JPH10508478A - Ｉ−Ｓｃｅ Ｉ酵素をコードするヌクレオチド配列、及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｉ-ＳceＩ酵素をコードした、単離ＤＮＡを提供する。該ＤＮＡ配列は、クローニングベクタ及び発現ベクタ、形質転換細胞及びトランスジェニック動物へ導入することが可能である。該ベクタは遺伝子マッピングと、遺伝子の部位特異的導入に有益である。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｉ-ＳceＩ酵素をコードするヌクレオチド配列、及びその使用 発明の背景 本発明は、制限酵素Ｉ-ＳceＩをコ−ドするヌクレオチド配列に関する。本発 明はまた、該ヌクレオチド配列を有するベクタ、該ベクタで形質転換した細胞、 該ベクタに基づくトランスジェニック動物、及び該動物の細胞由来の細胞株に関 する。本発明はまた、真核ゲノムのマッピング、及び in vivo での部位特異的 遺伝的組み換えへのための、Ｉ-ＳceＩの使用に関する。 遺伝子を哺乳類の生殖系列に導入することは、生物学で非常に興味のもたれて いることである。外来的に加えたＤＮＡを取り込み、またそのＤＮＡ中に含まれ ている遺伝子を発現するという哺乳類細胞の性向が、長い間知られている。遺伝 子操作の結果は、これらの動物の子孫へも遺伝する。これら子孫の細胞全ては、 導入遺伝子をゲノムの遺伝的構成の一部として遺伝している。このような動物は 、トランスジェニックと呼ばれている。 トランスジェニック哺乳類により、胚発生と分化時の遺伝子制御、遺伝子作用 、及び免疫系での細胞の相互作用についての研究方法が提供される。該動物全体 が、複雑な生物学的プロセスを制御する、操作遺伝子の究極のアッセイ系である 。 トランスジェニック動物により、種々の遺伝子の、組織特異的な、または発生 的制御に関わるＤＮＡ配列を機能的に解析する一般的アッセイが提供される。更 にトランスジェニック動物は、組み換えタンパク質の発現、及びヒトの遺伝病に 関しての正確な動物モデルを作るための有益な媒介物（vehicles）となる。 遺伝子クロ−ニングと、動物、及び動物細胞での発現に関する一般的議論は、 文献を参照されたし（Ｏld and Ｐrimrose,"Ｐrinciple of Ｇene Ｍanupilatio n",Ｂlackwell Ｓcientific Ｐublications,Ｌondon(1989)255-）。 特異的な疾患及び遺伝的障害にかかりやすい性質のあるトランスジェニック株 は、これらの状態へ導くイベントの調査において、価値が大きい。遺伝的疾患の 処置の有効性は、該疾患の初期的原因でめる遺伝子欠損の同定に依存する可能性 があることがよく知られている。有効な処置の発見は、有効性、安全性、及び処 置プロトコ−ルの作用様式（例えば遺伝的組み換え）の研究を可能にする、前記 の疾患または前記の障害に導く動物モデルを提供することにより促進される。 遺伝的組み換えを理解するための鍵となる問題の一つは、開始工程の性質であ る。細菌及び真菌を使った相同性組み換えの研究により、二つのタイプの開始機 構が提案されるに至った。最初のモデルでは、一本鎖のニックが、鎖の同化と枝 の移動（branch migration）とを開始する(Ｍeselson and Ｒadding 1975)。あ るいは、二本鎖の切れ目が生じて、次いで開裂していない相同性配列を鋳型とし て利用する修復機構が働く（Ｒesnick andＭartin 1976）。もう一方のモデルは 、形質転換用プラスミドを染色体との相同性部分で線状化すると、酵母における 組み込み形質転換が劇的に増大するという事実（Ｏrr-Ｗeaver,Ｓzostak and Ｒ othstein 1981）と、酵母の接合型相互変換(mating type interconversion)で現 れる二本鎖の切れ目の直接的観察（Ｓtrathern et al.,1982）とにより支持され ている。最近になって、二本鎖の切れ目が、正常な酵母の減数分裂の組み換え時 にも特徴づけられた（Ｓun et al.,1989;Ａlani,Ｐadmore and Ｋleckner 1990 ）。 酵母では、二本鎖エンドヌクレア−ゼ活性が幾つか特徴付けられている：ＨＯ 及びイントロンにコ−ドされたエンドヌクレア−ゼは、相同性組み換え機能に関 連していて、一方、その他のものは、不明の遺伝的機能を有している（Ｅndo-Ｓ ceＩ,Ｅndo-ＳceII）(Ｓhibata et al.,1984;Ｍorishima et al.,1990)。ＨＯ部 位特異的エンドヌクレア−ゼは、ＭＡＴのＹＺジャンクションの近傍で二本鎖の 切れ目を入れて、接合型相互変換を開始する(Ｋostriken et al.,1983)。次いで この切れ目は、無傷のＨＭＬまたはＨＭＲ配列を利用して修復される。ＨＯ認識 部位は縮重した２４bpの非対称的配列である(Ｎickoloff,Ｃhen,and Ｈeffron 1 986; Ｎickoloff,Ｓinger and Ｈeffron 1990)。この配列は、分子内及び分子間 の有糸分裂性、及び減数分裂性の組み換えを促進させるために、人工的構築物中 で「組み換え子（recombinator）」として利用されてきた(Ｎickoloff,Ｃhen,an d Ｈeffron 1986;Ｋolodkin,Ｋlar,and Ｓtahl 1986;Ｒay et al.,1988,Ｒudin and Ｈaber 1988;Ｒudin,Ｓugarman,and Ｈaber 1989)。 ミトコンドリア中でのイントロンの移動性の原因となっている、二つの、部位 特異的エンドヌクレア−ゼＩ-ＳceＩ（Ｊacquier and Ｄujon 1985）とＩ-ＳceI I(Ｄelahodde et al.,1989:Ｗenzlau et al.,1989)は、ＨＯ-誘導性変換に似た 遺伝子変換を開始する(Ｄujon 1989をレビュ−として参照されたし)。２１ＳrＲ ＮＡ遺伝子の、オプションイントロンであるＳcＬＳＵ.1にコ−ドされているＩ- ＳceＩは、二本鎖の切断をイントロン挿入部位において開始する（Ｍacreadie e t al.，1985;Ｄujon et al.,1985;Ｃolleaux et al.,1986）。Ｉ-ＳceＩの認識 部位は１８bpの非対称的配列にわたって伸びている（Ｃolleaux et al.,1988） 。この二つのタンパク質は明らかにその構造により関係していないが(長さに関 しては、ＨＯは586アミノ酸であり、一方Ｉ-ＳceＩは235アミノ酸である)、双方 はともに、それぞれの認識部位内に張り出した、４bpのよろめいた（staggered ）断片を生成する。ミトコンドリアのイントロンにコ−ドされたエンドヌクレア −ゼは、核内で転写されて、細胞質で翻訳され、核内の部位で二本鎖の切れ目を 生成することが分かっている。Ｉ-ＳceＩに誘導される修復イベントは、ＨＯに より開始されるものと同等である。 要約すると当該技術分野では、ヒトの疾患や遺伝的障害の、トランスジェニッ ク動物モデルを提供する方法と試薬とが必要とされている。試薬は制限酵素Ｉ- ＳceＩと、この酵素をコ−ドする遺伝子をベ−スとすることが可能である。特に 、天然の遺伝子を、前記の疾患または前記の障害を軽減する遺伝子で置換するた めの試薬と方法とが必要である。 発明の要約 したがって本発明は、当該技術分野でのこれらの必要性を実現するのを助ける 。特には、本発明はＩ-ＳceＩ酵素をコ−ドする単離されたＤＮＡに関連する。 該ＤＮＡは以下の配列を有している： 本発明はまた、本発明のＩ-ＳceＩ酵素をコ−ドしたＤＮＡに対して、機能す るように連結されたプロモ−タを具備したＤＮＡ配列に関する。 本発明は更に、本発明のＩ-ＳceＩ酵素をコ−ドしているＤＮＡ配列と、本願 で記載するその他のＤＮＡとに相補的な、単離されたＲＮＡに関する。 本発明の一つの態様において、ベクタが提供されている。該ベクタは、本発明 のＩ-ＳceＩ酵素をコ−ドする、プラスミド、バクテリオファ−ジ、またはコス ミドベクタを具備している。 更に本発明は、本発明のベクタで形質転換された大腸菌（Ｅ.coli）、または 真核細胞に関する。 また本発明は、Ｉ-ＳceＩ酵素をコ−ドするＤＮＡ配列を有するトランスジェ ニック動物と、該トランスジェニック動物の細胞由来の培養細胞株とに関する。 更に本発明は、酵素Ｉ-ＳceＩに対する、少なくとも一つの制限部位が生物体 の染色体に挿入されていることを特徴とする、トランスジェニック生物体に関す る。 更に本発明は、酵素Ｉ-ＳceＩを使用して真核ゲノムを遺伝的にマッピングす る方法に関する。 本発明は更に、酵素Ｉ-ＳceＩを利用した、生物体内での in vivo の部位特異 的組み換えの方法に関する。 図面の簡単な説明 本発明は、以下の図を参照することでより完全に記載されるであろう。 図１は、ミトコンドリアのＩ-ＳceＩ遺伝子に対応するユニバ−サルコ−ド（u niversal code）である。 図２は、酵素Ｉ-ＳceＩをコ−ドするヌクレオチドと、天然のＩ-ＳceＩ酵素の アミノ酸配列である。 １及び２：これらのアミノ酸は触媒活性を得るためには必ず必要である 。その他の置換（例えば初めの１０アミノ酸の欠失）が可能である。 図３はＩ-ＳceＩ認識配列を示し、該認識部位の可能な変異と、その変異の認 識 厳密度への影響とを示している。 図４は、プラスミドpＳＣＭ525の領域のヌクレオチド配列と、推定のアミノ酸 配列である。本発明のＩ-ＳceＩ酵素のヌクレオチド配列は、ボックスで囲って ある。該遺伝子の正規のものと比較してＮ末端にアミノ酸が二つ伸長しているこ とに注意されたし。 図５は、Ｉ-ＳceＩ酵素のアミノ酸配列の多様性を示している。 酵素活性に影響せずに、変異させることが可能な部位（証明済み）： １及び２位は非天然型である。この二つのアミノ酸はクロ−ニング戦略のため に加えられたものである。 １から１０位まで：欠失させることが可能である； ３６位：Ｇは許容される； ４０位：ＭまたはＶは許容される； ４１位：ＳまたはＮは許容される； ４３位：Ａは許容される； ４６位：ＶまたはＮは許容される； ９１位：Ａは許容される； １２３及び１５６位：Ｌは許容される； 23位：Ａ及びＳは許容される； 酵素活性に影響する変異（証明済み） １９位：ＬからＳ； ３８位：ＩからＳまたはＮ； ３９位：ＧからＤまたはＲ； ４０位：ＬからＱ； ４２位：ＬからＲ； ４４位：ＤからＥ,Ｇ,またはＨ； ４５位：ＡからＥまたはＤ； ４６位：ＹからＤ； ４７位：ＩからＲまたはＮ； ８０位：ＬからＳ； １４４位：ＤからＥ； １４５位：ＤからＥ； １４６位：ＧからＥ； １４７位：ＧからＳ。 図６は、エンドヌクレア−ゼと、関連するエンドヌクレア−ゼとをコ−ドして いる、グル−プＩイントロンを示す。 図７は、Ｉ-ＳceＩの合成遺伝子を有する酵母発現ベクタである。 図８は、哺乳類発現ベクタＰＲＳＶ Ｉ-ＳceＩである。 図９は、プラスミドpＡＦ100の制限酵素地図である（ＹＥＡＳＴ,6:521-534,1 990も参照されたし；これはこの文献に基づいていて、これを本願に組み込む） 。 図１０Ａ及び10Ｂは、プラスミドpＡＦ100の領域のヌクレオチド配列と制限部 位とを示す。 図１１は、大腸菌（Ｅ.coli）とその他の細菌に対するＩ-ＳceＩ部位を含んだ 、挿入ベクタpＴＳＭω、pＴＫＭω、及びpＴＴcωである。 構築：トランスポザ−ゼ遺伝子を有し、ユニ−クなＮotＩ部位のリンカ（Ｉ- ＳceＩ）が挿入された、pＧＰ704は、デロレンツォ（Ｄe Ｌorenzo）より入手し た。 図１２は、酵母に対するＩ-ＳceＩ部位を有した、挿入ベクタpＴＹＷ6である 。 構築：ＢamＨＩにリンカ（Ｉ-ＳceＩ−ＮptＩ）を有している挿入ベクタpＴＹ Ｗ6は、Ｊ.Ｄ.ボエク（Ｂoeke）より入手した。 図１３は、哺乳類に対するＩ-ＳceＩを有する挿入ベクタＰＭＬＶ ＬＴＲ Ｓ ＡＰＬＺである。 図１４は、Ｉ-ＳceＩで開裂した、７つのトランスジェニック酵母株のセット である。ＦＹ1679（対照）由来の染色体、及び染色体XIの種々の部位に挿入され たＩ-ＳceＩ部位を有する７つのトランスジェニック株由来の染色体をＩ-ＳceＩ で処理した。ＤＮＡを、0.25 Ｘ ＴＢＥ緩衝液中で一つのアガロ−スゲル（Ｓea Ｋem）で電気泳動した（130Ｖ、１２℃、Ｒotaphor装置（Ｂiometra）で７０時 間、１００から ４０秒の減少パルス時間）。(Ａ)ＤＮＡを臭化エチジウム（0.2μg／ml）で染色 して、ハイブリダイゼ−ション用にＨybondＮ膜（Ａmersham社）にトランスファ −した。(Ｂ)セット中の最も短い断片にハイブリダイズする、³²Ｐで標識したコ スミドpＵＫＧ040をプロ−ブとして使用した。染色体XIの位置及び最小の染色体 を示してゐる。 図１５は、遺伝子マッピング用の合理的な入れ子状(nested)染色体断片化戦略 である。(Ａ)Ｉ-ＳceＩの位置を、左／右の方向性に関わらずにマップ上に配置 してある（より短い断片を人為的に左に配置してある）。ＰＦＧＥで測定した断 片のサイズ（図１４Ａ）をkbで示してある(それぞれの測定の精度の限界のため 、二つの断片の大きさの合計には、幾分の多様性がある)。(Ｂ)セット中の最小 断片とハイブリダイズするプロ−ブを使用したハイブリダイゼ−ションにより、 それぞれの断片の方向性が決定される（図１４Ｂ）。プロ−ブとハイブリダイズ する断片（実線）を、人為的に左に配置した。(Ｃ)トランスジェニック酵母株を 、ハイブリダイズする染色体断片の長さの短いほうから順に配置した。(Ｄ)最小 及び最大の間隔を有する、推定のＩ-ＳceＩマップをkbで示してある（幾つかの 間隔の多様性はＰＦＧＥ測定の限界のためである）。(Ｅ)染色体のサブ断片をプ ロ−ブとして使用して、それぞれのコスミドクロ−ンをマップ上の間隔またはＩ -ＳceＩ部位へ割り当てた。 図１６は、染色体XIの左右末端プロ−ブを使用したハイブリダイゼ−ションに よる、トランスジェニック酵母株のＩ-ＳceＩ部位のマッピングである。ＦＹ167 9由来の染色体（対照）、及び７つのトランスジェニック酵母株由来の染色体を Ｉ-ＳceＩで処理した。トランスジェニック酵母株を図１５で説明したようにし て順に並べた。電気泳動の条件は、図１４と同様であった。³²Ｐで標識したコス ミドpＵＫＧ040とpＵＫＧ066を、それぞれ左、及び右の末端プロ−ブとして使用 した。 図１７は、入れ子状(nested)染色体断片をプロ−ブとして使用した、コスミド のコレクションである。コスミドＤＮＡをＥcoＲＩで消化して、0.9％のアガロ −スゲル電気泳動にかけて(ＳeaＫem,1.5Ｖ/cm,14時間)、臭化エチジウムで染色 しＨybondＮ膜へトランスファ−した。コスミドを前のハイブリダイゼ−ション の順で配置して、戦略を可視化すのに役立てた。ハイブリダイゼ−ションは、Ｐ ＦＧＥ で精製した（図１６を参照）左末端の入れ子状(nested)染色体断片をプロ−ブと して使用して、３つの同じ膜上で連続して行った。Ａ:臭化エチジウム染色（ラ ダ−はＢＲＬの１kbラダ−である）、Ｂ:膜♯１，プロ−ブ：左側のtelからＡ30 2まで、Ｃ:膜♯１，プロ−ブ：左側のtelからＭ57部位まで、Ｄ:膜♯２，プロ− ブ：左側のtelからＨ81部位まで、Ｅ:膜♯＝２，プロ−ブ：左側のtelからＴ62 部位まで、Ｆ:膜♯３，プロ−ブ：左のtelからＧ41部位まで、Ｇ:膜♯３，プロ −ブ：左側のtelからＤ304部位まで、Ｈ:膜♯３，プロ−ブ：染色体XI全体。 図１８は、入れ子状(nested)染色体断片戦略で決定した、酵母染色体XIのマッ プである。染色体を７つのＩ-ＳceＩ部位（E40,Ａ302，・・・）で離して、８つ の間隔に分けた（サイズはkbで表示、図１５Ｄを参照）。間隔内に含まれるか、 またはＩ-ＳceＩ部位を横切るコスミドクロ−ンを、間隔の下、または間隔の境 界の下にそれぞれ示した。プロ−ブとして使用した遺伝子とハイブリダイズする コスミドクロ−ンを、文字（a-i）で表示してある。それらは、Ｉ-ＳceＩマップ に関しての遺伝子の位置を示し、遺伝子地図（最上）との比較を可能にする。 図１９は、酵母で成功した部位特異的相同性組み換えの図である。 図２０は、Ｉ-ＳceＩによって誘導されるＨＲの検出のための実験の計画であ る。a)7.5kbのＰheleoＬacＺレトロウイルス（Ｇ-ＭtkＰＬ）と、6.0kbのＰhele oＬacＺレトロウイルス（Ｇ-ＭＰＬ）のマッブである；ＳＡはスプライシング受 容部位である；Ｇ-ＭtkＰＬ配列（Ｇ-ＭtkＰＬウイルス由来）は、感染陽性細胞 選択のためのＰheleoＬacＺ融合遺伝子（フレオマイシン（Ｐhelemycin）含有培 地での選択）、及び陰性選択のためのtk遺伝子（ガンシクロビル含有培地での選 択）を含む；Ｇ-ＭＰＬ配列（Ｇ-ＭＰＬウイルス由来）にはＰheleoＬacＺ配列 のみが含まれる。b)Ｇ-ＭtkＰＬ、及びＧ-ＭＰＬのレトロウイルス性組み込み後 のプロウイルス構造のマップ；Ｉ-ＳceＩＰheleoＬacＺ ＬＴＲは、Ｉ-ＳceＩ ＰheleoＬacＺ配列を５’ＬＴＲに置いて複製する；ウイルスベクタ（プロモ− タトラップ（trap）として機能する）が隣り合う細胞性プロモ−タ（Ｐ）により 転写される（矢印）。c)Ｉ-ＳceＩは、宿主ＤＮＡ中に二本鎖の切れ目（ＤＳＢs ）を生じさせて、中心の断片を遊離させ、ドナ−プラスミド、pＶＲneo(d)と対 を形成することが可能な、開裂染色体末端を残す。e)ＨＲ後に期待される組み換 え遺伝子座。 図２１.Ａ．pＧ-ＭＰＬの図。ＳＤ及びＳＡは、スプライシングの供与（ドナ −）部位と受容（アクセプタ−）部位である。スプライシングされていない5.8k b（ゲノミック）の転写物、及びスプライシングされた4.2kbの転写産物を示して ある。太線は³²Ｐで放射性標識したＬacＺプロ−ブ（Ｐ）である。Ｂ.ポリアデ ニル化ＲＮＡを使用して行った、pＧＭＬＰで形質転換したΨ−２産生クロ−ン のＲＮＡノ−ザンブロット分析；ゲノミック、及びスプライシングされたｍＲＮ Ａは、同程度の高いレベルで産生された。 図２２.Ａ.レトロウイルス性の組み込みによる、哺乳類細胞ゲノム内への、複 製したＩ-ＳceＩ認識部位の導入；二つのＬＴＲと関連する制限認識部位の位置 を表すＧ-ＭＰＬ及びＧ-tkＭＰＬプロウイルスの図である；ＢclＩ断片、及びＩ -ＳceＩ断片のサイズを示している；太線は³²Ｐで放射性標識したＬacＺプロ− ブ(Ｐ)である。Ｂ.Ｇ-ＭtkＰＬで感染したＮＩＨ3Ｔ3線維芽細胞と、Ｇ-ＭＰＬ で感染したＰＣＣ7-Ｓ多能性細胞由来の、細胞性ＤＮＡのサザンプロット分析； ＢclＩ消化物は、ＬＴＲ仲介性ＰheloＬacＺ複製を証明している；Ｉ-ＳceＩ消 化物は、Ｉ-ＳceＩの忠実な複製を証明している。 図２３.サザンによる、組み換えの確認。Ａ.;組み換え遺伝子座におけるプロ ウイルスの、期待される断片のサイズ（キロ塩基対、kb）、1)親プロウイルス遺 伝子座：太線(Ｐ)は、ハイブリダイゼ−ション用の、³²Ｐで放射性標識したプロ −ブである。２）pＶＲneoを使用して、二つのＩ-ＳceＩで開裂し、次いでギャ ップ修復することで由来した組み換え体（二重の部位相同性組み換え、ＤsＨＲ ）。３）左側のＬＴＲ内のＩ-ＳceＩ部位で開裂することで開始される組み換え イベント（一重の部位相同性組み換え、ＳsＨＲ）。Ｂ.:pＣＭＶ(Ｉ-ＳceＩ＋) と、pＶＲneo(1a,1b,2a,3a,3b,及び4a)を利用して行った、ＮＩＨ3Ｔ3／Ｇ-Ｍtk ＰＬのクロ−ン１及び２から由来したＤＮＡのサザン分析;親ＤＮＡをＫpnＩで 消化すると4.2kbのＬacＺ断片を有する断片を生じる；組み換え体1aと3aは、Ｄs ＨＲの例である；組み換え体1b,2a,3b,及び4aは、ＳsＨＲの例である。 図２４.ノ−ザン分析による、組み換えの確認。Ａ.:ＰＣＣ7-Ｓ/Ｇ-ＭＰＬの クロ−ン３細胞由来のＲＮＡの予想される構造と、サイズ(kb)［（上）：pＶＲn eo.1に関しての、Ｉ-ＳceＩ誘導性ＨＲ前:（下）：pＶＲneo.1に関しての、Ｉ- ＳceＩ誘導性ＨＲ 後］;太線Ｐ1及びＰ2は、³²Ｐで放射性標識したプロ−ブである。Ｂ.:ＰＣＣ7- Ｓ/Ｇ-ＭＰＬのクロ−ン３組み換え体の、ノ−ザン分析（全ＲＮＡ）；レ−ン３ は親細胞であり、レ−ン３ａは組み換え細胞である；最初の２レ−ンはＬacＺ Ｐ1でプロ−ブし、最後の２レ−ンはneo Ｐ2でプロ−ブした。ＰＣＣ7-Ｓ/Ｇ-Ｍ ＰＬのクロ−ン３親細胞は、細胞−ウイルス融合ＲＮＡの発現が引き起こされる 、細胞性プロモ−タのトラッピングにより予想される、7.0kbのＬacＺ ＲＮＡを 発現する；組み換え体クロ−ンはこのＬacＺ ＲＮＡを発現しないが、5.0kbのne o ＲＮＡを発現し、これはneoによるＰhloeＬacＺの正確な置換に対して予想さ れるサイズである。 図２５.Ｉ-ＳceＩ ＤＳＢsで誘導される組み換えイベントのタイブ、a)組み換 え基質の構造の概略図；Ｇ-ＭtkＰＬには二つのＬＴＲがあり、それぞれには一 つのＩ-ＳceＩ認識部位とＰhleoＬacＺ遺伝子がある；ＬＴＲはtk遺伝子を含む ウイルスの配列で分離されている；Ｇ-ＭtkＰＬを含んでいる細胞の表現型はＰh leo^R,Ｇis^s，β−gal±である。b)染色体内組み換えの可能な様式。1)Ｉ-ＳceＩ エンドヌクレア−ゼは５’ＬＴＲ内のＩ-ＳceＩ部位を切断する。５’ＬＴＲの Ｕ3の５’部分は、３’ＬＴＲ内にあるその相同性配列と対を形成して組み換え を起こす（ＳＳＡにより）。2)Ｉ-ＳceＩエンドヌクレア−ゼは３’ＬＴＲ内の Ｉ-ＳceＩ部位を切断する；３’ＬＴＲのＵ3の３’部分は、５’ＬＴＲ内にある その相同性配列と対を形成して組み換えを起こす（ＳＳＡにより）。3)Ｉ-Ｓce Ｉエンドヌクレア−ゼは二つのＬＴＲ内のＩ-ＳceＩ部位を切断する。二つのフ リ−末端は（末端結合機構により）、再結合（relegate）が可能である；これら ３つのモデルのそれぞれで得られる組み換え産物は単生のＬＴＲである（右側を 参照）。組み換え部位の脇の細胞配列には、なんら修飾が起きない。c)Ｉ-Ｓce Ｉエンドヌクレア−ゼは、二つのＬＴＲ内のＩ-ＳceＩ部位を切断する。この二 つのフリ−末端は（ギャップ修復機構により）、相同性染色体を利用して修復可 能である。右側の得られる組み換え産物は、プロウイルス組み込み遺伝子座が欠 損したものである。 図２６.ＮＩＨ3Ｔ3/Ｇ-ＭtkＰＬ１及び２、並びにpＣＭＶ(Ｉ-ＳceＩ＋)で形 質転換してガンシクロビル含有培地で選択したもの由来のＰheleoＬacＺ-から由 来したＤＮＡに関する、サザンブロットでの分析。a)ＰstＩエンドヌクレア−ゼ で消化した後の親プロウイルスに関する、断片の予想サイズ(kbp)；親ＮＩＨ3Ｔ 3／Ｇ-ＭtkＰＬ １をＰstＩで消化すると、10kbpの二つの断片が生じ、また親ＮＩＨ3Ｔ3／Ｇ-Ｍ tkＰＬ２をＰstＩで消化すると、7kbpと9kbpの二つの断片が生じる。b)ＮＩＨ3 Ｔ3/Ｇ-ＭtkＰＬ１、及びpＣＭＶ（Ｉ-ＳceＩ＋）での形質転換由来の組み換え 体の、ＰstＩ消化によるＤＮＡのサザンブロット分析（1.1から1.5）。c)ＮＩＨ 3Ｔ3/Ｇ-ＭtkＰＬ2、及びpＣＭＶ（Ｉ-ＳceＩ＋）での形質転換由来の組み換え 体の、ＰstＩ消化によるＤＮＡのサザンブロット分析（2.1から2.6）。太線は³² Pの放射性標識したＬacＺプロ−ブ（Ｐ）である。 図２７.ＮＩＨ3Ｔ3／Ｇ-ＭtkＰＬ１及び２、並びにpＣＭＶ(Ｉ-ＳceＩ⁺)とpＣ ＭＶ(Ｉ-ＳceＩ^-)での形質転換、フレオマイシン（Ｐhleomycin）及びガンシク ロビル含有培地での選択から由来した、ＰhleoＬacＺ⁺組み換え体に関する、サ ザンブロット分析。a)ＰstＩまたはＢclＩエンドヌクレア−ゼでの消化後に予想 される、親プロウイルスの断片のサイズ(kbp):親ＤＮＡ ＮＩＨ3Ｔ3／Ｇ-ＭtkＰ Ｌ１のＰstＩ消化により、10kbpの二つの断片が生じる。親ＤＮＡ ＮＩＨ3Ｔ3／ Ｇ-ＭtkＰＬ２のＢclＩ消化により、9.2kbp、7.2kbp、及び6.0kbpの３つの断片 が生じる。a2)ＰstＩ、またはＢclＩエンドヌクレア−ゼでの消化後の、予想さ れる組み換え体断片のサイズ（kbp）；ＮＩＨ3Ｔ3／Ｇ-ＭtkＰＬ１由来の組換え 体のＤＮＡに関するＰstＩ消化により、13.6kbpの一つの断片が生じる。ＮＩＨ3 Ｔ3／Ｇ-ＭtkＰＬ２由来の組換え体のＤＮＡに関するBclＩ消化により、9.2kbp と6.0kbpの二つの断片が生じる。b)ＮＩＨ3Ｔ3／Ｇ-ＭtkＰＬ１由来のＤＮＡ、 及びpＣＭＶ(Ｉ-ＳceＩ⁺)とpＣＭＶ（Ｉ-ＳceＩ^-）での形質転換由来組み換え体 のＤＮＡに関する、サザンブロット分析(1c,1d)。c)ＮＩＨ3Ｔ3／Ｇ-ＭtkＰＬ２ 由来のＤＮＡ、並びにpＣＭＶ(Ｉ-ＳceＩ^-)(2a,2b)、及びpＣＭＶ(Ｉ-ＳceＩ⁺） （2cから2h）での形質転換由来組み換え体からのＤＮＡに関する、サザンブロッ ト分析。太線は³²Ｐで放射性標識したＬacＺプロ−ブ(Ｐ)である。 図２８.図２８は、Ｉ-ＳceＩ部位の挿入または存在、酵素Ｉ-ＳceＩの発現、 該部位での切断、及び対応する染色分体での、該部位の二本鎖の切れ目の修復に よる異型接合性の喪失を示す図である。 図２９.図２９は、遺伝子の条件付き活性化を示す図である。Ｉ-ＳceＩ部位が 、タンデムな繰り返しの間に組み込まれいて、酵素Ｉ-ＳceＩが発現する。該酵 素がＩ-ＳceＩ部位で二本鎖ＤＮＡを開裂する。二本鎖の切れ目が、一本鎖アニ −リング により修復されて、活性遺伝子を生じる。 図３０.図３０は、Ｉ-ＳceＩ部位の組み込み、または遺伝子内に存在するＩ- ＳceＩ部位の使用による、遺伝子のワンステップ再編成を示す図である。活性遺 伝子内に一つのＩ-ＳceＩ部位、またはプロモ−タを有さない活性遺伝子のどち らかの末端にある二つのＩ-ＳceＩ部位、の何れかを有するプラスミドを細胞内 へ導入する。該細胞は、対応する遺伝子の不活性型を有する。酵素Ｉ-ＳceＩは 該プラスミドをＩ-ＳceＩ部位で切断し、染色体と該プラスミドとの間での組み 換えにより前記の不活性遺伝子を置換する、活性遺伝子を生じる。 図３１.図３１は、遺伝子座の複製を示す図である。一つのＩ-ＳceＩ部位、及 びその遺伝子から離れた部分を、古典的な遺伝子置換により遺伝子に挿入する。 このＩ-ＳceＩ部位を酵素Ｉ-ＳceＩで切断し、切れ目を相同性配列で修復する。 これにより、遺伝子座全体が複製する。 図３２.図３２は、遺伝子座の複製を示す図である。二つのＩ-ＳceＩ部位を、 欠失させる遺伝子座を挟むようにして加える。Ｉ-ＳceＩ酵素が発現し、該部位 が切断される。残りの二つの末端が組み換えを起こし、二つのＩ-ＳceＩ部位間 の遺伝子座が欠失する。 図３３.図３３は、プラスミドpＧ-ＭtkΔＰＡＰＬの図で、制限部位を示して いる。このプラスミドはpＧＭtkＰＬプラスミドのtk遺伝子からポリアデニレ− ション領域を欠失させて構築したものである。 好ましい態様の詳細な記載 真性のミトコンドリア遺伝子（参考文献８）は、ミトコンドリアの遺伝コ−ド の特性のために、大腸菌（Ｅ.coli）、酵母、またはその他の生物体で発現する ことはできない。「ユニバ−サル・コ−ド・エクゥイバレント」が、試験管内部 位特異的変異導入により構築された。その配列は図１に示してある。非ユニバ− サルなコドン（二つのＣＴＮは除く）が、大腸菌（Ｅ.coli）では非常にまれな 、幾つかのコドンとともに置換されていることに注目されたし。 ユニバ−サル・コ−ド・エクゥイバレントは大腸菌（Ｅ.coli）でうまく発現 され、活性酵素の合成が決定された。しかしながら大腸菌（Ｅ.coli）内で非常 にまれな数多くのコドンのために、発現レベルは低いままであった。「ユニバ− サル・コ−ド・エクゥイバレント」の発現は酵母で検出されている。 異種のシステムにおける遺伝子発現を最適化するために、合成遺伝子を設計し て、それぞれのコドンに対して大腸菌（Ｅ.coli）内で最もよく使用されるもの を利用して、Ｉ-ＳceＩの真のアミノ酸配列によるタンパク質をコ−ドするよう にした。この合成遺伝子の配列は、図２に示した。この合成遺伝子は、部分的に オ−バ−ラップした８つのオリゴヌクレオチドにより、in vitroで構築した。オ リゴヌクレオチドは、塩基対が形成によるアニ−リング時にクレノウポリメラ− ゼによる第二鎖合成を相互にプライミングするように設計した。次いで伸長した 塩基対を、プラスミドへ連結した。所定の配列内で適格に置かれた制限部位によ り、in vitroでの連結による合成遺伝子の最終的組み立てが可能になった。この 合成遺伝子は、大腸菌（Ｅ.coli）と酵母内でうまく発現した。 １．Ｉ-ＳceＩ遺伝子配列 本発明は、酵素Ｉ-ＳceＩをコ−ドする、単離したＤＮＡ配列に関する。酵素 Ｉ-ＳceＩは、エンドヌクレア−ゼである。この酵素の性質は以下の通りである （参考文献１４）。 Ｉ-ＳceＩは認識配列でＤＮＡを開裂させる二本鎖エンドヌクレア−ゼ である。Ｉ-ＳceＩは、3'ＯＨが張り出した４bpのよろめいた（staggered）開裂 部を生成する。 基質：二本鎖ＤＮＡに作用する。基質ＤＮＡは弛緩していても、ネガテ ィブなス−パ−コイルであってもよい。 カチオン：酵素活性には、Ｍg⁺⁺（８mＭが最適）が必要である。Ｍn⁺⁺ は、Ｍg⁺⁺の代わりになりえるが、この場合には、認識の厳密度が低下する。 最適な活性条件：高いpＨ（９から１０）、２０−４０℃の温度、一価 のカチオンが存在しないこと。 酵素の安定性：Ｉ-ＳceＩは室温で不安定でめる。酵素−基質複合体は 酵素のみよりもより安定である（認識部位の存在により、酵素が安定化する）。 酵素Ｉ-ＳceＩは、既知の認識部位を有する（参考文献１４）。Ｉ-ＳceＩの認 識部位は、システマティックな変異解析により決定された、１８bpを越える非対 称的配列である。その配列は、 である（矢印は開裂剖分を示す）。この認識部位は、その一部が上流のエクソ ンに相当し、更にその一部がイントロン付加型の遺伝子の下流エクソンに相当し ている。 認識部位は一部が縮重している：１８塩基の長さの配列内での、単−の塩基置 換により、その置換の性質に応じて、酵素に対する感受性が全く無くなるか、ま たは低減する結果となる。 認識の厳密度は、 −１−部位の変異体、 −２−酵母の全ゲノム（サッカロマイセス・セレビシアエは、ゲノムの 複雑さは1.4Ｘ10⁷bpである）、 で調べる。デ−タは未発表である。 結果は以下の通りである： −１−部位の変異：図３に示してあるように、厳密度の一般的なシフト が起きていて、すなわちＭg⁺⁺で重度に影響を被る変異体は、部分的にＭn⁺⁺で影 響を受けるようになり、Ｍg⁺⁺で部分的に影響を受ける変異体が、Ｍn⁺⁺で影響を 受けなくなる。 −２−酵母：マグネシウムの条件では、正常な酵母において開裂は観察 されなかった。同じ条件では、トランスジェニックな酵母由来のＤＮＡは、人工 的に挿入されたＩ-ＳceＩ部位で完全に開裂して、その他の開裂部位は全く検出 されなかった、マグネシウムをマンガンで置換すると、酵母の全ゲノム中で５つ の開裂部位が更に発見されたが、この何れもが完全には開裂しなかった。よって 、マンガン存在下ではこの酵素は、ca３百万塩基対（５/１.４Ｘ１０⁷bp）当た り平均して１部位をあらわす。 認識部位の定義：重要な塩基を図３に示してある。 これらは、重度に影響された変異体が存在している塩基に相当している。。し かし以下のことに注意されたし： −１−それぞれの部位での可能な変異の全てが決定されてはいない：よ って、重度に影響された変異体に相当する塩基は、別の変異体で同じ部位を試験 した場合に重要であるかもしれない。 −２−非常に重要な塩基（変異体全てにおいて重度に影響されている） と、中程度に重要な塩基（変異体の幾つかが重度に影響されている）との間のは っきりとした境目はない。酵素に対しての、上等の基質と、悪い基質との間は連 続している。 ランダムなＤＮＡ配列中の、天然のＩ-ＳceＩ部位の予想される頻度は、故に （０.２５）^-18、または（１.５Ｘ１０^-11）に等しい。言い換えると、ca 20の ヒトゲノム中に一つの天然の部位があると予想できるが、縮重した部位の頻度を 予想するのはより難しい。 Ｉ-ＳceＩは、二つのドデカペプチドファミリ−の「縮重した」サブファミリ −に属する。このドデカペプチドモチ−フの保存されたアミノ酸は、活性に必須 である。特に、この二つのドデカペプチドの９位のアスパラギン酸残基はグルタ ミン残基でさえも置換することができない。このドデカペプチドは触媒性部位、 またはその一部を形成するようである。 認識部位が非対称的であるのと一致して、Ｉ-ＳceＩのエンドヌクレア−ゼ活 性には二つの連続する認識工程が必要である：該部位の下流の半分（下流のエク ソンに相当）に対しての該酵素の結合；その後の、該部位の上流の半分（上流エ クソンに相当）に対しての該酵素の結合。第一の結合は強く、第二の結合はより 弱いが、この二つは、ＤＮＡの開裂に必要である。In vitroでは、該酵素は下流 のエクソンに単独で結合でき、また同様にイントロン−エクソン結合部にも結合 するが、開裂は起きない。 進化の過程で保存された、Ｉ-ＳceＩのイントロンにコ−ドされたドデカペプ チドモチ−フは、エンドヌクレア−ゼ活性に必要である。このモチ−フの役割は 、酵素のＤＮＡ配列認識領域に関して酸性のアミノ酸を適切に位置づけて、ホス ホジエステル結合の加水分解の触媒作用を引きだすことであると推定された（参 考文献Ｐ３）。 本発明のヌクレオチド配列は、天然のＩ-ＳceＩ酵素をコ−ドし、図２にそれ が示されている。本発明の遺伝子のヌクレオチド配列は、ジデオキシヌクレオチ ド配列決定法により由来した。該ヌクレオチドの塩基配列は、5’→3’の方向で 書かれている。示した文字のそれぞれは、以下のヌクレオチドに対しての、通常 の割当である： Ａ:アデニン Ｇ:グアニン Ｔ:チミン Ｃ:シトシン。 酵素Ｉ-ＳceＩをコ−ドするＤＮＡ配列は、精製された形態であることが望ま しい。例えば該配列は、ヒト血液由来タンパク質、ヒト血清タンパク質、ウイル スタンパク質、これらのタンパク質をコ−ドしているヌクレオチド配列、ヒトの 組織、ヒトの組織の成分、またはこららの物質の組み合わせが混入していないよ うにすることが可能である。更に本発明のＤＮＡ配列は、外来性のタンパク質及 び 脂質、細菌やウイルスのような外来性微生物を含んでいないことが好ましい。必 然的に精製、単離された、Ｉ-ＳceＩをコ−ドするＤＮＡ配列は特に、発現ベク タを調製するのに有益である。 プラスミドpＳＣＭ525は、pＵＣ12の誘導体であり、本発明のＤＮＡ配列をコ −ドした人工的配列を有する。プラスミドpＳＣＭ525の一領域のヌクレオチド配 列と、推定のアミノ酸配列を図４に示してある。本発明の、Ｉ-ＳceＩをコ−ド しているヌクレオチド配列は、ボックスで囲ってある。人工遺伝子は、化学的に 合成され組み立てられた７２３塩基対の、ＢamＨＩ−ＳalＩ ＤＮＡ配列である 。これは、tacプロモ−タ制御下に置かれている。人工遺伝子のＤＮＡ配列は、 天然のコ−ド配列や、文献（Ｃell,(1986),44 521-533）に記載のユニバ−サル ・コ−ド・エクゥイバレントとは異なっている。しかしながら、該人工遺伝子の 翻訳産物は、配列において、純正のオメガ−エンドヌクレア−ゼと、Ｎ末端での Ｍet-Ｈisの付加以外で一致している。この修飾されたエンドヌクレア−ゼが、 本発明の範囲内であることは、理解されるであろう。 プラスミドpＳＣＭ525を使用して、適切な如何なる大腸菌(Ｅ.coli)をも形質 転換することが可能であり、形質転換された細胞はアンピシリン抵抗性になる。 オメガ−エンドヌクレア−ゼの合成は、Ｉ.Ｐ.Ｔ.Ｇ.の添加か、またはラクト− スオペロン系の相当する誘導剤により得られる。 pＳＣＭ525と同定され、酵素Ｉ-ＳceＩを含んでいるプラスミドは、大腸菌(Ｅ .coli)株ＴＧ１内で、ＣＮＣＭ(Ｃollection Ｎationale de Ｃultures de Ｍic roorganismes of Ｉnstitute Ｐasteur in Ｐaris,Ｆrance)に、1990年11月22日 に培養コレクション寄託アクセス番号Ｉ-1014のもとに寄託された。よって本発 明のヌクレオチド配列は、この寄託物より入手可能である。 本発明の遺伝子はまた、通常の化学的合成技術を利用して、ヌクレオシド単位 間で3’から5’へのリン酸結合の形成により調製することも可能である。例えば 、 よく知られたホスホジエステル、ホスホトリエステル、及びホスファイトトリエ ステル技術と同様に、これらの方法に関する既知の修飾を利用することができる 。デオキシリボヌクレオチドは、ホスホロアミダイト法に基づいたもののような 自動合成機で調製すろことができる。オリゴとポリリボヌクレオチドはまた、通 常の技術を利用して、ＲＮＡリガ−ゼの助けにより得られる。 本発明にはもちろん、本発明のＤＮＡ配列の変異体であって、本発明の配列と 実質的に同じ性質を示すものも含まれる。これは、ＤＮＡ配列が、本願で開示さ れたものと必ずしも同じものである必要がないことを意味する。単一、若しくは 複数の塩基置換、欠失、または挿入、あるいは、酵素Ｉ-ＳceＩの開裂の特徴を 有する酵素をコ−ドしたＤＮＡ配列の特徴を実質的に損ねない、１以上のヌクレ オチドの局所的変異というような、変異がある。 図５は、Ｉ-ＳceＩのアミノ酸配列荷関しての幾つかの変異体を表示している 。以下の部位は、酵素活性に影響せずに変異させることが可能であることが証明 されている： 部位−１と−２は天然ではない。この二つのアミノ酸はクロ−ニングにより加 えられたものである。 部位１から１０：欠失され得る； 部位３６：Ｇを許容する； 部位４０：ＭとＶを許容する； 部位４１：ＳかＮを許容する； 部位４３：Ａを許容する； 部位４６：ＶかＮを許容する； 部位９１：Ａを許容する； 部位１２３及び１５６：Ｌを許容する； 部位２２３：ＡとＳを許容する。 これらの修飾を含む酵素は、本発明の範囲内にあることは理解されるであろう 。 図５のアミノ酸配列の変異で、酵素活性に影響することが示されたものは、以 下のものである： 部位１９：ＬからＳ； 部位３８：ＩからＳまたはＮ； 部位３９：ＧからＤまたはＲ； 部位４０：ＬからＯ； 部位４２：ＬからＲ； 部位４４：ＤからＥ、Ｇ、またはＨ； 部位４５：ＡからＥまたはＤ； 部位４６：ＹからＤ； 部位４７：ＩからＲまたはＮ； 部位８０：ＬからＳ； 部位１４４：ＤからＥ； 部位１４５：ＤからＥ； 部位１４６：ＧからＥ； 部位１４７：ＧからＳ。 更に、本発明では、精製された形態の、本発明のＤＮＡ配列の断片であって、 該断片が酵素的に活性なＩ-ＳceＩをコ−ドすることが可能であるものを含むこ とが理解されるであろう。 本発明の、酵素Ｉ-ＳceＩをコ−ドするＤＮＡ配列は、よく知られるポリメラ −ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅させることが可能であるが、これは、遺伝子 の全て、または特異的部分を増幅させるのに有益である（例えば、以下の文献を 参照されたし：Ｓ.Ｋwok et al.,Ｊ.Ｖirol.,61:1690-1694(1987);Ｕ.Ｓ.Ｐaten t 4,683,202;及びＵ.Ｓ.Ｐatent 4,683,195）。より特異的には、増幅されるＤ ＮＡのプラス鎖とマイナス鎖に相補的であって、互いに１０から３００塩基対難 れて位置する既知のＤＮＡプライマの組は、よく知られたオリゴヌクレオチド合 成技術により調製することが可能である。それぞれのプライマの一方の末端を伸 長して、ＤＮＡに アニ−リングしたときに制限エンドヌクレア−ゼ部位を創製するよにすることが 可能である、ＰＣＲの反応混合物には、ＤＮＡ、ＤＮＡプライマ、４種類のデオ キシリボヌクレオシド三リン酸、ＭgＣl₂、ＤＮＡポリメラ−ゼ、及び通常の緩 衝液が含まれる。ＤＮＡは、何回ものサイクルで増幅させることができる。慨し て、検出感度はサイクル数を多くして増大させることができるが、それぞれのサ イクルは、上昇された温度での短期間でのＤＮＡの変性と、反応混合物の冷却と 、ＤＮＡポリメラ−ゼによるポリメライズとからなる。増幅された配列はオリゴ マ−制限（oligomerrestriction）という技術を使用して検出することができる （参照:Ｒ.Ｋ.Ｓaiki et al.,Ｂio/Ｔechnology3:1008-1012(1985)）。 酵素Ｉ-ＳceＩは、同様の性質を有する多くのエンドヌクレア−ゼのうちの一 つである。以下は関連する酵素とその起源に関するリストである。 グル−プＩイントロンをコ−ドするエンドヌクレア−ゼと関連する酵素を参考 文献とともに以下に記載した。認識部位は図６に記載されている。 推定された新規の酵素（遺伝的には証拠があるが、活性はいまだ証明されてい ない）は、クラミドモナス・スミチイ（Ｃhlamydomonas smithii）ミトコンドリ アのチトクロ−ムｂイントロン１に由来するＩ-ＣsmＩ（参考文献１５）、ポド スポラ・アンセリナ（Podospora anserina）のミトコンドリアに由来するＩ-Ｐa nＩ（ＪillＳalvo）、及びおそらくニュ−ロスポラ・クラッサ（Ｎeurospora cr assa）に由来するＮc ndl１及びＮc cob！のイントロンにコ−ドされる酵素であ る。 Ｉ-エンドヌクレア−ゼは以下のように分類できる： クラスＩ：二つのドデカペプチドモチ−フ、3’ＯＨが張り出している、４bp のよろめいた（staggered）切断部、認識部位に対して内部の切断。 クラスII：ＧＩＹ-(Ｎ_10-11)ＹＩＧモチ−フ、３’ＯＨが張り出している、２ bpのよろめいた（staggered）切断部、認識部位に対して外部の切断： Ｉ-ＴevＩ。 クラスIII：典型的な構造モチ−フはない、３’ＯＨが張り出している、４bp のよろめいた（staggered）切断部、認識部位に対して内部の切断： Ｉ-ＰpoＩ。 クラスIV：典型的な構造モチ−フはない、３’ＯＨが張り出している、２bpの よろめいた（staggered）切断部、認識部位に対して外部の切断： Ｉ-ＴevII。 クラスＶ：典型的な構造モチ−フはない、５’ＯＨが張り出している、２bpの よろめいた（staggered）切断部： Ｉ-ＴevIII。 ２.本発明のＩ-ＳceＩ遺伝子を有するヌクレオチドプロ−ブ。 酵素Ｉ-ＳceＩをコ−ドする、本発明のＤＮＡ配列はまた、組織や体液のよう な生物学的試料中でのヌクレオチド配列の検出用のプロ−ブにもしようすること が できる。このプロ−ブは、原子または無機のラジカル、もっとも普通には放射性 核種で標識することが可能であるが、また重金属でもおそらく可能であろう。放 射性標識には³²Ｐ、³Ｈ、¹⁴Ｃなどが含まれる。適切なシグナルと十分な半減期 をゆうする、如何なる放射性標識を用いることが可能である。他の標識には、標 識済み抗体、蛍光体（fluorescers）、化学蛍光体、酵素、標識済みリガンドに 対して、対で特異的に結合する抗体などに特異的に結合できるリガンドがある。 標識の選択はプロ−ブの、ＤＮＡまたはＲＮＡへのハイブリダイゼ−ション速度 への、標識の影響により決まる。標識は、ハイブリダイゼ−ションが可能なＤＮ Ａ、またはＲＮＡの量を検出するのに十分な感度を提供することが必要であろう 。 本発明のヌクレオチド配列を、遺伝子へのハイブリダイゼ−ション用のプロ− ブとして使用する際には、該ヌクレオチド配列は好ましくは、ニトロセルロ−ス 紙のような、水に不溶性の、固体の多孔性支持体に固定されていることが望まし い。ハイブリダイゼ−ションは、本発明の標識したポリヌクレオチドや、通常の ハイブリダイゼ−ション試薬を使用して行うことが可能である。特別のハイブリ ダイゼ−ション技術は、本発明には必要ではない。 ハイブリダイゼ−ション溶液中の、標識されたプロ−ブの量は、標識の性質、 該支持体に充分に結合する標識済みプロ−ブの量、そしてハイブリダイゼ−ショ ンの厳密度に応じて、広い範囲で変わる。慨して、化学量論よりも実質的に過剰 なプロ−ブを使用して、固定化されたＤＮＡへのプロ−ブの結合速度を促進させ る。 ハイブリダイゼ−ションに関しての、種々の厳密度の程度を用いることができ る。より厳密な条件ほど、プロ−ブとボリヌクレオチドとの間の二重鎖形成に必 要な相補性が大きくなる。厳密さは温度、プロ−ブ濃度、プロ−ブの長さ、イオ ン強度、時間等で調節することができる。ハイブリダイゼ−ションの厳密度は反 応溶液の極性を変えることでうまく変化させられる。。使用する温度は経験的に 決定することができ、そのために開発されたよく知られる式により決定できる。 ３.Ｉ-ＳceＩをコ−ドするヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列。 本発明は更に、本発明の酵素Ｉ-ＳceＩをコ−ドするＤＮＡ配列に関している が、該ヌクレオチド配列は他の核酸に連結されている。この核酸は、例えばプラ スミド、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、原核生物や真核生物が含まれる如何なる起源の 天然のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、のような如何なるものよりから得られる。ＤＮＡ またはＲＮＡは、文献に記載されるような種々の技術（Ｍaniatis et al.,Ｍole cular Ｃloning: Ａ Ｌaboratory Ｍanual,Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory ,Ｎew Ｙork(1982)）により、生物学的液体や組織のような、生物学的物質より 抽出することができる。慨して核酸は、細菌、酵母、ウイルス、または植物や動 物のような高等生物より得られるであろう。該核酸は、ヒトのＤＮＡ全体に含ま れる遺伝子の一部、または特異的な微生物の核酸配列の一部のような、より複雑 な混合物の画分であってもよい。該核酸は、より大きい分子の画分であるか、ま たは遺伝子全体、若しくは遺伝子の集合を構成するものであってもよい。ＤＮＡ は、一本鎖か、または二本鎖の形態であてもよい。上記の断片が一本鎖の形態で ある場合には、通常の技術により、ＤＮＡポリメラ−ゼを使用して、二本鎖に変 換されてもよい。 本発明のＤＮＡ配列は、構造遺伝子に連結されてもよい。本願で使用する「構 造遺伝子」とは、その鋳型、またはmＲＮＡにより、特異的タンパク質またはポ リペプチドに特徴的であるアミノ酸配列がコ−ドされているＤＮＡ配列を意味す る。本発明のヌクレオチド配列は、発現制御配列、すなわち遺伝子に機能するよ うに連結されると該遺伝子の発現を制御及び調節するようなＤＮＡ配列とともに 、機能することが可能である。 ４.不発明のヌクレオチド配列を有するベクタ。 本発明は更に、酵素Ｉ-ＳceＩをコ−ドする本発明のＤＮＡ配列を有するクロ −ニング、及び発現用のベクタに関する。 より特には、該酵素をコ−ドする該ＤＮＡ配列は、該配列をクロ−ニングする ための担体（vehicle）に連結することが可能である。遺伝子クロ−ニングに関 わる主要な工程は、興味ある遺伝子を有するＤＮＡを、原核細胞、または真核細 胞より分離すること、得られたＤＮＡ断片とクロ−ニングベクタからのＤＮＡと を特異的な部位で切断すること、この二つのＤＮＡ断片をともに混合すること、 そしてこの断片を連結して組み換えＤＮＡ分子を生成させることを具備している 。次いで組み換え分子を宿主細胞にいれて、この細胞を複製させ、元のＤＮＡ配 列のクロ−ンを有する、同等の細胞を産生させる。 本発明で使用する担体（vehicle）は、本発明のヌクレオチド配列を宿主細胞 へ輸送することが可能であり、またその細胞内で複製することが可能である、任 意の二本鎖ＤＮＡ分子であってもよい。より特には、この担体は、宿主細胞内で 複製の起点として機能することが可能な、少なくとも一つのＤＮＡ配列を有して いる必要がある。更に、この担体は、本発明の遺伝子をコ−ドしたＤＮＡ配列を 挿入するための、２つ以上の部位を有している必要がある。これらの部位は通常 は、粘着性の末端を形成することが可能で、更に該担体に連結するプロモ−タ配 列の粘着末端に相補的である、制限酵素部位である。慨して、不発明はプラスミ ド、バクテリオファ−ジ、またはこれらの特徴を有しているコスミド担体で実施 することが可能である。 本発明のヌクレオチド配列は、該担体中の部位の如何なる組み合わせとも適合 する、粘着性末端を有することができる。あるいは、該配列は、該担体のクロ− ニング部位の対応する平滑末端と連結することが可能な、一つ以上の平滑末端を 有することが可能である。該ヌクレオチド配列は、望まれるならば、Ｂal31によ るような、引き続くエンドヌクレア−ゼ欠失により更に処理することが可能であ る。本発明のヌクレオチド配列が望ましい粘着末端の組み合わせを有さない場合 には、リンカ−、アダプタ−、またはホモポリマ−テイリングの付加により、該 配列を修飾することが可能である。 本発明のヌクレオチド配列のクロ−ニングに使用されるプラスミドは、宿主細 胞が表示する選択標識のような有益な特徴を担う、一つ以上の遺伝子を有してい ることが好ましい。好ましい戦略においては、二つの異なる薬剤に対する抵抗性 の遺伝子を有するプラスミドが選択される。例えば、抗生物質遺伝子へのＤＮＡ 配列の挿入は該遺伝子を不活化して、薬剤耐性を破壊する。第二の耐性遺伝子は 、細胞が組換え体で形質転換されて、第二の薬剤に対する抵抗性と第一の薬剤に 対する感受性とで選択されるときには影響されない。好ましい抗生物質標識は、 宿主細胞に、クロラムフェニコ−ル、アンピシリン、またはテトラサイクリンに 対する抵抗性を付与する遺伝子である。 種々の制限酵素を使用して、担体を切断することが可能である。慨してこのよ うな制限酵素の同定は、連結するＤＮＡ配列の末端と、担体中の制限部位の同定 とに依存している。制限酵素は担体中の制限部位に適合し、また該担体は連結す る核酸断片の末端に適合している。 連結反応は、よく知られる技術と試薬とを用いて設定することができる。連結 は、ＤＮＡ二重鎖中で隣り合う５’リン酸基とフリ−な３’ヒドロキシル基との 間にホスホジエステル結合の形成を触媒する、ＤＮＡリガ−ゼにより行なわれる 。該ＤＮＡリガ−ゼは、種々の微生物に由来してもよい。好ましいＤＮＡリガ− ゼは大腸菌（Ｅ.coli）、及びバクテリオファ−ジＴ4に由来する酵素である。Ｔ 4ＤＮＡリガ−ゼは、制限酵素での消化により生じるような、平滑、または粘着 性末端のＤＮＡ断片を連結することができる。大腸菌（Ｅ.coli）のＤＮＡリガ −ゼを使用して、粘着性末端を有する二重鎖ＤＮＡ分子の末端同士での、ホスホ ジエステル結合の形成を触媒させることが可能である。 クロ−ニングは、原核細胞や真核細胞で行うことができる。クロ−ニング用の 担体の複製のための宿主はもちろん、担体と適合するものであって、その中で該 担体が複製することが可能なものである。プラスミドを用いるときには、このプ ラスミドは合成して調製しても。よい。宿主の染色体とは独立に複製するプラス ミド、または組み込まれるプラスミド（エピソ−ム）を使用することができる。 プラスミドの複製に必要な酵素をコ−ドする遺伝子を有するプラスミドを複製す るために、該プラスミドは、宿主細胞のＤＮＡ複製酵素を利用することが可能で ある。数多くの異なるプラスミドが、本発明の実施に使用することが可能である 。 酵素Ｉ-ＳceＩをコ−ドする、本発明のＤＮＡ配列はまた、担体に連結して発 現ベクタを形成させることも可能である。この場合に用いられる担体は、適切な 宿主細胞内で、機能するようにプロモ−タに連結されている遺伝子を発現できる ものである。大腸菌（Ｅ.coli）、酵母、または哺乳類細胞内での遺伝子発現用 に知られている担体を用いることが好ましい。これらの担体には例えば、以下の 大腸菌（Ｅ.coli）発現ベクタが含まれる： pＳＣＭ525:tacプロモ−タと、Ｉ-ＳceＩの合成遺伝子とを挿入したpＵＣ12に 由来する、大腸菌（Ｅ.coli）の発現ベクタである。発現はＩＰＴＧで誘導され る。 pＧＥＸω^６：pＳＣＭ525内のＩ-ＳceＩの合成遺伝子がグルタチオンＳトラン スフェラ−ゼに融合しているpＧＥＸに由来し、ハイブリッドタンパク質を産生 する、大腸菌（Ｅ.coli）発現ベクタ。このハイブリッドタンパク質はエンドヌ クレア−ゼ活性を有する。 pＤＩＣ73.Ｔ7プロモ−タ制御下にある、Ｉ-ＳceＩの合成遺伝子（pＳＣＭ525 のＮdeＩ−ＢamＨＩ断片）の挿入により、pＥＴ-3Ｃから得られる大腸菌（Ｅ.co li）発現ベクタ。このベクタは、Ｔ７ＲＮＡポリメラ−ゼをＩＰＴＧ誘導下で発 現する、菌株ＢＬ21(ＤＥ3)内で使用される。 pＳＣＭ:351:Ｉ-ＳceＩの合成遺伝子がＬacＺ遺伝子と融合しているpＵＲ291 から得られ、ハイブリッドタンパク質を産生する、大腸菌（Ｅ.coli）発現ベク タ。 pＳＣＭ:353:Ｉ-ＳceＩの合成遺伝子がＣro/ＬacＺ遺伝子と融合しているpＥ Ｘ1から得られ、ハイブリッドタンパク質を産生する、大腸菌（Ｅ.coli）発現ベ クタ。 以下は酵母の発現ベクタの例である： ＰＥＸ7:ガラクト−スプロモ−タの制御下に合成遺伝子を挿入したpＲＰ51-Ｂ am Ｏ（pＬＧ-ＳＤ5のＬＥＵ2d誘導体）から得られる、酵母発現ベクタ。発現は、 ガラクト−スで誘導される。 pＰＥＸ408:ガラクト−スプロモ−タの制御下に合成遺伝子を挿入したpＬＧ- ＳＤ5から得られる、酵母発現ベクタ。発現は、ガラクト−スで誘導される。 幾つかの酵母発現ベクタを図７に記載した。 以下は、典型的な哺乳類発現ベクタである： pＲＳＶＩ-ＳceＩ：合成遺伝子（pＳＣＭ525のＢamＨＩ−ＰstＩ断片）が、ラ ウス肉腫ウイルスのＬＴＲプロモ−タ制御下にある、pＲＳＶ誘導体。この発現 ベクタは、図８に記載してある。 チャイニ−ズハムスタ−オバリ−（ＣＨＯ）細胞での発現ベクタも使用するこ とが可能である。 ５.本発明のベクタで形質転換した細胞。 本発明のベクタは、通常の技術により宿主生物内へ挿入することが可能である 。例えば、ベクタは形質転換、形質移入、電気穿孔、マイクロインジェクション 、またはリポソ−ムによる方法（リポフェクション）により挿入することができ る。 クロ−ニングは、原核細胞、または真核細胞で行うことができる。クロ−ニン グ用の担体を複製するための宿主は、当然、該担体と適合するものであって、そ の中で該担体が複製することが可能なものであろう。真菌類、動物、及び植物起 源の細胞も使用することが可能であるが、好ましくはクロ−ニングは、細菌、ま たは酵母の細胞で行うことがよい。クロ−ニング作業を行うのに好ましい宿主細 胞は大腸菌（Ｅ.coli）のような細菌細胞である。大腸菌（Ｅ.coli）の使用が特 に好ましいのは、細菌プラスミドうやバクテリオファ−ジのような多くのクロ− ニング用担体が、これらの細胞内で複製するからである。 本発明の好ましい態様において、本発明のヌクレオチドをコ−ドするＤＮＡ配 列が、機能するようにしてプロモ−タに連結されているものを有する発現ベクタ は、通常の技術により哺乳類細胞へ挿入される。 ラ−ジスケ−ルのマッピングのための、Ｉ-ＳceＩの適用。 １.種々のゲノム内での天然部位の発生度 精製したＩ-ＳceＩ酵素を使用して、天然、または縮重した部位の発生度を、 複数の種の完全なゲノムで調べた。サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓacchar omyces cerevisiae）、バシラス・アントラシス（Ｂacillus anthracis）、ボレ リア・ブルグドルフェリ（Ｂorrelia burgdorferi）、レプトスピラ・ビフレキ サ（Ｌeptospira biflexa）、及びＬ.インテロガンス（Ｌ.interrogans）では、 天然の部位は全く見られなかった。Ｔ7ファ−ジＤＮＡで、一つの縮重した部位 が見られた。 ２.人工部位の挿入。 天然のＩ-ＳceＩ部位がないので、人工部位を形質転換か形質移入により導入 することができる。二つの場合を区別する必要がある：相同性組み換えによる部 位特異的組み込みと、非相同的組み換え、トランスポゾン移動、またはレトロウ イルス感染によるランダムな組み込みである。最初のものは酵母と、２、３の細 菌種では容易であるが、高等な真核細胞ではより困難である。第二のものは全て の系で可能である。 ３.挿入ベクタ。 二つのタイプを区別する必要がある： −１−Ｉ-ＳceＩを選択標識とともに導入する、部位特異的カセット； 酵母に対して：標識遺伝子を含む以下のもの、全ては、pＡＦ100の誘導体であ る（Ｔhierry et al.,(1990)ＹＥＡＳＴ6:521-534）： pＡＦ101:ＵＲＡ3(Ｈind III部位に挿入）； pＡＦ103:Ｎeo^R(ＢglII部位に挿入）； pＡＦ104ＨＩＳ3(ＢglII部位に挿入）； pＡＦ105:Ｋan^R(ＢglII部位に挿入）； pＡＦ106:Ｋan^R(ＢglII部位に挿入）； pＡＦ107:ＬＹＳ2(Ｈind IIIとＥcoＲＶの間に挿入）。 プラスミドpＡＦ100の制限酵素地図を図９に示してある。プラスミドpＡＦ100 の領域のヌクレオチド配列と制限部位とを図１０Ａと図１０Ｂに示してある。 染色体上の種々の既知の部位にＩ-ＳceＩを有する、多くのトランスジェニッ ク酵母株が入手可能である。 −２−転移因子、またはレトロウイルスに由来するベクタ。 大腸菌（Ｅ.coli）と他の細菌に対して：Ｉ-ＳceＩ部位と、 pＴＳmωＳtr^R pＴＫmωＫan^R（図１１を参照） pＴＴωＴet^R を有するミニＴn5誘導体。 酵母に対して：pＴＹω６は、Ｉ-ＳceＩ部位がＴyエレメントのＬＴＲに挿入 されている、pＤ123の誘導体である。（図１２） ほ乳類細胞に対して： pＭＬＶ ＬＴＲ ＳＡＰＬＺ:ＭＬＶとＰhleo-ＬacＺのＬＴＲ内にＩ-ＳceＩ部 位を有する（図１３）。このベクタはまずΨ２細胞（３Ｔ３の誘導体；Ｒ.Ｍuli iganより入手）で増殖させる。ゲノム中の未同定の位置にＩ-ＳceＩ部位を有す る、二つのトランス ジェニック細胞株が入手可能である。：1009（多能性神経細胞）、及びＤ３（ト ランスジェニック動物を産生できるＥＳ細胞）。 ４.入れ子状（nested）染色体断片化方法 真核ゲノムを遺伝的にマッピングするための、入れ子状（nested）染色体断片 化方法では、１８塩基対の長さの認識のような、制限エンドヌクレア−ゼＩ-Ｓc eＩのユニ−クな性質をうまく利用している。ほとんどの真核ゲノムには、天然 にはＩ-ＳceＩ認識部位がないこともまた、このマッピング方法ではうまく利用 されている。 まず上記したようにして、選択性標識を含む特異的カセットを使用した相同性 組み換えによるか、またはランダムな挿入により、一つ以上の人工的Ｉ-ＳceＩ 認識部位をゲノムの種々の位置に挿入する。得られるトランスジェニック株のゲ ノムを次いで、Ｉ-ＳceＩ制限酵素とのインキュベ−ションにより、該人工的挿 入Ｉ-ＳceＩにおいて完全に開裂する。開裂産物は入れ子状の染色体断片を産生 する。 染色体断片を次いでパルスフィ−ルドゲル（ＰＦＧ）電気泳動で精製単離し、 染色体内での挿入部位の位置をマッピングするようにする。全ＤＮＡを制限酵素 で切断すると、人工的に導入された、それぞれのＩ-ＳceＩ部位はゲノム中でユ ニ−クな「分子的な印」を提供する。よって、上記の印の間の物理的ゲノム間隔 を定義するような、それぞれが単一のＩ-ＳceＩ部位を有する一連のトランスジ ェニック株を作りだすことができる。結果的に、ゲノム全体、染色体、または興 味あるどのような部分をも、人工的に導入したＩ-ＳceＩ制限部位を使用してマ ッピングすることいができる。 入れ子状染色体断片は、固相の膜にトランスファ−して該断片のＤＮＡに相補 的なＤＮＡを含む、標識済みプロ−ブにハイブリダイズさせることができる。観 察されるハイブリダイゼ−ションのバンディングパタ−ンに基づき、真核ゲノム をマッピングすることができる。適切な「印」を有するトランスジェニックのセ ットは、新規の遺伝子またはクロ−ンの如何なるものをも直接的にマッピングす るレファレンスとして使用される。 例１：酵母染色体XIのマッピングへの、入れ子状染色体断片化方法の適用。 この方法を、酵母サッカロマイセス・セレビシアエ(Ｓaccharamyces serevisi ae)の染色体XIのマッピングに適用した。Ｉ-ＳceＩ前位を二倍体株ＦＹ1679の染 色体XI上の７つの異なる部位に挿入し、その結果該染色体中に８つの物理的間隔 を定義した。相同性組み換えにより、ＵＲＡ3-１Ｉ-ＳceＩカセットより部位を 挿入した。二つの部位を、遺伝的に定義されている遺伝子、ＴＩＦ１とＦＡＳ１ 内に挿入し、その他のものは発明者が有する、オ−バ−ラップしていない５つの コスミドをランダムに選択して、染色体中の未知の位置に挿入した。７つのトラ ンスジェニック株のそれぞれがアガロ−スに包埋したものを次いでＩ-ＳceＩで 消化して、パルスフィ−ルドゲル電気泳動で分析した（図１４Ａ）。それぞれの トランスジェニック株の染色体XI上でのＩ-ＳceＩ部位の位置はまず、断片の左 右の向きを考慮に入れずに断片サイズより推定される、向きは、以下のようにし て決定する。この株のセットのなかで、最もテロメアに近いＩ-ＳceＩ部位は、 トランスジェニックＥ40の中にあるが、それは全ての断片の中で最も短いものが ５０kbであるからである（図１５Ａ）。よってここで、トランスジェニックＥ40 にＩ-ＳceＩを導入するのに使用したコスミドクロ−ンpＵＫＧＯ40を、全ての染 色体断片に対するプロ−ブとして使用する。予想したとおり、pＵＫＧ040はＥ40 株より二つの断片を明るみにだす（それぞれ５０kb及び６３０kb）。大きい断片 はほぼ染色体XI全体であり、長さが３８kbであるpＵＫＧ０４０は、その大きい 染色体断片内に４kb未満のものを含むという事実により、弱いハイブリダイゼ− ションシグナルを示す。該トランスジェニック株は、二つの相同物のうち一つの 中のみにＩ-ＳceＩ部位が挿入されている二倍体であるために、染色体XI全体は 、Ｉ-ＳceＩ消化後も視覚的に認識できることに注目されたし。現在では、pＵＫ Ｇ040プロ−ブはその他の全てのトランスジェニック株のうちのたった一つの断 片にハイブリダイズして、Ｉ- ＳceＩ部位の左右の向きを明瞭にする（図１５Ｂ）。コスミドベクタと、Ｉ-Ｓc eＩ部位を有する染色体サブ断片との間での顕箸な交差ハイブリダイゼ−ション は見られない。トランスジェニック株は現在では、Ｉ-ＳceＩ部位が該染色体の ハイブリダイズする末端からの距離が短い順に配置されていて（図１５Ｃ）、Ｉ -ＳceＩマップが推定できる（図１５Ｄ）。マッピングの精度はＰＦＧＥの分解 能と、最適な補正に依存する。遺伝子地図に関しての、染色体の正確な左右の向 きは、この段階では分からない。本方法を可視化し、Ｉ-ＳceＩ間のＩ-ＳceＩ部 位の間隔サイズのより正確な測定をするために、新たに並べた、同じトランスジ ェニック株を新規のパルスフィ−ルドゲル電気泳動にかけた（図１６）。トラン スファ−後、断片をすぐにコスミドpＵＫＧ040とpＵＫＧ066にハイブリダイズさ せたが、これらはそれぞれが該染色体の反対側の末端全ての断片を明るみに出す （クロ−ンpＵＫＧ066は、遺伝子地図に定義される染色体の右末端を定義するが 、これはそれにはＳＩＲ1遺伝子が含まれているからである）。通常の段階的な 染色体断片サイズの列が見られる。プロ−ブＵＫＧ066と染色体IIIとの間に幾つ かの交差ハイブリダイゼ−ションがあることに注目されたいが、これはおそらく 幾つかのＤＮＡ繰り返し配列のためである。 まとめると、染色体断片全ては図１５ｄに示したような、物理的間隔を定義す る。得られたＩ-ＳceＩマップは、平均して８０ kbの分解能を有する。 例２：酵母人工染色体（ＹＡＣ）クロ−ンへの、入れ子状染色体断片化方法の 適用。 この方法をＹＡＣマッピングに適用するのには、二つの可能性が考えられる。 −１−酵母内での相同性組み換えを利用して、興味ある遺伝子内にＩ-ＳceＩ 部位を挿入する。これにより、試験管内でのＩ-ＳceＩ消化によるＹＡＣ挿入物 内の遺伝子のマッピングが可能になる。これは実際に行なわれ成功した。 −２−高い反復性の配列（例:マウスのＢ2や、ヒトのＡlu）を使用した、酵母 内での相同性組み換えにより、ＹＡＣ挿入物内にＩ-ＳceＩ部位をランダムに組 み込 む。トランスジェニック株を次いで、参考文献Ｐ1に記載されているようにして 、ライブラリ−またはマップ遺伝子を並べる。 現在ではこの方法は、４５０kbのマウスＤＮＡを含むＹＡＣでも行えるように なっている。このため、マウスＤＮＡの繰り返し配列（Ｂ2と呼ばれる）をＩ-Ｓ ceＩと、選択性酵母標識（ＬＹＳ2）とを有するプラスミドヘ挿入した。Ｂ2配列 内で直鎖状にした組み換えＹＡＣを有する酵母細胞の形質転換により、Ｉ-Ｓce Ｉ部位が、マウスＤＮＡ挿入物内の５つの異なる位置に分配されて組み込まれた 。酵素による、組み込んだＩ-ＳceＩ部位の切断は成功し、電気泳動後に精製可 能な、入れ子状の断片が産生した。この方法の以下の工程は例１に示した方法と 全く一致する。 例３：直接的なコスミドライブラリ−の分類への、入れ子状染色体断片化の適 用。 入れ子状の、染色体断片は、分離用ＰＦＧより精製することができ、染色体XI 特異的サブライブラリ−からのクロ−ンに対するプロ−ブとして使用することが できる。このサブライブラリ−は１３８のコスミドクロ−ンよりなっているが（ ８回カバ−するのに相当する）、これはＰＦＧで精製した染色体XIでコロニ−ハ イブリダイゼ−ションして、出願人の有する完全な酵母ゲノムライブラリ−から 、以前に分類しておいたものである。次いで整列させていないクロ−ンのコレク ションを、該染色体の左末端からの短い順の染色体断片とハイブリダイズさせた 。Ｉ-ＳceＩマップ上のそれぞれのコスミドの位置はそれぞれのハイブリダイゼ −ションより明確に決定される。更にこの結果を確認するためと、より正確なマ ップを提供するため、順番に並べられているコスミドクロ−ン全てのサブセット を、ＥcoＲＩで消化して電気泳動にかけ、該染色体の左末端からの短い順番の、 入れ子状シリ−ズの染色体断片とハイブリダイズさせた。結果は図１７に示して ある。 一定のプロ−ブに対しては、二つの場合を区別することができる：ＥcoＲＩ断 片全てがプロ−ブとハイブリダイズするコスミドクロ−ン、及びＥcoＲＩ断片の 一部 のみしかハイブリダイズしないコスミドクロ−ン（すなわち図１７ｂにおいて、 pＥＫＧ100とpＥＫＧ098とを比較せよ）。第一の範疇は、挿入部が全部、二つの 染色体断片のうちの一つの中に含まれているクロ−ンに相当し、第二のものは挿 入部がＩ-ＳceＩ部位とオ−バ−ラップするクロ−ンに相当する。pＥＫＧシリ− ズのクロ−ンに対しては、８kbのＥcoＲＩ断片が全部、該染色体断片とはハイブ リダイズしないベクタ配列（pＷＥ15）からなっていることに注意されたし。染 色体断片が組み込みベクタを有している場合には、コスミドとの交差ハイブリダ イゼ−ションが見られる（図１７ｅ）。 図１７を調べると、コスミドクロ−ンはＩ-ＳceＩマップに関して整列してい ることが明確であり（図１３Ｅ）、それぞれのクロ−ンが定義した間隔内にある か、またはＩ-ＳceＩ部位を横切っている。更に、第二の範疇のクロ−ンにより 、幾つかのＥcoＲＩ断片をＩ-ＳceＩマップ上に配置することが可能となるが、 その他のものは配置されないままである。染色体XIに特異的な、完全なコスミド クロ−ンであって、あわせると該染色体の８回分をカバ−するものは、図１８に 示してあるように、Ｉ-ＳceＩマップに関して分類されている。 ５.Ｉ-ＳceＩを使用したパ−シャル制限マッピング。 この態様においては、人工的に挿入したＩ-ＳceＩ部位でのＤＮＡの完全消化 の後で、選択した細菌性制限エンドヌクレア−ゼによるパ−シャル消化を行う。 制限断片を次いで電気泳動により分離してブロットした。間接的末端標識を、左 または右のＩ-Ｓceｌの半分の部位を使用して行う。この技術は酵母染色体では 成功し、またＹＡＣに対しても困難なく適用できるはずである。 パ−シャル制限マッピングを、商業的な酵素Ｉ-ＳceＩを使用して、酵母ＤＮ Ａ及び哺乳類細胞ＤＮＡで行った。人工的に挿入したＩ-Ｓce-Ｉ部位を含む細胞 由来のＤＮＡをまず、Ｉ-ＳceＩで完全に消化する、次いでＤＮＡを興味ある細 菌性制限エンドヌクレア−ゼ（例えばＢamＨＩ)を使用するパ−シャル開裂条件 下で処理し、 サイズ補正マ−カ−にそって、電気泳動する。このＤＮＡをメンブレンにトラン スファ−し、続いてＩ-ＳceＩ部位のどちらか一方の脇の短い配列を使用してハ イブリダイゼ−ションする（これらの配列は、Ｉ-ＳceＩを挿入するのに使用し た元の挿入ベクタであるので、これらの配列は既知である）。オ−トラジオグラ フィ−（またはその他の、非放射性プロ−ブを使用する、等価な検出系）により 、ラダ−が視覚化され、これはＩ-ＳceＩ部位に由来する細菌性制限エンドヌク レア−ゼ部位の連続物を直接的に現わす。ラダ−のそれぞれのバンドを使用して 細菌性制限エンドヌクレア−ゼ部位の連続物の間の物理的距離を計算する。 in vivo部位特異的組み換えへの、Ｉ-ＳceＩの適用。 １.酵母内でのＩ-ＳceＩの発現。 合成のＩ-ＳceＩ遺伝子を、マルチコピ−プラスミドであるpＰＥＸ7及びpＰＥ Ｘ408上の、ガラクト−ス誘導性プロモ−タの制御下に置いた。発現は正常にお き、以下に示すような、部位への影響を誘導する。Ｉ-ＳceＩの合成遺伝子が染 色体内の誘導性プロモ−タの制御下に挿入されたトランスジェニック酵母を構築 することが可能である。 ２.酵母内での部位特異的二本鎖開裂の影響（参考文献１８及びＰ４）。 プラスミドの有するＩ-ＳceＩ部位への影響：分子内効果は、参考文献１８に 詳細が記載されている。分子間（プラスミドから染色体）組み換えを予想するこ とができる。 染色体に組み込まれたＩ-ＳceＩ部位への影響。 一倍体の細胞では、人工的Ｉ-ＳceＩ部位での染色体内単一切断は、細胞増殖 の停止とそれに引き続く細胞死を起こす（ほんの数％しか生き延びない）。切断 部 位に相同性のある無傷の配列が存在すると、修復がおきて、１００％細胞が生存 する。二倍体細胞では、染色体内の人工的Ｉ-ＳceＩ部位の単一の切断は染色体 相同部を使用した修飾がおきて、１００％細胞が生存する。この両方の場合、誘 導された二本鎖切断の修飾により、切断部の脇の非相同性配列の欠失と、ドナ− ＤＮＡ分子に由来する非相同性配列の挿入を伴った、異型接合性が失われる。 ３.酵母内での、in vivo組み換えＹＡＣへの適用。 クロ−ニング部位の次にＩ-ＳceＩ認識部位を有するＹＡＣベクタの構築によ り、挿入部が一部オ−バ−ラップしている場合には、別のＹＡＣとの相同性組み 換えを誘導することができる。これは、保有物（contigs）の構築にも有益であ る。 ４.その他の生物体の展望：Ｉ-ＳceＩ制限部位の挿入を細菌（大腸菌（Ｅ.col i）、エルシニア・エントロコリチカ(Ｙersinia entorocolitica)、Ｙ．ペスチ ス(Ｙ.pestis)、Ｙ．シュ−ドツベルクロシス（Ｙ．pseudotuberculosis））と 、マウスの細胞に対して行った。人工的Ｉ-ＳceＩ部位のin vivoでの開裂は、ト ランスジェニックマウス細胞に由来するＤＮＡで成功した。哺乳類、または植物 細胞内の合成遺伝子に由来するＩ-ＳceＩの発現はうまくいくはずである。 Ｉ-ＳceＩ部位をマウス細胞及び細菌細胞内へ、以下のようにして導入した： −１−マウス細胞 −a−マウス細胞（Ψ２）を標準的なリン酸カルシウム形質転換法を利 用して、Ｉ-ＳceＩ部位を有するベクタpＭＬＶ ＬＴＲ ＳＡＰＬＺで形質転換し た。 −b−形質転換済み細胞を、フレオマイシン（phleomysin）と５％ウシ 胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地で選択し、１２％ＣＯ₂、１００％湿度、３７℃ でコロニ−が形成されるまで増殖させた。 −c−フレオマイシン抵抗性コロニ−を同じ培地で一回サブクロ−ニン グした。 −d−１ml当たり１０⁵の力価のウイルス粒子を産生するクロ−ン ＭＬＯＰ014を選択した。このクロ−ンをＣＮＣＭに1992年５月５日に培養物コ レクションアクセス番号Ｉ-1207の下に寄託した。 −e−１０％ウシ胎児血清と５mg／mlの「ポリブレイン（polybrain）」 とを有するＤＭＥＭ培地内で１０⁵細胞当たり、このクロ−ンの上清を使用した １０⁵のウイルス粒子をまいて、他のマウス細胞（1009）を感染させた。培地は 新鮮な同じ培地で、感染６時間後に置き換えた。 −f−感染後２４時間で、フレオマイシン抵抗性細胞を、上記と同じ培 地内で選択した。 −g−フレオマイシン抵抗性のコロニ−を同じ培地でサブクロ−ニング した。 −h−一つのクロ−ンを取り上げて、分析した。ＤＮＡを標準的な方法 で精製して、最適な条件下でＩ-ＳceＩで消化した。 −２−細菌細胞： Ｉ-ＳceＩ部位を有するミニＴn5トランスポゾンを、標準的なＤＮＡ組み換え 技術により構築した。ミニＴn5トランスポゾンを共役プラスミド（conjugativep lasmid）上にのせる。大腸菌（Ｅ.coli）とエルシニア（Ｙersinia）との間の細 菌共役を使用して、エルシニア内にミニＴn5トランスポゾンを組み込む。カナマ イシン、ストレプトマイシン、またはテトラサイクリンに対して抵抗性のあるエ ルシニア細胞を選択する（それぞれ、ベクタpＴＫＭ-ω、pＴＳＭ-ω、及びpoＴ Ｔc-ω）。 プラスミドに由来するＤＮＡを染色体へ、部位特異的に挿入するための幾つか の方法を行うことが可能である。これにより、骨の折れるスクリ−ニング工程を 行わずに、予め決めておいた部位に導入遺伝子を挿入することが可能になるであ ろう。 この方法は以下のとおりである： −１−Ｉ-ＳceＩ認識部位が染色体のユニ−クな位置に挿入されている 、トランスジェニックな細胞を構築する。トランスジェニック細胞を、発現ベク タと、興味ある遺伝子、及びＩ-ＳceＩが内部に挿入されている配列に対して相 同性な部 分を有しているプラスミドとで共形質転換する。 −２−プラスミド上の興味ある遺伝子内、またはその隣への、Ｉ-Ｓce Ｉ認識部位の挿入。正常な細胞を、合成Ｉ-ＳceＩ遺伝子を有する発現ベクタと 、Ｉ-ＳceＩ認識部位を有するプラスミドとで共形質転換する。 −３−Ｉ-ＳceＩ遺伝子が、ゲノム中の、誘導性、または構成性の細胞 性プロモ−タの制御下に組み込まれた、安定なトランスジェニック細胞株の構築 。興味ある遺伝子内、またはその隣にＩ-ＳceＩ部位を有しているプラスミドに よる、細胞株の形質転換。 部位特異的相同性組み換え：酵母で成功した実験の図を、図１９に示し てある。 本願で引用している、参考文献の全ての開示事項全てと要約は、参照すること により本願に組み込む。 サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓaccharomyces cerevisiae）のＩ-ＳceＩ 系を利用した、哺乳類染色体での相同性組み換え誘導。 例４ イントロダクション 染色体と外来性ＤＮＡとの間の相同性組み換え（ＨＲ）は、ゲノムへの遺伝的 変化を導入する方法の基礎である（５Ｂ、２０Ｂ）。組み換えイベントのパラメ −タは、細胞内へ導入されているプラスミド配列の研究と(１Ｂ、４Ｂ、１０Ｂ 、１２Ｂ)、in vitro系での研究により決定された。ＨＲは、哺乳類細胞では非 効率的であるが、ＤＮＡ中の二本鎖切断により促進される。 これまでは、特定の染色体標的を効果的に開裂することは可能ではなく、よっ て組み換えに関する理解とその利用には限界があった。エンドヌクレア−ゼの中 では、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓaccharomyces cerevisiae）のミト コンドリアのエンドヌクレア−ゼ Ｉ-ＳceＩ（６Ｂ）が、特異的な染色体標的を 開裂させるための道具として利用できる性質を有していて、よって生きている生 物体の染色体を操作できる。Ｉ-ＳceＩタンパク質は、酵母のミトコンドリアに おける、イントロンホ−ミング（homing）、すなわち予め決めておいた配列が予 め決めておいた部位へ挿入される非相反的機構を担うエンドヌクレア−ゼである 。エンドヌクレア−ゼＩ-ＳceＩは酵母の核内で、二本鎖切断を開始することに より、組み換えを触媒することが確立されている（17Ｂ）。エンドヌクレア−ゼ Ｉ-ＳceＩの認識部位は１８bpの長さであり、よってＩ-ＳceＩタンパク質は非常 にまれに切断する制限エンドヌクレア−ゼである(22Ｂ)。更に、Ｉ-ＳceＩタン パク質はリコンビナ−ゼではないので、染色体工学への可能性は、宿主とドナ− 分子の両方に標的部位が要求されるの系の可能性よりも高い（９Ｂ）。 出願人らは本願で、酵母Ｉ-ＳceＩエンドヌクレア−ゼは、哺乳類細胞内の染 色 体標的内で効果的に二本鎖切断を誘導することが可能であることと、この切断が 、該切断に隣り合う領域と相同性を共有するドナ−分子を使用して修復されるこ とを証明している。該酵素は高い効率で組み換えを触媒する。このことは、染色 体ＤＮＡと外来性ＤＮＡとの間の組み換えが、二本鎖切断修復経路により、哺乳 類細胞内で起こりえることを証明している(２１Ｂ)。 実験材料と実験方法 プラスミドの構築 pＧ-ＭＰＬは４つの工程により得た： (I)モロニ−マウス白血病ウイルス（ＭoＭuＬＶ）の3’ＬＴＲのＵ3配列中の 、ＮheＩ部位−ＸbaＩ部位間のＳＡを有するＭoＭuＬＶのenv遺伝子の、０.３kb からなるＢglII−ＳmaＩ断片（クレノウ酵素で処置済み）の挿入； (II)リンカ−アダプタ−を有するこの修飾済みＬＴＲ中の、ＳＡの隣のＸbaＩ 部位における、ＰhleoＬacＺ融合遺伝子（15Ｂ）（Ｃayla laboratoryより入手 したpＵＴ65由来）を含む、３.５kbのＮcoＩ−ＸhoＩ断片の挿入； (III)p5'ＬＴＲプラスミド（ＸhoＩとＥcoRＩとの間に、ＭoＭuＬＶの、ヌク レオチド番号５６３までの5'ＬＴＲを有するプラスミド）の、ＳalＩとＥcoRＩ との二重消化により回収される、この3’ＬＴＲ（ＳＡとＰhleoＬacＺを有する ）の挿入； (IV)この3’ＬＴＲ内のＮcoＩ部位（ＳＡとＰhleoＬacＺとの間）への、合成 Ｉ-ＳceＩ認識部位の挿入。 pＧ-ＭtkＰ1は、１.６kbのtk遺伝子をそのプロモ−タとともにpＧ-ＭＰＬのＰ stＩ部位に挿入することにより得られた。pＶＲneoは、二つの工程で得られた： (I)ＳＡとＰhleoＬacＺとを有する3’ＬＴＲを含んだ４.５kbのＰstＩ−ＥcoＲ Ｉ断片の、ＰstＩ−ＥcoＲＩ二重消化により直鎖状にしたpＳＰ65（プロメガ社 ）への挿入；(II)Ｇ-ＭＰＬの3’ＬＴＲの一部を有するpＳＰ65のＮcoＩ制限部 位（クレノウ酵素で処理済み）への、２.０kbのＢglII−ＢamＨＩ断片（クレノ ウ酵素で処理済み）の挿入。 pＣＭＶ(Ｉ-ＳceＩ＋)は、二つの工程で得られた： (I)ＢamＨＩとＳalＩとで開裂させたphＣＭＶ1(Ｆ.Ｍeyer、個人的に入手)プ ラスミドへの、Ｉ-ＳceＩを含有する断片（pＳＣＭ525,Ａ.Ｔhierry，個人的に 入手）である０.７３kbのＢamＨＩ−ＳalＩの挿入； (II)ＳＶ40のポリアデニル化シグナルを有する１.６kbの断片の、phＣＭＶ1の ＰstＩ部位への挿入。 pＣＭＶ(Ｉ-ＳceＩ−)は、pＣＭＶ(Ｉ-ＳceＩ＋)プラスミドとは逆向きにＩ- ＳceＩＯＲＦを含んでいる。ＮsiＩ及びＳalＩとによる二重の切断で直鎖状にし 、クレノウ酵素で処理した、phＣＭＶPolＡベクタへの、ＢamＨＩ−ＰstlＩ-Ｓc eＩＯＲＦ断片の挿入により得られた。 プラスミドpＧ-ＭＰＬ、pＧ-ＭtkＰ1、pＧ-ＭtkΔＰＡＰＬを記載した。更に 上記したプラスミドに加えて、種々のプロモ−タ、遺伝子、ポリＡ部位、Ｉ-Ｓc eＩ部位を有する如何なるプラスミドベクタをも構築することができる。 細胞培養と選択 3Ｔ3、ＰＣＣ7Ｓ、Ψ２は、参考文献（７Ｂ）、及び(13Ｂ)で参照されている 。細胞選択培地：ガンシクロビル（１４Ｂ、２３Ｂ）を、組織培養液に２μＭの 濃度で加えた。ガンシクロビル選択は、６日間、細胞上で行い続けた。Ｇ418を 適切な培養液に、ＰＣＣ7-Ｓに対しては１mg／mlの濃度で、3Ｔ3に対しては、４ ００μg／mlの濃度で加えた。選択は、細胞培養中を通して行った。フレオマイ シンは１０μg／mlの濃度で使用した。 細胞株 −Ψ細胞株は、Ｉ-ＳceＩ認識部位を有するプロウイルス組み換えベクタを含 んでいるプラスミドで形質転換した：pＧ-ＭＰＬ、pＧ-ＭtkＰＬ、pＧ-Ｍtk_ΔpA ＰＬ。 −ＮＩＨ3Ｔ3線維芽細胞株を次のもので感染させる： Ｇ-ＭＰＬ 複数のクロ−ン（３０以上）が回収された。１から１４の プロウイルス組み込み、及び複数の異なる組み込み点が、分子的解析により確認 された。 Ｇ-ＭtkＰＬ ４クロ−ンが回収された(そのうち３つが正常なプロウイ ルス組み換えを有し、もう一つが、二つのＬＴＲ間の組み換えを有していて、そ のため唯一のＩ-ＳceＩ認識部位を有していた)。 −胚性癌腫 ＰＣＣ7-Ｓ細胞株をＧ-ＭＰＬで感染させる：１４クロ−ンを回 収、正常なプロウイルスの組み込みがおきていた。 −胚性幹細胞株Ｄ3をＧ-ＭＰＬで感染させる：４クロ−ンを回収（３つは正常 なプロウイルスの組み込みが起きていて、一つは４つのプロウイルス組み込みが 起きていた）。 「調製」マウス細胞： レトロウイルスの組み込み（プロウイルス組み込み）により、Ｉ-ＳceＩ含有 ＬＴＲの複製がおきる。細胞は該部位に関してヘテロ接合である。 形質転換、感染、細胞染色、及び核酸ブロット分析 これらの方法は、２Ｂ、及び３Ｂに記載のようにして行った。 結果 Ｉ-ＳceＩのＨＲを検出するために、図２０に示した実験系を設計した。欠損 した組み換えレトロウイルス（２４Ｂ）は、Ｉ-ＳceＩ認識部位とＰhloeＬacＺ （１５Ｂ）誘導遺伝子を、3’ＬＴＲ内に挿入して構築した（図２０a）。レトロ ウイルスの組み込みにより、細胞ゲノム内に、互いに５.８kb、または７.２kb離 れた二つのＩ-ＳceＩ部位の組み込みがおきた（図２０b）。これらの前位でのＩ -ＳceＩ誘導性二本鎖切断（ＤＳＢ）（図２０c）により、ＤＳＢの脇の領域との 相同性配列を有す るドナ−プラスミド（pＳＶneo，図２０d）とのＨＲが開始されることと、また 非相同性配列でドナ−プラスミドが有するものは、この組み換え中に複製される （図２０e）可能性とを推定した。 レトロウイルスの組み込みによる、哺乳類細胞ゲノムへの、複製済みＩ-Ｓce Ｉ認識部位の導入 より特には、二つのプロウイルス配列を本研究で使用した。Ｇ-ＭtkＰＬプロ ウイルス配列（Ｇ-ＭtkＰＬウイルス由来）には、形質移入済み細胞の（フレオ マイシン含有培地内での）陽性選択用のＰheleoＬacＺ誘導遺伝子と、（ガンシ クロビル含有培地内での）陰性選択用のtk遺伝子が含まれている。Ｇ-ＭＰＬプ ロウイルス（Ｇ-ＭＰＬウイルス由来）はＰhleoＬacＺ配列のみが含まれている 。Ｇ-ＭtkＰＬ及びＧ-ＭＰＬはエンハンサ非含有モロニ−マウス白血病プロウイ ルスより構築された欠損型組み換えウイルス（１６Ｂ）である。該ウイルスベク タは、プロモ−タトラップとして機能し、故に細胞のフランキング配列により活 性化される。 ウイルス産生細胞株は、pＧ-ＭtkＰＬまたはＧ-ＭＰＬをΨ−２パッケ−ジ細 胞株（１３Ｂ）へ形質導入して作成した。ウイルス転写産物のノ−ザン分析（図 ２１）は、Ψ−２−Ｇ-ＭＰＬ株がＬacＺプロ−ブとハイブリダイズする、４.２ 及び５.８kbの転写産物を発現することを示している。これらの転写産物は、お そらく5’ＬＴＲで開始され、3'ＬＴＲで終結している。この４.５kbの転写産物 は、スプライシングされた伝令に相当し、５.８kbの転写産物はスプライシング されていないゲノムの伝令に相当する（図２１Ａ）。このことは、該ウイルス中 の5'ＬＴＲと、スプライシングドナ−及びアクセプタ−の機能性を確認している 。ウイルスは、Ψ−２細胞株の培養液より調製した。 ＮＩＨ3Ｔ3線維芽細胞、及びＰＣＣ７−Ｓ多能性マウス細胞株（７Ｂ）を次い で、Ｇ-ＭtkＰＬ及びＧ-ＭＰＬでそれぞれ感染させ、クロ−ンを単離した。この クロ−ンより調製したＤＮＡのサザンブロット分析により、ＬＴＲ仲介性のＩ- ＳceＩ ＰleoＬacＺ配列の複製が証明された（図２２a）。ＢclＩによる消化により、予 想した５.８kb（Ｇ-ＭＰＬ）、または７.２kb（Ｇ-ＭtkＰＬ）の断片が産生され た。染色体のフランキングＤＮＡ内のBclＩ部位に相当する、二つの付加的断片 の存在により、単離したそれぞれのクロ−ンにおいて、プロウイルス標的が単一 であることが証明される。クロ−ンごとで変化するそのサイズは、別個の遺伝子 座でレトロウイルスの組み込みが起きていることを意味している。Ｉ-ＳceＩ消 化で５.８kb（Ｇ-ＭＰＬ）断片、または７.２kb（Ｇ-ＭtkＰＬ）が生じているこ とにより、Ｉ-ＳceＩ認識が忠実に複製されていることが示された（図２２ｂ） 。 ＤＮＡ交換へと導かれる組み換えの、Ｉ-ＳceＩによる誘導。 Ｇ-ＭtkＰＬウイルスによりＮＩＨ3Ｔ3に与えられた表現型は、Ｐhleo^Rβ-gal⁺ gls^Sであり、Ｇ-ＭＬＰによりＰＣＣ7-Ｓに与えられた表現型は、Ｐhleo^R、βg al⁺である（図２０b）。Ｉ-ＳceＩにより誘導される組み換えイベントの直接的 選択を可能にするため、pＶＲneoドナ−プラスミドを構築した。pＶＲneoにおい ては、neo遺伝子は、左側の染色体切断に対して5'である配列に相同性である３ ００ bpと、右側の切断に対して3’である配列に対して相同性である２.５kbと で挟まれている（図２０d）。ポリアデニレ−ションシグナルはneo遺伝子に対し て3’に配置して、組み換え後にＰhleoＬacＺ伝令を阻害するようにした。プロ ウイルスとプラスミドとの間の誘導性組み換えが起こると、得られる表現型はne o^Rであり、ドナ−プラスミド内のポリアデニレ−ションシグナルの存在のため、 ＰhleoＬacＺ遺伝子は発現しないはずであり、phleo^Sβ-gal^-表現型になる。 Ｇ-mtkＰＬ及びＧ-ＭtkＤＰＱＰＬにより、tk遺伝子を使用した陰性選択（ガ ンシクロビル使用）によるギャップのための選択と、neo遺伝子を使用した陽性 選択（ジェニティシン使用）によるドナ−プラスミドの交換のための選択を同時 に行うことが可能である。Ｇ-ＭＬＰを使用して、陽性選択のみをジェニティシ ン含有培地に適用することができる。よって、活性な内在性プロモ−タ近傍にお ける、ドナ−プラスミドのＨＲと組み込みイベントとの両方に関しての選択を期 待した。誘導 されたＨＲは、表現型がneo^Rβ-gal^-になり、またドナ−プラスミドのランダム な組み込みにより表現型がneo^Rβgal⁺になることより、上記の二つのイベントは 区別することができる。 二つの異なるＮＩＨ3Ｔ3／Ｇ-ＭtkＰＬと、３つの異なるＰＣＣ7-Ｓ／Ｇ-ＭＰ Ｌを次いで、Ｉ-ＳceＩ用の発現ベクタ、pＣＭＶ(Ｉ-ＳceＩ＋)と、ドナ−プラ スミドpＶＲneoで共形質転換した。Ｉ-ＳceＩの一過性発現により、Ｉ-ＳceＩ部 位でのＤＳＢがおき、よってpＶＲneoとのＨＲが促進される。対照は、Ｉ-Ｓce Ｉを発現しないプラスミドでゐるpＣＭＶ(Ｉ-ＳceＩ−)と、pＶＲneoである。 ＮＩＨ3Ｔ3／Ｇ-ＭtkＰＬクロ−ンを、プロウイルス配列の喪失及びneo^R表現 型の獲得（ガンシクロビルとジェネティシン使用）、またはneo^R表現型のみの獲 得の何れかに関して選択した（表１）。第一の場合においては、neo^Rgls^Rコロニ −が一連の実験では１０^-4の頻度で回収され、一連の対照ではコロニ−は全く回 収されなかった。更にneo^Rgls^Rコロニ−全てはβ-gal^-であって、これはプロウ イルス部位でのＨＲより得られたことと一貫性がある。第二の場合においては、 neo^Rコロニ−は、一連の実験で１０^-3の頻度で回収されたが、一連の対照実験で は１０から１００分の１の低頻度であった。さらにneo^Rコロニ−の９０％は、(p ＣＭＶ(Ｉ-ＳceＩ＋)のシリ−ズでは)β-gal^-であることが判明した。これは、 Ｉ-ＳceＩの発現により、pＶＲneoとプロウイルスとの間のＨＲが誘導されるこ とと、部位特異的ＨＲは、細胞プロモ−タ近傍でのpＶＲneoのランダムな組み込 みよりも１０倍、自発的ＨＲよりも少なくとも５００倍、より頻繁に起きること を示している。 表１：Ｉ-ＳceＩ仲介性の二本鎖切断の影響。 Ａ.１０⁶のＮＩＨ3Ｔ3／Ｇ-ＭtkＰＬ細胞のクロ−ン１および２、並びに５.１ ０⁶のＰＣＣ7-Ｓ／Ｇ-ＭＰＬ細胞のクロ−ン３から５を、pＶＲneoとpＣＭＶ(Ｉ -ＳceＩ＋)若しくはpＣＭＶ(Ｉ-ＳceＩ−)とで共形質転換した。細胞を表示の培 地で選択した：ジェニティシン（Ｇ418）、またはジェネティシン＋ガンシクロ ビル（Ｇ418_Ｇls）。βgal発現表現型は、Ｘ-gal組織化学的染色により決定し た。プロウイルスとpＶＲneoとの間の誘導性組み換えがおきるならば、細胞はne o^Rβ-gal-表現型を獲得する。Ｂ.組み換えクロ−ンサンプルの分子的分析。ＲＩ :親ウイルス構造pＶＲneoのランダムな組み込み。ＤsＨＲ：二重部位ＨＲ。Ｓs ＨＲ：単一部位ＨＲ。Ｄel:プロウイルスの欠失（図２０、及び図２３も参照さ れたし）。 サザンブロット、及びノ−ザンブロット分析による、組み換えの確認。 neo^R組換え体の分子的構造をサザンブロット分析で調べた（図２３、及び表１ ）。 Ｉ-ＳceＩ部位でのＨＲからは、組み換えＤＮＡは、４.２kbの親断片の代わりに ６４kbのＬacＺ断片が産生されることが予想される。ＮＩＨ3Ｔ3細胞からのneo^R gls^Rβ-gal^-の１５の組換え体全ては6.4kbのＫpnＩ断片のみを示した。よって、 二重の選択方法により、予想した遺伝子置換（二重部位相同性組み換え：ＤsＨ Ｒ）による組み換え体のみ産生された。 単一選択により産生された２５のβ-gal^-組換え体は４つのクラスに分類でき る：(a)上記のようにしてＩ-ＳceＩで誘導されるＤsＨＲ（１９クロ−ン）；(b) ６.４kbの断片（図２３、表１、単一部位相同性組み換え：ＳsＨＥ；クロ−ン３ からは３つの独立したβ-gal-組換え体）に加えて存在する、４.２kbのＫpnＩ断 片（残りのＬＴＲ内のＰhleoＬacＺに相当する）により証明される、左側のＬＴ Ｒ内へのpＶＲneoの組み込み。これらのクロ−ンは、左のＤＳＢのみのＩ-Ｓce Ｉ-ＩＨＲか、（より可能性は低いが）ＬＴＲとpＶＲneoとの間の二重の交差に 相当する；(c)：ランダムなpＶＲneoの組み込み（表１、ランダムな組み込み： ＩＲ）、及び同時のＨＲ（表１、欠失：Ｄel）（１つのβ−gal⁻組換え体）； 及び(d):ランダムなpＶＲneoの組み込みと、同時のプロウイルスの欠失（１つの β-gal⁻組換え体）。この四番目のクラスは、相同性染色体を使用したＤＳＢの 修復に相当していると思われる。予期したとおり、ジェニティシン選択のみによ るβ-gal⁺組換え体の全ては、一連の実験に由来するもの（８クロ−ンを分析） も、一連の対照に由来するもの（６クロ−ンを分析）も、ランダムなpＶＲneo組 み込みに相当している。 親細胞と、組換え体で産生されたＲＮＡを分析して、ＰＣＣ7-Ｓ／Ｇ-ＭＰＬ のＩ-ＳceＩ部位で組み換えが起きたことを証明する、付加的な証拠を得た（図 ２４）。親ＰＣＣ7-Ｓ／Ｇ-ＭＰＬ１細胞は、細胞プロモ−タのトラッピングに よって細胞−ウイルス融合ＲＮＡが発現していることを示す、７.０kbのＬacＺ ＲＮＡを発現する。組み換えクロ−ンはこのＬacＺ ＲＮＡを発現しないが、５. ０kbのneoＲＮＡを発現する。このneoＲＮＡのサイズは、neo遺伝子によるＰhle oＬacＺの正確な交換と、細胞性スプライシング部位とウイルス性スプライシン グ部位との交換の使用から予期されるサイズと正確に一致する(ＬＴＲ内のウイ ルス性のＰhleoＬacＺ Ｒ ＮＡは３.７kbであり、pＶＲneo中のneoＲＮＡは１.７kbである）。 考察 本願で示された結果は、二本鎖切断が、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓ accharomyces cerebisiae）のＩ-ＳceＩ系により、ほ乳類細胞中で誘導されるこ とと、標的染色体配列中の切断は、使用したドナ−プラスミドＤＮＡとの前位特 異的組み換えを誘導することを証明している。哺乳類細胞内で操作するために、 この系においては、内在性のＩ-ＳceＩ様活性が哺乳類細胞内ではないことと、 Ｉ-ＳceＩタンパク質が哺乳類細胞内で中性であることが必要である。Ｉ-ＳceＩ 認識部位の導入は、インプットしたＤＮＡ配列内での再構成や変異を起こさない ようであるので、内在性のＩ-ＳceＩ様活性は、哺乳類細胞内で作用しないであ ろう。例えば、Ｉ-ＳceＩ認識部位を有するレトロウイルスで感染させたＮＩＨ3 Ｔ3及びＰＣＣ7-Ｓクロ−ンの全ては、安定にウイルスを増殖させた。Ｉ-ＳceＩ 遺伝子産物の毒性を試験するために、Ｉ-ＳceＩ発現プラスミドをＮＩＨ3Ｔ3細 胞株へ導入した（デ−タ非掲載）。機能性のＩ-ＳceＩ遺伝子のコ・トランスフ ァ−が、高い割合で起きることが判明し、これは該遺伝子に関しての選択が全く 起きていないことを示唆している。Ｉ-ＳceＩ遺伝子の機能性は、遺伝子産物と 生物学的機能の転写分析、免疫蛍光検出で証明した(Choulika et al.,投稿準備 中)。 次にエンドヌクレア−ゼが、染色体上の認識部位を開裂するかどうかを試験し た。これは、プロウイルス構造のそれぞれのＬＴＲ内の、染色体上で５.８kb、 または７.２kb離れた二つのＩ-ＳceＩ認識部位を配置することと、Ｉ-ＳceＩ遺 伝子産物の存在下での標的ベクタとの組み換え反応の産物の分析により成し遂げ られた。得られた結果は、Ｉ-ＳceＩの存在下ではドナ−ベクタが非常に効率的 に二つのＬＴＲと組み換えを起こして、機能性のneoを産生することを示してい る。これにより、Ｉ-ＳceＩが非常に効率的に、両方のＩ-ＳceＩ部位で二本鎖切 断を誘導することが示唆される、更に、二本鎖切断は少なくとも５つの離れたプ ロウイルス挿入部内で起こるので、Ｉ-ＳceＩタンパク質がＩ-ＳceＩ認識部位を 消化する能力は周囲の構造 にはほとんど依存していない。 Ｉ-ＳceＩメガヌクレア−ゼが、哺乳類細胞の染色体部位での生物学的機能を 有する能力を証明することにより、生物体のゲノムの種々の操作に関しての道が 開かれる。部位特具的リコンビナ−ゼ（９Ｂ、18Ｂ）との比較において、Ｉ-Ｓc eＩ系は非可逆である。部位特異的リコンビナ−ゼはＤＮＡの切断用の部位のみ ならず、二つのパ−トナ−同士を一緒に連結するための部位をつきとめる。対照 的に、Ｉ-ＳceＩ系での唯一の必須事項はドナ−分子と、Ｉ-ＳceＩタンパク質に より誘導される切断を挟む領域との相同性である。 これは、染色体標的内での二本鎖ＤＮＡ切断は、哺乳類細胞内の導入されたＤ ＮＡでのＨＲを刺激することを示す最初の結果である。染色体側の受取ＤＮＡ中 の二本鎖切断（ＤＳＢ）と、スパ−コイル型のドナ−ＤＮＡとの組み合わせを使 用したので、二本鎖切断修復経路による組み換えの、Ｉ-ＳceＩエンドヌクレア −ゼによる刺激を調査した（２１Ｂ）。よって、誘導された切断部は、5’から3 ’へのエキソヌクレア−ゼ消化による一本鎖領域の創製後に侵入してドナ−コピ −からＤＮＡをコピ−する、開裂した両末端が協調して関わる遺伝子変換イベン トにより、おそらく修復される。しかしながら、哺乳類細胞と酵母細胞での数多 くの組み換えの研究（１０Ｂ、１１Ｂ、19Ｂ）は、一本鎖アニ−リング（ＳＳＡ ）と呼ばれる、オルタナティブな経路が存在することを示唆している。ＳＳＡ経 路においては二本鎖切断が、相同性の一本鎖ＤＮＡを受容側及びドナ−側のＤＮ Ａに露出させるエクソヌクレア−ゼの作用の基質である。次いで相補鎖のアニ− リングの後には、組換え体を産生する修復工程が続く。Ｉ-ＳceＩ系は、この二 つの経路の相対的重要性を評価するのに使用することができる。 例５ この例は、Ｉ-ＳceＩメガヌクレア−ゼ（サッカロマイセス・セレビシアエ（ Ｓaccharomyces cerevisiae）のミトコンドリアのイントロンホ−ミングに関わ る）（６Ｂ、28Ｂ）を使用して、ＤＳＢを誘導して哺乳類細胞での組み換えを仲 介 することを記載している。Ｉ-ＳceＩは、１８bpの長さの認識部位を有する（２ ９Ｂ、２２Ｂ）、非常にまれに切断する制限エンドヌクレア−ゼである。in viv oでは、Ｉ-ＳceＩエンドヌクレア−ゼは、特異的ＤＳＢを開始して細胞によるギ ャップ修復を導くことにより、修飾した酵母の核での組み換えを誘導することが できる（３０Ｂ、１７Ｂ、２１Ｂ）。よってこの方法は、生細胞中での染色体の 操作を目指して、特異的ＤＳＢを染色体標的ＤＮＡに導入する方法として使用す ることが潜在的には可能である。Ｉ-ＳceＩ仲介性組み換えは、染色体工学に関 してリコンビナ−ゼ系[１１]よりも優れているが、それは後者では宿主とドナ− のＤＮＡ分子の両方に標的部位が存在する必要があり、可逆的な反応に至るから である。 Ｉ-ＳceＩエンドヌクレア−ゼの発現には、組み換えイベントが関わる。よっ てＩ-ＳceＩ活性は、部位特異的二重鎖切断（ＤＳＢ）を哺乳類細胞中で起こす 。少なくとも二つのイベントが、ＤＳＢの修復で起きて、一つは染色体内相同性 組み換えにいたり、もう一方は導入遺伝子の欠失に至る。これらのＩ-ＳceＩ仲 介性組み換えは、バックグラウンドのものよりも顕箸に高い頻度でおきる。 実験材料と実験方法 プラスミドの構築 pＧ-ＭtkＰＬは、５つの工程により得た：(I)ＮheＩとＸbaＩ部位（クレノウ 酵素で処理済み）との間にスプライシングの受容部（ＳＡ）を有している、モロ ニ−マウス白血病ウイルス（ＭoＭuＬＶ）のenv遺伝子の、０.３kbのＢglII-Ｓm aＩ断片（クレノウ酵素で処理済み）を、中間体プラスミド中にある、ＭoＭuＬ Ｖの3’ＬＴＲのＵ3配列中に挿入する；(II)この修飾済みＬＴＲ内に、ＰhleoＬ acＺ融合遺伝子（[13],pＵＴ65由来;Ｃayla Ｌoratory,Ｚone Ｃommercial du Ｇros,Ｔoulouse,Ｆrance）を含む３.５kbのＮcoＩ-ＸhoＩ断片を、ＳＡの隣の ＸbaＩ部位で挿入する；(III)ＳalＩ-ＥcoＲＩの二重消化で回収したこの3'ＬＴ Ｒ(ＳＡとＰhleoＬacＺとを含む)を、p5'ＬＴＲプラスミド（ＭoＭuＬＶのヌク レオチド番号５６３までの5'ＬＴＲを含むプラスミド）のＸhoＩ部位とＥcoＲＩ 部位との間に挿入する；(IV)合成Ｉ-ＳceＩ認 識部位を、3'ＬＴＲ内のＮcoＩ部位へ挿入する;(Ｖ)pＧ-ＭＰＬのＰstＩ部位に 、リンカ−アダプタ−を有している１.６kbのtk遺伝子を挿入する（レトロウイ ルスゲノムとはアンチセンスで）。 pＣＭＶ(Ｉ-ＳceＩ＋)は、二つの工程で得られた：(I)Ｉ-ＳceＩを含有する、 ０.７３kbのＢamＨＩ−ＳalＩ断片（pＳＣＭ525由来、Ａ.Ｔhierryにより寄贈） を、ＢamＨＩ及びＳalＩで開裂済みのphＣＭＶ1プラスミドへ挿入する；(II)Ｓ Ｖ40のポリアデニレ−ションシグナルを有する、１.６kbの断片（ＳＶ40のヌク レオチド番号の３２０４から１９８８）をphＣＭＶ１のＰstＩに挿入する。 pＣＭＶ(Ｉ-ＳceＩ−)には、pＣＭＶ(Ｉ-ＳceＩ＋)プラスミド内の逆向きでＩ -ＳceＩＯＲＦを含んでいる。これは、ＮsiＩとＳalＩの二重消化により線状化 され、クレノウ酵素の処理を受けた、phＣＭＶＰolyＡベクタへ、ＢamＨＩ−Ｐs tＩのＩ-ＳceＩＯＲＦ断片を挿入することで得られた。 細胞培養と選択 Ｔ3及びΨ２は、参考文献（７Ｂ）と（１３Ｂ）のものである。細胞選択培地 ：ガンシクロビル（14Ｂ、23Ｂ）を２μＭの濃度で組織培養培地へ加えた。ガン シクロビル選択を６日間続けた。フレオマイシンを１０μg／mlの濃度で使用し た。同じ条件で二重の選択を行った。 形質転換、感染、細胞染色、及び核酸ブロット分析。 これらのプロトコ−ルは、記載されているものである（２Ｂ、３Ｂ）。 ウイルス産生細胞株 ウイルス産生細胞株は、pＧ-ＭtkＰＬをΨ２パッケ−ジング細胞株へ形質導入 して得られる。ウイルスは、形質転換済みΨ２細胞株の培養液の濾過により調製 さ れ、クロ−ンはフレオマイシン含有培地で単離した。 結果 哺乳類細胞でのＩ-ＳceＩエンドヌクレア−ゼ活性をアッセイするために、Ｇ- ＭtkＰＬプロウイルスを含むＮＩＨ3Ｔ3細胞を使用した。Ｇ-ＭtkＰＬプロウイ ルス（図２５a）は、ガンシクロビル含有培地での陰性選択用のtk遺伝子を含み 、また二つのＬＴＲ内にＩ-ＳceＩ認識部位とＰhleoＬacＺ融合遺伝子とを含む 。このＰhleoＬacＺ遺伝子はフレオマイシン含有培地での、形質導入済み細胞の 陽性選択に使用することが可能である。これらの細胞でのＩ-ＳceＩエンドヌク レア−ゼの発現は、以下の機構（図２５に例示されている）のうちの一つにより 修復されるＩ-ＳceＩ認識部位での二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導すると仮定した ： (a)仮にＩ-ＳceＩエンドヌクレア−ゼが二つのＬＴＲ（図１−ｂの１と２）の うちの一つのみで切断を誘導するならば、二つのＬＴＲの間で相同性である配列 は対を形成し、組み換えを起こして染色体内相同性組み換え（すなわち一本鎖ア ニ−リング(ＳＳＡ)(12Ｂ、10Ｂ)または交差）を起こす； (b)仮にＩ-ＳceＩエンドヌクレア−ゼが、二つのＬＴＲのそれぞれにおいて切 断を誘導するならば、二つのフリ−な末端は再連結することが可能であり（末端 結合機構（３１Ｂ））染色体内組み換え（図２５−ｂ３）がおきる；または、 (c)二つのＤＳＢにより作られるギャップは、相同性染色体かその他の染色体 断片上の配列を使用したギャップ修復機構により修復されて、プロウイルス配列 の喪失がおきる（３２Ｂ）（図２５−ｃ）。 Ｇ-ＭtkＰＬによりＮＩＨ3Ｔ3細胞に与えられた表現型は、Ｐhleo^RβＧal⁺Ｇl s-^sである。第一の実験系においては、tk遺伝子の喪失での選択により、組み換 えを検索した。ＮＩＨ3Ｔ3／Ｇ-ＭtkＰＬ１及び２（コロナルプロウイルス組み 込み部位を有する二つの独立したクロ−ン）を、Ｉ-ＳceＩ発現ベクタであるpＣ ＭＶ(Ｉ-ＳceＩ＋)、またはＩ-ＳceＩエンドヌクレア−ゼを発現しない対照プラ スミドであるpＣＭＶ(Ｉ-ＳceＩ−)で形質転換した。次いで細胞をガンシクロビ ル含有培地で増殖させて、ｔｋ活性の喪失で選択した。得られたＧls^Rクロ−ン もまた、組織化学的染色(Ｘ-gal を使用）して、βガラクトシダ−ゼ活性に関してアッセイした（表１）。 組み換え頻度に与える、Ｉ-ＳceＩ発現の効果。１Ｘ１０⁶のＮＩＨ3Ｔ3／Ｇ- ＭtkＰＬ1細胞と、２Ｘ１０⁶のＮＩＨ3Ｔ3／Ｇ-ＭtkＰＬ1細胞を、pＣＭＶ(Ｉ- ＳceＩ＋)またはpＣＭＶ(Ｉ-ＳceＩ−)で形質転換した。細胞をガンシクロビル 含有培地で培養した。Ｇls^Rクロ−ンの、βガラクトシダ−ゼ表現型を、Ｘ-gal 組織化学的染色で決定した。 pＣＭＶ(Ｉ-ＳceＩ−)で形質転換した対照の実験系では、Ｇls^R抵抗性クロ− ンが低頻度で見られ（３Ｘ１０^-6の処置済み細胞当たり２クロ−ン）、またこの 二つはβ-gal⁺であった。pＣＭＶ(Ｉ-ＳceＩ＋)で形質転換した実験系では、Ｉ- ＳceＩ遺伝子の発現により、Ｇls^Rクロ−ンの頻度を１００倍上昇させた。これ らのクロ−ンは、β-gal^-（９３％）、またはβ-gal⁺（７％）の何れかであった 。ＮＩＨ3Ｔ3／Ｇ-ＭtkＰＬ１に由来する５つのβ-gal^-クロ−ンと、ＮＩＨ3Ｔ3 ／Ｇ-ＭtkＰＬ2に由来する６クロ−ンとを、ＰstＩを使用したサザンブロッティ ングにより分析した（図２６）。親ＤＮＡにおいて、ＰstＩエンドヌクレア−ゼ は、プロウイルスのtk遺伝子内で二回切断した（図２６ａ）。二つのＰhleoＬac Ｚ含有断片のサイズを、フランキング細胞ＤＮＡの内のＰstＩ部位の位置で決定 した。ＮＩＨ3Ｔ3／-ＭtkＰＬ1では、これら二つのＰhleoＬacＺ断片は１０kbp であり、ＮＩＨ3Ｔ3／Ｇ-ＭtkＰＬ2では、それらは７kbpと９kbpである。ＮＩＨ 3Ｔ3／Ｇ-ＭtkＰＬ１に由来する、５つのＧls^Rβ-gal^-抵抗性クロ−ンと、ＮＩ Ｈ3Ｔ3／Ｇ-ＭtkＰＬ2に由来する６クロ−ンでは、tk遺伝子と二つのＰhleoＬac Ｚ配列が欠失していた（図２６ｂとｃ）。 この実験系では、対照系と比較すると、Ｇls^Rβ-gal⁺クロ−ンの数が、Ｉ-Ｓc eＩ 発現により、約１０倍上昇した。これらはこれ以上の分析を行わなかった。 回収される、Ｇls^Rβ-gal⁺クロ−ンの数を増大させるため、第二実験系では細 胞をガンシクロビルとフレオマイシンの両方を含む培地で増殖させた。ガンシク コビルはtk活性を喪失した細胞を選択し、またフレオマイシンは、ＰhleoＬacＺ 遺伝子を保持している細胞を選択する。ＮＩＨ3Ｔ3／Ｇ-ＭtkＰＬ１及び２を、p ＣＭＶ（Ｉ-ＳceＩ＋）、またはpＣＭＶ（Ｉ-ＳceＩ−）で形質転換した（表２ ）。 表２:染色体内組み換え頻度に与える、Ｉ-ＳceＩ発現の影響。２Ｘ１０⁶のＮ ＩＨ3Ｔ3／Ｇ-ＭtkＰＬ1細胞と、9Ｘ10(6)のＮＩＨ3Ｔ3／Ｇ-ＭtkＰＬ2細胞とを 、pＣＭＶ(Ｉ-ＳceＩ＋)、若しくはpＣＭＶ(Ｉ-ＳceＩ−)で形質転換した。細胞 は、フレオマイシン及びガンシクロビル含有培地で培養した。 対照実験系では、Ｐhleo^RＧls^R抵抗性クロ−ン回収頻度は１Ｘ１０^-6であった 。この結果は、tk活性を自発的に喪失するが、一方ではＰhleoＬacＺ遺伝子活性 を保持している細胞を反映している。この実験系ではこの頻度は２０から３０倍 上昇されたが、これは第一実験系とも一致する（表１）。 Ｐhleo^Rβ-gal⁺gls^Rクロ−ンの分子構造を、サザンブロットで分析した（図２ ７）。ＮＩＨ3Ｔ3／Ｇ-ＭtkＰＬ１に由来する４クロ−ンを分析したが、二つは 実験系からで、二つは対照からであった。これらのＤＮＡをＰstＩエンドヌクレ ア−ゼで消化した。染色体内のイベントが起きると、１３.６kbp（親ＤＮＡの３ つのＰstＩ断片の合計からＩ-ＳceＩ断片を差し引いたもの、す２７ａを参照） の単一の断片が得られることが期待された。４つのＰhleo^Rgls^R抵抗性クロ−ン 全ては、１３.６kbpのＰstＩ 断片を示したで、これは忠実な分子内組み換えを示唆している（図２７b）。 ＮＩＨ3Ｔ3／Ｇ-ＭtkＰＬ2細胞に由来する８クロ−ンからのＤＮＡを、ＢclＩ 消化を使用してサザンブロットで分析した（６つは実験系より、二つは対照系よ り）。親ＤＮＡのＢclＩ消化により、プロウイルス配列を含む７.２kbpの断片一 つと、６kbpと９.２kbpのフランキング断片二つとが得られる。染色体内組み換 えにより、７.２kbpの断片が喪失されるはずであるが、他の二つのバンド（６kb pと９.２kbp）は変化しないままである（図２７ａ）。８つのクロ−ン（２.７か ら２.１６）では、7.2kbp断片を含むtkが消えていたが、これは二つのＬＴＲ間 での染色体内組み換えを示している（図２７ｃ）。 考察 ここに示した結果は、酵母のＩ-ＳceＩエンドヌクレア−ゼが、哺乳類細胞中 で染色体組み換えを誘導することを証明している。これは、Ｉ-ＳceＩがin vivo において、予め決めておいた標的で染色体を切断することが可能であることを強 く示唆している。 種々の種におけるゲノム配列中の二本鎖切断は組み換えを刺激する（２１Ｂ、 １９Ｂ）。二倍体の酵母では、染色体ＤＳＢにより同質対立遺伝子の遺伝子座を 修復マトリクスとして使用することが可能になる。これにより、遺伝子変換イベ ントが起きて、該遺伝子座が同型接合型になる（３０Ｂ）。染色体ＤＳＢはまた 、異所性の遺伝子座の相同性配列をマトリックスとして使用して修復されること が可能である（３２Ｂ）。この結果は、ＤＳＢギャップ修復機構の結果としては 顕著なレベルで観察される。ＤＳＢが二つの直接的反復染色体配列の間で起きる と、組み換えの機構は一本鎖アニ−リング（ＳＳＡ）経路を使用する（１１Ｂ、 １０Ｂ）。ＳＳＡ経路には３つの工程が関わる：１）切断部分でエクソヌクレオ リシスが開始されて、3'に突出した一本鎖ＤＮＡを残す；２）二つの一本鎖ＤＮ Ａの間での、相同性配列による対形成；３）修復複合体と、非相同性配列を別け る変異導入遺伝子とによる、ＤＮＡの修復（３３Ｂ）。ＨＯまたはＩ-SceＩエン ドヌクレア−ゼ に誘導される染色体内でのＤＳＢが、末端連結によって、切断の修復を起こすこ とが示された一倍体酵母に関しての特別の問題がある（３４Ｂ）。これは実際に 起こるが低効率である（３０Ｂ、３５Ｂ）。 得られた結果は、二つのＩ-ＳceＩ部位がプロウイルス標的内に存在すること により、またＩ-ＳceＩエンドヌクレア−ゼが発現することにより、チミジンキ ナ−ゼ遺伝子の欠失が、少なくとも自発的に起きる場合よりも１００倍大きい頻 度で起きることを示している。Ｉ-ＳceＩ仲介性の組み換えにより二つのtk欠失 クロ−ンが得られる：ＰhleoＬacＺ配列を保持しているクロ−ン（７％）と、喪 失したクロ−ン（９３％）。 tk-ＰhleoＬacＺ⁺の創製はおそらく染色体内組み換えの結果である。ＬＴＲ内 にＩ-ＳceＩ認識部位を有する組み換えプロウイルスにおいて、Ｉ-ＳceＩエンド ヌクレア−ゼは、２０％の場合においてプロウイルスの一つのみのＩ-ＳceＩ部 位を切断し、また８０％の場合においてプロウイルスの２つのＩ-ＳceＩ部位を 切断することが、研究により示されている。２つのＩ-ＳceＩ部位の内一つのみ が該エンドヌクレア−ゼにより切断されるならば、染色体内組み換えはＳＳＡ経 路により起こりえる。二つのＩ-ＳceＩ部位がともに切断されるならば、tk-Ｐhl eoＬacＺ⁺細胞が末端連結により創製されて、染色体内組み換えが可能になる（ 図１を参照）。二倍体酵母においては、この経路は好ましくないが（切断部は相 同性の染色体配列を使用して修復される）（２Ｂ）、この経路が哺乳類細胞内で 使用される可能性はある。 tk-／ＰhleoＬacＺ・細胞の創製はおそらく、同型遺伝子型、及び／または異所 的遺伝子変換イベントの結果である（３６Ｂ）。プロウイルスの組み換え部位の 単離と分子的分析により、当該細胞による、染色体ＤＳＢのレゾル−ションのイ ベントそれぞれの相対的頻度に関する情報が提供される哺乳類細胞においては、 ゲノム配列の高重複性が、異所的相同性配列によるＤＳＢの修復の可能性を上昇 させるので、上記の定量的情報は重要である。ＤＳＢ修復のための異所的組み換 えは、進化におけるゲノムの形成と多様性に関わってきた可能性がある[29]。 予め決めておいたゲノムの部位において、染色体を特異的に消化する能力には 、ゲノム操作に関しての幾つかの潜在的適用性がある。 本願に記載の遺伝子置換のプロトコ−ルは、以下のように変化させてもよい； ドナ−ベクタの多様性 ドナ−プラスミド中のＩ-ＳceＩ部位のフランキング領域のサイズと配列（左 側３００bpと、右側２.５kbpに関して）：Ｉ-ＳceＩ部位の左右のフランキング 領域が最高で、合計１１kbまでの種々のサイズである、異なる構築物が存在する 。配列は、構築したものに依存している（ＬＴＲ、遺伝子）。３００bpから１１ kbの間の、如何なる配列も使用可能である。 ・挿入部（neo,phleo,phleo-ＬacＺ，及びＰytk-neoが構築された）。抗生物 質抵抗性：ネオマイシン、フレオマイシン；レポ−タ−遺伝子（ＬacＺ）；ＨＳ Ｖ１チミジンキナ−ゼ遺伝子：ガンシクロビルに対する感受性。１０kbまでの如 何なる遺伝子配列を挿入することや、それを置換することは不可能である。該遺 伝子はレトロウイルスの誘導性、または構成性プロモ−タ制御下、または遺伝子 トラップと相同性組み換え（すなわちインスリン、Ｈbs、ＩＬs、及び種々のタ ンパク質）により発現させることが可能である。 酵素Ｉ-ＳceＩを発現するために、種々の方法を使用することが可能である： 一過性の形質転換（プラスミド）、またはタンパク質の直接的インジェクション （胚の核内へ）；安定な形質転換（種々のプロモ−タ、例：ＣＭＶ,ＲＳＶ,Ｍo ＭuＬＶ）；欠失性組み換えレトロウイルス（ＭoＭuＬＶプロモ−タ制御下で、 染色体内にＯＲＦを組み込む）；エピソ−ム。 Ｉ-ＳceＩ部位を組み込む、宿主域の変化： Ｉ-ＳceＩ部位を有する組み換えのレトロウイルス（すなわち、pＧ-ＭＰＬ,p Ｇ- ＭtkＰＬ,pＧ-Ｍtk_ΔpAＰＬ）は、種々のパッケ−ジング細胞株（両種向性、ま たは異種栄養性）で産生させてもよい。 Ｉ-ＳceＩを発現する安定な細胞株の構築と、レトロウイルス感染に対する細 胞の保護。 Ｉ-ＳceＩを発現する安定な細胞株は、Ｉ-ＳceＩ部位を有するレトロウイルス ベクタでの感染に対して保護される（すなわち、Ｉ-ＳceＩエンドヌクレア−ゼ をＣＭＶプロモ−タ制御下で産生するＮＩＨ3Ｔ3細胞株は、pＧ-ＭＰＬや、pＧ- ＭtkＰＬによる感染や、Ψ２細胞でのＭoＭuＬＶプロモ−タ下のＩ-ＳceＩに対 して抵抗性である）。 Ｉ-ＳceＩ部位を含む、細胞株とトランスジェニック動物の構築。 Ｉ-ＳceＩ部位の挿入は、所望の遺伝子座、及び適切な位置での、古典的な遺 伝子置換により行う。次いで、細胞中（人工的に挿入したＩ-ＳceＩ部位へのド ナ−遺伝子の挿入）、またはトランスジェニック動物中の同じ位置での異なる遺 伝子の発現を、スクリ−ニングすることが可能である。複数の薬剤、リガンド、 医用タンパク質等の効果は、組織特異的な方法で試験することが可能である。遺 伝子は一貫して、染色体内の同じ位置に挿入されるであろう。 「無調整」のマウス細胞と全ての真核細胞に対しては、以下のようにして、ワ ンステップの遺伝子置換／組み込みを行う： ・Ｉ-ＳceＩ部位を有するベクタ（種々のドナ−プラスミド）：該遺伝子内（ またはその脇）に一つの部位、あるいはドナ−遺伝子の脇に二つの部位。 ・酵素の発現方法 一過性発現：同じプラスミド上、または別のもの（コ・トランスフェクション ）の上のＯＲＦ。 行った方法の特異的詳細は上記してある。以下の付加的な詳細により、以下の 構築を可能にする： 高力価である、種々の感染性レトロウイルス粒子を産生することが可能 な細胞株； Ｉ-ＳceＩ部位、レポ−タ−セレクタ−遺伝子、活性ＬＴＲ、及び他の レトロウイルスの必須配列を有する、欠失レトロウイルスを有するプラスミド； 上記の改変したレトロウイルス中のＩ-ＳceＩ部位のフランキング領域に対して 相同性な配列を含み、またマルチプルなクロ−ニング部位を含む、プラスミド； 並びに、Ｉ-ＳceＩエンドヌクレア−ゼの発現を可能にし、特異的適用に順応さ せたベクタ。 マウスの線維芽細胞Ψ２細胞株を使用して、Ｉ-ＳceＩ部位を有する、異所性 欠失組み換えレトロウイルスベクタを産生させた。pＧ-ＭＰＬ、pＧ-ＭtkＰＬ、 ＰＧ-Ｍtk_ΔpAＰＬのようなプラスミドを産生する細胞株もまた入手可能である 。更に、マウス両種向性細胞株（ＰＡ12のような）、または異種栄養性細胞株の ような、高力価の感染性粒子を産生する如何なる細胞をも、Ｉ-ＳceＩ部位を有 する組み換えレトロウイルス（すなわち、pＧ-ＭＰＬ,pＧ-ＭtkＰＬ,pＧ-Ｍtk_{Δ PA} ＰＬ）の、種々のパッケ−ジング細胞株（両種向性、同種指向性（ectropic） 、または異種栄養性）での産生に使用することが可能である。 Ｉ-ＳceＩを有する種々のプラスミドを、レトロウイルスの構築に使用するこ とが可能であるが、これにはpＧ-ＭＰＬ,pＧ-ＭtkＰＬ,およびpＧ-ＭtkΔＰＡＰ Ｌが含まれる。種々のプロモ−タ、遺伝子、ポリＡ部位、及びＩ-ＳceＩ部位を 有する、その他のプラスミドベクタを構築することが可能である。Ｉ-ＳceＩの フランキング領域に相同性である配列を有する、種々のプラスミドを構築するこ とが可能である。ドナ−プラスミド中のＩ-ＳceＩ部位のフランキング領域のサ イズと配列は、左に３００bp、右に２.５kbとなるように調製される。Ｉ-ＳceＩ 認識部位の左右に、最高で約１１kbの、種々のサイズのフランキング領域を有す る、他の構築物を使用することが可能である。 ネオマイシン、フレオマイシン、及びＰhleo-ＬacＺを有する挿入部を構築し た。 薬剤抵抗性または、ＬacＺ、ＨＳＶ1、若しくはチミジンキナ−ゼ遺伝子（ガン シクロビルに対しての感受性）、インシュリン、ＣＦＴＲ、ＩＬ2及び種々のタ ンパク質が含まれるリポ−タ−遺伝子のような他の配列を挿入することができる 。通常は、最高で１２kbまでの如何なる配列をも挿入することが可能であるが、 ここでサイズはカプシド形成するウイルスの容量に依存する。該遺伝子は、レト ロウイルスの誘導性、または構成性のプロモ−タ下、または相同性組み換え後の 遺伝子トラップにより、発現させることが可能である。 Ｉ-ＳceＩを含み、エンドヌクレア−ゼを産生する種々のプラスミドを構築す ることが可能である。pＣＭＶ-ＳceＩ（＋）のような発現ベクタ、またはＯＲＦ を含む同様の構築物は、一過性形質転換、電気穿孔、またはリポフェクションに より、細胞内で導入することが可能である。タンパク質はまた、インジェクショ ン、またはリポソ−ムにより細胞へ直接的に導入することも可能である。 Ｉ-ＳceＩ部位が組み込まれた種々の細胞株を産生することが可能である。好 ましくは、レトロウイルスの挿入（プロウイルスの組み込み）が、Ｉ-ＳceＩ部 位を含むＬＴＲの複製を誘導する。細胞はこの部位に関して半接合体である。適 切な細胞株には以下のものが含まれる： １.Ｇ-ＭＰＬのプロウイルス組み込みを、１から１４個有している、マウス線 維芽細胞株、ＮＩＨ3Ｔ3。複数のクロ−ン（３０よりも多い）を回収した。個と なるゲノム組み込み（未解析）の存在と多重度を分子的分析により確認した。 ２.ゲノムに１コピ−のＧ-ＭＰＬが組み込まれたマウス線維芽細胞株、ＮＩＨ 3Ｔ3。 ４クロ−ンが含まれる。 ３.１から４コピ−の、ゲノムへのＧ-ＭＰＬプロウイルス組み込みを有する、 マウス胚性癌腫細胞株、ＰＣＣ7-Ｓ。１４クロ−ンが含まれる。 ４.１コピ−のＧ-ＭtkＰＬがゲノムに組み込まれている、マウス胚性癌腫細胞 株、ＰＣＣ4。 ５.１から４コピ−のＧ-ＭＰＬをゲノムの種々の位置に有する（未解析）マウ ス胚性癌腫細胞株、Ｄ３。４クロ−ンが含まれる。 Ｉ-ＳceＩ部位を有する、他の細胞株とトランスジェニック動物の構築は、Ｉ- ＳceＩ部位を古典的な遺伝子置換により所望の遺伝子座の適切な場所に挿入する ことにより行える。如何なる動物または植物も先験的に使用して、Ｉ-ＳceＩ部 位を順応させろ細胞株中の、ゲノムの種々の位置に挿入することができる。本発 明は以下のようにして使用することができる： １.部位特異的遺伝子挿入 Ｉ-ＳceＩ部位を前もって組み込んでおくことにより、予め決めた位置に、種 々の遺伝子若しくはある遺伝子の変異体が挿入されている、限定されない数の細 胞株を産生することが、この方法により可能になる。よってこのような細胞株は 、表現型、リガンド、薬剤のスクリ−ニングに対して有益であり、また、該細胞 株がレトロウイルス産生に関してのトランス相補細胞株であるならば、組み換え レトロウイルスベクタの発現を、非常に高レベルで行うのに有益である。 上記のマウス細胞、またはヒトを含む、その他の脊椎動物由来の同等のものを 使用することが可能である。如何なる植物細胞も、その再生能力の有無に関わら ず、また繁殖性植物になるかどうかには関わらず培養して維持することが可能で ある。本方法はまた、トランスジェニック細胞にも使用可能である。 ２.部位特異的遺伝子発現 同様の細胞株と、導入遺伝子、種々の、プロモ−タ、制御因子、及び／または 構造遺伝子とを使用して、タンパク質、代謝物、またはその他の、生物学的もし くは生物工学的に興味ある化合物を産生することが可能である。遺伝子は常に、 染色体内の同じ位置に挿入される。トランスジェニック動物においては、複数の 薬剤、リガンド、または医用タンパク質の効果を組織特異的方法により試験する ことを可能にする。 ３.ゲノム遺伝子中のＣＦＴＲ遺伝子を挟む、相同性配列を利用した、Ｉ-Ｓce Ｉ認 識部位の、ＤＦＴＲ遺伝子座への挿入。Ｉ-ＳceＩ部位は、二重交差（double-cr ossingover）（Ｌe Ｍouellin et al.,ＰＮＡＳ,1990,Ｖol.87,4712-4716）によ る自発的遺伝子置換により挿入することが可能である。 ４.バイオメディカルの適用 Ａ.遺伝子治療では、患者由来の細胞をＩ-ＳceＩ含有レトロウイルスで 感染させ、欠失レトロウイルスの組み込みでスクリ−ニングし、次いでＩ-Ｓce Ｉ産生ベクタとドナ−配列とによる共形質転換が可能である。 適切な細胞の例には、造血組織、幹細胞、皮膚細胞、血管の内皮細胞、または 如何なる幹細胞が含まれる。 Ｉ-ＳceＩ含有レトロウイルスには、pＧ-ＭＰＬ,pＧＭtkＰＬ，または少なく とも一つのＩ-ＳceＩ部位を含んでいる、如何なるレトロウイルスベクタが含ま れる。 Ｉ-ＳceＩ産生ベクタには、pＣＭＶＩ-ＳceＩ（＋）、またはＩ-ＳceＩエンド ヌクレア−ゼの一過性発現を可能にする如何なるプラスミドが含まれる。 ドナ−配列には、(a)完全なＩＬ2遺伝子を含んだゲノム配列；(b)プレ−プロ インスリン遺伝子を含んだゲノム配列；(c)ヒトを含む、大部分の脊椎動物のゲ ノム配列で、遺伝子発現用のシス作用性配列を含むもの。修飾した細胞を次いで 、遺伝子治療に関して確立されたプロトコ−ルにそって、患者に再導入する。 Ｂ.Ｉ-ＳceＩ部位を有するプロモ−タ（すなわちＣＭＶ）を、幹細胞（すなわ ちリンパ球）へ挿入する。リンカ−（マルチクロ−ニング部位）を含むギャップ 修復分子を、ＣＭＶプロモ−タと下流の配列との間に挿入することができる。ド ナ−プラスミド中に存在する遺伝子（すなわちＩＬ-2遺伝子）の挿入は、Ｉ-Ｓc eＩメガヌクレア−ゼの発現（すなわちＩ-ＳceＩネガヌクレア−ゼ発現ベクタと の共形質転換）により効率的に行える。ＣＭＶプロモ−タ制御下にあるＩＬ-2遺 伝子の直接的 挿入により、ＩＬ-2を過剰に発現している幹細胞が直接的に選択される。 現在可能な系では、トランスジェニック細胞株の構築のため、レトロウイルス 感染を使用している、Ｉ-ＳceＩをゲノム内に導入する他の方法も使用可能であ り、これらにはＤＮＡのマイクロインジェクション、リン酸カルシウム誘導形質 転換、電気穿孔、リポフェクション、プロトプラスト若しくは細胞の融合、及び 細菌細胞接合が含まれる。 異型接合型の喪失は、次のようにして証明される： Ｉ-ＳceＩ部位を遺伝子座に導入し（外来配列とともに、または外来配列なし で）、細胞内で異型接合型を作りだす。修復ＤＮＡがないと、誘導される二本鎖 切断部は、非特異的エクソヌクレア−ゼにより伸長されて、娘染色分体の無傷の 配列によりギャップ修復され、よって、該細胞はこの遺伝子座に関して同型接合 型になる。 遺伝子治療の特異的例には、免疫調節（すなわちＩＬ遺伝子に関して、変化す る範囲と発現）；欠失遺伝子の置換；及びタンパク質の分泌（すなわち種々の分 泌タンパク質の、細胞小器官内での発現）が含まれる。 Ｉ-ＳceＩ誘導性の組み換えにより、in vivoで特異的遺伝子を活性化すること が可能である。Ｉ-ＳceＩ開裂部位は、遺伝子のタンデムな繰り返しでの二重化 部分の間に導入されていて、機能を喪失させている。エンドヌクレア−ゼＩ-Ｓc eＩの発現は、二つのコピ−の間の開裂を誘導する。組み換えによる補償が刺激 され、機能性遺伝子が生じる。 細胞株、または生物体の染色体の、部位特異的な遺伝的マクロ再構成 染色体の特異的転座、または欠失が、Ｉ-ＳceＩ開裂により誘導される。遺伝 子座挿入は、「古典的な遺伝子置換」により、染色体中の特異的な位置に一つ組 み込 むこことにより得られる。認識配列の、Ｉ-ＳceＩエンドヌクレア−ゼによる開 裂は、非致命的転座、または欠失とその後の末端連結により修復可能である。染 色体断片の欠失はまた、二つ以上のＩ-Ｓce-Ｉ部位を遺伝子座のフランキング領 域内に挿入することにより得られる（図３２を参照）。開裂は、組み換えにより 修復することが可能であり、上記の二つの部位の間の完全な領域が欠失する（図 ３２を参照）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ペリン、アルノー フランス国、エフ − 75014 パリ、ア ヴニュ・ピー − アペル 10 (72)発明者 デゥジョン、ベルナール フランス国、エフ − 91190 ジフ − スュール − イヴェット、リュ・ド ゥ・ラ・グリュリー ６ (72)発明者 ニコラ、ジャン−フランソワ フランス国、 エフ − 78590 ノワー ジー − ル − ロワ 、 シュマン・ ドゥ・ラ・スールス 39

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １.細胞中のＤＮＡに部位特異的に、二本鎖の切れ目を少なくとも一つ誘導す る、以下の工程を具備した方法： (a)少なくとも一つのＩ-ＳceＩ制限部位を具備した二本鎖ＤＮＡを有する細胞 を用意する； (b)メガヌクレア−ゼ（meganuclease）Ｉ-ＳceＩをコ−ドするＤＮＡを具備し た、少なくとも一つのプラスミドで前記の細胞を形質転換する；そして、 (c)少なくとも一つの、二本鎖の切れ目が誘導された細胞を選択する。 ２.前記の細胞が、哺乳類細胞、酵母細胞、及び植物細胞からなる群より選択 されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。 ３.前記の細胞が、Ｇ-ＭtkＰＬウイルスを有するＮＩＨ3Ｔ3細胞であることを 特徴とする、請求項２に記載の方法。 ４.前記のプラスミドがpＣＭＶ(Ｉ-ＳceＩ＋)であることを特徴とする、請求 項１に記載の方法。 ５.細胞の染色体ＤＮＡと、該細胞へ加えた外来ＤＮＡとの間での相同性組み 換えを誘導する、以下の工程を具備した方法： (a)少なくとも一つのＩ-ＳceＩ制限部位を具備した染色体ＤＮＡを有する細胞 を用意する； (b)外来性ＤＮＡを具備したプラスミドと、メガヌクレア−ゼ（meganuclease ）Ｉ-ＳceＩをコ−ドするＤＮＡを具備したプラスミドとで、前記の細胞を形質 転換する；そして、 (c)前記の外来ＤＮＡが、前記の染色体ＤＮＡに挿入された細胞を選択する。 ６.前記の細胞が、哺乳類細胞、酵母細胞、及び植物細胞からなる群より選択 さ れることを特徴とする、請求項５に記載の方法。 ７.前記の細胞が、Ｇ-ＭtkＰＬウイルスを有するＮＩＨ3Ｔ3細胞であることを 特徴とする、請求項６に記載の方法。 ８.前記のプラスミドがpＣＭＶ(Ｉ-ＳceＩ＋)であることを特徴とする、請求 項５に記載の方法。 ９細胞の染色体ＤＮＡと、該細胞へ加えた外来ＤＮＡとの間での相同性組み換 えを誘導する、以下の工程を具備した方法； (a)染色体ＤＮＡを具備した細胞を用意する； (b)少なくとも一つのＩ-ＳceＩ制限部位を前記の染色体ＤＮＡ内へ挿入する； (c)外来ＤＮＡを具備した第一プラスミドと、Ｉ-ＳceＩメガヌクレ−ゼをコ− ドするＤＮＡを具備した第二プラスミドとで、前記の細胞を形質転換する；そし て、 (d)前記の外来ＤＮＡが前記の染色体ＤＮＡに挿入されている細胞を選択する 。 １０.前記の細胞が、哺乳類細胞、酵母細胞、及び植物細胞よりなる群より選 択されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。 １１.前記の第一プラスミドがpＣＭＶ(Ｉ-ＳceＩ＋)であることを特徴とする 、請求項９に記載の方法。 １２.前記の第二のプラスミドがpＶＲneoであることを特徴とする、請求項９ に記載の方法。 １３.少なくとも一つの、部位特異的な切れ目をＤＮＡへ誘導し、ポリペプチ ドをコ−ドするＤＮＡを挿入する、以下の工程を具備した方法； (a)Ｉ-ＳceＩ制限部位と、前記のポリペプチドとを具備したＤＮＡで形質転換 することが可能であり、二本鎖ＤＮＡを有する細胞を用意する； (b)Ｓce-Ｉ酵素を加えるか、またはＳce-Ｉ酵素をコ−ドするＤＮＡで前記の 細胞を形質転換する； (c)前記のポリペプチドをコ−ドする前記のＤＮＡ、または前記のＤＮＡを有 するベクタで、前記の細胞を形質転換する；そして (d)前記のＤＮＡ、または前記のベクタで形質転換されていて、前記のポリペ プチドを発現する細胞を選択する。 １４.請求項１または１３の何れかに記載の方法で形質転換した、組み換え真 核細胞。 １５.請求項１または１３の何れかに記載の方法で形質転換した細胞を具備す る、トランスジェニック動物。 １６.Ｉ-ＳceＩ制限部位と、前記のポリペプチドをコ−ドするＤＮＡとを具備 したＤＮＡで、胚幹細胞を形質転換する工程、及び、 該胚幹細胞より得られたトランスジェニック動物内で、前記ポリペプチ ドの発現を検出する工程、 を具備したトランスジェニック動物内でポリペプチドを発現させる方法。 １７.Ｉ-ＳceＩ制限部位を具備したＤＮＡと、前記のポリペプチドを具備した ＤＮＡとで、以下の工程により形質転換される組み換え幹細胞： (a)前記の細胞へＳceＩ酵素を加えるか、または前記の細胞を、ＳcwＩ酵素を コ−ドする遺伝子を有するベクタえで形質転換する； (b)前記の細胞を前記のポリペプチドをコ−ドする前記ＤＮＡで形質転換する ； (c)前記のＤＮＡで形質転換され、前記のポリペプチドを発現している細胞を 選択する。 １８.前記のポリペプチドが細胞に対して外来抗原であることを特徴とする、 請 求項４または７の何れかに記載の、組み換え真核細胞。 １９.前記の細胞が、哺乳類細胞株であることを特徴とする、請求項１４に記 載の組み換え真核細胞。 ２０.前記の細胞が酵母であることを特徴する、請求項１４に記載の組み換え 真核細胞。 ２１.少なくとも一つのタンパク質産物を発現する細胞のＤＮＡ中に少なくと も一つの、部位特異的な切れ目を誘導し、ポリペプチドをコ−ドするＤＮＡを挿 入する、以下の工程を具備した方法； (a)Ｉ-ＳceＩ制限部位を具備したＤＮＡ、及び前記のポリペプチドをコ−ドす るＤＮＡにより形質転換することが可能である、二本鎖ＤＮＡを有した細胞を用 意する； (b)前記の細胞へＳceＩ酵素を加えるか、またはＳceＩ酵素をコ−ドしたＤＮ Ａで該細胞を形質転換する； (c)前記のポリペプチドをコ−ドした前記ＤＮＡ、または該ＤＮＡを有するベ クタで前記の細胞を形質転換する；そして (d)前記のＤＮＡ、または前記のベクタで形質転換され、前記のポリペプチド を発現するが前記のタンパク産物は発現しないことを特徴とする細胞を選択する 。 ２２.請求項２１に記載の方法により形質転換した組み換え細胞。