TW202206446A - 用於治療tdp-43蛋白質病變之組合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示一種新穎類別之融合蛋白，其募集細胞之先天性伴護蛋白機制，尤其Hsp70介導之系統，以尤其減少TDP-43介導之蛋白質聚集及相關蛋白質病變。

Description

用於治療TDP-43蛋白質病變之組合物及方法
細胞內表現之所有蛋白質需要恰當地摺疊成其預期結構以便正常發揮作用。數目逐漸增長之疾病及病症展示與蛋白質之不當摺疊及/或蛋白質及脂蛋白以及感染性蛋白質物質之不當沈積及聚集相關。由錯誤摺疊引起之疾病亦稱為構形病或蛋白質病變，其實例包括阿茲海默氏症(Alzheimer's disease；AD)、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)及額顳葉型失智症(FTLD)。突變蛋白在細胞中聚集，造成典型的細胞毒性細胞包涵體。
廣泛多種神經退化性疾病之病理特徵為由類澱粉原纖維構成之胞內或胞外蛋白質聚集體的積聚(Forman等人, (2004) Nat Med. 10:1055-1063)。舉例而言，阿茲海默氏症(AD)之病理由分別由β-類澱粉蛋白及微管相關蛋白tau構成的老年斑及神經原纖維纏結界定，且由α-突觸核蛋白構成之路易氏體(Lewy body)為帕金森氏症(Parkinson's disease)的疾病界定性病變。直至最近，具有泛素包涵體之額顳葉退化(FTLD-U) (Kumar-Singh及Van (2007) Brain Pathol., 17:104-114) (與FTLD症候群相關之最常見表型)，及肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS) (Xiao等人, (2006) Biochim Biophys Acta, 1762:1001-1012)兩者之神經病理才由非類澱粉生成泛素化包涵體(UBI)界定。
FTLD，初老期失智症之第二常見形式，係指具有共同行為及/或語言功能障礙之一組異質性神經退化性病症(Kumar-Singh及Van, 同上)。一些患病個體表現出運動障礙，諸如帕金森氏症或運動神經元疾病(MND)。儘管名稱FTLD反映顯著的額葉及顳葉退化，但在此等患者中鑑別出多種神經病理學異常(Cairns等人, (2007) Acta Neuropathol., 1145:5-22)。公認FTLD有兩大病理細分：具有tau陽性包涵體之腦(亦即，tau蛋白病變)及具有用針對tau、α-突觸核蛋白及β-類澱粉蛋白之抗體未偵測到之UBI的腦(亦即，FTLD-U)。高達40%之FTLD展示與FTLD-U病理相關之三種不同基因異常的家族遺傳模式，該等異常包括顆粒蛋白前體(PGRN)及含纈酪肽蛋白(VCP)中之突變以及與染色體9p上之新穎基因座的連鎖。
肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)，亦稱為運動神經元疾病或路格里克氏病(Lou Gehrig's disease)，為一種神經退化性疾病，特徵為腦幹及脊髓中之上運動神經元及下運動神經元兩者的進行性退化，導致進行性肌肉萎縮及無力(Al-Chalabi等人, (2016)Amyotrophic lateral sclerosis ., 15(11):1182-1194；Robberecht及Philips, (2013)Nat Rev Neurosci . , 14(4):248-264；Talbot等人, (2018)Nucleic Acids Res . , 37(8):e64)。ALS之中值盛行率為每100,000個人約5.4例，中值發病年齡在54-67歲，男性之風險略高於女性(Chio等人, (2009)Amyotroph Lateral Scler . , 10(5-6):310-323；Chio等人, (2013)Neuroepidemiology , 41(2):118-130；McCombe及Henderson, (2010)Gend Med . , 7(6):557-570)。ALS為破壞性神經退化性疾病，沒有任何有效治療，且患者通常在疾病發作2-4年內死亡，主要歸因於呼吸衰竭及吞咽問題(Chio等人, (2009)Amyotroph Lateral Scler . , 10(5-6):310-323；del Aguila等人, (2003)Neurology , 60(5):813-819；Tabata等人, (2009)Nucleic Acids Res . , 7(8):e64)。
大部分ALS病例為散發性，病因不明(sALS)，而僅約10%之病例涉及家族性基因突變之孟德爾式(Mendelian)遺傳模式，稱為家族性ALS (fALS) (Renton等人, (2014)Nat Neurosci . , 17(1):17-23；Taylor等人, (2016)Nature , 539(7628):197-206；Turner等人, (2017)J Neurol Neurosurg Psychiatry , 88(12):1042-1044)。迄今為止，高達30個基因描述為ALS之單基因原因，最常見的為C9orf72、SOD1、FUS及TARDBP/TDP43 (Chia等人, (2018)Lancet Neurol . , 17(1):94-102；Nicolas等人, (2018)Neuron , 97(6):1268-1283；Volk等人, (2018)Med Genet . , 30(2):252-258)。
ALS中大量基因之外顯率變化以及基因突變之鑑別表明，諸如多基因組分及環境因素之多種因素可構成疾病易感性的基礎。事實上，已提出細胞路徑，諸如蛋白質錯誤摺疊/聚集(Ross及Poirier, (2004)Nat Med . , 10增刊:S10-17)、麩胺酸介導之興奮性毒性(Blasco等人, (2014)Curr Med Chem . , 21(31):3551-3575)、粒線體動力學異常(Cappello及Francolini, (2017)Int J Mol Sci . , 18(10；Delic等人, (2018)J Neurosci Res . , 96(8):1353-1366；Onesto等人, (2016)Acta Neuropathol Commun . , 4(1):47)及氧化壓力之促成因素(Anand等人, (2013)Oxid Med Cell Longev . , 2013:635831；Sharma等人, (2016)Neurochem Res . , 41(5):965-984)的組合可導致ALS中之神經毒性結果。
分子量為43 KDa之反式活性反應(TAR)-DNA結合蛋白(TDP-43)鑑別為FTLD-U及ALS之UBI中的主要疾病蛋白(Neumann等人, (2006) Science 314:130-133)。此兩種病症中TDP-43病理之鑑別為以下提供機制聯繫：1)大比例ALS患者表現出一系列位於FTLD譜上的行為及認知變化(Murphy等人, (2007) Arch. Neurol., 64:330-334)；2)MND通常在FTLD-U患者中觀測到(McKhann等人, (2001) Arch. Neurol., 58:1803-1809)；3)在ALS及FTLD-U中觀測到之泛素病理存在顯著重疊(MacKenzie及Feldman (2005) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64:730-739)；及4) ALS及FTLD兩者共分離之家族中特定基因之基因座及突變的鑑別(Talbot及Ansorge (2006) Hum. Mol. Genet., 15:R183-R187)。TDP-43亦已展示為多種其他神經退化性疾病之組織病理學標記，該等疾病包括阿茲海默氏症(Amador-Ortiz等人, (2007),Ann Neurol ., 61:435-45)、帕金森氏症(Lin及Dickson, (2008)Acta Neuropathol ., 116:205-13)及杭丁頓氏症(Schwab等人, (2008),J Neuropathol Exp Neurol ., 67:1159-65)、海馬硬化(Amador-Ortiz等人, (2007), 同上)及路易氏體失智症(Lin及Dickson, (2008), 同上)；評述於(Lagier-Tourenne等人, (2010),Human Molecular Genetics , 19:R46-R64)中。
因此，需要研發經最佳化以靶向特定抗原、蛋白質、醣蛋白或脂蛋白，尤其針對具有基於蛋白質錯誤摺疊及聚集之病理以及在異質聚集體之情況下的疾病之新治療模態。
熱休克70 kDa蛋白(在本文中稱為「Hsp70s」)構成廣泛多種物種之細胞中普遍存在的伴護蛋白類別(Tavaria等人，(1996)Cell Stress Chaperones 1, 23-28)。Hsp70需要稱作輔伴護蛋白之輔助蛋白，諸如J域蛋白及核苷酸交換因子(NEF) (Hartl等人，(2009)Nat Struct Mol Biol 16, 574-581)，以便發揮作用。在用於摺疊蛋白質之Hsp70伴護蛋白機構之當前模型中，Hsp70在ATP結合狀態及ADP結合狀態之間循環，且J域蛋白結合至需要摺疊或再摺疊之另一蛋白質(稱作「受質蛋白」)，與Hsp70之ATP結合形式(Hsp70-ATP)相互作用(Young (2010)Biochem Cell Biol 88, 291-300；Mayer, (2010)Mol Cell 39, 321-331)。J域蛋白-受質複合物與Hsp70-ATP之結合刺激ATP水解，其造成Hsp70蛋白中之構形變化，封閉螺旋蓋，且藉此使受質蛋白與Hsp70-ADP之間的相互作用穩定化，以及引發J域蛋白釋放，該J域蛋白隨後自由結合至另一受質蛋白。
因此，根據此模型，J域蛋白藉由充當橋接子，且促進廣泛多種受質蛋白捕獲及呈遞至Hsp70機構中以促進摺疊或再摺疊成恰當構形，在Hsp70機構內起關鍵作用(Kampinga及Craig (2010)Nat Rev Mol Cell Biol 11, 579-592)。J域家族在原核生物(DnaJ蛋白)至真核細胞(Hsp40蛋白質家族)範圍內之物種中廣泛保守。J域(約60-80 aa)由四個螺旋構成：I、II、III及IV。螺旋II及III經由含有「HPD模體(motif)」之可撓性環連接，HPD模體在整個J域中高度保守且認為對活性而言至關重要(Tsai及Douglas, (1996)J Biol Chem 271, 9347-9354)。已發現HPD序列內之突變消除J域功能。
鑒於上文針對諸如ALS之蛋白質病變所提供之背景，顯然減少錯誤摺疊蛋白質含量可充當治療、預防或以其他方式改善此等破壞性病症之症狀的手段，且募集細胞修復蛋白質錯誤摺疊之先天性能力將為可採取之邏輯選擇。
諸位發明人已研發出一種新穎類別之融合蛋白，其募集細胞之先天性伴護蛋白機制，尤其Hsp70介導之系統，以尤其減少TDP-43介導之蛋白質聚集。不同於諸位發明人使用包含Hsp40蛋白(亦稱作J蛋白)，一種與Hsp70相互作用以增強蛋白分泌及表現之輔伴護蛋白之片段的融合蛋白的先前研究，本發明研究出於減少由突變TDP-43蛋白之聚集引起之蛋白質聚集及細胞毒性的目的而採用含J域之融合蛋白。在此上下文中，諸位發明人已驚人地發現，功能所需之J域之元件完全不同於J域在增強蛋白質表現及分泌方面之用途，表明本發明融合蛋白之作用模式之不同機制。本文所描述之融合蛋白包含J域及對TDP-43具有親和力之域。融合蛋白內TDP-43結合域之存在引起突變TDP-43蛋白聚集的特異性減少。 E1. 因此，在第一態樣中，本文揭示一種經分離之融合蛋白，其包含J蛋白之J域及TDP-43結合域。 E2. 如E1之融合蛋白，其中J蛋白之J域具有真核來源。 E3. 如E1至E2中任一項之融合蛋白，其中J蛋白之J域具有人類來源。 E4. 如E1至E3中任一項之融合蛋白，其中J蛋白之J域位於細胞溶質中。 E5. 如E1至E4中任一項之融合蛋白，其中J蛋白之J域選自由SEQ ID No: 1-50組成之群。 E6. 如E1至E5中任一項之融合蛋白，其中J域包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 1、5、6、10、16、24、25、31及49。 E7. 如E1至E6中任一項之融合蛋白，其中J域包含SEQ ID NO: 5之序列。 E8. 如E1至E6中任一項之融合蛋白，其中J域包含SEQ ID NO: 10之序列。 E9. 如E1至E6中任一項之融合蛋白，其中J域包含SEQ ID NO: 16之序列。 E10. 如E1至E6中任一項之融合蛋白，其中J域包含SEQ ID NO: 25之序列。 E11. 如E1至E6中任一項之融合蛋白，其中J域包含SEQ ID NO: 31之序列。 E12. 如E1至E11中任一項之融合蛋白，其中例如當使用ELISA分析量測時，TDP-43結合域對TDP-43 (例如使用包含TDP-43之C端207個胺基酸的報導子構築體)之KD 為1 µM或更小，例如300 nM或更小、100 nM或更小、30 nM或更小、10 nM或更小。 E13. 如E1至E12中任一項之融合蛋白，其中TDP-43結合域包含選自由SEQ ID NO: 51-55組成之群的序列。 E14. 如E1至E13中任一項之融合蛋白，其中TDP-43結合域包含SEQ ID NO:51-53之序列。 E15. 如E1至E13中任一項之融合蛋白，其中TDP-43結合域包含SEQ ID NO:51之序列。 E16. 如E1至E13中任一項之融合蛋白，其中TDP-43結合域包含SEQ ID NO:53之序列。 E17. 如E1至E16中任一項之融合蛋白，其包含複數個TDP-43結合域。 E18. 如E1至E17中任一項之融合蛋白，其由兩個TDP-43結合域組成。 E19. 如E1至E18中任一項之融合蛋白，其由三個TDP-43結合域組成。 E20. 如E1至E19中任一項之融合蛋白，其包含以下構築體中之一者： a. DNAJ-X-T， b. DNAJ-X-T-X-T， c. DNAJ-X-T-X-T-X-T， d. T-X-DNAJ， e. T-X-T-X-DNAJ， f. T-X-T-X-T-X-DNAJ， g. T-X-DNAJ-X-T， h. T-X-DNAJ-X-T-X-T， i. TDNAJ-X-TTTTTDNAJ-X-T， j. T-X-T-X-DNAJ-X-TT， k. TTDNAJ-X-T-X-TTTTTDNAJ-X-T， l. T-X-T-X-DNAJ-X-T-X-T-X-T， m. T-X-T-X-T-X-DNAJ-X-T， n. T-X-T-X-T-X-DNAJ-X-T-X-T， o. T-X-T-X-T-X-DNAJ-X-T-X-T-X-T， p. DnaJ-X-DnaJ-X-T-X-T， q. T-X-DnaJ-X-DnaJ， r. T-X-T-X-DnaJ-X-DnaJ，及 s. T-X-TDnaJ-X-TDnaJ-X-TTTT 其中， T為TDP-43結合域， DNAJ為J蛋白之J域，且 X為視情況選用之連接子。 E21. 如E1至E20中任一項之融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO: 5之J域序列及SEQ ID NO: 51之TDP-43結合域序列。 E22. 如E1至E21中任一項之融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO: 5之J域序列及SEQ ID NO: 53之TDP-43結合域序列的兩個複本。 E23. 如E1至E22中任一項之融合蛋白，其中融合蛋白包含選自由SEQ ID NO: 80-85及89-97組成之群的序列。 E24. 如E1至E23中任一項之融合蛋白，其中融合蛋白包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 80、82-85、89-90及92-97。 E25. 如E1至E23中任一項之融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO: 80之序列。 E26. 如E1至E23中任一項之融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO: 90之序列。 E27. 如E1至E23中任一項之融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO: 92之序列。 E28. 如E1至E23中任一項之融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO: 94之序列。 E29. 如E1至E23中任一項之融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO: 95之序列。 E30. 如E1至E23中任一項之融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO: 96之序列。 E31. 如E1至E30中任一項之融合蛋白，其進一步包含靶向試劑。 E32. 如E1至E31中任一項之融合蛋白，其進一步包含抗原決定基。 E33. 如E32之融合蛋白，其中抗原決定基為選自由SEQ ID NO:67-73組成之群的多肽。 E34. 如E1至E33中任一項之融合蛋白，其進一步包含細胞穿透劑。 E35. 如E34之融合蛋白，其中細胞穿透劑選自由SEQ ID NO: 74-77組成之群。 E36. 如E1至E35中任一項之融合蛋白，其進一步包含信號序列。 E37. 如E36之融合蛋白，其中信號序列包含選自由SEQ ID NO: 98-100組成之群的肽序列。 E38. 如E1至E37中任一項之融合蛋白，其能夠減少細胞中TDP-43蛋白之聚集。 E39. 如E1至E38中任一項之融合蛋白，其能夠降低TDP-43介導之細胞毒性。 E40. 一種核酸序列，其編碼如E1至E39中任一項之融合蛋白。 E41. 如E40之核酸序列，其中該核酸為DNA。 E42. 如E40之核酸序列，其中該核酸為RNA。 E43. 如E40至E42中任一項之核酸序列，其中該核酸包含至少一種經修飾之核酸。 E44. 如E40至E43中任一項之核酸序列，其進一步包含啟動子區、5' UTR、3' UTR，諸如聚(A)信號。 E45. 如E44之核酸序列，其中啟動子區包含選自由以下組成之群的序列：CMV增強子序列、CMV啟動子、CBA啟動子、UBC啟動子、GUSB啟動子、NSE啟動子、突觸蛋白啟動子、MeCP2啟動子及GFAP啟動子。 E46. 一種載體，其包含如E40至E45中任一項之核酸序列。 E47. 如E46之載體，其中載體選自由以下組成之群：腺相關病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒、反轉錄病毒、疱疹病毒、痘病毒(牛痘或黏液瘤)、副黏液病毒(麻疹、RSV或新城雞瘟病毒(Newcastle disease virus))、桿狀病毒、里奧病毒(reovirus)、α病毒及黃病毒。 E48. 如E46或E47之載體，其中載體為AAV。 E49. 一種病毒粒子，其包含衣殼及如E46至E48中任一項之載體。 E50. 如E49之病毒粒子，其中衣殼選自由以下組成之群：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、假型化AAV、恆河猴源AAV、AAVrh8、AAVrh10及AAV-DJan AAV衣殼突變體、AAV混雜血清型、親器官性AAV、親心性AAV及親心性AAVM41突變體。 E51. 如E49或E50之病毒粒子，其中衣殼選自由以下組成之群：AAV2、AAV5、AAV8、AAV9及AAVrh10。 E52. 如E49至E51中任一項之病毒粒子，其中衣殼為AAV2。 E53. 如E49至E51中任一項之病毒粒子，其中衣殼為AAV5。 E54. 如E49至E51中任一項之病毒粒子，其中衣殼為AAV8。 E55. 如E49至E51中任一項之病毒粒子，其中衣殼為AAV9。 E56. 如E49至E51中任一項之病毒粒子，其中衣殼為AAV rh10。 E57. 一種醫藥組合物，其包含選自由以下組成之群的藥劑：如E1至E39中任一項之融合蛋白、表現如E1至E39之融合蛋白之細胞、如E40至E45中任一項之核酸、如E46至E48中任一項之載體、如E49至E56中任一項之病毒粒子，及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。 E58. 一種降低細胞中TDP-43蛋白之毒性的方法，其包含使該細胞與有效量之一或多種選自由以下組成之群的藥劑接觸：如E1至E39中任一項之融合蛋白、表現如E1至E39之融合蛋白之細胞、如E40至E45中任一項之核酸、如E46至E48中任一項之載體、如E49至E56中任一項之病毒粒子及如E57之醫藥組合物。 E59. 如E58之方法，其中細胞係在個體中。 E60. 如E58至E59中任一項之方法，其中個體為人類。 E61. 如E58至E60中任一項之方法，其中細胞為中樞神經系統及周邊神經系統之細胞。 E62. 如E58至E61中任一項之方法，其中個體鑑別為患有TDP-43疾病。 E63. 如E62之方法，其中TDP-43疾病選自由以下組成之群：ALS、FTD、帕金森氏症、杭丁頓氏症、阿茲海默氏症、海馬硬化、路易氏體失智症及邊緣主導年齡相關TDP-43腦病。 E64. 如E62或E63之方法，其中TDP-43疾病為ALS。 E65. 如E58至E64中任一項之方法，其中當與對照細胞相比時，細胞中聚集TDP-43蛋白之量減少。 E66. 一種在有需要個體中治療、預防TDP-43疾病或延緩其進展的方法，該方法包含投與有效量之一或多種選自由以下組成之群的藥劑：如E1至E39中任一項之融合蛋白、表現如E1至E39之融合蛋白之細胞、如E40至E45中任一項之核酸、如E46至E48中任一項之載體、如E49至E56中任一項之病毒粒子及如E57之醫藥組合物。 E67. 如E66之方法，其中TDP-43疾病選自由以下組成之群：ALS、FTD、帕金森氏症、杭丁頓氏症、阿茲海默氏症、海馬硬化、路易氏體失智症及邊緣主導年齡相關TDP-43腦病。 E68. 如E67之方法，其中TDP-43疾病為ALS。 E69. 一種如E1至E39中任一項之融合蛋白、表現如E1至E39之融合蛋白之細胞、如E40至E45中任一項之核酸、如E46至E48中任一項之載體、如E49至E56中任一項之病毒粒子及如E57之醫藥組合物中之一或多者的用途，其用於製備適用於在個體中預防TDP-43疾病或延緩該疾病進展的藥劑。 E70. 如E69之用途，其中TDP-43疾病選自由以下組成之群：ALS、FTD、帕金森氏症、杭丁頓氏症、阿茲海默氏症、海馬硬化、路易氏體失智症及邊緣主導年齡相關TDP-43腦病。 E71. 如E69或E70之用途，其中TDP-43疾病為ALS。
相關申請案之交叉參考 本申請案根據35 U.S.C. § 119(e)主張2020年4月28日申請之美國臨時專利申請案63/016,707，以及2020年6月5日申請之美國臨時專利申請案63/035,437的優先權。前述申請案之全部內容以全文引用之方式併入本文中。
定義 除非上下文另外明確指示，否則如本說明書及申請專利範圍中所用，單數形式「一 ( a / an ) 」及「該 」包括複數個參考物。舉例而言，術語「一細胞 」包括複數個細胞，包括其混合物。
術語「多肽 」、「肽 」及「蛋白質 」在本文中可互換使用以指任何長度之胺基酸之聚合物。聚合物可為直鏈或分支鏈，其可包含經修飾之胺基酸，且其可間雜有非胺基酸。術語亦涵蓋已經修飾之胺基酸聚合物，例如藉由二硫鍵形成、醣基化、脂質化、乙醯化、磷酸化或任何其他操縱，諸如與標記組分結合。
如本文所用，術語「胺基酸 」係指天然及/或非天然或合成胺基酸，包括但不限於D或L光學異構體，及胺基酸類似物及肽模擬物。標準單字母或三字母編碼用於指示胺基酸。
「宿主細胞 」包括可為或已為本發明載體之接受者的單獨細胞或細胞培養物。宿主細胞包括單一宿主細胞之後代。由於自然、偶然或目的性突變，後代可能未必與原始母細胞完全相同(在形態或總DNA互補序列之基因體方面)。宿主細胞包括經本發明之載體活體內轉染之細胞。
當用於描述本文所揭示之各種多肽時，「經分離 」意謂已鑑別且自其天然環境之組分分離及/或回收的多肽。其天然環境之污染組分為將通常干擾多肽之診斷或治療用途之物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。如熟習此項技術者所顯見，非天然存在之聚核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或其片段不需要「分離」以將其與其天然存在之對應物區分開。另外，「濃縮」、「分離」或「稀釋」之聚核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或其片段可與其天然存在之對應物區分開，因為每體積之分子濃度或數目一般大於其天然存在之對應物。一般而言，將藉由重組方式製得且表現於宿主細胞中之多肽視為「經分離」。
「經分離之 」聚核苷酸或多肽編碼核酸或其他多肽編碼核酸為經鑑別且與在多肽編碼核酸之天然來源中通常與其相關聯之至少一種雜質核酸分子分離的核酸分子。經分離之多肽編碼核酸分子不呈其於自然界中所發現之形式或設定。經分離之多肽編碼核酸分子因此與其存在於天然細胞中時之特定多肽編碼核酸分子區分開。然而，經分離之多肽編碼核酸分子包括細胞中所含之多肽編碼核酸分子，該等細胞通常在例如核酸分子所處之染色體或染色體外位置不同於天然細胞之情況下表現多肽。
術語「聚核苷酸 」、「核酸 」、「核苷酸 」及「寡核苷酸 」可互換使用。其係指任何長度之核苷酸(去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其類似物的聚合形式。聚核苷酸可具有任何三維結構，且可執行任何已知或未知的功能。以下為聚核苷酸之非限制性實例：基因或基因片段之編碼或非編碼區、自連鎖分析所定義之基因座(loci/locus)、外顯子、內含子、信使RNA (mRNA)、轉移RNA、核糖體RNA、核糖核酸酶、cDNA、重組聚核苷酸、分支鏈聚核苷酸、質體、載體、經分離之任何序列DNA、經分離之任何序列RNA、核酸探針及引子。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及核苷酸類似物。若存在，可在聚合物組裝之前或之後賦予核苷酸結構之修飾。核苷酸之序列可間雜有非核苷酸組分。聚核苷酸可在聚合之後，諸如藉由與標記組分結合而經進一步修飾。
如本文所定義，術語「TDP - 43 病症 」或「TDP - 43 介導之疾病 」係指與胞內TDP-43聚集體，尤其TDP-43突變蛋白之聚集體形成相關的病症。TDP-43病症之實例包括但不限於較佳參考肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、額顳葉型失智症(FTD)、帕金森氏症、杭丁頓氏症、阿茲海默氏症、海馬硬化、路易氏體失智症及邊緣主導年齡相關TDP-43腦病。
「載體 」為較佳在適當宿主中自主複製之核酸分子，其將插入之核酸分子傳遞至宿主細胞中及/或之間。術語包括主要用於將DNA或RNA插入至細胞中之載體、主要用於複製DNA或RNA之載體的複製品及用於DNA或RNA轉錄及/或轉譯之表現載體。亦包括提供超過一種以上功能之載體。「表現載體 」為當引入至適當宿主細胞中時，可轉錄及轉譯成多肽之聚核苷酸。「表現系統 」通常意謂由可用以產生所需表現產物之表現載體構成的適合宿主細胞。
術語「可操作地 連接 」係指所描述之組分處於准許其以其預期方式作用的關係中的併接。「可操作地連接 」至編碼序列之控制序列係以使編碼序列之表現在與控制序列相容之條件下達成的方式接合。「可操作地連接 」序列可包括與相關基因相鄰之表現控制序列及以反式作用或以一定距離作用以控制相關基因之表現控制序列。術語「表現控制序列 」係指實現所接合之編碼序列的表現及加工所需之聚核苷酸序列。表現控制序列包括適當轉錄起始、終止、啟動子及強化子序列；有效RNA加工信號，諸如剪接及聚腺苷酸化信號；使細胞質mRNA穩定之序列；增強轉譯效率之序列(諸如，Kozak共有序列)；增強蛋白質穩定性之序列；及必要時，增強蛋白質分泌之序列。此類控制序列之性質視宿主生物體而不同；在原核生物中，此類控制序列一般包括啟動子、核糖體結合位點及轉錄終止序列；在真核生物中，此類控制序列一般包括啟動子及轉錄終止序列。術語「控制序列 」意欲包括其存在對表現及加工而言至關重要之組分，且亦可包括其存在有利之額外組分，例如前導序列及融合搭配物序列。除非另外陳述，否則本文中對將編碼本發明之融合蛋白之核酸分子插入表現載體中的描述或陳述意謂當將含有所插入之核酸分子之表現載體引入相容宿主細胞或生物體之相容細胞中時，所插入之核酸亦已在載體內可操作地連接至功能啟動子以及為表現經編碼融合蛋白所需之其他轉錄及轉譯控制元件。
當應用於聚核苷酸時，「重組 」意謂聚核苷酸為活體外選殖、限制性酶切及/或接合步驟及產生可在宿主細胞中潛在地表現之構築體之其他程序的不同組合之產物。
術語「基因 」及「基因片段 」在本文中可互換使用。其係指含有至少一個能夠在經轉錄及轉譯之後編碼特定蛋白質之開放閱讀框架的聚核苷酸。基因或基因片段可為基因體或cDNA，只要聚核苷酸含有至少一個可覆蓋整個編碼區或其區段之開放閱讀框架。「融合基因」為由至少兩種連接在一起之異源聚核苷酸構成之基因。
術語「疾病 」及「病症 」可互換地用以指示根據此項技術中之可接受之醫療標準及實踐鑑別的病理狀態。
如本文所用，術語「有效量 」係指足以減輕或改善疾病或其一或多種症狀之嚴重程度及/或持續時間；預防不利或病理狀態進展；使得病理狀態消退；預防與病理狀態相關之一或多個症狀之復發、發展、發作或進展；偵測病症；或增強或提高療法(例如投與另一預防劑或治療劑)之預防或治療效果之療法的量。
如本文所用，術語「J 域 」係指保留促進Hsp70及其同源物之固有ATP酶催化活性之能力的片段。已測定出多種J蛋白之J域(參見例如Kampinga等人(2010) Nat. Rev., 11 : 579-592；Hennessy等人(2005) Protein Science, 14: 1697-1709，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中)，且特徵為多個標誌：其特徵為四個α-螺旋(I、II、III、IV)，且通常在螺旋II與III之間具有組胺酸、脯胺酸及天冬胺酸之高度保守三肽序列模體(稱作「HPD模體」)。通常，J蛋白之J域之長度為五十個與七十個胺基酸之間，且咸信J域與Hsp70-ATP伴護蛋白之相互作用(結合)位點為自螺旋II內延伸之區且HPD模體為刺激Hsp70 ATP酶活性所必要的。如本文所用，術語「J域」意謂包括天然J域序列及其功能性變體，其保留促進Hsp70固有ATP酶活性之能力，此可使用此項技術中熟知之方法量測(參見例如Horne等人(2010)J . Biol . Chem . , 285, 21679-21688，其以全文引用之方式併入本文中)。人類J域之非限制性清單提供於表1中。
諸位發明人已發現，使細胞與包含J蛋白之J域及TDP-43結合域之融合蛋白構築體進行某些接觸具有出人意料的減少突變TDP43蛋白之聚集的效果。咸信突變TDP-43之聚集導致多種破壞性疾病，包括但不限於肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、額顳葉型失智症及阿茲海默氏症。因此，本文提供用於治療例如有需要之個體之TDP-43病症的適用組合物及方法。
為了克服與基於伴護蛋白之療法相關之問題，吾等研究其是否將有可能設計具有高特異性之人工伴護蛋白。吾等設計包含Hsp70結合/活化之效應子域(J域序列)及賦予對TDP-43蛋白之特異性之域的一系列融合蛋白構築體。所得融合蛋白用於促進Hsp70及其同源物之固有ATP酶催化活性，引起蛋白質摺疊增加、聚集減少及/或清除加速。
I . 融合蛋白構築體 a . 適用於本發明之 J 域 已確定各種J蛋白之J域。參見例如Kampinga等人，Nat. Rev., 11: 579-592 (2010)；Hennessy等人，Protein Science, 14:1697-1709 (2005)。適用於製備本發明之融合蛋白之J域具有主要促進HSP70 ATP酶活性之J域之關鍵定義特徵。因此，適用於本發明中之經分離之J域包含多肽域，其特徵為四個α-螺旋(I、II、III、IV)，且通常在螺旋II與III之間具有組胺酸、脯胺酸及天冬胺酸之高度保守三肽序列(稱作「HPD模體」)。通常，J蛋白之J域之長度為五十個與七十個胺基酸之間，且咸信J域與Hsp70-ATP伴護蛋白之相互作用(結合)位點為自螺旋II內延伸之區且HPD模體對於原始活性而言為重要的。代表性J域包括但不限於DnaJB1、DnaJB2、DnaJB6、DnaJC6之J域；SV40之大T抗原之J域；及哺乳動物半胱胺酸鏈帶蛋白(CSP-α)之J域。可用於本發明之融合蛋白中之此等及其他J域之胺基酸序列提供於表1中。保守HPD模體以粗體突出顯示。在一個實施例中，本文所揭示之融合蛋白包含選自由SEQ ID NO: 1-50組成之群的J域。如下文實例章節所示，諸位發明人已發現使用缺少保守「HPD」模體之J域不能減少蛋白質聚集。因此，在另一實施例中，本文所揭示之融合蛋白包含包括共有HPD模體之J域。在一個特定實施例中，選自由SEQ ID NO: 1-15、17-50組成之群。
在一特定實施例中，融合蛋白包含選自由以下組成之群的J域：SEQ ID NO: 1、5、6、10、16、24、25、31及49。表 1 . 代表性人類 J 域 序列
蛋白質名稱 SEQ ID NO: 長度 J域胺基酸序列
DNAJA1 1 63 TYYDVLGVKPNATQEELKKAYRKLALKYHPD KNPNEGEKFKQISQAYEVLSDAKKRELYDKGG
DNAJA2 2 63 KLYDILGVPPGASENELKKAYRKLAKEYHPD KNPNAGDKFKEISFAYEVLSNPEKRELYDRYG
DNAJA3 3 66 DYYQILGVPRNASQKEIKKAYYQLAKKYHPD TNKDDPKAKEKFSQLAEAYEVLSDEVKRKQYDAYG
DNAJA4 4 67 ETQYYDILGVKPSASPEEIKKAYRKLALKYHPD KNPDEGEKFKLISQAYEVLSDPKKRDVYDQGGEQ
DNAJB1 5 69 GKDYYQTLGLARGASDEEIKRAYRRQALRYHPD KNKEPGAEEKFKEIAEAYDVLSDPRKREIFDRYGEE
DNAJB2 6 70 ASYYEILDVPRSASADDIKKAYRRKALQWHPD KNPDNKEFAEKKFKEVAEAYEVLSDKHKREIYDRYGRE
DNAJB3 7 69 MVDYYEVLDVPRQASSEAIKKAYRKLALKWHPD KNPENKEEAERRFKQVAEAYEVLSDAKKRDIYDRYG
DNAJB4 8 69 GKDYYCILGIEKGASDEDIKKAYRKQALKFHPD KNKSPQAEEKFKEVAEAYEVLSDPKKREIYDQFGEE
DNAJB5 9 65 DYYKILGIPSGANEDEIKKAYRKMALKYHPD KNKEPNAEEKFKEIAEAYDVLSDPKKRGLYDQYG
DNAJB6 10 68 VDYYEVLGVQRHASPEDIKKAYRKLALKWHPD KNPENKEEAERKFKQVAEAYEVLSDAKKRDIYDKYG
DNAJB7 11 67 DYYEVLGLQRYASPEDIKKAYHKVALKWHPD KNPENKEEAERKFKEVAEAYEVLSNDEKRDIYDKYG
DNAJB8 12 67 NYYEVLGVQASASPEDIKKAYRKLALRWHPD KNPDNKEEAEKKFKLVSEAYEVLSDSKKRSLYDRAG
DNAJB9 13 65 SYYDILGVPKSASERQIKKAFHKLAMKYHPD KNKSPDAEAKFREIAEAYETLSDANRRKEYDTLG
DNAJB11 14 66 DFYKILGVPRSASIKDIKKAYRKLALQLHPD RNPDDPQAQEKFQDLGAAYEVLSDSEKRKQYDTYG
DNAJB12 15 65 YEILGVSRGASDEDLKKAYRRLALKFHPD KNHAPGATEAFKAIGTAYAVLSNPEKRKQYDQFGDD
DNAJB13 16 66 DYYSVLGITRNSEDAQIKQAYRRLALKHHPLKSNEPSSAEIFRQIAEAYDVLSDPMKRGIYDKFG
DNAJB14 17 65 NYYEVLGVTKDAGDEDLKKAYRKLALKFHPD KNHAPGATDAFKKIGNAYAVLSNPEKRKQYDLTG
DNAJC1 18 65 NFYQFLGVQQDASSADIRKAYRKLSLTLHPD KNKDENAETQFRQLVAIYEVLKDDERRQRYDDIL
DNAJC2 19 74 DHYAVLGLGHVRYKATQRQIKAAHKAMVLKHHPD KRKAAGEPIKEGDNDYFTCITKAYEMLSDPVKRRAFNSVD
DNAJC3 20 69 DYYKILGVKRNAKKQEIIKAYRKLALQWHPD NFQNEEEKKKAEKKFIDIAAAKEVLSDPEMRKKFDDGE
DNAJC4 21 66 TYYELLGVHPGASTEEVKRAFFSKSKELHPD RDPGNPSLHSRFVELSEAYRVLSREQSRRSYDDQL
DNAJC5 22 70 GESLYHVLGLDKNATSDDIKKSYRKLALKYHPD KNPDNPEAADKFKEINNAHAILTDATKRNIYDKYGSL
DNAJC5B 23 66 ALYEILGLHKGASNEEIKKTYRKLALKHHPD KNPDDPAATEKFKEINNAHAILTDISKRSIYDKYG
DNAJC6 24 65 TKWKPVGMADLVTPEQVKKVYRKAVLVVHPD KATGQPYEQYAKMIFMELNDAWSEFENQGQKPLY
DNAJC7 25 71 DYYKILGVDKNASEDEIKKAYRKRALMHHPD RHSGASAEVQKEEEKKFKEVGEAFTILSDPKKKTRYDSGQ
DNAJC8 26 68 NPFEVLQIDPEVTDEEIKKRFRQLSILVHPD KNQDDADRAQKAFEAVDKAYKLLLDQEQKKRALDVIQ
DNAJC9 27 68 DLYRVLGVRREASDGEVRRGYHKVSLQVHPD RVGEGDKEDATRRFQILGKVYSVLSDREQRAVYDEQG
DNAJC10 28 66 DFYSLLGVSKTASSREIRQAFKKLALKLHPD KNPNNPNAHGDFLKINRAYEVLKDEDLRKKYDKYG
DNAJC11 29 69 DYYSLLNVRREASSEELKAAYRRLCMLYHPD KHRDPELKSQAERLFNLVHQAYEVLSDPQTRAIYDIYG
DNAJC12 30 66 DYYTLLGCDELSSVEQILAEFKVRALECHPD KHPENPKAVETFQKLQKAKEILTNEESRARYDHWR
DNAJC13 31 66 DAYEVLNLPQGQGPHDESKIRKAYFRLAQKYHPD KNPEGRDMFEKVNKAYEFLCTKSAKIVDGPDP
DNAJC14 32 65 NPFHVLGVEATASDVELKKAYRQLAVMVHPD KNHHPRAEEAFKVLRAAWDIVSNAEKRKEYEMKR
DNAJC15 33 55 EAGLILGVSPSAGKAKIRTAHRRVMILNHPD KGGSPYVAAKINEAKDLLETTTKH
DNAJC16 34 65 DPYRVLGVSRTASQADIKKAYKKLAREWHPD KNKDPGAEDKFIQISKAYEILSNEEKRSNYDQYG
DNAJC17 35 66 DLYALLGIEEKAADKEVKKAYRQKALSCHPD KNPDNPRAAELFHQLSQALEVLTDAAARAAYDKVR
DNAJC18 36 65 NYYEILGVSRDASDEELKKAYRKLALKFHPD KNCAPGATDAFKAIGNAFAVLSNPDKRLRYDEYG
DNAJC19 37 55 EAALILGVSPTANKGKIRDAHRRIMLLNHPD KGGSPYIAAKINEAKDLLEGQAKK
DNAJC20 38 72 DYFSLMDCNRSFRVDTAKLQHRYQQLQRLVHPD FFSQRSQTEKDFSEKHSTLVNDAYKTLLAPLSRGLYLLK
DNAJC21 39 67 CHYEALGVRRDASEEELKKAYRKLALKWHPD KNLDNAAEAAEQFKLIQAAYDVLSDPQERAWYDNHR
DNAJC22 40 65 LAYQVLGLSEGATNEEIHRSYQELVKVWHPD HNLDQTEEAQRHFLEIQAAYEVLSQPRKPWGSRR
DNAJC23 41 62 NPYEVLNLDPGATVAEIKKQYRLLSLKYHPD KGGDEVMFMRIAKAYAALTDEESRKNWEEFG
DNAJC24 42 72 DWYSILGADPSANISDLKQKYQKLILMYHPD KQSTDVPAGTVEECVQKFIEIDQAWKILGNEETKREYDLQR
DNAJC25 43 76 DCYEVLGVSRSAGKAEIARAYRQLARRYHPD RYRPQPGDEGPGRTPQSAEEAFLLVATAYETLKDEETRKDYDYML
DNAJC26 44 65 SRWTPVGMADLVAPEQVKKHYRRAVLAVHPD KAAGQPYEQHAKMIFMELNDAWSEFENQGSRPLF
DNAJC27 45 57 DSWDMLGVKPGASRDEVNKAYRKLAVLLHPD KCVAPGSEDAFKAVVNARTALLKNIK
DNAJC28 46 65 EYYRLLNVEEGCSADEVRESFHKLAKQYHPD SGSNTADSATFIRIEKAYRKVLSHVIEQTNASQS
DNAJC29 47 88 ILKEVTSVVEQAWKLPESERKKIIRRLYLKWHPD KNPENHDIANEVFKHLQNEINRLEKQAFLDQNADRASRRTFSTSASRFQSDKYS
DNAJC30 48 66 ALYDLLGVPSTATQAQIKAAYYRQCFLYHPD RNSGSAEAAERFTRISQAYVVLGSATLRRKYDRGL
SV40 J域 49 64 QLMDLLGLERSAWGNIPLMRKAYLKKCKEFHPD KGGDEEKMKKMNTLYKKMEDGVKYAHQPDFG
細菌J域 50 70 KQDYYEILGVSKTAEEREIRKAYKRLAMKYHPD RNQGDKEAEAKFKEIKEAYEVLTDSQKRAAYDQYGHA
b ． TDP - 43 結合域 融合蛋白亦包含至少一種TDP-43結合域。TDP-43結合域可為單鏈多肽或與J域接合以形成融合蛋白之多聚體多肽。
理想的是，TDP-43結合域具有足以能夠結合以病理學含量存在於細胞內之TDP-43蛋白的親和力。因此，在一個實施例中，融合蛋白包含TDP-43結合域，當在96孔微量滴定盤上藉由ELISA測試時，該結合域對TDP-43報導子構築體(例如全長TDP-43 (Novus Biologicals, NBP2-22850, Centennial, CO)之KD 為例如2 µM或更小、1 µM或更小、500 nM或更小、300 nM或更小、100 nM或更小、30 nM或更小。
TDP-43結合域先前已經鑑別及表徵(參見例如美國專利第10,259,866號、WO 2016/53610、WO 2018/218252、WO 2019/134981、WO 2019/177138，其中之每一者以引用之方式併入本文中)。因此，在另一實施例中，融合蛋白包含選自由SEQ ID NO: 51-55 (參見例如表2)組成之群的TDP-43結合域。在一個特定實施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 51之TDP-43結合域。在另一實施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 53之TDP-43結合域。在再一實施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 52之TDP-43結合域。
在另一實施例中，融合蛋白亦考慮使用與J域化學結合之TDP-43結合域。TDP-43結合域可與J域直接結合。替代地，其可藉由連接子與J域結合。舉例而言，存在大量熟習此項技術者已知且適用於使TDP-43結合域交聯至J域或使靶向域交聯至包含TDP-43結合域及J域之融合蛋白的化學交聯劑。舉例而言，交聯劑為異雙官能交聯劑，其可用於以逐步方式連接分子。異雙官能交聯劑提供設計用於結合蛋白質之更特定偶合方法的能力，藉此減少諸如同源蛋白質聚合物之非所需副反應物存在。廣泛多種異雙官能交聯劑為此項技術中已知的，包括4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸丁二醯亞胺基酯(SMCC)、間馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基丁二醯亞胺酯(MBS)；N-丁二醯亞胺基(4-碘基乙醯基)胺基苯甲酸酯(SIAB)、4-(對馬來醯亞胺基苯基)丁酸丁二醯亞胺基酯(SMPB)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)；4-丁二醯亞胺基氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)-甲苯(SMPT)、3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二醯亞胺基酯(SPDP)、6-[3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯]己酸丁二醯亞胺基酯(LC-SPDP)。具有N-羥基丁二醯亞胺部分之彼等交聯劑可以一般具有更大水溶性之N-羥基磺酸基丁二醯亞胺類似物形式獲得。另外，在連接鏈內具有二硫橋鍵之彼等交聯劑可實際上合成為烷基衍生物以便降低活體內連接子裂解之量。除了異雙官能交聯劑之外，存在多種其他交聯劑，包括同雙官能及光反應性交聯劑。辛二酸二丁二醯亞胺酯(DSS)、雙順丁烯二醯亞胺基己烷(BMH)及二甲基庚二亞氨酸酯.2HCl (福布斯-科里病(Forbes-Cori Disease))為適用的同雙官能交聯劑之實例，且雙-[B-(4-疊氮基柳基醯胺基)乙基]二硫化物(BASED)及N-二丁二醯亞胺基-6(4'-疊氮基-2'-硝基苯基胺基)己酸酯(SANPAH)為用於本發明中適用之光反應性交聯劑之實例。對於蛋白質偶合技術之近期評述，參見Means等人，(1990)Bioconj . Chem . 1:2-12，其以引用之方式併入本文中。表 2 ： TDP-43結合域之實例
名稱 SEQ ID NO: 長度 序列
3B12A 51 241 EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRTEQGLEWIGRIDPEDGETKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTIIYYYGSRYVDYWGQGTTLTVSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSSYLHWYQQKPGFSPKLLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSSIPLTFGSGTKLEI
51C1 52 239 EVQLVESGGGLVQPGGSLRISCTTSGFIFSDYWMHWVRQAPGKGLTWVSRINLDGSDTIYADSVKGRFTISRDNDKNTLYLQMNSLRVEDTAIYYCARSRKSVWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGSNTDVGAYDYVSWSQQLPGKAPKFVIFDVDVRPSGISDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTKSGTLVFGGGTKVTVV
3F10 53 248 EVQLLESGGDLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSQAMSWVRQAPGKGLEWVSALSRTGDYTWYADSVRGRFTVSRDDSKNIFYLEMNSLRAEDTAVYYCAKNYYSSFGYNWAAFHIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQDVNNNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASRRATGVPDRFSGRGSGTDFTLTINRLEPEDFAMYFCQQYGGSPPYTFGQGTKLEIK
聚Q (Q25) 54 25 QQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQ
QBP1 55 11 SNWKWWPGIFD
c . 視情況選用之連接子 本文所描述之融合蛋白可視情況含有一或多種連接子。連接子可為肽或非肽。連接子之目的為尤其提供蛋白質內功能域之間的足夠距離(例如J域與TDP-43結合域之間，TDP-43結合域之串聯佈置之間，J域與TDP-43結合域及視情況選用之靶向試劑之間，或J域與TDP-43結合域及視情況選用之偵測域或抗原決定基之間)以便於域中之每一者之最佳功能。明顯地，連接子較佳不干擾J域(根據本發明之融合蛋白之目標蛋白結合域)之各別功能。選擇連接子(若存在於本發明之融合蛋白中)以減少目標蛋白(TDP-43蛋白)引起之細胞毒性，且若直接附接實現所需作用，則其可省去。本發明之融合蛋白中存在之連接子可包含一或多個胺基酸，其由存在於表現載體(其中在框架中插入編碼如本文所描述之蛋白域或整個融合蛋白之核酸區段)之選殖位點處或周圍之核酸區段上之核苷酸序列編碼。在一個實施例中，肽連接子之長度為1個胺基酸與20個胺基酸之間。在另一實施例中，肽連接子之長度為2個胺基酸與15個胺基酸之間。在再一實施例中，肽連接子之長度為2個胺基酸與10個胺基酸之間。
選擇一或多個多肽連接子以製造根據本發明之融合蛋白係在習此相關技藝之人士之知識及技能內。參見例如Arai等人，Protein Eng . , 14(8): 529-532 (2001)；Crasto等人，Protein Eng . , 13(5): 309-314 (2000)；George等人，Protein Eng . , 15(11): 871-879 (2003)；Robinson等人，Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 95: 5929-5934 (1998)，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中。可用於製備根據本發明之融合蛋白之兩個或多於兩個胺基酸的連接子之實例包括但不限於以下表3中所提供之彼等。表 3 ：連接子序列
SEQ ID NO: 長度 序列
56 2 SR
57 4 GTGS
58 5 GLESR
59 4 GGSG
60 4 GGGS
61 5 DIAAA
62 9 DIAAALESR
63 15 GGGGSGGGGSGGGGS
64 11 AEAAAKEAAAK
65 15 SGGGSGGGGSGGGGS
66 25 DIGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAAA
d . 靶向試劑 本文所揭示之融合蛋白可進一步包含靶向部分。如本文所用，術語「靶向部分」及「靶向試劑」可互換使用且係指與融合蛋白相關之物質，其增強結合、轉運、積聚、滯留時間、生物可用性或改變融合蛋白在細胞中或個體體內之生物活性或治療效果。靶向部分可在組織、細胞及/或次細胞水準下具有功能。靶向部分可例如在向個體投與融合蛋白後引導融合蛋白定位至特定細胞、組織或器官，或胞內分佈。在一個實施例中，靶向部分位於融合蛋白之N端。在另一實施例中，靶向部分位於融合蛋白之C端。在再一實施例中，靶向部分位於內部。在另一實施例中，靶向部分經由化學結合附接至融合蛋白。
靶向部分可尤其包括但不限於有機或無機分子、肽、肽模擬物、蛋白質、抗體或其片段、生長因子、酶、凝集素、抗原或免疫原、病毒或其組分、病毒載體、受體、受體配位體、毒素、聚核苷酸、寡核苷酸或適體、核苷酸、碳水化合物、糖、脂質、糖醣脂、核蛋白、醣蛋白、脂蛋白、類固醇、激素、生長因子、化學引誘劑、細胞介素、趨化介素、藥物或小分子。
在本發明之一例示性實施例中，靶向部分增強結合、轉運、積聚、滯留時間、生物可用性，或改變平台或其相關配位體及/或目標細胞或組織(例如神經元細胞、中樞神經系統及/或周邊神經系統)中之活性劑之生物活性或治療效果。因此，靶向部分可對與中樞神經系統相關之細胞受體具有特異性，或與經由血腦障壁(BBB)增強遞送至CNS另外相關。因此，如上文所描述之配位體可為配位體及靶向部分兩者。
在一些實施例中，靶向部分可為細胞穿透肽，例如如以全文引用之方式併入本文中之美國專利第10,111,965號中所描述。在另一實施例中，靶向部分可為抗體或抗原結合片段或其單鏈衍生物，例如如以全文引用之方式併入本文中之美國序號16/131,591中所描述。在另一實施例中，靶向部分可為核定位信號或核輸出信號之胺基酸序列。
靶向部分可藉由直接地或間接地結合至核心而與靶向細胞遞送之平台偶合。舉例而言，在核心包含奈米粒子之實施例中，靶向部分結合至奈米粒子可利用用以將PEG繫栓至奈米粒子之類似官能基。因此，靶向部分可經由靶向部分官能化直接結合至奈米粒子。替代地，靶向部分可經由靶向部分結合至如上文所論述之官能化PEG而間接結合至奈米粒子。靶向部分可藉助於共價、非共價或靜電相互作用附接至核心。在一個實施例中，靶向部分為肽。在一特定實施例中，靶向部分為共價附接至融合蛋白之N端之肽。
e . 抗原決定基 在某些實施例中，本發明之融合蛋白含有視情況選用之抗原決定基或標籤，其可賦予融合蛋白額外特性。如本文所用，術語「抗原決定基」及「標籤」可互換使用以指通常長度為300個或更少的胺基酸之胺基酸序列，其通常附接至融合蛋白之N端或C端。在一個實施例中，本發明之融合蛋白進一步包含用於促進純化之抗原決定基。以下表4中所提供之適用於純化之此類抗原決定基的實例包括人類IgG1 Fc序列(SEQ ID NO: 67)、FLAG抗原決定基(DYKDDDDK，SEQ ID NO: 68)、His6抗原決定基(SEQ ID NO: 69)、c-myc (SEQ ID NO: 70)、HA (SEQ ID NO: 71)、V5抗原決定基(SEQ ID NO: 72)或麩胱甘肽s-轉移酶(SEQ ID NO: 73)。在另一實施例中，本發明之融合蛋白進一步包含用於在投與至個體，例如人類中時延長融合蛋白之半衰期的抗原決定基。適用於延長半衰期之此類抗原決定基之實例包括人類Fc序列。因此，在一個特定實施例中，除J域及TDP-43結合域之外，融合蛋白亦包含人類Fc抗原決定基。抗原決定基位於融合蛋白之C端。表 4 ：抗原決定基之代表性實例
SEQ ID NO: 抗原決定基 長度 序列
67 人類IgG1 Fc域 232 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
68 FLAG抗原決定基 8 DYKDDDDK
69 His6 6 HHHHHH
70 c-myc 10 EQKLISEEDL
71 HA 9 YPYDVPDYA
72 V5抗原決定基 14 GKPIPNPLLGLDST
73 麩胱甘肽S-轉移酶 220 MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSD
f . 細胞穿透肽 在另其他實施例中，本文所描述之融合蛋白可進一步包含細胞穿透肽。已知細胞穿透肽攜帶結合貨物(無論小分子、肽、蛋白質或核酸)至細胞中。本發明之融合蛋白中之細胞穿透肽之非限制性實例包括但不限於聚陽離子肽，例如HIV TAT肽49-57、聚精胺酸及穿膜肽pAntan (43-58)；兩性肽，例如pep-1；疏水性肽，例如C405Y及其類似物。參見下表5。表 5 ：細胞穿透肽之實例
SEQ ID NO: 長度 序列
74 9 RKKRRQRRR
75 15 RQIKWFQNRRMKWKK
76 21 KETWWETWWTEWSQPKKKRKV
77 17 CSIPPEVKFNKPFVYLI
因此，在一個實施例中，融合蛋白包含細胞穿透肽及融合蛋白，其中細胞穿透肽選自由SEQ ID NO: 74-77組成之群，且融合蛋白包含J域及TDP-43結合域。在一個實施例中，融合蛋白選自由SEQ ID NO: 80-85及89-96組成之群。在另一實施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 74之信號序列，及選自由SEQ ID NO: 80-85、89-90及92-96組成之群的融合蛋白。在另一實施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 75之細胞穿透肽，及選自由SEQ ID NO: 80-85、89-90及92-96組成之群的融合蛋白。在另一實施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 76之細胞穿透肽，及選自由SEQ ID NO: 80-85、89-90及92-96組成之群的融合蛋白。在又一實施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 77之細胞穿透肽，及選自由SEQ ID NO: 80-85、89-90及92-96組成之群的融合蛋白。可向個體，例如人類個體(例如患有TDP-43病症或處於罹患該病症風險下之患者)投與表現具有細胞穿透肽之融合蛋白構築體之細胞。融合蛋白自細胞分泌，其幫助減少含TDP-43之蛋白質聚集及/或相關細胞毒性。
g . J 域 及 TDP - 43 結合域之佈置 本文所描述之融合蛋白可以多種方法佈置。在一個實施例中，TDP-43結合域附接至J域之C端側。在另一實施例中，TDP-43結合域附接至J域之N端側。任一組態中之TDP-43結合域及J域可視情況經由如上文所描述之連接子分離。
在一些實施例中，J域可附接至複數個TDP-43結合域，例如兩個TDP-43結合域、三個TDP-43結合域、四個TDP-43結合域或更多。TDP-43結合域可附接至J域之N端側。替代地，TDP-43結合域可附接至J域之C端側。在再一實施例中，TDP-43結合域可附接於J域之N端及C端側上。複數個TDP-43結合域中之每一者可為相同TDP-43結合域。在另一實施例中，融合蛋白中複數個TDP-43結合域中之每一者可為不同TDP-43結合域(亦即，不同序列)。
在一些實施例中，融合蛋白可包含選自以下群之結構： a.      DNAJ-X-T， b.      DNAJ-X-T-X-T， c.      DNAJ-X-T-X-T-X-T， d.      T-X-DNAJ， e.      T-X-T-X-DNAJ， f.       T-X-T-X-T-X-DNAJ， g.      T-X-DNAJ-X-T， h.      T-X-DNAJ-X-T-X-T， i.       TDNAJ-X-TTTTTDNAJ-X-T， j.       T-X-T-X-DNAJ-X-TT， k.      TTDNAJ-X-T-X-TTTTTDNAJ-X-T， l.       T-X-T-X-DNAJ-X-T-X-T-X-T， m.     T-X-T-X-T-X-DNAJ-X-T， n.      T-X-T-X-T-X-DNAJ-X-T-X-T， o.      T-X-T-X-T-X-DNAJ-X-T-X-T-X-T， p.      DnaJ-X-DnaJ-X-T-X-T， q.      T-X-DnaJ-X-DnaJ， r.       T-X-T-X-DnaJ-X-DnaJ，及 s.       T-X-TDnaJ-X-TDnaJ-X-TTTT 其中， T為TDP-43結合域， DNAJ為J蛋白之J域，且 X為視情況選用之連接子。
在一個實施例中，融合蛋白包含選自由以下組成之群的J域：SEQ ID NO: 5、6、10、24及31。在一個特定實施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 5之J域。
在另一實施例中，TDP-43結合域選自由SEQ ID NO:51-55組成之群。在一個特定實施例中，TDP-43結合域選自由SEQ ID NO:51-53組成之群。
在再一實施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 5之J域及SEQ ID NO: 51之TDP-43結合域。在另一實施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 5之J域及SEQ ID NO: 53之TDP-43域之至少兩個複本。
包含J域及TDP-43結合域之融合蛋白構築體之非限制性實例示意性地描繪於圖2中，且亦展示於以下表6中。在另一實施例中，特定融合蛋白構築體選自由SEQ ID NO: 80-85及89-96組成之群。表 6 ： 融合蛋白構築體及對照構築體
構築體編號 SEQ ID NO: 構築體名稱 長度 序列
1 78 僅J域 75 MGKDYYQTLGLARGASDEEIKRAYRRQALRYHPDKNKEPGAEEKFKEIAEAYDVLSDPRKREIFDRYGEEGLKGS
2 79 scFv(3B12A) 253 MGTGSEFDIAAAEVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRTEQGLEWIGRIDPEDGETKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTIIYYYGSRYVDYWGQGTTLTVSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSSYLHWYQQKPGFSPKLLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSSIPLTFGSGTKLEI
3 80 JB1-scFv(3B12A) 341 MGKDYYQTLGLARGASDEEIKRAYRRQALRYHPDKNKEPGAEEKFKEIAEAYDVLSDPRKREIFDRYGEEGLKGSDIGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAAAEVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRTEQGLEWIGRIDPEDGETKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTIIYYYGSRYVDYWGQGTTLTVSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSSYLHWYQQKPGFSPKLLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSSIPLTFGSGTKLEI
4 81 JB1(P33Q)-scFv(3B12A) 341 MGKDYYQTLGLARGASDEEIKRAYRRQALRYHQDKNKEPGAEEKFKEIAEAYDVLSDPRKREIFDRYGEEGLKGSDIGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAAAEVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRTEQGLEWIGRIDPEDGETKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTIIYYYGSRYVDYWGQGTTLTVSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSSYLHWYQQKPGFSPKLLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSSIPLTFGSGTKLEI
5 82 scFv(3B12A)-JB1 323 MGTEVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRTEQGLEWIGRIDPEDGETKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTIIYYYGSRYVDYWGQGTTLTVSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSSYLHWYQQKPGFSPKLLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSSIPLTFGSGTKLEIGSEFMGKDYYQTLGLARGASDEEIKRAYRRQALRYHPDKNKEPGAEEKFKEIAEAYDVLSDPRKREIFDRYGEEGLKGS
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II . 編碼融合蛋白構築體之核酸 根據本發明之另一態樣，本發明提供經分離之核酸，其包含選自以下之聚核苷酸序列：(a)編碼前述實施例中任一者之融合蛋白之聚核苷酸，或(b) (a)之聚核苷酸之互補序列。本發明提供編碼包含J域及TDP-43結合域之融合蛋白之經分離之核酸及與編碼融合蛋白之此類核酸分子(包括其同源變體)互補之序列。在另一態樣中，本發明涵蓋用以產生編碼本文所揭示之融合蛋白之核酸及與編碼融合蛋白之核酸分子(包括其同源變體)互補之序列的方法。根據本發明之此態樣之核酸可為前信使RNA (pre-mRNA)、信使RNA (mRNA)、RNA、基因體DNA (gDNA)、PCR擴增DNA、互補DNA (cDNA)、合成DNA或重組DNA。
在又一態樣中，揭示一種產生融合蛋白之方法，其包含(a)合成及/或組裝編碼融合蛋白之核苷酸，(b)將編碼基因併入至適於宿主細胞之表現載體中，(c)用表現載體轉型適當的宿主細胞，及(d)在使得或准許融合蛋白在經轉型之宿主細胞中表現之條件下培養宿主細胞，藉此產生生物活性融合蛋白，其藉由此項技術中已知之標準蛋白質純化方法回收為經分離之融合蛋白。分子生物學中之標準重組技術用於製造本發明之聚核苷酸及表現載體。
根據本發明，編碼本文所揭示之融合蛋白之核酸序列(或其互補序列)用於產生引導融合蛋白在適當的宿主細胞中表現之重組DNA分子。若干選殖策略適合於進行本發明，其中之許多用於產生包含編碼本發明之融合蛋白之基因或其互補序列的構築體。在一些實施例中，選殖策略用於產生編碼本發明之融合蛋白之基因，或其互補序列。
在某些實施例中，編碼一或多種融合蛋白之核酸為RNA分子，且可為前信使RNA (pre-mRNA)、信使RNA (mRNA)、RNA、基因體DNA (gDNA)、PCR擴增DNA、互補DNA (cDNA)、合成DNA或重組DNA。
在各種實施例中，核酸為引入至細胞中以便短暫表現所需多肽之mRNA。如本文所用，「短暫 」係指表現非整合轉殖基因幾小時、幾天或幾週之時段，其中該表現時段小於當聚核苷酸整合至基因體中或含於細胞中之穩定質體複製子內時的表現時段。
在特定實施例中，編碼多肽之mRNA為活體外轉錄mRNA。如本文所用，「活體外轉錄 RNA 」係指已活體外合成之RNA，較佳mRNA。一般而言，活體外轉錄RNA係自活體外轉錄載體產生。活體外轉錄載體包含用於產生活體外轉錄RNA之模板。
在特定實施例中，mRNA可進一步包含5'帽或經修飾之5'帽及/或聚(A)序列。如本文所用，5'帽(亦稱為RNA帽、RNA 7-甲基鳥苷帽或RNA m7G帽)為經修飾鳥嘌呤核苷酸，其在轉錄開始後不久即添加至真核信使RNA的「前部 」或5'端。5'帽包含連接至第一轉錄核苷酸且藉由核糖體識別且受保護免於核糖核酸酶影響之端基。封端部分可經修飾以調節mRNA之功能，諸如其轉譯穩定性或效率。在一特定實施例中，mRNA包含約50與約5000個之間的腺嘌呤之聚(A)序列。在一個實施例中，mRNA包含約100與約1000個鹼基之間，約200與約500個鹼基之間，或約300與約400個鹼基之間的聚(A)序列。在一個實施例中，mRNA包含約65個鹼基、約100個鹼基、約200個鹼基、約300個鹼基、約400個鹼基、約500個鹼基、約600個鹼基、約700個鹼基、約800個鹼基、約900個鹼基或約1000個或更多個鹼基之聚(A)序列。聚(A)序列可經化學修飾或酶修飾以調節mRNA功能，諸如定位、轉譯之穩定性或效率。
如本文所用，術語「聚核苷酸變體 」及「變體 」及其類似物係指呈現與參考聚核苷酸序列實質上序列一致性之聚核苷酸或在下文所定義之嚴格條件下與參考序列雜交之聚核苷酸。此等術語包括相比於參考聚核苷酸一或多個核苷酸已添加或缺失或替換為不同核苷酸之聚核苷酸。在此方面，此項技術中充分理解，可對參考聚核苷酸進行某些改變，包括突變、添加、缺失及取代，藉此經改變之聚核苷酸保留參考聚核苷酸之生物功能或活性。
在某些實施例中，核酸序列在核酸卡匣內包含編碼相關基因(例如包含J域及聚麩醯胺酸結合域之融合蛋白)之核苷酸序列。如本文所用，術語「核酸卡匣」或「表現卡匣」係指可表現RNA及隨後多肽之載體內之基因序列。在一個實施例中，核酸卡匣含有相關基因，例如相關聚核苷酸。在另一實施例中，核酸卡匣含有一或多種表現控制序列，例如啟動子、增強子、聚(A)序列及相關基因，例如相關聚核苷酸。載體可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多個核酸卡匣。核酸卡匣在位置上及順序上定向在載體內以使得卡匣中之核酸可經轉錄成RNA，且必要時，轉譯成蛋白質或多肽，經受經轉型細胞中之活性所需要之適當的轉譯後修飾，且藉由靶向至適當的細胞內隔室或分泌至細胞外隔室中而易位至生物活性適當的隔室。較佳地，卡匣具有適用於預備插入載體中之3'及5'端，例如其在各端具有限制性核酸內切酶位點。卡匣可移除且插入質體或病毒載體中作為單一單元。
適用於特定實施例中之說明性普遍存在的表現控制序列包括但不限於巨細胞病毒(CMV)即刻早期啟動子、病毒猿猴病毒40 (SV40) (例如早期或晚期)、莫洛尼鼠類白血病病毒(Moloney murine leukemia virus；MoMLV) LTR啟動子、勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus；RSV) LTR、單純疱疹病毒(HSV) (胸苷激酶)啟動子、來自牛痘病毒之H5、P7.5及Pl l啟動子、延長因子1-α (EFla)啟動子、早期生長反應1 (EGR1)、鐵蛋白H (FerH)、鐵蛋白L (FerL)、甘油醛3-磷酸酯去氫酶(GAPDH)、真核轉譯起始因子4A1 (EIF4A1)、熱休克70 kDa蛋白5 (HSPA5)、熱休克蛋白90 kDa β，成員1 (HSP90B1)、熱休克蛋白70 kDa (HSP70)、ß-驅動蛋白(b-KIN)、人類ROSA 26基因座(Irions等人，Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482 (2007))、泛素C啟動子(UBC)、磷酸甘油酸酯激酶-1 (PGK)啟動子、巨細胞病毒增強子/雞ß-肌動蛋白(CAG)啟動子(Okabe等人(1997)FEBS let . 407: 313-9)、b-肌動蛋白啟動子及骨髓增生肉瘤病毒增強子、負控制區缺失、dl587rev引子結合位點取代之(MND) U3啟動子(Haas等人，Journal of Virology. 2003;77(l7): 9439-9450)。
在一個實施例中，至少一個元件可與本文所描述之聚核苷酸一起使用以增強轉殖基因靶向特異性及表現(參見例如Powell等人(2015)Discovery Medicine 19(102):49-57，其內容以全文引用之方式併入本文中)，諸如啟動子。促進大部分組織中之表現的啟動子包括但不限於人類延長因子1α-次單元(EFla)、即刻早期巨細胞病毒(CMV)、雞β-肌動蛋白(CBA)及其衍生物CAG、β葡萄醣醛酸酶(GUSB)或泛素C (UBC)。組織特異性表現元件可用於將表現限於某些細胞類型，諸如但不限於可用於將表現限於神經元、星形細胞或寡樹突神經膠質細胞之神經系統啟動子。神經元之組織特異性表現元件之非限制性實例包括神經元特異性烯醇酶(NSE)、血小板衍生生長因子(PDGF)、血小板衍生生長因子B鏈(PDGF-β)、突觸蛋白(Syn)、甲基-CpG結合蛋白2 (MeCP2)、CaMKII、mGluR2、NFL、NFH、ηβ2、PPE、Enk及EAAT2啟動子。星形膠質細胞之組織特異性表現元件之非限制性實例包括膠質原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein；GFAP)及EAAT2啟動子。寡樹突神經膠質細胞之組織特異性表現元件之非限制性實例包括髓鞘鹼性蛋白(myelin basic protein；MBP)啟動子。以全文引用之方式併入本文中之Yu等人(2011)Molecular Pain , 7:63使用慢病毒載體評估大鼠DRG細胞及原代DRG細胞中之CAG、EFIa、PGK及UBC啟動子下之eGFP表現，且發現UBC展示比其他3個啟動子更弱的表現且所有啟動子可見僅10-12%神經膠質表現。Soderblom等人(E. Neuro 2015，其以全文引用之方式併入本文中)，在注射於運動皮質中之後具有CMV及UBC啟動子之AAV8及具有CMV啟動子之AAV2中之eGFP表現。含有UBC或EFIa啟動子之質體之鼻內投與展示大於在CMV啟動子情況下之表現的持續呼吸道表現(參見例如Gill等人，(2001)Gene Therapy , 第8卷, 1539-1546；其以全文引用之方式併入本文中)。以全文引用之方式併入本文中之Husain等人(2009)Gene Therapy 評估具有hGUSB啟動子、HSV-1LAT啟動子及NSE啟動子之HβH構築體且發現HβH構築體相比於NSE在小鼠大腦中展示更弱的表現。Passini及Wolfe (J. Virol. 2001, 12382-12392，其以全文引用之方式併入本文中)評估HβH載體在心室內注射至新生小鼠之後的長期作用，且發現存在至少1年之持續表現。以全文引用之方式併入本文中之Xu等人(2001)Gene Therapy , 8, 1323-1332發現，相比於CMV-lacZ、CMV-luc、EF、GFAP、hENK、nAChR、PPE、PPE + wpre、NSE (0.3 kb)、NSE (1.8 kb)及NSE (1.8 kb + wpre)，使用NF-L及NF-H啟動子時在所有腦區中之表現較低。Xu等人發現，啟動子活性按降序為NSE (1.8 kb)、EF、NSE (0.3 kb)、GFAP、CMV、hENK、PPE、NFL及NFH。NFL為650個核苷酸之啟動子且NFH為920個核苷酸之啟動子，此兩種啟動子在肝中均不存在，但NFH在感覺性本體感受性神經元、腦及脊髓中為豐富的且NFH存在於心臟中。Scn8a為在整個DRG、脊髓及大腦中表現之470個核苷酸之啟動子，其中在海馬神經元及小腦浦金埃氏細胞(Purkinje cell)、皮質、視丘及下視丘中可見特別高之表現(參見例如Drews等人2007及Raymond等人2004；其以全文引用之方式併入本文中)。
III . 包含編碼融合蛋白之核酸之載體 亦提供包含根據本發明之核酸之載體。此類載體較佳包含額外核酸序列，諸如編碼磷酸酶之核酸序列之轉錄/轉譯所必要的元件(例如啟動子及/或終止子序列)。該等載體亦可包含編碼選擇標記物(例如抗生素)以選擇或維持經該載體轉型之宿主細胞的核酸序列。術語「載體 」在本文中用於指能夠轉移或傳送另一核酸分子的核酸分子。經轉移之核酸一般連接至載體核酸分子，例如插入載體核酸分子中。載體可包括引導細胞中之自主複製之序列，或可包括足以允許整合至宿主細胞DNA中之序列。在特定實施例中，非病毒載體用於將本文所考慮之一或多種聚核苷酸遞送至受影響細胞(例如神經元細胞)。在一個實施例中，載體為編碼包含J域及TDP-43結合域之融合蛋白的活體外合成或合成製備之mRNA。非病毒載體之說明性實例包括但不限於mRNA、質體(例如DNA質體或RNA質體)、轉位子、黏質體及細菌人工染色體。
載體之說明性實例包括但不限於質體、自主複製序列及轉位元件，例如piggyBac、Sleeping Beauty、Mosl、Tcl/mariner、Tol2、mini-Tol2、Tc3、MuA、Himar I、Frog Prince及其衍生物。載體之額外說明性實例包括但不限於質體；噬菌粒；黏質體；人工染色體，諸如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或Pl衍生之人工染色體(PAC)；噬菌體，諸如λ噬菌體或M13噬菌體；及動物病毒。適用作載體之病毒之說明性實例包括但不限於反轉錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒(例如單純疱疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳突狀瘤病毒及乳多泡病毒(例如SV40)。表現載體之說明性實例包括但不限於用於在哺乳動物細胞中表現之pClneo載體(Promega)；用於哺乳動物細胞中慢病毒介導之基因轉移及表現之pLenti4/V 5-DEST™、pLenti6/V 5-DEST™及pLenti6.2/V 5-GW/lacZ (Invitrogen)。在特定實施例中，本文所揭示之多肽之編碼序列可接合至用於在哺乳動物細胞中表現多肽之此類表現載體。
在特定實施例中，載體為游離型載體或維持在染色體外之載體。如本文所用，術語「游離型 」係指能夠複製，而不整合至宿主之染色體DNA中之載體，且不自分裂宿主細胞逐漸損失亦意謂該載體染色體外或游離複製。
載體可包含廣泛多種位點特異性重組酶中之任一者之一或多個重組位點。應理解，用於位點特異性重組酶之目標位點為除了整合載體(例如反轉錄病毒載體或慢病毒載體)所需要之任何位點之外的位點。如本文所用，術語「重組序列 」、「重組位點 」或「位點特異性重組位點 」係指重組酶識別及結合之特定核酸序列。
舉例而言，Cre重組酶之一個重組位點為loxP，其為34個鹼基對之序列，包含側接8個鹼基對之核心序列的兩個13個鹼基對之反向重複序列(充當重組酶結合位點) (參見Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5:521-527 (1994)之圖1)。FLP重組酶之適合的識別位點包括但不限於：FRT (McLeod等人，1996)、FI、F2、F3 (Schlake及Bode, 1994)、FyFs (Schlake及Bode, 1994)、FRT(LE) (Senecoff等人，1988)、FRT(RE) (Senecoff等人，1988)。
識別序列之其他實例為藉由重組酶l整合酶(例如phi-c3l)所識別之attB、attP、attL及attR序列。(pC3l SSR僅介導異型位點attB (34 bp長)與attP (39 bp長)之間的重組(Groth等人，2000)。attB及attP (分別針對細菌及噬菌體基因體上之噬菌體整合酶之附接位點命名)均含有可能由ϕ031均二聚體結合之不完美反向重複序列(Groth等人，2000)。產物位點attL及attR對於另外tpQA 1介導之重組為有效惰性的(Belteki等人，2003)，使得反應不可逆。對於催化插入，已發現，帶有attB之DNA插入基因體attP位點比attP位點插入基因體attB位點更容易(Thyagarajan等人，2001；Belteki等人，2003)。因此，藉由同源重組之典型的策略位置，帶有attP之「對接位點」進入所定義之基因座，其隨後與帶有attB之引入序列搭檔以便插入。
如本文所用，「內部核糖體進入位點 」或「IRES 」係指促進直接內部核糖體進入順反子(蛋白質編碼區)之起始密碼子(諸如ATG)的元件，藉此引起基因不依賴於帽轉譯。參見例如Jackson等人，1990. Trends Biochem Sci 15(12):477-83)及Jackson及Kaminski. 1995. RNA 1(10):985-1000。在特定實施例中，載體包括編碼一或多個多肽之一或多個相關聚核苷酸。在特定實施例中，為了實現複數個多肽中之每一者之有效轉譯，聚核苷酸序列可由一或多個IRES序列或編碼自裂解多肽之聚核苷酸序列隔開。在一個實施例中，本文所考慮之聚核苷酸中所使用之IRES為EMCV IRES。
如本文所用，術語「Kozak 序列 」係指極大地促進mRNA最初結合至核糖體之小次單元且提高轉譯之短核苷酸序列。(Kozak, 1986. Cell. 44(2):283-92，及Kozak, 1987. Nucleic Acids Res. 15(20):8125-48)。在特定實施例中，載體包含具有共有Kozak序列且編碼包含J域及TDP-43結合域之融合蛋白的聚核苷酸。引導異源核酸轉錄物之有效封端及聚腺苷酸化之元件提高異源基因表現。轉錄終止信號一般可見於聚腺苷酸化信號下游。在特定實施例中，載體包含位於編碼待表現多肽之聚核苷酸3'處之聚腺苷酸化序列。
適用於本文所考慮之特定實施例之病毒載體系統之說明性實例包括但不限於腺相關病毒(AAV)、反轉錄病毒、單純疱疹病毒、腺病毒及牛痘病毒載體。
在各種實施例中，編碼包含J域及聚麩醯胺酸結合域之融合蛋白之一或多個聚核苷酸藉由用包含一或多個聚核苷酸之重組腺相關病毒(rAAV)轉導細胞來引入至細胞(例如神經元細胞)中。AAV為小型(約26 nm)複製缺陷型、主要游離型、非包膜病毒。AAV可感染分裂及非分裂細胞且可將其基因體併入至宿主細胞之基因體中。重組AAV (rAAV)在最低限度下通常由轉殖基因及其調節序列以及5'及3' AAV反向末端重複序列(ITR)構成。ITR序列為約145 bp長。在特定實施例中，rAAV包含自AAV1、AAV2 (描述於例如US6962815B2中，其以全文引用之方式併入本文中)、AAV3、AAV4、AAV5 (描述於例如US7479554B2中，其以全文引用之方式併入本文中)、AAV6、AAV7、AAV8(描述於例如US7282199B2中，其以全文引用之方式併入本文中)、AAV9 (描述於例如US9737618B2中，其以全文引用之方式併入本文中)、AAV rh10 (描述於例如US9790472B2中，其以全文引用之方式併入本文中)或AAV 10分離之ITR及衣殼序列。在一個實施例中，本發明之載體經囊封至選自由AAV2、AAV5、AAV8、AAV9及AAV rh10組成之群的衣殼中。在一個實施例中，載體經囊封於AAV2中。在一個實施例中，載體經囊封於AAV5中。在一個實施例中，載體經囊封於AAV8中。在一個實施例中，載體經囊封於AAV9中。在再一個實施例中，載體經囊封於AAV rh10中。
在一些實施例中，ITR序列使用之嵌合rAAV自一個AAV血清型分離且衣殼序列自不同AAV血清型分離。舉例而言，具有衍生自AAV2之ITR序列及衍生自AAV6之衣殼序列之rAAV稱為AAV2/AAV6。在特定實施例中，rAAV載體可包含來自AAV2之ITR及來自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10中之任一者之衣殼蛋白。在一較佳實施例中，rAAV包含衍生自AAV2之ITR序列及衍生自AAV6之衣殼序列。在一較佳實施例中，rAAV包含衍生自AAV2之ITR序列及衍生自AAV2之衣殼序列。
在一些實施例中，工程改造及選擇方法可應用於AAV衣殼以使其更可能轉導相關細胞。
建構rAAV載體、其產生及純化已揭示於例如美國專利第9,169,494號、第9,169,492號、第9,012,224號、第8,889,641號、第8,809,058號及第8,784,799號中，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中。
IV . 遞送 在特定實施例中，編碼包含J域及TDP-43結合域之融合蛋白的一或多個聚核苷酸藉由非病毒或病毒載體引入至細胞中。特定實施例中所考慮之聚核苷酸之非病毒遞送之說明性方法包括但不限於：電穿孔、聲致穿孔、脂質體轉染、顯微注射、基因槍(biolistic)、病毒顆粒、脂質體、免疫微脂囊、奈米粒子、聚陽離子或脂質核酸結合物、裸DNA、人工病毒粒子、DEAE-聚葡萄糖介導之轉移、基因槍(gene gun)及熱休克。
適用於特定實施例中所考慮之特定實施例之聚核苷酸遞送系統之說明性實例包括但不限於Amaxa Biosystems、Maxcyte, Inc.、BTX Molecular Delivery Systems及Copernicus Therapeutics Inc.所提供之彼等。脂質體轉染試劑為市售的(例如Transfectam™及Lipofectin™)。適用於聚核苷酸之有效受體識別脂質體轉染之陽離子及中性脂質已描述於文獻中。參見例如Liu等人，(2003) Gene Therapy. 10: 180-187；及Balazs等人，(20W) Journal of Drug Delivery. 2011 :1-12。特定實施例中亦考慮抗體靶向、細菌衍生、非生物奈米細胞基遞送。
包含特定實施例中所考慮之聚核苷酸之病毒載體可藉由向個體患者投與活體內遞送，通常藉由全身性投與(例如靜脈內、腹膜內、肌肉內、真皮下或顱內輸注)、藉由鞘內注射、腦室內注射或局部施用，如下文所描述。替代地，載體可離體遞送至細胞，諸如自個體患者移出之細胞(例如動員周邊血液、淋巴球、骨髓抽出物、組織切片等)或通用供體造血幹細胞，繼而將細胞再移植入患者中。
在一個實施例中，包含編碼本文所揭示之融合蛋白之聚核苷酸的病毒載體直接投與至生物體以便活體內細胞轉導。
經適當封裝及調配之病毒載體可經由鞘內遞送而遞送至中樞神經系統(CNS)中。舉例而言，腺相關病毒載體可使用美國序號15/771,481中所描述之方法遞送，其以全文引用之方式併入本文中。
替代地，可投與裸DNA。投與係藉由常用於引入分子以最終與血液或組織細胞接觸之途徑中之任一者來進行，該等途徑包括但不限於注射、輸注、局部施用及電穿孔。投與此類核酸之適合方法為熟習此項技術者可用及熟知的，且儘管超過一種途徑可用於投與特定組合物，但特定途徑可通常提供比另一途徑更直接且更有效的反應。
在各種實施例中，藉由用包含一或多個聚核苷酸之反轉錄病毒(例如慢病毒)轉導細胞來將編碼本文所揭示之融合蛋白之一或多個聚核苷酸引入細胞，例如神經元細胞或神經元幹細胞中。如本文所用，術語「反轉錄病毒 」係指將其基因體RNA反轉錄成線性雙股DNA複本且隨後將其基因體DNA共價整合至宿主基因體中之RNA病毒。適用於特定實施例中之說明性反轉錄病毒包括但不限於莫洛尼鼠類白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠類肉瘤病毒(MoMSV)、哈維(Harvey)鼠類肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠類乳房腫瘤病毒(MuMTV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、貓類白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、弗蘭德(Friend)鼠類白血病病毒、鼠類幹細胞病毒(MSCV)及勞氏肉瘤病毒(RSV)及慢病毒。如本文所用，術語「慢病毒」係指複雜反轉錄病毒之群(或屬)。說明性慢病毒包括但不限於：HIV (人類免疫缺陷病毒；包括第1型HIV及第2型HIV)；比斯奈病-慢性進行性肺病(visna-maedi)病毒(VMV)病毒；山羊關節炎-腦炎病毒(CAEV)；馬類感染性貧血病毒(EIAV)；貓類免疫缺陷病毒(FIV)；牛類免疫缺陷病毒(BIV)；及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一個實施例中，基於HIV之載體骨架(亦即，HIV順式作用序列元件)為較佳的。
慢病毒載體較佳含有作為修改LTR之結果的若干安全性增強。「自失活 」(SIN)載體係指複製缺陷型載體，例如其中右側(3') LTR增強子-啟動子區(已知為U3區)已經修飾(例如藉由缺失或取代)以預防超出第一輪病毒複製之病毒轉錄。藉由用異源啟動子置換5' LTR之U3區以在產生病毒粒子期間驅使病毒基因體之轉錄來提供額外安全性增強。可使用之異源啟動子之實例包括例如病毒猿猴病毒40 (SV40) (例如早期或晚期)、巨細胞病毒(CMV) (例如即刻早期)、莫洛尼鼠類白血病病毒(MoMLV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)及單純疱疹病毒(HSV) (胸苷激酶)啟動子。在某些實施例中，根據已知方法產生慢病毒載體。參見例如Kutner等人，BMC Biotechnol. 2009; 9:10. Doi: 10.1186/1472-6750-9-10；Kutner等人，Nat. Protoc. 2009; 4(4):495-505. Doi: l0.l038/nprot.2009.22。
根據本文所考慮之某些特定實施例，大部分或所有病毒載體骨架序列衍生自慢病毒，例如HIV-l。然而，應理解，可使用諸多不同來源之反轉錄病毒及/或慢病毒序列，或可容納某些慢病毒序列中經組合且眾多的取代及改變而不削弱轉移載體進行本文所描述之功能的能力。此外，多種慢病毒載體為此項技術中已知的，參見Naldini等人，(l996a、l996b及1998)；Zufferey等人，(1997)；Dull等人，1998；美國專利第6,013,516號；及第5,994,136號，其中許多可經調適以產生本文所考慮之病毒載體或轉移質體。
在各種實施例中，藉由用包含一或多個聚核苷酸之腺病毒轉導細胞來將編碼本文所揭示之融合蛋白之一或多個聚核苷酸引入目標細胞中。基於腺病毒之載體在許多細胞類型中能夠具極高轉導效率，且並不需要細胞分裂。在此類載體下，已獲得高效價及高表現量。可在相對簡單系統中大量產生此載體。大部分腺病毒載體經工程改造以使得轉殖基因置換Ad Ela、Elb及/或E3基因；隨後複製缺陷型載體在反式提供缺失之基因功能的人類293細胞中傳播。Ad載體可活體內轉導多個類型之組織，包括非分裂經分化細胞，諸如肝、腎及肌肉中所見之彼等細胞。習知Ad載體具有大攜載容量。
當前複製缺陷型腺病毒載體之產生及傳播可利用獨特的輔助細胞株(稱為293)，其藉由Ad5 DNA片段自人類胚胎腎細胞轉型且組成性表現El蛋白(Graham等人，1977)。由於E3區並非腺病毒基因體所必需(Jones及Shenk, 1978)，因此當前腺病毒載體藉助於293細胞在El、D3或兩個區中攜帶外源DNA (Graham及Prevec, 1991)。腺病毒載體已用於真核基因表現(Levrero等人，1991；Gomez-Foix等人，1992)及疫苗研發(Grunhaus及Horwitz, 1992；Graham及Prevec, 1992)。將重組腺病毒投與至不同組織之研究包括氣管滴注(Rosenfeld等人，1991；Rosenfeld等人，1992)、肌肉注射(Ragot等人，1993)、周邊靜脈內注射(Herz及Gerard, 1993)及立體定位接種至大腦中(Le Gal La Salle等人，1993)。在臨床試驗中使用Ad載體之實例涉及利用肌肉內注射之抗腫瘤免疫接種之聚核苷酸療法(Sterman等人，Hum. Gene Ther. 7: 1083-9 (1998))。
在各種實施例中，藉由用包含一或多個聚核苷酸之單純疱疹病毒(例如HSV-l、HSV-2)轉導細胞來將編碼本發明之融合蛋白之一或多個聚核苷酸引入個體之目標細胞中。
成熟HSV病毒粒子由包膜二十面體衣殼組成，該衣殼具有由152 kb線性雙股DNA分子組成之病毒基因體。在一個實施例中，基於HSV之病毒載體缺乏一或多個必需或非必需HSV基因。在一個實施例中，基於HSV之病毒載體為複製缺陷型。大部分複製缺陷型HSV載體含有缺失以移除一或多個中間早期、早期或晚期HSV基因，從而阻止複製。舉例而言，HSV載體可缺乏選自由以下組成之群的即刻早期基因：ICP4、ICP22、ICP27、ICP47及其組合。HSV載體之優勢為其進入可引起長期DNA表現之潛伏期的能力及其可容納高達25 kb之外源DNA插入物的大病毒DNA基因體。基於HSV之載體描述於例如美國專利第5,837,532號、第5,846,782號、第5,804,413號及國際專利申請案WO 91/02788、WO 96/04394、WO 98/15637及WO 99/06583中，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中。
V . 表現融合蛋白之細胞 在又一態樣中，本發明提供表現本文所描述之融合蛋白之細胞。細胞可經編碼如上文所描述之融合蛋白之載體轉染。在一個實施例中，細胞為原核細胞。在另一實施例中，細胞為真核細胞。在再一實施例中，細胞為哺乳動物細胞。在一特定實施例中，細胞為人類細胞。在另一實施例中，細胞為衍生自罹患TDP-43介導之病症(包括但不限於ALS、FTD及阿茲海默氏症)或處於罹患該病症風險下之患者的人類細胞。細胞可為神經元細胞或肌肉細胞。
表現融合蛋白之細胞可適用於產生融合蛋白。在此實施例中，細胞經過度表現融合蛋白之載體轉染。融合蛋白可視情況含有抗原決定基，例如如上文所描述之人類Fc域或FLAG抗原決定基，其將促進純化(分別使用蛋白A或抗FLAG抗體管柱)。抗原決定基可經由連接子或蛋白酶受質序列連接至融合蛋白之其餘部分，以使得在純化期間或之後可自融合蛋白移除抗原決定基。
表現融合蛋白之細胞亦可適用於治療情況。在一個實施例中，自需要療法之患者(例如罹患TDP-43病症或處於罹患該病症風險下之患者)收集細胞。在一個實施例中，細胞為神經元細胞。收集之細胞隨後經表現融合蛋白之載體轉染。經轉染細胞可隨後經處理以增濃或選擇經轉染細胞。經轉染細胞亦可經處理以分化成不同類型之細胞，例如神經元細胞。在處理之後，可向患者投與經轉染細胞。在一個實施例中，藉由鞘內注射、顱內注射或腦室內注射而定向注射至中樞神經系統中來投與細胞。
在替代性實施例中，可使用表現融合蛋白之分泌形式之細胞。舉例而言，融合蛋白構築體可經設計而在N端具有信號序列。代表性信號序列展示於以下表7中。表 7 ：代表性信號序列
SEQ ID NO: 序列
98 MGVKVLFALICIAVAEA
99 MAPVQLLGLLVLFLPAMRC
100 MAVLGLLFCLVTFPSCVLS
因此，在一個實施例中，融合蛋白包含信號序列及融合蛋白，其中信號序列選自由SEQ ID NO: 98-100組成之群，且融合蛋白包含J域及TDP-43結合域。在一個實施例中，信號序列選自由SEQ ID NO: 98-100組成之群，且融合蛋白選自由SEQ ID NO: 80-85、89-90及92-96組成之群。在另一實施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 98之信號序列，及選自由SEQ ID NO: 80-85、89-90及92-96組成之群的融合蛋白。在另一實施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 99之信號序列，及選自由SEQ ID NO: 80-85、89-90及92-96組成之群的融合蛋白。在另一實施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 100之信號序列，及選自由SEQ ID NO: 80-85、89-90及92-96組成之群的融合蛋白。可向個體，例如人類個體(例如患有TDP-43病症或處於罹患該病症風險下之患者)投與表現具有信號序列之融合蛋白構築體之細胞。融合蛋白自細胞分泌，其幫助減少TDP-43蛋白聚集及/或相關細胞毒性。
如上文所描述，在某些實施例中，融合蛋白可進一步包含細胞穿透肽。表現包含信號序列及細胞穿透肽之融合蛋白之細胞將能夠分泌不含信號序列之融合蛋白。亦包含細胞穿透肽之分泌融合蛋白將隨後能夠進入鄰近細胞，且具有減少彼等細胞中藉由TDP-43蛋白介導之聚集及/或細胞毒性的可能性。
VI . 使用方法 在另一態樣中，本發明提供一種用於在病症及/或TDP-43病症、由TDP-43聚集介導之病症或病狀中達成有益效果的方法。TDP-43病症選自由以下組成之群：肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、額顳葉型失智症(FTD)、帕金森氏症、杭丁頓氏症、阿茲海默氏症、海馬硬化、路易氏體失智症及邊緣主導年齡相關TDP-43腦病。
在一些實施例中，本發明提供用於治療患有TDP-43疾病、病症或病狀之個體(諸如人類)之方法，其包含向該個體投與治療有效量或預防有效量之融合蛋白、編碼此類融合蛋白之核酸或編碼本文所描述之此類融合蛋白之病毒載體的步驟，其中該投與使得與TDP-43疾病、病症或病狀相關之一或多個生物化學或生理參數或臨床指標得到改良。
在其他實施例中，本發明提供一種減少細胞中TDP-43聚集的方法。細胞可為經培養之細胞或經分離之細胞。細胞亦可來自個體，例如人類個體。在一個實施例中，細胞在人類個體之中樞神經系統中。在另一實施例中，人類個體罹患TDP-43病症疾病或處於罹患該疾病風險下，該疾病包括但不限於肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、額顳葉型失智症(FTD)及阿茲海默氏症。在一個特定實施例中，TDP-43病症為肌萎縮性脊髓側索硬化症。
TDP-43蛋白之聚集可以多種方法偵測。在一個實例中，聚集TDP-43蛋白可基於溶解度而區別於含游離(亦即，可溶性) TDP-43之蛋白質，例如藉由使細胞溶解物通過選擇性過濾器來截留不溶性聚集體。非聚集蛋白通過此等過濾器，而聚集體將保留在過濾器上，聚集體可使用任何數目之試劑，包括針對TDP-43蛋白之抗體進行偵測。可將經如本文所描述之融合蛋白、表現融合蛋白之細胞或編碼融合蛋白之核酸、載體或病毒粒子處理之細胞樣品之溶解物中截留的聚集蛋白之量與來自未經處理或經對照處理之細胞之溶解物進行比較，其中當相比於對照樣品時經處理之樣品中聚集TDP-43蛋白之量減少指示融合蛋白或編碼融合蛋白之核酸、載體或病毒粒子之功效(參見例如Kim等人，(2014)Mol . Cell . Biol . , 34: 643-652，及實例1)。當相比於對照時，聚集TDP-43蛋白減少愈多指示效能愈高。亦可直接在細胞中，例如使用免疫螢光顯微法，用偵測TDP-43蛋白之標記試劑偵測TDP-43蛋白之聚集減少(參見例如Ding等人, (2015)Oncotarget , 6: 24178-24191；Chou等人, (2015)Hum . Mol . Genet . 24:5154-5173，及實例1)。在某些實施例中，當相比於對照時，TDP-43多肽含量減少愈多指示效能愈高。
因此，在一個實施例中，該方法包含使細胞與一定量之融合蛋白或編碼融合蛋白之核酸、載體或病毒粒子接觸，該量能有效地使TDP-43蛋白之聚集相比於未經處理之細胞或對照細胞時減少至少10%，例如至少15%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%。
如下文實例1中所展示，已發現包含J域及TDP-43結合域之融合蛋白的表現減少含TDP-43報導子構築體的總體含量。因此，在另一實施例中，該方法包含使細胞與一定量之融合蛋白、表現融合蛋白之細胞、編碼融合蛋白之核酸、載體或病毒粒子接觸，該量能有效地使TDP-43蛋白含量相比於未經處理之細胞或對照細胞時減少至少10%，例如至少15%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%。
VII . 醫藥組合物 本文所考慮之組合物可包含一或多個包含J域及TDP-43結合域之融合蛋白、編碼此類融合蛋白之聚核苷酸、包含該等聚核苷酸之載體、經基因修飾之細胞等，如本文所考慮。組合物包括但不限於醫藥組合物。「醫藥組合物 」係指在醫藥學上可接受或生理學上可接受之溶液中調配以便單獨或與一或多種其他療法模態組合向細胞或動物投與之組合物。將亦理解，必要時，組合物亦可與其他藥劑組合投與，該等藥劑諸如細胞介素、生長因子、激素、小分子、化學治療劑、前藥、藥物、抗體或其他不同醫藥活性劑。實際上對組合物中亦可包括之其他組分無限制，條件為額外藥劑不會不利地影響組合物遞送預期療法之能力。
片語「醫藥學上可接受 」在本文中用於指在合理醫學判斷範疇內，適用於與人類及動物之組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症、與合理益處/風險比相稱的彼等化合物、物質、組合物及/或劑型。
如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑 」、「稀釋劑 」或 「賦形劑 」包括但不限於任何佐劑、載劑、賦形劑、助滑劑、甜味劑、稀釋劑、防腐劑、染料/著色劑、增香劑、界面活性劑、濕潤劑、分散劑、懸浮劑、穩定劑、等張劑、溶劑、界面活性劑或乳化劑，其已經美國食品及藥物管理局(the United States Food and Drug Administration)審核可接受用於人類或家畜。例示性醫藥學上可接受之載劑包括但不限於糖，諸如乳糖、葡萄糖及蔗糖；澱粉，諸如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素及乙酸纖維素；黃蓍；麥芽；明膠；滑石；可可脂、蠟、動物及植物脂肪、石蠟、聚矽氧、膨潤土、矽酸、氧化鋅；油，諸如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油及大豆油；二醇，諸如丙二醇；多元醇，諸如丙三醇、山梨糖醇、甘露醇及聚乙二醇；酯，諸如油酸乙酯及月桂酸乙酯；瓊脂；緩衝劑，諸如氫氧化鎂及氫氧化鋁；褐藻酸；無熱原質水；等張生理鹽水；林格氏溶液(Ringer's solution)；乙醇；磷酸鹽緩衝溶液；及醫藥調配物中採用之任何其他可相容物質。
VIII . 劑量 本文所描述之組合物(例如包括融合蛋白構築體、核酸或基因療法病毒粒子之組合物)之劑量可視諸多因素而變化，諸如化合物之藥力學特性；投與模式；接受者之年齡、健康狀況及體重；症狀之性質及程度；治療之頻率，及並行治療(若存在)之類型；及待治療之動物中化合物之清除率。本文所描述之組合物可起初以可視需要調節之適合的劑量投與，視臨床反應而定。在一些態樣中，組合物之劑量為預防或治療有效量。
IX . 套組 考慮套組，其包括：(a)醫藥組合物，其包括融合蛋白構築體、編碼此類融合蛋白之核酸或包涵此類核酸之病毒粒子，其減少本文所描述之細胞或個體中TDP-43蛋白之聚集；及(b)藥品說明書，其具有進行本文所描述之任一方法之說明。在一些態樣中，套組包括(a)醫藥組合物，其包括減少本文所描述之細胞或個體中TDP-43蛋白之聚集的本文所描述之組合物；(b)額外治療劑；及(c)藥品說明書，其具有進行本文所描述之任一方法之說明。
實例 為了測試J域是否可尤其經工程改造以促進聚集蛋白質之恰當摺疊，吾等設計及測試經設計以靶向TDP-43蛋白之多個融合蛋白構築體。
實例 1 ： 融合蛋白設計 A.方法通用技術及材料 除非另外指明，否則本發明之實踐採用免疫學、生物化學、化學、分子生物學、微生物學、細胞生物學、基因體學及重組DNA之習知技術，該等技術在此項技術之技能內。參見Sambrook, J.等人, 「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001；「Current protocols in molecular biology」, F. M. Ausubel等人編,1987；系列「Methods in Enzymology」, Academic Press, San Diego,Calif.；「PCR 2: a practical approach」, M.J. MacPherson, B.D. Hames及G.R. Taylor編, Oxford University Press, 1995；「Antibodies, a laboratory manual」 Harlow, E.及Lane, D.編, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988；「Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics」, 第11版, McGraw-Hill, 2005；及Freshney, R.I., 「Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique」, 第4版, John Wiley & Sons, Somerset, N J, 2000，其內容以全文引用之方式併入本文中。HEK-293細胞(人類胚胎腎細胞)係購自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection) (Manassas，VA)。抗FLAG抗體係購自Thermo Fisher Scientific。兔抗GFP抗體係購自GenScripts (Piscataway, NJ)。為了便於純化及表徵，除SEQ ID NO: 80-85及89-96中提供之序列之外，此實例1中所使用之一些融合蛋白構築體在蛋白質C端或N端含有SEQ ID NO:68之FLAG抗原決定基，以及短連接子序列。
HEK293 細胞中 蛋白質 之 表現及偵測 編碼不同蛋白質構築體之表現載體質體用脂染胺3000轉染劑(Thermo Fisher Scientific)轉染至HEK293細胞中。使用免疫墨點分析來分析細胞溶解物之表現蛋白質。在分析之前，將培養基之樣品離心以移除殘渣。在含有2 mM PMSF及蛋白酶混合液(完全蛋白酶抑制劑混合液；Sigma)之裂解緩衝液(10 mM Tris-HCl，pH 8.0，150 mM NaCl，10 mM EDTA，2% SDS)中裂解細胞。在短暫音波處理之後，使用免疫墨點分析來分析樣品之表現蛋白質。對於免疫墨點分析，將樣品在SDS-樣品緩衝劑中煮沸且在聚丙烯醯胺電泳上運行。其後，將經分離之蛋白質條帶轉移至PVDF膜。
使用化學發光信號偵測表現蛋白質。簡言之，使墨點與能夠結合特定抗原決定基(例如GFP)之初級抗體反應。在沖洗掉未反應之初級抗體後，使二級、酶連接抗體(例如，HRP連接之抗IgG抗體)與結合至墨點之初級抗體分子反應。在沖洗之後，添加化學發光試劑，且在X射線軟片上獲取墨點中之所得化學發光信號。
螢光顯微法 在一些情況下，使用螢光顯微法活體內偵測TDP-43 (C端片段全長) GFP報導子構築體(下文所描述)之聚集。表現報導子構築體以及包含J域及TDP-43結合域之融合蛋白的經培養細胞用PBS洗滌且用4%多聚甲醛在PBS中固定5分鐘。在用PBS進行三次5分鐘洗滌之後，用DAPI染色細胞核DNA。對經轉染細胞中含有TDP-43 (GFP焦點)之細胞之百分比進行計數。
分級分離分析 將經轉染之HEK293細胞在補充有蛋白酶抑制劑混合液、2 mM PMSF、10 mM NaF及2 mM Na3VO4之RIPA緩衝液(50 mM Tris，pH 7.5，150 mM NaCl，0.1% NP-40，0.5%去氧膽酸鈉，0.1% SDS)中均質化。在短暫音波處理之後，藉由BCA分析套組(Pierce)量測蛋白質濃度。藉由在4℃下以16,000×g離心30分鐘，將等量蛋白質短暫離心，分級分離成可溶性級分(上清液)及不溶性級分(沈澱)。將不溶性級分進一步溶解於SDS裂解緩衝液(10 mM Tris，pH 8.0，150 mM NaCl，2% SDS)中。將可溶性級分及不溶性級分兩者在還原條件下施加至SDS-PAGE，接著用抗GFP抗體進行免疫墨點分析。
B.報導子構築體 吾人首先研究靶向TDP-43之本發明融合分子是否改善經培養細胞中TDP-43之聚集。為此目的，吾人產生基於GFP之報導子構築體GFP-TDP43及GFP-TDP43，其中GFP在C端融合至全長人類TDP-43蛋白或C端片段TDP-43，其已知形成細胞質聚集及細胞毒性(參見以下表8)。將HEK293細胞培養，且用編碼全長TDP43或含有C端207個胺基酸TDP-43 (人類TDP-43之胺基酸208-414)的TDP43之C端片段，作為GFP融合體[GFP-TDP43FL (SEQ ID NO: 101)或GFP-TDP43CTF (SEQ ID NO:102)]的質體轉染。吾人發現所表現之GFP-TDP43FL大部分定位於細胞之細胞核中(圖3，第1圖)，而GFP-TDP43CTF產生明顯細胞質包涵體(圖3，第5圖)，如先前報導(Zhang等人, (2009) Proc Natl Acad Sci U S A., 106(18):7607-12)。表 8 ： TDP - 43 報導子構築體
構築體名稱 SEQ ID NO: 長度 序列
GFP-TDP43FL 101 660 MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKEFDIAAAMSEYIRVTEDENDEPIEIPSEDDGTVLLSTVTAQFPGACGLRYRNPVSQCMRGVRLVEGILHAPDAGWGNLVYVVNYPKDNKRKMDETDASSAVKVKRAVQKTSDLIVLGLPWKTTEQDLKEYFSTFGEVLMVQVKKDLKTGHSKGFGFVRFTEYETQVKVMSQRHMIDGRWCDCKLPNSKQSQDEPLRSRKVFVGRCTEDMTEDELREFFSQYGDVMDVFIPKPFRAFAFVTFADDQIAQSLCGEDLIIKGISVHISNAEPKHNSNRQLERSGRFGGNPGGFGNQGGFGNSRGGGAGLGNNQGSNMGGGMNFGAFSINPAMMAAAQAALQSSWGMMGMLASQQNQSGPSGNNQNQGNMQREPNQAFGSGNNSYSGSNSGAAIGWGSASNAGSGSGFNGGFGSSMDSKSSGWGM
GFP-TDP43CTF 102 453 MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKEFDIAAAREFFSQYGDVMDVFIPKPFRAFAFVTFADDQIAQSLCGEDLIIKGISVHISNAEPKHNSNRQLERSGRFGGNPGGFGNQGGFGNSRGGGAGLGNNQGSNMGGGMNFGAFSINPAMMAAAQAALQSSWGMMGMLASQQNQSGPSGNNQNQGNMQREPNQAFGSGNNSYSGSNSGAAIGWGSASNAGSGSGFNGGFGSSMDSKSSGWGM
TDP43FL 103 415 MSEYIRVTEDENDEPIEIPSEDDGTVLLSTVTAQFPGACGLRYRNPVSQCMRGVRLVEGILHAPDAGWGNLVYVVNYPKDNKRKMDETDASSAVKVKRAVQKTSDLIVLGLPWKTTEQDLKEYFSTFGEVLMVQVKKDLKTGHSKGFGFVRFTEYETQVKVMSQRHMIDGRWCDCKLPNSKQSQDEPLRSRKVFVGRCTEDMTEDELREFFSQYGDVMDVFIPKPFRAFAFVTFADDQIAQSLCGEDLIIKGISVHISNAEPKHNSNRQLERSGRFGGNPGGFGNQGGFGNSRGGGAGLGNNQGSNMGGGMNFGAFSINPAMMAAAQAALQSSWGMMGMLASQQNQSGPSGNNQNQGNMQREPNQAFGSGNNSYSGSNSGAAIGWGSASNAGSGSGFNGGFGSSMDSKSSGWGM*
TDP43ΔNLS 104 415 MSEYIRVTEDENDEPIEIPSEDDGTVLLSTVTAQFPGACGLRYRNPVSQCMRGVRLVEGILHAPDAGWGNLVYVVNYPKDNAAAMDETDASSAVKVKRAVQKTSDLIVLGLPWKTTEQDLKEYFSTFGEVLMVQVKKDLKTGHSKGFGFVRFTEYETQVKVMSQRHMIDGRWCDCKLPNSKQSQDEPLRSRKVFVGRCTEDMTEDELREFFSQYGDVMDVFIPKPFRAFAFVTFADDQIAQSLCGEDLIIKGISVHISNAEPKHNSNRQLERSGRFGGNPGGFGNQGGFGNSRGGGAGLGNNQGSNMGGGMNFGAFSINPAMMAAAQAALQSSWGMMGMLASQQNQSGPSGNNQNQGNMQREPNQAFGSGNNSYSGSNSGAAIGWGSASNAGSGSGFNGGFGSSMDSKSSGWGM*
C.融合蛋白構築體 為判定本發明之融合蛋白是否可用於減少TDP-43聚集，首先藉由共表現包含衍生自人類Hsp40 J域蛋白之J域序列結合至識別GFP之單鏈可變片段(scFv)的融合蛋白進行初始實驗(資料未展示)。出人意料地，當GFP-TDP43CTF與此構築體一起表現時，大部分聚集消失，而當GFP scFv (無J域序列)與GFP-TDP43CTF一起表現時，未觀測到顯著效果。此表明可使用HSP70介導之路徑解決TDP-43聚集(未圖示)。
吾人隨後設計一系列融合蛋白構築體，如表9中所描繪。表 9 . 融合蛋白構築體及對照
構築體編號 SEQ ID NO:    構築體名稱 註釋
1 78    僅J域 對照，含有來自人類DnaJB1之J域
2 79    scFv(3B12A) 僅scFv(3B12A)對照；結合TDP-43
3 80    JB1-scFv(3B12A) DnaJB1 J域與scFv(3B12A)之融合體
4 81    JB1(P33Q)-scFv(3B12A) 與構築體3相同，在保守HPD模體中具有P33Q突變
5 82    scFv(3B12A)-JB1 兩種構築體3之J域及TDP-43的反向佈置
6 83    scFv(3B12A)-JB1- scFv(3B12A) 包夾於兩個結合TDP-43之scFv之間的J域
7 84    JB6-scFv(3B12A) 來自DnaJB6之J域
8 85    JC6-scFv(3B12A) 來自DnaJC6之J域
9 86    DnaJB1 全長J蛋白對照
10 87    Hsp70 HSP70對照
11 88    Hsp110 HSP110對照
12 89    JB1-scFv(51C1) 來自DnaJB1之J域與結合TDP-43之替代scFv的融合體
13 90    JB1-scFv(3F10) 來自DnaJB1之J域與結合TDP-43之替代scFv的融合體
14 91    JB1-2XQBP1 來自DnaJB1之J域與QBP1之兩個串聯複本的融合體
進行初始實驗以測試融合蛋白構築體在減少TDP-43聚集方面之能力。構築體3 (JB1-scFv(3B12A))及伴侶對照構築體2 (僅TDP-43結合域)及構築體4 (與構築體3相同，但在J域之保守HPD模體內含有突變P33Q)，且轉染至表現GFP-TDP43FL或GFP-TDP43CTF報導子構築體之細胞中。圖3展示與表現GFP-TDP43FL之細胞相比，表現GFP-TDP43CTF報導子之細胞中GFP構築體之聚集更大。表現構築體3之細胞展示實質上減少之聚集，而表現對照(構築體2及構築體4)不減少聚集(圖4；亦參見以下表10)。含有P33Q之構築體4中活性缺失強有力地表明減少聚集之能力由經由Hsp70路徑起作用之J域驅動。表 10 ： 融合蛋白構築體在減少聚集方面之功效
報導子 構築體編號 構築體名稱 聚集% (相對於單獨的GFP-TDP43CTF標準化)
GFP-TDP43FL 無 9.07%
GFP-TDP43FL 2 scFv(3B12A) 5.86%
GFP-TDP43FL 3 JB1-scFv(3B12A) 8.54%
GFP-TDP43FL 4 JB1(P33Q)-scFv(3B12A) 10.56%
GFP-TDP43CTF 無 100%
GFP-TDP43CTF 2 scFv(3B12A) 80.05%
GFP-TDP43CTF 3 JB1-scFv(3B12A) 14.58%
GFP-TDP43CTF 4 JB1(P33Q)-scFv(3B12A) 91.25%
此等細胞之細胞提取物使用免疫墨點分析，使用抗GFP或抗FLAG抗體分別確定含GFP報導子構築體或含FLAG抗原決定基融合蛋白之含量(圖5)。在用抗GFP抗體探測時，表現GFP-TDP43FL之細胞提取物展示存在顯著的約70 kDa帶，而表現GFP-TDP43CTF之細胞展示存在約50 kDa帶。引起關注地，當與陰性對照、scFv對照(構築體2)或P33Q突變體(構築體4)比較時，攜帶GFP-TDP43CTF報導子且亦表現構築體3 (JB1-scFv(3B12A))之細胞展示報導子蛋白之量明顯減少。未發現全長報導子構築體(GFP-TDP43FL)含量之差異。
為研究TDP-43含量減少是否依賴於蛋白質聚集，將表現GFP-TDP43FL或GFP-TDP43CTF且亦表現構築體2或3之細胞的提取物分級分離成可溶性(未聚集)及不溶性(聚集)級分，且藉由用抗GFP抗體探測來偵測報導子之存在。如圖6中所展示，在表現全長報導子(GFP-TDP43FL)之細胞中，可溶性級分及不溶性級分兩者中報導子含量無顯著變化。相比之下，在表現GFP-TDP43CTF報導子之細胞中，在表現構築體3 (JB1-scFv(3B12A))之細胞的可溶性級分中發現報導子之中度減少，但在表現構築體2 (scFv(3B12A))之細胞中未發現。相比之下，報導子含量顯著減少，不溶性級分(可能為聚集形式)中報導子幾乎完全消失。
綜合而言，此等資料強有力地表明融合蛋白能夠減少細胞中TDP-43之含量，且可用以優先加快聚集TDP43蛋白之清除。
基於以上結果，產生若干額外構築體(構築體5-7)，其含有TDP-43結合域相對於J域之不同組態。測試此等構築體減少聚集之能力。將此等新構築體與構築體3 (JB1-scFv(3B12A))以及不表現(陰性對照)或表現單獨的scFv (構築體2)之細胞進行比較。圖7展示彼等實驗之結果(亦概述於以下表11中)。表 11 ：額外構築體及對照
報導子 構築體編號 構築體名稱
GFP-TDP43FL 無
GFP-TDP43FL 2 scFv(3B12A)
GFP-TDP43FL 3 JB1-scFv(3B12A)
GFP-TDP43FL 5 scFv(3B12A)-JB1
GFP-TDP43FL 6 scFv(3B12A)-JB1-scFv(3B12A)
GFP-TDP43FL 7 JB6-scFv(3B12A)
GFP-TDP43CTF 無
GFP-TDP43CTF 2 scFv(3B12A)
GFP-TDP43CTF 3 JB1-scFv(3B12A)
GFP-TDP43CTF 5 scFv(3B12A)-JB1
GFP-TDP43CTF 6 scFv(3B12A)-JB1-scFv(3B12A)
GFP-TDP43CTF 7 JB6-scFv(3B12A)
如圖7中可見，當與陰性對照及表現構築體2 (單獨的scFv)之細胞比較時，構築體3 (JB1-scFv(3B12A))、構築體5 (scFv(3B12A)-JB1)、構築體6 (scFv(3B12A)-JB1-scFv(3B12A))及構築體7 (JB6-scFv(3B12A))展示表現GFP-TDP43FL報導子構築體之細胞中的聚集量中度減少。相比之下，在表現GFP-TDP43CTF構築體之細胞中，在陰性對照及表現構築體2之細胞中存在總體更大量之蛋白質聚集，與早前觀測結果一致。此外，亦表現構築體3、構築體5、構築體6及構築體7之細胞均具有顯著減少量之蛋白質聚集，證明融合蛋白之以下組態有效：DNAJ-T、T-DNAJ、T-DNAJ-T (其中DNAJ為J域，且T為TDP-43結合域)。此外，發現多個J域(例如來自DnaJB1及DnaJB6)在融合蛋白中具有活性。
隨後產生且測試額外構築體，如圖8及圖9中所展示(亦參見以下表12)。引起關注地，表現無TDP-43結合域之全長DnaJB1能夠減少TDP-43聚集約43%，相比之下，藉由構築體3 (JB1-scFv(3B12A))得到＞90%減少。另外，表現含有QBP1肽之兩個串聯複本的構築體14亦展示聚集之大量減少(約71%減少)。先前展示QBP1與TDP-43相互作用(參見例如Mompean等人, (2019) Arch. Biochem. Biophys. 675: 108113)。因此，發現多個TDP-43結合域(scFv(3B12A)及QBP1)在置於融合蛋白中時具有活性。此外，當使用抗GFP抗體藉由免疫墨點分析細胞提取物以定量報導子構築體含量時(圖9B)，發現表現構築體3 (JB1-scFv(3B12A))、構築體9 (全長DnaJB1)及構築體14 (JB1-2XQBP1)之細胞具有較低報導子構築體含量。表 12 ： 額外融合蛋白構築體之產生及測試
報導子 構築體編號 構築體名稱 聚集% (相對於單獨的GFP-TDP43CTF標準化)
GFP-TDP43FL 無   
GFP-TDP43CTF 無 100%
GFP-TDP43CTF 2 scFv(3B12A) 98.40%
GFP-TDP43CTF 1 僅JB1域 115.66%
GFP-TDP43CTF 3 JB1-scFv(3B12A) 9.29%
GFP-TDP43CTF 4 JB1(p33Q)-scFv(3B12A) 103.40%
GFP-TDP43CTF 10 Hsc70對照 97.96%
GFP-TDP43CTF 9 全長DnaJB1 56.31%
GFP-TDP43CTF 11 Hsp110 115.34%
GFP-TDP43CTF 14 JB1-2XQBP1 28.55%
測試額外構築體，如以下表13及表14中所展示。表 13 ： 額外融合蛋白構築體之產生及測試
報導子 構築體編號 構築體名稱 SEQ ID NO: 磷酸化TDP43密度% (相對於單獨的GFP-TDP43CTF標準化)
GFP-TDP43FL 無    3.36%
GFP-TDP43CTF 無    100.00%
GFP-TDP43CTF 3 JB1-scFv(3B12A) 80 51.84%
GFP-TDP43CTF 7 JB6-scFv(3B12A) 84 42.21%
GFP-TDP43CTF 2 scFv(3B12A) 79 122.81%
GFP-TDP43CTF 15 JC7-scFv(3B12A) 92 47.89%
GFP-TDP43CTF 16 JB13-scFv(3B12A) 93 106.49%
表 14 ： 額外融合蛋白構築體之產生及測試
報導子 構築體編號 構築體名稱 SEQ ID NO: 磷酸化TDP43密度% (相對於單獨的GFP-TDP43CTF標準化)
   可溶性級分 不溶性級分
GFP-TDP43FL 無    30.00% 68.63%
GFP-TDP43CTF 無    100.00% 100.00%
GFP-TDP43CTF 3 JB1-scFv(3B12A) 80 7.91% 92.59%
GFP-TDP43CTF 17 JB1-scFv(3B12A) (1) 94 9.80% 66.34%
GFP-TDP43CTF 18 JB1-scFv(3B12A) (2) 95 9.93% 23.49%
GFP-TDP43CTF 19 JB1-scFv(3B12A) (3) 96 11.20% 22.77%
如上所示，大量構築體，包括使用替代J域(參見例如JB6及JC7域)之彼等有效減少GFP-TDP43CTF聚集。其他融合蛋白構築體指示，來自DNAJC6之J域及來自SV40或細菌J域蛋白(DnaJ)之J域亦發現有效減少其他報導子構築體之聚集(資料未展示)。然而，包含無共有HPD序列之J域(參見表1，SEQ ID NO: 16)的構築體16不能減少GFP-TDP43CTF報導子構築體之聚集。
測試額外構築體，如以下表15中所展示。使用結合至TDP-43之scFv 3F10的構築體13 (JB1-scFv(3F10)，SEQ ID NO: 90)與DNAJB1之J域融合。構築體20 (JB1-scFv(3B12A)-DD)，SEQ ID NO: 97，含有來自人類DnaJA1之二聚域。如下文所示，構築體13展示減少GFP-TDP43CTF聚集之中度能力。表現構築體20 (含有二聚域之構築體3)展示GFP-TDP43CTF聚集之強效減少。二聚域進一步促進效果可能歸因於二聚構築體3與GFP-TDP43CTF之間的相互作用增強，與一些天然J域蛋白中發現的域組態一致(Sha (2000)Structure 8(8), 799-807)。表 15 ： 額外融合蛋白構築體之產生及測試
報導子 構築體編號 構築體名稱 TDP43密度% (相對於單獨的GFP-TDP43CTF標準化)
可溶性級分 不溶性級分
GFP-TDP43FL 無 191.46% 90.99%
GFP-TDP43CTF 無 100.00% 100.00%
GFP-TDP43CTF 3 JB1-scFv(3B12A) 24.46% 38.15%
GFP-TDP43CTF 13 JB1-scFv(3F10) 43.90% 61.58%
GFP-TDP43CTF 20 JB1-scFv(3B12A)-DD 12.41% 14.41%
吾人接下來研究融合蛋白減少聚集之機制。單獨或與構築體3 (JB1-scFv(3B12A))一起，且在BFA (巴弗洛黴素A1，晚期自噬之抑制劑)或MG132 (蛋白酶體抑制劑)之情況下，用GFP-TDP43FL或GFP-TDP43CTF報導子構築體轉染HEK293細胞。如圖10中所展示，用10 nM或100 nM BFA處理細胞引起致病性TDP43以劑量依賴型方式再現。相比之下，用0.1 µM或1.0 µM MG132處理對致病性TDP43形式之積聚影響極小或無影響。綜合而言，此等結果表明融合蛋白構築體經由伴護蛋白介導之自噬發揮其作用。
實例 2 ： 編碼融合蛋白構築體之 AAV 載體 藉由帶有編碼表6之融合蛋白構築體，尤其構築體2、4、6、7、17及20-31以及對照構築體1 (僅DnaJB1 J域)、GFP (陰性對照)之密碼子最佳化cDNA的AAV9載體構築例示性基因療法載體，cDNA在含有巨細胞病毒(CMV)早期增強子元件及雞β-肌動蛋白啟動子之CAG啟動子的控制下。編碼構築體之cDNA位於Kozak序列下游且藉由牛類生長激素聚腺苷酸化(BGHpA)信號聚腺苷酸化。整個卡匣由AAV-2之兩個非編碼末端反向序列側接。
使用與上文所描述(Urabe等人，2002，Unzu等人，2011 (綜述於Kotin, 2011中))類似之桿狀病毒表現系統製備重組AAV載體。簡言之，使用三個重組桿狀病毒來感染SF9昆蟲細胞，一個編碼用於複製及封裝之REP，一個編碼用於AAV9衣殼之CAP-5，且一個具有表現卡匣。使用AVB瓊脂糖凝膠高速親和性培養基(GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ)進行純化。用轉殖基因之引子-探針組合使用QPCR滴定載體且效價表示為每ml基因體複本數(GC/ml)。載體之效價大致在8×1013 至2×1014 GC/ml之間。
實例 3 ： 測試 ALS 小鼠模型中之表現及功效 首先在野生型C57BL/6J小鼠中進行實驗以證實構築體3之表現，且確定表現是否對動物具有不利影響。6×1010 vg含有如上文所描述對照或構築體3之AAV rh10衣殼藉由鞘內或腦室內注射來注射，如以下表16中所展示。表 16 ： 含有編碼構築體 3 之表現載體之 AAV rh10 的 IT 及 ICV 注射
組 N 性別 化合物 劑量 (vg/ 小鼠) 給藥途徑 給藥頻率及齡
1 6 雄性 AAV (空) 1×1011 鞘內 5週時1×
2 6 雄性 AAV (構築體-3) 1×1011 鞘內 5週時1×
3 6 雄性 AAV (空) 6×1010 ICV 1×P1
4 6 雄性 AAV (構築體-3) 6×1010 ICV 1×P1
觀測到小鼠共濟失調、後肢無力或腳步拖遝。在AAV注射之後一週，每週獲取體重及臨床觀測結果。在3週時藉由CO2 人道地使小鼠(n=3)安樂死以確認AAV表現。在ICV或IT注射之後三週期間未發現體重差異(資料未展示)。如圖15中所展示，如使用大腦提取物之免疫墨點偵測，藉由鞘內(圖15B)或ICV (圖15C)注射進行注射之小鼠產生構築體3之表現，在對照小鼠中未偵測到。此外，發現ICV注射之後8週的表現顯著高於3週時的表現。
在新穎AAV NEFH-tTA × hTDP-43ΔNLS二基因小鼠(rNLS小鼠)之TDP-43相關病理上測試上文所製備之載體。此模型具有表現致病性TDP-43 (人類TDP-43∆NLS)之多西環素(doxycycline；DOX)可抑制構築體。移除DOX後，TDP-43∆NLS表現導致動物之快速且進行性惡化，導致嚴重體重減輕且一般在6-8週內死亡。吾人測試構築體3 (JB1-scFv(3B12A)，SEQ ID NO: 80)在減緩TDP-43∆NLS介導之病理進展方面的功效。如以下表17中所展示，含有對照或構築體3之AAV rh10在P1/P2以2 μl (最大4 μl)之體積在不同組中ICV單側投與。除對照組1以外，DOX移除發生在第5週。對照小鼠在組中。表 17 ： ∆NLS8 小鼠之 ICV 注射
組 數目 小鼠品系 性別 處理 劑量 投與時間
1 4 rNLS8小鼠(Dox +) 4隻雄性 AAV (對照) 6×1010 vg P1
2 8 rNLS8小鼠(Dox -) 5M/3F AAV (對照) 6×1010 vg P1
3 10 rNLS8小鼠(Dox -) 4M/6F AAV (構築體3) 6×1010 vg P1
斷奶之後每週量測兩次體重。測試完成後，自所有存活小鼠收集樣品。收集全腦且分成2個半球。將一個半球稱重且在乾冰上冷凍。將第二半球在4% PFA中後固定用於組織學評定。
如圖16B中所展示，在DOX移除後，第2組對照小鼠在接下來若干週內開始顯著減輕體重，導致與第1組的統計顯著體重差異。出人意料地，當與第2組比較時，表現構築體3之第3組亦展現統計顯著體重增加(由於第1組僅含有雄性，第2組及第3組之結果僅展示雄性體重以顧及性別差異)。
當檢查存活率時，吾人發現對照組2 (DOX停用)中之動物健康快速惡化，導致第10週時小鼠存活率僅為37.5% (雄性0%)。然而，表現構築體3之小鼠在第10週時展示100%存活率，與第1組(DOX啟用)對照無法區分。
其他態樣 本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案在本文中以全文引用之方式併入本文中，達到如同每一個別公開案、專利或專利申請案經具體且個別地指示為以引用之方式併入本文中之相同程度。在發現本申請案中之術語在以引用之方式併入本文中之文獻中有不同定義之情況下，本文所提供之定義充當該術語之定義。
儘管本發明已結合其特定態樣進行描述，但應理解，本發明能夠進行進一步修改，且本申請案意欲涵蓋本發明之任何變化、使用或改編，其大體上遵循本發明之原理且包括在關於本發明之此項技術內已知或慣用實踐範圍內出現之與本發明之該等偏離，且可應用於上文闡述之基本特徵，且遵循申請專利範圍之範疇。
圖1A展示代表性人類J域序列之Clustal Omega序列比對。高度保守HPD域展示於突出顯示框中。
圖1B展示代表性人類J域序列之Clustal Omega序列比對。
圖2展示包含J域及TDP-43結合域之一些說明性融合蛋白構築體。
圖3展示如藉由螢光顯微法所量測之細胞中TDP43-GFP融合構築體之聚集的視覺化，及J域融合蛋白在減少聚集方面之效果。將經GFP報導子構築體轉染之細胞的螢光顯微法與僅經報導子構築體轉染之細胞(第1圖及第5圖)進行比較，該等GFP報導子構築體含有全長TDP-43 (GFP-TDP43FL；第1圖至第4圖)或TDP-43之C端片段(GFP-TDPCTF；第5圖至第8圖)，進一步含有scFv對照(第2圖及第6圖)、DnaJB1-scFv (3B12A)融合蛋白(第3圖及第7圖)及在保守HPD域中含有P33Q突變之DnaJB1-scFv (3B12A)融合蛋白(第4圖及第8圖)。
圖4展示來自圖3之不同構築體中聚集的定量，相對於僅表現GFP-TDP43CTF構築體之對照細胞標準化。
圖5展示表現具有或不具有融合蛋白構築體之GFP報導子構築體之細胞提取物的免疫墨點分析。上圖為使用抗GFP抗體之西方墨點分析，偵測較大GFP-TDP43FL (第1泳道至第4泳道)及較小GFP-TDP43CTF (第5泳道至第8泳道)。下圖為抗FLAG抗原決定基抗體之西方墨點分析，其偵測scFv (3B12A)對照(第2泳道及第6泳道)、融合蛋白構築體(DnaJB1-scFv (3B12A)，第3泳道及第7泳道)、在保守HPD域中含有P33Q突變之DnaJB1-scFv (3B12A)融合蛋白(第4泳道及第8泳道)。
圖6展示來自表現GFP-TDP43FL或GFP-TDP43CTF報導子構築體，以及無表現(陰性對照)或表現構築體2或3之細胞的提取物之可溶性或不溶性級分之GFP報導子構築體的免疫墨點偵測。
圖7展示如藉由螢光顯微法所量測之細胞中TDP43-GFP融合構築體之聚集的視覺化，及J域融合蛋白在減少聚集方面之效果。將經GFP報導子構築體轉染之細胞的螢光顯微法與表現單獨的報導子之對照(無)進行比較，該等GFP報導子構築體含有全長TDP-43 (GFP-TDP43FL)或TDP-43之C端片段(GFP-TDPCTF)，且進一步含有構築體2、3、5、6及7。
圖8展示如藉由螢光顯微法所量測之細胞中TDP43-GFP融合構築體之聚集的視覺化，及J域融合蛋白在減少聚集方面之效果。將經GFP報導子構築體轉染之細胞的螢光顯微法與表現單獨的報導子之對照(無)進行比較，該等GFP報導子構築體含有全長TDP-43 (GFP-TDP43FL)或TDP-43之C端片段(GFP-TDPCTF)，且進一步含有構築體1、2、3、4、9、10、11或14。
圖9展示TDP-43報導子構築體之定量及偵測：圖9A展示來自圖8中所展示之實驗之細胞中聚集的定量差異。圖9B展示細胞提取物之免疫墨點分析，其使用抗GFP抗體以定量細胞提取物中之報導子構築體含量。
圖10展示晚期自噬之強效抑制劑巴弗洛黴素A1 (Bafilomycin A1；BFA)及蛋白酶體抑制劑MG132對共表現構築體3之細胞中GFP-TDP43CTF減少的影響。細胞經報導子構築體GFP-TDP43FL (第2泳道)或GFP-TDP43CTF (第3泳道至第8泳道)轉染，且經編碼構築體3之核酸共轉染(第4泳道至第8泳道)。如藉由免疫墨點偵測，用BFA (在0.01 µM下，第5泳道，及在0.1 µM下，第6泳道)處理細胞產生較高含量之GFP-TDP43CTF報導蛋白。相比之下，用0.1或1.0 µM MG132處理(分別第7泳道及第8泳道)幾乎無效果。
圖11展示共表現構築體3 (第4泳道及第8泳道)對細胞提取物之可溶性(非聚集)及不溶性(聚集)級分中GFP-TDP43CTF報導子含量的影響，如用抗TDP43抗體(圖11A)及抗磷酸化TDP43抗體(圖11B)探測。
圖12展示共表現構築體3 (第3泳道)、構築體7 (第4泳道)、構築體2 (第5泳道)、構築體15 (第6泳道)及構築體16 (第7泳道)在減少細胞提取物中磷酸化GFP-TDP43CTF報導子含量中的影響，如用抗磷酸化TDP43抗體探測。
圖13展示在表現TDP43FL構築體(第2、3、7及8泳道)及TDP43∆NLS構築體(第4、5、9及10泳道)之細胞中共表現構築體3 (第3、5、8及10泳道)對TDP-43 (如用抗TDP43抗體探測，頂部圖)、磷酸化TDP-43 (如用抗TDP43抗體探測，第二圖)、Flag抗原決定基(用抗FLAG抗體探測，第三圖)及微管蛋白(抗微管蛋白抗體，底部圖)之含量的影響。
圖14展示測試減少磷酸化TDP-43之能力的額外構築體。將表現GFP-TDP43FL (第1泳道及第7泳道)或GFP-TDP43CTF (第2-6泳道、第8-12泳道)之細胞用構築體3 (第3泳道及第9泳道)、構築體17 (第4泳道及第10泳道)、構築體18 (第5泳道及第11泳道)及構築體19 (第6泳道及第12泳道)共轉染。用抗磷酸化TDP43抗體探測可溶性級分(第1泳道至第6泳道)及不溶性級分(第7泳道至第12泳道)。
圖15展示經含有對照或編碼構築體3之載體的AAV rh10注射之C57小鼠之結果的概述，AAV rh10藉由鞘內(IT)或腦血管內(ICV)注射投與。圖15A概述研究時程。圖15B展示用含有對照(第1泳道及第2泳道)或含構築體3之載體(第3泳道及第4泳道)之AAV rh10 IT投與之後3週，來自小鼠之大腦提取物的免疫墨點。圖15C展示ICV注射之後來自小鼠大腦提取物的免疫墨點。第1泳道至第3泳道展示用含有對照(第1泳道及第2泳道)或含構築體3之載體(第3泳道)之AAV rh10 ICV投與之後3週，來自小鼠之大腦提取物的免疫墨點。第4泳道至第8泳道展示來自對照(第4泳道至第6泳道)及構築體3 (第7泳道及第8泳道)小鼠之8週小鼠的免疫墨點。
圖16展示使用經含有對照或編碼構築體3之載體之AAV rh10注射的∆NLS8小鼠之結果的概述，AAV rh10藉由ICV注射投與。圖16A展示研究時程。圖16B展示來自各組之雄性的平均體重。圖16C展示來自不同組之小鼠的存活率。
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Claims (71)

  1. 一種經分離之融合蛋白，其包含J蛋白之J域及TDP-43結合域。
  2. 如請求項1之融合蛋白，其中J蛋白之該J域具有真核來源。
  3. 如請求項1或請求項2中任一項之融合蛋白，其中J蛋白之該J域具有人類來源。
  4. 如請求項1至3中任一項之融合蛋白，其中J蛋白之該J域位於細胞溶質中。
  5. 如請求項1至4中任一項之融合蛋白，其中J蛋白之該J域選自由SEQ ID NO: 1-50組成之群。
  6. 如請求項1至5中任一項之融合蛋白，其中該J域包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 1、5、6、10、16、24、25、31及49。
  7. 如請求項1至6中任一項之融合蛋白，其中該J域包含SEQ ID NO: 5之序列。
  8. 如請求項1至6中任一項之融合蛋白，其中該J域包含SEQ ID NO: 10之序列。
  9. 如請求項1至6中任一項之融合蛋白，其中該J域包含SEQ ID NO: 16之序列。
  10. 如請求項1至6中任一項之融合蛋白，其中該J域包含SEQ ID NO: 25之序列。
  11. 如請求項1至6中任一項之融合蛋白，其中該J域包含SEQ ID NO: 31之序列。
  12. 如請求項1至11中任一項之融合蛋白，其中例如當使用ELISA分析量測時，該TDP-43結合域對TDP-43 (例如使用包含TDP-43之C端207個胺基酸的報導子構築體)之KD 為1 µM或更小，例如300 nM或更小、100 nM或更小、30 nM或更小、10 nM或更小。
  13. 如請求項1至12中任一項之融合蛋白，其中該TDP-43結合域包含選自由SEQ ID NO: 51-55組成之群的序列。
  14. 如請求項1至13中任一項之融合蛋白，其中該TDP-43結合域包含SEQ ID NO:51-53之序列。
  15. 如請求項1至13中任一項之融合蛋白，其中該TDP-43結合域包含SEQ ID NO:51之序列。
  16. 如請求項1至13中任一項之融合蛋白，其中該TDP-43結合域包含SEQ ID NO:53之序列。
  17. 如請求項1至16中任一項之融合蛋白，其包含複數個TDP-43結合域。
  18. 如請求項1至17中任一項之融合蛋白，其由兩個TDP-43結合域組成。
  19. 如請求項1至18中任一項之融合蛋白，其由三個TDP-43結合域組成。
  20. 如請求項1至19中任一項之融合蛋白，其包含以下構築體中之一者： a.    DNAJ-X-T， b.   DNAJ-X-T-X-T， c.    DNAJ-X-T-X-T-X-T， d.   T-X-DNAJ， e.    T-X-T-X-DNAJ， f.    T-X-T-X-T-X-DNAJ， g.   T-X-DNAJ-X-T， h.   T-X-DNAJ-X-T-X-T， i.    TDNAJ-X-TTTTTDNAJ-X-T， j.    T-X-T-X-DNAJ-X-TT， k.   TTDNAJ-X-T-X-TTTTTDNAJ-X-T， l.    T-X-T-X-DNAJ-X-T-X-T-X-T， m.   T-X-T-X-T-X-DNAJ-X-T， n.   T-X-T-X-T-X-DNAJ-X-T-X-T， o.   T-X-T-X-T-X-DNAJ-X-T-X-T-X-T， p.   DnaJ-X-DnaJ-X-T-X-T， q.   T-X-DnaJ-X-DnaJ， r.    T-X-T-X-DnaJ-X-DnaJ，及 s.    T-X-TDnaJ-X-TDnaJ-X-TTTT 其中， T為TDP-43結合域， DNAJ為J蛋白之J域，且 X為視情況選用之連接子。
  21. 如請求項1至20中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO: 5之J域序列及SEQ ID NO: 51之TDP-43結合域序列。
  22. 如請求項1至21中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO: 5之J域序列及SEQ ID NO: 53之TDP-43結合域序列的兩個複本。
  23. 如請求項1至22中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白包含選自由SEQ ID NO: 80-85及89-97組成之群的序列。
  24. 如請求項1至23中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 80、82-85、89-90及92-97。
  25. 如請求項1至23中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO: 80之序列。
  26. 如請求項1至23中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO: 90之序列。
  27. 如請求項1至23中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO: 92之序列。
  28. 如請求項1至23中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO: 94之序列。
  29. 如請求項1至23中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO: 95之序列。
  30. 如請求項1至23中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO: 96之序列。
  31. 如請求項1至30中任一項之融合蛋白，其進一步包含靶向試劑。
  32. 如請求項1至31中任一項之融合蛋白，其進一步包含抗原決定基。
  33. 如請求項32之融合蛋白，其中該抗原決定基為選自由SEQ ID NO:67-73組成之群的多肽。
  34. 如請求項1至請求項33中任一項之融合蛋白，其進一步包含細胞穿透劑。
  35. 如請求項34之融合蛋白，其中該細胞穿透劑係選自由SEQ ID NO: 74-77組成之群。
  36. 如請求項1至35中任一項之融合蛋白，其進一步包含信號序列。
  37. 如請求項36之融合蛋白，其中該信號序列包含選自由SEQ ID NO: 98-100組成之群的肽序列。
  38. 如請求項1至37中任一項之融合蛋白，其能夠減少細胞中TDP-43蛋白之聚集。
  39. 如請求項1至38中任一項之融合蛋白，其能夠降低TDP-43介導之細胞毒性。
  40. 一種核酸序列，其編碼如請求項1至39中任一項之融合蛋白。
  41. 如請求項40之核酸序列，其中該核酸為DNA。
  42. 如請求項40之核酸序列，其中該核酸為RNA。
  43. 如請求項40至42中任一項之核酸序列，其中該核酸包含至少一種經修飾之核酸。
  44. 如請求項40至43中任一項之核酸序列，其進一步包含啟動子區、5' UTR、3' UTR，諸如聚(A)信號。
  45. 如請求項44之核酸序列，其中該啟動子區包含選自由以下組成之群的序列：CMV增強子序列、CMV啟動子、CBA啟動子、UBC啟動子、GUSB啟動子、NSE啟動子、突觸蛋白啟動子、MeCP2啟動子及GFAP啟動子。
  46. 一種載體，其包含如請求項40至45中任一項之核酸序列。
  47. 如請求項46之載體，其中該載體係選自由以下組成之群：腺相關病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒、反轉錄病毒、疱疹病毒、痘病毒(牛痘或黏液瘤)、副黏液病毒(麻疹、RSV或新城雞瘟病毒(Newcastle disease virus))、桿狀病毒、里奧病毒(reovirus)、α病毒及黃病毒。
  48. 如請求項46或請求項47之載體，其中該載體為AAV。
  49. 一種病毒粒子，其包含衣殼及如請求項46至48中任一項之載體。
  50. 如請求項49之病毒粒子，其中衣殼係選自由以下組成之群：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、假型化AAV、恆河猴源AAV、AAVrh8、AAVrh10及AAV-DJan AAV衣殼突變體、AAV混雜血清型、親器官性AAV、親心性AAV及親心性AAVM41突變體。
  51. 如請求項49或請求項50之病毒粒子，其中該衣殼係選自由以下組成之群：AAV2、AAV5、AAV8、AAV9及AAVrh10。
  52. 如請求項49至請求項51中任一項之病毒粒子，其中該衣殼為AAV2。
  53. 如請求項49至請求項51中任一項之病毒粒子，其中該衣殼為AAV5。
  54. 如請求項49至請求項51中任一項之病毒粒子，其中該衣殼為AAV8。
  55. 如請求項49至請求項51中任一項之病毒粒子，其中該衣殼為AAV9。
  56. 如請求項49至請求項51中任一項之病毒粒子，其中該衣殼為AAV rh10。
  57. 一種醫藥組合物，其包含選自由以下組成之群的藥劑：如請求項1至39中任一項之融合蛋白、表現如請求項1至39中任一項之融合蛋白之細胞、如請求項40至45中任一項之核酸、如請求項46至48中任一項之載體、如請求項49至56中任一項之病毒粒子，及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
  58. 一種降低細胞中TDP-43蛋白之毒性的方法，其包含使該細胞與有效量之一或多種選自由以下組成之群的藥劑接觸：如請求項1至39中任一項之融合蛋白、表現如請求項1至39中任一項之融合蛋白之細胞、如請求項40至45中任一項之核酸、如請求項46至48中任一項之載體、如請求項49至56中任一項之病毒粒子及如請求項57之醫藥組合物。
  59. 如請求項58之方法，其中該細胞係在個體中。
  60. 如請求項58至請求項59中任一項之方法，其中該個體為人類。
  61. 如請求項58至請求項60中任一項之方法，其中該細胞為中樞神經系統之細胞。
  62. 如請求項58至請求項61中任一項之方法，其中個體鑑別為患有TDP-43疾病。
  63. 如請求項62之方法，其中該TDP-43疾病係選自由以下組成之群：ALS、FTD、帕金森氏症(Parkinson's disease)、杭丁頓氏症(Huntington's disease)、阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、海馬硬化及路易氏體失智症(dementia with Lewy's bodies)。
  64. 如請求項62或請求項63之方法，其中該TDP-43疾病為ALS。
  65. 如請求項58至請求項64中任一項之方法，其中當與對照細胞相比時，該細胞中聚集TDP-43蛋白之量減少。
  66. 一種在有需要個體中治療、預防TDP-43疾病或延緩其進展的方法，該方法包含投與有效量之一或多種選自由以下組成之群的藥劑：如請求項1至39中任一項之融合蛋白、表現如請求項1至39中任一項之融合蛋白之細胞、如請求項40至45中任一項之核酸、如請求項46至48中任一項之載體、如請求項49至56中任一項之病毒粒子及如請求項57之醫藥組合物。
  67. 如請求項66之方法，其中該TDP-43疾病係選自由以下組成之群：ALS、FTD、帕金森氏症、杭丁頓氏症、阿茲海默氏症、海馬硬化及路易氏體失智症。
  68. 如請求項67之方法，其中該TDP-43疾病為ALS。
  69. 一種如請求項1至39中任一項之融合蛋白、表現如請求項1至39中任一項之融合蛋白之細胞、如請求項40至45中任一項之核酸、如請求項46至48中任一項之載體、如請求項49至56中任一項之病毒粒子及如請求項57之醫藥組合物中之一或多者的用途，其用於製備適用於在個體中預防TDP-43疾病或延緩該疾病進展的藥劑。
  70. 如請求項69之用途，其中該TDP-43疾病係選自由以下組成之群：ALS、FTD、帕金森氏症、杭丁頓氏症、阿茲海默氏症、海馬硬化及路易氏體失智症。
  71. 如請求項69或請求項70之用途，其中該TDP-43疾病為ALS。
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