JP2023545972A - アルファ-シヌクレイン発現を抑制するための新規ジンクフィンガータンパク質転写因子 - Google Patents
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Abstract
本開示は、神経系においてアルファ-シヌクレインの発現を阻害するジンクフィンガー融合タンパク質、ならびにパーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、アルツハイマー病、および他の神経変性疾患を治療するためにそのタンパク質を使用する方法を提供する。【選択図】図1
Description
関連出願への相互参照
本出願は、2020年10月2日に出願された米国仮出願63/087,164号の優先権を主張しており、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2020年10月2日に出願された米国仮出願63/087,164号の優先権を主張しており、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。2021年9月30日に作成された配列表の電子コピーは、025297_WO035_SL.txtという名前で、サイズは167,361バイトである。
本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。2021年9月30日に作成された配列表の電子コピーは、025297_WO035_SL.txtという名前で、サイズは167,361バイトである。
発明の背景
パーキンソン病(PD)は、運動障害を特徴とする神経変性疾患である。PD患者の約50%が最終的に認知症を発症する。PDは、アルツハイマー病に次いで2番目に蔓延している神経変性疾患である。米国には約100万人のPD患者がおり、毎年50,000~60,000人の新規患者が発生している。散発性PDの典型的な発症年齢は60~70歳である。一般に、最初の診断からPD合併症による死亡まで15~20年の期間がある。
パーキンソン病(PD)は、運動障害を特徴とする神経変性疾患である。PD患者の約50%が最終的に認知症を発症する。PDは、アルツハイマー病に次いで2番目に蔓延している神経変性疾患である。米国には約100万人のPD患者がおり、毎年50,000~60,000人の新規患者が発生している。散発性PDの典型的な発症年齢は60~70歳である。一般に、最初の診断からPD合併症による死亡まで15~20年の期間がある。
PD患者は、運動緩慢、固縮、前かがみの姿勢、仮面表情、体幹の前傾、腕の振りの減少、肘、手首、股関節および膝の屈曲、姿勢の不安定性、安静時の四肢の震え、および引きずり、小刻みな歩き方などの一連の運動症状を示す。患者は、嗅覚障害、睡眠障害、腸の運動性の低下、神経障害性疼痛、認知症などの非運動症状を有することもよくある。例えば、Jeanjean および Aubert, Lancet (2011) 378(9805):1773-4; Kalia および Lang, Lancet (2015) 386(9996):896-912を参照されたい。
PD患者の脳は、黒質と呼ばれる領域におけるドーパミン産生(ドーパミン作動性)ニューロンの喪失を特徴とする。PD患者の脳は、ニューロン内に形成されるタンパク質の凝集体または塊であるレビー小体と、レビー小体に類似したタンパク質凝集体を含有する神経突起(ニューロンの突起)であるレビー神経突起の存在によっても特徴付けられる。レビー小体は、1912年にFriedrich LewyによってPD患者の脳内で最初に発見され、その後、凝集した不溶性形態のアルファ-シヌクレインの原線維を含有することが判明した (Goedert and Spillantini, Mol Psychiatry. (1998) 3(6):462-5; Spillantini et al., Neurosci Lett. (1998) 251(3):205-8; Spillantini et al., Nature (1997) 388(6645):839-40)。アルファ-シヌクレイン遺伝子(SNCA)の変異は、1997年にPDを有する家族で同定された(例えば、Polymeropoulos et al., Science (1997) 276(5321):2045-7を参照されたい)。その後、SNCA遺伝子の重複と三重重複、およびアルファ-シヌクレインの追加の点突然変異が、PDの遺伝的または家族的形態と相関することが示された。さらに、アルファ-シヌクレインの発現レベルを制御するゲノム部分の変化は、大規模かつ公平な集団研究(ゲノムワイド関連研究、GWAS)においてPDのリスク増加と関連していることが示されている。
アルファ-シヌクレインは、ニューロンのシナプス前末端での小胞放出に関与する膜結合タンパク質である。また、DNA修復にも役割を果たしている可能性がある。成熟アルファ-シヌクレインは、NAC(アルツハイマー病アミロイドの非Aβ成分)領域として知られる疎水性アミノ酸を含有する中心コア領域(残基61~95)を有する小さな14kDタンパク質である。NACはタンパク質の凝集に寄与する。ミスフォールドされたアルファ-シヌクレインポリペプチドは凝集してオリゴマーおよびプロトフィブリルになり、それらが集まってレビー小体に見られる大きな不溶性凝集体を形成する。蓄積されている証拠は、アルファ-シヌクレインのミスフォールディングおよび凝集が、PDで発生する細胞損傷において中心的な役割を果たし、最終的には黒質のニューロンの死につながることを示している。さらに、プリオン病で見られるものと同様に、アルファ-シヌクレインの小さな凝集体が細胞から細胞へ移動し、脳全体に広がることが示されている。アルファ-シヌクレインの凝集を阻害すると、ニューロンへの損傷が軽減され、PDの進行が遅くなったり、進行が停止したりする可能性がある。
アルファ-シヌクレインのレベルを低下させる現在のアプローチは、RNAレベルでアルファ-シヌクレインを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)、および細胞外のアルファ-シヌクレインの特定の3D形状または立体構造を標的とするモノクローナル抗体(mAb)の使用を含む。しかしながら、アルファ-シヌクレインを標的とする臨床的に有効なPDを処置する方法が依然として緊急に必要とされている。
本開示は、ヒトSNCA遺伝子内またはその近傍の部位を標的とするジンクフィンガータンパク質(ZFP)ドメインを提供する。本開示のZFPドメインは、DNAレベルでヒトSNCA遺伝子の発現を特異的に阻害するために転写因子に融合されてもよい。これらの融合タンパク質は、(i)SNCA遺伝子の標的領域に特異的に結合するZFPドメイン、および(ii)遺伝子の転写を低下させる転写抑制ドメインを含有する。
一態様において、本開示は、ジンクフィンガータンパク質(ZFP)ドメインおよび転写抑制因子ドメインを含む融合タンパク質を提供し、ここで、ZFPドメインは、ヒトアルファ-シヌクレイン遺伝子(SNCA遺伝子)の標的領域に結合する。いくつかの実施形態において、標的領域(すなわち、標的部位)は、SNCA遺伝子内の転写開始部位(TSS、例えば、TSS1、2a、または2b)の約1kb以内にある。さらなる実施形態において、標的領域は、図1~3に示されるように、SNCA遺伝子のTSS2aの上流約500bp以内、TSS2bの下流約500bp以内、および/またはTSS1の上流もしくは下流約500bp以内にある。標的領域の非限定的な例を表1に示す。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、1つ以上(例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ)のジンクフィンガーを含む。それは、SNCA遺伝子の発現を少なくとも約40%、75%、90%、95%、または99%抑制することができ、好ましくは、検出可能なオフターゲット結合または活性(例えば、SNCA遺伝子でない遺伝子への結合)が全くないかまたは検出可能な最小限である。ジンクフィンガードメインの非限定的な例を表1に示す。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、表1に示す1つまたは複数の認識ヘリックス配列を含む。さらなる実施形態において、融合タンパク質は、単一の行からの認識ヘリックス配列の一部またはすべてを含む。示された骨格変異の有無にかかわらず、特定の実施形態において、融合タンパク質は、表2に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質の転写抑制ドメインは、KOX1タンパク質のKRABドメインに由来する。ジンクフィンガードメインは、ペプチドリンカーを介して転写抑制ドメインに連結されてもよい。別の態様において、本開示は、本融合タンパク質のコード配列を含む核酸構築物を提供し、コード配列は、脳細胞において構成的に活性であるか誘導可能な哺乳類プロモーターなどの転写調節要素に作動可能に連結されている。ここで、プロモーターは所望によりヒトシナプシンIプロモーターである。本開示はまた、核酸構築物を含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、脳細胞または多能性幹細胞などのヒト細胞であってもよく、幹細胞は所望により胚性幹細胞または誘導性多能性幹細胞(iPSC)であってもよい。
別の態様において、本開示は、ヒト脳細胞におけるアルファ-シヌクレインの発現を阻害する方法を提供し、該方法は、細胞に本融合タンパク質を導入し(例えば、核酸構築物またはAAV(例えば、AAV2、AAV6、AAV9、またはそれらのハイブリッド)などの組換えウイルスの導入を介して)、それによって細胞内のアルファ-シヌクレインの発現を阻害することを含む。脳細胞は、ニューロン、グリア細胞、上衣細胞、または神経上皮細胞であってもよい。パーキンソン病、レビー小体型認知症、アルツハイマー病、多系統萎縮症、または他のシヌクレイノパチーに罹患しているかまたはそれらを発症するリスクがある患者の脳内に細胞が存在してもよい。
本開示はまた、患者におけるシヌクレイノパチーを処置する(例えば、進行を遅らせる)方法であって、本開示の融合タンパク質をコードする組換えAAVを患者に投与することを含む方法も提供する。いくつかの実施形態において、AAVは、静脈内、くも膜下腔内、脳室内、大槽内、線条体内、もしくは黒皮内注射、または任意の脳領域への注射を介して患者に導入される。患者はパーキンソン病、レビー小体型認知症、アルツハイマー病、または多系統萎縮症を有してもよい。
本開示はまた、上記の方法で使用するための融合タンパク質、および上記の方法で使用するための薬剤の製造における本融合タンパク質の使用を提供する。
本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施形態および態様を示しているが、限定ではなく例示のみを目的として与えられていることが理解されるべきである。本発明の範囲内の様々な変更および修正は、詳細な説明から当業者には明らかとなる。
図1は、遺伝子内の18塩基対を認識する、操作された6フィンガージンクフィンガータンパク質転写因子(ZFP-TF)によるSNCA遺伝子の特異的標的化を示す。ZFP-TFが遺伝子に結合すると、SNCA転写が減少し、その結果、SNCA mRNAおよびアルファ-シヌクレインタンパク質レベルが減少する。この図は、例示的な操作されたZFP(SBS-82110)のゲノム標的配列(結合配列;配列番号226)を開示す。
図2Aは、ヒトSNCA遺伝子のゲノム構造を示す図である。この遺伝子は7つのエクソン(2つの非タンパク質コーディングおよび5つのタンパク質コーディング)を有し、各転写物は5つのイントロンを含有する。TSS1、TSS2a、TSS2bと名付けられた3つの転写開始部位(TSS)があり、それぞれ非コーディングエクソン1、2a、2bで始まる転写物が生成される。すべての転写産物の最初のタンパク質をコードするエクソンはエクソン3である。
図2Bは、ヒトSNCA遺伝子の上流ゲノム領域を示す図である。SNCA mRNA配列は赤いバーで示されている。遺伝子の下のクラスター内の小さな三角形は、本明細書に例示される416の代表的なZFP-TFによって標的とされるSNCA遺伝子内の領域を示す。この図は、ZFP-TF mRNAによるトランスフェクションの24時間後に採取されたSK-N-MCヒト神経芽腫細胞におけるヒトSNCA mRNA発現の減少に対する各ZFP-TFの効果も示している。メッセンジャーRNAレベルはRT-qPCRによって測定された。正規化されたSNCA発現レベルは、勾配バー「SNCA mRNA」によって示される。最も濃い(赤色)色は100%減少を示す。最も明るい色(白)は0%減少を示す。RT-qPCRデータは、2つのハウスキーピング遺伝子(ATP5BおよびEIF4A2)のmRNAレベルの平均に対して正規化された。右向きの三角形は、ZFP-TFが遺伝子のセンス鎖に結合することを示す。左向きの三角形は、ZFP-TFが遺伝子のアンチセンス鎖に結合することを示す。
図3A~3Eは、本明細書に記載の416個のZFP-TFのライブラリーからのスクリーニング結果を示すグラフである。スクリーニングは、SK-N-MCヒト神経上皮細胞株で行われた。各グラフのy軸は、2つのハウスキーピング遺伝子(EIF4A2およびATP5B)の幾何平均に正規化され、さまざまなZFP-TFをコードするRNAでトランスフェクションの24時間後に評価されたアルファ-シヌクレインmRNA発現である。RNAの投与量は左から右に増加する(3、10、30、100、300、および1,000ng)。バーは4つの技術的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。グラフの下の数字は、ZFP-TFの内部参照番号である。
図4は、ヒトSNCA遺伝子の上流ゲノム領域を示す図である。SNCA mRNA配列は赤いバーで示されている。遺伝子の下のクラスター内の小さな三角形は、1、2、または3個のリン酸接触変異を有する27の代表的なZFP-TFによって標的とされるSNCA遺伝子内の領域を示している。この図は、ZFP-TF mRNAによるトランスフェクションの24時間後に採取されたSK-N-MCヒト神経芽腫細胞におけるヒトSNCA mRNA発現の減少に対する各ZFP-TFの効果も示している。メッセンジャーRNAレベルはRT-qPCRによって測定された。正規化されたSNCA発現レベルは、勾配バー「SNCA mRNA」によって示される。最も濃い(赤)色は100%減少を示す。最も明るい色(白)は0%減少を示す。RT-qPCRデータは、2つのハウスキーピング遺伝子(ATP5BおよびEIF4A2)のmRNAレベルの平均に対して正規化された。右向きの三角形は、ZFP-TFが遺伝子のセンス鎖に結合することを示す。左向きの三角形は、ZFP-TFが遺伝子のアンチセンス鎖に結合することを示す。
図5は、1、2、または3個のリン酸接触変異を有する27個の代表的なZFP-TFのライブラリーからの例示的なスクリーニング結果を示す。スクリーニングは、SK-N-MCヒト神経上皮細胞株で行われた。各グラフのy軸は、2つのハウスキーピング遺伝子(EIF4A2およびATP5B)の幾何平均に正規化され、さまざまなZFP-TFをコードするRNAでトランスフェクションの24時間後に評価されたアルファ-シヌクレインmRNA発現である。RNAの投与量は左から右に増加する(3、10、30、100、300、および1,000ng)。バーは4つの技術的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。グラフの下の数字は、ZFP-TFの内部参照番号である。
図6Aおよび6Bは、40のアルファ-シヌクレインZFP-TFがSK-N-MCヒト神経芽腫細胞およびヒトiPSC由来ニューロンにおいて一連のアルファ-シヌクレイン抑制活性を示したことを示すグラフのパネルである。表1および表2に記載されている20の例示的なZFP-TFが、パネルAに示されている。図3A~3Eに特徴づけられるが表1および2には記載されない例示的ZFP-TFが、パネルBに示されている。y軸は、2つのハウスキーピング遺伝子(ATP5BおよびEIF4A2)の幾何平均に正規化され、異なるZFP-TFをコードするRNAをSK-N-MC細胞にトランスフェクションした24時間後、または異なるZFP-TFをコードするAAV6をiPSC由来ニューロンに形質導入した28日後に評価されるアルファ-シヌクレインmRNA発現である。使用したRNAまたはAAV6の量は、RNA(3、10、30、100、300、および1,000ng)またはAAV6(1E3、3E3、1E4、3E4、1E5、および3E5)の左から右に増加する用量とともにx軸に示されている。青およびオレンジのバーは4つの技術的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。滴定スケールの拡大版が図の下部に示されている。
図7A~7Dは、マウス初代ニューロン(AおよびB)およびヒトiPSC由来ニューロン(CおよびD)における40個のアルファ-シヌクレインZFP-TFのオフターゲット活性を示すボルケーノプロットのパネルである。簡単に参照できるように、図1~図4の棒グラフを示す。ヒトiPSC由来ニューロンにおけるZFP-TFの抑制活性を示す図6A~6Bは、対応するZFP-TFのボルケーノプロットの隣に示されている。ボルケーノプロットは、形質導入7日後のマウス初代ニューロン(AおよびB)または形質導入19日後のヒトiPSC由来ニューロン(CおよびD)のトランスクリプトームの変化を示すマイクロアレイデータを要約している。黄色の丸はヒトアルファ-シヌクレインを示す。緑色の円(各ボルケーノプロットの右側)は、2倍を超えて有意に上方制御された遺伝子を表す。これらの遺伝子の数は緑色のテキストで示される。赤い丸は、2倍を超えて有意にダウンレギュレートされた遺伝子を表す。これらの遺伝子の数は赤い文字で示される。
図8Aおよび8Bは、(A)ZFP-TFおよびアルファ-シヌクレインのmRNA発現レベル、または(B)グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、イオン化カルシウム結合アダプター分子1(IBA1)、および雌性PACシヌクレインマウスの異なる脳領域におけるNeuNのmRNA発現レベルを示すグラフのパネルである(Kuo et al., Hum Mol Genet. (2010) 19(9):1633-50)。動物には、線条体の2つの部位に、指定された試験品またはビヒクルをコードするAAV9を両側に投与した。すべての遺伝子発現データは、3つのハウスキーピング遺伝子(ATP5B、EIF4A2、およびGAPDH)の幾何平均に対して正規化されている。y軸は指定された遺伝子のmRNA発現レベル、x軸は脳領域である。赤い四角は、ZFP-TF82195を投与したn=3匹の動物の平均発現データを示し、緑の三角は、ZFP-TF82264を投与したn=3匹の動物の平均発現データを示す。パネルAでは、アルファ-シヌクレインmRNA発現は、3匹のビヒクル処置動物の平均値であり、ZFP-TF発現は入力RNA 1ngあたりのコピー数として対数スケールで提供される。パネルBでは、すべての発現データが3匹のビヒクル処置動物の平均に対して正規化されている。統計分析は、一元配置分散分析(ANOVA)に続いてダネットの多重比較検定を使用して実行された。*p<0.05、**p<0.01、***,p<0.001、***,p<0.0001。
発明の詳細な説明
本開示は、ヒトSNCA遺伝子内またはその近傍の部位(すなわち、配列)を標的とするZFPドメインを提供する。本明細書に記載のZFPドメインは、別の機能性分子またはドメインに結合または融合されていてもよい。本開示のZFPドメインは、ヒトSNCA遺伝子のRNAへの転写を抑制するために転写因子に融合されてもよい。融合タンパク質はジンクフィンガータンパク質転写因子(ZFP-TF)と呼ばれる。これらのZFP-TFは、SNCA遺伝子内またはその近くの標的領域に特異的に結合するジンクフィンガータンパク質(ZFP)ドメインと、遺伝子の転写を低下させる転写抑制ドメインを含む。ZFP-TFを患者の脳に導入することによってニューロン内のアルファ-シヌクレインのレベルを低下させると、アルファ-シヌクレインのオリゴマー(より小さな可溶性凝集体)またはフィブリル(より大きな不溶性凝集体)形態への集合を阻害(例えば、減少または停止)することが期待される。アルファ-シヌクレインの凝集が減少すると、脳細胞は細胞の品質管理機構を使って、ミスフォールドされた有毒なアルファ-シヌクレインを適時に除去する能力を有するようになる。その結果、アルファ-シヌクレインの凝集および細胞間の伝播が減少または防止される。
本開示は、ヒトSNCA遺伝子内またはその近傍の部位(すなわち、配列)を標的とするZFPドメインを提供する。本明細書に記載のZFPドメインは、別の機能性分子またはドメインに結合または融合されていてもよい。本開示のZFPドメインは、ヒトSNCA遺伝子のRNAへの転写を抑制するために転写因子に融合されてもよい。融合タンパク質はジンクフィンガータンパク質転写因子(ZFP-TF)と呼ばれる。これらのZFP-TFは、SNCA遺伝子内またはその近くの標的領域に特異的に結合するジンクフィンガータンパク質(ZFP)ドメインと、遺伝子の転写を低下させる転写抑制ドメインを含む。ZFP-TFを患者の脳に導入することによってニューロン内のアルファ-シヌクレインのレベルを低下させると、アルファ-シヌクレインのオリゴマー(より小さな可溶性凝集体)またはフィブリル(より大きな不溶性凝集体)形態への集合を阻害(例えば、減少または停止)することが期待される。アルファ-シヌクレインの凝集が減少すると、脳細胞は細胞の品質管理機構を使って、ミスフォールドされた有毒なアルファ-シヌクレインを適時に除去する能力を有するようになる。その結果、アルファ-シヌクレインの凝集および細胞間の伝播が減少または防止される。
アルファ-シヌクレイン阻害に対する我々のZFP-TFアプローチは、他者によって試験されている現在のアプローチと比較して、いくつかの利点を有する。ZFP-TFは(ZFP-TF発現構築物を患者に導入することにより)1回のみ投与する必要があるが、ASOは反復投与が必要である。さらに、ZFP-TFアプローチでは、各細胞のゲノム内のSNCA遺伝子の2つの対立遺伝子を関与させるだけで済む。対照的に、ASOは各細胞内のSNCA mRNAの多数のコピーに関与する必要がある。
我々のZFP-TFアプローチは、抗体がアルファ-シヌクレインの形状または立体構造のサブセットにしか結合できないため、抗体アプローチよりも有利である。これでは確実な治療効果を得るには十分ではない可能性がある。対照的に、ZFP-TFはアルファ-シヌクレインの発現をDNAレベルで抑制し、あらゆる形態のアルファ-シヌクレインのレベルを低下させる。したがって、ZFP-TFは、抗体とは異なり、有毒種の形態に依存しない。さらに、抗体は主に細胞内または細胞外のアルファ-シヌクレインに作用すると考えられているが、ZFP-TFは細胞内のアルファ-シヌクレインを直接減少させ、間接的に細胞外のアルファ-シヌクレインレベルを低下させることができる。したがって、アルファ-シヌクレインは主に細胞内タンパク質であるため、ZFP-TFアプローチはより効果的であると予想される。さらに、抗体は反復投与する必要があるが、ZFP-TFは発現構築物の送達を1回だけ必要とする。
I.ZFPドメインの標的
本融合タンパク質のZFPドメインは、ヒトSNCA遺伝子内またはその近傍の標的領域に特異的に結合する。図1は、ZFPドメインの標的SNCA遺伝子配列への結合を示す。該図のZFPドメインは6つのジンクフィンガーを有する。しかしながら、以下でさらに説明するように、より少ないまたはより多くのジンクフィンガーを有するZFPドメインも使用することができる。
本融合タンパク質のZFPドメインは、ヒトSNCA遺伝子内またはその近傍の標的領域に特異的に結合する。図1は、ZFPドメインの標的SNCA遺伝子配列への結合を示す。該図のZFPドメインは6つのジンクフィンガーを有する。しかしながら、以下でさらに説明するように、より少ないまたはより多くのジンクフィンガーを有するZFPドメインも使用することができる。
ヒトSNCA遺伝子は約117kbに及び、chr4:89,724,099-89,838,315(GRCh38/hg38)にマッピングされている。そのヌクレオチド配列は、GenBankアクセッション番号NC_000004バージョン000004.12で入手できる。この遺伝子は7つのエクソン(2つの非タンパク質コーディングおよび5つのタンパク質コーディング)を有し、各転写物は5つのイントロンを有する(図2A)。この遺伝子は3つの転写開始部位(TSS)を有し、1つはエクソン1の先頭に、2つはエクソン2にあり、その結果、エクソン2aと2bが発現する。最初のタンパク質をコードするエクソンはエクソン3である。Touchman et al., Genome Res. (2001) 11:78-86も参照されたい。ヒトアルファ-シヌクレインのアイソフォーム1(全長)を以下に示す:
アイソフォーム2~4は、アミノ酸残基103~130が欠失している点でアイソフォーム1とは異なる。アイソフォーム2~5は、アミノ酸残基41~54が欠落している点でアイソフォーム1とは異なる。アルファ-シヌクレインの遺伝子分析は、遺伝子コピーの増幅を指摘している(例えば、Brueggemann et al., Neurology (2008) 71:1294; Troiano et al., Neurology (2008) 71:1295; Uchiyama et al., Neurology (2008) 71:1289-90を参照されたい)、および特定の点変異は、PDおよびレビー小体型認知症などのシヌクレイノパチーの潜在的な原因として挙げられる。 例えば、以下のアルファ-シヌクレイン点突然変異が、一部のPD患者において同定されている:A30P(Kruger et al., Nature Genet. (1998) 18:106-8); E46K (Zarranz et al., Ann Neurol. (2004) 55:164-73; Choi et al., FEBS Lett. (2004) 576:363-8); H50Q (Khalaf et al., J Biol Chem. (2014) 289:21856-76); G51D (Lesage et al., Ann Neurol. (2013) 73:459-71); およびA53T (Polymeropoulos et al., Science (1997) 276:2045-7)。
ZFP-TFのDNA結合ZFPドメインは、融合タンパク質をSNCA遺伝子の標的領域に導き、融合タンパク質の転写抑制ドメインを標的領域に導く。次に、リプレッサードメインは、RNAポリメラーゼによるSNCA遺伝子の転写を抑制する。ZFP-TFの標的領域は、遺伝子発現の抑制を可能にするSNCA遺伝子内またはその近くの任意の適切な部位であり得る。例として、標的領域は、SNCATSSまたはSNCA転写調節要素(例えば、プロモーター、エンハンサー、RNAポリメラーゼ休止部位など)を含むか、またはそれら(の下流または上流のいずれか)に隣接する。
上述したように、ヒトSNCA遺伝子は3つの転写開始点(TSS)を有する。それらは、5’から3’まで、TSS1、TSS2a、およびTSS2bであり、エクソン1(TSS1)、エクソン2a、およびエクソン2b(TSS2aおよび2b)の5’末端に位置する(図2B)。3つのTSSでの転写により、異なる長さのRNAアイソフォームが生成される。しかしながら、アルファ-シヌクレインの翻訳はエクソン3から始まるため、異なるTSSから生成されたRNAは同じタンパク質の形成につながる。いくつかの実施形態において、本ZFP-TFのゲノム標的領域は、TSS1(例えば、塩基対529~1529)またはTSS2aおよび2b(例えば、塩基対1613~2949)にわたるか、またはその近傍にある。特定の実施形態において、標的領域は、TSS1の上流または下流約500bp以内、および/またはTSS2aの上流または下流約500bp以内、および/またはTSS2bの上流または下流約500bp以内にある。
いくつかの実施形態において、ゲノム標的領域は少なくとも8bpの長さである。例えば、標的領域は、8bp~40bpの長さ、例えば、12、15、18、21、24、27、30、33、または36bpの長さであってもよい。標的配列は、遺伝子のセンス鎖上に存在する場合もあれば、遺伝子のアンチセンス鎖上に存在する場合もある。ターゲティング精度を確保し、ZFP-TFによるオフターゲット結合または活性を低減するために、選択されたSNCA標的領域の配列は、他の遺伝子の配列に対して好ましくは75%未満(例えば、70%未満、65%未満、60%未満、または50%未満)の相同性を有する。特定の実施形態において、本ZFP-TFの標的領域は、長さが15~18bpであり、TSS1、2a、または2bの500bp以内に存在する。対象領域の例を図2Bおよび表1に示す。
いくつかの実施形態において、本発明の操作されたZFPは、表1の単一行に示されるように、標的部位(すなわち、結合配列)に結合し、好ましくは検出可能なオフターゲット結合または活性が全くないかまたはほとんどない。
標的セグメントをさらに評価するための他の基準は、かかるセグメントまたは関連セグメントに結合するZFPの事前の入手可能性、所与の標的セグメントに結合する新しいZFPの設計の容易さ、およびオフターゲット結合のリスクを含む。
II.ZFPドメイン
「ジンクフィンガータンパク質」または「ZFP」は、亜鉛によって安定化されるDNA結合ドメインを有するタンパク質を指す。ZFPは配列特異的な方法でDNAに結合する。ZFPの個々のDNA結合ユニットは、ジンク「フィンガー」と呼ばれる。各フィンガーは、通常7つのアミノ酸残基で構成され、DNA結合の特異性を決定するDNA結合「認識ヘリックス」を含有する。ZFPドメインは少なくとも1つのフィンガーを有し、各フィンガーは2~4塩基対のDNA、通常は3塩基対または4塩基対のDNAに結合する。各ジンクフィンガーは通常、約30個のアミノ酸で構成され、亜鉛をキレートする。操作されたZFPは、天然に存在するZFPと比較して、新しい結合特異性を有することができる。操作手法は、合理的な設計やさまざまな種類の選択を含むが、これらに限定されない。合理的な設計は、例えば、トリプレット(またはクアドラプレット)ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用を含み、各トリプレットまたはクアドラプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドラプレット配列に結合するジンクフィンガーの1つまたは複数のアミノ酸配列と関連付けられる。例えば、U.S. Pats. 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,140,081; 6,200,759; 6,453,242; 6,534,261; 6,979,539;および8,586,526;および国際特許公開WO95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197; WO 02/016536; WO 02/099084; およびWO 03/016496に詳細に記載されているZFP設計方法を参照されたい。本明細書に記載のZFPドメインは、別の分子、例えばタンパク質に結合または融合されてもよい。かかるZFP融合体は、遺伝子活性化(例えば、活性化ドメイン)、遺伝子抑制(例えば、抑制ドメイン)、リガンド結合(例えば、リガンド結合ドメイン)、ハイスループットスクリーニング(例えば、リガンド結合ドメイン)、局所的超突然変異(例えば、活性化誘導シチジンデアミナーゼドメイン)、クロマチン修飾(例えば、ヒストンデアセチラーゼドメイン)、組換え(例えば、リコンビナーゼドメイン)、標的化組み込み(例えば、インテグラーゼドメイン)、DNA修飾(例えば、DNAメチル-トランスフェラーゼドメイン)、塩基編集(塩基編集ドメインなど)、または標的化されたDNA切断(ヌクレアーゼドメインなど)を可能にするドメインを含んでもよい。操作されたZFPドメインの例を表1に示す。
「ジンクフィンガータンパク質」または「ZFP」は、亜鉛によって安定化されるDNA結合ドメインを有するタンパク質を指す。ZFPは配列特異的な方法でDNAに結合する。ZFPの個々のDNA結合ユニットは、ジンク「フィンガー」と呼ばれる。各フィンガーは、通常7つのアミノ酸残基で構成され、DNA結合の特異性を決定するDNA結合「認識ヘリックス」を含有する。ZFPドメインは少なくとも1つのフィンガーを有し、各フィンガーは2~4塩基対のDNA、通常は3塩基対または4塩基対のDNAに結合する。各ジンクフィンガーは通常、約30個のアミノ酸で構成され、亜鉛をキレートする。操作されたZFPは、天然に存在するZFPと比較して、新しい結合特異性を有することができる。操作手法は、合理的な設計やさまざまな種類の選択を含むが、これらに限定されない。合理的な設計は、例えば、トリプレット(またはクアドラプレット)ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用を含み、各トリプレットまたはクアドラプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドラプレット配列に結合するジンクフィンガーの1つまたは複数のアミノ酸配列と関連付けられる。例えば、U.S. Pats. 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,140,081; 6,200,759; 6,453,242; 6,534,261; 6,979,539;および8,586,526;および国際特許公開WO95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197; WO 02/016536; WO 02/099084; およびWO 03/016496に詳細に記載されているZFP設計方法を参照されたい。本明細書に記載のZFPドメインは、別の分子、例えばタンパク質に結合または融合されてもよい。かかるZFP融合体は、遺伝子活性化(例えば、活性化ドメイン)、遺伝子抑制(例えば、抑制ドメイン)、リガンド結合(例えば、リガンド結合ドメイン)、ハイスループットスクリーニング(例えば、リガンド結合ドメイン)、局所的超突然変異(例えば、活性化誘導シチジンデアミナーゼドメイン)、クロマチン修飾(例えば、ヒストンデアセチラーゼドメイン)、組換え(例えば、リコンビナーゼドメイン)、標的化組み込み(例えば、インテグラーゼドメイン)、DNA修飾(例えば、DNAメチル-トランスフェラーゼドメイン)、塩基編集(塩基編集ドメインなど)、または標的化されたDNA切断(ヌクレアーゼドメインなど)を可能にするドメインを含んでもよい。操作されたZFPドメインの例を表1に示す。
本発明の操作されたZFP融合タンパク質のZFPドメインは、少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、またはそれ以上)のジンクフィンガーを含んでもよい。1本のフィンガーを有するZFPドメインは、通常、3つまたは4つのヌクレオチドを含む標的部位を認識する。2本のフィンガーを有するZFPドメインは、通常、6または8ヌクレオチドを含む標的部位を認識する。3本のフィンガーを有するZFPドメインは、通常、9または12ヌクレオチドを含む標的部位を認識する。4本のフィンガーを有するZFPドメインは、通常、12~15個のヌクレオチドを含む標的部位を認識する。5本のフィンガーを有するZFPドメインは、通常、15~18ヌクレオチドを含む標的部位を認識する。6本のフィンガーを有するZFPドメインは、18~21ヌクレオチドを含む標的部位を認識できる。
いくつかの実施形態において、本操作されたZFPは、表1に示すDNA結合認識ヘリックス配列を含む。例えば、操作されたZFPは、表1に示すF1、F2、F3、F4、F5、またはF6の配列を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、本操作されたZFPは、表1の単一行に示される2つの隣接するDNA結合認識ヘリックス配列を含む。例えば、操作されたZFPは、表1の単一行に示されているF1-F2、F2-F3、F3-F4、F4-F5、またはF5-F6の配列を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、本操作されたZFPは、表1の単一行に示されるDNA結合認識ヘリックス配列を含む。例えば、操作されたZFPは、表1の単一行に示されているF1、F2、F3、F4、F5、およびF6(例えばF1~F6)の配列を含んでもよい。
ZFPドメインの標的特異性は、例えば、U.S. Pat. Pub. 2018/0087072に記載されているように、ZFP骨格配列に対する突然変異によって改善されてもよい。この変異は、DNA骨格上のリン酸と非特異的に相互作用する可能性があるが、ヌクレオチド標的特異性には関与しない、ZFP骨格内の残基に生じた変異を含む。いくつかの実施形態において、これらの変異は、カチオン性アミノ酸残基を中性またはアニオン性アミノ酸残基に変異させることを含む。いくつかの実施形態において、これらの変異は、極性アミノ酸残基を中性または非極性アミノ酸残基に変異させることを含む。さらなる実施形態において、突然変異は、DNA結合ヘリックスに対して位置(-5)、(-9)および/または(-14)で行われる。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーは、位置(-5)、(-9)および/または(-14)に1つまたは複数の突然変異を含んでもよい。さらなる実施形態において、マルチフィンガーZFPドメイン内の1つまたは複数のジンクフィンガーは、位置(-5)、(-9)および/または(-14)に変異を含んでもよい。いくつかの実施形態において、位置(-5)、(-9)および/または(-14)のアミノ酸(例えば、アルギニン(R)またはリジン(K))は、アラニン(A)、ロイシン(L)、セリン(S)、アスパラギン酸(N)、グルタミン酸(E)、チロシン(Y)、および/またはグルタミン(Q)に変異される。1、2、または3個の骨格変異を有する操作されたZFPの例を図1~3に示す。表1の記号「^」は、示された認識ヘリックスの最初のアミノ酸の上流4番目の位置にあるアルギニン(R)残基がグルタミン(Q)に変更されていることを示す。各認識ヘリックス配列では、7つのDNA結合アミノ酸の位置に-1、+1、+2、+3、+4、+5、および+6の番号が付けられる。したがって、RからQへの置換の位置には(-5)と番号が付けられる。
いくつかの実施形態において、本操作されたZFPは、表1に示すDNA結合認識ヘリックス配列および関連する骨格変異を含む。いくつかの実施形態において、本操作されたZFPは、表1の単一行に示されているDNA結合認識ヘリックス配列および関連する骨格変異を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたZFPは、表2の単一行に示される配列の認識ヘリックスおよび骨格部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたZFPは、配列の認識ヘリックスおよび骨格部分を含む。翻訳後修飾後に出現する配列を表2の単一行に示す。例えば、翻訳後修飾により、表2に示すように配列から開始メチオニン残基が除去されてもよい。
いくつかの実施形態において、本発明のZFP-TFは、1つ以上のジンクフィンガードメインを含む。ドメインは、例えば、1つのドメインが1つまたは複数(例えば、4、5、または6)のジンクフィンガーを含み、別のドメインが追加の1つまたは複数(例えば、4、5、または6)のジンクフィンガーを含むように、伸長可能な柔軟なリンカーを介して一緒に連結されてもよい。いくつかの実施形態において、リンカーは、フィンガーアレイが8、9、10、11または12以上のフィンガーを含む1つのDNA結合ドメインを含むような標準的なフィンガー間リンカーである。他の実施形態において、リンカーは、柔軟なリンカーなどの非定型リンカーである。例えば、2つのZFPドメインは、(N末端からC末端への)ZFP-ZFP-TF、TF-ZFP-ZFP、ZFP-TF-ZFP、またはZFP-TF-ZFP-TF(2つのZFP-TF融合タンパク質がリンカーを介して融合されている)の構成で転写抑制因子TFに連結されてもよい。
いくつかの実施形態において、ZFP-TFは「両手型」である、すなわち、それらは、2つのZFPドメインが2つの不連続な標的部位に結合するように、介在アミノ酸によって分離された2つのジンクフィンガークラスター(2つのZFPドメイン)を含有する。両手タイプのジンクフィンガー結合タンパク質の例はSIP1である。SIP1では、4つのジンクフィンガーのクラスターがタンパク質のアミノ末端に位置し、3つのジンクフィンガーのクラスターがカルボキシル末端に位置している (Remacle et al., EMBO J. (1999) 18(18):5073-84を参照されたい)。これらのタンパク質のジンクフィンガーの各クラスターは、固有の標的配列に結合することができ、2つの標的配列間の間隔は多くのヌクレオチドを含む可能性がある。
III.ジンクフィンガータンパク質転写因子
本明細書に記載されるZFPドメインは、転写因子に融合されてもよい。いくつかの実施形態において、本融合タンパク質は、DNA結合ジンクフィンガータンパク質(ZFP)ドメインおよび転写因子ドメイン(すなわち、ZFP-TF)を含有する。いくつかの実施形態において、転写因子は、転写リプレッサードメインであってもよく、ZFPおよびリプレッサードメインは、直接ペプチジル結合もしくはペプチドリンカーによって、あるいは二量体化(例えば、ロイシンジッパー、STATタンパク質N末端ドメイン、またはFK506結合タンパク質を介する)によって互いに結合していてもよい。本明細書で使用する場合、「融合タンパク質」とは、共有結合したドメインを有するポリペプチド、および非共有結合を通じて互いに結合したポリペプチドの複合体を指す。転写抑制ドメインは、ZFPドメインのC末端またはN末端を含む任意の適切な位置でZFPドメインと結合することができる。
本明細書に記載されるZFPドメインは、転写因子に融合されてもよい。いくつかの実施形態において、本融合タンパク質は、DNA結合ジンクフィンガータンパク質(ZFP)ドメインおよび転写因子ドメイン(すなわち、ZFP-TF)を含有する。いくつかの実施形態において、転写因子は、転写リプレッサードメインであってもよく、ZFPおよびリプレッサードメインは、直接ペプチジル結合もしくはペプチドリンカーによって、あるいは二量体化(例えば、ロイシンジッパー、STATタンパク質N末端ドメイン、またはFK506結合タンパク質を介する)によって互いに結合していてもよい。本明細書で使用する場合、「融合タンパク質」とは、共有結合したドメインを有するポリペプチド、および非共有結合を通じて互いに結合したポリペプチドの複合体を指す。転写抑制ドメインは、ZFPドメインのC末端またはN末端を含む任意の適切な位置でZFPドメインと結合することができる。
いくつかの実施形態において、本ZFP-TFは、約25nM未満のKDでその標的に結合し、ヒトSNCA遺伝子の転写を20%以上(例えば、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または95%以上)抑制する。いくつかの実施形態において、本ZFP-TFの2つ以上が患者において同時に使用され、ZFP-TFは、SNCA発現の最適な抑制を達成するために、SNCA遺伝子内の異なる標的領域に結合する。
A.転写抑制因子ドメイン
本発明のZFP-TFは、本明細書に記載の操作されたZFPドメインと、SNCA遺伝子の転写活性を弱める1つ以上の転写抑制ドメインとを含む。1つ以上の操作されたZFPドメインおよび1つ以上の転写抑制ドメインは、柔軟なリンカーによって結合されてもよい。転写抑制ドメインの非限定的な例は、KOX1、KAP-1、MAD、FKHR、EGR-1、ERD、SID、TGF-β誘導性初期遺伝子(TIEG)、v-ERB-A、MBD2、MBD3、TRa、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチラーゼ(HDAC)、核ホルモン受容体(例えば、エストロゲン受容体または甲状腺ホルモン受容体)、DNMTファミリーのメンバー(例えば、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)、Rb、およびMeCP2のKRABドメインである。 例えば、Bird et al. (1999) Cell 99:451-454; Tyler et al. (1999) Cell 99:443-446; Knoepfler et al. (1999) Cell 99:447-450; および Robertson et al. (2000) Nature Genet. 25:338-342を参照されたい。さらなる例示的な抑制ドメインは、ROM2およびAtHD2Aを含むが、これらに限定されない。例えば、Chem et al. (1996) Plant Cell 8:305-321; およびWu et al. (2000) Plant J. 22:19-27を参照されたい。
本発明のZFP-TFは、本明細書に記載の操作されたZFPドメインと、SNCA遺伝子の転写活性を弱める1つ以上の転写抑制ドメインとを含む。1つ以上の操作されたZFPドメインおよび1つ以上の転写抑制ドメインは、柔軟なリンカーによって結合されてもよい。転写抑制ドメインの非限定的な例は、KOX1、KAP-1、MAD、FKHR、EGR-1、ERD、SID、TGF-β誘導性初期遺伝子(TIEG)、v-ERB-A、MBD2、MBD3、TRa、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチラーゼ(HDAC)、核ホルモン受容体(例えば、エストロゲン受容体または甲状腺ホルモン受容体)、DNMTファミリーのメンバー(例えば、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)、Rb、およびMeCP2のKRABドメインである。 例えば、Bird et al. (1999) Cell 99:451-454; Tyler et al. (1999) Cell 99:443-446; Knoepfler et al. (1999) Cell 99:447-450; および Robertson et al. (2000) Nature Genet. 25:338-342を参照されたい。さらなる例示的な抑制ドメインは、ROM2およびAtHD2Aを含むが、これらに限定されない。例えば、Chem et al. (1996) Plant Cell 8:305-321; およびWu et al. (2000) Plant J. 22:19-27を参照されたい。
いくつかの実施形態において、転写抑制ドメインは、ヒトジンクフィンガータンパク質10/KOX1(ZNF10/KOX1)のクルッペル関連ボックス(KRAB)ドメインからの配列を含む(例えば、GenBank番号NM_015394.4)。KRABドメイン配列の例は次のとおりである:
このKRAB配列の変異体も、同一または類似の転写抑制機能を有する限り使用することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたZFP-TFは、表1の単一行に示されるように、標的部位に結合し、好ましくは検出可能なオフターゲット結合または活性が全くないかまたはほとんどない。オフターゲット結合は、例えば、オフターゲット遺伝子におけるZFP-TFの活性を測定することによって決定されてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたZFP-TFは、表1に示されるDNA結合認識ヘリックス配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたZFP-TFは、表1の単一行に示される2つの隣接するDNA結合認識ヘリックス配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたZFP-TFは、表1の単一行に示されるDNA結合認識ヘリックス配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたZFP-TFは、認識ヘリックスおよび骨格部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたZFP-TFは、表2の一行に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたZFP-TFは、配列の認識ヘリックスおよび骨格部分は、翻訳後修飾後に出現する配列として表2の単一行に示されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたZFP-TFは、翻訳後修飾後に現れるであろう配列として、表2の単一行に示されるアミノ酸配列を含む。例えば、翻訳後修飾により、表2に示すように配列から開始メチオニン残基が除去されてもよい。
B.ペプチドリンカー
本発明のZFP-TFのZFPドメインおよび転写抑制因子ドメインおよび/またはZFPドメイン内のジンクフィンガーは、ペプチドリンカー、例えば、約5~200アミノ酸(例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20以上のアミノ酸)の非切断性ペプチドリンカーを介して連結されてもよい。好ましいリンカーは、典型的には、組換え融合タンパク質として合成される柔軟なアミノ酸部分配列である。例えば、上記の説明;およびU.S. Pats. 6,479,626; 6,903,185; 7,153,949; 8,772,453; および9,163,245; およびWO2011/139349を参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、適切なリンカーの任意の組み合わせを含んでもよい。リンカーの非限定的な例は、DGGGS(配列番号2)、TGEKP(配列番号3)、LRQKDGERP(配列番号4)、GGRR(配列番号5)、GGRRGGGS(配列番号6)、LRQRDGERP(配列番号7)、LRQKDGGGSERP(配列番号8)、LRQKD(G3S)2ERP(配列番号9)、およびTGSQKP(配列番号10)である。
本発明のZFP-TFのZFPドメインおよび転写抑制因子ドメインおよび/またはZFPドメイン内のジンクフィンガーは、ペプチドリンカー、例えば、約5~200アミノ酸(例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20以上のアミノ酸)の非切断性ペプチドリンカーを介して連結されてもよい。好ましいリンカーは、典型的には、組換え融合タンパク質として合成される柔軟なアミノ酸部分配列である。例えば、上記の説明;およびU.S. Pats. 6,479,626; 6,903,185; 7,153,949; 8,772,453; および9,163,245; およびWO2011/139349を参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、適切なリンカーの任意の組み合わせを含んでもよい。リンカーの非限定的な例は、DGGGS(配列番号2)、TGEKP(配列番号3)、LRQKDGERP(配列番号4)、GGRR(配列番号5)、GGRRGGGS(配列番号6)、LRQRDGERP(配列番号7)、LRQKDGGGSERP(配列番号8)、LRQKD(G3S)2ERP(配列番号9)、およびTGSQKP(配列番号10)である。
いくつかの実施形態において、TGEKPFA(配列番号15)および/またはTGSQKPFQ(配列番号16)は、ZFPドメイン内にジンクフィンガーを連結し、および/またはLRQKDAARGSGG(配列番号17)またはLRGSGG(配列番号18)は、ZFPドメインを転写抑制ドメインに連結する。
いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、長さが3~20アミノ酸残基であり、Gおよび/またはSが豊富である。かかるリンカーの非限定的な例は、G4S型リンカー(配列番号11)、すなわち、1つ以上(例えば、2、3、または4)のGGGGS(配列番号11)モチーフ、またはモチーフのバリエーション(モチーフから1つ、2つ、または3つのアミノ酸が挿入、欠失、および置換されているものなど)を含有するリンカーである。
IV.ZFP-TFの発現
本開示のZFP-TFは、それをコードする核酸分子を介して患者に導入されてもよい。核酸分子は、RNA分子またはcDNA分子であってもよい。核酸分子は、脂質:核酸複合体(例えば、リポソーム)を含む組成物の注射によって患者の脳に導入されてもよい。あるいは、ZFP-TFは、ZFP-TFをコードする配列を含む核酸発現ベクターを介して患者に導入されてもよい。発現ベクターは、神経系の細胞におけるZFP-TFのコード配列の発現を可能にする、プロモーター、エンハンサー、転写シグナル配列、および転写終結配列などの発現制御配列を含んでもよい。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、安定なエピソームとして細胞内に存在し続ける。他の実施形態において、発現ベクターは細胞のゲノムに組み込まれる。
本開示のZFP-TFは、それをコードする核酸分子を介して患者に導入されてもよい。核酸分子は、RNA分子またはcDNA分子であってもよい。核酸分子は、脂質:核酸複合体(例えば、リポソーム)を含む組成物の注射によって患者の脳に導入されてもよい。あるいは、ZFP-TFは、ZFP-TFをコードする配列を含む核酸発現ベクターを介して患者に導入されてもよい。発現ベクターは、神経系の細胞におけるZFP-TFのコード配列の発現を可能にする、プロモーター、エンハンサー、転写シグナル配列、および転写終結配列などの発現制御配列を含んでもよい。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、安定なエピソームとして細胞内に存在し続ける。他の実施形態において、発現ベクターは細胞のゲノムに組み込まれる。
いくつかの実施形態において、脳内でのZFP-TF発現を指示すためのベクター上のプロモーターは、構成的活性プロモーターまたは誘導性プロモーターである。適切なプロモーターは、限定されないが、レトロウイルスRSVLTRプロモーター(所望によりRSVエンハンサーを有する)、CMVプロモーター(所望によりCMVエンハンサーを有する)、CMV即時初期プロモーター、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)プロモーター、β-アクチンプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーター、EF1αプロモーター、MoMLVLTRプロモーター、CK6プロモーター、トランスサイレチンプロモーター(TTR)、TKプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター(TRE)、HBVプロモーター、hAATプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター(LSP)、E2Fプロモーター、テロメラーゼ(hTERT)プロモーター、CMVエンハンサー/ニワトリβ-アクチン/ウサギβ-グロビンプロモーター(CAGプロモーター;Niwa et al., Gene(1991)108(2):193-9)、およびRU-486応答性プロモーターを含む。シナプシンIプロモーター、MeCP2プロモーター、CAMKIIプロモーター、PrPプロモーター、GFAPプロモーター、またはニューロンおよび/またはグリア細胞への発現を制限する操作されたプロモーターまたは天然プロモーターなどの脳細胞特異的プロモーターも、使用されてもよい。
限定されないがエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、カチオン性またはアニオン性リポソーム、核局在化シグナルと組み合わされるリポソーム、天然に存在するリポソーム(例えば、エクソソーム)、またはウイルス形質導入を含む、ヌクレオチド配列を細胞に導入する任意の方法が、使用されてもよい。
発現ベクターのインビボ送達について、ウイルス形質導入を使用することができる。当業者であれば、当技術分野で公知の様々なウイルスベクター、例えば、ワクシニアベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ポキシウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、レトロウイルスベクター、およびハイブリッドウイルスベクター。いくつかの実施形態において、本明細書で使用されるウイルスベクターは、組換えAAV(rAAV)ベクターである。AAVベクターは、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染し、長期発現のために安定なエピソーム構造として存在し、免疫原性が非常に低いため、CNS遺伝子送達に特に適している(Hadaczek et al., Mol Ther. (2010) 18:1458-61; Zaiss, et al., Gene Ther. (2008) 15:808-16)。任意の適切なAAV血清型を使用することができる。例えば、AAVは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV8.2、AAV9、もしくはAAVrh10、またはAAV2/8、AAV2/5、AAV2/6、もしくはAAV2/9、または本明細書に列挙されるAAV血清型の1つの変異体もしくは誘導体である血清型(すなわち、複数の血清型に由来するAAV;例えば、rAAVは、そのゲノム中にAAV2逆方向末端反復(ITR)およびAAV8、5、6、または9キャプシドを含む)などの偽型であってもよい。いくつかの実施形態において、発現ベクターはAAVウイルスベクターであり、ゲノムが構築物を含む組換えAAVビリオンによって標的ヒト細胞に導入され、これは昆虫細胞/バキュロウイルス産生系または哺乳動物細胞産生系などの産生系におけるAAVビリオンの産生を可能にするために、両端にAAV逆末端反復(ITR)配列を有することを含む。AAVは、そのキャプシドタンパク質がヒトまたは非ヒト霊長類において免疫原性を低下させるか、または形質導入能力を増強するように操作されてもよい。いくつかの実施形態において、AAV9が使用される。本明細書に記載されるウイルスベクターは、当技術分野で知られている方法を使用して産生されてもよい。ウイルス粒子を生成するために、任意の適切な許容細胞またはパッケージング細胞を使用することができる。例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞をパッケージング細胞株として使用することができる。
V.医薬品への適用
本発明のZFP-TFは、アルファ-シヌクレイン発現の下方制御を必要とする患者を処置するために使用することができる。患者は、パーキンソン病、レビー小体型認知症、アルツハイマー病、多系統萎縮症、および任意の他のシヌクレイノパチーなどの神経変性疾患に罹患しているかまたはそれらを発症するリスクがある。リスクにさらされている患者は、遺伝的素因を有する患者、脳震盪などの脳損傷を反復して受けた患者、環境神経毒にさらされた患者を含む。本開示は、処置を必要とするヒト患者などの対象において神経疾患(例えば、神経変性疾患)を処置する方法であって、対象の神経系に治療有効量(例えば、SNCA発現の十分な抑制を可能にする量)のZFP-TF(例えば、それを発現するrAAVベクター)を導入することを含む方法を提供する。「処置する」なる用語は、症状の緩和、症状の発症の予防、疾患の進行の遅延、生活の質の改善、および生存期間の延長を含む。
本発明のZFP-TFは、アルファ-シヌクレイン発現の下方制御を必要とする患者を処置するために使用することができる。患者は、パーキンソン病、レビー小体型認知症、アルツハイマー病、多系統萎縮症、および任意の他のシヌクレイノパチーなどの神経変性疾患に罹患しているかまたはそれらを発症するリスクがある。リスクにさらされている患者は、遺伝的素因を有する患者、脳震盪などの脳損傷を反復して受けた患者、環境神経毒にさらされた患者を含む。本開示は、処置を必要とするヒト患者などの対象において神経疾患(例えば、神経変性疾患)を処置する方法であって、対象の神経系に治療有効量(例えば、SNCA発現の十分な抑制を可能にする量)のZFP-TF(例えば、それを発現するrAAVベクター)を導入することを含む方法を提供する。「処置する」なる用語は、症状の緩和、症状の発症の予防、疾患の進行の遅延、生活の質の改善、および生存期間の延長を含む。
本開示は、その組換えゲノムがZFP-TFの発現カセットを含む組換えAAV(rAAV)などのウイルスベクターを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、水、生理食塩水(例えば、リン酸緩衝生理食塩水)、ブドウ糖、グリセロール、スクロース、乳糖、ゼラチン、デキストラン、アルブミン、またはペクチンなどの薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。さらに、組成物は、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、安定化剤、または医薬組成物の有効性を高める他の試薬などの補助物質を含有してもよい。医薬組成物は、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、および小胞などの送達ビヒクルを含有してもよい。
本開示の治療薬によって標的とされる細胞は、限定されないが、神経細胞(例えば、運動ニューロン、感覚ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、GABA作動性ニューロン、またはセロトニン作動性ニューロン);グリア細胞(例えば、希突起膠細胞、星状膠細胞、周皮細胞、シュワン細胞、またはミクログリア細胞);上衣細胞;または神経上皮細胞を含む、脳内の細胞である。治療薬の標的となる脳領域は、線条体、尾状核、被殻、黒質、中脳、嗅球、小脳、青斑核、橋、延髄、脳幹、淡蒼球、海馬、大脳皮質または他の脳領域など、シヌクレイノパチーで最も深刻な影響を受ける領域であってもよい。これらの領域には、線条体内注射、黒質内注射、脳内注射、大槽内(ICM)注射、またはより一般的には実質内注射、脳室内(ICV)注射、くも膜下腔内注射、または静脈内注射によって直接到達できる。他の投与経路は、脳室内、鼻腔内、または眼内投与を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、例えば髄腔内および/または脳室内注射、または大槽内注射を介して脳脊髄液(CSF)に直接投与された後、CNS組織全体に広がる。他の実施形態において、ウイルスベクターは、静脈内投与後に血液脳関門を通過し、対象のCNS組織全体に広範囲に分布する。他の実施形態において、ウイルスベクターは、実質内注射を介して標的領域に直接送達される。場合によっては、ウイルスベクターは、実質内送達後に他の脳領域への逆行性または順行性輸送を受ける可能性がある。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、安定した非毒性の遺伝子導入を高効率で達成する、独特のCNS組織標的化能力(例えば、CNS組織指向性)を有する。
一例として、医薬組成物は、例えば右側脳室、左側脳室、第3脳室、または第4脳室などの患者の前脳の脳室領域への脳室内投与を通じて患者に提供されてもよい。医薬組成物は、脳内投与、例えば、線条体、尾状核、被殻、黒質、中脳、嗅球、大脳、小脳、青斑核、橋、延髄、脳幹、淡蒼球、海馬、大脳皮質、頭蓋内腔、髄膜、硬膜、くも膜、または脳の軟膜内またはその近くへの組成物の注射によって患者に提供されてもよい。脳内投与は、場合によっては、脳を取り囲むくも膜下腔の脳脊髄液(CSF)への薬剤の投与を含んでもよい。
場合によっては、脳内投与は、定位固定手順を使用する注射を含む。定位固定処置は当技術分野で周知であり、典型的には、特定の脳内領域、例えば心室領域への注入を誘導するために一緒に使用されるコンピュータおよび3次元走査装置の使用を含む。微量注入ポンプ(例えば、World Precision Instruments製)も使用されてもよい。場合によっては、ウイルスベクターを含む組成物を送達するために微量注入ポンプが使用される。場合によっては、組成物の注入速度は、0.1μl/分~100μl/分の範囲である。当業者には理解されるように、注入速度は、例えば、対象の種、対象の年齢、対象の体重/体格、AAVの血清型、必要な用量、および脳内領域が標的となる。したがって、当業者であれば、特定の状況では他の注入速度が適切であるとみなしてもよい。
対象へのrAAVの送達は、例えば、静脈内投与によって達成されてもよい。特定の例では、rAAVを脳組織、脊髄、脳脊髄液(CSF)、神経細胞、グリア細胞、髄膜、星状細胞、希突起膠細胞、ミクログリア、間質腔などに局所的に送達することが望ましい場合がある。場合によっては、組換えAAVは、心室領域への注射によってCNSに直接送達されるほか、線条体、尾状核、被殻、黒質、中脳、嗅球、小脳、青斑核、橋、延髄、脳幹、淡蒼球、海馬、大脳皮質、またはその他の脳領域にも送達される。AAVは、定位注射などの当該技術分野で公知の神経外科技術を使用して、針、カテーテル、または関連機器を用いて送達されてもよい(例えば、Stein et al., J Vir. (1999) 73:3424-9; Davidson et al., PNAS. (2000) 97:3428-32; Davidson et al., Nat Genet. (1993) 3:219-223; および Alisky および Davidson, Hum. Gene Ther. (2000) 11:2315-29を参照されたい)。
本明細書で別途定義しない限り、本開示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。例示的な方法および材料を以下に説明するが、本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料も、本開示の実施または試験に使用することができる。矛盾が生じた場合には、定義を含む本仕様が優先される。一般に、本明細書に記載される神経学、医学、医薬化学、および細胞生物学に関連して使用される命名法および技術は、当技術分野で周知であり一般的に使用されているものである。酵素反応および精製技術は、当該技術分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように、製造業者の仕様書に従って行われる。さらに、文脈により別途要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。この明細書および実施形態を通じて、「有する(have)」および「含む(comprise)」なる語、または「有する(has)」、「有する(having)」、「含む(comprises)」、または「含む(comprising)」などの変形は、記載された整数または基を含むことを意味するものと理解される。しかしながら、他の整数または整数のグループは除外されない。本明細書で言及されるすべての刊行物および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。本明細書では多数の文書が引用されているが、この引用は、これらの文書のいずれかが当該技術分野における共通一般知識の一部を形成することを認めるものではない。本明細書で使用される場合、1つまたは複数の対象の値に適用される「およそ」または「約」なる用語は、記載された基準値と同様の値を指す。特定の実施形態において、この用語は、別段の記載がない限り、または文脈から明らかな場合を除き、記載の参考値のいずれかの方向に(より大きいかまたはより小さい)10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%以内に収まる値の範囲を指す。
本発明をよりよく理解するために、以下の実施例を説明する。これらの実施例は説明のみを目的としており、いかなる形でも本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例
実施例1:ZFP-TFのスクリーニング
アルファ-シヌクレインの発現を抑制するZFP-TFを同定するために、本発明者らは、500bpにわたるヒトSNCA遺伝子の領域内の15または18bpの配列に結合すると予測される416個のZFP-TFのライブラリーを設計し、スクリーニングした。TSS1の上流からTSS1の500bp下流まで、またはTSS2aの500bp上流からTSS2bの500bp下流まで(図2B)。ZFP-TFの標的領域は、図2において矢印で示されている。矢印の方向は、ZFP-TFが結合するDNA鎖(5’から3’)を示している。図4は、図3に表示されたものと同様のデータを示す。図2Bは、SNCA遺伝子のTSS2aおよび2bを標的とする1、2、または3個のリン酸接触変化を有するZFP-TFについてである。この研究では、KRABドメイン配列(配列番号12)を転写リプレッサーとして使用し、ZFPドメインのC末端に融合させた。47の代表的なZFP-TFの配列を以下の表2に示す。インビトロ転写用の鋳型は、PCR(フォワードプライマーGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAG(配列番号13);リバースプライマーT(180)CTGGCAACTAGAAGGCACAG(配列番号14))を使用してpVAX-ZFPまたはpVAX-GFPプラスミドから生成した。メッセンジャーRNAは、mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA転写キット(Thermo Fisher Scientific)を製造元の指示に従って使用して合成し、RNeasy96カラム(Qiagen)を使用して精製した。次いで、各ZFP-TFをコードするRNAを6用量希釈で96ウェルプレートに等分した。
実施例1:ZFP-TFのスクリーニング
アルファ-シヌクレインの発現を抑制するZFP-TFを同定するために、本発明者らは、500bpにわたるヒトSNCA遺伝子の領域内の15または18bpの配列に結合すると予測される416個のZFP-TFのライブラリーを設計し、スクリーニングした。TSS1の上流からTSS1の500bp下流まで、またはTSS2aの500bp上流からTSS2bの500bp下流まで(図2B)。ZFP-TFの標的領域は、図2において矢印で示されている。矢印の方向は、ZFP-TFが結合するDNA鎖(5’から3’)を示している。図4は、図3に表示されたものと同様のデータを示す。図2Bは、SNCA遺伝子のTSS2aおよび2bを標的とする1、2、または3個のリン酸接触変化を有するZFP-TFについてである。この研究では、KRABドメイン配列(配列番号12)を転写リプレッサーとして使用し、ZFPドメインのC末端に融合させた。47の代表的なZFP-TFの配列を以下の表2に示す。インビトロ転写用の鋳型は、PCR(フォワードプライマーGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAG(配列番号13);リバースプライマーT(180)CTGGCAACTAGAAGGCACAG(配列番号14))を使用してpVAX-ZFPまたはpVAX-GFPプラスミドから生成した。メッセンジャーRNAは、mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA転写キット(Thermo Fisher Scientific)を製造元の指示に従って使用して合成し、RNeasy96カラム(Qiagen)を使用して精製した。次いで、各ZFP-TFをコードするRNAを6用量希釈で96ウェルプレートに等分した。
ZFP-TFコード配列を有する組換えrAAVベクターを、周知の方法に従ってHEK293細胞中で生成した。AAVヘルパー遺伝子およびrAAVゲノムをコードするプラスミドを細胞にトランスフェクトしてから3日後、細胞を回収した。次いで、細胞を3回の凍結/融解によって溶解し、細胞破片を遠心分離によって除去した。rAAVビリオンは、ポリエチレングリコールを使用して沈殿させた。再懸濁後、塩化セシウム勾配で一晩超遠心分離することによりビリオンを精製した。ビリオンを透析によって製剤化し、その後濾過滅菌した。AAVを等分し、使用するまで-80°Cで保存した。AAVは解凍後に再凍結しなかった。
スクリーニングを、SK-N-MCヒト神経上皮細胞株において実施した。SK-N-MC細胞はヒトアルファ-シヌクレインを高レベルで発現するため、アルファ-シヌクレインの発現を低下させるZFP-TFの検査に適している。SK-N-MC細胞を組織培養フラスコ内でコンフルエントになるまで培養した。細胞を96ウェルプレートにウェルあたり150,000細胞で播種し、Amaxa(登録商標)SF溶液に再懸濁した。次に細胞をZFP-TFRNA(6用量:3、10、30、100、300、および1000ng)と混合し、Amaxa(登録商標)シャトルプレートウェルに移した。Amaxa(登録商標)Nucleofector(登録商標)機器(Lonza;プログラムCM-137)を使用して細胞をトランスフェクトした。EagleのMEM細胞培地をプレートの各ウェルに添加した。細胞を96ウェル組織培養プレートに移し、37°Cで24時間インキュベートした。
ZFP-TFを、ヒトiPSC由来のGABA作動性ニューロン(Cellular Dynamics International)においても試験した。細胞をポリ-L-オルニチンおよびラミニンでコーティングした96ウェルプレートにウェルあたり40,000細胞の密度で播種し、メーカーの指示に従って維持した。播種の48時間後に、細胞を6つの異なるMOI(1E3、3E3、1E4、3E4、1E5、および3E5)で所望のZFP-TFを発現するAAV6でトランスフェクトした。形質導入された細胞を最大32日間維持した(50~75%の培地交換を3~5日ごとに行った)。AAVトランスフェクションの28~30日後に細胞を回収した。
採取した細胞を溶解し、製造業者の指示に従ってC2CTキットを使用して逆転写を行った。TaqMan定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を使用して、SNCAの発現レベルを測定した。SNCA発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子EIF4A2、ATP5B、およびGAPDHの発現レベルの幾何平均に対して正規化した。模擬トランスフェクションおよびSNCAを標的としないことが知られているZFP-TFによるトランスフェクションを陰性対照として使用した。
アルファ-シヌクレインの用量依存性抑制を、試験したZFP-TFの多くで実証した。達成された最大抑制は99%以上であったが、より低い程度(例えば、最高用量で約90%、約75%、または約40%)アルファ-シヌクレインを抑制するZFP-TFも同定した。図3A~Eおよび5はスクリーニングデータを示す。
実施例2:アルファ-シヌクレインZFP-TFのオフターゲット活性
全体的な遺伝子発現に対するアルファ-シヌクレインZFP-TFのオフターゲット影響を評価するために、本発明者らは、代表的なアルファ-シヌクレインZFP-TFをコードするAAVで処理したヒトiPSC由来ニューロンおよび初代マウス皮質ニューロンから単離した全RNAに対してマイクロアレイ実験を行った。
全体的な遺伝子発現に対するアルファ-シヌクレインZFP-TFのオフターゲット影響を評価するために、本発明者らは、代表的なアルファ-シヌクレインZFP-TFをコードするAAVで処理したヒトiPSC由来ニューロンおよび初代マウス皮質ニューロンから単離した全RNAに対してマイクロアレイ実験を行った。
ヒトiPSC由来ニューロンを実施例1に記載のように処理した。マイクロアレイ分析のために、細胞をポリ-L-オルニチンおよびラミニンでコーティングした24ウェルプレート上にウェル当たり260,000細胞の密度で播種し、播種後48時間で1E5VG/細胞でトランスフェクトし、そしてウイルストランスフェクションの19日後に回収した。採取した細胞から単離したRNAを、マイクロアレイ解析に使用した。
初代マウス皮質ニューロンはGibcoから購入した。細胞をポリ-D-リジンでコーティングした24ウェルプレートに200,000細胞/ウェルで播種し、GlutaMAX(登録商標)I添加物、B27添加物、およびペニシリン/ストレプトマイシンを含有するGibco Neurobasal Mediumを使用して製造業者の仕様書に従って維持した。播種から48時間後(DIV2で)、細胞を3E3VG/細胞のMOIでAAV6に感染させ、7日後に回収した(DIV9;3~4日ごとに50%の培地交換を実施)。続いて、RNAの単離およびマイクロアレイ分析を行った。
オフターゲット分析は、GeneTitan(登録商標)プラットフォーム(ClariomSキット)を製造業者の指示に従って使用して実施した。アッセイ結果を、TACソフトウェアを使用して分析した。解析において、FDR補正p値≦0.05で2倍以上制御されている、示差的に制御された遺伝子を呼び出した。オフターゲットが最小限であることが知られているZFP-TFおよびモックトランスフェクションを陰性対照として使用した。
図7A~Dは、ヒトiPSC由来ニューロンおよび初代マウス皮質ニューロンにおける40の代表的なアルファ-シヌクレインZFP-TFのマイクロアレイの結果を示す。さまざまなオフターゲット活性があり、一部のZFP-TFは非常に低いオフターゲット活性を示すか、検出できないオフターゲット活性を示した。
実施例3:アルファ-シヌクレインmRNA発現のインビボ抑制
ヒトおよびマウスニューロンの両方において検出可能なオフターゲット活性が最小限または全くなく、ヒトiPSC由来ニューロンにおいて異なる最大抑制活性を有する2つの代表的なZFP-TF(82195および82264)を発現するAAV9構築物(82195、~約95%;82264、~約80%)を使用して、PACシヌクレインマウスモデルにおけるヒトSNCAのインビボ抑制を実証した(Kuo et al., Hum Mol Genet.(2010)19(9):1633-50)。このマウスモデルは、マウスアルファ-シヌクレイン-ヌルバックグラウンドで完全なヒトSNCA配列とその上流制御配列を発現する。各ZFP-TFおよびビヒクルを発現するAAV9ベクターを、8週齢雌性PACシヌクレインマウス(各群n=3)の線条体の2か所に0.5μL/分の速度で両側投与した(半球あたり2部位:前線条体に5μL、後線条体に4μL、合計9μL/半球、18μL/動物)。注入後、針を所定の位置に5分間放置して、試験物質を拡散させた。次いで、針を1~2分間かけてゆっくりと後退させた。注射の定位座標は次のとおりであった(吻側線条体-AP:+1.4mm、ML:+/-1.7mm、DV:-3.0mm、尾側線条体:AP:+0.2mm、ML:+/-2.3mm、DV:-2.7mm)。マウスを3週間後に安楽死させ、分子分析のために脳を収集した。安楽死の際、動物を経心的に0.9%生理食塩水で灌流し、脳を摘出して半切片にした。左半球を、さらに12の異なる領域(嗅球、吻側、内側、および尾側皮質、吻側、内側、および尾側線条体、海馬、視床、腹側中脳、延髄、および小脳)に解剖した。RNAの完全性を維持するために、解剖した組織をRNALater中に置いた。24時間後、RNAlaterを除去し、組織を液体窒素中で急速冷凍し、-80°Cで保存するまでドライアイス上に維持した。
ヒトおよびマウスニューロンの両方において検出可能なオフターゲット活性が最小限または全くなく、ヒトiPSC由来ニューロンにおいて異なる最大抑制活性を有する2つの代表的なZFP-TF(82195および82264)を発現するAAV9構築物(82195、~約95%;82264、~約80%)を使用して、PACシヌクレインマウスモデルにおけるヒトSNCAのインビボ抑制を実証した(Kuo et al., Hum Mol Genet.(2010)19(9):1633-50)。このマウスモデルは、マウスアルファ-シヌクレイン-ヌルバックグラウンドで完全なヒトSNCA配列とその上流制御配列を発現する。各ZFP-TFおよびビヒクルを発現するAAV9ベクターを、8週齢雌性PACシヌクレインマウス(各群n=3)の線条体の2か所に0.5μL/分の速度で両側投与した(半球あたり2部位:前線条体に5μL、後線条体に4μL、合計9μL/半球、18μL/動物)。注入後、針を所定の位置に5分間放置して、試験物質を拡散させた。次いで、針を1~2分間かけてゆっくりと後退させた。注射の定位座標は次のとおりであった(吻側線条体-AP:+1.4mm、ML:+/-1.7mm、DV:-3.0mm、尾側線条体:AP:+0.2mm、ML:+/-2.3mm、DV:-2.7mm)。マウスを3週間後に安楽死させ、分子分析のために脳を収集した。安楽死の際、動物を経心的に0.9%生理食塩水で灌流し、脳を摘出して半切片にした。左半球を、さらに12の異なる領域(嗅球、吻側、内側、および尾側皮質、吻側、内側、および尾側線条体、海馬、視床、腹側中脳、延髄、および小脳)に解剖した。RNAの完全性を維持するために、解剖した組織をRNALater中に置いた。24時間後、RNAlaterを除去し、組織を液体窒素中で急速冷凍し、-80°Cで保存するまでドライアイス上に維持した。
脳組織を、氷上の0.6mLのTRI試薬(Thermo Fisher)および2つの3.2mmスチールビーズ(BioSpec Products)を含有する1.5mLのエッペンドルフチューブに移した。試料は、Qiagen TissueLyserを使用して4°Cで次のパラメーターを使用して溶解した:5サイクル、90秒の持続時間、および25.1周波数。短時間遠心した後、70μLの1-ブロモ-3-クロロプロパンを室温で各試料に添加した。試料を10秒間ボルテックスし、4°C、12,000×gで10分間遠心分離し、各試料からの水相120μLを96ウェルプレートのウェルに移した。
60マイクロリットルのイソプロピルアルコールおよび12μLのMagMax磁気ビーズ(Thermo Scientific)を、組織溶解物の水相を含有する各ウェルに添加した。Kingfisher 96ロボット(Thermo Scientific)およびMagMaxキット(Thermo Fisher)を使用して、メーカーのプロトコールに従って組織溶解物からリボ核酸(RNA)を単離した。磁気スタンドを使用して、100マイクロリットルの溶出RNAを磁気ビーズから分離した。RNAの収量および品質を、Nanodrop8000機器(Thermo Scientific)を使用して評価した。
相補的デオキシリボ核酸(cDNA)を、10μLのRNAおよび10μLのRTマスターミックス(10×RT緩衝液、10×ランダムプライマー、25×dNTPミックス、マルチスクライブ酵素、およびRNAseを含まない水)をデフォルトで有する高容量cDNA逆転写キット(Applied Biosystems)を使用して調製した。必要に応じて、RNAおよびRT Master Mixの量を調整して、入力が100~1,000ngの範囲になるようにした。逆転写を、次のプログラムを使用してC1000 Touch Bioradサーマルサイクラーで実行した:25°Cで10分間、37°Cで120分間、85°Cで5分間、4°Cで保持。
cDNAを、Biorad CFX384サーマルサイクラーを使用してRT-qPCRに供した。cDNAをヌクレアーゼを含まない水で10倍に希釈し、4μLの希釈cDNAを各10μLのPCR反応液に加えた。各試料を技術的に4回繰り返してアッセイした。トリプレックスアッセイには2x Fast Multiplex PCR(Qiagen)マスターミックスを使用し、他のアッセイにはSsoAdvanced Universal Probes Supermix(Biorad)を使用した。
以下のサイクリング条件を使用した:Qiagen Fast Multiplexマスターミックス→95°Cで5分間、95°Cで45秒間、60°Cで45秒間、プレート読み取り、40サイクル;Biorad SsoAdvancedマスターミックス→95°Cで90秒、95°Cで12秒、60°Cで40秒、プレート読み取り、42サイクル。
RNA回収率%を評価するために、RNA単離工程の前と後のGFPRNAのスパイクを使用した。研究の動物から採取したプールしたRNAの4試料の5倍希釈系列を標準曲線として使用した。試料データを、3つのハウスキーピング遺伝子ATP5B、EIF4A2、およびGAPDHの幾何平均に正規化した。
実験からのアルファ-シヌクレイン、ZFP-TF、GFAP、IBA1、およびNeuNmRNA発現データを図8Aおよび8Bに示す。データは、ZFP-TF発現が顕著な脳領域でアルファ-シヌクレインの抑制があったことを示している。さらに、GFAP、IBA1、およびNeuNの発現データは、ZFP-TFの投与により神経炎症マーカーの発現上昇または神経マーカーNeuNの発現低下が起こらなかったため、ZFP-TFの忍容性が良好であることを示している。
配列表
以下の表1は、本開示の47の例示的な操作されたZFPを列挙する。各ZFPについて、ZFPドメイン内の各ジンクフィンガーのゲノム標的配列(結合配列)およびDNA結合認識ヘリックス配列(つまり、F1~F6)が単一行に表示される。以下の表の「^」は、示されたヘリックスの最初のアミノ酸の上流4番目の位置にあるアルギニン(R)残基がグルタミン(Q)に変更されていることを示す。各配列の配列番号は、配列の下の括弧内に示されている。列2の塩基配列において、ZFPが接触する塩基を大文字で示す。
以下の表1は、本開示の47の例示的な操作されたZFPを列挙する。各ZFPについて、ZFPドメイン内の各ジンクフィンガーのゲノム標的配列(結合配列)およびDNA結合認識ヘリックス配列(つまり、F1~F6)が単一行に表示される。以下の表の「^」は、示されたヘリックスの最初のアミノ酸の上流4番目の位置にあるアルギニン(R)残基がグルタミン(Q)に変更されていることを示す。各配列の配列番号は、配列の下の括弧内に示されている。列2の塩基配列において、ZFPが接触する塩基を大文字で示す。
以下の表2は、本開示の47の例示的なZFP-TFの完全なアミノ酸配列を列挙しており、DNA結合認識ヘリックス配列は太字であり、モジュール内リンカーおよびモジュール間リンカーには下線が引かれている。R(-5)Q骨格変異は太字および下線で示されている。ZFPドメインとKRABドメインの間のリンカーには二重下線が引かれている。
Claims (27)
- ジンクフィンガータンパク質(ZFP)ドメインおよび転写抑制因子ドメインを含む融合タンパク質であって、前記ZFPドメインがヒトアルファ-シヌクレイン遺伝子(SNCA遺伝子)の標的領域に結合する、融合タンパク質。
- 前記標的領域が、前記SNCA遺伝子の転写開始部位(TSS)の1kb以内にある、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記TSSがTSS1、2a、または2bである、請求項2に記載の融合タンパク質。
- 前記標的領域が、SNCA遺伝子の、TSS1の上流500bp以内、TSS1の下流500bp以内、TSS2aの上流500bp以内、および/またはTSS2bの下流500bp以内にある、請求項3に記載の融合タンパク質。
- 前記ZFPドメインが6つのジンクフィンガーを含み、前記融合タンパク質が所望により前記SNCA遺伝子の発現を少なくとも約40%、75%、90%、95%、または99%抑制し、検出可能なオフターゲット結合または活性が全くないかまたは検出可能な最小限である、請求項1~4のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記転写抑制ドメインが、ヒトKOX1由来のKRABドメインアミノ酸配列を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記ZFPドメインが、ペプチドリンカーを介して前記転写抑制因子に連結されている、請求項1~6のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記ZFPドメインが、表1に示されるDNA結合認識ヘリックス配列を含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記ZFPドメインが、表1の単一行に示されるDNA結合認識ヘリックス配列を含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記コード配列が、転写調節要素に作動可能に連結されている、請求項1~9のいずれか一項に記載の融合タンパク質のコード配列を含む核酸構築物。
- 前記転写調節要素が、脳細胞において構成的に活性であるか誘導可能な哺乳類プロモーターであり、前記プロモーターが所望によりヒトシナプシンIプロモーターである、請求項10に記載の核酸構築物。
- 請求項10または11に記載の核酸構築物を含む、組換えウイルス。
- 前記組換えウイルスが、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、請求項12に記載の組換えウイルス。
- 請求項10または11に記載の核酸構築物または請求項12または13に記載の組換えウイルス、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
- 請求項10または11に記載の核酸構築物、または請求項12または13に記載の組換えウイルスを含む、宿主細胞。
- 前記宿主細胞がヒト細胞である、請求項15に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が脳細胞または多能性幹細胞であり、前記幹細胞が所望により胚性幹細胞または誘導性多能性幹細胞(iPSC)である、請求項15に記載の宿主細胞。
- ヒト脳細胞においてアルファ-シヌクレインの発現を阻害する方法であって、所望により請求項10または11に記載の核酸構築物または組換え体または請求項12または13に記載のウイルスの導入を介して、請求項1~9のいずれか一項に記載の融合タンパク質を細胞に導入し、それによって細胞内のアルファ-シヌクレインの発現を阻害することを含む、方法。
- 前記ヒト脳細胞が、ニューロン、グリア細胞、上衣細胞、または神経上皮細胞である、請求項18に記載の方法。
- 前記細胞が、パーキンソン病、レビー小体型認知症、アルツハイマー病、多系統萎縮症、または別のシヌクレイノパチーに罹患しているかまたはそれらを発症するリスクのある患者の脳内にある、請求項18または19に記載の方法。
- 前記融合タンパク質を発現する組換えウイルスを前記細胞に導入することを含む、請求項18~20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えウイルスが、所望により血清型9のアデノ随伴ウイルス(AAV)である、請求項21に記載の方法。
- 患者においてシヌクレイノパチーを処置する方法であって、請求項1~9のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする組換えAAVを患者に投与することを含む、方法。
- 前記AAVが、静脈内、くも膜下腔内、脳室内、大槽内、線条体内もしくは黒皮内注射、または任意の脳領域への注射を介して患者に導入される、請求項23に記載の方法。
- 前記シヌクレイノパチーが、パーキンソン病、レビー小体型認知症、アルツハイマー病、または多系統萎縮症である、請求項23または24に記載の方法。
- 請求項18~25のいずれか一項に記載の方法における使用のための、請求項1~9のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項10または11に記載の核酸構築物、請求項12または13に記載の組換えウイルス、請求項14に記載の医薬組成物。
- 請求項18~25のいずれか一項に記載の方法における薬剤の製造のための、請求項1~9のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項10または11に記載の核酸構築物、請求項12または13に記載の組換えウイルスの使用。
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