JP2022551286A - α－シヌクレイン発現を抑制するためのジンクフィンガータンパク質転写因子 - Google Patents
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Abstract
本開示は、神経系におけるα－シヌクレインの発現を阻害するジンクフィンガー融合タンパク質、およびパーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、アルツハイマー病、および他の神経変性疾患を治療するための前記タンパク質の使用方法を提供する。【選択図】なし
Description
関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年１０月２日に提出した米国仮出願６２／９０９，４９６、および２０２０年１月９日に提出した米国仮出願６２／９５９，１５３に基づく優先権を主張する。前記仮出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年１０月２日に提出した米国仮出願６２／９０９，４９６、および２０２０年１月９日に提出した米国仮出願６２／９５９，１５３に基づく優先権を主張する。前記仮出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。上記のＡＳＣＩＩコピーは、２０２０年１０月１日に作成され025297_WO011_SL.txtという名称であり、サイズは１２１，４６８バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。上記のＡＳＣＩＩコピーは、２０２０年１０月１日に作成され025297_WO011_SL.txtという名称であり、サイズは１２１，４６８バイトである。
発明の背景
パーキンソン病（ＰＤ）は、運動障害を特徴とする神経変性疾患である。ＰＤ患者の約５０％が最終的に認知症を発症する。ＰＤは、アルツハイマー病に次いで２番目に多い神経変性疾患である。米国では、約１００万人のＰＤ患者がおり、毎年５０，０００～６０，０００人の新しい症例がある。散発的な形態のＰＤは、典型的な発症年齢が６０～７０歳である。一般に、最初の診断からＰＤ合併症による死亡まで１５～２０年の期間である。
パーキンソン病（ＰＤ）は、運動障害を特徴とする神経変性疾患である。ＰＤ患者の約５０％が最終的に認知症を発症する。ＰＤは、アルツハイマー病に次いで２番目に多い神経変性疾患である。米国では、約１００万人のＰＤ患者がおり、毎年５０，０００～６０，０００人の新しい症例がある。散発的な形態のＰＤは、典型的な発症年齢が６０～７０歳である。一般に、最初の診断からＰＤ合併症による死亡まで１５～２０年の期間である。
パーキンソン病の患者は、動作緩慢、硬直、前屈姿勢、仮面状表情、体幹の前傾、腕の振りの減少、肘、手首、腰および膝の屈曲、姿勢の不安定性、安静時の四肢の震え、ならびに足を引きずる短い歩き方などの様々な運動症状を示す。患者はまた、無嗅覚症、睡眠障害、腸運動の低下、神経障害性疼痛、および認知症を含む非運動症状を示すことが多い。例えば、Jeanjean and Aubert, Lancet(2011)378(9805):1773-4; Kalia and Lang, Lancet(2015)386(9996):896-912を参照のこと。
ＰＤ患者の脳は、黒質と呼ばれる領域におけるドーパミン産生（ドーパミン作動性）ニューロンが失われることによって特徴付けられる。ＰＤ患者の脳はまた、ニューロン内に形成されたタンパク質凝集体または凝集塊であるレビー小体、およびレビー小体に類似したタンパク質凝集体を含む神経突起（ニューロンの突起）であるレビー神経突起の存在によって特徴付けられる。レビー小体は、１９１２年にフリードリッヒ・レビーによってＰＤ患者の脳で最初に発見され、その後、α－シヌクレインの凝集した不溶性の形態の原線維を含むことが知見された（Goedert and Spillantini, MolPsychiatry (1998)3(6):462-5; Spillantini et al., NeurosciLett.(1998)251(3):205-8; Spillantini et al., Nature(1997)388(6645):839-40）。α－シヌクレイン遺伝子（ＳＮＣＡ）の変異は、１９９７年にＰＤに罹患している家族で同定された（例えば、Polymeropoulos et al., Science(1997)276(5321):2045-7を参照のこと）。その後、ＳＮＣＡ遺伝子の二重化および三重化、ならびにα－シヌクレインのさらなる点変異が、ＰＤの遺伝的または家族性の形態と相関することが示された。さらに、α－シヌクレインの発現レベルを制御するゲノムの一部の変化は、大規模な偏りのない集団研究（ゲノムワイド関連解析、ＧＷＡＳ）においてＰＤのリスクの増加と関連することが示された。
α－シヌクレインは、ニューロンのシナプス前終末における小胞放出に関連する膜結合タンパク質である。また、ＤＮＡ修復においても重要でありうる。成熟α－シヌクレインは、ＮＡＣ（アルツハイマー病アミロイドの非Ａ－ベータ成分）領域として知られる疎水性アミノ酸を含む中央コア領域（残基６１－９５）を有する小さな１４ｋＤタンパク質である。ＮＡＣは、タンパク質凝集の一因である。ミスフォールドされたα－シヌクレインポリペプチドは、オリゴマーとプロトフィブリルに凝集し、次いでそれらが一緒になって、レビー小体で見られる大きな不溶性の凝集体を形成する。蓄積された証拠により、α－シヌクレインのミスフォールティングと凝集は、ＰＤで発生する細胞損傷において中心的な役割を果たし、最終的に黒質のニューロン死に引き起こすことが示されている。さらに、α－シヌクレインのより小さな凝集体は、プリオン病で見られるものと同様に、細胞から細胞へと移動し、脳全体に広がることが示されている。α－シヌクレイン凝集を阻害すると、ニューロンへの損傷が減少し、ＰＤの進行が遅くなるか、停止することさえある。
α-シヌクレインのレベルを下げるための現在のアプローチには、α－シヌクレインをＲＮＡレベルで標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、および細胞外のα－シヌクレインの特定の３Ｄ形態または立体構造を標的とするモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の使用が含まれる。しかしながら、α－シヌクレインを標的とすることによるＰＤを治療する臨床的に有効な方法の緊急の必要性が存在する。
本開示は、ヒトＳＮＣＡ遺伝子またはその付近の部位を標的とするジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインを提供する。本開示のＺＦＰドメインは、転写因子に融合されることにより、ヒトＳＮＣＡ遺伝子の発現をＤＮＡレベルで特異的に阻害させうる。これらの融合タンパク質には、（ｉ）ＳＮＣＡ遺伝子における標的領域に特異的に結合するＺＦＰドメインおよび（ｉｉ）前記遺伝子の転写を低下させる転写リプレッサードメインが含まれる。
１の態様において、本開示は、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインおよび転写リプレッサードメインを含む融合タンパク質であって、前記ＺＦＰドメインが、ヒトα－シヌクレイン遺伝子（ＳＮＣＡ遺伝子）の標的領域に結合する、融合タンパク質を提供する。ある実施態様において、標的領域（すなわち、標的部位）は、ＳＮＣＡ遺伝子における転写開始部位（ＴＳＳ、例えば、ＴＳＳ１、２ａ、または２ｂ）の約１ｋｂ以内である。さらなる実施態様において、標的領域は、図２Ｂおよび／または４に示されるように、ＴＳＳ２ａの上流約５００ｂｐ以内、ＴＳＳ２ｂの下流約５００ｂｐ以内、および／またはＴＳＳ１の上流または下流約５００ｂｐ以内にある。標的領域の非限定的な例を表１に示す。
ある実施態様において、融合タンパク質は、１個またはそれ以上（例えば、２個、３個、４個、５個、または６個）のジンクフィンガーを含む。それは、ＳＮＣＡ遺伝子の発現を、好ましくは、検出可能なオフターゲット結合または活性がないか、または最小において（例えば、ＳＮＣＡ遺伝子ではない遺伝子への結合）、少なくとも約４０％、７５％、９０％、９５％、または９９％まで抑制する。ジンクフィンガードメインの非限定的な例を表１に示す。ある実施態様において、融合タンパク質は、表１に示される１つまたはそれ以上の認識ヘリックス配列を含む。さらなる実施態様において、融合タンパク質は、示される主な変異を伴うか、または伴わず、表の一行からのいくつかまたは全ての認識ヘリックス配列を含む。特定の実施態様において、融合タンパク質は、表２に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、融合タンパク質の転写リプレッサードメインは、ＫＯＸ１タンパク質のＫＲＡＢドメインに由来する。ジンクフィンガードメインは、ペプチドリンカーを介して転写リプレッサードメインに結合されうる。別の態様において、本開示は、本融合タンパク質のコーディング配列を含む核酸構築物であって、前記コーディング配列が、転写調節エレメント、例えば、脳細胞において構成的に活性または誘導性である哺乳動物プロモーターなどに作動可能に連結されており、前記プロモーターが、適宜、ヒトシナプシンＩプロモーターである、核酸構築物を提供する。本開示はまた、核酸構築物を含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、ヒト細胞、例えば、脳細胞または多能性幹細胞などであって、前記幹細胞は、適宜、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
別の態様において、本開示は、ヒト脳細胞におけるα-シヌクレインの発現を阻害するための方法であって、本融合タンパク質を前記細胞に導入し（例えば、核酸構築物または組換えウイルス、例えば、ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ９、またはそれらのハイブリッド）を導入することにより）、それにより前記細胞におけるα-シヌクレインの発現を阻害することを含む方法を提供する。脳細胞は、ニューロン、グリア細胞、上衣細胞、または神経上皮細胞であってもよい。細胞は、パーキンソン病、レビー小体型認知症、アルツハイマー病、多系統萎縮症、またはその他のシヌクレイン病に罹患しているか、または発症するリスクがある患者の脳内にありうる。
本開示はまた、患者におけるシヌクレイン病を治療する（例えば、進行を遅らせる）ための方法であって、本開示の融合タンパク質をコードする組換えＡＡＶを前記患者に投与することを含む方法を提供する。ある実施態様において、ＡＡＶは、静脈内、髄腔内、脳室内、大槽内、線条体内、または黒質内注射、あるいはいずれかの脳領域への注射を介して患者に導入される。患者は、パーキンソン病、レビー小体型認知症、アルツハイマー病、または多系統萎縮症に罹患していてもよい。
本開示はまた、上記方法で使用するための融合タンパク質、および上記方法で使用するための薬剤の製造における本融合タンパク質の使用を提供する。
本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明で明らかである。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施形態および態様を示しているが、限定ではなく、例示としてのみ供されることが理解されるべきである。本発明の範囲内の様々な変更および改変は、詳細な説明から当業者には明らかである。
発明の詳細な説明
本開示は、ヒトＳＮＣＡ遺伝子内またはその近くの部位（すなわち、配列）を標的とするＺＦＰドメインを提供する。本明細書に記載されるＺＦＰドメインは、別の機能的な分子またはドメインに結合し、または融合されうる。本開示のＺＦＰドメインは、転写因子に融合されて、ヒトＳＮＣＡ遺伝子のＲＮＡへの転写を抑制しうる。融合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ－ＴＦ）と称される。これらのＺＦＰ－ＴＦは、ＳＮＣＡ遺伝子内またはその近くの標的領域に特異的に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインおよび前記遺伝子の転写を低下させる転写リプレッサードメインを含む。ＺＦＰ－ＴＦを患者の脳に導入することによってニューロンのα－シヌクレインのレベルを下げると、α－シヌクレインのオリゴマー（より小さな可溶性凝集体）または原線維（より大きな不溶性）形態への集合を阻害（例えば、減少または停止）することが期待される。α－シヌクレインの凝集が減少すると、脳細胞は、細胞の品質管理機構を用いて、ミスフォールされた毒性形態のα－シヌクレインを適時に除去しうる。その結果として、α－シヌクレインの凝集および細胞間増殖が減少され、または阻止される。
本開示は、ヒトＳＮＣＡ遺伝子内またはその近くの部位（すなわち、配列）を標的とするＺＦＰドメインを提供する。本明細書に記載されるＺＦＰドメインは、別の機能的な分子またはドメインに結合し、または融合されうる。本開示のＺＦＰドメインは、転写因子に融合されて、ヒトＳＮＣＡ遺伝子のＲＮＡへの転写を抑制しうる。融合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ－ＴＦ）と称される。これらのＺＦＰ－ＴＦは、ＳＮＣＡ遺伝子内またはその近くの標的領域に特異的に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインおよび前記遺伝子の転写を低下させる転写リプレッサードメインを含む。ＺＦＰ－ＴＦを患者の脳に導入することによってニューロンのα－シヌクレインのレベルを下げると、α－シヌクレインのオリゴマー（より小さな可溶性凝集体）または原線維（より大きな不溶性）形態への集合を阻害（例えば、減少または停止）することが期待される。α－シヌクレインの凝集が減少すると、脳細胞は、細胞の品質管理機構を用いて、ミスフォールされた毒性形態のα－シヌクレインを適時に除去しうる。その結果として、α－シヌクレインの凝集および細胞間増殖が減少され、または阻止される。
α－シヌクレイン阻害に対する我々のＺＦＰ－ＴＦアプローチには、他の人によって試験されている現在のアプローチに比べていくつかの利点がある。ＺＦＰ－ＴＦは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）で報告されているものよりも高いレベルのα－シヌクレイン抑制を達成できる（例えば、Luna et al., ActaNeuropathol. (2018)135(6):855-75（ＡＳＯによる７５％未満のＳＮＣＡ阻害を示す）を参照すること）。さらに、ＺＦＰ－ＴＦは、（患者にＺＦＰ－ＴＦ発現構築物を導入することによって）一度だけ投与することが必要となりうるが、ＡＳＯは反復投与を必要とする。さらに、ＺＦＰ－ＴＦアプローチのみが、各細胞のゲノムにおけるＳＮＣＡ遺伝子の２つの対立遺伝子を使用することが必要となる。対照的に、ＡＳＯは、各細胞におけるＳＮＣＡのｍＲＮＡの多数のコピーを使用することが必要とされる。
我々のＺＦＰ－ＴＦアプローチは、抗体がα－シヌクレインの形態または立体構造の部分セットにしか結合できないため、前記抗体アプローチよりも有益である。これは、強力な治療効果には十分ではありえない。対照的に、ＺＦＰ－ＴＦは、α－シヌクレインの発現をＤＮＡレベルで抑制し、α－シヌクレインの全ての形態のレベルを低下させる。したがって、ＺＦＰ－ＴＦは、抗体とは異なり、毒性種の形態にとらわれない。さらに、抗体は細胞上または外のα－シヌクレインに主に作用すると考えられているが、ＺＦＰ－ＴＦは細胞内のα－シヌクレインを直接的に減少させ、および細胞外のα－シヌクレインレベルを間接的に低下させることができる。よって、α－シヌクレインは、主に細胞内タンパク質であるため、ＺＦＰ－ＴＦアプローチはより効果的であることが予想される。さらに、抗体は反復投与を必要とするが、ＺＦＰ－ＴＦはそれらの発現構築物の１回の送達のみを必要とする。
Ｉ．ＺＦＰドメインの標的
本発明の融合タンパク質のＺＦＰドメインは、ヒトＳＮＣＡ遺伝子内またはその近くの標的領域に特異的に結合する。図１は、ＺＦＰドメインの標的ＳＮＣＡ遺伝子配列への結合を示す。図中のＺＦＰドメインは６個のジンクフィンガーを有するが、以下でさらに記載されるように、より少ないか、またはより多いジンクフィンガーを有するＺＦＰドメインを使用することができる。
本発明の融合タンパク質のＺＦＰドメインは、ヒトＳＮＣＡ遺伝子内またはその近くの標的領域に特異的に結合する。図１は、ＺＦＰドメインの標的ＳＮＣＡ遺伝子配列への結合を示す。図中のＺＦＰドメインは６個のジンクフィンガーを有するが、以下でさらに記載されるように、より少ないか、またはより多いジンクフィンガーを有するＺＦＰドメインを使用することができる。
ヒトＳＮＣＡ遺伝子は、約１１７ｋｂに及び、ｃｈｒ４：８９，７２４，０９９－８９，８３８，３１５（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）にマッピングされている。そのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿０００００４バージョン０００００４．１２で入手可能である。前記遺伝子は、７つのエクソン（２つの非タンパク質コーディングおよび５つのタンパク質コーディング）を有し、各転写産物は、５つのイントロンを有する（図２Ａ）。前記遺伝子には３つの転写開始部位（ＴＳＳ）があり、１つはエクソン１の先頭にあり、２つはエクソン２にあり、それによりエクソン２ａおよび２ｂを発現する。最初のタンパク質をコードするエクソンはエクソン３である。Touchman et al., GenomeRes.(2001)11:78-86もまた参照のこと。ヒトα－シヌクレインのアイソフォーム１（全長）を以下に示す。
MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH
GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL
GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA(配列番号１; P37840-1)
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アイソフォーム２～４は、アミノ酸残基１０３～１３０が欠損している点でアイソフォーム１とは異なる。アイソフォーム２～５は、アミノ酸残基４１～５４が欠損している点でアイソフォーム１とは異なる。α－シヌクレインの遺伝子分析は、遺伝子コピーの増幅（例えば、Brueggemann et al., Neurology(2008)71:1294; Troiano et al., Neurology(2008)71:1295; Uchiyama et al., Neurology( 2008)71:1289-90）およびＰＤやレビー小体型認知症などのシヌクレイン病の潜在的な原因としての特定の点変異を示す。例えば、下記のα－シヌクレイン点変異が一部のＰＤ患者で同定されている：Ａ３０Ｐ（Kruger et al., NatureGenet.(1998)18:106-8）；Ｅ４６Ｋ（Zarranz et al., AnnNeurol.(2004)55:164-73; Choi et al., FEBSLett.(2004)576:363-8）；Ｈ５０Ｑ（Khalaf et al., J Biol Chem.(2014)289:21856-76）；Ｇ５１Ｄ（Lesage et al., AnnNeurol.(2013)73:459-71）；およびＡ５３Ｔ（Polymeropoulos et al., Science(1997)276:2045-7）。
ＺＦＰ－ＴＦのＤＮＡ結合ＺＦＰドメインは、融合タンパク質をＳＮＣＡ遺伝子の標的領域に向け、融合タンパク質の転写リプレッサードメインを標的領域にもたらす。次いで、リプレッサードメインは、ＲＮＡポリメラーゼによるＳＮＣＡ遺伝子の転写を抑制する。ＺＦＰ－ＴＦの標的領域は、遺伝子発現の抑制を可能にするＳＮＣＡ遺伝子内またはその近くのいずれかの適切な部位でありうる。一例として、前記標的領域は、ＳＮＣＡ ＴＳＳまたはＳＮＣＡ転写調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、ＲＮＡポリメラーゼ停止部位など）を（下流または上流のいずれかに）含むか、またはそれらに隣接する。
上記のように、ヒトＳＮＣＡ遺伝子は、３つの転写開始部位（ＴＳＳ）を有する。それらは、５’から３’に、ＴＳＳ１、ＴＳＳ２ａ、およびＴＳＳ２ｂであり、エクソン１（ＴＳＳ１）、エクソン２ａ、およびエクソン２ｂ（ＴＳＳ２ａおよび２ｂ）の５’末端に位置している（図２Ｂ）。３つのＴＳＳにおける転写により、長さが異なるＲＮＡアイソフォームが生成される。しかしながら、α－シヌクレインの翻訳がエクソン３で開始するため、異なるＴＳＳから生成されるＲＮＡは、同一のタンパク質を形成する。ある実施態様において、本ＺＦＰ－ＴＦのゲノム標的領域は、ＴＳＳ１（例えば、塩基対５２９～１５２９）またはＴＳＳ２ａおよび２ｂ（例えば、塩基対１６１３～２９４９）に及ぶか、またはその近くにある。特定の実施態様において、前記標的領域は、ＴＳＳ１の上流または下流約５００ｂｐ以内、および／またはＴＳＳ２ａの上流または下流約５００ｂｐ以内、および／またはＴＳＳ２ｂの上流または下流約５００ｂｐ以内である。
ある実施態様において、ゲノム標的領域は、少なくとも８ｂｐの長さである。例えば、標的領域は、８ｂｐから４０ｂｐの長さ、例えば、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、または３６ｂｐの長さであってもよい。標的配列は、遺伝子のセンス鎖、または遺伝子のアンチセンス鎖上にありうる。標的化の正確性を確保し、ＺＦＰ－ＴＦによるオフターゲット結合または活性を減少させるために、選択されるＳＮＣＡ標的領域の配列は、好ましくは、他の遺伝子の配列に対して７５％未満の相同性（例えば、７０％未満、６５％未満、６０％、または５０％未満）を有する。特定の実施態様において、本発明のＺＦＰ－ＴＦの標的領域は、１５～１８ｂｐの長さであり、ＴＳＳ１、２ａ、または２ｂの５００ｂｐ以内に存在する。標的領域の例を図２Ｂおよび表１に示す。
ある実施態様において、本発明の操作されたＺＦＰは、好ましくは、検出可能なオフターゲット結合または活性を全くまたはほとんど伴わず、表１の一行に示される標的部位（すなわち、結合配列）に結合する。
標的部分をさらに評価するための他の基準には、このような部分または関連部分に結合するＺＦＰの過去の利用可能性、所定の標的部分に結合する新規ＺＦＰを設定するための容易性、およびオフターゲット結合のリスクが含まれる。
ＩＩ．ＺＦＰドメイン
「ジンクフィンガータンパク質」または「ＺＦＰ」は、亜鉛によって安定化されるＤＮＡ結合ドメインを有するタンパク質を意味する。ＺＦＰは、配列特異的な方法でＤＮＡに結合する。ＺＦＰの各ＤＮＡ結合ユニットは、ジンク「フィンガー」と呼ばれる。各フィンガーは、典型的に、７つのアミノ酸残基で構成され、ＤＮＡ結合の特異性を決定するＤＮＡ結合「認識ヘリックス」を含有する。ＺＦＰドメインは、少なくとも１つのフィンガーを有し、各フィンガーは、２～４塩基対のＤＮＡ、典型的には、３または４塩基対のＤＮＡに結合する。各ジンクフィンガーは、典型的には、約３０個のアミノ酸およびキレート亜鉛で構成される。操作されたＺＦＰは、天然に存在するＺＦＰと比較して、新規の結合特異性を有することができる。操作方法には、以下に限定されないが、合理的な設計および様々な種類の選択が含まれる。合理的な設計には、例えば、トリプレット（またはクアドラプレット）ヌクレオチド配列および各ジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用が含まれ、各トリプレットまたはクアドラプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドラプレット配列に結合するジンクフィンガーの１つまたはそれ以上のアミノ酸配列に関連するものである。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，１４０，０８１号；第６，２００，７５９号；第６，４５３，２４２号；第６，５３４，２６１号；第６，９７９，５３９号；および第８，５８６，５２６号；および国際特許公開ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０；ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０１６５３６；ＷＯ０２／０９９０８４；およびＷＯ０３／０１６４９６に詳細に記載されるＺＦＰ設計方法を参照のこと。本明細書に記載されるＺＦＰドメインは、別の分子、例えば、タンパク質に結合され、または融合されていてもよい。このようなＺＦＰ融合物は、遺伝子活性化（例えば、活性化ドメイン）、遺伝子抑制（例えば、抑制ドメイン）、リガンド結合（例えば、リガンド結合ドメイン）、ハイスループットスクリーニング（例えば、リガンド結合ドメイン）、超変異の局所化（例えば、活性化誘導シチジンデアミナーゼドメイン）、クロマチン修飾（例えば、ヒストンデアセチラーゼドメイン）、組換え（例えば、リコンビナーゼドメイン）、標的化されたインテグレーション（例えば、インテグラーゼドメイン）、ＤＮＡ修飾（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメイン）、塩基エディッション（例、塩基エディタードメイン）、またはターゲットＤＮＡ切断（例えば、ヌクレアーゼドメイン）を可能にするドメインを含んでいてもよい。操作されたＺＦＰドメインの例を表１に示す。
「ジンクフィンガータンパク質」または「ＺＦＰ」は、亜鉛によって安定化されるＤＮＡ結合ドメインを有するタンパク質を意味する。ＺＦＰは、配列特異的な方法でＤＮＡに結合する。ＺＦＰの各ＤＮＡ結合ユニットは、ジンク「フィンガー」と呼ばれる。各フィンガーは、典型的に、７つのアミノ酸残基で構成され、ＤＮＡ結合の特異性を決定するＤＮＡ結合「認識ヘリックス」を含有する。ＺＦＰドメインは、少なくとも１つのフィンガーを有し、各フィンガーは、２～４塩基対のＤＮＡ、典型的には、３または４塩基対のＤＮＡに結合する。各ジンクフィンガーは、典型的には、約３０個のアミノ酸およびキレート亜鉛で構成される。操作されたＺＦＰは、天然に存在するＺＦＰと比較して、新規の結合特異性を有することができる。操作方法には、以下に限定されないが、合理的な設計および様々な種類の選択が含まれる。合理的な設計には、例えば、トリプレット（またはクアドラプレット）ヌクレオチド配列および各ジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用が含まれ、各トリプレットまたはクアドラプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドラプレット配列に結合するジンクフィンガーの１つまたはそれ以上のアミノ酸配列に関連するものである。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，１４０，０８１号；第６，２００，７５９号；第６，４５３，２４２号；第６，５３４，２６１号；第６，９７９，５３９号；および第８，５８６，５２６号；および国際特許公開ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０；ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０１６５３６；ＷＯ０２／０９９０８４；およびＷＯ０３／０１６４９６に詳細に記載されるＺＦＰ設計方法を参照のこと。本明細書に記載されるＺＦＰドメインは、別の分子、例えば、タンパク質に結合され、または融合されていてもよい。このようなＺＦＰ融合物は、遺伝子活性化（例えば、活性化ドメイン）、遺伝子抑制（例えば、抑制ドメイン）、リガンド結合（例えば、リガンド結合ドメイン）、ハイスループットスクリーニング（例えば、リガンド結合ドメイン）、超変異の局所化（例えば、活性化誘導シチジンデアミナーゼドメイン）、クロマチン修飾（例えば、ヒストンデアセチラーゼドメイン）、組換え（例えば、リコンビナーゼドメイン）、標的化されたインテグレーション（例えば、インテグラーゼドメイン）、ＤＮＡ修飾（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメイン）、塩基エディッション（例、塩基エディタードメイン）、またはターゲットＤＮＡ切断（例えば、ヌクレアーゼドメイン）を可能にするドメインを含んでいてもよい。操作されたＺＦＰドメインの例を表１に示す。
本発明の操作されたＺＦＰ融合タンパク質のＺＦＰドメインは、少なくとも１個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、またはそれ以上）のジンクフィンガーを含んでいてもよい。１個のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、典型的に、３個または４個のヌクレオチドを含む標的部位を認識する。２個のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、典型的に、６個または８個のヌクレオチドを含む標的部位を認識する。３個のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、典型的に、９個または１２個のヌクレオチドを含む標的部位を認識する。４個のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、典型的に、１２～１５個のヌクレオチドを含む標的部位を認識する。５個のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、典型的に、１５～１８個のヌクレオチドを含む標的部位を認識する。６個のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、１８～２１個のヌクレオチドを含む標的部位を認識することができる。
ある実施態様において、本発明の操作されたＺＦＰは、表１に示されるＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。例えば、操作されたＺＦＰは、表１に示されるように、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、またはＦ６の配列を含みうる。
ある実施態様において、本発明の操作されたＺＦＰは、表１の一行に示される２つの隣接するＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。例えば、操作されたＺＦＰは、表１の一行に示されるＦ１－Ｆ２、Ｆ２－Ｆ３、Ｆ３－Ｆ４、Ｆ４－Ｆ５、またはＦ５－Ｆ６の配列を含みうる。
ある実施態様において、本発明の操作されたＺＦＰは、表１の一行に示されるＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。例えば、操作されたＺＦＰは、表１の一行に示されるＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、およびＦ６（例えば、Ｆ１～Ｆ６）の配列を含みうる。
ＺＦＰドメインの標的特異性は、例えば、米国特許第２０１８／００８７０７２号に記載されるＺＦＰ骨格配列に対する変異によって改善されうる。前記変異には、ＤＮＡ骨格上のリン酸と非特異的に相互作用することができるがヌクレオチド標的特異性には関連しないＺＦＰ骨格の残基に対してなされた変異が含まれる。ある実施態様において、これらの変異には、カチオン性アミノ酸残基を中性またはアニオン性アミノ酸残基に変異させることが含まれる。ある実施態様において、これらの変異には、極性アミノ酸残基を中性または非極性アミノ酸残基に変異させることが含まれる。さらなる実施態様において、変異は、ＤＮＡ結合ヘリックスに対して位置（－５）、（－９）および／または（－１４）で行われる。ある実施態様において、ジンクフィンガーは、位置（－５）、（－９）および／または（－１４）において１つまたはそれ以上の変異を含んでいてもよい。さらなる実施態様において、マルチフィンガーＺＦＰドメインにおける１つまたはそれ以上のジンクフィンガーは、位置（－５）、（－９）および／または（－１４）における変異を含みうる。ある実施態様において、位置（－５）、（－９）および／または（－１４）におけるアミノ酸（例えば、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ））は、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン酸（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、チロシン（Ｙ）、および／またはグルタミン（Ｑ）において変異を有する。１個、２個、または３個の骨格変異を有する操作されたＺＦＰの例を図４および５ならびに表１および２に示す。表１中の記号「＾」は、示される認識ヘリックスの１番目のアミノ酸の４位上流のアルギニン（Ｒ）残基がグルタミン（Ｑ）に変化されていることを示す。各認識ヘリックス配列では、７個のＤＮＡ結合アミノ酸の位置に－１、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、および＋６の番号が付けられている。よって、ＲからＱへの置換の位置は（－５）として番号付けされる。
ある実施態様において、本発明の操作されたＺＦＰは、表１に示されるように、ＤＮＡ結合認識ヘリックス配列および関連する骨格変異を含む。ある実施態様において、本発明の操作されたＺＦＰは、表１の一行に示されるように、ＤＮＡ結合認識ヘリックス配列および関連する骨格変異を含む。
ある実施態様において、本明細書に記載の操作されたＺＦＰは、表２の一行に示される配列の認識ヘリックスおよび骨格部分を含む。ある実施態様において、本明細書に記載の操作されたＺＦＰは、翻訳後修飾後に配列が現れるので、表２の一行に示される配列の認識ヘリックスおよび骨格部分を含む。例えば、翻訳後修飾は、表２に示すように、配列から開始因子メチオニン残基を除去していてもよい。
ある実施態様において、本発明のＺＦＰ－ＴＦは、１個またはそれ以上のジンクフィンガードメインを含む。前記ドメインは、例えば、１つのドメインが、１個またはそれ以上（例えば、４個、５個、または６個）のジンクフィンガーを含み、別のドメインが、さらに１個またはそれ以上（例えば、４個、５個、または６個）のジンクフィンガーを含むように、伸長可能な可撓性リンカーを介して一緒に連結されていてもよい。ある実施態様において、前記リンカーは、フィンガーアレイが、８個、９個、１０個、１１個または１２個またはそれ以上のフィンガーを含む１個のＤＮＡ結合ドメインを含むような、標準的なフィンガー間リンカーである。他の実施態様において、前記リンカーは、可撓性リンカーなどの非定型リンカーである。例えば、２つのＺＦＰドメインは、構造（Ｎ末端からＣ末端まで）ＺＦＰ－ＺＦＰ－ＴＦ、ＴＦ－ＺＦＰ－ＺＦＰ、ＺＦＰ－ＴＦ－ＺＦＰ、またはＺＦＰ－ＴＦ－ＺＦＰ－ＴＦにおける転写リプレッサーＴＦに連結されていてもよい（２つのＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質はリンカーを介して融合される）。
ある実施態様において、ＺＦＰ－ＴＦは、「ツーハンド（two-handed）」、すなわち、それらは、介在するアミノ酸によって分離された２つのジンクフィンガークラスター（２つのＺＦＰドメイン）を含み、前記２つのＺＦＰドメインが２つの不連続な標的部位に結合している。ツーハンドタイプのジンクフィンガー結合タンパク質の例は、ＳＩＰ１であり、４個のジンクフィンガーのクラスターがタンパク質のアミノ末端に位置し、３個のフィンガーのクラスターがカルボキシル末端に位置している（Remacleetal., EMBO J.(1999)18(18):5073-84）。これらのタンパク質におけるジンクフィンガーの各クラスターは、固有の標的配列に結合することができ、２個の標的配列間の間隔は多くのヌクレオチドを含むことができる。
あるいは、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来していてもよい。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼ、例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、およびＩ－ＴｅｖＩＩＩなどの認識配列が知られている。米国特許第５，４２０，０３２号および第６，８３３，２５２号；Belfort et al., NucleicAcidsRes.(1997)25:3379-88; Dujon et al., Gene(1989)82:115-8; Perler et al., NucleicAcidsRes.(1994)22:1125-7; Jasin, Trends Genet(1996)12:224-8; Gimble et al., JMolBiol.(1996)263:163-80; Argast et al., JMolBiol.(1998)280:345-53；ならびにニューイングランドバイオラボのカタログなども参照のこと。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然の標的部位に結合するように操作することができる。例えば、Chevalier et al., Mol Cell(2002)10:895-905; Epinat et al., NucleicAcidsRes.(2003)31:2952-62; Ashworth et al., Nature(2006)441:656-59; Paques et al., Current Gene Therapy(2007)7:49-66;および米国特許公報第２００７／０１１７１２８号を参照のこと。
ＩＩＩ．ジンクフィンガータンパク質転写因子
本明細書に記載のＺＦＰドメインは、転写因子に融合されていてもよい。ある実施態様において、本発明の融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインおよび転写因子ドメイン（すなわち、ＺＦＰ－ＴＦ）を含む。ある実施態様において、前記転写因子は、転写リプレッサードメインであって、前記ＺＦＰおよびリプレッサードメインは、直接ペプチジル結合またはペプチドリンカーによって、または二量体化によって（例えば、ロイシンジッパー、ＳＴＡＴタンパク質Ｎ末端ドメイン、またはＦＫ５０６結合タンパク質を介して）相互に結合していてもよい。本明細書で用いられるように、「融合タンパク質」は、共有結合したドメインを有するポリペプチド、ならびに非共有結合を介して相互に結合されたポリペプチドの複合体を意味する。転写リプレッサードメインは、ＺＦＰドメインのＣ末端またはＮ末端を含むいずれかの適切な位置でＺＦＰドメインと結合することができる。
本明細書に記載のＺＦＰドメインは、転写因子に融合されていてもよい。ある実施態様において、本発明の融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインおよび転写因子ドメイン（すなわち、ＺＦＰ－ＴＦ）を含む。ある実施態様において、前記転写因子は、転写リプレッサードメインであって、前記ＺＦＰおよびリプレッサードメインは、直接ペプチジル結合またはペプチドリンカーによって、または二量体化によって（例えば、ロイシンジッパー、ＳＴＡＴタンパク質Ｎ末端ドメイン、またはＦＫ５０６結合タンパク質を介して）相互に結合していてもよい。本明細書で用いられるように、「融合タンパク質」は、共有結合したドメインを有するポリペプチド、ならびに非共有結合を介して相互に結合されたポリペプチドの複合体を意味する。転写リプレッサードメインは、ＺＦＰドメインのＣ末端またはＮ末端を含むいずれかの適切な位置でＺＦＰドメインと結合することができる。
ある実施態様において、本発明のＺＦＰ－ＴＦは、約２５ｎＭ未満のＫＤでそれらの標的に結合し、ヒトＳＮＣＡ遺伝子の転写を２０％またはそれ以上まで（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、あるいは９５％またはそれ以上まで）抑制する。ある実施態様において、本発明のＺＦＰ－ＴＦの２つまたはそれ以上が患者において同時に使用され、前記ＺＦＰ－ＴＦは、ＳＮＣＡ発現の最適な抑制を達成するために、ＳＮＣＡ遺伝子の異なる標的領域に結合する。
Ａ．転写リプレッサードメイン
本発明のＺＦＰ－ＴＦは、本明細書に記載される操作されたＺＦＰドメインおよびＳＮＣＡ遺伝子の転写活性を弱める１つまたはそれ以上の転写リプレッサードメインを含む。１つまたはそれ以上の操作されたＺＦＰドメインおよび１つまたはそれ以上の転写リプレッサードメインは、可撓性リンカーによって結合されていてもよい。転写リプレッサードメインの非限定的な例は、ＫＯＸ１のＫＲＡＢドメイン、ＫＡＰ－１、ＭＡＤ、ＦＫＨＲ、ＥＧＲ－１、ＥＲＤ、ＳＩＤ、ＴＧＦ－ベータ誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ＥＲＢ－Ａ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＴＲａ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、核ホルモン受容体（例えば、エストロゲン受容体または甲状腺ホルモン受容体）、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２である。例えば、Bird et al. (1999) Cell 99:451-454; Tyler et al. (1999) Cell 99:443-446; Knoepfler et al. (1999) Cell 99:447-450; and Robertson et al. (2000) Nature Genet. 25:338-342を参照のこと。さらに例示的な抑制ドメインには、以下に限定されないが、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが含まれる。例えば、Chem et al. (1996) Plant Cell 8:305-321; and Wu et al. (2000) Plant J. 22:19-27を参照すること。
本発明のＺＦＰ－ＴＦは、本明細書に記載される操作されたＺＦＰドメインおよびＳＮＣＡ遺伝子の転写活性を弱める１つまたはそれ以上の転写リプレッサードメインを含む。１つまたはそれ以上の操作されたＺＦＰドメインおよび１つまたはそれ以上の転写リプレッサードメインは、可撓性リンカーによって結合されていてもよい。転写リプレッサードメインの非限定的な例は、ＫＯＸ１のＫＲＡＢドメイン、ＫＡＰ－１、ＭＡＤ、ＦＫＨＲ、ＥＧＲ－１、ＥＲＤ、ＳＩＤ、ＴＧＦ－ベータ誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ＥＲＢ－Ａ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＴＲａ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、核ホルモン受容体（例えば、エストロゲン受容体または甲状腺ホルモン受容体）、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２である。例えば、Bird et al. (1999) Cell 99:451-454; Tyler et al. (1999) Cell 99:443-446; Knoepfler et al. (1999) Cell 99:447-450; and Robertson et al. (2000) Nature Genet. 25:338-342を参照のこと。さらに例示的な抑制ドメインには、以下に限定されないが、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが含まれる。例えば、Chem et al. (1996) Plant Cell 8:305-321; and Wu et al. (2000) Plant J. 22:19-27を参照すること。
ある実施態様において、転写リプレッサードメインは、ヒトジンクフィンガータンパク質１０／ＫＯＸ１（ＺＮＦ１０／ＫＯＸ１）のクルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインからの配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿０１５３９４．４）を含む。例示的なＫＲＡＢドメイン配列は：
ＤＡＫＳＬＴＡＷＳＲ ＴＬＶＴＦＫＤＶＦＶ ＤＦＴＲＥＥＷＫＬＬ ＤＴＡＱＱＩＶＹＲＮ ＶＭＬＥＮＹＫＮＬＶ ＳＬＧＹＱＬＴＫＰＤ ＶＩＬＲＬＥＫＧＥＥ ＰＷＬＶＥＲＥＩＨＱ ＥＴＨＰＤＳＥＴＡＦ ＥＩＫＳＳＶ
（配列番号１２）
である。
このＫＲＡＢ配列の変異体はもまた、同一または類似の転写抑制機能を有する限り用いられてもよい。
ＤＡＫＳＬＴＡＷＳＲ ＴＬＶＴＦＫＤＶＦＶ ＤＦＴＲＥＥＷＫＬＬ ＤＴＡＱＱＩＶＹＲＮ ＶＭＬＥＮＹＫＮＬＶ ＳＬＧＹＱＬＴＫＰＤ ＶＩＬＲＬＥＫＧＥＥ ＰＷＬＶＥＲＥＩＨＱ ＥＴＨＰＤＳＥＴＡＦ ＥＩＫＳＳＶ
（配列番号１２）
である。
このＫＲＡＢ配列の変異体はもまた、同一または類似の転写抑制機能を有する限り用いられてもよい。
ある実施態様において、本明細書に記載される操作されたＺＦＰ－ＴＦは、好ましくは、検出可能なオフターゲット結合または活性がなく、またはほとんど伴わず、表１の一行に示される標的部位に結合する。オフターゲット結合は、例えば、オフターゲット遺伝子におけるＺＦＰ－ＴＦの活性を測定することによって決定されてもよい。ある実施態様において、本明細書に記載される操作されたＺＦＰ－ＴＦは、表１に示されるＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。ある実施態様において、本明細書に記載される操作されたＺＦＰ－ＴＦは、表１の一行に示される２つの隣接するＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。ある実施態様において、本明細書に記載される操作されたＺＦＰ－ＴＦは、表１の一行に示されるＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。ある実施態様において、本明細書に記載される操作されたＺＦＰ－ＴＦは、表２の一行に示される配列の認識ヘリックスおよび骨格部分を含む。ある実施態様において、本明細書に記載される操作されたＺＦＰ－ＴＦは、表２の一行に示されるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、本明細書に記載の操作されたＺＦＰ－ＴＦは、翻訳後修飾後に配列が現れるため、表２の一行に示される配列の認識ヘリックスおよび骨格部分を含む。ある実施態様において、本明細書に記載される操作されたＺＦＰ－ＴＦは、配列が翻訳後修飾の後に現れるため、表２の一行に示されるアミノ酸配列を含む。例えば、翻訳後修飾は、表２に示される配列からの開始因子メチオニン残基を除去してもよい。
Ｂ．ペプチドリンカー
本発明のＺＦＰ－ＴＦのＺＦＰドメインおよび転写リプレッサードメイン、ならびに／あるいは前記ＺＦＰドメイン内のジンクフィンガーは、ペプチドリンカー、例えば、約５～２００個のアミノ酸（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれ以上のアミノ酸）の切断不可能なペプチドリンカーを介して連結されていてもよい。好ましいリンカーは、典型的には、組換え融合タンパク質として合成される可撓性アミノ酸部分配列である。例えば、上記ならびに米国特許第６，４７９，６２６号；第６，９０３，１８５号；第７，１５３，９４９号；第８，７７２，４５３号；および第９，１６３，２４５号；およびＷＯ２０１１／１３９３４９を参照のこと。本明細書に記載のタンパク質は、適切なリンカーのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。リンカーの非限定的な例は、ＤＧＧＧＳ（配列番号２）、ＴＧＥＫＰ（配列番号３）、ＬＲＱＫＤＧＥＲＰ（配列番号４）、ＧＧＲＲ（配列番号５）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号６）、ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号７）、ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号８）、ＬＲＱＫＤ（Ｇ３Ｓ）２ＥＲＰ（配列番号９）、およびＴＧＳＱＫＰ（配列番号１０）である。
本発明のＺＦＰ－ＴＦのＺＦＰドメインおよび転写リプレッサードメイン、ならびに／あるいは前記ＺＦＰドメイン内のジンクフィンガーは、ペプチドリンカー、例えば、約５～２００個のアミノ酸（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれ以上のアミノ酸）の切断不可能なペプチドリンカーを介して連結されていてもよい。好ましいリンカーは、典型的には、組換え融合タンパク質として合成される可撓性アミノ酸部分配列である。例えば、上記ならびに米国特許第６，４７９，６２６号；第６，９０３，１８５号；第７，１５３，９４９号；第８，７７２，４５３号；および第９，１６３，２４５号；およびＷＯ２０１１／１３９３４９を参照のこと。本明細書に記載のタンパク質は、適切なリンカーのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。リンカーの非限定的な例は、ＤＧＧＧＳ（配列番号２）、ＴＧＥＫＰ（配列番号３）、ＬＲＱＫＤＧＥＲＰ（配列番号４）、ＧＧＲＲ（配列番号５）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号６）、ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号７）、ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号８）、ＬＲＱＫＤ（Ｇ３Ｓ）２ＥＲＰ（配列番号９）、およびＴＧＳＱＫＰ（配列番号１０）である。
ある実施態様において、ＴＧＥＫＰＦＡ（配列番号１６６）および／またはＴＧＳＱＫＰＦＱ（配列番号１６７）は、ＺＦＰドメイン内のジンクフィンガーを、ならびに／あるいはＬＲＱＫＤＡＡＲＧＳＧＧ（配列番号１６８）またはＬＲＧＳＧＧ（配列番号１６９）は、ＺＦＰドメインを、転写リプレッサードメインに結合する。
ある実施態様において、ペプチドリンカーは、３～２０個のアミノ酸残基の長さであり、Ｇおよび／またはＳが多い。このようなリンカーの非限定的な例は、Ｇ４Ｓ型リンカー（配列番号１６）、すなわち、１個またはそれ以上（例えば、２個、３個、または４個）のＧＧＧＧＳ（配列番号１１）モチーフ、または前記モチーフの変形（前記モチーフから１個、２個、または３個のアミノ酸の挿入、欠失、および置換を有するものなど）を含むリンカーである。
ＩＶ．ＺＦＰ－ＴＦの発現
本開示のＺＦＰ－ＴＦは、それをコードする核酸分子を介して患者に導入されてもよい。前記核酸分子は、ＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子でありうる。核酸分子は、脂質：核酸複合体（例えば、リポソーム）を含む組成物の注射を介して患者の脳に導入されてもよい。あるいは、ＺＦＰ－ＴＦは、ＺＦＰ－ＴＦをコードする配列を含む核酸発現ベクターを介して患者に導入されうる。前記発現ベクターは、神経系の細胞におけるＺＦＰ－ＴＦのコーディング配列の発現を可能にする発現調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、転写シグナル配列、および転写終結配列などを含みうる。ある実施態様において、前記発現ベクターは、安定なエピソームとして細胞内に存在したままである。他の実施態様において、前記発現ベクターは、細胞のゲノムに組み込まれる。
本開示のＺＦＰ－ＴＦは、それをコードする核酸分子を介して患者に導入されてもよい。前記核酸分子は、ＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子でありうる。核酸分子は、脂質：核酸複合体（例えば、リポソーム）を含む組成物の注射を介して患者の脳に導入されてもよい。あるいは、ＺＦＰ－ＴＦは、ＺＦＰ－ＴＦをコードする配列を含む核酸発現ベクターを介して患者に導入されうる。前記発現ベクターは、神経系の細胞におけるＺＦＰ－ＴＦのコーディング配列の発現を可能にする発現調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、転写シグナル配列、および転写終結配列などを含みうる。ある実施態様において、前記発現ベクターは、安定なエピソームとして細胞内に存在したままである。他の実施態様において、前記発現ベクターは、細胞のゲノムに組み込まれる。
ある実施態様において、脳におけるＺＦＰ－ＴＦ発現を指示するためのベクター上のプロモーターは、構成的に活性なプロモーターまたは誘導性プロモーターである。適切なプロモーターには、以下に限定されないが、レトロウイルスＲＳＶ ＬＴＲプロモーター（適宜、ＲＳＶエンハンサーを有する）、ＣＭＶプロモーター（適宜、ＣＭＶエンハンサーを有する）、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）プロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ＣＫ６プロモーター、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、ＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧプロモーター；Niwa et al., Gene(1991)108 (2):193-9）、およびＲＵ－４８６応答性プロモーターが含まれる。ニューロン特異的プロモーター、例えば、シナプシンＩプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＣＡＭＫＩＩプロモーター、ＰｒＰプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、またはニューロンとグリア細胞への発現を制限する操作されたか、または天然のプロモーターなどもまた用いられうる。
エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、カチオン性またはアニオン性リポソーム、核局在化シグナルと組み合わせたリポソーム、天然に存在するリポソーム（例えば、エキソソーム）、またはウイルス形質導入を含むが、これらに限定されない、細胞にヌクレオチド配列を導入するためのいずれかの方法が用いられてもよい。
発現ベクターのインビボ送達のために、ウイルス形質導入が用いられてもよい。当該技術分野で公知の様々なウイルスベクター、例えば、ワクチンベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ポキシウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、およびハイブリッドウイルスベクターが、本開示における使用のために当業者によって用いられうる。ある実施態様において、本明細書で用いられるウイルスベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶベクターは、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染し、長期発現のための安定したエピソーム構造として存在し、免疫原性が非常に低いため、ＣＮＳ遺伝子送達に特に適する（Hadaczek et al., MolTher.(2010)18:1458-61; Zaiss, et al., GeneTher.(2008)15:808-16）。いずれかの適切なＡＡＶ血清型が用いられてもよい。例えば、前記ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、またはＡＡＶｒｈ１０、あるいはＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、またはＡＡＶ２／９などのシュードタイプのもの、あるいは本明細書に記載のＡＡＶ血清型のうちの１つの変異体または派生物である血清型のもの（すなわち、複数の血清型に由来するＡＡＶ；例えば、ｒＡＡＶが、そのゲノムおよびＡＡＶ８、５、６、または９キャプシドにＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む）であってもよい。ある実施態様において、前記発現ベクターは、ＡＡＶウイルスベクターであり、昆虫細胞／バキュロウイルス産生系または哺乳動物細胞産生系などの産生系においてＡＡＶビリオンの生成を可能にするために、そのゲノムが、両端にＡＡＶ逆末端反復（ＩＴＲ）配列を有することを含む構築物を含む組換えＡＡＶビリオンによって標的ヒト細胞に導入される。前記ＡＡＶは、そのキャプシドタンパク質が、ヒトまたは非ヒト霊長類において免疫原性を低下させるか、または形質導入能を高めるように操作されていてもよい。ある実施態様において、ＡＡＶ９が用いられる。本明細書に記載のウイルスベクターは、当該技術分野で公知の方法を用いて生成されうる。いずれかの適切な許容細胞またはパッケージング細胞がウイルス粒子を生成するために用いられてもよい。例えば、哺乳動物または昆虫細胞がパッケージング細胞株として用いられうる。
Ｖ．医薬用途
本発明のＺＦＰ－ＴＦは、α－シヌクレイン発現の下方調節を必要とする患者を治療するために用いることができる。患者は、パーキンソン病、レビー小体型認知症、アルツハイマー病、多系統萎縮症、その他のシヌクレイン病などの神経変性疾患に羅漢しているか、または発症するリスクがある。リスクのある患者には、遺伝的素因のある患者、脳震盪などの脳損傷を繰り返し受けた患者、および環境神経毒にさらされた患者が含まれる。本開示は、治療を必要とするヒト患者などの対象における神経疾患（例えば、神経変性疾患）を治療するための方法であって、ＺＦＰ－ＴＦ（例えば、それを発現するｒＡＡＶベクター）の治療上有効量（例えば、ＳＮＣＡ発現の十分な抑制を可能にする量）を、前記対象の神経系に導入することを含む方法を提供する。用語「治療する」は、症状の緩和、症状の発症の予防、疾患進行の遅延、生活の質の改善、および生存率の増加を包含する。
本発明のＺＦＰ－ＴＦは、α－シヌクレイン発現の下方調節を必要とする患者を治療するために用いることができる。患者は、パーキンソン病、レビー小体型認知症、アルツハイマー病、多系統萎縮症、その他のシヌクレイン病などの神経変性疾患に羅漢しているか、または発症するリスクがある。リスクのある患者には、遺伝的素因のある患者、脳震盪などの脳損傷を繰り返し受けた患者、および環境神経毒にさらされた患者が含まれる。本開示は、治療を必要とするヒト患者などの対象における神経疾患（例えば、神経変性疾患）を治療するための方法であって、ＺＦＰ－ＴＦ（例えば、それを発現するｒＡＡＶベクター）の治療上有効量（例えば、ＳＮＣＡ発現の十分な抑制を可能にする量）を、前記対象の神経系に導入することを含む方法を提供する。用語「治療する」は、症状の緩和、症状の発症の予防、疾患進行の遅延、生活の質の改善、および生存率の増加を包含する。
本開示は、ウイルスベクター、例えば、組換えゲノムがＺＦＰ－ＴＦのための発現カセットを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）などを含む医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、医薬的に許容される担体、例えば、水、生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、デキストロース、グリセロール、ショ糖、乳糖、ゼラチン、デキストラン、アルブミン、またはペクチンなどをさらに含んでいてもよい。さらに、前記組成物は、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、または医薬組成物の有効性を高める他の試薬などを含みうる。前記医薬組成物は、送達ビヒクル、例えば、リポソーム、ナノカプセル、マイクロ粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、および小胞などを含んでいてもよい。
本開示の治療法の標的となる細胞は、以下に限定されないが、神経細胞（例えば、運動ニューロン、感覚ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、またはセロトニン作動性ニューロン）；グリア細胞（例えば、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、周皮細胞、シュワン細胞、またはミクログリア細胞）；上衣細胞；または神経上皮細胞を含む。治療法の標的となる脳領域は、シヌクレイン病において最も顕著に影響を受ける領域、例えば、線条体、尾状核、被殻、黒質、中脳、嗅球、小脳、青斑核、橋、髄質、脳幹、淡蒼球、海馬、大脳皮質、または他の脳領域であってもよい。これらの領域は、線条体内注射、黒質内注射、脳内注射、大槽内（ＩＣＭ）注射、より一般的には、実質内注射、脳室内（ＩＣＶ）注射、髄腔内注射、または静脈内注射によって直接到達されうる。他の投与経路には、以下に限定されないが、脳内、心室内、鼻腔内、または眼内投与が含まれる。ある実施態様において、ウイルスベクターは、例えば、髄腔内および／または脳室内注射、または大槽内注射を介して脳脊髄液（ＣＳＦ）に直接投与された後、ＣＮＳ組織全体に広がる。他の実施態様において、ウイルスベクターは、血液脳関門を通過し、静脈内投与後に対象のＣＮＳ組織全体に広範囲に分布することを達成する。他の実施態様において、ウイルスベクターは、実質内注射を介して標的領域に直接送達される。ある場合において、ウイルスベクターは、実質内送達後に、他の脳領域への逆行性または順行性輸送を受けうる。ある態様において、ウイルスベクターは、高い効率にて安定で無毒な遺伝子導入を達成する、異なるＣＮＳ組織標的化能力（例えば、ＣＮＳ組織向性）を有する。
一例として、医薬組成物は、脳室内投与により、患者の前脳の脳室領域、例えば、右側脳室、左側脳室、第三脳室、または第四脳室などに提供されうる。医薬組成物は、脳内投与、例えば、線条体、尾状核、被殻、黒質、中脳、嗅球、大脳、髄質、橋、小脳、青斑核、脳幹、淡蒼球、海馬、大脳皮質、頭蓋内腔、髄膜、硬膜、くも膜、または脳軟膜へまたはその近くへの組成物の注射によって患者に提供されうる。脳内投与には、ある場合において、脳周辺のくも膜下腔の脳脊髄液（ＣＳＦ）への薬剤の投与が含まれうる。
ある場合において、脳内投与は、定位固定法を用いた注射に関する。定位固定法は、当該技術分野で周知であり、典型的に、特定の脳内領域、例えば、心室領域に対して注射を誘導するために一緒に用いられるコンピュータおよび３次元走査装置の使用を伴う。マイクロインジェクションポンプ（例えば、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）もまた用いられてもよい。ある場合において、マイクロインジェクションポンプは、ウイルスベクターを含む組成物を送達するために用いられる。ある場合において、組成物の注入速度は、０．１μｌ／分～１００μｌ／分の範囲である。当業者に理解されるように、注入速度は、例えば、対象の種、対象の年齢、対象の体重／サイズ、ＡＡＶの血清型、必要とされる投薬量、および対象とする脳内領域を含む様々な因子に依存する。よって、他の注入速度は、当業者が特定の状況において適切であると見なされるものであってもよい。
ｒＡＡＶの対象への送達は、例えば、静脈内投与によって行われてもよい。ある例において、ｒＡＡＶを、脳組織、脊髄、脳脊髄液（ＣＳＦ）、神経細胞、グリア細胞、髄膜、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、間質腔などに局所的に送達することが望まれうる。ある場合において、組換えＡＡＶは脳室領域に注入することによりＣＮＳに、ならびに線条体、尾状核、被殻、黒質、中脳、嗅球、小脳、青斑核、橋、髄質、脳幹、淡蒼球、海馬、および大脳皮質、または他の脳領域に直接送達されてもよい。ＡＡＶは、当該技術分野で公知の神経外科技術を用いて、例えば、定位固定注射などによってニードル、カテーテル、または関連するデバイスで送達されうる（例えば、Stein et al., J Vir. (1999) 73:3424-9; Davidson et al., PNAS. (2000) 97:3428-32; Davidson et al., Nat Genet. (1993) 3:219-223; and Alisky and Davidson, Hum. Gene Ther. (2000) 11:2315-29を参照のこと）。
本明細書で別段の定義がない限り、本開示に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。例示的な方法および材料が以下に記載されるが、本明細書に記載される方法および材料と類似または同等のものもまた、本開示の実施または試験で用いることができる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先される。一般に、本明細書に記載の神経学、医学、医薬品化学、および細胞生物学に関連して使用される命名法、およびそれらの技術は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されているものである。酵素反応および精製技術は、当該技術分野で一般的に行われているか、または本明細書に記載されているように、製造業者の仕様に従って実施される。さらに、文脈上別段の必要がない限り、単数形には複数形が含まれ、複数形には単数形が含まれるものとする。本明細書および実施態様を通して、単語「有する（have）」および「含む（comprise）」、あるいはこれらの変形「有する（has）」、「有する（having）」、「含む（comprises）」、または「含む（comprising）」などは、記載される整数または整数群を含むが、他の整数または整数群を除くことではないことを意味するものと理解される。本明細書に記載される全ての刊行物および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。多くの文献が本明細書で引用されているが、この引用は、これらの文献のいずれもが当該技術分野の一般的な技術常識の一部を形成することを認めるものではない。本明細書で用いられるように、１つまたはそれ以上の目的の値に適用される用語「およそ」または「約」は、記載される参照値に類似する値を意味する。特定の実施態様において、前記用語は、特に明記されていないか、または文脈から明らかでない限り、記載され参照値の（より大きいか、または小さいかの）いずれかの方向において１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下の範囲内にある値の範囲を意味する。
本発明がより理解されるために、以下の実施例が示される。これらの実施例は、例示のみを目的とするものであって、いかなる方法でも本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１：ＺＦＰ－ＴＦのスクリーニング
α－シヌクレインの発現を抑制するＺＦＰ－ＴＦを同定するために、ＴＳＳ１の上流５００ｂｐからＴＳＳ１の下流５００ｂｐまで、またはＴＳＳ２ａの上流５００ｂｐからＴＳＳ２ｂの下流５００ｂｐまでの範囲のヒトＳＮＣＡ遺伝子の領域における１５または１８ｂｐの配列に結合すると予測される４１６個のＺＦＰ－ＴＦのライブラリーを設計し、スクリーニングした（図２Ｂ）。ＺＦＰ－ＴＦの標的領域を、図２Ｂでは矢印で示し、矢印の方向は、ＺＦＰ－ＴＦが結合するＤＮＡの鎖を示す（５’から３’）。図４は、ＳＮＣＡ遺伝子のＴＳＳ２ａおよび２ｂを標的とする１、２、または３個のリン酸接触変化を伴うＺＦＰ－ＴＦについて、図２Ｂに示されるものと同様のデータを示す。この試験では、ＫＲＡＢドメイン配列（配列番号１２）を転写リプレッサーとして用い、ＺＦＰドメインのＣ末端に融合させた。２０個の代表的なＺＦＰ－ＴＦの配列を以下の表２に示す。インビトロ転写用のテンプレートは、ＰＣＲ（フォワードプライマーＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＡＡＣＴＡＧＡＧ（配列番号１３）；リバースプライマーＴ（１８０）ＣＴＧＧＣＡＡＣＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧ（配列番号１４））を用いてｐＶＡＸ－ＺＦＰまたはｐＶＡＸ－ＧＦＰプラスミドから調製した。メッセンジャーＲＮＡは、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ ＵＬＴＲＡ転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の説明書に従って用いて合成し、ＲＮｅａｓｙ９６カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。次に、各ＺＦＰ－ＴＦをコードするＲＮＡを、６回希釈で９６ウェルプレートに分注した。
α－シヌクレインの発現を抑制するＺＦＰ－ＴＦを同定するために、ＴＳＳ１の上流５００ｂｐからＴＳＳ１の下流５００ｂｐまで、またはＴＳＳ２ａの上流５００ｂｐからＴＳＳ２ｂの下流５００ｂｐまでの範囲のヒトＳＮＣＡ遺伝子の領域における１５または１８ｂｐの配列に結合すると予測される４１６個のＺＦＰ－ＴＦのライブラリーを設計し、スクリーニングした（図２Ｂ）。ＺＦＰ－ＴＦの標的領域を、図２Ｂでは矢印で示し、矢印の方向は、ＺＦＰ－ＴＦが結合するＤＮＡの鎖を示す（５’から３’）。図４は、ＳＮＣＡ遺伝子のＴＳＳ２ａおよび２ｂを標的とする１、２、または３個のリン酸接触変化を伴うＺＦＰ－ＴＦについて、図２Ｂに示されるものと同様のデータを示す。この試験では、ＫＲＡＢドメイン配列（配列番号１２）を転写リプレッサーとして用い、ＺＦＰドメインのＣ末端に融合させた。２０個の代表的なＺＦＰ－ＴＦの配列を以下の表２に示す。インビトロ転写用のテンプレートは、ＰＣＲ（フォワードプライマーＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＡＡＣＴＡＧＡＧ（配列番号１３）；リバースプライマーＴ（１８０）ＣＴＧＧＣＡＡＣＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧ（配列番号１４））を用いてｐＶＡＸ－ＺＦＰまたはｐＶＡＸ－ＧＦＰプラスミドから調製した。メッセンジャーＲＮＡは、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ ＵＬＴＲＡ転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の説明書に従って用いて合成し、ＲＮｅａｓｙ９６カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。次に、各ＺＦＰ－ＴＦをコードするＲＮＡを、６回希釈で９６ウェルプレートに分注した。
ＺＦＰ－ＴＦコーディング配列を有する組換えｒＡＡＶベクターを、周知の方法に従ってＨＥＫ２９３細胞で調製した。前記細胞を、ＡＡＶヘルパー遺伝子をコードするプラスミドおよびｒＡＡＶゲノムでトランスフェクトして３日後、前記細胞を回収した。次いで、前記細胞を３回の凍結／解凍によって溶解し、該細胞破片を遠心分離によって除去した。ｒＡＡＶビリオンを、ポリエチレングリコールを用いて沈殿させた。再懸濁後、該ビリオンを塩化セシウム勾配で終夜超遠心分離することにより精製した。該ビリオンを透析により処方し、続いてフィルター滅菌した。ＡＡＶを分注し、使用するまで－８０℃で保存した。該ＡＡＶは、解凍後に再凍結しなかった。
スクリーニングは、ＳＫ－Ｎ－ＭＣヒト神経上皮細胞株で行った。ＳＫ－Ｎ－ＭＣ細胞は、ヒトα－シヌクレインを高レベルで発現するため、α－シヌクレインの発現を低下させるＺＦＰ－ＴＦの試験に適切である。ＳＫ－Ｎ－ＭＣ細胞を組織培養フラスコでコンフルエントに達するまで培養した。前記細胞を９６ウェルプレートに１ウェルあたり１５０，０００個の細胞でプレーティングし、Ａｍａｘａ（登録商標）ＳＦ溶液で再懸濁した。次いで、前記細胞をＺＦＰ－ＴＦ ＲＮＡ（６回分：３、１０、３０、１００、３００、および１０００ｎｇ）と混合し、Ａｍａｘａ（登録商標）シャトルプレートウェルに移した。前記細胞を、Ａｍａｘａ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）デバイス（Ｌｏｎｚａ；プログラムＣＭ－１３７）を使用してトランスフェクトした。イーグルＭＥＭ細胞培地を、該プレートの各ウェルに加えた。該細胞を９６ウェル組織培養プレートに移し、３７℃で２４時間インキュベートした。
ＺＦＰ－ＴＦもまた、ヒトｉＰＳＣ由来のＧＡＢＡ作動性ニューロン（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で試験した。前記細胞をポリ－Ｌ－オルニチンおよびラミニンでコーティングした９６ウェルプレートに１ウェルあたり４０，０００個の細胞の密度でプレーティングし、製造業者の説明書に従って維持した。前記細胞を、プレーティング４８時間後に６個の異なるＭＯＩ（１Ｅ３、３Ｅ３、１Ｅ４、３Ｅ４、１Ｅ５、および３Ｅ５）で目的のＺＦＰ－ＴＦを発現するＡＡＶ６を用いてトランスフェクトした。形質導入された細胞を３２日間まで維持した（５０～７５％の培地交換を３～５日ごとに行った）。前記細胞を、ＡＡＶトランスフェクション２８～３０日後に回収した。
回収した細胞を溶解し、Ｃ２ＣＴキットを用いて製造業者の説明書に従って逆転写を行った。ＴａｑＭａｎ定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を用いてＳＮＣＡの発現レベルを測定した。ＳＮＣＡ発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子ＥＩＦ４Ａ２、ＡＴＰ５Ｂ、およびＧＡＰＤＨの発現レベルの幾何平均に対して正規化した。模擬トランスフェクションおよびＳＮＣＡを標的としないことが公知のＺＦＰ－ＴＦによるトランスフェクションをネガティブコントロールとして使用した。
α－シヌクレインの用量依存的な抑制が、試験したＺＦＰ－ＴＦの多くで示された。達成された最大抑制は、９９％以上であったが、α－シヌクレインがより低い程度（例えば、最高用量で約９０％、約７５％、または約４０％）で抑制するＺＦＰ－ＴＦを同定した。図３Ａ～Ｅおよび図５は、スクリーニングのデータを示す。
ＺＦＰ－ＴＦの４０個の例の用量依存的な活性を図６Ａおよび６Ｂに示す。これらの図のデータは、ＺＦＰ－ＴＦが広範囲のα－シヌクレイン抑制活性プロファイルを示し、試験した最高用量でのα－シヌクレインｍＲＮＡの抑制が約４０％～９９％以上の範囲であることを示す。例えば、ＺＦＰ－ＴＦ８１９６６、８１９７０、８１９７２、８２００２、８２００８、８２０１２、８２０４９、８２０５４、８２０９０、８２０９２、８２０９６、８２０９７、８２１０７、８２１５０、８２１９０、８２１９５、８２１９７、８２２１５、８２２２５、および８２２９４は、ヒトＳＮＣＡ遺伝子の９５％またはそれ以上の抑制を示し、ＺＦＰ－ＴＦ８１９６５、８１９７１、８２０７６、８２１３５、８２１３６、８２１５８、８２１６７、８２２４２、８２２６４、８２２８５、および８２３２９は、８０～９４％の抑制を示し、ＺＦＰ－ＴＦ８２００１、８２０５６、８２０５８、８２１１０、８２１４４、８２１４８、８２１５１、８２２０８、および８２２８８は、４１～７９％の抑制を示した。
実施例２：α－シヌクレインＺＦＰ－ＴＦのオフターゲット活性
全般的遺伝子発現に対するα－シヌクレインＺＦＰ－ＴＦのオフターゲットの影響を評価するために、代表的なα－シヌクレインＺＦＰ－ＴＦをコードするＡＡＶで処理したヒトｉＰＳＣ由来ニューロンおよび一次マウス皮質ニューロンから単離したトータルＲＮＡを用いてマイクロアレイ実験を行った。
全般的遺伝子発現に対するα－シヌクレインＺＦＰ－ＴＦのオフターゲットの影響を評価するために、代表的なα－シヌクレインＺＦＰ－ＴＦをコードするＡＡＶで処理したヒトｉＰＳＣ由来ニューロンおよび一次マウス皮質ニューロンから単離したトータルＲＮＡを用いてマイクロアレイ実験を行った。
ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンは、実施例１に記載されるように処理した。マイクロアレイ分析のために、前記細胞を、ポリ－Ｌ－オルニチンおよびラミニンでコーティングした２４ウェルプレート上に１ウェルあたり２６０，０００個の細胞の密度でプレーティングし、プレーティング４８時間後に１Ｅ５ ＶＧ／細胞でトランスフェクトし、ウイルストランスフェクション１９日後に回収した。回収した細胞から単離したＲＮＡをマイクロアレイ解析に用いた。
一次マウス皮質ニューロンは、Ｇｉｂｃｏから購入した。前記細胞を、ポリ－Ｄ－リジンでコーティングした２４ウェルプレート上に２００，０００個の細胞／ウェルでプレーティングし、ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）Ｉサプリメント、Ｂ２７サプリメント、およびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＧｉｂｃｏ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍを用いて製造業者の説明書に従って維持した。（ＤＩＶ２による）プレーティング４８時間後、前記細胞を１Ｅ５ ＶＧ／細胞のＭＯＩでＡＡＶ６に感染させ、７日後に回収した（ＤＩＶ９で；３～４日ごとに５０％の培地交換を行った）。これに続いてＲＮＡ分離とマイクロアレイ分析を行った。
オフターゲット分析は、ＧｅｎｅＴｉｔａｎ（登録商標）プラットフォーム（Ｃｌａｒｉｏｍ Ｓキット）を用いて製造業者の説明書に従って行った。前記アッセイ結果を、ＴＡＣソフトウェアを用いて分析した。当該分析では、ＦＤＲで補正したｐ値が０．０５以下である、２倍以上に調節された差次的に調節された遺伝子を収集した。最小のオフターゲットを示すが公知のＺＦＰ－ＴＦおよび模擬トランスフェクションをネガティブコントロールとして使用した。
図７Ａ～Ｄは、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンおよび一次マウス皮質ニューロンにおける４０個の代表的なα－シヌクレインＺＦＰ－ＴＦのマイクロアレイ結果を示す。広範囲のオフターゲット活性が存在し、一部のＺＦＰ－ＴＦは非常に低いか、検出不可能なオフターゲット活性を示した。
実施例３：α－シヌクレインｍＲＮＡ発現のｉｎｖｉｖｏ抑制
ヒトとマウスの両方のニューロンにおいて最小から検出不可能なオフターゲット活性およびヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて異なる最大抑制活性を有する２つの代表的なＺＦＰ－ＴＦ（８２１９５および８２２６４）を発現するＡＡＶ６構築物（８２１９５、～９５％；８２２６４、～８０％）を、ＰＡＣシヌクレインマウスモデルにおけるヒトＳＮＣＡのインビボ抑制を示すために使用した（Kuo et al., HumMolGenet. (2010)19(9):1633-50）。このマウスモデルは、全長ヒトＳＮＣＡ配列をその上流の調節配列とともにマウスα－シヌクレインヌルのバックグラウンドで発現する。各ＺＦＰ－ＴＦを発現するＡＡＶ６ベクターおよびベヒクルを、８週齢の雌ＰＡＣシヌクレインマウス（１群あたりｎ＝３）において、０．５μＬ／分の速度で２つの部位の線条体に両側投与した（１半球あたり２つの部位：前線条体に対して５μＬ、後線条体に対して４μＬ、合計９μＬ／半球および１８μＬ／動物）。注入後、ニードルを５分間そのままにして試験薬剤を拡散させた。次に、前記ニードルを１～２分間かけてゆっくりと引き抜いた。前記注射の定位座標は以下のとおりであった（前線条体－ＡＰ：＋１．４ｍｍ、ＭＬ：＋／－１．７ｍｍ、ＤＶ：－３．０ｍｍ；後線条体：ＡＰ：＋０．２ｍｍ、ＭＬ：＋／－２．３ｍｍ、ＤＶ：－２．７ｎｎ）。前記マウスを３週間後に安楽死させ、それらの脳を分子分析のために採取した。安楽死の際、該動物に０．９％の生理食塩水を経心的に灌流し、脳を摘出し、半切除した。左半球を１２個の異なる領域（嗅球；吻側、内側、および尾側皮質；吻側、内側、および尾側線条体；海馬；視床；腹側中脳；延髄；および小脳）にさらに解剖した。解剖した組織をＲＮＡＬａｔｅｒに入れ、ＲＮＡの完全性を維持した。２４時間後、ＲＮＡｌａｔｅｒを取り出し、前記組織を液体窒素で急速凍結し、－８０℃で保存するまでドライアイス上で維持した。
ヒトとマウスの両方のニューロンにおいて最小から検出不可能なオフターゲット活性およびヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて異なる最大抑制活性を有する２つの代表的なＺＦＰ－ＴＦ（８２１９５および８２２６４）を発現するＡＡＶ６構築物（８２１９５、～９５％；８２２６４、～８０％）を、ＰＡＣシヌクレインマウスモデルにおけるヒトＳＮＣＡのインビボ抑制を示すために使用した（Kuo et al., HumMolGenet. (2010)19(9):1633-50）。このマウスモデルは、全長ヒトＳＮＣＡ配列をその上流の調節配列とともにマウスα－シヌクレインヌルのバックグラウンドで発現する。各ＺＦＰ－ＴＦを発現するＡＡＶ６ベクターおよびベヒクルを、８週齢の雌ＰＡＣシヌクレインマウス（１群あたりｎ＝３）において、０．５μＬ／分の速度で２つの部位の線条体に両側投与した（１半球あたり２つの部位：前線条体に対して５μＬ、後線条体に対して４μＬ、合計９μＬ／半球および１８μＬ／動物）。注入後、ニードルを５分間そのままにして試験薬剤を拡散させた。次に、前記ニードルを１～２分間かけてゆっくりと引き抜いた。前記注射の定位座標は以下のとおりであった（前線条体－ＡＰ：＋１．４ｍｍ、ＭＬ：＋／－１．７ｍｍ、ＤＶ：－３．０ｍｍ；後線条体：ＡＰ：＋０．２ｍｍ、ＭＬ：＋／－２．３ｍｍ、ＤＶ：－２．７ｎｎ）。前記マウスを３週間後に安楽死させ、それらの脳を分子分析のために採取した。安楽死の際、該動物に０．９％の生理食塩水を経心的に灌流し、脳を摘出し、半切除した。左半球を１２個の異なる領域（嗅球；吻側、内側、および尾側皮質；吻側、内側、および尾側線条体；海馬；視床；腹側中脳；延髄；および小脳）にさらに解剖した。解剖した組織をＲＮＡＬａｔｅｒに入れ、ＲＮＡの完全性を維持した。２４時間後、ＲＮＡｌａｔｅｒを取り出し、前記組織を液体窒素で急速凍結し、－８０℃で保存するまでドライアイス上で維持した。
脳組織を、氷上で０．６ｍＬのＴＲＩ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と２つの３．２ｍｍスチールビーズ（ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を含む１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移した。該試料を、Ｑｉａｇｅｎ ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒを使用して、４℃で下記パラメーターを用いて溶解した：５サイクル、９０秒間、および２５．１周波。短いスピン後、７０μＬの１－ブロモ－３－クロロプロパンを、各試料に室温で加えた。該試料を１０秒間ボルテックスし、１２，０００×ｇで４℃にて１０分間遠心分離し、各試料からの水相１２０μＬを９６ウェルプレートのウェルに移した。
６０μＬのイソプロピルアルコールおよび１２μＬのＭａｇＭａｘ磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、前記組織溶解物の水相を含む各ウェルに加えた。Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ ９６ロボット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とＭａｇＭａｘキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて製造業者のプロトコルに従ってリボ核酸（ＲＮＡ）を組織溶解物から単離した。１００μＬの溶出ＲＮＡを、磁気スタンドを用いて磁気ビーズから分離した。ＲＮＡの収量と品質を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ８０００機器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて評価した。
相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）は、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、１０μＬのＲＮＡおよび１０μＬの既定のＲＴマスターミックス（１０ｘＲＴバッファー、１０ｘランダムプライマー、２５ｘｄＮＴＰミックス、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ酵素、およびＲＮＡｓｅフリー水）とともに用いて調製した。必要に応じて、ＲＮＡおよびＲＴマスターミックスの体積を調整して、前記生成物が１００～１，０００ｎｇの範囲になるようにした。逆転写は、Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｂｉｏｒａｄサーマルサイクラーで下記プログラムを用いて行った：２５℃で１０分間、３７℃で１２０分間、８５℃で５分間、および４℃で保持。
ｃＤＮＡを、バイオラッドＣＦＸ３８４サーマルサイクラーを用いてＲＴ－ｑＰＣＲに付した。ｃＤＮＡをヌクレアーゼフリー水で１０倍に希釈し、４μＬの希釈ｃＤＮＡを各１０μＬのＰＣＲ反応物に加えた。各試料を、技術的に４回分析した。２ｘＦａｓｔＭｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ（Ｑｉａｇｅｎ）マスターミックスをトリプレックスアッセイのために用い、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅｓ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏｒａｄ）を他のアッセイのために用いた。
下記のサイクリング条件を用いた：Ｑｉａｇｅｎ Ｆａｓｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘマスターミックス→９５℃で５分間、９５℃で４５秒間、６０℃で４５秒間、プレート読み取り、４０サイクル；Ｂｉｏｒａｄ ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄマスターミックス→９５℃で９０秒間、９５℃で１２秒間、６０℃で４０秒間、プレート読み取り、４２サイクル。
ＲＮＡ単離ステップの前後のＧＦＰ ＲＮＡのスパイクを用いてＲＮＡ回収率％を評価した。実験動物からのプールしたＲＮＡの４サンプル５倍希釈系列を標準曲線として使用した。試料データを、３つのハウスキーピング遺伝子ＡＴＰ５Ｂ、ＥＩＦ４Ａ２、およびＧＡＰＤＨの幾何平均に対して正規化した。
前記実験からのα－シヌクレイン、ＺＦＰ－ＴＦ、ＧＦＡＰ、ＩＢＡ１、およびＮｅｕＮのｍＲＮＡ発現データを図８Ａおよび８Ｂに示す。前記データにより、顕著なＺＦＰ－ＴＦ発現を示す脳領域でα－シヌクレインの抑制があったことが示される。さらに、ＧＦＡＰ、ＩＢＡ１、およびＮｅｕＮの発現データにより、ＺＦＰ－ＴＦの投与が、神経炎症マーカーの発現の上昇も神経マーカーのＮｅｕＮの発現の低下も生じなかったことから、ＺＦＰ－ＴＦが十分な忍容性を有することが示される。
配列表
下記の表１は、本開示の３３個の例示的な操作されたＺＦＰを記載する。各ＺＦＰについて、ＺＦＰドメイン内の各ジンクフィンガーのゲノム標的配列（結合配列）およびＤＮＡ結合認識ヘリックス配列（すなわち、Ｆ１－Ｆ６）を一行で表示する。下記表中の「＾」は、示されるヘリックス中の１番目のアミノ酸の上流４番目のアルギニン（Ｒ）残基がグルタミン（Ｑ）に変化していることを示す。配列番号（配列番号＃）を括弧内に示す。
下記の表１は、本開示の３３個の例示的な操作されたＺＦＰを記載する。各ＺＦＰについて、ＺＦＰドメイン内の各ジンクフィンガーのゲノム標的配列（結合配列）およびＤＮＡ結合認識ヘリックス配列（すなわち、Ｆ１－Ｆ６）を一行で表示する。下記表中の「＾」は、示されるヘリックス中の１番目のアミノ酸の上流４番目のアルギニン（Ｒ）残基がグルタミン（Ｑ）に変化していることを示す。配列番号（配列番号＃）を括弧内に示す。
下記の表２は、本開示の３３個の例示的なＺＦＰ－ＴＦの全アミノ酸配列を記載するものであって、ＤＮＡ結合認識ヘリックス配列が、太字であり、モジュール内およびモジュール間リンカーが、下線で示される。Ｒ（－５）Ｑ骨格の変異は、太字と下線で示す。括弧内は、配列番号（配列番号＃）を示す。
Claims (27)
- ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインおよび転写リプレッサードメインを含む融合タンパク質であって、前記ＺＦＰドメインが、ヒトα－シヌクレイン遺伝子（ＳＮＣＡ遺伝子）における標的領域に結合する、融合タンパク質。
- 前記標的領域が、ＳＮＣＡ遺伝子における転写開始部位（ＴＳＳ）の１ｋｂ以内である、請求項１に記載の融合タンパク質。
- 前記ＴＳＳが、ＴＳＳ１、２ａ、または２ｂである、請求項２に記載の融合タンパク質。
- 前記標的領域が、ＳＮＣＡ遺伝子の、ＴＳＳ１の上流５００ｂｐ以内、ＴＳＳ１の下流５００ｂｐ以内、ＴＳＳ２ａの上流５００ｂｐ以内、および／またはＴＳＳ２ｂの下流５００ｂｐ以内である、請求項３に記載の融合タンパク質。
- 前記ＺＦＰドメインが、６個のジンクフィンガーを含み、前記融合タンパク質が、適宜、前記ＳＮＣＡ遺伝子の発現を、検出可能なオフターゲット結合または活性がないか、または最小において、少なくとも約４０％、７５％、９０％、９５％、または９９％まで抑制する、請求項１に記載のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記転写リプレッサードメインが、ヒトＫＯＸ１に由来するＫＲＡＢドメインアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記ＺＦＰドメインが、ペプチドリンカーを介して転写リプレッサーに結合されている、請求項１～６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記ＺＦＰドメインが、表１に示されるＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記ＺＦＰドメインが、表１のうちの一行に示されるＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記コーディング配列が、転写調節エレメントに作動可能に連結されている、請求項１～９のいずれか１項に記載の融合タンパク質のコーディング配列を含む、核酸構築物。
- 前記転写調節エレメントが、脳細胞において構成的に活性または誘導性である哺乳動物プロモーターであり、前記プロモーターが、適宜、ヒトシナプシンＩプロモーターである、請求項１０に記載の核酸構築物。
- 請求項１０または１１に記載の核酸構築物を含む、組換えウイルス。
- 前記組換えウイルスが、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、請求項１２に記載の組換えウイルス。
- 請求項１０または１１に記載の核酸構築物、あるいは請求項１２または１３に記載の組換えウイルス、および医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
- 請求項１０または１１に記載の核酸構築物、あるいは請求項１２または１３に記載の組換えウイルスを含む、宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、ヒト細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、脳細胞または多能性幹細胞であって、前記幹細胞が、適宜、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１５に記載の宿主細胞。
- ヒト脳細胞におけるα－シヌクレインの発現を阻害するための方法であって、適宜、請求項１０または１１に記載の核酸構築物あるいは請求項１２または１３に記載の組換えウイルスを導入することにより、請求項１～９のいずれか１項に記載の融合タンパク質を前記細胞に導入し、それにより前記細胞におけるα－シヌクレインの発現を阻害することを含む、方法。
- 前記ヒト脳細胞が、ニューロン、グリア細胞、上衣細胞、または神経上皮細胞である、請求項１８に記載の方法。
- 前記細胞が、パーキンソン病、レビー小体型認知症、アルツハイマー病、多系統萎縮症、または別のシヌクレイン病に罹患しているか、または発症するリスクがある患者の脳内にある、請求項１８または１９に記載の方法。
- 前記融合タンパク質を発現する組換えウイルスを前記細胞に導入することを含む、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記組換えウイルスが、適宜、血清型９のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項２１に記載の方法。
- 請求項１～９のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする組換えＡＡＶを前記患者に投与することを含む、患者のシヌクレイン病を治療するための方法。
- 前記ＡＡＶが、静脈内、髄腔内、脳室内、大槽内、線条体内、または黒質内注射、あるいはいずれかの脳領域への注射を介して前記患者に導入される、請求項２３に記載の方法。
- 前記シヌクレイン病が、パーキンソン病、レビー小体型認知症、アルツハイマー病、または多系統萎縮症である、請求項２３または２４に記載の方法。
- 請求項１８～２５のいずれか１項に記載の方法で使用するための、請求項１～９のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項１０または１１に記載の核酸構築物、あるいは請求項１２または１３に記載の組換えウイルス、請求項１４に記載の医薬組成物。
- 請求項１８～２５のいずれか１項に記載の方法における薬剤の製造のための、請求項１～９のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項１０または１１に記載の核酸構築物、あるいは請求項１２または１３に記載の組換えウイルスの使用。
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