CN107217071A - 一种重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒、构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒，通过将大鼠磷脂酶Cγ2基因插入含有腺病毒基因组的腺病毒穿梭质粒pHBAd‑MCMV‑GFP中获得，所述大鼠磷脂酶Cγ2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了上述重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒的构建方法和应用。本发明针对PLCγ2在癌细胞凋亡中的促进作用，构建PLCγ2重组腺病毒以代替基因的模式，可以针对性对癌细胞生长情况进行调控，重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒能够稳定表达大鼠磷脂酶Cγ2，病毒滴度高，促细胞凋亡效应显著；重组腺病毒及其表达的大鼠磷脂酶Cγ2对大鼠肝肿瘤细胞具有显著抑制细胞增殖、促进其凋亡效应，为肝肿瘤的预防和治疗提供新的治疗思路。

Description

一种重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒、构建方法及其应用
技术领域
本发明属于生物病毒构建领域，具体涉及一种重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒、构建方法及其应用。
背景技术
肝脏是机体的重要器官，有外分泌、内分泌、代谢、生物转化等功能，参与糖、脂肪、维生素等营养物代谢、储存和重新分配，对维持机体的代谢平衡有重要作用。肝脏还是机体的主要解毒器官，通过生物转化和胆汁排泄等方式去除代谢废物和外源物。由于肝脏有诸多重要生理功能，因此当肝脏功能失调时就会产生各种肝病。相关的疾病达数百种之多，常见的有肝肿瘤、脂肪肝、肝纤维化、急性肝坏死、中毒性肝病等。我国每年因肝病死亡的人数超过50万，每年治疗肝病的费用高达50-100亿元人民币。在各种肝病中，肝肿瘤有“癌症之王”之称，以高发病率和高死亡率威胁人类的健康，是各种肝病(脂肪肝、肝硬化、病毒性肝炎等)的终末期表现。
由于肝肿瘤发病前期病症不明显，致使其不能够较早预防与治疗，故肝脏肿瘤疾病的检测、预防与治疗一直是全球范围的难点课题。随着分子生物学技术的发展，新的治疗方法不断出现。其中基因治疗由于其成本低、药效高、特异性强等优点，成为治疗肝脏瘤的最佳途径。具体说，基因治疗药物是具有治疗作用的基因及其载体，可通过直接把含治疗基因的载体注入患者体内而根治疾病。因此，从生物学角度寻找治疗肝肿瘤的新基因已成为新的研究方向。
磷脂酶Cγ2属于PLCγ亚家族成员之一，广泛存在于哺乳类各种细胞的浆膜中。它能被细胞外因子，细胞表面抗原、生长因子等激活后水解PIP2产生IP3和DAG。IP3促使胞内Ca2+释放，诱发Ca2+信号途径；DAG激活PKC，诱发下游信号通路，最后通过影响转录因子活性或引起基因表达扳动一系列生理生化活动。近年来越来越多的研究发现，PLCγ2在细胞凋亡中起重要作用。然而，PLCγ2是否能够诱导肝肿瘤细胞的凋亡目前尚无报道。
腺病毒作为一种基因搭载体，其感染效率高，宿主细胞范围广，可感染分裂或非分裂细胞，且对宿主无致病性。与逆转录病毒等其他病毒载体不同，腺病毒载体不整合到宿主细胞染色体中，无插入致突变性，在一定时间内能持续高表达导入的目的基因，腺病毒载体可承载较长外源基因片段，易通过体外扩增获得高的病毒滴度等特点，这使得它与其它转基因载体相比具有独特的优势，因而被广泛用于靶向基因转移等相关研究。
目前，肝癌的基因诊断和治疗在临床应用仍存在着以下问题：1)反映肝癌生物学行为的目的基因特异性弱，需要寻找新的目的基因，以提高在肝癌细胞中的表达阳性率；2)基因治疗中引入体内的外源基因不能在细胞内长期稳定表达，不能得到有效调控，需要寻找高效、安全和特异性好的基因治疗载体。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒、构建方法及其应用，解决了现有肝癌的基因诊断和治疗在临床应用中，目的基因特异性弱、在肝癌细胞中的表达阳性率低，基因治疗中引入体内的外源基因不能在细胞内长期稳定表达，不能得到有效调控的问题。
本发明提供了一种重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒，通过将大鼠磷脂酶Cγ2基因插入含有腺病毒基因组的腺病毒穿梭质粒pHBAd-MCMV-GFP中获得，所述大鼠磷脂酶Cγ2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了上述重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒的构建方法，具体包括以下步骤：
步骤1，重组穿梭质粒的构建
步骤1.1，采用无缝克隆技术将SEQ ID NO.1所示的大鼠磷脂酶Cγ2基因插入pUC57载体中，得到克隆载体pUC57-PLCγ2；
步骤1.2，以克隆载体pUC57-PLCγ2为模板，以Forward primer和Reward primer为引物，PCR扩增，凝胶回收扩增产物PLCγ2，并利用Sma I将扩增产物PLCγ2酶切，凝胶回收得到PLCγ2酶切产物；
所述Forward primer的序列为：
5’-CTGCAGGTCGGATCCAGACCCGGGATGACCACCATGGTCAACGTGGA-3’，
Reward primer的序列为：
5’-TCTGTAGAATTCGGTCCCGGGGGAGTAGAACCTGCTGTTACTCA-3’；
步骤1.3，以Sma I酶切腺病毒穿梭质粒pHBAd-MCMV-GFP，对酶切后的产物进行凝胶回收和纯化，得到MCMV酶切产物；
步骤1.4，利用DNAT4连接酶将PLCγ2酶切产物和MCMV酶切产物连接，得到重组穿梭质粒pHBAd-MCMV-GFP-PLCγ2；
步骤2，重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒质粒的构建
步骤2.1，将HEK293细胞接种于含10％FBS的DMEM完全培养液中，于5％CO2、37℃环境中培养，当细胞密度达到70-80％时，将重组穿梭质粒pHBAd-MCMV-GFP-PLCγ2和腺病毒骨架载体pHBAd-BHG经转染试剂LipofiterTM介导，共转染HEK293细胞，得到细胞混合物；
步骤2.2，将所述细胞混合物接种于含10％FBS的DMEM完全培养液中，按“8”字形晃动，5％CO2、37℃条件下培养，6h后更换新鲜的DMEM完全培养液，观察细胞出毒情况，当细胞渐成葡萄状并出现噬斑时，将从培养皿底部脱落的细胞收集至离心管中，离心管交替置于液氮和37℃水浴条件下进行冻融，然后离心，收集上清毒液，即得到第一代毒种P1；
步骤2.3，用第一代毒种P1感染密度为90％的HEK293细胞，收集第二代毒种P2；
步骤2.4，用第二代毒种P2感染密度为90％的HEK293细胞，收集第三代毒种P3，所述第三代毒种P3即为重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒。
本发明还提供了上述重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒在抑制肝肿瘤细胞增殖中的应用。
本发明还提供了上述重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒在预防和治疗肝肿瘤中的应用。
与现有技术相比，本发明提供的一种重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒、构建方法及其应用，具有以下有益效果：
1、本发明针对PLCγ2在癌细胞凋亡中的促进作用，构建PLCγ2重组腺病毒以代替基因的模式，可以针对性对细胞生长情况进行调控，本发明的重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒，对大鼠肝癌细胞凋亡中有着显著促进作用，为肝肿瘤的预防和治疗提供新的治疗思路。
2、本发明是利用缺陷型腺病毒将大鼠磷脂酶Cγ2(PLCγ2)基因引入大鼠肝癌细胞中，使病毒能在宿主细胞中自主表达磷脂酶Cγ2，提高细胞中该酶的水平，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，从而达到预防和治疗肝脏肿瘤的目的。另一方面，该方法还克服了外源蛋白不稳定、活性低、成本高等缺点。
3、利用缺陷型腺病毒作为载体，具有以下优点：
(1)腺病毒载体工艺流程简单，病毒滴度高；
(2)腺病毒载体转染率高，可操作性好；
(3)腺病毒载体宿主范围广，安全性好，致病性弱；
(4)腺病毒载体免疫原性弱，外源基因表达稳定；
(5)由MCMV启动子控制的大鼠磷脂酶Cγ2(PLCγ2)能高效表达，可有效调节肝癌细胞增殖；
4、由于在真核细胞中自主目的蛋白，其产物与天然蛋白构象与活性一致。
附图说明
图1是重组穿梭载体pHBAd-MCMV-GFP-PLCγ2单克隆的PCR鉴定结果；
图2是感染重组腺病毒后HEK293细胞出毒情况；
其中，图2A是感染重组腺病毒后HEK293细胞后第一代毒种P1，图2B是第二代毒种P2，图2C是第三代毒种P3；
图3是重组腺病毒对肝癌CBRH-7919细胞感染情况；
其中，图3A是荧光下重组腺病毒组的显微视图，图3B是荧光下空载腺病毒组的显微视图，图3C是白光下重组腺病毒组的显微视图，图3D为白光下空载腺病毒组的显微视图；
图4是感染重组腺病毒后CBRH-7919细胞PLCγ2蛋白表达情况的电泳图；
图5重组腺病毒对CBRH-7919细胞周期影响的流式细胞检测情况；
其中，图5A是对照组的PI的面积信号，图5B是空载腺病毒组的PI的面积信号，图5C是重组腺病毒组的PI的面积信号；
图6是重组腺病毒促CBRH-7919细胞凋亡情况；
其中图6A为对照组检测结果，图6B为空载腺病毒组检测结果，图6C为重组腺病毒组检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
下述实施例中pUC57载体、腺病毒骨架载体pHBAd-BHG、腺病毒穿梭载体pHBAd-MCMV-GFP、无外源基因表达的空载野生型腺病毒以及HEK293细胞购自上海汉恒生物科技有限公司。大鼠CBRH-7919肝癌细胞和大肠杆菌DH5α感受态细胞由河南师范大学省部共建重点实验室惠赠。转染试剂LipofiterTM购自上海汉恒生物科技有限公司；DMEM、胎牛血清(FBS)、胰酶购自Hyclone公司；青霉素、链霉素购自Invitrogen公司；兔抗大鼠β-actin一抗和PLCγ2一抗分别购自武汉博士德生物公司和Abcam公司；HRP标记山羊抗兔二抗IgG购自上海康成生物公司；质粒DNA大、小量抽提试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；凝胶回收试剂盒为美国Axygen公司生产；PI细胞周期流式检测试剂盒和AnnexinV-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒均购自南京凯基生物。
本发明提供了一种用于抗肝肿瘤细胞增生的重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒，其是通过将大鼠磷脂酶Cγ2基因插入含有腺病毒基因组的腺病毒穿梭质粒pHBAd-MCMV-GFP中获得，所述大鼠磷脂酶Cγ2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。具体按照以下步骤构建：
步骤1，重组穿梭质粒的构建
步骤1.1，采用GBclonart无缝克隆试剂盒(购自上海诺晶生物科技有限公司)的无缝克隆技术将SEQ ID NO.1所示的大鼠磷脂酶Cγ2基因插入pUC57载体中，得到克隆载体pUC57-PLCγ2。
其中SEQ ID NO.1所示的大鼠磷脂酶Cγ2基因插入pUC57载体时，不受酶切位点的限制。
步骤1.2，以克隆载体pUC57-PLCγ2为模板，以Forward primer和Reward primer为引物，利用表1所示的PCR体系PCR扩增，凝胶回收扩增产物PLCγ2(扩增产物PLCγ2中含有PLCγ2基因片段)，然后将扩增产物PLCγ2按照表2所示的酶切体系、于30℃酶切反应2h，酶切反应后凝胶回收，得到PLCγ2酶切产物。
表1 PLCγ2的PCR扩增体系
PCR程序如下：
其中，Forward primer的序列为：
5’-CTGCAGGTCGGATCCAGACCCGGGATGACCACCATGGTCAACGTGGA-3’，如SEQ ID NO.2所示；
Reward primer的序列为：
5’-TCTGTAGAATTCGGTCCCGGGGGAGTAGAACCTGCTGTTACTCA-3’，如SEQ ID NO.3所示。
表2 PLCγ2扩增产物的酶切体系
步骤1.3，以Sma I酶切腺病毒穿梭质粒pHBAd-MCMV-GFP，其酶切体系如表3所示，其酶切反应条件为37℃反应3h，凝胶回收纯化酶切后的产物，得到MCMV酶切产物。
表3 pHBAd-MCMV-GFP的酶切体系
步骤1.4，利用DNA T4连接酶将产物PLCγ2酶切产物和MCMV酶切产物连接，得到重组穿梭质粒，连接体系如表4所示，连接反应条件为：16℃下孵育过夜(12h以上)。
将所述重组穿梭质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃、250r/min摇菌14h，以培养得到的菌液为模板进行菌液PCR和测序鉴定。测序正确的质粒命名为重组穿梭质粒pHBAd-MCMV-GFP-PLCγ2。
重组穿梭载体pHBAd-MCMV-GFP-PLCγ2单克隆的PCR鉴定结果如图1所示，结果显示，重组穿梭质粒pHBAd-MCMV-GFP-PLCγ2的片段大小接近5000bp，为3798bp，比腺病毒穿梭载体pHBAd-MCMV-GFP大300bp左右，对重组穿梭质粒pHBAd-MCMV-GFP-PLCγ2进行测序鉴定，得到的PLCγ2的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，与NCBI数据库公布的序列一致。
表4 PLCγ2酶切产物和MCMV酶切产物的连接体系
步骤2，重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒质粒的构建
步骤2.1，将HEK293细胞接种于含10％FBS的DMEM完全培养液中，于5％CO2、37℃环境中培养。当细胞密度达到70-80％时，将重组穿梭质粒pHBAd-MCMV-GFP-PLCγ2和腺病毒骨架载体pHBAd-BHG经转染试剂LipofiterTM介导共转染HEK293细胞，得到细胞混合物。
当细胞密度达到70-80％时，具体共转染的步骤如下：
a.共转染前2h更换新鲜的DMEM完全培养液。取2μg重组穿梭质粒pHBAd-MCMV-GFP-PLCγ2和4μg腺病毒骨架载体pHBAd-BHG，用300μL DMEM完全培养液稀释，室温下放置5min，得到质粒混合液。
b.取15μL LipofiterTM，用300μL DMEM完全培养液进行稀释，室温放置5min，得到试剂溶液。
c.将细胞混合液和试剂溶液混合，室温下避光孵育20min，得到细胞混合物。
步骤2.2，将所述细胞混合物接种于装有含10％FBS的DMEM完全培养液的60mm培养皿中，按“8”字形晃动，5％CO2(体积分数)、37℃条件下培养，6h后更换新鲜的DMEM完全培养液。观察细胞出毒情况，当细胞渐成葡萄状并出现噬斑时(10天左右)，表明重组腺病毒包装成功。将从培养皿底部脱落的细胞收集至离心管中，离心管交替置于液氮和37℃水浴条件下进行冻融，其中，液氮和37℃分别放置3次，3000rpm室温离心5min，收集上清毒液，即得到第一代毒种P1(参见图2A)。
步骤2.3，用第一代毒种P1感染密度为90％的HEK293细胞，收集第二代毒种P2，具体操作为：
取2mL第一代毒种P1感染密度至少为90％的HEK293细胞，培养两天后待染毒细胞脱落，将脱落的细胞置于新的离心管中，并将离心管交替置于液氮和37℃水浴条件下进行冻融，其中液氮和37℃分别放置3次，3000rpm离心5min，收集上清毒液，收集第二代毒种P2(参见图2B)。
步骤2.4，用第二代毒种P2感染密度为90％的HEK293细胞，收集第三代毒种P3，具体操作为：
取2mL第二代毒种P2感染密度至少为90％的HEK293细胞，培养两天后待染毒细胞脱落，将脱落的细胞置于新的离心管中，并将离心管交替置于液氮和37℃水浴条件下进行冻融，其中，液氮和37℃分别放置3次，3000rpm离心5min，收集上清毒液，获得第三代毒种P3(参见图2C)，所述第三代毒种P3即为重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒。
下面，我们通过一些实验数据，来验证本发明重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒的效果：
一、滴度检测
对上述方法制备而成的重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒的滴度进行检测，第三代毒种P3样品滴度用改进的半数组织培养感染剂量(50％tissue culture infective dose，TCID50)法测定。对于100μL样品，滴度的计算方法如下：T＝101+d(s-0.5)，其中d＝log10稀释度＝1(对10倍稀释度而言)，s＝阳性比率之和(自第一个10倍稀释度算起)；再根据公式T＝a×10b TCID50/mL＝a×10b-0.7PFU/mL，将TCID50/mL转换成PFU/mL。注：两次重复实验得到的滴度值相差应<100.7
利用上述方法测得的重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒的滴度如表5所示，检测总滴度＝1×1010PFU/m L，T＝101+(10.2－0.5)＝1010.7TCID50/m L，将TCID50/mL换算成PFU/mL，T＝1010.7－0.7＝1010＝1.0×1010PFU/mL，病毒滴度高。
表5 病毒滴度稀释结果
二、重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒的抗肝肿瘤细胞增殖的效果。
1、重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒对大鼠CBRH-7919肝癌细胞感染情况及过表达效率检测
(1)荧光显微镜观察感染情况
将大鼠CBRH-7919肝癌细胞放置于含10％(体积分数)FBS的DMEM培养基，37℃、5％(体积分数)CO2环境下培养。当细胞密度达到70-80％融合时，用胰酶消化并制成细胞悬液。以2×105个细胞/孔的密度接种至12孔板中，分别设计重组腺病毒组、空载腺病毒组和空白对照组3个组，每组3个重复孔。重组腺病毒组滴加感染复数(Multiplicity of infection，MOI)为400的重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒，空载腺病毒组滴加感染复数(Multiplicity ofinfection，MOI)为400的腺病毒穿梭载体pHBAd-MCMV-GFP，空白对照组则无病毒感染，在DMEM完全培养基中继续培养，培养24h后荧光显微镜观察感染效果并拍照。
结果如图3所示，图3A为荧光下重组腺病毒组的显微视图，图3B为荧光下空载腺病毒组的显微视图，图3C为白光下重组腺病毒组的显微视图，图3D为白光下空载腺病毒组的显微视图，结果表明，重组腺病毒组较其他两组的荧光强度更强，转染效果明显。
(2)荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测过表达效率
按密度1×105细胞/孔接种CBRH-7919细胞至12孔板中，分别设计重组腺病毒组、空载腺病毒组和空白对照组3个组，每组3个重复孔。重组腺病毒组滴加感染复数(Multiplicity of infection，MOI)为400的重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒，空载腺病毒组滴加感染复数(Multiplicity of infection，MOI)为400的腺病毒穿梭载体pHBAd-MCMV-GFP，空白对照组则无病毒感染，于含10％(体积分数)FBS的DMEM完全培养基中培养24h后收集细胞，按Invitrogen公司的Trizol试剂盒提取总RNA，在260/280nm波长下测定总RNA浓度。实验用RNA质量浓度均为1μg/L。取5μg总RNA，按RNA反转录试剂盒指南合成cDNA。取合成的cDNA2μL、SYBR GreenI Mix 10μL、5’端和3’端引物各0.2μL、无核酸酶纯水7.6μL，形成20μL体系，置Rotor Gene 3000PCR仪中(Corbett Research公司，Australia)进行PCR。PCR反应条件如下：95℃1min，95℃15s，相应的退火温度下反应15s，72℃30s，45个循环。其中，目的基因rPLCγ2和内参基因GAPDH的引物序列用primer express 2.0软件，根据基因序列进行设计，由上海基康生物公司合成，序列如下。
重组腺病毒组细胞PCR扩增使用的引物为：
5’端引物：5’-CTGGCAACCGACTCAAAGGA-3’
3’端引物：5’-GCTGATGCTGTTTCTTCGGG-3’
空载腺病毒组CPR扩增使用的引物为：
5’端引物：5’-TTCCTACCCCCAATGTGTCC-3’
3’端引物：5’-GGTCCTCAGTGTAGCCCAAG-3’
最后，以本领域常用的GAPDH(即甘油醛-3-磷酸脱氢酶，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)为内参基因，根据公式：相对含量＝2-ΔΔCt计算PLCγ2表达量，通过PCR扩增循环数及荧光信号强度对结果进行分析。
用Real-time qPCR方法检测CBRH-7919细胞中PLCγ2mRNA表达量，结果如表6所示，相比空白对照组和重组腺病毒组，重组腺病毒组中PLCγ2mRNA表达丰度至少增加16000倍之多，说明经腺病毒载体介导后CBRH-7919细胞可高表达PLCγ2基因。
表6 qRT-PCR检测感染重组腺病毒后CBRH-7919细胞PLCγ2mRNA水平
注：Ct指的是在PCR扩增时，每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数
(3)Western blot检测过表达效率
设计重组腺病毒组、空载腺病毒组和空白对照组，每组3个重复孔，重组腺病毒组滴加感染复数(Multiplicity of infection，MOI)为400的重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒，空载腺病毒组滴加感染复数(Multiplicity of infection，MOI)为400的腺病毒穿梭载体pHBAd-MCMV-GFP，空白对照组则无病毒感染，培养36h后，弃掉培养基，用PBS buffer清洗CBRH-7919细胞3次，并收集各组细胞至离心管内。向各离心管加入含0.1mmol/LPMSF的RIPA裂解液(1％Triton X-100、50mmol/L Tris·HCl pH8.0、150mmol/L NaCl、0.5％SDS)，吹打均匀后4℃静置20min；超声波破碎10s后，冰置30min。12000g离心2次，10min/次，弃沉淀，留上清。取5μL上清液用BCA方法测定蛋白浓度，结果确定上样量为60μg。将蛋白样品进行6％SDS-PAGE凝胶电泳，结束后将凝胶电转移(4℃，70V，2.5h)至PVDF膜上，电转后将膜放入5％(即5g/L)脱脂奶粉中室温轻摇封闭2h，加兔抗大鼠PLCγ2一抗的稀释液(体积稀释100倍)，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，10min/次；加入HRP标记山羊抗兔二抗IgG的稀释液(体积稀释5000倍)室温振荡孵育1h，TBST洗膜3次，10min/次。经ECL发光试剂盒显色后，用X-胶片曝光显影并拍照分析。
同时，为确保每组样品中蛋白总量的一致，本研究选用兔抗大鼠β-actin一抗做内标，将不同组的蛋白质总量调整至相同，操作步骤同上。
本研究用免疫印迹方法检测重组腺病毒感染后CBRH-7919细胞中PLCγ2蛋白表达量，结果如图4所示，图4中，1号泳道为空白对照组，2号泳道为空载腺病毒组，3号泳道为重组腺病毒组。空白对照组和空载腺病毒组细胞中几乎无PLCγ2蛋白的表达，而重组腺病毒组感染细胞后该蛋白表达水平明显增加，说明被重组腺病毒转染的CBRH-7919细胞能高表达PLCγ2蛋白(图4)。
三、重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒对CBRH-7919细胞生长的影响
(1)PI单染流式检测细胞周期
取处于对数生长期，生长状态良好的CBRH-7919细胞，以每孔2×105个细胞的密度接种于细胞培养6孔板中，37℃、5％(v/v)CO2培养箱中培养过夜。吸弃6孔板内的含10％FBS、1％双抗(青霉素-链霉素混合溶液)的DMEM完全培养基，使培养基终体积为1mL，然后分别加入重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒和空载腺病毒。侵染6h后，将培养基补足至2mL。继续培养48h。用不含EDTA的0.25％胰酶消化细胞，消化终止后收集细胞，1000rpm、离心5min，去上清，PBS重悬润洗2次。去上清(1000rpm，5min)后用PBS重悬细胞，缓慢加入预冷的80％乙醇，4℃固定4h后弃离心上清(1000rpm，5min)，用预冷PBS洗2次。加入100μL RNase，37℃水浴30min；再加入400μLPI染液，4℃避光反应30min。最后用流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期。以无病毒感染的CBRH-7919细胞为对照组。实验重复3次。
细胞周期的流式细胞检测结果如图5显示，图5A是对照组的细胞周期的流式细胞检测结果的PI的面积信号，图5B是空载腺病毒组的细胞周期的流式细胞检测结果的PI的面积信号，图5C是重组腺病毒组的细胞周期的流式细胞检测结果的PI的面积信号。
转染24h后，对照组CBRH-7919细胞在G1期、S期和G2/M期含量分别为64.26％、21.17％和14.57％(参见图5A)。统计学分析显示，空载腺病毒组细胞在G1期、S期和G2/M期含量无明显变化，分别为64.47％、24.18％和11.36％(参见图5B)。与对照组和空载腺病毒组相比，重组腺病毒组细胞在G1期的比例极显著增加(P＜0.01)，为71.88％；而S期和G2/M期细胞含量则显著降低(P<0.01)，分别降至10.01％和18.1％(参见图5C)。结果表明，重组腺病毒中含有的大鼠PLCγ2基因可使CBRH-7919细胞周期阻滞在G1期。
(2)Annexin V-APC/7-AAD双染流式检测细胞凋亡
取处于对数生长期，生长状态良好的CBRH-7919细胞，以每孔2×105个细胞的密度接种于细胞培养6孔板中，37℃、5％(v/v)CO2培养箱中培养过夜。吸弃6孔板内的培养基，使培养基终体积为1mL，然后分别加入重组腺病毒和空载腺病毒。侵染6h后，将培养基补足至2mL。继续培养48h。用不含EDTA的0.25％胰酶消化细胞，消化终止后收集细胞，1000rpm、离心5min，去上清，PBS重悬润洗2次，收集细胞沉淀。
将细胞沉淀重悬于50μL Binding Buffer中，加入5μL 7-AAD染液，混匀，室温下避光反应15min。反应后加入450μL Binding Buffer，再加入1μL Annexin V-APC，混匀，室温下避光反应15min。最后，流式细胞仪上机检测各组细胞中的细胞凋亡情况。实验重复3次。
细胞凋亡的流式细胞检测结果如图6所示，其中图6A为对照组检测结果，图6B为空载腺病毒组检测结果，图6C为重组腺病毒组检测结果，图6A、6B、6C中与纵轴平行的线为界限，左侧为Annexin V-APC(即荧光素APC标记的膜联蛋白V)阴性，线右侧为Annexin V-APC阳性，左下象限(LL)为Annexin V、7-AAD双阴性，代表正常活细胞；右下象限(LR)为AnnexinV单阳性，代表早期凋亡细胞；右上(UR)象限为Annexin V、7-AAD双阳性，代表晚期凋亡细胞。
转染24h后，对照组、空载腺病毒组和重组腺病毒组细胞凋亡率分别为0.56％、0.84％和22.62％。统计学分析显示，重组腺病毒组细胞凋亡率明显高于对照组和空载腺病毒组(P＜0.01)，而对照组与空载腺病毒组之间的凋亡率无显著差异(P>0.05)。说明过表达重组腺病毒Ad-PLCγ2能显著促进肝肿瘤细胞凋亡。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 河南科技大学
<120> 一种重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒、构建方法及其应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3798
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaccacca tggtcaacgt ggacaccctt ccagaatatg agaagagtca gatcaagaga 60
gccctggagc tagggacggt gatgaccgta ttcagtgccc gcaaatccac cccagagcgg 120
aggacagtac agatgatcat ggagacccgg caggtggcat ggagcaagac agcagataag 180
atcgaaggct tcttggacat catggaaata aaggaaatcc ggccagggaa gaactccaag 240
gactttgagc gagccaaggc tgtccgtcac aaggcagact gctgcttcac catcttctac 300
ggcacccagt tcgtgctcag cactctcagt ctggcaaccg actcaaagga ggatgcagtg 360
aagtggctct ctggcttgaa gatcttacac caggaagcga tgaacgcatc cactcccaca 420
atgattgaga gttggctgcg gaaacagatt tattcagtag atcaaacccg aagaaacagc 480
atcagcctcc gggagctgaa gaccatcttg cccctggtca acttcaaagt gagcggcatc 540
aagttcctca aggacaagct ggtggaaatt ggcgcccaga aagatgagct cagttttgaa 600
cagttccatc tcttctataa aaaactcatg tttgagcagc agaagtcgat acttgacgaa 660
ttcaaaaaag actcctccgt gttcatccta gggaacacag accggcctga tgcctcagcc 720
gtctacctgc aagacttcca gaggtttctt ttacatgaac agcaggagct atgggctcag 780
gatctgaaca aagtccggga gcggatgacc aagtttatcg atgacacaat gagggagacc 840
gcagagccct tcttgtttgt ggatgagttc ctcacgtatc tgttctcacg ggagaacagc 900
atctgggacg agaagtacga tgccgtggac atgcaggaca tgaacaaccc cttgtcccat 960
tactggatct cctcttccca caacacgtac ctcactggag accagctgcg tagcgagtcc 1020
tccacggaag cgtatatccg ctgtctgcgt gctggttgtc gctgcatcga gttggattgc 1080
tgggatgggc ctgacgggaa acccataatc tatcacggtt ggacacggac caccaagatc 1140
aagtttgatg atgttgttca ggccatccgg gatcatgcct ttgttacctc cagctttccc 1200
gtgattctgt ctatcgagga gcactgcagt gtggagcagc aacgtcacat ggccaaggtc 1260
ttcaaggaag tgttaggaga cctgctgttg acgaagccca cggaggccag tgctgaccag 1320
ctgccctcac ccagccagct tcgtgagaag atcattatca agcataagaa gctgggcccc 1380
cgaggtgatg tcgatgtcaa tgtggaggac aagaaagatg agcacaagac ccagggcgag 1440
ctgtatatgt gggactccat cgaccagaaa tggactcgcc actactgtgc tattgcggac 1500
gccaagctgt ccttcagtga cgacattgaa cagactgtgg aagaggatcc ggtccaggac 1560
actcccccca cggagctaca ttttggggag aaatggttcc ataagaaggt ggagagcagg 1620
accagtgcgg agaagctgct gcaggagtac tgtgccgaga ctggggccaa ggatggcacc 1680
ttcctggtgc gggagagcga gaccttcccc aacgactaca cactctcctt ctggcggtct 1740
ggccgggtgc agcactgccg aatccggtct accatggagg gtggggtcat gaagtactac 1800
ctgactgaca acctcacgtt caacagcatc tacgccctca tccagcacta ccgggaggca 1860
cacctgcgct gtgcggagtt cgagctgcgg ctcacagacc cggtgcccaa ccccaaccca 1920
catgagtcca agccgtggta ctatgacagg ctgagcaggg gggaagcaga ggacatgttg 1980
atgcggattc cccgagatgg agccttcctc attcggaagc gggaggggac cgactcttac 2040
gccatcacct tcagggccag gggcaaggtg aaacattgcc gtatcaaccg ggacggacgt 2100
cactttgtgc tggggacctc tgcctacttt gagagcctgg tggagctcgt cagctactat 2160
gagaagcacg cactctaccg caagatgagg cttcgctacc ccgtgacccc ggagctcctg 2220
gaacgatata atatggaaag agacatcaac tctctctatg acgtcagcag gatgtatgtg 2280
gacccaagtg agatcaaccc ttccatgcct cagaggactg tgaaagcact ctatgactac 2340
aaagccaagc gcagcgatga gctgaccttc tgccgaggtg ccctcatcca caacgtctcc 2400
aaggagccgg gaggatggtg gaaaggggac tatgggaccc ggatccagca gtatttccca 2460
tctaactacg ttgaagatat ctcggcaggc gatgctgagg agatggaaaa gcagattatt 2520
gaagacaacc ccctcgggtc tctctgcaga ggcatattgg atcttaatac ctacaatgtg 2580
gtgaaggccc cccaggggaa aaaccagaaa gccttcgtct ttatcctgga gcctaagaaa 2640
cagggggacc ctcctgtgga gttcgcgact gaccgtgtgg aggaactgtt tgagtggttt 2700
cagagtatac gagagatcac ttggaagatc gacaccaagg agaacaacat gaagtactgg 2760
gagaggaatc agtccattgc tattgagctc tctgacttgg ttgtgtactg caagccgact 2820
agcaaaacca aggaccattt ggaaaatcct gacttccggg aaattcgctc ttttgtggag 2880
acaaaggcag acagcattgt caggcaaaag cccgtggatc tattgcggta caaccagaag 2940
ggcctgaccc gtgtctaccc caagggacag agagttgact cttccaacta cgaccccttc 3000
cgtctgtggc tgtgtggctc ccagatggtg gcgctcaatt tccagactcc agacaagtac 3060
atgcagatga accatgcatt gttttcgctc aatgggcgga caggttacgt cctgcagccc 3120
gagagcatgc ggtctgagaa gtatgacccg atgcccccgg agtcccagag gaagatcctg 3180
atgacactca ctgtcaaggt tcttggtgca cgccacctcc ctaaactagg gcggagtatc 3240
gcctgtccct ttgtagaggt ggaaatctgt ggggccgagt atgacagcaa caaattcaag 3300
acgacggttg tgaatgacaa cggtctcagc cctgtctggg ctccaactca ggagaaggtg 3360
acatttgaaa tttatgaccc aaaccttgcg ttcctacgct ttctggtcta cgaagaagac 3420
atgttcagtg accccaactt cctggctcat gccacatacc ccattaaagg catcaaatca 3480
ggatttagat cagtccctct gaagaacggg tacagtgaag acatcgagct ggcatccctc 3540
ctggttttct gtgagatgcg gccagtcctg gagagtgaag aagaactcta ttcctcctgt 3600
cgccagctgc ggaggcggca ggaagagctc aacaaccagc tcttcctgta tgacacacac 3660
cagaacctgc gaggagccaa ccgggatgcc ctggtgaagg agttcaatgt taacgagaat 3720
cagctgcggc tgtaccagga gaagtgtaac cggaggctga gagagaagag agtgagtaac 3780
agcaggttct actcctag 3798
<210> 2
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctgcaggtcg gatccagacc cgggatgacc accatggtca acgtgga 47
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tctgtagaat tcggtcccgg gggagtagaa cctgctgtta ctca 44

Claims (4)

1.一种重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒，其特征在于，通过将大鼠磷脂酶Cγ2基因插入含有腺病毒基因组的腺病毒穿梭质粒pHBAd-MCMV-GFP中获得，所述大鼠磷脂酶Cγ2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤1，重组穿梭质粒的构建
步骤1.1，采用无缝克隆技术将SEQ ID NO.1所示的大鼠磷脂酶Cγ2基因插入pUC57载体中，得到克隆载体pUC57-PLCγ2；
步骤1.2，以克隆载体pUC57-PLCγ2为模板，以Forward primer和Reward primer为引物，PCR扩增，凝胶回收扩增产物PLCγ2，并利用Sma I将扩增产物PLCγ2酶切，凝胶回收得到PLCγ2酶切产物；
所述Forward primer的序列为：
5’-CTGCAGGTCGGATCCAGACCCGGGATGACCACCATGGTCAACGTGGA-3’，
Reward primer的序列为：
5’-TCTGTAGAATTCGGTCCCGGGGGAGTAGAACCTGCTGTTACTCA-3’；
步骤1.3，以Sma I酶切腺病毒穿梭质粒pHBAd-MCMV-GFP，对酶切后的产物进行凝胶回收和纯化，得到MCMV酶切产物；
步骤1.4，利用DNAT4连接酶将PLCγ2酶切产物和MCMV酶切产物连接，得到重组穿梭质粒pHBAd-MCMV-GFP-PLCγ2；
步骤2，重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒质粒的构建
步骤2.1，将HEK293细胞接种于含10％FBS的DMEM完全培养液中，于5％CO2、37℃环境中培养，当细胞密度达到70-80％时，将重组穿梭质粒pHBAd-MCMV-GFP-PLCγ2和腺病毒骨架载体pHBAd-BHG经转染试剂LipofiterTM介导，共转染HEK293细胞，得到细胞混合物；
步骤2.2，将所述细胞混合物接种于含10％FBS的DMEM完全培养液中，按“8”字形晃动，5％CO2、37℃条件下培养，6h后更换新鲜的DMEM完全培养液，观察细胞出毒情况，当细胞渐成葡萄状并出现噬斑时，将从培养皿底部脱落的细胞收集至离心管中，离心管交替置于液氮和37℃水浴条件下进行冻融，然后离心，收集上清毒液，即得到第一代毒种P1；
步骤2.3，用第一代毒种P1感染密度为90％的HEK293细胞，收集第二代毒种P2；
步骤2.4，用第二代毒种P2感染密度为90％的HEK293细胞，收集第三代毒种P3，所述第三代毒种P3即为重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒。
3.一种如权利要求1所述的重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒在抑制肝肿瘤细胞增殖中的应用。
4.一种如权利要求1所述的重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒在预防和治疗肝肿瘤中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN108359686A (zh) * 2018-02-24 2018-08-03 武汉伊艾博科技有限公司 融合标签NusA在大肠杆菌表达PLCG2蛋白中的应用
CN109679929A (zh) * 2019-01-08 2019-04-26 安徽医科大学 一种重组腺病毒、制备方法、应用
CN112921009A (zh) * 2021-03-17 2021-06-08 昆明市延安医院 一种携带Klotho启动基因重组腺病毒的细胞构建方法及其应用

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