CN103781800A - 抗erbB3抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及识别erbB3的胞外域且抑制依赖于EGF样配体的erbB3的磷酸化的抗体及该抗体片段、编码该抗体及该抗体片段的DNA、该抗体及该抗体片段的制造方法、含有该抗体及该抗体片段的治疗药以及使用该抗体及该抗体片段的治疗用途。

Description

抗erbB3抗体

技术领域

本发明涉及识别erbB3的胞外域且抑制依赖于EGF样配体的erbB3的磷酸化的抗体及该抗体片段、编码该抗体及该抗体片段的DNA、该抗体及该抗体片段的制造方法、含有该抗体及该抗体片段的治疗药以及使用该抗体及该抗体片段的治疗用途。

背景技术

erbB3是属于表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor；EGFR)家族的一次跨膜型蛋白质(非专利文献1、2及3)。erbB3的立体结构与EGFR、Her2及erbB4类似，胞外域自N端侧起由结构域1、2、3及4这四个结构域结构构成。erbB3以外的EGFR家族分子在细胞内保有激酶结构域，通过受体的活化发挥激酶活性，但erbB3的细胞内结构域不具有激酶活性。

关于erbB3的活化，已知如下两个通路：1.作为erbB3的特异性配体的调蛋白与erbB3结合，通过与erbB3形成异二聚体的其他EGFR家族使erbB3磷酸化，然后使磷脂酰肌醇-3-磷酸激酶(phosphatidylinositol-3phosphate kinase；PI3激酶)、Akt活化的信号级联；2.通过配体的结合或过度表达使erbB3以外的EGFR家族(EGFR或Her2等)活化，结果使erbB3磷酸化，然后使PI3激酶、Akt活化的信号级联。

使用蛋白质阵列对EGFR家族分子的细胞内结构域与信号转导蛋白的亲和性进行网罗性分析的结果是，EGFR家族分子中，erbB3对PI3激酶的亲和性特别高，强烈地暗示其对PI3激酶的活化很重要(非专利文献4)。最近，报道了erbB3与癌症变得耐受EGFR抑制剂有关(非专利文献5、6)。

已经明确，药剂耐受性的肿瘤中，肝细胞生长因子受体(hepatocytegrowth factor receptor;HGFR或Met)引起erbB3的磷酸化(非专利文献5)或者Met使erbB3的表达增加(非专利文献6)，结果使药剂存在下的肿瘤细胞增殖得以维持。

关于erbB3的表达与癌症的预后的关联性，有若干报道。Chen等人(非专利文献7)基于阵列分析的结果选择出与肺癌的预后关联性高的5个基因(DUSP6、MMD、STAT1、ERBB3及LCK)，其中包含erbB3。

免疫组织学分析中也报道了erbB3的表达为肺癌的预后不良因子(非专利文献8)。Muller-Tidow等人(非专利文献9)通过阵列分析考察了肺癌中与转移相关的激酶，结果，erbB3被鉴定为继INSR、NTRK1之后第3个与远处转移风险的关联性高的基因。除了肺癌以外，在乳腺癌(非专利文献10)及卵巢癌(非专利文献11)中也报道了erbB3的表达为预后不良因子。

关于抗erbB3的抗体，报道了抑制调蛋白(heregulin)与erbB3的结合的抗体(非专利文献12)、不与erbB1及erbB2反应而特异性地与erbB3反应的抗体(专利文献1)、抑制依赖于调蛋白的erbB2-erbB3的相互作用的erbB3抗体(专利文献2)、与erbB3胞外域反应的抗体(专利文献3)以及与erbB3的结构域1结合而抑制依赖于调蛋白的erbB3的磷酸化的抗体(专利文献4)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利第5480968号说明书

专利文献2：美国专利第5968511号说明书

专利文献3：国际公开第2007/077028号

专利文献4：国际公开第2008/100624号

非专利文献

非专利文献1：Harari P.M.et.al.,Endocr Relat Cancer.2004,11,689-708.

非专利文献2：Nagy P.et.al.,Pathol Oncol Res.1999,5,255-71.

非专利文献3：Hynes N.E.et.al.,Nat Rev Cancer.2005,5,341-54.

非专利文献4：Jones R.B.et.al.,Nature.2006,439,168-74.

非专利文献5：Engelman J.A.et.al.,Science.2007,316,1039-43.

非专利文献6：Sergina N.V.et.al.,Nature.2007,445,437-41.

非专利文献7：Chen H.Y.et.al.,N Engl J Med.2007,356,11-20

非专利文献8：Hilbe W.et.al.,J Clin Pathol.2003,56,736-41

非专利文献9：Muller-Tidow C.Et.Al.,Cancer Res.2005,65,1778-82

非专利文献10：Bieche I.et.al.,Int J Cancer.2003,106,758-65.

非专利文献11：Tanner B.et.al.,J Clin Oncol.2006,24,4317-23

非专利文献12：Chen et al.,J Bio Chem1996,271,7620-7629,1996.

发明内容

发明所要解决的问题

正寻求erbB3表达细胞相关疾病的治疗药。根据本发明，能够提供抑制依赖于EGF样配体的erbB3的磷酸化的抗体及该抗体片段、编码该抗体及该抗体片段的DNA、该抗体及该抗体片段的制造方法、使用该抗体及该抗体片段的治疗方法以及含有该抗体及该抗体片段的治疗药。另外，根据本发明，能够提供使用抗erbB3抗体的联合疗法。

用于解决问题的方法

本发明涉及以下(1)～(15)项。

(1)一种抗体及该抗体片段，其与erbB3的胞外域特异性结合且抑制依赖于表皮生长因子(epidermal growth factor；EGF)样配体的erbB3的磷酸化。

(2)一种抗体，其与erbB3的胞外域特异性结合且抑制依赖于erbB3特异性配体的erbB3的磷酸化及不依赖于erbB3特异性配体的erbB3的磷酸化这两种磷酸化。

(3)如(1)或(2)所述的抗体及该抗体片段，其中，erbB3的磷酸化为依赖于选自表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(transforming growthfactor-α；TGF-α)、双调蛋白(amphiregulin)、β细胞素(betacellulin)、表皮调节素(epiregulin)、肝素结合表皮生长因子样生长因子(heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor；HB-EGF)及调蛋白(heregulin)中的至少两种配体的erbB3的磷酸化。

(4)如(1)～(3)中任一项所述的抗体及该抗体片段，其中，erbB3的胞外域为包含选自由序列号3所示的氨基酸序列的第20位至第179位氨基酸序列构成的结构域1、由第180位至第328位氨基酸序列构成的结构域2、由第329位至第487位氨基酸序列构成的结构域3及由第488位至第643位氨基酸序列构成的结构域4中的至少一个结构域的胞外域。

(5)如(1)～(4)中任一项所述的抗体及该抗体片段，其中，抗体为选自下述(a)～(c)中的抗体，

(a)与选自1153抗体克隆、12511抗体克隆、920104抗体克隆及1126抗体克隆中的任何一个抗体克隆发生竞争反应的抗体及该抗体片段，

(b)与如下表位反应的抗体及该抗体片段，所述表位包含与选自1153抗体克隆、12511抗体克隆、920104抗体克隆及1126抗体克隆中的任何一个抗体克隆反应的表位，

(c)与如下表位反应的抗体及该抗体片段，所述表位和与选自1153抗体克隆、12511抗体克隆、920104抗体克隆及1126抗体克隆中的任何一个抗体克隆反应的表位相同的表位。

(6)如(1)～(5)中任一项所述的抗体及该抗体片段，其中，抗体为选自包含含有序列号57所示的氨基酸序列的抗体重链可变区(以下也称为VH)及含有序列号58所示的氨基酸序列的抗体轻链可变区(以下也称为VL)的抗体、包含含有序列号69所示的氨基酸序列的VH及含有序列号70所示的氨基酸序列的VL的抗体、包含含有序列号81所示的氨基酸序列的VH及含有序列号82所示的氨基酸序列的VL的抗体、以及包含含有序列号93所示的氨基酸序列的VH及含有序列号94所示的氨基酸序列的VL的抗体中的任何一种抗体。

(7)一种编码(1)～(6)中任一项所述的抗体及该抗体片段的DNA。

(8)一种制造(1)～(6)中任一项所述的抗体及该抗体片段的方法，其特征在于，在培养基内培养将包含(7)所述的DNA的载体导入细胞而得到的转化体，使(1)～(6)中任一项所述的抗体及该抗体片段在培养液中生成并蓄积，并从培养液纯化抗体及该抗体片段。

(9)一种抗体组合物，其包含：

第一抗体或该抗体片段，其与erbB3的胞外域的选自由序列号3所示的氨基酸序列的第20位至第179位氨基酸序列构成的结构域1、由第180位至第328位氨基酸序列构成的结构域2、由第329位至第487位氨基酸序列构成的结构域3及由第488位至第643位氨基酸序列构成的结构域4中的至少一个结构域反应；以及

第二抗体或该抗体片段，其与不同于与第一抗体反应的结构域的结构域反应。

(10)如(9)所述的抗体组合物，其中，第一抗体或该抗体片段为与_erbB3的胞外域的结构域2或结构域4反应的抗体或该抗体片段。

(11)如(9)或(10)中任一项所述的抗体组合物，其中，第二抗体或该抗体片段为与erbB3的胞外域的结构域1或结构域3反应的抗体或该抗体片段。

(12)如(9)～(11)中任一项所述的抗体组合物，第一抗体或该抗体片段为选自下述(a)～(c)中的抗体或该抗体片段，

(a)与1126抗体克隆发生竞争反应的抗体及该抗体片段，

(b)与如下表位反应的抗体及该抗体片段，所述表位包含与1126抗体克隆反应的表位，

(c)与如下表位反应的抗体及该抗体片段，所述表位和与1126抗体克隆反应的表位相同。

(13)如(9)～(12)中任一项所述的抗体组合物，其中，第二抗体或该抗体片段为选自下述(a)～(c)中的抗体或该抗体片段，

(a)与1153抗体克隆发生竞争反应的抗体及该抗体片段，

(b)与如下表位反应的抗体及该抗体片段，所述表位包含与1153抗体克隆反应的表位，

(c)与如下表位反应的抗体及该抗体片段，所述表位和与1153抗体克隆反应的表位相同。

(14)一种erbB3表达细胞相关疾病的治疗方法，其使用(9)～(13)中任一项所述的抗体组合物。

(15)如(14)所述的治疗方法，其中，erbB3表达细胞相关疾病为癌症。

(16)一种erbB3表达细胞相关疾病的治疗药，其含有(9)～(13)中任一项所述的抗体组合物。

发明效果

根据本发明，能够提供识别erbB3的胞外域并抑制依赖于EGF样配体的erbB3的磷酸化的抗体及该抗体片段、编码该抗体及该抗体片段的DNA、该抗体及该抗体片段的制造方法、含有该抗体及该抗体片段的药物及使用该抗体及该抗体片段的治疗用途。

附图说明

图1(a)表示抗人ebB3抗体对人鳞状细胞癌细胞系A431中的调蛋白α(HRGα)。图1(b)表示抗人ebB3抗体对人鳞状细胞癌细胞系A431中的依赖于调蛋白β(HRGβ)的erbB3磷酸化及Akt磷酸化的抑制效果。左侧表示依赖于调蛋白α的磷酸化，右侧表示依赖于调蛋白β的磷酸化，从上方开始表示磷酸化erbB3、总erbB3蛋白、磷酸化Akt及总Akt蛋白。另外，左右最上部表示使用的抗体。

图2(a)和(b)表示抗人erbB3抗体对人鳞状细胞癌细胞系A431中的依赖于EGF样配体的erbB3磷酸化的抑制效果。图2(a)表示依赖于双调蛋白或β细胞素的erbB3的磷酸化，图2(b)表示依赖于表皮调节素或TGFα的erbB3的磷酸化，图2(c)表示依赖于EGF或HB-EGF的erbB3的磷酸化。各图的上部表示磷酸化erbB3，下部表示总erbB3蛋白。另外，各图的最上部表示使用的抗体。

图3(a)和(b)表示抗人erbB3抗体对人乳腺癌细胞系T47D中的依赖于EGF样配体的erbB3磷酸化的抑制效果。图3(a)表示依赖于表皮调节素的erbB3的磷酸化，图3(b)表示依赖于TGFα的erbB3的磷酸化，图3(c)表示依赖于HB-EGF的erbB3的磷酸化，图3(d)表示依赖于调蛋白β的erbB3的磷酸化。各图的上部表示磷酸化erbB3，下部表示总erbB3蛋白。另外，各图的最上部表示使用的抗体。

图4表示人乳腺癌细胞系T47D移植小鼠模型中的抗人erbB3抗体的抗肿瘤效果。横轴表示移植肿瘤后的天数，纵轴表示肿瘤体积。□表示作为对照的抗DNP抗体，◆表示1153抗体，○表示12511抗体，×表示920104抗体，△表示1126抗体，●表示U1-59抗体。

图5表示人乳腺癌细胞系T47D移植小鼠模型中的抗人erbB3抗体的联用效果。×表示作为对照的抗DNP抗体，□表示1153抗体，◆表示1126抗体，○表示1153+1126联用抗体(1153抗体及1126抗体的联用抗体)。横轴表示移植肿瘤后的天数，纵轴表示肿瘤体积。

图6表示人鳞状细胞癌细胞系A431移植小鼠模型中的抗人erbB3抗体的联用效果。□表示作为对照的抗DNP抗体，◆表示1153+12511联用抗体(1153抗体及12511抗体的联用抗体)，○表示12511+1126联用抗体(12511及1126抗体的联用抗体)，×表示1153+1126联用抗体(1153抗体及1126抗体的联用抗体)。横轴表示移植肿瘤后的天数，纵轴表示肿瘤体积。

具体实施方式

本发明的抗体涉及与erbB3的胞外域(extracellular domain，有时简记为ECD)特异性结合且抑制依赖于EGF样配体的erbB3的磷酸化的抗体及该抗体片段。

erbB3是作为酪氨酸激酶(tyrosine kinase)型受体家族的表皮生长因子受体(EGFR)家族(也称为HER家族、erbB家族)之一，也称为erbB3受体、表皮生长因子受体3(epidermal growth factor receptor3；EGFR3)、HER3受体、Her3受体或仅称为HER3、Her3。

erbB3为一次跨膜型膜蛋白，胞外域包含配体结合结构域、二聚体形成结构域，并且细胞内包含酪氨酸磷酸化结构域。已知作为erbB3的特异性配体的调蛋白与其胞外域的配体结合结构域结合时，引起erbB3的二聚体化，从而传播细胞增殖信号。

特别是已知erbB3与其他的作为EGF受体(EGFR)家族的erbB1(EGFR1或HER1)、erbB2(EGFR2、HER2或Neu)或erbB4(EGFR4或HER4)的异二聚体参与细胞增殖。

本发明中，erbB3是指包含由Kraus等人(Proc.Nat.Acad.Sci.86:9193-9197,1989.)揭示的氨基酸序列的多肽，具体而言是指包含序列号2所示的氨基酸序列的膜蛋白及包含序列号3所示的氨基酸序列的膜蛋白。

另外，erbB3的氨基酸序列信息可以从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等公知的数据库获得，可以列举例如：包含序列号2所示的氨基酸序列的人erbB3(NCBI登记号：NP_001973.2)、包含序列号5所示的氨基酸序列的小鼠erbB3(NCBI登记号：NP_034283.1)等。

本发明中，作为erbB3，可以列举例如：由在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个以上的氨基酸而成的氨基酸序列构成且具有erbB3的功能的多肽。

本发明的erbB3还包括：包含与序列号2所示的氨基酸序列具有70%以上、优选80%以上、更优选90%以上的同源性的氨基酸序列的多肽；最优选的由与序列号2所示的氨基酸序列具有95%、96%、97%、98%及99%以上的同源性的氨基酸序列构成且具有erbB3的功能的多肽。

具有在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个以上的氨基酸而成的氨基酸序列的多肽可以通过如下方法得到：使用定点诱变法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)；Current Protocols in Molecular Biology，约翰威立父子出版公司(1987-1997)；Nucleic Acids Research,10,6487(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)；Gene,34,315(1985)；Nucleic AcidsResearch,13,4431(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)]等，在例如编码序列号2所示的氨基酸序列的DNA中导入定点突变。缺失、取代或添加的氨基酸数没有特别限定，优选为一个至数十个、例如1～20个氨基酸，更优选为一个至数个、例如1～5个氨基酸。

作为编码erbB3的基因，可以列举例如序列号1(NCBI登记号：NM_001982.3)所示的碱基序列的第277位～第4305位所示的人erbB3的碱基序列、序列号4(NCBI登记号：NM_010153.1)所示的小鼠erbB3的碱基序列。

本发明的编码erbB3的基因还包括：含有由在序列号1所示的第277位～第4305位的碱基序列中缺失、取代或添加一个以上的碱基而成的碱基序列构成且编码具有erbB3的功能的多肽的DNA的基因；含有由与序列号1所示的第277位～第4305位的碱基序列具有至少60%以上的同源性的碱基序列、优选具有70%、80%以上的同源性的碱基序列、更优选具有90%、95%、96%、97%、98%、99%以上的同源性的碱基序列构成且编码具有erbB3的功能的多肽的DNA的基因；以及含有由在严格条件下与具有序列号1所示的第277位～第4305位的DNA杂交的DNA且编码具有erbB3的功能的多肽的DNA的基因等。

在严格条件下杂交的DNA是指使用序列号1所示的第277位～第4305位的DNA作为探针，通过集落杂交法、噬菌斑杂交法、DNA印迹杂交法或DNA微阵列法等得到的能够杂交的DNA。

具体而言，可以列举能够通过如下方法进行鉴定的DNA：使用固定有来源于杂交的集落或噬菌斑的DNA或者具有该序列的PCR产物或寡聚DNA的滤膜或载玻片，在0.7～1.0摩尔/升的氯化钠存在下，在65℃下进行杂交[Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)；Current Protocols in Molecular Biology，约翰威立父子出版公司(1987-1997)；DNA Cloning1:Core Techniques,APractical Approach，第二版，牛津大学，(1995)]，然后，使用0.1～2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成为：150毫摩尔/升的氯化钠、15毫摩尔/升的柠檬酸钠)，在65℃的条件下清洗滤膜或载玻片，由此进行鉴定。

作为能够杂交的DNA，可以列举与序列号1所示的第277位～第4305位的碱基序列具有至少60%以上同源性的DNA，优选具有70%或80%以上同源性的DNA，更优选具有90%、95%、96%、97%、98%或99%以上同源性的DNA。

编码真核生物的蛋白质的基因的碱基序列常常可以确认到基因的多态性。本发明的编码erbB3的基因还包括使本发明中使用的基因由于这种多态性而在碱基序列中产生小规模突变而得到的基因。

除了特别说明的情况以外，本发明中的同源性的数值可以是使用本领域技术人员公知的同源性检索程序计算出的数值，对于碱基序列而言，可以列举使用BLAST[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]中默认的参数算出的数值等，对于氨基酸序列而言，可以列举使用BLAST2[NucleicAcidsRes.,25,3389(1997);Genome Res.,7,649(1997);http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html]中默认的参数计算出的数值等。

作为默认的参数，G(起始空位罚分，Cost to open gap)在碱基序列的情况下为5，在氨基酸序列的情况下为11；-E(空位延伸罚分，Cost toextend gap)在碱基序列的情况下为2，在氨基酸序列的情况下为1；-q(核苷酸错配罚分，Penalty for nucleotide mismatch)为-3；-r(核苷酸匹配得分，reward for nucleotide match)为1；-e(期望值，expect value)为10；-W(字长大小，word size)在碱基序列的情况下为11个残基，在氨基酸序列的情况下为3个残基；-y(非空位延伸下降的阈值，Dropoff(X)forblast extensions in bits)在blastn中为20，在blastn以外的程序中为7；-X(空位比对的下降阈值，X dropoff value for gapped alignment in bits)为15；-Z(最终空位比对的下降值，final X dropoff value for gappedalignment in bits)在blastn中为50，在blastn以外的程序中为25(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。

包含序列号2所示的氨基酸序列的部分序列的多肽可以通过本领域技术人员公知的方法来制作，例如，可以通过使编码序列号2所示的氨基酸序列的DNA的一部分缺失并对导入有包含上述DNA的表达载体的转化体进行培养来制作。

另外，可以基于使用上述方法制作的多肽或DNA，通过与上述同样的方法，得到具有在序列号2所示的氨基酸序列的部分序列中缺失、取代或添加一个以上的氨基酸而成的氨基酸序列的多肽。

此外，包含序列号2所示的氨基酸序列的部分序列的多肽或者包含在序列号2所示的氨基酸序列的部分序列中缺失、取代或添加一个以上的氨基酸而成的氨基酸序列的多肽，也可以通过芴甲氧羰基(Fmoc)法和叔丁氧羰基(tBoc)法等化学合成法来制造。

作为本发明中的erbB3的胞外域，可以列举例如：使用公知的跨膜区预测程序SOSUI(http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html)、TMHMM2.0版(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)或ExPASy Proteomics Server(ExPASy蛋白质组服务器)(http://Ca.expasy.org/)等对序列号2所示的氨基酸序列进行预测而得到的区域等。具体而言，可以列举例如在ExPASy蛋白质组服务器中预测出的胞外域。

已知erbB3的胞外域(ECD)分为结构域1～4(D1～D4)，与其他EGFR家族同样，结构域1和结构域3对于配体结合很重要，结构域2对于二聚体形成很重要。具体而言，序列号3所示的氨基酸序列的第20位至第179位氨基酸序列为结构域1，第180位至第328位氨基酸序列为结构域2，第329位至第487位氨基酸序列为结构域3，第488位至第643位氨基酸序列为结构域4。

EGF样配体是指与EGFR家族结合的EGF配体家族。具体而言，可以列举例如：表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGF-α)、双调蛋白、β细胞素、表皮调节素、肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)、NTAK及调蛋白[神经调节蛋白(neuregulin)]。

本发明中，作为erbB3的功能，可以列举如下功能：诱导依赖于调蛋白的结合的erbB3的同二聚体化及异二聚体化，使erbB3磷酸化，结果促进细胞增殖、细胞分化。这种erbB3的功能可以通过将该目的蛋白导入宿主细胞中制作蛋白表达细胞并在适当的细胞培养条件下确认配体依赖性效果。

作为本发明的抗体，可以列举：与erbB3的胞外域特异性结合且抑制依赖于EGF样配体的erbB3的磷酸化的抗体、与erbB3的胞外域特异性结合且抑制依赖于erbB3特异性配体的erbB3的磷酸化及不依赖于erbB3特异性配体的erbB3的磷酸化这两种磷酸化的抗体。

本发明中，依赖于erbB3特异性配体的erbB3的磷酸化是指，作为erbB3的特异性配体而已知的调蛋白与erbB3的胞外域结合，结果使erbB3的细胞内结构域的酪氨酸残基发生磷酸化。

本发明中，不依赖于erbB3特异性配体的erbB3的磷酸化是指，包括作为erbB3特异性配体的调蛋白的EGF样配体与erbB3以外的erbB家族的胞外域结合，结果，与erbB3形成异二聚体而使erbB3的细胞内结构域的酪氨酸残基发生磷酸化。或者，不依赖于erbB3特异性配体的erbB3的磷酸化可以指以依赖于EGF样配体的方式引起的间接的erbB3的磷酸化。

本发明的抗体能够同时抑制上述依赖于/不依赖于erbB3特异性配体的erbB3的磷酸化。

具体而言，可以列举：抑制依赖于选自表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGF-α)、双调蛋白、β细胞素、表皮调节素、肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)、NTAK及调蛋白(neuregulin)中的至少2种、3种、4种、5种或6种配体的erbB3的磷酸化的抗体、优选抑制所有依赖于EGF样配体的erbB3的磷酸化的抗体。

作为本发明的抗体，可以列举：与包含选自由序列号3所示的氨基酸序列的第20位至第179位氨基酸序列构成的结构域1、由第180位至第328位氨基酸序列构成的结构域2、由第329位至第487位氨基酸序列构成的结构域3及由第488位至第643位氨基酸序列构成的结构域4中的至少一个结构域的胞外域结合的抗体，优选列举与包含结构域2或结构域4中的至少一个结构域的胞外域结合的抗体，更优选列举与包含结构域2的胞外域结合的抗体及与包含结构域4的胞外域结合的抗体。

另外，作为本发明的抗体，可以列举与erbB3的胞外域中的D1至D4各结构域中存在的表位结合的抗体。

此外，作为本发明的抗体，可以列举能够抑制erbB3的二聚体化的抗体、能够抑制erbB3与其他erbB家族(erbB1、erbB2及erbB4)的异二聚体化的抗体。具体而言，可以列举能够抑制选自erbB3-erbB1、erbB3-erbB2及erbB3-erbB4中的至少一组的相互作用的抗体。

此外，作为本发明的抗体，也包含抑制依赖于与erbB3相互作用的生长因子受体的erbB3的磷酸化的抗体。具体而言，可以列举抑制依赖于肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor；HGF)受体(c-Met)的erbB3的磷酸化的抗体。

本发明的抗体包括单克隆抗体、寡克隆抗体及多克隆抗体中的任何一种抗体。

本发明中，单克隆抗体为单一克隆的抗体产生细胞所分泌的抗体，该抗体仅识别一个表位(也称为抗原决定簇)，并且构成单克隆抗体的氨基酸序列(一级结构)一致。寡克隆抗体、多克隆抗体为含有两种以上的单克隆抗体的抗体混合物。

作为表位，可以列举例如：单克隆抗体所识别并结合的单一氨基酸序列、由氨基酸序列构成的立体结构、结合有糖链的氨基酸序列以及由结合有糖链的氨基酸序列构成的立体结构等。立体结构是天然存在的蛋白质所具有的三维立体结构，是指在细胞内或细胞膜上表达的蛋白质所构成的立体结构。

作为本发明的抗体识别的表位，可以列举例如：在细胞膜上表达的erbB3上存在的表位中由erbB3的氨基酸序列构成的一级结构、由erbB3的氨基酸序列构成的立体结构、在erbB3的氨基酸序列上结合有糖链的立体结构及由EGFR家族蛋白的晶体结构分析的结果规定的三维立体结构上的氨基酸残基等。

抗体分子也称为免疫球蛋白(以下记作Ig)，人抗体根据分子结构的差异分为IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM各同种型。氨基酸序列的同源性较高的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4也统称为IgG。

抗体分子由称为重链(Heavy chain，以下记作H链)和轻链(Lightchain，以下记作L链)的多肽构成。另外，H链从N端侧起由H链可变区(也记作VH)、H链恒定区(也记作CH)各区域构成，L链从N端侧起由L链可变区(也记作VL)、L链恒定区(也记作CL)各区域构成。

各亚类抗体的CH分别已知α、δ、ε、γ和μ链。而且，CH从N端侧起由CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域各结构域构成。

结构域是指构成抗体分子的各多肽的功能性结构单元。另外，将CH2结构域和CH3结构域合并称为Fc段或简称Fc。CL已知Cλ链和Cκ链。

本发明中的CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域、CH3结构域和Fc段可以根据EU索引[Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]用自N端起的氨基酸残基的编号来确定。

具体而言，CH1确定为EU索引第118～215位的氨基酸序列，铰链确定为EU索引第216～230位的氨基酸序列，CH2确定为EU索引第231～340位的氨基酸序列，CH3确定为EU索引第341～447位的氨基酸序列。

作为本发明的抗体，特别地，也包括人嵌合抗体(以下也简记为嵌合抗体)、人源化抗体[也称为互补决定区(Complementarity DeterminingRegion；CDR)移植抗体]和人抗体等基因重组抗体。

嵌合抗体是指包含人以外的动物(非人动物)的抗体的VH和VL与人抗体的CH和CL的抗体。作为非人动物，只要是例如小鼠、大鼠、仓鼠和兔等能够制作杂交瘤的动物，则均可以使用。

杂交瘤是指通过使对非人动物进行抗原免疫而获得的B细胞与来源于小鼠等的骨髓瘤细胞进行细胞融合而得到的、产生具有期望的抗原特异性的单克隆抗体的细胞。因此，构成杂交瘤所产生的抗体的可变区包含非人动物抗体的氨基酸序列。

人嵌合抗体可以通过如下方法进行制造：由生产单克隆抗体的非人动物细胞来源的杂交瘤获取编码VH和VL的cDNA，将它们分别插入到具有编码人抗体的CH和CL的DNA的动物细胞用表达载体中，构建人嵌合抗体表达载体，并将其导入动物细胞中，由此进行表达，从而制造人嵌合抗体。

人源化抗体是指将非人动物抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列移植到人抗体的VH和VL的对应的CDR中而得到的抗体。将VH和VL的CDR以外的区域称为框架区(以下记作FR)。

人源化抗体可以通过如下方法进行制造：构建编码VH的氨基酸序列的cDNA和编码VL的氨基酸序列的cDNA，所述VH的氨基酸序列包含非人动物抗体的VH的CDR的氨基酸序列和任意的人抗体的VH的FR的氨基酸序列，所述VL的氨基酸序列包含非人动物抗体的VL的CDR的氨基酸序列和任意的人抗体的VL的FR的氨基酸序列，将上述cDNA分别插入到具有编码人抗体的CH和CL的DNA的动物细胞用表达载体中，构建人源化抗体表达载体，并将其导入动物细胞中，由此进行表达，从而制造人源化抗体。

人抗体原本是指人体内天然存在的抗体，也包括由利用最近的基因工程、细胞工程、发育工程的技术进步制作的人抗体噬菌体文库及产生人抗体的转基因动物得到的抗体等。

人抗体可以通过用期望的抗原对保有人免疫球蛋白基因的小鼠(Tomizuka K.et.al.,Proc Natl Acad Sci USA.97,722-7,2000.)进行免疫而获得。另外，可以通过使用对抗体基因进行扩增而得到的噬菌体展示文库从来源于人类的B细胞中选择具有期望的结合活性的人抗体而在不进行免疫的情况下获得人抗体(Winter G.et.al.,Annu RevImmunol.12:433-55.1994)。此外，可以通过使用EB病毒使人B细胞永生化而制作生产具有期望的结合活性的人抗体的细胞，从而获得人抗体(Rosen A.et.al.,Nature267,52-54.1977)。

人体内存在的抗体例如可以如下获得：使由人外周血分离出的淋巴细胞感染EB病毒等，由此使其永生化，然后进行克隆，由此可以培养出产生该抗体的淋巴细胞，并可以从培养物中纯化出该抗体。

人抗体噬菌体文库是通过将由人B细胞制备的抗体基因插入到噬菌体基因中而使Fab、scFv等抗体片段在表面进行表达而得到的噬菌体的文库。可以以抗体片段对固定有抗原的底物的结合活性为指标，从该文库中回收表达具有期望的抗原结合活性的抗体片段的噬菌体。该抗体片段还可以进一步通过基因工程的方法转变为包含两条完整的H链和两条完整的L链的人抗体分子。

产生人抗体的转基因动物是指宿主动物的染色体内重组有人抗体基因的动物。具体而言，将人抗体基因导入小鼠ES细胞中，将该ES细胞移植到其他小鼠的早期胚胎中，然后使其发育，由此，能够制作产生人抗体的转基因动物。由产生人抗体的转基因动物制作人抗体的方法中，利用通常的在人以外的哺乳动物中实施的杂交瘤制作方法获取产生人抗体的杂交瘤并进行培养，由此，能够在培养物中产生并蓄积人抗体。

作为本发明的抗体的VH及VL的氨基酸序列，可以是人抗体的VH及VL的氨基酸序列、非人动物抗体的VH及VL的氨基酸序列、或者将非人动物抗体的CDR移植到人抗体的框架中而得到的人源化抗体的氨基酸序列中的任何一种氨基酸序列。具体而言，可以列举例如：杂交瘤所产生的非人动物抗体的VH及VL的氨基酸序列、人源化抗体的VH及VL的氨基酸序列以及人抗体的VH及VL的氨基酸序列等。

作为本发明的抗体的CL的氨基酸序列，可以是人抗体的氨基酸序列或非人动物抗体的氨基酸序列中的任何一种氨基酸序列，优选人抗体的氨基酸序列的Cκ或Cλ。

作为本发明的抗体的CH，只要属于免疫球蛋白则可以是任何一种CH，可以优选使用属于IgG类的亚类γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)或γ4(IgG4)中的任何一种。

效应活性是指抗体的Fc段介导产生的抗体依赖性的活性，已知抗体依赖性细胞毒活性(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicityactivity；ADCC活性)、补体依赖性细胞毒活性(Complement-Dependentcytotoxicity activity；CDC活性)或者巨噬细胞或树状细胞等吞噬细胞的抗体依赖性吞噬作用(Antibody-dependent phagocytosis activity；ADP活性)等。本发明中，ADCC活性及CDC活性可以使用公知的测定方法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]进行测定。

ADCC活性是指与靶细胞上的抗原结合的抗体通过抗体的Fc段介导与免疫细胞的Fc受体结合、由此使免疫细胞(自然杀伤细胞等)活化而杀伤靶细胞的活性。

Fc受体(以下有时也记作FcR)是与抗体的Fc段结合的受体，其通过抗体的结合来诱导各种效应活性。FcR与抗体的亚类对应，IgG、IgE、IgA、IgM分别与FcγR、FcεR、FcαR、FcμR特异性结合。

此外，FcγR存在FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)各亚型，并分别存在FcγRIA、FcγRIB、FcγRIC、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcγRIIIB各同种型。上述不同的FcγR存在于不同的细胞上(Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)。

对于人类而言，FcγRIIIB在中性粒细胞上特异性地表达，FcγRIIIA在单核细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)及一部分T细胞上表达。FcγRIIIA介导的抗体的结合诱导NK细胞依赖性的ADCC活性。

CDC活性是指与靶细胞上的抗原结合的抗体使血液中的包含补体相关蛋白族的一连串级联反应(补体活化途径)活化、从而杀伤靶细胞的活性。另外，利用由补体活化产生的蛋白质片段，可以诱导免疫细胞的游走和活化。CDC活性的级联反应通过下述反应开始：具有与抗体的Fc段结合的结构域的C1q与Fc段结合，并与两种丝氨酸蛋白酶C1r和C1s结合，由此形成C1复合物。

作为本发明的抗体，具体可以列举：含有包含序列号57所示的氨基酸序列的VH及包含序列号58所示的氨基酸序列的VL的抗体、含有包含序列号69所示的氨基酸序列的VH及包含序列号70所示的氨基酸序列的VL的抗体、含有包含序列号81所示的氨基酸序列的VH及包含序列号82所示的氨基酸序列的VL的抗体、以及含有包含序列号93所示的氨基酸序列的VH及包含序列号94所示的氨基酸序列的VL的抗体、含有分别包含序列号59～61所示的氨基酸序列的H链CDR1～3及分别包含序列号62～64所示的氨基酸序列的L链CDR1～3的抗体、含有分别包含序列号71～73所示的氨基酸序列的H链CDR1～3及分别包含序列号74～76所示的氨基酸序列的L链CDR1～3的抗体、含有分别包含序列号83～85所示的氨基酸序列的H链CDR1～3及分别包含序列号86～88所示的氨基酸序列的L链CDR1～3的抗体、以及含有分别包含序列号95～97所示的氨基酸序列的H链CDR1～3及分别包含序列号98～100所示的氨基酸序列的L链CDR1～3的抗体等。

作为本发明的抗体，可以列举：含有分别包含序列号59～61所示的氨基酸序列的H链CDR1～3及分别包含序列号62～64所示的氨基酸序列的L链CDR1～3的1153抗体克隆、含有分别包含序列号71～73表示的氨基酸序列的H链CDR1～3及分别包含序列号74～76所示的氨基酸序列的L链CDR1～3的920104抗体克隆、含有分别包含序列号83～85所示的氨基酸序列的H链CDR1～3及分别包含序列号86～88所示的氨基酸序列的L链CDR1～3的1126抗体克隆、以及含有分别包含序列号95～97所示的氨基酸序列的H链CDR1～3及分别包含序列号98～100所示的氨基酸序列的L链CDR1～3的12511抗体克隆。

作为本发明的基因重组抗体，可以列举：含有分别包含序列号59～61所示的氨基酸序列的H链CDR1～3及分别包含序列号62～64所示的氨基酸序列的L链CDR1～3的抗体、含有分别包含序列号71～73所示的氨基酸序列的H链CDR1～3及分别包含序列号74～76所示的氨基酸序列的L链CDR1～3的抗体、含有分别包含序列号83～85所示的氨基酸序列的H链CDR1～3及分别包含序列号86～88所示的氨基酸序列的L链CDR1～3的抗体、以及含有分别包含序列号95～97所示的氨基酸序列的H链CDR1～3及分别包含序列号98～100所示的氨基酸序列的L链CDR1～3的抗体等。

作为本发明的抗体，可以列举下述(a)～(c)所述的抗体。

(a)与选自1153抗体克隆、12511抗体克隆、920104抗体克隆及1126抗体克隆中的任何一个抗体克隆发生竞争反应的抗体及该抗体片段。

(b)与如下表位反应的抗体及该抗体片段，所述表位包含与选自1153抗体克隆、12511抗体克隆、920104抗体克隆及1126抗体克隆中的任何一个抗体克隆反应的表位。

(c)与如下表位反应的抗体及该抗体片段，所述表位和与选自1153抗体克隆、12511抗体克隆、920104抗体克隆及1126抗体克隆中的任何一个抗体克隆反应的表位相同。

另外，作为本发明的抗体，可以列举：和上述抗体竞争地与erbB3的胞外域结合的抗体、与包含与上述抗体反应且存在于erbB3的胞外域的表位的表位反应的抗体、以及与和与上述抗体反应且存在于erbB3的胞外域的表位相同的表位反应的抗体。

本发明中，“与如下表位反应的抗体及该抗体片段，所述表位包含与选自1153抗体克隆、12511抗体克隆、920104抗体克隆及1126抗体克隆中的任何一个抗体克隆反应的表位”是指，与包含与选自1153抗体克隆、12511抗体克隆、920104抗体克隆及1126抗体克隆中的第一抗体反应的第一表位的第二表位结合的第二抗体。

作为本发明的抗体，Fc与抗体片段结合而成的Fc融合蛋白、Fc与天然存在的配体或受体结合而成的Fc融合蛋白(也称为免疫粘附素)、多个Fc段融合而成的Fc融合蛋白等也包括在本发明中。另外，为了使抗体的效应活性增强或产生缺陷、为了使抗体稳定化及控制血中半衰期而进行了氨基酸残基修饰的包含氨基酸残基修饰的Fc段也可以用作本发明的抗体。

作为本发明的抗体，可以列举与选自包含序列号3所示的氨基酸序列的erbB3的胞外域的结构域1～结构域4中的至少2个结构域反应的抗体及该抗体片段。具体而言，可以列举与选自结构域1与结构域2、结构域1与结构域3、结构域1与结构域4、结构域2与结构域3、结构域2与结构域4及结构域3与结构域4中的任何一种组合反应的抗体。上述抗体中，优选与选自结构域1与结构域2、结构域1与结构域4、结构域2与结构域3及结构域3与结构域4中的任何一种组合反应的抗体，更优选与结构域1和结构域4反应的抗体。

与erbB3的胞外域的2个结构域反应的抗体可以通过现有的双特异性抗体、多价抗体(multivalent antibody、polyvalent antibody)制作技术(国际公开第1998/050431号、国际公开第2001/7734号、国际公开第2002/002773号、国际公开第2009/131239号)来制作。

本发明中，作为抗体片段，可以列举：Fab、Fab’、F(ab’)₂、scFv、双价抗体(Diabody)、dsFv、包含CDR的肽等。

Fab是将IgG抗体用蛋白分解酶木瓜蛋白酶进行处理而得到的片段中(在H链的第224位的氨基酸残基处切断)N端侧约一半的H链与整个L链通过二硫键(S-S键)结合而成的分子量约为5万的具有抗原结合活性的抗体片段。

F(ab’)₂是将IgG用蛋白分解酶胃蛋白酶进行处理而得到的片段中(在H链的第234位的氨基酸残基处切断)比Fab通过铰链区的S-S键结合而成的片段稍大的分子量约为10万的具有抗原结合活性的抗体片段。

Fab’是将上述F(ab’)₂的铰链区的S-S键切断而得到的分子量约为5万的具有抗原结合活性的抗体片段。

scFv是使用12个残基以上的适当的肽接头(P)将一条VH与一条VL连接而形成的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，是具有抗原结合活性的抗体片段。

双价抗体是抗原结合特异性相同或不同的scFv形成二聚体而得到的抗体片段，是对相同的抗原具有二价抗原结合活性或者对不同的两种抗原具有双特异性抗原结合活性的抗体片段。

dsFv是指使VH和VL中的各一个氨基酸残基取代成半胱氨酸残基的多肽通过该半胱氨酸残基之间的S-S键结合而得到的抗体片段。

包含CDR的肽包含VH或VL的CDR中的至少一个以上的区域而构成。包含多个CDR的肽可以使CDR之间直接结合或者通过适当的肽接头进行结合。

包含CDR的肽可以如下制造：构建编码本发明的修饰抗体的VH及VL的CDR的DNA，将该DNA插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，并将该表达载体导入原核生物或真核生物中，由此使其进行表达，从而制造包含CDR的肽。另外，包含CDR的肽也可以通过Fmoc法或tBoc法等化学合成法来制造。

作为本发明的抗体组合物，可以列举含有两种以上的上述中记载的抗体或该抗体片段的抗体组合物(或混合物)等。具体而言，可以列举含有与含有选自包含序列号1所示的氨基酸序列的erbB3的胞外域的结构域1～结构域4中的至少一个结构域的胞外域反应的第一抗体或该抗体片段和与不同于第一抗体的结构域反应的第二抗体或该抗体片段的抗体组合物等。其中，优选第一抗体为与erbB3的结构域4或结构域2反应的抗体且第二抗体为与erbB3的结构域1或结构域3反应的抗体的抗体组合物，更优选第一抗体为与erbB3的结构域4反应的抗体且第二抗体为与erbB3的结构域1反应的抗体的抗体组合物等。

上述第一抗体优选为选自下述(a)～(c)中的抗体或该抗体片段。

(a)与1126抗体克隆发生竞争反应的抗体及该抗体片段。

(b)与如下表位反应的抗体及该抗体片段，所述表位包含与1126抗体克隆反应的表位。

(c)与如下表位反应的抗体及该抗体片段，所述表位和与1126抗体克隆反应的表位相同。

另外，上述第二抗体优选为选自下述(a)～(c)中的抗体或该抗体片段。

(a)与1153抗体克隆发生竞争反应的抗体及该抗体片段。

(b)与如下表位反应的抗体及该抗体片段，所述表位包含与1153抗体克隆反应的表位。

(c)与如下表位反应的抗体及该抗体片段，所述表位和与1153抗体克隆反应的表位相同。

本发明的抗体组合物能够抑制erbB3特异性配体向erbB3上的结合，同时能够抑制erb3与erbB家族的二聚体化(同二聚体及异二聚体)。

本发明的抗体包括：利用化学方法或基因工程方法在本发明的特异性地识别erbB3的胞外域且抑制依赖于EGF样配体的erbB3的磷酸化的抗体或该抗体片段上结合放射性同位素、低分子药剂、高分子药剂、蛋白质或抗体药物等而得到的抗体的衍生物。

本发明中的抗体的衍生物可以通过利用化学方法[抗体工学入門(抗体工程入门)，地人书馆(1994)]在本发明的特异性地识别erbB3的胞外域且抑制依赖于EGF样配体的erbB3的磷酸化的抗体或该抗体片段的H链或L链的N端侧或C端侧、抗体或该抗体片段中的适当的取代基或侧链以及抗体或该抗体片段中的糖链等上结合放射性同位素、低分子药剂、高分子药剂、免疫刺激剂、蛋白质或抗体药物等来制造。

另外，本发明中的抗体的衍生物可以通过下述基因工程方法来制造：使编码本发明的特异性地识别erbB3的胞外域且抑制依赖于EGF样配体的erbB3的磷酸化的抗体或抗体片段的DNA与编码要结合的蛋白质或抗体药物的DNA连接后将其插入表达载体中，并将该表达载体导入适当的宿主细胞中进行表达。

作为放射性同位素，可以列举例如：¹¹¹In、¹³¹I、¹²⁵I、⁹⁰Y、⁶⁴Cu、⁹⁹Tc、⁷⁷Lu或²¹¹At等。放射性同位素可以通过氯胺T法等直接与抗体进行结合。另外，也可以在抗体上结合用于螯合放射性同位素的物质。作为螯合剂，可以列举例如1-异硫氰酸苄酯基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)等。

作为低分子药剂，可以列举例如：烷化剂、亚硝基脲剂、代谢拮抗剂、抗生素、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂、激素疗法制剂、激素拮抗剂、芳香化酶抑制剂、P糖蛋白抑制剂、铂络合物衍生物、M期抑制剂或激酶抑制剂等抗癌剂[临床肿瘤学，癌症与化学疗法出版社(1996)]、氢化可的松或泼尼松龙等甾体制剂，阿司匹林或吲哚美辛等非甾体制剂，硫代苹果酸金、青霉胺等免疫调节剂，环磷酰胺或硫唑嘌呤等免疫抑制剂、马来酸氯苯那敏或氯马斯汀等抗组胺剂等抗炎剂[炎症与抗炎疗法，医齿药出版株式会社(1982)]等。

作为抗癌剂，可以列举例如：阿米福汀(氨磷汀)、顺铂、达卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、二氯甲基二乙胺(氮芥)、链脲霉素、环磷酰胺、异环磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(阿霉素)、表柔比星、吉西他滨(健择)、柔红霉素、丙卡巴肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、长春碱、长春新碱、博来霉素、道诺霉素、培洛霉素、雌莫司汀、紫杉醇(泰素)、多西紫杉醇(多西他奇)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、克拉屈滨、喜树碱、10-羟基-7-乙基-喜树碱(SN38)、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、伊达比星、美司那、依立替康(CPT-11)、拓扑替康、米托蒽醌、托泊替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、羟基脲、普卡霉素、密妥坦、培门冬酶、喷司他丁、哌泊溴烷、链脲霉素、他莫昔芬、戈舍瑞林、亮丙瑞林、氟他胺、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、塞替派、乌拉莫司汀、长春瑞滨、苯丁酸氮芥、氢化可的松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、长春地辛、尼莫司汀、司莫司汀、卡培他滨、雷替曲塞、氮胞苷、UFT、奥沙利铂、吉非替尼(易瑞沙)、伊马替尼(STI571)、厄洛替尼、FMS样酪氨酸激酶3(FMS-liketyrosine kinase3；Flt3)抑制剂、血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂、易瑞沙、特罗凯等表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor；EGFR)抑制剂、根赤壳菌素、17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素、雷帕霉素、安吖啶、全反式维甲酸、沙利度胺、来那度胺、阿那曲唑、法曲唑、来曲唑、依西美坦、硫代苹果酸金、D-青霉胺、布西拉明、硫唑嘌呤、咪唑立宾、环孢素、雷帕霉素、氢化可的松、蓓萨罗丁(塔革雷汀)、他莫昔芬、地寒米松、孕激素类、雌激素类、阿那曲唑(瑞宁德)、利普安、阿司匹林、吲哚美辛、塞来昔布、硫唑嘌呤、青霉胺、硫代苹果酸金、马来酸氯苯那敏、氯苯那敏、氯马斯汀、维甲酸、蓓萨罗丁、砷、硼替佐米、别嘌呤醇、卡奇霉素、替伊莫单抗、塔革雷汀、奥唑米星、克拉霉素、瘤可维、异环磷酰胺、酮康唑、氨鲁米特、苏拉明、甲氨蝶呤、类美登醇或其衍生物等。

作为使低分子药剂与抗体结合的方法，可以列举例如：通过戊二醛使药剂与抗体的氨基之间结合的方法、或通过水溶性碳二亚胺使药剂的氨基与抗体的羧基结合的方法等。

作为高分子药剂，可以列举例如：聚乙二醇(以下记作PEG)、白蛋白、右旋糖酐、聚环氧乙烷、苯乙烯马来酸共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物或羟丙基甲基丙烯酰胺等。

通过使这些高分子化合物与抗体或抗体片段结合，可以期待如下效果：(1)提高对化学性、物理性或生物性的各种因素的稳定性；(2)显著延长血中半衰期；(3)抑制免疫原性消失或抑制抗体产生；等[バイオコンジュゲート医薬品，广川书店(1993)]。

作为使PEG与抗体结合的方法，可以列举例如与PEG化修饰试剂进行反应的方法等[バイオコンジュゲート医薬品，广川书店(1993)]。作为PEG化修饰试剂，可以列举例如：赖氨酸的ε-氨基的修饰剂(日本特开昭61-178926号公报)、天冬氨酸及谷氨酸的羧基的修饰剂(日本特开昭56-23587号公报)或精氨酸的胍基的修饰剂(日本特开平2-117920号公报)等。

作为免疫刺激剂，可以是作为免疫佐剂已知的天然物，作为具体例，例如，使免疫亢进的药剂可以列举：β(1→3)葡聚糖(香菇多糖、西佐糖)或α-半乳糖神经酰胺(KRN7000)等。

作为蛋白质，可以列举例如：激活NK细胞、巨噬细胞或中性粒细胞等免疫活性细胞的细胞因子或增殖因子或者毒素蛋白等。

作为细胞因子或增殖因子，可以列举例如：干扰素(以下记作IFN)-α、INF-β、INF-γ、白细胞介素(以下记作IL)-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)等。作为毒素蛋白，可以列举例如：蓖麻毒素、白喉毒素或ONTAK等，还包括为调节毒性而向蛋白质中引入突变而得到的蛋白毒素。

作为抗体药物，可以列举例如抗下述抗原的抗体：通过抗体的结合诱导凋亡的抗原、与肿瘤的病态形成相关的抗原或调节免疫功能的抗原、与病变部位的血管新生相关的抗原。

作为通过抗体的结合诱导凋亡的抗原，可以列举例如：分化抗原(以下记作CD)19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80(B7.1)、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86(B7.2)、人类白细胞抗原(HLA)II类或表皮生长因子受体(Epidermal GrowthFactor Receptor；EGFR)等。

作为与肿瘤的病态形成相关的抗原或调节免疫功能的抗体的抗原，可以列举例如：CD4、CD40、CD40配体、B7家族分子(CD80、CD86、CD274、B7-DC、B7-H2、B7-H3或B7-H4)、B7家族分子的配体(CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1或BTLA)、OX-40、OX-40配体、CD137、肿瘤坏死因子(TNF)受体家族分子(DR4、DR5、TNFR1或TNFR2)、TNF相关的凋亡诱导配体受体(TNF-related apoptosis-inducing ligandreceptor；TRAIL)家族分子、TRAIL家族分子的受体家族(TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3或TRAIL-R4)、核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand；RANK)、RANK配体、CD25、叶酸受体4、细胞因子[IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、转化生长因子(TGF)β或TNFα等]、上述细胞因子的受体、趋化因子(SLC、ELC、I-309、TARC、MDC或CTACK等)或上述趋化因子的受体。

作为抑制病变部位的血管新生的抗体的抗原，可以列举例如：血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor；VEGF)、血管生成素(angiopoietin)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor；FGF)、EGF、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor；HGF)、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor；PDGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor；IGF)、促红细胞生成素(erythropoietin；EPO)、TGFβ、IL-8、Ephilin、SDF-1或它们的受体等。

与蛋白质或抗体药物的融合抗体可以如下制造：使编码蛋白质的cDNA与编码单克隆抗体或抗体片段的cDNA连接，构建编码融合抗体的DNA，将该DNA插入原核生物或真核生物用表达载体中，并将该表达载体导入原核生物或真核生物中，由此进行表达而制造融合抗体。

将上述抗体的衍生物作为检测方法、定量方法、检测用试剂、定量用试剂或诊断剂使用的情况下，作为与本发明的特异性识别erbB3的胞外域的天然型立体结构且与该胞外域结合的单克隆抗体或该抗体片段结合的药剂，可以列举例如通常的免疫学检测或测定方法中使用的标记物。

作为标记物，可以列举例如：碱性磷酸酶、过氧化物酶或荧光素酶等酶；吖啶酯或洛酚碱等发光物质；或者异硫氰酸荧光素(FITC)或三甲基罗丹明(RITC)等荧光物质等。

本发明中，作为肿瘤、恶性肿瘤及癌，可以列举选自由大肠癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、脑肿瘤、黑色素瘤、肾细胞癌、白血病、淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、胃癌、胰腺癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、头颈部鳞状细胞癌、皮肤癌、尿道癌、前列腺癌、绒癌、咽癌、喉癌、胸膜瘤、男性细胞瘤、子宫内膜增生、子宫内膜异位症、胚胎瘤、纤维肉瘤、卡波西氏肉瘤、血管瘤、海绵状血管瘤、成血管细胞瘤、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、神经纤维瘤、少突胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、横纹肌肉瘤、胶质母细胞瘤、骨原性肉瘤、平滑肌肉瘤、甲状腺肉瘤及肾母细胞瘤组成的组中的任何一种。

以下，对本发明的抗体的制作方法、使用抗体的erb3的测定方法、诊断方法及治疗方法进行具体说明。

1.抗体的制作方法

本发明中，单克隆抗体的制造时，包括下述操作步骤。

即，(1)作为免疫原使用的生物高分子的纯化和/或在细胞表面过量表达抗原蛋白的细胞的制作；(2)通过对动物注射抗原而进行免疫后，采集血液检测其抗体效价而决定脾脏等的摘除时期，然后制备抗体产生细胞的步骤；(3)骨髓瘤细胞(以下称为骨髓瘤)的制备；(4)抗体产生细胞与骨髓瘤的细胞融合；(5)产生目标抗体的杂交瘤群的筛选；(6)向单一细胞克隆的分割(克隆)；(7)根据情况，用于大量制造单克隆抗体的杂交瘤的培养或移植杂交瘤后的动物的饲养；(8)以这种方式制造的单克隆抗体的生理活性及其识别特异性的研究或作为标记试剂的特性的检测；等。

以下，沿上述步骤详述本发明的抗erbB3抗体的制作方法，但该抗体的制作法方不限于此，例如也可以使用脾细胞以外的抗体产生细胞及骨髓瘤。另外，也可以使用来源于产生人抗体的转基因动物血清的抗体。

(1)抗原的纯化

作为抗原的erbB3或表达erbB3的细胞可以通过将包含编码全长或部分长度erbB3的cDNA的表达载体导入大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或动物细胞等中而得到。另外，可以从大量表达erbB3的各种人类肿瘤培养细胞、人类组织等中纯化得到erbB3。另外，也可以直接使用该肿瘤培养细胞或该组织等作为抗原。此外，也可以通过Fmoc法或tBoc法等化学合成方法制备具有erbB3的部分序列的合成肽来作为抗原使用。

本发明中使用的erbB3可以通过使用Molecular Cloning,ALaboratory Manual，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)或CurrentProtocols in Molecular Biology，约翰威立父子出版公司(1987-1997)等中记载的方法等，例如利用以下的方法，使编码该erbB3的DNA在宿主细胞中进行表达来制造。

将包含编码erbB3的全长cDNA插入适当的表达载体的启动子的下游，由此制作重组载体。也可以代替上述全长cDNA使用基于全长cDNA制备的编码部分多肽的适当长度的DNA片段。接着，将所得到的该重组载体导入适合于该表达载体的宿主细胞中，由此能够得到生产erbB3的转化体。

作为表达载体，只要是能够在使用的宿主细胞中进行自主复制或者能够整合到染色体中并且在能够转录编码erbB3的DNA的位置含有适当的启动子的表达载体，则均可以使用。

作为宿主细胞，只要是大肠杆菌等属于埃希氏菌属的微生物、酵母、昆虫细胞或动物细胞等能够表达目的基因的宿主细胞，则均可以使用。

在使用大肠杆菌等原核生物作为宿主细胞的情况下，重组载体优选为能够在原核生物中自主复制并且包含启动子、核糖体结合序列、编码erbB3的DNA及转录终止序列的载体。另外，该重组载体不一定必须包含转录终止序列，但优选在紧接结构基因的下游配置转录终止序列。该重组载体可以进一步含有调控启动子的基因。

作为该重组载体，优选使用将作为核糖体结合序列的夏因-达尔加诺序列与起始密码子的间隔调节至适当距离(例如6～18个碱基)而得到的质粒。

另外，作为该编码erbB3的DNA的碱基序列，可以对碱基进行取代以形成最适于在宿主内表达的密码子，由此，能够提高目标erbB3的生产率。

作为表达载体，只要是能够在使用的宿主细胞中发挥功能的表达载体，则均可以使用，可以列举例如：pBTrp2、pBTac1、pBTac2(以上为罗氏诊断公司制造)、pKK233-2(法玛西亚公司制造)、pSE280(Invitrogen公司制造)、pGEMEX-1(Promega公司制造)、pQE-8(凯杰公司制造)、pKYP10(日本特开昭58-110600号公报)、pKYP200[Agricultural Biological Chemistry,48,669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBlue scriptII SK(-)(Stratagene公司制造)、pTrs30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]、pTrs32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]、pGHA2[由大肠杆菌IGHA2(FERM BP-400)制备，日本特开昭60-221091号公报]、pGKA2[由大肠杆菌IGKA2(FERM BP-6798)制备，日本特开昭60-221091号公报]、pTerm2(美国专利第4686191号说明书、美国专利第4939094号说明书、美国5160735号说明书)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.,172,2392(1990)]、pGEX(法玛西亚公司制造)、pET系统(Novagen公司制造)和pME18SFL3等。

作为启动子，只要是能够在使用的宿主细胞中发挥功能的启动子，则均可以使用。可以列举例如：trp启动子(Ptrp)、lac启动子、PL启动子、PR启动子或T7启动子等来源于大肠杆菌或噬菌体等的启动子。另外，也可以使用两个Ptrp串联而成的串联启动子、tac启动子、lac T7启动子或let I启动子等人工设计修饰后的启动子等。

作为宿主细胞，可以列举例如：大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49和大肠杆菌DH5α等。

作为向宿主细胞中导入重组载体的方法，只要是向使用的宿主细胞中导入DNA的方法，则均可以使用，可以列举例如：使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)；Gene,17,107(1982)；Molecular&General Genetics,168,111(1979)]。

在使用动物细胞作为宿主的情况下，作为表达载体，只要是能够在动物细胞中发挥功能的表达载体，则均可以使用。可以列举例如：pcDNAI、pcDM8(フナコシ公司制造)、pAGE107[日本特开平3-22979号公报；Cytotechnology,3,133,(1990)]、pAS3-3(日本特开平2-227075号公报)、pCDM8[Nature,329,840,(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司制造)、pcDNA3.1(Invitrogen公司制造)、pREP4(Invitrogen公司制造)、pAGE103[J.Biochemistry,101,1307(1987)]、pAGE210、pME18SFL3或pKANTEX93[国际公开第97/10354号]等。

作为启动子，只要是能够在动物细胞中发挥功能的启动子，则均可以使用。可以列举例如：巨细胞病毒(CMV)的即刻早期(IE)基因的启动子、SV40的早期启动子、逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、SRα启动子或莫洛尼小鼠白血病病毒的启动子或增强子等。另外，也可以将人CMV的IE基因的增强子与启动子一同使用。

作为宿主细胞，可以列举例如：作为人类细胞的那马瓦细胞、作为猿细胞的COS细胞、作为中国仓鼠细胞的CHO细胞或HBT5637(日本特开昭63-000299号公报)等。

作为向宿主细胞中导入重组载体的方法，只要是向动物细胞中导入DNA的方法，则均可以使用。可以列举例如：电穿孔法[Cytotechnology,3,133(1990)]、磷酸钙法(日本特开平2-227075号公报)或脂质体转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等。

将以上述方式得到的包含重组有编码erbB3的DNA的重组载体的来源于微生物或动物细胞等的转化体在培养基中进行培养，在培养物中生成并蓄积该erbB3，并从该培养物中进行收集，由此能够制造erbB3。将该转化体在培养基中进行培养的方法可以根据宿主的培养中使用的通常的方法来进行。

在来源于真核生物的细胞中进行表达时，能够得到附加有糖或糖链的erbB3。对用使用诱导性启动子的重组载体转化后的微生物进行培养时，可以根据需要向培养基中添加诱导物。例如，对用使用lac启动子的重组载体转化后的微生物进行培养时，可以向培养基中添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷等，对用使用trp启动子的重组载体转化后的微生物进行培养时，可以向培养基中添加吲哚丙烯酸等。

作为用于培养以动物细胞为宿主而得到的转化体的培养基，可以使用例如普遍使用的RPMI1640培养基[The Journal of the AmericanMedical Association,199,519(1967)]、伊戈尔(Eagle)的MEM培养基[Science,122,501(1952)]、杜尔贝科(Dulbecco)改良MEM培养基[Virology,8,396(1959)]、199培养基[Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,73,1(1950)]、伊思考夫(Iscove)改良的杜尔贝科培养基(IMDM)或向这些培养基中添加胎牛血清(FBS)等而得到的培养基等。培养通常在pH6～8、30～40℃、5%CO₂存在下等条件下进行1～7天。另外，培养中可以根据需要向培养基中添加卡那霉素、青霉素等抗生素。

作为编码erbB3的基因的表达方法，除了直接表达以外，还可以列举例如分泌生产或融合蛋白表达等方法[Molecular Cloning,ALaboratory Manual，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)]。

作为erbB3的生产方法，可以列举例如：在宿主细胞内生产的方法、分泌到宿主细胞外的方法或在宿主细胞外膜上生产的方法，可以通过改变使用的宿主细胞或生产的erbB3的结构来选择适当的方法。

例如，可以通过制作在编码胞外域的氨基酸序列的DNA上连接有编码抗体的Fc段的DNA、编码谷胱甘肽S-转移酶(GST)的DNA、编码FLAG标签的DNA或编码组氨酸标签的DNA等的DNA并进行表达、纯化来制作抗原融合蛋白。

具体而言，可以列举：erbB3的胞外域与人IgG的Fc段结合而成的Fc融合蛋白(以下记作erbB3-hFc)、erbB3的胞外域与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白(以下记作erbB3-GST)。

在宿主细胞内或宿主细胞外膜上生产erbB3的情况下，通过使用鲍尔森等人的方法[J.Biol.Chem.,264,17619(1989)]、罗等人的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86,8227(1989)；Genes Develop.,4,1288(1990)]、日本特开平05-336963号公报或国际公开第94/23021号等中记载的方法，能够使erbB3主动地分泌到宿主细胞外。

另外，还可以利用使用二氢叶酸还原酶基因等的基因扩增系统(日本特开平2-227075号公报)来提高erbB3的生产量。

所得到的erbB3例如可以如下进行分离、纯化。

erbB3在细胞内以溶解状态表达的情况下，培养结束后通过离心分离回收细胞，悬浮于水系缓冲液中后，利用超声波破碎机、法式压滤壶、MANTON-GULIN匀浆器或卧式砂磨机等将细胞破碎，得到无细胞提取液。从将该无细胞提取液离心分离而得到的上清中利用通常的蛋白质的分离纯化方法，即，单独使用或者组合使用溶剂提取法、利用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂的沉淀法、使用二乙氨基乙基(DEAE)-琼脂糖、DIAION HPA-75(三菱化学公司制造)等树脂的阴离子交换层析法、使用S-琼脂糖FF(法玛西亚公司制造)等树脂的阳离子交换层析法、使用丁基琼脂糖、苯基琼脂糖等树脂的疏水层析法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、聚焦层析法或等电点电泳等电泳法等方法，能够得到纯化制备品。

erbB3在细胞内形成包涵体而进行表达的情况下，与上述同样地回收细胞后将其破碎，并进行离心分离，由此，以沉淀组分的形式回收该erbB3的包涵体。利用蛋白变性剂使回收的该erbB3的包涵体可溶化。对该可溶化液进行稀释或透析，由此，使该erbB3恢复至正常的立体结构，然后，通过与上述同样的分离纯化方法，能够得到多肽的纯化制备品。

erbB3或其糖基化物等衍生物被分泌到细胞外的情况下，可以在培养上清中回收该erbB3或其糖基化物等衍生物。将该培养物与上述同样地利用离心分离等方法进行处理，由此得到可溶性组分，使用与上述同样的分离纯化方法，由此能够从该可溶性组分中得到纯化制备品。

另外，本发明中使用的erbB3也可以通过Fmoc法或tBoc法等化学合成法来制造。此外，erbB3的一级结构是公知的(Kraus,M.H.etal.,Proc.Nat.Acad.Sci.86,9193-9197,1989.)，因此，可以通过本领域技术人员公知的方法制作肽等，也可以利用Advanced ChemTech公司、珀金埃尔默公司、法玛西亚公司、Protein Technology Instrument公司、Synthecell-Vega公司、パーセプチブ公司或岛津制作所公司制造等的肽合成仪进行化学合成。

(2)抗体产生细胞的制备步骤

对3～20周龄的小鼠、大鼠或仓鼠等动物免疫(1)中得到的抗原，采集该动物的脾脏、淋巴结、外周血中的抗体产生细胞。另外，也可以使用富塚等人的文献(Tomizuka.et al.,Proc Natl Acad Sci USA.,Vol97:722、2000)中记载的具有产生来源于人类的抗体的能力的转基因小鼠作为动物或者为了提高免疫原性而使用erbB3条件性基因敲除小鼠作为被免疫动物。

免疫通过将抗原与完全弗氏佐剂或者氢氧化铝凝胶和百日咳菌疫苗等适当的佐剂一同施用来进行。小鼠免疫时的免疫原施用法可以为皮下注射、腹腔内注射、静脉内注射、皮内注射、肌肉内注射或足底注射等中的任何一种，优选腹腔内注射、足底注射或静脉内注射。在抗原为部分肽的情况下，与牛血清白蛋白(BSA)或钥孔

血蓝蛋白(KLH)等载体蛋白制作结合物，将其作为免疫原使用。

抗原的施用在第一次施用之后每隔1～2周进行5～10次。各次施用后第3～7天从眼底静脉丛采血，利用酶免疫测定法[Antibodies-ALaboratory Manual，冷泉港实验室(1988)]等测定其血清的抗体效价。将其血清对免疫所用的抗原显示出充分的抗体效价的动物作为融合用抗体产生细胞的供给源时，能够提高后续操作的效果。

在抗原的末次施用后第3～7天，从免疫后的动物中摘除脾脏等含有抗体产生细胞的组织，采集抗体产生细胞。抗体产生细胞为浆细胞及作为其前体细胞的淋巴细胞，这些细胞可以从个体的任何部位获得，一般可以从脾脏、淋巴结、骨髓、扁桃体或外周血或者它们的适当组合等中获得，但最普遍使用脾脏细胞。在使用脾脏细胞的情况下，将脾脏细切、搅散后离心分离，进而除去红细胞，获得融合用抗体产生细胞。

(3)骨髓瘤的制备步骤

作为骨髓瘤，可以使用来源于小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔或人类等哺乳动物的自身不具有抗体产生能力的细胞。一般使用由小鼠得到的细胞系，例如，作为骨髓瘤细胞，使用由小鼠得到的细胞系，例如，使用8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠(来源于BALB/c)骨髓瘤细胞系P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topicsin Microbiology and Immunology,18,1(1978)]、P3-NS1/1-Ag41(NS-1)[European J.Immunology,6,511(1976)]、SP2/O-Ag14(SP-2)[Nature,276,269(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J.Immunology,123,1548(1979)]或P3-X63-Ag8(X63)[Nature,256,495(1975)]等。

这些细胞系在适当的培养基例如8-氮杂鸟嘌呤培养基[向添加有谷氨酰胺、2-巯基乙醇、庆大霉素及胎牛血清(以下称为“FCS”)的RPMI-1640培养基中添加8-氮杂鸟嘌呤而得到的培养基]、伊思考夫改良的杜尔贝科培养基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；以下称为“IMDM”)或杜尔贝科改良的伊戈尔培养基(Dulbecco’s Modified EagleMedium；以下称为“DMEM”)等培养基中传代培养，细胞融合的3～4天前在正常培养基(例如含有10%FCS的DMEM培养基)中传代培养，从而在融合当天确保2×10⁷以上的细胞数。

(4)细胞融合

将(2)中得到的融合用抗体产生细胞和(3)中得到的骨髓瘤细胞用最低必需培养基(MEM)或PBS(磷酸氢二钠1.83g、磷酸二氢钾0.21g、氯化钠7.65g、蒸馏水1升、pH7.2)充分清洗，以使细胞数达到融合用抗体产生细胞:骨髓瘤细胞=5:1～10:1的方式混合，离心分离后，除去上清。

将沉淀的细胞群充分搅散后，在37℃下搅拌的同时加入聚乙二醇-1000(PEG-1000)、MEM培养基及二甲亚砜的混合液。进而，每1～2分钟加入1～2mL的MEM培养基，重复数次后，加入MEM培养基使总量达到50mL。离心分离后，除去上清。将沉淀的细胞群轻轻搅散后，将融合用抗体产生细胞轻轻地悬浮于添加有次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷及氨基蝶呤的正常培养基(HAT培养基)中。将该悬浮液在5%CO₂的孵箱中在37℃下培养7～14天。

另外，也可以通过以下的方法进行细胞融合。将脾细胞和骨髓瘤用无血清培养基(例如DMEM)或磷酸缓冲生理盐水(以下称为“磷酸缓冲液”)充分清洗，以使脾细胞与骨髓瘤的细胞数之比为约5:1～约10:1的方式混合，并离心分离。

除去上清，将沉淀的细胞群充分搅散后，在搅拌的同时滴加1mL含有50%(w/v)聚乙二醇(分子量1000～4000)的无血清培养基。然后，缓慢加入10mL的无血清培养基后，离心分离。

再次弃去上清，将沉淀的细胞悬浮于适量的含有HAT液及人白介素-2(以下称为“IL-2”)的HAT培养基中并分注到培养用板(以下称为“板“)的各孔中，在5%CO₂存在下在37℃下培养约2周。其间适当补充HAT培养基。

(5)杂交瘤群的选择

在上述骨髓瘤细胞为8-氮杂鸟嘌呤抗性株的情况下，即为次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺陷株的情况下，未融合的该骨髓瘤细胞及骨髓瘤细胞之间的融合细胞不能在含有HAT的培养基中存活。另一方面，抗体产生细胞之间的融合细胞或抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的杂交瘤能够存活，但抗体产生细胞之间的融合细胞寿命有限。因此，通过在含有HAT的培养基中持续培养，仅抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的杂交瘤存活下来，结果能够选择出杂交瘤。

对于以集落状生长的杂交瘤，进行由HAT培养基向除去氨基蝶呤后的培养基(以下称为“HT培养基”)的培养基更换。然后，采集一部分培养上清，使用后述的抗体效价测定法，能够选择出生产抗体的杂交瘤。

作为抗体效价的测定方法，可以列举例如放射性同位素免疫定量法(以下称为“RIA法”)、固相酶联免疫定量法(以下称为“ELISA法”)、荧光抗体法及被动血细胞凝集反应法等各种公知技术。其中，从检测灵敏度、迅速性、准确性及操作自动化的可能性等观点出发，优选RIA法或ELISA法。

将通过测定抗体效价判明产生特异性抗体的杂交瘤转移到另一板中进行克隆。作为该克隆法，可以列举例如：以使板的1个孔中含有1个杂交瘤的方式稀释而培养的有限稀释法、在软琼脂培养基中培养并回收集落的软琼脂法、通过显微操纵器将细胞逐个取出并培养的方法及利用细胞分选仪分离1个细胞的“分选仪克隆”等，有限稀释法较为简便，因此经常使用。

对于确认了抗体效价的孔，重复2～4次例如利用有限稀释法的克隆，选择出稳定确认抗体效价的杂交瘤株作为抗人erbB3单克隆抗体产生杂交瘤株。

(6)单克隆抗体的制备

对姥鲛烷处理[腹腔内施用0.5mL的2,6,10,14-四甲基十五碳烷(姥鲛烷)并饲养2周]后的8～10周龄的小鼠或裸鼠腹腔内注射(5)中得到的产生单克隆抗体的杂交瘤。在10～21天内杂交瘤产生癌性腹水。

从上述小鼠中采集腹水，离心分离除去固体成分后，用40～50%的硫酸铵盐析，利用辛酸沉淀法、DEAE-琼脂糖柱、蛋白A柱或凝胶过滤柱进行纯化，收集IgG或IgM组分，得到纯化单克隆抗体。另外，使该杂交瘤在相同系统的小鼠(例如BALB/c)或Nu/Nu小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠或兔等的腹腔内增殖，由此，能够得到大量含有本发明的抗erbB3抗体的腹水。

将(5)中得到的产生单克隆抗体的杂交瘤在添加有10%FBS的RPMI1640培养基等中进行培养，然后，通过离心分离除去上清，悬浮于GIT培养基、添加有5%ダイゴGF21的杂交瘤SFM培养基等中，通过烧瓶培养、摇床培养、袋培养等培养3～7天。

将所得到的细胞悬浮液离心分离，由所得到的上清进行利用蛋白A柱或蛋白G柱的纯化，收集IgG组分，也能够得到纯化单克隆抗体。作为纯化的简便方法，也可以利用市售的单克隆抗体纯化试剂盒(例如，MAbTrap GII试剂盒；Amersham Pharmacia Biotech公司制造)等。

抗体亚类的确定使用亚类分型试剂盒通过酶免疫测定法来进行。蛋白量的定量可以通过劳里法及由280nm下的吸光度[1.4(OD280)=免疫球蛋白1mg/mL]计算的方法进行。

(7)抗erbB3单克隆抗体的结合分析

本发明的抗erbB3单克隆抗体的结合活性可以通过Ouchterlony法、ELISA法、RIA法、流式细胞术法(FCM)或表面等离子体共振法(SPR)等结合分析系统来确认。Ouchterlony法较为简便，但在抗体浓度低的情况下需要进行浓缩操作。

另一方面，在使用ELISA法或RIA法的情况下，通过使培养上清直接与抗原吸附固相反应、进而使用与各种免疫球蛋白同种型、亚类对应的抗体作为二次抗体，能够鉴定抗体的同种型、亚类。

使纯化或部分纯化后的重组人erbB3吸附到ELISA用96孔板等固相表面上，进而，使用与抗原无关的蛋白例如牛血清白蛋白(以下记作“BSA”)对未吸附抗原的固相表面进行封闭。

将ELISA板用含有0.05%Tween20的磷酸盐缓冲液(以下简记为PBS)(以下简记为Tween-PBS)等清洗后，使连续稀释的一次抗体(例如小鼠血清、培养上清等)反应，使抗体结合到固定在板上的抗原上。

接着，分注由生物素、酶(horse radish peroxidase;HRP,alkalinephosphatase;ALP等)、化学发光物质或放射性化合物等标记的抗免疫球蛋白抗体作为第二抗体，使二次抗体与板上结合的一次抗体反应。用Tween-PBS充分清洗后，进行与第二抗体的标记物质对应的反应，选择出对免疫原发生特异性反应的单克隆抗体。

FCM法可以测定目标抗体对抗原表达细胞的结合活性[CancerImmunol.Immunother.,36,373(1993)]。目标抗体与表达在细胞膜上的膜蛋白结合时，可以说目标抗体为识别天然存在的抗原的立体结构的抗体。

SPR法可以列举利用Biacore(注册商标)的动力学分析。例如，使用Biacore(注册商标)T100，测定抗原与被测物之间的结合的动力学，使用设备附带的分析软件对其结果进行分析。

通过胺偶联法将抗小鼠IgG抗体固定在传感器芯片CM5上，然后，使杂交瘤培养上清或纯化单克隆抗体等被测物质流过，使其以适当量结合，再使浓度已知的多个浓度的抗原流过，测定结合、解离。使用设备附带的软件利用1:1结合模型对所得到的数据进行动力学分析，获得各种参数。

或者，通过例如胺偶联法将人erbB3蛋白固定在传感器芯片上，然后，使浓度已知的多个浓度的纯化单克隆抗体流过，测定结合、解离。使用设备附带的软件利用双价结合模型对所得到的数据进行动力学分析，获得各种参数。

另外，与本发明的抗erbB3抗体竞争地与erbB3结合的抗体可以通过向上述的结合分析系统中添加被测抗体使其反应而获得。即，通过筛选添加被测抗体时抗体的结合受到抑制的抗体，能够获得在与erbB3胞外域的结合中与获得的抗体竞争的抗体。

(8)抗erbB3单克隆抗体的表位的鉴定

本发明中，抗体的识别表位的鉴定可以如下进行。例如，制作抗原的部分缺陷体、休息因种差异而不同的氨基酸残基后的氨基酸修饰体或修饰结构域后的修饰体，如果目标抗体对该缺陷体或氨基酸修饰体的反应性降低，则可知缺陷部位或氨基酸修饰部位为目标抗体的表位。抗原的部分缺陷体及氨基酸修饰体可以使用适当的宿主细胞(大肠杆菌、酵母、植物细胞、哺乳动物细胞等)以分泌蛋白的形式获得，也可以在宿主细胞的细胞膜上表达而制作抗原表达细胞。在膜型抗原的情况下，为了在保持抗原的立体结构的状态下进行表达，优选在宿主细胞膜上表达。另外，也可以制作模仿抗原的一级结构或立体结构的合成肽来确认目标抗体的反应性。关于合成肽，可以列举使用公知的肽合成技术制作该分子的各种部分肽的方法等。

对于本发明的抗erbB3抗体，可以通过针对人类及小鼠erbB3的胞外域制作分别组合有各结构域1～4的嵌合蛋白并确认目标抗体的反应性来鉴定抗体的表位。

然后，可以通过使用本领域技术人员公知的寡肽合成技术进一步详细地合成各种其对应部分的寡肽或该肽的突变体等并确认目标抗体对该肽的反应性来限定表位。作为用于得到多种寡肽的简便的方法，也可以利用市售的试剂盒[例如，SPOTs试剂盒(Genosys Biotechnologies公司制造)、使用多针合成法的一系列多针肽合成试剂盒(カイロン公司制造)等]。

与和本发明的与erbB3的胞外域结合的抗体所识别的表位相同的表位结合的抗体可以通过如下方法获得：对利用上述的结合分析系统获得的抗体的表位进行鉴定，制作鉴定出的表位的部分合成肽、模拟表位的立体结构的合成肽或重组蛋白等，进行免疫。

例如，如果为膜蛋白，则通过制作使全部胞外域或一部分胞外域与适当的标签(FLAG标签、组氨酸标签、GST蛋白、抗体Fc段等)连接而成的重组蛋白并用该重组蛋白进行免疫，能够制作更高效的表位特异性抗体。

2.基因重组抗体的制作

作为基因重组抗体的制作例，在P.J.Delves.,ANTIBODYPRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.,1997WILEY、P.Shepherdand C.Dean.Monoclonal Antibodies.,2000OXFORD UNIVERSITYPRESS及J.W.Goding.,Monoclonal Antibodies:principles andpractice.,1993ACADEMIC PRESS等中进行了概述，以下示出了人嵌合抗体、人源化抗体及人抗体的制作方法。

(1)基因重组抗体表达用载体的构建

基因重组抗体表达用载体是重组有编码人抗体的CH及CL的DNA的动物细胞用表达载体，可以通过将编码人抗体的CH及CL的DNA分别克隆到动物细胞用表达载体中来进行构建。

人抗体的C区可以使用任意的人抗体的CH及CL。例如，使用人抗体的γ1亚类的CH及κ类的CL等。作为编码人抗体的CH及CL的DNA，使用cDNA，也可以使用包含外显子和内含子的染色体DNA。作为动物细胞用表达载体，只要是能够重组并表达编码人抗体的C区的基因的载体，则均可以使用。。

例如使用pAGE107[Cytotechnol.,3,133(1990)]、pAGE103[J.Biochem.,101,1307(1987)]、pHSG274[Gene,27,223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78,1527(1981)]、pSG1bd2-4[Cytotechnol.,4,173(1990)]或pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol.,13,79(1993)]、INPEP4,(Biogen-IDEC公司制造)、N5KG1val(美国专利第6001358号说明书)、转座子载体(国际公开第2010/143698号)等。作为动物细胞用表达载体中的启动子和增强子，使用SV40的早期启动子[J.Biochem.,101,1307(1987)]、莫洛尼小鼠白血病病毒的LTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.,149,960(1987)]、CMV启动子(美国专利第5168062号说明书)或免疫球蛋白H链的启动子[Cell,41,479(1985)]和增强子[Cell,33,717(1983)]等。

从基因重组抗体表达载体的构建的容易度、向动物细胞中导入的容易度、抗体H链及L链在动物细胞内的表达量的平衡均衡等观点出发，基因重组抗体表达用载体使用抗体H链及L链存在于同一载体上的类型(串联型)的基因重组抗体表达用载体[J.Immunol.Methods,167,271(1994)]，但也可以使用抗体H链及L链存在于不同载体上的类型。作为串联型基因重组抗体表达用载体，使用pKANTEX93(国际公开第97/10354号)、pEE18[Hybridoma,17,559(1998)]、N5KG1val(美国专利第6001358号说明书)、转座子载体(国际公开第2010/143698号)等。

(2)编码来源于人类以外的动物的抗体的V区的cDNA的获得及氨基酸序列的分析

编码非人抗体的VH及VL的cDNA的获得及氨基酸序列的分析可以如下进行。

从产生非人抗体的杂交瘤细胞中提取mRNA，并合成cDNA。将合成的cDNA克隆到噬菌体或质粒等载体中，制作cDNA文库。使用编码小鼠抗体的C区部分或V区部分的DNA作为探针，从该文库中分别分离出具有编码VH或VL的cDNA的重组噬菌体或重组质粒。分别确定重组噬菌体或重组质粒上的目标小鼠抗体的VH或VL的全部碱基序列，由碱基序列分别推测出VH或VL的全部氨基酸序列。

作为制作产生非人抗体的杂交瘤细胞的人类以外的动物，使用小鼠、大鼠、仓鼠或兔等，只要能够制作杂交瘤细胞，则任何动物均可以使用。

由杂交瘤细胞制备总RNA时，使用异硫氰酸胍三氟乙酸铯法[Methods in Enzymol.,154,3(1987)]或RNA easy(注册商标)试剂盒(凯杰公司制造)等试剂盒等。

由总RNA制备mRNA时，使用固定有寡聚(dT)的纤维素柱法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)]或者使用Oligo-dT30<Super>(注册商标)mRNA纯化试剂盒(Takarabio公司制造)等试剂盒等。另外，也可以使用Fast Track(注册商标)mRNA分离试剂盒(Invitrogen公司制造)或QuickPrep(注册商标)mRNA纯化试剂盒(法玛西亚公司制造)等试剂盒从杂交瘤细胞中制备mRNA。

cDNA的合成及cDNA文库的制作时，使用公知的方法[MolecularCloning,A Laboratory Manual，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)；Current Protocols in Molecular Biology，附录1，约翰威立父子出版公司(1987-1997)]、用于cDNA合成和质粒克隆的SuperScript质粒系统(Invitrogen公司制造)或ZAP-cDNA合成试剂盒(Stratagene公司制造)等试剂盒等。

cDNA文库的制作时，用于重组以由杂交瘤细胞提取的mRNA为模板而合成的cDNA的载体只要是能够重组该cDNA的载体，则均可以使用。可以列举例如：ZAP Express[Strategies,5,58(1992)]、pBluescriptII SK(+)[Nucleic Acids Research,17,9494(1989)]、λZAPII(Stratagene公司制造)、λgt10、λgt11[DNA Cloning:A Practical Approach(DNA克隆实用方法),I,49(1985)]、λBlueMid(クローンテック公司制造)、λExCell、pT7T3-18U(法玛西亚公司制造)、pcD2[Mol.Cell.Biol.,3,280(1983)]或pUC18[Gene,33,103(1985)]等。

作为用于导入由噬菌体或质粒载体构建的cDNA文库的大肠杆菌，只要是能够导入、表达及维持该cDNA文库的大肠杆菌，则均可以使用。可以列举例如：XL1-Blue MRF’[Strategies,5,81(1992)]、C600[Genetics,39,440(1954)]、Y1088、Y1090[Science,222,778(1983)]、NM522[J.Mol.Biol.,166,1(1983)]、K802[J.Mol.Biol.,16,118(1966)]或JM105[Gene,38,275(1985)]等。

从cDNA文库中选择编码非人抗体的VH或VL的cDNA克隆时，使用利用同位素或荧光标记的探针的集落杂交法或噬菌斑杂交法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)]等。

另外，也可以通过如下方法制备编码VH或VL的cDNA：制备引物，将由mRNA合成的cDNA或cDNA文库作为模板来进行聚合酶链式反应法[以下记作PCR法；Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)、Current Protocolsin MolecularBiology,附录1,约翰威立父子出版公司(1987-1997)]。

将选择出的cDNA用适当的限制酶等切割后，克隆到pBluescriptSK(-)(Stratagene公司制造)等质粒中，利用通常使用的碱基序列分析方法等确定该cDNA的碱基序列。作为碱基序列分析方法，进行例如双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463(1977)]等的反应后，使用A.L.F.DNA测序仪(法玛西亚公司制造)等碱基序列自动分析装置等。

由确定的碱基序列分别推测出VH及VL的全部氨基酸序列，并与已知的抗体的VH及VL的全部氨基酸序列[Sequences of Proteins ofImmunological Interest，美国卫生与公众服务部(1991)]进行比较，由此，分别确认所获得的cDNA是否编码包含分泌信号序列的抗体的VH及VL的完整氨基酸序列。

关于包含分泌信号序列的抗体的VH及VL的完整氨基酸序列，通过与已知的抗体的VH及VL的全部氨基酸序列[Sequences of Proteinsof Immunological Interest，美国卫生与公众服务部(1991)]进行比较，能够推测出分泌信号序列的长度及N端氨基酸序列。进而能够获知它们所属的亚类。

另外，关于VH及VL的各CDR的氨基酸序列，也可以通过与已知的抗体的VH及VL的氨基酸序列[Sequences of Proteins ofImmunological Interest，美国卫生与公众服务部(1991)]进行比较来找出。

另外，使用所得到的VH及VL的完整氨基酸序列，对例如SWISS-PROT或PIR-Protein等任意的数据库利用BLAST法[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]等进行同源性检索，可以确认VH及VL的完整氨基酸序列的新颖性。

(3)人嵌合抗体表达载体的构建

将分别编码非人抗体的VH或VL的cDNA分别克隆到(1)中得到的基因重组抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，由此，可以构建人嵌合抗体表达载体。

为了使编码非人抗体的VH或VL的cDNA的3’末端侧与人抗体的CH或CL的5’末端侧连接，制作以如下方式设计的VH及VL的cDNA：连接部分的碱基序列编码适当的氨基酸且成为适当的限制酶识别序列。将所制作的VH及VL的cDNA分别克隆到(1)中得到的人源化抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，以使它们以适当的形式进行表达，从而构建人嵌合抗体表达载体。

另外，也可以使用在两端具有适当的限制酶的识别序列的合成DNA，通过PCR法对编码非人抗体VH或VL的cDNA分别进行扩增，并将它们克隆到(1)中得到的基因重组抗体表达用载体中。

(4)编码人源化抗体的V区的cDNA的构建

编码人源化抗体的VH或VL的cDNA可以如下构建。

分别选择用于移植非人抗体的VH或VL的CDR的氨基酸序列的人抗体的VH或VL的框架区(以下记作FR)的氨基酸序列。选择的FR的氨基酸序列只要是人抗体来源的氨基酸序列，则均可以使用。

例如，使用蛋白数据库(Protein Data Bank)等数据库中登记的人抗体的FR的氨基酸序列或人抗体的FR的各亚类的共有氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest，美国卫生与公众服务部(1991)]等。为了抑制抗体的结合活性的降低，选择与原来的抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列具有尽量高的同源性(至少60%以上)的FR的氨基酸序列。

接着，向选择好的人抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列中分别移植原抗体的CDR的氨基酸序列，从而分别设计出人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列。通过考虑在抗体基因的碱基序列中出现的密码子的使用频率[Sequences of Proteins of Immunological Interest，美国卫生与公众服务部(1991)]而将设计好的氨基酸序列转换成DNA序列，从而分别设计出编码人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列。

基于设计好的DNA序列，合成多条包含约100～150个碱基的长度的合成DNA，使用这些合成DNA进行PCR反应。这种情况下，从PCR反应中的反应效率及能够合成的DNA的长度考虑，优选对于H链、L链均设计4～6条合成DNA。另外，也可以合成可变区全长的合成DNA来使用。

另外，通过在位于两端的合成DNA的5’末端导入适当的限制酶的识别序列，可以容易地将编码人源化抗体的VH或VL的cDNA克隆到(1)中得到的人源化抗体表达用载体中。

PCR反应后，将扩增产物分别克隆到pBluescript SK(-)(Stratagene公司制造)等质粒中，通过与(2)中记载的方法同样的方法来确定碱基序列，从而获得具有编码期望的人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列的质粒。

(5)人源化抗体的V区的氨基酸序列的修饰

仅将非人抗体的VH及VL的CDR移植到人抗体的VH及VL的FR中时，人源化抗体的抗原结合活性与原来的非人抗体相比降低[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。在人源化抗体中，鉴定出人抗体的VH及VL的FR的氨基酸序列中直接与抗原的结合相关的氨基酸残基、与CDR的氨基酸残基相互作用的氨基酸残基以及维持抗体的立体结构并间接与抗原的结合相关的氨基酸残基，并将这些氨基酸残基取代为原来的非人抗体的氨基酸残基，由此能够使降低的抗原结合活性升高。

为了鉴定出与抗原结合活性相关的FR的氨基酸残基，可以通过使用X射线晶体分析[J.Mol.Biol.,112,535(1977)]或计算机模拟分析[Protein Engineering,7,1501(1994)]等来进行抗体的立体结构的构建及分析。另外，通过针对各个抗体制作多种修饰体并反复研究它们与抗原结合活性的相关性来进行各种尝试，能够获得具有所需抗原结合活性的修饰人源化抗体。

人抗体的VH及VL的FR的氨基酸残基可以通过使用修饰用合成DNA进行(4)中记载的PCR反应来进行修饰。对于PCR反应后的扩增产物，通过(2)中记载的方法来确定碱基序列，从而确认已实施了目标修饰。

(6)人源化抗体表达载体的构建

将构建好的编码基因重组抗体的VH或VL的cDNA分别克隆到(1)中得到的基因重组抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，从而可以构建人源化抗体表达载体。

例如，通过向(4)及(5)中得到的构建人源化抗体的VH或VL时使用的合成DNA中位于两端的合成DNA的5’末端导入适当的限制酶的识别序列，将构建好的VH或VL的cDNA分别克隆到(1)中得到的人源化抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，以使它们以适当的形式进行表达。

(7)基因重组抗体的瞬时表达

使用(3)及(6)中得到的基因重组抗体表达载体或者对上述载体进行修饰后的表达载体来进行基因重组抗体的瞬时表达，从而可以有效地评价所制作的多种人源化抗体的抗原结合活性。

用于导入表达载体的宿主细胞只要是能够表达基因重组抗体的宿主细胞，则均可以使用。例如使用COS-7细胞[美国典型培养物保藏中心(ATCC)编号：CRL1651][Methods in Nucleic Acids Res.,CRC press,283(1991)]。向COS-7细胞中导入表达载体时，使用DEAE-右旋糖酐法[Methods in Nucleic Acids Res.,CRC出版社,283(1991)]或脂质体转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等。

导入表达载体后，培养上清中的基因重组抗体的表达量及抗原结合活性使用ELISA法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice，第三版，美国学术出版社(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual，冷泉港实验室(1988)；単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィック(1987)]等进行测定。

(8)稳定表达基因重组抗体的转化株的获得和基因重组抗体的制备

通过将(3)及(6)中得到的基因重组抗体表达载体导入适当的宿主细胞中，能够得到稳定表达基因重组抗体的转化株。

向宿主细胞中导入表达载体时，可以列举：电穿孔法[日本特开平2-257891号公报、Cytotechnology,3,133(1990)]、钙离子方法、电穿孔法、原生质体法、醋酸锂法、磷酸钙法、脂质体转染法等)。另外，作为将基因导入后述的动物中的方法，可以列举：显微注射法、使用电穿孔或脂质体转染法将基因导入ES细胞中的方法或核移植法等。

用于导入表达载体的宿主细胞只要是能够表达基因重组抗体的宿主细胞，则可以使用任何细胞。例如，使用小鼠SP2/0-Ag14细胞(ATCC编号：CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC编号：CRL1580)、二氢叶酸还原酶基因(以下记作dhfr)缺陷的CHO细胞[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)]、获得了凝集素抗性的Lec13[Somatic Cell andMolecular genetics,12,55(1986)]、α1,6-岩藻糖转移酶基因缺陷的CHO细胞(国际公开第2005/035586号、国际公开第02/31140号)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC编号：CRL1662)等。

另外，还可以使用与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶等蛋白质或与在N-糖苷键复合型糖链的还原末端的N-乙酰葡糖胺的6位上使岩藻糖的1位进行α连接的糖链修饰相关的酶等蛋白质或者与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖向高尔基体的转运相关的蛋白质等的活性降低或缺失的宿主细胞(国际公开第2003/85102号)，例如α1,6-岩藻糖转移酶基因缺陷的CHO细胞(国际公开第2005/035586号、国际公开第02/31140号)等。

导入表达载体后，通过在含有G418硫酸盐(以下记作G418)等药剂的动物细胞培养用培养基中进行培养来选择稳定表达基因重组抗体的转化株(日本特开平2-257891号公报)。

作为动物细胞培养用培养基，可以列举例如：RPMI1640培养基(Invitrogen公司制造)、GIT培养基(日本制药公司制造)、EX-CELL301培养基、EX-CELL302培养基、EX-CELL325培养基(JRH公司制造)、IMDM培养基(Invitrogen公司制造)、杂交瘤-SFM培养基(Invitrogen公司制造)或者在这些培养基中添加有FBS等各种添加物的培养基等。

通过将所得到的转化株在培养基中进行培养，在培养上清中表达并蓄积基因重组抗体。培养上清中的基因重组抗体的表达量及抗原结合活性可以通过ELISA法等来测定。另外，可以利用DHFR扩增系统(日本特开平2-257891号公报)等使转化株的基因重组抗体的表达量升高。

基因重组抗体使用蛋白A柱从转化株的培养上清中进行纯化[Monoclonal Antibodies-Principles and practice，第三版，美国学术出版社(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual，冷泉港实验室(1988)]。另外，也可以将凝胶过滤、离子交换层析及超滤等蛋白质纯化中使用的方法进行组合。

纯化后的基因重组抗体的H链、L链或整个抗体分子的分子量可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳法[Nature,227,680(1970)]或蛋白免疫印迹法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice，第三版，美国学术出版社(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual，冷泉港实验室(1988)]等来测定。

3.纯化单克隆抗体或该抗体片段的活性评价

纯化后的本发明的单克隆抗体或该抗体片段的活性评价可以如下进行。

对erbB3表达细胞系的结合活性可以使用上述1-(7)中记载的结合分析来测定。对抗原阳性细胞系的CDC活性或ADCC活性可以使用公知的测定方法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]来测定。

依赖于EGF样配体的erbB3的磷酸化及依赖于erbB3特异性配体的erbB3的磷酸化可以如下测定。

将erbB3表达细胞用PBS或无血清培养基等进行清洗，在无血清培养基中培养约24小时。接着，使用在含有数ng/mL～数十ng/mL的erbB3受体配体的培养基中添加有目标抗体的培养基将erbB3表达细胞培养数分钟～数十分细胞分钟后，制备该细胞提取液，使用erbB3特异性抗体及管家基因(肌动蛋白等)特异性抗体对各蛋白进行免疫沉淀。

将上述沉淀蛋白在SDS-PAGE中电泳后，使用erbB3特异性抗体及磷酸化酪氨酸特异性抗体进行蛋白免疫印迹，由此能够测定erbB3的磷酸化抑制活性。

另外，利用甲醛及皂素对添加抗体后的培养细胞蛋白进行固定及细胞膜透过处理，通过进行使用erbB3特异性抗体及磷酸化酪氨酸特异性抗体的FCM分析，能够确认erbB3的磷酸化。

另外，对于erbB3的二聚体化，与上述磷酸化检测实验同样地进行培养、细胞提取液的制备后，使用抗erbB3抗体进行erbB3蛋白的免疫沉淀，使用抗各erbB家族蛋白的抗体检测该沉淀蛋白，由此能够以对erbB3的二聚体化或异二聚体化进行检测。

4.控制抗体的效应活性的方法

作为控制本发明的抗erbB3抗体的效应活性的方法，可以列举：对抗体的Fc段的第297位的天冬酰胺(Asn)上结合的N-糖苷键复合型糖链的还原末端上存在的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)上以α-1,6糖苷键结合的岩藻糖(也称为核心岩藻糖)的量进行控制的方法(国际公开第2005/035586号、国际公开第2003/85102号、国际公开第2002/31140号、国际公开第00/61739号)或修饰抗体的Fc段的氨基酸残基的方法等。本发明的抗erbB3抗体使用任何一种方法均能够控制效应活性。

效应活性是指抗体的Fc段介导产生的抗体依赖性的活性，已知抗体依赖性细胞毒活性(ADCC活性)、活性(CDC活性)或者巨噬细胞或树状细胞等吞噬细胞的抗体依赖性吞噬作用(Antibody-dependentphagocytosis，ADP活性)等。

可以通过控制抗体的Fc的N-糖苷键复合型糖链的核心岩藻糖的含量而使抗体的效应活性增加或降低。作为使抗体的Fc上结合的N-糖苷键复合型糖链上结合的岩藻糖的含量降低的方法，通过使用α1,6-岩藻糖转移酶基因缺陷的CHO细胞表达抗体，能够获得未结合岩藻糖的抗体。未结合岩藻糖的抗体具有高的ADCC活性。

另一方面，作为使抗体的Fc上结合的N-糖苷键复合型糖链上结合的岩藻糖的含量增加的方法，通过使用导入有α1,6-岩藻糖转移酶基因的宿主细胞表达抗体，能够获得结合有岩藻糖的抗体。结合有岩藻糖的抗体具有比未结合岩藻糖的抗体低的ADCC活性。

另外，可以通过修饰抗体的Fc段的氨基酸残基而使ADCC活性或CDC活性增加或降低。通过进行Fc段的氨基酸残基修饰，使对FcγR的结合活性增加或降低，由此能够控制ADCC活性，通过进行Fc段的氨基酸残基修饰，使补体的结合活性增加或降低，由此能够控制CDC活性。

例如，通过使用美国专利申请公开第2007/0148165号说明书中记载的Fc段的氨基酸序列，能够使抗体的CDC活性。另外，通过进行美国专利第6737056号说明书、美国专利第7297775号说明书、美国专利第7317091号说明书或国际公开第2005/070963号中记载的氨基酸修饰，能够使ADCC活性或CDC活性增加或降低。

此外，通过将上述的控制糖链的方法与进行Fc段的氨基酸残基修饰的方法组合，能够获得抗体的效应活性经过控制的抗体。

5.使用本发明的抗erbB3抗体或该抗体片段的疾病的治疗方法

本发明的特异性识别erbB3的胞外域且抑制依赖于EGF样配体的erbB3的磷酸化的抗体或该抗体片段能够用于治疗erbB3相关癌症等过度增殖性疾病(hyper proliferative diseases)的治疗。

作为erbB3相关疾病，可以列举例如：大肠癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、恶性黑色素瘤(黑色素瘤)、甲状腺癌、肾细胞癌、白血病、淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、胃癌、胰腺癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、头颈部鳞状细胞癌、皮肤癌、尿道癌、膀胱癌、前列腺癌、绒癌、咽癌、喉癌、胸膜瘤、男性细胞瘤、子宫内膜增生、子宫内膜症、胚胎瘤、纤维肉瘤、卡波西氏肉瘤、血管瘤、海绵状血管瘤、成血管细胞瘤、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、神经纤维瘤、少突胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、横纹肌肉瘤、胶质母细胞瘤、骨原性肉瘤、平滑肌肉瘤、甲状腺肉瘤及肾母细胞瘤等。

另外，可以使用至少两种以上的本发明的抗erbB3抗体进行上述疾病的治疗。具体而言，可以列举将erbB3的结构域1～4的各结构域的抗体组合使用的治疗方法，优选包括施用与erbB3的结构域1或3结合的抗体和与结构域2或4结合的抗体的治疗方法，最优选包括施用与erbB3的结构域1结合的抗体和与结构域4结合的抗体的治疗方法。

含有本发明的抗体或该抗体片段或者它们的衍生物的治疗剂可以仅含有作为有效成分的该抗体或该抗体片段或者它们的衍生物，通常优选以与药理学上可容许的一种以上的载体一起混合并通过制剂学的技术领域中公知的方法制造而成的医药制剂的形式来提供。

作为给药途径，可以列举例如：口服给药或者口腔内、气管内、直肠内、皮下、肌肉内或静脉内等非口服给药。作为给药形态，可以列举例如：喷雾剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、栓剂、注射剂、软膏或胶带剂等。

各种制剂可以使用通常使用的赋形剂、增量剂、粘合剂、浸润剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、分散剂、缓冲剂、保存剂、助溶剂、防腐剂、着色料、香味剂或稳定剂等通过常规方法制造。

作为赋形剂，可以列举例如：乳糖、果糖、葡萄糖、玉米淀粉、山梨醇、结晶纤维素、无菌水、乙醇、甘油、生理盐水及缓冲液等。作为崩解剂，可以列举例如：淀粉、海藻酸钠、明胶、碳酸钙、枸橼酸钾、糊精、碳酸镁及合成硅酸镁等。

作为粘合剂，可以列举例如：甲基纤维素或其盐、乙基纤维素、阿拉伯胶、明胶、羟丙基纤维素及聚乙烯基吡咯烷酮等。作为润滑剂，可以列举例如：滑石、硬脂酸镁、聚乙二醇及硬化植物油等。

作为稳定剂，可以列举例如：精氨酸、组氨酸、赖氨酸、蛋氨酸等氨基酸、人血清白蛋白、明胶、葡聚糖40、甲基纤维素、亚硫酸钠、偏亚硫酸钠等。

作为其他添加剂，可以列举例如：糖浆、凡士林、甘油、乙醇、丙二醇、柠檬酸、氯化钠、亚硝酸钠及磷酸钠等。

适于口服给药的制剂为乳剂、糖浆剂、胶囊剂、片剂、散剂或颗粒剂等。

乳剂或糖浆剂等液体制备物使用如下成分作为添加剂来制造：水，蔗糖、山梨醇或果糖等糖类，聚乙二醇或聚丙二醇等二醇类，芝麻油、橄榄油或大豆油等油类，对羟基苯甲酸酯等防腐剂或者草莓香料或薄荷等香料类等。

胶囊剂、片剂、散剂或颗粒剂等使用如下成分作为添加剂来制造：乳糖、葡萄糖、蔗糖或甘露醇等赋形剂，淀粉或海藻酸钠等崩解剂，硬脂酸镁或滑石等润滑剂，聚乙烯醇、羟丙基纤维素或明胶等粘合剂、脂肪酸酯等表面活性剂或甘油等增塑剂等。

作为适于非口服给药的制剂，可以列举例如：注射剂、栓剂或喷雾剂等。

注射剂使用包含食盐溶液、葡萄糖溶液或者这两者的混合物的载体等来制造。

栓剂使用可可脂、氢化脂肪或羧酸等载体来制造。

喷雾剂使用不刺激接受者的口腔及气管粘膜并且使本发明的单克隆抗体或该抗体片段以微细粒子的形式分散从而容易吸收的载体等来制造。作为载体，使用例如乳糖或甘油等。另外，也可以以气溶胶或干粉的形式制造。

此外，也可以向上述非经口剂中添加在适于口服给药的制剂中作为添加剂而例示的成分。

本发明的抗体的有效量和作为与适当的稀释剂及药理学上能够使用的载体的组合而施用的有效量为每次每1kg体重0.0001mg～100mg，以2天至8周的间隔给药。

6.使用本发明的抗erbB3单克隆抗体或该抗体片段的疾病的诊断方法

通过使用本发明的抗体或该抗体片段来检测或测定erbB3或表达erbB3的细胞，能够对erbB3相关疾病进行诊断。

作为erbB3相关疾病之一的癌症的诊断，例如可以通过如下检测或测定erbB3来进行。

首先，对于从多名健康人的体内采集的生物试样，使用本发明的单克隆抗体或该抗体片段或者它们的衍生物，利用下述免疫学方法进行erbB3的检测或测定，考察erbB3在健康人的生物试样中的存在量。接着，对受试者的生物试样也同样地考察erbB3的存在量，并将其存在量与健康人的存在量进行比较。当受试者的该多肽的存在量与健康人相比增加时，诊断癌为阳性。

免疫学方法是指使用实施标记后的抗原或抗体来检测或测定抗体量或抗原量的方法。可以列举例如：放射性物质标记免疫抗体法、酶免疫测定法、荧光免疫测定法、发光免疫测定法、蛋白免疫印迹法或物理化学方法等。

放射性物质标记免疫抗体法中，例如，使本发明的抗体或该抗体片段与抗原或表达抗原的细胞等反应，进而，使实施放射性标记后的抗免疫球蛋白抗体或结合片段进行反应，然后，利用闪烁计数仪等进行测定。

酶免疫测定法中，例如，使本发明的抗体或该抗体片段与抗原或表达抗原的细胞等反应，进而，使实施标记后的抗免疫球蛋白抗体或结合片段进行反应，然后，利用吸光光度计测定显色色素。可以列举例如夹心ELISA法等。

作为酶免疫测定法中使用的标记物，可以使用公知[酶免疫测定法，医学书院(1987)]的酶标记。可以列举例如：碱性磷酸酶标记、过氧化物酶标记、荧光素酶标记或生物素标记等。

夹心ELISA法是使抗体结合在固相上后使其捕获作为检测或测定对象的抗原并使第二抗体与被捕获的抗原反应的方法。该ELISA法中，准备两种识别要检测或测定的抗原的、抗原识别部位不同的抗体或抗体片段，预先使其中的第一抗体或抗体片段吸附到板(例如96孔板)上，接着，将第二抗体或抗体片段用FITC等荧光物质、过氧化物酶等酶或生物素等进行标记。

在吸附有上述抗体的板上使从生物体内分离的细胞或其破碎液、组织或其破碎液、细胞培养上清、血清、胸水、腹水或眼液等进行反应，然后，使标记后的单克隆抗体或抗体片段反应，并进行与标记物质相对应的检测反应。利用将浓度已知的抗原进行连续稀释而制作的标准曲线计算受试样品中的抗原浓度。

作为夹心ELISA法中使用的抗体，可以使用多克隆抗体或单克隆抗体中的任何一种，也可以使用Fab、Fab’或F(ab’)₂等抗体片段。作为夹心ELISA法中使用的两种抗体的组合，可以是识别不同表位的单克隆抗体或抗体片段的组合，也可以是多克隆抗体与单克隆抗体或抗体片段的组合。

荧光免疫测定法通过文献[Monoclonal Antibodies-Principles andpractice,第三版,美国学术出版社(1996)；単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィック(1987)]等中记载的方法进行测定。作为荧光免疫测定法中使用的标记物，可以使用公知[荧光抗体法，ソフトサイエンス公司(1983)]的荧光标记。可以列举例如FITC或RITC等。

发光免疫测定法通过文献[生物发光和化学发光，临床检查42，广川书店(1998)]等中记载的方法进行测定。作为发光免疫测定法中使用的标记物，可以列举公知的发光体标记，可以列举例如吖啶酯标记或洛酚碱标记等。

蛋白免疫印迹法中，将抗原或表达抗原的细胞等利用SDS(十二烷基硫酸钠)-PAGE[Antibodies-A Laboratory Manual，冷泉港实验室(1988)]分级后，将该凝胶印迹到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜或硝酸纤维素膜上，

并使识别抗原的抗体或抗体片段与该膜进行反应，进而，使实施FITC等荧光物质、过氧化物酶等酶标记或生物素标记等后的抗小鼠IgG抗体或结合片段进行反应，然后，使该标记可见化，由此进行测定。以下示出一例。

使表达具有序列号2所示的氨基酸序列的多肽的细胞或组织溶解，在还原条件下使每个泳道的蛋白量为0.1～30μg，通过SDS-PAGE法进行电泳。将电泳后的蛋白转印到PVDF膜上，在含有1～10%BSA的PBS(以下记作BSA-PBS)中在室温下反应30分钟，进行封闭操作。

在此，使本发明的单克隆抗体进行反应，用含有0.05～0.1%Tween-20的PBS(以下记作Tween-PBS)清洗，并使过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG在室温下反应2小时。用Tween-PBS清洗，使用ECL(注册商标)蛋白免疫印迹检测试剂(安玛西亚公司制造)等对结合有单克隆抗体的条带进行检测，由此，检测出具有序列号2所示的氨基酸序列的多肽。

作为蛋白免疫印迹法的检测中使用的抗体，使用能够与未保持天然型立体结构的多肽结合的抗体。

作为物理化学方法，可以列举例如：使作为抗原的_erbB3与本发明的单克隆抗体或该抗体片段结合、由此形成凝集体并对该凝集体进行检测的方法。此外，作为物理化学方法，还可以列举例如：毛细管法、一维免疫扩散法、免疫比浊法或乳胶免疫比浊法[临床检查法提要，金原出版(1998)]等。

乳胶免疫比浊法中，使用以抗体或抗原致敏的粒径约0.1μm～约1μm的聚苯乙烯乳胶等载体，利用对应的抗原或抗体引起抗原抗体反应时，反应液中的散射光增加，透射光减少。将该变化以吸光度或积分球浊度的形式进行检测，由此测定受试样品中的抗原浓度等。

另一方面，表达erbB3的细胞的检测或测定可以使用公知的免疫学检测方法，优选使用免疫沉淀法、免疫细胞染色法、免疫组织染色法或荧光抗体染色法等。

免疫沉淀法中，使表达erbB3的细胞等与本发明的单克隆抗体或该抗体片段反应后，加入对蛋白G-琼脂糖等免疫球蛋白具有特异性结合能力的载体而使抗原抗体复合物沉淀。

或者，也可以通过如下方法来进行。使上述本发明的单克隆抗体或该抗体片段固相化于ELISA用96孔板上后，利用BSA-PBS进行封闭。

在抗体为例如杂交瘤培养上清等未纯化的状态的情况下，使抗小鼠免疫球蛋白、抗大鼠免疫球蛋白、蛋白A或蛋白G等预先固相化于ELISA用96孔板上，用BSA-PBS封闭后，分注杂交瘤培养上清而使其进行结合。

接着，弃去BSA-PBS并用PBS充分清洗，然后，使表达erbB3的细胞或组织的溶解液进行反应。用SDS-PAGE用样品缓冲液从充分清洗后的板上提取免疫沉淀物，通过上述蛋白免疫印迹法进行检测。

免疫细胞染色法或免疫组织染色法为如下方法：将表达抗原的细胞或组织等根据情况用表面活性剂或甲醇等进行处理以增加抗体的透过性，然后，与本发明的单克隆抗体进行反应，进而，与实施FITC等荧光标记、过氧化物酶等酶标记或生物素标记等后的抗免疫球蛋白抗体或其结合片段反应，然后，使该标记可见化并利用显微镜进行显微观察。

另外，可以通过使细胞与荧光标记的抗体反应并使用流式细胞仪进行分析的荧光抗体染色法[Monoclonal Antibodies-Principles andpractice，第三版，美国学术出版社(1996)；単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィック(1987)]进行检测。特别地，本发明的与erbB3的胞外域结合的单克隆抗体或该抗体片段可以通过荧光抗体染色法来检测表达在细胞膜上的erbB3。

另外，荧光抗体染色法中，在使用FMAT8100HTS系统(美国应用生物系统公司制造)等的情况下，可以在不对形成的抗体-抗原复合物与未参与抗体-抗原复合物形成的游离抗体或抗原进行分离的情况下测定抗原量或抗体量。

实施例

以下，通过实施例更具体地对本发明进行说明，但本发明不受下述实施例的限定。

[实施例1]erbB3抗原的制作

1.人erbB3-Fc蛋白表达载体

在人erbB3的胞外域(序列号3)上结合有人IgG1-Fc段的Fc融合蛋白(以下记作erbB3-Fc)的cDNA片段如下制作。编码人erbB3的胞外域的氨基酸序列的DNA片段通过使用序列号7及序列号8的引物，以人肺Marathon Ready cDNA(Clontech公司)作为模板，使用KOD plus(注册商标)DNA聚合酶(东洋纺织公司制造)，进行94℃15秒钟、60℃30秒钟、68℃2分钟、35个循环的PCR反应来进行扩增。将该erbB3基因片段用限制酶KpnI及XbaI消化，插入到含有人IgG的Fc段的INPEP4载体(Biogen-IDEC公司制造)的适当位点，制作erbB3-Fc表达载体。

2.人erbB3-GST蛋白表达载体的制作

以下的实验中，只要没有另外记载，则进行1.的PCR条件及限制酶处理，制作各表达载体。

人erbB3的胞外域(序列号3)与谷胱甘肽S-转移酶(以下记作GST)结合而成的GST融合蛋白(以下记作herbB3-GST)的cDNA片段如下制作。

人erbB3胞外域的cDNA片段通过使用序列号9的引物及序列号10的引物，以人肺Marathon Ready cDNA(Clontech公司制造)作为模板，进行94℃15秒钟、60℃15秒钟、68℃2分钟、35个循环的PCR反应来进行扩增。将该基因片段用限制酶KpnI及BglII消化，插入到含有GST的INPEP4载体(Biogen-IDEC公司制造)的适当位点，制作herbB3-GST表达载体。

3.小鼠erbB3-GST蛋白表达载体的制作

在小鼠erbB3的胞外域(序列号6)上结合有GST的GST融合蛋白(以下记作merbB3-GST)的cDNA片段通过以小鼠肺Marathon ReadycDNA(Clontech公司制造)作为模板，使用序列号11的引物及序列号12的引物进行94℃30秒钟、65℃15秒钟、68℃2分钟、35个循环的PCR反应来进行扩增。扩增得到的cDNA片段使用限制酶MuI及BglII消化。以下的操作与[实施例1]1.同样地制作小鼠erbB3-GST表达载体。

4.人-小鼠嵌合erbB3-Fc蛋白表达载体的制作

为了考察抗erbB3抗体的结合区域，如下制作将人erbB3的胞外域的结构域2～4置换成小鼠erbB3的结构域2～4的嵌合蛋白(以下记作hD1/mD234)、将人erbB3的胞外域的结构域3～4置换成小鼠erbB3的结构域3～4的嵌合蛋白(以下记作hD12/mD34)及将人erbB3的胞外域的结构域4置换成小鼠erbB3的结构域4的嵌合蛋白(以下记作hD123/mD4)的表达载体。

(1)hD1/mD234表达载体的制作

人erbB3-D1的cDNA片段通过以人erbB3cDNA作为模板，使用序列号13的引物和序列号14的引物，进行94℃30秒钟、65℃15秒钟、68℃30秒钟、35个循环的PCR反应来进行扩增。另一方面，小鼠erbB3-D234的cDNA片段通过以小鼠erbB3cDNA作为模板，使用序列号15的引物和序列号16的引物，进行94℃30秒钟、65℃15秒钟、68℃90秒钟、35个循环的PCR来进行扩增。

hD1/mD234的cDNA片段通过纯化人erbB3-D1的cDNA片段及小鼠erbB3-D234的cDNA片段，将其混合物作为模板，进行94℃30秒钟、65℃15秒钟、68℃2分钟、5个循环的PCR反应后，添加序列号17的引物及序列号18的引物，再进行94℃30秒钟、65℃15秒钟、68℃2分钟、35个循环的PCR反应来进行扩增。将该基因片段用限制酶MluI及BglII消化，插入到含有GST的INPEP4载体(Biogen-IDEC公司制造)中，制作hD1/mD234表达载体。

(2)hD12/mD34表达载体的制作

人erbB3-D12的cDNA片段通过以人erbB3cDNA作为模板，使用序列号19的引物及序列号20的引物，进行94℃30秒钟、65℃15秒钟、68℃1分钟、35个循环的PCR来进行扩增。

另一方面，小鼠erbB3-D34的cDNA片段通过以小鼠erbB3cDNA作为模板，使用序列号21的引物及序列号22的引物，进行94℃30秒钟、65℃15秒钟、68℃90秒钟、35个循环的PCR反应而进行扩增。使用上述扩增得到的2个cDNA片段和序列号23的引物及序列号24的引物，与上述(a)同样地制作hD12/mD34表达载体。

(3)hD123/mD4表达载体的制作

人erbB2-D123的cDNA片段通过以人erbB3cDNA作为模板，使用序列号25的引物及序列号26的引物，进行94℃30秒钟、65℃15秒钟、68℃2分钟、35个循环的PCR来进行扩增。

另一方面，小鼠erbB3-D4的cDNA片段通过以小鼠erbB3cDNA作为模板，使用序列号27的引物及序列号28的引物，进行94℃30秒钟、65℃15秒钟、68℃90秒钟、35个循环的PCR反应来进行扩增。使用上述扩增得到的2个cDNA片段和序列号29的引物及序列号30的引物，与上述(a)同样地制作hD123/mD4表达载体。

5.erbB3-Fc蛋白及erbB3-GST蛋白的制作

使用FreeStyle293表达试剂盒(Invitrogen公司)，按照附带的说明书将上述1.～4.中制作的erbB3-Fc蛋白表达载体及erbB3-GST蛋白表达载体分别导入FreeStyle293F细胞中。回收载体导入后第5天的培养上清，进行0.2μm的过滤器(密理博公司制造)处理。

erbB3-Fc蛋白使用Protein A树脂(MabSelect(注册商标)，安玛西亚公司制造)进行亲和纯化。使用磷酸缓冲液(PBS)作为清洗液，使用20mM柠檬酸钠、50mM NaCl缓冲液(pH2.7)作为洗脱缓冲液。洗脱组分通过添加200mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)而调节至pH6.0附近。

对于erbB3-GST蛋白，向125mL培养上清中添加1mL谷胱甘肽琼脂糖4B(安玛西亚公司制造)树脂悬浮液，在4℃下反应4小时。然后，用磷酸缓冲液清洗，使用10mM谷胱甘肽的50mM Tris-HCl(pH8.0)溶液作为洗脱缓冲液对各结构域肽进行亲和纯化。

对于洗脱后的融合蛋白溶液，使用透析膜(截留分子量10000，Spectrum Laboratories公司制造)置换成磷酸缓冲液，用孔径0.22μm的膜滤器MILLEX-GV(密理博公司制造)过滤灭菌，制作erbB3-Fc蛋白及erbB3-GST蛋白。

erbB3-Fc蛋白及erbB3-GST蛋白的浓度通过测定280nm的吸光度，将显示0.86最适密度的融合蛋白溶液的浓度作为1mg/mL进行计算。

[实施例2]抗人erbB3抗体的制作

本实施例中的单克隆抗体的制作按照单克隆抗体实验操作入门(安东民卫等著、讲谈社发行、1991年)等中记载的一般的方法制备。被免疫动物使用日本SLC公司销售的C3H/Hej jms Slc-lpr/lpr小鼠。

将erbB3-Fc等抗原蛋白与MPL+TDM乳剂(RiBi；Sigma公司制造，目录号52-0177-00)以1:1混合，以20μg/只对小鼠的右腹腔内进行初次免疫。初次免疫以后，将10～20μg/只的抗原以7-9天的间隔对小鼠进行多次免疫。进而，为了进行细胞融合，在获取脾脏及淋巴结的3天前，将该抗原免疫到右腹腔内。从第2次抗原免疫后开始测定抗体效价，之后随时间推移进行抗体效价的测定，判断脾脏等的摘除时期。

向通过外科方法由免疫抗原后的小鼠切除的脾脏及淋巴结中加入10mL含有350mg/mL碳酸氢钠、50单位/mL青霉素及50μg/mL链霉素的无血清DMEM培养基(GIBCO BRL公司制造)(以下记作无血清DMEM培养基)，使用刮刀在筛网(Cell Strainer；Falcon公司制造)上压碎。对通过筛网后的细胞悬浮液进行离心分离使细胞沉淀后，将细胞用无血清DMEM培养基清洗2次，然后悬浮在无血清DMEM培养基中测定细胞数。

另一方面，使用含有10%胎牛血清(以下简记作FCS)(Sigma公司制造)及L-Glu的DMEM培养基(GIBCO BRL公司制造)(以下记作含血清DMEM培养基)，在37℃、5%CO₂存在下将8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠骨髓瘤P3X63Ag8U.1(P3-U1)以1×10⁸细胞/mL以下的细胞浓度进行传代培养。

培养得到的小鼠骨髓瘤细胞与上述同样地用无血清DMEM培养基清洗，悬浮在无血清DMEM培养基中测定细胞数。回收的来源于小鼠脾脏及淋巴结的细胞悬浮液与小鼠骨髓瘤悬浮液以细胞数为5:1的比例进行混合。将该细胞混合液离心分离，然后完全除去上清。

用移液器的尖端搅拌团块的同时缓慢地向该团块中添加1mL作为融合剂的50%(w/v)聚乙二醇1500(Boehringer Mannheim公司制造)，然后，分2次缓慢地添加1mL预先加热至37℃的无血清DMEM培养基，再添加7mL的无血清DMEM培养基。离心分离后，除去上清，将所得到的融合细胞供于以下记载的利用有限稀释法的筛选。

杂交瘤通过在含有10%FCS、次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)以及胸腺嘧啶核苷(T)(以下称为“HAT”；Sigma公司制造)的DMEM培养基(HAT培养基)中培养来选择。

进而，通过使用含有HT(Sigam公司制造)的DMEM培养基(HT培养基)的有限稀释法对杂交瘤进行单克隆。培养在96孔微量滴定板(BD公司制造)中进行。

产生抗人erbB3单克隆抗体的杂交瘤筛选及各杂交瘤所产生的单克隆抗体的反应特异性分析通过后述的酶联免疫吸附分析(ELISA)及荧光活化细胞分选仪(FACS)分析进行。

结果，确立了产生抗人erbB3单克隆抗体的杂交瘤1126、1153、920104及12511。

[实施例3]抗erbB3抗体的结合结构域的确定

本发明中获得的抗人erbB3单克隆抗体的结合结构域通过对使erbB3的胞外域与GST融合而得到的GST融合蛋白的结合ELISA确定。

将用50mM碳酸缓冲液(pH9)(以下记作包被缓冲液)制备成1μg/mL的抗谷胱甘肽转移酶-日本血吸虫(山羊)(Rockland公司制造，目录号16979)(以下记作抗GST)以50μL/孔添加到Maxi-Sorb板(NUNC；目录号442404)中，在37℃、1小时(或4℃、开启)的条件下孵育，使其固相化。

弃去缓冲液后，向各孔中以250～300μL/孔加入封闭试剂(SuperBlock(注册商标)封闭缓冲液，PIERCE公司制造)，在室温下孵育5～10分钟，进行封闭。弃去封闭试剂后，向各抗原的板中分别以50μL/孔添加用含有10%Block Ace(注册商标)(大日本住友制药公司制造)、0.1%tween20的Tris缓冲液生理盐水(以下记作分析稀释液)稀释至5μg/mL的herbB3-GST融合蛋白、merbB3-GST融合蛋白、hD1/mD234融合蛋白、hD12/mD34融合蛋白及hD123/mD4融合蛋白，在室温下孵育1小时使其固相化。

弃去抗原溶液，将板用含有0.1％tween20的Tris缓冲液生理盐水(以下记作洗涤缓冲液)清洗3次后，以50μL/孔添加应用分析稀释液稀释后的免疫血清样品(终浓度100、1000、10000倍稀释)、小鼠血清样品(终浓度100、1000、10000倍稀释)、作为阳性对照的抗c-ErbB3小鼠单克隆抗体(Ab-4)(Calbiochem公司制造，目录号OP119)(终浓度1～1000ng／mL)及作为阴性对照的小鼠IgGlκ同种型对照(SouthernBiotech公司制造，目录号010201)(终浓度1～1000ng/mL)。添加一次抗体后，在室温下孵育30分钟。

用洗涤缓冲液清洗3次后，向各孔内加入50pL用分析稀释液稀释后的HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体(southern biotech公司制造，目录号1030—05)、HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体(CALTAG公司制造，目录号M30107)及HRP标记山羊抗小鼠IgM抗体(southern biotech公司制造，目录号1020-05)，在室温下反应30分钟。

用洗涤缓冲液清洗4次后，向各孔内加入50μL的3，3’，5，5’一四甲基联苯胺(TMB)显色底物液(DAKO公司制造)，在暗处在室温下孵育，使其显色(约3分钟)。观察显色的进行情况的同时加入0.5M硫酸(50pL／孔)，使反应停止。

使用酶标仪(MTP-300；コロナ电气公司制造)测定波长450nm(参考波长570nm)下的吸光度。作为结合ELISA的结果，将各克隆对各种抗原的反应性示于表1中。

表1

克隆名称	herbB3	merbB3	hD1／mD234	hD12／ml)34	hD123／mD4	抗体的结合结构域
							1153	+	-	+	+	+	1
920104	+	-	-	-	+	3
							1126	+	-	-	-	-	4
1251l	+	+	+	+	+	N.D.*

*12511与任一抗原蛋白质均反应，因此，在本分析中未明确结合结构域。

如表1所示，可知本发明的抗人erbB3单克隆抗体1153识别erbB3胞外域的结构域1，抗人erbB3单克隆抗体920104识别结构域3，抗人erbB3单克隆抗体1126识别结构域4。另一方面，可知本发明的抗人erbB3单克隆抗体12511与人erbB3及小鼠erbB3这两者发生反应。

[实施例4]基因重组抗体的制作

1.各抗体基因的cDNA克隆与小鼠/人嵌合单克隆抗体表达载体的制作

将杂交瘤在含血清的DMEM中培养，通过离心分离(1500rpm、3分钟)收集细胞后，添加5mL的ISOGEN(注册商标)(日本基因公司制造)，按照附带的操作手册提取总RNA。以1μL的总RNA作为模板，按照SMART RACE(注册商标)cDNA扩增试剂盒(Clontech公司制造)附带的操作手册制作第一链cDNA，以制作的cDNA2.5μL作为模板，使用KOD plus(注册商标)DNA聚合酶(东洋纺织公司制造)扩增轻链可变区(以下记作VL)及重链可变区(以下记作VH)。

VL的扩增时，使用UMP(包含在SMART RACE cDNA扩增试剂盒中)和mk-RvP1(序列号31)引物，进行94℃5秒钟、72℃3分钟、5个循环的PCR，接着进行94℃5秒钟、70℃10秒钟、72℃3分钟、5个循环的反应，再进行94℃5秒钟、68℃10秒钟、72℃3分钟、25个循环的PCR。

接着，以5倍稀释的该反应液1μL作为模板，使用NUMP(包含在SMART RACE(注册商标)cDNA扩增试剂盒中)和mk-RvP2引物(序列号32)，进行94℃15秒钟、60℃30秒钟、68℃1分钟、25～30个循环的PCR。

VH的扩增时，与上述同样地进行使用试剂盒附带的UMP和mH-Rv1引物(序列号33)的PCR及使用试剂盒附带的NUMP和mH-Rv2引物(序列号34)的PCR。

将扩增得到的VH及VL的PCR产物供于2%琼脂糖凝胶电泳，利用QIAquick(注册商标)凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司制造)进行纯化。将纯化得到的PCR产物与pCR4Blunt-TOPO(注册商标)载体(Invitrogen公司制造)连接，按照附带说明书进行亚克隆。接着，使用试剂盒中含有的T3引物及T7引物进行碱基序列的确定，设计出各克隆特异性的引物。

以下示出各克隆的嵌合抗体表达载体制作步骤。另外，全部的PCR反应使用KOD plus(注册商标)DNA聚合酶(东洋纺织公司制造)进行。另外，插入表达载体后的序列分析中，重链使用SEQ4618引物(序列号35)确认，轻链使用SEQ1783引物(序列号36)确认。

(1)1153抗体表达载体的制作

以亚克隆得到的1153重链基因作为模板，使用1153Hc-SalIU(序列号37)和1153Hc-NheIL(序列号38)，进行94℃15秒钟、55℃30秒钟、68℃1分钟、30个循环的PCR。将该反应液供于2%琼脂糖凝胶电泳，使用QIAquick(注册商标)凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司制造)纯化得到约450bp的片段。

将1153VH扩增片段用限制酶SalI及NheI消化，导入到含有编码人IgG1的H链恒定区及L链恒定区的DNA片段的N5KG1-Val Lark载体(Biogen-IDEC公司制造)的SalI及NheI位点。确认插入部分的DNA序列，制作具有1153抗体的VH的DNA的N5KG1/1153H载体。

以亚克隆得到的1153轻链基因作为模板，使用1153Lc-BglII引物(序列号39)和1153Lc-BsiWI引物(序列号40)进行与VH同样的PCR反应，纯化得到约400bp的片段。将提取的1153VL扩增片段用限制酶BglII及BsiWI消化，并插入N5KG1/1153VH载体的BglII及BsiWI中。确认插入部分的DNA序列，制作含有1153抗体VH及VL的DNA的N5KG1/1153表达载体。

(2)920104抗体表达载体的制作

对于920104抗体表达载体，使用VH扩增用的920104Hc-SalIU引物(序列号41)和920104Hc-NheIL引物(序列号42)，使用VL扩增用的920104Lc-BglII引物(序列号43)和920104Lc-BsiWI引物(序列号44)，除此以外，与1-(1)同样地进行，制作具有920104抗体的VH及VL的DNA的N5KG1/920104表达载体。

(3)1126抗体表达载体的制作

对于1126抗体表达载体，使用VH扩增用的1126Hc-SalIU引物(序列号45)和1126Hc-NheIL引物(序列号46)，使用VL扩增用的1126Lc-PmeIU引物(序列号47)和1126Lc-BsiWI引物(序列号48)，使用PmeI作为VL的限制酶，除此以外，与1-(1)同样地进行，制作含有1126抗体的VH及VL的DNA的N5KG1/1126表达载体。

(4)12511抗体表达载体的制作

对于12511抗体表达载体，使用VH扩增用的12511Hc-SalIU引物(序列号49)和12511Hc-NheIL引物(序列号50)，使用VL扩增用的12511Lc-BglIIU引物(序列号51)和12511Lc-BsiWI引物(序列号52)，除此以外，与上述1-(1)同样地进行，制作含有12511抗体的VH及VL的DNA的N5KG1/12511表达载体。

将以上(1)～(4)中记载的抗体表达载体中含有的DNA的碱基序列、由该碱基序列编码的氨基酸序列及抗体的氨基酸序列示于以下。

将编码1153抗体的VH及VL的DNA的碱基序列示于序列号53及序列号55中，将由该碱基序列编码的氨基酸序列示于序列号54及56中。另外，将分泌的1153抗体的VH及VL的氨基酸序列示于序列号57及58中。此外，将VH的CDR1～3及VL的CDR1～3的氨基酸序列分别示于序列号59～61及序列号62～64中。

将编码920104抗体的VH及VL的DNA的碱基序列示于序列号65及序列号67中，将由该碱基序列编码的氨基酸序列示于序列号66及68中。另外，将分泌的920104抗体的VH及VL的氨基酸序列示于序列号69及70中。此外，将VH的CDR1～3及VL的CDR1～3的氨基酸序列分别示于序列号71～73及序列号74～76中。

将编码1126抗体的VH及VL的DNA的碱基序列示于序列号77及序列号79中，将由该碱基序列编码的氨基酸序列示于序列号78及80中。另外，将分泌的1126抗体的VH及VL的氨基酸序列示于序列号81及82中此外，将VH的CDR1～3及VL的CDR1～3的氨基酸序列分别示于序列号83～85及序列号86～88中。

将编码12511抗体的VH及VL的DNA的碱基序列示于序列号89及序列号91中，将由该碱基序列编码的氨基酸序列示于序列号90及92中。另外，将分泌的12511抗体的VH及VL的氨基酸序列示于序列号93及94中。此外，将VH的CDR1～3及VL的CDR1～3的氨基酸序列分别示于序列号95～97及序列号98～100中。

(5)对照抗体表达载体的制作

作为阳性对照抗体，使用国际公开第2007/077028号(专利文献3)中记载的抗人erbB3人抗体U1-59。抗人erbB3人抗体U1-59的表达载体通过全合成编码国际公开第2007/077028号(专利文献3)中记载的序列号70及72所示的氨基酸序列的cDNA(Takarabio公司)并组入N5KG1表达载体(Biogen-IDEC公司制造)中来制作。

作为阴性对照抗体的抗二硝基苯肼(DNP)抗体使用Motoki K et.al.,Clin.Cancer Res.11,3126-3135,2005中记载的抗体。

2.基因重组抗体的表达与纯化

将上述实施例4-1.中制作的基因重组抗体表达载体分别使用FreeStyle293(注册商标)表达试剂盒(Invitrogen公司)按照附带说明书导入FreeStyle293F细胞中，进行数天的培养。获得的上清供于0.2μm的过滤器(密理博公司制造)，将FreeStyle293细胞等夹杂物除去。

接着，将过滤器处理后的培养上清添加到蛋白A树脂(MabSelect(注册商标)，安玛西亚公司制造)上，进行基因重组抗体的亲和纯化。使用磷酸缓冲液作为清洗液，使用20mM柠檬酸钠缓冲液(pH3)作为洗脱缓冲液。

洗脱组分通过添加50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)而调节至pH6.0附近。制备的抗体溶液使用透析膜(截留分子量10000，SpectrumLaboratories公司制造)置换成磷酸缓冲液，用孔径0.22μm的膜滤器MILLEX-GV(密理博公司制造)过滤灭菌，制作纯化的抗人erbB3基因重组抗体。纯化抗体的浓度通过测定280nm的吸光度，以1.45最适密度作为1mg/mL进行计算。

[实施例5]抗erbB3抗体对依赖于调蛋白的erbB3的磷酸化抑制效果

将5×10⁴个的人鳞状细胞癌细胞系A431在含10%FBS的RPMI1640培养基(Invitrogen公司制造)(以下记作含血清RPMI)中悬浮，以1mL/孔接种到24孔板中，在37℃、6.5%CO₂的培养条件下培养过夜。

除去培养上清，用无血清RPMI1640培养基(Invitrogen公司制造)(以下记作RPMI)清洗1次后，以1mL/孔添加RPMI，培养过夜。除去培养上清，用RPMI清洗1次后，以250μL/孔添加用RPMI制备成50μg/mL的各抗体，在37℃、6.5%CO₂的条件下将细胞培养30分钟。

接着，分别以250μL/孔添加用RPMI稀释的200ng/mLNRG1-α/HRG1-αEGF结构域(R&D公司制造，296-HR-050/CF)或40ng/mL NRG1-β1/HRG1-β1胞外域(R&D公司制造，377-HB-050/CF)，在37℃、6.5%CO₂的条件下培养10分钟。

培养后，在冰上除去上清，用RPMI清洗1次后，以100μL/孔添加Takara39000泳道标记物还原型上样缓冲液(Takarabio公司制造)，将细胞回收。接着，使DNA破碎，在95℃加热5分钟而制成蛋白免疫印迹的样品。

接着，在30mA/凝胶、60分钟的条件下进行SDS-PAGE，在30mA/凝胶、90分钟的条件下转印到PVDF膜上。对于转印后的PVDF膜，在检测erbB3、磷酸化erbB3及Akt时使用Block Ace(注册商标)(大日本住友制药公司制造)作为封闭缓冲液，在检测磷酸化Akt时使用含有5%BSA及0.1%tween20的Tris缓冲液生理盐水(以下记作5%BSA-tTBS)作为封闭缓冲液，分别在室温下进行1小时的封闭。

除去封闭缓冲液后，添加用5%BSA-tTBS制备的抗erbB3抗体(Santa Cruz Biotechnology公司)、抗磷酸化erbB3抗体(cell signalingtechnology公司制造)、抗AKT抗体(cell signaling公司)及抗磷酸化AKT抗体(Promega公司)，在4℃下孵育过夜。

用含有0.1%tween20的Tris缓冲液生理盐水(以下记作TTBS)对PVDF膜进行清洗后，用抗兔免疫球蛋白山羊多克隆抗体/HRP(DAKO公司制造)在室温下孵育1小时孵育。用TTBS清洗PVDF膜，使ECL(注册商标)Plus蛋白免疫印迹检测试剂(Amhersham Pharmacia公司制造)进行反应，使用发光图像分析仪(LAS-1000富士胶片)检测荧光。

结果，如图1所示，调蛋白α及β均诱导了人鳞状细胞癌细胞系A431细胞的erbB3的磷酸化及下游信号Akt的磷酸化。另外，抗人erbB3人抗体U1-59及本发明的抗人erbB3基因重组抗体均抑制了依赖于调蛋白α及β的erbB3的磷酸化，并且还抑制了下游信号Akt的磷酸化。

[实施例6]抗erbB3抗体对依赖于双调蛋白、β细胞素、表皮调节素、TGF-α、EGF及HB-EGF的erbB3的磷酸化抑制

与实施例5同样地进行人鳞状细胞癌细胞系A431的预处理，接着添加各配体。分别以250μL/孔向培养基中添加用无血清RPMI稀释的100ng/mL双调蛋白(R&D262-AR/CF)、100ng/mLβ细胞素(R&D261-CE/CF)、100ng/mL表皮调节素(R&D1195-EP/CF)、200ng/mLHB-EGF(R&D259-HE/CF)及200ng/mL TGF-α(R&D239-A)，在37℃、6.5%CO₂的条件下培养10分钟。之后，与实施例5同样地分析总erbB3蛋白量和磷酸化erbB3蛋白量。

结果，如图2所示，作为调蛋白以外的EGF样配体的双调蛋白、β细胞素、表皮调节素、TGF-α、EGF及HB-EGF中任何一种配体均使人鳞状细胞癌细胞系A431的erbB3磷酸化。

抗人erbB3人抗体U1-59及本发明的抗人erbB3基因重组抗体1153、920104、1126及12511均抑制了所有依赖于EGF样配体的erbB3的磷酸化。特别是本发明的抗人erbB3基因重组抗体1126最强地抑制了所有依赖于配体的erbB3的磷酸化。

[实施例7]抗erbB3抗体对依赖于表皮调节素、TGF-α、HB-EGF及调蛋白的erbB3的磷酸化抑制

将1×10⁵个的人乳腺癌细胞系T47D在含血清RPMI中悬浮，以1mL/孔接种到24孔板中，在37℃、6.5%CO₂的培养条件下培养过夜。除去培养上清，用RPMI清洗1次后，以1mL/孔添加RPMI，培养过夜。除去培养上清，用RPMI清洗1次后，以250μL/孔添加用RPMI制备成50μg/mL的各抗人erb3抗体，在37℃、6.5%CO₂的条件下将细胞培养30分钟。

接着，分别以250μL/孔添加用RPMI稀释的40ng/mLNRG1-β1/HRG1-β1胞外域(R&D公司制造，377-HB/CF)、100ng/mL表皮调节素(R&D公司制造，1195-EP/CF)、200ng/mL HB-EGF(R&D公司制造，259-HE/CF)及200ng/mL TGF-α(R&D公司制造，239-A)，在37℃、6.5%CO₂的条件下培养10分钟。

培养后，在冰上除去上清，用RPMI清洗1次后，以100μL/孔添加Takara39000泳道标记物还原型上样缓冲液(Takarabio公司制造)，将细胞回收。接着，使DNA破碎，在95℃加热5分钟而制成蛋白免疫印迹的样品。之后，与实施例5同样地分析总erbB3蛋白量和磷酸化erbB3蛋白量。

结果，如图3所示，与阴性对照抗体相比，本发明的抗人erbB3基因重组抗体1126抗体抑制了人乳腺癌细胞T47D的依赖于表皮调节素、TGF-α、HB-EGF及HRG1β的erbB3的磷酸化。另外，与阳性对照抗体相比，本发明的抗人erbB3基因重组抗体1126抗体对人乳腺癌细胞T47D的依赖于TGF-α及HB-EGF的erbB3的磷酸化的抑制效果更高。

另外，与阳性对照抗体(U1-59)相比，本发明的抗人erbB3基因重组抗体12511完全地抑制了人乳腺癌细胞T47D中的依赖于HRG1β及HB-EGF的erbB3的磷酸化。

此外，与阳性对照抗体(U1-59)相比，本发明的抗人erbB3基因重组抗体920104对人乳腺癌细胞T47D中的依赖于TGF-α及HB-EGF的erbB3的磷酸化的抑制效果更高。

另外，与阴性对照抗体相比，本发明的抗人erbB3基因重组抗体1153抑制了人乳腺癌细胞T47D中的依赖于TGF-α的erbB3的磷酸化。

[实施例8]抗erbB3抗体的体内药效评价

购入6周的BALB/cA Jcl-nu/nu雌性(日本クレア公司)，进行1周的预饲养。使用RPMI将使用10%RPMI培养基在37℃、6.5%CO₂条件下培养的人乳腺癌细胞系T47D制备成1×10⁸细胞/mL的细胞悬浮液。

将制备的细胞悬浮液以100μL/只皮下移植到72只小鼠个体中。确认T47D在小鼠体内植活，在肿瘤体积(长径×短径×短径/2)达到50mm³～100mm³的时刻以肿瘤体积的平均值等同的方式选择小鼠，6个体/1组，共计分成6组。

从分组时刻起，以200μL/只对小鼠腹腔内开始施用以PBS稀释的1mg/mL抗人erbB3基因重组抗体1153、12511、920104、1126、1mg/mL抗人erbB3人抗体U1-59及作为阴性对照的抗DNP抗体，2次/周，共计进行8次。

结果，如图4所示，与作为对照的抗DNP抗体相比，抗人erbB3人抗体U1-59及抗人erbB3基因重组抗体均抑制了人乳腺癌细胞系T47D的肿瘤增殖。

[实施例9]使用多种抗erbB3抗体的体内药效评价

与实施例8同样地准备皮下移植了人乳腺癌细胞系T47D的xenograft小鼠或皮下移植了人鳞状细胞癌细胞系A431的xenograft小鼠，在肿瘤块达到100mm³～200mm³的时刻以肿瘤体积的平均值等同的方式选择小鼠，6个体/1组，共计分成4组。

使用PBS制备2mg/mL抗人erbB3基因重组抗体1153、12511、1126及抗DNP抗体溶液。将1153抗体、12511抗体及1126抗体溶液分别以1:1混合，制备1153+12511联用抗体溶液(1153抗体及12511抗体的联用抗体溶液)、1153+1126联用抗体溶液(1153抗体及1126抗体的联用抗体溶液)及12511+1126联用抗体溶液(12511抗体及1126抗体的联用抗体溶液)。从分组时刻起，将抗体以100μL/只通过腹腔内给药进行给药，2次/周，共计进行10次。

结果，如图5所示，与作为对照的抗DNP抗体相比，抗人erbB3基因重组抗体1153及1126抑制了人乳腺癌细胞T47D的肿瘤增殖。另外，与单独施用1153抗体或1126抗体相比，1153抗体及1126抗体的联合给药更强力地抑制了肿瘤增殖。

此外，如图6所示，与作为对照的抗DNP抗体相比，1153抗体及12511抗体的联用、12511抗体及1126抗体的联用以及1153抗体及1126抗体的联用中的任何一种抗体联用均抑制了人鳞状细胞癌细胞A431的细胞增殖。另外，与1153抗体及12511抗体的联合给药相比，12511抗体及1126抗体的联用以及1153抗体及1126抗体的联合给药更强力地抑制了肿瘤增殖。

由以上的结果可知，识别erbB3的胞外域的结构域4的抗体1126和与结构域4以外的erbB3胞外域结合的抗体1153或12511的联合给药使抗肿瘤活性增强。

本申请为2006年度独立行政法人新能源产业技术综合开发机构“新功能抗体创制技术开发项目”“新功能抗体创制技术开发/系统性高特异性抗体创制技术的开发/寡克隆抗体创制技术开发”委托研究，为适用产业技术力强化法第19条的专利申请。

使用特定的实施方式详细地说明了本发明，在不脱离本发明的意图和范围的情况下可以进行各种变更及变形，这对本领域技术人员来说是显而易见的。另外，本申请基于2011年6月20日提出的美国临时申请(61/498732号)，其全部内容以引用的方式援引到本说明书中。

序列表自由文本

序列号3：人erbB3胞外域的氨基酸序列

序列号6：小鼠erbB3胞外域的氨基酸序列

序列号7：rherbB3引物1的碱基序列

序列号8：rherbB3引物2的碱基序列

序列号9：rherbB3-GST引物1的碱基序列

序列号10：rherbB3-GST引物2的碱基序列

序列号11：小鼠erbB3-GST引物1的碱基序列

序列号12：小鼠erbB3-GST引物2的碱基序列

序列号13：hD1/mD234引物1的碱基序列

序列号14：hD1/mD234引物2的碱基序列

序列号15：hD1/mD234引物3的碱基序列

序列号16：hD1/mD234引物4的碱基序列

序列号17：hD1/mD234引物5的碱基序列

序列号18：hD1/mD234引物6的碱基序列

序列号19：hD12/mD34引物1的碱基序列

序列号20：hD12/mD34引物2的碱基序列

序列号21：hD12/mD34引物3的碱基序列

序列号22：hD12/mD34引物4的碱基序列

序列号23：hD12/mD34引物5的碱基序列

序列号24：hD12/mD34引物6的碱基序列

序列号25：hD123/mD4引物1的碱基序列

序列号26：hD123/mD4引物2的碱基序列

序列号27：hD123/mD4引物3的碱基序列

序列号28：hD123/mD4引物4的碱基序列

序列号29：hD123/mD4引物5的碱基序列

序列号30：hD123/mD4引物6的碱基序列

序列号31：mkRvP1引物的碱基序列

序列号32：mkRvP2引物的碱基序列

序列号33：mH-Rv1引物的碱基序列

序列号34：mH-Rv2引物的碱基序列

序列号35：SEQ4618引物的碱基序列

序列号36：SEQ1783引物的碱基序列

序列号37：1153Hc-SalIU引物的碱基序列

序列号38：1153Hc-NheIL引物的碱基序列

序列号39：1153Lc-BglII引物的碱基序列

序列号40：1153Lc-BsiWI引物的碱基序列

序列号41：920104Hc-SalIU引物的碱基序列

序列号42：920104Hc-NheIL引物的碱基序列

序列号43：920104Lc-BglII引物的碱基序列

序列号44：920104Lc-BsiWI引物的碱基序列

序列号45：1126Hc-SalIU引物的碱基序列

序列号46：1126Hc-NheIL引物的碱基序列

序列号47：1126Lc-PmeIU引物的碱基序列

序列号48：1126Lc-BsiWI引物的碱基序列

序列号49：12511Hc-SalIU引物的碱基序列

序列号50：12511Hc-NheIL引物的碱基序列

序列号51：12511Lc-BglII引物的碱基序列

序列号52：12511Lc-BsiWI引物的碱基序列

Claims (16)

1.一种抗体及该抗体片段，其与erbB3的胞外域特异性结合且抑制依赖于表皮生长因子(EGF)样配体的erbB3的磷酸化。

2.一种抗体，其与erbB3的胞外域特异性结合且抑制依赖于erbB3特异性配体的erbB3的磷酸化及不依赖于erbB3特异性配体的erbB3的磷酸化这两种磷酸化。

3.如权利要求1或2所述的抗体及该抗体片段，其中，erbB3的磷酸化为依赖于选自表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGF-α)、双调蛋白、β细胞素、表皮调节素、肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)及调蛋白中的至少两种配体的erbB3的磷酸化。

4.如权利要求1～3中任一项所述的抗体及该抗体片段，其中，erbB3的胞外域为包含选自由序列号3所示的氨基酸序列的第20位至第179位氨基酸序列构成的结构域1、由序列号3所示的氨基酸序列的第180位至第328位氨基酸序列构成的结构域2、由序列号3所示的氨基酸序列的第329位至第487位氨基酸序列构成的结构域3及由序列号3所示的氨基酸序列的第488位至第643位氨基酸序列构成的结构域4中的至少一个结构域的胞外域。

5.如权利要求1～4中任一项所述的抗体及该抗体片段，其中，抗体为选自下述(a)～(c)中的抗体，

(a)与选自1153抗体克隆、12511抗体克隆、920104抗体克隆及1126抗体克隆中的任何一个抗体克隆发生竞争反应的抗体及该抗体片段，

(b)与如下表位反应的抗体及该抗体片段，所述表位包含与选自1153抗体克隆、12511抗体克隆、920104抗体克隆及1126抗体克隆中的任何一个抗体克隆反应的表位，

(c)与如下表位反应的抗体及该抗体片段，所述表位和与选自1153抗体克隆、12511抗体克隆、920104抗体克隆及1126抗体克隆中的任何一个抗体克隆反应的表位相同。

6.如权利要求1～5中任一项所述的抗体及该抗体片段，其中，抗体为选自包含含有序列号57所示的氨基酸序列的抗体重链可变区及含有序列号58所示的氨基酸序列的抗体轻链可变区的抗体、包含含有序列号69所示的氨基酸序列的抗体重链可变区及含有序列号70所示的氨基酸序列的抗体轻链可变区的抗体、包含含有序列号81所示的氨基酸序列的抗体重链可变区及含有序列号82所示的氨基酸序列的抗体轻链可变区的抗体、以及包含含有序列号93所示的氨基酸序列的抗体重链可变区及含有序列号94所示的氨基酸序列的抗体轻链可变区的抗体中的任何一种抗体。

7.一种编码权利要求1～6中任一项所述的抗体及该抗体片段的DNA。

8.一种制造权利要求1～6中任一项所述的抗体及该抗体片段的方法，其特征在于，在培养基内培养将包含权利要求7所述的DNA的载体导入细胞而得到的转化体，使权利要求1～6中任一项所述的抗体及该抗体片段在培养液中生成并蓄积，并从培养液纯化抗体及该抗体片段。

9.一种抗体组合物，其包含：

第一抗体或该抗体片段，其与erbB3的胞外域的选自由序列号3所示的氨基酸序列的第20位至第179位氨基酸序列构成的结构域1、由序列号3所示的氨基酸序列的第180位至第328位氨基酸序列构成的结构域2、由序列号3所示的氨基酸序列的第329位至第487位氨基酸序列构成的结构域3及由序列号3所示的氨基酸序列的第488位至第643位氨基酸序列构成的结构域4中的至少一个结构域反应；以及

第二抗体或该抗体片段，其与不同于与第一抗体反应的结构域的结构域反应。

10.如权利要求9所述的抗体组合物，其中，第一抗体或该抗体片段为与erbB3的胞外域的结构域2或结构域4反应的抗体或该抗体片段。

11.如权利要求9或10所述的抗体组合物，其中，第二抗体或该抗体片段为与erbB3的胞外域的结构域1或结构域3反应的抗体或该抗体片段。

12.如权利要求9～11中任一项所述的抗体组合物，其中，第一抗体或该抗体片段为选自下述(a)～(c)中的抗体或该抗体片段，

(a)与1126抗体克隆发生竞争反应的抗体及该抗体片段，

(b)与如下表位反应的抗体及该抗体片段，所述表位包含与1126抗体克隆反应的表位，

(c)与如下表位反应的抗体及该抗体片段，所述表位和与1126抗体克隆反应的表位相同。

13.如权利要求9～12中任一项所述的抗体组合物，其中，第二抗体或该抗体片段为选自下述(a)～(c)中的抗体或该抗体片段，

(a)与1153抗体克隆发生竞争反应的抗体及该抗体片段，

(b)与如下表位反应的抗体及该抗体片段，所述表位包含与1153抗体克隆反应的表位，

(c)与如下表位反应的抗体及该抗体片段，所述表位和与1153抗体克隆反应的表位相同。

14.一种erbB3表达细胞相关疾病的治疗方法，其使用权利要求9～13中任一项所述的抗体组合物。

15.如权利要求14所述的治疗方法，其中，_erbB3表达细胞相关疾病为癌症。

16.一种erbB3表达细胞相关疾病的治疗药，其含有权利要求9～13中任一项所述的抗体组合物。

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