻链的共表达将导致三种不同的种类，AA、AB和BB。为了提高期望的双特异性产物(AB)的百分比，可使用CH3改造，或者换句话说，可使用具有如下文所定义的相容性异二聚化结构域的重链。

本文中使用的术语‘相容性异二聚化结构域’是指这样的蛋白质结构域，其是经改造的使得经改造的结构域A’将优先与经改造的结构域B’形成异二聚体并且反之亦然，而A’-A’与B’-B’之间的同二聚化降低。

术语‘共同的轻链’是指可以是相同的或具有一些氨基酸序列差异而全长抗体的结合特异性不受影响的轻链。例如，例如可通过引入并测试保守氨基酸变化、在与重链配对时不导致或仅部分地导致结合特异性的区域中的氨基酸变化等来制备或发现不相同但仍在功能上等同的轻链。在添加或不添加术语“经重排的”的情况下，术语‘共同的轻链’、‘共同的VL’、‘单一轻链’、‘单一VL’在本文中全部可互换使用。

共同的轻链(可变区)优选具有种系序列。一个优选的种系序列是人库(humanrepertoire)中经常使用，并且具有良好的热力学稳定性、产量和溶解性的轻链可变区。在一个优选的实施方案中，轻链包含轻链区，所述轻链区包含如序列1C“共同的轻链IGKV1-39/jk1”中所示的O12/IgVκ1-39*01基因区段的氨基酸序列，具有0至10个、优选0至5个氨基酸插入、缺失、替换、添加或其组合。IgVκ1-39是免疫球蛋白可变κ1-39基因的简称。该基因也被称为：免疫球蛋白κ可变1-39；IGKV139；IGKV1-39；O12a或O12。该基因的外部Id为：HGNC：5740；Entrez Gene：28930；Ensembl：ENSG00000242371。IGKV1-39的可变区在序列1C中列出。V区可与五个J区之一组合。序列1C描述了与J区组合的IgVκ1-39的两个优选序列。联合的序列表示为IGKV1-39/jk1和IGKV1-39/jk5；别名为IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01(根据IMGT数据库万维网imgt.org的命名)。

优选地，包含O12/IgVκ1-39*01的轻链可变区是种系序列。进一步优选地，包含IGJκ1*01或/IGJκ5*01的轻链可变区是种系序列。在一个优选的实施方案中，IGKV1-39/jk1或IGKV1-39/jk5轻链可变区是种系序列。

在一个优选的实施方案中，轻链可变区包含种系O12/IgVκ1-39*01。在一个优选的实施方案中，轻链可变区包含κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01。在一个优选的实施方案中，IgVκ1-39*01/IGJκ1*01。轻链可变区优选包含种系κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或种系κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ5*01，优选种系IgVκ1-39*01/IGJκ1*01。

显然，本领域技术人员将认识到“共同的”还指代氨基酸序列不相同的轻链的功能等同物。存在所述轻链的许多变体，其中存在不实质上影响功能性结合区形成的突变(缺失、替换、添加)。轻链也可以是本文中如上所述的轻链，具有1至5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合。

优选地，所述第一抗原结合位点和所述第二抗原结合位点二者均包含轻链可变区，所述轻链可变区包含具有序列(RASQSISSYLN)的CDR1、具有序列(AASSLQS)的CDR2和具有序列(QQSYSTPPT)的CDR3。

本文中使用的术语‘ErbB-1’是指在人中由ERBB-1基因编码的蛋白质。该基因或蛋白质的替代名称包括：EGFR、ERBB、HER1、Erb-B2受体酪氨酸激酶1。在本文中提及ErbB-1时，该提及是指人ErbB-1。

本文中使用的术语‘ErbB-2’是指在人中由ERBB-2基因编码的蛋白质。该基因或蛋白质的替代名称包括：CD340；HER-2；HER-2/neu；MLN19；NEU；NGL；TKR1。ERBB-2基因通常被称为HER2(来源于人表皮生长因子受体2)。在本文中提及ErbB-2时，该提及是指人ErbB-2。包含结合ErbB-2的抗原结合位点的抗体结合人ErbB-2。由于人和其他哺乳动物直系同源物之间的序列和三级结构相似性，ErbB-2抗原结合位点也结合这样的直系同源物，但不一定如此。人ErbB-2蛋白及其编码基因的数据库登录号为(NP_001005862.1、NP_004439.2、NC_000017.10、NT_010783.15、NC_018928.2)。主要给出登录号以提供将ErbB-2鉴定为靶标的另外的方法，结合抗体的ErbB-2蛋白的实际序列可变化，例如由于编码基因中的突变而变化，所述突变例如在一些癌症等中发生的那些。ErbB-2抗原结合位点结合ErbB-2及其多种变体，例如由一些ErbB-2阳性的细胞或肿瘤细胞表达的那些。

本文中使用的术语‘ErbB-3’是指在人中由ERBB-3基因编码的蛋白质。该基因或蛋白质的替代名称是：HER3；LCCS2；MDA-BF-1；c-ErbB-3；c-erbb-3；erbb-3-S；p180-Erbb-3；p45-sErbb-3；以及p85-sErbb-3。在本文中提及ErbB-3时，该提及是指人ErbB-3。包含结合ErbB-3的抗原结合位点的抗体结合人ErbB-3。由于人和其他哺乳动物直系同源物之间的序列和三级结构相似性，ErbB-3抗原结合位点也可结合这样的直系同源物，但不一定如此。人ErbB-3蛋白及其编码基因的数据库登录号为(NP_001005915.1、NP_001973.2、NC_000012.11、NC_018923.2、NT_029419.12)。主要给出登录号以提供将ErbB-3鉴定为靶标的另外的方法，抗体结合的ErbB-3蛋白的实际序列可变化，例如由于编码基因中的突变而变化，所述突变例如在一些癌症等中发生的那些。ErbB-3抗原结合位点结合ErbB-3及其多种变体，例如由一些ErbB-2阳性的细胞或肿瘤细胞表达的那些。

本文中使用的术语‘ErbB-4’是指在人中由ERBB-4基因编码的蛋白质。该基因或蛋白质的替代名称包括：HER4、Erb-B2受体酪氨酸激酶4和人表皮生长因子受体4。在本文中提及ErbB-1时，该提及是指人ErbB-4。

本文中公开的抗体可降低ErbB-2和ErbB-3阳性细胞上的ErbB-3的配体诱导的受体功能。在存在过量ErbB-2的情况下，在异二聚体中不存在可检出的ErbB-3链的配体的情况下，ErbB-2/ErbB-3异二聚体可向表达细胞提供生长信号。该ErbB-3受体功能在本文中被称为ErbB-3的配体非依赖性受体功能。在存在ErbB-3配体的情况下，ErbB-2/ErbB-3异二聚体也向表达细胞提供生长信号。该ErbB-3受体功能在本文中被称为ErbB-3的配体诱导的受体功能。

本文中使用的术语“ErbB-3配体”是指结合并激活ErbB-3的多肽。ErbB-3配体的一些实例包括但不限于：神经调节蛋白(NRG)1和神经调节蛋白2、乙胞素(betacellulin)、肝素结合表皮生长因子以及上皮调节蛋白(epiregulin)。该术语包括天然存在的多肽的生物活性片段和/或变体。

优选地，ErbB-3的配体诱导的受体功能是ErbB-3配体诱导的ErbB-2和ErbB-3阳性细胞生长。在一个优选的实施方案中，所述细胞是MCF-7细胞(

HTB-22^TM)；SKBR3(

HTB-30^TM)细胞；NCI-87(

CRL-5822^TM)细胞；BxPC-3-luc2细胞(PerkinElmer125058)，BT-474细胞(HTB-20^TM)或JIMT-1细胞(DSMZ号：ACC589)。

本文中使用的配体诱导的受体功能降低至少20％、优选至少30％、40％、50％、60％或至少70％，在一个特别优选的实施方案中，配体诱导的受体功能降低80％、更优选90％。该降低优选通过确定在存在本文中公开的双特异性抗体的情况下的配体诱导的受体功能，并在其他条件相同的条件下将其与在没有抗体的情况下的相同功能进行比较来确定。所述条件包括至少存在ErbB-3配体。存在的配体的量优选是诱导ErbB-2和ErbB-3阳性细胞系最大生长的一半的量。用于该测试的ErbB-2和ErbB-3阳性细胞系优选是MCF-7细胞系(HTB-22^TM)、SKBR3细胞系(HTB-30^TM)细胞、JIMT-1细胞系(DSMZ ACC589)或NCI-87细胞系(

CRL-5822^TM)。用于确定ErbB-3配体诱导的受体功能的测试和/或配体优选是如实施例中所指定的用于ErbB-3配体诱导的生长降低的测试。

ErbB-2蛋白包含数个结构域(参见Landgraf，R Breast Cancer Res.2007；9(1)：202-的图1作为参考)。胞外结构域被称为结构域I至IV。已经映射了与本文中所述抗体的抗原结合位点的相应结构域结合的位置。具有结合ErbB-2的结构域I或结构域IV(第一抗原结合位点)的抗原结合位点(第一抗原结合位点)的双特异性抗体包含重链可变区，所述重链可变区当与多种轻链组合时，保持对ErbB-2的显著的结合特异性和亲和力。具有结合ErbB-2的结构域I或结构域IV(第一抗原结合位点)的抗原结合位点(第一抗原结合位点)和对于ErbB-3的抗原结合位点(第二抗原结合位点)的双特异性抗体相比于包含与ErbB-2的其他胞外结构域结合的抗原结合位点(第一抗原结合位点)的双特异性抗体更有效地降低ErbB-3的配体诱导的受体功能。包含结合ErbB-2的抗原结合位点(第一抗原结合位点)的双特异性抗体，其中所述抗原结合位点与ErbB-2的结构域I或结构域IV结合是优选的。优选地，所述抗原结合位点与ErbB-2的结构域IV结合。优选的抗体包含结合ErbB-2的结构域I的第一抗原结合位点和结合ErbB-3的结构域III的第二抗原结合位点。

在一个优选的实施方案中，所述抗体包含这样的抗原结合位点，其结合选自以下的ErbB-2的结构域I的至少一个氨基酸：T144、T164、R166、P172、G179、S180和R181、以及位于与T144、T164、R166、P172、G179、S180或R181相距约5个氨基酸位置内的表面-暴露的氨基酸残基。

在一个优选的实施方案中，所述抗体优选包含这样的抗原结合位点，其结合选自以下的ErbB-3的结构域IIJ的至少一个氨基酸：天然ErbB-3蛋白中的R426和位于与R426相距

内的表面暴露的氨基酸残基。

具有结合ErbB-2的抗原结合位点(第一抗原结合位点)并且还包含ADCC的双特异性抗体比不具有显著ADCC活性的其他ErbB-2结合抗体更有效，特别是在体内。因此，表现出ADCC的双特异性抗体是优选的。发现其中所述第一抗原结合位点与ErbB-2结构域IV结合的抗体具有固有的ADCC活性。具有低的固有ADCC活性的结合结构域I的ErbB-2结合抗体可被改造以增强ADCC活性，Fc区通过与免疫效应细胞(例如巨噬细胞、自然杀伤细胞、B细胞和中性粒细胞)上的不同受体结合来介导抗体功能。这些受体中的一些，例如CD16A(FcγRIIIA)和CD32A(FcγRIIA)，活化细胞以建立针对抗原的应答。另一些受体(例如CD32B)抑制免疫细胞的活化。通过对与具有更高选择性的激活受体结合的Fc区进行改造(通过引入氨基酸替换)，可产生具有更高的介导对于抗癌Mab所期望的细胞毒性活性的能力的抗体。

用于增强抗体的ADCC的一种技术是无岩藻糖基化(afucosylation)(参见，例如Junttila，T.T.，K.Parsons，et al.(2010).“Superior In vivo Efficacy ofAfucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer.”Cancer Research 70(11)：4481-4489)。因此，还提供了本文中公开的双特异性抗体，其是无岩藻糖基化的。作为替代或补充，可使用多种其他策略来实现ADCC增强，所述策略例如包括糖工程(glycoengineering)(Kyowa Hakko/Biowa，GlycArt(Roche)和EurekaTherapeutics)和诱变(Xencor和Macrogenics)，所有这些都试图改善Fc与低亲和力激活FcγRIIIa结合，和/或降低与低亲和力抑制性FcγRIIb结合。

存在数种用于确定抗体或效应细胞在引发ADCC中的效力的体外方法。其中有铬51[Cr51]释放测定、铕[Eu]释放测定和硫35[S35]释放测定。通常来说，将表达某种表面暴露的抗原的经标记靶细胞系用对该抗原具有特异性的抗体孵育。洗涤之后，通常将表达Fc受体CD16的效应细胞与经抗体标记的靶细胞共孵育。随后通常通过胞内标记的释放，例如通过闪烁计数器或分光光度法来测量靶细胞裂解。

在一些优选的双特异性抗体中，所述第二抗原结合位点对ErbB-3阳性细胞的亲和力等于或优选高于所述第一抗原结合位点对ErbB-2阳性细胞的亲和力。所述第二抗原结合位点对ErbB-3阳性细胞的亲和力(KD)优选低于或等于2.0nM，更优选低于或等于1.5nM，更优选低于或等于1.39nM，更优选低于或等于0.99nM。在一个优选的实施方案中，所述第二抗原结合位点对SK-BR-3细胞上ErbB-3的亲和力低于或等于2.0nM，更优选低于或等于1.5nM，更优选低于或等于1.39nM，优选低于或等于0.99nM。在一个实施方案中，所述亲和力在1.39至0.59nM的范围内。在一个优选的实施方案中，所述第二抗原结合位点对BT-474细胞上ErbB-3的亲和力低于或等于2.0nM，更优选低于或等于1.5nM，更优选低于或等于1.0nM，更优选低于0.5nM，更优选低于或等于0.31nM，更优选低于或等于0.23nM。在一个实施方案中，所述亲和力在0.31至0.15nM的范围内。上述亲和力优选如使用稳态细胞亲和力测量所测量的，其中使用经放射性标记的抗体在4℃下孵育细胞，然后测量细胞结合的放射性，如在WO2015/130173的实施例中所述的。

所述第一抗原结合位点对ErbB-2阳性细胞的亲和力(KD)优选低于或等于5.0nM，更优选低于或等于4.5nM，更优选低于或等于3.9nM。在一个优选的实施方案中，所述第一抗原结合位点对SK-BR-3细胞上ErbB-2的亲和力低于或等于5.0nM，优选低于或等于4.5nM，更优选低于或等于4.0nM，更优选低于或等于3.5nM，更优选低于或等于3.0nM，更优选低于或等于2.3nM。在一个实施方案中，所述亲和力在3.0至1.6nM的范围内。在一个优选的实施方案中，所述第一抗原结合位点对BT-474细胞上ErbB-2的亲和力低于或等于5.0nM，优选低于或等于4.5nM，更优选低于或等于3.9nM。在一个实施方案中，所述亲和力在4.5nm至3.3nM的范围内。上述亲和力优选如使用稳态细胞亲和力测量所测量的，其中使用经放射性标记的抗体在4℃下孵育细胞，然后测量细胞结合的放射性，如在WO 2015/130173的实施例中所述的。

优选地，在公开的方法中使用的双特异性抗体不显著影响心肌细胞的存活。心脏毒性是ErbB-2靶向治疗中的已知风险因素，并且当曲妥珠单抗与蒽环类(anthracyclines)联合使用时，并发症的频率提高，从而引起心脏应激。

本文中公开的双特异性抗体优选用于人中。因此，优选的抗体是人抗体或人源化抗体。人对多肽的耐受性由许多不同的方面控制。无论是T细胞介导的、B细胞介导的还是其他的免疫，其都是人对多肽的耐受性中所涵盖的变量之一。双特异性抗体的恒定区优选是人恒定区。该恒定区可包含相较于天然存在的人抗体的恒定区的一个或更多个、优选不超过10个、优选不超过5个氨基酸差异。优选地，恒定部分全部来源于天然存在的人抗体。本文中产生的多种抗体来源于人抗体可变结构域文库。因此，这些可变结构域是人的。独特的CDR区可来源于人，其可以是合成的或来源于其他生物体。当可变区具有与天然存在的人抗体的可变区氨基酸序列具有同一性的氨基酸序列时，认为该可变区是人可变区，但仅针对CDR区。抗体中ErbB-2结合VH、ErbB-3结合VH或轻链的可变区可包含相较于天然存在的人抗体的可变区的一个或更多个、优选不超过10个、优选不超过5个氨基酸差异，而没有计算CDR区的氨基酸序列中的可能的差异。在体细胞超变(somatic hypermutation)的情况下，这样的突变也在自然中发生。

至少在重链可变区方面，抗体可来源于多种动物物种。使例如鼠重链可变区人源化是常见的做法。有多种方法可将其实现，其中有：将CDR接枝到具有与鼠重链可变区的3D结构相匹配的3D结构的人重链可变区中；对鼠重链可变区进行去免疫，优选通过从鼠重链可变区中去除已知的或怀疑的T或B细胞表位来进行去免疫。去除通常通过将表位中的一个或更多个氨基酸替换为其他(通常是保守的)氨基酸，使得表位的序列是经修饰的，使得其不再是T或B细胞表位。

相比于原始的鼠重链可变区，这样的去免疫鼠重链可变区在人中的免疫原性更低。优选地，可变区或结构域是进一步人源化的，例如经饰面(veneer)的。通过使用饰面技术，免疫系统容易遇到的外部残基被选择性地替代为人残基，以提供包含弱免疫原性或基本上非免疫原性饰面表面的杂交分子。用于本发明的动物优选是哺乳动物，更优选灵长类，最优选人。

本文中公开的双特异性抗体优选包含人抗体的恒定区。根据其重链恒定结构域的差异，抗体可分为五个类别或同种型：IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。这些类别或同种型包含以相应的希腊字母命名的所述重链中的至少一种。恒定区优选包含IgG恒定区、更优选IgG1恒定区、优选突变的IgG1恒定区。IgG1恒定区的一些变异是自然发生的，例如同种异型G1m1、17和G1m3，和/或在不改变所得抗体的免疫学特性的情况下是允许的。通常在恒定区中允许约1至10个氨基酸之间的插入、缺失、替换或其组合。

本文中公开的一些优选双特异性抗体包含：

-选自以下的ErbB-2特异性重链可变区的至少CDR3序列、优选至少CDR1、CDR2和CDR3序列或至少重链可变区序列：MF2926、MF2930、MF1849；MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003和MF1898，或者与所述的重链可变区序列在至多15个氨基酸处不同、优选在至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸处不同、更优选在至多1、2、3、4或5个氨基酸处不同的重链可变区序列；和/或

-选自以下的ErbB-3特异性重链可变区的至少CDR3序列、优选至少CDR1、CDR2和CDR3序列或至少重链可变区序列：MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF 6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073和MF6074，或者与所述的重链可变区序列在至多15个氨基酸处不同、优选在至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸处不同、更优选在至多1、2、3、4或5个氨基酸处不同的重链可变区序列。

例如，改变CDR序列用于优化目的，优选为了提高抗体的结合效力或稳定性。优化例如通过诱变操作进行，然后优选地测试所得抗体的稳定性和/或结合亲和力，并且优选地选择改善的ErbB-2或ErbB-3特异性CDR序列。技术人员完全能够产生包含至少一个改变的CDR序列的抗体变体。例如，应用保守氨基酸替换。保守氨基酸替换的一些实例包括将一个疏水性残基(例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸)替换为另一疏水性残基，以及将一个极性残基替换为另一极性残基，例如将精氨酸替换为赖氨酸，将谷氨酸替换为天冬氨酸，或将谷氨酰胺替换为天冬酰胺。

优选的抗体包含结合ErbB-2的可变结构域，其中所述可变结构域的VH链包含以下的VH链的氨基酸序列：MF2926；MF2930；MF1849；MF2973；MF3004；MF3958(为人源化的MF2971)；MF2971；MF3025；MF2916；MF3991(为人源化的MF3004)；MF3031；MF2889；MF2913；MF1847；MF3001、MF3003或MF1898；或者包含以下的VH链同时相对于所述VH链序列具有至多15个、优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个、更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合的氨基酸序列：MF2926；MF2930；MF1849；MF2973；MF3004；MF3958(为人源化的MF2971)；MF2971；MF3025；MF2916；MF3991(为人源化的MF3004)；MF3031；MF2889；MF2913；MF1847；MF3001、MF3003或MF1898。结合ErbB-2的可变结构域的VH链优选包含以下的氨基酸序列：

-MF1849；或者

-MF2971或其人源化形式，其中所述人源化形式优选包含MF3958的氨基酸序列：或者

-MF3004或其人源化形式，其中所述人源化形式优选包含MF3991的氨基酸序列。在一个实施方案中，结合ErbB-2的可变结构域的VH链包含以下的氨基酸序列：VH链MF1849：或者MF2971或其人源化形式，其中所述人源化形式优选包含MF3958的氨基酸序列；或者MF3004或其人源化形式，其中所述人源化形式优选包含MF3991的氨基酸序列，其中所述的VH序列相对于相应序列具有至多15个、优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个、更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合。在一个优选的实施方案中，结合ErbB-2的可变结构域的VH链包含MF3958的氨基酸序列；或者包含相对于VH链序列具有至多15个、优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个、更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合的MF3958的氨基酸序列。

结合Erb-B3的可变结构域的VH链优选包含以下的VH链的氨基酸序列：MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF 6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073或MF6074；或者包含相对于VH链序列具有至多15个、优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个、更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合的以下的VH链的氨基酸序列：MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF 6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073或MF6074。结合Erb-B3的可变结构域的VH链优选包含MF3178、MF3176、MF3163、MF6058、MF6061或MF6065的氨基酸序列；或者包含相对于相应的VH链序列具有至多15个、优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个、更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合的MF3178、MF3176、MF3163、MF6058、MF6061或MF6065的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，结合ErbB-3的可变结构域的VH链包含MF3178的氨基酸序列；或者包含相对于VH链序列具有至多15个、优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个、更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合的MF3178的氨基酸序列。优选地，上述氨基酸插入、缺失和替换不存在于CDR3区中。上述氨基酸插入、缺失和替换还优选不存在于CDR1和CDR2区中。上述氨基酸插入、缺失和替换还优选不存在于FR4区中。

优选地，抗体包含MF1849、MF2971、MF3958、MF3004或MF3991的至少CDR1、CDR2和CDR3序列，最优选MF3958的至少CDR1、CDR2和CDR3序列。所述抗体优选包含MF3178、MF3176、MF3163、MF6058、MF6061或MF6065的至少CDR1、CDR2和CDR3序列，最优选MF3178的至少CDR1、CDR2和CDR3序列。

优选地，ErbB-2特异性重链可变区包含相对于VH链MF3958具有至多15个、优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个、更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合的VH链MF3958的氨基酸序列(优选地其中所述插入、缺失、替换不在CDR1、CDR2或CDR3中)。优选地，ErbB-3特异性重链可变区包含相对于VH链MF3178具有至多15个、优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个、更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合的VH链MF3178的氨基酸序列。所述一个或更多个氨基酸的插入、缺失、替换或其组合优选不在VH链的CDR1、CDR2和CDR3区中。它们还优选不存在于FR4区中。氨基酸替换优选是保守氨基酸替换。

优选地，ErbB-2特异性重链可变区包含相对于VH链MF3991具有至多15个、优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个、更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合的VH链MF3991的氨基酸序列(优选地其中所述插入、缺失、替换不在CDR1、CDR2或CDR3中)。优选地，ErbB-3特异性重链可变区包含相对于VH链MF3178具有至多15个、优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个、更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合的VH链MF3178的氨基酸序列。所述一个或更多个氨基酸的插入、缺失、替换或其组合优选不在VH链的CDR1、CDR2和CDR3区中。它们还优选不存在于FR4区中。氨基酸替换优选是保守氨基酸替换。

优选地，所述抗体的所述第一抗原结合位点包含MF3958的至少CDR1、CDR2和CDR3序列，或者与MF3958的CDR1、CDR2和CDR3序列在至多3个、优选地至多2个、优选地至多1个氨基酸处不同的CDR1、CDR2和CDR3序列，并且其中所述第二抗原结合位点包含MF3178的至少CDR1、CDR2和CDR3序列，或者与MF3178的CDR1、CDR2和CDR3序列在至多3个、优选地至多2个、优选地至多1个氨基酸处不同的CDR1、CDR2和CDR3序列。

优选地，双特异性抗体包含：i)第一抗原结合位点，其包含含有MF3958的CDR1、CDR2和CDR3序列的ErbB-2特异性重链可变区和轻链可变区，以及ii)第二抗原结合位点，其包含含有MF3178的CDR1、CDR2和CDR3序列的ErbB-3特异性重链可变区和轻链可变区。

优选地，ErbB-2特异性重链可变区具有MF3958序列，并且ErbB-3特异性重链可变区具有MF3178序列。该组合也称为PB4188抗体。优选地，PB4188抗体是无岩藻糖基化的。

优选地，双特异性抗体包含如序列表1D部分中所示的“用于erbB-2结合的重链”和如序列表1D部分中所示的“用于erbB-3结合的重链”。

优选地，双特异性抗体的抗原结合位点包含种系轻链O12，优选重排的种系人κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或其片段或功能性衍生物(根据IMGT数据库万维网imgt.org的命名)。使用术语重排的种系人κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01、IGKV1-39/IGKJ1、huVκ1-39轻链或简称huVκ1-39。轻链可具有1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合。所述的1、2、3、4或5个氨基酸替换优选为保守氨基酸替换、插入、缺失、替换或其组合优选不在VL链的CDR3区中，优选不在VL链的CDR1、CDR2或CDR3区或FR4区中。优选地，第一抗原结合位点和第二抗原结合位点包含相同的轻链可变区，或者更精确地共同的轻链。优选地，轻链可变区包含具有序列(RASQSISSYLN)的CDR1、具有序列(AASSLQS)的CDR2和具有序列(QQSYSTPPT)的CDR3。优选地，轻链可变区包含序列表1C部分中所示的共同的轻链序列。

多种方法可用于产生双特异性抗体，并且在WO 2015/130173中讨论。一种方法涉及在细胞中表达两条不同的重链和两条不同的轻链，并收集由该细胞产生的抗体。以这种方式产生的抗体通常将包含具有重链和轻链的不同组合的抗体的收集物(collection)，其中的一些是期望的双特异性抗体。随后可从收集物中纯化双特异性抗体。

可以以多种方式提高细胞产生的双特异性抗体与其他抗体的比值。优选地，通过在细胞中不表达两条不同的轻链而表达两条基本上相同的轻链来提高该比值。这个概念在本领域中也被称为“共同的轻链”方法。当基本上相同的轻链与两条不同的重链一起发挥作用时，允许形成具有不同抗原结合位点和伴随的不同结合特性的可变结构域，细胞产生的双特异性抗体与其他抗体的比值随着两条不同轻链的表达显著提高。通过刺激两条彼此不同的重链的配对超过两条相同的重链的配对可进一步提高细胞产生的双特异性抗体的比值。本领域描述了可实现这样的重链异二聚化的多种方式。一种方式是产生‘钮进孔(knobinto hole)’双特异性抗体。参见美国专利申请20030078385(Arahoon et al.-Genentech)。在PCT申请No.PCT/NL2013/050294(WO 2013/157954 A1)中描述了另一种并且优选的方法，其通过引用并入本文。公开了用于从单一细胞产生双特异性抗体的方法和手段，由此提供了比单特异性抗体的形成更倾向于双特异性抗体之形成的手段。

本公开内容中提及的序列在下面和图1中示出。

序列1A(erbB-2特异性)

MF2926：erbB-2结合抗体的重链可变区序列

核酸序列(带下划线的序列编码前导肽的末端)：

氨基酸序列：

CDR1：GYHMNWVKQSPEKSLE

CDR2：NQIFRA

CDR3：RGDWSFDV

MF2930：erbB-2结合抗体的重链可变区序列

核酸序列(带下划线的序列编码前导肽的末端)：

氨基酸序列：

CDR1：SYPIAWMKQVHGKSLE

CDR2：NENFKG

CDR3：SNPLYYFAMDY

MF1849：erbB-2结合抗体的重链可变区序列

核酸序列(带下划线的序列编码前导肽的末端)：

氨基酸序列：

CDR1：SYGMH

CDR2：VISYDGSNKYYADSVKG

CDR3：GDYGSYSSYAFDY

MF2973：erbB-2结合抗体的重链可变区序列

核酸序列(带下划线的序列编码前导肽的末端)：

氨基酸序列：

CDR1：GYYINWLRQRPGQGLE

CDR2：NEKFRG

CDR3：GPHYDYDGPWFVY

MF3004：erbB-2结合抗体的重链可变区序列

核酸序列(带下划线的序列编码前导肽的末端)：

氨基酸序列：

CDR1：GYYINWVKQRPGQGLE

CDR2：NEKFKG

CDR3：PHYGYDDWYFGV

MF2971：erbB-2结合抗体的重链可变区序列

核酸序列(带下划线的序列编码前导肽的末端)：

氨基酸序列：

CDR1：AYYINWVKQRPGQGLE

CDR2：NEIFKG

CDR3：PPVYYDSAWFAY

MF3025：erbB-2结合抗体的重链可变区序列

核酸序列(带下划线的序列编码前导肽的末端)：

氨基酸序列：

CDR1：GYYINWVKQRPGQGLE

CDR2：NEKFKG

CDR3：PHYGYDDWYFAV

MF2916：erbB-2结合抗体的重链可变区序列

核酸序列(带下划线的序列编码前导肽的末端)：

氨基酸序列：

CDR1：GYYINWVKQRPGQGLE

CDR2：NEKFKG

CDR3：PIYFDYAGGYFDV

MF3958：erbB-2结合抗体的重链可变区序列

核酸序列(带下划线的序列编码前导肽的末端)：

氨基酸序列：

CDR1：AYYIN

CDR2：RIYPGSGYTSYAQKFQG

CDR3：PPVYYDSAWFAY

MF3031：erbB-2结合抗体的重链可变区序列

核酸序列(带下划线的序列编码前导肽的末端)：

氨基酸序列：

CDR1：AYYINWVKQRPGQGLE

CDR2：NENFRG

CDR3：GVYDYDGAWFAY

MF3991：erbB-2结合抗体的重链可变区序列

核酸序列(带下划线的序列编码前导肽的末端)：

氨基酸序列：

CDR1：AYYIN

CDR2：RIYPGSGYTSYAQKFQG

CDR3：PHYGYDDWYFGV

序列1B(erbB-3特异性)

MF3178：erbB-3结合抗体的重链可变区序列

核酸序列(带下划线的序列编码前导肽的末端)：

氨基酸序列：

CDR1：GYYMH

CDR2：WINPNSGGTNYAQKFQG

CDR3：DHGSRHFWSYWGFDY

MF3176：erbB-3结合抗体的重链可变区序列

核酸序列(带下划线的序列编码前导肽的末端)：

氨基酸序列：

CDR1：SYAMS

CDR2：AISGSGGSTYYADSVKG

CDR3：DWWYPPYYWGFDY

MF3163：erbB-3结合抗体的重链可变区序列

核酸序列(带下划线的序列编码前导肽的末端)：

氨基酸序列：

CDR1：GYYMH

CDR2：WINPNSGGTNYAQKFQG

CDR3：DSYSRHFYSWWAFDY

MF3099：erbB-3结合抗体的重链可变区序列

核酸序列(带下划线的序列编码前导肽的末端)：

氨基酸序列：

CDR1：SYWMH

CDR2：ILDPSDSYTTYNQKFKG

CDR3：GGDYDEGGAMDY

MF3307：erbB-3结合抗体的重链可变区序列

核酸序列(带下划线的序列编码前导肽的末端)：

氨基酸序列：

CDR1：GYYMH

CDR2：WINPNSGGTNYAQKFQG

CDR3：GSRKRLSNYFNAFDY

序列1C

共同的轻链

IGKV1-39A的可变区

CDR1：RASQSISSYLN

CDR2：AASSLQS

CDR3：QQSYSTPPT

IGKV1-39/jk1

共同的轻链IGKV1-39/jk1(恒定区是未带下划线的)

IGKV1-39/jk5共同的轻链可变结构域

序列1D(erbB-2特异性)

用于erbB-2结合的重链

用于erbB-3结合的重链

序列1E

HER2特异性Ab序列

MF2889：erbB-2结合抗体的重链可变区序列

核酸序列(带下划线的序列编码前导肽的末端)：

氨基酸序列：

CDR1：NYLIE

CDR2：VIYPEGGGTIYNEKFKG

CDR3：GDYDYKYAMDY

MF2913：erbB-2结合抗体的重链可变区序列

核酸序列(带下划线的序列编码前导肽的末端)：

氨基酸序列：

CDR1：DYKMDWVKQSHGKSLE

CDR2：NQKFRG

CDR3：GLWDAMDS

MF1847：erbB-2结合抗体的重链可变区序列

核酸序列(带下划线的序列编码前导肽的末端)：

氨基酸序列：

CDR1：SYGMH

CDR2：VISYDGSNKYYADSVKG

CDR3：HWWHPLLSGFDY

MF3001：erbB-2结合抗体的重链可变区序列

核酸序列(带下划线的序列编码前导肽的末端)：

氨基酸序列：

CDR1：IYWMHWVKQRPGRGLE

CDR2：NQKFKD

CDR3：EGITGFTY

MF1898：erbB-2结合抗体的重链可变区序列

核酸序列(带下划线的序列编码前导肽的末端)：

氨基酸序列：

CDR1：SYGMH

CDR2：VISYDGSNKYYADSVKG

CDR3：DGFRRTTLSGFDY

MF3003：erbB-2结合抗体的重链可变区序列

核酸序列(带下划线的序列编码前导肽的末端)：

氨基酸序列：

CDR1：YSWMNWVKQRPGKGLE

CDR2：NGKFKG

CDR3：GQLGLEAWFAY

HER3特异性Ab序列

MF6058：erbB-3结合抗体的重链可变区序列

核酸序列(带下划线的序列编码前导肽的末端)：

氨基酸序列：

CDR1：GYYMH

CDR2：WINPQSGGTNYAKKFQG

CDR3：DHGSRHFWSYWGFDY

MF6061：erbB-3结合抗体的重链可变区序列

核酸序列(带下划线的序列编码前导肽的末端)：

氨基酸序列：

CDR1：GYYMH

CDR2：WINPQSGGTNYAQKFKG

CDR3：DHGSRHFWSYWGFDY

MF6065：erbB-3结合抗体的重链可变区序列

核酸序列(带下划线的序列编码前导肽的末端)：

氨基酸序列：

CDR1：SYYMH

CDR2：WINPQGGSTNYAQKFQG

CDR3：DHGSRHFWSYWGFDY

为了清楚和简明描述的目的，本文中将特征描述为相同或分开的实施方案的一部分，但是，应理解，本发明的范围可包含具有全部或一些所描述特征的组合的实施方案。

附图简述

图1：MF3178变体的氨基酸比对。

点表示在该位置处与MF3178中相同的氨基酸。MF3178的CDR1、CDR2和CDR3序列以粗体和下划线标出。

图2：双特异性抗体相对于单克隆抗体的提高的体内肿瘤靶向。Micro-PET成像示出，与HER3单克隆抗体相比，PB4188变体更有效地在肿瘤中积聚(图2A)。对肿瘤中存在的放射性进行γ计数器定量证实，肿瘤中的PB4188变体的水平是亲本抗HER3抗体的2.5倍高(图2B)。在48小时时4个mAb组中的肿瘤摄取的定量生物分布。结果表示为注射剂量/克组织的百分比(％ID/g)，误差棒表示±S(图2C)。

图3：在EGFR：HER2、HER2：HER3和HER2：HER4测定中的抗体拮抗剂模式剂量响应曲线。在EGFR：HER2的情况下以2.5K/孔，或者在HER2：HER3和HER2：HER4的情况下以5K/孔，将报道细胞在37℃下接种4小时。将抗体连续稀释，并在37℃下孵育3小时，然后分别在EGFR：HER2或HER2：HER3和HER2：HER4的情况下用10ng/ml EGF或30ng/ml HRG-β2刺激16小时。通过单独孵育配体的滴定持续24小时来获得激动剂的参考刺激曲线。每个数据点表示每个剂量四个重复的平均值和标准差。将数据在GraphPad Prism中制图，并使用log(抑制剂)对响应-变量响应(4个参数)拟合进行曲线拟合以计算IC50。

图4：不同组中的小鼠的体重变化。在向荷有OV-10-0050建立的肿瘤的雌性BALB/c裸鼠施用MCLA-128、PG2863和PG2869抗体之后，体重发生变化。数据点表示组平均体重。误差棒表示平均值的标准误差(standard error of the mean，SEM)。

图5：体重的相对变化(％)。基于给药第一天的动物体重计算BW变化。数据点表示BW的组平均变化百分比。误差棒表示平均值的标准误差(SEM)。

图6：肿瘤生长曲线。在向荷有OV-10-0050建立的肿瘤的雌性BALB/c裸鼠施用MCLA-128、PG2863和PG2869抗体之后的肿瘤体积示踪。数据点表示组平均值，误差棒表示平均值的标准误差(SEM)。

图7：肿瘤系MDA-MB-175和OV-10-0050在体外和体内的生长抑制。DOC4-NRG1和CLU-NRG1基因融合体分别在MDA-MB-175细胞系(乳腺)和OV-10-0050 PDX(卵巢)中表达。左图：体外MCLA-128处理抑制MDA-MB-175细胞增殖。右图：体内MCLA-128处理(每周25mg/kg，直至第28天)降低了肿瘤生长，并在6只/8只动物中消除了肿瘤。

实施例

实施例1：ErbB-2指导的靶向

进行了成像实验，将HER2×HER3双特异性抗体(PB4188)与HER3二价单克隆抗体进行了比较。将bAb PB4188的变体和抗HER3MF3178(亲本抗体)用64Cu进行标记并静脉内注射到异种移植有HER2基因扩增的JIMT-1肿瘤的小鼠中。Micro-PET成像示出，与HER3单克隆相比，PB4188变体更有效地在肿瘤中积聚(图2A)。对肿瘤中存在的放射性进行γ计数器定量证实，肿瘤中的PB4188变体的水平是亲本抗HER3抗体的2.5倍高(图2B)。总体而言，体外和体内数据示出，HER2靶向是增强PB4188在肿瘤细胞上的结合的原因。

使用抗HER2(MF3958)抗体进行了另外的研究。图2C总结了用64Cu标记并注射到异种移植有HER2基因扩增的JIMT-1肿瘤的小鼠中的相应抗体的结果(对于每种抗体处理，n＝4只小鼠)。

方法

生物分布研究。将bAb PB4188的变体、抗HER2MF3958和抗HER3 MF3178与双功能螯合剂缀合[Paterson2014Dalton Transactions]。使用基于流式细胞术的测定确定缀合产物与靶标的结合特征。然后用64Cu标记蛋白质，并通过尾静脉(图2A至2B，以及图2C的“i.v.”)或腹膜内(图2C的“i.p.”)向荷有JIMT-1乳腺异种移植物的小鼠施用放射性标记的抗体。注射之后48小时获取MicroPET/CT图像，然后切除肿瘤并在γ计数器中测量放射性。结果表示为所注射剂量/克组织的百分比。

实施例2：异二聚体形成的抑制

使用了基于酶片段互补技术的异二聚化测定。可将β-半乳糖苷酶人工分为两个非活性片段：酶供体和酶接受体，其仅在非常接近时组合成活性酶。编码酶供体或酶接受体的各个序列与各个异二聚化伴侣的胞外结构域和跨膜结构域相连接。然后将这两种基因共转染到U2OS细胞中以表达与β-半乳糖苷酶的一个结构域(ED或EA)相连接的RTK受体的胞外结构域。在对一个RTK受体进行激动性刺激之后，这两个RTK受体均二聚化，诱导形成有活性的完全重构的β-半乳糖苷酶。最后，通过添加在水解之后将导致发光的底物来测量β-半乳糖苷酶活性。

在EGFR：HER2、HER2：HER3和HER3：HER4异二聚化报道细胞系中测试抗体。用以下抗体运行RTK异二聚化测定：双特异性抗体MCLA-128(MF3178臂和MF3958臂)；抗HER3抗体MF3178/PG3178和PG3793/AMG-888/patritumab；以及抗HER2抗体MF3958/PG3958、PG2867/曲妥珠单抗、PG2869/帕妥珠单抗和帕罗嘉(Perjeta，帕妥珠单抗的临床批次)。EGFR：HER2和HER2：HER3、HER2：HER4测定中的EGF和HRG滴定显示出剂量依赖性激动剂响应(图3)。MCLA-128表现出对HER2：HER3二聚体形成的特异性地完全抑制，并且对EGFR：HER2或HER2：HER4异二聚化没有影响。相较之下，曲妥珠单抗(PG2867)在EGFR：HER2和HER2：HER3测定中表现为部分拮抗剂。

MCLA-128和PG3178以最高的效力完全抑制HRG诱导的HER2：HER3二聚化(表1)。

表1：RTK异二聚化测定中测试的抗体的EC50汇总结果。在Prism中通过非线性回归(4个参数)确定EC50。

在HER2：HER3测定中，曲妥珠单抗的效力是MCLA-128或PG3178的约4倍低。帕罗嘉(临床帕妥珠单抗)在所有三种测定中均表现为完全拮抗剂，并且给出与PG2867(帕妥珠单抗)相似的谱(profile)。在HER2：HER4测定中，抗HER2 PG3958和PG2867(帕妥珠单抗)二者均显示了二聚化的轻微降低，该降低看来是剂量依赖性的。在高浓度的PG1337、MCLA-128、PG3178和PG3958下，观察到在EGFR：HER2测定中的小的非特异性响应。

MCLA-128仅显示出对HER2：HER3异二聚体的特异性抑制。这表明，在结合HER2之后，MCLA-128不应在EGF刺激之后在空间上损害HER2与EGFR的相互作用，也不应在HRG刺激之后损害HER2与HER4的异二聚化。

后者与HRG诱导的基于细胞周期的T47D细胞增殖测定中的观察结果一致。使用这些细胞的测定未能示出MCLA-128或PG3178的抑制活性，这可能归因于与HER3相比HER4的更高表达。认为HRG在T47D细胞中优选通过HER2：HER4而不是HER2：HER3传导信号，说明MCLA-128的效力的缺乏，并表明MCLA-128对HRG诱导的HER2：HER3二聚体而不是对HRG诱导的HER2：HER4二聚体的特异性。

在本研究中，曲妥珠单抗分别阻断EGF诱导的和HRG诱导的EGFR：HER2和HER2：HER3的异二聚化。曲妥珠单抗和帕妥珠单抗分别表现为部分和完全拮抗剂，这与如下普遍接受的声称一致：曲妥珠单抗阻断HER2的配体非依赖性激活，而帕妥珠单抗抑制配体依赖性信号传导。在这些测定中观察到曲妥珠单抗抑制性响应的事实可能是由于这两种靶标的过表达。这可能允许与传统的免疫沉淀实验相比更灵敏的读出。

最后，尽管PG3793显示出与PG3178相比对MCF-7的更低结合亲和力，但其在HER2：HER3异二聚化测定中的较低效力是更不严重的(二聚化测定效力相差2.5倍相对于结合测定亲和力相差30倍)。先前已经在MCLA-128和PG3178的情况下观察到了结合亲和力和拮抗作用效力之间的差异。尽管PG3178以比MCLA-128稍微更好的亲和力结合MCF-7，但在基于细胞周期的增殖测定中，MCLA-128胜过PG3178。

实施例3

研究目标与法规顺应性

研究的目的是评价MCLA-128、PG2863和PG2869抗体在BALB/c裸鼠中的OV-10-0050的皮下人卵巢癌PDX模型的处理中的体内抗肿瘤效力。

实验设计

实验设计在表2中指示。在所有组中，在第2天(第一剂量之后24小时)在4只动物中对血液进行取样并且在第6天(第一剂量之后5天)在其余4只动物中对血液进行取样。在指定的时间点时，将50至100μl血液收集到无菌收集管(Microvette CB300Z凝固激活物/血清，Sarstedt B.V.目录号16.440.100)中，使样品在室温下凝固45分钟，以3000rpm离心10分钟，并将水层(约20μl血清)吸取到另一1.5mL无菌Eppendorf中，用于立即在-80℃下储存。将样品在干冰上输送。

表1：实验设计说明

a.N：动物数目/组；

b.剂量体积：基于体重10μl/g调整给药体积。

在第1、8、15、22、29天处理所有动物(每周处理持续5周)

对于所有组，途径为I.P.。

在最后剂量之后48小时(第31天)收获肿瘤样品。将肿瘤在中性缓冲福尔马林(至少1∶20的组织∶固定剂的比例)中固定24小时，然后转为FFPE封闭。

中性缓冲液福尔马林的制备：将一袋PBS粉末放入透明的5L容量瓶中，添加4.5L去离子水，并搅拌以使粉末分散以获得澄清溶液。然后添加500ml甲醛，搅拌直至获得均匀的溶液。

材料

动物：物种：小家鼠(Mus musculus)：品系：BALB/c裸鼠；年龄：6至8周；性别：雌性；体重：18至22g；动物数目：32只小鼠加备用动物供应商：上海中英SIPPR/BK实验动物有限公司(Shanghai Sino-British SIPPR/BK Laboratory Animal Co.，LTD)。

饮食：在整个研究期间，动物可自由获得经辐照灭菌的干燥颗粒食品；水：动物可自由获得无菌饮用水。

抗体包装和储存条件：

MCLA-128；冷冻小瓶，2.5mg/ml的10×1.5ml/小瓶，储存于4℃。

PG2863；冷冻小瓶，2.5mg/ml的10×1.5ml/小瓶，储存于4℃。

PG2869；冷冻小瓶，2.5mg/ml的10×1.5ml/小瓶，储存于4℃。

PDX模型的产生

OV-10-0050的人卵巢癌PDX模型最初是从患有卵巢3级(grade 3)腺癌的48岁女性患者建立的。将手术切除的临床样品植入到裸鼠(定义为第0代，P0)中，并将随后的系列植入定义为P1、P2等。将P6肿瘤组织用于本研究。

肿瘤植入

每只小鼠在右胁(right flank)处皮下植入有被剪刀剪切的OV-10-0050P6肿瘤切片(约30mm3)用于肿瘤发生。在肿瘤植入之后第30天，当平均肿瘤尺寸达到约152mm3时，开始处理。用分层随机化方法将32只荷瘤小鼠随机分为4组，并且每组由8只荷瘤小鼠组成。将随机化的日期记录为第1天，并且其是处理开始日。根据实验设计表(表2)中所示的预先确定的方案，向小鼠施用受试物(test article)。

观察

在研究中所有涉及动物处理、护理和治疗的操作均根据WuXi AppTec的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)批准的指南，遵循实验动物护理评估和认可协会(Association for Assessment andAccreditation of Laboratory Animal Care，AAALAC)的指南进行。在常规监测时，每天检查动物的肿瘤生长和处理对正常行为的任何影响，例如活动性、食物和水消耗(仅通过目测)、体重增长/减轻(每周两次测量体重)、眼/毛发无光泽(eye/hair matting)以及方案中指明的任何其他异常影响。基于每个子集内的动物数目对死亡和观察到的临床体征进行记录。

肿瘤测量

测试了是否可延缓肿瘤生长或是否可治愈小鼠。使用卡尺每周两次在二维上测量肿瘤尺寸，并使用下式以mm3表示体积：V＝0.5a×b2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。然后将肿瘤尺寸用于T-C、T/C和TGI值的计算。计算T-C，其中T为处理组肿瘤达到预先确定的尺寸(例如500mm3)所需的中位时间(以天计)，且C为对照组肿瘤达到同一尺寸的中位时间(以天计)。T/C值(以百分比计)是抗肿瘤效力的指标；T和C分别是在给定日时的处理组和对照组的平均体积。使用下式计算每个组的TGI：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100；Ti是在给定日时的处理组的平均肿瘤体积，T0是在处理第一天时的处理组的平均肿瘤体积，Vi是在与Ti相同的日期时的载剂对照组的平均肿瘤体积，并且V0是在处理第一天时的载剂组的平均肿瘤体积。

统计分析

提供了在每个时间点时的每组的肿瘤体积的总结统计，包括平均值和平均值的标准误差(SEM)(在表3中详述)。对在最终剂量(分组之后第29天)之后的最佳治疗时间点时获得的数据进行组间肿瘤体积差异的统计分析和药物相互作用的分析。

进行单因素ANOVA以在组间比较肿瘤体积，并且当获得显著的F统计量(P＜0.001，处理方差比误差方差的比值)时，用Games-Howell进行组间比较。使用SPSS 17.0分析所有数据。认为p＜0.05是统计学显著的。

结果

死亡率、发病率和体重增长或减轻

定期监测动物体重作为毒性的间接度量。没有观察到作为受试物施用结果的组体重减轻(图4)，并且也没有观察到死亡或发病。因此，没有表现出与向荷瘤BALB/c裸鼠施用MCLA-128、PG2863和PG2869抗体相关的明显毒性。

用MCLA-128、PG2863和PG2869抗体进行给药的荷有OV-10-0050异种移植物的雌性BALB/c裸鼠的体重变化在图4和图5中示出。用MCLA-128、PG2863和PG2869抗体进行给药的荷有OV-10-0050异种移植物的雌性BALB/c裸鼠中随时间的平均肿瘤体积在表3中示出。图6示出了肿瘤生长。

表3：随时间的肿瘤体积(mm³)^a

a.平均值±SEM；b.研究日

结果与讨论

在研究中，评价了作为单一试剂的MCLA-128、PG2863和PG2869抗体在处理OV-10-0050人卵巢癌异种移植物模型中的治疗效力。在肿瘤接种之后在不同时间点时不同组中的肿瘤尺寸的结果在表3、表4和图4中示出。

在分组之后第29天，载剂处理的对照小鼠的平均肿瘤尺寸达到1,161mm³。用受试物MCLA-128、PG2863和PG2869抗体以25mg/kg进行的处理(QW×5周)产生了显著的抗肿瘤活性：在相同的时间时，它们的平均肿瘤尺寸分别为23、108和1mm3(T/C值分别＝1.95％、9.28％和0.06％；TGI值分别＝112.78％、104.37％和114.96％；p值分别＝0.002、0.003和0.002)，肿瘤尺寸达到500mm³时，它们的肿瘤生长与载剂组相比均延迟了多于14天。处理引起肿瘤的部分消退或完全消退。当对于研究过程期间三次连续测量，肿瘤体积减小其第1天体积的50％或更多，并且对于这三次测量中的一次或更多次，肿瘤体积≥13.5mm³时，认为小鼠具有部分消退(partial regression，PR)。并且当对于研究过程期间的连续三次测量肿瘤体积＜13.5mm³时，小鼠具有完全消退(complete regression，CR)。无肿瘤存活被认为是在研究结束时未检测到可触及的肿瘤。

用MCLA-128、PG2863和PG-2869进行的处理导致PR、CR和TFS的不同比值。每组中表现出PR、CR和TFS的小鼠量在表5中示出。所有受试物被荷瘤动物良好地耐受。在所有处理组中均未观察到体重减轻。

总的来说，在本研究中，作为单一试剂的三种受试抗体全部产生针对OV-10-0050人卵巢癌异种移植物模型的显著抗肿瘤活性。其被荷瘤动物良好地耐受。结果表明所述抗体是安全且有效的抗癌剂。

表4：基于分组之后第29天的肿瘤体积测量计算的OV-10-0050模型中注射的MCLA-128、PG2863和PG2869抗体的肿瘤生长抑制计算。

a.平均值±SEM。

b.通过将处理组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积来计算肿瘤生长抑制(T/C)。对于被认为具有抗肿瘤活性的受试物，T/C必须为50％或更低。使用公式TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100计算TGI。

C.基于肿瘤尺寸，与载剂组相比较来计算p值。

表5：不同处理的PR、CR和TFS统计

实施例4

MCLA-128是靶向HER2和HER3受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)的双特异性抗体，其参与癌细胞的增殖和存活。已在调蛋白(HRG)诱导的HER3信号传导和增殖的情况下，对MCLA-128进行了广泛的研究。已经示出了与以下相比更强的体外效力：抗HER2抗体帕妥珠单抗(PG2869)+曲妥珠单抗(PG2867)的组合，其可分别阻断配体依赖性和配体非依赖性HER2：HER3信号传导[Agus 2002；Juntilla 2009]；抗HER3 MM-121(PG2863)，其阻断HRG诱导的HER3激活[Schoeberl 2010]。

MCLA-128还在表达包含HRG基因的基因融合体的细胞中显示出抗肿瘤活性。MDA-MB-175细胞系包含DOC4-NRG1基因融合体，其由于NRG1表达而导致增殖性自分泌环。迄今为止，尚未在癌症患者环境中发现这种基因融合体[Sanchez-Valdivieso 2002]。

根据乳腺癌细胞系的图，MDA-MB-175细胞对单一药剂MCLA-128敏感，表明在该细胞系中HER3/HRG信号传导轴的重要性(图7左图)。还已经在体内示出了该细胞系中的HER2的激活，其中单一剂量的帕妥珠单抗而不是曲妥珠单抗抑制原位MDA-MB-175肿瘤生长。尽管已经讨论了DOC4-NRG1基因融合体在乳腺癌患者中的相关性[Sánchez-Valdivieso2002]，但其他基因融合体最近也获得了关注。特别地，独立小组报道了侵袭性黏液腺癌(非小细胞肺癌的亚群)中的CD74-NRG1融合体[Fernandez-Cuesta 2014，Duruisseaux 2016]。还已检测到数种其他NRG1基因融合体，即肺癌中的VAMP2-NRG1、RBPMS-NRG1和WRN-NRG1，以及卵巢癌巾的RAB2IL1-NRG1[Jung 2015，Dhanasekaran，2014]。基因融合体的这种多样性可与NRG1基因在8号染色体上的定位有关，该染色体易于发生易位[

2003]。

发现OV-10-0050是HER依赖性的。用阿法替尼(EGFR和HER2的不可逆抑制剂，其还抑制HER3的转磷酸作用(transphosporylation))进行的处理导致肿瘤生长抑制。将MCLA-128的抗肿瘤效力与PBS进行比较(图7，右图)。

小鼠：NOD-SCID，Crl：NU(NCr)-Foxn1nu和BALB/c裸鼠。在4周期间，以25mg/kg进行抗体给药。每周两次通过卡尺测量肿瘤体积。

实施例5：患有实体瘤的患者中的MCLA-128(靶向HER2和HER3的全长IgG1双特异性抗体)的I/II期研究

研究持续时间：

在招募28位患者之后，已经完成了研究的剂量逐增部分(第1部分，第一位患者于2015年2月3日给药)的积累(accrual)。研究的第2部分(剂量增大期)中的第一位患者在欧洲于2016年1月15日给药。第2部分的总持续时间为约25至32个月；但是，实际持续时间受数个变量的影响，例如，总体对象招募率。

站点数目：

研究期间估计多达13个站点进行参与。可添加另外的站点以确保存在可接受的入选率或用于替换未入选/退出的站点。

患者数目：

第1部分中入选了二十八(28)位患者。对于第2部分，至少20位可评价的患者并且至多约40位患者可入选到具有侵袭性黏液腺癌或被证明的NRG1融合体的晚期/转移性非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的组中。

由于除疾病进展之外的其他原因而没有完成至少两个研究处理的周期的患者，不可评价疗效，并在各自组中被替代。

该实施例描述了第2部分。尽管该实施例描述了结合Erb-2、Erb-3之双特异性抗体MCLA-128的施用，但是该实施例不旨在限制该具体实施方案的应用并且应用于本文中公开的其他双特异性抗体。

研究目标：

第1部分

第2部分

研究设计：

这是I/II期、开放标签、多中心、多国家、剂量逐增的单组分配研究，以评估MCLA-128的安全性、耐受性、PK、PD、免疫原性和抗肿瘤活性。

研究分为两部分：

第1部分

研究的第1部分的积累于2015年11月24日实现，截至2017年1月24日，所有第1部分患者均已完成了该研究。研究了九种剂量水平：以1位患者为一组中的40mg、80mg、160mg；以3位患者为一组的240mg、360mg、480mg、600mg、750mg和900mg。MCLA-128最初在3周处理周期的第1天在约60分钟中给予。在第1部分期间，输注持续时间延长至2小时，可选择将其提高至4小时以降低与输注相关的反应(infusion-related reaction，IRR)。

在任一剂量水平下均未经历剂量限制性毒性(DLT)。为了获得足够的PK信息，在600mg和750mg组中的每一个中向三位另外的患者给药。

由于在900mg剂量水平下未达到MTD，MCLA-128-CL01的数据审查委员会(DataReview Committee，DRC)决定基于累积安全性、可用的PK数据和PK模拟将750mg剂量水平指定为研究的RP2D。

第2部分

第2部分包括在所选患者群体的扩展组中对MCLA-128所选剂量水平的安全性和耐受性进行进一步表征，以及CBR(其被定义为具有CR、PR或持久SD(SD持续时间为至少12周)的患者的比例)的评估。

在新招募的患者中评价具有4周周期的每周剂量方案，其由对于前2个周期的每周400mg的平剂量(flat dose)，以及对于初始施用的800mg负荷剂量(loading dose)组成。从第3个周期开始，以每周400mg的剂量给予MCLA-128持续3周，随后休息1周。施用强制性在先药物以降低IRR。但是，皮质类固醇仅在第1周期第1天的负荷剂量之前是强制性的，并且应根据研究者管理IRR的决定仅用于随后的输注。

在所治疗的前5位患者已经完成至少2个治疗周期之后的磨合期(run-in period)期间，将审查每周方案的安全性。DRC审查所有安全数据，其中着重于3至4级毒性的发生率、IRR的发生率和严重性、以及顺应性。如果DRC审查得出的结论是毒性是不可接受的，则主办者将继续用3周周期的剂量方案招募患者，直至每个组中入选足够数目的患者。

第2部分中不允许患者内的剂量逐增。

在研究的第2部分中待评估的目标患者群体是：

·具有记录的NRG1融合体的NSCLC-仅对亚洲的招募开放

每个组(C至F)中可入选至少20位且多至约40位患者，所述组包含用每周推荐剂量治疗的最少10位患者/组。先前关闭的组可重新开放。

治疗的持续时间

研究的第1部分和第2部分二者中的患者可继续治疗，直至疾病进展、死亡、不可接受的毒性或由于任何其他原因中止。

数据审查委员会(DRC)：

第1部分中的所有剂量逐增决策均由DRC做出，召集DRC以审查所有可用的安全性数据和PK数据。DRC参与者包括主要研究者(或其代表)、主办者的医学主管、研究医学监测者、研究药物警戒医师、研究项目经理、研究统计学家以及根据需要邀请的专家(例如临床药理学专家)。

在第2部分中，DRC审查在所有后续患者中在每周剂量的安全磨合期完成之后在增大每周剂量方案之前的数据。

研究评估：

研究由以下组成：长达4周(28天)筛选期的分子预筛选评估、随后的顺序治疗周期直至因任何原因退出治疗或终止治疗。对于在第2部分中以初始推荐的剂量治疗的患者，治疗周期持续时间为3周(21天)，并且对于在第2部分中以每周推荐的剂量治疗的患者，治疗周期持续时间为4周(28天)。所有患者均应参加治疗中断之后1周内的治疗结束访视和结束治疗或研究中止之后30天的最终研究访视。

在完成最终研究访视时尚未进展或撤消同意的患者，每3个月对其进行随访持续长达2年(大约)以检查其疾病进展和/或存活状态直至其下一个抗癌治疗的开始。

如果试验期间的安全性数据以及可用的PK、PD和抗肿瘤活性数据的进行性评价表明在第2部分中应评价替代给药频率，或应评价其他患者群体，则在开始这些评价之前，在方案修订中阐明这些修改。

分子预筛选和筛选：

分子预筛选在有资格对NRG1融合体进行分子筛选的当地实验室中进行。为了开始预筛选，患者必须满足以下标准之一：

·IMA的组织学诊断，并且被证明为不存在EGFR/ALK改变。注意：未进行NRG1融合体的预筛选测试的IMA患者可参加试验。

或者

·病理学检查不允许IMA诊断，但研究者基于症状、影像特征(例如局部固结(consolidation)、多个双侧结节或固结)、不吸烟者和被证明为不存在EGFR/ALK改变而怀疑IMA。

在提交新鲜或存档的肿瘤组织用于分析以确定NRG1融合体状态之前，被鉴定为潜在的研究参与者的NSCLC患者必须签署分子预筛选的知情同意书(Informed ConsentForm，ICF)。可在疾病的自然病史的任何时间时(例如，在诊断时、在一线治疗期间、在进展时等)直至第1周期第1天之前最多一年进行测试。评估NRG1融合体的存在需要新鲜的肿瘤样品(福尔马林固定石蜡包埋的(formalin-fixed paraffin-embedded)；FFPE)或不超过1年的存档的肿瘤样品。样品应提交至有资格的当地实验室用于通过分子谱分析(molecularprofiling)(PCR、下一代测序[DNA或RNA]或FISH)测试NRG1融合体状态。如果具有阳性局部NRG1融合体结果的患者愿意并能够参加主要研究，则他们有资格签署主要研究ICF。

主要知情同意书

在进行任何筛选程序或评估之前，必须由所有患者签署主要研究ICF。在第1周期第1天之前4周内进行筛选评估，除血清妊娠测试必须在第1周期第1天的7天内进行之外。为了考虑筛选，要求来自新鲜或存档的组织的基线强制性肿瘤样品，优选团块。主办者表明新鲜组织优先。存档物是可接受的，并且应在距离筛选2年内采集，NSCLC除外，其必须在1年内。应注意的是，对于NSCLC患者，即使提供了预筛选活检样品用于NRG1的预筛选局部测试，仍然需要用于筛选的基线活检。完成所有需要的筛选评估并确认所有资格标准之后，患者可在第1周期第1天开始给药。

安全性评估

并发的疾病在基线处捕获；在整个研究参与期间对AE和伴随治疗进行监测。安全性评估包括审查东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)体能状态(performance status)、身体检查(包括身高和体重)、生命体征和心电图(electrocardiogram，ECG)。左心室射血分数(Left Ventricular Ejection Fraction，LVEF)的心脏功能测试也在筛选、第4周期结束(或第5周期第1天)、研究访视结束、以及研究期间的任何时间(如果有临床指示的话)时进行。实验室评价包括临床化学、血液学、凝血测试、尿液分析和妊娠测试。注意，直到2017年8月1日才进行细胞因子谱分析(cytokinepanel analysis)。

在所有的MCLA-128施用日时，患者必须在输注结束时间之后在诊所停留至少60分钟(PK样品所需的时间更长)以进行观察，并在离开诊所之前重复生命体征。应根据临床指示进行进一步另外的安全性评估，并且，如果需要的话，应基于研究者的判断延长在诊所停留的持续时间。

免疫原性评估

抗MCLA-128抗体的血清效价在第1、2、3、4个周期中的每一个以及随后每4个周期(第8、12、16个周期等)的第1天在给药前进行测量，并且以在MCLA-128施用之前3天的窗口的情况下的治疗结束访视和最终研究访视时进行测量。

药动学评估

第1部分和第2部分初始推荐的剂量方案：在第1周期中，在第一天在给药前、输注结束(end of infusion，EOI)以及EOI之后1、2、4、8、24小时时、然后在第4天(或第3天)、第8天和第15天时收集血液样品用于PK分析。在第2至4周期中，仅收集给药前和EOI血液样品。

第2部分每周推荐的剂量方案：在第1周期中，在第1天在给药前、EOI、EOI之后2、4、24小时时、然后在第8天和第15天在给药前、以及在第22天在给药前和EOI时收集血液样品用于PK分析。在第2和第3周期中，在第15天收集给药前和EOI血液样品。在第4周期中，在第1天在给药前、以及在第15天在给药前和EOI时收集血液样品。此后每2个周期(第6、8、10个周期等)，在第15天收集给药前血液样品。

肿瘤评估

根据当地研究者根据RECIST版本1.1评价肿瘤评估。在筛选时和在每2个治疗周期结束时(对于接受3周周期方案的患者)以及每6周(对于接受4周周期方案的患者)获得影像。

生物标志物和药效学评估

根据存档的或已有的肿瘤组织的可用性、同意另外的肿瘤样品以及同意特定生物标志物测试，对存档的和/或新鲜的肿瘤样品材料和/或血液(液体活检)进行了一系列生物标志物和药效学测试。

在可获得足够的样品的情况下，评估以下候选生物标志物：

·HER2、HER3、HER2：HER3二聚化、磷酸化的HER2(pHER2)和HER3(pHER3)和调蛋白；

·循环血浆肿瘤DNA(Circulating plasma tumor DNA，ctDNA)和肿瘤样品DNA(取决于可用性)用于检查癌症基因(包括与HER2和HER3信号传导相关的那些)中的突变

·MAPK和AKT信号传导途径中的磷酸化分子；

·Fcγ受体多态性；

·HER2的循环肿瘤细胞；

·调蛋白基因融合体

不包含种系DNA评估(Fcγ受体多态性除外)。

在基线处，要求患者提供可来自新鲜或存档的组织的强制性肿瘤样品组织，优选团块。主办者表明新鲜组织优先。存档物是可接受的，并且应在距离筛选2年内采集，NSCLC除外，其必须在1年内。此外，任选地要求患者在第4周期结束和任选的在治疗结束访视时提供肿瘤样品/活检。

在这些时间点还采集血液样品用于液体活检测试的目的。

资格标准：

研究入选了患有NSCLC的患者。

用于第2部分的通用纳入标准

1. 18岁或更大的年龄；

2.根据RECIST v1.1的至少一个可测量病变；

3. ECOG 0或1的体能状态；

4.至少12周的预期寿命；

5.先前的抗癌治疗导致的毒性消退至≤1级(如通过NCI CTCAE v4.03所定义的)，脱发(alopecia)、被评估为非临床显著的淋巴细胞减少(lymphopenia)、2级感觉神经毒性除外；

6.最后一次接受放射治疗与第一个计划的MCLA-128给药日之间至少4周的间隔(直到用于疼痛缓解的1×8Gy除外)；

7.从大手术完全恢复(稳定且<2级毒性可接受)；

8.筛选时的实验室值：

a.绝对中性粒细胞计数≥1.5×10⁹/L，无集落刺激因子支持；

b.血小板≥100×10⁹/L；

c.血红蛋白≥9g/dL或≥2.2mmol/L(不依赖输血)；

d.总胆红素<正常上限(upper limit ofnormal，ULN)的1.5倍(除非由于吉尔伯特综合征(Gilbert’s syndrome))；

e.AST(SGOT)≤2.5×ULN；ALT(SGPT)≤2.5×ULN；≤5×ULN

(对于患有具有肝转移之晚期实体瘤的患者)；允许对具有经证实的骨转移的患者进行研究，其具有＞5×ULN的ALP的单独升高；

f.基于Cockroft-Gault公式的血清肌酐≤1.5×ULN或估计的肾小球滤过率(glomerular filtration rate，GFR)＞50mL/分钟；

g.凝血功能(INR和aPTT≤1.5ULN，除非对于治疗性抗凝剂)

h.尿蛋白≤2+(如通过油标尺(dipstick)测量的)或≤100mg/24小时尿；

9.能够在基线处提供来自新鲜(优选)或存档的组织的强制性肿瘤活检样品(FFPE)，优选团块。存档的组织必须在筛选之前2年内收集，NSCLC除外，其必须在1年内。

10.阴性妊娠试验结果可用，如在有生育潜力的女性(被定义为≤50岁或在参与研究之前闭经史≤12个月的女性)中，在筛选期间以及第1周期第1天的7天之内，通过尿或血液人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)测试所限定的；

11.有生育潜力的性活跃男性和女性患者必须同意在整个研究持续时间和最后施用MCLA-128之后6个月，使用有效的节育方法(例如，使用杀精子剂、经口或肠胃外避孕剂和/或子宫内装置的屏障方法)。注意，女性患者的不育必须在患者的病历中得到确认，并且被限定为以下的任一项：伴有双侧卵巢切除术的手术子宫切除术、双侧管结扎、自然绝经同时最后一次月经＞1年以前；辐射诱导的卵巢切除术同时最后一次月经＞1年以前；化学治疗诱导的绝经同时自最后一次月经以来间隔1年；

12.能够在任何研究特异性的筛选程序之前给出书面知情同意书，应理解，患者可在任何时间撤回同意书而不产生损害；

13.够理解强制性和任选的方案要求，愿意并且能够遵守研究方案操作，并且已经签署了主要的知情同意文件。对于任何任选的活检样品(组织和/或血液)和长期样品储存，需要另外的同意书；

14.患有转移性癌症的患者，其在已经接受了用已知传达临床益处的所有可获得的治疗剂进行的治疗之后，具有疾病进展。

15.不可切除或转移性NSCLC，其满足以下条件之一：

·经活检证实的侵袭性黏液腺癌(invasive mucinous adenocarcinoma，IMA)。注意：未进行NRG1融合体的预筛选测试的IMA患者可参加试验。

或者

·具有被证明的NRG1融合体的NSCLC，该NRG1融合体在有资格的当地实验室中通过分子谱分析使用例如PCR、下一代测序[DNA或RNA]或FISH的方法在EGFR/ALK基因中没有已知的驱动突变或融合的患者中被确定。

16.在局部晚期或转移性环境中，通过研究者对至少某一线标准治疗的评估的被证明的疾病进展。

统计分析：

第1部分和第2部分

在第2部分中，对每个组的抗肿瘤和临床益处变量进行了描述性总结。在适当的情况下，根据相对于基线的绝对和相对变化来表示变量。分类数据表示为百分比和频率列表。

在适当的情况下，可将来自在第1部分期间接受被鉴定为MTD或MRD的剂量的那些患者以及在第2部分中接受相同剂量的患者的数据进行组合、总结以及独立地总结。

严重和非严重AE的频率和性质以绝对和相对频率进行评估，并根据MedDRA医学词典进行编码。

第1部分

数据评价本质上是描述性的。在每个剂量水平下总结了患者人口统计、疾病特征以及药动学和药效学变量。还在每个剂量水平总结了DLT的频率和性质。

第2部分

在第2部分中，N＝20/组，临床上有意义的观察到的至少0.38的相关系数以95％置信度可与零区分开；较小的、非临床上有意义的观察到的相关性不能与零区分开。因此，第2部分中的20名对象/组被认为足以探索MCLA-128的抗肿瘤活性与疾病相关生物标志物之间的关系。

在看到临床活性的迹象的情况下，可招募至多共约40位另外的患者。对于40位患者，可以以约±5％至±8％的合理精确度评估例如10％至50％的真实临床响应率。

总结了第1部分中每个组和第2部分中每个肿瘤组的PK参数。除了中位数、范围、SD和％CV之外，还提供了算术和几何平均值。根据梯形法则(trapezoid rule)计算AUC。绘制每个组相对于时间的血清浓度的图。

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Weinstein et al.(1998).Oneogene 17：2107-2113.

Claims

1.双特异性抗体，其包含可结合ErbB-2胞外部分的第一抗原结合位点和可结合ErbB-3胞外部分的第二抗原结合位点，所述双特异性抗体用于治疗具有ErbB-2和ErbB-3阳性细胞的个体，所述细胞包含NRG1融合基因，所述NRG1融合基因包含与来自不同染色体位置的序列融合的NRG1基因的至少一部分。

2.权利要求1所述应用的抗体，其中所述NRG1融合基因至少包含与来自不同染色体位置的5’序列融合的所述NRG1基因的3’端。

3.权利要求1或2所述应用的抗体，其中所述细胞是癌细胞。

4.权利要求3所述的抗体，其中所述癌细胞与NRG1融合体相关。

5.权利要求3或4所述应用的抗体，其中所述癌细胞由NRG1融合体驱动。

6.前述权利要求中任一项所述应用的抗体，其中所述细胞是乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、肺癌细胞例如非小细胞肺癌，或其转移。

7.双特异性抗体，其包含可结合ErbB-2胞外部分的第一抗原结合位点和可结合ErbB-3胞外部分的第二抗原结合位点，所述双特异性抗体用于治疗患有ErbB-2和ErbB-3阳性肿瘤或处于患有所述肿瘤之风险中的个体，所述方法的特征在于，所述肿瘤的细胞表达NRG1融合基因，所述NRG1融合基因至少包含与来自不同染色体位置的5’序列融合的NRG1基因的3’端。

8.权利要求7所述应用的抗体，其中所述肿瘤是乳腺癌、卵巢癌、肺癌例如非小细胞肺癌，或其转移。

9.前述权利要求中任一项所述应用的抗体，其中所述NRG1融合基因表达包含NRG1 EGF样结构域的蛋白质。

10.前述权利要求中任一项所述应用的抗体，其中所述NRG融合体是NRG1与人8号染色体上的基因的融合体。

11.权利要求10所述应用的抗体，其中所述人8号染色体上的基因编码分泌蛋白或细胞膜相关蛋白。

12.前述权利要求中任一项所述应用的抗体，其中所述NRG1融合基因是所述NRG1基因的3’端与选自以下的基因之一的5’序列的融合体：CD74；DOC4；TNFRSF10B；CLU；VAMP2；SLC3A2；RBPMS；WRN；SDC4；KIF13B；SLECA2；PDE7A；ATP1B1；CDK1；BMPR1B；MCPH1和RAB2IL1。

13.前述权利要求中任一项所述应用的抗体，其中所述细胞或肿瘤是上皮来源的。

14.前述权利要求中任一项所述应用的抗体，其中所述个体已经历靶向EGFR抑制的治疗，优选用EGFR结合抗体进行的治疗，所述EGFR结合抗体优选为西妥昔单抗。

15.前述权利要求中任一项所述应用的抗体，其中所述肿瘤的细胞上的ErbB-1细胞表面受体密度；ErbB-2细胞表面受体密度；ErbB-3细胞表面受体密度；ErbB-4细胞表面受体密度或其组合是经测定的。

16.前述权利要求中任一项所述应用的抗体，其特征在于，所述细胞或肿瘤具有少于400,000个ErbB-1细胞表面受体/细胞，优选少于200,000个ErbB-1细胞表面受体/细胞。

17.前述权利要求中任一项所述应用的抗体，其还包括向所述个体施用ErbB-1抑制剂，优选西妥昔单抗。

18.前述权利要求中任一项所述应用的抗体，其中所述第一抗原结合位点可结合ErbB-2的结构域I，并且所述第二抗原结合位点可结合ErbB-3的结构域III，优选地其中所述第一抗原结合位点对ErbB-2的亲和力低于所述第二抗原结合位点对ErbB-3的亲和力。

19.根据权利要求18所述应用的抗体，其中所述抗体包含：

i)选自以下的ErbB 2特异性重链可变区的至少CDR1、CDR2和CDR3序列：MF2926、MF2930、MF1849；MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003和MF1898，或者其中所述抗体包含与MF2926、MF2930、MF1849；MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003或MF1898的CDR1、CDR2和CDR3序列在至多3个氨基酸、优选地至多2个氨基酸、优选地至多1个氨基酸处不同的CDR序列；和/或

ii)选自以下的ErbB 3特异性重链可变区的至少CDR1、CDR2和CDR3序列：MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF 6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073和MF6074，或者其中所述抗体包含与MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF 6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073或MF6074的CDR1、CDR2和CDR3序列在至多3个氨基酸、优选地至多2个氨基酸、优选地至多1个氨基酸处不同的CDR序列；优选地其中所述抗体包含：

i)选自以下的重链可变区序列的ErbB 2特异性重链可变区序列：MF2926、MF2930、MF1849；MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003和MF1898，或者其中所述抗体包含与以下的重链可变区序列在至多15个氨基酸处不同的重链可变区序列：MF2926、MF2930、MF1849；MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003或MF1898；和/或

ii)选自以下的重链可变区序列的ErbB3特异性重链可变区序列：MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF 6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073和MF6074，或者其中所述抗体包含与以下的重链可变区序列在至多15个氨基酸处不同的重链可变区序列：MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF 6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073或MF6074。

20.权利要求18所述应用的抗体，其中所述抗体至少包含ErbB 2特异性重链可变区MF3958的CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述抗体至少包含ErbB 3特异性重链可变区MF3178的CDR1、CDR2和CDR3序列。

21.前述权利要求中任一项所述应用的抗体，其中包含所述第一抗原结合位点的可变结构域和包含所述第二抗原结合位点的可变结构域包含轻链可变区，所述轻链可变区包含IgVK1-39基因区段，最优选重排的种系人κ轻链IgVKl-39*01/IGJKl*01，优选地其中包含所述第一抗原结合位点的可变结构域和包含所述第二抗原结合位点的可变结构域包含轻链可变区，所述轻链可变区包含具有序列(RASQSISSYLN)的CDR1、具有序列(AASSLQS)的CDR2和具有序列(QQSYSTPPT)的CDR3。