KR101812348B1 - 단백질의 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 목적 단백질을 코딩하는 DNA 및 선택 마커 유전자를 포함하는 유전자 단편의 양단에 트랜스포존 서열을 포함하는 단백질 발현 벡터를 부유성의 포유 동물 세포에 도입하고, 한쌍의 트랜스포존 서열 사이에 삽입된 상기 유전자 단편을 상기 포유 동물 세포의 염색체에 조립하여 상기 목적 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 얻고, 상기 포유 동물 세포를 부유 배양하여 상기 목적 단백질을 생산하는 방법, 및 목적 단백질을 발현하는 부유성의 포유 동물 세포에 관한 것이다.

Description

단백질의 생산 방법{PROCESS FOR PRODUCTION OF PROTEIN}
본 발명은, 목적 단백질을 코딩하는 DNA 및 선택 마커 유전자를 포함하는 유전자 단편의 양단에 트랜스포존 서열을 포함하는 단백질 발현 벡터를 부유성의 포유 동물 세포에 도입하고, 한쌍의 트랜스포존 서열 사이에 삽입된 상기 유전자 단편을 상기 포유 동물 세포의 염색체에 조립하여 상기 목적 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 얻고, 상기 포유 동물 세포를 부유 배양하여 상기 목적 단백질을 생산하는 방법, 및 목적 단백질을 발현하는 부유성의 포유 동물 세포에 관한 것이다.
유전자 재조합 기술에 의한 외래 단백질의 생산은, 의약품 및 식품 업계 등 다양한 산업에 이용되고 있다. 대부분의 경우 재조합 단백질의 생산은, 목적 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 발현 벡터를 대장균, 효모, 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포 등의 숙주에 도입하고, 상기 발현 벡터가 염색체에 조립된 형질 전환주를 선택하고, 상기 세포주를 적절한 배양 조건으로 배양하여 목적 단백질을 발현시킴으로써 행해지고 있다.
그러나, 외래 단백질을 효율적으로 생산할 수 있는 숙주를 개발하기 위해서는, 목적으로 하는 단백질마다 생산성이 양호한 숙주 세포를 선정하는 것이 필요하며, 개개의 숙주에서의 외래 단백질 생산 기술에 있어서 한층 더 기술 혁신이 요망되고 있다.
대장균 등의 세균 및 효모의 계에서는 동물 세포와는 달리 당쇄 수식 등 번역 후 수식이 곤란한 경우가 많아, 활성을 갖는 단백질을 생산함에 있어서 문제가 된다.
곤충 세포의 계는 생산된 단백질이 인산화, 당쇄의 부가 등 번역 후 수식되어, 본래의 생리 활성을 유지한 채로 발현시킬 수 있다는 이점을 갖는다. 그러나, 분비 단백질의 당쇄 구조는 포유류에서 유래하는 세포의 것과는 상이하기 때문에, 의약품 용도로 하기 위해서는 항원성 등이 문제가 된다.
또한, 곤충 세포의 계는 외래 유전자의 도입에 재조합 바이러스를 사용하기 때문에, 안전성의 면에서 그의 불활성화나 봉쇄가 필요하다는 과제가 있다.
동물 세포의 계에서는, 인간을 비롯한 고등 동물 유래의 단백질에 대하여 인산화, 당쇄 부가 및 폴딩(folding) 등의 번역 후 수식을 생체에서 제조되는 것과 보다 동일하게 실시하는 것이 가능하다. 이 정확한 번역 후 수식은, 단백질이 본래 갖는 생리 활성을 재조합 단백질로 재현하기 위해 필요한 것이며, 그와 같은 생리 활성이 필요로 되는 의약품 등에는 포유 동물 세포를 숙주로 한 단백질 생산계가 이용되고 있다.
그러나, 동물 세포를 숙주로 한 단백질 발현계의 생산성은 일반적으로 낮고, 도입 유전자의 안정성에도 문제가 있는 경우가 많다. 포유 동물 배양 세포를 숙주로 한 단백질의 생산성 향상은, 치료용 의약품이나 진단약 등의 제조에 있어서 매우 중요할 뿐만 아니라, 이들의 개발 연구에도 많이 기여하고 있다. 그 때문에, 포유 동물 배양 세포, 특히 차이니즈ㆍ햄스터 난소 세포(CHO 세포)를 숙주로 하여 용이하게 고생산주의 획득을 가능하게 하는 유전자 발현계의 개발은 급선무가 되었다.
트랜스포존은, 염색체의 하나의 유전자좌로부터 별도의 유전자좌로 이동할 수 있는 전위성 유전 요소이다. 트랜스포존은, 분자 생물학이나 유전학의 연구에 있어서 강력한 툴이며, 곤충이나 선충(예를 들면, 노랑초파리(Drosophila melanogaster) 또는 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)) 및 식물에서 변이 도입, 유전자 트래핑 및 트랜스제닉 개체의 제작 등의 목적으로서 이용되고 있다. 그러나, 이러한 기술은, 포유 동물 세포를 포함하는 척추 동물에서는 개발이 지연되었다.
그러나, 최근, 척추 동물에서도 활성이 있는 트랜스포존이 보고되었으며, 그 중 몇 개가 마우스나 인간 등의 포유 동물 세포에서도 활성을 갖는다는 것이 확인되었다. 대표적인 것으로, 송사리로부터 클로닝된 트랜스포존 Tol1(특허문헌 1), Tol2(비특허문헌 1), 연어과 어류 게놈에 존재하고 있었던 비자율성의 트랜스포존으로부터 재구축된 Sleeping Beauty(비특허문헌 2), 개구리 유래의 인공 트랜스포존 Frog prince(비특허문헌 3) 및 곤충 유래의 트랜스포존 piggyBac(비특허문헌 4)을 들 수 있다.
이들 DNA 트랜스포존은, 포유 동물 세포의 게놈에 새로운 표현계를 도입하기 위한 유전자 도입 툴로서, 변이 도입, 유전자 트래핑, 트랜스제닉 개체의 제작 및 약제 내성 단백질을 발현시키는 것 등에 이용되게 되었다(비특허문헌 5 내지 12).
곤충에서는, 나비목 곤충 유래의 트랜스포존 piggyBac을 이용하여 외래 유전자를 누에 염색체에 도입하고, 상기 외래 유전자가 코딩하는 단백질을 발현시키는 방법이 연구되었으며, 이 기술을 이용한 단백질 생산 방법이 개시되어 있다(특허문헌 2).
그러나, 발현시킨 목적 단백질의 발현량이 충분하지 않고, 누에 전신에 생산되기 때문에, 대량의 협잡 단백질이 존재하는 체액으로부터 발현시킨 외래 단백질을 고순도인 형태로 회수하기 위해서는 고도의 정제 기술을 필요로 한다는 점에서 경제적으로 문제가 있었다.
또한, 송사리 유래 Tol2 트랜스포존을 사용하여, 포유 동물 세포에 G418 내성에 관계된 단백질을 발현시킨 예가 알려져 있다(비특허문헌 12).
국제 공개 제2008/072540호 일본 특허 공표 제2001-532188호 공보
Nature 383, 30(1996) Cell 91, 501-510(1997) Nucleic Acids Res, 31, 6873-6881(2003) Insect Mol. Biol. 5, 141-151(1996) Genetics. 166, 895-899(2004) PLoS Genet, 2, e169(2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 10769-10773(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6759-6764(2001) Nature 436, 221-226(2005) Nucleic Acids Res, 31, 6873-6881(2003) Nucleic Acids Res. 35, e87(2007) Proc Natl Acad Sci USA, 103, 15008-15013(2006)
목적 단백질을 생산, 해석하기 위해서는, 포유 동물 유래의 배양 세포를 사용하여 목적 단백질을 안정적으로 고발현하는 세포주를 선택해야만 하지만, 목적 단백질을 생산하는 세포의 제작 및 배양에는 많은 노동력과 시간을 요한다.
또한, 지금까지 트랜스포존 서열을 이용하여 포유 동물 세포에서 목적 단백질의 발현을 행하는 것은 알려져 있었지만, 트랜스포존 서열을 사용함으로써 단백질의 생산계로서 이용할 수 있는 목적 단백질을 고발현하는 세포를 제작하는 것, 트랜스포존 서열을 사용한 목적 단백질을 고생산하는 포유 동물 세포의 제작 방법 및 상기 세포를 사용한 단백질의 생산 방법에 대해서는 전혀 알려져 있지 않다.
상기한 바와 같이 포유 동물 배양 세포를 사용하여 목적 단백질을 고발현하는 단백질 생산계를 효율적이면서도 단기간에 제작하고, 목적 단백질을 고생산하는 것이 종래 요구되고 있었다. 따라서, 본 발명은, 효율적으로 제작할 수 있는 목적 단백질을 고발현하는 세포 및 상기 세포를 사용하여 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 상술한 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 목적 단백질을 코딩하는 DNA 및 선택 마커 유전자를 포함하는 유전자 단편의 양단에 트랜스포존 서열을 포함하는 단백질 발현 벡터를 부유성의 포유 동물 세포에 도입하고, 한쌍(2개)의 트랜스포존 서열 사이에 삽입된 상기 유전자 단편을 상기 포유 동물 세포의 염색체에 조립함으로써, 상기 목적 단백질을 고발현하는 포유 동물 세포를 효율적으로 제작할 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 당해 세포를 사용함으로써 목적 단백질을 고효율로 생산할 수 있다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
[1] 목적 단백질을 코딩하는 DNA 및 선택 마커 유전자를 포함하는 유전자 단편의 양단에 트랜스포존 서열을 포함하는 단백질 발현 벡터를 부유성의 포유 동물 세포에 도입하고, 한쌍의 트랜스포존 서열 사이에 삽입된 상기 유전자 단편을 상기 포유 동물 세포의 염색체에 조립하여 상기 목적 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 얻고, 상기 포유 동물 세포를 부유 배양하여 상기 목적 단백질을 생산하는 방법.
[2] 이하의 공정 (A) 내지 (C)를 포함하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 생산 방법.
(A) 이하의 발현 벡터 (a) 및 (b)를 부유성의 포유 동물 세포에 동시에 도입하는 공정
(a) 목적 단백질을 코딩하는 DNA와 선택 마커 유전자를 포함하는 유전자 단편의 양단에 트랜스포존 서열을 포함하는 발현 벡터
(b) 트랜스포존 서열을 인식하여, 한쌍의 트랜스포존 서열 사이에 삽입된 유전자 단편을 염색체에 전이시키는 활성을 갖는 트랜스포사제를 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터
(B) 공정 (A)에서 도입한 발현 벡터 (b)에 의해 트랜스포사제를 일과성 발현시켜, 한쌍의 트랜스포존 서열 사이에 삽입된 상기 유전자 단편을 상기 포유 동물 세포의 염색체에 조립하고, 목적 단백질을 발현하는 부유성의 포유 동물 세포를 얻는 공정
(C) 공정 (B)에서 얻어진 목적 단백질을 발현하는 부유성의 포유 동물 세포를 부유 배양하여, 목적 단백질을 생산하는 공정
[3] 목적 단백질을 코딩하는 DNA 및 선택 마커 유전자를 포함하는 유전자 단편의 양단에 트랜스포존 서열을 포함하는 단백질 발현 벡터를 부유성의 포유 동물 세포에 도입하고, 한쌍의 트랜스포존 서열 사이에 삽입된 상기 유전자 단편을 상기 포유 동물 세포의 염색체에 조립하여 상기 목적 단백질을 발현하는 부유성의 포유 동물 세포를 얻는 방법.
[4] 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 부유성의 포유 동물 세포가 무혈청 배양에서 생존 및 증식 가능한 세포인 방법.
[5] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서, 부유성의 포유 동물 세포가 CHO 세포를 부유 배양에 순화한 부유성의 CHO 세포, PER.C6 세포, 래트 미엘로마 세포 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(또는 YB2/0이라고도 함) 및 부유 배양에 순화한 부유성의 마우스 미엘로마 세포 NS0로부터 선택되는 적어도 하나인 방법.
[6] 상기 [5]에 있어서, CHO 세포가 CHO-K1, CHO-K1SV, DUKXB11, CHO/DG44, Pro-3 및 CHO-S로부터 선택되는 적어도 하나인 방법.
[7] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 있어서, 선택 마커 유전자가 시클로헥시미드 내성 유전자인 방법.
[8] 상기 [7]에 있어서, 시클로헥시미드 내성 유전자가 인간 리보솜 단백질 L36a의 변이체를 코딩하는 유전자인 방법.
[9] 상기 [8]에 있어서, 변이체가 인간 리보솜 단백질 L36a의 54 위치의 프롤린이 다른 아미노산으로 치환된 변이체인 방법.
[10] 상기 [9]에 있어서, 다른 아미노산이 글루타민인 방법.
[11] 상기 [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 있어서, 한쌍의 트랜스포존 서열이 포유 동물 세포에서 기능하는 한쌍의 DNA형 트랜스포존 유래의 염기 서열인 방법.
[12] 상기 [11]에 있어서, 한쌍의 DNA형 트랜스포존 유래의 염기 서열이 한쌍의 Tol1 트랜스포존 유래의 염기 서열 또는 Tol2 트랜스포존 유래의 염기 서열인 방법.
[13] 상기 [12]에 있어서, 한쌍의 Tol2 트랜스포존 유래의 염기 서열이 서열 번호 2로 표시되는 염기 서열을 포함하는 염기 서열 및 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열인 방법.
[14] 상기 [12]에 있어서, 한쌍의 Tol1 트랜스포존 유래의 염기 서열이 서열 번호 14로 표시되는 염기 서열 및 서열 번호 15로 표시되는 염기 서열인 방법.
[15] 목적 단백질을 코딩하는 DNA 및 선택 마커 유전자를 포함하는 유전자 단편의 양단에 트랜스포존 서열을 포함하는 단백질 발현 벡터가 도입되고, 한쌍의 트랜스포존 서열 사이에 삽입된 상기 유전자 단편이 염색체에 조립되어, 상기 목적 단백질을 생산하는 부유성의 포유 동물 세포.
[16] 목적 단백질을 코딩하는 DNA와 선택 마커 유전자를 포함하는 유전자 단편의 양단에 트랜스포존 서열을 포함하는 발현 벡터 (a), 및 상기 트랜스포존 서열을 인식하여, 한쌍의 트랜스포존 서열 사이에 삽입된 유전자 단편을 염색체에 전이시키는 활성을 갖는 트랜스포사제(전이 효소)를 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터 (b)를 동시에 도입시킴으로써, 상기 한쌍의 트랜스포존 서열 사이에 삽입된 상기 유전자 단편이 염색체에 조립되어, 상기 목적 단백질을 생산하는 부유성의 포유 동물 세포.
[17] 상기 [15] 또는 [16]에 있어서, 무혈청 배양에서 생존 및 증식 가능한 부유성의 포유 동물 세포인 세포.
[18] 상기 [15] 또는 [17] 중 어느 하나에 있어서, CHO 세포를 부유 배양에 순화한 부유성의 CHO 세포, PER.C6 세포, 래트 미엘로마 세포 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(또는 YB2/0이라고도 함) 및 부유 배양에 순화한 부유성의 마우스 미엘로마 세포 NS0로부터 선택되는 적어도 하나의 부유성의 포유 동물 세포인 세포.
[19] 상기 [18]에 있어서, CHO 세포가 CHO-K1, CHO-K1SV, DUKXB11, CHO/DG44, Pro-3 및 CHO-S로부터 선택되는 적어도 하나인 세포.
[20] 상기 [15] 내지 [19] 중 어느 하나에 있어서, 선택 마커 유전자가 시클로헥시미드 내성 유전자인 세포.
[21] 상기 [20]에 있어서, 시클로헥시미드 내성 유전자가 인간 리보솜 단백질 L36a의 변이체를 코딩하는 유전자인 세포.
[22] 상기 [21]에 있어서, 변이체가 인간 리보솜 단백질 L36a의 54 위치의 프롤린이 다른 아미노산으로 치환된 변이체인 세포.
[23] 상기 [22]에 있어서, 다른 아미노산이 글루타민인 세포.
[24] 상기 [15] 내지 [23] 중 어느 하나에 있어서, 한쌍의 트랜스포존 서열이 포유 동물 세포에서 기능하는 한쌍의 DNA형 트랜스포존 유래의 염기 서열인 세포.
[25] 상기 [24]에 있어서, 한쌍의 DNA형 트랜스포존 유래의 염기 서열이 한쌍의 Tol1 트랜스포존 유래의 염기 서열 또는 Tol2 트랜스포존 유래의 염기 서열인 세포.
[26] 상기 [25]에 있어서, 한쌍의 Tol2 트랜스포존 유래의 염기 서열이 서열 번호 2로 표시되는 염기 서열 및 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열인 세포.
[27] 상기 [25]에 있어서, 한쌍의 Tol1 트랜스포존 유래의 염기 서열이 서열 번호 14로 표시되는 염기 서열 및 서열 번호 15로 표시되는 염기 서열인 세포.
[28] 목적 단백질을 코딩하는 DNA 및 선택 마커 유전자를 포함하는 유전자 단편의 양단에 한쌍의 트랜스포존 서열을 포함하는 단백질 발현 벡터.
[29] 상기 [28]에 있어서, 한쌍의 트랜스포존 서열이 한쌍의 Tol1 트랜스포존 유래의 염기 서열 또는 Tol2 트랜스포존 유래의 염기 서열인 단백질 발현 벡터.
[30] 상기 [29]에 있어서, 한쌍의 Tol2 트랜스포존 유래의 염기 서열이 서열 번호 2로 표시되는 서열 및 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열인 단백질 발현 벡터.
[31] 상기 [29]에 있어서, 한쌍의 Tol1 트랜스포존 유래의 서열이 서열 번호 14로 표시되는 염기 서열 및 서열 번호 15로 표시되는 염기 서열인 단백질 발현 벡터.
본 발명의 단백질의 생산 방법에 따르면, 포유 동물 세포를 사용하여 목적 단백질을 효율적으로 생산할 수 있다. 또한, 본 발명의 세포는, 유전자 재조합 단백질을 고효율로 생산하기 위한 단백질 생산 세포로서 사용할 수 있다.
[도 1] 항인간 인플루엔자 M2 항체 발현 트랜스포존 벡터의 모식도를 나타낸다. Tol2-L은 left end Tol2 트랜스포존(서열 번호 2)을, Tol2-R은 right end Tol2 트랜스포존(서열 번호 3)을, CMV는 CMV 프로모터를, poly A는 폴리아데닐레이션 사이트를, Hc는 인간 항체 H쇄 cDNA를, Lc는 인간 항체 L쇄 cDNA를, CHX-r은 시클로헥시미드 내성 유전자를 나타낸다.
[도 2] 항인간 인플루엔자 M2 항체 발현 벡터의 모식도를 나타낸다. CMV는 CMV 프로모터를, poly A는 폴리아데닐레이션 사이트를, Hc는 인간 항체 H쇄 cDNA를, Lc는 인간 항체 L쇄 cDNA를, CHX-r은 시클로헥시미드 내성 유전자를 나타낸다.
[도 3] Tol2 트랜스포사제 발현 벡터의 모식도를 나타낸다. CAGGS는 CAGGS 프로모터를, poly A는 폴리아데닐레이션 사이트를, TPase cDNA는 Tol2 트랜스포사제 cDNA를 나타낸다.
[도 4] (A) 항인간 인플루엔자 M2 항체 발현 Tol2 트랜스포존 벡터를 사용한 경우의 부유성의 CHO-K1 세포에서의 항인간 인플루엔자 M2 항체의 발현량을 검토한 결과를 나타낸다. 종축은 항체 생산량(μg/mL), 횡축은 부유성의 CHO-K1 세포의 유전자 도입 클론 번호를 나타낸다.
(B) 항인간 인플루엔자 M2 항체 발현 Tol2 트랜스포존 벡터를 사용한 경우의 접착성의 CHO-K1 세포에서의 항인간 인플루엔자 M2 항체의 발현량을 검토한 결과를 나타낸다. 종축은 항체 생산량(μg/mL), 횡축은 접착성의 CHO-K1 세포의 유전자 도입 클론 번호를 나타낸다.
[도 5] 항인간 인플루엔자 M2 항체 발현 Tol1 트랜스포존 벡터의 모식도를 나타낸다. Tol1-L은 left end Tol1 트랜스포존(서열 번호 14)을, Tol1-R은 right end Tol1 트랜스포존(서열 번호 15)을, CMV는 CMV 프로모터를, poly A는 폴리아데닐레이션 사이트를, Hc는 인간 항체 H쇄 cDNA를, Lc는 인간 항체 L쇄 cDNA를, CHX-r은 시클로헥시미드 내성 유전자를 나타낸다.
[도 6] Tol1 트랜스포사제 발현 벡터의 모식도를 나타낸다. CAGGS는 CAGGS 프로모터를, poly A는 폴리아데닐레이션 사이트를, TPase cDNA는 Tol1 트랜스포사제 cDNA를 나타낸다.
[도 7] 항인간 인플루엔자 M2 항체 발현 Tol1 트랜스포존 벡터를 사용한 경우의 부유성의 CHO-K1 세포에서의 항인간 인플루엔자 M2 항체의 발현량을 검토한 결과를 나타낸다. 종축은 항체 생산량(μg/mL), 횡축은 부유성의 CHO 세포의 유전자 도입 클론 번호를 나타낸다.
본 발명은, 목적 단백질을 코딩하는 DNA 및 선택 마커 유전자를 포함하는 유전자 단편의 양단에 트랜스포존 서열을 포함하는 단백질 발현 벡터를 부유성의 포유 동물 세포에 도입하고, 한쌍(2개)의 트랜스포존 서열 사이에 삽입된 상기 유전자 단편을 상기 포유 동물 세포의 염색체에 조립하여 상기 목적 단백질을 발현하는 포유 동물 세포를 얻고, 상기 포유 동물 세포를 부유 배양하여 상기 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 목적 단백질을 생산하는 방법으로서는, 이하의 공정 (A) 내지 (C)를 포함하는 목적 단백질의 생산 방법을 들 수 있다.
(A) 이하의 발현 벡터 (a) 및 (b)를 부유성의 포유 동물 세포에 동시에 도입하는 공정
(a) 목적 단백질을 코딩하는 DNA와 선택 마커 유전자를 포함하는 유전자 단편의 양단에 트랜스포존 서열을 포함하는 단백질 발현 벡터
(b) 트랜스포존 서열을 인식하여, 한쌍의 트랜스포존 서열 사이에 삽입된 유전자 단편을 염색체에 전이시키는 활성을 갖는 트랜스포사제를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터
(B) 공정 (A)에서 도입한 발현 벡터 (b)에 의해 트랜스포사제를 일과성 발현시켜, 한쌍의 트랜스포존 서열 사이에 삽입된 상기 유전자 단편을 상기 포유 동물 세포의 염색체에 조립하고, 목적 단백질을 발현하는 부유성의 포유 동물 세포를 얻는 공정
(C) 공정 (B)에서 얻어진 목적 단백질을 발현하는 부유성의 포유 동물 세포를 부유 배양하여, 목적 단백질을 생산하는 공정
또한, 본 발명은, 목적 단백질을 코딩하는 DNA 및 선택 마커 유전자를 포함하는 유전자 단편의 양단에 트랜스포존 서열을 포함하는 단백질 발현 벡터가 도입되고, 한쌍의 트랜스포존 서열 사이에 삽입된 상기 유전자 단편이 염색체에 조립되어, 상기 목적 단백질을 생산하는 부유성의 포유 동물 세포에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적 단백질을 생산하는 세포로서는, 목적 단백질을 코딩하는 DNA와 선택 마커 유전자를 포함하는 유전자 단편의 양단에 트랜스포존 서열을 포함하는 단백질 발현 벡터 (a), 및 상기 트랜스포존 서열을 인식하여, 한쌍의 트랜스포존 서열 사이에 삽입된 유전자 단편을 염색체에 전이시키는 활성을 갖는 트랜스포사제(전이 효소)를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터 (b)를 동시에 도입시킴으로써, 상기 한쌍의 트랜스포존 서열 사이에 삽입된 상기 유전자 단편이 염색체에 조립되어, 상기 목적 단백질을 생산하는 부유성의 포유 동물 세포를 들 수 있다.
본 명세서에서 "트랜스포존"이란 전위성 유전 요소이며, 일정한 구조를 유지한 채로 염색체 위를, 또는 염색체에서 별도의 염색체로 전위(transposition)하는 유전자 단위를 의미한다.
트랜스포존은, 유전자 단위의 양단에 역방향 또는 동일한 방향의 반복된 트랜스포존 서열[Inverted Repeat Sequence(IR 서열) 또는 Terminal Inverted Repeat Sequence(TIR 서열)라고도 함] 및 상기 트랜스포존 서열을 인식하여, 상기 트랜스포존 서열 사이에 존재하는 유전자를 전이시키는 트랜스포사제를 코딩하는 염기 서열을 포함한다.
트랜스포존으로부터 번역된 트랜스포사제는, 트랜스포존의 양단의 트랜스포존 서열을 인식하여, 한쌍의 트랜스포존 서열 사이에 삽입된 DNA 단편을 잘라내어 전이 위치에 삽입함으로써 DNA의 전이를 행할 수 있다.
본 명세서에서 "트랜스포존 서열"이란, 트랜스포사제에 의해 인식되는 트랜스포존의 염기 서열을 의미하고, IR 서열 또는 TIR 서열과 동일한 의미이다. 상기 염기 서열을 포함하는 DNA는 트랜스포사제의 작용에 의해 전이(게놈 중의 다른 위치에 삽입) 가능하면, 불완전한 반복 부분을 포함하고 있을 수도 있고, 트랜스포사제에 특이적인 트랜스포존 서열이 존재한다.
본 발명에서 사용하는 트랜스포존 서열은, DNA형 트랜스포존 유래의 염기 서열이 바람직하고, 트랜스포사제에 의해 인식되는 포유 동물 세포 내에서 전위 가능한 천연 또는 인공의 한쌍의 DNA형 트랜스포존 유래의 염기 서열이 보다 바람직하다.
DNA형 트랜스포존 유래의 염기 서열로서는, 예를 들면 송사리 유래의 Tol1 트랜스포존 및 Tol2 트랜스포존, 연어과 어류 게놈에 존재하고 있었던 비자율성의 트랜스포존으로부터 재구축된 Sleeping Beauty, 개구리 유래의 인공 트랜스포존 Frog Prince 및 곤충 유래의 트랜스포존 PiggyBac 유래의 염기 서열을 들 수 있다.
이들 중에서도, 서열 목록의 서열 번호 6으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 송사리 유래 Tol2 트랜스포존 및 서열 목록의 서열 번호 13으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 송사리 유래 Tol1 트랜스포존 유래의 염기 서열이 바람직하다.
한쌍의 Tol2 트랜스포존 유래의 염기 서열로서는, 서열 목록의 서열 번호 6으로 표시되는 Tol2 트랜스포존의 염기 서열의 1번째에서 2229번째의 염기 서열 및 4148번째에서 4682번째의 염기 서열을 들 수 있다.
한쌍의 Tol2 트랜스포존 유래의 염기 서열로서는, 보다 바람직하게는 서열 목록의 서열 번호 1로 표시되는 Tol2 트랜스포존의 염기 서열에서의 1번째에서 200번째의 염기 서열(서열 번호 2)(이하, "Tol2-L 서열"이라고 기재함)과, 2285번째에서 2788번째의 염기 서열(서열 번호 3)(이하, "Tol2-R 서열"이라고 기재함)을 들 수 있다.
한쌍의 Tol1 트랜스포존 유래의 트랜스포존 서열로서는, 서열 목록의 서열 번호 13으로 표시되는 Tol1 트랜스포존의 염기 서열의 1번째에서 157번째의 염기 서열을 포함하는 염기 서열 및 1748번째에서 1855번째의 염기 서열을 들 수 있다.
한쌍의 Tol1 트랜스포존 유래의 트랜스포존 서열로서는, 보다 바람직하게는 서열 목록의 서열 번호 13으로 표시되는 Tol1 트랜스포존의 염기 서열에서의 1번째에서 200번째의 염기 서열(서열 번호 14)(이하, "Tol1-L 서열"이라고 기재함)과, 1351번째에서 1855번째의 염기 서열(서열 번호 15)(이하, "Tol1-R 서열"이라고 기재함)을 들 수 있다.
본 발명에 사용하는 트랜스포존 서열에는, 상기한 트랜스포존 유래의 트랜스포존 서열의 부분 서열을 사용하는 것, 염기 서열의 길이를 조절하는 것, 및 염기 서열의 부가, 결실 또는 치환에 의한 개변을 행함으로써, 전이 반응이 제어된 트랜스포존 서열도 포함된다.
트랜스포존의 전이 반응의 제어는, 트랜스포사제에 의한 트랜스포존 서열의 인식을 촉진 또는 억제함으로써 전이 반응을 촉진 또는 억제할 수 있다.
본 명세서에서 "트랜스포사제"란, 트랜스포존 서열을 갖는 염기 서열을 인식하여, 상기 염기 서열 사이에 존재하는 DNA를 염색체 위, 또는 염색체에서 별도의 염색체로 전위시키는 효소를 의미한다.
트랜스포사제로서는, 예를 들면 송사리 유래의 Tol1 및 Tol2, 연어과 어류 게놈에 존재하고 있었던 비자율성의 트랜스포존으로부터 재구축된 Sleeping Beauty, 개구리 유래의 인공 트랜스포존 Frog Prince, 곤충 유래의 트랜스포존 PiggyBac 유래의 효소를 사용할 수 있다.
트랜스포사제는 천연형의 효소를 사용할 수도 있고, 트랜스포사제와 동일한 전위 활성을 유지하고 있으면, 그 일부의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가되어 있을 수도 있다. 트랜스포사제의 효소 활성을 제어함으로써, 트랜스포존 서열 사이에 존재하는 DNA의 전이 반응을 제어할 수 있다.
트랜스포사제와 동일한 전이 활성을 유지하는지를 해석하기 위해서는, 일본 특허 공개 제2003-235575호 공보에 의해 개시되어 있는 2-성분 해석 시스템에 의해 측정할 수 있다.
구체적으로는, 각각의 Tol2 트랜스포사제를 결손한 Tol2 트랜스포존(Tol2 유래 비자율성 트랜스포존)을 포함하는 플라스미드와 Tol2 트랜스포사제를 포함하는 플라스미드를 사용하여, 트랜스포사제의 작용에 의해 비자율성 Tol2 엘리멘트가 포유 동물 세포의 염색체 내에 전이, 삽입될 수 있는지를 해석할 수 있다.
본 명세서에서 "비자율성 트랜스포존"이란, 트랜스포존 내에 존재하는 트랜스포사제를 결손하고, 자율적으로는 전이될 수 없는 트랜스포존을 말한다. 비자율성 트랜스포존은, 트랜스포사제의 단백질, 트랜스포사제의 단백질을 코딩하는 mRNA 또는 트랜스포사제의 단백질을 코딩하는 DNA를 세포 내에 동시에 존재시킴으로써, 비자율성 트랜스포존의 트랜스포존 서열 사이에 삽입된 DNA를 숙주 세포의 염색체 내에 전이시킬 수 있다.
트랜스포사제 유전자란, 트랜스포사제를 코딩하는 유전자를 의미한다. 포유 동물 세포에서의 발현 효율을 향상시키기 위해, 상기 유전자의 번역 개시 코돈 ATG의 상류에 kozak의 컨센서스 서열(문헌 [Kozak, M.Nucleic Acids Res., 12, 857-872(1984)])이나, 리보솜 결합 서열인 샤인ㆍ달가노(Shine-Dalgarno) 서열과 개시 코돈 사이를 적당한 거리(예를 들면 6 내지 18 염기)로 조절하는 서열이 연결될 수도 있다.
본 발명의 방법에서, 발현 벡터 중의 목적 단백질을 코딩하는 DNA 및 선택 마커 유전자를 포함하는 유전자 단편을 숙주 세포의 염색체에 조립하기 위해서는, 목적 단백질을 코딩하는 DNA와 선택 마커 유전자를 포함하는 유전자 단편의 양단에 트랜스포존 서열을 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하고, 상기 세포 내에 도입된 발현 벡터에 포함되는 트랜스포존 서열에 대하여 트랜스포사제를 작용시킨다.
숙주 세포 내에 도입된 발현 벡터에 포함되는 트랜스포존 서열에 대하여 트랜스포사제를 작용시키기 위해서는, 트랜스포사제를 상기 세포 내에 주입할 수도 있고, 트랜스포사제를 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터를, 목적 단백질을 코딩하는 DNA 및 선택 마커 유전자를 포함하는 발현 벡터와 함께 숙주 세포에 도입할 수도 있다. 또한, 트랜스포사제 유전자를 코딩하는 RNA를 숙주 세포 내에 도입하여, 트랜스포사제를 상기 세포 내에서 발현시킬 수도 있다.
발현 벡터로서는 특별히 한정되지 않으며, 트랜스포사제 유전자를 조립한 발현 벡터를 도입하는 숙주 세포, 용도 등에 따라 당업자에게 알려져 있는 발현 벡터로부터 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에서 2 이상의 폴리펩티드로 구성되는 단백질을 생산하는 경우에는, 2 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 동일하거나 또는 상이한 발현 벡터에 조립하고, 당해 발현 벡터를 숙주 세포에 도입함으로써 상기 세포의 염색체에 상기 DNA를 조립할 수 있다.
트랜스포사제는, 발현 벡터에 조립하여 목적 단백질과 함께 발현시킬 수도 있고, 발현 벡터와는 별도의 벡터에 조립하여 발현시킬 수도 있다. 트랜스포사제는 일과성 기능하게 할 수도 있고, 계속적으로 기능하게 할 수도 있지만, 안정된 생산 세포를 제작하기 위해서는 트랜스포사제를 일과성 기능하게 하는 것이 바람직하다.
트랜스포사제를 일과성 기능하게 하는 방법으로서는, 예를 들면 목적 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터와는 별도의 발현 벡터에 트랜스포사제를 코딩하는 DNA를 조립하고, 양 발현 플라스미드를 숙주 세포에 동시에 도입하는 방법을 들 수 있다.
본 명세서에서 "발현 벡터"란 목적 단백질을 발현시키기 위해, 포유 동물 세포를 형질 전환시키기 위해 사용하는 발현 벡터를 의미한다. 본 발명에서 사용하는 발현 벡터는, 발현 카세트의 양측에 적어도 한쌍의 트랜스포존 서열이 존재하는 구조를 갖는다.
본 명세서에서 "발현 카세트"란, 목적 단백질을 발현시키기 위해 필요한 유전자 발현 제어 영역 및 목적 단백질을 코딩하는 서열을 갖는 핵산 서열을 의미한다. 상기 유전자 발현 제어 영역으로서는, 예를 들면 인핸서, 프로모터 및 터미네이터 등을 들 수 있다. 발현 카세트는, 선택 마커 유전자를 포함하고 있을 수도 있다.
프로모터로서는, 포유 동물 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있다. 예를 들면, 사이토메갈로바이러스(CMV)의 IE(immediate early) 유전자의 프로모터, SV40의 초기 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 히트 쇼크 프로모터, SRα 프로모터, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스(moloney murine leukemia virus)의 프로모터 및 인핸서 등을 들 수 있다. 또한, 인간 CMV의 IE 유전자의 인핸서를 프로모터와 함께 사용할 수도 있다.
"선택 마커 유전자"란, 플라스미드 벡터가 도입된 세포와 상기 벡터가 결여된 세포를 구별하기 위해 사용할 수 있는 임의의 다른 마커 유전자를 의미한다.
선택 마커 유전자로서는, 예를 들면 약제 내성 유전자(네오마이신 내성 유전자, DHFR 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자, 블라스티사이딘 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 시클로헥시미드 내성 유전자(일본 특허 공개 제2002-262879호 공보)) 및 형광 및 생체 발광 마커 유전자(녹색 형광 단백질 GFP 등) 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서 바람직한 선택 마커는 약제 내성 유전자이며, 특히 바람직한 선택 마커는 시클로헥시미드 내성 유전자이다. 또한, 선택 마커 유전자의 유전자 개변을 행함으로써, 선택 마커 단백질의 약제 내성능 및 발광능을 변경할 수 있다.
시클로헥시미드(이하, CHX로 약기하는 경우도 있음)는 단백질 합성 저해제이고, CHX 내성 유전자를 선택 마커로 한 이용예로서는, 효모(문헌 [Kondo K. J. Bacteriol., 177, 24, 7171-7177(1995)]), 동물 세포(일본 특허 공개 제2002-262879호 공보)의 예가 알려져 있다.
동물 세포에서는, 서열 목록의 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열로 코딩되는 인간 리보솜 단백질 서브 유닛의 L36a의 54 위치의 프롤린이 글루타민으로 치환된, 서열 목록의 서열 번호 7로 표시되는 염기 서열로 코딩되는 단백질을 발현시킨 형질 전환주가 시클로헥시미드에 대한 내성을 부여한다는 것이 분명해져 있다.
숙주 세포에 상기한 트랜스포존 서열을 포함하는 단백질 발현 벡터, 트랜스포사제를 발현하는 플라스미드 벡터 및 RNA를 도입하는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 인산칼슘법, 전기 천공법, 리포솜법, 유전자총법 및 리포펙션법 등을 이용할 수 있다.
트랜스포사제를 직접 단백질로서 도입하는 방법으로서는, 예를 들면 미세 주입법 및 엔도사이토시스에 의한 세포로의 공급을 들 수 있다. 유전자 도입은, 예를 들면 문헌 [신유전자 공학 핸드북, 무라마쯔 마사미ㆍ야마모또 미야비/편, 요도사, ISBN 9784897063737]에 기재된 방법으로 실시할 수 있다.
숙주 세포로서는, 계대 배양이 가능하며 안정적으로 목적 단백질을 발현할 수 있는 포유 동물 세포를 들 수 있다. 숙주 세포로서는, 예를 들면 PER.C6 세포, 인간 백혈병 세포 Namalwa 세포, 원숭이 세포 COS 세포, 래트 미엘로마 세포 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(또는 YB2/0이라고도 함), 마우스 미엘로마 세포 NS0, 마우스 미엘로마 세포 SP2/0-Ag14, 시리안 햄스터 세포 BHK, HBT5637(일본 특허 공개 (소)63-000299호 공보) 차이니즈ㆍ햄스터 난소 세포 CHO 세포(문헌 [Journal of Experimental Medicine, 108, 945(1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 601275(1968); Genetics, 55, 513(1968); Chromosoma, 41, 129(1973); Methods in Cell Science, 18, 115(1996); Radiation Research, 148, 260(1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216(1980); Proc. Natl. Acad. Sci., 60, 1275(1968); Cell, 6, 121(1975); Molecular Cell Genetics, Appendix I, II(pp.883-900);), CHO/DG44, CHO-K1(ATCC CCL-61), DUKXB11(ATCC CCL-9096), Pro-5(ATCC CCL-1781), CHO-S(Life Technologies, Cat #11619), Pro-3 및 CHO 세포의 아주(亞株)를 들 수 있다.
또한, 상기한 숙주 세포는, 염색체 DNA의 개변 및 외래성 유전자의 도입 등에 의해 단백질의 생산에 적합하도록 개변하여, 본 발명의 단백질의 생산 방법에 사용할 수도 있다.
또한, 숙주 세포로서, 생산하는 목적 단백질에 결합한 당쇄 구조를 제어하기 위해 렉틴 내성을 획득한 Lec13[Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55(1986)] 및 α1,6-푸코스 전이 효소 유전자가 결손된 CHO 세포(국제 공개 제05/35586호, 국제 공개 제02/31140호)를 사용할 수도 있다.
목적 단백질은, 본 발명의 방법에 의해 발현 가능하면 어떠한 단백질이어도 상관없다. 구체적으로는, 예를 들면 인간 혈청 단백질, 펩티드 호르몬, 증식 인자, 사이토카인, 혈액 응고 인자, 선용계 단백질 및 항체 및 각종 단백질의 부분 단편 등을 들 수 있다.
또한, 목적 단백질로서, 예를 들면 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 등의 모노클로날항체, Fc 융합 단백질 및 알부민 결합 단백질 및 상기 부분 단편 등을 바람직하게 들 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 이펙터 활성은, 다양한 방법으로 제어할 수 있다. 예를 들면, 항체의 Fc 영역의 297번째의 아스파라긴(Asn)에 결합하는 N 결합 복합형 당쇄의 환원 말단에 존재하는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)에 α-1,6 결합하는 푸코스(코어 푸코스라고도 함)의 양을 제어하는 방법(국제 공개 제05/035586호, 국제 공개 제02/31140호, 국제 공개 제00/61739호)이나, 항체의 Fc 영역의 아미노산 잔기를 개변함으로써 제어하는 방법 등이 알려져 있다. 본 발명의 방법에 의해 생산되는 모노클로날 항체에는 어떠한 방법을 이용하여도 이펙터 활성을 제어할 수 있다.
"이펙터 활성"이란, 항체의 Fc 영역을 통해 야기되는 항체 의존성의 활성을 말하며, 항체 의존성 세포 상해 활성(ADCC 활성), 보체 의존성 상해 활성(CDC 활성)이나, 마크로파지나 수상 세포 등의 식세포에 의한 항체 의존성 파고사이토시스(Antibody-dependent phagocytosis, ADP 활성) 등이 알려져 있다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 Fc 영역의 N 결합 복합형 당쇄의 코어 푸코스의 함량을 제어함으로써, 항체의 이펙터 활성을 증가 또는 저하시킬 수 있다.
항체의 Fc 영역에 결합되어 있는 N 결합 복합형 당쇄에 결합하는 푸코스의 함량을 저하시키는 방법으로서는, α1,6-푸코스 전이 효소 유전자가 결손된 CHO 세포를 사용하여 항체를 발현함으로써, 푸코스가 결합하지 않은 항체를 취득할 수 있다. 푸코스가 결합하지 않은 항체는 높은 ADCC 활성을 갖는다.
한편, 항체의 Fc에 결합되어 있는 N 결합 복합형 당쇄에 결합하는 푸코스의 함량을 증가시키는 방법으로서는, α1,6-푸코스 전이 효소 유전자를 도입한 숙주 세포를 사용하여 항체를 발현시킴으로써, 푸코스가 결합되어 있는 항체를 취득할 수 있다. 푸코스가 결합하고 있는 항체는, 푸코스가 결합하지 않은 항체보다 낮은 ADCC 활성을 갖는다.
또한, 항체의 Fc 영역의 아미노산 잔기를 개변함으로써 ADCC 활성이나 CDC 활성을 증가 또는 저하시킬 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 출원 공개 제2007/0148165호 명세서에 기재된 항체의 Fc 영역의 아미노산 서열을 사용함으로써, 항체의 CDC 활성을 증가시킬 수 있다.
또한, 미국 특허 제6,737,056호 명세서, 미국 특허 제7,297,775호 명세서, 나 미국 특허 제7,317,091호 명세서에 기재된 아미노산 개변을 행함으로써, 항체의 ADCC 활성 또는 CDC 활성을 증가시킬 수도 저하시킬 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 "부유성의 포유 동물 세포"란, 마이크로 비드나 조직 배양용 배양기(조직 배양 또는 접착 배양 용기 등이라고도 함) 등의 배양 세포가 접착하기 쉽게 코팅된 세포 배양 지지체에 접착하지 않고, 배양액 중에 부유하여 생존 및 증식할 수 있는 세포를 말한다.
세포 배양 지지체에 세포가 접착하지 않으면 배양액 중에서 하나의 세포의 상태로 생존, 증식할 수도 있고, 또는 세포끼리 복수 응집된 세포 덩어리의 상태로 생존, 증식하고 있을 수도 있으며, 어떠한 상태여도 상관없다.
또한, 본 발명에서 사용되는 부유성의 포유 동물 세포로서는, 소 태아 혈청(fetal calf serum, 이하 FCS라고 함) 등이 포함되어 있지 않은 무혈청 배지 중에서 세포 배양 지지체에 접착하지 않고 배양액 중에 부유하여 생존 및 증식할 수 있는 세포가 바람직하고, 단백질이 포함되어 있지 않은 무단백질 배지 중에서 부유하여 생존 및 증식할 수 있는 포유 동물 세포가 보다 바람직하다.
조직 배양용 배양기로서는, 접착 배양용의 코팅이 이루어져 있는 플라스크, 페트리 접시 등이면 어떠한 배양기여도 상관없다. 구체적으로는, 예를 들면 시판되어 있는 조직 배양 플라스크(그레이너사 제조) 및 접착 배양 플라스크(스미또모 베이크라이트사 제조) 등을 사용함으로써, 부유성의 포유 동물 세포인 것을 확인할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 부유성의 포유 동물 세포로서는, 원래 부유성의 성질을 갖는 부유 배양에 순화된 세포일 수도 있고, 접착성의 포유 동물 세포를 부유성의 배양 조건에 순화시킨 부유성의 포유 동물 세포 중 어떠한 것이어도 상관없다.
원래 부유성의 성질을 갖는 포유 동물 세포로서는, 예를 들면 PER.C6 세포, 래트 미엘로마 세포 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(또는 YB2/0이라고도 함) 및 CHO-S 세포(인비트로젠사 제조) 등을 들 수 있다.
상기 "접착성의 포유 동물 세포를 부유성의 배양 조건에 순화시킨 부유성의 포유 동물 세포"는, 문헌 [Mol. Biotechnol. 2000, 15(3), 249-57]에 기재된 방법이나 이하에 나타내는 방법 등으로 제작할 수 있으며, 부유 배양 순화 전과 동일하거나, 또는 부유 배양 순화 전보다 우수한 증식 및 생존성을 나타내는 세포를 확립함으로써 제작할 수 있다(문헌 [J. Biotechnol. 2007, 130(3), 282-90]).
"부유 배양 순화 전과 동등하다"는 것은, 부유 배양에 순화된 세포의 생존율 및 증식 속도(배화 시간) 등이 부유 배양 순화 전의 세포와 비교하여 실질적으로 동일한 것을 의미한다.
본 발명에서 접착성의 포유 동물 세포를 부유성의 배양 조건에 순화시키는 방법으로서는, 다음의 방법을 들 수 있다. 혈청 함유의 배지의 혈청 함량을 1/10로 감소시키고, 비교적 높은 세포 농도로 계대 배양을 반복하여, 포유 동물 세포가 생존 및 증식할 수 있게 된 시점에 혈청 함량을 더욱 삭감함으로써 계대 배양을 반복한다. 이 방법에 의해, 비혈청하에서 생존, 증식 가능한 부유성의 포유 동물 세포를 제작할 수 있다.
또한, 배양액 중에 적당한 비이온성 계면활성제 플루로닉-F68 등을 첨가하여 배양하는 방법에 의해서도 부유성의 포유 동물 세포를 제작할 수 있다.
부유성의 배양 조건에 순화시킴으로써 부유성이 되는 접착성의 포유 동물 세포로서는, 예를 들면 마우스 미엘로마 세포 NS0 및 CHO 세포 등을 들 수 있다.
본 발명에서 부유성의 포유 동물 세포가 갖는 성질로서는, 상기 세포를 2×105 세포/mL로 부유 배양한 경우, 3 내지 4일 후의 배양 종료시의 세포 밀도가 5×105 세포/mL 이상인 것이 바람직하고, 8×105 세포/mL 이상인 것이 보다 바람직하고, 1×106 세포/mL 이상인 것이 특히 바람직하고, 1.5×106 세포/mL 이상인 것이 가장 바람직하다.
또한, 본 발명의 부유성의 포유 동물 세포의 배화 시간으로서는 48 시간 이하인 것이 바람직하고, 24 시간 이하가 보다 바람직하고, 18 시간 이하가 특히 바람직하고, 11 시간 이하가 가장 바람직하다.
부유 배지는, 예를 들면 CD-CHO 배지(인비트로젠사), EX-CELL 325-PF 배지(SAFC 바이오사이언스사) 및 SFM4CHO 배지(하이클론사) 등의 시판된 배지를 사용할 수 있다. 또한, 포유 동물 세포의 배양에 필요한 당류, 아미노산류 등을 배합하여 제조함으로써도 얻어진다.
부유성의 포유 동물 세포의 배양은, 부유 배양이 가능한 배양 용기를 사용하여 부유 배양이 가능한 배양 조건에 의해 행할 수 있다. 배양 용기로서는, 예를 들면 세포 배양용의 96 구멍 플레이트(코닝사), T-플라스크(벡톤 디킨슨사) 및 삼각 플라스크(코닝사) 등을 이용할 수 있다.
배양 조건으로서는, 예를 들면 5 ％ CO2 분위기 중 배양 온도 37 ℃에서 정치 배양 등에 의해 행할 수 있다. 부유 배양 전용의 배양 설비인 웨이브 바이오리액터(GE 헬스케어 바이오사이언스사) 등의 진탕 배양 장치 등을 사용할 수도 있다.
웨이브 바이오리액터 장치를 사용한 부유성의 포유 동물 세포의 부유 배양 조건에 대해서는 GE 헬스케어 바이오사이언스사 홈페이지 http://www.gelifesciences.co.jp/tech_support/manual/pdf/cellcult/wave_03_16.pdf에 기재된 방법으로 행할 수 있다.
진탕 배양 이외에 바이오리액터 등의 선회 교반 장치에 의한 배양도 가능하다. 바이오리액터에서의 배양은, 문헌 [Cytotechnology(2006)52: 199-207]에 기재된 방법 등으로 행할 수 있다.
본 발명에서 부유성의 포유 동물 세포 이외의 세포주를 사용하는 경우, 상기한 바와 같은 방법으로 부유 배양에 순화시킨 포유 동물 세포주이며, 본 발명의 단백질 생산 방법을 사용할 수 있는 세포주이면 어떠한 세포주도 사용할 수 있다.
부유성의 포유 동물 세포로 생산한 목적 단백질의 정제는 목적 단백질을 포함하는 배양액이나 세포 파쇄액으로부터 목적 단백질과 목적 단백질 이외의 불순물을 분리함으로써 행한다. 분리 방법은, 예를 들면 원심, 투석, 황산암모늄 침전, 컬럼 크로마토그래피 및 필터 등을 사용하여, 목적 단백질과 불순물의 물리 화학적 성질의 차이나 칼럼 단체로의 결합력의 차이에 의해 행할 수 있다.
목적 단백질을 정제하는 방법은, 예를 들면 문헌 [단백질 실험 노트(상) 추출ㆍ분리와 재조합 단백질의 발현(요도사, 오카다 마사토ㆍ미야자키 카오리/편, ISBN 9784897069180)]에 기재된 방법에 의해 실시할 수 있다.
본 명세서에서 인용된 과학 문헌, 특허, 특허출원 등의 참고 문헌은, 그 전체가 각각 구체적으로 기재된 것과 동일한 정도로 본 명세서에서 참고로서 원용된다.
이상, 본 발명을 이해의 용이를 위해 바람직한 실시 형태를 나타내어 설명하였다. 이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 상술한 설명 및 이하의 실시예는 예시의 목적으로만 제공되며, 본 발명을 한정하는 목적으로 제공한 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 범위는, 본 명세서에 구체적으로 기재된 실시 형태로도 실시예로도 한정되지 않으며, 특허청구범위에 의해서만 한정된다.
이후에 기술하는 클로닝 등, 유전자 재조합에 관한 각종 실험 기술에 대해서는, 문헌 [J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis 저; 분자 클로닝 제2판(Molecular Cloning 2nd edition) 및 Frederick M. Ausubel 등 편, Current Protocols 발행, Current Protocols in Molecular Biology] 등에 기재된 유전자 공학적 방법에 준하여 행하였다.
[실시예]
[실시예 1]
항인간 인플루엔자 M2 항체 발현 트랜스포존 벡터의 제작
단백질 발현용 플라스미드 벡터에는, 한쌍의 Tol2 트랜스포존 서열 사이에 삽입된 임의의 인간 항체 유전자 및 약제 내성 마커 유전자를 포함하는 포유 동물 세포용 유전자 발현 카세트를 포함하는 플라스미드를 사용하였다.
사용한 유전자의 DNA는 기지된 염기 서열을 바탕으로 인공적으로 화학 합성하거나, 또는 그의 양단 서열의 프라이머를 제작하여, 적당한 DNA 소스를 주형으로 하여 PCR을 행함으로써 취득하였다. 프라이머의 끝에는 이후의 유전자 조작을 위해 제한 효소 절단 부위를 부가하였다.
트랜스포존 서열은, 일본 특허 공개 제2003-235575호 공보에 의해 개시되어 있는 비자율성 Tol2 트랜스포존의 염기 서열(서열 번호 1) 중, 1번째에서 200번째의 염기 서열(Tol2-L 서열)(서열 번호 2)과, 2285번째에서 2788번째의 염기 서열(Tol2-R 서열)(서열 번호 3)의 염기 서열을 사용하였다.
다음의 방법에 의해, 각각 한쌍의 트랜스포존 서열을 포함하는 합성 DNA 단편을 제작하였다(다카라 바이오 가부시끼가이샤 제조). Tol2-R 서열의 5' 말단 및 3' 말단의 양쪽에 제한 효소 NruI의 인식 서열을 연결한 염기 서열을 포함하는 DNA 단편을 제작하였다. 또한, Tol2-L 서열의 5' 말단에는 제한 효소 FseI의 인식 서열을 연결하고, 3' 말단에는 제한 효소 AscI의 인식 서열을 연결한 염기 서열을 포함하는 DNA 단편을 제작하였다.
이어서, 제작한 Tol2-R 서열 및 Tol2-L 서열을 포함하는 DNA 단편을 항인간 인플루엔자 M2 항체 Z3G1의 아미노산 서열을 코딩하고 있는 염기 서열을 포함하는 발현 벡터 N5LG1_M2_Z3 벡터(국제 공개 제06/061723호)에 삽입하였다.
항체 유전자 발현 카세트에는, CMV 인핸서/프로모터 제어하에 항인간 인플루엔자 M2 항체 Z3G1(ATCC Deposit No.PTA-5968; deposited March 13, 2004, American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)의 H쇄를 코딩하는 염기 서열(서열 번호 8) 및 L쇄(서열 번호 9)를 코딩하는 염기 서열(서열 번호 10 및 서열 번호 11)이 삽입된 N5LG1_M2_Z3 벡터(국제 공개 제06/061723호)를 사용하였다.
M5LG1_M2_Z3 벡터의 항체 유전자 발현 카세트 및 내성 마커 유전자 발현 카세트를 포함하는 유전자 단편의 5' 말단측에 존재하는 제한 효소 NruI 사이트에, Tol2-R 서열을 포함하는 DNA 단편을 삽입하였다. 또한, 3' 말단측에 존재하는 제한 효소 FseI 및 AscI 사이트에 Tol2-L 서열을 포함하는 DNA 단편을 삽입하였다.
또한, CMV 인핸서/프로모터 제어하에, 시클로헥시미드에 대한 내성 유전자(인간 리보솜 단백질 L36a의 54 위치의 프롤린이 글루타민으로 변이된 유전자)를 코딩하는 염기 서열(서열 번호 5)이 접속된 시클로헥시미드 내성 유전자 발현 카세트를, Tol2 트랜스포존 서열이 연결된 N5LG1_M2_Z3 벡터의 FseI 인식 부위에 삽입하여, 항인간 인플루엔자 M2 항체 트랜스포존 발현 벡터를 구축하였다(도 1).
한편, 트랜스포존 서열을 포함하지 않는 벡터를 항인간 인플루엔자 M2 항체발현 벡터로 명명하고, 대조군 벡터로서 사용하였다(도 2).
[실시예 2]
트랜스포사제 발현 벡터의 제작
트랜스포사제는, 목적으로 하는 항체의 발현 벡터와는 독립된 발현 벡터를 사용하여 발현시켰다. 즉, pCAGGS 벡터(Gene 108, 193-200, 1991)의 CAGGS 프로모터의 하류에 송사리 유래의 Tol2 트랜스포사제를 코딩하는 유전자(서열 번호 4)를 삽입하여, 발현 벡터로서 이용하였다(도 3).
[실시예 3]
포유 동물 세포를 사용한 형질 전환체의 제작
(1) 부유화 CHO 세포의 제작
10 ％ 혈청(FCS)을 첨가한 α-MEM 배지(인비트로젠사)에서 배양한 접착성 CHO 세포를 트립신 처리에 의해 박리, 회수하고, 새로운 10 ％ FCS 첨가 α-MEM 배지를 사용하여 5 ％ CO2 인큐베이터 내에서 37 ℃에서 진탕 배양하였다. 수일 후, 이들 세포가 증식되어 있는 것을 확인한 후, 5 ％ FCS 첨가 α-MEM 배지에 2×105 개/mL의 농도로 파종하여, 진탕 배양을 행하였다.
또한, 수일 후, 5 ％ FCS 첨가 α-MEM 배지를 사용하여 동일한 파종 작업을 행하였다. 최종적으로, 혈청을 포함하지 않는 α-MEM 배지를 사용하여 계대, 진탕 배양을 반복하고, 혈청 존재하에서의 배양과 동일한 증식능을 갖고 있다는 것을 확인하여, 부유 배양 순화주를 제작하였다.
(2) 항체를 생산하는 CHO 세포의 제작
발현 벡터로서, 실시예 1 및 실시예 2의 항인간 인플루엔자 M2 항체 발현 트랜스포존 벡터(이하, 트랜스포존 벡터로 약기함) 및 Tol2 트랜스포사제 발현 벡터 pCAGGS-T2TP(도 3, 문헌 [Kawakami K&Noda T. Genetics. 166, 895-899(2004)])를 사용하였다. 또한, 대조군으로서 트랜스포존 서열을 갖고 있지 않은 항인간 인플루엔자 M2 항체 발현 벡터를 사용하였다.
상기 발현 벡터를 부유 배양에 순화한 CHO-K1 세포(문헌 [American Type Culture Collection Cat. No. CCL-61]) 또는 HEK293 세포(인비트로젠사 FreeStyle 293F 세포)에 도입하여, 시클로헥시미드에 대한 내성 클론이 얻어지는 빈도를 비교하였다.
각 세포(4×106개)를 400 μL의 PBS에 현탁하고, 항인간 인플루엔자 M2 항체 발현 트랜스포존 벡터(10 μg)와 Tol2 트랜스포사제 발현 벡터(25 μg)를 전기 천공법에 의해 환상 DNA인 채로 함께 도입하였다. 또한, Tol2 트랜스포사제 발현 벡터는 Tol2 트랜스포사제를 일과성 발현시키기 위해, 숙주 염색체로의 조립을 방지하는 목적으로 환상 DNA인 채로 도입하였다.
또한, 대조군으로서, 항인간 인플루엔자 M2 항체 발현 벡터(10 μg)를 표준 전기 천공에 의한 유전자 도입법에 따라 제한 효소에 의해 직쇄상으로 한 후, 각 세포에 도입하였다.
전기 천공은 일렉트로포레이터(Gene Pulser XceII system(바이오래드사 제조)를 사용하고, 전압 300 V, 정전 용량 500 μF, 실온의 조건에서 갭 폭 4 mm의 큐벳(바이오래드사 제조)을 사용하여 행하였다.
전기 천공에 의한 유전자 도입 후, 각각의 세포에 대하여 3장의 96 구멍 플레이트에 파종하고, CHO 세포는 SAFC 바이오사이언스사 EX-CELL 325-PF 배지를, HEK293 세포는 freeStyle-293 배지(인비트로젠사)를 사용하여 CO2 인큐베이터 내에서 3일간 배양하였다.
이어서, 유전자 도입 후 4일 후의 배지 교환부터 3 μg/mL의 시클로헥시미드를 첨가하고, 시클로헥시미드 존재하에 배양하고, 1주일마다 배지 교환을 행하면서 3주일간 배양하였다.
3주일간 배양한 후, 시클로헥시미드 내성 콜로니가 관찰되는 웰 수를 계산하였다. 그 결과를 표 1 및 표 2에 나타내었다.
Figure 112011097807984-pct00001
Figure 112011097807984-pct00002
표 1에 나타낸 바와 같이, 부유성의 CHO-K1 세포에 항인간 인플루엔자 M2 항체 발현 트랜스포존 벡터 또는 항인간 인플루엔자 M2 항체 발현 벡터를 도입한 바, 항인간 인플루엔자 M2 항체 발현 벡터를 도입한 세포에서는 다른 세포주와 마찬가지로 시클로헥시미드 내성의 형질 전환주가 취득되지 않았지만, 항인간 인플루엔자 M2 항체 발현 트랜스포존 벡터 도입 세포에서는 시클로헥시미드 내성의 형질 전환주가 높은 빈도로 얻어졌다.
한편, 표 2에 나타낸 바와 같이, HEK293 세포에 항인간 인플루엔자 M2 항체 발현 트랜스포존 벡터 또는 항인간 인플루엔자 M2 항체 발현 벡터 중 어떠한 발현 벡터를 도입하여도, 시클로헥시미드 내성의 형질 전환주는 취득되지 않았다.
이들 결과로부터, 부유성의 포유 동물 세포에서 한쌍의 트랜스포존 서열 사이에 삽입된 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 시클로헥시미드 내성 유전자가 효율적으로 숙주 세포의 염색체 내에 도입된다는 것을 알 수 있다.
(3) 부유성 CHO 세포와 접착성 CHO 세포에서의 항체 생산의 검토
부유성 CHO 세포 또는 접착성 CHO 세포에서의 항체 생산 효율을 검토하기 위해, 각 세포주에서의 항체의 생산량을 검토하였다. 부유성 CHO 세포로서는, 부유 배양에 순화한 부유성 CHO-K1 세포를 사용하였다. 또한, 접착성 CHO 세포로서는 부유 배양 순화 전의 접착성 CHO-K1 세포를 사용하였다.
부유성 CHO-K1 세포 및 접착성 CHO-K1 세포에 항인간 인플루엔자 M2 항체 발현 트랜스포존 벡터(10 μg)와 Tol2 트랜스포사제 발현 벡터(25 μg)를 각각 전기 천공하였다. 그 후, 부유성 CHO-K1 세포와 접착성 CHO-K1 세포를 각각 3장의 96 구멍 플레이트에 파종하였다.
부유성 CHO-K1 세포는 부유 세포용 배지(SAFC 바이오사이언스사 EX-CELL 325-PF)를 사용하고, 접착성 CHO-K1 세포는 10 ％ 혈청을 첨가한 α-MEM 배지(인비트로젠사)를 사용하였다. 각 세포를 CO2 인큐베이터 내에서 3일간 배양하고, 전기 천공에서부터 4일 후의 배지 교환부터 3 μg/mL의 시클로헥시미드 존재하에 3주일간 배양하였다. 이때, 1주일마다 배지 교환을 행하였다.
부유성 CHO-K1 세포는 1×106개의 세포를 6 구멍 플레이트에 파종하고, CO2 인큐베이터 내에서 3일간 진탕 배양하고, 배양 상청을 사용하여 항인간 인플루엔자 M2 항체의 단백질량을 HPLC로 측정하였다.
접착성 CHO-K1 세포는 6 구멍 플레이트에서 콘플루언트(confluent)에 도달한 후(2×106개) 배지 교환하고, 3일간 정치 배양한 후, 배양 상청을 사용하여 항체 단백질량을 HPLC로 측정하였다.
배양 상청 중의 항체 농도의 측정은 문헌 [FEMS Yeast Res., 7, (2007), 1307-1316]에 기재된 방법에 따라 행하였다. 결과를 도 4의 (A) 및 (B)에 나타낸다.
도 4의 (A)에 나타낸 바와 같이, 부유 배양에 순화한 CHO-K1 세포에서는 매우 높은 항체 발현량을 나타내는 세포가 다수 얻어졌다. 한편, 도 4의 (B)에 나타낸 바와 같이, 접착성의 CHO-K1 세포에서는 HPLC의 검출 한계(5 μg/mL) 이하의 발현량을 나타내는 세포만이 얻어졌다.
이들 결과로부터, 트랜스포존 벡터를 사용하여 목적 단백질을 발현시키기 위해서는, 부유성의 포유 동물 세포를 사용한 경우에 목적 단백질을 고발현할 수 있다는 것을 발견하였다.
또한, 실시예 1 내지 3의 결과로부터, 본 발명의 방법은, 부유 배양에 순화한 부유성의 포유 동물 세포를 사용하여 외래 유전자를 고발현하는 생산 세포를 효율적으로 제작하고, 목적 단백질을 생산하는 신규 방법으로서 이용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
[실시예 4]
항인간 인플루엔자 M2 항체 발현 Tol1 트랜스포존 벡터의 제작
실시예 1과 마찬가지로 단백질 발현용 플라스미드 벡터에는, 한쌍의 Tol1 트랜스포존 서열 사이에 삽입된 임의의 인간 항체 유전자 및 약제 내성 마커 유전자를 포함하는 포유 동물 세포용 유전자 발현 카세트를 포함하는 플라스미드를 사용하였다.
사용한 유전자의 DNA는 기지된 서열 정보를 바탕으로 인공적으로 화학 합성하거나, 또는 그의 양단 서열의 프라이머를 제작하고, 적당한 DNA 소스를 주형으로 하여 PCR을 행함으로써 취득하였다. 프라이머의 끝에는 이후의 유전자 조작을 위해 제한 효소 절단 부위를 부가하였다.
트랜스포존 서열은, 서열 목록의 서열 번호 13으로 표시되는 비자율성 Tol1 트랜스포존의 염기 서열(국제 공개 제2008/072540호) 중 1번째에서 200번째의 염기 서열(Tol1-L 서열)(서열 번호 14)과, 1351번째에서 1855번째의 염기 서열(Tol1-R 서열)(서열 번호 15)을 사용하였다.
다음의 방법에 의해, 각각 한쌍의 트랜스포존 서열을 포함하는 합성 DNA 단편을 제작하였다. Tol1-R 서열의 5' 말단 및 3' 말단의 양쪽에 제한 효소 NruI의 인식 서열을 연결한 염기 서열을 포함하는 DNA 단편을 제작하였다. 또한, Tol1-L 서열의 5' 말단에는 제한 효소 FseI의 인식 서열을 연결하고, 3' 말단에는 제한 효소 AscI의 인식 서열을 연결한 염기 서열을 포함하는 DNA 단편을 제작하였다.
이어서, 제작한 Tol1-R 서열 및 Tol1-L 서열을 포함하는 DNA 단편을 N5LG1_M2_Z3 벡터에 삽입하였다. N5LG1_M2_Z3 벡터의 항체 유전자 발현 카세트 및 내성 마커 유전자 발현 카세트를 포함하는 유전자 단편의 5' 말단측에 존재하는 제한 효소 NruI 사이트에 Tol1-R 서열을 포함하는 DNA 단편을, 3' 말단측에 존재하는 제한 효소 FseI 및 AscI 사이트에 Tol1-L 서열을 포함하는 DNA 단편을 삽입하였다.
또한, CMV 인핸서/프로모터 제어하에, 시클로헥시미드에 대한 내성 유전자(인간 리보솜 단백질 L36a의 54 위치의 프롤린이 글루타민으로 변이된 유전자)(서열 번호 7)가 접속된 시클로헥시미드 내성 유전자 발현 카세트를 Tol1 트랜스포존 서열이 연결된 N5LG1_M2_Z3 벡터의 FseI 인식 부위에 삽입하여, 항인간 인플루엔자 M2 항체 Tol1 트랜스포존 발현 벡터를 구축하였다(도 5).
[실시예 5]
Tol1 트랜스포사제 발현 벡터의 제작
트랜스포사제는 목적 항체의 발현 벡터와는 독립된 발현 벡터를 사용하여 발현시켰다. 즉, CMV 인핸서/프로모터 제어하에, 서열 목록의 서열 번호 16으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 송사리 유래의 Tol1 트랜스포사제를 코딩하는 DNA 단편이 접속된 Tol1 트랜스포사제 유전자 발현 카세트를 pBluescriptII SK(+)(스트라테이진사 제조)에 삽입하고, 발현 벡터 pTol1ase로서 사용하였다(도 6).
[실시예 6]
(1) 항체를 생산하는 CHO 세포의 제작
발현 벡터로서, 실시예 4 및 실시예 5의 항인간 인플루엔자 M2 항체 발현 Tol1 트랜스포존 벡터(이하, Tol1 트랜스포존 벡터로 약기함) 및 Tol1 트랜스포사제 발현 벡터 pTol1ase를 사용하였다. 또한, 세포는 실시예 3의 (1)과 동일하게 하여 부유 배양에 순화한 CHO-K1 세포를 사용하였다.
상기 발현 벡터를 부유 배양에 순화한 CHO-K1 세포에 도입하고, 시클로헥시미드에 대한 내성 클론이 얻어지는 빈도를 측정하였다. 부유 배양에 순화한 CHO-K1 세포(4×106개)를 400 μL의 PBS에 현탁하고, 항인간 인플루엔자 M2 항체 발현 Tol1 트랜스포존 벡터(10 μg)와 Tol1 트랜스포사제 발현 벡터(50 μg)를 전기 천공법에 의해 환상 DNA인 채로 함께 도입하였다. Tol1 트랜스포사제 발현 벡터는, Tol1 트랜스포사제를 일과성 발현시키기 위해, 숙주 염색체로의 조립을 방지하는 목적으로 환상 DNA인 채로 도입하였다.
전기 천공은 일렉트로포레이터(Gene Pulser XceII system(바이오래드사 제조))를 사용하고, 전압 300 V, 정전 용량 500 μF, 실온의 조건에서 갭 폭 4 mm의 큐벳(바이오래드사 제조)을 사용하여 행하였다.
전기 천공에 의한 유전자 도입 후, 각각의 세포에 대하여 2장의 96 구멍 플레이트에 파종하고, CHO 세포는 EX-CELL 325-PF 배지(SAFC 바이오사이언스사)를 사용하여 CO2 인큐베이터 내에서 3일간 배양하였다. 이어서, 유전자 도입 후 4일 후의 배지 교환부터 3 μg/mL의 시클로헥시미드를 첨가하고, 시클로헥시미드 존재하에 배양하고, 1주일마다 배지 교환을 행하면서 3주일간 배양하였다.
3주일간 배양한 후, 시클로헥시미드 내성 콜로니가 관찰되는 웰 수를 계산하였다. 그 결과를 표 3에 나타낸다. 표 3에서 실험 1 내지 3은, 각각 유전자 도입을 3회 행한 결과를 나타내고 있다.
Figure 112011097807984-pct00003
표 3에 나타낸 바와 같이, 부유성의 CHO-K1 세포에 항인간 인플루엔자 M2 항체 발현 Tol1 트랜스포존 벡터를 도입하면, 항인간 인플루엔자 M2 항체 발현 Tol2 트랜스포존 벡터를 도입한 실시예 3과 마찬가지로 시클로헥시미드 내성의 형질 전환주가 높은 빈도로 얻어졌다.
이 결과로부터, 부유성의 포유 동물 세포에서 Tol1 트랜스포존을 사용하여도 2개의 트랜스포존 서열 사이에 삽입된 항체 유전자 및 시클로헥시미드 내성 유전자가 효율적으로 숙주 세포의 염색체 내에 도입된다는 것을 알 수 있었다.
(2) 부유성 CHO 세포에서의 항체 생산의 검토
Tol1 트랜스포존을 사용하여, 부유성 CHO 세포에서의 항체 생산 효율을 검토하였다. 부유 배양에 순화한 부유성 CHO-K1 세포에 항인간 인플루엔자 M2 항체 발현 트랜스포존 벡터(10 μg)와 Tol1 트랜스포사제 발현 벡터(50 μg)를 전기 천공하였다.
그 후, 각각 2장의 96 구멍 플레이트에 파종하고, 부유 세포용 배지 EX-CELL 325-PF를 사용하여 CO2 인큐베이터 내에서 3일간 배양하였다. 전기 천공에서부터 4일 후의 배지 교환부터 3 μg/mL의 시클로헥시미드 존재하에 3주일간 배양하였다. 이때, 1주일마다 배지 교환을 행하였다.
부유성 CHO-K1 세포는 1×106개의 세포를 6 구멍 플레이트에 파종하고, CO2 인큐베이터 내에서 3일간 진탕 배양하고, 배양 상청을 사용하여 항인간 인플루엔자 M2 항체의 단백질량을 HPLC로 측정하였다.
배양 상청 중의 항체 농도의 측정은 문헌 [FEMS Yeast Res., 7, (2007), 1307-1316]에 기재된 방법에 따라 행하였다. 결과를 도 7에 나타낸다.
도 7에 나타낸 바와 같이, Tol1 트랜스포존을 사용한 경우에도 매우 높은 항체 발현량을 나타내는 세포가 다수 얻어졌다. 이 결과로부터, 트랜스포존 서열로서 Tol1 트랜스포존 유래의 염기 서열을 사용한 경우에도, Tol2 트랜스포존 유래의 염기 서열을 사용한 경우와 마찬가지로 목적 단백질을 고발현하는 부유성의 포유 동물 세포가 얻어진다는 것을 알 수 있었다.
본 발명을 특정한 양태를 사용하여 상세히 설명하였지만, 본 발명의 의도와 범위를 밧어나지 않고 다양한 변경 및 변형이 가능하다는 것은 당업자에게 있어서 분명하다. 또한, 본 출원은, 2009년 6월 11일자로 출원된 일본 특허 출원(일본 특허 출원 제2009-140626호) 및 2009년 6월 11일자로 출원된 미국 가출원(61/186,138호)에 기초하고 있으며, 그 전체가 인용에 의해 원용된다.
[산업상 이용가능성]
본 발명의 단백질의 생산 방법에 의해, 목적 단백질을 부유성의 포유 동물 세포를 사용하여 효율적으로 생산할 수 있다. 본 발명의 세포는, 유전자 재조합 단백질을 생산하기 위한 단백질 생산 세포로서 사용할 수 있다.
[서열 목록 프리 텍스트]
서열 번호 1-인공 서열의 설명; 비자율성 Tol2 트랜스포존의 염기 서열
서열 번호 2-인공 서열의 설명; Tol2-L 서열
서열 번호 3-인공 서열의 설명; Tol2-R 서열
서열 번호 7-인공 서열의 설명; 시클로헥시미드 내성 유전자의 염기 서열
서열 번호 8-인공 서열의 설명; 시클로헥시미드 내성 유전자가 코딩하는 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 9-인공 서열의 설명; M2Z3 항체 H쇄를 코딩하는 염기 서열
서열 번호 10-인공 서열의 설명; M2Z3 항체 H쇄의 아미노산 서열
서열 번호 11-인공 서열의 설명; M2Z3 항체 L쇄를 코딩하는 염기 서열
서열 번호 12-인공 서열의 설명; M2Z3 항체 L쇄의 아미노산 서열
서열 번호 13-인공 서열의 설명; 비자율성 Tol1 트랜스포존의 염기 서열
서열 번호 14-인공 서열의 설명; Tol1-L 서열
서열 번호 15-인공 서열의 설명; Tol1-R 서열
SEQUENCE LISTING <110> Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Inter-University Research Institute Corporation Research Organization of Information and Systems <120> Protein production method <130> W069874 <150> JP2009-140626 <151> 2009-06-11 <150> US61/186138 <151> 2009-06-11 <160> 17 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 2788 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence; nonautologus Tol2 transposon <400> 1 cagaggtgta aagtacttga gtaattttac ttgattactg tacttaagta ttatttttgg 60 ggatttttac tttacttgag tacaattaaa aatcaatact tttactttta cttaattaca 120 tttttttaga aaaaaaagta ctttttactc cttacaattt tatttacagt caaaaagtac 180 ttattttttg gagatcactt cattctattt tcccttgcta ttaccaaacc aattgaattg 240 cgctgatgcc cagtttaatt taaatgttat ttattctgcc tatgaaaatc gttttcacat 300 tatatgaaat tggtcagaca tgttcattgg tcctttggaa gtgacgtcat gtcacatcta 360 ttaccacaat gcacagcacc ttgacctgga aattagggaa attataacag tcaatcagtg 420 gaagaaaatg gaggaagtat gtgattcatc agcagctgcg agcagcacag tccaaaatca 480 gccacaggat caagagcacc cgtggccgta tcttcgcgaa ttcttttctt 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Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser 85 90 95 ggg ctc cag tct gag gat gag gct gat tat tac tgt gca gca tgg gat 336 Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp 100 105 110 gac agc ctg aat ggt gtg gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc 384 Asp Ser Leu Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val 115 120 125 cta ggt cag ccc aag gct gcc ccc tcg gtc act ctg ttc cca ccc tcc 432 Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser 130 135 140 tct gag gag ctt caa gcc aac aag gcc aca ctg gtg tgt ctc ata agt 480 Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser 145 150 155 160 gac ttc tac ccg gga gcc gtg aca gtg gcc tgg aag gca gat agc agc 528 Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser 165 170 175 ccc gtc aag gcg gga gtg gag acc acc aca ccc tcc aaa caa agc aac 576 Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn 180 185 190 aac aag tac gcg gcc agc agc tac ctg agc ctg acg cct gag cag tgg 624 Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp 195 200 205 aag tcc cac aaa agc tac agc tgc cag gtc acg cat gaa ggg agc acc 672 Lys Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr 210 215 220 gtg gag aag aca gtg gcc cct aca gaa tgt tca tag 708 Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 235 <210> 12 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Met Ala Ser Phe Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr His Cys Ala Gly 1 5 10 15 Ser Trp Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr 20 25 30 Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile 35 40 45 Gly Ser Lys Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Ser Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser 85 90 95 Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp 100 105 110 Asp Ser Leu Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val 115 120 125 Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser 130 135 140 Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser 145 150 155 160 Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser 165 170 175 Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn 180 185 190 Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp 195 200 205 Lys Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr 210 215 220 Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 235 <210> 13 <211> 1855 <212> DNA <213> artificial <220> <223> nonautologus Tol1 transposon <400> 13 cagtagcggt tctaggcacg ggccgtccgg gcggtggcct ggggcggaaa actgaagggg 60 ggcggcaccg gcggctcagc cctttgtaat atattaatat gcaccactat tggtttactt 120 atgtcacagt ttgtaagttt gtaacagcct gaacctggcc gcgccgccgc cctcgccccg 180 cagctgcgct ctcctgtctt tgagaagtag acacaaatgt gtgtgaagaa ggagaaggga 240 gggggcgcgg ggtgagcacg gagcgtcgcc gcgtttgcgc atgcgcaaaa cctggctggc 300 tcatctttca ggggaggcga cggtcgcggg cttgatgaaa aaaataaaag taaaaactgc 360 gactgcgccg tcatgtagcg aatcagcgcc cctggctgta gctgcacgcg ctcctgctgg 420 aaatgtgtga agaggggggg gggggggggg gctgcgggga atcagttcaa ttgtgggacg 480 cttccaaatt aagtggctag gtggggacaa gggcgggggt ttgaatctac ttcataaaac 540 ctttttatat tataagtcag tcataaggtg acattctata acctacattt taataaaggt 600 ataaaaaata tattctgctt tttttgggtt aattttgtgt gaaatgtcca aataaaaaaa 660 atggcaacac aaaacaatgc tgtcactaag gtgacagttg gttcagtcga cggacttgat 720 gccttcttcg tgacgtgagg acatttatgc caaacaaacg ccaataaaca tctaaaatat 780 ggaaaagaaa aggtcaaagc catctggtgc ccaatttaga aagaaaagaa aagaagaaga 840 ggagaaaaga gataaagaaa agggtaagtc ctcacagctt gatgcatgtt ttttctaaat 900 tctaatgcta cctgccctac aacaacgttg ccgatgaaaa ctttattttg gtcgatgacc 960 aacactgaat taggcccaaa tgttgcaaat agcgtcattt tttttttttt ttttagattt 1020 tattcttaaa aatttgctct gccttaactt gtaacattag ttatgattca tgtgtctgtc 1080 tgctctgctg taacacaaag gttttgttgg gttttgctgt tgtatactag ctcataatgt 1140 taaaaaagct gtgatggtta cacagcatgc tggtgctgcc ataagatgct aatggggcaa 1200 ataatttgag attggtcatt aatttaataa tcatttgtgg cagcctaaac gttttcacaa 1260 tgtttttttg acatttaact ggggatttag gggttaattt tgagcctgca tatgaagttt 1320 attttttatt tgttttacaa atgtgggatt atatttttag ccaatagaat ttccataaat 1380 ctgtaggtag ttttaaaaat gaatatttac catttactgc aactctatgg ggacaaaaca 1440 taatgtaaca ggtcataact aaaaatgtgc caatcaaagg attgaagacg gaaaacatga 1500 gttaattttt cttctctgaa gtagagatcg atatagaaca tgacaattta aatttccaat 1560 tcataaatgt ttttaaaata tttattttat attatttatt taacattgag tttgattcaa 1620 tattttctta gctaactgta tttttgccat gcttatggtc ttttattttt tgtgttctga 1680 taacttttat aatgcttttc agaattttga catcttttgt atccacttct taatttcaat 1740 gacaataaaa catttcagtt gacgaagaca aacaaagttc tgttgtgact atgggggggg 1800 ggggcgcctg gggatggtct cgcccgggga gtaattcagg gtagaaccgc cactg 1855 <210> 14 <211> 200 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Tol1-L transposon sequence <400> 14 cagtagcggt tctaggcacg ggccgtccgg gcggtggcct ggggcggaaa actgaagggg 60 ggcggcaccg gcggctcagc cctttgtaat atattaatat gcaccactat tggtttactt 120 atgtcacagt ttgtaagttt gtaacagcct gaacctggcc gcgccgccgc cctcgccccg 180 cagctgcgct ctcctgtctt 200 <210> 15 <211> 505 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Tol1-R transoposon sequence <400> 15 atatttttag ccaatagaat ttccataaat ctgtaggtag ttttaaaaat gaatatttac 60 catttactgc aactctatgg ggacaaaaca taatgtaaca ggtcataact aaaaatgtgc 120 caatcaaagg attgaagacg gaaaacatga gttaattttt cttctctgaa gtagagatcg 180 atatagaaca tgacaattta aatttccaat tcataaatgt ttttaaaata tttattttat 240 attatttatt taacattgag tttgattcaa tattttctta gctaactgta tttttgccat 300 gcttatggtc ttttattttt tgtgttctga taacttttat aatgcttttc agaattttga 360 catcttttgt atccacttct taatttcaat gacaataaaa catttcagtt gacgaagaca 420 aacaaagttc tgttgtgact atgggggggg ggggcgcctg gggatggtct cgcccgggga 480 gtaattcagg gtagaaccgc cactg 505 <210> 16 <211> 2745 <212> DNA <213> Oryzias latipes <220> <221> CDS <222> (30)..(2585) <400> 16 gccaaacaaa cgccaaaaac atctaaaat atg gag aaa aaa agg tca aag cca 53 Met Glu Lys Lys Arg Ser Lys Pro 1 5 tct ggt gcc caa ttt aga aag aaa aga aaa gaa gaa gag gag aaa aga 101 Ser Gly Ala Gln Phe Arg Lys Lys Arg Lys Glu Glu Glu Glu Lys Arg 10 15 20 gat aaa gaa aag ggg gca ctt cta aga tat ttt gga tcg tct acc act 149 Asp Lys Glu Lys Gly Ala Leu Leu Arg Tyr Phe Gly Ser Ser Thr Thr 25 30 35 40 gct caa gat gag aca tct acc tcc ctg cca gct atc tca tca gcc aca 197 Ala Gln Asp Glu Thr Ser Thr Ser Leu Pro Ala Ile Ser Ser Ala Thr 45 50 55 gtc aca gtc tca ccc cct cag gat gag cta cca tct aca tcc tct gct 245 Val Thr Val Ser Pro Pro Gln Asp Glu Leu Pro Ser Thr Ser Ser Ala 60 65 70 act cat gta gtt cca cag ttg tta cct gag caa agt ttt gat agt gag 293 Thr His Val Val Pro Gln Leu Leu Pro Glu Gln Ser Phe Asp Ser Glu 75 80 85 gct gaa gac gtt gtt cca tct acg tct acc cag ctt gag act tca gaa 341 Ala Glu Asp Val Val Pro Ser Thr Ser Thr Gln Leu Glu Thr Ser Glu 90 95 100 atg cct ggt gat gaa acc cca ctg acc ccg act gct gag gac cag cct 389 Met Pro Gly Asp Glu Thr Pro Leu Thr Pro Thr Ala Glu Asp Gln Pro 105 110 115 120 cta cca act gac cct gca aag tgg ccc tca cct ctg act gac agg ata 437 Leu Pro Thr Asp Pro Ala Lys Trp Pro Ser Pro Leu Thr Asp Arg Ile 125 130 135 cgg atg gag ctg gtt cga aga gga cca agt agc ata cca cct gac ttt 485 Arg Met Glu Leu Val Arg Arg Gly Pro Ser Ser Ile Pro Pro Asp Phe 140 145 150 gtt ttc cca aga aat gac agt gat ggg aga agt tgt cat cac cac tat 533 Val Phe Pro Arg Asn Asp Ser Asp Gly Arg Ser Cys His His His Tyr 155 160 165 ttc agg aag aca cta gta agt ggt gaa aaa ata gca aga act tgg ttg 581 Phe Arg Lys Thr Leu Val Ser Gly Glu Lys Ile Ala Arg Thr Trp Leu 170 175 180 atg tat tca aaa gtg aag aac agc ctc ttt tgc ttt tgt tgc aaa ttg 629 Met Tyr Ser Lys Val Lys Asn Ser Leu Phe Cys Phe Cys Cys Lys Leu 185 190 195 200 ttt tcc aac aaa aac att aat tta aca act tct ggt aca gca aac tgg 677 Phe Ser Asn Lys Asn Ile Asn Leu Thr Thr Ser Gly Thr Ala Asn Trp 205 210 215 aaa cat gca agc aca tac ctc aca gca cac gaa aaa agc cca gaa cac 725 Lys His Ala Ser Thr Tyr Leu Thr Ala His Glu Lys Ser Pro Glu His 220 225 230 ctc aat tgt atg aaa gca tgg aag gaa ctg tca ggg agg atc aga agt 773 Leu Asn Cys Met Lys Ala Trp Lys Glu Leu Ser Gly Arg Ile Arg Ser 235 240 245 ggg aaa aca att gat aag cag gag atg gca ctt ctg gaa gag gag cgg 821 Gly Lys Thr Ile Asp Lys Gln Glu Met Ala Leu Leu Glu Glu Glu Arg 250 255 260 gtg aga tgg aga gca gtg cta acc cgt ctc att gct att gtg cag tca 869 Val Arg Trp Arg Ala Val Leu Thr Arg Leu Ile Ala Ile Val Gln Ser 265 270 275 280 ctg gca gtt cgg aat ttg gct cta agg gga cac aca gaa aca ctg ttc 917 Leu Ala Val Arg Asn Leu Ala Leu Arg Gly His Thr Glu Thr Leu Phe 285 290 295 aca tca tca aat ggg aat ttt ttg aaa gag gtt gaa ctg atg gcc agg 965 Thr Ser Ser Asn Gly Asn Phe Leu Lys Glu Val Glu Leu Met Ala Arg 300 305 310 ttt gat ccc ata atg aaa gat cat ctt aac cgt gta tta aga gga aca 1013 Phe Asp Pro Ile Met Lys Asp His Leu Asn Arg Val Leu Arg Gly Thr 315 320 325 gca agt cac aac agc tac ata ggc cat cat gtg cag aat gaa ctt att 1061 Ala Ser His Asn Ser Tyr Ile Gly His His Val Gln Asn Glu Leu Ile 330 335 340 gat ttg ttg agc agc aaa atc cta tcc gct ata gtg gat gac atc aaa 1109 Asp Leu Leu Ser Ser Lys Ile Leu Ser Ala Ile Val Asp Asp Ile Lys 345 350 355 360 aag gca aaa tat ttt tca ata att ctg gac tgc act ctg gat ata agc 1157 Lys Ala Lys Tyr Phe Ser Ile Ile Leu Asp Cys Thr Leu Asp Ile Ser 365 370 375 cac aca gaa cag ttg tca gtt ata att aga gtg gtg tca ctg atg gag 1205 His Thr Glu Gln Leu Ser Val Ile Ile Arg Val Val Ser Leu Met Glu 380 385 390 aag cct cag atc agg gaa cat ttt atg ggg ttt ttg gag gca gag gag 1253 Lys Pro Gln Ile Arg Glu His Phe Met Gly Phe Leu Glu Ala Glu Glu 395 400 405 tcc aca ggc cag cac ttg gca tcc atg atc tta aac aga ctt gag gag 1301 Ser Thr Gly Gln His Leu Ala Ser Met Ile Leu Asn Arg Leu Glu Glu 410 415 420 tta gga att tct ttt gaa gac tgc aga gga caa tca tat gat aat ggg 1349 Leu Gly Ile Ser Phe Glu Asp Cys Arg Gly Gln Ser Tyr Asp Asn Gly 425 430 435 440 gca aat atg aaa ggc aaa aat aag gga gta caa gcc agg ctc tta gaa 1397 Ala Asn Met Lys Gly Lys Asn Lys Gly Val Gln Ala Arg Leu Leu Glu 445 450 455 aag aat ccc cgt gct ctg ttt ttg cca tgc ggt gca cac aca ttg aat 1445 Lys Asn Pro Arg Ala Leu Phe Leu Pro Cys Gly Ala His Thr Leu Asn 460 465 470 tta gtt gtg tgt gat gct gct aag aga tct gtt gat gct atg agc tac 1493 Leu Val Val Cys Asp Ala Ala Lys Arg Ser Val Asp Ala Met Ser Tyr 475 480 485 ttt ggt gtc ctg caa aag ctt tac act tta ttt tca gcc tct gcc caa 1541 Phe Gly Val Leu Gln Lys Leu Tyr Thr Leu Phe Ser Ala Ser Ala Gln 490 495 500 cga tgg gcc ata ctg aag agt cag gtg agc atc act cta aag tcg tgg 1589 Arg Trp Ala Ile Leu Lys Ser Gln Val Ser Ile Thr Leu Lys Ser Trp 505 510 515 520 aca gaa aca agg tgg gag agc aaa atc aaa agc atc gag ccc atg agg 1637 Thr Glu Thr Arg Trp Glu Ser Lys Ile Lys Ser Ile Glu Pro Met Arg 525 530 535 tac cag gga gct gca gtg aga gag gct tta ata gaa gtg aga gac aag 1685 Tyr Gln Gly Ala Ala Val Arg Glu Ala Leu Ile Glu Val Arg Asp Lys 540 545 550 acc aaa gac cca gtt ata aag gct gag gcc cag tct ttg tct gaa gag 1733 Thr Lys Asp Pro Val Ile Lys Ala Glu Ala Gln Ser Leu Ser Glu Glu 555 560 565 gta ggg tcg tac cgc ttc aac atc tgc aca gtc gta tgg cat gac att 1781 Val Gly Ser Tyr Arg Phe Asn Ile Cys Thr Val Val Trp His Asp Ile 570 575 580 cta tct aca ata aag cat gtc agc aaa ctc atg cag tct cca aat atg 1829 Leu Ser Thr Ile Lys His Val Ser Lys Leu Met Gln Ser Pro Asn Met 585 590 595 600 cat gtg gac cta gct gtg agt ctt ttg aag aag act gaa caa agt ctc 1877 His Val Asp Leu Ala Val Ser Leu Leu Lys Lys Thr Glu Gln Ser Leu 605 610 615 cag agc tac agg gca aat ggc ttt gtg aat gca cag atg gca gcc aaa 1925 Gln Ser Tyr Arg Ala Asn Gly Phe Val Asn Ala Gln Met Ala Ala Lys 620 625 630 gaa atg tgc aag gaa atg aat gtc gag gct att ttg aaa caa aaa aga 1973 Glu Met Cys Lys Glu Met Asn Val Glu Ala Ile Leu Lys Gln Lys Arg 635 640 645 ata aga tcc aca aag tgc caa ttc tcg tat gaa tca cac gat gag cct 2021 Ile Arg Ser Thr Lys Cys Gln Phe Ser Tyr Glu Ser His Asp Glu Pro 650 655 660 ttc agt gac gca ctt aaa aag ttg gag gtt gaa ttt ttc aat gtt gtt 2069 Phe Ser Asp Ala Leu Lys Lys Leu Glu Val Glu Phe Phe Asn Val Val 665 670 675 680 gtt gat gaa gcc ttg tca gcc atc gcg gag agg ttt tcc aca ttg gaa 2117 Val Asp Glu Ala Leu Ser Ala Ile Ala Glu Arg Phe Ser Thr Leu Glu 685 690 695 gtt gta caa aac aga ttt ggg gtt ttg acc aat ttc cca agc ctt gga 2165 Val Val Gln Asn Arg Phe Gly Val Leu Thr Asn Phe Pro Ser Leu Gly 700 705 710 gac gag gag ctg acg gag caa tgc gag gca cta ggc aac ata ctc cat 2213 Asp Glu Glu Leu Thr Glu Gln Cys Glu Ala Leu Gly Asn Ile Leu His 715 720 725 ttt gag aag aac tgg gat ttg gac agt aga gag ctt gtt cag gaa atc 2261 Phe Glu Lys Asn Trp Asp Leu Asp Ser Arg Glu Leu Val Gln Glu Ile 730 735 740 aag aac ttg cct aac tta cca tca acg act cca agt ctc ctt gag ctc 2309 Lys Asn Leu Pro Asn Leu Pro Ser Thr Thr Pro Ser Leu Leu Glu Leu 745 750 755 760 atc tct ttc atg tct gat aag gat cta tca gaa atc tat ccg aac ttt 2357 Ile Ser Phe Met Ser Asp Lys Asp Leu Ser Glu Ile Tyr Pro Asn Phe 765 770 775 tgg act gct ctc agg att gca ctc acc ttg cca gtc act gtg gct caa 2405 Trp Thr Ala Leu Arg Ile Ala Leu Thr Leu Pro Val Thr Val Ala Gln 780 785 790 gca gag agg agc ttt tca aaa cta aaa ttg atc aag tcg tac ctg agg 2453 Ala Glu Arg Ser Phe Ser Lys Leu Lys Leu Ile Lys Ser Tyr Leu Arg 795 800 805 tca aca atg tca cag gag cga ctc act aac ctt gcc gtt gtt agc atc 2501 Ser Thr Met Ser Gln Glu Arg Leu Thr Asn Leu Ala Val Val Ser Ile 810 815 820 aat cac tca gta ggg gag cag ata tca tat gat gat gtt att gac gag 2549 Asn His Ser Val Gly Glu Gln Ile Ser Tyr Asp Asp Val Ile Asp Glu 825 830 835 840 ttt gca tca aga aag gct agg aag gtt agg ttt tag ttggtgtttt 2595 Phe Ala Ser Arg Lys Ala Arg Lys Val Arg Phe 845 850 ctgttattgt attggtgctg cagttatatt tattttagcg tgtcatttgt gtgataaaag 2655 gtttgtgctt tataatattt attttatatt atttattcaa tattgagttt gattcaatat 2715 tttcttagct aactgtattt ttgccatgct 2745 <210> 17 <211> 851 <212> PRT <213> Oryzias latipes <400> 17 Met Glu Lys Lys Arg Ser Lys Pro Ser Gly Ala Gln Phe Arg Lys Lys 1 5 10 15 Arg Lys Glu Glu Glu Glu Lys Arg Asp Lys Glu Lys Gly Ala Leu Leu 20 25 30 Arg Tyr Phe Gly Ser Ser Thr Thr Ala Gln Asp Glu Thr Ser Thr Ser 35 40 45 Leu Pro Ala Ile Ser Ser Ala Thr Val Thr Val Ser Pro Pro Gln Asp 50 55 60 Glu Leu Pro Ser Thr Ser Ser Ala Thr His Val Val Pro Gln Leu Leu 65 70 75 80 Pro Glu Gln Ser Phe Asp Ser Glu Ala Glu Asp Val Val Pro Ser Thr 85 90 95 Ser Thr Gln Leu Glu Thr Ser Glu Met Pro Gly Asp Glu Thr Pro Leu 100 105 110 Thr Pro Thr Ala Glu Asp Gln Pro Leu Pro Thr Asp Pro Ala Lys Trp 115 120 125 Pro Ser Pro Leu Thr Asp Arg Ile Arg Met Glu Leu Val Arg Arg Gly 130 135 140 Pro Ser Ser Ile Pro Pro Asp Phe Val Phe Pro Arg Asn Asp Ser Asp 145 150 155 160 Gly Arg Ser Cys His His His Tyr Phe Arg Lys Thr Leu Val Ser Gly 165 170 175 Glu Lys Ile Ala Arg Thr Trp Leu Met Tyr Ser Lys Val Lys Asn Ser 180 185 190 Leu Phe Cys Phe Cys Cys Lys Leu Phe Ser Asn Lys Asn Ile Asn Leu 195 200 205 Thr Thr Ser Gly Thr Ala Asn Trp Lys His Ala Ser Thr Tyr Leu Thr 210 215 220 Ala His Glu Lys Ser Pro Glu His Leu Asn Cys Met Lys Ala Trp Lys 225 230 235 240 Glu Leu Ser Gly Arg Ile Arg Ser Gly Lys Thr Ile Asp Lys Gln Glu 245 250 255 Met Ala Leu Leu Glu Glu Glu Arg Val Arg Trp Arg Ala Val Leu Thr 260 265 270 Arg Leu Ile Ala Ile Val Gln Ser Leu Ala Val Arg Asn Leu Ala Leu 275 280 285 Arg Gly His Thr Glu Thr Leu Phe Thr Ser Ser Asn Gly Asn Phe Leu 290 295 300 Lys Glu Val Glu Leu Met Ala Arg Phe Asp Pro Ile Met Lys Asp His 305 310 315 320 Leu Asn Arg Val Leu Arg Gly Thr Ala Ser His Asn Ser Tyr Ile Gly 325 330 335 His His Val Gln Asn Glu Leu Ile Asp Leu Leu Ser Ser Lys Ile Leu 340 345 350 Ser Ala Ile Val Asp Asp Ile Lys Lys Ala Lys Tyr Phe Ser Ile Ile 355 360 365 Leu Asp Cys Thr Leu Asp Ile Ser His Thr Glu Gln Leu Ser Val Ile 370 375 380 Ile Arg Val Val Ser Leu Met Glu Lys Pro Gln Ile Arg Glu His Phe 385 390 395 400 Met Gly Phe Leu Glu Ala Glu Glu Ser Thr Gly Gln His Leu Ala Ser 405 410 415 Met Ile Leu Asn Arg Leu Glu Glu Leu Gly Ile Ser Phe Glu Asp Cys 420 425 430 Arg Gly Gln Ser Tyr Asp Asn Gly Ala Asn Met Lys Gly Lys Asn Lys 435 440 445 Gly Val Gln Ala Arg Leu Leu Glu Lys Asn Pro Arg Ala Leu Phe Leu 450 455 460 Pro Cys Gly Ala His Thr Leu Asn Leu Val Val Cys Asp Ala Ala Lys 465 470 475 480 Arg Ser Val Asp Ala Met Ser Tyr Phe Gly Val Leu Gln Lys Leu Tyr 485 490 495 Thr Leu Phe Ser Ala Ser Ala Gln Arg Trp Ala Ile Leu Lys Ser Gln 500 505 510 Val Ser Ile Thr Leu Lys Ser Trp Thr Glu Thr Arg Trp Glu Ser Lys 515 520 525 Ile Lys Ser Ile Glu Pro Met Arg Tyr Gln Gly Ala Ala Val Arg Glu 530 535 540 Ala Leu Ile Glu Val Arg Asp Lys Thr Lys Asp Pro Val Ile Lys Ala 545 550 555 560 Glu Ala Gln Ser Leu Ser Glu Glu Val Gly Ser Tyr Arg Phe Asn Ile 565 570 575 Cys Thr Val Val Trp His Asp Ile Leu Ser Thr Ile Lys His Val Ser 580 585 590 Lys Leu Met Gln Ser Pro Asn Met His Val Asp Leu Ala Val Ser Leu 595 600 605 Leu Lys Lys Thr Glu Gln Ser Leu Gln Ser Tyr Arg Ala Asn Gly Phe 610 615 620 Val Asn Ala Gln Met Ala Ala Lys Glu Met Cys Lys Glu Met Asn Val 625 630 635 640 Glu Ala Ile Leu Lys Gln Lys Arg Ile Arg Ser Thr Lys Cys Gln Phe 645 650 655 Ser Tyr Glu Ser His Asp Glu Pro Phe Ser Asp Ala Leu Lys Lys Leu 660 665 670 Glu Val Glu Phe Phe Asn Val Val Val Asp Glu Ala Leu Ser Ala Ile 675 680 685 Ala Glu Arg Phe Ser Thr Leu Glu Val Val Gln Asn Arg Phe Gly Val 690 695 700 Leu Thr Asn Phe Pro Ser Leu Gly Asp Glu Glu Leu Thr Glu Gln Cys 705 710 715 720 Glu Ala Leu Gly Asn Ile Leu His Phe Glu Lys Asn Trp Asp Leu Asp 725 730 735 Ser Arg Glu Leu Val Gln Glu Ile Lys Asn Leu Pro Asn Leu Pro Ser 740 745 750 Thr Thr Pro Ser Leu Leu Glu Leu Ile Ser Phe Met Ser Asp Lys Asp 755 760 765 Leu Ser Glu Ile Tyr Pro Asn Phe Trp Thr Ala Leu Arg Ile Ala Leu 770 775 780 Thr Leu Pro Val Thr Val Ala Gln Ala Glu Arg Ser Phe Ser Lys Leu 785 790 795 800 Lys Leu Ile Lys Ser Tyr Leu Arg Ser Thr Met Ser Gln Glu Arg Leu 805 810 815 Thr Asn Leu Ala Val Val Ser Ile Asn His Ser Val Gly Glu Gln Ile 820 825 830 Ser Tyr Asp Asp Val Ile Asp Glu Phe Ala Ser Arg Lys Ala Arg Lys 835 840 845 Val Arg Phe 850

Claims (35)

  1. 목적 단백질을 코딩하는 DNA 및 선택 마커 유전자를 포함하는 유전자 단편의 양단에 Tol1 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열 또는 Tol2 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열을 포함하는 단백질 발현 벡터를 부유성의 CHO 세포에 도입하고, 한쌍의 Tol1 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열 또는 Tol2 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열 사이에 삽입된 상기 유전자 단편을 상기 CHO 세포의 염색체에 조립하여 상기 목적 단백질을 발현하는 CHO 세포를 얻고, 상기 CHO 세포를 부유 배양하여 상기 목적 단백질을 생산하는, 목적 단백질의 생산 방법.
  2. 이하의 공정 (A) 내지 (C)를 포함하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 생산 방법.
    (A) 이하의 발현 벡터 (a) 및 (b)를 부유성의 CHO 세포에 동시에 도입하는 공정
    (a) 목적 단백질을 코딩하는 DNA와 선택 마커 유전자를 포함하는 유전자 단편의 양단에 Tol1 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열 또는 Tol2 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열을 포함하는 발현 벡터
    (b) Tol1 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열 또는 Tol2 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열을 인식하여, 한쌍의 Tol1 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열 또는 Tol2 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열 사이에 삽입된 유전자 단편을 염색체에 전이시키는 활성을 갖는 트랜스포사제를 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터
    (B) 공정 (A)에서 도입한 발현 벡터 (b)에 의해 트랜스포사제를 일과성 발현시켜, 한쌍의 Tol1 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열 또는 Tol2 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열 사이에 삽입된 상기 유전자 단편을 상기 CHO 세포의 염색체에 조립하고, 목적 단백질을 발현하는 부유성의 CHO 세포를 얻는 공정
    (C) 공정 (B)에서 얻어진 목적 단백질을 발현하는 부유성의 CHO 세포를 부유 배양하여, 목적 단백질을 생산하는 공정
  3. 목적 단백질을 코딩하는 DNA 및 선택 마커 유전자를 포함하는 유전자 단편의 양단에 Tol1 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열 또는 Tol2 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열을 포함하는 단백질 발현 벡터를 부유성의 CHO 세포에 도입하고, 한쌍의 Tol1 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열 또는 Tol2 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열 사이에 삽입된 상기 유전자 단편을 상기 CHO 세포의 염색체에 조립하여 상기 목적 단백질을 발현하는 부유성의 CHO 세포를 얻는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 부유성의 CHO 세포가 무혈청 배양에서 생존 및 증식 가능한 세포인 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 부유성의 CHO 세포가 CHO 세포를 부유 배양에 순화한 부유성의 CHO 세포인 방법.
  6. 제5항에 있어서, CHO 세포가 CHO-K1, CHO-K1SV, DUKXB11, CHO/DG44, Pro-3 및 CHO-S로부터 선택되는 적어도 하나인 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 선택 마커 유전자가 시클로헥시미드 내성 유전자인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 시클로헥시미드 내성 유전자가 인간 리보솜 단백질 L36a의 변이체를 코딩하는 유전자인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 변이체가 인간 리보솜 단백질 L36a의 54 위치의 프롤린이 다른 아미노산으로 치환된 변이체인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 다른 아미노산이 글루타민인 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 한쌍의 Tol2 트랜스포존의 염기 서열이 서열 번호 2로 표시되는 염기 서열 및 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열인 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 한쌍의 Tol1 트랜스포존의 염기 서열이 서열 번호 14로 표시되는 염기 서열 및 서열 번호 15로 표시되는 염기 서열인 방법.
  13. 목적 단백질을 코딩하는 DNA 및 선택 마커 유전자를 포함하는 유전자 단편의 양단에 Tol1 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열 또는 Tol2 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열을 포함하는 단백질 발현 벡터가 도입되고, 한쌍의 Tol1 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열 또는 Tol2 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열 사이에 삽입된 상기 유전자 단편이 염색체에 조립되어, 상기 목적 단백질을 생산하는 부유성의 CHO 세포.
  14. 목적 단백질을 코딩하는 DNA와 선택 마커 유전자를 포함하는 유전자 단편의 양단에 Tol1 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열 또는 Tol2 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열을 포함하는 발현 벡터 (a), 및 상기 Tol1 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열 또는 Tol2 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열을 인식하여, 한쌍의 Tol1 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열 또는 Tol2 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열 사이에 삽입된 유전자 단편을 염색체에 전이시키는 활성을 갖는 트랜스포사제(전이 효소)를 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터 (b)를 동시에 도입시킴으로써, 상기 한쌍의 Tol1 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열 또는 Tol2 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열 사이에 삽입된 상기 유전자 단편이 염색체에 조립되어, 상기 목적 단백질을 생산하는 부유성의 CHO 세포.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 무혈청 배양에서 생존 및 증식 가능한 부유성의 CHO 세포인 세포.
  16. 제13항 또는 제14항에 있어서, 부유성의 CHO 세포가 CHO 세포를 부유 배양에 순화한 부유성의 CHO 세포인 세포.
  17. 제16항에 있어서, CHO 세포가 CHO-K1, CHO-K1SV, DUKXB11, CHO/DG44, Pro-3 및 CHO-S로부터 선택되는 적어도 하나인 세포.
  18. 제13항 또는 제14항에 있어서, 선택 마커 유전자가 시클로헥시미드 내성 유전자인 세포.
  19. 제18항에 있어서, 시클로헥시미드 내성 유전자가 인간 리보솜 단백질 L36a의 변이체를 코딩하는 유전자인 세포.
  20. 제19항에 있어서, 변이체가 인간 리보솜 단백질 L36a의 54 위치의 프롤린이 다른 아미노산으로 치환된 변이체인 세포.
  21. 제20항에 있어서, 다른 아미노산이 글루타민인 세포.
  22. 제13항 또는 제14항에 있어서, 한쌍의 Tol2 트랜스포존의 염기 서열이 서열 번호 2로 표시되는 염기 서열 및 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열인 세포.
  23. 제13항 또는 제14항에 있어서, 한쌍의 Tol1 트랜스포존의 염기 서열이 서열 번호 14로 표시되는 염기 서열 및 서열 번호 15로 표시되는 염기 서열인 세포.
  24. 목적 단백질을 코딩하는 DNA 및 선택 마커 유전자를 포함하는 유전자 단편의 양단에 한쌍의 Tol1 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열 또는 Tol2 트랜스포존의 염기 서열을 포함하는 염기 서열을 포함하는 단백질 발현 벡터.
  25. 제24항에 있어서, 한쌍의 Tol2 트랜스포존의 염기 서열이 서열 번호 2로 표시되는 염기 서열 및 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열인 단백질 발현 벡터.
  26. 제24항에 있어서, 한쌍의 Tol1 트랜스포존의 염기 서열이 서열 번호 14로 표시되는 염기 서열 및 서열 번호 15로 표시되는 염기 서열인 단백질 발현 벡터.
  27. 제3항에 있어서, 부유성의 CHO 세포가 무혈청 배양에서 생존 및 증식 가능한 세포인 방법.
  28. 제3항에 있어서, 부유성의 CHO 세포가 CHO 세포를 부유 배양에 순화한 부유성의 CHO 세포인 방법.
  29. 제28항에 있어서, CHO 세포가 CHO-K1, CHO-K1SV, DUKXB11, CHO/DG44, Pro-3 및 CHO-S로부터 선택되는 적어도 하나인 방법.
  30. 제3항에 있어서, 선택 마커 유전자가 시클로헥시미드 내성 유전자인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 시클로헥시미드 내성 유전자가 인간 리보솜 단백질 L36a의 변이체를 코딩하는 유전자인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 변이체가 인간 리보솜 단백질 L36a의 54 위치의 프롤린이 다른 아미노산으로 치환된 변이체인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 다른 아미노산이 글루타민인 방법.
  34. 제3항에 있어서, 한쌍의 Tol2 트랜스포존의 염기 서열이 서열 번호 2로 표시되는 염기 서열 및 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열인 방법.
  35. 제3항에 있어서, 한쌍의 Tol1 트랜스포존의 염기 서열이 서열 번호 14로 표시되는 염기 서열 및 서열 번호 15로 표시되는 염기 서열인 방법.
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