JPH04504950A - 位置特異的挿入ベクターおよびこれを用いた方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １２、前記組み込まれたヘルパーウィルスが複製不能である請求項１１記載の改 変されたヘルパー細胞系。

１３、前記組み込まれたヘルパーウィルスカー組換えを介して請求項６記載の遺 伝子を直接取り込んだ産物である請求項１２記載の改変されたヘルパー細胞系。

１４、前記組み込まれたヘルパーウィルメカＣ１ａ、プロモーター−翻訳開始領 域をコードする核酸配列；ｂ　核酸結合ポリペプチドをコードする核酸配列：Ｃ ４逆転写酵素をコードするヌクレオチドとともに請求項７記載の遺伝子を包含す る核酸配列、および ｄ　エンベロープポリペプチドをコードする核酸配列。

を含む請求項１１記載の改変されたヘルパー細胞系。

１５　前記細胞系がｐｓｉ−２である請求項１４記載の改変されたヘルパー細胞 系。

１６、前記組み込まれた配列がモロニーマウス白血病ウィルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ）に由来する請求項１４記載の改 変されたヘルパー細胞系。

１７、請求項１１記載の改変されたヘルパー細胞系であって、その細胞境界内部 に請求項２記載のベクターが存在するヘルパー細胞系。

１８、内部ドメイン核酸配列の５°末端に隣接する位置特異的組込みマーカーが 、転写産物として発現されたとき、下記の配列：ＴＡＴＴＡＧＧＡＴＴ　ＧＴＣ ＡＡＧＡＣＡＣｕＡＴｒＡ　（ＴＣＧＡＧＩ：（Ｉ　ＴＭＴＡＣＡＡＣＡである こと、および内部ドメイン核酸配列の３゛末端に隣接する位置特異的組込みマー カーが、転写産物として発現されたとき、下記の配列：覧宵石ＡＴＣＴ　ＣＡＡ ＡＡＴＧＡＧＡ　ＴＡＴ（？ｒＣＡ（７ｒＡ　ＴＧＡＣＡＡＴＡＣＧ冗Ａｎであ ること、およびさらにこれらの配列がその複製された完全な長さのＤＮＡにおい て、３・および５°外側末端並びに内部的にそれぞれ見いだされる請求項１７記 載の改変されたヘルパーｍ胞晟 １９、位置特異的方法で細胞のゲノム中に外来遺伝子を挿入可能な伝達ベクター であって、 ａ、サツカロマイセス・セレビシェ　Ｔｙ３エンドヌクレアーゼの位置特異性を 有するエンドヌクレアーゼまたは前記エンドヌクレアーゼをコードし前記細胞中 において発現可能な核酸：およ、び す、前記ゲノム中に挿入される外来遺伝子で、前記遺伝子カー前記エンドヌクレ アーゼによって認識される位置特異的組込みマーカーの間に位置する遺伝子；を 含む伝達ベクター。

２０、前記遺伝子がＤＮＡからなる請求項１９記載の伝達ベクター。

２１、前記遺伝子がＲＮＡからなり、前記ベクターがさらに逆転写酵素または前 記細胞中において逆転写酵素をコードする発現可能な核酸配列を含む請求項１９ 記載の伝達ベクター。

２２　さ引ミ前記エンドヌクレアーゼおよび前記遺伝子が含有されるエンベロー プを含む請求項２０または２１記載の伝達ベクター。

２３、前記エンベロープがウィルスエンベロープである請求項２２記載のベクタ ２４、前記エンベロープが脂質小胞である請求項２２記載のベクター。

２５、サツカロマイセス・セレビシェ　ＴＹ３エンドヌクレアーゼに特異的な抗 体。

２６、サツカロマイセス・セレビシェ　ＴＹ３エンドヌクレアーゼに特異的な抗 体を産生じおよび分泌する継代株化細胞。

２７、ｔＲＮＡの隣に特異的に遺伝子を挿入可能な伝達ベクターを作製する方法 であって、以下の段階からなる方法。

ａ、核酸結合性ポリペプチドをコードする核酸配鳳　プロモーター−翻訳開始領 域を含み、逆転写酵素およびサツカロマイセス・セレビシェ　エンドヌクレアー ゼを含むポリペプチドをコードする核酸配ダ１１　およびエンベロープをコード する核酸配列を含む第１の外来性の、複製不能なヌクレオチド配列を有するヘル パー細胞系を準備すること、および す、前記ヘルパー細胞系の細胞境界内部において、所望のタンパク質をコードす る遺伝子を含む第２の組換え核酸配列を準備することであり、前記遺伝子がサツ カロマイセス・セレビシェ　ＴＹ３の位置特異的組込みマーカーが隣接している こと。

Ｃ前記第２の核酸配列またはそれからの核酸誘導体を前記ヘルパー細胞系中にパ ッケージし伝達ベクターを産生ずる。

２８゜サツカロマイセス・セレビシェ　Ｔｙ３エンドヌクレアーゼに特異的な抗 体を生産する方法であって、以下の段階からなる方法。

ａ、動物をサツカロマイセス・セレビシェ　Ｔｙ３エンドヌクレアーゼによって 免疫すること、 ｂ　前記免疫化された動物から抗体産生細胞を採取すること、Ｃ前記細胞を永久 分裂可能な細胞と融合させ、ハイブリッド細胞を形成させること、 ｄ、サツカロマイセス・セレビシェ　Ｔｙ３エンドヌクレアーゼに特異的な抗体 を産生するハイブリッド細胞を選択すること、ｅ、サツカロマイセス・セレビシ ェ　Ｔｙ３エンドヌクレアーゼに特異的な抗体を前記選択されたハイブリッド細 胞から採取すること。

２９、実質的に純粋なサツカロマイセス・セレビシェ　ＴＶ３エンドヌクレアー ゼを調製する方法であって、以下の段階からなる方九ａ６　前記サツカロマイセ ス・セレビシェ　ＴＹ　エンドヌクレアーゼの粗液体調製物を、前記エンドヌク レアーゼに対する固定化抗体に接触させること、ｂ、前記液体調製物を前記固定 化抗体から分離すること、およびＣ１その後、前記固定化抗体から前記エンドヌ クレアーゼを純粋な形態で容量する。

３０、改変されたヘルパー細胞系構築のための方法で、ａ、ＭＲ結合ポリペプチ ド、逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、およびエンペローブポリペプチドをコー ドする外来性で複製不能なヌクレオチド配列を準備すること、 ｂ、前記配列をヘルパー細胞系に挿入すること、およびＣ０前記配列を前記ヘル パー細胞ゲノム中に組み込むこと。

からなる方法。

３１、ヘルパー細胞系のゲノム中に組み込むことが可能な外来性核酸配列の構築 のための方法で、 ａ、核酸結合ポリペプチドをコードする核酸配鳳プロモーターー翻訳開始領域を 含み、逆転写酵素およびエンドヌクレアーゼを含むポリペプチドをコードする核 酸配ダ瓜およびエンベロープポリペプチドをコードする核酸配列を含む外来の、 複製不能なヌクレオチド配列を準備上サツカロマイセス・セレビシェ　ＴＹ３の 位置特異的組み込みマーカーによって隣接されているヌクレオチド配列を準備す ること、および す、サツカロマイセス・セレビシェ　Ｔｙ３エンドヌクレアーゼ。

からなる方法。

３２、請求項２記載のベクター構築のための方法で、ａ、挿入される遺伝子を得 ること、およびす、サツカロマイセス・セレビシェ　ＴＹ３の位置特異的組込み マーカーを前記遺伝子のフランキング領域上にスプライスすること。

からなる方丸 ３３、外来遺伝子およびサツカロマイセス・セレビシェの挿入位置特異性を有す るエンドヌクレアーゼを前記細胞中に供給することを含む、細胞のＤＮＡ中に外 来遺伝子を挿入する方法であって、前記外米性遺伝子が前記エンドヌクレアーゼ によって認識される末端によって隣接されており、その結果前記エンドヌクレア ーゼが前記細胞中においてｔＲＮＡ遺伝子に隣接するＤＮＡを切断しかつ、前記 外来遺伝子および前記末端をこの切断部位において前記ＤＮＡ中に挿入すること を特徴とする特許 明細書 位置特異的挿入ベクターおよびこれを用いた方法発明の背景 本発明１戴遺伝子治療およびその他部用のためのレトロウィルスベクター類に関 する。レトロウィルスベクターは高効率で細胞に感染しそしてそのＤＮＡコピー を宿主ゲノム中に組み込むことができる。このようなベクター類頃外来ＤＮＡ配 列を動物細胞中に導入しおよび発現するために多くの点で望ましい。外来的に導 入された遺伝子の遷延化された安定発現１戯動物細胞培養における実験ならびに トランスジェニックな哺乳類の作製およびヒトの遺伝子治療のような全生体系実 験において必須条件である。

レトロウィルスベクターについてのひとつの問題ｉｔそれらが、ベクターが保持 している遺伝子の発現を抑制するような宿主ゲノムのある領域に挿入されるかも しれないということである。位置効果檄異なるゲノム位置に導入された本質的に 同一の構築体の発現にさまざまな変化をもたらすことが知られている。

レトロウィルスは長さ数キロの塩基対（ｋｂｐ）を有し組み込まれたプロウィル ス形感において１戴数百塩基対（ｂｐ）の長い末端反復配列（ＬＴＲｓ）が隣接 する内部ドメインからなる。これらのＬＴＲｓｌｆ、ゲノムＲＮＡの合成を指示 するプロモーター、ポリアデニルイヒおよび転写終結のシグナルを含んでいる。

実際のＲＮＡゲノムは１端に左ＬＴＲの半分（５°末端におけるＵ５）を、およ び他端に右ＬＴＲの半分（３゛　末端におけるＵ３）を、各端に存在する短い反 復配列（Ｒ）とともに有している。複製時において完全なＬＴＲが各端において 再生さねう完全な長さのＤＮＡコピーを形成する。例え１４　Ｈ，Ｅ、Ｖａｒｍ ｕｓおよびＲ，Ｓｗａｎ　ｓ　ｔ　ｒ　ｏｒｒＬ、ＲＮＡ腫瘍ウィルス（ＲＮＡ 　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ）、第２版、３６９−５１２頁（１９８４）参照 。

内部ドメインｌｊ少なくとも３つの遺伝子’ＪＬ！Ｊ、１且」およびｅｎｖに対 するコード化情報を有している。これら頃第１１第２および第３のオープン・リ ーディング・フレーム（ＯＲＦｓ）と一致する。（１ｊ遺伝子ｉｆ、ＲＮＡに結 合しヌクレオキャプシドを形成する構造タンパク質をコードする。２且」　ＯＲ Ｆはｍのそれに隣接または重複しそして、１旦」タンパク質１戴第１０ＲＦのリ ードスルー産物として合成される。第２０ＲＦのこの通常と異なる異常な限定的 発現手段鷹第１および第２０ＲＦｓを分離する終始コドンの抑制（サプレッショ ン）く　またはフレームシフト事象に依存している。１旦」遺伝子はプロテアー ゼ、逆転写酵素、およびエンドヌクレアーゼをコードする。プロテアーゼはポリ タンパク質のプロセシングを担当し一方、逆転写酵素はレトロウィルスのＲＮＡ ゲノムを完全な長さの２本＠ＤＮＡにコピーする。第１（゛マイナス”　）ＤＮ Ａ鎖の合成］戴　レトロウィルスＲＮＡに相補的な短い領域を有するｔＲＮＡに よって開始される。エンドヌクレアーゼはおそらくレトロウィルスのＤＮＡコピ ーをその末端で、および宿主ゲノム中の標的部位を、双方ともに切断する。

ｅｎｖ遺伝子によってコードされたエンベロープタンパク質憾スプライスされた 転写産物から発現される。

レトロウィルスベクターの作製に従来行われてきた操作を第１図に概略した。

ウィルス粒子形成、複製、および組込みのために必要なタンパク質＋ｉ、そのＲ ＮＡパッケージングシグナル（ｐｓｉ）中に欠失を有する組み込まれたヘルパー レトロウィルスから供給される。レトロウィルスによってコードされたタンパク 質は全て欠陥のない複製能力のあるレトロウィルスに必要である力で、例えば末 端、プラス鎖およびマイナス鎖のプライマー結合部位、およびｐｓｉのように比 較的小さな領域のみがＲＮＡ上の且ユ遣において、それカルトロウィルス粒子内 部にらの配列順　レトロウィルスベクター中に存在している。ベクター配列を含 むＤＮＡ＋４パツケージング系中に移入さね、そしてＲＮＡが産生されパッケー ジング（詰め込み）される。上述したよう！；　ＤＮＡへの逆転写の過程はウィ ルスヌクレオキャプシド内部で起こり、そして完全なＬＴＲｓが再生される。Ｌ ＴＲ配列の外側末端はそれ自体短い逆向き反復配列を含んでおり、これらがイン ・ビトロでレトロウィルスエンドヌクレアーゼによって結合されることおよび組 込みのために必要であることが示されている。

パッケージング系およびベクターの双方として、マウス白血病ウィルスが広く使 用されてきた。これにはいくつかの理由がある。第１に、それらは分子生物学的 に比較的よく知られているということである。第２＆へそれらは遣直細胞に効率 よく感染する。第３＆ミ知見力吟動物モデルに拡大できること、最後＆へ異なる 晴乳類種由来の培養細胞に感染する両感染性（アンフォトロビック）ウィルスが 入手可能であるということである。　マウスｐｓｉ−２細胞系＋Ｌ　レトロウィ ルスベクター作製のために開発された最初のパッケージング系のひとつであった 。

例え（！、Ｒ，Ｍａｎｎら、セル（Ｃｅｌｌ）３３：１５３　（１９８３）参照 。これらの細胞のゲノム１４ｐｓｉ配列を欠失したモロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ） マウス白血病ウィルス（ＭｏＭＬＶ）のコピーを組み込んでいた。ＰＡ１２およ びｐｓｉ−ＡＭパッケージング系１ｆ、ｐｓｉ−２に類似している力Ｃ１両感染 性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）ウィルス由来の、宿主範囲を増加させるエンベロ ープタンパク質を有している。ｐｓｉ−２１４（たとえ極めて低い頻度であって も）ヘルパーウィルスを伝染することが示されているので、以後のヘルパーウィ ルスの型に（戴さら＆ミバッケージされる配列を制限するように追加の欠失が導 入された。

例え１！、Ａ、Ｄ、　Ｍｉ　ｌ　１　ｅｒおよびＣ，Ｂｕｔｔｉｍｏｒｅ、モレ キュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅｌ　１．Ｂｉｏｌ、 ）６：　２８９５　（１９８６）参照。

一般に使用されているベクターには現在いくつかの変異型がある。このようなひ とつのベクターＮ２はマウス白血病ウィルスに基づいており、完全なレトロウィ ルスＬＴＲｓ１　プライマー結合部位、ｐｓｉ配ダＩＬおよび内部（非ＬＴＲ） プロモーターから発現されるＴｎ５ネオマイシン耐性遺伝子（ｎ　ｅ　ｏ　Ｒ） のコピーを含んでいる。このベクターの従来の変異型は下記を含む。

１）異なる薬剤耐性マーカーの置換； ２）スプライスされたメツセージからの第２遺法子の発現；　および３）組込み がいったん起こった後に５゛末端におけるＬＴＲプロモーターを不活化するため のＬＴＲｓの改変。

これらの改変は実際に技術的利点を有しているが、それらは同様にウィルスの力 価低下を生じることになり、それによってそれらの有用性が減少する。

動物細胞中への外来遺伝子の導入および発現のためのレトロウィルスベクター類 の実証された利点にも関わらず、ヒト遺伝子治療におけるその使用には問題が残 っている。まず第１−複製可能なレトロウィルス（戴それらが組み込まれるべく 指示された宿主細胞中で増加する能力を有している。この危険屯パッケージング および複製に関連するタンパク質をコードする内部配列を除去することによって ベクターを弱体化することによって低減させることができる。しかし弱体化され たレトロウィルスベクターを使用するに鷹欠落した機能を付与されはするがレト ロウィルスの転位のために必要な末端配列を有していないヘルパー細胞株を使用 することが必要となる。これ１戴ヘルパー細胞からの内因性レトロウィルス転写 物がベクター配列によってパッケージできる可能性またはベクターおよび欠損ヘ ルパー配列が再結合して複製可能なウィルスを産生する可能性を生じる。再結合 がベクターと弱体化されたパッケージングウィルスとの間で実際に起これ（戴　 このベクターに低頻度で保持されることができる生存可能なレトロウィルスが作 製できる。

第２＆へ　レトロウィルス（九ゲノム中に比較的ランダムに挿入される。この性 質に２つの問題が内在している。レトロウィルスベクターに保持されたプロモー タの挿入頃組込み部位に隣接する細胞遺伝子を活性化する可能性がある。これに ついての潜在的危険の例として、隣接する癌遺伝子の活性化がある。コーディン グ配列へのレトロウィルスの挿入も同様に障害となることがある。はとんどの場 合（礼感染細胞は単純に集団から消失するだけかも知れないが、機能喪失変異は 同様に発ガンを促進する可能性がある。このようく　レトロウィルス挿入の比較 的非特異的な様式に内在する問題がある。

最後になるが、異なる染色体位置に挿入されたレトロウィルスベクター１戴異な るレベルで発現される。例え１４　Ｍ、Ａ、Ｅｇｌｉｔｉｓら、サイエンス（多 ｃ　１ｅｎｃｅ）　２３０：　１３９５−１３９８　（１９８５）を参照。これ らの位置効果頃挿入部位に隣接する配列の転写活性に帰すことができる。この性 質ＩＬ異なる始原細胞に由来する、すなわち、異なる位置に挿入されたベクター を有する細胞群が異なるレベルでベクターが発現するであろうということを意味 する。

例え１ｆ、レトロウィルスベクター（ｉ、ベクターが保持する遺伝子の発現を抑 制するような宿主ゲノム領域中に挿入するであろう。これによって大きな細胞集 団上で行われる遺伝子転位の容認できる活性の「平均」レベルがもたらされるが 、形質転換動物中における独立した挿入配列の異なる発現は、異なる組織中で発 現された遺伝的欠陥を修正するために戦略を立てることを極めて複雑化すること もある。

したがって、もしゲノム中の特定の無害な位置に挿入するベクター類を設計する ことができるならば、宿主細胞機能の破壊を回避できるであろう。本発明）戴位 置特異的に組み込むことができるようにする特徴を取り入れた異種のベクターを 提供しそれによって現在の方法に対して有意義な利点を提供する。

発明の要約 本発明頃動物細胞ゲノム中へ外来性ＤＮＡを効率的かつ位置特異的に組み込むた めのベクターを提供する。これ１戯組込みベクター設計のため、我々が発見した 、酵母の位置特異的なレトロトランスポゾンＴＹ３を利用している。Ｃ１ａｒｋ ら、″酵母シグマ複合体因子ＴＹ３はレトロトランスポゾン特性を有している（ Ａ　Ｙｅａｓｔ　Ｓｉｇｍａ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　Ｅｌｅｍｅｎｔ、　Ｔｙ３ 、ｈａｓ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ａ　Ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓ。

ｎ）°、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、　 Ｃ上ｅｍ、）２互３：　１４１３−１４２３　（１９８８）参照。これ【戴本文 で参考として引用しである。Ｔｙ３１ｆ、動物レトロウィルスに相同性を有する が多くの異なるｔＲＮＡ遺伝子の５′側に挿入される酵母のレトロトランスポゾ ンである。

レトロトランスポゾンは転移因子（トランスポーザブル・エレメント）に属しこ れ（戴ゲノム中においである位置から他の位置への転位が可能なりＮＡ配列であ る。挿入の部位に応じて、それら鷹宿主遺伝子の発現および配置を双方とも変化 させることができる。レトロウィルス様の酵母のレトロトランスポゾン因子を含 む転移因子の一つのクラス１４ＲＮＡ媒介プロセスを介して転移する。レトロト ランスポゾン（戯標的配列の４〜６ｂｐの順方向反復配列を両端に有している。

各因子は数ｋｂｐの内部領域と、それぞれ数百ｂｐのＬＴＲｓとから構成される 複合体である。これらのＬＴＲｓの末端は長さ１０ｂｐまでの逆向き反復配列で あり、それら田保存されたジヌクレオチドＴＧ−ＣＡによって終結している。こ のＬＴＲｓ＋４　内部コーディング配列の転写を指示する開始、終始、およびポ リアデニル化のシグナルを含んでいる。　（Ｃ１ａｒｋら、同ム）位置特異的な ＴＹ３の組込み機構およびそれを触媒するエンドヌクレアーゼの構造に関する研 究によって、触媒機能および特異性を担っているエンドヌクレアーゼの内部ドメ インの同定力呵能となる。下記に概略したようくこの情報を用いて位置特異的レ トロウィルスベクターを設計する。１＃り本発明の目的１４エンドヌクレアーゼ の特異性および触媒ドメインを双方とも部位特異的変異によって改変することお よび現在入手可能なベクターよりも優れた利点を有するベクターを作製すること である。

明確かつ簡潔とするため、開示の範囲内に関して＆転用語「エンドヌクレアーゼ 」（瓢　下記第５図に示した遺伝子配列によってコードされるポリペプチドから なるＴｙ３エンドヌクレアーゼに適用する。このポリペプチドＧｆ、位置特異的 エンドヌクレアーゼ活性を有している。用語「位置特異的マーカー」と（戴複製 されたベクター（または相当するＲＮＡ）の外側末端に存在する配列を指上　こ れら代エンドヌクレアーゼによる認識および位置特異的挿入のために必要とされ ている。

特異的挿入の着想１１必ずしもレトロウィルスベクターの適用に限定されている わけではない。造成されたエンドヌクレアーゼを使用して、ＤＮＡの効率的組込 みのための技術を同様に用いて、レトロウィルス配列および必要なレトロウィル スタンパク質を最小にした「画線化された（ストリームライン化）」ベクターを 設計することができる。例えｉ４　ＤＮＡ、エンドヌクレアーゼおよび最小限の ヌクレオキャプシドコアをリポソーム内に導入しそして、種々のウィルス由来エ ンベロープタンパク質または抗体によって修飾されて広範囲の組織を標的とする 。この造成されたエンドヌクレアーゼ活性（戴　したがって、本発明の重要な特 徴である。効率的であり位置特異的なベクターの存在頃動物遺伝子発現の研究お よびこれらの知見を遺伝子治療に応用することにとって実質的な利点を提供する であろう。

従って、本発明のひとつの面によ泊戴所望のタンパク質をコードする遺伝子また は遺伝子群からなる組換え核酸配列が提供さぺこの遺伝子（群）１４多ｅｅｒｅ ｖｉｓ　ｉａｅ　（サツカロマイセス・セレビシェ）Ｔｙ３の位置特異的組込み マーカーによって隣接されている。本発明のもうひとつの面によれ頃前記組込み マーカーを認識する位置特異的エンドヌクレアーゼはＤＮＡウィルス、ＲＮＡウ ィルスまたはプラスミドのようなベクター中で提供される。ｌ実施例で；戴核酸 配列の５′末端に隣接する位置特異的組込みマーカー（転写物またはゲノムＲＮ Ａと相同の鎖に対応する２本鎖ＤＮＡについて定義）が下記の配列゛（５°　） ＴＧＴｒσＡＴＣｒ　ＣＡＡＡＡＴＧＡＧＡ　ＴＡＴＧｒＣＡ石Ａ　ＴＧＡＣＡ ＡＴＡＣＧ　ＴＣ膿ｒ而面中にあり、そして、複製された核酸配列の計末端に隣 接する位置特異的組込みマーカーは下記の配列。

（５’）ＴＡＴＴＡα込ＴｒＧＴＣ品０Ω（冗■石ＭτＡσ圓心刀尤ＴんσＥ境 。

中にある。

同様に本発明の一部１戴位置特異的方法で外来性遺伝子を標的細胞のゲノム中に 挿入するための伝達ベクター（二泊戴上述したヘルパー細胞株によって産生され る）であり、このベクター（戴サツカロマイセス・セレビシェ　ＴＶ３エンドヌ クレアーゼの位置特異性を有するエンドヌクレアーゼ、またはこのエンドヌクレ アーゼをコードし標的細胞中において発現可能な核酸配列；および位ｅ’ａ異的 組込みマーカーの間に位置し標的ゲノム中に挿入される外来性遺伝子を含む。

１実施例において、この遺伝子はＤＮＡからなる。別の実施例で１それはＲＮＡ からなり、そしてこのベクターはさらにタンパク質またはこの遺伝子を標的細胞 に供するために必要なタンパク質のための核酸配列からなる。別の実施例で（戯 このベクター頃エンドヌクレアーゼおよび遺伝子が収容されるエンベロープを含 ム。このエンベロープ！３脂質〕」）胞またはウィルスエンベロープのいずれか であるのが有利である。

本発明の別の面によれ１戴サツカロマイセス・セレビシェ　Ｔｙ３の位置特異的 エンドヌクレアーゼの生物活性を保持するポリペプチドをコードする組換え核酸 分子からなる遺伝子が提供さね、この生物活性（戴サツカロマイセス・セレビシ ェ　Ｔｙ３の位置特異的マーカーの間に保持される遺伝材料の位置特異的挿入を 触媒することである。好ましくＩＬ　このエンドヌクレアーゼは下記の配列また はその等価コドンによってコードされる（５勺ＧＣＡ　ＧＴＴ　ＡＴＧ　ＡＧＡ 　ＣＴＡ　ＴＡＴ　ＣＡＴ　ＧＡＣＣＡＴ　ＡＣＣＴｒＡ　ＴＴＴ　ＧＧＡ　Ｇ ＧＡ　ＣＡＴ　ＴＴｒ　ＧＧＴ　ＧＴＡ　ＡＣＡ　ＧＴＧ　ＡＣＣＣＴＴ　ＧＣ Ｇ　ＡＡＡ　ＡＴＣＡＧＣＣＣＡ　ＡＴＴ　ＴＡＣＴＡＴ　ＴＧＧ　ＣＣＡ　Ａ ＡＡ　ＴｒＡ　ＣＡＡ　ＣＡＴ　ＴＧＣＡＴＣＡＴＡ　Ｃ八人ＴＡＣＡＴＣＡＧ Ｇ　ＡＣＣＴＧＣＧＴＡ　ＣＡＡ　ＴＧＴ　ＣＡＡ　ＣＴＡ　ＡＴＡ　ＡＡＡ　 ＴＣＡ　ＣＡＣＣＧＡＣＣＡ　ＣにＣＴＴＡ　ＣＡＴ　ＧＧＡ　ＣＴＡ　ＴＴＡ 　ＣＡＡ　ＣＣＡ　ＣＴＣＣＣＴ　ＡＴＡ　ＧＣＡ　ＧＭ　ＧＣＡＡＣＡ　ＴＧ Ｇ　ＣＴｒ　ＧＡＴ　ＡＴＡ　ＴＣＡ　ＡＴＧ　ＧＡＴ　ＴＴｒ　ＧＴＧ　ＡＣ Ａ　ＧＧＡ　ＴｒＡ　ＣＣＣＣＣＧＡＣＡ　ＴＣＡ　ＡＡＴ　ＡＡＣＴｒＧ　Ａ ＡＴ　ＡＴＧ　ＡＴＣＣＴＣＧＴＣＧＴＡ　ＧＴＴ　ＧＡＴ　ＣＧＴ　ＴＴＴＴ ＣＧ　ＡＡＡ　ＣＧＣＧＣＴ　ＣＡＣＴＴＣＡＴＡ　ＧＣＴ　ＡＣＡ　ＡＧＧ　 Ａ五人　ＡＣＣＴＴＡ　ＧＡＣＧＣＡＡＣＡ　ＣＡＡ　ＣＴＡ　ＡＴＡ　Ｇ）、 Ｔ　ＣＴＡ　ＣＴＣＴＴＴ　ＣＧＡ　ＴＡＣＡＴＴ　ＴＴ！’　ＴＣＡ　ＴＡＴ 　ＣＡＴＧＧＴ　ＴＴＴ　ＣＣＣＡＧＧ　ＡＣＡ　ＡＴＡ　ＡＣＣＡＧＴ　ＧＡ Ｔ　ＡＧＡ　ＧＡＴ　ＣＴＣＣＧＴ　ＡＴＧ　ＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＡ　ＴＡ Ｔ　ＣＡＡ　ＧＡＡ　ＣＩ’ＣＡＣＧ　ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＣＩ’Ａ　ＧＧＡ　Ａ ＴＡ　ＡＡＡ　ＴＣＧＡＣＡ　ＡＴＧ　ＴＣＴ　ＴＣＣＧＣＧ　ＡＡＣＣＡＣＣ ＣＣＣＡＡ　ＡＣＡ　ＧＡＴ　ＧＧＡ　ＣＡＡ　ＴＣＣＧ入ＡＣＧＡ　ＡＣＧ　 ＡＴＡ　ＣＡＧ　ＡＣＡ　ＴＴＡ　ＡＡＣＡにＧ　’ＥＴＡ　ＣＴＡ　ＡＧＡ　 ＧＣＣＴＡＴ　ＧＣＴ　ＴＣＡＡＡＣＭＴ　ＡＴＴ　ＣＡＧ　ＭＴ　ＴＧＧ　Ｃ ＡＴ　ＧＴＡ　ＴＡＴ　ＴＴＡ　ＣＣＡ　ＣＡＡ　ＡＴＣＧＡＡ　ＴｒＴＧＴＴ 　ＴＡＣＡＡＴ　ＴＣＴ　ＡＣＡ　ＣＣＴ　ＡＣＴ　ＡＧＡ　ＡＣＡ　ＣＩＴ　 ＧＧＡ　入入Ａ　ＴＣＡ　ＣＣＡ　ＴｒＴＧ入入　五人Ｔ　ＧＡＴ　ＴＴＡ　Ｇ ＧＡ　ＴＡＴ　ＴＴＡ　ＣＣＧ　ＡＡＴ　ＡＣＣＣＣＴ　ＧＣＴ　ＡＴＴ　ＡＡ Ｇ　ＴＣ入入ＡＴ　ＧＡＣＧＡＡ　ＧＴＣＡＡＣＧＣＡ　ＡＧＡ　ＡＧＴ　’Ｉ Ｔｒ　ＡＣＴ　ＧＣＣＧＴＡ　ＧＡＡ　ＣＴｒ　ＧＣＣ入入五人　ＣＡＣＣＴＣ ＡＡＡ　Ｇｃｅ　ＣＴＴ　入ＣＣＡＴＣＣＡＡ　ＡＣＧ　ＡＡＧ　ＧＡＡ　ＣＡ Ｇ　ＣｒＡ　ＧＡＡＣＡＣＧｃＴ　ＣＡＡ　ＡＴＣＧＡＡ　ＡＴＧ　ＧＡＡ　Ａ ＣＴ　ＡＡＴ　ＡＡＣＡＡＴ　ＣＡＡ　ＡＧＡ　ＣＧＴ　ＡＡＪｉＣＣＣＴＴＡ 　ＴＴＧ　ＴＴＡ　ＡＡＣＡＴＡ　にＧＡ　ＧＡＴ　ＣＡＣＧＴＡ　ＴｒＡ　Ｇ ＴＧ　ＣＡＴ　ＡＧＡ　ＧＡＴＧＣＡ　ＴＡＣＴＴＣＡＡＧ　ＡＡＡ　ＧＧＴ　 ＧＣＴ　ＴＡＴ　ＡＴＧ　ＡＡＡ　ＧＴＡ　ＣＡＡ　ＣＡＡ　ＡＴＡ　ＴＡＣＧ ＴＡ　ＣＡＡ　’ＩＴＣＣＴＧ　ＡＡＡ　ＡＡＧ　’ｆｆｒ　ＧＴＡ　ＴＡＣＣ ＧＴ　ＣＣＡ　ＣＡＣＧＣＧ　ＴＡＣＣＣＡＡＡＧ　ＡＡＴ　ＭＡ　ＣＣＡ　Ａ ＴＣＡＧＣＴＣＣＡＣ！’　ＧＭ　ＡＣＡ　ＡＴＴ　ＡＡＧ　ＡＧＡ　ＧＣＡ　 ＣＡＣＧＡＡ　ＧＴＴ　ＡＣＴ　ＧＣＡ　ＣＴＣＡＴＡ　ＧＧＡ　ＡＴＡ　（ａ Ｔ　ＡＣＴ　ＡＣＡ　ＣＡＣＭＡ　ＡＣＴ　ＴＡＣＴＴＡ　ＴＧＴ　ＣＡＣＡＴ Ｇ　ＣＡＡ　ＧＡＴ　ＧＴＡ　ＧＡＣＣＣＡ　ＡＣＡ　ＣＴＴ　ＴＣＡ　ＧＴＡ 　ＧＭ　ＴＡＣＴＣＡ　ＧＡＡ　ＧＣＴ　ＧＡＡ　ＴＴＩ’　ＴＧＣＣＡＡ　Ａ Ｔｒ　ＣＣＣＧＡＡ　ＡＧＡ　ＡＣＡ　ＣＧＡ　ＡＧＡ　ＴＣＡＡＴＡ　ＴＴＡ 　ＧＣＣＡＡＣＴＴＴ　ＡＧＡ　ＣＡＡ　ＣＴＣＴＡＣＧＡＡ　ＡＣＡ　Ｃ入Ａ Ｇ入ＣλＡＣＣＣＴＧＡＧ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＧＭ　ＧＡＴ　（？ｒ　ＣＴＡ　 ＴＣＴ　ＣＡＡ　ＭＴ　ＧＡＧ　ＡＴＡ　ＴＧＴ　ＣＡＧ　ＴＡＴＧＡＣＡＡＴ 　ＡＣＧ　ＴＣＡ　ＣＣＣＬ先の配列が、これに対する相補的な配列が１個ある １本鎖を示すことに同様に注意しなければならない。

好ましく１戴標的細胞ゲノム中に挿入される遺伝材料の５゛末端に隣接する位置 特異的組込みマーカーは下記の配列：（５−）　ＴＧＴｒＧｒＡＴＣＴ　ＣＡＡ ＡＡＴＧＡＧＡ　ＴＡＴＧＴＣＡＧＴＡ　ＴＧＡＣＭＴＡＣＧ　ＴＣＡＣＣＣＴ ＧＡＡ。

であり、そして、この挿入される遺伝材料の３゛末端に隣接するマーカー鷹下記 の配列 これらのマーカーを含む組換え核酸配列も同様に本発明の範囲内にある。

本発明（戴さ労ミサッカロマイセス・セレビシェ　ＴＶ３の位置特異的エンドヌ クレアーゼをコードし細胞ゲノム内部に組み込まれた外来性ヌクレオチド配列を 有し、さらく細胞境界内部においてウィルスベクター内にパッケージされる外来 性の組み込まれていない核酸であって、いずれかの側でエンドヌクレアーゼによ る認識を確実とするマーカー配列が隣接する弁組込み遺伝子からなる核酸を有す る改変ヘルパー細胞系統を含む。組み込まれた外来性ヌクレオチド配列（戴好ま しくは複製不能なヘルパーレトロウィルス（すなわち、パッケージングシグナル を欠失したウィルス）である。組み込まれた配列檄好ましく檄さらにプロモータ ー−翻訳開始領域；核酸結合ポリペプチド（例　−Ｌ！ｌ）　；逆転写酵素、エ ンドヌクレアーゼをコードする核酸配列、およびエンベロープポリペプチドをコ ードする核酸配列からなる。１実施例で鷹エンドヌクレアーゼをコードする配列 （ｉ、サツカロマイセス・セレビシェ　ＴＹ３エンドヌクレアーゼの位置特異的 活性のために必要な、あるいはサツカロマイセス・セレビシェ　Ｔｙ３エンドヌ クレアーゼの特異性ドメインを有するエンドヌクレアーゼのために必要な配列を 含む。ひとつの好適な実施例で（戴ヘルパー細胞系統ＩＬエンドヌクレアーゼの 特異性のために必要なＴｙ３配列を含むように改変されたｐｓｉ−２である。

別の実施例では、組み込まれた外来性の配列は、両感染性マウス白血病ウィルス に由来する。

同様に本発明の範囲に包含されるのは、サツカロマイセス・セレビシェ　ＴＹ３ エンドヌクレアーゼに特異的な抗体、およびこの抗体を産生じかつ分泌する継代 細胞系である。本発明哄さら！ミ実質的に純粋なサツカロマイセス・セレビシェ 　ＴＹ３エンドヌクレアーゼの調製のために前記抗体を利用する方法を提供する 。

さらに本発明の別の面哄核酸結合性ポリペプチド、逆転写酵素、サツカロマイセ ス・セレビシェの挿入位置特異的エンドヌクレアーゼ、およびエンベロープポリ ペプチドをコードする外来性で発現可能な複製不能ヌクレオチド配列を提供する 工程：およびこの配列をヘルパー細胞ゲノム中へ組み込む工程を含むヘルパー細 胞系の構築方法に関する。

さらに本発明の別の面＋４ｔＲＮＡ遺伝子の隣に特異的に挿入可能な伝達ベクタ ーを作製する方法であって、 核酸結合ポリペプチドをコードする、第１の外来の複製不能なヌクレオチド配孔 およびプロモーター−翻訳開始領域、逆転写酵素、サツカロマイセス・セレビシ ェの挿入位置特異的エンドヌクレアーゼのようなエンドヌクレアーゼ、およびエ ンベロープポリペプチドを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（こ れらは全てはそのゲノムに組み込まれている）を有するヘルパー細胞系を提供す る工程： 前記ヘルパー細胞系の細胞境界内部において、サツカロマイセス・セレビシェＴ Ｙ３の位置特異的活性に必要とされる位置特異的組込みマーカーによって隣接さ れる遺伝子で所望のタンパク質をコードする遺伝子を含む第２の組換え核酸配列 を提供する工程、および、 第１の核酸配列から産生された核酸結合タンパク質、エンドヌクレアーゼおよ　 −び逆転写酵素とともに第２の組換え核酸配列を前記ヘルパー細胞株中において 伝達ベクター中にパッケージさせる工程、からなる方法を提供する。

本発明；戴　また、細胞のゲノム中に外来遺伝子を位置特異的方法で挿入するベ クターを提供する。こｔｂ＋４サツカロマイセス・セレビシェ　Ｔｙ３エンドヌ クレアーゼの挿入位置特異性を有するエンドヌクレアーゼ、または細胞中で発現 可能なこのエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列：および標的細胞のゲノム 中に挿入される外来の発現可能な遺伝子であって、前記エンドヌクレアーゼによ って認識されるＬＴＲｓの間に位置している遺伝子を含む。プロモーターおよび 認識配列は、周知のように、好適に提供できるであろう。このベクター（戴好ま しくはウィルスエンベロープまたは脂質小胞のようなエンベロープ中に取り込ま れる。外来遺伝子がＲＮＡである場合、このベクター頃　また、逆転写酵素をも 含む。

本発明のもう一つの面は、複製されたときく下記配列：（５’　）　ＴＧＴｒＧ ｒＡＴＣＴ　ＣＡＡＡＡＴＧＡＧＡ　ＴＡＴＧＴＣＡＧＴＡ　ＴＧＡＣＡＡＴＡ ＣＧ　ＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡ。

にあるサツカロマイセス・セレビシェ　ＴＹ３エンドヌクレアーゼの位置特異的 マーカーがその５゛末端にで隣接しそして、下記配列：（５゛）　ＴＡＴｒＡＧ ＧＡＴＴ　（ＥＭＧＡＣＡＣ冗■πＡＴｒＡ　α圓后刀刀ＴＡＡＴＡＣＡＡＣＡ 。

にあるサツカロマイセス・セレビシェ　ＴＹ３エンドヌクレアーゼの位置特異的 マーカーがその３′末端にで隣接する遺伝子を含む組換え核酸配列に関する。本 発明はさらにこれら上記の配列を含むベクターを提供獣このベクターの構築方法 を提案する。

最終的に１戴本発明１戴外来遺伝子および細胞中においてサツカロマイセス・セ レビシェの挿入位置特異性を有するエンドヌクレアーゼを提供することを含み、 前記外来遺伝子がこのエンドヌクレアーゼによって認識される末端によって隣接 さぺその結果、このエンドヌクレアーゼが細胞中においてｔＲＮＡ遺伝子に隣接 するＤＮＡを切断部そしてこの外来遺伝子および末端をその切断部位においてＤ ＮＡ中に挿入することを特徴とする細胞のＤＮＡ中に外来遺伝子を挿入する方法 を提供する。

図面の簡単な説明 第１図（戴　レトロウィルスベクターの作製およびパッケージングを図示したも のである。

第２図１叡クローン化されたＴＶ、３因子、ＴＶ３−１の制限部位マツプを示し たものである。

第４図１４Ｔｙ３およびモロニー（Ｍｏ　１　ｏｎ　ｅ　ｙ）マウス白血病ウィ ルス（ＭｏＭＬＶ）の比較構造を示したものである。

第４図１４Ｔｙ３の転位を示したものである。

第５図１戴サツカロマイセス・セレビシェ　ＴＹ３位置特異的エンドヌクレアー ゼの遺伝子を含むヌクレオチド配列を示したものである。

発明の詳細な説明 ｒｙ３ｔ４動物レトロウィルスに構造的および配列的に相同性を有する酵母サツ カロマイセス・セレビシェ中に見いだされたレトロトランスポゾンである（ＣＩ 　ａｒｋら、玉揚）。レトロトランスポゾン１４エンベロープタンパク質を欠損 医かつ、完全な細胞外相を有しないレトロウィルス様の転位可能な因子である。

Ｔｙ３１ｔ、シグマ因子と呼ばれる長さ３４０ｂｐのＬＴＲｓが隣接する長さ４ ７ｋｂｐの内部ドメインからなる。第２図＋４”ｒｙ３−１を含むサツカロマイ セス・セレビシェのゲノム断片の制限部位マツプを示している。シグマ因子１お よびｔＲＮＡ遺伝子２を示しである。図に示したようへ遺伝子２はアミノ酸シス ティン（Ｃｙｓ）をコードしており、ｔＲＮＡ遺伝子２の転写方向檄遺伝子直下 の矢印によって示しである。ＴＹ３因子の転写（転座から右の方向に起こる。

第２図の下方に示したキロベース（ｋｂ）目盛り１礼上流シグマ因子の左端と合 わせである。制限部位１３略示しである。ＴＹ３因子１３それぞれ数百ｂｐのＬ ＴＲｓが隣接する数ｋｂｐの内部領域を含む複合体である。これらのＬＴＲｓの 末端は長さ１０ｂｐまでの逆向き反復配列であり、これ＋４保存されたジヌクレ オチドＴＧ−ＣＡで終結する。このＬＴＲｓ憾内部コーディング配列の転写を指 示する開始、終結、およびポリアデニル化シグナルを含んでいる。　（Ｃｌ　ａ 　ｒｋら、１摺１ｈ　） ＴＶ３の内部ドメイン（飄　２つの長い０ＲＦｓを含んでいる。コードされてい る機能＋４予測されるタンパク質配列のレトロウィルスタンパク質配列との類似 性に基づいて推定することができる。第１のＴＶ３　０ＲＦがら予測されるタン バク質配列はレトロウィルスの核酸結合タンパク質中に見いださね、かつ、レト ロウィルスＪＬＩ遺伝子によってコードされる保存モチーフの存在を示している 。

第２のＴｙａ　０ＲＦＩＬ　レトロウィルス類の１２」遺伝子に類似している。

それ叫第１０ＲＦに重複しかつ、プロテアーゼ、逆転写酵素、およびエンドヌク レアーゼをこの順にコードする。ＴＹ３逆転写酵素およびエンドヌクレアーゼタ ンパク質配列と、Ｔｙｌおよび’ｒｙｚ（ｚつの酵母レトロトランスポゾン）、 ヒト免疫不全ウィルス、ラウスザルコーマ（Ｒｏｕｓ　Ｓａｒｃｏｍａ）’Ｆイ ル人　ウシ白血病ウィルス、およびＭｏＭＬＶによってコードされたものの配列 との比ｆｆＬ　後記４者がＴｙａにコードされているタンパク質と最大の類似性 を有していること、および、ＴｙｌおよびＴｙ２タンパク質が最も小さい類似性 を有していることを示している。さらをミＭｏＭＬＶとＴｙａの逆転写酵素（ポ リメラーゼ）ドメインとの間の相同性は２６％である。

第３図檄ＭｏＭＬＶおよびＴｙａの全体構造を比較したものである。ＬＴＲｓ　 １０、ヌクレオキャプシドタンパク質１２、プロテアーゼ１４、逆転写酵素Ｉ６ 、およびエンドヌクレアーゼＬ８ｊｉ　同じように１直線に並んでいることが示 されている。ＭｏＭＬＶのエンベロープタンパク質２０も示しである。先にも述 べたようへ　レトロトランスポゾンは、一般へエンベロープタンパク質ヲ合成す る能力を欠損している。

Ｔｙ３１４それが極めて位置特異的であるという点においてレトロウィルスと非 常に異なっている。酵母の典型的なハブロイド株において１個から４個のＴ７３ 因子が存在する。１株からのＴＹ３因子の解析）戴　２つのＴｙ３因子が成熟ｔ ＲＮＡコード配列の５゛　末端から１６ｂｐおよび１７ｂｐであることを示した 。

Ｔｙａの挿入位置（戯　また、孤立したシグマ因子の位置から推論することがで きる。これらの孤立した因子は、Ｔｙａ　ＬＴＲｓ間の組換えによって生ずると 考えられる。それらは、ある意味で１ｊＴｙ３因子によって先に占有された「フ ットプリント」探測立置である。

我々の研究室において、我々１４１７個のシグマ因子に隣接する領域のＤＮＡ配 列を決定した；あらゆる場合において、シグマ因子は、成熟ｔＲＮＡのコード配 列の５゛末端から２０ｂｐ以内にあるか、または１個のＴＹ３因子のｔＲＮＡ遺 伝子から遠い方のシグマＬＴＲであった。我々１３Ｔｙ３因子が高度に位置特異 的であると推定した。

正常条件下において、Ｔｙａは高度には転写されず、したがって、それほど頻繁 には転位しない。Ｔｙ３転位の分子機構を研究するためへ我々鷹Ｔｙ３転位がガ ラクトース含有媒地上で高頻度に起こる系を開発した。ガラクトース誘導可能な 酵母のＧＡＬＩ−１０遺伝子からの上流活性化配列（ＵＡＳ）を、ＴＹ３プロモ ーターの上流に融合させた。ガラクトース炭素源上において高レベルのＴｙ３転 写が誘導され、そして、−Ｔｙａ転位が頻繁に生じる（細胞の１−２％）。

（組換えＤＮＡ操作） 細菌培養条件および組換えＤＮＡ操作１ｔ、Ｃ１ａｒｋら、玉揚書ば記載された 通りであり、これらは本文の参考文献にも含まれている。サツカロマイセス・セ レビシェ　ＡＢ９７２株（Ｍａｙｎａｒｄ　０１ｓｏｎ博士、ワシントン大学、 セントルイス）由来の染色体ＤＮＡを且ｃｏＲＩで切断ｔ、、１％アガロースゲ ルで分画した。長さ５．５ｋｂおよび乙　５ｋｂの間のＤＮＡ断片を低ゲル化温 度アガロース（バイオラド（ＢｉｏＲａｄ））がら単離り、、ｐＩＢＩ２１　（ インタナショナルバイオテクノロジー社（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｏｌ　ｏｇｉ　ｅｓ、Ｉｎｃ、）、＋　ＩＢＩ−、＝ユーヘブン、コ ネチカット州、から市販〕の旦ｃｏＲＩ部位中にサブクローン化しさら＆、、Ｈ ＢＩＯＩ　［（Ｆ−、ｈｓｄｓ２０、ｒａ−！！！！−）、ｒｅｃＡ１３，１ｅ ｕＢ６、ａｒａ−１４，１ｒｏＡ２，１ａｃＹ１，５３↓に２．　工旦互↓ヱη （Ｓｍ’）　、五ｙ↓−５，ｍｔ」二１．．ｍす１東４、λ−］に形質転換した 。プラスミドｐＩＢＩ２１ｉＬ　バクテリオファージエフプロモーターおよびＩ ＢＩプライマー配列の下流にクローニング領域を有しており、この後にＭ１３プ ライマー配列が続く。バクテリオファージｆ１の複製開始点がｐＩＢＩ２１中に 存在獣かつ、ｐ　ＩＢＩ　２１で形質転換された細菌かへルバーファージＭ１３ ＫＯ７（ＩＢＩ）で重感染されたときに１本鎖プラスミドＤＮＡを産生さぜる。

Ｔｙ３挿入物を含む形質転換休戦放射性標識した内部制限断片をプローブとして 使用したコロニーハイブリダイゼーションによって識別された。このプラスミド はｐＴｙ３−２と名付けらね、転位しない。先にクローン化されたＴｙａ　（ｐ ｓＢｓ１２：Ｃ１ａｒｋら、玉揚書参照）は、ｐＩＢＩ２０の旦ユｎｄ［ｌＩお よび且至りＲＩ部位に連結された旦ニーｎｄロー一旦ｃｏＲＩ制限断片土に含ま れており、ｐＴｙ３−１と名付けられた。このＴｙａ−１は転位可能である。

Ｔｙ３転位の研究を促進するために、ＧＡＬＩ−１０上流活性化配列（ＵＡＳ） をＴｙａ−１およびＴｙａ−２のＴＡＴＡＡ配列の上流に融合した。構築の第１ 段階において、ＴｙａのＴＡＴＡＡ配列および転写開始部位を含む２７６−ｂｐ ポリリンカー中で−５ａＩＩで切断し　シグマ因子の下流末端でＸｈｏＩで切断 しＸｈｏＩ適合末端を有するシグマプロモーター断片を作製した。次＆ミこの断 片をｐＨ２１８の誘導体中にあるＧＡＬＬ−１０のＵＡＳの下流のＸｈｏＩ部位 中に挿入しｐＡＬＧ２８を構築した。酵母ＵＲＡ３遺伝子およびＧＡＬＬ−１０ ＵＡＳとシグマプロモーターとの融合配列を含むｐＡＬＧ２８由来の旦↓ｎｄｍ −Ｘｈｏ　Ｉ断片とを、完全な旦ｉｎｄｍ消化および’ＸｈｏＩの部分消化によ って造成したｐＴ５ｒ３−１またはｐＴｙ３−２中のある部位にクローン化した 。これらの構築体の制限酵素切断によるスクリーニングによって、プラスミドｐ ＧＴｙ３−１およびｐｃＴｙ３−２が識別された。この中でＧＡＬ、１−１０Ｕ ＡＳ−シグマプロモーターがＴｙａ−１およびＴｙａ−２内部ドメインに融合宅 れている。

ｐＧＴｙ３−１およびｐＧＴｙ３−２服酵母２ミクロンエピゾームからの２゜（ ヌクレオチド配列決定の方針） Ｈｅｎｉｋｏｆｆの特異的欠失法を用いて、チェーンターミネータ法（ジデオキ シチェーン終結法）によるＴｙａ−１の非コード鎖の配列解析のための重複サブ クローンを作製した。　（Ｓ、Ｈｅｎ１ｋｏｆｆ、ジーン（Ｇｅｎｅ）２８：　 ３５１−３５９　（１９８４）参照。）１本鎖テンプレートをｐＴｙ３含有細菌 宿主ＮＭ５２２［（△匡−■エユに上）、虫、ふＩＡΔ）、１旦１ｊ、ｓ退１！ ；＝　（Ｆ’　、　■工ＡへＢ、１ａｃＩａＺ△Ｍｌ　５］の、ヘルパーファー ジＭ１３ＫＯ７を用いた重感染によって作製し配列決定反応のために利用した。

制限酵素類、Ａ↓ｕＩＳＲｓａＩおよび５ａｕ３ＡはＴｙａ−１配列内部で頻繁 に切断するので、これらを用いて、コーディング鎖の配列解析のために適切な長 さのランダムサブクローンを作製した。このＤＮＡを、ＨｏｌｍｅｓおよびＱｕ ｉｇｌｅｙの沸騰法（ボイリング法）により、小量調製した（Ｄ、Ｓ、Ｈｏｌｍ ｅｓおよびＫＱｕｉｇｌｅｙ、アナリティカルバイオケミストリー（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、）↓↓４：　１９３−１９７　（１９８１）参照）。これらの 挿入物の配列４３Ｍ１３ユニバーサルプライマーまたはＩＢＩ逆向きプライマー によって開始するポリメラーゼ反応によるチェーンターミネータ法を使用して決 定した。全ての配列解析にシークエネース（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）酵素（米国バ イオケミカル社（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ。

ｒｐ、））および［”Ｓｌ　ｄＡＴＰ　（１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；アマジャム （Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈ　ａｍ）　）を使用した。Ｔｙａ−１配列にハイブリダイ ズする６個の合成オリゴヌクレオチド（オペロンチクノロシーズ社（Ｏｐｅｒｏ ｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ、）ンを眉いて、残りの領域の解析を行 った。Ａ、Ｇ。

１ｄｉｎ博士およびＧ、Ｇｕｔｍａｎ博士（カリフォルニア大学（Ｕｎｉｖｅｔ ｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）、アービン（Ｉｒｖｉｎｅ））のＤＮ Ａ配列解析プログラムを用いて、このヌクレオチド配列をコンパイル獣［％し翻 訳した。ジエンバンクヌクレイツクアシドデータベース（ＧｅｎｅＢａｎｋＮｕ ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｄａｔａｂａｓｅ）およびＮＢＲＦプロティンデータベ ース（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａ５ｅ）との比較を、ＶＡＸコンピュータ によるライスコンシン大学ジェネティクスコンピュータグループのプログラムを 使用して行った。逆転写酵素およびエンドヌクレアーゼのアミノ酸の比較を、Ｖ ＡＸコンピュータによるＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのプロブレシブ・ア ラインメント・プログラムによって行った。ｐ、ＦｅｎｇおよびＲ，Ｄｏｏｌｉ 　ｔ　ｔ　ｌ　ｅ、ジャーナル・オブ・モレキュラー・エボリューション（Ｊ　 γ旦」Ｅｖｏｌ、）２５：３５１−３６０（１９８７）。もちろん、他の公知の 配列解析技術を同様に用いて、同等のデータを作製することができる。

（転移） 酵母を標準的方法で培養した。ｙＶＢ１０９株（ＭＡＴσ、１工旦↓ｆｆ９０１ ジヤーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）１５３１６ ３−１６８　（１９８３）中のＩｔｏらの方法を改良してプラスミドｐＥＧＴｙ 　３−１　ｔタハｐＥＧＴｙ　３−２ｆ：形ｊｉｌｆｉ、換Ｌ−タ。ｙ　ＶＢ　 １１０株１ｆ、　ｙ　ＶＢ　１０９株の同質遺伝型誘導体であり、これから３つ の内因性ＴＹ３因子が順番に欠失していた。異なるＴＹ３因子力吹失した３つの 株力Ｃ１個々のＴｙ３因子のＵＲＡ３破壊によって得られ、続いてｕｒ　ａ３− のコロニー選択用の５−フルオロオＬト酸（５ＦＯＡ）含有培地で選択した。複 数のＴＹ３を欠失した株憾標準的な遺伝学的方法によって作製した。誘導可能な プラスミドを含むｙＶＢ１１０形質転換体を、プラスミドによって付与されたウ ラシルフォトトロピーを基にウラシルを含まない合成完全（ＳＣ）培地上で選択 した。このＹＶＢ　１１０形質転換体を、同培地上または炭素源としてグルコー スの代わりに２％ガラクトースを含む培地上ヘストリークした後、２３℃または ３０℃で１０日間インキュベートシタインキュベート終了後へそれぞれの条件で 形成したコロニー１０個をＹＰＤ上に単一コロニー形成のためにストリークした 。ＵＲＡ３プラスミドマーカーを失った細胞を選択するためへ最初のそれぞれの コロニーから選んだ５０個の単離体を５ＦＯＡ含有培地上に点種ｔた。これらの 細胞をＹＰＤ培地上のニトロセルロースフィルター上にストリーク獣約１４時間 増殖させた。フィルター（表光に述べたように処理しかつハイブリダイズさせた 。ＴＹ３の内部ドメインの断片を放射性標識したものをプローブとした。ｙＶＢ １０９株は同様に形質転換し、誘導条件および非誘導条件下で増殖させた。単一 コロニーを単離し、上述した方法でプラスミドのキユアリングを行った。

サザン・プロット解析に用いるゲノムＤＮＡ１＆　Ｂｏｅｋｅら、セルＣ年」） ４η：　４９１−５００　（１９８５）に記載されている方法に従って調製した 。

第４図（ＢおよびＣ）に示した解析のためのＤＮＡＩＬ　ガラクトースで増殖さ せたｙＶＢ１０９−ｐＥＧＴＹ３−１形質転換体の異なる単離クローンから調製 した。全部で２３０個のコロニーを、それぞれが８〜１０個のコロニ一群である ＤＮＡｗＲ製物２４検体としてスクリーニングした。これらのプールされた培養 物がらゲノムＤＮＡを単離り、ＥｃｏＲＩで消化し、ＴＨＥ緩衝液（２，５ｍＭ 　ＥＤＴＡ、４５ｍＭホウ酸、および１３３ｍＭ）リス塩酸、ｐＨ８，３）を用 いた０　８％アガロースによる電気泳動によって分画Ｌサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒ ｎ）の方法によってニトロセルロースに移した。ニトロセルロースに結合したＤ ＮＡのハイブリダイゼーションを行い、フィルターをＣ１ａｒｋら（玉揚、１９ ８８）ニ記載のように洗浄後、クロネックスクオンタ（Ｃｒｏｎｅ：ｃ　Ｑｕａ ｎｔａ）ロ　−ｍ増感スクリーン（デュポン（Ｄｕｐｏｎｔ））の存在下で一７ ０℃で一晩コダック（Ｋｏｄａｋ）ＸＡＲ−５フイルムに露光させた。ＤＮＡ１ ４　また、Ｔｙｔ　３組換えの証拠を示すプールに寄与する個々のコロニーから 同様にして調製り解析した。このようにして、新規なＴｙ３がハイブリダイズす る断片の存在に関に　して均質である単離クローンをｗ３１Ｌな。これらの一部 からのＤＮＡ１４　ＴＹ３特異的プローブおよびシグマ特異的プローブとのハイ ブリダイゼーション（第４：０　図参照）によって解析した。

−’　第４図（Ａ）ＩＬガラクトース誘導性ＴＶ３−１およびＴＹ３−２配列を 含ｔｒ供与体プラスミドを示しており、これら＋を上記のように構築さね、そし て、ｐＥＧＴＹ３として一般化されて示されている。標識された酵母配列１表下 記のようである：ＧＡＬ１−１０　ＵＡＳ、２０（黒塗）；シグマ因子類、２２ （線および点刻）；Ｔｙ３内部ドメイン、２４（点刻）：２ミクロンプラスミド 複製配置１Ｊ、２６　（細イ斜線）　；　オ！ヒＵＲＡ　３ＷＩＩＬ、２８　（ 太イ斜線）　、Ｅ、　ｃ　ｏ　Ｉユ配タＩＪ、０エユおよＶΔｍ１Ｂ（戴同様に ３０（白抜き）で示されている。目盛りは、およそである。

（ベクターの構築） ベクター頃周知のベクター構築法のいずれかを用いてサツカロマイセス・セレビ シェの位置特異的エンドヌクレアーゼを利用して構築できる。しがし　これらの 技術鷹宿主細胞のゲノム中に挿入される遺伝子が本文で述べたマーカー配列によ っていずれかの側で隣接させ、そしてこれらのマーカーを識別する本願に開示の 位置特異的エンドヌクレアーゼは同様に宿主細胞中で提供されることができるよ うに改良しなければならない。位置特異的エンドヌクレアーゼは、そのポリペプ チドの形で細胞中に直接提供することができ、あるい１戴当技術で認識されてい る技術にしたがって、ＲＮＡまたはＤＮＡとして、発現可能なヌクレオチド配列 の形で細胞中に提供することができる。

ベクター自体代ウィルスベクター（ＲＮＡまたはＤＮＡ）、露出しな直鎖または 環状ＤＮＡ、または核酸材料および細胞中に挿入されるべきあらゆるポリペプチ ドを含む小胞またはエンベロープのような、適切ないかなる型でもよい。小胞に 関して、リポソームのような脂質小胞の構築技術は周知である。このようなリポ ソーム憾　このリポソームの外側において抗体または他の特異的結合分子を提供 することのようなその他の従来技術を用いて特定細胞を標的とすることができる 。例えば、Ａ、Ｈｕａｎｇら、ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリ（ Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２５５：８０１５−８０１８（１９８０）参照。

サツカロマイセス・セレビシェの位置特異的エンドヌクレアーゼカー第５図に示 したヌクレオチド配列を有する遺伝子またはその等価コドンによる配列を有する 遺伝子を発現させることによって、直接得られる。このエンドヌクレアーゼをコ ードするようにされた遺伝子はいかなる適切な発現系でも発現させることができ る。したがって、それカー従来法によって適当なプロモーターを有しＥ、　ｃ旦 」ユ中で発現されるプラスミド中へ取り込まれることができ、そして次にこのエ ンドヌクレアーゼに対する抗体を用いて精製することができる。

しかし好適な実施例で（および本文に例示したように）、このエンドヌクレアー ゼ遺伝子を、そのゲノム中に取り込まれたエンドヌクレアーゼをコードする遺伝 子を有するヘルパー細胞系中で、取り込まれたウィルス配列の一部として発現さ せる。次にヘルパー細胞系１戴位置特異的エンドヌクレアーゼによって認識され るマーカー配列が隣接する、問題の遺伝子を含む外来ヌクレオチド配列をＲＮＡ またはＤＮＡベクター中にパッケージする。これらのウィルスベクター＋４　さ ら＆ミ位置特異的エンドヌクレアーゼ自体を包含しそして、ＲＮＡウィルスの場 合に繊　ウィルスエンベロープがさらに逆転写酵素を包含する。

したがって、本発明実施の際に１戴あらゆる周知の伝達ベクター合成法を使用で き、唯一の違い（戯従来のエンドヌクレアーゼの代わりにサツカロマイセス・セ レビシェのエンドヌクレアーゼを用いること、および宿主ゲノム中に挿入される 遺伝材料に隣接する、新規エンドヌクレアーゼによって認識されるマーカー配列 をイ史用することである。

使用すべきマーカー配列（戴５′末端において、サツカロマイセス・セレビシェ 　Ｔｙ３レトロトランスポゾンの内部ドメインに直かに隣接する５００塩基対、 好ましくは前記ドメインに最も直かに隣接する５０塩基対、および最も好ましく はそれに最も直かに隣接する２５塩基対からなる。同様＆へ挿入される遺伝子の ３°末端において、マーカー配列は前記Ｔｙ３のレトロトランスポゾン内部ドメ インに直かに隣接する５００塩基対、好ましくは前記ドメインに最も直かに隣接 する５０塩基対、および最も好ましくはそれに最も直かに隣接する２５塩基対か らなる。挿入される遺伝子の５°および３゛側の必須マーカー配列を含む遺伝材 料の最小量鷹実施例４に従って決定できる。さら〈実施例１〜３の操作を用いて 、サツカロマイセス・セレビシェ　ＴＹ３エンドヌクレアーゼの位置特異的活性 を提供するために必要な第５図に記載のヌクレオチド配列の最が量を決定するこ とができる。

本発明の特に好ましい実施例において、ベクターエンベロープ＋４’ｒｙ３エン ドヌクレアーゼばかりでなく’ｒｙ３−ｉの第１および第２の０ＲＦｓの全ポリ ペプチド発現産物を含む。

これとは別（ミ従来のレトロウィルスエンドヌクレアーゼマーカー配列（九本発 明の位置特異的エンドヌクレアーゼによって認識されるであろうと確信されてる 。このような他のマーカー（戴単純なスクリーニング技術によって、スクリーニ ングすべきマーカー配列力で隣接する（ｎｅｏＲのような）マーカー遺伝子を含 むヌクレオチド配列を本発明のヘルパー細胞系に導入すること、次いで別の細胞 系を、結果として生じたウィルスベクター（もしあれば）に移入することを試み ること、および形質転換された細胞をスクリーニングすることによって容易に識 別できる。結果として生じた全ての形質転換細胞はさらに解析して、実施例５と 関連させて検討しているよ徨ミマーカー遺伝子の挿入位置を決定する。

（抗体の生産） サツカロマイセス・セレビシェ　ＴＹ３エンドヌクレアーゼに対する抗体檄動物 、特にウサギまたはマウスのような鴫乳類をサツカロマイセス・セレビシェＴＹ ３エンドヌクレアーゼによって免疫し免疫した動物から抗体産生細胞を採取獣こ の細胞を永久分裂可能な培養細胞と融合させ、ハイブリッド細胞を形成し、サツ カロマイセス・セレビシェ　ＴＹ３エンドヌクレアーゼに特異的な抗体を産生ず るハイブリッド細胞を選択しこのハイブリッド細胞から抗体を採取することによ って得ることができる。

このようにしてモノクローナル抗体産生細胞系を作製する技術は周知である：ひ とつの方法１４ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉＬｓｔｅｉｎ、ネイチャー（ＮａｔｕＬ ｌ）ス５６：　４９５−４９７　（１９７５）の方法である。これとは別へ免疫 動物からの血清（戴前記エンドヌクレアーゼに対するポリクローナル抗体の厚料 として利用することができる。実施例６（戴抗体の生産方法を記載している。こ のようにして生産された抗体１戴次に製造規模でエンドヌクレアーゼを精製する ために利用でき、そして、リポソーム小胞中への取り込みのための精製エンドヌ クレアーゼを提供するのに特に有用である。

２施例ユ Ｔ　３エンドヌクレアーゼのアミノおよびカルボキシ　端の識１」Ｔｙ３エンド ヌクレアーゼｆｌＴｙ３位置特異性の明かな決定因子である。

レトロウィルスにおいて、このエンドヌクレアーゼ＋ｔ　ＩＡｊ−１遼」融合タ ンパク質の部分として合成さね、レトロウィルスプロテアーゼの作用によって切 断される。このタンパク質をコードする領域は、Ｔｙ３ＤＮＡ配列のコンピュー タ翻訳によって識別さね、かつ、このタンパク質配列のレトロウィルスエンドヌ クレアーゼ配列との比較が行われた。公知の技術を用いたこのエンドヌクレアー ゼの大規模精製によって、ＴＹ３エンドヌクレアーゼの大きさおよびコード化配 列におけるその末端の位置が確認された。組換え体檄細菌中および酵母中におい てエンドヌクレアーゼを過剰生産するために利用可能であり、かつ、エンドヌク レアーゼ部分を示すペプチドに対する抗体はこのエンドヌクレアーゼの精製をモ ニターするために利用できる。

精製されたタンパク質１１　レトロウィルスエンドヌクレアーゼについて記載さ れているようにＴＹ３末端との結合およびＤＮＡにニックを入れる（ＤＮＡ−ｎ ｉｃｋｉｎｇ）活性について試験される（例え１４Ｍ１ｓｔｒａら、ジャーナル ・オブ・ピロロジー（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、））４４：３３０−３４３（１９８２ ）およびＧｒａｎｄｇｅｎｅｔｔら、ジャーナル・オブ・ピロロジー（１，Ｖｉ 工説１．））５８：　９７０−９７４　（１９８６）。精製されたエンドヌクレ アーゼを次にアミノ末端配列解析に供することができる。エドマン（Ｅｄｍａｎ ）分解を数回行うだけで、通常、これらの結果をＤＮＡ配列と比較するためにア ミノ末端を識別するのに十分である。カルボキシ末端番戴　カルボキシペプチダ ーゼＹ消化によって決定される。

実施例７ オリゴヌクレオチド　・ ＴＹ３挿入特異性を決定する１または複数のタンパク質ドメイン（戴エンドヌク レアーゼ内部にあり、これ（戴挿入を担っている。我々屯位置特異性を与えるド メインを明確にするためへ徹底的なオリゴヌクレオチド特異的変異誘発を試みた 。この技術を用いて、我々屯エンドヌクレアーゼコード化領域において数コドン おきに単一の制限部位のコピーを導入した（およそ３０）。オリゴヌクレオチド 変異誘発技術はこの技術では周知であり、下記のハンドブックに詳細に記載され ている°Ｆ、Ｍ、Ａｕ５ｕｂｅｌら８編著、カレント・プロウィルス・イン−モ レキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ　Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　呈１遼」ヱ１Ｎ）（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆５ｏｎｓ、１９８７ ）。この方法１戯イン・ビトロで容易に識別可能であり、がっ、種々の欠失変異 形成または動物レトロウィルスコード化配列類の導入のための「特異性カセット 」を生成するために後に結合できる変異を生じる。オリゴヌクレオチド手法はや や時間を要したとえ特異性ドメインにおける変異のＴＶ３転位に及ぼす効果は予 測できないにしても、高い成功の確立を有している。

イン・ビボ転位に及ぼすオリゴヌクレオチド変異の効果を試験するためのＴｙ３ 転位アッセイ１戯必要に応じ下記の操作またはその変法によって行うことができ る　ｈｉｓ３−、ｕｒａ３−の酵母株が、標識（ＨＩＳ３）された、ガラスドー スで誘導可能なＴＹ３因子を有するプラスミドで形質変換される。この株（戴同 様＆−変異したエンドヌクレアーゼコード化領域を有するＴｙ３因子のガラスド ースで誘導可能なコピーで形質転換されるであろう。

２重形質転換酵母はガラクトースで増殖１．、ＴＶ３転位を誘発する。次しへ細 胞を５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）上で増殖させてＵＲＡ３標識プラスミ ドをキユアリングする。転位（戴標識プラスミド（ｕ　ｒ　ａ　３−）を喪失し ているがヒスチジン欠乏培地で増殖できるコロニーの頻度によって測定される。

このような細胞はゲノムＨＩＳ３配列を獲得しこうして、転位現象を経る。生じ たデータのサーベイ檄エンドヌクレアーゼのどの領域が組込みに必要であるかを 示している。

２施倒１ ヱヱ土歪徐作 エンドヌクレアーゼ活性モニターのひとつの方法Ｅ　その想定ターゲット、Ｔｙ ３末端およびｔＲＮＡ遺伝子ターゲットに特異的にニックを入れる能力を試験す ることによる。ＬＴＲｓの末端およびターゲットｔＲＮＡ遺伝子における特異的 ＤＮＡニツキングが最大となるような条件１４　Ｇｒａｎｄｇｅｎｅｔｔら、玉 揚書に記載されているような標準的な生化学的操作によって決定できるであろう 。

タンパク質−ＤＮＡ相互作用を追跡するための簡易な方法（本試験下のタンパク 質の存在下において標識された未変化ＤＮＡのニトロセルロースとの結合をモニ ターすることである。タンパク質はニトロセルロースに吸着しかつ生の２本鎖Ｄ ＮＡは吸着しないので、タンパク質−ＤＮＡ相互作用はこのようなアッセイによ って追跡できる。これとは別に、Ａｕ５ｕｂｅｌら、玉揚書に記載のような標準 的操作を通してゲル遅延アッセイ（ゲル・リターデーション・アッセイ）によっ て、タンパク質およびＤＮＡ配列の相互作用を追跡できる。

実施例Ａ ＼にパ　なＴ　３　配置のＵ″′ 組み込まれた（レトロ）プロウィルスを含む転置因子はほとんど全て逆向き反復 配列末端を有している。組込みに必要な実際の末端領域に醜これらの逆向き反復 配列が含まれている。必要な領域哄　レトロウィルスについては欠失解析ニよっ て決定さね、かつ、イン・ビトロでレトロウィルスエンドヌクレアーゼに結合す ることが示された。ｃｉｓにおいて位置特異的転位のために必要なＴＹ３因子の 末端領域檄シグマ因子内部から外側末端に向けて進む重複した欠失によって決定 される。変異憾オリゴヌクレオチド変異誘発および坦３１消化の組み合せによっ てきわめて効率的に行われる。欠失ＴＹ３因子の活性１飄エンドヌクレアーゼ変 異について上述したようく欠失ＴＹ３をＨＩＳ３挿入によって標識しかつｔｒａ ｎｓにおいて相補されたときに組込む能力をアッセイすることによって試験され る。位置特異的組込みのために必要な最ホ末端はそれによって推定される。

実施例１ 動惣岬胞鰐上兄工役用　るための立　的、ベクターの■　ヘルパーウィルスの改 変 モロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）ヘルパーウィルスのようなヘルパーウィルスの特異 性をＴＹ３の特異性に変化させるため＆へ　２種の改変が必要である。最初（ミ ＴＹ３のエンドヌクレアーゼコード化配列をヘルパーウィルスに挿入しなければ ならない。これ哄下記のようにして達成することができる。

ＴＹ３のエンドヌクレアーゼコード化配列を一旦ａｍＨＩ制限断片として単離す る。ＴＹ３中のエンドヌクレアーゼコード化配列ｉｌｌ旦ａｍＨ１部位に隣接し ておらず、したがって、これらの部位置オリゴ変異誘発を介して導入される（Ｆ Ｍ、Ａｕ５ｕｂｅｌら、編著、上掲。）クローンｐＥＧＴｙ３−１からの１重鎖 ’ｒｙ３−を因子ＩＬ必要な変化を造成するために２つの異なるオリゴヌクレオ チドで連続的に変異させる。オリゴヌクレオチド１戴下記に示されている。これ らのオリゴヌクレオチド配列１ｆ、Ｔｙ３−１プラス（＋）鎖配列に等しいと言 うよりはむしろ札補的である。変化した位置法下線および太字で示されている： カッコ内の数字＋４”ｒｙ３−１プラス鎖配列に対応する：（１）５°（３８０ ０）　ＣＡＧＴＣＴＣＡＴＡＡＣＴＧＣＧＧＡＴ（ＸＩＴＴＧＴＴＩＴＡＴｒＧ Ｇ　（３７６８）　３′（２）　５’　（５１４０）田■艶α込Ｗ塵石Ａ貫釘Ｃ ＡＴＡＣＴ弘Ｃ（５１１２）　３’ヘルパ一ウイルスエンドヌクレアーゼコード 化配列の大部分を含む領域に（戯同様＆へ造成された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ） ＢａｍＨ１部位が隣接している。我々が変異誘発するウィルス配列すなわちＭｏ ＭＬＶｌｊ　ｐｓ　ｉマイナスヘルパーウィルスのそれである。本文に述べた対 等な組み合わせ（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅＳ）は、ＭｏＭＬＶの当初の配列解析に 示された通りのＲＮＡゲノム配列に相当している（Ｓｈｉｎｎｉｃｋら、ネイチ ャー　（Ｎａｔｕｒｅ）２９３：　５４３−５４８　（１９８１）参照）。変異 の第２組引戴下記の通りである。

変異の両組が導入されかつ制限消化およびヌクレオチド配列解析によって確認さ れたとき、ＴＹ３−１からのエンドヌクレアーゼコード化領域を含有する且Ａ電 気泳動による適当な断片の単離、およびＴＹ３エンドヌクレアーゼコード化断片 のＭｏＭＬＶベクターのＢａｍＨ１部位への連結によって行うことができる。

これ１４Ａｕｓｕｂｌ、上掲に記載のように標準的技術である。

ヘルパーウィルスは上記のように構築され一数多くの参考文献にこれまで記載さ れてきたように細胞系統に組込まれる。例えＥＭａｎｎら、セル（Ｃｅｌｌ）３ ３：　１５３　（１９８３）Ｍｉ　１ｌｅｒら、モレキュラー・アンド・セルラ ー・バイオロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、）５：４３１（１９８５ ）；およびＣｏｎｅおよびＭｉｌｌｉｇａｎ、プロシーディンゲス・オブ・ナシ ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンシイズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

５工ｉ、ＵＳＡ）８１：　６３４９　（１９８４）参虱第２の改変（戴ベクター ウィルス・・・この場合ＭｏＭＬＶベクター・・・の末端を供給する反復配列の ためのＴＹ３エンドヌクレアーゼのための基質認識領域の置換を伴う。例えばこ のようなベクター＋ｆ、Ｎ２タンパク質コード化領域を置換する問題の遺伝子を 含む。本質的ζ本操作は下記の通りである。小さい欠失変異を導入しベクターウ ィルスのために外側末端が生成した領域をそこから除去する。これらの変異（戴 同時にＭｏＭＬＶベクターの５′および３＝　ＬＴＲ内部末端から逆向き反復配 列を除去し、そして、ＴＹ３逆向き反復末端を挿入できる制限部位を造成する。

付与された最初のオリゴヌクレオチド＋４ＸｍａＩ部位（ＣＣＣＧＧＧ）を生じ る。付与された第２のオリゴヌクレオチドＬ　Ａ１１１部位（ＧＧＧＣＣＣ）を 生じる。ＭｏＭＬＶベクターに導入されたこれらの変異の対等な組み合わせＩＬ 上記（すなわち、＝般的ベクターよりもむしろこのウィルスの公表された配列に 関して）と同一である。導入されるべきＴＹ３末端配列は極めて短く、新規作製 ＭｏＭＬＶベクター制限部位と一致する末端延長部を有する合成２本鎖オリゴヌ クレオチドとして供給されるのが好ましい。モロニー（Ｍ　。

１ｏｎｅｙ）ゲノムに変異を造成するために用いられるオリゴヌクレオチド哄プ ラス（＋）鎖配ダ１ＪｉＺ…補的な鎖中に付与される。変化したヌクレオチＦｌ ＆下線および太字で示しである。欠失領域はハイフン（−）で示しである。

ＴＹ３末端を有するオリゴヌクレオチド（戴下記に示した。これらの「カセット 」（戯　欠失モロニー（Ｍｏ　１　ｏｎ　ｅ　ｙ）ベクター逆向き末端反復配列 の位置の上に示した制限部位中に挿入される。カセット７１戴配列５のＸｍａＩ 部位に挿入さＬ　一方、カセット８は配列６のｍＩ部位に挿入される。

３　’　ＡＴＭＴＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＴＴＡｍ　５゜ここで利用した酵母培養 物およびクローン類（戯アービン（Ｉ　ｒ　ｖ　ｉ　ｎ　ｅ）のカルフォルニア 大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）の私的寄託機関に 維持されている。これとは別へ第５図に示した配列を有するＤＮＡＩ戴例えば自 動ヌクレオチド配列合成装置を使用して容易に合成でき、その後、記載のように この配列を容易にヘルパー細胞ゲノム中に挿入できる。

■　ヘルパー細胞系の改変 次に、レトロウィルス構造遺伝子ｍ、　１旦」、および’ｅｎｖをコードするプ ラスミドまたはプラスミド類の導入ならびにレトロウィルスエンドヌクレアーゼ を記載のようにＴＹ３エンドヌクレアーゼに置換することによって、細胞系を「 ヘルパー」または「パスケージング」系に改変する。次＆ミバツケージング系、 例えばｐｓｉ−２を、「カセット」・・・すなわちＴＹ３エンドヌクレアーゼに よって認識される末端を有するプラスミドのような・・・クローン化されたレト ロウィルスベクターを保持するプラスミドの挿入によって改変する。ヘルパーウ ィルスに導入される配列ＩＬＴｙ３エンドヌクレアーゼのほとんどまたは単に特 異性ドメインのみを含むことができる。ポリペプチド・・すなわちＴＹ３エンド ヌクレアーゼ自体ＩＬベクターウィルスに結び付いている。

ヘルパーまたはパッケージング糸瓜　レトロウィルスのヌクレアーゼと置換され たＴｙ３エンドヌクレアーゼを有している。ヘルパーパッケージング系から発現 されたベクターウィルス１戴ヘルパーウイルスタンパク質によってパッケージさ れたベクター核酸（ＴＹ３末端）であり、Ｔｙ３エンドヌクレアーゼポリペプチ ドを含む。

上述したベクターおよびパンケージング系について、最初＆ミ複製および位置特 異的組込みが可能なウィルスを産生ずる能力を試験する。例え（戴複製ウィルス の末端がＴＹ３エンドヌクレアーゼと一致するように改変されたｎｅｏＲ標識し たＮ−２ベクター１戯置換されたエンドヌクレアーゼをコードする配列を有する 組込みヘルパーウィルスを含むパッケージング系中に移入させることができる。

ＴＹ３エンドヌクレアーゼを含む粒子または小胞中にパッケージされたＴｙ３末 端配列を有するベクターウィルス鷹　このパッケージング系から採取さね、次に 標的細胞を感染させるために使用される。大臣形質転換体を識別するため（ミこ れらの標的細胞をネオマイシンアナログ選択によってテストする。

例えばネオマイシン耐性の動物細胞クローンを、ベクター配列の位置特異的組込 みのためにスクリーニングする。ベクターゲノム結合点を含む制限断片はポリメ ラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）によって増幅１．、ＤＮＡ配列解析のためにサブ クローン化する。多数の組込み体を同様にスクリーニングレイン・ビトロ増幅Ｄ ＮＡを、総ｔＲＮＡから作製されたプローブとハイブリダイズさせることによっ て、組込みがｔＲＮＡ遺伝子に位置特異的であるかどうかを決定することができ る。

ヌＪ岨舛５ 胡タシ＞＋産 サツカロマイセス・セレビシェ　ＴＹ３エンドヌクレアーゼをコードする配列に よって生産されたポリペプチドの精製（戴　クローン化されたエンドヌクレアー ゼに対する抗体を用いて行うことができる。抗体はポリクローナルであってもよ く、従来の免疫化によってウサギまたはヤギのような動物において作製しても、 またはＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、ネイチャー　（ＮＢｔｕｒｅ）２ ５６：　４９５−４９７　（１９７５）によって開発されたハイブリドーマ技術 によって作製されたモノクローナルであってもよい。

例え１戴雄のニューシーラント白色ウサギを用いる（他の属および種も適切で有 用であるかもしれないが）。例え）戯使用する微生物の細胞の超音波抽出抗原の 調製に使用されるものと同一の培養物に由来する全細胞成分を含むフロイント（ Ｆｒｅｕｎｄ）完全アジュバントを使用することによって、免疫化を達成する。

したがって、洗浄、集菌されたある量の細菌を１０倍容量の蒸留水に懸濁し、２ ０分間蒸気を当てる。遠心分離後、上溝を捨てそして細胞を水に再懸濁し、再度 ２０分間蒸気を当てる。この細胞を再度遠心分離しその後、水に再懸濁し　１５ ｍｇ／ｍｌ　（乾燥重量）に相当する懸濁物を得る。粗可溶性タンパク質抗原（ リン酸緩衝生理食塩水１ｍｌ当たりタンパク質１ｍｇ）６ｍｌを０．４ｍｌの全 細胞成分アジュバント懸濁物と同一免疫原となるよう＆ミフロイント不完全アジ ュバント（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）、デトロイト、ミシガン）６ｍｌと混合獣２ ０ゲージの針を通してフラッシングを繰り返すことによって、均質ペーストに変 換する。最初の接種（戴皮下部位４ケ所のそれぞれに１．０ｍｌおよび皮内部位 ２ケ所のそれぞれに０，１ｍｌ接種することからなる。動物に対して、皮下部位 ２ケ所のそれぞれに１ｍｌを最初の５週後に接種しその後、４及至５週間隔で０ １ｍｌを静注および０．４ｍｌを皮下中に接種する。

血清の実験試料は各接種１週後に血液から採取する。

ＴＹ３エンドヌクレアーゼ試料（戯一般的なタンパク質分画方法によって部分的 に精製できる。次にある量のこの酵素調製物を用いて動物を標準的方法によって 免疫する。血清代それを、すなわち相同Ｕを誘発した酵素バッチに対する所望の 抗体について試験する。遊離の抗体グロブリン１３イオン交換クロマトグラフイ ーまたはその他の適当な技術によってあらゆる血液沈澱物および／または免疫複 合体から分離される。

次に抗体を、同種の酵素／Ｕに対するその能力を決定するために試験する。

これとは別へモノクローナル抗体をエンドヌクレアーゼから作製できる。識別さ れた抗原に対するモノクローナル抗体の調製方法は周知である。

本発明（戯その精神または本質的特徴から逸脱することなく他の特異的形態で実 施できる。記載された実施例は全ての点において例示されているのみであり限定 的でないとして見なされるべきであり、したがって、本発明の範囲服先の記載よ りもむしろ添付されたクレームによって表される。クレームと同一の意味および 範囲と同一の範躊に入る変更は全て、この範囲内に包含されるべきである。

ＦＩＧ、　４Ｂ　ＦＩＧ、　４Ｃ ４，４− ２、〇− 噂 国際調査報告

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. １．所望のタンパク質をコードする遺伝子を含み、前記遺伝子がサッカロマイセ ス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｔｙ３の位置特異的組込みマーカ ーによって隣接されている組換え核酸配列。
2. ２．ベクター中の請求項１記載の配列。
3. ３．前記ベクターがＤＮＡウィルスである請求項２記載のベクター。
4. ４．前記ベクターがＲＮＡウィルスである請求項２記載のベクター。
5. ５．前記ベクターがプラスミストである請求項２記載のベクター。
6. ６．サッカロマイセス・セレビシエＴｙ３位置特異的エンドヌクレアーゼの生物 活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸分子を含み、前記生物活性が 、サッカロマイセス・セレビシエＴｙ３の位置特異的組込みマーカーの間に保持 される遺伝材料の位置特異的挿入の触媒作用である遺伝子。
7. ７．前記ポリペプチドが下記の配列またはその等価コドンによってコードされる 請求項６記載の遺伝子。： 【配列があります】
8. ８．請求項６で識別されるポリペプチドの実質的に純枠な試料。
9. ９．ヘルパーウィルスに組み込まれた請求項７記載の遺伝子。
10. １０．サッカロマイセス・セレビシエＴｙ３の５′末端上で、下記の配列：【配 列があります】 にある位置特異的組込みマーカー、および、サッカロマイセス・セレビシエＴｙ ３の３′末端上で下記の配列：【配列があります】 にある位置特異的組込みマーカーをコードする組換え核酸配列。
11. １１．細胞中に、請求項６記載の遺伝子を有する組み込まれたヘルパーウィルス を含有し、さらに細胞境界内部に、前記ポリペプチドによって認識される位置特 異的マーカーによって隣接される非取り込み遺伝子を含有する改変されたヘルパ ー細胞系。
12. １２．前記組み込まれたヘルパーウィルスが複製不能である請求項１１記載の改 変されたヘルパー細胞系。
13. １３．前記組み込まれたヘルパーウィルスが、組換えを介して請求項６記載の遺 伝子を直接取り込んだ産物である請求項１２記載の改変されたヘルパー細胞系。
14. １４．前記組み込まれたヘルパーウィルスが、ａ．プロモーター−翻訳開始領域 をコードする核酸配列；ｂ．核酸結合ポリペプチドをコードする核酸配列；ｃ． 逆転写酵素をコードするヌクレオチドとともに請求項７記載の遺伝子を包含する 核酸配列；および ｄ．エンベロープポリペプチドをコードする核酸配列；を含む請求項１１記載の 改変されたヘルパー細胞系。
15. １５．前記細胞系がｐｓｉ−２である請求項１４記載の改変されたヘルパー細胞 系。
16. １６．前記組み込まれた配列がモロニーマウス白血病ウィルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ）に由来する請求項１４記載の改 変されたヘルパー細胞系。
17. １７．請求項１１記載の改変されたヘルパー細胞系であって、その細胞境界内部 に請求項２記載のベクターが存在するヘルパー細胞系。
18. １８．内部ドメイン核酸配列の５′末端に隣接する位置特異的組込みマーカーが 、転写産物として発現されたとき、下記の配列：【配列があります】 であること、および内部ドメイン核酸配列の３′末端に隣接する位置特異的組込 みマーカーが、転写産物として発現されたとき、下記の配列：【配列があります 】 であること、およびさらにこれらの配列がその複製された完全な長さのＤＮＡに おいて、３′および５′外側末端並びに内部的にそれぞれ見いだされる請求項１ ７記載の改変されたヘルパー細胞系。
19. １９．位置特異的方法で細胞のゲノム中に外来遺伝子を挿入可能な伝達ベクター であって、 ａ．サッカロマイセス・セレビシエＴｙ３エンドヌクレアーゼの位置特異性を有 するエンドヌクレアーゼまたは前記エンドヌクレアーゼをコードし前記細胞中に おいて発現可能な核酸；および ｂ．前記ゲノム中に挿入される外来遺伝子で、前記遺伝子が、前記エンドヌクレ アーゼによって認識される位置特異的組込みマーカーの間に位置する遺伝子；を 含む伝達ベクター。
20. ２０．前記遺伝子がＤＮＡからなる請求項１９記載の伝達ベクター。
21. ２１．前記遺伝子がＲＮＡからなり、前記ベクターがさらに逆転写酵素または前 記細胞中において逆転写酵素をコードする発現可能な核酸配列を含む請求項１９ 記載の伝達ベクター。
22. ２２．さらに、前記エンドヌクレアーゼおよび前記遺伝子が含有されるエンベロ ープを含む請求項２０または２１記載の伝達ベクター。
23. ２３．前記エンベロープがウィルスエンベロープである請求項２２記載のベクタ ー。
24. ２４．前記エンベロープが脂質小胞である請求項２２記載のベクター。
25. ２５．サッカロマイセス・セレビシエＴｙ３エンドヌクレアーゼに特異的な抗体 。
26. ２６．サッカロマイセス・セレビシエＴｙ３エンドヌクレアーゼに特異的な抗体 を産生しおよび分泌する継代株化細胞。
27. ２７．ｔＲＮＡの隣に特異的に遺伝子を挿入可能な伝達ベクターを作製する方法 であって、以下の段階からなる方法。 ａ．核酸結合性ポリペプチドをコードする核酸配列、プロモーター−翻訳開始領 域を含み、逆転写酵素およびサッカロマイセス・セレビシエエンドヌクレアーゼ を含むポリペプチドをコードする核酸配列、およびエンベロープをコードする核 酸配列を含む第１の外来性の、複製不能なヌクレオチド配列を有するヘルパー細 胞系を準備すること、および ｂ．前記ヘルパー細胞系の細胞境界内部において、所望のタンパク質をコードす る遺伝子を含む第２の組換え核酸配列を準備することであり、前記遺伝子がサッ カロマイセス・セレビシエＴｙ３の位置特異的組込みマーカーが隣接しているこ と。 ｃ．前記第２の核酸配列またはそれからの核酸誘導体を前記ヘルパー細胞系中に パッケージし伝達ベクターを産生する。
28. ２８．サッカロマイセス・セレビシエＴｙ３エンドヌクレアーゼに特異的な抗体 を生産する方法であって、以下の段階からなる方法。 ａ．動物をサッカロマイセス・セレビシエＴｙ３エンドヌクレアーゼによって免 疫すること、 ｂ．前記免疫化された動物から抗体産生細胞を採取すること、ｃ．前記細胞を永 久分裂可能な細胞と融合させ、ハイブリッド細胞を形成させること、 ｄ．サツカロマイセス・セレビシエＴｙ３エンドヌクレアーゼに特異的な抗体を 産生するハイブリッド細胞を選択すること、ｅ．サッカロマイセス・セレビシエ Ｔｙ３エンドヌクレアーゼに特異的な抗体を前記選択されたハイブリッド細胞か ら採取すること。
29. ２９．実質的に純粋なサッカロマイセス・セレビシエＴｙ３エンドヌクレアーゼ を調製する方法であって、以下の段階からなる方法。 ａ．前記サッカロマイセス・セレビシエＴｙエンドヌクレアーゼの粗液体調製物 を、前記エンドヌクレアーゼに対する固定化抗体に接触させること、ｂ．前記液 体調製物を前記固定化抗体から分離すること、およびｃ．その後、前記固定化抗 体から前記エンドヌクレアーゼを純粋な形態で容出する。
30. ３０．改変されたヘルパー細胞系構築のための方法で、ａ．核酸結合ポリペプチ ド、逆転写酵素エンドヌクレアーゼ、およびエンベロープポリペプチドをコード する外来性で複製不能なヌクレオチド配列を準備すること、 ｂ．前記配列をヘルパー細胞系に挿入すること、およびｃ．前記配列を前記ヘル パー細胞ゲノム中に組み込むこと。 からなる方法。
31. ３１．ヘルパー細胞系のゲノム中に組み込むことが可能な外来性核酸配列の構築 のための方法で、 ａ．核酸結合ポリペプチドをコードする核酸配列、プロモーター−翻訳開始領域 を含み、逆転写酵素およびエンドヌクレアーゼを含むポリペプチドをコードする 核酸配列、およびエンベロープポリペプチドをコードする核酸配列を含む外来の 、複製不能なヌクレオチド配列を準備し、サッカロマイセス・セレビシエＴｙ３ の位置特異的組み込みマーカーによって隣接されているヌクレオチド配列を準備 すること、および ｂ．サッカロマイセス・セレビシエＴｙ３エンドヌクレアーゼ。 からなる方法。
32. ３２．請求項２記載のベクター構築のための方法で、ａ．挿入される遺伝子を得 ること、およびｂ．サッカロマイセス・セレビシエＴｙ３の位置特異的組込みマ ーカーを前記遺伝子のフランキング領域上にスプライスすること。 からなる方法。
33. ３３．外来遺伝子およびサッカロマイセス・セレビシエの挿入位置特異性を有す るエンドヌクレアーゼを前記細胞中に供給することを含む、細胞のＤＮＡ中に外 来遺伝子を挿入する方法であって、前記外来性遺伝子が前記エンドヌクレアーゼ によって認識される末端によって隣接されており、その結果前記エンドヌクレア ーゼが前記細胞中においてｔＲＮＡ遺伝子に隣接するＤＮＡを切断し、かつ、前 記外来遺伝子および前記末端をこの切断部位において前記ＤＮＡ中に挿入するこ とを特徴とする方法。