CN101173294B - 一种基因微链载体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因微链载体，由线性DNA序列表达框和两个对称排列的Cap保护序列组成，Cap保护序列封闭线性DNA序列表达框两端，对Cap保护序列进行修饰以构建不同的保护结构，在此基础上，构建了在EB病毒相关肿瘤中特异表达的MEKK1微链载体。本发明同时公开了所述基因微链载体的构建方法。微链载体的线性核酸结构中含有可置换目的基因表达框，使之具有加载外源基因通用性良好、置换方便等优点，此类微链载体有望成为一种基因治疗的通用型载体，为基因治疗的载体开发提供了一条新的思路和方向。

Description

一种基因微链载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及基因载体技术领域，尤其是涉及一种基因微链载体及其构建方法和应用。

背景技术

目前，基因治疗的难点是载体的转染、表达效率低和存在安全隐患，安全有效的基因治疗载体是现今基因治疗研究领域的重点。基因治疗载体的安全性问题使得开发出安全可靠、转染效率高的载体成为现今基因治疗研究领域的重点。

做为基因治疗主要载体的病毒载体其局限性则是显而易见：因为病毒型载体利用其自身感染程序将外源目的基因导入宿主细胞，故为维持该感染过程则需要完整病毒的参与。这些病毒成分在宿主细胞内复制极易引发机体产生不同程度的免疫反应，而且存在插入突变等致瘤、致毒风险。

非病毒载体在安全性方面可能优于病毒载体，虽然不会整合入宿主细胞染色体中，同时具有无传染性、不限制载体容量、可大量制备等优点，但同样能导致免疫反应，而且转染效率不高。目前非病毒载体面临两大难题：首先，非病毒型载体是通过内吞方式将目的基因导入细胞，进入胞质的内吞小泡很快被溶酶体融合并被其释放的各种酶系所降解。由此产生的后果将是严重影响目的基因的表达及其在基因治疗中的实际用价值。其次，源于非宿主载体的DNA表达产物特别是CpG序列的大量存在可能引发宿主免疫反应。美国StanfordUniversity的Kay MA等开发出几乎不含非宿主DNA成分的微环DNA质粒(Minicircle DNA vectors)，但此种微环载体在转染效率上尚显不足。

所以人工合成具有稳定性、安全性和靶向性的非病毒载体的研究日益受到重视，比如构建新型微链载体，但如何有效地防止体内核酸外切酶的降解，增强微链载体在细胞内的稳定性、安全性是一个新的难题。

同时，载体的分子量要求更小，以便有利于从胞浆中进入到细胞核内表达，有效地提高在体细胞内的转染效率。

MEKK1作为丝/苏氨酸的蛋白激酶，位于信号传导通路中的上游，将细胞外信号经级联放大传入细胞内。MEKK1介导的信号通过级联放大直接作用于EB病毒自杀基因启动子，诱导自杀基因的表达，使肿瘤细胞对抗癌药物GCV敏感性增加数十倍。本申请入拟以其为靶点，通过导入具有活性的MEKK1基因激活EBV-TK基因表达调控系统，达到治疗鼻咽癌等EB病毒相关肿瘤目的。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的空白，提供一种基因微链载体，转染效率高，能有效地防止体内核酸外切酶的降解，在细胞内的稳定性、安全性较高。

本发明的另一个目的是提供所述的基因微链载体的构建方法，简单易行，可靠性高。

本发明还有一个目的是提供所述基因微链载体的应用，通过装载EB病毒膜蛋白LMP1的启动子使得MEKK1基因只在EB病毒感染的细胞中进行表达以制备选择性杀伤鼻咽癌细胞的药物。

本发明的技术方案是提供一种基因微链载体，由线性DNA序列表达框和两个对称排列的Cap保护序列组成，所述Cap保护序列封闭线性DNA序列表达框两端。

所述Cap保护序列进行修饰以构建不同的保护结构。

所述对Cap保护序列进行修饰是通过模拟真核生物细胞内tRNA相对稳定的c环结构，构建微链两端稳定的Cap序列，分别在其两端加上AseI、AflII酶切位点。

所述线性DNA序列为EGFP基因序列。

所述线性DNA序列为MEKK1基因序列。

本发明提供了所述EGFP基因微链载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)模拟体内tRNA稳定C环的帽状Cap构建；

(2)目的基因质粒的提取；

(3)基因表达框的获得；

(4)目的基因表达框和Cap序列进行连接；

(5)微链载体的扩增、纯化和保存。

提取pEGFP-N3质粒，37℃水浴条件下双酶切pEGFP-N3质粒4h，采用1％的琼脂糖凝胶胶回收1.6kb左右的片段；所述目的基因片段和两端Cap采用摩尔比1∶10、16℃条件下进行连接，Ligation High连接酶作用下连接30～60min或T4连接酶作用下过夜连接12～16h。

本发明提供了所述MEKK1基因微链载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)B95-8培养和细胞收集，EBV的提取及EBV基因组DNA的提取，EBV膜蛋白LMPl启动子的获得；

(2)pCMV-MEKK1质粒的大量提取及MEKK1基因的获得；

(3)XhoI酶切消化LMP1 Promoter及MEKK1基因并对其进行连接；

(4)PCR扩增连接产物并利用AseI、AflII对连接产物进行消化；

(5)LMP1 promoter-MEKK1微链载体的构建和量化扩增；

(6)将LMP1 promoter-MEKK1目的条带连上T载体并进行量化扩增；

(7)构建pEGFP-MEKK1质粒并进行量化扩增；

(8)将等量的pCMV-MEKK1质粒、MEKK1-T质粒、MEKK1微链载体转染进入B95-8细胞；

(9)Western-blotting检测pCMV-MEKK1质粒、MEKK1-T质粒、MEKK1微链载体在B95-8细胞内MEKK1下游产物TK的表达。

本发明提供了所述MEKK1基因微链载体的应用，其特征在于通过装载EB病毒膜蛋白LMP1的启动子使得MEKK1基因只在EB病毒感染的细胞中进行表达以制备选择性杀伤鼻咽癌细胞的药物。

本发明的有益效果是：

(1)构建了一种新型微链载体，在目的基因的线性表达框两端加上Cap保护序列，该Cap序列模拟真核细胞中tRNA中较稳定的c环设计，封闭线性DNA两端的线性缺口，可有效地防止体内核酸外切酶的降解，增强微链载体在细胞内的稳定性；微链载体的线性核酸结构中含有可置换目的基因表达框，使之具有加载外源基因通用性良好、置换方便等优点。因此，此类微链载体有望成为一种基因治疗的通用型载体。

(2)本发明的微链载体分子量仅为一般质粒载体的1/3甚至更小，更加有利于从胞浆中进入到细胞核内表达，可有效地提高在体细胞内的转染效率；较少含有非宿主性基因成分，不仅易于通过胞膜的核酸通道进入细胞，而且可游离于宿主染色体之外稳定自主表达，因而具有较高的生物安全性和较低的免疫原性。

(3)本发明微链载体仅含很少量的外源序列，基本不含有被认为是引发基因治疗免疫毒性反应主要原因的CpG序列，而且由于微链载体的获得可通过PCR扩增，排除了质粒载体在扩增和提取过程当中摄入细菌内毒素的问题，能够有效地增强其作为基因治疗载体的安全性。

(4)微链载体是一种全新的基因治疗载体，为基因治疗的载体开发提供了一条新的思路和方向，对其保护Cap的修饰，还可能使得其具有靶向特异性，选择性杀伤病变细胞而不损伤癌细胞，具有现有基因治疗载体难以达到的优越性，较好地满足基因治疗载体所需要的安全性和转染效率，开发和生产成本相对较低，能大规模适应于研究和生产及临床应用，具有很好的应用前景。尤其是针对鼻咽癌等EB病毒相关肿瘤都存在EB病毒感染及其生物学特征，本课题提出以解除EB病毒自杀基因沉默为靶标的治疗策略。将MEKK1插入微链载体的目的基因表达框中，在EB病毒特异性LMP1启动子的调控下，MEKK1可通过信号级联放大解除EB病毒自杀基因的沉默状态，驱动自杀基因表达并放大其拷贝数量，解决EB病毒自杀基因拷贝数不高导致的治疗效果不佳的问题。同时，通过EB病毒特异性启动子的调控达到仅对EB病毒感染阳性肿瘤细胞产生选择性的杀伤效应，而不对正常体细胞产生影响，具有其它治疗方式所难以达到的特异性和安全性。

附图说明

图1pEGFP-N3质粒图谱

图2EGFP基因琼脂糖电泳检测图

图3微链载体示意图

图4微链载体的扩增产物电泳检测图

图53.5％DNA-PAGE胶区分微链载体和GFP表达框

图6等摩尔的微链载体与pEGFP-N3同时转染进入293细胞48h后10×10镜头下荧光显微镜检测结果

图7等质量的微链载体和pEGFP-N3质粒转染进入293细胞48h后10×5镜头下荧光显微镜检测结果

图8等质量的微链载体和pEGFP-N3质粒转染进入3T3细胞中48h后10×10镜头下荧光显微镜检测结果

图9等质量的微链载体和pEGFP-N3质粒转染进入CNE2细胞48h后10×10镜头下荧光显微镜检测结果

图10等质量的微链载体和pEGFP-N3质粒转染进入B95-8细胞48h后10×10镜头下荧光显微镜检测结果

图11等质量的微链载体与pEGFP-N3质粒转染的293细胞进行流式细胞仪观察结果

图12等质量的微链载体与pEGFP-N3质粒转染的3T3细胞进行流式细胞仪观察结果

图13等质量的微链载体与pEGFP-N3质粒转染的CNE2细胞进行流式细胞仪观察结果

图14微链载体在不同细胞株中表达持续时间的观察

图15微链载体与pEGFP-N3质粒对细胞增值的影响

图16EBV的提取检测及LMP1 promoter的PCR扩增电泳检测图

图17PCR量化扩增LMP1 promoter琼脂糖胶凝体电泳法检测图

图18HindIII单酶切和HindIII、XhoI双酶切pCMV-MEKK1质粒电泳检测提取结果图

图19PCR扩增MEKK1电泳检测图

图20扩增后得到MEKK1和LMP1 promoter基因表达框消化后连接电泳检测图

图21扩增MEKK1微链载体图和微链载体示意图

图22MEKK1-T载体经过AflII单酶切和AseI、AflII双酶切后检测图

图23pEGFP-MEKK1经过AflII单酶切和AseI、AflII双酶切后检测图

图24Western-blotting检测MEKK1下游产物TK的表达

具体实施方式

下面结合附图进一步详细说明本发明。

实施例1含GFP报告基因的微链载体的构建及转染效率的测定

一材料与方法

(一)材料

1主要材料pEGFP-N3质粒，大肠杆菌菌株DH5α，细胞株3T3、CNE2和B95-8由本实验室保种，293细胞由中山大学人体解剖教研室邹俊涛博士惠赠，Cap序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

2、工具酶与主要试剂限制性内切酶Ase I、Afl II购自晶美公司，核酸外切酶ExoIII、T4连接酶购自TaKaRa公司；Ligation high连接酶购自日本TOYOBO BO公司，琼脂糖粉来自Shanghai YitoEnterprise Company；小牛血清购自北京鼎国生物技术有限公司；细胞转染试剂购自锐博生物科技有限公司；其余试剂为国产分析纯以上。

3分子量标准和试剂盒核酸分子量标准(1kb ladder marker，DL2000 ladder marker)购自Takara公司；质粒提取试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒，PCR清洁试剂盒购自Omega公司。

4主要仪器荧光显微镜：Olypums公司；流式细胞仪：中山大学附属第一医院检验科6楼流式细胞室；核酸电泳仪：北京市六一仪器厂的DYY-2C型和DYY-2C型电泳仪；紫外分光光度仪：Beckmancoulter的DU 530；PCR仪：GeneAmp PCR System 9700和Bio-Rad；纯水系统：Mill iporeAFS-25EDI；；旋涡混合器：江苏海门市麒麟医用仪器厂；离心机：雄发公司的TGL-16 Centrifuge，Beckmancoulter的Avanti J-E和eppendorf的centrifuge 5417R；电子天平：赛多利斯公司的BT 224 S；pH计：赛多利斯公司的PB-10；超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份公司的JY88-II；水浴锅：上海森信实验仪器公司的DK-8D型电热恒温水槽

(二)主要溶液的配制

1、LB(Luria-Bertani)培养基

每升培养基中加入：胰蛋白胨(trypton)10g；酵母提取物(yeastextract)5g；NaCl 10g；用三蒸水定容至1L，高压灭菌后使用。

2、Tris-乙酸(TAE)

工作液(1X)Tris-乙酸40mM；EDTA 1mM；储存液(50X)Tris-碱242g；冰乙酸57.1mL；EDTA(0.5M，pH8.0)100mL用三蒸水定容至1L。

3、Tris-硼酸(TBE)

工作液(1×)Tris-硼酸40mM；EDTA1mM；储存液(5×)Tris-碱54g；硼酸27.5g；EDTA(0.5M PH8.0)20ml；用三蒸水定容至1L。

4、PBS

工作液(1X)NaCl137mM；KCl 2.7mM；Na2HPO48.1mM；KH2PO41.5mM；储存液(10X)；NaCl40g；KCl 1g；Na2HPO4 7.2g；KH2PO4 1.2g；用三蒸水定容至1L。

5、饱和硫酸铵溶液 室温下称取100g的水，加入76.7g的硫酸铵固体。

6RPMI 1640培养基 取培养基粉末，加入2.38g HEPES和2gNaHCO3，用超纯水溶解定容至1L，加入7ul-巯基乙醇，4℃静置约4h，用0.22um孔径的滤膜过滤，置37℃，5％CO2细胞培养箱48h检菌。

7DMEM培养基 取培养基粉末，加入2.38g HEPES和2gNaHCO3，用超纯水溶解定容至1L，加入7ul-巯基乙醇，4℃静置约4h，用0.22um孔径的滤膜过滤，置37℃，5％CO2细胞培养箱48h检菌。

83.5％DNA-PAGE胶 30％丙烯酰胺1.17ml；10×TBE 1ml；10％APS(过硫酸胺)450ul；TEMED10ul；加三蒸水至10ml。

9碱裂解液I(制备质粒)葡萄糖50mM；Tris-Cl(PH 8.0)25mM；EDTA(PH 8.0)10mM；溶液I可一次配置100ml，15psi压力下灭菌20min后，保存在4℃。

10碱裂解液II(制备质粒)NaOHO.2M；SDS(m/v)1％，溶液II现配现用，在室温条件下使用。

11碱裂解液III乙酸钾(5M)60ml；冰乙酸11.5ml；水加至100m，保存于4℃，用时至于冰浴。

(三)实验方法

1微链载体Cap序列的构建模拟真核生物细胞内tRNA相对稳定的c环结构，构建微链两端稳定的Cap序列，分别在其两端加上AseI、AflII酶切位点，其序列结构见表1：

表1Cap的核苷酸序列及其保护结构形状

2pEGFP-N3质粒的提取

制备感受态细胞，取1ulpEGFP-N3质粒转入100ulDH5α感受态，涂布于含Kan的固体LB培养板，待37℃，5％CO2培养箱中过夜培养后，挑取单克隆菌于5mlLB培养液，加入kan至浓度为100ug/ml后200rpm摇至OD值约为0.6后，转入500ml含kan的LB中，200rpm摇12-16h，用《分子克隆》p32-36上的方法大提质粒，并对质粒进行纯化和电泳检测，电泳条带位于4.7kb左右，用紫外分光光度仪检测质粒提取量。

3EGFP基因表达框的获得

利用AseI，Afl II在buffer O缓冲液中双酶切pEGFP-N3质粒，酶切条件为37℃水浴下4h，在1％的琼脂糖凝胶电泳中加入1kb的DNA ladder marker，胶回收1.6kb左右的片段，即为含启动子、EGFP基因、polyA尾的目的基因表达框。

4微链载体的构建

加入EGFP表达框及10倍摩尔量的两端Cap保护序列，在Ligation High连接酶的作用下，16℃30min反应，或T4连接酶16℃作用下过夜连接12-16h，连接酶将在酶切位点处对目的基因表达框和Cap序列进行连接。

5微链载体的检测与量化扩增

利用3.5％聚丙烯酰胺(PAGE)胶经溴化乙啶(EB)染色后紫外灯下可观测到连接上的微链载体和未连接上的单独基因片段的差别约在50bp左右，设计引物通过PCR反应可量化扩增微链载体。引物序列为5’ACAAGTTCAGCGTGTCCG3’

6 293、3T3、CNE2、B95-8细胞的培养

293、3T3、CNE2细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养基中，B95-8细胞在含10％小牛血清的1640培养基中生长至培养瓶底面积80％左右时，用PBS进行清洗两次，0.25％胰酶进行消化，加入适量培养基终止消化，1000rpm，5min离心收集细胞，用适量培养基进行重悬后分至3-4瓶内进行继续培养，每隔1-2天进行换液一次。

7pEGFP-N3与微链载体转染进入293、3T3、CNE2、B95-8细胞

在转染前24h，将90mm培养皿中细胞传代为4皿35mm小培养皿，待培养皿中细胞数量增值至5×10⁵个时，分别将等摩尔量与等质量的pEGFP-N3质粒和微链载体用脂质体转染试剂按试剂说明书转染进入293、3T3、CNE2、B95-8细胞，同时设置空白对照组，每隔24小时进行换液培养。

8GFP表达的荧光显微镜观察

转染48h后，利用荧光显微镜初步观察GFP的表达情况，选择相同视野下的细胞进行比较。此后每隔24h观察，记录表达变化情况和持续表达表达时间。

9GFP表达的的流式细胞仪观察

待皿内细胞数量为5-10×10⁵个左右时，将细胞用0.25％胰酶消化后，用1mlPBS重悬，流式细胞仪观察GFP的表达情况。

10转染后细胞对细胞毒性作用观察和对细胞增值的影响

分别取等质量的pEGFP-N3质粒与微链载体转染293细胞，在35mm培养皿用无血清DMEM培养基中培养，设空白对照，48h后用细胞计数法统计皿内细胞数量，记录细胞死亡情况。

二结果与讨论

(一)实验结果

1Cap序列的筛选及构建

在目的基因表达框两端加Cap保护序列封闭DNA外端缺口，可有效防止真核细胞内的核酸外切酶将线性表达框进行非特异性的降解，阻断核酸外切酶的作用，使目的基因顺利进入核内表达。我们模拟真核细胞内tRNA的稳定c环结构，使得保护Cap具有良好的抗外切酶作用。Cap的核苷酸序列见表1，首尾两端Cap分别具有AseI，AflII酶切位点.

2pEGFP-N3质粒的提取及EGFP基因的获得

用《分子克隆》的p32-36上的方法大提质粒，纯化后经紫外分光光度计检测得到pEGFP-N3质粒约2mg，质粒图谱如图1。pEGFP-N3质粒经AseI，Afl II双酶切后得到的含pCMV-EGFP-polyA的基因表达框片段，长度大约在1.63kb，凝胶回收可得到该片段，如图2所示。

3微链载体的构建

T4 DNA连接酶在16℃水浴12-16h过夜连接后将Cap序列同目的基因表达框进行连接，连接之后利用核苷酸外切酶ExoHI对有线性缺口的DNA片段具有外且活性的特点将未连接产物在37℃条件下作用2h，使得未连接产物在ExoHI的作用下降解为单个核苷酸，用PCR产物清洁试剂盒对ExoIII外切的体系进行纯化，得到微链载体的纯化物。构建好的微链载体示意图如图3。

4微链载体的PCR扩增

设计PCR引物5’ACAAGTTCAGCGTGTCCG3’，加入适量的ExTaq聚合酶，dNTP及反应缓冲液，50ul体系10管进行PCR扩增，得到微链载体的扩增产物，PCR产物电泳检测如图4，其中1为EGFP，2为PCR扩增的微链载体。利用3.5％PAGE胶进行电泳检测，检测结果如图5，1为微链载体，2为EGFP基因表达框，PCR Clean回收微链载体。

5pEGFP-N3质粒与微链载体转染进入293细胞，48h后荧光显微镜检测结果

(1)将等摩尔的微链载体与pEGFP-N3质粒同时转染进入细胞，其表达的GFP在荧光的激发能显出绿色荧光，根据荧光的表达情况可以初步推测其转染效率。48h后10×10镜头下表达效率见图6，其中左图为pEGFP-N3质粒，中间图片为微链载体，右图为空白对照。

(2)将等质量的微链载体和pEGFP-N3质粒转染进入293细胞中，48h后10×5镜头下观察其转染表达效率见图7，其中左图为pEGFP-N3质粒，中间图片为微链载体，右图为空白对照。我们可以得到结论等质量的微链载体转染表达效率比pEGFP-N3质粒高，因为微链载体微链载体分子量仅为一般质粒载体的1/3甚至更小，更加有利于从胞浆中进入到细胞核内表达，可有效地提高在体细胞内的转染效率。

6pEGFP-N3质粒与微链载体转染进入3T3细胞，48h后荧光显微镜检测结果

将等质量的微链载体和pEGFP-N3质粒转染进入293细胞中，48h后10×10镜头下观察其转染表达效率见图8，其中左图为pEGFP-N3质粒，中间图片为微链载体，右图为空白对照。

7pEGFP-N3质粒与微链载体转染进入CNE2细胞，48h后荧光显微镜检测结果

将等质量的微链载体和pEGFP-N3质粒转染进入CNE2细胞中，48h后10×5镜头下观察其转染表达效率见图9，其中左图为pEGFP-N3质粒，中间图片为微链载体，右图为空白对照。

8pEGFP-N3质粒与微链载体转染进入B95-8细胞，48h后荧光显微镜检测结果

将等质量的微链载体和pEGFP-N3质粒转染进入B95-8细胞中，48h后10×10镜头下观察其转染表达效率见图10，其中左图为pEGFP-N3质粒，中间图片为微链载体，右图为空白对照。

9流式细胞仪测定GFP基因经两种载体转染后在293、3T3、CNE2细胞中的表达效率

(1)为能更准确地测定其转染表达效率，我们对等质量的微链载体与pEGFP-N3质粒转染的293细胞进行流式细胞仪观察，检测GFP表达细胞数占总细胞的百分数，得到其转染效率。每批次细胞依次经过24h、48h、72h进行观察，取三个批次细胞在相同时刻转染百分率的平均数对时间作图，见图11，每一组紧靠的两柱形中左边柱形为pEGFP-N3，右边柱形为微链载体。每批次细胞数据见表2。

表2：pEGFP-N3与微链载体对293细胞的转染率(％)

由图11我们可以得到在293细胞内，转染后相同时间微链载体比pEGFP-N3质粒表达GFP的效率高。

(2)我们在3T3、CNE2细胞中进行了同样的实验，得到了较类似的实验结果。转染后细胞的分别经过24h，48h，72h后检测，其转染效率相对时间作图分别得图12和图13，图12中每一组紧靠的两柱形中右边柱形为pEGFP-N3，左边柱形为微链载体。图13中每一组紧靠的两柱形中左边柱形为pEGFP-N3，右边柱形为微链载体。实验结果显示在3T3、CNE2细胞内，微链载体表达GFP的效率与pEGFP-N3质粒基本持平，表达效率有一定的优势但是并不非常明显。不同细胞株GFP表达效率相差较大。

10微链载体在293，3T3，CNE2，B95-8细胞株中表达持续时间的观察

为观察微链载体在不同细胞株内表达GFP的持续时间，并和pEGFP-N3质粒进行对照，转染后每隔24小时进行荧光显微镜观察GFP的表达，记录荧光完全猝灭的时间。结果如图14，其中每一组紧靠的两柱形中左边柱形为pEGFP-N3，右边柱形为微链载体；第一组在293细胞株中表达，第二组在3T3细胞株中表达，第三组在CNE2细胞株中表达，第四组在B95-8细胞株中表达。

从图上我们可以看出在不同的细胞株内，GFP表达的持续时间相差较大。总体来说，GFP在由微链载体转染进入细胞后GFP的表达持续时间基本与质粒转染后相同，显示了微链载体在装载基因转染后在不同细胞株内均能稳定持续表达。

11微链载体和pEGFP-N3质粒转染后对细胞的毒性实验

用细胞计数法检测微链载体和pEGFP-N3质粒转染进入293细胞后的毒性损伤作用。设置微链载体、pEGFP-N3质粒、空脂质体转染三组。转染后换用无血清培养基抑制细胞增值，35mm培养皿内每皿接种1×10⁵个细胞，48h后细胞计数观察其细胞死亡百分数，取三批细胞的平均数作图15，其中1为pEGFP-N3；2为微链载体；3为6.5％cationic lipids。图15结果发现虽然效果不是很明显，但仍可以发现微链载体对细胞的损伤稍比pEGFP-N3质粒稍小。用细胞计数的方法观察pEGFP-N3质粒与微链载体对细胞的增值无明显影响。

实验结果初步说明了微链载体的转染效率相对于原pEGFP-N3质粒有所提高。这种提高可以用微链载体有利于基因进入到细胞核进行解释。核被膜被认为是非病毒类载体进入到细胞核最主要的屏障，能较大地影响非病毒类载体地转染和表达效率。DNA进入到细胞核与载体大小有关，载体分子量越大，能进入到细胞核内的机会就越少。由于微链载体分子量只是普通质粒载体的1/3甚至更少，而且其呈线状结构，更加有利于进入到细胞核内表达。因此能有效提高转染效率。微链载体另外一个较为显著的优点在于它只含有很少量的未甲基化的CpG序列，除去了普通质粒载体的大量的无治疗作用基因中包含的CpG序列。CpG序列被认为是导致免疫反应的重要原因。研究显示，患有纤维囊泡症的患者被导入阳离子脂质体和pDNA后将导致发热、肌肉疼痛、肺功能下降和精神紧张的概率远大于仅被导入阳离子脂质体的患者。克隆仅含原质粒约一半CpG序列的质粒载体能有效减少炎症发生概率，但由于其费用较高，临床应用价值较低。而微链载体所含有的CpG序列非常少，可减少免疫反应发生的概率，因而具有较大的临床意义。

通过对Cap序列的修饰，可以使得其具有靶向效应，从而进一步提高其作为基因治疗载体的应用价值。选用肿瘤细胞特异性标志高亲和多肽序列作为Cap保护序列的骨架，能使该微链载体具有较高的稳定性和高特异靶向性。

本实验初步证实了微链载体做为基因治疗载体有比传统质粒更高的表达效率。其较小的分子量和线性结构使该载体易于通过细胞膜系统中的核酸通道进入细胞，而不必采用内吞方式，提高了转染效率。其较少含有非宿主性基因成分，并可游离于宿主染色体之外稳定自主表达。因而又具有较高的生物安全性和较低的免疫原性。微链载体具有传统载体所难以达到的安全性，同时又能使转染效率有一定的提高，并且有望开发出具有靶向特异性的载体。随着技术的成熟和研究的深入，其有可能成为基因治疗的一种通用载体，促进基因治疗的发展。

实施例2MEKK1基因微链载体的构建及表达检测

一材料与方法

(一)材料

1主要材料 pCMV-MEKK1质粒、B95-8细胞由本实验室保种，pMD18-T Vector购自TaKaRa公司，预染蛋白标准蛋白购自基因公司，来自纽英伦生物技术有限公司(new England biolabs)；一抗鼻咽癌患者血清由中山大学附属肿瘤医院检验科刘万里老师惠赠；二抗购自博士德生物有限公司，一抗兔抗β-actin购自北京博奥森生物技术有限公司；二抗为羊抗兔-HRP，购自博士德生物有限公司；PMSF，牛血清白蛋白组分五(BSA)购自北京鼎国生物技术有限公司；蛋白定量试剂为Bio-Rad公司的Bio-Rad Protein Assay试剂盒；RPMI1640、DMEM培养基粉末购自Gibco公司；β-巯基乙醇购自Sigma公司；新生牛血清(NPS)购自PPA公司；其余试剂为国产分析纯。

2分子量标准 1kb marker，DL2000marker，200bp DNA laddermarker均购自TaKaRa公司

3实验所用到的酶 Ex Tap酶、T4 DNA连接酶购自TakaRa公司，XhoI、AseI、AflII购自Fermentas公司，PCR Master Mix购自TianGen，

4所用试剂盒 胶回收试剂盒购自BioFlux公司，质粒提取试剂盒、PCR Clean试剂盒购自Omega公司

5主要仪器 纯水系统：Millipore的AFS-25EDI；电子天平：赛多利斯公司的BT 224 S；离心机：Eppendorf的centrifuge 5417R；pH计：赛多利斯公司的PB-10；超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份公司的JY88-II；蛋白电泳仪：Bio-Rad的PowerPac basic；分光光度仪：Beckman coulter的DU 530。

(二)主要溶液的配置

1、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)

Tris-HCl(1M，pH6.8)2.5ml；β-巯基乙醇1.0ml；SDS 0.6g；甘油2ml；溴酚蓝10mg，用三蒸水定容至10ml。

(2X)

Tris-HCl(1M，pH6.8)2ml；β-巯基乙醇2.0ml；SDS(10％)8ml；甘油5ml；溴酚蓝(1％)3ml。

2、电泳缓冲液(running buffer)(Tris-甘氨酸)

工作液(1X)

Tris-base 25mM；甘氨酸(glycine)250mM；SDS 0.1％；储存液(10X)；Tris-base 30.3g；甘氨酸(glycine)144.4g；SDS10g；用三蒸水定容至1L。

3、电转缓冲液(transfer buffer)

工作液(1X)Tris-base25mM；甘氨酸(glycine)250mM；甲醇20％

储存液(10X)Tris-base30.3g；甘氨酸(glycine)144.4g；用三蒸水定容至1L，甲醇临用时加入。

4、TBS-T

工作液(1X)Tris-base2.42g；NaCl8g；Tween-20 0.1％

储存液(10X)Tris-base24.2g；NaCl 80g；用盐酸调PH至7.6，用三蒸水定容至1L，Tween-20临用时加。

5、Stripping buffer Tris-HCl(1M，pH6.8)31.2ml；SDS10g；β-巯基乙醇3.497ml；用三蒸水定容至500ml，β-巯基乙醇临用时加。

6、考马斯亮蓝染色液 考马斯亮蓝R-250 0.1％；甲醇(或乙醇)40％；冰醋酸10％

7、三去污裂解液 Tris-Cl(pH＝8.0)50mM；NaCl150mM；NaN30.02％；SDS 0.1％；NP-40 1％；脱氧胆酸钠0.5％；EDTA1mM。

8TBE

5×

Tris-base 54g；硼酸27.5g；0.5M EDTA(PH 8.0)20ml；加水至1L。

8STE

Tris-Cl 10mM；NaCl 0.1M；EDTA 1mM，高压蒸汽灭菌15min，贮存于4℃。

(三)实验方法

1B95-8的培养和细胞收集

取保存在液氮罐的B95-8一管，在37℃水浴中融化后离心使细胞沉淀，用适量1640培养基重悬，至于90mm培养皿中培养，每隔24-48h换液一次，待细胞长至80％左右时传代。收集传代时的细胞上清，至于-80℃保存。收集10皿约200ml的细胞悬液。

2EBV的提取及EBV基因组DNA的提取

在37℃水浴条件下解冻收集的细胞悬液，4℃，4000rpm离心30min，转移上清至另外的离心管，4℃，41,000rpm离心30min，取沉淀用适量的TE重悬过夜，加入蛋白酶K至50ug/ul，保持EDTA浓度至20mM，加入10％SDS至终浓度为0.5％，将混合物在56℃条件下温育1h，然后冷却至室温，加入等体积的饱和酚，充分混合后10000g，2min将两相分开，吸取水相至另一离心管，加入等体积氯仿抽提，标准乙醇沉淀法纯化DNA，最大转速2min后弃去上清，挥干乙醇后加入50ul无菌水溶解，得到EBV基因组DNA。可用检测引物通过PCR方法检测EBV是否提取获得。

3EBV膜蛋白LMPl启动子的获得

Pri1序列为：5’GAC AT/TAAT CTCAGGGCAGTGTGTCAG 3’包括AseI酶切位点：AT/TAAT；Pri2序列为：5’CCG C/TCGAGTTGTGCAGATTACACTGC 3’(包括XhoI酶切位点：C/TCGAG。加入ExTap酶在适当浓度dNTP条件下扩增得到LMP1 promoter的长度为361bp。

4pCMV-MEKK1质粒的大量提取及MEKK1基因的获得

取1ul pCMV-MEKK1转接进入100ulDH5α感受态，冰上静置30min后42℃热休克90s后在冰上放置1-2min，加入900ulLB培养基后37℃，100rpm温和振荡1h，4000rpm5min离心后收集菌，取100ul上清重悬菌液后涂布于Amp板上，12-16h过夜后挑取单克隆于5mlLB培养基，300rpm振摇过夜后转接入200mlLB培养基中，振荡2-3h后转接入1000mlLB培养基中，振摇2-3h。用《分子克隆》p32-36上的方法提取纯化质粒，并对质粒进行纯化和电泳检测，HindIII单酶切检测质粒的提取，电泳条带位于5.0kb左右，用紫外分光光度仪检测质粒提取量。

设计引物Pri1：(包括XhoI酶切位点：C/TCGAG)序列为：5’CCGC/TCGAG CCACCATGGCGATGTCAGCGTCTC 3’引物Pri2：(包括AflII酶切位点CT/TAAG)5’CAG CT/TAAGTTTATTTGTGAAATTTGTGATGC3’，扩增MEKK1基因，大小为1197bp。

PCR体系为：Pri1 0.5ul；Pri2 0.5ul；dNTP 4ul；ExTap buffer5ul；ExTaq 0.5ul；模板2ul；水加至50ul。

分10管扩增MEKK1目的基因，经过电泳鉴定扩增得到MEKK1后用PCR Clean试剂盒进行回收，紫外分光光度计检测得到的MEKK1基因的浓度。

5XhoI酶切消化LMP1 Promoter及MEKK1基因并对其进行连接

LMP1 promoter和MEKK1XhoI单酶切消化体系：DNA 5ug；Buffer2ul；XhoI 1ul，水加至20ul。

37℃酶切过夜后PCR Clean回收试剂盒进行回收，得到经过XhoI酶切后的LMP1 promoter及MEKK1目的基因。利用T4连接酶对经过XhoI消化后的LMP1 promoter及MEKK1目的基因进行连接，摩尔比控制在1∶1，T4连接酶在16℃ 10ul体系下对LMP1 promoter及MEKK1目的基因进行连接，之后取1ul连接体系进行电泳鉴定，电泳鉴定连上之后对连接体系进行PCR Clean纯化。得到连接上的LMP1 promoter-MEKK1产物。

6PCR扩增连接产物并利用AseI、AflII对连接产物进行消化

由于连接难度较高且T4连接酶的连接效率较低，故对连接产物进行PCR扩增以得到足够量的连接产物。前端引物为LMP1 promoterpriI，后端引物为MEKK1 PriII，扩增体系为：前端引物0.3ul；后端引物0.3ul；dNTP 4ul；buffer 5ul；ExTaq酶0.5ul；模板1ul，水加至50ul。

PCR扩增的条件为：解链条件94℃30s，退火条件54℃30s，延伸条件72℃90s，35个循环。总共10管进行扩增。经过电泳检测后得到连接产物，PCR Clean回收连接产物，利用紫外分光光度计测定连接产物浓度。

AseI、AflII对连接产物进行双酶切过夜，反应体系为：连接产物10ug；AseI、AflII各2ul；BufferO 2ul，加水至20ul。

双酶切消化过夜后进行PCR Clean回收，得到经过双酶切消化后两端有AseI AflII酶切位点的LMP1 promoter-MEKK1连接片段。

7LMP1 promoter-MEKK1微链载体的构建和量化扩增

利用平末端连接条件将两端设计好的Cap，Cap与表达框的摩尔比为10∶1，T4连接酶在16℃条件下连接过夜。连接后利用连接体系作为模板，设计引物量化扩增含MEKK1基因的微链载体：PriI序列为5’GAGTAAATACGGAGCTTTCAAGGAG 3’PriII序列为：5’CTCCTTGAAAGCTCCGTATTTACTC 3’，扩增后产物经过电泳检测得到目的片段大小的条带，胶回收目的条带，并检测扩增得到的微链载体的浓度，于-20℃条件下进行保存。PCR扩增的条件为：解链条件94℃30s，退火条件54℃30s，延伸条件72℃90s。胶回收具体步骤可见Omega胶回收试剂盒说明书。

8将LMP1 promoter-MEKK1目的条带连上T载体并进行量化扩增

具体操作步骤为：

(1)在微量离心管中加入pMD18-T Vector 1ul，InsertDNA0.6pmol，ddH₂O至5ul；

(2)加入等量的Solution I，16℃连接30min

(3)全量(10ul)加入至100ulDH5α感受态菌液中，冰上放置30min；

(4)42℃热休克60s，再在冰上放置1min

(5)加入890ulLB培养基，37℃振荡培养60min

(6)在含有X-Gal，IPTG，Amp的LB琼脂糖平板上培养，形成单菌落。计数白、蓝菌落；

(7)挑取白色菌落在5ml含Amp的LB培养基中进行振荡培养过夜

(8)将菌液按1∶200转接入1000mlLB培养基中进行大规模培养

(9)用《分子克隆》p32-36上的方法大量提取质粒，并对质粒进行纯化和电泳检测，AflII单酶切检测质粒的提取，电泳条带位于4.3kb左右，用紫外分光光度仪检测质粒提取量。

9构建pEGFP-MEKK1质粒并进行量化扩增

(1)取10ugpEGFP-N3质粒，用AseI、AflII双酶切过夜，将用检测显示酶切后条带位于3.0kb，1.7kb处，胶回收3.0kb处片段，电泳检测并测定其浓度

(2)将经过AseI、AflII双酶切消化后的LMP1promoter-MEKK1表达框按摩尔比5∶1的比例与pEGFP-N3质粒双酶切后胶回收3.0kb处片段用T4DNA连接酶进行10ul体系过夜连接12-16h

(3)全量(10ul)加入至100ulDH5α感受态菌液中，冰上放置30min；

(4)42℃热休克60s，再在冰上放置1min

(5)加入890ulLB培养基，37℃振荡培养60min

(6)在含有Amp的LB琼脂糖平板上培养，形成单菌落。

(7)挑取单克隆在5ml含Amp的LB培养基中进行振荡培养过夜

(8)将菌液按1∶200转接入1000mlLB培养基中进行大规模培养

(9)用《分子克隆》p32-36上的方法大量提取质粒，并对质粒进行纯化和电泳检测，AflII单酶切检测质粒的提取，电泳条带位于4.5kb左右，用紫外分光光度仪检测质粒提取量。

10将等量的pCMV-MEKK1质粒、MEKK1-T质粒、MEKK1微链载体转染进入B95-8细胞

将2ugpCMV-MEKK1质粒、MEKK1-T质粒、MEKK1微链载体用锐博公司的脂质体转染试剂按照转染试剂说明书转染进入B95-8细胞，并设置空白对照。转染步骤为：

(1)将转染质粒用无血清无抗生素的1640培养基稀释至100ul；

(2)将4ul脂质体转染试剂用无血清无抗生素的1640培养基稀释至100ul；

(3)将(2)中的试剂滴入(1)中，蜗旋振荡15s后静置30min；

(4)将(3)中试剂滴入换过新鲜培养基的B95-8细胞中，培养36h。

11Western-blotting检测pCMV-MEKK1质粒、MEKK1-T质粒、MEKK1微链载体在B95-8细胞内MEKK1下游产物TK的表达

(1)B95-8细胞内总蛋白的收集

将35mm培养皿贴壁超过90％以上，状态良好的细胞置于冰上，弃去细胞培养基，用冰预冷的PBS洗两次，将残留的PBS尽量吸干，再加入30-40μL三去污细胞裂解液(含1mM PMSF)，冰上放置30min，用细胞刮将细胞刮下，收集到1.5mlEP管中，4℃最高转速离心25min，收集上清，存放于-30℃。

(2)蛋白定量

将浓度为10mg/ml的BSA储存液用PBS稀释成0.2mg/ml，0.4mg/ml，0.6mg/ml，0.8mg/ml，1.0mg/ml的浓度，加入蛋白定量试剂，在595nm处测定吸收值，做标准曲线。

取样品1-2ul，加入蛋白定量试剂，在595nm处测定吸收值，由分光光度仪自动读出浓度。

(3)蛋白电泳

加入5×loading buffer后在100℃水浴中煮5-10min，将细胞上清以每孔10-20ug蛋白上样量，电压80-100V进行10％SDS-PAGE电泳。

(4)转膜

电泳完毕后将SDS-PAGE胶条带区切割后用电转缓冲液进行漂洗10min，将PVDF膜甲醇浸泡2min后在电转缓冲液中漂洗10min，保持90V电压将蛋白转到PVDF膜上，时间约90min。

(5)封闭

电转后的PVDF膜用封闭液(5％脱脂奶粉的TBS-T)于室温封闭2h。

(6)一抗孵育

将封闭后PVDF膜用PBST洗涤3次，每次10min后，将TK抗体以1∶2000比例与封闭液混合，加入膜，4℃摇床振荡孵育过夜。

(7)二抗孵育

PBS-T洗10min×3次后，二抗以1∶5000比例加入，室温摇床振荡1小时。

(8)曝光

PBS-T洗三次后，加入约100ul发光液将PVDF膜用X光片曝光。

(9)Strip

用PBST洗掉PVDF膜上的发光液后，加入stripping buffer，50℃加热45min，期间可以每隔10min轻轻摇动。

(10)封闭

弃去stripping buffer，用PBS-T每次10min洗三次去掉残余的stripping buffer后，用封闭液(5％脱脂奶粉的TBS-T)于室温封闭2h。

(11)一抗孵育

-actin抗体以1∶2000比例与封闭液混合，加入膜，4℃孵育过夜。

(12)二抗孵育

PBS-T洗三次后，二抗(羊抗兔-HRP)以1∶5000比例加入，室温摇床振荡1小时。

(13)曝光

PBS-T洗三次后，加入发光液用X光片曝光。

二结果与讨论

(一)实验结果

1EBV的提取与LMP1 promoter的PCR扩增

培养足够量的B95-8细胞后提取其中的EB病毒，利用检测引物检测EBV的提取。检测结果见图16、图17，图16中，1为LMP1promoter，2为EBV。显示条带出现在预测位置，显示EBV基因组的提取获得。收集10管50ul体系扩增的Promoter，PCR Clean后紫外分光光度计检测显示得到LMP1 promoter 0.145ug/ul 200ul。

2pCMV-MEKK1质粒的大量提取及MEKK1基因的获得

按《分子克隆》p32-36上的方法提取纯化质粒，得到pCMV-MEKK1质粒1.925ug/ul，1500ul总共约3000ug，质粒用HindIII单酶切和HindIII、XhoI双酶切后电泳检测图见图18，1、2为HindIII单酶切，3为HindIII、XhoI双酶切。PCR可以量化扩增MEKK1目的基因片段，扩增出来的MEKK1基因片段两端含有XhoI和AflII酶切位点，PCR扩增MEKK1电泳检测图见图19，得到MEKK1目的基因片段0.18ug/ul250ul，45ug.

3XhoI消化MEKK1基因片段和LMP1 promoter并对其进行连接

利用XhoI对MEKK1基因片段和LMP1 promoter进行消化，对消化体系用PCR Clean试剂盒清洁后对其用T4连接酶过夜连接，连接体系琼脂糖胶回收后得到的纯化物为模板分别加LMP1 promoer的PriI和MEKK1的priII进行PCR扩增，扩增后得到MEKK1基因表达框3.3ug/ul100ul，约300ug。消化后连接电泳检测见图20，其中1为LMPl promoter2为MEKKl。

4AseI、AflII双酶切MEKK1基因表达框后与Cap进行连接构建微链载体

用AseI、AflII对MEKK1基因表达框进行双酶切过夜，对酶切体系纯化后及按Cap与表达框10∶1的摩尔比数在16℃用T4连接酶连接过夜。将连接体系直接作为模板用PCR的方法进行扩增，PCR产物经过胶回收后即为MEKK1微链载体，图21为50ul体系扩增MEKK1微链载体图(下图)和微链载体示意图(上图)，胶回收得到MEKK1微链载体0.12ul/ul1约12ug。

5MEKK1-T载体的构建

由于MEKK1与LMP1 promoter连接产物经过ExTap酶进行PCR扩增后会在扩增的两端加上碱基A，所以可以直接用于T载体构建。构建好的T载体含有LMP1 promoter和MEKK1基因表达框，转入1L含Amp的培养基中大量提取得到1.0ug/ul1500ul，约1500ug质粒，质粒经过AflII单酶切和AseI、AflII双酶切后鉴定正常，构建好的MEKK1-T载体大小为4279bp。检测结果见图22，其中1为AseI、AflII双酶切；2为AseI单酶切；3为AflII单酶切。

6pEGFP-MEKK1质粒的构建及提取鉴定

由于T载体上存在多个AseI的酶切位点，不利于LMP1promoter-MEKK1表达框的酶切分离，所以重新构建到pEGFP-N3质粒上。利用AseI、AflII双酶切pEGFP-N3质粒，切下pCMV-EGFP基因片段，回收3kb左右片段，将用AseI、AflII消化的LMP1promoter-MEKK1表达框与其进行连接，连接产物转感受态挑取单克隆后在5ml含卡那霉素的LB培养基中培养过夜后，转入1L含Kan的培养基中大量提取得到0.8ug/ul1200ul，约1000ug质粒，质粒经过AflII单酶切和AseI、AflII双酶切后鉴定正常，酶切后电泳如图23，质粒大小约为4.6kb，其中1为AseI单酶切；2为AflII单酶切；3、4为AseI、AflII双酶切。

7转染pCMV-MEKK1质粒、MEKK1-T质粒、MEKK1微链载体进入B95-8细胞及蛋白的提取

将35mm皿内的细胞长至5×10⁵个左右时，将2ugpCMV-MEKK1质粒、MEKK1-T质粒、MEKK1微链载体用4ul阳离子脂质体转染进入换过新鲜培养基的细胞中，同时以4ul脂质体转染进入细胞作为空白对照。37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养36h。

将细胞用PBS洗两遍后至于冰上，加上200ul三去污细胞裂解液，提取细胞内的蛋白。紫外分光光度计测得蛋白浓度分别为：

8Western-blotting检测pCMV-MEKK1质粒、MEKK1-T质粒、MEKK1微链载体在B95-8细胞内MEKK1下游产物TK的表达。

加入10ug的蛋白量后在100℃水浴中煮8min后上样SDS-PAGE电泳，转膜后孵一抗二抗，X光片曝光后如图24，其中1为空白对照；2为MEKK1微链载体；3为MEKK1-T质粒；4为pCMV-MEKK1质粒。

Western blotting检测结果显示在B95-8细胞中，空白对照组表达的TK条带较弱，MEKK1微链载体能够稳定表达MEKK1基因，从而通过信号级联反应激活TK的表达，表达效率与普通质粒(pCMV-MEKK1质粒、MEKK1-T载体质粒)基本相近，证实了其MEKK1微链载体作为一种抗EBV病毒相关肿瘤的基因治疗载体的具有一定的实际意义。

(二)实验结论

用于基因治疗的通用型微链载体，该载体由目的基因表达框的线性核酸结构和两个对称排列的Cap保护序列组成。我们将MEKK1插入该微链载体的目的基因表达框中，并置于EB病毒特异性启动子LMP1 promoter的调控下。MEKK1可通过信号级联放大解除EB病毒自杀基因的沉默状态，驱动自杀基因表达并放大其拷贝数量，在后者的表达产物胸苷激酶与药物GCV的协同作用下，对EB病毒感染阳性肿瘤细胞产生特异性性杀伤效应，具有特异性，能起到增强安全性的作用。本论文的第一部分已经证实了微链载体作为一种通用的基因治疗载体具有较高的转染表达效率，因此MEKK1微链载体能较好地进入到B95-8细胞中进行表达。

Western blotting的检测结果显示正常条件下B95-8细胞内的TK表达量较低，当MEKK1基因转染进入细胞后，能通过信号级联反应激活癌细胞内EB病毒的TK基因来杀伤肿瘤细胞，在载体的转染效率上，微链载体基本上能与质粒载体具有相同的转染效率。实验结果初步达到了预期的目的，能较好地说明微链载体作为一种通用的基因治疗载体在EBV相关肿瘤中具有较好临床应用意义，同时本实验开发的特异性在EBV感染肿瘤细胞中表达的MEKK1微链载体对正常细胞理论不具备杀伤作用，能选择性地杀伤EBV相关肿瘤细胞，起到目前其它方法所不能具备的较好的安全性。

由于MEKK1微链载体具有目前临床治疗EBV相关肿瘤手段中所不具备的安全性和特异性，因此其有可能发展为EBV相关肿瘤基因治疗的临床方法。

Claims (6)

1.一种基因微链载体，其特征在于所述载体由线性DNA序列表达框和两个对称排列的Cap保护序列组成，所述Cap保护序列封闭线性DNA序列表达框两端；所述Cap保护序列是通过模拟真核生物细胞内tRNA的c环结构构建的，分别在其两端加上AseI、AflII酶切位点；其序列结构为：

Cap 1：

Cap 2：

2.根据权利要求1所述的基因微链载体，其特征在于所述线性DNA序列为EGFP基因序列。

3.根据权利要求1所述的基因微链载体，其特征在于所述线性DNA序列为MEKK1基因序列。

4.一种权利要求1或2所述基因微链载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)模拟体内tRNA稳定C环的帽状Cap构建；

(2)目的基因质粒的提取；

(3)基因表达框的获得；

(4)目的基因表达框和Cap序列进行连接；

(5)微链载体的扩增、纯化和保存。

5.根据权利要求4所述基因微链载体的构建方法，其特征在于提取pEGFP-N3质粒，37℃水浴条件下双酶切pEGFP-N3质粒4h，采用1％的琼脂糖凝胶胶回收1.6kb左右的片段；所述目的基因片段和两端Cap采用摩尔比1∶10、16℃条件下进行连接，Ligation High连接酶作用下连接30～60min或T4连接酶作用下过夜连接12～16h。

6.一种权利要求1或3所述基因微链载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)B95-8培养和细胞收集，EBV的提取及EBV基因组DNA的提取，EBV膜蛋白LMP1启动子的获得；

(2)pCMV-MEKK1质粒的大量提取及MEKK1基因的获得；

(3)XhoI酶切消化LMP1 Promoter及MEKK1基因并对其进行连接；

(4)PCR扩增连接产物并利用AseI、AflII对连接产物进行消化；

(5)LMP1 promoter-MEKK1微链载体的构建和量化扩增；

(6)将LMP1 promoter-MEKK1目的条带连上T载体并进行量化扩增；

(7)构建pEGFP-MEKK1质粒并进行量化扩增；

(8)将等量的pCMV-MEKK1质粒、MEKK1-T质粒、MEKK1微链载体转染进入B95-8细胞；

(9)Western-blotting检测pCMV-MEKK1质粒、MEKK1-T质粒、MEKK1微链载体在B95-8细胞内MEKK1下游产物TK的表达。

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