DE60117550T2 - Doppelsträngige parvovirus-vektoren - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Reagenzien zum Gentransport. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung verbesserte Parvovirus-basierte Vektoren zum Gentransport.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Adeno-assoziiertes Virus (AAV) ist ein nicht-pathogenes, helferabhängiges Mitglied der Parvovirusfamilie. Eines der charakteristischen Merkmale dieser Gruppe ist die Enkapsidation eines einzelsträngigen DNA-Genoms (ssDNA-Genom). Im Fall von AAV werden die getrennten Stränge mit Plus- oder Minuspolarität mit gleicher Häufigkeit verpackt und jeder ist infektiös. An jedem Ende des ssDNA-Genoms führt eine palindromische Terminal Repeat (TR)-Struktur durch Basenpaarung mit sich selbst zu einer Haarnadelkonfiguration. Diese dient der zellulären DNA-Polymerase nach Freisetzung in der Wirtszelle als Primer zur Synthese des Komplementärstrangs. Adeno-assoziiertes Virus benötigt zur produktiven Infektion im Allgemeinen ein Helfervirus. Obwohl üblicherweise Adenovirus (Ad) diesen Zweck erfüllt, ermöglicht eine Behandlung von AAV-infizierten Zellen mit UV-Strahlung oder Hydroxyharnstoff (HU) ebenfalls eine begrenzte Replikation.
  • Rekombinate AAV (rAAV)-Vektoren zum Gentransport verpacken ebenfalls ssDNA mit Plus- oder Minuspolarität und sind zur Synthese des komplementären Strangs auf zelluläre Replikationsfaktoren angewiesen. Obwohl ursprünglich erwartet wurde, dass dieser Schritt spontan durch zelluläre DNA-Replikation oder Reparaturwege erfolgt, scheint dies nicht der Fall zu sein. Frühe Arbeiten mit rAAV-Vektoren ergaben, dass die Fähigkeit zur Expression eines Markergens dramatisch verbessert wurde, wenn Zellen mit Adenovirus coinfiziert oder transient mit genotoxischen Mitteln vorbehandelt wurden. Diese Verbesserung korrelierte mit der Bildung von Doppelstrang-DNA (Duplex-DNA) aus der einzelsträngigen Virion-DNA (vDNA). Eine ähnliche Induktion von rAAV-Vektoren wurde in vivo nach Behandlung mit Ad, ionisierender Strahlung oder Topoisomeraseinhibitoren beobachtet. Der Effekt war jedoch bei unterschiedlichen Geweben und Zelltypen sehr verschieden. In jüngerer Zeit wurde vermutet, dass die Reassoziation komplementärer vDNA separater infizierender rAAV-Partikeln ein wichtiger Weg für die rAAV-Transduktion sein könnte.
  • Das Erfordernis der Komplementärstrangsynthese oder -Rekrutierung wird mittlerweile als ein limitierender Faktor bei der Effizienz von rAAV-Vektoren betrachtet. Die Transduktionsrate von rAAV bei Mäuseleber wurde nach Infusion von 4,2 × 1010 Partikeln in die Portalvene als etwa 5 % der Hepatozyten berechnet. Spätere Versuche ergaben, dass die rAAV-vDNA im Grunde in den Kern aller Leberhepatozyten aufgenommen worden war und dass das Transduktionspotential dieser Genome durch Coinfektion mit Adenovirus gerettet werden konnte (Rescue). Dies stimmt mit einem früheren Bericht überein, dass mit 1010 rAAV-Partikel in Gegenwart von coinfizierendem Adenovirus bis zu 25 % der Mäusehepatozyten transduziert wurden. Die Expression von rAAV in Lebergewebe geht mit der Bildung von Duplex-DNA einher und die vDNA scheint verloren zu gehen, wenn sie nicht innerhalb von 5-13 Wochen in einen Duplex überführt wird. Weitere Versuche lassen vermuten, dass eine Subpopulation von Mäusehepatozyten transient permissiv für eine rAAV-Transduktion in vivo ist.
  • Die WO 01/11034 offenbart doppelsträngige Parvoviruspartikel. Fisher et al., Journal of Virology, Jan. 1996, S. 520-532, offenbaren, dass der geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Transduktion von Zellen mit rAAV die Umwandlung des viralen Genoms in ein transkriptionell aktives Doppelstrangtemplat ist.
  • Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung das Problem verbesserter Parvovirusvektoren zum Gentransport. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung das Problem der Komplementärstrangsynthese bei herkömmlichen AAV-Vektoren zum Gentransport.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Einzelstrangnatur des AAV-Genoms könnte die Expression von rAAV-Vektoren mehr als irgendein anderes biologisches Merkmal beeinflussen. Anstatt sich die der Bereitstellung eines Komplementärstrangs für rAAV-Vektoren auf möglicherweise veränderliche zelluläre Mechanismen verlassen zu müssen, wurde nun gefunden, dass sich dieses Problem umgehen lässt, indem man beide Stränge als ein einziges DNA-Molekül verpackt. Bei den hier beschriebenen Untersuchungen wurde in HeLa-Zellen mit solchen doppelsträngigen ("duplexed") Vektoren gegenüber herkömmlichem rAAV eine erhöhte Transduktionseffizienz beobachtet (5- bis 140-fach). Wichtiger noch ist, dass Inhibitoren der DNA-Replikation, anders als bei herkömmlichen einzelsträngigen AAV-Vektoren, die Transduktion der Doppelstrang-Vektoren der Erfindung nicht beeinträchtigten. Ferner zeigten die erfindungsgemäßen doppelsträngigen Parvovirusvektoren in Mäusehepatozyten in vivo ein rascheres Einsetzen der Expression des Transgens und ein höheres Expressionsniveau als rAAV-Vektoren. Alle diese biologischen Attribute stützen die Bildung und Charakterisierung einer neuen Klasse von Parvovirusvektoren (die Duplex-DNA transportieren), die wesentlich zur fortschreitenden Entwicklung von Parvovirus-basierten Systemen zum Gentransport beitragen.
  • Insgesamt wurde ein neuer Typ Parvovirusvektor konstruiert und durch die hier beschriebenen Untersuchungen charakterisiert, der ein doppelsträngiges Genom trägt, was zur gleichzeitigen Verpackung von Strängen mit Plus- und Minuspolarität führt, die in einem einzigen Molekül miteinander verbunden sind. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Parvoviruspartikel bereit, das ein Parvoviruskapsid (z. B. ein AAV-Kapsid) und ein Vektorgenom umfasst, das eine heterologe Necleotidsequenz codiert, wobei das Vektorgenom selbstkomplementär ist, d. h. das Vektorgenom ist eine dimere invertierte Sequenzwiederholung (ein dimerer "Inverted Repeat"). Das Vektorgenom hat entsprechend dem Parvoviruskapsid, in das es verpackt wird, vorzugsweise etwa die Größe des Wildtyp-Parvovirusgenoms (z. B. des AAV-Genoms) und umfasst ein geeignetes Verpackungssignal. Die vorliegende Erfindung stellt das oben beschriebene Vektorgenom bereit und Template, die dieses codieren.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein doppelsträngiges Parvoviruspartikel bereit, umfassend: ein Parvoviruskapsid und ein Vektorgenom, umfassend in 5'→3'-Richtung: (i) eine 5'-terminale repetitive Parvovirussequenz; (ii) eine erste heterologe Nucleotidsequenz; (iii) eine nicht auflösbare terminate repetitive Parvovirussequenz; (iv) eine separate heterologe Nucleotidsequenz, die im Wesentlichen vollständig komplementär zu der ersten heterologen Nucleotidsequenz ist; und (v) eine 3'-terminale repetitive Parvovirussequenz; wobei das Vektorgenom nach Freisetzung aus dem Parvoviruskapsid unter geeigneten Bedingungen zur Intrastrang-Basenpaarung zwischen den heterologen Nucleotidsequenzen in der Lage ist. Durch die Basenpaarung zwischen den komplementären heterologen Nucleotidsequenzen wird eine doppelsträngige Sequenz gebildet, die ein geeignetes Substrat zur Genexpression (d. h. Transkription und, gegebenenfalls, Translation) oder ein Substrat für die Wirtsrekombination (d. h. ein dsDNA-Templat) in einer Wirtszelle ist, ohne dass die Wirtszellmaschinerie das Vektorgenom in eine doppelsträngige Form überführen muss.
  • Die Bezeichnungen 5' und 3' bezüglich des Vektorgenoms (oder Templaten zu dessen Herstellung, siehe unten) gibt keine besondere Transkriptionsrichtung für die zwischen den beiden komplementären heterologen Sequenzen gebildete doppelsträngigen Sequenz an. Der "codierende Strang" kann sich entweder auf der 5'- oder der 3'-Hälfte der Virion-DNA befinden. Der Fachmann erkennt, dass der Begriff "codierender Strang" in seiner breitesten Bedeutung verwendet wird, um den Strang anzugeben, der das gewünschte Transkript codiert, und auch nichttranslatierte Sequenzen, einschließlich Antisense-Sequenzen, umfasst. Transkription kann also vom 5'-Ende der ersten heterologen Nucleotidsequenz in der 5'-Hälfte des Vektorgenoms oder vom 5'-Ende der komplementären heterologen Nucleotidsequenz auf der 3'-Hälfte des Vektorgenoms initiiert werden.
  • Mit anderen Worten kann die Transkription in der durch Intrastrang-Basenpaarung gebildeten doppelsträngigen vDNA vom offenen Ende oder vom geschlossenen Ende (d. h. dem dem nicht auflösbaren TR nächstgelegenen Ende) der Haarnadelstruktur initiiert werden.
  • Gemäß dieser Ausführungsform ist das Parvoviruskapsid vorzugsweise ein AAV-Kapsid. Es ist weiterhin bevorzugt, dass die terminalen repetitiven Parvovirussequenzen und/oder die nicht auflösbaren terminalen repetitiven Sequenzen AAV-Sequenzen sind.
  • Bei besonderen Ausführungsformen umfasst das doppelsträngige Parvoviruspartikel Expressionskontrollsequenzen (z.B. einen Promotor), die zur Expression der durch Intrastrang-Basenpaarung in der selbstkomplementären vDNA gebildeten Doppelstrangsequenz ausreichen.
  • Das Vektorgenom kann weiterhin zwei oder mehr Transkripte von der durch Intrastrang-Basenpaarung gebildeten Doppelstrangsequenz exprimieren.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Nucleotidsequenz bereit, die ein Templat zur Produktion einer Virion-DNA umfasst, wobei das Templat eine heterologe Nucleotidsequenz umfasst, die von einer terminalen repetitiven Parvovirussequenz und einer nicht auflösbaren terminalen repetitiven Parvovirussequenz flankiert wird.
  • Gemäß noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Nucleotidsequenz bereit, die ein dimeres Templat zur Produktion einer Virion-DNA umfasst, wobei das Templat in 5'→3'-Richtung umfasst: eine 5'-terminate repetitive Parvovirussequenz; eine erste heterologe Nucleotidsequenz; eine nicht auflösbare terminate repetitive Parvovirussequenz; eine separate heterologe Nucleotidsequenz, die im Wesentlichen vollständig komplementär zu der ersten heterologen Nucleotidsequenz ist; und eine 3'-terminate repetitive Parvovirussequenz; wobei die Virion-DNA in der Lage ist, nach Freisetzung aus dem Parvoviruskapsid unter geeigneten Bedingungen für eine Intrastrang-Basenpaarung eine dsDNA zwischen den heterologen Nucleotidsequenzen zu bilden.
  • Vorzugsweise sind die terminalen repetitiven Parvovirussequenzen und/oder die nicht auflösbaren terminalen repetitiven Parvovirussequenz AAV-Sequenzen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zur Herstellung der erfinderischen doppelsträngigen Parvovirusvektoren der Erfindung bereit.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein in vitro-Verfahren zum Transport einer Nucleotidsequenz zu einer Zelle bereit, umfassend: In-Kontakt-Bringen einer Zelle mit einem doppelsträngigen Parvoviruspartikel, umfassend ein Parvoviruskapsid und ein Vektorgenom, das umfasst: (i) eine 5'-terminale repetitive Parvovirussequenz; (ii) eine erste heterologe Nucleotidsequenz; (iii) eine zentral lokalisierte terminale repetitive Parvovirussequenz; (iv) eine separate heterologe Nucleotidsequenz, die im Wesentlichen vollständig komplementär zu der ersten hterologen Nucleotidsequenz ist; (v) eine 3'-terminale repetitive Parvovirussequenz; wobei das doppelsträngige Vektorgenom nach Freisetzung aus dem Parvoviruskapsid unter geeigneten Bedingungen zur Intrastrang-Basenpaarung zwischen den heterologen Nucleotidsequenzen in der Lage ist.
  • Gemäß dieser Ausführungsform ist das Parvoviruskapsid vorzugsweise ein AAV-Kapsid, und das Vektorgenom hat ungefähr die Größe des Wildtyp-AAV-Genoms. Weiterhin ist es bevorzugt, dass die terminalen repetitiven Parvovirussequenzen AAV-Sequenzen sind. Die Zelle kann mit dem doppelsträngigen Parvoviruspartikel in vitro in Kontakt gebracht werden.
  • Diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden in der nachfolgenden Beschreibung der Erfindung ausführlicher beschrieben.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1. Virion-DNA-Gehalt von rAAV-Vektoren und Doppelstrang-Vektoren. Die Abbildung veranschaulicht den DNA-Gehalt der bei dieser Untersuchung verwendeten Vektoren und die vorhergesagte Konformation, die sie nach Freisetzung aus den Virions annehmen. Die von dem "immediate early"-Promotor von Cytomegalovirus (CMV) exprimierten Transgene sind: grünfluoreszierendes Protein (GF), β-Galactosidase (LacZ), murines Erythropoietin (mEPO). Neomycin-Phosphotransferase (neo) wird vom frühen SV40-Promotor (SV40) exprimiert. Die Größe eines jeden verpackten DNA-Moleküls, in Nucleotiden (nt), ist angegeben. Die selbstkomplementären oder "duplexed" (scAAV) GFP-Dimer- und mEpo-Vektoren falten sich zu einer vollständigen Doppelstrang-DNA (Duplex-DNA) mit einer Extrakopie des Terminal Repeats, während die GFPneo-, LacZ- und mEpoλ-Vektoren eine zellvermittelte DNA-Synthese des Komplementärstrangs benötigen.
  • 2. Vektorfraktionierung über CsCl-Gradienten. Virion-DNA (vDNA) wurde aus mittels CsCl-Gradienten fraktionierten CMV-GFP- (Bild a), GFPneo- (Bild b) und LacZ-rAAV-Vektoren (Bild c) extrahiert. Alkalische Agarosegele der vDNA wurden einem Southern Blot unterzogen und hybridisierten mit einem CMV-GFP-DNA-Fragment. Marker auf der linken Seite von Bild a waren die ausgeschnittenen Vektorsequenzen von den Plasmiden, die zur Bildung der viralen Vektoren verwendet wurden (siehe Ergebnisse). Die Anzahl von Einheitslängen, ssDNA, und Vektrokopien pro Molekül sind durch 1x, 2x und 4x angegeben. Die viralen Vektoren, die in den in den 3 und 4 dargestellten Versuchen verwendet wurden, stammten für CMV-GFP aus den Fraktionen a-11 oder a-10 (wie in den Legenden zu den Abbildungen angegeben), für GFPneo aus der Fraktion b-13 und für LacZ aus der Fraktion c-12.
  • 3. Transduktionseffizienz doppelsträngiger rAAV-Vektoren gegenüber herkömmlichen rAAV-Vektoren ohne und mit coinfizierendem Adenovirus. Die Effizienz der drei CsCl-fraktionierten Vektoren (1) wurden in sich rasch teilenden HeLa-Zellen verglichen, die mit scAAV-GFP-Fraktion 11 (0,5 Partikel pro Zelle), rAAV-GFPneo-Fraktion 13 (2 Partikel pro Zelle) oder rAAV-LacZ-Fraktion 12 (0,5 Partikel pro Zelle) infiziert worden waren. Transduktion wurde 24 Stunden nach Infektion quantifiziert, indem GFP-positive Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie oder durch Fixieren der Zellen und X-Gal-Färbung gezählt wurden. Die Transduktionseffizienz wurde graphisch als die Zahl physikalischer Partikel pro transduzierender Einheit aufgetragen, bestimmt durch die Anzahl von Zellen, die sich als für GFP- oder LacZ-Expression positiv erwiesen. Dunkelgraue Balken geben die Transduktionseffizienz bei Coinfektion von Ad mit 5 pfu pro Zelle an.
  • 4. Transduktion mit doppelsträngigen und herkömmlichen rAAV-Vektoren in Gegenwart von DNA-Syntheseinhibitor. (Bild a). HeLa-Zellkulturen wurden bei 30%iger Konfluenz 24 h vor Infektion mit 3,8 × 106 Partikeln scAAV-GFP, ♦, (2a, Fraktion 10), dem homologen Monomer, •, (2, Bild a, Fraktion 14) oder rAAV-GFPneo, ∇, (2, Bild b, Fraktion 13) mit den angegebenen Konzentrationen von Hydroxyharnstoff (HU) behandelt. Die HU-Behandlung wurde bis zum Test der Transduktion 24 h nach Infektion beibehalten. Jeder Datenpunkt wurde aus dem Mittelwert der Anzahl GFP-positiver Zellen in 10 zufälligen Feldern unabhängig von der Gesamtzellzahl berechnet, die aufgrund der Wirkung des Hydroxyharnstoffs auf die Zellteilung variierte. (Bild b). Das gleiche Verfahren wurde verwendet, um die Transduktion in Gegenwart der angegebenen Konzentrationen von Aphidicolin zu bestimmen. Es wurde nur das doppelsträngige und das homologe Monomer (Fraktionen 10 und 14) verglichen.
  • 5. In vivo-Transduktion von Mäuselebergewebe mit doppelsträngigen oder einzelsträngigen rAAV-Vektoren. Zehn Wochen alte Balbc ByJ-Mäuse wurden mit 2 × 1010 Partikeln von entweder scAAV-CMV-mEpo, ♦, (n=4) oder einzelsträngigem rAAV-CMV-mEpoλ vollständiger Länge, ⧫, (n=5) in 200 μl normaler Kochsalzlösung durch Injektion in die Portalvene infundiert. Eine Gruppe von Kontrollmäusen wurde mit normaler Kochsalzlösung, ☐, (n=4) infundiert und eine einzige Maus, O, wurde in den gleichen 7-Tage-Intervallen ohne vorhergehende Operation phlebotomiert. Als funktionelle Größe für die mEpo-Expression wurde Bluthämatokrit verwendet.
  • 6 ist eine Darstellung eines bevorzugten Templats zur Produktion der doppelsträngigen Parvovirusvektoren der Erfindung.
  • 7 zeigt einen CsCl-Dichtegradienten des mutierten rAAV-CMV-GFP-Hpa-trs-Vektors.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezug auf die anliegenden Zeichnungen beschrieben, in denen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung gezeigt sind.
  • Falls nicht anders angegeben, werden hier alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe in der dem Fachman auf dem Gebiet der Erfindung geläufigen Bedeutung verwendet. Die in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung verwendete Terminologie dient nur der Beschreibung besonderer Ausführungsformen und soll diese Erfindung nicht einschränken. Die Singularformen "ein", "eine" und "der", "die" und "das", wie sie in der Beschreibung der Erfindung und den sich anschließenden Ansprüchen verwendet werden, sollen auch die Pluralformen umfassen, falls es sich aus dem Zusammenhang nicht eindeutig anders ergibt.
  • Nucleotidsequenzen werden hier nur als Einzelstrang dargestellt, und zwar von links nach rechts in 5'→3'-Richtung, falls nicht explizit anders angegeben. Nucleotide und Aminosäuren sind hier in der von der IUPAC-IUB-Biochemical Nomenclature Commission empfohlenen Weise dargestellt oder (für Aminosäuren) entweder durch den Einbuchstabencode oder den Dreibuchstabencode, jeweils entsprechend 37 CFR §1.822 und etablierter Verwendung. Siehe z. B. PatentIn User Manual, 99-102 (Nov. 1990) (U.S. Patent and Trademark Office).
  • Falls nicht anders angegeben, können zur Herstellung der Konstrukte von rekombinantem Parvovirus und rAAV, von Verpackungsvektoren, die die rep- und/oder cap-Sequenzen von Parvovirus exprimieren, und von transient und stabil transfizierten Verpackungszellen dem Fachmann bekannte Standardverfahren verwendet werden. Solche Methoden sind dem Fachmann bekannt. Siehe z. B. SAMBROOK et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Aufl. (Cold Spring Harbor, NY, 1989); F. M. AUSUBEL et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Green Publishing Associates, Inc. und John Wiley & Sons, Inc., New York).
  • Parvoviren sind relativ kleine DNA-Viren bei Tieren und enthalten ein lineares, einzelsträngiges DNA-Genom. Der Begriff "Parvovirus", wie er hier verwendet wird, umfasst die Familie Parvoviridae, einschließlich autonom replizierender Parvoviren und Dependoviren. Die autonomen Parvoviren beinhalten Mitglieder der Genera Parvovirus, Erythrovirus, Densovirus, Iteravirus und Contravirus. Beispielhafte autonome Parvoviren beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Mouse Minute Virus, bovines Parvovirus, canines Parvovirus, Hühner-Parvovirus, felines Panleukopenievirus, felines Parvovirus, Gänse-Parvovirus und B19-Virus. Dem Fachmann sind andere autonome Parvoviren bekannt. Siehe z. B. BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, Band 2, Kapitel 69 (3. Aufl., Lippincott-Raven Publishers).
  • Das Genus Dependovirus enthält die Adeno-assoziierten Viren (AAV), einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, AAV Typ 1, AAV Typ 2, AAV Typ 3, AAV Typ 4, AAV Typ 5, AAV Typ 6, aviäres AAV, bovines AAV, canines AAV, equines AAV und ovines AAV. Siehe z. B. BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, Band 2, Kapitel 69 (3. Aufl., Lippincott-Raven Publishers).
  • Der Begriff "Vektor" oder "Gentransportvektor", wie er hier verwendet wird, kann sich auf ein Parvovirus (z. B. AAV)-Partikel beziehen, das als Gentransportvehikel fungiert und das vDNA (d. h. das Vektorgenom) in einem Parvoviruskapsid (z. B. AAV) verpackt enthält. In bestimmtem Zusammenhang kann der Begriff "Vektor" auch verwendet werden, um Vektorgenom/vDNA zu bezeichnen.
  • Eine "heterologe Nucleotidsequenz" ist üblicherweise eine Sequenz, die in dem Virus nicht natürlich vorkommt. Alternativ kann eine heterologe Nucleotidsequenz eine Virussequenz bezeichnen, die sich in einer nicht natürlich vorkommenden Umgebung befindet (z. B. durch Verbindung mit einem Promotor, mit dem sie natürlicherweise nicht im Virus verbunden ist).
  • Der Begriff "rekombinantes Parvovirusvektorgenom", wie er hier verwendet wird, bedeutet ein Parvovirusgenom (d. h. vDNA), in das eine heterologe (z. B. fremde) Nucleotidsequenz (z. B. ein Transgen) eingebaut wurde. Ein "rekombinantes Parvoviruspartikel" umfasst ein rekombinantes Parvovirusvektorgenom, das in ein Parvoviruskapsid verpackt ist.
  • Ähnlich ist ein "rAAV-Vektorgenom" ein AAV-Genom (d. h. vDNA), die eine heterologe Nucleotidsequenz umfasst. rAAV-Vektoren benötigen nur die 145 Basen langen Terminal Repeats in cis, um Virus zu erzeugen. Alle anderen viralen Sequenzen sind verzichtbar und können in trans bereitgestellt werden (Muzyczka, (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol., 158:97). Üblicherweise behält das rAAV-Vektorgenom nur die minimalen terminalen repetitiven (TR) Sequenzen, um so die Größe des Transgens, das effizient durch den Vektor verpackt werden kann, maximieren zu können. Ein "rAAV-Partikel" umfasst ein rAAV-Vektorgenom, das in ein AAV-Kapsid verpackt ist.
  • Das erfindungsgemäße Parvoviruspartikel kann ein "Hybrid"-Partikel sein, bei dem die viralen TRs und das Viruskapsid von verschiedenen Parvoviren stammen. Vorzugsweise sind die viralen TRs und das Kapsid von verschiedenen AAV-Serotypen (wie z.B. beschrieben in der Internationalen Patentanmeldung WO 00/208004, der U.S. Provisional Application 60/248,920; und bei Chao et al., (2000) Molecular Therapy 2:619. Ähnlich kann das Parvovirus ein "chimäres" Kapsid haben (das z. B. Sequenzen von verschiedenen Parvoviren, vorzugsweise verschiedenen AAV-Serotypen enthält) oder ein "targeted" Kapsid (z. B. einen gerichteten Tropismus), wie in der Internationalen Patentanmeldung WO 00/28004 beschrieben.
  • Vorzugsweise hat das erfindungsgemäße doppelsträngige Parvoviruspartikel ein AAV-Kapsid, das ferner, wie oben beschrieben, ein chimäres oder ein "targeted" Kapsid sein kann.
  • Die erfindungsgemäßen "doppelsträngigen" ("duplexed") Parvoviruspartikel und Vektorgenome können hier synonym als "dimere" oder "selbstkomplementäre" Vektoren bezeichnet werden. Die doppelsträngigen Parvoviruspartikel der Erfindung umfassen ein Parvoviruskapsid, das eine Virion-DNA (vDNA) enthält. Die vDNA ist selbstkomplementär, so dass sie nach Freisetzung aus dem Viruskapsid eine Haarnadelstruktur bilden kann. Mit der "duplexed" vDNA scheint der Wirtszelle eine Doppelstrang-DNA zur Verfügung gestellt zu werden, die von der Wirtszelle exprimiert (d. h. transkribiert und, gegebenenfalls, translatiert) werden kann, ohne dass dafür die Synthese eines zweiten Strangs notwendig wäre, wie es bei üblichen Parvovirusvektoren der Fall ist.
  • Das doppelsträngige Parvovirusvektorgenom enthält vorzugsweise genügend Verpackungsseqenzen zur Enkapsidation in das gewählte Parvoviruskapsid (z. B. das AAV-Kapsid).
  • Dem Fachmann ist klar, dass die doppelsträngige ("duplexed") vDNA nicht unter allen Bedingungen in einer doppelsträngigen Form vorliegt, sondern die Fähigkeit besitzt, dies unter Bedingungen zu tun, die eine Reassoziation komplementärer Nucleotidbasen begünstigen. Dementsprechend bedeutet der Begriff "doppelsträngiger (duplexed) Parvovirusvektor" nicht, dass die vDNA in dem Parvoviruskapsid notwendigerweise in Duplex- oder Doppelstrangform vorliegt (dass es z. B. eine Basenpaarung zwischen den selbstkomplementären Strängen gibt). Tatsächlich ist es für den Fachmann offensichtlich, dass die vDNA, solange sie im Parvoviruskapsid verpackt ist, wahrscheinlich nicht in einer doppelsträngigen Form vorliegt.
  • Die Expression einer heterologen Nucleotidsequenz (wie nachfolgend beschrieben) wird mit den erfindungsgemäßen doppelsträngigen Parvovirusvektoren im Vergleich mit dem entsprechenden Parvovirusvektor (z.B. rAAV-Vektor) vorzugsweise "verstärkt" oder "enhanced". Vorzugsweise lässt sich eine Genexpression aus dem doppelsträngigen Parvovirusvektor deutlich rascher nachweisen als aus dem entsprechenden monomeren Parvovirusvektor. Beispielsweise lässt sich eine Genexpression in weniger als etwa 2 Wochen, vorzugsweise weniger als etwa 1 Woche, besonders bevorzugt in weniger als etwa 72 Stunden, noch bevorzugter in weniger als etwa 48 Stunden und ganz besonders bevorzugt in weniger als etwa 24 Stunden nach Verabreichung des doppelsträngigen Parvovirusvektors nachweisen. Die Genexpression lässt sich mit jedem beliebigem, auf diesem Gebiet bekannten Verfahren nachweisen, z. B. durch Nachweis von Transkription, Translation oder biologischer Aktivität oder eines phänotypischen Effekts, der aus der Expression einer heterologen Nucleotidsequenz resultiert (z. B. Blutgerinnungszeit).
  • Alternativ kann eine Genexpression von dem doppelsträngigen Parvovirusvektor insoweit "verstärkt" sein, als im Vergleich mit dem entsprechenden monomeren Parvovirusvektor (z.B. rAAV-Vektor) ein höheres Genexpressionsniveau (wie im vorhergehenden Absatz definiert) nachgewiesen wird. Vergleiche im Genexpressionsniveau können zum gleichen Zeitpunkt nach Virusverabreichung erfolgen. Alternativ kann das maximale Genexpressionsniveau, das mit jedem Vektor erreicht wird, verglichen werden.
  • Die doppelsträngigen Parvovirusvektoren der Erfindung können im Vergleich mit herkömmlichen Parvovirusvektoren vorteilhaft ein besseres Verhältnis von transduzierenden Einheiten (tu)/Partikel aufweisen. Dementsprechend erfasst die vorliegende Erfindung auch neue Parvovirusvektor-Zusammensetzungen mit verbessertem tu/Partikel-Verhältnis gegenüber Zusammensetzungen herkömmlicher Parvovirusvektoren (z.B. rAAV-Vektoren). Vorzugsweise ist das tu/Partikel-Verhältnis weniger als etwa 50:1, weniger als etwa 20:1, weniger als etwa 15:1, weniger als etwa 10:1, weniger als etwa 8:1, weniger als etwa 7:1, weniger als etwa 6:1, weniger als etwa 5:1, weniger als etwa 4:1 oder geringer. Für das tu/Partikel-Verhältnis gibt es keine bestimmte Untergrenze. Üblicherweise ist das tu/Partikel-Verhältnis größer als etwa 1:1, 2:1, 3:1 oder 4:1.
  • Der Begriff "Templat" oder "Substrat" wird hier typischerweise zur Bezeichnung einer Polynucleotidsequenz verwendet, die unter Bildung der doppelsträngigen Parvovirus-vDNA der Erfindung repliziert werden kann. Zur Vektorproduktion ist das Templat üblicherweise in eine größere Nucleotidsequenz oder ein größeres Konstrukt eingebettet, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Plasmiden, nacktem DNA-Vektor, künstlichem bakteriellem Chromosom (BAC), künstlichem Hefechromosom (YAC) oder viralen Vektoren (z.B. Adenovirus-, Herpesvirus-, Epstein-Barr-Virus-, AAV-, Baculovirus- oder Retrovirusvektoren und dergleichen). Alternativ kann das Templat stabil in das Chromosom einer Verpackungszelle eingebaut sein.
  • Der Begriff "Polypeptid", wie er hier verwendet wird, umfasst, falls nicht anders angegeben, sowohl Peptide als auch Proteine.
  • Der Begriff "Transduktion" oder "Infektion" einer Zelle durch AAV, wie er hier verwendet wird, bedeutet, dass das AAV unter Etablierung einer latenten bzw. aktiven (d. h. lytischen) Infektion in die Zelle eindringt. Siehe z. B. BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, Band 2, Kapitel 69 (3. Aufl., Lippincott-Raven Publishers). In den Ausführungsformen der Erfindung, in denen ein rAAV-Vektor in eine Zelle eingeschleust wird, um eine Nucleotidsequenz zu der Zelle zu transportieren, integriert das AAV vorzugsweise in das Genom und etabliert eine latente Infektion.
  • Doppelsträngige Parvovirusvektoren
  • Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf der Entdeckung, dass "doppelsträngige" ("duplexed") Parvovirus-DNA-Vektoren (wie oben beschrieben) vorteilhaft zum Gentransport eingesetzt werden können. Außerdem haben die vorliegenden Untersuchungen gezeigt, dass diese doppelsträngigen Parvovirusvektoren effizienter als AAV-Vektoren sein können, z. B. mit verbessertem Verhältnis von transduzierenden Einheiten/Partikel, rascherer Transgenexpression, höherem Expressionsniveau des Transgens und/oder anhaltenderer Transgenexpression. Die Erfinder haben ferner gezeigt, dass die doppelsträngigen Parvovirusvektoren der Erfindung zum Gentransport zu Wirtszellen verwendet werden können, die üblicherweise gegen AAV-Transduktion resistent sind. Diese doppelsträngigen Parvovirusvektoren haben also einen anderen (z.B. breiteren) Wirtsbereich als AAV-Vektoren.
  • Die hier offenbarten doppelsträngigen Parvovirusvektoren sind dimere selbstkomplementäre (sc) Polynucleotide (üblicherweise DNA), die in ein Viruskapsid, vorzugsweise ein Parvoviruskapsid, besonders bevorzugt ein AAV-Kapsid, verpackt sind. In gewisser Hinsicht ist das in das Kapsid verpackte Virusgenom im Wesentlichen ein "gefangenes" Replikationsintermediat, das nicht aufgelöst werden kann, um die Parvovirus-DNA-Stränge mit Plus- und Minuspolarität zu produzieren. Dementsprechend scheinen die doppelsträngigen Parvovirusvektoren der Erfindung die Notwendigkeit einer wirtszellvermittelten Synthese komplementärer DNA, die bei den herkömmlichen rekombinanten AAV (rAAV)-Vektoren inhärent ist, zu umgehen und dadurch einen der Nachteile von AAV-Vektoren zu vermeiden.
  • Dieses Ergebnis wird erreicht, indem man das Virus im Wesentlichen dimere invertierte Sequenzwiederholungen des einzelsträngigen Parvovirusvektorgenoms (z. B. AAV) so verpacken lässt, dass beide Stränge, an einem Ende verbunden, in einem einzigen infektiösen Kapsid enthalten sind. Nach Freisetzung aus dem Kapsid reassoziieren die komplementären Sequenzen unter Bildung transkriptionell aktiver doppelsträngiger DNA in der Targetzelle.
  • Die hier offenbarten doppelsträngigen Parvovirusvektoren unterscheiden sich insoweit grundlegend von herkömmlichen Parvovirusvektoren (z. B. rAAV) und vom Eltern-Parvovirus (z. B. AAV), als die vDNA infolge von Intrastrang-Basenpaarung eine doppelsträngige Haarnadelstruktur bilden kann und beide DNA-Stränge enkapsidiert werden. Der doppelsträngige Parvovirusvektor ist also funktionell eher Doppelstrang-DNA-Virusvektoren ähnlich als dem Parvovirus, von dem er abstammt.
  • Dieses Charakteristikum vermeidet einen früher erkannten Nachteil des rAAV-vermittelten Gentransfers, nämlich die geringe Neigung der gewünschten Targetzelle zur Synthese einer komplementären DNA zu dem einzelsträngigen Genom, das normalerweise von den Parvoviridae enkapsidiert wird.
  • Das Viruskapsid kann, wie oben beschrieben, von jedem beliebigen Parvovirus stammen, nämlich entweder von einem autonomen Parvovirus oder einem Dependovirus. Vorzugsweise ist das Viruskapsid ein AAV-Kapsid (z. B. ein AAV1-, AAV2-, AAV3-, AAV4-, AAV5- oder AAV6-Kapsid). Im Allgemeinen sind das AAV1-Kapsid, das AAV5-Kapsid und das AAV3-Kapsid bevorzugt. Die Wahl des Parvoviruskapsids basiert auf einer Reihe von dem Fachmann bekannten Überlegungen, z. B. der Art der Targetzelle, dem gewünschten Expressionsniveau, der Art der zu exprimierenden heterologen Nucleotidsequenz, Fragen der Virusproduktion und dergleichen. Beispielsweise kann das AAV1-Kapsid vorteilhaft für Skelettmuskel, Leber und Zellen des zentralen Nervensystems (z. B. Hirn); AAV5 für Zellen der Luftwege und der Lunge; AAV3 für Knochenmarkszellen; und AAV4 für bestimmte Zellen im Hirn (z. B. Anhangszellen) eingesetzt werden.
  • Das Parvoviruspartikel kann ein "Hybrid"-Partikel sein, in dem die viralen TRs und das Viruskapsid von unterschiedlichen Parvoviren stammen. Vorzugsweise sind die viralen TRs und das Kapsid von unterschiedlichen AAV-Serotypen (z. B. wie beschrieben in der Internationalen Patentanmeldung WO 00/28004, der U.S. Provisional Application 60/248,920; und bei Chao et al., (2000) Molecular Therapy 2:619. Ferner kann das Parvovirus ein "chimäres" Kapsid (das z. B. Sequenzen von verschiedenen Parvoviren enthält) oder ein "targeted" Kapsid (z. B. einen gerichteten Tropismus) haben, wie in diesen Veröffentlichungen beschrieben wird.
  • Der Begriff "doppelsträngiges ("duplexed") Parvoviruspartikel", wie er hier verwendet wird, umfasst Hybridviruspartikel, chimäre Viruspartikel und "targeted" Viruspartikel. Vorzugsweise hat das doppelsträngige Parvoviruspartikel ein AAV-Kapsid, das wie oben beschrieben auch ein chimäres oder ein "targeted" Kapsid sein kann.
  • Ein erfindungsgemäßer doppelsträngiger Parvovirusvektor kann mit jedem geeigneten Verfahren produziert werden. Vorzugsweise ist das Templat zur Produktion der vDNA ein Templat, das bevorzugt zu einer dimeren und nicht zu einer monomeren vDNA führt (d. h. der größte Teil der produzierten vDNAs ist dimer), die die Fähigkeit besitzt, eine doppelsträngige vDNA zu bilden. Vorzugsweise sind wenigstens etwa 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % oder mehr der Replikationsprodukte des Templats dimer.
  • In einer besonderen Ausführungsform ist das Templat ein DNA-Molekül, das ein oder mehrere terminate repetitive (TR) Sequenzen umfasst. Das Templat umfasst ferner einen modifizierten TR, der nicht durch die Parvovirus-Rep-Proteine aufgelöst werden kann, (d. h. es kann kein Strangbruch erfolgen). Bei der Replikation führt die Unfähigkeit von Rep-Protein zur Auflösung des modifizierten TR zu einem stabilen Intermediat mit den zwei "Monomeren", die durch den nicht auflösbaren TR kovalent verbunden sind. Dieses "duplexed" Molekül kann in das Parvovirus (AAV)-Kapsid verpackt werden, um so einen neuen duplexed Parvovirusvektor zu produzieren.
  • Ohne an eine bestimmte Theorie für die Erfindung gebunden sein zu wollen, ist es wahrscheinlich, dass das Viriongenom, solange es im Viruskapsid verpackt ist, in einer einzelsträngigen Form vorliegt. Es scheint, dass sich das dimere Molekül bei Freisetzung aus dem Kapsid bei der Virusinfektion "zurückfaltet" oder reassoziiert und durch Intrastrang-Basenpaarung ein doppelsträngiges Molekül bildet, wobei die nicht auflösbare TR-Sequenz an einem Ende eine kovalent geschlossene Haarnadelstruktur bildet. Diese doppelsträngige vDNA macht die wirtszellvermittelte Synthese des zweiten Strangs, die als ein geschwindigkeitsbestimmender Schritt für die AAV-Transduktion postuliert wurde, überflüssig.
  • Bei bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Templat ferner (eine) heterologe Nucleotidsequenz(en) (wie oben beschrieben), die zum Transport zu einer Targetzelle verpackt werden sollen. Gemäß dieser besonderen Ausführungsform befindet sich die heterologe Nucleotidsequenz zwischen den viralen TRs an beiden Enden des Substrats. Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen sind die cap-Gene von Parvovirus (z. B. AAV) und die rep-Gene von Parvovirus (z. B. AAV) aus dem Templat (und der von diesem produzierten vDNA) deletiert. Diese Konfiguration maximiert die Größe der heterologen Nucleinsäuresequenz(en), die vom Parvoviruskapsid getragen werden kann (können).
  • In einer besonderen Ausführungsform enthält das Templat zur Produktion der erfindungsgemäßen doppelsträngigen Parvovirusvektoren wenigstens einen TR an den 5'- und 3'-Enden, der eine interessierende heterologe Nucleotidsequenz flankiert (wie nachfolgend beschrieben). Der TR an einem Ende des Substrats ist nicht auflösbar, d. h. er kann nicht durch Rep-Protein aufgelöst werden (es efolgt kein Strangbruch). Während der Replikation führt die Unfähigkeit von Rep-Protein, einen der TRs aufzulösen, zu einem stabilen Intermediat, in dem die zwei "Monomeren" durch den nicht-funktionellen (d. h. den nicht auflösbaren) TR kovalent miteinander verbunden sind. Die heterologe Nucleotidsequenz kann bezüglich dem nicht auflösbaren TR in jeder Orientierung vorliegen.
  • Der Begriff "flankiert" soll nicht angeben, dass die Sequenzen benachbart sein müssen. Im Beispiel des vorhergehenden Absatzes können beispielsweise zwischen der heterologen Nucleotidsequenz und dem TR intervenierende Sequenzen liegen. Eine Sequenz, die von zwei anderen Elementen "flankiert" wird, bedeutet, dass ein Element 5' zu der Sequenz lokalisiert ist und das andere 3' zu der Sequenz lokalisiert ist; dazwischen können sich jedoch intervenierende Sequenzen befinden.
  • Gemäß dieser Ausführungsform ist das Templat zur Produktion der duplexed Parvovirus-vDNA der Erfindung vorzugsweise etwa halb so groß wie das Wildtyp-Parvovirusgenom (z. B. AAV), das dem Kapsid entspricht, in das die vDNA verpackt wird. Anders ausgedrückt entspricht das Templat vorzugsweise etwa 40 % bis etwa 55 % des Wildtyps (wt), besonders bevorzugt etwa 45 % bis etwa 52 % des wt. Die von diesem Templat produzierte duplexed vDNA hat also vorzugsweise eine Gesamtgröße, die in etwa der Größe des Wildtyp-Parvovirusgenoms (z. B. AAV) gleicht, das dem Kapsid entspricht, in das die vDNA verpackt wird, z. B. etwa 80 % bis etwa 105 % des wt. Im Fall von AAV ist dem Fachmann allgemein bekannt, dass das AAV-Kapsid das Verpacken von vDNA, die in ihrer Größe deutlich vom wtAAV-Genom abweicht, nicht begünstigt. Im Falle eines AAV-Kapsids hat die doppelsträngige vDNA vorzugsweise eine Größe von etwa 5,2 kb oder weniger. Bei anderen Ausführungsformen hat die doppelsträngige vDNA vorzugsweise eine Länge von mehr als etwa 3,6, 3,8, 4,0, 4,2 oder 4,4 kb und/oder von weniger als eta 5,4, 5,2, 5,0 oder 4,8 kb.
  • Anders ausgedrückt hat (haben) die heterologe(n) Nucleotidsequenz(en) üblicherweise eine Länge von weniger als etwa 2,5 kb (besonders bevorzugt weniger als etwa 2,4 kb, noch bevorzugter weniger als etwa 2,2 kb und ganz besonders bevorzugt weniger als etwa 2,1 kb), um die Verpackung des doppelsträngigen Templats durch das Parvoviruskapsid (z. B. AAV) zu erleichtern.
  • Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Templat selbst doppelsträngig ("duplexed), d. h. ein dimeres selbstkomplementäres Molekül. Gemäß dieser Ausführungsform umfasst das Templat an jedem Ende einen auflösbaren TR. Das Templat umfasst ferner einen zentral lokalisierten nicht auflösbaren TR (wie oben beschrieben). Mit anderen Worten besitzt jede Hälfte des Templats auf jeder Seite des nicht auflösbaren TR ungefähr die gleiche Länge. Jede Hälfte des Templats, nämlich zwischen dem auflösbaren und dem nicht auflösbaren TR, umfasst ein oder mehrere interessierende heterologe Nucleotidsequenzen. Die heterologe(n) Nucleotidsequenz(en) jeder Hälfte des Moleküls ist (sind) von einem auflösbaren TR und dem zentralen nicht auflösbaren TR flankiert.
  • Die Sequenzen in jeder Hälfte des Templats sind im Wesentlichen komplementär (d. h. die Komplementarität in der Nucleotidsequenz beträgt wenigstens etwa 90 %, 95 %, 98 %, 99 % oder mehr), so dass die Replikationsprodukte des Templats aufgrund von Basenpaarung zwischen den komplementären Sequenzen doppelsträngige Moleküle bilden können. Mit anderen Worten ist das Templat im Wesentlichen eine invertierte Sequenzwiederholung, wobei die beiden Hälften durch den nicht auflösbaren TR miteinander verknüpft sind.
  • Vorzugsweise ist (sind) die heterologe(n) Nucleotidsequenz(en) in jeder Hälfte des Templats im Wesentlichen vollständig selbstkomplementär (d. h. sie enthält (enthalten) eine nicht signifikante Anzahl ungepaarter Basen oder gar keine ungepaarten Basen). Es ist ferner bevorzugt, dass die beiden Hälften der Nucleotidsequenz im Wesentlichen vollständig selbstkomplementär sind.
  • Entsprechend dieser Ausführungsform hat das Templat (und die von diesem produzierte vDNA) bevorzugt in etwa die gleiche Größe wie das natürlicherweise von dem Parvoviruskapsid (z. B. AAV) enkapsidierte wt-Genom, d.h. um eine effiziente Verpackung in das Parvoviruskapsid zu erleichtern. Im Falle eines AAV-Kapsids hat das Templat beispielsweise vorzugsweise etwa die Größe des wtAAV-Genoms. Bei besonderen Ausführungsformen ist die Größe des Templats etwa 5,2 kb oder weniger. Bei anderen Ausführungsformen hat das Templat vorzugsweise eine Länge von mehr als etwa 3,6, 3,8, 4,0, 4,2 oder 4,4 kb und/oder von weniger als etwa 5,4, 5,2, 5,0 oder 4,8 kb. Anders ausgedrückt hat das Templat vorzugsweise eine Größe im Bereich von 80 % bis 105 % des Wildtyp-Parvovirusgenoms (z. B. AAV).
  • Die (auflösbaren und nicht auflösbaren) TR(s) sind vorzugsweise AAV-Sequenzen, wobei die Serotypen 1, 2, 3, 4, 5 und 6 bevorzugt sind. Der Begriff "Terminal Repeat" oder "terminale repetitive Sequenz" umfasst synthetische Sequenzen, die als ein invertierter terminaler AAV-Repeat fungieren, so wie die "Doppel-D-Sequenz", die in dem US-Patent 5,478,745 von Samulski et al. beschrieben wird. Auflösbare AAV-TRs gemäß der vorliegenden Erfindung benötigen keine Wildtyp-TR-Sequenz (z.B. kann eine Wildtyp-Sequenz durch Insertion, Deletion, Trunkierung oder Missense-Mutationen verändert sein), solange der TR die gewünschten Funktionen vermittelt, z. B. Virusverpackung, Integration und/oder Provirus-Rescue und dergleichen. Üblicherweise, aber nicht notwendig, stammen die TRs vom gleichen Parvovirus, z. B. sind beide TR-Sequenzen von AAV2.
  • Der Fachmann erkennt, dass das oder die virale(n) Rep-Protein(e), das (die) zur Herstellung der erfindungsgemäßen doppelsträngigen Vektoren verwendet wird (werden), unter Berücksichtigung der Quelle der viralen TRs ausgewählt werden. Beispielsweise ist die Wechselwirkung des AAV5-TR mit dem AAV5-Rep-Protein effizienter.
  • Die Genomsequenzen der verschiedenen autonomen Parvoviren und der verschiedenen AAV-Serotypen sowie die Sequenzen der TRs, Kapsiduntereinheiten und Rep-Proteine sind dem Fachmann bekannt. Solche Sequenzen lassen sich in der Literatur oder in öffentlich zugänglichen Datenbanken wie GenBank finden. Siehe z. B. GenBank Accession Numbers NC 002077, NC 001863, NC 001862, NC 001829, NC 001729, NC 001701, NC 001510, NC 001401, AF063497, U89790, AF043303, AF028705, AF028704, J02275, J01901, J02275, X01457, AF288061, AH009962, AY028226, AY028223, NC 001358, NC 001440, siehe z. B. auch Chiorini et al., (1999) J. Virology 73:1309; Xiao et al., (1999) J. Virology 73:3994; Muramatsu et al. (1996) Virology 221:208; Internationale Patentveröffentlichungen WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; US-Patent 6,156, 303. Eine frühe Beschreibung der TR-Sequenzen von AAV1, AAV2 und AAV3 findet sich bei Xiao, X., (1996) "Characterization of Adeno-associated virus (AAV) DNA replication and integration"; Ph. D. Dissertation, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA.
  • Der nicht auflösbare TR kann nach jedem beliebigen, dem Fachmann bekannten Verfahren produziert werden. Beispielsweise verschiebt eine Insertion in den TR die Strangbruchstelle (d. h. trs) und führt zu einem nicht auflösbaren TR. Die Bezeichnungen der verschiedenen Regionen oder Elemente innerhalb des TR sind dem Fachmann bekannt. Eine Veranschaulichung der Regionen innerhalb des AAV-TR findet sich in 6 (siehe auch BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, Band 2, Kapitel 69, 5, 3. Aufl., Lippincott-Raven Publishers). Die Insertion erfolgt vorzugsweise in die Sequenz der Terminal Resolution Site (trs). Alternativ kann die Insertion an einer Stelle zwischen dem Rep-bindenden Element (RBE) innerhalb des A-Elements und der trs im D-Element erfolgen (siehe 6). Die Core-Sequenz der AAV-trs-Stelle ist dem Fachmann bekannt und wurde von Snyder et al., (1990) Cell 60:105; Snyder et al., (1993) J. Virology 67:6096; Brister & Muzyczka, (2000) J. Virology 74:7762; Brister & Muzyczka, (1999) J. Virology 73:9325 beschrieben. Beispielsweise beschreiben Brister & Muzyczka, (1999) J. Virology 73:9325 eine trs-Core-Sequenz von 3'-CCGGT/TG-5' im D-Element. Snyder et al., (1993) J. Virology 67:6096 identifizieren die minimale trs-Sequenz als 3'-GGT/TGA-5', was die von Brister & Muzyczka identifizierte Sequenz deutlich überlappt.
  • Vorzugsweise befindet sich die Insertion in der Region der trs-Stelle. Die Insertion kann jede geeignete Länge besitzen, die die Auflösung des TR reduziert oder im Wesentlichen eliminiert (z. B. um 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % oder mehr). Vorzugsweise hat die Insertion wenigstens etwa 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20 oder 30 Nucleotide oder mehr. Für die Größe der inserierten Sequenz gibt es keine besonderen Obergrenzen, solange ausreichend Virusreplikation und Verpackung erfolgen (z. B. kann die Insertion 50, 100, 200 oder 500 Nucleotide lang oder länger sein).
  • Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann der TR wegen einer Deletion der trs-Stelle nicht mehr auflösbar sein. Die Deletionen können 1, 3, 5, 8, 10, 15, 20, 30 Nucleotide oder weiter über die trs-Stelle hinausgehen, solange das Templat die gewünschten Funktionen behält. Zusätzlich zur trs-Stelle kann das D-Element ganz oder teilweise deletiert sein. Die Deletionen können ferner in das A-Element reichen, der Fachmann erkennt jedoch, dass es vorteilhaft sein könnte, das RBE im A-Element zu erhalten, z. B. um ein effizientes Verpacken zu erleichtern. Die Deletionen in das A-Element können 2, 3, 4, 5, 8, 10 oder 15 Nucleotide lang sein oder mehr, solange der nicht auflösbare TR alle anderen gewünschten Funktionen behält. Außerdem ist es bevorzugt, dass die Parvovirussequenzen (z.B. AAV) jenseits des D-Elements außerhalb der TR-Sequenz (z. B. rechts vom D-Element in 6), ganz oder teilweise deletiert sind, um eine Genkonversion, die den veränderten TR repariert, zu verhindern.
  • Gemäß einer weiteren Alternative kann die Sequenz an der Strangbruchstelle so mutiert werden, dass die Auflösung durch das Rep-Protein reduziert oder im Wesentlichen eliminiert ist. Beispielsweise können die Basen A und/oder C durch die Basen G und/oder T an oder nahe der Strangbruchstelle substituiert werden. Die Wirkungen von Substitutionen an der Terminal Resolution Site auf die Spaltung durch Rep wurden von Brister & Muzyczka, (1999) J. Virology 73:9325 beschrieben. Gemäß einer weiteren Alternative können Nucleotidsubstitutionen in den Bereichen um die Strangbruchstelle, von denen postuliert wurde, dass sie eine Stem-Loop-Struktur bilden, ebenfalls verwendet werden, um die Spaltung durch Rep an der Terminal Resolution Site zu reduzieren (s.o.).
  • Der Fachmann erkennt, dass die Änderungen im nicht auflösbaren TR so gewählt werden können, dass gegebenenfalls gewünschte Funktionen des veränderten TRs (z. B. Verpackung, Rep-Erkennung, sequenzspezifische Integration und dergleichen) erhalten bleiben.
  • Bei bevorzugteren Ausführungsformen ist der TR gegenüber dem Genkonversionsprozess resistent, wie von Samulski et al., (1983) Cell 33:135 beschrieben. Eine Genkonversion am nicht auflösbaren TR restauriert die trs-Stelle, was einen auflösbaren TR generiert und zu einer Zunahme der Häufigkeit monomerer Replikationsprodukte führt. Genkonversion erfolgt durch homologe Rekombination zwischen dem auflösbaren TR und dem veränderten TR.
  • Eine Strategie, um die Genkonversion zu reduzieren, besteht darin, Virus mit DNA-Reparatur-defizienten Zelllinien (vorzugsweise einer Säugerzelllinie), wie dem Fachmann bekannt, zu produzieren, da diese Zelllinien in ihrer Fähigkeit beeinträchtigt sind, die in das Virustemplat eingeführten Mutationen zu reparieren.
  • Alternativ können Template mit einer deutlich reduzierten Genkonversionsrate erzeugt werden, indem man in den nicht auflösbaren TR eine Region mit Nichthomologie einführt. Nichthomologie in der Region, die das trs-Element zwischen dem nicht auflösbaren TR und dem unveränderten TR auf dem Templat umgibt, reduziert die Genkonversion oder eliminiert sie sogar im Wesentlichen.
  • Zur Erzeugung einer Region mit Nichthomologie kann jede zweckmäßige Insertion oder Deletion in den nicht auflösbaren TR eingeführt werden, solange die Genkonversion verringert oder im Wesentlichen eliminiert wird. Strategien, die zur Erzeugung von Nichthomologie Deletionen verwenden, sind bevorzugt. Ferner ist es bevorzugt, dass die Deletion die Replikation und die Verpackung des Templats nicht unverhältnismäßig beeinträchtigt. Im Falle einer Deletion kann ein und dieselbe Deletion genügen, um die Auflösung der trs-Stelle zu beeinträchtigen und die Genkonversion zu reduzieren.
  • Gemäß einer weiteren Alternative kann die Genkonversion durch Insertionen in den nicht auflösbaren TR oder, alternativ, in das A-Element zwischen der RBE- und der trs-Stelle reduziert werden. Die Insertion hat üblicherweise eine Länge von wenigstens etwa 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20 oder 30 Nucleotiden oder mehr. Es gibt keine besondere Obergrenze für die Größe der eingebauten Sequenz, die 50, 100, 200 oder 500 Nucleotide lang oder länger sein kann, es ist jedoch bevorzugt, dass die Insertion Replikation und Verpackung des Templats nicht unverhältnismäßig beeinträchtigt.
  • Bei anderen Ausführungsformen kann der nicht auflösbare TR ein natürlich vorkommender TR (oder eine veränderte Form davon) sein, der unter den gegebenen Bedingungen nicht auflösbar ist. Beispielsweise ist es möglich, dass der nicht auflösbare TR von den Rep-Proteinen, die zur Produkten der vDNA von dem Templat verwendet werden, nicht erkannt werden. Beispielsweise kann der nicht auflösbare TR eine autonome Parvovirussequenz sein, die nicht von AAV-Rep-Proteinen erkannt wird. Entsprechend einem weiteren Veranschaulichungsbeispiel können der auflösbare TR und die Rep-Proteine von einem AAV-Serotyp (z.B. AAV2) sein, und der nicht auflösbare TR ist von einem anderen AAV-Serotyp (z. B. AAV5), der von den AAV2-Rep-Proteinen nicht erkannt wird.
  • Gemäß einer weiteren Alternative kann die nicht auflösbare Sequenz jede beliebige invertierte Sequenzwiederholung sein, die eine Haarnadelstruktur bildet und nicht von den Rep-Proteinen gespalten werden kann.
  • Gemäß noch einer weiteren Alternative kann ein Templat mit der Größe eines halben Genoms verwendet werden, um ein Parvoviruspartikel zu produzieren, das eine doppelsträngige vDNA trägt, produziert von einem Templat mit der Größe eines halben Genoms, wie hier in den Beispielen und bei Hirata & Russell, (2000) J. Virology 74:4612, beschrieben wird. Dieser Artikel beschreibt die Verpackung von paarweisen Monomeren und transienten RF-Intermediaten, wenn AAV-Genome auf weniger als die Hälfte der Größe des wtAAV-Genoms (<2,5 kb) verkleinert wurden. Diese Forscher fanden, dass monomere Genome die bevorzugten Substrate für eine Genreparatur mittels homologer Rekombination waren und dass doppelsträngige Genome bei diesem Test weniger gut als monomere Genome funktionierten. Dieser Artikel untersuchte nicht die Verwendung doppelsträngiger Genome als Vektoren zum Gentransport und legte dies auch nicht nahe.
  • Gemäß dieser Ausführungsform ist das Templat vorzugsweise etwa halb so groß wie die vDNA, die durch das Parvoviruskapsid verpackt werden kann. Für ein AAV-Kapsid ist das Templat beispielsweise vorzugsweise etwa halb so groß wie das wtAAV-Genom, wie oben beschrieben.
  • Das Templat (wie oben beschrieben) wird repliziert, um ein erfindungsgemäßes "duplexed" Vektorgenom (vDNA) zu produzieren, das unter geeigneten Bedingungen eine doppelsträngige DNA bilden kann. Das "duplexed" Molekül ist im Wesentlichen selbstkomplementär, so dass es in der Lage ist, eine doppelsträngige Virus-DNA zu bilden (d. h. wenigstens 90 %, 95 %, 98 %, 99 % Komplementarität in der Nucleotidsequenz oder mehr). Basenpaarung zwischen einzelnen Nucleotidbasen oder Polynucleotidsequenzen ist dem Fachmann allgemein bekannt. Vorzugsweise ist die doppelsträngige Parvovirus-Virus-DNA im Wesentlichen vollständig selbstkomplementär (d. h. sie enthält keine oder eine nicht signifikante Anzahl ungepaarter Basen). Insbesondere ist bevorzugt, dass die heterologe(n) Nucleotidsequenz(en) (z. B. die von der Zelle zu transkribierenden Sequenzen) im Wesentlichen vollständig selbstkomplementär ist (sind).
  • Im Allgemeinen können die doppelsträngigen Parvoviren bis zu einem solchen Maße nichtkomplementär sein, dass die Expression der heterologen Nucleotidsequenz(en) von dem doppelsträngigen Parvovirusvektor effizienter ist als von einem entsprechenden monomeren Vektor.
  • Die "duplexed" Parvoviren der vorliegenden Erfindung liefern der Wirtszelle ein doppelsträngiges Molekül, das einen der Nachteile der rAAV-Vektoren vermeidet, nämlich dass die Wirtszelle die einzelsträngige rAAV-vDNA in eine doppelsträngige DNA überführen muss. Die Anwesenheit wesentlicher Bereiche mit Nichtkomplementarität innerhalb der Virion-DNA, insbesondere in der (den) heterologen Nucleotidsequenz(en), wird wahrscheinlich von der Wirtszelle erkannt und führt dazu, dass DNA-Reparaturmechanismen eingreifen, um die ungepaarten Basen zu korrigieren, was den vorteilhaften Eigenschaften der doppelsträngigen Parvovirusvektoren entgegengewirkt, z.B. reduzieren oder eliminieren die erfindungsgemäßen Vektoren die Notwendigkeit, dass die Wirtszelle das Virustemplat prozessieren muss.
  • Produktion von doppelsträngigen Parvovirusvektoren
  • Im Allgemeinen lassen sich Verfahren zur Herstellung von AAV-Vektoren auch zur Herstellung der doppelsträngigen Parvovirusvektoren der Erfindung verwenden; der Hauptunterschied zwischen den Verfahren ist die Struktur des zu verpackenden Templats oder Substrats. Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen doppelsträngigen Parvovirusvektors wird ein wie oben beschriebenes Templat verwendet, um das enkapsidierte Virusgenom zu produzieren.
  • Das oben beschriebene Templat ist vorzugsweise ein DNA-Substrat und kann in jeder beliebigen, dem Fachmann bekannten Form bereitgestellt werden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Plasmiden, nackem DNA-Vektor, artifiziellem bakteriellen Chromosom (BAC), artifiziellem Hefechromosom (YAC) oder Virusvektoren (z.B. Adenovirus-, Herpesvirus-, Epstein-Barr-Virus-, AAV-, Baculovirus- und Retrovirusvektoren und dergleichen). Alternativ kann das Templat stabil in das Genom einer Verpackungszelle eingebaut sein.
  • Bei einer besonderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Parvovirusvektoren "duplexed" monomere vDNA tragen, die halb so groß wie das Genom ist, wie hier in den Beispielen beschrieben wird. Diese Maßnahme, um Zellen eine doppelsträngige Parvovirus-Virion-DNA (z.B. AAV) verfügbar zu machen, macht sich die "Rolling-Hairpin"-Replikation zunutze, bei der monomere vDNA aus dimeren "Inverted Repeat"-Intermediaten generiert wird (Cavalier-Smith et al., (1974) Nature 250:467; Straus et al., (1976) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 73:742). Wenn das Genom klein genug ist, können die dimeren invertierten Sequenzwiederholungen selbst in das Virion enkapsidiert werden. Dieser Ansatz generiert eine gemischte Population monomerer und dimerer Moleküle. Die doppelsträngigen Parvovirusvektoren können nach bekannten Methoden isoliert werden, z. B. Trennung über einen Cäsiumchlorid-Dichtegradienten.
  • Erfindungsgemäße doppelsträngige Parvoviruspartikel können nach jedem beliebigen, dem Fachmann bekannten Verfahren produziert werden, z.B. durch Einschleusen des zu replizierenden und verpackenden Templats in eine permissive Zelle oder Verpackungszelle, so wie diese Begriffe vom Fachmann verstanden werden (z. B. kann eine "permissive" Zelle durch das Virus infiziert oder transduziert werden; eine "Verpackungszelle" ist eine stabil transformierte Zelle, die Helferfunktionen bereitstellt.
  • Bei einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Herstellung eines doppelsträngigen Parvoviruspartikels bereitgestellt, umfassend: Bereitstellen für eine Zelle, die für eine Parvovirus-Replikation permissiv ist, (a) eine Nucleotidsequenz, die ein Templat zur Herstellung von erfindungsgemäßem Vektorgenom codiert (wie oben ausführlich beschrieben); (b) Nucleotidsequenzen, die zur Replikation des Templats ausreichen, zur Produktion eines Vektorgenoms; (c) Nucleotidsequenzen, die ausreichen, um das Vektorgenom in ein Parvoviruskapsid zu verpacken, unter Bedingungen, die zur Replikation und Verpackung des Vektorgenoms in das Parvoviruskapsid ausreichen, wodurch in der Zelle doppelsträngige Parvoviruspartikel produziert werden, die das Vektorgenom enkapsidiert im Parvoviruskapsid umfassen. Vorzugsweise sind die für die Parvovirusreplikation und/oder das Parvoviruskapsid codierenden Sequenzen AAV-Sequenzen.
  • Zum Einschleusen der das Templat tragenden Nucleotidsequenz in einen zellulären Wirt zur Replikation und Verpackung kann jedes beliebige Verfahren verwendet werden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Elektroporation, Calciumphosphatfällung, Mikroinjektion, kationische oder anionische Liposomen und Liposomen in Kombination mit einem Kernlokalisierungssignal. Bei Ausführungsformen, bei denen das Templat von einem Virusvektor bereitgestellt wird, können Standardverfahren zur Virusinfektion verwendet werden.
  • Zur Produktion der doppelsträngigen Vektoren kann jede dem Fachmann bekannte geeignete permissive Zelle oder Verpackungszelle eingesetzt werden. Säugerzellen sind bevorzugt. Ebenfalls bevorzugt sind trans-komplementierende Verpackungszelllinien, die Funktionen bereitstellen, die von einem replikationsdefizienten Helfervirus deletiert wurden, z. B. 293-Zellen oder andere E1a-trans-komplementierende Zellen. Ebenso bevorzugt sind dem Fachmann bekannte Säugerzellen oder -zelllinien, die DNA-Reparatur-defizient sind, da diese Zelllinien in ihrer Fähigkeit beeinträchtigt sind, die in das Virustemplat eingeführten Mutationen zu reparieren.
  • Das Templat kann einige oder alle cap- und rep-Gene des Parvovirus (z. B. AAV) enthalten. Vorzugsweise werden jedoch einige oder alle cap- und rep-Funktionen in trans zur Verfügung gestellt, indem ein oder mehrere Verpackungsvektoren in die Zellen eingeschleust werden, die die Kapsid- und/oder Rep-Proteine codieren. Ganz besonders bevorzugt codiert das Templat keine Kapsid- oder Rep-Proteine. Alternativ wird eine Verpackungszelllinie verwendet, die stabil transformiert ist, um die cap- und/oder rep-Gene zu exprimieren (siehe z. B. Gao et al., (1998) Human Gene Therapy 9:2353; Inoue et al., (1998) J. Virol. 72:7024; US-Patent 5,837,484; WO 98/27207; US-Patent 5,658,785; WO 96/17947).
  • Daneben werden dem Vektor vorzugsweise Helfervirusfunktionen zur Verfügung gestellt, damit neue Viruspartikel gebildet werden. Sowohl Adenovirus als auch Herpes simplex-Virus können als Helferviren für AAV dienen. Siehe z. B. BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, Band 2, Kapitel 69 (3. Aufl., Lippincott-Raven Publishers). Beispielhafte Helferviren umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Herpes simplex (HSV), Varizella Zoster, Cytomegalovirus und Epstein-Barr-Virus. Die Infektionsmultiplizität (MOI) und die Dauer der Infektion hängen vom verwendeten Virustyp und der eingesetzten Verpackungszellinie ab. Es kann jeder zweckmäßige Helfervektor verwendet werden. Vorzugsweise sind der oder die Helfervektoren Plasmide, beispielsweise wie bei Xiao et al., (1998) J. Virology 72:2224 beschrieben. Der Vektor kann mit jedem geeigneten, dem Fachmann bekannten Verfahren wie oben beschrieben in die Verpackungszelle eingeschleust werden.
  • Bei einem Verfahren können die erfindungsgemäßen doppelsträngigen Parvovirusvektoren produziert werden, indem man mit Adenovirus infizierte humane Zellen mit einem rep/cap-Vektor, der AAV-Verpackungsfunktionen codiert, und dem Templat, das die AAV-vDNA codiert, cotransfiziert (Samulski et al., (1989) J. Virology 63:3822). Unter optimierten Bedingungen kann dieses Verfahren bis zu 109 infektiöse Viruspartikeleinheiten pro ml liefern. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist jedoch, dass es zur Coproduktion von kontaminierendem Wildtyp-Adenovirus führt. Da von mehreren Adenovirusproteinen (z. B. Faser, Hexon usw.) bekannt ist, dass sie bei Menschen zu einer zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL)-Immunreaktion führen (Yang und Wilson, (1995) J. Immunol. 155:2564; Yang et al., (1995) J. Virology 69:2004; Yang et al., (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:4407), stellt dies einen schwerwiegenden Nachteil dar, wenn diese rAAV-Präparate verwendet werden (Monahan et al., (1998) Gene Therapy 5:40).
  • Vektormaterial frei von kontaminierendem Helfervirus kann mit beliebigen dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden. Beispielsweise können doppelsträngiges Virus und Helfervirus leicht auf Basis der Größe unterschieden werden. Das doppelsträngige Virus kann auch auf Basis seiner Affinität für ein Heparinsubstrat vom Helfervirus abgetrennt werden (Zolotukhin et al. (1999) Gene Therapy 6:973). Vorzugsweise werden deletierte replikationsdefiziente Helferviren verwendet, so dass kontaminierende Helferviren nicht replikationskompetent sind. Als weitere Alternative kann ein Adenovirushelfer eingesetzt werden, der die späten Gene nicht exprimiert, da nur die Expression der frühen Adenovirusgene nötig ist, um die Verpackung des doppelsträngigen Virus zu vermitteln. Adenovirusmutanten, die in der späten Genexpression defizient sind, sind dem Fachmann bekannt (z. B. die Adenovirusmutanten ts 100K und ts 149).
  • Ein bevorzugtes Verfahren zur bereitstellung von Helferfunktionen verwendet ein nicht-infektiöses Adenovirus-Miniplasmid, das alle Helfergene trägt, die für eine effiziente AAV-Produktion erforderlich sind (Ferrari et al., (1997) Nature Med. 3:1295; Xiao et al., (1998) J. Virology 72:2224). Die mit Adenovirus-Miniplasmiden erhaltenen rAAV-Titer sind 40-mal höher als die, die mit herkömmlichen Verfahren zur Infektion mit Wildtyp-Adenovirus erhalten wurden (Xiao et al., (1998) J. Virology 72:2224). Dieser Ansatz macht eine Cotransfektiion mit Adenovirus überflüssig (Holscher et al., (1994), J. Virology 68:7169; Clark et al., (1995) Hum. Gene Ther. 6:1329; Trempe und Yang, (1993) in: Fifth Parvovirus Workshop, Crystal River, FL).
  • Es wurden auch andere Verfahren zur Produktion von rAAV-Stämmen beschrieben, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Verfahren, die die rep- und cap-Gene auf getrennte Expressionskassetten aufspalten, um die Bildung von replikationskompetentem AAV zu verhindern (siehe z. B. Allen et al., (1997) J. Virol. 71:6816), Verfahren, die Verpackungszelllinien einsetzen (siehe z. B. Gao et al., (1998) Human Gene Therapy 9:2353; Inoue et al., (1998) J. Virol. 72:7024; US-Patent 5,837,484; WO 98/27207; US-Patent 5,658,785; WO 96/17947) und anderen helfervirusfreien Systemen (siehe z. B. US-Patent 5,945,335 von Colosi).
  • Herpesvirus kann ebenfalls als Helfervirus bei Verpackungsverfahren für AAV verwendet werden. Hybrid-Herpesviren, die das (die) AAV-Rep-Proteine) codieren, können anpassbarere AAV-Vektor-Produktionsschemata vorteilhaft begünstigen. Ein Herpes simplex-Virus Typ I (HSV-1)-Hybridvektor, der die AAV-2-rep- und -cap-Gene exprimiert, wurde beschrieben (Conway et al., (1999) Gene Therapy 6:986 und WO 00/17377.
  • Zusammengefasst werden einer Zelle (z. B. einer permissiven Zelle oder einer Verpackungszelle) das zu replizierende und verpackende Virustemplat, die Parvovirus-cap-Gene, geeignete Parvovirus-rep-Gene und (vorzugsweise) Helferfunktionen zur Verfügung gestellt, um Parvoviruspartikel zu produzieren, die das doppelsträngige Genom tragen (d. h. das Genom ist fähig, nach Freisetzung aus dem Virus eine "Snap Back"-DNA oder eine selbstkomplementäre DNA zu bilden. Die gemeinsame Expression der rep- und cap-Gene, die von dem Templat und/oder dem (den) Verpackungsvektoren) und/oder der stabil transformierten Verpackungszelle codiert werden, führt zur Produktion eines Parvoviruspartikels, bei dem ein Parvoviruskapsid ein erfindungsgemäßes doppelsträngiges Parvovirusgenom verpackt. Die doppelsträngigen Parvoviruspartikel können sich in der Zelle zusammenbauen und dann nach irgendeinem dem Fachmann bekannten Verfahren gewonnen werden.
  • Alternativ können auch Ansätze zur in vitro-Verpackung verwendet werden, wie sie dem Fachmann bekannt sind, um die hier beschriebenen dimeren vDNA-Template zu produzieren. Beispielsweise kann die "duplexed" vDNA-Sequenz unter Verwendung des Einzelstrangphagen M13 in Bakterien amplifiziert werden. Die auflösbaren TRs an jedem Ende der von M13 getragenen vDNA reassoziieren unter Bildung einer doppelsträngigen Sequenz, die mit einem geeigneten Restriktionsenzym gespalten werden kann, um die dimere vDNA aus dem M13-Gerüst auszuschneiden. Gemäß noch einer weiteren Alternative können PCR oder andere geeignete Amplifikationsmethoden verwendet werden, um die doppelsträngige vDNA-Sequenz von einem dimeren selbstkomplementären Templat, wie oben beschrieben, zu amplifizieren.
  • Die hier offenbarten Reagenzien und Verfahren können verwendet werden, um hochtitriges Ausgangsmaterial der erfindungsgemäßen Parvovirusvektoren zu produzieren, vorzugsweise mit im Wesentlichen Wildtyp-Titern. Es ist ferner bevorzugt, dass das Parvovirus-Ausgangsmaterial einen Titer von wenigstens etwa 105 transduzierenden Einheiten (tu)/ml, besonders bevorzugt wenigstens etwa 106 tu/ml, besonders bevorzugt wenigstens etwa 107 tu/ml, noch bevorzugter wenigstens etwa 108 tu/ml, noch bevorzugter wenigstens etwa 109 tu/ml, noch bevorzugter wenigstens etwa 1010 tu/ml, noch bevorzugter wenigstens etwa 1011 tu/ml oder mehr aufweist.
  • Anders ausgedrückt hat das Parvovirus-Ausgangsmaterial vorzugsweise einen Titer von wenigstens etwa 1 tu/Zelle, besonders bevorzugt von wenigstens etwa 5 tu/Zelle, noch bevorzugter von wenigstens etwa 20 tu/Zelle, noch bevorzugter von wenigstens etwa 50 tu/Zelle, noch bevorzugter von wenigstens etwa 100 tu/Zelle, noch bevorzugter von wenigstens etwa 250 tu/Zelle, ganz besonders bevorzugt von wenigstens etwa 500 tu/Zelle oder sogar mehr.
  • Ferner können die doppelsträngigen Parvovirusvektoren der Erfindung ein im Vergleich mit herkömmlichen Parvovirusvektoren verbessertes Verhältnis von transduzierenden Einheiten (tu)/Partikel aufweisen. Vorzugsweise ist das tu/Partikel-Verhältnis weniger als etwa 50:1, weniger als etwa 20:1, weniger als etwa 15:1, weniger als etwa 10:1, weniger als etwa 8:1, weniger als etwa 7:1, weniger als etwa 6:1, weniger als etwa 5:1, weniger als etwa 4:1 oder geringer. Es gibt keine bestimmte Untergrenze für das tu/Partikel-Verhältnis. Üblicherweise ist das tu/Partikel-Verhältnis größer als etwa 1:1, 2:1, 3:1 oder 4:1.
  • Anwendungen für die vorliegende Erfindung
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Transportieren einer Nucleotidsequenz zu einer Zelle unter Verwendung der hier beschriebenen doppelsträngigen Parvovirusvektoren. Der Vektor kann in vitro nach einem geeigneten, dem Fachmann bekannten Verfahren zu einer Zelle transportiert werden. Alternativ kann der Vektor, wie dem Fachmann bekannt, ex vivo zu einer Zelle transport werden.
  • Die vorliegenden Verfahren können vorteilhaft eingesetzt werden, um eine effizientere Transduktion der Targetzellen als mit wtAAV-Vektoren zu erreichen. So können die doppelsträngigen Parvovirusvektoren mit einer höheren Rate als wtAAV-Vektoren transduzieren. Alternativ oder zusätzlich können die doppelsträngigen Parvovirusvektoren für ein rascheres Anschalten der Transgenexpression, für ein höheres Expressionsniveau des Transgens und/oder für ein längeres Anhalten der Transgenexpression als AAV-Vektoren sorgen.
  • Die erfindungsgemäßen doppelsträngigen Parvovirusvektoren und Verfahren können ferner bei Verfahren der Verabreichung einer Nucleotidsequenz an eine Zelle Verwendung finden, die üblicherweise für eine Transduktion durch AAV nicht permissiv ist oder durch AAV nur ineffizient transduziert wird. Beispielhafte Zellen beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Dendritenzellen, bestimmte Typen von Krebs- oder Tumorzellen, Astrozyten und Knochenmarkstammzellen. Außerdem können die offenbarten Verfahren vorteilhaft mit nicht replizierenden oder langsam replizierenden Zellen durchgeführt werden, die eine Synthese des zweiten Strangs von AAV nur ineffizient unterstützen, wie Leberzellen, Zellen des zentralen Nervensystems (z. B. Hirn) und bestimmte Zellpopulationen im Muskel (z. B. "Fast-Twitch"-Fasern).
  • Dementsprechend können die hier offenbarten doppelsträngigen Parvovirusvektoren im Vergleich mit rAAV-Vektoren einen anderen Targetzellenbereich (z. B. einen breiteren Targetzellenbereich) haben. Ohne an eine bestimmte Theorie der Erfindung gebunden sein zu wollen scheint es, dass Zellen, die gegen eine Transduktion durch rAAV resistent sind, für die erfindungsgemäßen doppelsträngigen Parvovirusvektoren, die der Wirtszelle ein doppelsträngiges Molekül liefern, permissiv sein können. Die vorliegende Erfindung findet also zum Transportieren einer Nucleotidsequenz zu einer Zelle Verwendung, die für herkömmliche rAAV-Vektoren nicht permissiv ist oder durch rAAV-Vektoren nur schlecht transduziert wird, weil sie die Synthese des zweiten Strangs der Virus-DNA nicht effizient unterstützt.
  • Eine der charakteristischen Eigenschaften von wtAAV-Vektoren ist die verlängerte lag-Periode, bevor man eine Transgenexpression auf hohem Niveau beobachtet. Die hier offenbarten doppelsträngigen Parvovirusvektoren könnten ein schnelleres und agressiveres Gentransportsystem als wtAAV-Vektoren vorsehen, weil sie den Schritt der Komplementärstrangsynthese überflüssig machen.
  • Dementsprechend finden die erfindungsgemäßen doppelsträngigen Parvovirusvektoren bei Verfahren zur Behandlung von Krebs oder Tumoren Verwendung, z. B. durch Transport von Antikrebsmitteln oder Krebsantigenen.
  • Die doppelsträngigen Parvovirusvektoren können vorteilhaft auch bei der Behandlung von Individuen mit Stoffwechselerkrankungen (zum Beispiel Ornithintranscarbamylasemangel) verwendet werden. Solche Erkrankungen erfordern üblicherweise ein rascheres Anschalten der Expression eines therapeutischen Polypeptids durch den Gentransportvektor. Als weitere Alternative können die erfindungsgemäßen Vektoren verabreicht werden, um Mittel zuzuführen, die die Überlebensfähigkeit von Transplantaten verbessern (z.B. Superoxiddismutase) oder Sepsis bekämpfen.
  • Außerdem haben die Erfinder gefunden, dass Dendritenzellen (DC), die gegen wtAAV-Vektoren resistent sind (Jooss et al., (1998) 72:4212), für die hier offenbarten doppelsträngigen Parvovirusvektoren permissiv sind. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung gemäß einem weiteren Aspekt Verfahren zum Transportieren einer Nucleotidsequenz zu DC bereit, z. B. um eine Immunantwort auf ein von der Nucleotidsequenz codiertes Polypeptid zu induzieren. Vorzugsweise codiert die Nucleotidsequenz ein Antigen von einem infektiösen Agens oder ein Krebsantigen.
  • Gemäß noch einem weiteren Aspekt kann die vorliegende Erfindung zum Transport einer heterologen Nucleotidsequenz in Situationen eingesetzt werden, bei denen es wünschenswert ist, die Stärke der Transgenexpression zu regulieren (z. B. Transgenen, die Hormone oder Wachstumsfaktoren codieren, wie nachfolgend beschrieben). Das raschere Anschalten der Transgenexpression durch die offenbarten doppelsträngigen Parvovirusvektoren macht diese Gentransportvehikel für solche Behandlungsschemata geeigneter als es rAAV-Vektoren sind.
  • Erfindungsgemäß können beliebige heterologe Nucleotidsequenzen (wie oben definiert) transportiert werden. Nucleinsäuren von Interesse beinhalten Nucleinsäuren, die Polypeptide codieren, vorzugsweise therapeutische Polypeptide (z.B. für medizinische oder veterinärmedizinische Zwecke) oder immunogene Polypeptide (z. B. für Impfstoffe).
  • Ein "therapeutisches Polypeptid" ist ein Polypeptid, das Symptome lindern oder mildern kann, die die Folge eines Proteinmangels oder eines Defekts in einem Protein in einer Zelle oder einem Subjekt sind. Alternativ ist ein "therapeutisches Polypeptid" ein Polypeptid, das einem Patienten auf andere Weise einen Vorteil bringt, z.B. Wirkungen gegen Krebs oder eine Verbesserung bei der Überlebensfähigkeit von Transplantaten.
  • Vorzugsweise hat oder haben die heterologe Nucleotidsequenz bzw. die heterologen Nucleotidsequenzen eine Länge von weniger als etwa 2,5 kb (besonders bevorzugt weniger als etwa 2,4 kb, noch bevorzugter weniger als etwa 2,2 kb, noch bevorzugter weniger als etwa 2,0 kb), um das Verpacken des doppelsträngigen Templats durch das Parvoviruskapsid (z. B. AAV) zu erleichtern. Beispielhafte Nucleotidsequenzen codieren Faktor IX, Faktor X, lysosomale Enzyme (z. B. Hexosaminidase A, die mit dem Tay-Sachs-Syndrom assoziiert ist, oder Iduronatsulfatase, die mit dem Hunter-Syndrom/MPS II assoziiert ist), Erythropoietin, Angiostatin, Endostatin, Superoxiddismutase, Globin, Leptin, Katalase, Tyrosinhydroxylase sowie Zytokine (z. B. α-Interferon, β-Interferon, γ-Interferon, Interleukin-2, Interleukin-4, Interleukin-12, Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierender Faktor, Lymphotoxin und dergleichen), Peptidwachstumsfaktoren und Hormone (z.B. Somatotropin, Insulin, Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren 1 und 2, Blutplättchen-Wachstumsfaktor, epidermaler Wachstumsfaktor, Fibroblastenwachstumsfaktor, Nervenwachstumsfaktor, neurotropher Faktor 3 und 4, Brainderived Neurotrophic Factor, glialer Wachstumsfaktor, transformierender Wachstumsfaktor α und β, und dergleichen), Rezeptoren (z.B. Tumornekrosefaktorrezeptor). Bei anderen beispielhaften Ausführungsformen codiert die heterologe Nucleotidsequenz einen monoklonalen Antikörper, vorzugsweise einen einzelkettigen monoklonalen Antikörper oder einen monoklonalen Antikörper, der gegen ein Krebs- oder Tumorantigen gerichtet ist (z. B. HER2/neu und wie nachfolgend beschrieben). Andere illustrative heterologe Nucleotidsequenzen codieren Suizidgenprodukte (Thymidinkinase, Cytosindeaminase, Diphtherietoxin, Cytochrom P450, Deoxycytidinkinase und Tumornekrosefaktor), Proteine, die Resistenz gegen ein bei der Krebstherapie verwendetes Medikament vermitteln, und Tumorsuppressorgenprodukte.
  • Als weitere Alternative kann die heterologe Nucleinsäuresequenz ein Reporterpolypeptid codieren (z. B. ein Enzym wie grünfluoreszierendes Protein, alkalische Phosphatase).
  • Bei besonderen Ausführungsformen der Erfindung kann die interessierende Nucleinsäure alternativ eine Antisense-Nucleinsäure, ein Ribozym (z. B. wie in US-Patent Nr. 5,877,022 beschrieben), RNAs, die ein Spliceosom-vermitteltes trans-Splicing bewirken (siehe Puttaraju et al., (1999) Nature Biotech. 17:246; US-Patent 6,013,487; US-Patent 6,083,702), interferierende RNAs (RNAi), die ein Gene-Silencing vermitteln (siehe Charp et al., (2000) Science 287:2431), oder andere nicht-translatierte RNAs, wie "Guide"-RNAs (Gorman et al., (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:4929; US-Patent 6,869,248 an Yuan et al.) und dergleichen, codieren.
  • Der Parvovirusvektor kann auch eine heterologe Nucleotidsequenz codieren, die mit einem Locus auf dem Wirtschromosom Homologie aufweist und mit diesem rekombiniert. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um einen genetischen Defekt in der Wirtszelle zu korrigieren.
  • Die vorliegende Erfindung kann auch verwendet werden, um ein immunogenes Polypeptid in einem Subjekt zu exprimieren, z. B. zur Impfung. Die Nucleinsäure kann jedes beliebige interessierende, dem Fachmann bekannte Immunogen codieren, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Immunogene von humanem Immundefizienzvirus, Influenzavirus, gag-Proteinen, Tumorantigenen, Krebsantigenen, bakteriellen Antigenen, Virusantigenen und dergleichen.
  • Die Verwendung von Parvoviren als Impfstoff ist im Stand der Technik bekannt (siehe z. B. Miyamura et al., (1994) Proc. Nat. Acad. Sci USA 91:8507; US-Patente 5,916,563 an Young et al., 5,905,040 an Mazzara et al., US-Patent 5,882,652, US-Patent 5,863,541 an Samulski et al.). Das Antigen kann im Parvoviruskapsid präsentiert werden. Alternativ kann das Antigen von einer heterologen Nucleinsäure exprimiert werden, die in ein rekombinantes Vektorgenom eingebaut wurde. Von dem Parvovirusvektor kann jedes beliebige interessierende Immunogen zur Verfügung gestellt werden. Immunogene von Interesse sind dem Fachmann allgemein bekannt und beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Immunogene von humanem Immundefizienzvirus, Influenzavirus, gag-Proteine, Tumorantigene, Krebsantigene, bakterielle Antigene, Virusantigene und dergleichen.
  • Ein immunogenes Polypeptid, oder Immunogen, kann jedes Polypeptid sein, das sich zum Schutz des Subjekts gegen eine Krankheit eignet, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, mikrobielle und bakterielle Erkrankungen, Protozoenerkrankungen, parasitäre Erkrankungen und Viruserkrankungen. Das Immunogen kann beispielsweise ein Orthomyxovirusimmunogen (z. B. ein Influenzavirusimmunogen wie das Influenzavirus-Hämagglutinin (HA)-Oberflächenprotein oder das Influenzavirus-Nucleoproteingen, oder ein equines Influenzavirusimmunogen) oder ein Lentivirusimmunogen sein (z. B. ein Immunogen von equinem infektiösem Anämievirus, ein Immunogen von Simian Immunodeficiency Virus (SIV) oder ein Immunogen von humanem Immundefizienzvirus (HIV), wie das HIV- oder SIV-GP160-Hüllprotein, die HIV- oder SIV-Matrix/Kapsid-Proteine, und die HIV- oder SIV-gag-, pol- und env-Genprodukte). Das Immunogen kann auch ein Arenavirusimmunogen (z.B. ein Lassafiebervirusimmunogen, wie das Lassafiebervirus-Nucleokapsidproteingen und das Lassafieber-Hüllglykoproteingen), ein Pockenvirusimmunogen (z.B. Vacciniagene, wie die Vaccinia L1- oder L8-Gene), ein Flavivirusimmunogen (z. B. ein Gelbfiebervirusimmunogen oder ein Immunogen von Japan-Encephalitisvirus), ein Filovirusimmunogen (z.B. ein Ebolavirusimmunogen oder ein Marburgvirusimmunogen, wie NP- und GP-Gene), ein Bunyavirusimmunogen (z. B. RVFV-, CCHF- und SFS-Viren) oder ein Coronavirusimmunogen (z.B. ein Immunogen von infektiösem humanem Coronavirus, wie das Hüllglycoproteingen von humanem Coronavirus, oder ein Immunogen von porcinem TGE (Transmissible Gastroenteritis)-Virus oder ein Immunogen von aviärem infektiösem Bronchitis-Virus sein. Das Immunogen kann ferner ein Polioimmunogen, ein Herpesantigen (z. B. CMV-, EBV-, HSV-Immunogene), ein Mumpsimmunogen, ein Masernimmunogen, ein Rötelvirusimmunogen, Diphtherietoxin oder ein anderes Diphtherieimmunogen, Pertussisantigen, ein Hepatitisimmunogen (z. B. Hepatitis A- oder Hepatitis B-Immunogen) oder irgendein anderes dem Fachmann bekanntes Impfstoffimmunogen sein.
  • Alternativ kann das Immunogen ein Tumor- oder Krebszellantigen sein. Vorzugsweise wird das Tumor- oder Krebsantigen auf der Oberfläche der Krebszelle exprimiert. Beispielhafte Krebs- und Tumorzellantigene sind bei S. A. Rosenberg, (1999) Immunity 10:281) beschrieben. Andere beispielhafte Krebs- und Tumorantigene umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein: BRCA1-Genprodukt, BRCA2-Genprodukt, gp100, Tyrosinase, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, NY-ESO-1, CDK-4, β-Catenin, MUM-1, Caspase-8, KIAA0205, HPVE, SART-1, PRAME, p15, Melanomtumorantigene (Kawakami et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3515); Kawakami et al., (1994) J. Exp. Med., 180:347); Kawakami et al., (1994) Cancer Res. 54:3124), einschließlich MART-1 (Coulie et al., (1991) J. Exp. Med. 180:35), gp100 (Wick et al., (1988) J. Cutan. Pathol. 4:201) und MAGE-Antigen, MAGE-1, MAGE-2 und MAGE-3 (Van der Bruggen et al., (1991) Science, 254:1643); CEA, TRP-1, TRP-2, P-15 und Tyrosinase (Brichard et al., (1993) J. Exp. Med. 178:489); HER-2/neu-Genprodukt (US-Patent 4,968,603), CA 125, LK26, BF5 (Endosialin), TAG 72, AFP, CA19-9, NSE, DU-PAN-2, CA50, SPan-1, CA72-4, HCG, STN (Sialyl-Tn-Antigen), c-erbB-2-Proteine, PSA, L-CanAg, Östrogenrezeptor, Milchfettglobulin, p53-Tumorsuppressorprotein (Levine, (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:623); Mucinantigene (Internationale Patentanmeldung WO 90/05142); Telomerasen; nukleäre Matrixproteine; saure Prostataphosphatase; Papillomavirusantigene; und Antigene, die mit den folgenden Krebstypen assoziiert sind: Melanomen, Metastasen, Adenokarzinom, Thymom, Lymphom, Sarkom, Lungenkrebs, Leberkrebs, Kolonkrebs, Non-Hodgkin-Lymphom, Hodgkin-Lymphom. Leukämien, Gebärmutterkrebs, Brustkrebs, Prostatakrebs, Ovarialkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Blasenkrebs, Nierenkrebs, Pankreaskrebs und anderen (siehe z. B. Rosenberg, (1996) Ann. Rev. Med. 47:481-91.
  • Alternativ kann die heterologe Nucleotidsequenz jedes Polypeptid codieren, von dem gewünscht wird, dass es in vitro, ex vivo oder in vivo in einer Zelle produziert wird. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Vektoren in kultivierte Zellen eingeschleust werden und die exprimierten Genprodukte daraus isoliert werden.
  • Für den Fachmann versteht sich, dass die heterologe(n) Nucleotidsequenz(en) von Interesse funktionsfähig mit geeigneten Kontrollsequenzen assoziiert sein muss (müssen). Beispielsweise kann die heterologe Nucleinsäure funktionsfähig mit Expressionskontrollelementen verknüpft sein, wie Transkriptions/Translations-Kontrollsignalen, Replikationsursprüngen, Polyadenylierungssignalen und internen Ribosomeneintrittsstellen (IRES), Promotoren, Enhancern und dergleichen.
  • Der Fachmann erkennt, dass, abhängig von der gewünschten Stärke und gewebespezifischen Expression, zahlreiche verschiedene Promotor/Enhancer-Elemente verwendet werden können. Der Promotor/Enhancer kann konstitutiv oder induzierbar sein, abhängig vom gewünschten Expressiosmuster. Der Promotor/Enhancer kann natürliche (nativ) oder fremd sein und kann eine natürliche oder eine synthetische Sequenz sein. Unter "fremd" ist zu verstehen, dass sich die Transkriptionsinitiationsregion nicht in dem Wildtyp-Wirt befindet, in den die Transkriptionsinitiationsregion eingeschleust wird.
  • Promotor/Enhancer-Elemente, die für die zu behandelnde Targetzelle oder das zu behandelnde Subjekt natürlich (nativ) sind, sind ganz besonders bevorzugt. Ebenfalls bevorzugt sind Promotor/Enhancer-Elemente, die für die heterologe Nucleinsäuresequenz nativ sind. Das Promotor/Enhancer-Element wird so gewählt, dass es in der oder den interessierenden Targetzellen funktioniert. Promotor/Enhancer-Elemente von Säugern sind ebenfalls bevorzugt. Das Promotor/Enhancer-Element kann konstitutiv oder induzierbar sein.
  • Induzierbare Expressionskontrollelemente werden bei Anwendungen bevorzugt, bei denen eine Expressionskontrolle der heterologen Nucleinsäuresequenz(en) erwünscht ist. Induzierbare Promotor/Enhancer-Elemente zum Gentransport sind vorzugsweise gewebespezifische Promotor/Enhancer-Elemente und beinhalten muskelspezifische (einschließlich Herz- und Skelettmuskel und/oder glattem Muskel), nervengewebespezifische (einschließlich hirnspezifische), leberspezifische, knochenmarkspezifische, pankreasspezifische, milzspezifische, retinaspezifische und lungenspezifische Promotor/Enhancer-Elemente. Andere induzierbare Promotor/Enhancer-Elemente umfassen hormoninduzierbare und metallinduzierbare Elemente. Beispielhafte induzierbare Promotor/Enhancer-Elemente umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein Tet on/off-Element, einen RU486-induzierbaren Promotor, einen Ecdyson-induzierbaren Promotor, einen Rapamycin-induzierbaren Promotor und einen Metallothioneinpromotor.
  • Bei Ausführungsformen der Erfindung, bei denen die heterologe(n) Nucleinsäuresequenz(en) in den Targetzellen transkribiert und dann translatiert wird (werden), sind im Allgemeinen für eine effiziente Translation der inserierten proteincodierenden Sequenzen spezifische Initiationssignale erforderlich. Diese exogenen Translationskontrollsequenzen, die das ATG-Startcodon und benachbarte Sequenzen beinhalten können, können verschiedenen Ursprungs und sowohl natürlich als auch synthetisch sein.
  • Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen doppelsträngigen Parvovirusvektoren gegenüber rAAV-Vektoren besteht darin, dass die Orientierung der codierenden Sequenz bezüglich des auflösbaren TR fest ist und kontrolliert werden kann. So können beispielsweise Orientierung und Expression des Transgens unter Berücksichtigung der putativen Transkriptionskontrollelemente im auflösbaren TR kontrolliert werden. Außerdem kann die Kontrolle der Orientierung des Transgens bezüglich des nicht auflösbaren TR für ein größeres Maß an Kontrolle über die Rekombinationsprodukte zwischen den Genomen von coinfizierenden Vektoren sorgen. Wenn entweder das geschlossene Ende des Genoms (d. h. nahe dem nicht auflösbaren TR) oder das offene Ende ein bevorzugtes Substrat zur intermolekularen Rekombination ist, kann die Orientierung der codierenden Sequenz in dem Rekombinationsprodukt vorhergesagt und kontrolliert werden.
  • Schließlich sind die doppelsträngigen Parvovirusvektoren der vorliegenden Erfindung anders als rAAV-Vektoren insofern einheitlich, als sie sowohl den Plus- als auch den Minusstrang gemeinsam in einem einzigen Molekül verpacken. Diese charakteristische Eigenschaft ist wünschenswert, wenn man konstantes "Clinical Grade"-Reagens herstellen will.
  • Gentransfermethodik
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung stellen ferner ein Mittel bereit, um heterologe Nucleotidsequenzen in einen breiten Bereich von Zellen zu transportieren, einschließlich sich teilender und nicht-teilender Zellen. Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um eine interessierende Nucleotidsequenz in vitro zu einer Zelle zu transportieren, z. B. um ein Polypeptid in vitro oder zur ex vivo-Gentherapie zu produzieren. Die Zellen, die pharmazeutischen Formulierungen und die Verfahren der vorliegenden Erfindung eignen sich ferner für ein Verfahren zum Transport einer Nucleotidsequenz zu einem Subjekt, das dies benötigt, z. B. um ein immunogenes oder therapeutisches Polypeptid zu exprimieren. Auf diese Weise kann das Polypeptid in dem Subjekt sogar in vivo produziert werden. Das Subjekt kann das Polypeptid benötigen, weil das Subjekt einen Mangel an dem Polypeptid hat, oder weil die Produktion des Polypeptids in dem Subjekt eine therapeutische Wirkung haben kann, wie weiter unten erklärt wird.
  • Im Allgemeinen kann die vorliegende Erfindung eingesetzt werden, um eine beliebige fremde Nucleinsäure mit einer biologischen Wirkung zuzuführen, um die Symptome, die mit einer mit der Genexpression zusammenhängenden Erkrankung assoziiert sind, zu behandeln oder zu bessern. Beispielhafte Krankheitszustände umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein: Zystische Fibrose (und andere Lungenerkrankungen), Hämophilie A, Hämophilie B, Thalassämie, Anämie und andere Blutkrankheiten, AIDS, Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Huntington-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose, Epilepsie und andere neurologische Krankheiten, Krebs, Diabetes mellitus, Muskeldystrophien (z.B. Duchenne, Becker) Gaucher-Krankheit, Hurler-Krankheit, Adenosindeaminasemangel, Glykogenspeichererkrankungen und andere Stoffwechseldefekte, degenerative Retinaerkrankungen (und andere Augenerkrankungen), Erkrankungen fester Organe (z. B. Hirn, Leber, Niere, Herz) und dergleichen.
  • Gentransfer findet wichtige potentielle Verwendung für das Verständnis von Krankheitszuständen und die Bereitstellung einer entsprechenden Therapie. Es gibt eine Reihe von Erbkrankheiten, bei denen defekte Gene bekannt sind und kloniert wurden. Im Allgemeinen fallen die obigen Krankheitszustände in zwei Klassen: Mangelzustände, gewöhnlich an Enzymen, die allgemein rezessiv vererbt werden, und Ungleichgewichtszustände, an denen regulatorische Proteine oder Struktur proteine beteiligt sind und die typischerweise dominant vererbt werden. Bei Mangelerkrankungen könnte ein Gentransfer zur Austauschtherapie benutzt werden, um ein normales Gen in das betroffene Gewebe zu bringen, sowie um mittels Antisense-Mutationen Tiermodelle für die Krankheit zu erzeugen. Bei Krankheiten mit Ungleichgewichtszuständen könnte ein Gentransfer benutzt werden, um einen Krankheitszustand in einem Modellsystem zu erzeugen, der dann bei den Bemühungen verwendet werden könnte, dem Krankheitszustand entgegenzuwirken. So wie die Begriffe hier verwendet werden, wird ein Krankheitszustand behandelt, indem der Mangel oder das Ungleichgewicht, das zu der Erkrankung führt oder sie verschlimmert, teilweise oder ganz geheilt wird. Sequenzspezifische Rekombination von Nucleinsequenzen zur Erzeugung von Mutationen oder um Defekte zu reparieren ist ebenfalls möglich.
  • Die vorliegende Erfindung kann auch eingesetzt werden, um einer Zelle in vitro eine Antisense-Nucleinsäure zu liefern. Die Expression der Antisense-Nucleinsäure in der Zielzelle verringert die Expression eines bestimmten Proteins durch die Zelle. Antisense-Nucleinsäuren können Zellen in vitro verabreicht werden, um die Zellphysiologie zu regulieren, z.B. um Zell- oder Gewebekultursysteme zu optimieren.
  • Schließlich findet die vorliegende Erfindung auch bei diagnostischen Verfahren und bei Screeningverfahren Verwendung, wobei ein interessierendes Gen transient oder stabil in einem Zellkultursystem oder, alternativ, einem transgenen Tiermodell exprimiert wird.
  • Im Allgemeinen kann die vorliegende Erfindung eingesetzt werden, um eine heterologe Nucleinsäure in vitro, ex vivo oder in vivo zu einer Zelle zu transportieren.
  • Subjekte, pharmazeutische Formulierungen, Impfstoffe und Verabreichungsweisen.
  • Die vorliegende Erfindung findet sowohl veterinärmedizinische als auch medizinische Verwendung. Geeignete Subjekte für ex vivo-Verfahren zum Gentransport, wie sie oben beschrieben werden, umfassen sowohl Vögel als auch Säuger, wobei Säuger bevorzugt sind. Der Begriff "Vogel", wie er hier verwendet wird, beinhaltet, ohne darauf beschränkt zu sein, Hühner, Enten, Gänse, Wachteln, Truthähne und Fasane. Der Begriff "Säuger", wie er hier verwendet wird, beinhaltet, ohne darauf beschränkt zu sein, Menschen, Rinder, Schafe, Ziegen, Pferde, Katzen, Hunde, Lagomorphe usw. Menschliche Subjekte sind ganz besonders bevorzugt. Menschliche Subjekte umfassen Neugeborene, Babys, Jugendliche und Erwachsene.
  • In besonderen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die ein Viruspartikel der Erfindung in einem pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder anderen medizinischen Mitteln, pharmazeutischen Mitteln, Trägern, Adjuvanzien, Füllstoffen usw. umfasst. Zur Injektion ist der Träger üblicherweise eine Flüssigkeit. Bei anderen Verabreichungsverfahren kann der Träger entweder fest oder flüssig sein. Bei der Verabreichung durch Inhalation ist der Träger einzuatmen und liegt bevorzugt in fester oder flüssiger partikulärer Form vor. Als Injektionsmedium wird bevorzugt Wasser verwendet, das die für Injektionslösungen üblichen Zusätze wie Stabilisierungsmittel, Salze oder Kochsalzlösung und/oder Puffer enthält.
  • Im Allgemeinen ist ein "physiologisch verträglicher Träger" ein Träger, der nicht toxisch oder nicht unverhältnismäßig schädlich für die Zellen ist. Beispielhafte physiologisch verträgliche Träger umfassen steriles, pyrogenfreies Wasser und sterile, pyrogenfreie, phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Physiologisch verträgliche Träger umfassen pharmazeutisch verträgliche Träger.
  • Unter "pharmazeutisch verträglich" wird ein Material verstanden, das biologisch oder anderweitig nicht unerwünscht ist, d. h. das Material kann einem Subjekt verabreicht werden, ohne dass es zu unerwünschten biologischen Wirkungen führt. Eine solche pharmazeutische Zusammensetzung kann also beispielsweise bei der ex vivo-Transfektion einer Zelle verwendet werden.
  • Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung umfassen üblicherweise eine immunogene Menge infektiöser Viruspartikel, wie sie hier offenbart sind, in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Trger. Eine "immunogene Menge" ist eine Menge der infektiösen Viruspartikel, die ausreicht, um in dem Subjekt eine Immunantwort hervorzurufen. Zweckmäßig ist üblicherweise eine Menge von etwa 103 bis etwa 1015 Viruspartikeln, vorzugsweise von etwa 104 bis etwa 1010 und besonders bevorzugt von etwa 104 bis 106 Viruspartikeln pro Dosis, abhängig von Alter und Spezies des behandelten Subjekts und dem Immunogen, gegen das eine Immunantwort gewünscht wird. Subjekte und Immunogene sind wie oben beschrieben.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein in vitro-Verfahren zum Transportieren einer Nucleinsäure zu einer Zelle bereit. Bei in vitro-Verfahren kann das Virus üblicherweise mit üblichen viralen Transduktionsverfahren, wie sie dem Fachmann bekannt sind, in die Zelle eingeschleust werden. Vorzugsweise werden die Viruspartikel den Zellen entsprechend üblichen Transduktionsverfahren mit der für die jeweiligen Targetzellen geeigneten Infektionsmultiplizität zugesetzt. Die Titer der zu verabreichenden Viren können abhängig vom Typ der Targetzelle und dem jeweiligen Virusvektor variieren und lassen sich vom Fachmann ohne aufwendige Versuche bestimmen.
  • Rekombinante Virusvektoren werden der Zelle vorzugsweise in einer biologisch wirksamen Menge zugeführt. Eine "biologisch wirksame" Menge des Virusvektors ist eine Menge, die zur Infektion (oder Transduktion) und zur Expression der heterologen Nucleinsäuresequenz in der Zelle ausreicht.
  • Die Zellen, denen der erfindungsgemäße Virusvektor verabreicht werden soll, können beliebiger Art sein und umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Nervenzellen (einschließlich Zellen des peripheren und zentralen Nervensystems, insbesondere Hirnzellen), Lungenzellen, Retinazellen, Epithelzellen (z.B. Epithelzellen von Darm und Luftwegen), Muskelzellen, Dendritenzellen, Pankreaszellen (einschließlich Inselzellen), Leberzellen, Myokardzellen, Knochenzellen (z. B. Knochenmarkstammzellen), hämatopoetische Stammzellen, Milzzellen, Keratinozyten, Fibroblasten, Endothelzellen, Prostatazellen, Keimzellen und dergleichen. Die Zelle kann auch eine Progenitorzelle sein. Gemäß einer weiteren Alternative kann die Zelle eine Stammzelle sein (z.B. eine Nervenstammzelle, Leberstammzelle). Gemäß noch einer weiteren Alternative kann die Zelle eine Krebs- oder Tumorzelle sein. Außerdem können die Zellen von jeder beliebigen Ursprungsspezies, wie sie oben angegeben sind, stammen.
  • In besonderen Ausführungsformen der Erfindung werden einem Subjekt Zellen entnommen und der Parvovirusvektor in diese eingeschleust.
  • Geeignete Zellen zur ex vivo-Gentherapie sind wie oben beschrieben.
  • Die mit dem erfindungsgemäßen Vektor transduzierten Zellen liegen vorzugsweise in einer "therapeutisch wirksamen Menge" in Kombination mit einem pharmazeutischen Träger vor. Der Begriff "therapeutisch wirksame" Menge, wie er hier verwendet wird, bedeutet eine Menge, die zu einer Expression der mit dem Vektor transportierten heterologen Nucleotidsequenz führt, die ausreicht, um für das Subjekt eine Verbesserung oder einen Vorteil herbeizuführen. Anders ausgedrückt ist eine "therapeutisch wirksame" Menge eine Menge, die zu einer gewissen Linderung, Milderung oder Abnahme wenigstens eines klinischen Symptoms bei dem Subjekt führt. Der Fachmann erkennt, dass die therapeutischen Wirkungen nicht vollkommen oder heilend sein müssen, solange sich für das Subjekt ein Vorteil ergibt.
  • Bei anderen Ausführungsformen können Zellen, die mit einem erfindungsgemäßen Vektor transduziert wurden, verwendet werden, um eine immunogene Reaktion gegen die zugeführten Polypeptide hervorzurufen. Üblich ist die Verwendung einer Menge von Zellen, die eine immunogene Menge des Polypeptids exprimiert, in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Eine "immunogene Menge" ist eine Menge des exprimierten Polypeptids, die ausreicht, um eine aktive Immunantwort hervorzurufen. Der Grad des durch die aktive Immunantwort hervorgerufenen Schutzes muss nicht vollständig oder permanent sein, solange die Vorteile der Verabreichung des immunogenen Polypeptids die Nachteile überwiegen.
  • Die Dosierung der Zellen variiert mit dem Alter, dem Zustand und der Spezies des Subjekts, dem Zelltyp, der von der Zelle exprimierten Nucleinsäure und dergleichen. Üblicherweise werden wenigstens etwa 102 bis etwa 108, vorzugsweise etwa 103 bis etwa 106 Zellen pro Dosis verwendet. Vorzugsweise werden die Zellen in einer "therapeutisch wirksamen Menge" eingesetzt.
  • Beispielhafte Verwendungsformen viraler Vektoren beinhalten orale, rektale, transmukosale, topische, transdermale, inhalative, parenterale (z.B. intravenöse, subkutane, intradermale, intramuskuläre und intraartikuläre) Verabreichung und dergleichen sowie eine direkte Injektion in Gewebe oder Organe und alternativ intrathekale, direkte intramuskuläre, intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale, intranasale oder intraokulare Injektionen. Injektionspräparate können in üblichen Formen hergestellt werden, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, als feste Formen, die sich zum Auflösen oder Suspendieren in Flüssigkeiten vor der Injektion eignen, oder als Emulsionen. Alternativ kann man das Virus lokaler statt systemisch eingesetzt werden, beispielsweise in einer Depot- oder Retardformulierung.
  • Der Parvovirusvektor kann verwendet werden, um eine permissive Zelle oder ein permissives Gewebe zu transduzieren. Zellen, die sich zur Transduktion mit den erfindungsgemäßen Parvovirusvektoren eignen, sind wie oben beschrieben.
  • Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird die interessierende Nucleotidsequenz verwendet, um die Leber des Subjekts zu transduzieren. Die Verwendung des Vektors zur Verabreichung an die Leber kann mit jedem beliebigen, dem Fachmann bekannten Verfahren erfolgen, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, intravenöser Verabreichung, intraportaler Verabreichung, intrabiliärer Verabreichung, intraarterieller Verabreichung und direkter Injektion in das Leberparenchym.
  • Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen werden die erfindungsgemäßen Parvoviruspartikel zur intramuskulären Verabreichung verwendet, besonders bevorzugt mittels intramuskulärer Injektion oder lokaler Verabreichung (wie oben definiert). Ein Transport zum Gehirn ist ebenfalls bevorzugt. Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen werden die Parvoviruspartikel der vorliegenden Erfindung zur Verabreichung an die Lunge verwendet.
  • Die hier offenbarten Parvovirusvektoren können mit jedem zweckmäßigen Mittel an die Lunge verabreicht werden, vorzugsweise aber mittels einer Aerosolsuspension von einzuatmenden Partikeln, die aus den erfindungsgemäßen Parvovirusvektoren bestehen, die das Subjekt inhaliert. Die einzuatmenden Partikel können flüssig oder fest sein. Aerosole flüssiger Partikel, die die erfindungsgemäßen Parvovirusvektoren umfassen, lassen sich mit jedem beliebigen geeigneten Mittel herstellen, beispielsweise einem mit Druck arbeitenden Aerosolvernebler oder einem Ultraschallvernebler, wie sie dem Fachmann bekannt sind. Siehe z. B. US-Patent 4,501,729. Aerosole fester Partikel, die die erfindungsgemäßen Virusvektoren umfassen, können in ähnlicher Weise mit jedem beliebigen Aerosolgenerator für feste partikuläre Medikamente hergestellt werden, und zwar mit Methoden, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Pharmazie bekannt sind.
  • Die Dosierungen der erfindungsgemäßen Parvoviruspartikel hängen von der Verabreichungsweise, der zu behandelnden Krankheit oder dem zu behandelnden Zustand, dem Zustand des einzelnen Subjekts, dem jeweiligen Virusvektor und dem zu transportierenden Gen ab und können routinemäßig bestimmt werden. Beispielhafte Dosen, um therapeutische Wirkungen zu erzielen, sind Virustiter von wenigstens etwa 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015 transduzierenden Einheiten oder mehr, vorzugsweise von etwa 108–1013 transduzierende Einheiten, besonders bevorzugt 1012 transduzierenden Einheiten.
  • Bei besonderen Ausführungsformen werden die erfindungsgemäßen Parvoviruspartikel als Teil eines Verfahrens zur Krebs- oder Tumorbehandlung mit Antikrebsmitteln (z. B. Zytokinen) oder einem Krebs- oder Tumorantigen verwendet. Das Parvoviruspartikel kann einer Zelle in vitro oder mittels ex vivo-Verfahren zugeführt werden, wie hier beschrieben wird und dem Fachmann bekannt ist.
  • Der Ausdruck "Krebs" hat die für den Fachmann übliche Bedeutung, beispielsweise als ein unkontrolliertes Wachstum von Gewebe, das das Potential zur Ausbreitung zu entfernt liegenden Stellen des Körpers (d. h. zur Metastasierung) besitzt. Beispielhafte Krebsarten umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Leukämien, Lymphome, Kolonkrebs, Nierenkrebs, Leberkrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs, Prostatakrebs, Ovarialkrebs, Melanom und dergleichen. Der Ausdruck "Tumor" hat ebenfalls die für den Fachmann übliche Bedeutung, beispielsweise als abnorme Masse undifferenzierter Zellen innerhalb eines mehrzelligen Organismus. Tumore können bösartig oder gutartig sein.
  • Erfindungsgemäße Krebs- und Tumorantigene wurden oben beschrieben. Unter den Begriffen "Behandeln von Krebs" oder "Krebsbehandlung" ist zu verstehen, dass die Schwere der Krebserkrankung zurückgeht oder der Krebs wenigstens teilweise entfernt wird. Vorzugsweise drücken diese Begriffe aus, dass die Metastasierung des Krebses verringert oder wenigstens teilweise beseitigt wird. Bevorzugt drücken diese Begriffe außerdem aus, dass das Wachstum metastatischer Knoten (z.B. nach chirurgischer Entfernung eines Primärtumors) reduziert oder wenigstens teilweise gestoppt wird. Unter den Begriffen "Krebsprävention" oder "Verhindern von Krebs" versteht man, dass die erfindungsgemäßen Verfahren das Auftreten oder den Ausbruch von Krebs wenigstens teilweise eliminieren oder verringern. Anders ausgedrückt verlangsamen, bekämpfen und vermindern die vorliegenden Verfahren die Wahrscheinlichkeit von Krebs in dem Subjekt oder verzögern dessen Ausbruch.
  • Ähnlich sollen die Begriffe "Behandeln von Tumoren" oder "Tumorbehandlung" ausdrücken, dass die Schwere des Tumors verringert oder der Tumor wenigstens teilweise entfernt wird. Vorzugsweise sollen diese Ausdrücke bedeuten, dass die Metastasierung des Tumors verringert oder wenigstens teilweise beseitigt wird. Bevorzugt sollen diese Begriffe ferner ausdrücken, dass das Wachstum metastatischer Knoten (z.B. nach chirurgischer Entfernung eines Primärtumors) reduziert oder wenigstens teilweise gestoppt wird. Mit den Ausdrücken "Tumorprävention" oder "Verhindern von Tumoren" soll ausgedrückt werden, dass die erfindungsgemäßen Verfahren die Häufigkeit oder das Ausbrechen von Tumoren wenigstens teilweise eliminieren oder verringern. Anders ausgedrückt verlangsamen, bekämpfen und vermindern die vorliegenden Verfahren die Wahrscheinlichkeit von Tumoren bei dem Subjekt oder verzögern deren Ausbruch.
  • Bei anderen Ausführungsformen können einem Subjekt mit einem Krebs oder einem Tumor Zellen entnommen und mit den Parvoviruspartikeln der Erfindung in Kontakt gebracht werden. Die modifizierte Zelle wird dann bei der Behandlung verwendet, wodurch eine Immunantwort gegen das Krebs- oder Tumorantigen hervorgerufen wird. Dieses Verfahren wird besonders vorteilhaft bei immunkompromittierten Subjekten eingesetzt, die keine ausreichende Immunantwort in vivo entwickeln können (d. h. die die Antikörper, die das Befinden verbessern, nicht in ausreichenden Mengen produzieren können).
  • Dem Fachmann ist bekannt, dass Immunantworten durch immunmodulatorische Zytokine gefördert werden können (z.B. α-Interferon, β-Interferon, γ-Interferon, ω-Interferon, τ-Interferon, Interleukin-1α, Interleukin-1β, Interleukin-2, Interleukin-3, Interleukin-4, Interleukin-5, Interleukin-6, Interleukin-7, Interleukin-8, Interleukin-9, Interleukin-10, Interleukin-11, Interleukin-12, Interleukin-13, Interleukin-14, Interleukin-18, B-Zell-Wachstumsfaktor, CD40-Ligand, Tumornekrosefaktor-α, Tumornekrosefaktor-β, Monozyten-chemoattraktives Protein-1, Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierender Faktor und Lymphotoxin). Dementsprechend werden bei besonderen Ausführungsformen der Erfindung in Verbindung mit den hier beschriebenen Verfahren immunmodulatorische Zytokine verwendet (vorzugsweise CTL-induktive Zytokine), um eine Immunantwort hervorzurufen oder eine Immuntherapie bereitzustellen.
  • Es können exogene Zytokine verwendet werden, oder alternativ kann zusammen mit einem geeigneten Vektor eine Nucleotidsequenz verwendet werden, die ein Zytokin codiert, und das Zytokin so in vivo produziert werden.
  • Nachdem die Erfindung nun beschrieben wurde, wird sie unter Bezug auf verschiedene Beispiele veranschaulicht, die hier lediglich der Erläuterung dienen und die Erfindung nicht einschränken sollen.
  • Beispiel 1
  • Material und Methoden
  • Plasmide. Die rAAV-Plasmide, die grünfluoreszierendes Protein (GFP) exprimieren, wurden aus dem früher beschriebenen pTRgSUF-2 (einem Geschenk von Nick Muzyczka) konstruiert. Zuerst wurde die humanisierte GFP-codierende Sequenz unter Bildung des Plasmids pTR-CMV-GFPneo durch "enhanced GFP" (eGFP) (Clonetech) ersetzt. Dieses Plasmid generierte den rAAV-GFPneo-Vektor. Als Zweites wurde das Sal I-Fragment, das die neo-codierende Region und den SV40-Promotor enthielt, unter Bildung von pTR-CMV-GFP deletiert. Der Vektor aus diesem Plasmid wurde hier als rAAV-GFP bezeichnet.
  • Das Plasmid, p43mEpo, ein Geschenk von Barry Byrne, enthielt das murine Erythropoietingen unter Kontrolle des CMV-Promotors und generierte ein rAAV-Replikon (raaVmEpo) mit weniger als der Hälfte der Länge des wtAAV. Eine längere Version dieses Konstrukts (pmEpo-λ) wurde hergestellt, indem das 2,3 kb-Hind III-Fragment des Phagen λ in eine Cla I-Stelle zwischen dem Polyadenylierungssignal und dem AAV-Terminal Repeat stromabwärts eingebaut wurde. Der rAAV-LacZ-Vektor wurde aus pDX11-LacZ generiert, das bereits beschrieben wurde (McCown et al., (1996) Brain Research 713:99).
  • Virusvektoren. Virusvektoren wurden in 293-Zellen (108–109 Zellen pro Präparation) durch Cotransfektion von 3 Plasmiden generiert, die enthielten: 1) das spezifische rAAV-Konstrukt, 2) die AAV-rep- und cap-Gene (pACG) oder 3) die wesentlichen Adenovirus-Helfergene (pXX-6; Xiao et al., (1998) J. Virology 72:2224). 40 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen in das Medium abgekratzt und durch drei Einfrier-Auftau-Zyklen lysiert. Die Lysate wurden bei 37 °C mit 2 μg/ml DNase I inkubiert, bis die flockigen Trümmer dispergiert waren. Die Lysate wurden durch Zentrifugation geklärt, und rAAV wurde mit Ammoniumsulfat präzipitiert (Snyder et al., Production of recombinant adeno-associated virus vectors. In: Dracopoli et al., Hrsg., Current Protocols in Human Genetics. New York: John Wiley & Sohns Ltd.: 1996. S. 12.1.1-12.2.23). Das Viruspräzipitat wurde mit 8 ml 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM MgCl2 resuspendiert, und Cäsiumchlorid wurde bis zu einer finalen Dichte von 1,4 g/cm3 und einem Endvolumen von 12,5 ml zugegeben. Die Lösung wurde 36 h bei 38 krpm in einem SW41-Rotor zentrifugiert. Fraktionen (0,75 ml) wurden aufgefangen, indem am Boden eines jeden Röhrchens mit einer subkutanen Nadel eingestochen wurde und die Flüssigkeit zu einem Fraktionssammler gepumpt wurde. Die Vektoren wurden bei 4 °C in Cäsiumchlorid aufbewahrt.
  • Virion-DNA (vDNA) wurde aus 10 μl einer jeden Fraktion extrahiert, indem in 50 μl-Reaktionsansätzen, die 0,4 mg/ml Protease K, 1 % Sarkosyl und 10 mM EDTA enthielten, bei 50 °C 1 Stunde verdaut und anschließend mit Phenol/Chloroform extrahiert wurde. Die Proben wurden zur Analyse mittels alkalischer Agarosegelelektrophorese und Southern Blot-Hybridisierung dreifach mit Wasser verdünnt und mit Ethanol ausgefällt.
  • Zellen und Infektionen. HeLa- und HEK 293-Zellen wurden in DMEM-Medien gezüchtet, die 10 % FBS und Pen/Strep enthielten. Das Virusvektormaterial wurde in Medium verdünnt, bevor es zu subkonfluenten Kulturen gegeben wurde, und auf den Zellen belassen, bis 24 Stunden nach Infektion mittels Fluoreszenzmikroskopie eine GFP-Transduktion beobachtet wurde.
  • Zur Expression von Erythropoietin in Mäuseleber wurden 200 μl normale Kochsalzlösung, die 2 × 1010 physikalische Partikel entweder von herkömmlichem rAAV oder "Duplexed" Virus (scAAV) enthielt, direkt in die Portalvene von 10 Wochen alten Balb-c-ByJ-Mäusen (Jackson Laboratory) injiziert. Blutproben wurden durch retroorbitale Phlebotomie zum Zeitpunkt der Infektion und in Intervallen von 7 Tagen entnommen, um das Hämatokrit zu bestimmen.
  • Beispiel 2
  • Bildung doppelsträngiqer ("duplexed") Vektoren
  • Ein rAAV-Plasmidkonstrukt (pTR-CMV-GFP) mit einer Replikongröße von 2299 Nukleotiden wurde verwendet, um mittels üblicher Verfahren ein Virusvektormaterial (rAAV-GFP) zu generieren. Die vorhergesagte Größe der dimeren replikativen Form dieses Vektors betrug 4474 Nucleotide (1), was 95,6 % der Länge des wtAAV-Genoms entsprach. Die Virusvektoren wurden durch isopyknische Gradientenzentrifugation in CsCl fraktioniert und der vDNA-Gehalt jeder Fraktion wurde auf alkalischen Agarosegelen analysiert (2). Phospholmager-Scans wurden verwendet, um die vDNA-spezifischen Banden von jeder Fraktion zu quantifizieren. Unter denaturierenden Bedingungen lief die selbstkomplementäre dimere DNA (2, Bild a, Fraktionen 10-13) bei etwa der doppelten Länge des monomeren Genoms. Das hybridisierende Material in den Fraktionen 2-4 ist unverpackte DNA in replikativer Form, die am unteren Ende des Gradienten sedimentiert. Obwohl bei der Vektorreinigung ein DNase-Schritt enthalten war (siehe Methoden), war damit keine abschließende Behandlung beabsichtigt, und dieses Material erwies sich in nachfolgenden Versuchen als DNase-sensitiv, während das Material in den Fraktionen 10-14 DNase-resistent war (Daten nicht gezeigt). Vektoren, die hauptsächlich dimere DNA-Genome enthielten (Fraktionen 10 und 11), wurden als doppelsträngiges ("duplexed") oder "selbstkomplementäres" Virus (scAAV) bezeichnet. Die Inverted-Repeat-Struktur dieser Moleküle wurde durch Verdau mit Restriktionsenzymen bestätigt (Daten nicht gezeigt).
  • Parallel wurden zwei weitere rAAV-Vektoren (1) konstruiert und gereinigt und auf gleiche Weise analysiert (2, Bild b und c). Der erste, rAAV-GFPneo, enthielt zusätzlich zu GFP ein neo-Gen und besaß eine replizierende Genomlänge von 3398 Nucleotiden. Dies entsprach 72,6 % der Größe des wtAAV-Genoms und war zu groß, um als ein Dimer verpackt zu werden. Der zweite war ein rAAV-CMV-LacZ-Konstrukt mit 4898 Nucleotiden, das etwas größer (104,7 %) als das wtAAV-Genom war, aber innerhalb der Grenzen für eine effiziente Verpackung lag (Dong et al., (1996) Human Gene Therapy 7:2101). Das hybridisierende Material in den Fraktionen 14 und 15 mit geringerer Dichte und höherer Mobilität (2, Bild c) umfasste Genome, bei denen Deletionen erfolgt waren, und diese Fraktionen wurden in den nachfolgenden Experimenten nicht verwendet.
  • Beispiel 3
  • Transduktion mit doppelsträngigen im Vergleich mit monomeren Vektoren und Effekt einer Coinfektion mit Ad
  • Die Transduktionseffizienz des scAAV-GFP-Vektors (2, Bild a, Fraktion 11) wurde mit dem homologen Monomer (Fraktion 13) sowie den GFPneo- und LacZ-Vektoren (2, Bild b und c, Fraktionen 13 bzw. 12) in mit geringer Multiplizität infizierten HeLa-Zellen verglichen (3). Die Partikelanzahl wurde aus den spezifischen Phospholmager-Signalen in jeder Fraktion auf dem Southern Blot für vDNA vollständiger Länge berechnet, nachdem hinsichtlich Kopienzahl monomerer gegenüber dimerer DNA korrigiert worden war. Jedes doppelsträngige Virus enthält also zwei Kopien des Transgens in Form eines einzigen Moleküls in "Inverted Repeat"-Orientierung, während jedes monomere Partikel eine einzelsträngige Kopie enthält.
  • Der scAAV-GFP-Vektor (Fraktion 11), der etwa 90 % dimeres Virus enthält, lieferte ein Verhältnis physikalische Partikel zu transduzierenden Einheiten von 5,9:1 und bestätigt so die Vorhersage einer hohen Transduktionseffizienz. Fraktion 13 des gleichen Gradienten, die im Gegensatz dazu etwa 80-90 % monomeres Virus enthält, hatte ein Verhältnis Partikel zu transduzierenden Einheiten von 24,6:1. Dieser vierfache Unterschied in der Effizienz stellte den Mindestunterschied dar, wenn berücksichtigt wurde, dass die Dimerverunreinigung in der Monomerfraktion einen stärkeren Einfluss auf deren Transduktionspotential haben sollte als der der Monomerkomponente auf die Dimerfraktion. Im Gegensatz dazu hatten die monomeren ssDNA-GFPneo- und -LacZ-Vektoren Verhältnisse Partikel zu transduzierenden Einheiten von 125:1 bzw. 828:1, was mit der früher für diese Vektoren beschriebenen Effizienz vergleichbar war (Fisher et al., (1996) J. Virology 70:520; Zolotukhin et al., (1999) Gene Therapy 6:973).
  • Die Transduktionseffizienz herkömmlicher rAAV-Vektoren kann durch Coinfektion mit Ad oder durch Behandlung mit DNA-schädigenden Mitteln oder anderen Arten von Zellstress stark verbessert werden (bis zu 100-fach). Diese Verbesserung hing mit der zellvermittelten Umwandlung des ssDNA-Genoms in aktive dsDNA-Transkriptionstemplate zusammen. Weil der doppelsträngige Vektor die beiden komplementären Stränge in Form eines einzigen Moleküls verpackt enthält, wurde vorhergesagt, dass die Transduktion unabhängig von der Hilfe durch Adenovirus sein sollte. Dies war größtenteils der Fall, wenn HeLa-Zellen mit den doppelsträngigen Vektoren und 5 Infektionseinheiten Adenovirus pro Zelle coinfiziert wurden (3). Die Zahl GFP-positiver Zellen in mit doppelsträngigem Virus infizierten Kulturen stieg nur um das 1,6-fache an, ein Effekt, der, wie bereits beschrieben, auf die transkriptionellen Wirkungen einer Adenovirusinfektion auf die Aktivität des CMV-Promotors zurückgeführt werden konnte (Clesham et al., (1998) Gene Therapy 5:174; Loser et al., (1998) J. Virology 72:180). Die Transduktionsrate des monomeren Vektors stieg durch Coinfektion um das 2,4-fache, während der GFPneo- und der LacZ-Vektor 6,0-fach bzw. 12,8-fach induziert wurden.
  • Zusammengefasst war der doppelsträngige Vektor in kultivierten HeLa-Zellen mehr als viermal effizienter als der homologe Vektor, der nur ein monomeres ssDNA-Genom enthielt. Dieser Unterschied wäre wahrscheinlich größer, wenn die Monomerfraktionen nicht mit etwa 10-20 % Dimervektoren verunreinigt wären. Übereinstimmend mit dieser Interpretation war der doppelsträngige Vektor 20-mal effizienter als ein herkömmlicher rAAV-GFPneo-Vektor und 140-mal effizienter als ein rAAV-LacZ-Vektor.
  • Beispiel 4
  • Transduktion mit doppelsträngigen Vektoren ohne DNA-Synthese der Wirtszelle
  • Weil die vDNA der doppelsträngigen Vektoren beide DNA-Stränge auf einem einzigen Molekül enthielt, was nach der Freisetzung eine effiziente Reassoziierung erlaubt, wurde vorhergesagt, dass diese Vektoren die Rolle der Wirtszell-DNA-Synthese bei der Transduktion überflüssig machen sollten. Der scAAV-GFP-Vektor wurde mit dem homologen Monomer und dem GFPneo-Vektor in HeLa-Zellen verglichen, die 24 Stunden vor Infektion mit Hydroxyharnstoff (HU) vorbehandelt worden waren, um die DNA-Synthese der Wirtszelle zu inhibieren. Die Behandlung mit Hydroxyharnstoff wurde nach der Injektion ununterbrochen mit den gleichen Konzentrationen fortgesetzt und in den nachfolgenden 24 Stunden bis zur Bestimmung der GFP-Transduktion für die Zellen beibehalten.
  • Die Transduktion von dem scAAV-GFP wurde in Reaktion auf zunehmende Konzentrationen HU bis zu 1,9-fach stimuliert (4). Diese Stimulierung, die in einer ähnlichen Größenordnung liegt wie die, die bei einer Coinfektion mit Ad beobachtet wurde, wurde wahrscheinlich durch eine Kombination aus transkriptioneller Transaktivierung des CMV-Promotors als Folge von Zellstress und Akkumulation von GFP in den sich nicht teilenden Zellen beeinträchtigt. Im Gegensatz dazu wurde die Transduktion der Fraktion des homologen Monomerenvektors bei der niedrigsten HU-Konzentration stimuliert und bei höheren Konzentrationen inhibiert. Die restliche Transduktionsaktivität des monomeren Vektors bei höheren HU-Konzentrationen mit einem Niveau, das etwa 5-mal geringer war als das der Fraktion des doppelsträngigen Virus, stimmt mit der 10–20%igen Verunreinigung der Monomerfraktionen mit Dimer enthaltenden Partikeln überein (2, Bild a). Die Transduktion mit rAAV-GFPneo-Vektor wurde unter den gleichen Bedingungen mehr als 10-fach inhibiert. Identische Ergebnisse wurden durch Behandlung mit Aphidicolin, einem Polymerase α/δ-spezifischen Inhibitor, erhalten (4, Bild b). Dies bestätigte die Hypothese, dass die Transduktion mit doppelsträngigem Vektor unabhängig von der DNA-Synthese der Wirtszelle war.
  • Beispiel 5
  • In vivo-Transduktion durch doppelsträngige Vektoren
  • Zum Vergleich der Effizienz von doppelsträngigem und herkömmlichem einzelsträngigem rAAV in vivo wurde ein anderer Reporter verwendet. Das Dimerproduzierende Konstrukt enthielt nur das murine Erythropoietingen (mEpo), das vom CMV-Promotor transkribiert wurde. Die Größe des replizierenden Elements dieses Minimalvektors betrug 2248 Nucleotide. Die dimere Form dieses Moleküls mit einer Länge von 4372 Nucleotiden (1) entsprach 93 % der Größe des wtAAV-Genoms und wurde leicht verpackt. Ein zweites Konstrukt enthielt das gleiche Transgen, wobei stromabwärts eine heterologe Sequenz (λ-Phage) angefügt worden war, um die Größe des rekombinanten Vektors auf 4570 Nucleotide oder 98 % der Größe des wtAAV-Genoms zu bringen. Frühere Untersuchungen haben λ-Phagen-DNA als Mittel zum Auffüllen ohne schädliche Wirkungen auf den Vektor verwendet (Muzyczka et al., (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:97). Beide Vektoren wurden durch Heparin-Agarosechromatographie gereinigt. Der kleinere Vektor wurde außerdem auf einem CsCl-Gradienten gereinigt, um dimere DNA-enthaltende Virionen zu isolieren (nicht gezeigt). Die beiden Vektormaterialien wurden mit Southern Blots von alkalischen Agarosegelen quantifiziert, um die Anzahl DNA-haltiger Partikel zu bestimmen. In diesem Fall enthielten etwa 25 % der Partikel der Dimerfraktion zwei separate monomere Genome. Weil sie über die Dichte nicht von dem echten Dimer getrennt werden konnten und weil ihr Verhalten nicht charakterisiert worden war, wurden sie für die Zwecke des Vergleichs mit dem Vektor vollständiger Länge als dimere Partikel gezählt, so dass der Dimereffekt eher unterschätzt als überschätzt sein sollte.
  • Gleiche Mengen physikalischer rAAV-Partikel (2 × 1010 pro Tier in 200 μl normaler Kochsalzlösung) wurden Mäusen durch Injektion in die Portalvene verabreicht. Die Expression des mEpo-Gens wurde durch Bestimmung der Änderungen im Hämatokritwert in Abständen von 7 Tagen berechnet. Kontrollmäuse erhielten entweder intraportale Kochsalzinjektionen oder wurden nicht operiert, sondern in Abständen von 7 Tagen phlebotomiert. Mäuse, die den doppelsträngigen Vektor erhielten, reagierten mit einem raschen Hämatokritanstieg (5) und mit weiteren Anstiegen in den nachfolgenden zwei Wochen. Unter Berücksichtigung der lag-Zeit zwischen der Expression von Erythropoietin und der Produktion roter Blutzellen ließ dies vermuten, dass der doppelsträngige Vektor innerhalb der ersten Woche in großen Mengen exprimiert wurde. Mäuse, die ssDNA-Vektor vollständiger Länge erhielten, zeigten bis 21 Tage nach Injektion keinen signifikanten Hämatokritanstieg und erreichten über die Dauer des Experiments keine Mengen, die mit den Tieren vergleichbar waren, die mit doppelsträngigem Vektor behandelt worden waren.
  • Die Infektion von Mäusen mit scAAVmEpo führte zu einer rascheren Reaktion und einem größeren Anstieg von Hämatokrit als bei dem ssDNA-Vektor vollständiger Länge, der das gleiche Gen trägt. Diese Ergebnisse stützen unsere Beobachtungen bei kultivierten Zellen und stimmen mit der Ansicht überein, dass die dimeren Vektoren bereit sind, das Transgen unmittelbar nach dem Freisetzen und dem Eindringen in den Kern zu exprimieren. Die schließlich erreichten höheren Expressionsmengen könnten die Unfähigkeit vieler infizierter Zellen widerspiegeln, dsDNA von herkömmlichem rAAV bilden zu können, und/oder den Verlust/Abbau der ssvDNA vor Bildung einer Duplex (Miao et al., (1998) Nature Genetics 19:13).
  • Wie wir durch Vorbehandlung von Zellen mit HU gezeigt haben, ist die Transduktion mit dem scAAV-Vektor unabhängig von der DNA-Synthese der Wirtszelle. Die Fähigkeit, Zellen ohne DNA-Synthese transduzieren zu können, stellt einen fundamentalen Unterscheid in der Biologie von scAAV-Vektoren gegenüber dem Elternvirus dar und erlaubt ihnen, unter Bedingungen zu funktionieren, bei denen herkömmliche rAAV-Vektoren versagen würden. Bestimmte Zelltypen sind, was eine Transduktion mit rAAV betrifft, extrem ineffizient, offensichtlich wegen der Unfähigkeit, einen Komplementärstrang zu synthetisieren oder zu ergänzen (Fisher et al., (1996) J. Virology 70:520; Alexander et al., (1996) Human Gene Therapy 7:841; Miao et al., (1998) Nature Genetics 19:13). Der scAAV unterliegt keiner derartigen Einschränkung und kann mit Markergenen verwendet werden, um direkt zu bestimmen, ob eine Zelle ungeachtet der DNA-Synthese in allen anderen Schritten für eine rAAV-Transduktion permissiv ist.
  • Ungeachtet der Fähigkeit der Targetzelle, den rAAV-Komplementärstrang herzustellen, ist klar, dass diese Reagenzien ein alternatives AAV-Transportsystem für Gene bieten, die rasch angeschaltet werden müssen: Noch wichtiger ist es, dass unsere Daten vermuten lassen, dass scAAV-Vektoren insgesamt zu größeren Mengen an therapeutischem Produkt führen, wenn eine identische Anzahl von Partikeln verabreicht wird. scAAV-Vektoren werden sich also dort als nützlich erweisen, wo eine zeitnähere, robustere oder quantitativere Reaktion auf die Vektordosis erforderlich ist. Das Potential, bei minimaler Dosis ein kritisches Niveau der Transgenexpression zu erreichen, ist auch für die Anforderungen an die Vektorproduktion für klinische Versuche wichtig und um die Exposition eines Patienten mit Virus zu minimieren.
  • Beispiel 6
  • Verbesserte Substrate zur Produktion doppelsträngiger Parvovirusvektoren
  • Um die Produktion von doppelsträngigem Vektormaterial zu rationalisieren und um die Komplikationen gemischter Populationen aus Duplex- und Monomergenomen zu vermeiden, wurde ein mutierter Vektor erzeugt, der nur die dimeren Genome bildet (6). Dieses Konstrukt hat eine Mutation in einem TR, so dass die Rep-Strangbruchstelle (trs) deletiert ist, während der andere TR Wildtyp ist. Diew Wirkung besteht darin, dass die "Rolling Hairpin"-Replikation vom wt-Ende des Genoms beginnt, ohne terminale Auflösung durch das mutierte Ende fortschreitet und dann zur Bildung des Dimers wieder über das Genom zurückläuft. Das Endprodukt ist ein selbstkomplementäres Genom mit dem mutierten TR in der Mitte und nun wtTRs an jedem Ende. Replikation und Verpackung dieses Moleküls erfolgt dann wie normal von den wtTRs aus, außer dass die dimere Struktur bei jeder Runde erhalten bleibt.
  • Mit diesem Mutantenhintergrund wurde Vektormaterial sowohl von rAAV-CMV-GFP-Hpa-trs und rAAV-CMV-mEpo-Hpa-trs gebildet, und die Produkte wurden wie oben auf CsCl-Gradienten analysiert. (7). Diese Konstrukte produzieren zu etwa 90 % doppelsträngige Vektoren. Dies ermöglicht höhere Ausbeuten an doppelsträngigem Parvovirusvektor und eine Iodixanol/Neparin-Reinigung dieser Vektoren ohne den zusätzlichen Schritt einer CsCl-Dichtegradientenreinigung.
  • Das zur Bildung dieser Vektoren verwendete Plasmidkonstrukt enthielt eine Deletion im 5'-TR, relativ zum codierenden Strang des exprimierten Transgens. Diese Deletion umfasst das gesamte D-Element und 3 bp des A-Elements, umspannt also die Strangbruchstelle (6). Sämtliche AAV-Sequenzen zwischen dem Rest des A-Elements und dem Transgen sind deletiert. Dies schließt eine homologe Rekombination zwischen Sequenzen aus, die den mutierten TR und den wtTR flankieren, und verringert so die Möglichkeit einer Genkonversion, wie bei Samulski et al., (1983) Cell 33:135 beschrieben. Diese Deletion wurde konstruiert, indem an den einmal vorkommenden Restriktionsschnittstellen unmittelbar 5' vom Transgen (Kpn I) und innerhalb des Amp-Gens der bakteriellen Plasmidsequenzen (Xmn I) geschnitten wurde. Das entfernte Fragment, das einen TR enthielt, wurde durch ein Fragment aus einem zweiten rAAV-Plasmid ersetzt, das an der gleichen Stelle im Amp-Gen und an einer synthetischen Hpa I-Stelle geschnitten wurde, die zuvor in die BaI I-Stelle links von der A/D-Verbindungsstelle eingebaut worden war.
  • Bei einer alternativen Ausführungsform wird ein Templat gebildet, das vorzugsweise doppelsträngigen Vektor produziert, das an einem Ende einen auflösbaren AAV-TR aufweist, und ein modifizierter AAV-TR wird hergestellt, indem in den TR eine Sequenz inseriert wird. Bei einer besonderen Ausführungsform wird das wtAAV-Plasmid psub201 verwendet, um dieses Templat zu bilden (Samulski et al., (1987) J. Virology 61:3096). Dieses Konstrukt enthält ein einzigartiges Paar Xba I-Stellen sowie Pvu II-Stellen, die die viralen TRs flankieren. Zwei AAV-Plasmidintermediate, die sich von psub201, Hpa7 und Hpa9 ableiten, weisen einen einmaligen Hpa I-Linker auf (CCAATTGG), der an der BaI I-Stelle zwischen den Nucleotiden 121 und 122 (Hpa9) bzw. zwischen 4554 und 4555 (Hpa7) in die TR-Sequenz des AAV-Genoms eingebaut wurde (Xiao, X., (1996), "Characterization of Adeno-associated virus (AAV) DNA replication and integration", Ph. D. Dissertation, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA). Die Insertion dieser Linker verschiebt die wtAAV-Strangbruchstelle einwärts fort von der natürlichen Position, was dazu führt, dass nach Replikation keine Auflösung mehr durch das AAV-Rep-Protein erfolgen kann.
  • Diese Substrate akkumulieren ein dimeres Intermediat, bis eine Genkonversion stattfindet. Verdau von Hpa7 oder Hpa9 mit dem Restriktionsenzym Hpa I plus partieller Verdau mit Xba I führt zu neuen TRs, denen die wtAAV-Strangbruchstelle sowie das D-Element fehlt (links für Hpa9 und rechts für Hpa7). Dieses Substrat ist für eine Genkonversion ungeeignet, wie von Samulski et al., (1983) Cell 33:135 beschrieben, weil das D-Element fehlt, und akkumuliert nach Virusinfektion weiter ein dimeres Replikationsintermediat. Wenn man mit einem Molekül beginnt, das halb so groß wie das wtAAV-Genom oder kleiner ist, wird dieses Intermediat von AAV-Kapsiden bevorzugt verpackt. Diese Moleküle liegen in dimerer Form vor (kovalent verknüpft durch den modifizierten TR), insbesondere stellen sie eine einzigartige Quelle für Parvovirusvektoren dar, die doppelsträngige Substrate tragen, weil sie selbstkomplementär sind. Diese Vektorpartikel umgehen den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt, der bei allen zurzeit verwendeten AAV-Vektoren nötig ist, nämlich die Synthese eines zweiten Strangs (siehe Ferrari et al., (1996) J. Virology 70:3227-34).
  • Beispiel 7
  • Transduktion von Dendritenzellen
  • Es wurde postuliert, dass Dendritenzellen (DC) eine wichtige Rolle bei der Antigenpräsentation und bei der Initiierung verschiedener T-Zell-abhängiger Immunreaktionen spielen. Es wurde gezeigt, dass DC stärkere Antigenpräsentierende Zellen (APC) sind als es Makrophagen oder Monozyten sind. Außerdem wurde beschrieben, dass DC die T-Zell-Proliferation bis zu zehnmal effizienter stimulieren als Monozyten (Guyre et al., (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45:146, 147, Spalte 2). Dementsprechend gibt es zahlreiche Versuche, Vektoren gezielt zu Dendritenzellen zu lenken, um so eine effektivere Immunantwort zu produzieren. Es wurde bereits beschrieben, dass DC gegen AAV-Vektoren resistent sind (Jooss et al., (1998) J. Virology 72:4212).
  • DC von zwei humanen Patienten wurden erhalten und in vitro kultiviert. Zellen von jedem Patienten wurden mit wtAAV-GFP-Vektor oder pHpa7GFP (doppelsträngiger Vektor, beschrieben in Beispiel 1) mit einer MOI von 10 transduziert. In Zellen, die mit wtAAV-GFP transduziert worden waren, wurde nach 7 Tagen keine GFP-Expression nachgewiesen. Im Gegensatz dazu wurde in 5-15 % der DC, die mit dimerem pHpa7GFP-Vektor transduziert worden waren, eine GFP-Expression beobachtet.
  • Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass der bestimmende Schritt der wtAAV-Transduktion von DC in der Fähigkeit der Wirtszellen zur Synthese eines zweiten Strangs liegt. Die Parvovirusvektoren der Erfindung scheinen diesen Schritt überflüssig zu machen, indem sie der Zelle ein doppelsträngiges Substrat liefern. Dementsprechend haben die erfindungsgemäßen dimeren Parvovirusvektoren einen anderen (z. B. breiteren) Tropismus und Targetzellenbereich als wtAAV-Vektoren.
  • Beispiel 8
  • In vivo-Verabreichung von pHpa7GFP
  • Zur Bestimmung des Tropismus der doppelsträngigen Vektoren in vivo werden Mäusen intramuskulär (im) etwa 1,5 × 1011 der in Beispiel 7 beschriebenen wtAAV-GFP- oder pHPA7GFP-Vektoren verabreicht. Die Mäuse werden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verabreichung getötet (z. B. 4, 8, 16, 32, 64 Tage usw.), und es werden Autopsien durchgeführt, um die Transgenexpression in verschiedenen Wirtszellen und Geweben zu bestimmen. Das Anschalten, die Kinetik und die Fortdauer der Expression werden ebenfalls ausgewertet und für den wtAAV- und den Doppelstrangvektor verglichen. Besonders interessant sind Zellen, die üblicherweise gegen wtAAV-Vektoren resistent sind, wie Knochenmarkstammzellen, Astrozyten und pulmonale Epithelzellen. Ebenfalls interessant sind nicht replizierende und langsam replizierende Zellen, die die Synthese eines zweiten AAV-Strangs nur ineffizient unterstützen, beispielsweise Muskelzellen, Leberzellen und Zellen des zentralen Nervensystems. SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00510001

Claims (90)

  1. Doppelsträngiges ("duplexed") Parvoviruspartikel, umfassend: ein Parvoviruskapsid ein Vektorgenom, umfassend in 5'→3'-Richtung: (i) eine 5'-terminate repetitive Parvovirussequenz; (ii) eine erste heterologe Nucleotidsequenz; (iii) eine nicht auflösbare terminate repetitive Parvovirussequenz; (iv) eine separate heterologe Nucleotidsequenz, die im Wesentlichen vollständig komplementär zu der ersten heterologen Nucleotidsequenz ist; und (v) eine 3'-terminale repetitive Parvovirussequenz; wobei das Vektorgenom nach Freisetzung aus dem Parvoviruskapsid unter geeigneten Bedingungen zur Intrastrang-Basenpaarung zwischen den heterologen Nucleotidsequenzen in der Lage ist.
  2. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel, umfassend: ein Parvoviruskapsid ein Vektorgenom, umfassend in 5'→3'-Richtung: (i) eine 5'-terminale repetitive Parvovirussequenz; (ii) eine erste heterologe Nucleotidsequenz; (iii) eine nicht auflösbare terminale repetitive Parvovirussequenz; (iv) eine separate heterologe Nucleotidsequenz; und (v) eine 3'-terminate repetitive Parvovirussequenz; wobei die Nucleotidsequenzen zwischen jeder terminalen repetitiven Sequenz und der nicht auflösbaren terminalen repetitiven Sequenz wenigstens 90 % komplementär zueinander sind; und wobei das Vektorgenom ferner nach Freisetzung aus dem Parvoviruskapsid unter geeigneten Bedingungen zur Intrastrang-Basenpaarung zwischen den heterologen Nucleotidsequenzen in der Lage ist.
  3. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die terminalen repetitiven Parvovirussequenzen terminale repetitive Sequenzen von Adeno-assoziiertem Virus (AAV) sind.
  4. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach Anspruch 3, wobei die terminalen repetitiven AAV-Sequenzen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus terminalen repetitiven Sequenzen von AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 und AAV6.
  5. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach Anspruch 4, wobei die terminalen repetitiven AAV-Sequenzen AAV2-Sequenzen sind.
  6. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach irgendeinem der Ansprüche 1-5, wobei die nicht auflösbare terminate repetitive Parvovirussequenz eine nicht auflösbare terminale repetitive AAV-Sequenz ist.
  7. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach irgendeinem der Ansprüche 1-6, wobei die Terminal Resolution Site (trs) aus der nicht auflösbaren terminalen repetitiven Parvovirussequenz deletiert ist.
  8. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach Anspruch 7, wobei im Wesentlichen das gesamte D-Element aus der nicht auflösbaren terminalen repetitiven Sequenz deletiert ist.
  9. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach Anspruch 8, wobei sich die Deletion im D-Element der nicht auflösbaren terminalen repetitiven Sequenz über die A/D-Verbindungsstelle in das A-Element erstreckt.
  10. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach irgendeinem der Ansprüche 1-6, wobei die nicht auflösbare terminale repetitive Parvovirussequenz eine Insertion im D-Element umfasst.
  11. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach Anspruch 10, wobei sich die Insertion im D-Element in der Sequenz der Terminal Resolution Site (trs) befindet.
  12. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach irgendeinem der Ansprüche 1-6, wobei die nicht auflösbare terminale repetitive Parvovirussequenz ein oder mehrere Nucleotidbasensubstitutionen in der Sequenz der Terminal Resolution Site (trs) umfasst.
  13. Doppelsträngiges Parvovirus nach irgendeinem der Ansprüche 1-12, wobei die nicht auflösbare terminale repetitive Parvovirussequenz eine terminale repetitive Sequenz von einem AAV-Serotyp ist, die nicht von AAV2-Rep-Proteinen erkannt wird, oder eine terminale repetitive Sequenz von einem autonomen Parvovirus ist, die nicht von AAV-Rep-Proteinen erkannt wird.
  14. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach irgendeinem der Ansprüche 1-13, wobei das Vektorgenom etwa die Größe des Wildtyp-Genoms von Adeno-assoziiertem Virus (AAV) hat.
  15. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach irgendeinem der Ansprüche 1-14, wobei ein Polypeptid von dem Vektorgenom codiert wird.
  16. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach Anspruch 15, wobei das Polypeptid ein therapeutisches Polypeptid ist.
  17. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach Anspruch 15, wobei das Polypeptid ein immunogenes Polypeptid ist.
  18. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach Anspruch 16, wobei das Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Endostatin, Angiostatin, Superoxid-Dismutase, Erythropoietin, einem monoklonalen Antikörper, Faktor IX, Faktor X, einem lysosomalen Enzym, einschließlich Hexosaminidase A und Iduronatsulfatase, Globin, Leptin, Katalase, Tyrosinhydroxylase, einem Zytokin, einschließlich α-Interferon, β-Interferon, Interferon-γ, Interleukin-2, Interleukin-4, Interleukin-12, Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierendem Faktor und Lymphotoxin, einem Peptidwachstumsfaktor oder Hormon, einschließlich Somatotropin, Insulin, Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren 1 und 2, Blutplättchen-Wachstumsfaktor, epidermalem Wachstumsfaktor, Fibroblastenwachstumsfaktor, Nervenwachstumsfaktor, neurotrophem Faktor 3 und 4, Brain-derived neurotrophem Faktor, glialem Wachstumsfaktor, transformierendem Wachstumsfaktor α und β, einem Rezeptor, einschließlich Tumornekrosefaktorrezeptor, einem Suizidgenprodukt, einschließlich Thymidinkinase, Cytosindeaminase, Diphtherietoxin, Cytochrom P450, Desoxycytidinkinase und Tumornekrosefaktor, einem Protein, das Resistenz gegen einen Wirkstoff zur Krebstherapie vermittelt, und einem Produkt eines Tumorsuppressorgens.
  19. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach Anspruch 16, wobei das Polypeptid ein Krebs- oder Tumorantigen ist.
  20. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach Anspruch 16, wobei das Polypeptid ein Bakterienantigen, ein Virusantigen, ein Protozoenantigen oder ein Parasitenantigen ist.
  21. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach irgendeinem der Ansprüche 1-14, wobei das Vektorgenom eine Antisense-Nucleinsäure, ein Ribozym, eine RNA, die ein Spleißosom-vermitteltes trans-Splicing bewirkt, eine interferierende RNA (RNAi), eine Guide-RNA codiert.
  22. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach irgendeinem der Ansprüche 1-21, wobei das Parvoviruskapsid ein Kapsid von Adeno-assoziiertem Virus (AAV) ist.
  23. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach Anspruch 22, wobei das Parvoviruskapsid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem AAV1-, AAV2-, AAV3-, AAV4-, AAV5- und AAV6-Kapsid.
  24. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach irgendeinem der Ansprüche 1-23, wobei das Parvoviruskapsid ein Kapsid von Adeno-assoziiertem Virus (AAV) ist und die 5'- und 3'-terminalen repetitiven Parvovirussequenzen terminate repetitive AAV-Sequenzen sind.
  25. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach irgendeinem der Ansprüche 1-24, wobei die durch Intrastrang-Basenpaarung gebildeten doppelsträngigen heterologen Nucleotidsequenzen funktionsfähig mit einem Promotor- oder Enhancerelement verknüpft sind.
  26. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach irgendeinem der Ansprüche 1-25, wobei die Transkriptionsrichtung hin zur nicht auflösbaren terminalen repetitiven Sequenz verläuft.
  27. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach irgeneinem der Ansprüche 1-25, wobei die Transkriptionsrichtung weg von der nicht auflösbaren terminalen repetitiven Sequenz verläuft.
  28. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach irgendeinem der Ansprüche 1-27, wobei die Nucleotidsequenzen zwischen jeder terminalen repetitiven Sequenz und der nicht auflösbaren terminalen repetitiven Sequenz im Wesentlichen vollständig komplementär zueinander sind.
  29. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach irgendeinem der Ansprüche 1-28, wobei das doppelsträngige Parvoviruspartikel ein Hybrid-Parvoviruspartikel ist.
  30. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach irgendeinem der Ansprüche 1-29, wobei das doppelsträngige Parvoviruspartikel ein chimäres Parvoviruspartikel ist.
  31. Doppelsträngiges Parvoviruspartikel nach irgendeinem der Ansprüche 1-30, wobei das doppelsträngige Parvoviruspartikel ein gerichtetes Parvoviruspartikel ist.
  32. Pharmazeutische Formulierung, umfassend eine Vielzahl der doppelsträngigen Parvoviruspartikel nach irgendeinem der Ansprüche 1-31 in einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
  33. Nucleinsäure, umfassend ein Templat zur Produktion einer Virion-DNA, wobei das Templat eine heterologe Nucleotidsequenz umfasst, die von einer terminalen repetitiven Parvovirussequenz und einer nicht auflösbaren terminalen repetitiven Parvovirussequenz flankiert wird.
  34. Nucleinsäure nach Anspruch 33, wobei die terminale repetitive Parvovirussequenz eine terminale repetitive Sequenz von Adeno-assoziiertem Virus (AAV) ist.
  35. Nucleinsäure nach Anspruch 34, wobei die terminale repetitive AAV-Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer terminalen repetitiven Sequenz von AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 und AAV6.
  36. Nucleinsäure nach Anspruch 35, wobei die terminale repetitive AAV-Sequenz eine AAV2-Sequenz ist.
  37. Nucleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 33-36, wobei die nicht auflösbare terminale repetitive Sequenz eine nicht auflösbare terminale repetitive AAV-Sequenz ist.
  38. Nucleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 33-37, wobei die Terminal Resolution Site (trs) aus der nicht auflösbaren terminalen repetitiven Parvovirussequenz deletiert ist.
  39. Nucleinsäure nach Anspruch 38, wobei im Wesentlichen das gesamte D-Element aus der nicht auflösbaren terminalen repetitiven Sequenz deletiert ist.
  40. Nucleinsäure nach Anspruch 39, wobei sich die Deletion im D-Element der nicht auflösbaren terminalen repetitiven Sequenz über die A/D-Verbindungsstelle in das A-Element erstreckt.
  41. Nucleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 33-37, wobei die nicht auflösbare terminale repetitive Parvovirussequenz eine Insertion im D-Element umfasst.
  42. Nucleinsäure nach Anspruch 41, wobei sich die Insertion im D-Element in der Sequenz der Terminal Resolution Site (trs) befindet.
  43. Nucleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 33-37, wobei die nicht auflösbare terminate repetitive Parvovirussequenz ein oder mehrere Nucleotidbasensubstitutionen in der Sequenz der Terminal Resolution Site (trs) umfasst.
  44. Nucleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 33-43, wobei die nicht auflösbare terminale repetitive Parvovirussequenz eine terminate repetitive Sequenz von einem AAV-Serotyp ist, die nicht von AAV2-Rep-Proteinen erkannt wird, oder eine terminale repetitive Sequenz von einem autonomen Parvovirus, die nicht von AAV-Rep-Proteinen erkannt wird.
  45. Nucleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 33-44, wobei das Templat etwa die Hälfte der Größe des Wildtyp-Genoms von Adeno-assoziertem Virus (AAV) hat.
  46. Nucleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 33-45, wobei die heterologe Nucleotidsequenz oder eine hierzu komplementäre Sequenz eine Codierungssequenz für ein Polypeptid ist.
  47. Nucleinsäure nach Anspruch 46, wobei das Polypeptid ein therapeutisches Polypeptid ist.
  48. Nucleinsäure nach Anspruch 46, wobei das Polypeptid ein immunogenes Polypeptid ist.
  49. Nucleinsäure nach Anspruch 47, wobei das Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Endostatin, Angiostatin, Superoxid-Dismutase, Erythropoietin, einem monoklonalen Antikörper, Faktor IX, Faktor X, einem lysosomalen Enzym, einschließlich Hexosaminidase A und Iduronatsulfatase, Globin, Leptin, Katalase, Tyrosinhydroxylase, einem Zytokin, einschließlich α-Interferon, β-Interferon, Interferon-γ, Interleukin-2, Interleukin-4, Interleukin-12, Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierendem Faktor und Lymphotoxin, einem Peptidwachstumsfaktor oder Hormon, einschließlich Somatotropin, Insulin, Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren 1 und 2, Blutplättchen-Wachstumsfaktor, epidermalem Wachstumsfaktor, Fibroblastenwachstumsfaktor, Nervenwachstumsfaktor, neurotrophem Faktor 3 und 4, Brain-derived neurotrophem Faktor, glialem Wachstumsfaktor, transformierendem Wachstumsfaktor α und β, einem Rezeptor, einschließlich Tumornekrose-faktorrezeptor, einem Suizidgenprodukt, einschließlich Thymidinkinase, Cytosindeaminase, Diphtherietoxin, Cytochrom P450, Desoxycytidinkinase und Tumornekrosefaktor, einem Protein, das Resistenz gegen einen Wirkstoff zur Krebstherapie vermittelt, und einem Produkt eines Tumorsuppressorgens.
  50. Nucleinsäure nach Anspruch 47, wobei das Polypeptid ein Krebs- oder Tumorantigen ist.
  51. Nucleinsäure nach Anspruch 47, wobei das Polypeptid ein Bakterienantigen, eii Virusantigen, ein Protozoenantigen oder ein Parasitenantigen ist.
  52. Nucleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 33-45, wobei die heterologe Nucleotidsequenz oder eine hierzu komplementäre Sequenz ein Ribozym, eine RNA, die ein Spleißosom-vermitteltes trans-Splicing bewirkt, eine interferierende RNA (RNAi), eine Guide-RNA codieren.
  53. Nucleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 33-52, wobei die Nucleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Plasmid, nacktem DNA-Vektor, künstlichem bakteriellen Chromosom (BAC), künstlichem Hefechromosom (YAC) oder einem viralen Vektor.
  54. Nucleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 33-53, wobei die Nucleinsäure stabil in das Chromosom einer Säugerzelle integriert ist.
  55. Virion-DNA, hergestellt aus der Nucleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 33-54.
  56. Nucleinsäure, umfassend ein dimeres Templat zur Herstellung einer Virion-DNA, wobei das Templat in 5'→3'-Richtung umfasst: eine 5'-terminale repetitive Parvovirussequenz; eine erste heterologe Nucleotidsequenz; eine nicht auflösbare terminale repetitive Parvovirussequenz; eine separate heterologe Nucleotidsequenz, die im Wesentlichen vollständig komplementär zu der ersten heterologen Nucleotidsequenz ist; und eine 3'-terminale repetitive Parvovirussequenz; wobei die Virion-DNA nach Freisetzung aus dem Parvoviruskapsid unter geeigneten Bedingungen zur Intrastrang-Basenpaarung zwischen den heterologen Nucleotidsequenzen in der Lage ist.
  57. Nucleinsäure, umfassend ein dimeres Templat zur Herstellung einer Virion-DNA, wobei das Templat in 5'→3'-Richtung umfasst: eine 5'-terminate repetitive Parvovirussequenz; eine erste heterologe Nucleotidsequenz; eine nicht auflösbare terminale repetitive Parvovirussequenz; eine separate heterologe Nucleotidsequenz; und eine 3'-terminale repetitive Parvovirussequenz; wobei die Nucleotidsequenzen zwischen jeder terminalen repetitiven Sequenz und der nicht auflösbaren terminalen repetitiven Sequenz wenigstens 90 % komplementär zueinander sind; und wobei das Vektorgenom ferner nach Freisetzung aus dem Parvoviruskapsid unter geeigneten Bedingungen zur Intrastrang-Basenpaarung zwischen den heterologen Nucleotidsequenzen in der Lage ist.
  58. Nucleinsäure nach Anspruch 56 oder Anspruch 57, wobei die 5'- und 3'-terminalen repetitiven Parvovirussequenzen terminale repetitive Sequenzen von Adeno-assoziiertem Virus (AAV) sind.
  59. Nucleinsäure nach Anspruch 58, wobei die terminalen repetitiven AAV-Sequenzen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus terminalen repetitiven Sequenzen von AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 und AAV6.
  60. Nucleotidsequenz nach Anspruch 59, wobei die terminalen repetitiven AAV-Sequenzen AAV2-Sequenzen sind.
  61. Nucleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 56-60, wobei die nicht auflösbare terminale repetitive Sequenz eine nicht auflösbare terminate repetitive AAV-Sequenz ist.
  62. Nucleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 56-61, wobei die Terminal Resolution Site (trs) aus der nicht auflösbaren terminalen repetitiven Parvovirussequenz deletiert ist.
  63. Nucleinsäure nach Anspruch 44-62, wobei im Wesentlichen das gesamte D-Element aus der nicht auflösbaren terminalen repetitiven Sequenz deletiert ist.
  64. Nucleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 56-63, wobei die nicht auflösbare terminale repetitive Parvovirussequenz eine terminale repetitive Sequenz von einem AAV-Serotyp ist, die nicht von AAV2-Rep-Proteinen erkannt wird, oder eine terminate repetitive Sequenz von einem autonomen Parvovirus, die nicht von AAV-Rep-Proteinen erkannt wird.
  65. Nucleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 56-64, wobei das Templat etwa die Größe des Wildtyp-Genoms von Adeno-assoziiertem Virus (AAV) hat.
  66. Nucleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 56-65, wobei das Templat ein Polypeptid codiert.
  67. Nucleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 56-65, wobei das Templat eine Antisense-Nucleinsäure, ein Ribozym, eine RNA, die ein Spleißosomvermitteltes trans-Splicing bewirkt, eine interferierende RNA (RNAi), eine Guide-RNA codiert.
  68. Nucleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 56-67, wobei die Nucleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Plasmid, nacktem DNA-Vektor, künstlichem bakteriellen Chromosom (BAC), künstlichem Hefechromosom (YAC) oder einem viralen Vektor.
  69. Nucleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 56-67, wobei die Nucleinsäure stabil in das Chromosom einer Säugerzelle integriert ist.
  70. Nucleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 56-69, wobei die Nucleotidsequenzen zwischen jeder terminalen repetitiven Sequenz und der nicht auflösbaren terminalen repetitiven Sequenz im Wesentlichen vollständig komplementär zueinander sind.
  71. Kultivierte Zelle, umfassend die Nucleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 33-54.
  72. Kultivierte Zelle, umfassend die Nucleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 56-70.
  73. Verfahren zur Herstellung eines doppelsträngigen Parvoviruspartikels, umfassend Bereitstellen für eine Zelle, die für eine Parvovirus-Replikation permissiv ist: (a) eine Nucleinsäure, die ein Templat nach irgendeinem der Ansprüche 33-54 oder der Ansprüche 56-70 codiert; (b) Nucleotidsequenzen, die zur Replikation des Templats ausreichen, zur Produktion eines Vektorgenoms; (c) Nucleotidsequenzen, die ausreichen, um das Vektorgenom in ein Parvoviruskapsid zu verpacken, unter Bedingungen, die zur Replikation und Verpackung des Vektorgenoms in das Parvoviruskapsid ausreichen, wodurch in der Zelle doppelsträngige Parvoviruspartikel produziert werden, die das Vektorgenom enkapsidiert im Parvoviruskapsid umfassen.
  74. Verfahren nach Anspruch 73, ferner umfassend den Schritt des Sammelns der doppelsträngigen Parvoviruspartikel.
  75. Verfahren nach Anspruch 74, ferner umfassend den Schritt des Lysierens der Zelle vor Sammeln der doppelsträngigen Parvoviruspartikel.
  76. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 73-75, wobei die rep- und cap-codierenden Parvovirussequenzen durch ein oder mehrere Verpackungsvektoren bereitgestellt werden.
  77. Verfahren nach Anspruch 76, wobei die rep- und cap-codierenden Parvovirussequenzen durch ein Plasmid bereitgestellt werden.
  78. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 73-75, wobei die rep-codierenden Parvovirussequenzen stabil in die Zelle integriert sind.
  79. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 73-75 oder nach Anspruch 78, wobei die cap-codierenden Parvovirussequenzen stabil in die Zelle integriert sind.
  80. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 73-79, wobei die das Templat umfassende Nucleinsäure ein Plasmid ist.
  81. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 73-79, wobei die das Templat umfassende Nucleinsäure ein viraler Vektor, gegebenenfalls ein Herpesvirusvektor, ein Adenovirusvektor oder ein Baculovirusvektor ist.
  82. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 73-79, wobei die das Templat umfassende Nucleinsäure stabil in das Chromosom einer Säugerzelle integriert ist.
  83. In-vitro-Verfahren zum Transportieren einer Nucleotidsequenz zu einer Zelle, umfassend das In-Kontakt-Bringen einer Zelle mit einem doppelsträngigen Parvoviruspartikel nach irgendeinem der Ansprüche 1-31 unter Bedingungen, die ausreichen, damit das doppelsträngige Parvoviruspartikel in die Zelle eintritt.
  84. Verfahren nach Anspruch 83, wobei die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Krebszellen, Tumorzellen, Nervenzellen, einschließlich Zellen des peripheren Nervensystems und des zentralen Nervensystems einschließlich Hirnzellen, Lungenzellen, Muskelzellen, Epithelzellen, einschließlich Epithelzellen von Darm und Luftwegen, Leberzellen, Dendritenzellen, Augenzellen, einschließlich Retinazellen, Pankreaszellen, einschließlich Inselzellen, Myokardzellen, Knochenzellen, einschließlich Knochenmarkstammzellen, hämatopoetischen Stammzellen, Milzzellen, Keratinozyten, Fibroblasten, Endothelzellen, Prostatazellen, Keimzellen, Progenitorzellen, neuralen Stammzellen und Leberstammzellen.
  85. Verwendung eines doppelsträngigen Parvovirus nach irgendeinem der Ansprüche 1-31 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung beim Transport einer Nucleinsäure zu einer Zelle.
  86. Verwendung nach Anspruch 85, wobei die Nucleotidsequenz ein Polypeptid codiert.
  87. Verwendung nach Anspruch 85, wobei die Nucleotidsequenz eine Antisense-Nucleinsäure, ein Ribozym, eine RNA, die ein Spleißosom-vermitteltes trans-Splicing bewirkt, eine interferierende RNA (RNAi), eine Guide-RNA codiert.
  88. Verwendung nach Anspruch 85 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Krankheit, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus zystischer Fibrose oder einer anderen Lungenkrankheit, Hämophilie A, Hämophilie B, Thalassämie, Anämie oder einer anderen Blutkrankheit, AIDS, Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Huntington-Krankheit, amyotropher Lateralsklerose, Epilepsie oder einer anderen neurologischen Krankheit, Krebs, Diabetes mellitus, Muskeldystrophie (einschließlich Duchenne'sche Muskeldystrophie und Becker'sche Muskeldystrophie), Gaucher Krankheit, Hurler Krankheit, Adenosindeaminase-Mangel, einer Glykogenspeichererkrankung, Ornithintranscarbamylase-Mangel, Tay-Sachs-Erkrankung, Hunter-Syndrom oder einem anderen Stoffwechseldefekt, einer degenerativen Retinaerkrankung oder einer anderen Erkrankung des Auges.
  89. Verwendung nach Anspruch 85 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs oder Tumoren.
  90. Verwendung eines doppelsträngigen Parvovirus nach irgendeinem der Ansprüche 1-15, 17 oder 19-31 zur Herstellung eines Medikaments zum Transport eines immunogenen Polypeptids zu einer Zelle.
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