BR112020001940A2 - modelos celulares de e terapias para doenças oculares - Google Patents

modelos celulares de e terapias para doenças oculares Download PDF

Info

Publication number
BR112020001940A2
BR112020001940A2 BR112020001940-2A BR112020001940A BR112020001940A2 BR 112020001940 A2 BR112020001940 A2 BR 112020001940A2 BR 112020001940 A BR112020001940 A BR 112020001940A BR 112020001940 A2 BR112020001940 A2 BR 112020001940A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
cell
fact
cells
gene
individual
Prior art date
Application number
BR112020001940-2A
Other languages
English (en)
Inventor
Richard R. Yang
Stephen H. TSANG
Original Assignee
Reflection Biotechnologies Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=65232366&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BR112020001940(A2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Reflection Biotechnologies Limited filed Critical Reflection Biotechnologies Limited
Publication of BR112020001940A2 publication Critical patent/BR112020001940A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/80—Cytochromes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5073—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Abstract

Modelos celulares para doenças de olhos, métodos e composições para tratamento de doenças em olhos são providos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MODE- LOS CELULARES DE E TERAPIAS PARA DOENÇAS OCULARES”.
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[1] O presente pedido reivindica prioridade sob 35 U.S.C. § 119(e) para o Pedido U.S. No. 62/539.473 intitulado “CELLULAR MO- DELS OF AND THERAPIES FOR OCULAR DISEASES” depositado em 31 de julho de 2017. Os conteúdos em sua totalidade do acima são aqui incorporados a título de referência.
ANTECEDENTES Distrofia Cristalina de Bietti (BCD)
[2] A Distrofia Cristalina de Bietti (BCD, tcc Distrofia Cristalina Corneorretinal de Bietti, Retinopatia Cristalina de Bietti, Distrofia Reti- nal de Bietti (OMIM 210370)) é uma distrofia retinal autossômica re- cessiva e cegante, rara, caracterizada por vários depósitos do tipo cris- tal amarelos-brancos de pouco brilho finos no polo posterior da retina, associados com atrofia do epitélio pigmentar da retina (RPE), grumos de pigmentos e esclerose coroidal. Ela foi primeiro identificada pelo Dr. G. B. Bietti em 1937. As fotografias do fundo e imagens SD-OCT de pacientes com BCD mostraram que os depósitos no cristalino estavam localizados principalmente no lado retinal do epitélio pigmentar da reti- na (RPE). (H. Kojima, A. Otani, K. Ogino e outros. “Outer retinal circu- lar structures in patients with Bietti crystalline retinopathy.” British Jour- nal of Ophthalmology, vol. 96, pp. 390–393, 2012.). Depósitos cristali- nos no limbo da córnea foram estimados ocorrer em um quarto a um terço de pessoas com BCD (Kaiser-Kupfer e outros. Clinical biochemi- cal and pathologic correlations in Bietti's crystalline dystrophy, Am J Ophthalmol., 1994, 118:569–82). Em alguns casos, depósitos de cris- tal nas lentes são também observados (Chung e outros, J Ophthalmol. 57:447-450, 2013). Em estágio avançado, pacientes com BCD têm es- clerose coroidal avançada, diminuição ou ausência de depósitos crista-
linos e atenuação de vasos retinais (Wada e outros. Am J Ophthalmol 2005; 139:894-9). ERG anormal e afinamento da retina também estão presentes em BCD.
[3] Clinicamente, a BCD é progressiva e associada com distro- fia e degeneração de RPE. Assimetria acentuada entre olhos do mes- mo paciente é comum. A idade de início e progressão da doença vari- am dentre pacientes com BCD, mesmo dentro da mesma família. A maioria dos pacientes desenvolve cegueira noturna, campo visual res- trito, visão colorida pobre, degeneração macular e acuidade visual di- minuída entre as 2ª e 4ª décadas de vida e progride para cegueira le- gal entre as 3ª e 6ª décadas de vida.
[4] Localizado entre vasos dos coriocapilares e segmentos ex- ternos sensíveis à luz dos fotorreceptores, o RPE é uma monocamada de células pigmentadas que interage intimamente com fotorreceptores (cones e bastões) na manutenção da função visual. Uma função-chave do RPE é nutrir e remover produtos residuais dos fotorreceptores que estão na retina neurossensorial. Outras funções do RPE incluem, sem limitação: absorção de luz, transporte epitelial, tamponamento de íon espacial, ciclo visual, fagocitose, secreção e modulação imune (Strauss, 2005, The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev 85:845-81). Desta maneira, disfunção e degeneração de RPE causam disfunção e degeneração de fotorreceptor que resultam em perda de visão. A dada BCD está associada com distrofia e dege- neração progressivas de RPE, o RPE é crítico para propósitos de am- bos estudo e tratamento de BCD.
[5] A BCD é uma doença rara. Uma fonte estimou a taxa de incidência de BCD ser de 1:67.000 (ghr.nlm.nih.gov/condition/bietti- crystalline-dystrophy#statistics on the World Wide Web). Uma outra fonte estimou que a prevalência de BCD é 2,5% de todos os pacientes com RP (3 pacientes de índice de BCD de 121 pacientes de índice de
RP, vide Mataftsi e outros, Retina. 24:416-426, 2004). Com base nesta estimativa e taxa de incidência de RP dada ser de 1:4000 (Hartong e outros, Lancet. 368:1795-1809, 2006), a taxa de incidência de BCD é estimada ser 1:160.000. Devido ao fato dos sintomas de BCD serem similares àqueles de outros distúrbios dos olhos que danificam pro- gressivamente a retina, ela é algumas vezes diagnosticada geralmente como retinite pigmentosa (RP) (Mataftsi A e outros. Bietti's crystalline corneoretinal dystrophy: a cross-sectional study. Retina. 2004; 24: 416–426). Embora pacientes com BCD tenham sido relatados em dife- rentes regiões do mundo, incluindo Ásia, África, Europa, Oriente Mé- dio, Américas do Norte e Sul, a BCD foi relatada ser mais comum em pessoas com descendência do Leste Asiático, especialmente nas po- pulações Chinesa e Japonesa (Hu 1983, Ophthalmic genetics in Chi- na. Ophthal Paed Genet 2:39–45; Li e outros, Am J Hum Genet. 2004 Maio; 74(5): 817–826).
[6] Atualmente não há nenhum tratamento aprovado para BCD, e os pacientes eventualmente ficam cegos. Há uma necessidade médica não satisfeita forte de desenvolvimento de opções de trata- mento modificadoras de vida para pacientes sofrendo desta doença rara. CYP4V2
[7] CYP4V2 (Citocromo P450, Família 4, Subfamília V, Poli- peptídeo 2, (OMIM 608614), sinônimo: CYP4AH1) é uma das proteí- nas na superfamília do citocromo P450 e um membro da subfamília do citocromo P450 heme-tiolato 4 (CYP4). Os citocromos P450s (CYPs) são proteínas contendo heme importantes, conhecidas pela sua rea- ção mono-oxigenase. Elas estão envolvidas no metabolismo de com- postos xenobióticos e endógenos, tais como esteroides e ácidos gra- xos. CYPs humanos são principalmente proteínas associadas à mem- brana localizadas ou na membrana interna de mitocôndria ou no retí-
culo endoplásmico de células. Proteínas P450 podem ser identificadas através de seu elemento de sequência de assinatura FxxGxxxCxG (SEQ ID NO: 30), onde a cisteína sublinhada serve como um ligante axial ao ferro heme. Um outro elemento de sequência de assinatura para proteínas P450 é ExxR (SEQ ID NO: 31). O Projeto Genoma Humano estabeleceu o número de genes P450 humanos em 57. Para referência, há 103 genes P450 de camundongo e 89 genes P450 de rato. (Guengerich & Cheng, Pharmacological Reviews, Setembro 2011, 63 (3) 684-699).
[8] A família CYP4 humana consiste em 12 genes e 10 pseu- dogenes. O gene CYP4V2 humano (HGNC: 23198) está localizado em 4q35 e tem 11 éxon s. Mutações no gene CYP4V2 causam BCD (Li e outros, Am J Hum Genet. 74:817-826, 2004). Embora CYP4V2 seja expresso em quase todos os tecidos, ele é expresso em níveis altos na retina e RPE e em níveis um pouco menores na córnea, tecidos que mostram as principais constatações clínicas de BCD (Li e outros, Am J Hum Genet. 74:817-826, 2004; Nakano M, Kelly EJ, Rettie AE: Expression and Characterization of CYP4V2 as a Fatty Acid omega- Hydroxylase. Drug Metab Dispos 2009; Nakano M, Kelly EJ, Wiek C, Hanenberg H, Rettie AE: CYP4V2 in Bietti's crystalline dystrophy: ocu- lar localization, metabolism of omega-3-polyunsaturated fatty acids, and functional deficit of the p.H331P variant. Mol Pharmacol 2012; 82: 679-686).
[9] Uma vez que CYP4V2 é um membro relativamente novo da família P450 e BCD é uma doença rara, a função de CYP4V2 não foi estudada extensivamente. Estudos anteriores mostraram que proteína CYP4V2 é predominantemente ativa em metabolismo de ácido graxo. Anormalidades em ácidos graxos e seu metabolismo foram demons- tradas em soro, linfócitos e fibroblastos da pele de pacientes com BCD (Lee J, Jiao X, Hejtmancik JF e outros: The metabolism of fatty acids in human Bietti crystalline dystrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001; 42: 1707-1714; Lai T, Chu KO, Chan KP e outros: Alterations in serum fat- ty acid concentrations and desaturase activities in Bietti crystalline dys- trophy unaffected by CYP4V2 genotypes. Invest Ophthalmol Vis Sci 2010; 51: 1092-1097). Um outro estudo mostrou que CYP4V2 é um ácido graxo ômega-3-poli-insaturado (PUFA) hidroxilase e uma P450 altamente expressa na linhagem celular de RPE humana transformada ARPE-19 (Nakano M, Kelly EJ, Wiek C, Hanenberg H, Rettie AE: CYP4V2 in Bietti's crystalline dystrophy: ocular localization, metabolism of omega-3-polyunsaturated fatty acids, and functional deficit of the p.H331P variant. Molecular pharmacology 2012; 82: 679-686).
[10] Várias mutações foram identificadas no gene CYP4V2 e causando BCD, com pelo menos uma mutação em cada um dos 11 éxons do gene. A mutação de CYP4V2 mais comum dentre pacientes com BCD é c.802-8_810del17insGC (se referindo a uma deleção na base 17 com duas bases (GC) inseridas no local começando 8 bases a partir da extremidade de íntron 6 do gene CYP4V2, também referido como IVS6-8 del/insGC. Vide SEQ ID NO: 46 mostrando sequência de região de DNA genômico de CYP4V2 humano compreendendo a mu- tação c.802-8_810del17insGC e SEQ ID NO: 47 mostrando a sequên- cia do tipo selvagem correspondente. A mutação c.802- 8_810del17insGC é ilustrada na sequência que segue que mostra jun- ção de íntron 6-éxon 7 de CYP4V2 humano. A sequência de íntron 6 é mostrada em letras minúsculas e a sequência de éxon 7 em letras maiúsculas. A deleção em 17 pbs e a inserção de GC estão em col- chetes): caa aca gaa gca tgt gat tat cat tca aa (tca tac agG TCA TCG CT) (GC) GAA CGG GCC AAT GAA ATG AAC GCC AAT GA (SEQ ID NO:46)) resultando no salto do éxon 7 (Xiao e outros, Biochem Bi- ophys Res Commun. 409:181-6, 2011; Meng e outros, 2014, Mol. Vis., 20:1806-14; Wada e outros, Am J Ophthalmol. 139:894-9, 2005; Jiao e outros, European Journal of Human Genetics (2017) 25, 461-471). Um estudo recente estimou que a idade da mutação c.802- 8_810del17insGC seria de 1.040-8.200 gerações nas populações Chi- nesa e 300-1100 gerações na Japonesa. Vide Jiao e outros, European Journal of Human Genetics (2017) 25, 461-471.
[11] Vários tipos de mutações de CYP4V2 foram verificadas as- sociadas com BCD, incluindo, mas não limitado a, errônea, em dupli- cata, sítio de união, mudança de estrutura, deleção, inserção, indel, sem sentido, polimorfismos (por exemplo, polimorfismos de nucleotí- deo único) e término prematuro, bem como deleção inteira do gene CYP4V2. Um sumário de mutações de CYP4V2 de seleção dentre pa- cientes com BCD humanos é provido na Tabela 1 aqui e pode ser en- contrado em várias publicações e bancos de dados online, por exem- plo, LOVD (databases.lovd.nl/shared/genes/CYP4V2 na World Wide Web), OMIM (omim.org/allelicVariant/608614 na World Wide Web) e ClinVar (ncbi.nlm.nih.gov/clinvar?term=608614[MIM] na World Wide Web). Tabela 1. Mutações de CYP4V2 para Seleção dentre Pacientes com
BCD Éxon Mudança de Mudança de Proteína Nucleotídeo Predita 1 c.31C >T p.Q11X 1 c.64C >G p.L22V 1 c.71T >C p.L24P 1 c.77G >A p.G26D 1 c.130T>A p.W44R 1 c.134A>C p.Q45P 1 c.181G>A p.G61S 1 c.197T>G p.M66R IVS1 c.214+1G>A Éxon 1del IVS1 c.214+25delT Não disponível IVS1 c.215-2A>G Éxon 2del IVS1 c.215-1G>A Éxon 2del 2 c.219T>A p.F73L 2 c.237G>T p.E79D 2 c.253C>T p.R85C 2 c.277T>C p.W93R
2 c.283G>A p.G95R 2 c.327G>A Não disponível IVS2 c.327+1G>A p.E72Gfs*5 IVS2 c.327+11G > C Não disponível 3 c.332T>C p.I111T 3 c.335T>G p.L112* 3 c.367A>G p.M123V 3 c.400G>T p.G134* 3 c.413+2T>G Aceitador de união 4 c.518T>G p.L173W 5 c.637_641delAGTAA p.S213* 5 c.655T>C p.Y219H 6 c.677T>A p.M226K 6 c.694C>T p.R232* 6 c.724delG p.D242Ifs*35 6 c.732G>A p.W244* 6 c.761A>G p.H254R 6 c.772C>T p.L258F 6 c.791delT Deleção 7 c.802-8_806del13 Éxon 7del 7 c.802-8_810del17insGC Éxon 7del 7 c.810delT p.(Glu271Argfs*34) 7 c.838G>T p.E280* 7 c.958C>T p.R320* 7 c.971A>T p.D324V 7 c.974C>T p.T325I IVS7 c.985+3A>G Não disponível 8 c.992A>C p.H331P 8 c.998C >A p.T333K 8 c.1020G>A p.W340* 8 c.1021T>C p.S341P 8 c.1027 T>G p.Y343D 8 c.1062dupA p.V355Sfs*4 IVS8 c.1091-2A>G Éxon 9del 9 c.1157A>C p.K386T 9 c.1168C>T p.R390C 9 c.1169G>A p.R390H 9 c.1178C>T p.P393L 9 c.1187C>T p.P396L 9 c.1198C>T p.R400C 9 c.1199G>A p.R400H 9 c.1219G>T p.E407* 9 c.1225+1 G>A p.(G364_V408del) 10 c.1226-6_1235del16 Éxon 10del 10 c.1328G>A p.R443Q 10 c.1348C>T p.Q450* 10 c.1355G>A p.R452H
10 c.1372G>A p.V458M 10 c.1393A>G p.R465G 10 c.1396 A >G p.N466D 10 c.1399T>C p.C467R 10 c.1441delT p.(Ser481Argfs*4) 10 c.1445C>T p.S482* 11 c.1523G>A p.R508H 11 c.1526C>T p.P509L c.604G>A p.(Glu202Lys) c.242C>G p.(Thr81Arg) c.604+4A>G p.(?) c.1249dup p.(Thr417Asnfs*2) Deleção de CYP4V2 * inteiro
[12] Esta é uma lista de seleção apenas e pode não conter to- das as mutações/variantes de CYP4V2 patológicas dentre pacientes com BCD identificadas e relatadas até agora. As mutações são relati- vas a sequências de referência (NM_207352.3) e (NP_997235.3). No- vas mutações de CYP4V2 patológicas dentre pacientes com BCD es- tão sendo continuamente identificadas. Todas as mutações/variantes de CYP4V2 patológicas identificadas e identificadas futuras associa- das com BCD são aqui incorporadas a título de referência. Degenerações Retinais Herdadas (IRDs)
[13] Degenerações Retinais Herdadas (IRDs) é uma causa prin- cipal de cegueira. Atualmente mais de 200 genes são conhecidos es- tar envolvidos em IRDs e distúrbios relacionados. Retinite pigmentosa (RP) é a forma principal de IRDs em humanos. Há três modos gerais de herança para RP (autossômica dominante, autossômica recessiva e ligada ao X). A taxa de incidência em todo o mundo de RP foi esti- mada ser um em 4000, com RP autossômica recessiva sendo respon- sável por 50%-60% de RP (Hartong DT, Berson EL, Dryja TP. Retinitis pigmentosa. Lancet. 2006;368:1795–809). Um estudo na Europa esti- mou que a prevalência de BCD é 2,5% de todos os pacientes com RP e aproximadamente 10% de pessoas com RP autossômica recessiva não sindrômica (Mataftsi A, Zografos L, Millá E, Secrétan M, Munier FL. Bietti's crystalline corneoretinal dystrophy: a cross-sectional study.
Retina. 2004;24:416–26). O mesmo estudo também notou que BCD é frequentemente diagnosticada geralmente como RP. Desta maneira, BCD pode ter sido subdiagnosticada. BCD é uma doença mundial, mas é mais comum no Leste Asiático especialmente nas populações Chinesa e Japonesa (Li e outros, Am J Hum Genet. 2004 Maio; 74(5): 817–826). Referências para mutações na Tabela 1:
[14] Li A, Jiao X, Munier FL, Schorderet DF, Yao W, e outros (2004) Bietti crystalline corneoretinal dystrophy is caused by mutations in the novel gene CYP4V2. Am J Hum Genet 74: 817-826.
[15] Xiao X, Mai G, Li S, Guo X, Zhang Q (2011) Identification of CYP4V2 mutation in 21 families and overview of mutation spectrum in Bietti crystalline corneoretinal dystrophy. Biochem Biophys Res Com- mun 409: 181-186.
[16] Shan M, Dong B, Zhao X, Wang J, Li G, e outros (2005) Novel mutations in the CYP4V2 gene associated with Bietti crystalline corneoretinal dystrophy. Mol Vis 11: 738-743.
[17] Rossi S, Testa F, Li A, Yaylacioglu F, Gesualdo C, e outros (2013) Clinical and genetic features in Italian Bietti crystalline dystrophy patients. Br J Ophthalmol 97: 174-179.
[18] Lin J, Nishiguchi KM, Nakamura M, Dryja TP, Berson EL, e outros (2005) Recessive mutations in the CYP4V2 gene in East Asian and Middle Eastern patients with Bietti crystalline corneoretinal dystro- phy. J Med Genet 42: e38.
[19] Manzouri B, Sergouniotis PI, Robson AG, Webster AR, Moore A (2012) Bietti crystalline retinopathy: report of retinal crystal deposition in male adolescent siblings. ARCH OPHTHALMOL 130: 1470-1473.
[20] Lai TY, Ng TK, Tam PO, Yam GH, Ngai JW, e outros (2007) Genotype phenotype analysis of Bietti's crystalline dystrophy in pa-
tients with CYP4V2 mutations. Invest Ophthalmol Vis Sci 48: 5212-
5220.
[21] Parravano M, Sciamanna M, Giorno P, Boninfante A, Vara- no M (2012) Bietti crystalline dystrophy: a morpho-functional evalua- tion. Doc Ophthalmol 124: 73-77.
[22] Wada Y, Itabashi T, Sato H, Kawamura M, Tada A, e outros (2005) Screening for mutations in CYP4V2 gene in Japanese patients with Bietti's crystalline corneoretinal dystrophy. Am J Ophthalmol 139: 894-899.
[23] Zenteno JC, Ayala-Ramirez R, Graue-Wiechers F (2008) Novel CYP4V2 gene mutation in a Mexican patient with Bietti's crystal- line corneoretinal dystrophy. Curr Eye Res 33: 313-318.
[24] Lee KY, Koh AH, Aung T, Yong VH, Yeung K, e outros (2005) Characterization of Bietti crystalline dystrophy patients with CYP4V2 mutations. Invest Ophthalmol Vis Sci 46: 3812-3816.
[25] Yokoi Y, Sato K, Aoyagi H, Takahashi Y, Yamagami M, e outros (2011) A Novel Compound Heterozygous Mutation in the CYP4V2 Gene in a Japanese Patient with Bietti's Crystalline Cor- neoretinal Dystrophy. Case Rep Ophthalmol 2: 296-301.
[26] Haddad NM, Waked N, Bejjani R, Khoueir Z, Chouery E, e outros (2012) Clinical and molecular findings in three Lebanese fami- lies with Bietti crystalline dystrophy: report on a novel mutation. Mol Vis 18: 1182-1188.
[27] Fu Q, Wang F, Wang H, Xu F, Zaneveld JE, e outros (2013) Next-generation sequencing-based molecular diagnosis of a Chinese patient cohort with autosomal recessive retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci 54: 4158-4166.
[28] Song Y, Mo G, Yin G (2013) A novel mutation in the CYP4V2 gene in a Chinese patient with Bietti's crystalline dystrophy. Int Ophthalmol 33: 269-276.
[29] Jin ZB, Ito S, Saito Y, Inoue Y, Yanagi Y, e outros (2006) Clinical and molecular findings in three Japanese patients with crystal- line retinopathy. Jpn J Ophthalmol 50: 426-431.
[30] Halford S, Liew G, Mackay DS, Sergouniotis PI, Holt R, Broadgate S, Volpi EV, Ocaka L, Robson AG, Holder GE, Moore AT, Michaelides M, Webster AR. Detailed phenotypic and genotypic char- acterization of bietti crystalline dystrophy. Ophthalmology. 2014; 121:1174-84.
[31] Houfa Yin, Chongfei Jin, Xiaoyun Fang, Qi Miao, Yingying Zhao,Zhiqing Chen, Zhaoan Su, Panpan Ye, Yao Wang and Jinfu Yin, Molecular Analysis and Phenotypic Study in 14 Chinese Families With Bietti Crystalline Dystrophy. PLoS One 9 (4), e94960. 2014 Abr 16.
[32] Xiao Hong Meng, Hong Guo, Hai Wei Xu, Qi You Li, Xin Jin, Yun Bai, Shi Ying Li, Zheng Qin Yin, Identification of novel CYP4V2 gene mutations in 92 Chinese families with Bietti’s crystalline cor- neoretinal dystrophy, Molecular Vision (2014); 20:1806-1814.
[33] Galuh D N Astuti, Vincent Sun, Miriam Bauwens, Ditta Zo- bor, Bart P Leroy, Amer Omar, Bernhard Jurklies, Irma Lopez, Huanan Ren, Volkan Yazar, Christian Hamel, Ulrich Kellner, Bernd Wissinger, Susanne Kohl, Elfride De Baere, Rob W J Collin, and Robert K Koenekoop, Novel insights into the molecular pathogenesis of CYP4V2-associated Bietti's retinal dystrophy, Mol Genet Genomic Med. 2015 Janeiro; 3(1): 14–29.
[34] Xiaodong Jiao, Anren Li, Zi-Bing Jin, Xinjing Wang, Ales- sandro Iannaccone, Elias I Traboulsi, Michael B Gorin, Francesca Simonelli and J Fielding Hejtmancik, Identification and Population His- tory of CYP4V2 mutations in Patients with Bietti Crystalline Corneoreti- nal Dystrophy, European Journal of Human Genetics (2017) 25, 461-
471.
SUMÁRIO
Reivindicações de Linhagem celular Reivindicações de Linhagem celular e Modelo de Doença Composição de Linhagem celular
[35] Em um aspecto, um modelo de doença celular incluindo uma linhagem celular é provido. Tal modelo de doença inclui (a) uma célula-tronco provida de um indivíduo ou reprogramada a partir de uma célula provida de um indivíduo ou (2) uma célula derivada de uma cé- lula-tronco provida de um indivíduo ou reprogramada de uma célula provida de um indivíduo, compreendendo uma ou mais mutações em um gene-alvo.
[36] Em algumas modalidades, a célula-tronco é uma célula- tronco pluripotente induzida (iPS). Em algumas modalidades, a célula- tronco é uma célula-tronco embriônica (ES), célula-tronco somática (ou adulta) ou célula-tronco mesenquimal (MSC). Em algumas modalida- des, a célula provida a partir de um indivíduo é de qualquer tipo de cé- lula e/ou de qualquer tecido do indivíduo. Em algumas modalidades, a célula provida a partir de um indivíduo é uma célula da pele, uma célu- la de fibroblasto ou sanguínea. Em algumas modalidades, em que a célula provida a partir de um indivíduo é um fibroblasto da pele ou uma célula mononuclear de sangue periférico (PBMC). Em algumas moda- lidades, a célula provida a partir de um indivíduo é uma célula urinária, uma célula epitelial renal, um folículo piloso ou uma célula papilar dermal.
[37] Em algumas modalidades, a célula derivada de uma célula- tronco é uma célula ocular. Em algumas modalidades, a célula ocular é uma célula do epitélio pigmentar da retina (RPE), célula fotorrecepto- ra (PRC, incluindo célula bastão, célula cone e célula progenitora fotor- receptora), célula retinal, célula da córnea, célula epitelial da córnea (CEC), célula do nervo óptico, célula da lente, célula endotelial coroidal (CE), célula do nervo óptico ou célula coroidal. Em algumas modalida-
des, a célula derivada de uma célula-tronco é uma célula de neurônio.
[38] Em algumas modalidades, a mutação é endógena ao indi- víduo. Em algumas modalidades, a mutação é exógena ao indivíduo. Em algumas modalidades, a mutação é introduzida artificialmente através de edição genética ou manipulação genética. Em algumas modalidades, a linhagem celular compreende uma pluralidade de mu- tações que são endógenas e/ou exógenas ao indivíduo.
[39] Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero. Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano.
[40] Em algumas modalidades, o gene-alvo compreende um gene mostrado na Tabela 4. Em algumas modalidades, o gene-alvo compreende um gene CYP4V2, CYP1B1, MYO7A, DFNB31, USH1C, USH1G, CDH23, PCDH15, CLRN1, ACO2, AFG3L2, ATXN2, AUH, C12orf65, CISD2, FOXC1, FOXF2, LTBP2, MTPAP, MYOC, NDUFS1, NR2F1, OPA1, OPA3, OPTN, PAX6, PDGF, PITX2, POLG, SPG7, TEK, TXNRD2, WFS1, ABCA4, REP-1, RPE65, CEP290, PDE6B, RPGR, MERTK, MT-ND4, FAM47E, GBA, GCH1, HTRA2, LRRK2, PARK2, PINK1, SNCA, SYNJ1, NPC1, NPC2, CYP4A11, CYP4A22, CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F22, CYP4X1, CYP4Z1 ou gene CYP46A ou um gene CYP4V2, CYP1B1, MYO7A, DFNB31, USH1C, USH1G, CDH23, PCDH15, CLRN1, ACO2, AFG3L2, ATXN2, AUH, C12orf65, CISD2, FOXC1, FOXF2, LTBP2, MTPAP, MYOC, NDUFS1, NR2F1, OPA1, OPA3, OPTN, PAX6, PDGF, PITX2, POLG, SPG7, TEK, TXNRD2, WFS1, ABCA4, REP-1, RPE65, CEP290, PDE6B, RPGR, MERTK, MT-ND4, FAM47E, GBA, GCH1, HTRA2, LRRK2, PARK2, PINK1, SNCA, SYNJ1, NPC1, NPC2, CYP4A11, CYP4A22, CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F22, CYP4X1, CYP4Z1 ou CYP46A mutado ou defeituoso que codifica uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial. Em algumas modalidades, o gene-alvo é CYP4V2.
[41] Em algumas modalidades, a linhagem celular compreende uma célula iPS. Em algumas modalidades, a linhagem celular compre- ende uma célula iPS-RPE. Em algumas modalidades, a linhagem celu- lar compreende uma célula iPS-fotorreceptora (iPS-PRC), uma célula iPS-epitelial da córnea (iPS-CEC), uma célula iPS-endotelial coroidal (CE), uma célula iPS-da córnea, uma célula iPS-coroidal, uma célula iPS-do nervo óptico, uma célula iPS-ocular ou uma célula iPS-de neu- rônio. Em algumas modalidades, a mutação de CYP4V2 na linhagem celular é endógena ao indivíduo. Em algumas modalidades, o indiví- duo tem uma mutação patológica no gene CYP4V2 ou em um ortólogo do gene CYP4V2.
[42] Em algumas modalidades, o indivíduo tem pelo menos uma mutação mostrada na Tabela 1. Em algumas modalidades, o indivíduo tem degeneração retinal herdada (IRD) ou retinite pigmentosa (RP). Em algumas modalidades, o indivíduo tem Distrofia Cristalina de Bietti (BCD, tcc Distrofia Cristalina Corneorretinal de Bietti, Retinopatia Cris- talina de Bietti, Distrofia Retinal de Bietti) ou está sob risco de desen- volver BCD.
[43] Em algumas modalidades a linhagem celular compreende uma mutação em CYP4V2 que é exógena ao indivíduo e é introduzida artificialmente através de edição genética ou manipulação genética.
[44] Em algumas modalidades, a linhagem celular compreende uma célula iPS, célula ES, MSC, ou célula-tronco adulta, ou uma célu- la de RPE, célula fotorreceptora, célula epitelial da córnea, célula en- dotelial coroidal (CE) ou célula coroidal derivada de uma célula iPS, célula ES, MSC ou célula-tronco adulta. Em algumas modalidades, a célula iPS ou outro tipo de célula-tronco é caracterizada por um ou mais do que segue: a. a morfologia única de iPS, ES ou MSC; b. um ou mais marcadores de pluripotência, tais como Oct-4, Sox-2, SSEA4,
TRA-1-60, TRA-1-81, NANOG e AP; c. a habilidade em diferenciar no tipo de célula desejado (por exemplo, RPE) e/ou d. um ensaio de tera- toma.
[45] Em algumas modalidades, a célula iPS-RPE ou a célula de RPE derivada de outros tipos de célula-tronco é caracterizada por: a. morfologia: pigmento e formato hexagonal e/ou b. um ou mais dos bi- omarcadores que seguem, proteína de ligação a retinaldeído 1 (RLBP1, pseudônimo: CRALBP), RPE65, BESTROPHIN-1, MITF, LRAT, RDH5, PAX6, MERTK, TYR, ZO-1 e/ou VINCULIN.
[46] Em um outro aspecto, um modelo celular humano de BCD ou um modelo celular de função de CYP4V2 é provido. Tal modelo in- clui compreendendo uma célula iPS ou linhagem celular iPS ou uma célula iPS-RPE ou linhagem celular iPS-RPE derivada de uma célula ou linhagem celular de um paciente com BCD ou derivada de uma cé- lula ou uma linhagem celular com mutações em CYP4V2 artificialmen- te criadas.
[47] Em algumas modalidades, a linhagem celular tem um perfil bioquímico anormal em um ou mais compostos dos grupos de com- postos que seguem: (i) ácidos graxos, (ii) ceramidas, (iii) esfingomieli- nas, (iv) esfingosina, (v) esfinganina ou (vi) ácidos hidróxi-graxos, comparado com uma linhagem celular correspondente de um controle saudável. Em algumas modalidades, a linhagem celular tem um perfil bioquímico anormal em um ou mais compostos mostrados na Tabela 2 comparado com a linhagem celular correspondente de um controle saudável. Método de Fabricação do Modelo de Doença Celular:
[48] Em um outro aspecto, um método de fabricação de um mo- delo de doença BCD derivada de iPS é provido. Tal método inclui ob- tenção de células a partir de um indivíduo tendo mutações endógenas no gene CYP4V2 ou células sem quaisquer mutações endógenas no gene CYP4V2, mas mutação de CYP4V2 exógena é introduzida artifi- cialmente através de edição genética ou manipulação genética neste estágio ou qualquer um dos estágios que seguem; indução de pluripo- tência nas células ou reprogramação das células para produzir iPSCs; cultura das iPSCs sob condições que resultem em diferenciação das iPSCs em células oculares desejadas, desta maneira produzindo uma linhagem celular ocular derivada de iPS.
[49] Em algumas modalidades, as células obtidas dos indivíduos são células somáticas. Em algumas modalidades, as células obtidas dos indivíduos são células da pele, fibroblastos, células sanguíneas, células mononucleares de sangue periférico (PBMC) ou células ocula- res. Em algumas modalidades, as células obtidas dos indivíduos são células urinárias, células epiteliais renais, um folículo piloso ou células papilares dermais. Em algumas modalidades, as células oculares são células epiteliais do pigmento da retina (RPE), células epiteliais da córnea (CECs), células fotorreceptoras (PRCs), células endoteliais co- roidais (CE), células do nervo óptico, células retinais, células da cór- nea ou células coroidais. Em algumas modalidades, a pluripotência é induzida ou as células são reprogramadas usando um ou mais dos fa- tores de transcrição OCT4, SOX2, KLF4 e c-MYC
[50] Em algumas modalidades, a mutação é patológica. Em al- gumas modalidades, a linhagem celular compreende uma ou mais mu- tação dentre as mutações mostradas na Tabela 1. Em algumas moda- lidades, a linhagem celular é heterozigota para a mutação. Em algu- mas modalidades, a linhagem celular é homozigota para a mutação.
[51] Em algumas modalidades, o modelo de doença celular exi- be níveis anormais em um ou mais compostos a partir dos grupos de compostos que seguem comparado com aqueles em uma linhagem celular relevante de um controle saudável: (i) ácidos graxos, (ii) cera- midas, (iii) esfingomielinas, (iv) esfingosina, (v) esfinganina ou (vi) áci-
dos hidróxi-graxos. Em algumas modalidades, o modelo de doença celular exibe níveis anormais comparado com aqueles em uma linha- gem celular relevante de um controle saudável em um ou mais com- postos mostrados na Tabela 2. Método de Ensaio Bioquímico
[52] Em um aspecto, um método de detecção de anormalidades ou fenótipo em um modelo celular de doença é provido. Tal método inclui tipicamente avaliação e comparação dos níveis de um ou mais compostos entre a linhagem celular de um paciente (ou uma linhagem celular geneticamente editada ou manipulada compreendendo uma mutação exógena no gene causando tal doença) e um controle saudá- vel, em que o um ou mais composto é selecionado dos grupos que se- guem: (i) ácidos graxos, (ii) ceramidas, (iii) esfingomielinas, (iv) esfin- gosina, (v) esfinganina e/ou (vi) ácidos hidróxi-graxos.
[53] Em algumas modalidades, um ou mais dos compostos ava- liados são mostrados na Tabela 2. Em algumas modalidades, a identi- ficação e/ou avaliação de níveis de compostos é realizada usando LC- MS, LC-MS/MS, GC-MS, GC-MS/MS e/ou FIA-MS/MS. Em algumas modalidades, o modelo celular de doença compreende um gene muta- do ou defeituoso mostrado na Tabela 4. Em algumas modalidades, o modelo celular de doença compreende um gene mutado ou defeituoso dentre o gene CYP4V2, CYP1B1, MYO7A, DFNB31, USH1C, USH1G, CDH23, PCDH15, CLRN1, ACO2, AFG3L2, ATXN2, AUH, C12orf65, CISD2, FOXC1, FOXF2, LTBP2, MTPAP, MYOC, NDUFS1, NR2F1, OPA1, OPA3, OPTN, PAX6, PDGF, PITX2, POLG, SPG7, TEK, TXNRD2, WFS1, ABCA4, REP-1, RPE65, CEP290, PDE6B, RPGR, MERTK, MT-ND4, FAM47E, GBA, GCH1, HTRA2, LRRK2, PARK2, PINK1, SNCA, SYNJ1, NPC1, NPC2, CYP4A11, CYP4A22, CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F22, CYP4X1, CYP4Z1 ou CYP46A.
Método de Uso do Modelo Celular de BCD (Avaliação de Fármaco, Dosagem e Dispositivo)
[54] Em um outro aspecto, um método de avaliação de um agente de teste quanto à eficácia terapêutica contra BCD é provido. Tal método inclui tipicamente contato das células de uma linhagem celular iPS-RPE derivada de um paciente com BCD ou uma linhagem celular iPS-RPE compreendendo um gene CYP4V2 mutado ou defei- tuoso como um resultado de edição ou manipulação genética artificial com um agente de teste; e avaliação das células quanto à normaliza- ção em níveis de um ou mais compostos mostrados na Tabela 2; um aumento em sequência de ácido nucleico de CYP4V2 não defeituoso nas células; um aumento na quantidade de polipeptídeos de CYP4V2 nas células; e/ou estrutura, morfologia ou função celular melhorada, comparado com antes do contato por tal agente de teste; em que nor- malização em níveis de um ou mais composto mostrado na Tabela 2; um aumento em sequência de ácido nucleico de CYP4V2 não defeitu- oso nas células; um aumento na quantidade de polipeptídeos de CYP4V2 nas células; e/ou estrutura, morfologia ou função celular me- lhorada, comparado com antes do tratamento por tal agente de teste, é indicativo de um agente de teste que exibe eficácia terapêutica contra BCD.
[55] Em algumas modalidades, os agentes de teste são selecio- nados do grupo consistindo em ácidos nucleicos ou análogos dos mesmos, vetores contendo sequência de ácido nucleico ou polipeptí- deos de codificação, polipeptídeos ou análogos dos mesmos, anticor- pos, agentes químicos, moléculas pequenas e/ou qualquer combina- ção dos mesmos. Em algumas modalidades, as células são avaliadas usando técnicas de PCR, imunoensaios, sequenciamento, ensaio bio- químico, ensaio de função, microscopia ou combinação dos mesmos.
[56] Em um outro aspecto, um método de avaliação de eficácia ou eficiência de uma formulação, vetor ou construto compreendendo um agente de teste para BCD é provido. Tal método inclui tipicamente contato de amostras celulares múltiplas de uma linhagem celular iPS- RPE derivada de um paciente com BCD ou uma linhagem celular iPS- RPE compreendendo um gene CYP4V2 mutado ou defeituoso como um resultado de edição ou manipulação genética artificial com um agente de teste formulado ou empacotado em várias formulações, ve- tores ou construtos; e avaliação das amostras celulares quanto à nor- malização em níveis de um ou mais composto mostrado na Tabela 2; um aumento em sequência de ácido nucleico de CYP4V2 não defeitu- oso nas células; um aumento na quantidade de polipeptídeos de CYP4V2 nas células; estrutura, morfologia ou função celular melhora- da; e/ou tolerância ou morte celular, comparado com antes do trata- mento por tal agente de teste e/ou amostras celulares tratadas pelo mesmo agente de teste, mas formulado ou empacotado em uma for- mulação, vetor ou construto diferente, para determinar e comparar a eficiência ou eficácia de tal formulação, vetor ou construto; em que as células são avaliadas usando técnicas de PCR, imunoensaios, se- quenciamento, ensaio bioquímico, ensaio de viabilidade celular, mi- croscopia ou combinação dos mesmos.
[57] Em um aspecto, um método de avaliação de faixa de dosa- gem eficaz e segura de um agente de teste para BCD é provido. Tal método inclui tipicamente contato de amostras celulares múltiplas de uma linhagem celular iPS-RPE derivada de um paciente com BCD ou uma linhagem celular iPS-RPE compreendendo um gene CYP4V2 mu- tado ou defeituoso como um resultado de edição ou manipulação ge- nética artificial com um agente de teste em uma dose diferente para cada amostra celular; avaliação das amostras celulares quanto à nor- malização em níveis de um ou mais composto mostrado na Tabela 2; um aumento em sequência de ácido nucleico de CYP4V2 não defeitu-
oso nas células; um aumento na quantidade de polipeptídeos de CYP4V2 nas células; estrutura, morfologia ou função celular melhora- da, e/ou tolerância ou morte celular, comparado antes do tratamento por tal agente de teste e/ou amostras celulares tratadas pelo mesmo agente de teste, mas com uma dose diferente, para determinar e com- parar a eficácia e segurança de doses diferentes, desta maneira de- terminando uma faixa de dosagem apropriada; em que as células são avaliadas usando técnicas de PCR, imunoensaios, sequenciamento, ensaio bioquímico, ensaio de viabilidade celular, ensaio de função, mi- croscopia ou combinação dos mesmos.
[58] Em um outro aspecto, um método de avaliação da eficácia ou eficiência de um dispositivo ou método de administração para ad- ministração de um agente terapêutico à retina ou células retinais é provido. Tal método inclui tipicamente (i) contato de uma amostra celu- lar de uma linhagem celular iPS-RPE derivada de um paciente com BCD ou uma linhagem celular iPS-RPE compreendendo um gene CYP4V2 mutado ou defeituoso como um resultado de edição ou mani- pulação genética artificial com um agente de teste sem emprego do dispositivo ou método de administração; (ii) contato de uma outra amostra celular de uma linhagem celular iPS-RPE derivada de um pa- ciente com BCD ou uma linhagem celular iPS-RPE compreendendo um gene CYP4V2 mutado ou defeituoso como um resultado de edição ou manipulação genética artificial com o agente de teste da mesma dosagem que em (i) empregando o dispositivo ou método de adminis- tração; (iii) avaliação e comparação das amostras celulares de (i) e (ii) para normalização em níveis de um ou mais composto mostrado na Tabela 2; um aumento em sequência de ácido nucleico de CYP4V2 não defeituoso nas células; um aumento na quantidade de polipeptí- deos de CYP4V2 nas células; estrutura, morfologia ou função celular melhorada; tolerância ou morte celular; e/ou os níveis do agente de teste nas células, comparado com antes do tratamento por tal agente de teste e/ou tratamento pelo mesmo agente de teste da mesma dose, mas sem emprego do dispositivo ou método de administração, para determinar a eficácia ou eficiência de tal dispositivo ou técnica de ad- ministração; em que as células são avaliadas usando técnicas de PCR, imunoensaios, sequenciamento, ensaio bioquímico, ensaio de função, microscopia ou combinação dos mesmos.
[59] Em algumas modalidades, as células retinais são células de RPE. Terapia de Edição genética CRISPR
[60] Em um aspecto, é provida uma composição que inclui: (a) um RNA-guia de CRISPR direcionando uma sequência de ácido nu- cleico (a “sequência-alvo”) de ou dentro de 100 pbs para o gene CYP4V2 e (b) uma proteína associada a CRISPR (Cas) funcional. Em algumas modalidades, tal composição pode incluir ainda (c) uma se- quência de ácido nucleico doadora compreendendo toda ou uma por- ção de uma sequência do tipo selvagem ou uma sequência funcional do gene CYP4V2 para correção, rompimento ou substituição de gene CYP4V2 ou uma porção do mesmo.
[61] Em algumas modalidades, um ou mais componentes da mesma são providos na forma de uma molécula de DNA codificando tal componente, uma molécula de mRNA codificando tal componente, uma molécula de RNA, um polipeptídeo e/ou uma ribonucleoproteína (RNP) ou complexo de proteína-RNA. Em algumas modalidades, dois ou mais componentes da mesma estão em molécula separada ou combinados em uma molécula ou em um complexo, estão em vetores separados ou combinados em um vetor, estão em um ou mais com- plexo de ácido nucleico, estão em um ou mais complexo de RNP. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico doadora é provi- da em um oligonucleotídeo doador de filamento único (ssODN) ou um vetor. Em algumas modalidades, o vetor é um plasmídeo, um vetor de AAV recombinante, um vetor de lentivírus recombinante e/ou uma combinação dos mesmos.
[62] Em alguns aspectos, uma composição incluindo uma célula com uma mutação de CYP4V2 patológica que contém qualquer uma das composições descritas aqui é provida. Em algumas modalidades, (a) o RNA-guia de CRISPR compreendendo (i) um RNA de CRISP (crRNA) que compreende uma sequência de elemento protoespaçador que é complementar à sequência-alvo de ou dentro de 100 pbs para um gene-alvo (o “gene-alvo”) e uma sequência que corresponde a uma região complementar do crRNA de transativação (tracrRNA) e (ii) um tracrRNA que compreende uma região que é complementar à regi- ão correspondente do crRNA e uma sequência que interage com uma proteína associada a CRISPR 9 (Cas9) e (b) a proteína associada a CRISPR funcional compreende Cas9.
[63] Em algumas modalidades, o elemento protoespaçador é de cerca de 20 bases, cerca de 19 bases, cerca de 21 bases, cerca de 19-21 bases, cerca de 18-22 bases ou cerca de 16-24 bases. Em al- gumas modalidades, o crRNA e o tracrRNA estão em moléculas sepa- radas. Em algumas modalidades, o crRNA e o tracrRNA são combina- dos em um RNA-guia único (sgRNA). Em algumas modalidades, o sgRNA é de cerca de 88-150 pbs.
[64] Em algumas modalidades, a Cas9 compreende um ortólogo de Cas9 ou Cas9 mutante selecionado de: Streptococcus pyogenes (SpCas9), SpCas9 nickase (Cas9n D10A), SpCas9 (D1135E), eS- pCas9, SpCas9-HF1, SpCas9 VRER, SpCas9 VQR, SpCas9EQR, Staphylococcus aureus (SaCas9), Neisseria Meningitidis, Streptococ- cus thermophilus, Streptococcus pneumnoniae, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Streptococcus mutans, Pasteurella multocida, Bifidobacterium longum, Bacillus smithii, Treponema denticola, myco-
plasma canis e enterococcus faecalis. Em algumas modalidades, a proteína associada a CRISPR, Cas9, ou Cpf1, inclui ainda uma, duas, três ou mais sequências de localização nuclear (NLS) no terminal N e/ou terminal C, e/ou um marcador de seleção, incluindo, sem limita- ção, GFP ou EGFP.
[65] Em algumas modalidades, (a) o RNA-guia de CRISPR compreende um crRNA que compreende uma sequência de elemento protoespaçador que é complementar à sequência-alvo de ou dentro de 100 pbs para um gene-alvo (b) a proteína associada a CRISPR funci- onal compreende Cpf1. Em algumas modalidades, o elemento protoe- spaçador é de cerca de 20 bases, cerca de 21 bases, cerca de 22 ba- ses, cerca de 23 bases, cerca de 24 bases, cerca de 19-25 bases, cerca de 18-26 bases ou cerca de 16-28 bases.
[66] Em algumas modalidades, a sequência do elemento proto- espaçador é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 48 a 52 ou compartilha pelo menos 85% de identidade de sequência com uma de SEQ ID NOs: 48 a 52 para uso com uma proteína Cas que tem NGG como um motivo adjacente a protoespaçador (PAM) para se direcionar à mutação c.802-8_810del17insGC do gene CYP4V2. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico doadora é sele- cionada de SEQ ID NOs: 56 e 57 (isto é, as duas sequências modelo doadoras) ou compartilha pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID NOs: 56 e 57, ou uma sequência que é comple- mentar à mesma, para uso para corrigir, romper ou substituir a muta- ção c.802-8_810del17insGC no gene CYP4V2. Reivindicações de
[67] Método de terapia genética CRISPR Em um outro aspecto, um método de tratamento ou prevenção de BCD em um indivíduo ou uma célula com um gene CYP4V2 mutado é provido. Tal método inclui (i) identificar a mutação patológica no indivíduo ou na célula através de sequenciamento; (ii) encontrar sítios de PAM relacionados à Cas den- tro da região se estendendo de a partir de cerca de 100 pbs a montan- te do primeiro nucleotídeo envolvido na mutação até cerca de 100 pbs a jusante do último nucleotídeo envolvido na mutação; (iii) identificar várias sequências de elemento protoespaçador direcionando à se- quência de CYP4V2 relevante para cada sítio de PAM identificado em (ii); (iv) avaliar o nível de atividade de cada RNA-guia de CRISPR compreendendo uma sequência de elemento protoespaçador identifi- cada em (iii) e perfil de edição fora do alvo com base na sequência de elemento protoespaçador e PAM; (v) selecionar um ou mais projeto de RNA-guia de CRISPR com base em (iv); (vi) projetar uma ou mais se- quência de ácido nucleico doadora com base em reparo baseado em homologia (HDR) para correção, rompimento ou substituição da muta- ção de CYP4V2 direcionada; (vii) construir RNA-guia de CRISPR, Cas e sequência de ácido nucleico doadora como provido nas reivindica- ções de composição 1 a 18; (viii) opcionalmente validar e selecionar mais os componentes de (vii) em uma célula isolada do indivíduo; ou uma célula iPS derivada do indivíduo ou uma célula diferenciada de uma célula-tronco derivada do indivíduo ou o DNA genômico isolado do indivíduo ou uma célula isolada ou derivada do mesmo para avaliar o nível de atividade e/ou perfil de edição fora do alvo; e (ix) administrar os componentes em (viii) ao indivíduo ou à célula através de um sis- tema de administração selecionado do grupo consistindo em uma ri- bonucleoproteína ou complexo de proteína-RNA, um vetor, uma prote- ína, uma molécula de ácido nucleico, uma nanopartícula, um liposso- ma, uma micela, um virossoma, um complexo de ácido nucleico, e/ou uma combinação dos mesmos, em que a administração é realizada através de eletroporação ou através de transfecção mediada por lipí- deo, ou nucleofecção, ou transdução viral ou injeção, ou uma combi- nação dos mesmos; (x) em que para tratamento em células in vitro, um marcador de seleção incluindo, sem limitação, GFP, EGFP ou resis- tência à puromicina é opcionalmente adicionado ou incorporado aos componentes em (viii).
[68] Em um aspecto, uma composição de edição genética é provida para correção ou substituição da mutação c.802- 8_810del17insGC em um gene CYP4V2 em um indivíduo in vivo ou em uma célula in vitro. Tal composição inclui tipicamente: (i) uma RNA- guia de CRISPR compreendendo uma sequência de elemento protoe- spaçador selecionada de uma de SEQ ID NOs: 48 a 52 ou comparti- lhando pelo menos 80% de identidade de sequência com uma das se- quências em SEQ ID NOs: 48 a 52; (ii) uma sequência de ácido nu- cleico doadora selecionada de uma de SEQ ID NOs: 56 e 57 ou com- partilha pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID NOs: 56 e 57 ou uma sequência que é complementar à mes- ma; e (iii) uma proteína Cas9 (sequência exemplar mostrada na SEQ ID NO: 58), contendo opcionalmente 1, 2, 3 ou mais NLS, e/ou um marcador de seleção incluindo, sem limitação, GFP ou EGFP.
[69] Em algumas modalidades, um nucleotídeo G opcional é adicionado antes da sequência do elemento protoespaçador. Em al- gumas modalidades, o RNA-guia de CRISPR inclui um crRNA (se- quência exemplar (excluindo a sequência do elemento protoespaçador 5’) mostrado na SEQ ID NO: 53) e um tracrRNA (sequência exemplar mostrada na SEQ ID NO: 54); e a sequência do elemento protoespa- çador está contida no crRNA. Em algumas modalidades, o RNA-guia de CRISPR inclui um RNA-guia único (sgRNA) compreendendo a se- quência do elemento protoespaçador (sequência de sgRNA exemplar (excluindo a sequência do elemento protoespaçador 5’) mostrada na SEQ ID NO: 55).
[70] Em algumas modalidades, um ou mais componentes de (i), (ii) e (iii) são providos na forma de uma molécula de DNA codificando tal componente, uma molécula de mRNA codificando tal componente, uma molécula de ácido nucleico, um vetor, uma molécula de RNA, um polipeptídeo, uma ribonucleoproteína (RNP) ou complexo de proteína- RNA e/ou uma combinação dos mesmos. Reivindicações de Terapia Celular para BCD, Terapia Celular Autóloga para Doença Ocular e Tratamento de Combinação Terapia Celular para BCD Terapia Celular Alogênica ou Terapia Celular Autóloga sem reparo ge- nético para BCD
[71] Em alguns aspectos, um método de tratamento ou preven- ção de uma doença do olho em um indivíduo é provido, em que a do- ença é associada com uma alteração genética ou epigenética patoló- gica no gene CYP4V2. Tal método inclui tipicamente administrar uma composição celular ao indivíduo, em que a composição celular inclui: células do epitélio pigmentar da retina (RPE), fotorreceptoras ou pro- genitoras de fotorreceptoras (PRCs), células epiteliais da córnea (CECs), células endoteliais coroidais (CE) e/ou outras células oculares derivadas de uma célula-tronco.
[72] Em algumas modalidades, a célula-tronco é uma célula- tronco embriônica (ES), uma célula iPC, uma MSC, uma célula-tronco adulta ou uma célula-tronco específica de tecido. Em algumas modali- dades, a célula-tronco é de ou derivada de um ou mais indivíduos não tendo BCD ou não tendo um gene CYP4V3 patológico. Em algumas modalidades, a célula-tronco é de ou derivada de um ou mais indiví- duos com mutações patológicas no gene CYP4V2. Em algumas moda- lidades, o indivíduo é um indivíduo humano. Terapia celular autóloga geneticamente reparada para BCD
[73] Em um outro aspecto, é provida uma composição celular que inclui (a) uma célula-tronco reprogramada a partir de uma célula isolada de ou uma célula-tronco isolada de um indivíduo afetado por
BCD ou tendo mutações patológicas no gene CYP4V2 ou (b) uma cé- lula diferenciada de uma célula-tronco isolada de um indivíduo ou re- programada a partir de uma célula isolada de um indivíduo afetado por BCD ou tendo mutações patológicas no gene CYP4V2.
[74] Em algumas modalidades, a célula-tronco reprogramada a partir de uma célula isolada do indivíduo é uma célula iPC. Em algu- mas modalidades, a célula iPS é reprogramada a partir de qualquer célula de qualquer tecido do indivíduo. Em algumas modalidades, a célula iPS é reprogramada a partir de uma célula da pele, uma célula sanguínea, uma célula urinária, uma célula capilar, um fibroblasto, uma célula mononuclear de sangue periférico (PBMC), uma célula epi- telial renal, um folículo piloso ou uma célula papilar dermal. Em algu- mas modalidades, a célula-tronco isolada do indivíduo é uma MSC, uma célula-tronco adulta ou uma célula-tronco específica de tecido. Em algumas modalidades, a célula diferenciada de uma célula-tronco é uma célula ocular. Em algumas modalidades, a célula diferenciada de uma célula-tronco é uma célula de RPE, uma PRC, uma célula reti- nal, uma célula da córnea, uma célula coroidal, uma CEC ou uma célu- la CE. Em algumas modalidades, a célula diferenciada de uma célula- tronco é uma célula iPS-RPE, iPS-PRC, iPS-CEC ou iPS-CE
[75] Em algumas modalidades, (i) a célula isolada de um indiví- duo afetado por BCD ou tendo mutações patológicas no gene CYP4V2 para uso para reprogramar em uma iPSC, (ii) a célula-tronco isolada de um indivíduo ou célula iPS reprogramada a partir de uma célula iso- lada de um indivíduo afetado por BCD ou tendo mutações patológicas no gene CYP4V2 ou (iii) a célula diferenciada de uma célula-tronco isolada de um indivíduo ou uma célula iPS reprogramada a partir de uma célula isolada de um indivíduo afetado por BCD ou tendo muta- ções patológicas no gene CYP4V2, é geneticamente reparada para melhorar o efeito do gene CYP4V2 mutado. Em algumas modalidades,
reparo genético é realizado antes da reprogramação em uma célula iPS. Em algumas modalidades, reparo genético é realizado após re- programação em uma célula iPS. Em algumas modalidades, reparo genético é realizado antes da diferenciação da célula-tronco ou célula iPS. Em algumas modalidades, reparo genético é realizado após dife- renciação da célula-tronco ou célula iPS. Em algumas modalidades, reparo genético é através de terapia de transferência genética. Em al- gumas modalidades, reparo genético é através de terapia de transfe- rência genética através do uso de qualquer composição ou método de qualquer uma das reivindicações de terapia genética. Em algumas modalidades, reparo genético é através de edição genética. Em algu- mas modalidades, reparo genético é através de edição genética atra- vés do uso de qualquer composição ou método de qualquer uma das reivindicações de terapia genética CRISPR.
[76] Em um outro aspecto, um método de tratamento ou pre- venção de uma doença do olho em um indivíduo afetado por BCD ou tendo alterações genéticas ou epigenéticas patológicas no gene CYP4V2 é provido. Tal método inclui tipicamente administração de qualquer uma das composições celulares autólogas de CYP4V2 des- critas aqui ao indivíduo, em que a composição celular inclui: células do epitélio pigmentar da retina (RPE), fotorreceptoras ou progenitoras de fotorreceptoras (PRCs), células epiteliais da córnea (CECs), células endoteliais coroidais (CE) e/ou outras células oculares derivadas de uma célula-tronco do indivíduo.
[77] Em algumas modalidades, a célula-tronco é uma célula iPC, uma MSC, uma célula-tronco adulta ou uma célula-tronco especí- fica de tecido. Em algumas modalidades, a célula iPS é reprogramada usando um ou mais dos fatores de transcrição OCT4, SOX2, KLF4 e c- MYC. Em algumas modalidades, as células geneticamente reparadas demonstram um ou mais do que segue: normalização em níveis de um ou mais composto mostrado na Tabela 2; um aumento em sequência de ácido nucleico de CYP4V2 não defeituoso nas células; um aumento na quantidade de polipeptídeos de CYP4V2 funcionais; e/ou estrutura, morfologia ou função celular melhorada, comparado com antes do re- paro genético ser realizado.
[78] Em algumas modalidades, a quantidade de células adminis- tradas é cerca de 1.000 a cerca de 100 milhões de células em uma única administração. Em algumas modalidades, a administração é através de injeção. Em algumas modalidades, a administração é atra- vés de injeção sub-retinal. Em algumas modalidades, a administração é através de injeção intravítrea. Em algumas modalidades, a adminis- tração é através de injeção retinal direta. Em algumas modalidades, a administração é através de injeção na córnea. Em algumas modalida- des, a administração é através de qualquer outro método de adminis- tração que administre eficazmente as células ao local sub-retinal, ao segmento posterior ou à córnea do olho do indivíduo. Em algumas modalidades, as células são administradas através de injeção de uma suspensão celular. Em algumas modalidades, as células são adminis- tradas como parte de uma folha, uma matriz, uma base ou um tecido.
[79] Em algumas modalidades, as células de RPE são adminis- tradas usando bases naturais e/ou sintéticas para gerar uma monoca- mada de RPE funcional. Em algumas modalidades, o indivíduo é um indivíduo humano. Terapia celular autóloga geneticamente reparada para doenças ocula- res
[80] Em um outro aspecto, é provida uma composição celular que inclui (a) uma célula-tronco reprogramada a partir de uma célula isolada de ou uma célula-tronco isolada de um indivíduo afetado por uma doença causada por um gene mutado ou defeituoso ou um gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou par-
cial ou (b) uma célula diferenciada a partir de uma célula-tronco isola- da de um indivíduo ou reprogramada a partir de uma célula isolada de um indivíduo afetado por uma doença causada por um gene mutado ou defeituosos ou um gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial.
[81] Em algumas modalidades, a célula-tronco reprogramada a partir de uma célula isolada do indivíduo é uma célula iPS. Em algu- mas modalidades, a célula iPS é reprogramada a partir de qualquer célula de qualquer tecido do indivíduo. Em algumas modalidades, a célula iPS é reprogramada a partir de uma célula da pele, uma célula sanguínea, uma célula urinária, uma célula capilar, um fibroblasto, uma célula mononuclear de sangue periférico (PBMC), uma célula epi- telial renal, um folículo piloso ou uma célula papilar dermal. Em algu- mas modalidades, a célula-tronco isolada do indivíduo é uma MSC, uma célula-tronco adulta ou uma célula-tronco específica de tecido.
[82] Em algumas modalidades, o gene está envolvido em de- senvolvimento ou função ocular e/ou mutação do qual causa ou é um fator de risco para causar uma doença ocular. Em algumas modalida- des, o gene está envolvido em desenvolvimento ou função neuronal e/ou mutação do qual causa ou é um fator de risco para causar uma doença neurodegenerativa. Em algumas modalidades, o gene é um gene P450 do citocromo. Em algumas modalidades, o gene é um mos- trado na Tabela 4.
[83] Em algumas modalidades, o gene inclui um gene CYP4V2, CYP1B1, MYO7A, DFNB31, USH1C, USH1G, CDH23, PCDH15, CLRN1, ACO2, AFG3L2, ATXN2, AUH, C12orf65, CISD2, FOXC1, FOXF2, LTBP2, MTPAP, MYOC, NDUFS1, NR2F1, OPA1, OPA3, OPTN, PAX6, PDGF, PITX2, POLG, SPG7, TEK, TXNRD2, WFS1, ABCA4, REP-1, RPE65, CEP290, PDE6B, RPGR, MERTK, MT-ND4, FAM47E, GBA, GCH1, HTRA2, LRRK2, PARK2, PINK1, SNCA,
SYNJ1, NPC1, NPC2, CYP4A11, CYP4A22, CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F22, CYP4X1, CYP4Z1 ou gene CYP46A ou um gene CYP4V2, CYP1B1, MYO7A, DFNB31, USH1C, USH1G, CDH23, PCDH15, CLRN1, ACO2, AFG3L2, ATXN2, AUH, C12orf65, CISD2, FOXC1, FOXF2, LTBP2, MTPAP, MYOC, NDUFS1, NR2F1, OPA1, OPA3, OPTN, PAX6, PDGF, PITX2, POLG, SPG7, TEK, TXNRD2, WFS1, ABCA4, REP-1, RPE65, CEP290, PDE6B, RPGR, MERTK, MT-ND4, FAM47E, GBA, GCH1, HTRA2, LRRK2, PARK2, PINK1, SNCA, SYNJ1, NPC1, NPC2, CYP4A11, CYP4A22, CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F22, CYP4X1, CYP4Z1 ou CYP46A mutado ou defei- tuoso que codifica uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial.
[84] Em algumas modalidades, a célula diferenciada a partir de uma célula-tronco é qualquer tipo de célula. Em algumas modalidades, a célula diferenciada a partir de uma célula-tronco é uma célula ocular. Em algumas modalidades, a célula diferenciada a partir de uma célula- tronco é uma célula de RPE, uma PRC, uma célula retinal, uma célula da córnea, uma célula coroidal, uma CEC, uma célula CE ou uma cé- lula do nervo óptico. Em algumas modalidades, a célula diferenciada de uma célula-tronco é uma célula iPS-RPE, iPS-PRC, iPS-CEC ou iPS-CE. Em algumas modalidades, a célula diferenciada de uma célu- la-tronco é um neurônio.
[85] Em algumas modalidades, (i) a célula isolada de um indiví- duo afetado por uma doença causada por um gene mutado ou defeitu- oso ou um gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial para uso para reprogramar em uma iPSC, (ii) a célula-tronco isolada de um indivíduo ou célula iPS reprogramada a partir de uma célula isolada de um indivíduo afetado por uma doença causada por um gene mutado ou defeituoso ou um gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial ou (iii) a célula diferenciada a partir de uma célula-tronco isolada de um indiví- duo ou uma célula iPS reprogramada de uma célula isolada de um in- divíduo afetado por uma doença causada por um gene mutado ou de- feituoso ou um gene codificando uma proteína tendo função ou ativi- dade defeituosa ou parcial é geneticamente reparada para melhorar o efeito do gene mutado ou defeituoso.
[86] Em algumas modalidades, reparo genético é realizado an- tes da reprogramação em uma célula iPS. Em algumas modalidades, reparo genético é realizado após reprogramação para uma célula iPS. Em algumas modalidades, reparo genético é realizado antes da dife- renciação da célula-tronco ou célula iPS. Em algumas modalidades, reparo genético é realizado após diferenciação da célula-tronco ou cé- lula iPS. Em algumas modalidades, reparo genético é através de tera- pia de transferência genética. Em algumas modalidades, reparo gené- tico é através de terapia de transferência genética usando qualquer composição ou método de qualquer uma das reivindicações relaciona- das à terapia genética. Em algumas modalidades, reparo genético é através de terapia de edição genética. Em algumas modalidades, re- paro genético é através de terapia de edição genética usando qualquer composição ou método de qualquer uma das reivindicações relaciona- das à terapia genética CRISPR.
[87] Em um outro aspecto, um método de tratamento ou pre- venção de uma doença em um indivíduo afetado por uma doença cau- sada por um gene defeituoso ou mutado ou um gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial mostrada na Tabela 4 é provido. Tal método inclui tipicamente administração de uma composição celular autóloga como aqui descrito ao indivíduo, em que a composição celular inclui: células do epitélio pigmentar da retina (RPE), fotorreceptoras ou progenitoras de fotorreceptoras (PRCs), cé-
lulas do epitélio da córnea (CECs), neurônios, células endoteliais co- roidais (CE) e/ou outras células oculares derivadas de uma célula- tronco do indivíduo, e em que o gene mutado ou defeituoso na compo- sição celular foi geneticamente reparado.
[88] Em ainda um outro aspecto, é provido um método para tra- tar autologamente um indivíduo. Tal método inclui tipicamente (i) pro- ver células a partir de um indivíduo tendo uma doença do olho; (ii) in- duzir pluripotência nas células do indivíduo para produzir iPSCs; (iii) reparar geneticamente uma ou mais mutações em um gene mutado ou defeituoso mostrado na Tabela 4 nas iPSCs derivadas do indivíduo; (iv) diferenciar as iPSCs em células oculares; (v) alternativa para a etapa (iii), reparar geneticamente as células oculares iPS através de terapia de transferência genética; (vi) introduzir as células iPS-oculares no indivíduo, desta maneira tratando autologamente o indivíduo tendo a doença do olho.
[89] Em algumas modalidades, a célula-tronco é uma célula iPS, uma MSC, uma célula-tronco adulta ou uma célula-tronco específica de tecido. Em algumas modalidades, a célula iPS é reprogramada usando um ou mais fatores de transcrição OCT4, SOX2, KLF4 e c- MYC. Em algumas modalidades, as células geneticamente reparadas demonstram um ou mais do que segue: um aumento em sequência de ácido nucleico de gene-alvo não defeituoso nas células; um aumento na quantidade de polipeptídeos funcionais codificados pelo gene-alvo nas células; estrutura, morfologia ou função celular melhorada e/ou funções bioquímicas melhoradas ou normalizadas nas células, compa- rado com antes do reparo genético ser realizado. Em algumas modali- dades, a quantidade de células administradas é cerca de 1.000 a cer- ca de 100 milhões de células em uma única administração.
[90] Em algumas modalidades, a administração é através de injeção. Em algumas modalidades, a administração é através de inje-
ção sub-retinal. Em algumas modalidades, a administração é através de injeção intravítrea. Em algumas modalidades, a administração é através de injeção retinal direta. Em algumas modalidades, a adminis- tração é através de injeção na córnea. Em algumas modalidades, a administração é através de qualquer outro método de administração que administre eficazmente as células ao local sub-retinal, ao segmen- to posterior ou à córnea do olho do indivíduo. Em algumas modalida- des, as células são administradas através de injeção de suspensão celular. Em algumas modalidades, as células são administradas como parte de uma folha, uma matriz, uma base ou um tecido. Em algumas modalidades, as células de RPE são administradas usando bases na- turais e/ou sintéticas para gerar uma monocamada de RPE funcional. Em algumas modalidades, o indivíduo é um indivíduo humano.
[91] Em algumas modalidades, a doença está associada com uma alteração genética ou epigenética ou fator de risco no indivíduo. Em algumas modalidades, a doença é degeneração de fotorreceptor, degeneração da célula do epitélio pigmentar da retina, degeneração retinal, degeneração da córnea e/ou distúrbios coroidais. Em algumas modalidades, a doença é uma degeneração retinal herdada (IRD). Em algumas modalidades, a doença é retinite pigmentosa (RP). Em algu- mas modalidades, a doença é Distrofia Cristalina de Bietti (também conhecida como Distrofia Cristalina Corneorretinal de Bietti; BCD). Em algumas modalidades, a doença está relacionada com degeneração neurológica. Em algumas modalidades, a doença é distrofia da córnea. Em algumas modalidades, o indivíduo tem BCD ou está sob risco de desenvolver BCD.
[92] Em algumas modalidades, as células são fibroblastos, célu- las sanguíneas ou células oculares. Em algumas modalidades, as cé- lulas são obtidas de urina ou de cabelo ou folículos pilosos. Em algu- mas modalidades, as células oculares são células do epitélio pigmen-
tar da retina (RPE), células epiteliais da córnea (CECs), células endo- teliais coroidais (CE) ou células fotorreceptoras (PRCs).
[93] Em algumas modalidades, a alteração genética ou epigené- tica é selecionada do grupo consistindo em mutação, uma inserção, um polimorfismo de nucleotídeo único, metilação imprópria, desmetila- ção imprópria e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a alteração genética ou epigenética é uma mutação. Em algumas mo- dalidades, a alteração genética ou epigenética em células oculares iPS do indivíduo foi geneticamente reparada usando edição genética. Em algumas modalidades, o método de edição genética utiliza uma nu- clease dedo-de-zinco, tecnologia TALEN ou tecnologia CRISPR. Em algumas modalidades, a alteração genética ou epigenética nas células iPSC-oculares do indivíduo foi geneticamente reparada usando trans- ferência de gene. Em algumas modalidades, o método de transferên- cia de gene utiliza um vetor de AAV recombinante ou um outro vetor viral ou vetor não viral para administrar uma cópia saudável do gene- alvo (por exemplo, cDNA) às células a serem transplantadas.
[94] Em algumas modalidades, a etapa de administração acon- tece antes do início de sintomas da doença ou após o início de sinto- mas da doença. Em algumas modalidades, a administração é ao olho ou um outro órgão ou tecido compreendendo neurônios. Em algumas modalidades, a administração é através de injeção. Em algumas mo- dalidades, a administração é através de injeção sub-retinal ou intraví- trea. Em algumas modalidades, a administração é através de injeção retinal direta. Em algumas modalidades, a administração é através de injeção na córnea. Em algumas modalidades, a administração é atra- vés de qualquer outro método que administre eficazmente as células ao local sub-retinal, ao segmento posterior ou à córnea do olho do in- divíduo.
[95] Em algumas modalidades, o método inclui ainda, antes da administração ou transplante, realização de análise genotípica nas cé- lulas para identificar a presença ou ausência da alteração genética ou epigenética em um ou mais genes mostrados na Tabela 4. Em algu- mas modalidades, a alteração genética ou epigenética é uma muta- ção. Em algumas modalidades, a mutação é na molécula de ácido nu- cleico de CYP4V2. Em algumas modalidades, o método inclui ainda, antes da administração, avaliação do olho do indivíduo para identificar a(s) área(s) e extensão de fotorreceptores, células retinais ou células da córnea danificados ou retidos.
[96] Em algumas modalidades, o método inclui ainda, seguindo administração, monitoramento do indivíduo. Em algumas modalidades, o monitoramento compreende realização de imagem retinal não inva- siva, testes da córnea, perimetria, ERG, OCT, testes de acuidade vi- sual e/ou estudos funcionais. Em algumas modalidades, o monitora- mento compreende avaliação do indivíduo quanto a uma resposta imune. Em algumas modalidades, o método inclui ainda, seguindo administração, avaliação do olho do indivíduo para identificar a(s) área(s) e extensão de fotorreceptores, células retinais ou células da córnea danificados ou retidos. Reivindicações de Terapia Celular –RNP Reivindicações de RNP
[97] Em um outro aspecto, é provida uma composição que in- clui: (a) um RNA-guia de CRISPR direcionando uma sequência de áci- do nucleico (a “sequência-alvo”) de ou dentro de 100 pbs para um ge- ne-alvo (o “gene-alvo”) e (b) uma proteína associada a CRISPR funci- onal, em uma ribonucleoproteína (RNP) ou complexo de proteína- RNA.
[98] Em algumas modalidades, a composição inclui ainda (c) uma sequência de ácido nucleico doadora incluindo toda ou uma por- ção de uma sequência do tipo selvagem ou uma sequência funcional do gene-alvo para correção ou substituição de tal gene-alvo ou uma porção do mesmo. Em algumas modalidades, o gene-alvo está envol- vido em desenvolvimento ou função ocular e/ou mutação do qual cau- sa ou é um fator de risco para causar uma doença ocular. Em algumas modalidades, o gene-alvo está envolvido em desenvolvimento ou fun- ção neuronal e/ou mutação do qual causa ou é um fator de risco para causar uma doença neurodegenerativa.
[99] Em algumas modalidades, o gene-alvo é um gene do cito- cromo P450. Em algumas modalidades, o gene-alvo inclui um gene mostrado na Tabela 4 que é mutado ou defeituoso ou codifica uma proteína tendo uma função ou atividade defeituosa ou parcial. Em al- gumas modalidades, a sequência de ácido nucleico doadora é provida em um oligonucleotídeo doador de filamento único (ssODN) ou um ve- tor.
[100] Em algumas modalidades, (a) o RNA-guia de CRISPR in- cluindo (i) um RNA de CRISPR (crRNA) que inclui uma sequência de elemento protoespaçador que é complementar à sequência-alvo de ou dentro de 100 pbs para um gene-alvo e uma sequência que corres- ponde a uma região complementar do crRNA de transativação (tracrRNA) e (ii) um tracrRNA que inclui uma região que é complemen- tar à região correspondente do crRNA e uma sequência que interage com uma proteína associada a CRISPR 9 (Cas9) e (b) a proteína as- sociada a CRISPR funcional compreende Cas9.
[101] Em algumas modalidades, o elemento protoespaçador é de cerca de 20 bases, cerca de 19 bases, cerca de 21 bases, cerca de 19-21 bases, cerca de 18-22 bases ou cerca de 16-24 bases. Em al- gumas modalidades, o crRNA e o tracrRNA estão em moléculas de ácido nucleico diferentes. Em algumas modalidades, o crRNA e o tracrRNA são combinados em um RNA-guia único (sgRNA). Em algu- mas modalidades, o sgRNA é de cerca de 88-150 pbs.
[102] Em algumas modalidades, a Cas9 compreende um ortólogo de Cas9 ou uma Cas9 mutante selecionada de: Streptococcus pyoge- nes (SpCas9), SpCas9 nickase (Cas9n D10A), SpCas9 (D1135E), eS- pCas9, SpCas9-HF1, SpCas9 VRER, SpCas9 VQR, SpCas9EQR, Staphylococcus aureus (SaCas9), Neisseria Meningitidis, Streptococ- cus thermophilus, Streptococcus pneumnoniae, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Streptococcus mutans, Pasteurella multocida, Bifidobacterium longum, Bacillus smithii, Treponema denticola, myco- plasma canis e enterococcus faecalis.
[103] Em algumas modalidades, (a) o RNA-guia de CRISPR compreende um crRNA que compreende uma sequência de elemento protoespaçador que é complementar à sequência-alvo de ou dentro de 100 pbs para um gene-alvo e (b) a proteína associada a CRISPR fun- cional compreende Cpf1. Em algumas modalidades, o elemento proto- espaçador é de cerca de 20 bases, cerca de 21 bases, cerca de 22 bases, cerca de 23 bases, cerca de 24 bases, cerca de 19-25 bases, cerca de 18-26 bases ou cerca de 16-28 bases. Em algumas modali- dades, a proteína associada a CRISPR, Cas9, ou Cpf1, compreende ainda uma, duas, três ou mais sequências de localização nuclear (NLS) no terminal N e/ou terminal C e/ou um marcador de seleção, in- cluindo, sem limitação, GFP ou EGFP.
[104] Em algumas modalidades, o elemento protoespaçador é 100% complementar à sequência-alvo ou contém 1, 2, 3, 4 ou 5 faltas de compatibilidade de nucleotídeo correspondendo à sequência-alvo. Em algumas modalidades, a sequência de crRNA compreende ainda um nucleotídeo G adicionado opcionalmente à sequência de crRNA imediatamente antes do elemento protoespaçador. Em algumas moda- lidades, o RNA-guia de CRISPR, crRNA e/ou o tracrRNA, ou o sgRNA, é quimicamente modificado.
[105] Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico doadora não é mais do que cerca de 1kb, 800bp, 600bp, 500bp, 400bp, 300bp, 280bp, 260bp, 240bp, 220bp ou 200bp para uma se- quência de ácido nucleico doadora provida em um ssODN e não mais do que cerca de 30kb, 25kb, 20kb, 15kb, 10kb, 9kb, 8kb, 7kb, 6kb, 5kb, 4,5kb, 4kb, 3,5kb, 3kb, 2,5kb, 2kb, 1,5kb, 1kb, 0,5kb, 0,2kb ou 0,1kb para uma sequência de ácido nucleico doadora provida em um vetor. Em algumas modalidades, a versão do tipo selvagem do gene- alvo codifica uma enzima.
[106] Em algumas modalidades, o gene-alvo inclui um gene CYP4V2, CYP1B1, MYO7A, DFNB31, USH1C, USH1G, CDH23, PCDH15, CLRN1, ACO2, AFG3L2, ATXN2, AUH, C12orf65, CISD2, FOXC1, FOXF2, LTBP2, MTPAP, MYOC, NDUFS1, NR2F1, OPA1, OPA3, OPTN, PAX6, PDGF, PITX2, POLG, SPG7, TEK, TXNRD2, WFS1, ABCA4, REP-1, RPE65, CEP290, PDE6B, RPGR, MERTK, MT-ND4, FAM47E, GBA, GCH1, HTRA2, LRRK2, PARK2, PINK1, SNCA, SYNJ1, NPC1, NPC2, CYP4A11, CYP4A22, CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F22, CYP4X1, CYP4Z1 ou gene CYP46A ou um gene CYP4V2, CYP1B1, MYO7A, DFNB31, USH1C, USH1G, CDH23, PCDH15, CLRN1, ACO2, AFG3L2, ATXN2, AUH, C12orf65, CISD2, FOXC1, FOXF2, LTBP2, MTPAP, MYOC, NDUFS1, NR2F1, OPA1, OPA3, OPTN, PAX6, PDGF, PITX2, POLG, SPG7, TEK, TXNRD2, WFS1, ABCA4, REP-1, RPE65, CEP290, PDE6B, RPGR, MERTK, MT-ND4, FAM47E, GBA, GCH1, HTRA2, LRRK2, PARK2, PINK1, SNCA, SYNJ1, NPC1, NPC2, CYP4A11, CYP4A22, CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F22, CYP4X1, CYP4Z1 ou CYP46A muta- do ou defeituoso que codifica uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial.
[107] Em algumas modalidades, qualquer um ou mais componen- tes da mesma incluindo o RNA-guia de CRISPR, proteína associada a
CRISPR e/ou a sequência de ácido nucleico doadora é provido sepa- radamente e/ou adicionalmente em um vetor, um DNA e/ou um mRNA que pode transcrever e/ou traduzir em tal componente. Em um aspec- to, uma formulação farmacêutica incluindo qualquer uma das composi- ções descritas aqui é provida.
[108] Em um outro aspecto, é provido um método de tratamento de uma doença de um indivíduo causada por um gene mutado ou de- feituoso ou um gene codificando uma proteína tendo função ou ativi- dade defeituosa ou parcial. Tal método inclui rompimento, correção ou substituição de tal gene através da administração ao indivíduo de qualquer uma das composições descritas aqui.
[109] Em um outro aspecto, é provido um método de tratamento de uma doença ocular ou melhora de um fator de risco relacionado à mesma de um indivíduo causada por um gene mutado ou defeituoso ou um gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defei- tuosa ou parcial. Tal método inclui rompimento, correção ou substitui- ção de tal gene através da administração ao indivíduo de qualquer uma das composições descritas aqui.
[110] Em um outro aspecto, é provido um método de tratamento de uma doença neurodegenerativa ou melhora de um fator de risco relacionado à mesma de um indivíduo causada por um gene mutado ou defeituoso ou um gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial. Tal método inclui rompimento, corre- ção ou substituição de tal gene através da administração ao indivíduo de qualquer uma das composições descritas aqui.
[111] Em um outro aspecto, é provido um método de tratamento de uma doença ou melhora de um fator de risco relacionado à mesma de um indivíduo causada por um gene P450 do citocromo mutado ou defeituoso ou um gene P450 do citocromo codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial. Tal método inclui rompimento, correção ou substituição de tal gene através da adminis- tração ao indivíduo de qualquer uma das composições descritas aqui.
[112] Em algumas modalidades, o gene mutado ou defeituoso, ou gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial, rompido, corrigido ou substituído é uma versão mutada ou defeituosa de um gene mostrado na Tabela 4 ou uma versão de um gene mostrado na Tabela 4 que codifica uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial. Em algumas modalidades, o gene mu- tado ou defeituoso, ou gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial, está presente em fibroblastos, células sanguíneas, de RPE, fotorreceptoras, retinais, da córnea, coroidais, oculares, do nervo óptico, neurônio ou células-tronco ou qualquer tipo de células derivadas de uma célula-tronco.
[113] Em algumas modalidades, a presente composição é admi- nistrada a fibroblastos, células sanguíneas, de RPE, fotorreceptores, retinais, da córnea, coroidais, oculares, do nervo óptico, neurônio ou células-tronco ou qualquer tipo de células derivadas de uma célula- tronco. Em algumas modalidades, administração é realizada através de eletroporação ou através de transfecção mediada por lipídeo ou nucleofecção ou transdução viral ou injeção ou uma combinação das mesmas. Em algumas modalidades, qualquer um ou mais componen- tes das mesmas incluindo o RNA-guia de CRISPR, proteína associada a CRISPR e/ou a sequência de ácido nucleio doadora são administra- dos ao indivíduo ou às células através de um sistema de administra- ção selecionado do grupo consistindo em uma ribonucleoproteína ou complexo de proteína-RNA, uma nanopartícula, um lipossoma, uma micela, um virossoma, um complexo de ácido nucleico e/ou uma com- binação dos mesmos.
[114] Em algumas modalidades, o tratamento é realizado para um indivíduo in vivo. Em algumas modalidades, o tratamento é reali-
zado in vitro em fibroblastos, células sanguíneas, de RPE, fotorrecep- toras, retinais, da córnea, coroidais, oculares, do nervo óptico, de neu- rônio ou células-tronco ou qualquer tipo de células derivadas de uma célula-tronco. Em algumas modalidades, as células tratadas são transplantadas em um indivíduo in vivo, ou se a célula tratada for uma célula-tronco, tal célula-tronco é diferenciada no tipo desejado de célu- las para transplante e então as células diferenciadas são transplanta- das em um indivíduo in vivo.
[115] Em algumas modalidades, o gene mutado ou defeituoso, ou gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial, é substituído. Em algumas modalidades, o gene mutado ou defeituoso, ou gene codificando uma proteína tendo função ou ativida- de defeituosa ou parcial, tem uma ou mais mutações corrigidas ou substituídas. Em algumas modalidades, o gene mutado ou defeituoso, ou gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeitu- osa ou parcial, é rompido.
[116] Em algumas modalidades, o gene mutado ou defeituoso, ou gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial, tem 1-20, 21-40, 41-60, 61-80, 81-100, 101-1000, 1001- 10000 pares de base de nucleotídeos ou mutações rompidos, corrigi- dos ou substituídos. Em algumas modalidades, uma região do gene mutado ou defeituoso, ou gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial, é rompida, corrigida ou substituída. Em algumas modalidades, uma região de menos do que cerca de 10, 8, 6, 4, 2 ou 1 kb do gene mutado ou defeituoso, ou gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial, é rompi- da, corrigida ou substituída.
[117] Em algumas modalidades, o gene mutado ou defeituoso, ou gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial, é rompido, corrigido ou substituído através de inserção e/ou deleção de nucleotídeos. Em algumas modalidades, o gene mutado ou defeituoso, ou gene codificando uma proteína tendo função ou ativida- de defeituosa ou parcial, é rompido, corrigido ou substituído em um alelo ou ambos os alelos. Em algumas modalidades, dois ou mais RNAs-guias de CRISPR, proteínas associadas a CRISPR e/ou se- quências de ácido nucleico doadoras diferentes são usados para rom- per, corrigir ou substituir uma ou mais mutações ou defeitos no gene mutado ou defeituoso, ou gene codificando uma proteína tendo função defeituosa ou parcial.
[118] Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero. Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano. Em algumas modali- dades, o método melhora o desenvolvimento ou função ocular ou pre- vine degeneração ocular, retinal ou da córnea. Em algumas modalida- des, o método melhora um desenvolvimento ou função neurológico ou previne degeneração neural. Em algumas modalidades, o método me- lhora expressão ou função de uma enzima P450.
[119] Em algumas modalidades, um reparo direcionado à homo- logia com base na sequência de ácido nucleico doadora resultou em um íntron e/ou um Éxon do gene-alvo. Em algumas modalidades, um reparo direcionado à homologia com base na sequência de ácido nu- cleico doadora resultou em um aceitador de união do gene-alvo. Tal método pode incluir ainda (c) uma sequência de ácido nucleico doado- ra compreendendo todo ou uma porção de um gene-alvo mostrado na Tabela 4 com uma mutação ou alteração para geração de um gene- alvo mutado ou alterado ou uma porção do mesmo.
[120] Em alguns aspectos, um método de geração de um modelo de doença celular de uma doença causada por um gene mutado ou defeituoso, ou um gene codificando uma proteína tendo função ou ati- vidade defeituosa ou parcial, através da geração de uma mutação em tal gene é provido. Tal método inclui administração às células de uma versão saudável de tal gene através de qualquer uma das composi- ções descritas aqui. Em algumas modalidades, administração é reali- zada através de eletroporação ou através de transfecção mediada por lipídeo ou nucleofecção ou transdução viral ou microinjeção ou combi- nação das mesmas. Em algumas modalidades, as células são fi- broblastos, células sanguíneas, de RPE, fotorreceptoras, retinais, co- roidais, oculares, do nervo óptico, de neurônio ou células-tronco ou qualquer tipo de células derivadas de uma célula-tronco.
[121] Em ainda um outro aspecto, é provida uma composição que inclui uma célula com um gene mutado ou defeituoso mostrado na Ta- bela 4.
[122] Em um outro aspecto, é provida uma composição que inclui uma célula com um gene CYP4V2, CYP1B1, MYO7A, DFNB31, USH1C, USH1G, CDH23, PCDH15, CLRN1, ACO2, AFG3L2, ATXN2, AUH, C12orf65, CISD2, FOXC1, FOXF2, LTBP2, MTPAP, MYOC, NDUFS1, NR2F1, OPA1, OPA3, OPTN, PAX6, PDGF, PITX2, POLG, SPG7, TEK, TXNRD2, WFS1, ABCA4, REP-1, RPE65, CEP290, PDE6B, RPGR, MERTK, MT-ND4, FAM47E, GBA, GCH1, HTRA2, LRRK2, PARK2, PINK1, SNCA, SYNJ1, NPC1, NPC2, CYP4A11, CYP4A22, CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F22, CYP4X1, CYP4Z1 ou CYP46A mutado ou defei- tuoso compreendendo uma composição de qualquer uma das presen- tes reivindicações.
[123] Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de AAV. Em algumas modalidades, a sequência de elemento protoespaçador é se- lecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 48 a 52 ou comparti- lha pelo menos 80% de identidade de sequência com uma de SEQ ID NOs: 48 a 52 para uso com uma proteína Cas que tem NGG como motivo adjacente protoespaçador (PAM) para se direcionar à mutação c.802-8_810del17insGC do gene CYP4V2. Em algumas modalidades,
a sequência de ácido nucleico doadora é selecionada de SEQ ID NOs: 56 e 57 ou compartilha pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID NOs: 56 e 57, ou uma sequência que é comple- mentar à mesma, para uso para corrigir, romper ou substituir a muta- ção c.802-8_810del17insGC do gene CYP4V2. Reivindicações de Terapia genética Reivindicações relacionadas à sequência otimizada no códon:
[124] Em um aspecto, uma molécula de ácido nucleico incluindo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2 codificando uma pro- teína CYP4V2 humana ou uma sequência de ácido nucleico comparti- lhando pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2 é provida.
[125] Em um outro aspecto, um cassete de expressão incluindo uma molécula de ácido nucleico como descrito aqui e uma ou mais sequência reguladora operavelmente ligada à sequência de ácido nu- cleico é provido. Em ainda um outro aspecto, um vetor incluindo uma molécula de ácido nucleico como descrito aqui ou um cassete de ex- pressão como descrito aqui é provido.
[126] Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral. Em al- gumas modalidades, o vetor viral é selecionado do grupo consistindo em um vetor de adenovírus recombinante, um vetor de lentivírus re- combinante, um vetor de vírus herpes simples recombinante, um vetor de vírus Sendai recombinante e um vetor de retrovírus recombinante. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) ou um plasmídeo. Em algumas modalidades, o vetor é um plasmídeo ou um vetor não viral. Em algumas modalidades, o vetor não viral é selecionado do grupo consistindo em ácidos nuclei- cos nus, lipossomos, dendrímeros e nanopartículas.
[127] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira incluindo qualquer uma das moléculas de ácido nucleico descritas aqui e/ou qualquer uma das composições descritas aqui. Em algumas modalida- des, a célula hospedeira é uma célula bacteriana, uma célula de E. coli, uma célula de planta, uma célula de inseto ou uma célula de ma- mífero. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula HEK293, HeLa, Vero, V27, A549, K562, B50, WI38, Hep G2 ou BHK.
[128] Em um outro aspecto, o uso de qualquer uma da molécula de ácido nucleico descrita aqui, de qualquer um dos cassetes de ex- pressão descritos aqui, ou de qualquer um dos vetores descritos aqui, para expressar o produto codificado por tal molécula de ácido nucleico, em uma célula bacteriana, ou uma célula de inseto, uma célula de planta, uma célula de mamífero, uma célula de RPE, um fotorreceptor ou progenitor de fotorreceptor (PRC), uma célula retinal, uma célula da córnea, uma célula ocular, um neurônio, uma célula neuronal, uma cé- lula sanguínea, uma célula epitelial, uma célula somática, uma célula iPS, uma célula ES, uma MSC, uma célula-tronco adulta, uma célula- tronco ou qualquer célula derivada de uma célula-tronco. Reivindicações relacionadas a EFS e/ou SPA
[129] Em um outro aspecto, um vetor de vírus adenoassociado autocomplementar (scAAV) incluindo um promotor curto fator de alon- gamento 1α (EFS) e/ou um sinal de poliadenilação (poliA) pequeno (SPA) ligado operavelmente a uma molécula de ácido nucleico codifi- cando um polipeptídeo, uma molécula de RNA de interferência ou um oligonucleotídeo é provido. Em algumas modalidades, o promotor EFS consiste em uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 35 e o SPA consiste em uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 80% de identidade de sequência de SEQ ID NO: 36.
[130] Em algumas modalidades, o vetor de scAAV é administrado a uma célula de modo que o produto codificado pela molécula de ácido nucleico é expresso na célula. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, a célula é uma célula retinal, uma célula da córnea, uma célula coroidal, uma célula ocular, uma célula cerebral, um neurônio, uma célula neuronal, uma célula iPS, uma célula ES, uma MSC, uma célula-tronco ou qualquer célula derivada de uma célula-tronco.
[131] Em um aspecto, é provido um método para reduzir respos- tas imunes a vetores virais e preservar eficiência de transdução em terapia genética e/ou maximizar efeito terapêutico para pacientes dife- rentes da mesma doença genética. Tal método inclui (a) estabelecer um grupo de mais de um vetor viral recombinante (por exemplo, rA- AVs) com eficiência de transdução suficiente no tipo de célula-alvo pa- ra a terapia genética. O grupo de vetor viral pode ser expandido atra- vés da criação de variantes com mutações de região antigênica ou ou- tras mutações ou variantes nos capsídeos dos ditos vetores virais e tais mutações ou variantes confirmadas com eficiência de transdução suficiente nas células-alvo relevantes para a doença (por exemplo, em linhagens celulares iPS-RPE para terapia genética com CYP4V2 para BCD); (b) detectar anticorpos de vetor antiviral de neutralização pree- xistentes (NAbs) contra sorotipos de vetor viral diferentes e/ou muta- ções ou variantes de capsídeo no indivíduo com necessidade da tera- pia genética, e/ou testar e comparar vetores virais diferentes em célu- las específicas de paciente (por exemplo, células iPS-RPE) derivadas de tal indivíduo; (c) selecionar um vetor viral a partir do grupo de veto- res virais com eficiência de transdução suficiente com a mais baixa reatividade cruzada com os NAbs preexistentes no indivíduo e/ou um vetor viral com o melhor resultado de resgate de fenótipo nas células específicas de paciente do indivíduo, tal grupo de vetor viral compre- endendo sorotipos e vetores virais modificados com capsídeo diferen- tes (por exemplo, incluindo, sem limitação, AAVs com capsídeo mutan- te e/ou AAVs de variante de proteína do capsídeo); (d) uso do vetor viral selecionado de (c) para administração ao indivíduo; e (e) repeti- ção de (b) a (d) (apenas a parte relacionada a NAbs preexistentes) an- tes de cada vez que o indivíduo necessitar uma administração de tera- pia genética, incluindo, sem limitação, uma administração de acompa- nhamento para o mesmo olho ou uma administração ao olho contrala- teral, ou a um outro órgão.
[132] Em um outro aspecto, é provida uma composição para tra- tamento ou prevenção de uma doença em um indivíduo, incluindo uma quantidade eficaz de um vetor e um carreador farmaceuticamente aceitável. Tipicamente, o vetor inclui uma molécula de ácido nucleico ou uma variante não patogênica da mesma codificando uma proteína CYP4V2 não mutante ou funcional operavelmente ligada a uma se- quência reguladora.
[133] Em algumas modalidades, a doença é Distrofia Cristalina de Bietti (também conhecida como Distrofia Corneorretinal Cristalina; BCD). Em algumas modalidades, a doença é associada com uma alte- ração genética ou epigenética no indivíduo. Em algumas modalidades, a doença é degeneração de fotorreceptor, degeneração de célula do epitélio pigmentar da retina, degeneração retinal, degeneração da cór- nea ou degeneração coroidal. Em algumas modalidades, a degenera- ção retinal é retinite pigmentosa (RP). Em algumas modalidades, a degeneração retinal é uma degeneração retinal herdada (IRD). Em al- gumas modalidades, a doença é BCD. Em algumas modalidades, a doença é distrofia da córnea. Em algumas modalidades, o indivíduo tem BCD ou está sob risco de desenvolver BCD.
[134] Em um aspecto, é provido um vetor incluindo molécula de ácido nucleico ou uma variante não patogênica da mesma codificando uma proteína CYP4V2 não mutante ou funcional operavelmente ligada a uma sequência reguladora.
[135] Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral. Em al-
gumas modalidades, o vetor viral é selecionado do grupo consistindo em um vetor de vírus adenoassociado (AAV), um vetor de adenovírus, um vetor de lentivírus, um vetor de vírus herpes simples, um vetor de vírus Sendai e um vetor de retrovírus. Em algumas modalidades, o AAV é um AAV recombinante (rAAV). Em algumas modalidades, o rA- AV compreende um genoma de AAV ou um derivado do mesmo e/ou uma proteína do capsídeo de AAV ou um derivado da mesma. Em al- gumas modalidades, o rAAV é um AAV quimérico, um AAV embara- lhado ou um AAV com capsídeo modificado.
[136] Em algumas modalidades, o genoma de AAV ou proteína do capsídeo de AAV é de qualquer um de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 ou um ou- tro sorotipo naturalmente derivado ou isolato ou Glade de AAV ou qualquer derivado ou híbrido do mesmo. Em algumas modalidades, o rAAV é um AAV pseudotipificado (por exemplo, AAV2/5, AAV2/8, AAV2/1, AAV2/4, AAV2/6, AAV2/7, AAV2/12, AAV2/10 e AAV2/9). Em algumas modalidades, o rAAV é um AAV híbrido (por exemplo, AAV- DJ, AAV-DJ/8 ou AAV-DJ/9). Em algumas modalidades, o rAAV é de- senvolvido através de evolução dirigida e/ou projeto racional (por exemplo, AAV 7m8 ou AAV-PHP.B).
[137] Em algumas modalidades, o rAAV compreende uma ou mais mutações do capsídeo (por exemplo, mutações Y-F, K-R, T-A, S- A e/ou T-V (por exemplo, AAV2 com uma ou mais mutações do capsí- deo dentre Y444F, Y500F, Y730F, Y252F, Y272F, Y700F, Y704F e T491V, ou a mutação correspondente para um sorotipo de AAV dife- rente (por exemplo, AAV2/8 (Y733F), AAV2 (Y444F +Y500F+Y730F) e AAV2 (quadY-F+T-V))). Em algumas modalidades, o sorotipo do rAAV é selecionado do grupo consistindo em AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Anc80, rh10 e ShH10. Em algumas modalidades, o vetor rAAV é selecionado do grupo consistindo em AAV2/5, AAV2/8, AAV2/8(Y733F), AAV2 (Y444F+Y500F+Y730F), AAV2/1, AAV2/4, AAV2/9, AAV2/6, AAV2/7, AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV12, Anc80, AAV 7m8, AAV-DJ, ShH10, AAV-PHP.B ou um híbrido, um de- rivado ou variante do mesmo.
[138] Em algumas modalidades, o vetor de rAAV é um vetor de AAV de filamento único ou um vetor de AAV autocomplementar (scA- AV). Em algumas modalidades, o vetor é um plasmídeo ou um vetor não viral (por exemplo, ácidos nucleicos nus, lipossomos, dendrímeros e nanopartículas).
[139] Em algumas modalidades, a proteína CYP4V2 não mutante ou funcional codificada pela sequência de ácido nucleico compreende: (i) a proteína CYP4V2 humana (SEQ ID NO: 4); (ii) uma variante de (por exemplo, mudança dos aminoácidos e/ou variante de união) pro- teína CYP4V2 humana ou uma proteína CYP4V2 funcional (por exem- plo, SEQ ID NO: 5); (iii) um ou mais fragmentos de uma proteína CYP4V2 funcional (por exemplo, SEQ ID NO: 6); (iv) toda ou parte de sequências de um ou mais do ortólogo de CYP4V2 de outras espé- cies; (v) toda ou parte de sequências da uma ou mais outras proteínas P450, incluindo, mas não limitado a, outras proteínas CYP4 e CYP46A1, (vi) um polipeptídeo que pode melhorar, tratar ou parar uma ou mais anormalidades bioquímicas em um ou mais dos genes lista- dos na Tabela 4 em uma célula de paciente (por exemplo, a célula iPS-RPE de um paciente com BCD) e/ou (vii) uma combinação dos acima.
[140] Em algumas modalidades, a proteína CYP4V2 não mutante ou funcional codificada pela sequência de ácido nucleico compreende toda ou parte da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 5 ou 6. Em algumas modalidades, a proteína CYP4V2 não mutante ou funcional codificada pela sequência de ácido nucleico compreende to-
da ou parte de uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em CYP4V2, CYP4A11, CYP4A22, CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F22, CYP4X1, CYP4Z1 e CYP46A1 (SEQ ID NOs: 4-18) e derivados, híbridos, variantes e/ou fragmentos das mesmas. Em algumas modalidades, a proteína CYP4V2 não mutante ou funcional codificada pela sequência de ácido nucleico compreende toda ou parte da sequência de aminoácido sele- cionada do grupo consistindo em CYP4V2 (ou ortólogos de CYP4V2) de chimpanzés, macaco Rhesus, cachorro, vaca, camundongo, rato, galinha, sapo, cavalo, coelho e mosca de fruta (SEQ ID NOs: 19-29) e derivados, híbridos, variantes e/ou fragmentos das mesmas.
[141] Em algumas modalidades, a proteína CYP4V2 não mutante ou funcional codificada pela sequência de ácido nucleico compreende um polipeptídeo tendo pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácido (por exemplo, pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) com qualquer uma das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4-29. Em algumas modalidades, a proteína CYP4V2 não mutante ou funcio- nal codificada pela sequência de ácido nucleico compreende elemen- tos de sequência de FxxGxxxCxG e ExxR (SEQ ID NOs: 30 e 31). Em algumas modalidades, a proteína CYP4V2 não mutante ou funcional é um composto ou agente que pode melhorar, tratar ou parar uma ou mais anormalidades bioquímicas em um ou mais dos genes listados na Tabela 4 em uma célula do paciente (por exemplo, a célula iPS- RPE de um paciente com BCD).
[142] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica uma proteína CYP4V2 não mutante ou funcional de qualquer uma das reivindicações 43-50. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica uma proteína CYP4V2 não mutante ou fun-
cional compreendendo uma sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 4, 5 ou 6 ou tendo pelo menos 80% de identidade de se- quência com qualquer uma de SEQ ID NO: 4, 5 ou 6. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico tem pelo menos 60% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nu- cleico tem pelo menos 70% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3. Em algumas modalida- des, a molécula de ácido nucleico tem pelo menos 75% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico tem pelo menos 76% de identidade de sequência com qualquer uma das se- quências na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3. Em algumas modalidades, a molé- cula de ácido nucleico compreende uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3.
[143] Em algumas modalidades, a sequência reguladora compre- ende um promotor. Em algumas modalidades, o promotor é um promo- tor específico de célula de RPE, um promotor específico de célula reti- nal, um promotor específico de célula da córnea, um promotor especí- fico de célula ocular ou um promotor constitutivo. Em algumas modali- dades, o promotor é um promotor beta-actina do mamífero ou um promotor viral.
[144] Em algumas modalidades, o promotor é selecionado do grupo consistindo em um promotor CAG (promotor potenciador preco- ce do CMV/ beta-actina da galinha híbrido, também conhecido como promotor CAGGS, promotor CB ou promotor CBA), um promotor beta- actina da galinha, um promotor CBA pequeno (smCBA), um promotor CBSB, ou um promotor CBh, um outro promotor beta-actina tal como um promotor beta-actina humana, um promotor curto fator de alonga- mento 1 alfa (EFS), um promotor curto fator de alongamento 1 alfa
(EF-1 alfa), um promotor CMV, um promotor PGK, um promotor UBC, um promotor GUSB, um promotor UCOE, um promotor VMD2 (distrofia macular viteliforme 2; também conhecido como BEST1), um promotor RPE65 ou um híbrido ou derivado do mesmo.
[145] Em algumas modalidades, o promotor é um promotor CAG (promotor potenciador precoce CMV/beta-actina da galinha híbrido, também conhecido como promotor CAGGS, promotor CB ou promotor CBA), um promotor curto fator de alongamento 1 alfa (EFS), um pro- motor curto fator de fator de alongamento 1 alfa (EF-1 alfa) ou um promotor CMV ou um derivado ou um híbrido do mesmo. Em algumas modalidades, a sequência reguladora compreende um potenciador.
[146] Em algumas modalidades, o potenciador é um potenciador viral, incluindo, sem limitação, um potenciador WPRE, um potenciador HPRE, um potenciador CTE ou um derivado ou híbrido do mesmo. Em algumas modalidades, a sequência reguladora compreende um sinal de poliadenilação (poliA). Em algumas modalidades, o sinal de poliA é um sinal de poliadenilação de hormônio do crescimento bovino (poliA bGH), um sinal poliA pequeno (SPA), um sinal de poliadenilação de hormônio do crescimento humano (poliA hGH), um sinal de poliA SV40, um sinal de poliA tardio de SV40 ou um derivado ou híbrido do mesmo. Em algumas modalidades, a sequência reguladora compre- ende uma sequência Kozak (SEQ ID NO: 37 ou 38).
[147] Em algumas modalidades, a composição é formulada com um carreador e componentes adicionais adequados para a via de ad- ministração específica.
[148] Em um outro aspecto, uma célula hospedeira incluindo qualquer um dos vetores descritos aqui é provida.
[149] Em um outro aspecto, um método de tratamento ou pre- venção de uma doença do olho em um indivíduo é provido, o método incluindo administrar um vetor ao indivíduo, em que o vetor compreen-
de uma molécula de ácido nucleico ou uma variante não patogênica da mesma codificando uma proteína CYP4V2 humana ou uma proteína CYP4V2 funcional operavelmente ligada a uma sequência reguladora.
[150] Em um aspecto, um método de prevenção, parada ou dimi- nuição da velocidade de progressão de ou melhora da disfunção, dis- trofia, distúrbio, degeneração e/ou morte de uma célula ocular é provi- do, o método incluindo administração de um vetor à célula ocular, em que o vetor compreende uma molécula de ácido nucleico ou uma vari- ante não patogênica da mesma codificando uma proteína CYP4V2 humana ou uma proteína CYP4V2 funcional operavelmente ligada a uma sequência reguladora.
[151] Em algumas modalidades, a doença é Distrofia Cristalina de Bietti (também conhecida como Distrofia Cristalina Corneorretinal de Bietti; Retinopatia Cristalina de Bietti; Distrofia Retinal de Bietti; BCD). Em algumas modalidades, o indivíduo é afetado por outras con- dições oftalmológicas clinicamente definidas (por exemplo, degenera- ção retinal herdada (IRD), retinite pigmentosa (RP) ou distrofia da cór- nea) causada por mutações no gene CYP4V2. Em algumas modalida- des, a doença do olho é degeneração de fotorreceptor, degeneração de célula do epitélio pigmentar da retina, degeneração retinal, distrofia da córnea ou BCD.
[152] Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral. Em al- gumas modalidades, o vetor viral é selecionado do grupo consistindo em um vetor de vírus adenoassociado recombinante (rAAV), um vetor de adenovírus recombinante, um vetor de lentivírus recombinante, um vetor do vírus herpes simplex recombinante, um vetor do vírus Sendai recombinante e um vetor de retrovírus recombinante. Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor de rAAV. Em algumas modalida- des, o vetor de rAAV compreende uma proteína do capsídeo VP1, VP2 ou VP3 de qualquer sorotipo de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5,
AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 ou um outro soro- tipo naturalmente derivado ou isolato ou Glade de AAV ou híbridos, variantes ou derivados dos mesmos.
[153] Em algumas modalidades, a ITR AAV 5’ do vetor de rAAV é selecionada de qualquer um de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 ou um outro soro- tipo naturalmente derivado ou isolato ou Glade de AAV ou mutações, quimeras, variantes ou fusões dos mesmos. Em algumas modalida- des, a ITR AAV 3’ do vetor de rAAV é selecionada de qualquer um de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, ou um outro sorotipo naturalmente derivado ou isolato ou Glade de AAV ou mutações, quimeras, variantes ou fusões dos mesmos. Em algumas modalidades, o rAAV é um AAV quimérico, um AAV embaralhado ou um AAV com capsídeo modificado. Em algumas modalidades, o rAAV é um AAV pseudotipificado (por exemplo, AAV2/5, AAV2/8, AAV2/1, AAV2/4, AAV2/6, AAV2/7, AAV2/12, AAV2/10 e AAV2/9). Em algumas modalidades, o rAAV é um AAV hí- brido (por exemplo, AAV-DJ, AAV-DJ/8 ou AAV-DJ/9). Em algumas modalidades, o rAAV é desenvolvido através de evolução dirigida e/ou projeto racional (por exemplo, AAV 7m8 ou AAV-PHP.B).
[154] Em algumas modalidades, o rAAV compreende uma ou mais mutações do capsídeo (por exemplo, mutações Y-F, K-R, T-A, S- A e/ou T-V (por exemplo, AAV2 com uma ou mais mutações do capsí- deo dentre Y444F, Y500F, Y730F, Y252F, Y272F, Y700F, Y704F e T491V, ou a mutação correspondente para um sorotipo de AAV dife- rente (por exemplo, AAV2/8 (Y733F), AAV2 (Y444F +Y500F+Y730F) eAAV2 (quadY-F+T-V))). Em algumas modalidades, o sorotipo do rA- AV é selecionado do grupo consistindo em AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Anc80, rh10 e ShH10. Em algumas modalidades, o vetor de rAAV é selecio-
nado do grupo consistindo em AAV2/5, AAV2/8, AAV2/8(Y733F), AAV2 (Y444F+Y500F+Y730F), AAV2/1, AAV2/4, AAV2/9, AAV2/6, AAV2/7, AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV12, Anc80, AAV 7m8, AAV-DJ, ShH10, AAV-PHP.B ou um híbrido, um derivado ou variante do mesmo.
[155] Em algumas modalidades, o vetor de rAAV é um vetor de AAV de filamento único ou um vetor de AAV autocomplementar (scA- AV). Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de plasmídeo ou um não viral. Em algumas modalidades, o vetor não viral é seleciona- do do grupo consistindo em ácidos nucleicos nus, lipossomos, dendrí- meros e nanopartículas.
[156] Em algumas modalidades, a proteína CYP4V2 não mutante ou funcional codificada pela sequência de ácido nucleico compreende: (i) a proteína CYP4V2 humana (SEQ ID NO: 4); (ii) uma variante de (por exemplo, mudança dos aminoácidos e/ou variante de união) da proteína CYP4V2 humana ou uma proteína CYP4V2 funcional (por exemplo, SEQ ID NO: 5); (iii) um ou mais fragmentos de uma proteína CVP4V2 funcional (por exemplo, SEQ ID NO: 6); (iv) toda ou parte de sequências de um ou mais do ortólogo de CYP4V2 de outras espé- cies; (v) toda ou parte de sequências de uma ou mais outras proteínas P450, incluindo, mas não limitado a, outras proteínas CYP4 e CYP46A1; (vi) um polipeptídeo que pode melhorar, tratar ou parar uma ou mais anormalidades bioquímicas em um ou mais genes listados na Tabela 4 em uma célula de paciente (por exemplo, a célula iPS-RPE de um paciente com BCD) e/ou (vii) uma combinação dos acima.
[157] Em algumas modalidades, a proteína CYP4V2 não mutante ou funcional codificada pela sequência de ácido nucleico compreende toda ou parte da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 5 ou 6. Em algumas modalidades, a proteína CYP4V2 não mutante ou funcional codificada pela sequência de ácido nucleico compreende to-
da ou parte de uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em CYP4V2, CYP4A11, CYP4A22, CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F22, CYP4X1, CYP4Z1 e CYP46A1 (SEQ ID NOs: 4-18) e derivados, híbridos, variantes e/ou fragmentos das mesmas.
[158] Em algumas modalidades, a proteína CYP4V2 não mutante ou funcional codificada pela sequência de ácido nucleico compreende toda ou parte da sequência de aminoácido selecionada do grupo con- sistindo em CYP4V2 (ou ortólogos de CYP4V2) de chimpanzé, maca- co Rhesus, cachorro, vaca, camundongo, rato, galinha, sapo, cavalo, coelho e mosca da fruta (SEQ ID NOs: 19-29) e derivados, híbridos, variantes e/ou fragmentos das mesmas. Em algumas modalidades, a proteína CYP4V2 não mutante ou funcional codificada pela sequência de ácido nucleico compreende um polipeptídeo tendo pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácido (por exemplo, pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de se- quência) com qualquer uma das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4-29.
[159] Em algumas modalidades, a proteína CYP4V2 não mutante ou funcional codificada pela sequência de ácido nucleico compreende elementos de sequência de FxxGxxxCxG e ExxR (SEQ ID NOs: 30 e 31). Em algumas modalidades, a proteína CYP4V2 não mutante ou funcional é um composto ou agente que pode melhorar, tratar ou parar uma ou mais anormalidades bioquímicas em um ou mais dos genes listados na Tabela 4 em uma célula de paciente (por exemplo, a célula iPS-RPE de um paciente com BCD). Em algumas modalidades, a mo- lécula de ácido nucleico codifica uma proteína CYP4V2 não mutante ou funcional de qualquer uma das reivindicações 91-97. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica uma proteína
CYP4V2 não mutante ou funcional compreendendo uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 5 ou 6 ou tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma de SEQ ID NO: 4, 5 ou 6. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifi- cando uma proteína CYP4V2 funcional tem uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3. Em algumas modalida- des, a molécula de ácido nucleico codificando uma proteína CYP4V2 funcional tem uma identidade de sequência de pelo menos 60% com qualquer uma da SEQ ID NO: 1, 2 ou 3.
[160] Em algumas modalidades, a sequência reguladora compre- ende um promotor. Em algumas modalidades, o promotor é um promo- tor específico de célula de RPE, um promotor específico de célula reti- nal, um promotor específico de célula da córnea ou um promotor es- pecífico de célula ocular. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor constitutivo. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor beta-actina de mamífero ou um promotor viral.
[161] Em algumas modalidades, o promotor é selecionado do grupo consistindo em um promotor CAG (promotor potenciador preco- ce CMV/beta-actina da galinha híbrido, também conhecido como pro- motor CAGGS, promotor CB ou promotor CBA), um promotor beta- actina da galinha, um promotor CBA pequeno (smCBA), um promotor CBSB, ou um promotor CBh, um outro promotor beta-actina tal como o promotor beta-actina humano, um promotor curto fator de alongamento 1 alfa (EFS), um promotor curto fator de alongamento 1 alfa (EF-1 al- fa), um promotor CMV, um promotor PGK, um promotor UBC, um pro- motor GUSB, um promotor UCOE, um promotor VMD2 (distrofia macu- lar viteliforme 2; também conhecido como BEST1), um promotor RPE65 ou um híbrido ou um derivado do mesmo. Em algumas modali- dades, o promotor é um promotor CAG (promotor potenciador precoce CMV/beta-actina da galinha híbrido, também conhecido como promo-
tor CAGGS, promotor CB ou promotor CBA), um promotor curto fator de alongamento 1 alfa (EFS), um promotor curto fator de alongamento 1 alfa (EF-1 alfa) ou um promotor CMV ou um derivado ou um híbrido do mesmo.
[162] Em algumas modalidades, a sequência reguladora compre- ende um potenciador. Em algumas modalidades, o potenciador é po- tenciador viral, incluindo, sem limitação, um potenciador WPRE, um potenciador HPRE, um potenciador CTE ou um derivado ou híbrido do mesmo. Em algumas modalidades, a sequência reguladora compre- ende um sinal de poliadenilação (poliA). Em algumas modalidades, o sinal de poliA é um sinal de poliadenilação de hormônio do crescimen- to bovino (poliA bGH), um sinal de poliA pequeno (SPA), um sinal de poliA de SV40, um sinal de poliadenilação de hormônio do crescimento humano (poliA hGH), um sinal de poliA tardio de SV40 ou um derivado ou híbrido do mesmo. Em algumas modalidades, a sequência regula- dora compreende uma sequência Kozak (SEQ ID NO: 37 ou 38).
[163] Em algumas modalidades, para tratamento in vitro, a célula- alvo é infectada em uma dose (MOI) de cerca de 1 x 10^3 GC a cerca de 1 x 10^6 GC por célula (GC: cópias genômicas, medição de geno- ma contendo partículas de AAV (tcc/ genoma de vetor (vg) ou partícu- las de genoma (gp)). Em algumas modalidades, para administração in vivo ao olho de um indivíduo, uma administração única pode ser da ordem de a partir de cerca de 1 x 10^6 a 2 x 10^13 GC (por exemplo, uma faixa de dose alta de cerca de 1 x 10^11 GC a cerca de 1 x 10^12 GC, uma faixa de dose média de cerca de 1 x 10^10 GC a cerca de 1 x 10^11 GC, uma faixa de dose baixa de cerca de 1 x 10^9 GC a cerca de 1 x 10^10 GC, uma faixa de dose muito baixa de cerca de 1 x 10^6 GC a cerca de 1 x 10^9 GC e uma faixa de dose muito alta de cerca de 1 x 10^12 GC a cerca de 2 x 10^13 GC) ou qualquer dose dentro dessas faixas que seja suficiente para prover o efeito desejado.
[164] Em algumas modalidades, a etapa de administração acon- tece antes do início de sintomas da doença ou após o início de sinto- mas da doença. Em algumas modalidades, a administração é ao olho. Em algumas modalidades, a administração é através de injeção sub- retinal. Em algumas modalidades, a administração é através de inje- ção intravítrea. Em algumas modalidades, a administração é através de injeção retinal direta. Em algumas modalidades, a administração é através de qualquer outro método de administração que administre eficazmente os vetores ao local sub-retinal, ao segmento posterior do olho, às células da córnea ou RPE, às células fotorreceptoras ou célu- las epiteliais da córnea do indivíduo.
[165] Em algumas modalidades, a administração é através de administração à córnea. Em algumas modalidades, a administração ao olho é obtida através da administração pela corrente sanguínea. Em algumas modalidades, a administração é através de colírio. Em algu- mas modalidades, a administração é através da administração à lente. Em algumas modalidades, a administração é no espaço sub-retinal, à córnea, à lente ou ao vítreo. Em algumas modalidades, as células ocu- lares são selecionadas do grupo consistindo em células do epitélio pigmentar da retina (RPE), células fotorreceptoras (PRCs), células do epitélio da córnea (CECs), células endoteliais coroidais (CE), células retinais, células da córnea, células da lente, células dos gânglios, célu- las do nervo óptico e/ou células coroidais, bem como os ditos tipos de células derivadas de uma célula-tronco (incluindo, sem limitação, uma iPSC, uma célula ES, uma MSC, uma célula-tronco adulta e/ou uma célula-tronco específica de tecido).
[166] Em algumas modalidades, os métodos descritos aqui po- dem incluir ainda identificação de um indivíduo tendo BCD ou sob risco de desenvolver BCD. Uso de EFS e/ou SPA em um vetor de rAAV compreendendo uma se-
quência de ácido nucleico codificando Cas Reivindicações relacionadas
[167] Em um aspecto, uma composição incluindo um vetor de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) compreendendo um pro- motor curto e fator de alongamento 1α (EFS) e/ou um sinal de poliade- nilação (poliA) pequeno (SPA) ligado operavelmente a uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína associada a CRISPR (Cas) é provida.
[168] Em algumas modalidades, o promotor EFS consiste em uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 80% de identidade de sequência de SEQ ID NO: 35 e o SPA consiste em uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 80% de identidade de sequência de SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, a Cas codificada pela sequência de ácido nucleico operavelmente ligada ao promotor EFS e/ou ao SPA é uma Cas9 ou Cpf1.
[169] Células hospedeiras incluindo um rAAV como descrito aqui são providas. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula bacteriana, uma célula de E. coli, uma célula de planta, uma cé- lula de inseto ou uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, a célula é uma célula somática ou uma célula-tronco. Em algumas mo- dalidades, a célula hospedeira é uma célula retinal, uma célula da cór- nea, uma célula coroidal, uma célula ocular, uma célula cerebral, um neurônio, uma célula neuronal, uma célula iPS, uma célula ES, uma MSC, uma célula-tronco adulta, uma célula específica de tecido, uma célula-tronco ou qualquer célula derivada de uma célula-tronco. Em algumas modalidades, o vetor de rAAV é administrado a uma célula hospedeira de modo que a Cas codificada pela molécula de ácido nu- cleico é expressa na célula. Em algumas modalidades, a célula hos- pedeira compreendendo qualquer célula de qualquer uma das reivindi- cações 131 a 134.
[170] Outras características e vantagens da invenção serão apa- rentes a partir da Descrição Detalhada, Descrição dos Desenhos e Exemplos e também a partir das reivindicações. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, sequências, registros de bancos de da- dos e outras referências mencionadas aqui são incorporados a título de referência em sua totalidade.
DESCRIÇÃO DE DESENHOS
[171] A invenção é ilustrada mais nas figuras e desenhos que se- guem, que não limitam o escopo da invenção descrita nas reivindica- ções. Patente de Linhagem Celular:
[172] Figura 1: linhagens celulares iPS derivadas de pacientes com BCD (a) células iPS geradas de fibroblastos de amostras de biópsia de pele de pacientes com BCD: (i) células iPS do paciente 1 (P1) (ii) células iPS do paciente 2 (P2) (iii) caracterização de linhagens celulares iPS de P1 e P2 por marcadores Oct-4, Sox-2 e SSEA-4 (iv) caracterização de linhagens celulares iPS de P1 e P2 por marcadores Nanog e Tra-1-60 (b) células iPS geradas a partir de um paciente com BCD e um controle saudável a partir de células mononucleares de sangue perifé- rico (PBMC) de amostras de sangue: (i) imagens de contraste de fase de linhagens celulares iPS (ii) resultados de tingimento AP de linhagens celulares iPS (c) imagens de cariótipo de célula iPS derivada de paciente com BCD mostrando cariótipo humano aparentemente normal.
[173] Figura 2: linhagens celulares iPS-RPE derivadas de pacien- tes com BCD:
(a) imagens de campo claro de linhagens celulares iPS-RPE derivadas de pacientes com BCD mostrando morfologia única de RPE – formato hexagonal, pigmentação e monocamada: (i) células iPS-RPE de P1 (ii) células iPS-RPE de P2 (b) resultados de marcadores de RPE de células iPS-RPE de pacientes com BCD, mostrando a presença de marcadores específicos de RPE, RPE65, CRALBP e MITF.
[174] Figura 3: resultados de qRT-PCR de expressão de CYP4V2 em amostras de iPS-RPE. (WT (controles). WT AVE (média de contro- les). P1 (Paciente 1 com BCD). P1-AAV8 (amostra de P1 tratada por AAV8.CYP4V2fv, MOI=1,5x10e4 GC/célula).
[175] Figura 4: resultados de qRT-PCR de expressão de CYP4V2op em amostras de iPS-RPE. WT (controles) WT AVE (média de controles). P1 e P2 (Paciente 1 e Paciente 2 com BCD). P1-AAV2 (amostra de P1 tratada por AAV2.CYP4V2op em MOI de 2x10e4 GC/célula). P2-AAV2 (amostra de P2 tratada por AAV2.CYP4V2op em MOI de 2x10e4 GC/célula)). P2-scAAV1 (amostra de P2 tratada por scAAV1.CYP4V2op em MOI de 2x10e4 GC/célula).
[176] Figura 5: imagens de viabilidade celular de amostras de iPS-RPE sem exposição à luz azul. WT (controles). P1 e P2 (Paciente 1 e Paciente 2 com BCD). Vermelho (células mortas/doentes); Verde (células vivas/saudáveis). Figura 5(a): apenas Vermelho. Figura 5(b): Vermelho e verde.
[177] Figura 6: imagens de viabilidade celular de amostras de iPS-RPE após 1 hora de exposição à luz azul. WT (controles). P1 e P2 (paciente 1 e Paciente 2 com BCD). Vermelho (células mor- tas/doentes); Verde (células vivas/saudáveis). Figura 6(a): Apenas vermelho. Figura 6(b): Vermelho e verde. Terapia genética:
[178] Figura 7: esquema de e anotações para cassetes de ex- pressão de CYP4V2 exemplares e vetores de AAV recombinantes (rAAV) (a) cassete de expressão de CYP4V2 (com um potenciador) empacotado em vetores de AAV de filamento único (ssAAV) (b) cassete de expressão de CYP4V2 (sem um potenciador) empacotado em vetores de AAV de filamento único (ssAAV) (c) cassete de expressão de CYP4V2 empacotado em vetores de AAV autocomplementares (scAAV) ou ssAAV.
[179] Anotações: um cassete de expressão de CYP4V2 (como mostrado flanqueado por ITRs de AAV) pode ser empacotado em um vetor de rAAV com capsídeo de qualquer sorotipo de AAV ou um hí- brido ou variante do mesmo. ITRs: repetições terminais invertidas (po- dem ser ITRs de AAV2 ou ITRs de outros sorotipos de AAV). Sequên- cias de ITRs de AAV2 exemplares mostradas em SEQ ID NOs: 42 e
43. CYP4V2: um cDNA codificando a proteína CYP4V2 humana ou uma variante funcional da mesma, por exemplo, CYP4V2st (SEQ ID NO: 1) ou CYP4V2op (SEQ ID NO: 2) codificando a proteína CYP4V2 humana (SEQ ID NO: 4) ou CYP4V2fv (SEQ ID NO: 3) codificando proteína CYP4V2 funcional (SEQ ID NO: 5). Uma sequência Kozak (sequência mostrada na SEQ ID NO: 37 ou 38) é inserida imediata- mente antes da sequência de cDNA de CYP4V2. CAG: promotor CAG híbrido (sequência exemplar mostrara na SEQ ID NO: 32). Outros promotores discutidos aqui podem ser também usados, incluindo, sem limitação, um promotor CMV (sequência exemplar mostrada na SEQ ID NO: 40) ou um promotor EF-1α (sequência exemplar mostrada na SEQ ID NO: 41). WPRE: elemento regulador pós-transcripcional do vírus da hepatite woodchuck (sequência exemplar mostrada na SEQ ID NO: 33). poliA bGH: sinal de poliadenilação de hormônio de cresci- mento bovino (sequência exemplar mostrada na SEQ ID NO: 34). Si-
nais de poliA alternativos podem ser usados, por exemplo, um sinal de poli A tardio de SV40 (sequência exemplar mostrada na SEQ ID NO: 39). EFS: promotor núcleo curto fator de alongamento 1α (EFS). Se- quência exemplar mostrada na SEQ ID NO: 35. SPA: sinal de poliA pequeno. Sequência exemplar mostrada em SEQ ID NO: 36. ITR mu- tante/truncada: uma das duas ITRs usadas em um vetor de scAAV é uma ITR mutante/truncada (mostrada como ITR*). Sequência exem- plar mostrada na SEQ ID NO: 44. Um potenciador é opcional em cas- setes de expressão de CYP4V2.
[180] Figura 8: imagens de viabilidade celular de amostras de iPS-RPE derivadas de paciente com BCD após 1 hora de exposição à luz azul (sem tratamento com AAV.CYP4V2 vs. tratadas por AAV2.CYP4V2op ou scAAV1.CYP4V2op em MOI de 1x10e5 GC/célula). P1 e P2 (Paciente 1 e Paciente 2 com BCD). Vermelho (células mortas/doentes); Verde (células vivas/saudáveis). Figura 8(a): Vermelho apenas. Figura 8(b): Vermelho e verde.
[181] Figura 9: imagens de viabilidade celular de amostras de iPS-RPE derivadas de paciente com BCD após 1 hora de exposição à luz azul (sem tratamento com AAV.CYP4V2 vs. tratadas com AAV5.CYP4V2op, AAV5.CYP4V2st ou AAV8.CYP4V2fv em MOI 1x10e5 GC/célula). P1 (Paciente 1 com BCD). Vermelho (células mor- tas/doentes); Verde (células vivas/saudáveis). Figura 9(a): Apenas vermelho; Figura 9(b): Vermelho e verde.
[182] Figura 10: imagens de viabilidade celular de amostras de iPS-RBE derivadas de paciente com BCD após 1 hora de exposição à luz azul (sem tratamento com AAV.CYP4V2 vs. tratadas com AAV5.CYP4V2op, scAAV1.CYP4V2op ou scAAV5.CYP4V2op em MOI de 1x10e4 GC/célula). P2 (Paciente 2 com BCD). Vermelho (células mortas/doentes); Verde (células vivas/saudáveis). Figura 10(a): Ape- nas vermelho. Figura 10(b): Vermelho e verdes.
[183] Figura 11: imagens de viabilidade celular de amostras de iPS-RPE derivadas de paciente com BCD após 1 hora de exposição à luz azul (sem tratamento com AAV.CYP4V2 vs. tratadas com scA- AV9.CYP4V3op em MOI de 1x10e5 GC/célula). P1 (Paciente 1 com BCD). Vermelho (células mortas/doentes); Verde (células vi- vas/saudáveis). Figura 11(a): Vermelho apenas. Figura 11(b): Verme- lho e verde. Terapia Celular:
[184] A Figura 12 mostra uma região da sequência de CYP4V2 e a posição dos RNAs-guias (gRNAs) projetados com relação à mutação c.802-8_810del17insGC e iniciadores (setas laranjas) para ensaio de atividade de gRNA.
[185] A Figura 13 mostra um ensaio de agrimensura in vitro. Fai- xas 1: amplicon+Cas9; 2: amplicon + g1 + Cas9; 3: amplicon + g2 + Cas9; 4: amplicon + g3 + Cas9; 5: amplicon + g4 + Cas9: 6: amplicon + g5 + Cas9; 7: amplicon apenas; M: marcador de DNA 1 kb.
[186] A Figura 14 é uma comparação de sequência confirmando a origem do DNA usado no ensaio de agrimensura. Superior: amplicon não tratado; Meio: fragmento de amplicon tratado com g2; Inferior: lo- cus de CYP4V2 indicando sítio de mutação.
[187] A Figura 15 é uma ilustração de construção de vetor de gRNA.
[188] A Figura 16 é um mapa de vetor de gRNA (usando g1 como exemplo), plasmídeo de coexpressão de Cas9 e PuroR pX459- hSpCas9-2A-Puro.
[189] A Figura 17 mostra a posição do gRNA (usando g1 como um exemplo) em relação ao promotor U6 no plasmídeo pX459- hSpCas9-2A-Puro. O nucleotídeo “G” entre o promotor U6 e o gRNA é para aumentar a eficiência de transcrição direcionada pelo promotor U6. Ele é opcional e não necessário quando um promotor diferente é usado ou quando o gRNA começa com um nucleotídeo “G”.
DEFINIÇÕES
[190] Deve ser compreendido que como usado no relatório des- critivo e nas reivindicações, “um” ou “uma” pode significar um ou mais, dependendo do contexto no qual é usado. Desta maneira, por exem- plo, referência a “uma célula” pode significar “pelo menos uma célula” ou “mais de uma célula”.
[191] O termo “cerca de” ou “aproximadamente” ou o símbolo “~” se refere a de dentro de mais ou menos uma faixa 10% (inclusive) de um dado valor ou estado. A menos que de outro modo claro a partir do contexto, todos os valores numéricos providos aqui podem ser modifi- cados pelo termo cerca de.
[192] O termo “AAV.CYP4V2” se refere a um vetor de vírus ade- noassociado (AAV) recombinante compreendendo um polinucleotídeo codificando uma proteína CYP4V2 funcional.
[193] O termo “terapia genética de CYP4V2” se refere à introdu- ção de uma proteína CYP4V2 funcional ou um polinucleotídeo codifi- cando uma proteína CYP4V2 funcional em uma célula e/ou um indiví- duo. Vide discussão detalhada na descrição.
[194] O termo “quantidade eficaz” ou “dosagem eficaz” ou “dosa- gem terapeuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade de um com- posto (por exemplo, um vetor) e/ou células suficiente e/ou adequada para realizar tratamento quando administrada a um indivíduo com ne- cessidade de tal tratamento. A quantidade eficaz variará dependendo da atividade específica do agente terapêutico sendo usado, da severi- dade do estado de doença do paciente e da idade, condição física, existência de outros estados de doença e estado nutricional do indiví- duo. Ainda, outra medicação e/ou tratamento que o paciente possa estar recebendo afetará a determinação da quantidade eficaz do agen- te terapêutico a administrar. Vide descrição aqui para discussão mais detalhada.
[195] O termo “tratamento” ou “tratar” refere-se à administração de uma composição conforme revelado aqui (por exemplo, um AAV compreendendo um transgene e/ou células) a um indivíduo para pro- pósitos incluindo 1) prevenir ou proteger contra a doença ou condição, isto é, fazer com que os sintomas clínicos não se desenvolvam; 2) ini- bir a doença ou condição, isto é, parar, diminuir a velocidade, melhorar ou suprimir o desenvolvimento de sintomas clínicos; 3) aliviar da doen- ça ou condição, isto é, causar a regressão de sintomas clínicos; e/ou 4) substituir e/ou restaurar a perda de função das células, tecido e/ou órgão doente. Em algumas modalidades, o termo “tratamento” ou “tra- tar” refere-se ao alívio da doença ou condição; isto é, causar a regres- são de sintomas clínicos. Em algumas modalidades, o termo “trata- mento” ou “tratar” alternativamente ou adicionalmente refere-se ao tra- tamento profilático de um indivíduo com necessidade do mesmo. O tratamento profilático pode ser realizado ao prover uma dose apropria- da de um agente terapêutico a um indivíduo sob risco de sofrer uma doença, desta maneira prevenindo substancialmente o início da doen- ça. Será compreendido por aqueles versados na técnica que não é sempre possível distinguir entre “prevenir” e “suprimir”, uma vez que evento ou eventos indutivos finais podem ser desconhecidos ou laten- tes, ou o paciente pode não se certificar até bem depois da ocorrência do evento ou eventos. Desta maneira, como usado aqui, o termo “pro- filaxia” é pretendido como um elemento de “tratamento” para compre- ender ambos “prevenir” e “suprimir” como aqui definido.
[196] O termo “indivíduo” refere-se a um animal, tal como um mamífero, por exemplo, um humano. Os métodos descritos aqui po- dem ser úteis em aplicações terapêuticas, pré-clínicas e veterinárias humanas. Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero e em algumas modalidades, o indivíduo é humano.
[197] Uma “variante” é uma proteína com homologia de sequên- cia com uma proteína biologicamente ativa de referência que retém pelo menos uma porção da atividade terapêutica e/ou biológica da pro- teína biologicamente ativa. Por exemplo, uma proteína variante pode ter pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo me- nos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de se- quência de aminoácido comparado com a proteína biologicamente ati- va de referência. O termo “proteína biologicamente ativa” inclui proteí- nas deliberadamente modificadas, como por exemplo, através de mu- tagênese direcionada a sítio, inserções ou acidentalmente através de mutações. Uma “variante” inclui um “fragmento”, que é uma forma truncada de uma proteína biologicamente ativa nativa ou não nativa que retém pelo menos uma porção da atividade terapêutica e/ou bioló- gica.
[198] O termo “ácido nucleico” é usado aqui para se referir a to- das as formas de ácido nucleico, polinucleotídeos e oligonucleotídeos, incluindo ácido desoxirribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA). Ácidos nucleicos incluem DNA, cDNA e RNA genômico. Polinucleotí- deos incluem polinucleotídeos de ocorrência natural, sintéticos e inten- cionalmente modificados ou alterados. Polinucleotídeos podem ser simples, duplos ou triplos, lineares ou circulares, e podem ser de qual- quer comprimento. Uma sequência ou estrutura de um polinucleotídeo particular pode ser descrita aqui de acordo com a convenção de provi- são da sequência na direção 5’ para 3’.
[199] O termo “variante de sequência” significa genes ou polipep- tídeos que foram modificados comparado com sua sequência nativa ou original por uma ou mais inserções, deleções e/ou substituições de nucleotídeo ou aminoácido. Inserções podem estar localizadas em um ou ambos os terminais do gene ou proteína e/ou podem estar posicio-
nadas dentro de regiões internas da sequência de nucleotídeo ou se- quência de aminoácido. Em deleção de variantes, um ou mais resí- duos de nucleotídeo ou aminoácido em um gene ou polipeptídeo como aqui descrito são removidos. Em substituição de variantes, um ou mais resíduos de nucleotídeo ou aminoácido de um gene ou polipeptídeo são removidos e substituídos com resíduos alternativos. Em um as- pecto, as substituições são conservativas em natureza e substituições conservativas deste tipo são bem conhecidas na técnica.
[200] Como aqui usado, o termo “terapia” ou “tratamento” pode ser aplicado ou in vivo a um indivíduo ou in vitro em uma célula.
[201] Como aqui usado, um plasmídeo é um tipo de um vetor.
[202] Como aqui usado, o termo “geneticamente reparado” ou “reparo genético” refere-se a uma célula que carrega originalmente um defeito genético (por exemplo, uma mutação ou alteração patológica) em um gene, seu defeito genético tendo sido reparado ou através de correção de gene ou rompimento no DNA ou mRNA genômico da célu- la (daqui em diante referido como “edição genética”, “terapia de edição genética” ou “correção de gene”) ou através de transferência ou su- plementação de gene de uma molécula de ácido nucleico exógena pa- ra a célula que expressa uma proteína funcional que corresponde ao gene defeituoso (daqui em diante referido como “terapia de transferên- cia genética” ou “terapia genética”).
[203] Como aqui usado, o termo “identidade de sequência per- centual“ ou “identidade de sequência” deve ser determinado e calcula- do como segue. No cálculo da identidade de sequência (porcenta- gem), duas sequências são alinhadas e o número de correspondên- cias idênticas de nucleotídeos ou resíduos de aminoácido entre as du- as sequências é determinado. O número de correspondências idênti- cas é dividido pelo comprimento da região alinhada (isto é, o número de nucleotídeos ou resíduos de aminoácido alinhados) e multiplicado por 100 para se chegar a um valor de identidade de sequência percen- tual (e arredondado para o próximo número inteiro maior (por exemplo, 65,01% deve ser arredondado para 66% e considerado 66% para os presentes propósitos)). Será compreendido que o comprimento da re- gião alinhada pode ser uma porção de uma ou ambas as sequências até o tamanho de comprimento líquido inteiro (sem aplicação de lacu- na) da sequência mais curta.
Para determinar correspondências idên- ticas e calcular identidade de sequência entre duas sequências de nu- cleotídeo de codificação de proteína, qualquer sequência de nucleotí- deo de não codificação (por exemplo, sem limitação, íntron, UTR, se- quência Kozak, promotor, potenciador ou outras sequências regulado- ras) deve ser removida antes da submissão das duas sequências a alinhamento e cálculo da identidade de sequência.
O alinhamento de duas sequências para determinar o número de correspondências idên- ticas de nucleotídeos ou resíduos de aminoácido entre as duas se- quências pode ser realizado usando o Pairwise Sequence Alignment EMBOOS Neddle que cria um alinhamento global ótimo de duas se- quências usando o algoritmo Needleman-Wunsch (disponível no The European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI) e na World Wide Web: ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html quanto a alinha- mento de nucleotídeo e ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/ para ali- nhamento de proteína) e uso de parâmetros default (Para sequência de nucleotídeo usar: Matriz: EDNAFULL.
Penalidade de Lacuna Aber- ta: 10. Penalidade de Extensão de Lacuna: 0.5. Formato de saída: par.
Penalidade de Lacuna final: falsa.
Penalidade de Lacuna Abertura Fi- nal: 10. Penalidade de Extensão de Lacuna final: 0.5. Para uso de se- quência de proteína: Matriz: EBLOSUM62. Penalidade de Lacuna Aberta: 10. Penalidade de Extensão de Lacuna: 0.5. Formato de Saí- da: par.
Penalidade de Lacuna Final: falsa.
Penalidade de Lacuna Aberta Final: 10. Penalidade de Extensão de Lacuna final: 0.5).
[204] O termo “vetor de vírus adenoassociado” refere-se a um ácido nucleico derivado de qualquer sorotipo de AAV, por exemplo, sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, ou qualquer outro vírus ou sorotipo que com- partilhe homólogos em sua sequência de proteína do capsídeo com a proteína do capsídeo de um sorotipo de AAV. O termo “vírus adenoas- sociado recombinante” ou “rAAV” se refere a um vírus infeccioso, de- feituoso em replicação, composto de uma casca de proteína de AAV encapsulando uma molécula de ácido nucleico de interesse, que é flanqueada em um ou ambos os lados por ITRs de AAV. Como aqui usado, a referência a um sorotipo de AAV particular significa um AAV tendo pelo menos uma proteína do capsídeo para este sorotipo de AAV. Por exemplo, o termo “AAV2” se refere a um AAV tendo pelo menos uma proteína do capsídeo de sorotipo 2 de AAV.
[205] O termo “CYP4V2” refere-se a Citocromo P450 4V2 ou Ci- tocromo P450, família 4, subfamília V, polipeptídeo 2 (algumas vezes referido como CYP4AH1) e seus ortólogos em outras espécies. Muta- ções em CYP4V2 foram associadas com BCD (vide, por exemplo, Li e outros, Am J Hum Genet. 74:817-826, 2004) e retinite pigmentosa (vi- de, por exemplo, Wang e outros, PLOS ONE 7:e33673, 2012). O gene CYP4V2 humano genômico de comprimento integral é de cerca de 22,053 pb de comprimento e pode ser encontrado em, por exemplo, genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=CYP4V2&keywords=CYP4V2 na World Wide Web. Como aqui usado, o termo “hCYP4V2” se refere a um gene ou proteína CYP4V2 humano. Deve ser compreendido que hCYP4V2 e CYP4V2 podem se referir a um gene ou proteína que con- tém uma alteração genética ou epigenética ou um gene ou proteína que não contém uma alteração genética ou epigenética.
[206] Como aqui usado, o termo “CYP4V2 funcional” refere-se a uma proteína ou uma molécula de nucleotídeo que, quando expressa,
produz uma proteína que é eficaz para prover benefícios terapêuticos (por exemplo, melhorar ou resgatar níveis de ácido graxo anormais (por exemplo, nível de DHA) em células-alvo) a um indivíduo (por exemplo, um indivíduo com uma alteração genética ou epigenética em uma molécula de CYP4V2). Uma molécula de CYP4V2 funcional pode corresponder a uma sequência de hCYP4V2 do tipo selvagem ou uma variante de ocorrência natural da mesma (por exemplo, uma variante polimórfica, por exemplo, uma variante que não contém uma alteração patológica) ou uma sequência otimizada. Em algumas modalidades, uma molécula de CYP4V2 funcional é uma molécula de CYP4V2 de uma outra espécie (por exemplo, um outro mamífero, tal como um ro- edor, coelho, cachorro, porco ou um primata não humano) que com- partilha uma ortologia similar a CYP42V humana por exemplo. Por exemplo, um ortólogo de uma sequência de CYP4V2 humana é a se- quência de mCyp4v3 de murino. Em algumas modalidades, uma mo- lécula de CYP4V2 funcional é uma outra molécula de P450 (por exemplo, uma proteína CYP4).
[207] O termo “célula ocular” refere-se a qualquer célula no, ou associada com a função do, olho incluindo, sem limitação, uma célula da retina, uma célula bipolar da retina, uma célula fotorreceptora ou uma célula progenitora fotorreceptora (incluindo bastão e/ou cone, jun- tos (“PRCs”), uma célula de gânglio, uma célula do epitélio pigmentar da retina (RPE), uma célula epitelial coroidal (CE), uma célula do epi- télio da córnea (CEC), uma célula coroidal ou uma célula da córnea ou uma célula do nervo óptico.
[208] O termo “perda de função” ou “disfunção” refere-se a uma diminuição em, ou perda de, função celular (por exemplo, função de fotorreceptor, função de célula fotorreceptora, função de célula do epi- télio pigmentar da retina, função de lente, função de coroide ou função de córnea) comparado com uma célula não doente, normal, ou compa-
rado com o outro olho ou o mesmo olho em um ponto de tempo anteri- or. Como aqui usado, “degeneração”, “atrofia”, “distúrbio”, “doença” e/ou “distrofia” pode ser usado sinonimamente com perda de função. O termo “função aumentada” significa melhorar a função (por exemplo, a função dos fotorreceptores, células fotorreceptoras, células do epité- lio pigmentar da retina, células coroidais ou células da córnea) ou au- mentar o número ou porcentagem de fotorreceptores ou células funci- onais (por exemplo, células fotorreceptoras, células do epitélio pigmen- tar da retina, células coroidais ou células da córnea) comparado com um olho doente (tendo a mesma doença ocular), o mesmo olho em um ponto de tempo anterior, uma porção não tratada do mesmo olho ou o olho contralateral do mesmo paciente.
[209] O termo “transgene” refere-se a um ácido nucleico doador que é pretendido ou foi introduzido em uma célula ou organismo. Transgenes incluem qualquer gene, tal como um conjunto de gene ou cDNA mostrado na Tabela 4.
[210] Os termos “formulação farmaceuticamente aceitável” e “formulação fisiologicamente aceitável” e “carreador farmaceuticamen- te aceitável” significam uma formulação biologicamente aceitável, ga- sosa, líquida ou sólida, ou misturas das mesmas, que é adequada pa- ra uma ou mais vias de administração, administração in vivo, adminis- tração in vitro ou contato, e podem incluir uma formulação ou carrea- dor usado em terapias para outras doenças (por exemplo, terapia ge- nética ou terapia celular para outras doenças oculares). Uma composi- ção “farmaceuticamente aceitável” ou “fisiologicamente aceitável” é um material que não é biologicamente ou de outra maneira indesejável, por exemplo, o material pode ser administrado a um indivíduo sem causar efeitos biológicos indesejáveis substanciais. Desta maneira, tal composição farmacêutica pode ser usada, por exemplo, em adminis- tração de uma proteína, um polinucleotídeo, um plasmídeo, um vetor viral ou uma nanopartícula a uma célula ou um indivíduo. Tais compo- sições incluem, sem limitação, solventes (aquosos ou não aquosos), soluções (aquosas ou não aquosas), emulsões (por exemplo, óleo-em- água ou água-em-óleo), suspensões, xaropes, elixires, meios de dis- persão e suspensão, revestimentos, agentes isotônicos e de promoção ou retardo de absorção, compatíveis com administração farmacêutica ou contato ou administração in vivo ou in vitro. Solventes aquosos e não aquosos, soluções e suspensões podem incluir agentes de sus- pensão, agente lubrificante e agentes espessantes. Tais carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem comprimidos (revestidos ou não revestidos), cápsulas (duras ou macias), microesferas, pó, grânulos e cristais. Compostos ativos suplementares (por exemplo, conservantes, agentes antibacterianos, antivirais e antifúngicos e imunossupresso- res) podem ser também incorporados às composições. Composições farmacêuticas podem ser formuladas para ser compatíveis com uma via de administração ou administração particular, como mostrado aqui ou conhecido de um versado na técnica. Desta maneira, composições farmacêuticas incluem carreadores, diluentes ou excipientes adequa- dos para administração através de várias vias.
[211] O termo “crRNA” refere-se a RNA de CRISPR, que contém ambos o elemento protoespaçador e nucleotídeos adicionais que são complementares ao tracrRNA.
[212] O termo “tracrRNA” refere-se a crRNA de transativação, que hibridiza para o crRNA e se liga a uma proteína Cas9 ativando o complexo para criação de quebras de filamento duplo em sítios espe- cíficos dentro de sequência genômica.
[213] O termo “sgRNA” refere-se a um RNA-guia único, que combina o crRNA e o tracrRNA, que são moléculas separadas no sis- tema de CRISPR/Cas9 nativo em S. pyogenes, em uma constante de RNA única.
[214] O termo “PAM” refere-se a “motivo adjacente protoespaça- dor” que é uma sequência curta em qualquer filamento do genoma re- conhecido por nucleases de CRISPR como um sítio de corte. PAM va- ria com a nuclease (por exemplo, Cas9, Cpfl, etc.). A sequência do elemento protoespaçador está geralmente diretamente a montante do sítio de PAM.
[215] O termo “elemento protoespaçador” (também referido como “RNA-guia” ou “gRNA de CRISPR” ou “gRNA” ou g1, g2, g3, g4, g5, etc.) refere-se à porção do crRNA (ou sgRNA) que é complementar à sequência-alvo do DNA genômico.
[216] DHA: Ácido Docosaexaenoico, um ácido graxo ômega-3 poli-insaturado, também conhecido como 22:6 (ω-3) ou C22:6 n3.
[217] AA: Ácido Araquidônico, um ácido graxo ômega-6 poli- insaturado, também conhecido como 20:4(ω-6) ou C20:4 n6 ou ARA.
[218] PBS(+): solução salina tamponada com fosfato (PBS) com Cálcio e Magnésio.
[219] PBS(-): solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem Cálcio ou Magnésio.
DESCRIÇÃO DETALHADA Métodos e Composições para Modelos de Doença Celular BCD
[220] Desenvolvimento de um modelo de doença BCD apropriado e determinação do fenótipo de nível molecular para BCD são críticos para pesquisa relacionada à BCD, desenvolvimento e teste de fárma- cos e opções de tratamento para BCD. São também importantes para o estudo de função de CYP4V2. Como mostrado na seção Anteceden- tes aqui, o fenótipo clínico de BCD foi caracterizado, estabelecido e estudado há 80 anos, as mutações genéticas causando BCD foram identificadas durante uma década. No entanto, há ainda uma lacuna entre o fenótipo clínico (por exemplo, depósitos do tipo cristal na retina de pacientes com BCD) e as mutações de CYP4V2 de base.
[221] Estudos anteriores sobre BCD constataram níveis de ácido graxo anormais em pacientes com BCD, incluindo em fibroblastos, lin- fócitos e soro. Por exemplo, em Lee e outros, The Metabolism of Fatty Acids in Human Bietti Crystalline Dystrophy, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001 Jul;42(8):1707-14, os pesquisadores usaram um método pulse- chase para estudar anormalidades em fibroblasto e linfócitos de paci- entes com BCD. Fibroblastos e linfócitos de paciente com BCD e con- trole normal foram incubados com [(14)C]18:3n-3 ou [(14)C]18:2n-6. Fibroblastos de pacientes com BCD mostraram conversão menor de 18:3n-3, mas não de 18:2n-6, em ácidos graxos poli-insaturados (PU- FAs) do que aqueles de indivíduos normais. Em um outro estudo (Lai e outros, Alterations in Serum Fatty Acid Concentrations and Desaturase Activities in Bietti Crystalline Dystrophy Unaffected by CYP4V2 Ge- notypes, Invest Ophthalmol Vis Sci 2010;51:1092–7), os pesquisado- res usaram GC-MS para analisar concentrações de ácido graxo no so- ro em amostras de soro de pacientes com BCD e controle. O estudo constatou uma concentração maior de ácido octadecanoico (18:0) em soro de pacientes com BCD do que em indivíduos controle, bem como uma concentração menor de ácido octadecadienoico (18:1n-9) do que em indivíduos controle. Ainda, a concentração de ácido graxo monoin- saturado total foi significantemente menor em BCD do que no controle. Em ainda um outro estudo (Nakano e outros, CYP4V2 in Bietti’s Crystalline Dystrophy: Ocular Localization, Metabolism of omega-3- Polyunsaturated Fatty Acids, and Functional Deficit of the p.H331P Va- riant, Mol Pharmacol 82:679–686, 2012) que não usou amostras de paciente com BCD como objeto de estudo, os resultados sugeriram que a enzima CYP4V2 possui atividade de ômega-hidroxilase em rela- ção a ômega-3-PUFAs.
[222] É importante confirmar se os níveis de ácido graxo anor- mais em fibroblasto e soro de pacientes com BCD realmente existem em células de RPE de paciente com BCD, que são as células causa- doras de doença para BCD. Desta maneira, um modelo de doença BCD permitindo investigação direta em células de RPE de pacientes com BCD é desejado para obter mais compreensão de patologia de doença BCD e funções de CYP4V2, bem como avaliar a eficácia de opções de tratamento potenciais. No entanto, dada a localização e ra- ridade de RPEs de BCD, não é prático obter células de RPE nativas a partir de pacientes com BCD.
[223] A presente descrição provê modelos e métodos celulares de BCD para gerar modelos celulares de BCD. Modelos celulares de BCD consistem em células-tronco específicas de paciente com BCD (incluindo, sem limitação, células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), células-tronco embriônicas (ES), células-tronco somáticas (ou adultas), células-tronco mesenquimais (MCS)) e células oculares (in- cluindo, sem limitação, células de RPE, células fotorreceptoras (bastão ou cone), células progenitoras fotorreceptoras, células epiteliais da córnea, células da lente e/ou células da coroide) derivadas de qual- quer célula-tronco de um paciente com BCD. Em adição a células- tronco específicas de paciente, modelo celular de BCD pode ser tam- bém gerado através da criação de mutações de CYP4V2 em células de indivíduos não tendo BCD e tais células podem ser células ES, cé- lulas iPS ou outras células-tronco, ou quaisquer células que possam ser reprogramadas em células-tronco, ou quaisquer células oculares (sejam derivadas de uma célula-tronco ou não).
[224] Tecnologia de célula-tronco pluripotente induzida provê uma alternativa para modelagem de doença para modelos animais. No entanto, nem todas as doenças foram modeladas com sucesso usan- do iPSC. (Urbach, A., Bar-Nur, O., Daley, G. Q. & Benvenisty, N. Dif- ferential Modeling of Fragile X Syndrome by Human Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell 6, 407-411
(2010)). Ainda, dado o anabolismo de ácido graxo relatado associado com BCD, não ficou claro se células iPS específicas de paciente ou iPS-RPE específicas de paciente com BCD podem ser geradas atra- vés de tecnologia iPS. A. Indução de Pluripotência
[225] Métodos de produção de células-tronco pluripotentes indu- zidas (iPSCs) são conhecidos na técnica. Virtualmente todos os tipos de células somáticas podem ser usados como a célula-fonte para re- programação de iPSC. Em suma, iPSCs podem ser feitas através da introdução de um conjunto de proteínas particular (por exemplo, ácidos nucleicos codificando um conjunto de proteínas particular ou através de administração direta de proteína) em células. Seria compreendido pelo versado que um método não limitante, exemplar, é através da in- trodução de um ou mais transgenes codificando um ou mais de OCT4, SOX2, KLF4 e/ou c-MYC (por exemplo, os “Fatores Yamanaka”). Em algumas modalidades, a reprogramação usa todos os quatro fatores de transcrição. Em algumas modalidades, um, dois ou três fatores de transcrição podem ser usados. Li e outros, Stem Cells, 2009;27:2992–
3000. Zhu e outros, Cell Stem Cell 2010;7: 651–655. Em algumas mo- dalidades, iPSCs podem ser geradas através da administração direta das proteínas de reprogramação. Kim e outros, Cell Stem Cell. 2009;4(6):472-6. A seção de Exemplos provê métodos para produção de iPSCs usando métodos não integrantes, por exemplo, através do vírus Sendai (Exemplo 1) ou através de métodos epissomais (Exemplo 2). Qualquer método de produção de iPSCs, no entanto, é compreen- dido dentro do escopo da presente descrição.
[226] Vários métodos (por exemplo, vírus Sendai, método epis- somal, com ou sem moléculas pequenas) podem ser usados para ge- rar iPSCs, vide seção de Exemplos, vide também, por exemplo, Hub- bard e outros, J. Vis. Exp., 2014, 92:52009. Ainda, métodos de produ-
ção de iPSCs a partir de vários tipos de célula diferentes são conheci- dos na técnica. Vide, por exemplo, Hayashi e outros, 2012, PLoS One, 7(9): e45435; Poon e outros 2015, PLoS One, 10(7): e0131288; Lam- ba e outros 2010, PLoS One, 5(1): e8763. Tipicamente, iPSCs expres- sam níveis detectáveis de pelo menos um marcador incluindo, sem limitação, Oct-4, Sox-2, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, AP e/ou NA- NOG.
[227] Qualquer tipo de células-tronco pode ser usado na geração do modelo celular de BCD descrito aqui incluindo, sem limitação, célu- las-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), células-tronco hematopoié- ticas (HSCs), células-tronco embriônicas (ES), células-tronco mesen- quimais, células-tronco adultas ou células-tronco específicas de tecido. Células-tronco para uso nos métodos descritos aqui podem ser célu- las-tronco pluripotentes, multipotentes ou totipotentes.
[228] Como aqui usado, o termo “pluripotente” refere-se a uma célula capaz de pelo menos se desenvolver em uma de células ecto- dermais, endodermais e mesodermais. Em uma modalidade, o termo “pluripotentes” refere-se a células que são totipotentes e multipotentes. Como aqui usado, o termo célula “totipotente” refere-se a uma célula capaz de se desenvolver em todas as linhagens celulares. Como aqui usado, o termo “multipotente” refere-se a uma célula que não é termi- nalmente diferenciada. As células pluripotentes da presente descrição podem ser quaisquer células-tronco ou produzidas a partir de células não pluripotentes, tais como fibroblastos, usando métodos de indução, desdiferenciação e transferência nuclear conhecidos na técnica. As células pluripotentes descritas aqui, sejam células-tronco ou produzi- das a partir de células não pluripotentes, podem ser de um indivíduo tendo BCD ou tendo mutações de CYP4V2 ou de um indivíduo saudá- vel não tendo BCD para uso como controle ou para uso para criar mu- tações de CYP4V2 artificiais.
[229] Virtualmente qualquer tipo de células pode ser reprograma- do em células iPS. Vide discussão na subseção intitulada “Originação de Células” aqui. B. Diferenciação de iPSCs
[230] Células iPS de paciente com BCD foram diferenciadas em células iPS-RPE (ou um outro tipo de células oculares (por exemplo, iPS-CEC, células iPS-CE ou iPS-PRC). Métodos para diferenciação de células iPSCs em RPE ou um outro tipo de célula ocular (por exemplo, CEC e PRC) são conhecidos. Vide, por exemplo, a seção Exemplos, Hayashi e outros, 2012, PLoS One, 7(9):e45435; Songstad, e outros, Investigative Ophthalmology & Visual Science Dezembro 2015, Vol.56, 8258-8267; e Lamba e outros, PLoS One. 2010 Jan 20;5(1):e8763. Por exemplo, células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) reprograma- das a partir de células podem ser produzidas a diferenciadas mais em, por exemplo, células de RPE (referidas aqui como “iPS-RPE”), células epiteliais da córnea (referidas aqui como “iPS-CEC”), células fotorre- ceptoras (ou progenitoras de fotorreceptoras; referidas aqui como “iPS-PRC”) ou células iPS-endoteliais coroidais (CE) (referidas aqui como “iPS-CE”).
[231] Células diferenciadas, por exemplo, células iPS-RPE, foram testadas quanto a funções biológicas (como descrito aqui e na seção Exemplos) para avaliar seus defeitos/anormalidades bioquímicos com- parado com células iPS-RPE de controles saudáveis.
[232] As linhagens celulares iPS-RPE produzidas como descrito aqui exibem a morfologia (por exemplo, pigmentação e formato hexa- gonal) e/ou expressam um ou mais biomarcadores que são indicativos de células de RPE. Biomarcadores para células de RPE (e células iPS-RPE) são conhecidos e incluem, sem limitação, um ou mais de RLBP1 (tcc CRALBP), RPE65, BESTROPHIN-1, MITF, VINCULIN, LRAT, RDH5, PAX6, MERTK, TYR e/ou ZO-1, e podem ser usados para determinar ou confirmar que diferenciação de RPE aconteceu. Similarmente, biomarcadores para CECs (e iPS-CECs) e PRCs (e iPS- PRCs) são conhecidos e incluem, por exemplo, citoqueratina 12 e ci- toqueratina 3 para células epiteliais da córnea; e Crx para fotorrecepto- res, recoverina para bastões e cones e Nrl para bastões.
[233] Através de métodos de reprogramação de iPS e diferencia- ção de RPE como descrito na seção de Exemplos, células iPS e iPS- RPE específicas de paciente com BCD foram geradas com sucesso. C. Ensaio Bioquímico para Identificação de Defeitos/Anormalidades Bioquímicos e Ensaio de Viabilidade Celular para Avaliar Atrofia de PRE em Células iPS-RPE de Pacientes com BCD
[234] Um conjunto de ensaios bioquímicos foi desenvolvido e usado para avaliar e determinar o fenótipo nas células iPS-RPE espe- cíficas de paciente com BCD.
[235] Primeiro, uma lista mais completa de ácidos graxos foi in- cluída no ensaio bioquímico da requerente. Em um estudo anterior que identificou níveis de ácido graxo no soro anormais em pacientes com BCD, as amostras foram testadas quanto aos ácidos graxos que se- guem, 16:0, 16:1, 18:0, 18:1n-9, 18:2n-6, 18:3n-3, 20:3n-6, 20:4n-6, 22:5n-3, 22:6n-3, 24:0 e 24:1. O estudo constatou uma concentração maior de ácido octadecanoico (18:0) no soro de pacientes com BCD do que em indivíduos-controle, bem como uma concentração menor de ácido octadecadienoico (18:1n-9) do que aquela em indivíduos- controle. Para determinar se as mesmas anormalidades de ácidos graxos existem em células iPS-RPE específicas de paciente com BCD e se há mais anormalidades em outros ácidos graxos, um ensaio bio- químico compreendendo mais ácidos graxos foi desenvolvido (vide Tabela 2) usando LC-MS.
[236] Ainda, para determinar se as células iPS-RPE específicas de paciente com BCD carregam outras anormalidades em adição a ácidos graxos, outras espécies de lipídeo foram incluídas no ensaio, incluindo ceramidas (Cer), esfingomielinas (SM) e esfingosina e esfin- ganina (SOSA), para analisar o fenótipo em modelo de doença BCD e determinar as funções bioquímicas da proteína CYP4V2. Vide Tabela 2 quanto a uma lista de espécies e compostos diferentes incluídos no ensaio bioquímico usado para testar as células iPS-RPE específicas de paciente com BCD.
[237] Surpreendentemente, os resultados de teste (vide seção Exemplos) mostrou que células iPS-RPE específicas de paciente com BCD têm um perfil de anormalidade de ácidos graxos diferente daque- las encontradas em soro de pacientes com BCD.
[238] O olho é um órgão sensível à luz do corpo humano. BCD começa com atrofia de RPE, que for sua vez causa morte de fotorre- ceptores e perda de visão. Uma função-chave da RPE é absorção de luz (Strauss, 2005, The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev 85:845-81). Exposição à luz ambiental pode afetar o de- senvolvimento e progressão de degenerações retinais humanas tais como degeneração macular relacionada com a idade (AMD) e retinite pigmentosa (RP). O uso de exposição à luz em modelos de doença ocular é um sistema modelo adequado para estudar degenerações retinais. Exposição à luz incluindo exposição à luz azul tem sido am- plamente usada em pesquisa retinal (Dual roles of polyunsaturated fa- tty acids in retinal physiology and pathophysiology associated with reti- nal degeneration, Masaki Tanito & Robert Anderson (2009) Clinical Li- pidology, 4:6, 821-827. Seko, e outros, Graefes Arch Clin Exp Oph- thalmol. 2001 Jan; 239 (1): 47-52. Blue light-induced apoptosis in cul- tured retinal pigment epithelium cells of the rat. Narimatsu, e outros, Exp Eye Res. 2015 Mar;132:48-51. Blue light-induced inflammatory marker expression in the retinal pigment epithelium-choroid of mice and the protective effect of a yellow intraocular lens material in vivo). A luz azul existe em luz ambiental tal como luz do sol e luz artificial (por exemplo, iluminação de escritório), bem como de dispositivos de exibi- ção eletrônicos tais como TVs, monitores, smartphones, notebooks e tablets (Moon, e outros, Blue light effect on retinal pigment epithelial cells by display devices, Integr Biol (Camb). 2017, 22;9(5):436-443. doi: 10.1039/c7ib00032d).
[239] Neste estudo, ensaio de viabilidade celular constatou atrofia de RPE em modelo celular de BCD. Exposição à luz (azul) causou morte de célula significantemente maior em amostras de iPS-RPE de pacientes com BCD do que em amostras-controle. Fenótipo clínico de BCD (isto é, atrofia de RPE) é evidente em modelo celular de BCD. AAV.CYP4V2 demonstrou eficácia em resgate de atrofia de RPE em modelo celular de BCD. D. Aplicações de Modelo Celular de BCD
[240] Em adição à avaliação de fenótipo de nível celular associa- do com BCD, o Modelo Celular de BCD pode ser usado para outras aplicações de um modelo de doença, incluindo, sem limitação, avalia- ção de fármaco, desenvolvimento de agentes ou dispositivos terapêu- ticos, determinação de faixas de dosagem, teste de segurança e toxi- dez, teste de formulações diferentes para BCD ou outras condições relacionadas a CYP4V2 ou o estudo de funções e usos de CYP4V2, incluindo, sem limitação, desenvolvimento e avaliação de fármacos compreendendo ou expressando proteína CYP4V2, por exemplo, tera- pia genética com CYP4V2. Ainda, a iPS-RPE específica de paciente com BCD (e outras células oculares derivadas de célula-tronco especí- fica de paciente com BCD, incluindo, sem limitação, células iPS- fotorreceptoras, células iPS-da córnea) pode ser usada como terapia celular, ou em forma não modificada ou após reparo genético (por exemplo, através de transferência de gene ou edição genética como descrito aqui). A seção Exemplos provê exemplos de exemplos não limitantes de aplicações de Modelo Celular de BCD. E. Métodos de Avaliação de Compostos
[241] Significantemente, as linhagens celulares iPSC-RPE descri- tas aqui podem prover modelos de doença celular humana (por exem- plo, BCD, retinite pigmentosa, IRD). Tais células iPSC-RPE, células iPSC-CEC ou células iPSC-PRC, que podem ser coletivamente referi- das como “células iPSC-oculares”, podem ser usadas para diagnósti- co, prognóstico, predição do início de doença, severidade e taxa de progressão de um paciente com BCD ou de um paciente com retinite pigmentosa ou de um paciente tendo um outro tipo de doença retinal herdada. Por exemplo, tais linhagens celulares iPSC-oculares também podem ser usadas para avaliar compostos de teste quanto àqueles que teriam eficácia terapêutica para tratamento ou prevenção de do- enças associadas com alterações genéticas ou epigenéticas em um ácido nucleico de CYP4V2 (por exemplo, BCD).
[242] As células pluripotentes descritas aqui, particularmente aquelas produzidas a partir de um indivíduo tendo uma alteração ge- nética ou epigenética em CYP4V2 ou um indivíduo que tem uma do- ença do olho (por exemplo, BCD), podem ser usadas como uma fer- ramenta de pesquisa em métodos para identificar compostos que são candidatos terapêuticos para tratamento, diagnóstico, prognóstico ou prevenção da doença do olho (por exemplo, BCD). Deve ser compre- endido que os compostos de teste podem ser qualquer tipo de com- posto. Eles podem ser de origem natural ou eles podem ser produzi- dos através de síntese química. Eles podem ser uma biblioteca de compostos químicos estruturalmente definidos, de compostos ou subs- tâncias não caracterizados ou uma mistura de compostos. Deve ser compreendido por um versado que compostos de teste podem ser, sem limitação, ácidos nucleicos ou análogos dos mesmos, polipeptí- deos ou análogos dos mesmos, anticorpos, agentes químicos e molé-
culas pequenas.
[243] As células descritas aqui, na presença ou ausência de um composto de teste, podem ser avaliadas quanto à sua habilidade em crescer e funcionar em um modelo animal (por exemplo, no olho de um modelo animal) e quanto à sua propensão, ou falta de propensão, a formar tumores. Vários métodos podem ser usados para avaliar as células, incluindo, sem limitação, técnicas de PCR, imunoensaios e/ou análises de metabolismo de lipídeo/ácido graxo. Métodos e Composições para Terapias Celulares
[244] Como discutido aqui, terapia genética com CYP4V2 de- monstrou eficácia em correção das anormalidades bioquímicas em cé- lulas iPS-RPE específicas de paciente com BCD. No entanto, um pré- requisito para terapia genética funcionar in vivo é que o indivíduo ainda tenha algumas das células de RPE e fotorreceptoras restantes no olho sendo tratado. Para pacientes com BCD em estágio avançado que têm poucas ou nenhumas células de RPE ou células fotorreceptoras res- tantes no olho, terapia celular pode ser usada como uma alternativa ou em combinação com terapia genética como uma opção de tratamento.
[245] Terapia celular envolve transplante de células novas para substituir as células mortas ou degeneradas. Para BCD, as células no- vas podem ser células de RPE, células fotorreceptoras (cone e/ou bas- tão), células progenitoras fotorreceptoras, células da coroide, células do epitélio da córnea, células da lente ou outros tipos de células ocula- res, dependendo de qual tipo de células mostrou degeneração e ne- cessita uma substituição no indivíduo. A descrição e Exemplos que seguem descritos aqui usaram células iPS-RPE para ilustrar os méto- dos e processos. Eles podem ser aplicados a outro tipo de células ocu- lares.
[246] Terapia celular para BCD e outros tipos de doenças ocula- res incluindo, sem limitação, doenças retinais herdadas (IRD), retinite pigmentosa (RP), degeneração macular (incluindo degeneração macu- lar relacionada com a idade (AMD)), pode ser categorizada como se- gue. (1) Transplante alogênico:
[247] Em uma modalidade, células de RPE, PRCs, CECs, células CE e outras células oculares derivadas de células-tronco embriônicas (ESC) ou iPSCs de um doador saudável podem ser usadas em trans- plante alogeneico como terapia celular para BCD. Ela envolve diferen- ciação de uma ESC ou iPSC saudável de um indivíduo saudável (isto é, um sem mutações de CYP4V2) em células de RPE e transplante de tal célula ESC-RPE para o olho de um paciente com BCD. Métodos para reprogramar iPSC e diferenciar ESC ou iPSC em RPE são provi- dos aqui na seção Exemplos. Em um estudo anterior, célula-tronco embriônica (ESC) derivada de células de RPE foi usada para tratar degeneração macular relacionada com a idade (AMD), vide, Schwartz e outros, Investigative Ophthalmology & Visual Science April 2016, Vol.57, ORSFc1-ORSFc9. Os prós de um transplante alogeneico de aloenxerto é que ele tem menos custo do que transplante autólogo porque uma fonte comum pode ser usada para tratar múltiplos pacien- tes. No entanto, ele tem uma desvantagem significante tal como rejei- ção imune pelo indivíduo hospedeiro que pode afetar significantemen- te sua eficácia e duração. Ainda, ele requer imunossupressor a longo prazo que pode levar a efeitos colaterais sistêmicos severos. Final- mente, o uso de ESC pode dar origem a questões éticas. (2) Transplante autólogo sem reparo genético
[248] Em uma modalidade, células autólogas podem ser usadas em terapia celular para BCD. Uma tal fonte autóloga são células iPS e células iPS-RPE derivadas de um paciente com BCD, que podem ser transplantadas no olho de tal paciente com BCD. BCD é uma doença de início relativamente tardio. Sintomas em pacientes com BCD são geralmente desenvolvidos na 2ª, 3ª ou até mesmo 4ª década de vida. Ainda, processos de reprogramação de iPS têm algum grau de efeito de “reiniciar o relógio” nas células iPS e células derivadas das células iPS. Desta maneira, as células iPS-RPE e outras células iPS-oculares derivadas de um paciente com BCD podem ser usadas como uma te- rapia celular para transplante do paciente com BCD mesmo sem ne- nhum reparo genético das mutações de CYP4V2 nas células iPS-RPE. Métodos de reprogramação de iPS e diferenciação de RPE são provi- dos na seção Exemplos aqui. Como uma precaução, sequenciamento de genoma inteiro pode ser realizado para comparar o DNA genômico nas células iPS ou iPS-RPE e o DNA genômico na célula-fonte (por exemplo, célula de fibroblasto ou sanguínea) caso haja quaisquer mu- tações causadoras de doença criadas durante processo de reprogra- mação de iPS e diferenciação de RPE. (3) Células Autólogas de Paciente Geneticamente Reparadas para Terapia Celular para BCD e outros tipos de IRDs e RPs
[249] A presente descrição provê métodos e composições para gerar células autólogas geneticamente reparadas para terapia celular. Como aqui usado, “geneticamente reparado” ou “reparo genético” refe- re-se à correção das mutações de CYP4V2 através ou de edição ge- nética do genoma do paciente (por exemplo, diretamente no cromos- somo usando, por exemplo, CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpf1, Dedo-de- Zinco, TALEN) ou através de transferência de gene de uma cópia sau- dável do gene CYP4V2 (cDNA, RNA ou outra forma) para a célula do paciente, que tipicamente não integra no genoma (por exemplo, a te- rapia genética com CYP4V2 como descrito aqui) ou correção ou com- pensação pelo mRNA defeituoso na célula do paciente.
[250] Como uma doença causada por mutações genéticas, as células autólogas para uso em terapia celular para BCD ou uma outra IRD ou RP deve ter idealmente seus efeitos genéticos (isto é, as mu-
tações em CYP4V2) e/ou sua proteína CYP4V2 disfuncional reparados antes do transplante. Em uma modalidade, tal reparo genético pode ser obtido através de terapia de transferência genética como discutido aqui, incluindo, sem limitação, terapia genética mediada por AAV transferência de um ácido nucleico sequenciando codificando e ex- pressando uma proteína CYP4V2 funcional. Composições e métodos de terapia de transferência genética de CYP4V2 são providos aqui, vide a presente descrição detalhada e a seção Exemplos. Célula-fonte específica de paciente com BCD, células iPS ou iPS-RPE podem ser tratadas através de AAV.CYP4V2 (como provido aqui), seguido por reprogramação de iPS e/ou diferenciação de RPE (se aplicável) e veri- ficação de funções bioquímicas melhoradas (como provido aqui), e en- tão ser transplantadas no olho do mesmo paciente. Em uma outra mo- dalidade, tal reparo genético pode ser obtido através de edição genéti- ca, por exemplo, correção da(s) mutação(ões) de CYP4V2 no genoma ou RNA nas células do paciente com BCD. Em adição a ser aplicado in vitro como parte de uma terapia celular, tal edição genética pode ser também aplicada diretamente in vivo como uma terapia genética. Tal edição genética pode ser realizada na célula-fonte do paciente (por exemplo, fibroblasto ou células sanguíneas), iPS, iPS-RPE ou outros tipos de células iPS-oculares. Reprogramação de iPS e diferenciação de RPE para gerar a iPS e iPS-RPE específicas do paciente podem ser realizadas ou antes ou após o reparo genético (por exemplo, tera- pia de transferência genética ou edição genética).
[251] A presente descrição provê composições e métodos para corrigir uma mutação de CYP4V2 através de edição genética. A des- crição na seção Exemplos aqui ilustra as composições e métodos usando um construto de CRISPR/Cas9 para corrigir a mutação c.802- 8_810del17insGC, a mutação mais comum dentre pacientes com BCD. Ela pode ser aplicada também a outros métodos de edição ge-
nética (por exemplo, CRISPR/Crpl, TALEN, Dedo-de-zinco) e outras mutações de IRD (por exemplo, sem limitação, outras mutações de CYP4V2 na Tabela 1) em combinação com métodos conhecidos na técnica.
[252] A mutação de CYP4V2 mais comum dentre pacientes com BCD é c.802-8_810del17insGC (com referência a uma deleção da ba- se 17 com duas bases (GC) inseridas no lugar partindo de 8 bases a partir da extremidade de íntron 6 de gene CYP4V2, também referida como IVS6-8 del/insGC. Vide SEQ ID NO: 46 mostrando sequência da região de DNA genômico CYP4V2 e SEQ ID NO: 47 mostrando a se- quência do tipo selvagem correspondente. A mutação c.802- 8_810del17insGC é ilustrada na sequência que segue que mostra jun- ção de íntron 6 -éxon 7 de CYP4V2. A sequência de íntron 6 é mos- trada em letra minúscula e a sequência de éxon 7 em letras maiúscu- las. A deleção de 17 pbs e a inserção de GC estão em parênteses): caa aca gaa gca tgt gat tat cat tca aa (tca tac agG TCA TCG CT) (GC) GAA CGG GCC AAT GAA ATG AAC GCC AAT GA) (SEQ ID NO: 46) resultando no salto do éxon 7. (Xiao e outros, Biochem Biophys Res Commun. 409:181-6, 2011; Meng e outros, 2014, Mol. Vis., 20:1806- 14; Wada e outros, Am J Ophthalmol. 139:894-9, 2005; Jiao e outros, European Journal of Human Genetics (2017) 25, 461-471). Um estudo recente estimou que a idade da mutação c.802-8_810del17insGC de- veria ser 1.040-8.200 gerações nas populações Chinesa e 300-1100 gerações na Japonesa. Vide Jiao e outros, European Journal of Hu- man Genetics (2017) 25, 461-471.
[253] Terapia celular (também conhecida como terapia celular ou crioterapia) pode ser usada como descrito aqui para tratar ou prevenir uma doença do olho em um indivíduo. Como descrito aqui, BCD, certa RP, IRD e outras doenças do olho referidas aqui estão associadas com uma alteração genética ou epigenética em uma sequência de áci-
do nucleico de CYP4V2.
[254] Terapia celular geralmente envolve injeção, implante, transplante ou de outra maneira administração de uma composição que inclui células a um indivíduo (por exemplo, a um tecido ou órgão de um paciente (por exemplo, um olho)). Os métodos descritos aqui são únicos porque eles permitem terapia celular autóloga genetica- mente reparada de um indivíduo tendo uma doença no olho.
[255] São aqui descritos métodos que incluem obtenção de célu- las a partir de um indivíduo tendo uma doença no olho (por exemplo, associada com uma alteração genética ou epigenética em uma se- quência de ácido nucleico de CYP4V2) e reparo da(s) mutação(ões) dentro do ácido nucleico de CYP4V2 (por exemplo, DNA ou RNA) usando, por exemplo, edição genética, ou reparo através da adminis- tração de uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína CYP4V2 funcional (por exemplo, transferência de gene). As células podem ser tornadas pluripotentes (por exemplo, através de indução de pluripotência, por exemplo, para produzir iPSCs) e ser diferenciadas em uma ou mais células oculares (por exemplo, iPS-RPE, iPS-CECs, iPS-PRCs) antes da administração de volta ao indivíduo (por exemplo, ao olho do indivíduo). Seria compreendido que as células podem ser reparadas geneticamente antes de ou após serem tornadas pluripoten- tes ou após serem diferenciadas nas células oculares. A. Originação de Células
[256] Em alguns casos, células autólogas (por exemplo, células específicas do indivíduo (por exemplo, paciente) podem ser usadas nos métodos de terapia celular descritos aqui. Por exemplo, tais fi- broblastos ou células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) podem ser obtidos de um indivíduo e usados para produzir iPSCs co- mo descrito na seção Exemplos. Virtualmente todos os tipos de células podem ser usados para gerar iPSCs e desta maneira podem ser usa-
dos como células-fonte. Em alguns casos, células obtidas da urina (vi- de, por exemplo, Zhou e outros, 2012, Nat. Protoc., 7:2080-9) ou folí- culos pilosos ou células da papila dérmica (vide, por exemplo, Mu- chkaeva e outros, 2014, Acta Naturae, 6:45-53) podem ser usadas pa- ra produzir iPSCs. B. Indução de Pluripotência
[257] Métodos de produção de células-troncos pluripotentes in- duzidas (iPSCs) são conhecidos na técnica. Em suma, iPSCs podem ser feitas através da introdução de um conjunto de proteínas particular (por exemplo, ácidos nucleicos codificando um conjunto particular de proteínas) em células. Seria compreendido pelo versado que um mé- todo não limitante, exemplar, é através da introdução de um ou mais transgenes codificando OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC (por exemplo, os “fatores Yamanaka”). Em algumas modalidades, a reprogramação usa todos os quatro fatores de transcrição. Em algumas modalidades, um, dois ou três fatores de transcrição podem ser usados. Li e outros, Stem Cells, 2009;27:2992–3000. Zhu e outros, Cell Stem Cell 2010;7: 651–655. Em algumas modalidades, iPSCs podem ser geradas atra- vés da administração direta das proteínas de reprogramação. Kim e outros, Cell Stem Cell. 2009;4(6):472–6. A seção Exemplos provê mé- todo para produção de iPSCs usando métodos não integradores, por exemplo, através do vírus Sendai (Exemplo 1) ou através de métodos epissomais (Exemplo 2). Qualquer método de produção de iPSCs, no entanto, é compreendido dentro do escopo da presente descrição.
[258] Vários métodos (por exemplo, vírus Sendai, método epis- somal, com ou sem moléculas pequenas) podem ser usados para ge- rar iPSCs, vide seção Exemplos, vide também, por exemplo, Hubbard e outros, J. Vis. Exp., 2014, 92:52009. Ainda, métodos de produção de iPSCs a partir de vários tipos de células diferentes são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Hayashi e outros, 2012, PLoS One, 7(9):
e45435; Poon e outros 2015, PLoS One, 10(7): e0131288; Lamba e outros 2010, PLoS One, 5(1): e8763. Tipicamente, iPSCs expressam níveis detectáveis de pelo menos um marcador incluindo, sem limita- ção, Oct-4, Sox-2, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, AP e/ou NANOG.
[259] Qualquer tipo de células-tronco pode ser usado nos méto- dos de terapia celular descritos aqui incluindo, sem limitação, células- tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), células-tronco hematopoiéticas (HSCs), células-tronco embriônicas (ES), células-tronco mesenqui- mais, células-tronco adultas ou células-tronco específicas de tecido. Células-tronco para uso nos métodos descritos aqui podem ser célu- las-tronco pluripotentes, multipotentes ou totipotentes.
[260] Como aqui usado, o termo “pluripotente” refere-se a uma célula capaz de pelo menos se desenvolver em uma de células ecto- dermais, endodermais e mesodermais. Em uma modalidade, o termo “pluripotentes” refere-se a células que são totipotentes e multipotentes. Como aqui usado, o termo célula “totipotente” refere-se a uma célula capaz de se desenvolver em todas as linhagens celulares. Como aqui usado, o termo “multipotente” refere-se a uma célula que não é termi- nalmente diferenciada. As células pluripotentes da presente invenção podem ser quaisquer células-tronco ou produzidas a partir de células não pluripotentes, tais como fibroblastos, usando métodos de indução, desdiferenciação e de transferência nuclear conhecidos na técnica. As células pluripotentes descritas aqui, sejam células-tronco ou produzi- das a partir de células não pluripotentes, podem ser de um indivíduo tendo BCD ou tendo mutações em CYP4V2 ou um indivíduo saudável.
[261] iPSCs podem ser caracterizadas por um ou mais do que segue: a. a morfologia única de iPSCs; b. um ou mais marcadores de pluripotência, tais como Oct-4, Sox-2, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, Nanog e AP; c. A habilidade em diferenciar no tipo de célula desejado (por exemplo, células de RPE) e/ou d. um ensaio de teratoma. Nem todos dos acima são necessários para caracterização de iPSCs e vali- dação de pluripotência (por exemplo, teratoma, vide, por exemplo, Bu- ta e outros, 2013, Stem Cell Res., 11(1):552–562). C. Edição genética
[262] Várias tecnologias de edição genética podem ser usadas nos métodos descritos aqui para reparar uma alteração genética ou epigenética presente no ácido nucleico de CYP4V2 de um indivíduo. Edição genética pode ser realizada usando qualquer número de tecno- logias incluindo tecnologia de repetições palindrômicas curtas regu- larmente interespaçadas agrupadas (CRISPR) (vide, por exemplo, Pa- tentes U.S. Nos. 8.697.359; 8.889.418; 8.999.641; e US 2014/0068797), tecnologia de nucleases com efetores do tipo ativador transcripcional (TALEN) (vide, por exemplo, Li e outros, 2011, Nucleic Acids Res., 39(14):6315-25) ou tecnologia de nuclease de dedo-de- zinco (vide, por exemplo, Wright e outros, 2005, The Plant J., 44:693- 705).
[263] Para realizar edição genética usando tecnologia CRISPR, ácidos nucleicos codificando uma nuclease (por exemplo, muitas ve- zes uma nuclease Cas9, mas outras nucleases (por exemplo, outras nucleases Cas, por exemplo, Cpf1, ou nucleases não Cas) podem ser também usadas) podem ser incorporados a um ou mais vetores e ad- ministrados a um indivíduo como descrito aqui. Simplesmente a título de exemplo, as células descritas aqui (por exemplo, células do indiví- duo antes da reprogramação em iPSCs, iPSCs do indivíduo antes da diferenciação em RPE, células epiteliais da córnea ou células fotorre- ceptoras, ou após diferenciação em RPE, células epiteliais da córnea ou células fotorreceptoras (referidas aqui como “iPSCs-RPE,” “iPSC- CEC” ou “iPSC-PRC”)) podem ser transduzidas ou transfectadas com um ou mais construtos (por exemplo, vetores, RNP, mRNAs) contendo e/ou codificando pelo menos um RNA-guia (gRNA), pelo menos uma proteína associada a CRISPR (por exemplo, Cas9 ou Cpf1) e pelo menos um ácido nucleico modelo doador. Em algumas modalidades, o ácido nucleico modelo doador não é requerido, por exemplo, quando o reparo genético é obtido através de inativação.
[264] Similarmente, para obter edição genética usando tecnologia TALEN, um ácido nucleico codificando TALEN (por exemplo, fator de transcrição dimérico/nuclease) pode ser incorporado a um vetor e ad- ministrado a um indivíduo como aqui descrito. Da mesma maneira, pa- ra obter edição genética usando tecnologia de nuclease de dedo-de- zinco, um ácido nucleico codificando uma endonuclease de DNA per- sonalizada (por exemplo, um heterodímero em que cada subunidade contém um domínio de dedo-de-zinco e um domínio de endonuclease FokI) pode ser incorporado a um ou mais vetores e administrado a um indivíduo como descrito aqui.
[265] Os componentes necessários para realizar cada uma des- sas tecnologias estão disponíveis comercialmente e são personalizá- veis para a(s) sequência(s)-alvo particular(es). Vide, por exemplo, Ca- ribou Biosciences; GenScript, CRISPR Therapeutics; Editas Medicine; Cellectis Bioresearch; Life Technologies; Sangamo BioSciences; ou Sigma Aldrich Chemical Co.
[266] Sob as circunstâncias apropriadas, edição genética pode ocorrer de modo que a alteração genética ou epigenética no ácido nu- cleico de CYP4V2 do indivíduo é reparada e como um resultado uma proteína CYP4V2 funcional é expressa. Uma sequência de ácido nu- cleico CYP4V2 foi reparada quando a presença de ácido nucleico de CYP4V2 (por exemplo, o mRNA de CYP4V2) é restaurada, a presença da proteína CYP4V2 é restaurada ou a função da proteína CYP4V2 é restaurada. Similarmente, “reparado” ou “corrigido” pode se referir a uma restauração da sequência afetada (por exemplo, a alteração ge- nética ou epigenética) para a sequência do tipo selvagem ou uma ou-
tra sequência não mutante como descrito aqui.
[267] Pode haver alguns casos quando é desejável introduzir, usando edição genética, uma ou mais mutações em uma célula (por exemplo, no ácido nucleico de CYP4V2). Este é um modo em que um modelo celular de doença (por exemplo, BCD) pode ser criado. Por exemplo, adição de gene pode ser realizada em células-tronco embri- ônicas (células ES) para criar linhagens celulares com mutações de CYP4V2 artificiais, que então podem ser diferenciadas em células de RPE. Alternativamente, edição genética pode ser realizada em linha- gens celulares iPS a partir de um indivíduo saudável (por exemplo, um indivíduo não BCD) ou em uma linhagem celular de RPE (por exem- plo, linhagem celular ARPE-19) para criar linhagens celulares iPS ou de RPE mutantes em CYP4V2.
[268] Em alguns casos, é desejável avaliar as células (por exem- plo, usando sequenciamento de genoma inteiro) após as etapas de edição genética estarem completas a fim de confirmar que a mutação direcionada tenha sido reparada e que nenhuma edição fora do alvo significante tenha ocorrido.
[269] CRISPR e proteína 9 associada a CRISPR (Cas9), conhe- cida como CRISPR-Cas9, consistindo em uma nuclease guiada por RNA (Cas9) e um RNA-guia, geram quebras de DNA específicas de sítio, que são reparadas por mecanismos celulares endógenos. Resul- tados possíveis da abordagem incluem mutação de um sítio específico através de união de extremidade não homóloga mutagênica (NHEJ), criando inserções ou deleções (indels) no sítio da quebra, e mudança precisa de uma sequência genômica através de recombinação homó- loga (HR) usando um modelo de doador exogenamente introduzido. O RNA-guia de CRISPR é composto de dois RNAs chamados RNA de direcionamento de CRISPR (crRNA, também referido aqui como CRISPR RNA) e crRNA de transativação (tracrRNA). Os crRNAs são tipicamente de cerca de 20 nucleotídeos (nt) de comprimento. Ele hi- bridiza para uma sequência de DNA-alvo pelo emparelhamento de ba- se Watson-Crick e guia a endonuclease Cas para clivar o DNA genô- mico-alvo.
[270] Para reparar geneticamente a mutação de CYP4V2 mais comum através de edição genética, vários construtos de correção CRISPR de mutação de CYP4V2 foram desenvolvidos (vide seção Exemplos). CRISPR foi usado porque ele é mais simples de imple- mentar e edita em eficiência maior do que outras formas de edição ge- nética, tais como TALENs e nucleases dedo-de-zinco. Os construtos de CRISPR contêm sequências de gRNA otimizadas e validadas in vitro e opções de construto diferentes que podem ser prontamente usadas para corrigir a mutação c.802-8_810del17insGC em linhagens celulares de paciente com BCD, resultando em células geneticamente reparadas que podem ser usadas em terapia celular, incluindo, sem limitação, terapia de célula autóloga, para BCD.
[271] Terapia de edição genética CRISPR envolve o uso de uma proteína associada a CRISPR (Cas) que é uma nuclease e um RNA- guia de CRISPR. O papel do RNA-guia de CRISPR é guiar Cas para a sequência que é direcionada pelo RNA-guia de CRISPR através de um elemento protoespaçador contido no RNA-guia de CRISPR que é complementar (ou específico para) à sequência-alvo. Para Cas (por exemplo, Cas9 ou Crf1) se ligar a e clivar em ou próximo da sequên- cia-alvo, uma sequência de motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) também precisa estar presente. Uma sequência de PAM é uma extensão curta de DNA (tipicamente 2-6 nucleotídeos) que serve como um sinal de ligação para Cas. Cas diferente pode ter PAM e padrão de clivagem diferentes. Por exemplo, para Cas9 de Streptococcus pyoge- nes (SpCas9), a sequência de PAM canônica é NGG. Para Staphylo- coccus aureus (SaCas9), a sequência de PAM é NGRRT ou NGRRN.
Para Neisseria meningitidis (NM) e Treponema denticola (Td), a se- quência de PAM é NNNNGATT e NAAAAC, respectivamente. Cas en- genheirada ou mutada pode também resultar em sequência de PAM alterada. Por exemplo, a sequência de PAM da variante VQR de SpCas9 (D1135V, R1335Q e T1337R) é NGAN ou NGNG. A sequên- cia de PAM da variante EQR de SpCas9 (D1135E, R1335Q e T1337R) é NGAG. A sequência de PAM da variante VRER de SpCas9 (D1135V, G1218R, R1335E eT1337R) é NGCG. Para Cpf1, a se- quência de PAM é TTTN. Tipicamente Cas gera uma quebra de fila- mento duplo (DSB), mas Cas alterada pode resultar em uma quebra de filamento único (por exemplo, SpCas9 Nickase (Cas9n D10A)) ou nenhuma quebra (dCas9). Enquanto Cas9 gera extremidades cegas 3 nt a montante do sítio de PAM, Cpf1 cliva de uma maneira escalonada, criando uma sobreposição 5’ de 5 nucleotídeos 18-23 bases distante do PAM.
[272] O RNA-guia de CRISPR para Cas9 compreende tipicamen- te um RNA de CRISPR (crRNA) e um crRNA de transativação (tracrR- NA). O crRNA compreende uma sequência de elemento protoespaça- dor que é projetada para ser complementar (ou específica) a uma se- quência direcionada próximo do gene direcionado para correção, rom- pimento ou substituição, e uma sequência que corresponde a uma re- gião complementar do tracrRNA. O tracrRNA que compreende uma região que é complementar à região correspondente do crRNA e uma sequência que interage com a proteína associada a CRISPR 9 (Cas9). Nenhum tracrRNA é requerido para Cpf1.
[273] O comprimento do elemento protoespaçador é tipicamente cerca de 20 nucleotídeos. Sequência de elemento protoespaçador mais longa ou mais curta (cerca de 16-24 nt) pode ser também usada. O elemento protoespaçador pode ser 100% complementar à sequên- cia-alvo ou pode conter incompatibilidades com a sequência-alvo. Em algumas modalidades, um nucleotídeo “G” pode ser opcionalmente adicionado no início da sequência do elemento protoespaçador.
[274] Após uma molécula de DNA ser clivada por Cas, ela pode ser reparada de uma de duas maneiras. Um reparo de união de ex- tremidade não homóloga (NHEJ) propenso a erro pode resultar em uma mutação indel que pode romper função de proteína codificada pelo gene. NHEJ pode ser usado para criar mutações artificiais em uma linhagem celular. Em algumas modalidades, ele pode ser usado para criar mutações no gene CYP4V2 (por exemplo, uma indel em um éxon ou uma região aceitadora de união) de uma linhagem celular (por exemplo, uma célula ES, uma célula iPS ou uma linhagem celular AR- PE-19) sem quaisquer mutações de CYP4V2 endógenas e desta ma- neira gerando um modelo celular de doença (por exemplo, um modelo celular de BCD). Ainda, dois ou mais RNAs-guia de CRISPR podem ser usados juntos para inativar uma região direcionada de um gene- alvo ou o gene-alvo inteiro desta maneira gerando um modelo de inati- vação. Em algumas modalidades, silenciamento de gene baseado em CRISPR é usado para romper (ou silenciar) um gene defeituoso, por exemplo, em tratamento de uma doença genética dominante. Durante silenciamento de gene, a célula tenta reparar o DNA rompido, mas NHEJ frequentemente o faz com erros que rompem o gene desta ma- neira silenciando-o eficazmente. Em algumas modalidades, NHEJ po- de também resultar em correção de uma mutação, por exemplo, espe- cialmente quando a mutação é uma variação de nucleotídeo único ou de mais do que cerca de 10 nucleotídeos. Alternativamente, se uma sequência de ácido nucleico doadora estiver disponível, a quebra do DNA pode ser reparada através de reparo direcionado à homologia (HDR) para correção ou substituição do gene-alvo. Uma sequência de ácido nucleico doadora pode ser provida na forma de um DNA de fila- mento único (ssDNA) ou um nucleotídeo de oligo DNA de filamento único (ssODN) ou um vetor. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico doadora não é mais do que cerca de 1kb, 800bp, 600bp, 500bp, 400bp, 300bp, 280bp, 260bp, 240bp, 220bp ou 200pb para uma sequência de ácido nucleico doadora provida em um ssODN. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do- adora não é mais do que cerca de 25kb, 20kb, 15kb, 10kb, 9kb, 8kb, 7kb, 6kb, 5kb, 4,5kb, 4kb, 3,5kb ou 3kb para uma sequência de ácido nucleico doadora provida em um vetor. Em algumas modalidades, uma sequência de ácido nucleico doadora é simétrica. Em algumas modali- dades, a sequência de ácido nucleico doadora é assimétrica. Em al- gumas modalidades, o comprimento de uma sequência de ácido nu- cleico doadora pode ser ajustado para taxa de HDR maior. Em algu- mas modalidades, se o PAM direcionado pela Cas usado na adição de gene de CRISPR estiver também presente na sequência de ácido nu- cleico doadora, ele pode ser mutado (mudar para um nucleotídeo dife- rente) de modo que o PAM não existe mais na sequência de ácido nu- cleico doadora para evitar que o modelo doador ou a sequência de DNA reparada pelo modelo doador seja clivado e destruído por Cas. Em adição à correção ou substituição de um gene mutado ou defeituo- so ou uma porção do mesmo, HDR pode ser também usada para criar mutação(ões) artificial(ais) no gene CYP4V2 (por exemplo, inserção de mutação em um éxon ou uma região aceitadora de união) de uma li- nhagem celular (por exemplo, uma célula ES, uma célula iPS ou uma linhagem celular ARPE-19) sem quaisquer mutações de CYP4V2 en- dógenas e desta maneira gerando um modelo celular de doença (por exemplo, modelo celular de BCD).
[275] O RNA-guia de CRISPR e a Cas usados em terapia de edi- ção genética de CRISPR podem ser providos em uma forma de vetor (por exemplo, um plasmídeo (por exemplo, pX330, pX458, pX459), um vetor de AAV recombinante ou um vetor de lentivírus recombinante) ou um mRNA codificando tal(is) componente(s) e/ou RNA e proteína.
[276] O modelo doador pode ser provido em um ssDNA (por exemplo, ssODN) ou clonado em um plasmídeo ou outros tipos de ve- tores (por exemplo, um vetor de AAV (por exemplo, AAV2 ou AAV6) para uso em HDR.
[277] Várias composições e métodos podem ser usados para me- lhorar a edição no alvo ou eficiências de reparo e/ou diminuir ocorrên- cias fora do alvo potenciais. Por exemplo, Cas diferente (por exemplo, Cas9 ou Cpf1) ou Cas de espécies diferentes (por exemplo, SpCas9, SaCas9, NMCas9) ou variantes (SpCas9, SpCas9 VQR) podem ser usadas para ampliar as seleções de PAM disponíveis para uma se- quência-alvo, desta maneira aumentando a especificidade. Se uma região de sequência-alvo não tiver o sítio de PAM NGG para SpCas9, mas for rico em AT, Cpf1 pode ser considerado então. Cas9 nickase (por exemplo, Cas9 D10A) gera apenas uma quebra de filamento úni- co no DNA-alvo e desta maneira requer dois RNAs-guia de CRISPS em par para gerar uma quebra de filamento duplo. Esta condição au- menta drasticamente especificidade do alvo, uma vez que é imprová- vel que dois entalhes fora do alvo sejam gerados dentro de proximida- de grande o suficiente para causar uma DSB. Ainda, modelo doador assimétrico pode aumentar a taxa de HDR. dCas9 cataliticamente ina- tiva não corta DNA-alvo, mas pode ainda obter uma substituição de sequência sem nenhum do reparo propenso a erro que normalmente acompanha o corte de Cas9. Vide, Richardson e outros, Nature Bio- technology 34, 339–344 (2016).
[278] Obter correção de gene direcionada e no meio tempo evitar ou minimizar edição fora do alvo são dois objetivos de edição genética. Pesquisa anterior revelou as mutações fora do alvo causadas por tec- nologias de edição genética, incluindo, sem limitação, CRISPR e TA- LEN, vide, por exemplo, Tsai e outros, Nature Biotechnology 33, 187–
197 (2015); Wang e outros, Nature Biotechnology 33, 175–178 (2015); Wu, W.H. e outros CRISPR repair reveals causative mutation in a pre- clinical model of retinitis pigmentosa. Mol. Ther. 24, 1388–1394 (2016). Para edição genética usada in vivo, ou em terapia celular (por exem- plo, in vitro em células primeiro e então transplante das células in vi- vo), o segundo objetivo, evitar ou minimizar edição fora do alvo, é tão importante quanto obter correção do gene direcionado porque edição fora do alvo pode causar doença ou induzir formação de tumor. Deve ser notado que nem toda adição fora do alvo pode ser predita por sof- tware ou algoritmo de computador.
[279] Desta maneira, um projeto cuidadoso, validação e aperfei- çoamentos foram empregados no desenvolvimento e validação dos construtos de correção de gene CRISPR de mutação de CYP4V2: (1) Candidatos a gRNA múltiplos foram gerados com base na sequência de ácido nucleico de CYP4V2 mutante que contém a muta- ção c.802-8_810del17insGC (2) Os 5 melhores gRNAs foram selecionados usando os crité- rios que seguem (SEQ ID NOs: 48-52, Tabela 5 e Figura 12): a. A proximidade do sítio de clivagem de gRNA com o sítio de modifi- cação, e b. O perfil fora do alvo do gRNA; (3) A atividade dos 5 melhores gRNAs foi avaliada no DNA ge- nômico de um paciente com BCD com mutações c.802- 8_810del17insGC homozigotas (vide Figura 13); (4) Com base em (2) e (3), três gRNAs foram selecionados. Cada um dos 3 gRNAs foi clonado em um plasmídeo pX459 junto com sequências de ácido nucleico codificando Cas9 e gene de resistência à puromicina (Puro) para seleção de célula transfectada usando puro- micina (Vide Figuras 15 e 18). (5) Dois modelos doadores (ambos complementar avançado e reverso) provendo sequência de ácido nucleico doadora de HDR foram gerados. O ssODNs contendo as sequências modelo doadoras foram sintetizados através de IDT (vide SEQ ID NOs: 56 e 57). (6) Em adição a construtos de plasmídeo, um construto de CRISPR RNP foi desenvolvido. Um construto de RNP oferece certas vantagens com relação a outros construtos. Uma discussão detalhada é provida abaixo e na seção Exemplos. (7) Os construtos de correção de CRISPR de CYP4V2 são va- lidados em células iPS derivadas de um paciente com BCD com muta- ções c.802-8_810del17insGC homozigotas. (8) Sequenciamento de genoma inteiro é realizado em células não modificadas e células iPS geneticamente reparadas pelos constru- tos de correção de CRISPR de mutação de CYP4V2 para confirmar a correção da mutação c.802-8_810del17insGC e avaliar edições fora do alvo.
[280] Métodos para determinar as condições ótimas para trans- fecção em iPSCs e selecionar células transfectadas são providos. Vide a seção Exemplos para descrição detalhada. É compreendido que es- ses construtos podem ser usados em tratamento não apenas de célu- las iPS específicas de paciente com BCD in vitro, mas também as cé- lulas-fonte (por exemplo, fibroblastos ou PBMCs) ou células iPS-RPE, iPS-PRC, iPS-CE ou células iPS-CEC ou outras células oculares deri- vadas de células iPS específicas de paciente com BCD in vitro, bem como in vivo em pacientes com a mutação c.802-8_810del17insGC. Em uma modalidade, os componentes dos construtos podem ser usa- dos diretamente. Em algumas modalidades, os componentes no cons- truto podem ser modificados ou clonados em um vetor diferente para obter eficiência de transdução maior in vivo ou especificidade maior para o tipo de célula-alvo ou atingir outros propósitos. Por exemplo, Cas9 pode ser modificada para Cas9 nickase (Cas9n D10A), que con-
tém uma mutação que permite que a endonuclease crie entalhes de filamento único, oposto a quebras de filamento duplo. Emparelhamen- to de duas sequências de gRNA de faceamento opostas com SpCas9 nickase é um método eficiente de edição genética que impede que in- dels indesejados se formem. Em adição a plasmídeos, outros vetores comuns usados para empacotar componentes de CRISPR incluem vetores de lentivírus e vetores de vírus adenoassociado (AAV). Quan- do usando vetores de AAV, o ortólogo de Cas9 de Staphylococcus au- reus (SaCas9) pode ser usado como a endonuclease porque SaCas9 é aproximadamente 1 kb mais curto do que SpCas9, e oferece flexibi- lidade adicional próximo das limitações de empacotamento de AAV.
[281] Várias melhorias foram feitas no construto de CRISPR RNP. Ao invés de IVT sgRNA ou um dúplex de crRNA:tracrRNA, um sgRNA sintético foi usado. gRNAs sintéticos têm pureza maior do que IVT sgRNAs e desta maneira diminuem o risco de edição fora do alvo causada por impurezas em sgRNA. Ainda, modificação química é apli- cada ao sgRNA para proteger o sgRNA de degradação intracelular, o que pode aumentar eficiência de edição. Vide seção Exemplos para mais detalhes.
[282] É compreendido que, em adição aos construtos de plasmí- deo e construtos de CRISPR RNP descritos aqui, um construto de mRNA compreendendo mRNA de codificação de Cas9 e um oligonu- cleotídeo de RNA-guia podem ser também usados.
[283] Após células iPS específicas de paciente com BCD serem transfectadas com os construtos de correção de CRISPR de mutação de CYP4V2, as células transfectadas são selecionadas usando puro- micina. Deve ser compreendido que outros marcadores, tal como GFP, podem ser incorporados aos construtos e usados como um marcador no lugar de ou em adição à puromicina. Seguindo seleção, clonagem de célula única é realizada, depois disso algumas células do clone de célula única são coletadas para sequenciamento. Após resultados de sequenciamento confirmarem edição genética no alvo bem-sucedida e quaisquer edições de gene causadoras de doença serem encontradas, as células restantes do mesmo clone são usadas para diferenciação no tipo de célula ocular desejado, por exemplo, células iPS-RPE. D. Diferenciação de iPSCs
[284] As células iPS de paciente com BCD geneticamente repa- radas são diferenciadas em células iPS-RPE (ou um outro tipo de célu- las oculares (por exemplo, células iPS-CEC, iPS-CE ou iPS-PRC). Mé- todos para diferenciação de células iPSCs em RPE ou um outro tipo de célula ocular (por exemplo, CEC ou PRC) são conhecidos. Vide, por exemplo, Hayashi e outros, 2012, PLoS One, 7(9):e45435; Songs- tad, e outros, Investigative Ophthalmology & Visual Science Dezembro 2015, Vol.56, 8258-8267; e Lamba e outros, PLoS One. 2010 Jan 20;5(1):e8763. Por exemplo, células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) reprogramadas a partir de células podem ser produzidas e di- ferenciadas mais em, por exemplo, células de RPE (referidas aqui co- mo “iPS-RPE”), células epiteliais da córnea (referidas aqui como “iPS- CEC”), células fotorreceptoras (ou progenitoras de fotorreceptoras; re- feridas aqui como “iPS-PRC”) ou células iPS-endoteliais coroidais (CE) (referidas como “iPS-CE”).
[285] Células diferenciadas, por exemplo, células iPS-RPE, são testadas quanto às suas funções bioquímicas (como descrito na seção Exemplos) para confirmar que elas têm funções bioquímicas melhora- das comparado com células iPS-RPE do paciente sem reparo genéti- co.
[286] Linhagens celulares iPSC-RPE produzidas como descrito aqui exibem a morfologia (por exemplo, pigmentação e/ou formato he- xagonal) e/ou expressam um ou mais biomarcadores que são indicati- vos de células de RPE. Biomarcadores para células de RPE (e células iPS-RPE) são conhecidos e incluem, sem limitação, um ou mais de RLBP1 (tcc CRALBP), RPE65, BESTROPHIN-1, MITF, VINCULIN, LRAT, RDH5, PAX6, MERTK, TYR e/ou ZO-1, e podem ser usados para determinar ou confirmar que a diferenciação de RPE aconteceu. Similarmente, biomarcadores para CECs (e iPS-CECs) e PRCs (e iPS- PRCs) são conhecidos e incluem, por exemplo, citoqueratina 12 e ci- toqueratina 3 para células epiteliais da córnea; e Crx para fotorrecepto- res, recoverina para bastões e cones e Nrl para bastões. E. Administração
[287] As células iPS-RPE geneticamente reparadas podem ser usadas em transplante autólogo para o paciente do qual as células iPS-RPE são derivadas. Pacientes com BCD ou uma outra condição oftalmológica devido a mutações de CYP4V2 podem ser tratados atra- vés dos métodos de terapia celular providos aqui. Similarmente, o mé- todo pode ser usado para prover uma terapia celular autóloga geneti- camente reparada para doenças oculares causadas por uma ou mais mutações genéticas.
[288] Métodos de administração de células são conhecidos, e métodos de administração de células ao olho são conhecidos. Vide, por exemplo, Wert e outros, J Vis Exp. 2012; (69): 4286; WO 2016/179496; Schwartz e outros, Investigative Ophthalmology & Visual Science Abril 2016, Vol.57, ORSFc1-ORSFc9. Em uma modalidade, a célula ocular pode ser transplantada através de injeção de suspensão celular, por exemplo, suspensão de células de RPE. Em uma outra modalidade, as células podem ser transplantadas como parte de uma folha ou base, por exemplo, em um tecido in vitro usando bases natu- rais e/ou sintéticas para gerar uma monocamada de RPE funcional polarizada.
[289] A quantidade terapeuticamente eficaz de células adminis- tradas ao olho é conhecida daqueles versados na técnica e variará com o tipo de células sendo transplantadas, a maturidade das células sendo transplantadas e se é esperado dividir pós-transplante, o tama- nho da área ou número de células direcionadas para substituição, e o indivíduo sendo tratado (por exemplo, a idade, sexo, peso, estágio de desenvolvimento da doença e condição do indivíduo a ser tratado); a via de administração; e o regime requerido. A quantidade terapeutica- mente eficaz de células usadas em terapia de célula ocular pode variar de a partir de cerca de 1*10^3 a cerca de 1*10^8 células em uma úni- ca administração.
[290] Enquanto linhagens celulares iPSC podem ser geradas pa- ra sujeitos individuais, um banco de células de iPSCs tendo haplotipos de HLA comuns (ou em que o haplotipo de HLA foi geneticamente manipulado) pode ser gerado, o qual seria projetado para obter com- patibilidade imunológica com uma porção grande da população de pa- ciente. Vide, por exemplo, Turner e outros, Cell Stem Cell, 13:382– 384, 2013. Ainda, uma linhagem celular iPSC pode ser gerada, a qual é imunologicamente silenciosa sem importar o genótipo do indivíduo (vide, por exemplo, Riolobos e outros, Mol. Ther., 21:1232–41, 2013). Quando combinadas com esses métodos, as células iPS específicas de paciente e células iPS-oculares podem ser usadas não apenas em um sentido autólogo estrito, mas podem ser também usadas para transplante para outros pacientes.
[291] Tipicamente etapa de administração de terapia celular acontece após o início de sintomas da doença ou após o indivíduo ter mostrado sinais de degeneração retinal ou distrofia da córnea, confor- me aplicável. Em uma modalidade, terapia de célula ocular provida aqui pode ser usada independentemente em tratamento de uma doen- ça ocular (por exemplo, BCD). Em uma outra modalidade, terapia de célula ocular provida aqui pode ser usada em combinação com uma ou mais outras opções de tratamento, incluindo, sem limitação, a tera-
pia de transferência genética de CYP4V2 e/ou terapia de edição gené- tica CRISPR de CYP4V2 provida aqui.
[292] Similarmente, administração pode ocorrer uma vez, ou uma pluralidade de vezes (por exemplo, durante várias semanas, meses ou anos), e pode ser aplicada ao mesmo olho ou ao olho contralateral. Ainda, um ou mais tipos de células podem ser administrados em ad- ministrações únicas ou separadas.
[293] Avaliação pós-tratamento pode usar métodos descritos na seção Terapia genética com CYP4V2 aqui, incluindo, sem limitação, através de exames do olho tal como função visual, por exemplo, con- forme medido através de acuidade visual, campo visual, adaptação ao escuro, função visual e/ou Tomografia de Coerência Óptica (OCT, por exemplo, Domínio Espectral-OCT (SD-OCT) e ERG. Métodos de Uso de RNP CRISPR em Terapia de Célula Ocular e Te- rapia genética
[294] RNP CRISPR é um complexo de ribonucleoproteína (RNP) de edição genética que inclui um RNA-guia complexado com uma pro- teína Cas (por exemplo, proteínas Cas9). O RNA-guia é formado de dois RNAs chamados RNA CRISPR (crRNA) e crRNA de transativação (tracrRNA). Em uma modalidade, o crRNA e o tracrRNA são providos como duas moléculas de ácido nucleico separadas. Em uma outra modalidade, o crRNA e tracrRNA podem ser combinados em um RNA- guia único quimérico (sgRNA). O sgRNA pode ser de cerca de 100 nu- cleotídeos (nt) de comprimento, ou mais curto ou mais longo conforme desejado ou necessário. Vinte nt na extremidade 5’ (crRNA) hibridizam para uma sequência de DNA-alvo através de emparelhamento de base Watson-Crick e guiam a endonuclease Cas para clivar o DNA genômi- co-alvo, com a estrutura de filamento duplo restante no lado 3’ para reconhecimento de Cas9.
[295] RNPs CRISPR têm prós- e contras comparado com cons-
trutos de Cas9/RNA tradicionais (por exemplo, construtos de plasmí- deo que incorporam sequências de ácido nucleico o RNA-guia de CRISPR e proteína Cas9). Por exemplo, o RNA-guia (crRNA e tracrR- NA) e proteína Cas9 podem ser administrados a células-alvo como complexos intactos, superando a necessidade do maquinário de trans- crição da própria célula expressar os componentes de CRISPR. Como resultado, RNPs CRISPR podem editar rapidamente após transfecção. Ainda, os componentes de CRISPR depletam mais rápido a partir das células, o que pode reduzir a chance de edição fora do alvo. Ainda, pode reduzir a chance de mutagênese integracional causada por plasmídeos. Dadas essas vantagens, RNP pode ser também vantajo- so em adição de gene in vivo. Por outro lado, no entanto, uma vez que RNP sai rapidamente das células através de degradação de proteína, ele pode ter eficiência de edição no alvo menor do que os construtos de plasmídeo cuja expressão dura mais tempo em células.
[296] Para avaliar a hipótese acima e provar se construtos de RNP CRISPR podem atingir ambos os objetivos da edição genética desejada em terapia celular ocular e terapia genética, dois conjuntos de construtos foram projetados. Um construto é um construto de plas- mídeo e o outro é um construto de RNP. Ambos os construtos usam as mesmas células iPS do paciente com BCD para transfecção, que são subsequentemente sequenciadas para analisar reparo genético no alvo e edição fora do alvo de cada construto. Edições fora do alvo são determinadas comparando contra DNA genômico a partir de fibroblas- tos não modificados do mesmo paciente. Resultados de ambos cons- truto de plasmídeo e construto de RNP podem ser comparados.
[297] Descrição detalhada de RNP, métodos para formar RNP e usar o construto de RNP para gerar células geneticamente reparadas (células iPS e iPS-RPE) para um paciente com BCD, é provida na se- ção Exemplos.
[298] Deve ser notado que um construto de RNP CRISPR similar pode ser usado para corrigir ou inativar outras mutações de BCD e mutações de outros RP e IRDs. Em um aspecto, a sequência de crR- NA usada aqui é mudada para uma outra sequência de crRNA direcio- nando especificamente a uma sequência de mutação-alvo diferente. Em um outro aspecto, um RNA-guia ou sgRNA em um construto de RNP pode ser modificado para aumentar a eficiência de edição genéti- ca. Vide Hendel e outros, Nat. Biotechnol. 2015 Set; 33(9): 985-989. Em algumas modalidades, os construtos de RNP CRISPR podem ser transfectados usando eletroporação. Em algumas modalidades, o construto de RNP CRISPR pode ser transfectado usando lipofecção ou nucleofecção. Em algumas modalidades, o construto de RNP CRISPR pode ser administrado através de microinjeção.
[299] Em adição a reparar geneticamente e tratar as células do paciente in vitro, construtos de RNP CRISPR podem ser também usa- dos para tratar uma doença ocular causada por mutações genéticas in vivo e têm vantagens com relação a outros tipos de construtos de CRISPR (por exemplo, plasmídeos e/ou mRNAs codificando os com- ponentes de CRISPR) para aplicações in vivo. Por exemplo, constru- tos de RNP CRISPR têm potência maior, risco fora do alvo menor e/ou toxidez ou ativação de resposta imune inata menor comparado com mRNA e srRNAs de Cas9 transcritos in vitro. Em uma modalidade, construtos de RNP CRISPR compreendidos de uma proteína Cas9 complexada com um RNA-guia direcionando à região da sequência de DNA mutante podem ser injetados diretamente no olho do indivíduo (por exemplo, injeção sub-retinal, injeção intravítrea ou à córnea). Em uma outra modalidade, variantes engenheiradas de Cas9 com se- quências de localização nuclear de SV40 (NLS) que mostraram efici- ência de edição aumentada em células cerebrais in vivo (Staahl e ou- tros, Nat Biotechnol. 2017 Maio;35(5):431-434) podem ser usadas pa-
ra obter eficiência de edição maior em células oculares. Proteínas Cas9 com um ou múltiplos NLSs (no terminal N e/ou terminal C) estão comercialmente disponíveis em vários CROs, tal como IDT e Feldan. Em algumas modalidades, o construto de RNP CRISPR é formulado com um carreador farmaceuticamente aceitável quando administrado. Em algumas modalidades, o construto de RNP CRISPR é administra- do em uma forma empacotada, por exemplo, em uma nanopartícula.
[300] Seria compreendido que a razão entre os componentes de RNP CRISPR, por exemplo, o RNA-guia e proteína Cas9, pode ser ajustada e otimizada através do teste de razões diferentes em linha- gens celulares de paciente in vitro (por exemplo, células iPS específi- cas de paciente com BCD ou células iPS-RPE) antes do tratamento in vitro ou in vivo. O construto de RNP CRISPR pode ser usado indepen- dentemente ou em combinação com um outro construto de CRISPR, incluindo, sem limitação, um plasmídeo ou vetor codificando um RNA- guia ou crRNA de CRISPR ou uma proteína Cas ou uma combinação dos mesmos; um mRNA de codificação de Cas9; um oligonucleotídeo de RNA-guia; um outro construto de RNP CRISPR ou uma combina- ção ou híbrido do mesmo. Ainda, os construtos de RNP CRISPR po- dem ser usados para corrigir ou inativar uma ou mais de uma muta- ções relacionadas a uma ou mais de uma doenças oculares. Tratamento de Combinação de Terapia genética e Terapia Celular
[301] A presente descrição provê múltiplas opções de tratamento para BCD e outras doenças oculares causadas por mutações de CYP4V2, incluindo, sem limitação, terapia de transferência genética de CYP4V2 e terapia de edição genética CRISPR de CYP4V2. Ambas a terapia de transferência genética de CYP4V2 e terapia de edição ge- nética de CYP4V2 podem ser usadas ou in vivo ou in vitro ou ambos in vivo e in vitro. Quando aplicada in vivo, terapia de transferência gené- tica de CYP4V2 e/ou terapia de edição genética CRISPR de CYP4V2 podem tratar células oculares restantes afetadas por BCD como tera- pia genética. Quando aplicada in vitro em células de paciente ou célu- las derivadas de paciente, as células tratadas por terapia de transfe- rência genética de CYP4V2 e/ou por terapia de edição genética CRISPR de CYP4V2 podem ser transplantadas no paciente para subs- tituir células oculares mortas ou degeneradas como terapia de célula. Significantemente, composições e métodos de terapia genética e tera- pia de célula providos aqui podem ser combinados para prover benefí- cios adicionais a pacientes que não podem ser obtidos usando terapia genética ou terapia de célula sozinha. O “tratamento de combinação” pode também ampliar a base de paciente elegível. Por exemplo, para pacientes em estágio avançado que não têm nenhuma ou poucas cé- lulas fotorreceptoras ou RPE restantes, terapia genética não é tão efi- caz quanto para pacientes em estágio inicial. Neste caso, a terapia de célula pode se beneficiar da provisão de novas células (por exemplo, células de RPE ou fotorreceptoras), enquanto terapia genética pode melhorar o efeito de terapia celular ao resgatar as células de RPE ou fotorreceptoras restantes e/ou ao melhorar as condições de células coroides cuja saúde afeta as condições de células oculares. A combi- nação do efeito de “resgate” e “substituição” de terapia genética e te- rapia celular, respectivamente, faz do tratamento de combinação um aperfeiçoamento de ou terapia genética ou terapia de célula. Este mé- todo de tratamento de combinação pode ser aplicado para as doenças oculares causadas por uma ou mais mutações genéticas. Métodos e Composições para Terapia genética de CYP4V2
[302] A presente invenção refere-se a várias composições com- preendendo uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína CYP4V2 funcional e vários métodos utilizando as mesmas para trata- mento de uma célula ocular e/ou doença ocular. Em uma modalidade, uma proteína CYP4V2 funcional pode ser usada diretamente para pro-
pósito de tratamento. Em algumas modalidades, uma molécula de áci- do nucleico codificando uma proteína CYP4V2 funcional é usada. Em algumas modalidades, um cassete de expressão compreendendo tal molécula de ácido nucleico codificando uma proteína CYP4V2 funcio- nal operavelmente ligada com uma ou mais sequências reguladoras é usado para direcionar e controlar expressão do produto da molécula de ácido nucleico. Em algumas modalidades, um vetor é usado para empacotar tal cassete de expressão de CYP4V2 compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína CYP4V2 funcio- nal e uma ou mais sequências reguladoras para administração aumen- tada à célula-alvo e obter a expressão desejada do produto de tal mo- lécula de ácido nucleico de codificação de CYP4V2 e cassete de ex- pressão.
[303] Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de vírus ade- noassociado recombinante (rAAV). Em algumas modalidades, o vetor é um plasmídeo. Em algumas modalidades, o vetor é um outro tipo de vetor viral ou não viral. Os métodos de tratamento compreendem ad- ministração de uma quantidade eficaz (ou uma concentração eficaz) de ditos vetores ao olho do indivíduo e/ou às células-alvo. Em uma modalidade, o tratamento é aplicado diretamente in vivo. Em uma ou- tra modalidade, o tratamento compreende tratamento ex vivo em célu- las-alvo (por exemplo, uma célula ocular) e transplante das células- alvo tratadas no indivíduo (por exemplo, ao olho do indivíduo). Os mé- todos de tratamento são direcionados a doenças oculares e outras condições associadas com mutações de CYP4V2. Em uma modalida- de, a doença ocular é Distrofia Cristalina de Bietti (BCD). A. Proteína CYP4V2 Funcional e Ácidos Nucleicos codificando uma Proteína CYP4V2 Funcional
[304] CYP4V2 (Citocromo P450, Família 4, Subfamília V, Poli- peptídeo 2, (MIM 608614), sinônimo: CYP4AH1) é uma das proteínas na superfamília de citocromo P450 (P450) e um membro da subfamília 4 de citocromo P450 (CYP4). Citocromo P450s (CYPs) são proteínas contendo heme importantes, conhecidas por seus papéis como enzi- mas oxidases. O termo P450 é derivado do pico espectrofotométrico no comprimento de onda do máximo de absorção da enzima (450 nm) quando ela está no estado reduzido e complexada com monóxido de carbono. Elas estão envolvidas no metabolismo de compostos xeno- bióticos e endógenos, tais como esteroides e ácidos graxos. Enzimas CYP foram identificadas em todos os reinos de vida: animais, plantas, fungos, protistas, bactérias, arqueas e até mesmo em vírus. No entan- to, elas não são onipresentes; por exemplo, elas não foram encontra- das em Escherichia coli.
[305] Proteínas P450 compartilham elementos-chave em estrutu- ra. Por exemplo, proteínas P450 podem ser identificadas por seu ele- mento de sequência de assinatura FXXGXXXCXG (SEQ ID NO: 30), onde a cisteína serve como um ligante axial para o ferro heme. Identi- dade de sequência é relativamente baixa dentre proteínas P450, mas sua topografia real e dobras estruturais são altamente conservadas. O núcleo conservado é composto de uma espiral chamada ‘meandro’, um feixe de quatro hélices, hélices J e K e dois conjuntos de folhas beta. Esses constituem a alça de ligação heme (com uma cisteína ab- solutamente conservada que serve como o 5º ligante para o ferro he- me), a ranhura de transferência de próton e o motivo EXXR conserva- do (SEQ ID NO: 31) na hélice K. Proteínas P450 são principalmente proteínas associadas à membrana localizadas ou na membrana inter- na de mitocôndria ou no retículo endoplásmico de células.
[306] Em adição a similaridades estruturais, proteínas P450 tam- bém compartilham similaridades funcionais. A reação mais comum ca- talisada por enzimas P450 é uma reação de mono-oxigenase, por exemplo, inserção de um átomo de oxigênio na posição alifática de um substrato orgânico (RH) enquanto o outro átomo de oxigênio é reduzi- do em água: RH + O2 + NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+
[307] Muitas reações de hidroxilação (inserção de grupos hidroxi- la) usam enzimas P450. Muitas enzimas P450 têm esteroides e/ou ácidos graxos como substratos.
[308] A proteína CYP4V2 humana (NCBI RefSeq: NP_997235.3) tem 525 aminoácidos (sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4). Há variantes de proteína CYP4V2 humana, incluindo variantes patológicas (isto é, mutações) (vide Tabela 1 aqui para uma lista seleta de mutações de CYP4V2 dentre pacientes com BCD) e variantes não patológicas (isto é, funcionais).
[309] Em um aspecto, uma proteína CYP4V2 funcional é a prote- ína CYP4V2 humana (SEQ ID NO: 4). Em outros aspectos, uma prote- ína CYP4V2 funcional é uma variante ou fragmento funcional da prote- ína CYP4V2 humana, incluindo, sem limitação, um com uma sequên- cia de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 5).
[310] Uma proteína CYP4V2 funcional pode ser também uma va- riante de uma outra proteína CYP4V2 funcional. O que segue é uma discussão baseada na mudança dos aminoácidos de um polipeptídeo descrito aqui para criar uma molécula de segunda geração equivalen- te, ou até mesmo melhorada. Por exemplo, certos aminoácidos podem substituir outros aminoácidos em uma estrutura de proteína sem perda apreciável de capacidade de ligação interativa com estruturas tais co- mo, por exemplo, sítios de ligação em moléculas de substrato, por exemplo, sítio de ligação para ácidos graxos. Uma vez que sua capa- cidade interativa e natureza de uma proteína que definem a atividade funcional biológica desta proteína, certas substituições de aminoácido podem ser feitas em uma sequência de proteína, e em sua sequência de codificação de DNA ou RNA de base, e não obstante produzem uma proteína com propriedades similares. É então compreendido que várias mudanças podem ser feitas na sequência de aminoácido de uma proteína CYP4V2 funcional ou nas sequências de DNA ou RNA de genes ou regiões de codificação dos mesmos sem perda apreciável de sua utilidade ou atividade biológica, como aqui discutido. Por exemplo, SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácido de uma variante de proteína CYP4V2 que tem uma mudança de aminoácido da se- quência de proteína CYP4V2 humana mostrada na SEQ ID NO: 4.
[311] Várias técnicas, algoritmos, software e ferramentas podem ser usados para projetar ou engenheirar derivados, variantes e/ou fra- gmentos funcionais de uma proteína CYP4V2 funcional, por exemplo, a proteína CYP4V2 humana. Por exemplo, a estrutura e funções dos vários polipeptídeos ou mudanças podem ser modeladas, resolvidas ou preditas por RMN, cristalografia de raio-X ou modelagem por com- putador, por exemplo, ClustalW, SWISS-MODEL server, Swiss-Pdb Viewer, Polyphen-2, PROVEAN, SIFT, Condel, MutationAssessor e FatHMM.
[312] Uma proteína CYP4V2 funcional pode ser também um fra- gmento ou derivada de um fragmento de uma proteína CYP4V2 funci- onal. Por exemplo, a proteína CYP4V2 humana (SEQ ID NO: 4) e sua variante (SEQ ID NO: 5) ambas têm um domínio de transmembrana entre mais ou menos o 13º resíduo de aminoácido e mais ou menos o 35º resíduo a partir do terminal N. A estrutura principal de proteína CYP4V2 humana (SEQ ID NO: 4) está localizada entre mais ou menos 36-525aa. Desta maneira, uma CYP4V2 funcional pode ser derivada da deleção dos primeiros mais ou menos 35 aminoácidos a partir da proteína CYP4V2 humana (SEQ ID NO: 6) e sua substituição com uma sequência de domínio de transmembrana alternativo. Uma outra fonte de proteína CYP4V2 funcional é uma variante de união de proteína CYP4V2 funcional.
[313] O segmento de transmembrana predito de CYP4V2 reside próximo do terminal N, seguido por um domínio estrutural globular típi- co da família CYP450. O domínio globular de CYP4V2 inclui 18 hélices e segmentos estruturais beta.
O grupo heme está localizado próximo da superfície da proteína, coordenado pela hélice I em direção ao inte- rior da proteína e a hélice L superficialmente.
Li e outros, Am J Hum Genet. 74:817-826, 2004. Proteína CYP4V2 é predominantemente ati- va em metabolismo de ácido graxo.
Muitas outras enzimas P450 estão também envolvidas em metabolismo de ácido graxo.
CYP4V2 é ex- pressa ubiquamente em quase todos os tecidos e órgãos.
Expressão de CYP4V2 foi verificada em coração, cérebro, placenta, pulmão, fíga- do, músculo esqueletal, rim, pâncreas, retina, epitélio pigmentar da retina, córnea e linfócitos (Li e outros, Am J Hum Genet. 74:817-826, 2004). No entanto, a maioria das outras enzimas P450 não está pre- sente em células oculares.
Por exemplo, CYP4V2 e CYP1B1 foram as únicas enzimas P450 expressas em níveis altos em linhagem celular ARPE-19; CYP2E1, CYP2J2 e CYP3A4 foram transcritas em apenas níveis baixos (5% de expressão de mRNA de CYP4V2) e transcritos para CYP4A11, CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3 e CYP4F12 não foram detectáveis (Nakano, e outros, Mol Pharmacol 2012; 82: 679-686). O fato que sintomas de mutações de CYP4V2 são restritos ao olho, onde CYP4V2 é a única enzima P450 principal expressa além de CYP1B1 e a única enzima da subfamília 4 de P450 (CYP4) expressa, mas não mostrada em órgãos onde CYP4V2 está presente com outras enzimas P450, sugere que outras enzimas P450, particularmente enzimas CYP4, podem ser usadas para substituir toda ou parte das funções de CYP4V2. Na verdade, a subfamília CYP4 foi verificada compartilhar papéis comuns em metabolismo de ácido graxo, incluindo, sem limita- ção, como hidroxilase para PUFAs.
Vide, Hardwick, Biochem.
Phar- macol., 75(12):2263–75; Fer e outros, J.
Lipid Res., 49(11):2379-89 ;
Nakano e outros, Mol. Pharmacol., 2012, 82:679-686). Sequências de proteína de proteínas CYP4 humanas são mostradas nas SEQ ID NOs: 8-18.
[314] Em adição a substratos e funções compartilhados com as outras proteínas da subfamília CYP4, análise computacional revelou que CYP4VC2 foi formada a partir da duplicação dos ancestrais de CYP46A (SEQ ID NO: 7), que foi então duplicada para gerar a família CYP4 inteira. Pan e outros, Int. J. Mol. Sci., 2016, 17(7) pii: E1020. doi:
10.3390/ijms17071020.
[315] Ainda, o gene CYP4V2 (ou ortólogos do gene CYP4V2, por exemplo, Cyp4v3 para camundongo) é conservado em muitas espé- cies, incluindo, sem limitação, humano, chimpanzés, macaco Rhesus, cachorro, vaca, camundongo, rato, galinha, sapo, cavalo, coelho e mosca da fruta (SEQ ID NOs: 19-29). Ortólogos com gene humano CYP4V2 foram encontrados em 196 organismos.
[316] Uma proteína CYP4V2 funcional pode compreender ou ser projetada, engenheirada, ou derivada de, incluindo, sem limitação, o que segue: (i) a proteína CYP4V2 humana (SEQ ID NO: 4) (ii) uma variante de (por exemplo, mudança dos aminoácidos e/ou uma variante de união) da proteína CYP4V2 humana ou uma pro- teína CYP4V2 funcional (por exemplo, SEQ ID NO: 5), (iii) um ou mais fragmentos de uma proteína CYP4V2 funcional (por exemplo, SEQ ID NO: 6), (iv) uma proteína CYP4V2 (ou ortólogo) de outras espécies, (v) uma outra proteína CYP ou CYP46A1, (vi) um polipeptídeo que pode melhorar, tratar ou parara uma ou mais anormalidades bioquímicas em um ou mais compostos lista- dos na Tabela 2 em uma célula de paciente (por exemplo, a célula iPS-RPE de um paciente com BCD), e/ou
(vii) um derivado, híbrido ou variante de qualquer um ou mais de (i) a (vi) acima.
[317] É compreendido que as composições e métodos revelados aqui podem ser utilizados para expressar qualquer proteína CYP4V2 funcional como acima descrito. Em uma modalidade, uma proteína CYP4V2 funcional é um polipeptídeo compreendendo toda ou parte da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 5 ou 6. Em al- gumas modalidades, uma proteína CYP4V2 funcional é um polipeptí- deo compreendendo toda ou parte de uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em CYP4V2, CYP4A11, CYP4A22, CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F22, CYP4X1, CYP4Z1 e CYP46A (SEQ ID NOs: 4-18) e CYP4V2 de chimpanzé, macaco Rhesus, cachorro, vaca, camundon- go, rato, galinha, sapo, cavalo, coelho e mosca da fruta (SEQ ID NOs: 19-29), e derivados, híbridos, variantes e/ou fragmentos das mesmas. Em algumas modalidades, uma proteína CYP4V2 funcional pode ter pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácido (por exemplo, pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) com qualquer uma das sequências sele- cionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4-29. Em uma moda- lidade, uma proteína CYP4V2 funcional é um polipeptídeo compreen- dendo elementos de sequência de FxxGxxxCxG e ExxR (SEQ ID NOs: 30 e 31).
[318] Em algumas modalidades, uma proteína CYP4V2 funcional é um composto ou agente que pode melhorar, tratar ou parar uma ou mais anormalidades bioquímicas em uma célula de paciente (por exemplo, a célula iPS-RPE de um paciente com BCD).
[319] Em uma modalidade, uma proteína CYP4V2 funcional pode ser usada diretamente para tratar BCD, similar a fármacos à base de proteína para outras doenças. Em uma outra modalidade, uma molé- cula de ácido nucleico codificando uma proteína CYP4V2 funcional é usada para expressar a proteína CYP4V2 funcional nas células direci- onadas. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico é um RNA. Em uma outra modalidade, a molécula de ácido nucleico é um DNA, incluindo, sem limitação, um DNA complementar (cDNA), para expres- são a longo prazo. O cDNA pode ser de sentido positivo ou negativo, de filamento único ou duplo. Em algumas modalidades, o ácido nuclei- co codificando uma proteína CYP4V2 funcional é operavelmente liga- do com uma ou mais sequências reguladoras para formar um cassete de expressão de CYP4V2. Em algumas modalidades, tal cassete de expressão é empacotado em um vetor para eficiência de administra- ção e/ou expressão aumentada.
[320] Um códon consiste em um conjunto de três nucleotídeos e codifica um aminoácido específico ou resulta no término de tradução (isto é, códons de parada). A maioria dos aminoácidos (geralmente tudo exceto metionina) é codificada por códons múltiplos. Desta ma- neira, sequências de ácido nucleico diferentes podem ser usadas para expressar a mesma proteína. A identidade de sequência entre duas moléculas de ácido nucleico codificando a mesma sequência de prote- ína pode variar de a partir de 0% a mais de 99%. Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 1) e uma outra sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 2), ambas codificando a proteína CYP4V2 humana (SEQ ID NO:4), compartilham apenas uma identida- de de sequência de 77%.
[321] Otimização de códon de sequências de ácido nucleico pode melhorar e/ou estabilizar expressão de proteína sem mudança da se- quência de aminoácido codificada. Otimização de códon substitui có- dons presentes em uma sequência de ácido nucleico com códons pre- feridos codificando o mesmo aminoácido, por exemplo, códons prefe-
ridos para expressão de mamífero. Várias estratégias e parâmetros podem ser usados em otimização de códon, incluindo, sem limitação, tendência de uso de códon, teor de GC, teor de dinucleotídeos CpG, estrutura secundária de mRNA, sítios de união crípticos, sítios de Po- liA prematuros, sítios de chi internos e sítios de ligação ribossomal, ilhas de CpG negativas, motivo de instabilidade de RNA (ARE), se- quências de repetição (repetição direta, repetição reversa e repetição Dyad) e sítios de restrição que podem interferir com clonagem. Méto- dos de otimização de códon são conhecidos na técnica, por exemplo, Patentes U.S. No. 6.114.148 e US 20110081708. Uma sequência de ácido nucleico otimizada no códon de uma dada sequência de amino- ácido ou uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo pode ser gerada através de métodos descritos aqui e/ou usando vários softwares de otimização de códon, incluindo através de software onli- ne.
[322] Deve ser compreendido que, dependendo dos métodos de otimização de códon, configuração, algoritmos ou software sendo usa- dos, sequências de ácido nucleico otimizadas no códon diferentes co- dificando a mesma proteína podem ser geradas. No entanto, otimiza- ção do códon não leva sempre à expressão melhorada comparado com uma sequência de ácido nucleico não modificada, do tipo selva- gem. Vide Alexeyev MF, Winkler HH: Gene synthesis, bacterial ex- pression and purification of the Rickettsia prowazekii ATP/ADP trans- locase. Biochim Biophys Acta. 1999, 1419: 299-306. 10.1016/S0005- 2736(99)00078-4; Curran KA, Leavitt JM, Karim AS, Alper HS: Meta- bolic engineering of muconic acid production in Saccharomyces cere- visiae. Metab Eng. 2013, 15: 55-66; Agashe D, Martinez-Gomez NC, Drummond DA, Marx CJ: Good codons, Bad transcript: large reduc- tions in gene expression and fitness arising from synonymous muta- tions in a Key enzyme. Mol Biol Evol. 2013, 30 (3): 549-560.
10.1093/molbev/mss273. doi:10.1093/molbev/mss273.
[323] Uma sequência de ácido nucleico com códon otimizado (SEQ ID NO: 2) codificando a proteína CYP4V2 humana (SEQ ID NO: 4) é provida aqui. Ambas a SEQ ID NO: 1 e a SEQ ID NO: 2 codificam a mesma proteína CYP4V2 humana (SEQ ID NO: 4). A sequência de ácido nucleico com códon otimizado (SEQ ID NO: 2) tem um índice de adaptação de códon melhorado (CAI) de 0,95 com relação a CAI de 0,94 para a sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 1. Um CAI de 1,0 é considerado ser perfeito no organismo de expressão desejado. Seria compreendido que a presente descrição compreende todas as formas e tipos da sequência de ácido nucleico com códon otimizado conforme representado pela sequência de cDNA mostrada na SEQ ID NO: 2, incluindo qualquer sequência de RNA ou sequência de DNA ou outra sequência de ácido nucleico correspondendo a tal sequência de cDNA ou derivada da mesma, e pode estar em forma de filamento simples ou filamento duplo de, e/ou sentido positivo, negati- vo, anti ou complementar para a sequência provida aqui.
[324] Em adição à otimização de códon, outros métodos podem ser usados para melhorar o desempenho de tradução. Por exemplo, sequência Kozak ou Sequência Shine-Dalgamo pode ser usada para aumentar a eficiência de início de tradução. Um códon de parada dife- rente (por exemplo, TGA) pode ser usado para aumentar a eficiência de término de tradução. Em adição à sequência de ORF, uma sequên- cia de ácido nucleico codificando uma proteína CYP4V2 funcional po- de também incluir uma ou mais sequências de não codificação tais como UTR(s) e/ou um ou mais íntrons para melhorar expressão de proteína. Uma sequência Kozak (sequência exemplar mostrada em SEQ ID NO: 36) pode ser inserida imediatamente antes de um cDNA codificando CYP4V2 para aumentar expressão.
[325] Como discutido aqui, é compreendido que variantes e/ou fragmentos funcionais da proteína CYP4V2 humana podem ser utiliza- dos. Uma sequência de ácido nucleico codificando uma variante funci- onal (SEQ ID NO: 5) da proteína CYP4V2 humana (SEQ ID NO: 4) é provida na SEQ ID NO: 3.
[326] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico CYP4V2 é uma molécula de polinucleotídeo que codifica qualquer pro- teína CYP4V2 funcional, incluindo, sem limitação, SEQ ID NOs: 4-30 ou codificando um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácido com qualquer uma das sequências mostra- das em SEQ ID NOs: 4-30. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico CYP4V2 é um polinucleotídeo compartilhando pelo menos 60% de identidade de sequência com qualquer uma de SEQ ID NO: 1, 2 ou 3.
[327] Um vetor (por exemplo, um vetor viral ou não viral) e um cassete de expressão de CYP4V2 como descrito aqui tipicamente con- têm uma ou mais moléculas de ácido nucleico de CYP4V2 ou um fra- gmento das mesmas. Seria compreendido que uma molécula de ácido nucleico pode tomar muitas formas incluindo, sem limitação, DNA ou RNA, ácidos nucleicos de filamento simples (por exemplo, ssDNA, ssRNA), ácidos nucleicos de filamento duplo (por exemplo, dsDNA, dsRNA), ácidos nucleicos de mais filamento ou menos filamento, DNAs complementares (cDNAs), DNA genômico, RNA mensageiro (mRNA), RNA de interferência pequeno (siRNA) e/ou interferência de RNA direcionada a DNA (ddRNAi)). Moléculas de ácido nucleico po- dem incluir também um ou mais análogos de nucleotídeo ou modifica- ções de estrutura principal. Ainda, seria compreendido que um cDNA pode ser sintetizado a partir de um modelo de mRNA em uma reação catalisada por uma enzima transcriptase reversa, ou pode ser projeta- do e sintetizado com base na proteína que ele pretende codificar, in- cluindo, sem limitação, um cDNA com códon otimizado, ou pode ser sintetizado a partir de uma outra molécula de ácido nucleico através de mutagênese. Seria também compreendido que um cDNA pode conter apenas éxons, ou pode conter éxons mais outras sequências, por exemplo, regiões não traduzidas (UTR) e/ou íntrons. Em alguns casos, um vetor e um cassete de expressão de CYP4V2 descritos aqui po- dem incluir uma molécula de ácido nucleico que tem uma sequência codificando a proteína CYP4V2 humana ou uma variante ou fragmento funcional da mesma.
[328] Uma sequência de ácido nucleico adequada pode ser qual- quer sequência de ácido nucleico que codifique uma proteína CYP4V2 funcional. Tal sequência de ácido nucleico pode ou não conter elemen- tos de não codificação, tais como UTRs, íntrons ou uma sequência Kozak. Ela pode inclui ruma sequência do tipo selvagem ou uma se- quência sintética ou modificada (por exemplo, uma sequência com có- don otimizado). Uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína CYP4V2 funcional pode ser gerada como aqui descrito ou através de outros métodos conhecidos na técnica.
[329] Uma molécula de ácido nucleico com a sequência como mostrado em SEQ ID NO: 1 codificando a proteína CYP4V2 humana é aqui referida como “CYP4V2st”. Uma molécula de ácido nucleico com uma sequência com códon otimizado como mostrado em SEQ ID NO: 2 codificando a proteína CYP4V2 humana é aqui referida como “CYP4V2op”. Uma molécula de ácido nucleico com a sequência mos- trada na SEQ ID NO: 3 codificando uma variante funcional da proteína CYP4V2 humana é aqui referida como “CYP4V2fv”. Em algumas mo- dalidades, uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína CYP4V2 funcional tem uma identidade de sequência de pelo menos 60% com uma da SEQ ID NO: 1, 2 ou 3.
[330] Uma proteína CYP4V2 funcional e uma molécula de ácido nucleico codificando tal proteína CYP4V2 funcional podem ser sinteti-
zadas ou isoladas, purificadas e detectadas através de métodos co- nhecidos na técnica. Ainda, síntese ou isolamento, purificação e de- tecção de proteína são também comercialmente disponíveis através de CROs incluindo Wuxi Apptec (Shanghai, China) e GenScript (Pisca- taway, Nova Jersey). Síntese ou isolamento, clonagem por purificação e detecção de molécula de ácido nucleico estão comercialmente dis- poníveis através de CROs incluindo GenScript (Piscataway, New Jer- sey) e Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa).
[331] Um polipeptídeo pode ser sintetizado (por exemplo, através de expressão de proteína recombinante ou síntese química) ou isola- do. Como aqui usado, um polipeptídeo “purificado” é um polipeptídeo que foi separado ou purificado de componentes celulares que o acom- panham naturalmente. Tipicamente, um polipeptídeo é considerado “purificado” quando ele é pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99%), através de peso seco, livre dos polipeptídeos e moléculas de ocorrência natural com os quais eles es- tão naturalmente associados. Uma vez que um polipeptídeo que é quimicamente sintetizado é, por natureza, separado dos componentes que o acompanham naturalmente, um polipeptídeo sintético é “purifi- cado”.
[332] Polipeptídeos podem ser purificados a partir de fontes natu- rais (por exemplo, uma amostra biológica) através de métodos conhe- cidos tais como troca de íon DEAE, filtragem em gel e cromatografia de hidroxiapatita. Um polipeptídeo também pode ser purificado através de, por exemplo, expressão de um ácido nucleico em um vetor de ex- pressão. Ainda, um polipeptídeo purificado pode ser obtido através de síntese química. O grau de pureza de um polipeptídeo pode ser medi- do usando qualquer método apropriado, por exemplo, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de poliacrilamida ou análise de HPLC.
[333] Polipeptídeos são tipicamente detectados usando anticor-
pos. Técnicas para detecção de polipeptídeos usando anticorpos in- cluem ensaios imunoabsorventes ligados à enzima (ELISAs), Western blots, imunoprecipitações e imunofluorescência. Um anticorpo pode ser policlonal ou mono-oclonal. Um anticorpo tendo afinidade de liga- ção específica com um polipeptídeo ou uma porção de um polipeptí- deo pode ser gerado usando métodos bem conhecidos na técnica. O anticorpo pode ser ligado a um apoio sólido tal como uma placa de mi- crotitulação usando métodos conhecidos na técnica. Na presença de um polipeptídeo, um complexo de anticorpo-polipeptídeo é formado.
[334] Uma molécula de ácido nucleico “isolada” refere-se tipica- mente a uma molécula de ácido nucleico que é livre de sequências que flanqueiam naturalmente uma ou ambas as extremidades do ácido nucleico no genoma do organismo a partir do qual a molécula de ácido nucleico isolada é derivada (por exemplo, um cDNA ou fragmento de DNA genômico produzido através de PCR ou digestão de endonu- clease de restrição). Tal molécula de ácido nucleico isolada é geral- mente introduzida em um construto (por exemplo, um construto de clonagem ou um construto de expressão para uso em terapia genéti- ca), geralmente para conveniência de manipulação, para expressar uma proteína, para gerar uma proteína de fusão ou para outros propó- sitos, incluindo, sem limitação, para empacotamento em um vetor (por exemplo, um vetor viral ou não viral).
[335] Ácidos nucleicos podem ser isolados usando técnicas de rotina no campo. Por exemplo, ácidos nucleicos podem ser isolados usando qualquer método incluindo, sem limitação, tecnologia de ácido nucleico recombinante, mutagênese específica de sítio, a reação em cadeia da polimerase (PCR) e/ou outros métodos de engenharia gené- tica. Técnicas de PCR gerais são descritas, por exemplo, em PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. Técnicas de ácido nucleico re-
combinantes incluem, por exemplo, digestão com enzima de restrição e ligação, que podem ser usadas para isolar um ácido nucleico. Proto- colos de mutagênese são descritos, por exemplo, em In vitro Mutage- nesis Protocols, Braman, ed., Humana Press, 2002.
[336] Ácidos nucleicos isolados podem ser também quimicamen- te sintetizados, ou como uma molécula de ácido nucleico única ou co- mo uma série de oligonucleotídeos.
[337] Construtos contendo um ácido nucleico são conhecidos na técnica. Construtos, incluindo construtos de clonagem e construtos de expressão, podem ser feitos sob encomenda comercialmente ou po- dem ser produzidos através de técnicas de DNA recombinante rotina no campo. Um construto pode ter sequências reguladoras operavel- mente ligadas a um ácido nucleico a ser expresso, e ainda pode incluir sequências tais como aquelas codificando um marcador selecionável (por exemplo, um gene de resistência a antibiótico). Sequências regu- ladoras são discutidas aqui. Um construto contendo um ácido nucleico pode codificar um polipeptídeo quimérico ou de fusão (isto é, um poli- peptídeo operavelmente ligado a um polipeptídeo heterólogo, que po- de estar ou no terminal N ou terminal C do polipeptídeo). Polipeptídeos heterólogos representativos são aqueles que podem ser usados em purificação ou detecção do polipeptídeo codificado (por exemplo, mar- cador 6xHis, glutationa S-transferase (GST), CFP, Fc, FLAG, HA, Myc, RFP, Strep, VSV, GFP e YFP).
[338] Construtos carregando uma sequência de ácido nucleico podem ser introduzidos em uma célula hospedeira. Como aqui usado, “célula hospedeira” se refere à célula particular na qual o ácido nuclei- co é introduzido e também inclui a progênie de tal célula que carrega o construto. Uma célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica. Por exemplo, células hospedeiras podem ser células bacterianas tais como E. coli, ou células de inseto, células de levedura ou mamífero (tais como células de ovário de hamster Chinês (CHO), células COS, células HEK293, células HeLa, Vero, V27, A549, K562, B50, WI38 e BHK). Outras células hospedeiras incluem, sem limitação, células iPS, células ES, células de RPE, células iPS-RPE, células iPS- fotorreceptoras, células ES-RPE, células ARPE-19, células da córnea, células fotorreceptoras, células da coroide, células do nervo óptico, qualquer outro tipo de células oculares discutidas aqui, células neuro- nais, células epiteliais, células sanguíneas, fibroblastos, linfócitos e células derivadas de células-tronco. Muitos métodos para introdução de ácidos nucleicos ou um vetor ou um cassete de expressão carre- gando um transgene de ácido nucleico em células hospedeiras, ambos in vivo e in vitro, são bem conhecidos daqueles de habilidade na técni- ca e incluem, sem limitação, eletroporação, sonoporação, precipitação de fosfato de cálcio, transformação de polietileno glicol (PEG), choque térmico, lipofecção, microinjeção e transferência de ácido nucleico vi- ral-mediada.
[339] Ácidos nucleicos podem ser detectados usando qualquer número de técnicas de amplificação (vide, por exemplo, PCR Primer: A Laboratory Manual, 1995, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; e Patentes U.S. Nos. 4.683.195; 4.683.202; 4.800.159; e 4.965.188) com um par apro- priado de oligonucleotídeos (por exemplo, iniciadores). Várias modifi- cações da PCR original foram desenvolvidas e podem ser usadas para detectar um ácido nucleico. Ácidos nucleicos também podem ser de- tectados usando hibridização. Hibridização entre ácidos nucleicos é discutida em detalhes em Sambrook e outros (1989, Molecular Clo- ning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Seções 7.37-7.57, 9.47-9.57, 11.7-11.8 e 11.45-11.57). Sambrook e outros discutem condições Southern blot adequadas para sondas de oligonucleotídeos de menos do que 100 nucleotídeos (Seções 11.45-11.46) e condições de Southern blot para sondas de oligonucleotídeo maiores do que cerca de 100 nucleotídeos (vide Seções 9.47-9,54). B. Vetores
[340] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificando uma proteína CYP4V2 funcional ou fragmento da mesma é administrada às células oculares com necessidade de tratamento por meio de um vetor. Para administração às células oculares, o vetor te- rapêutico é desejavelmente não tóxico e eficiente em administração de uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, DNA, RNA) nas célu- las-alvo. Vetores de terapia genética são conhecidos na técnica e po- dem ser vetores virais ou vetores não virais.
[341] Uma abordagem para introdução in vivo de ácido nucleico em uma célula é através do uso de um vetor viral contendo molécula de ácido nucleico, por exemplo, um cDNA. Infecção de células com um vetor viral tem a vantagem que uma proporção grande das células-alvo pode receber a molécula de ácido nucleico. Ainda, moléculas codifica- das com o vetor viral, por exemplo, por um cDNA contido no vetor vi- ral, são expressas eficientemente em células que absorveram vetores virais contendo a molécula de ácido nucleico.
[342] Exemplos de vetores virais que podem ser usados incluem, sem limitação, vetores de adenovírus, vetores de vírus adenoassocia- do (AAV), vetores de lentivírus, vetores de vírus do herpes (HV) tais como vetores de vírus herpes simples (HSV), vetores de papilomaví- rus, vetores de poxvírus, vetores de vírus espumoso humano (HFV), vetores de vírus Epstein Barr (EBV), vetores do vírus vaccínia, vetores de vírus Sendai e vetores de retrovírus. Plasmídeos podem ser tam- bém usados para administrar uma molécula de ácido nucleico na célu- la-alvo. Em alguns casos, o vetor viral é um vetor viral recombinante tal como um vetor de AAV recombinante (rAAV). Seria compreendido por um versado na técnica que certos vetores integrarão, ou são mais propensos a integrar, no genoma da célula hospedeira (por exemplo, a célula do indivíduo), enquanto outros vetores não integrarão, ou são menos propensos a integrar, no genoma da célula hospedeira (por exemplo, expressão extracromossomal).
[343] Vetores de AAV recombinantes (rAAV) são comumente usados em abordagens de terapia genética. AAVs pertencem à família de parvovírus e cada um contém um DNA de filamento único. Vetores de rAAV são atualmente considerados ser a plataforma mais segura e mais eficiente para transferência de gene em células de mamífero (Salganik e outros, 2015, Microbiol. Spectr., 3(4): doi:10.1128 / micro- biolspec.MDNA3-0052-2014). Até agora, 12 sorotipos de AAV (AAV1 a AAV12) e mais de 100 variantes foram isolados de amostras de tecido de humano e primata não humano (vide, por exemplo, Gao e outros, 2005, Curr. Gene Ther., 5:285–97) e de outras espécies. Ambos os tipos de AAV de ocorrência natural e modificados podem ser usados nos métodos descritos aqui.
[344] AAVs do tipo selvagem contêm um genoma de DNA de fi- lamento único linear dentro de um capsídeo composto de três proteí- nas VP1, VP2 e VP3. Em AAVs recombinantes (rAAVs), os genes rep e cap do genoma de AAV do tipo selvagem são tipicamente substituí- dos por um cassete de expressão de transgene, flanqueados pelas repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV requeridas para empa- cotamento. Como aqui usado, “vetor de rAAV” refere-se a um vetor de AAV recombinante contendo um ou mais elementos do capsídeo de ou derivados um ou mais vírus AAV.
[345] Apesar das vantagens de AAV e outra terapia genética me- diada por vetor oral, nem todos os ditos vetores virais e nem todos os tipos de AAV são adequados para tratamento de uma doença particu- lar. Dois principais desafios enfrentados por terapia genética usando vetores virais (por exemplo, vetores de AAV). Primeiro, eficiência de transdução suficiente pelo vetor de AAV no tipo de célula direcionado para tratamento é desejada. Segundo, reações imunes potenciais dis- paradas pelo vetor viral precisam ser consideradas. Vide Madsen e outros, Adeno-associated virus serotype 2 induces cell-mediated im- mune responses directed against multiple epitopes of the capsid pro- tein VP1. J Gen Virol 90, 2622–2633 (2009); Mingozzi e outros, CD8(+) T-cell responses to adeno-associated virus capsid in humans. Nat Med 13, 419–422 (2007). Embora como comparado com a maioria de ou- tros órgãos e tecidos, o olho é considerado um órgão imunoprivilegia- do em relação a muitos outros órgãos e respostas imunes em terapia genética mediada por AAV no olho podem ser controladas pelo uso de imunossupressor, o papel de respostas imunes tais como anticorpos de neutralização (NABs) em transdução de AAV do olho não é claro em animais grandes. Ainda, administração de AAV intravítrea é mais suscetível a interações com o sistema imune do que administração sub-retinal. Desta maneira, o vetor viral usado em terapia genética ocular disparará resposta imune mínima ou nenhuma, de modo a evi- tar efeitos colaterais potenciais e assegurar que eficiência de transdu- ção/expressão dos vetores virais não seja substancialmente reduzida por reações imunes, por exemplo, NABs preexistentes no indivíduo, e/ou diminuir a dose de vetores de rAAV.
[346] Várias composições e métodos com relação a projeto e se- leção de vetor de AAV podem ser usados para se endereçar a esses desafios. Para uso de terapia genética com CYP4V2 para tratar BCD, um vetor com eficiência de transdução suficiente em células de RPE é desejado quando as células direcionadas para tratamento são princi- palmente células de RPE. Quando tratando as células da córnea de um paciente com BCD, um vetor com eficiência de transdução sufici- ente em células da córnea é desejado. Em algumas modalidades, um vetor com eficiência de transdução suficiente em células de RPE é usado. Em algumas modalidades, um vetor com eficiência de transdu- ção suficiente em células da córnea é usado. Em algumas modalida- des, um vetor com eficiência de transdução suficiente em células de RPE e fotorreceptoras é usado. Em algumas modalidades, um vetor com eficiência de tradução suficiente em células de RPE, fotorrecepto- ras e coroides é usado. Em algumas modalidades, um vetor com efici- ência de transdução suficiente em células retinais é usado. Em algu- mas modalidades, um vetor com eficiência de transdução suficiente em células oculares é usado. Em algumas modalidades, um vetor com eficiência de transdução suficiente em células oculares e/ou células sanguíneas é usado. Para se endereçar à resposta imune potencial (por exemplo, respostas imunes baseadas em NABs e célula contra os vetores de terapia genética), sorotipos e variantes de AAV diferentes, vetores de AAV e/ou protocolos de imunossupressão modificados po- dem ser usados.
[347] Um vetor de rAAV usado aqui pode ser baseado em ou de- rivado ou de um AAV do tipo selvagem (por exemplo, de um de AAV1 a AAV12 ou outras variantes de AAV do tipo selvagem isoladas de humano ou outras espécies, incluindo, sem limitação, AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 e AAV12) ou um AAV modificado. Um AAV modificado pode ser gerado de muitas ma- neiras diferentes, incluindo, sem limitação, um AAV pseudotipificado (por exemplo, AAV2/5, AAV2/8, AAV2/1, AAV2/4, AAV2/6, AAV2/7, AAV2/9, AAV2/12, AAV8/2), um AAV quimérico (por exemplo, AAV- DJ), um AAV com capsídeo modificado (por exemplo, um AAV mutan- te em capsídeo (por exemplo, AAV com mutações Y-F, K-R, T-A, S-A e/ou T-V e AAV-DJ/8 ou AAV-DJ/9 que são AAVs mutantes em capsí- deo de AAV-DJ), um AAV variante em capsídeo (por exemplo, AAV 7m8 e derivados), um AAV ancestral (por exemplo, Anc80). Um AAV recombinante envolvendo qualquer mudança no genoma e/ou capsí- deo de um AAV de ocorrência natural ou variante e qualquer combina- ção dos mesmos. Seria compreendido que há maneiras diferentes de se referir a um AAV modificado, incluindo, sem limitação, AAV artificial, modificado, sintetizado, reconstruído, engenheirado, desenvolvido, projetado, derivado ou melhorado ou AAV gerado através de projeto racional e/ou evolução dirigida e/ou embaralhamento de DNA ou uma variante de AAV. O uso de um AAV modificado pode ter certas vanta- gens com relação a um AAV não modificado, incluindo, sem limitação, eficiência de transdução maior, especificidade de tecido ou célula mai- or, menos reações imunes e/ou mais adequado para certo tipo de ad- ministração (por exemplo, injeção intravítrea ou administração através da corrente sanguínea).
[348] Em algumas modalidades, um vetor de AAV modificado usado aqui é um AAV pseudotipificado. Pseudotipificação de AAV refe- re-se à mistura de um capsídeo e genoma de sorotipos virais diferen- tes. Esses sorotipos são denotados usando um talho, de modo que AAV2/5 indica um vírus contendo o genoma (por exemplo, ITRs) de sorotipo 2 empacotado no capsídeo do sorotipo 5. Em algumas moda- lidades, um vetor de AAV é um vetor de AAV2/1, AAV2/2, AAV2/5, AAV2/8, AAV2/6, AAV2/9, AAV2/4, AAV2/7, AAV2/10 ou AAV2/12.
[349] Em algumas modalidades, um vetor de AAV modificado usado aqui é um AAV quimérico (algumas vezes também referido co- mo híbrido ou embaralhado) que é derivado de sorotipos de AAV dife- rentes, incluindo de sorotipos de AAV diferentes isolados de espécies diferentes. Em algumas modalidades, um vetor de AAV é AAV-DJ, AAV-DJ/8 ou AAV-DJ/9. AAV-DJ é uma variante de AAV gerada a par- tir das bibliotecas de híbridos de AAV de oito sorotipos através do mé- todo de embaralhamento de DNA. Grimm, D. e outros (2008). J. Virol. 82: 5887-5911. Ele é capaz de transduzir eficientemente uma faixa ampla de tipos de célula incluindo células oculares. Além disso, AAVs quiméricos possuem mais habilidade em evadir neutralização imune do que AAVs de ocorrência natural e então podem administrar eficien- temente quantidades maiores de transgene terapêutico. Um AAV hí- brido pode ser modificado mais. Por exemplo, AAV-DJ/8 e AAV-DJ/9 foram criados fazendo mutações por ponto no domínio de ligação de heparina (HBD) de AAV-DJ. Grimm, D. e outros (2008). J. Virol. 82: 5887-5911.
[350] Em algumas modalidades, um AAV modificado usado aqui é um AAV com capsídeo mutante. Ele envolve criação de uma ou mais mutações (por exemplo, mutação por ponto) em proteína do capsídeo de AAV. AAVs com capsídeo mutante podem ter vantagens sobre AAVs não modificados. Por exemplo, mutação por ponto de resíduos tirosina (Y) expostos à superfície de proteína do capsídeo de AAV foi relatada como um método simples e eficaz para evitar fosforilação e subsequente ubiquitinação, levando à eficiência de transdução maior ambos in vitro e in vivo (Zhong e outros, Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105(22): 7827–32: Markusic e outros, Mol Ther. 2010;18(12):2048–56; Li e outros, Hum Gene Ther. 2010 Nov; 21(11): 1527–1543). Por exemplo, mutagênese direcionada a sítio de cada um dos sete resíduos de tirosina do capsídeo de AAV2 (Y252, Y272, Y444, Y500, Y700, Y704 e Y730) por substituição do resíduo de fenila- lanina leva à transdução de vetor e expressão de transgene aumenta- das ao contornar fosforilação de EGFR-PTK e a via de ubiquitina- proteassoma em células humanas in vitro e hepatócitos de murino in vivo (Zhong e outros, Virology. 2008 Nov 25; 381(2):194-202). Foi também relatado que mutações por ponto do capsídeo de AAV em re- síduos tirosina (Y), serina (S), treonina (T) e lisina (K) poderiam levar à melhora em transdução significante ambos in vitro e in vivo (Gabriel e outros, Hum Gene Ther Methods. 2013;24(2):80–93; Sen e outros,
Hum Gene Ther Methods. 2013;24(2):104–16; Sen e outros, Sci Rep. 2013;3:1832; Wu e outros, J Virol. 2006;80(22):11393–7). Mutações do capsídeo podem ser também feitas em um AAV modificado para gerar um outro AAV modificado. Por exemplo, AAV-DJ/8 e AAV-DJ/9 foram criados ao fazer mutações por ponto no domínio de ligação de hepari- na (HBD) de AAV-DJ, um AAV híbrido. Grimm, D. e outros (2008). J. Virol. 82: 5887-5911. Mutações no capsídeo também podem fazer um AAV evitar NABs e gerar respostas menos imune. Ainda, certas muta- ções do capsídeo podem tornar um AAV mais adequado para adminis- tração intravítrea. Kay e outros, PLoS One, 8:e62097, 2013. Em algu- mas modalidades, um vetor de AAV usado aqui é um AAV modificado com uma ou mais mutações de capsídeo, inclui sem limitação, Tirosina em Fenilalanina (Y-F), Treonina em Valina (T-V), Lisina em Arginina (K-R), Treonina em Alanina (T-A), Serina em Alanina (S-A) e/ou afe- tando o domínio de ligação de heparina de AAV (HBD), e/ou em suas regiões antigênicas, incluindo sem limitação nas posições 459, 493 e
551. Em algumas modalidades, um vetor de AAV é um AAV2 com uma ou mais mutações de capsídeo dentre Y444F, Y500F, Y730F, Y252F, Y272F, Y700F, Y704F e T491V, em que o número (por exemplo, 444) indica a localização de uma mutação por ponto do capsídeo de AAV. Em algumas modalidades, um vetor de AAV é um AAV5 com uma ou mais mutações de capsídeo dentre Y263F e Y719F. Em algumas mo- dalidades, um vetor de AAV é um AAV8 com uma ou mais mutações de capsídeo dentre Y447F, Y733F e T494V. Em algumas modalida- des, um vetor de AAV é um AAV1 com um mutante de capsídeo de Y731F. Em algumas modalidades, um vetor de AAV é um AAV5 com uma ou mais mutações de capsídeo dentre Y455F e Y731F. Em algu- mas modalidades, um vetor de AAV é um AAV9 com uma mutação de capsídeo de Y731F. Em algumas modalidades, um vetor de AAV é um AAV-DJ, AAV-DJ/8 ou AAV-DJ/9 com uma ou mais mutações de cap-
sídeo dentre K137R, T251A e S503A.
[351] Em algumas modalidades, um vetor de AAV modificado é um AAV com proteínas do capsídeo de AAV variantes. Proteínas do capsídeo de AAV variantes são conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo de ocorrência não natural po- de incluir uma sequência de AAV selecionada (por exemplo, um frag- mento de uma proteína do capsídeo vp1) em combinação com se- quências heterólogas (por exemplo, sequências obtidas de um soroti- po de AAV selecionado diferente, porções não contíguas do mesmo sorotipo de AAV, de uma fonte viral não AAV ou de uma fonte não vi- ral). Em algumas modalidades, um vetor de AAV modificado inclui uma ou mais inserções de aminoácidos (por exemplo, de a partir de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 11 aminoácidos) na alça de GH da prote- ína do capsídeo. Proteínas do capsídeo de AAV variantes podem con- ferir infectividade aumentada de uma célula retinal comparado com a infectividade da célula retinal por um AAV não variante (por exemplo, AAVs do tipo selvagem). Em algumas modalidades, um AAV modifica- do é um que pode administrar o transgene através da barreira sangue- ocular (BOB) que o torna adequado para administração através da cor- rente sanguínea, oferecendo uma via de administração alternativa das administrações convencionais (por exemplo, injeção sub-retinal ou in- jeção intravítrea) usadas em terapia genética ocular. Em algumas mo- dalidades, um AAV com proteínas do capsídeo de AAV variantes em um AAV 7m8, ou seus derivados ou variantes (Dalkara e outros, Sci- ence Translation Medicine, 5:189ra76, 2013; Pedido PCT No. PCT/US2012/034413, Pedido PCT No. PCT/US2014/039015, Pedido US No. 14/214,011 e Pedido US No. 13/899.481). Em algumas moda- lidades, um AAV com proteínas do capsídeo de AAV variantes é um AAV-PHP-B.
[352] Em algumas modalidades, um vetor de AAV pode ser re-
construído ou sintetizado através de reconstrução da linhagem revolu- cionária viral. Tal reconstrução pode prover AAVs ancestrais, antigos ou parentais. Em uma modalidade, um vetor de AAV é um Anc80 (um ancestral de AAV1, 2, 8 e 9) ou seus derivados. Zinn e outros, Cell Rep. 2015 Aug 11;12(6):1056-68.
[353] Em algumas modalidades, um ou mais AAVs e/ou outros vetores virais podem ser modificados (por exemplo, otimizados para administração intravítrea, para transdução aumentada em tipo de célu- la-alvo (por exemplo, células de RPE) ou para administração através da corrente sanguínea) por meio de técnicas conhecidas no campo incluindo, por exemplo, “evolução dirigida” e/ou “projeto racional”. Vide, por exemplo, Asuri e outros, Mol Ther. 20:329-338, 2012 e Yang e ou- tros, Methods Mol Biol. 709:127-139, 2011. AAVs modificados ou ou- tros vetores virais podem ser descritos como, por exemplo, “engenhei- rados”, “híbridos”, “desenvolvidos”, “melhorados” ou “projetados”. Tais modificações podem, por exemplo, melhorar direcionamento do vetor (por exemplo, melhorando a adequabilidade para administração intra- vítrea ou para administração através da corrente sanguínea), eficiência de transdução e/ou reação imune menor, resultando em, por exemplo, uma dose menor sendo requerida. Em algumas modalidades, um vetor de rAAV é um sorotipo de AAV rh10 (EP 20100178940) ou ShH10. Em algumas modalidades, um vetor de rAAV é um AAV-PHP.B (US 20150079038).
[354] Em algumas modalidades, um vetor de AAV pode ser gera- do e/ou selecionado de uma combinação de mais de uma estratégia declarada aqui. Por exemplo, AAV-DJ/8 e AAV-DJ/9 foram criados ao fazer mutação por ponto no domínio de ligação de heparina (HBD) de AAV-DJ, um AAV híbrido.
[355] É conhecido na técnica que certos AAVs podem ser mais adequados para administração intravítrea do que alguns outros AAVs.
Muitos tais AAVs para administração intravítrea envolvem modificação da proteína do capsídeo de AAV através de mutações (por exemplo, AAV2 (quadY-F+T-V) (Kay e outros, PLoS One. 2013 Apr 26;8(4)) ou proteínas do capsídeo de AAV variantes (por exemplo, AAV 7m8). Ainda, há AAVs adequados para administração através da corrente sanguínea, por exemplo, AAV-PHP.B. Seu uso, no entanto, não é limi- tado à administração intravítrea ou administração através da corrente sanguínea, por exemplo, eles podem ser também usados como veto- res de AAV para sub-retinal e outras vias de administração.
[356] Em algumas modalidades, um vetor de AAV autocomple- mentar (scAAV) é usado. AAVs do tipo selvagem têm um genoma de DNA de filamento único. Um inconveniente de AAV é seu genoma de DNA de filamento único. Devido ao fato do genoma de AAV de fila- mento único depender do maquinário de replicação de DNA da célula para sintetizar o filamento complementar, expressão de transgene é retardada e não é tão robusta quanto DNA de filamento duplo. Para terapia genética com CYP4V2, a requerente desenvolveu um projeto de scAAV (vide Figura 7) para evitar uma síntese de segundo filamen- to limitante de taxa em vetores de AAV de filamento único convencio- nais e facilitar expressão de transgene robusta. O scAA.CYP4V2 com- preende uma estrutura de DNA de CYP4V2 autocomplementar intra- molecular que elimina a necessidade de síntese de DNA de célula- hospedeira e resulta em expressão mais rápida e mais robusta quando da transdução. A estrutura autocomplementar de um scAAV, no entan- to, reduz o limite de empacotamento de vetor de scAAV de a partir de 4,7-5,0 kb para ssAAV a cerca de 2,4-2,5 kb para scAAV. Desta ma- neira, sequências reguladoras de comprimento mais curto (por exem- plo, promotora, potenciadora e/ou sinal poliA) são requeridas em um projeto de scAAV. Para assegurar que o cassete de expressão não exceda o limite de empacotamento do vetor e dependendo do compri-
mento do cDNA e outras sequências reguladoras usadas, certa se- quência reguladora opcional pode precisar ser excluída do construto de scAAV, tal como um potenciador. Uma das duas ITRs em um proje- to de scAAV é uma ITR truncada e tem uma mutação no sítio de reso- lução terminal (TRS). Para uma discussão detalhada sobre estrutura de scAAV, purificação e produção, vide McCarthy, Molecular Therapy, Volume 16, Issue 10, p1648–1656, Outubro 2008.
[357] Vários outros projetos de vetor podem ser usados. Por exemplo, um sistema de vetor duplo (por exemplo, um sistema de ve- tor duplo baseado em AAV, por exemplo, vetores de AAV de união trans ou duplos híbridos) pode ser usado para expressar uma sequên- cia de ácido nucleico (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico de CYP4V2). Vide, por exemplo, Colella, e outros, Gene Ther. 21, 450–456, 2014. Por exemplo, um sistema de vetor duplo pode incluir (i) um primeiro polinucleotídeo de vetor de AAV tendo uma repetição terminal invertida em cada extremidade (extremidades 5’ e 3’) do poli- nucleotídeo, e entre as repetições terminais invertidas, um promotor adequado operavelmente ligado a uma sequência de codificação par- cial que codifica uma parte N-terminal da proteína codificada pela se- quência de ácido nucleico de interesse; e ii) um segundo polinucleotí- deo de vetor de AAV tendo uma repetição terminal invertida em cada extremidade (extremidades 5’ e 3’) do polinucleotídeo, e entre as repe- tições terminais invertidas, uma sequência de codificação parcial que codifica uma parte C-terminal da proteína codificada pela sequência de ácido nucleico de interesse, seguido por uma sequência de sinal de poliadenilação (pA).
[358] Vários vetores de rAAVs foram projetados e gerados para o presente estudo, incluindo scAAV2/1, AAV2/2, AAV2/5, scAAV2/5, AAV2/8, scAAV2/9 e AAV2/2 (Y444F+Y500F+Y730F) (vide desenhos esquemáticos e anotações na Figura 7 no presente relatório). Eles demonstram que vetores de rAAV de vários projetos de vetor podem ser usados em terapia genética com CYP4V2. Ainda, inclusão de veto- res de rAAV múltiplos como opções pode ajudar a reduzir resposta imune potencial em terapia genética com CYP4V2 dados os anticorpos de neutralização preexistentes e outra resposta imune individual contra certos tipos de AAV dentre a população de paciente. Também proveria mais opções se uma administração subsequente ao mesmo olho ou uma administração ao olho contralateral do mesmo indivíduo for dese- jada.
[359] Métodos para produzir vetores de administração viral, inclu- indo produção usando sistema livre de auxiliar, são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, PCT/US2007/010055; Patente No: 6458587, Patente No: US 6428988 B1). Produção de vários vetores usados em terapia genética, incluindo, sem limitação, vetores de AAV, adenovírus, lentivírus e retrovírus, está também comercialmente dis- ponível através de organizações de pesquisa contratadas (CROs) e organizações de fabricação contratadas (CMOs), por exemplo, Vector Biolabs (Malvern, PA) e Cell Biolabs, Inc., (San Diego, CA).
[360] Em algumas modalidades, um vetor de AAV recombinante útil nos métodos descritos aqui pode ser gerado através da cultura de uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula HEK293) que contém uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína do capsídeo de sorotipo de AAV ou fragmento da mesma; um gene rep; um mini- gene compreendendo, no mínimo, repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV e uma molécula de ácido nucleico de interesse (por exemplo, tendo uma sequência de ácido nucleico de CYP4V2); e fun- ções auxiliares suficientes para permitir empacotamento do ácido nu- cleico de interesse na proteína do capsídeo de AAV. Os componentes requeridos ser culturados na célula hospedeira para empacotar um ácido nucleico em um capsídeo de AAV podem ser providos na célula hospedeira em cis ou trans. Alternativamente, qualquer um ou mais dos componentes requeridos (por exemplo, molécula de ácido nucleico de interesse, sequências rep, sequências cap e/ou funções auxiliares) pode ser provido por uma célula hospedeira estável que foi engenhei- rada para conter um ou mais dos componentes requeridos. Qualquer um desses componentes pode ser selecionado dentre qualquer soroti- po adequado. Por exemplo, vetores de rAAV são gerados através de cotransfecção de células produtoras (por exemplo, células HEK 293) com (a) um plasmídeo (cis-plasmídeo de AAV) contendo um genoma de AAV recombinante clonado composto do gene de interesse (por exemplo, um cDNA codificando CYP4V2) e outras sequências regula- doras desejadas flanqueadas por duas ITRs de AAV, (b) um construto separado expressando em trans os genes Rep e Cap virais. (c) os fa- tores auxiliares de adenovírus, que são providos ou por infecção de adenovírus ou transfecção em células produtoras de um terceiro plas- mídeo que provê esses fatores auxiliares de adenovírus. Em adição a células HEK293, outras linhagens celulares podem ser usadas na pro- dução de vetores de rAAV, incluindo, sem limitação, células HeLa, Ve- ro, A549, B50, WI38 e BHK.
[361] Em algumas modalidades, o vetor de administração viral é um vírus de rAAV2, um vírus de rAAV2/5, um vírus de rAAV2/8, um vírus de rAAV2/1, um vírus de rAAV2/4, um vírus de rAAV2/6, um vírus de rAAV2/9, um vírus de rAAV2/12 ou um vírus de rAAV com elemen- tos do capsídeo de um ou mais de vírus de AAV1, AAV2, AAV5, AAV8, AAV9 e/ou AAV12. Em uma modalidade, o vetor de administração viral é vírus de rAAV com uma ou mais mutações Y-F, incluindo, sem limi- tação, AAV2 (Y444F+Y500F+Y730F) ou AAV8 (Y733F).
[362] Em algumas modalidades, o vetor de administração viral é um vírus de rAAV de filamento único (ssAAV). Em algumas modalida- des, o vetor de administração viral é um vírus de rAAV autocomple-
mentar (scAAV).
[363] Em adição a vetores de AAV, outros vetores virais podem ser usados em terapia genética com CYP4V2. Por exemplo, vetores adenovirais foram também demonstrados ser úteis para administração de gene. Por exemplo, Mori e outros, 2002. IOVS, 43:1610-1615 reve- lam o uso de um vetor adenoviral que é um Ad tipo 5 com E-1 deleta- do, E-3 parcialmente deletado em que o transgene (proteína verde flu- orescente) é dirigido por um promotor CMV. Níveis de expressão de pico foram demonstrados quando da injeção de 10^7 a 10^8 partículas virais, com injeção sub-retinal provendo níveis maiores de expressão do que injeção intravítrea.
[364] Em algumas modalidades, o vetor de administração é um plasmídeo contendo uma molécula de ácido nucleico codificando a proteína CYP4V2 humana ou uma variante ou fragmento funcional da mesma.
[365] Vetores não virais podem ser também usados em terapia genética com CYP4V2. Exemplos de vetores não virais incluem, sem limitação, ácidos nucleicos nus, dendrímeros, lipossomos (por exem- plo, lipossomos catiônicos ou aniônicos), polímeros (por exemplo, poli- plexos), sistemas de lipídeo-polímero e nanopartículas (por exemplo, nanopartículas inorgânicas ou sintetizadas). Por exemplo, transferên- cia de gene ocular não viral eficiente foi demonstrada por Farjo e ou- tros, 2006, PLoS 1:e38, que usaram nanopartículas de DNA compac- tadas como um sistema para transferência de gene não viral para teci- dos oculares. Como uma prova de conceito, o construto de expressão pZEEGFP5.1 (5,147 pb) que codifica o cDNA da proteína verde fluo- rescente (GFP) melhorada transcripcionalmente controlada pelo pro- motor imediato-precoce CMV e potenciador foi usado. Nanopartículas de DNA foram formuladas misturando DNA de plasmídeo com CK3OPEG10K, um peptídeo lisina de 30 mer com uma cisteína N-
terminal que é conjugada através de uma ligação maleimida a polieti- leno glicol de 10 kDa usando métodos conhecidos. Nanopartículas fo- ram concentradas até 4 mg/ml de DNA em solução salina. O DNA compactado foi administrado em uma dose de 0,6 µm à cavidade ví- trea. Expressão de GFP foi observada na lente, retina e epitélio do pigmento/coroide/esclera através de PCR e microscopia.
[366] Ainda, várias patentes foram expedidas para métodos de transferência de gene ocular incluindo, mas não limitado a, Pat. U.S. No. 7.144.870 que provê métodos de transdução adenoviral mediada por ácido hialurônico; Pat. U.S. Nos. 7.122.181 e 6.555.107 que pro- veem vetores lentivirais e seu uso para mediar administração de gene ocular; Pat. U.S. No. 6.106.826 que provê vetores virais de herpes simples e seu uso para mediar administração de gene ocular; e Pat. U.S. No. 5.770.580, que provê vetores de expressão de DNA e seu uso para mediar administração de gene ocular.
[367] Um método de avaliação e seleção de vetores adequados para uso na terapia genética com CYP4V2 de vetores diferentes é provido na seção Exemplos aqui. Os Exemplos usaram vetores de AAV diferentes para ilustrar o método. Seria compreendido que tal mé- todo pode ser também usado pelo versado na técnica para comparar e selecionar dentre tipos diferentes de vetores, por exemplo, vetores vi- rais vs. não virais, adenovírus vs. AAV, lentivírus vs. AAV, HSV vs. AAV, etc. C. Cassetes de Expressão de CYP4V2 e Sequências Reguladoras
[368] A descrição também provê um cassete de expressão com- preendendo uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteí- na CYP4V2 funcional (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 2 ou 3) e uma sequência de controle de expressão operavelmente ligada à sequência de ácido nucleico codificando CYP4V2. Em adição à molécula de ácido nucleico codificando uma proteína CYP4V2 funcional, os outros elementos-chave de um cassete de expressão usado em terapia genética com CYP4V2 incluem uma ou mais sequências reguladoras para controlar a expressão da dita molécula de ácido nucleico. Em algumas modalidades, o cassete de expressão é empacotado em um vetor de administração (por exemplo, em um vetor de rAAV flanqueado pelas ITRs de AAV) para eficiência de administração, transdução e/ou expressão aumentada. Quaisquer ITRs de AAV podem ser usadas nos métodos descritos aqui. Os veto- res de ssAAV descritos nos presentes Exemplos contêm duas ITRs de AAV2 de cerca de 141 pb cada uma (sequências exemplares mostra- das em SEQ ID NO: 40). O vetor de scAAV descrito nos Exemplos contém duas ITRs de AAV2, uma das quais é truncada (sequências exemplares mostradas em SEQ ID NO: 41). Uma ITR de AAV2 geral- mente tem um comprimento de cerca de 132 a cerca de 167 pb de- pendendo do vetor parental sendo usado.
[369] Como aqui usado, o termo “sequência reguladora” refere-se a qualquer elemento genético (por exemplo, sequência de polinucleo- tídeo) que pode exercer um efeito regulador sobre replicação ou ex- pressão (transcrição ou tradução) da sequência de ácido nucleico, ou de outro modo direciona, influencia e/ou regula expressão da sequên- cia de ácido nucleico. Sequências de controle de expressão comuns incluem promotores, sinais de poliadenilação (poliA), potenciadores, domínios reguladores a montante, íntrons, UTRs, elementos de res- posta ou elementos induzíveis, origens de replicação, sítios de entrada de ribossomo internos (IRES), sequências de início de transcrição, se- quências de terminação, sequências de processamento de RNA tais como sequências de união e poliadenilação (poliA), sequências que estabilizam mRNA citoplásmico, sequências que aumentam a eficiên- cia de tradução (isto é, sequência de consenso Kozak), sequências que aumentam a estabilidade da proteína ou sequências que aumen-
tam a secreção da proteína codificada. Sequências reguladoras po- dem ser de origem bacteriana, de levedura, inseto, mamífero ou viral ou podem ser derivados, híbridos ou variantes das mesmas ou podem ser sintéticas, e vetores podem conter uma combinação de sequências reguladoras de origens diferentes. Por exemplo, sequências regulado- ras podem ser heterólogas (por exemplo, de origem diferente de ou de um gene diferente; por exemplo, de um gene não-CYP4V2) ou homó- logas (por exemplo, do mesmo gene; por exemplo, de um gene CYP4V2) com relação à sequência de codificação cuja expressão eles estão regulando (por exemplo, um gene CYP4V2). Como aqui usado, “operavelmente ligado” significa que um promotor e/ou outra(s) se- quência(s) reguladora(s) são posicionados em relação a uma sequên- cia de codificação de ácido nucleico de tal maneira a direcionar, influ- enciar ou regular expressão da sequência de codificação de ácido nu- cleico. Uma sequência reguladora pode ser “operavelmente ligada” com uma sequência de codificação de ácido nucleico no mesmo vetor ou em um vetor diferente. Uma ou mais sequências reguladoras ope- ravelmente ligadas a uma sequência de codificação de ácido nucleico podem ser contíguas e/ou podem agir em trans ou em uma distância para direcionar, influenciar ou regular expressão da sequência de codi- ficação de ácido nucleico. Dentre as sequências reguladoras, um pro- motor é essencial, enquanto outras sequências reguladoras tais como potenciadores, íntrons e terminadores podem ser benéficas, mas são opcionais.
[370] Várias sequências promotoras podem ser usadas para di- recionar a expressão de uma sequência de codificação de ácido nu- cleico. Alguns promotores são promotores constitutivos, que direcio- nam expressão em virtualmente todos os tecidos e na maioria dos ti- pos de célula. Enquanto outros promotores são mais controlados. Promotores regulados agiriam apenas em certos tecidos ou células
(isto é, promotores específicos de tecido ou célula) ou em certos mo- mentos em desenvolvimento (isto é, promotores específicos de estágio de desenvolvimento) e/ou podem ser condicionados para condições ambientais ou estímulos externos tais como químico, níveis de oxigê- nio, calor ou luz (isto é, promotores induzíveis).
[371] Em alguns casos, pode ser desejável usar um promotor constitutivo (ou ubíquo). Promotores constitutivos exemplares incluem, sem limitação, o promotor citomegalovírus (CMV) (Gray e outros, Hum Gene Ther. 2011 Sep; 22(9): 1143–1153; Norman e outros, PLoS ONE 5(8): e12413, Ag 2010), o promotor β-actina da galinha, o promotor CAG híbrido (tcc CAGGS, CBA ou CB) derivado de CMV/beta-actina da galinha/beta-globina do coelho (Miyazaki J, Takaki S, Araki K, Tas- hiro F, Tominaga A, Takatsu K, Yamamura K. 1989. Sistema de vetor de expressão baseado no promotor β-actina da galinha direciona pro- dução eficiente de interleucina-5. Gene 79: 269–277; Acland, G. M. e outros MoI Then, 2005, 12:1072-1082), o promotor CBA pequeno (smCBA) (~953 pbs, vide, Mah, e outros 2003, Hum. Gene Ther. 14:143-152; Haire, e outros 2006 IOVS, 2006, 47:3745-3753), o pro- motor CBh (~800 pbs, vide, Gray e outros, Hum Gene Ther. 2011 Set; 22(9): 1143–1153), o promotor β-actina humano (ACTB) (Norman e outros, PLoS ONE 5(8): e12413, Ag 2010), o promotor fator 1 alfa de alongamento (EF-1 alfa) (vide, Gill e outros, Gene Ther. 2001;8(20):1539–1546; Norman e outros, PLoS ONE 5(8): e12413, Ag 2010), o promotor fosfoglicerato cinase (PGK, humano ou camundon- go) (Norman e outros, PLoS ONE 5(8): e12413, Ag 2010), o promotor Ubiquitina C (UBC) (Norman e outros, PLoS ONE 5(8): e12413, Ag 2010), o promotor GUSB (Glucuronidase Beta), o promotor mínimo GUSB (hGBp) (Husain, Gene Therapy (2009) 16, 927–932), o promo- tor UCOE, o promotor fator de alongamento 1α curto (EFS), o promo- tor vírus Símio 40 (SV40). O promotor vírus sarcoma Rous (RSV). Vi-
de, por exemplo, Powell, Discov Med. 2015 Jan; 19(102): 49–57, para uma comparação geral e discussão de vários promotores. Deve ser compreendido que em alguns casos promotores “constitutivos” ou “ubíquos” podem ser propensos a silenciamento ou promover resistên- cia de expressão diferencial em tipos de célula selecionados, vide, por exemplo, McCown e outros, Brain Res. 1996;713(1–2):99–107; Gray e outros, Hum Gene Ther. 2011;22:1143–1153.
[372] Em alguns casos, é desejável usar um promotor específico de célula ou específico de tecido, que direcione a expressão de uma sequência de codificação de ácido nucleico em um tipo particular de célula ou tecido. Com base na presente descrição, seria compreendido que um promotor específico de célula ou um específico de tecido pode ser específico para uma célula ou tecido ocular ou para linfócitos. Ti- pos de células oculares incluem, sem limitação, células retinais, célu- las bipolares da retina, células fotorreceptoras, células bastão e célu- las cone, células de gânglio, células do epitélio pigmentar da retina (RPE), células da coroide ou células do epitélio da córnea. Desta ma- neira, um promotor específico de célula como aqui descrito pode ser um promotor específico da retina (por exemplo, específico de RPE, especifico de receptor (por exemplo, específico de cone e/ou específi- co de bastão) e/ou específico da coroide) ou um promotor específico da córnea. Promotores específicos de célula ocular exemplares inclu- em, sem limitação, a proteína cinase receptora acoplada à proteína G humana 1 tcc promotor rodopsina cinase 1 (GRK1) (Número de Aces- so Genbank AY327580), um fragmento de 292 nt (posições 1793- 2087) do promotor GRK1 (vide Beltran e outros, Gene Therapy 17:1162-74, 2010), o promotor proximal proteína de ligação a retinoide interfotorreceptora humana (IRBP), um fragmento de 235 nt do promo- tor hIRBP, o promotor proximal RPGR, o promotor opsina vermelho, o promotor opsina vermelho-verde, o promotor opsina azul, o promotor opsina de camundongo (ambas as versões longa e curta, Le e outros, Molecular Vision 2006; 12:389-398; Beltran e outros, Gene Therapy 17: 1 162-74, 2010), o promotor rodopsina (Rho) (Mussolino e outros, Gene Therapy, 18:637-45, 2011); a subunidade alfa da transducina cone (Morrissey e outros, BMC Dev, Biol, 11:3, 2011); promotor beta fosfodiesterase (PDE); promotor retinite pigmentosa (RP1) (Nicord e outros, J. Gene Vied. 9: 1015-23, 2007), o promotor NXNL2/NXNL1 (Lambard e outros, PLoS One, 5:el3025, 2010), o promotor RPE65 (Li e outros, Investigative Ophthalmology & Visual Science, Dezembro 2002, Vol.43, 3640); o promotor degeneração retinal lenta/periferina 2 (Rds/perphZ) (Cai e outros, Exp Eye Res, 91: 186-94, 2010), o promo- tor VMD2 (distrofia macular viteliforme 2; tcc BEST1, Kachi e outros, Human Gene Therapy, 20:31-9, 2009), o promotor IRBP/GNAT2 (po- tenciador hIRBP fundido a promotor alfa da transducina cone), o pro- motor Rds (degeneração retinal lenta), o promotor hPDE6b ou o pro- motor VEcad (promotor VE-caderina/Caderina 5 (CDH5)/CD144). Se- ria compreendido que outros promotores que são conhecidos na técni- ca podem ser usados no lugar de, ou em adição a, qualquer um dos promotores exemplares providos aqui com base no raciocínio e dis- cussões providos aqui.
[373] Promotores induzíveis exemplares incluem, sem limitação, um promotor sensível a cálcio (por exemplo, um promotor NFAT, vide Gene Ther. 2013, Mar;20(3):248-54), o promotor metalotionina de car- neiro induzível por zinco (MX), o promotor vírus do tumor mamário de camundongo (MMTV) induzível por dexametasona (Dex), o sistema do promotor polimerase T7; o promotor de inseto acdisona, o sistema re- pressível de tetraciclina, o sistema induzível por tetraciclina, o sistema induzível por RU486, o sistema induzível por rapamicina, vários pro- motores induzíveis comerciais disponíveis e promotores induzíveis re- gulados por um estado fisiológico específico, por exemplo, temperatu-
ra, fase aguda, um estado de diferenciação particular da célula ou em células em replicação apenas. Em algumas modalidades, o promotor induzível é um que firmemente regulado e específico para um tipo de célula ocular particular.
[374] Um promotor pode ser um híbrido de ou versão trunca- da/encurtada ou modificada de ou de outra maneira derivado de um outro promotor e/ou uma outra sequência reguladora, por exemplo, o promotor CAG é um híbrido de potenciador precoce imediato de CMV, promotor beta-actina da galinha e gene beta-globina de coelho, o pro- motor smCBA é uma versão truncada do promotor CBA. Um promotor pode conter outros elementos, por exemplo, um íntron, éxon e/ou um potenciador, por exemplo, o promotor CAG. Mais de um promotor po- de ser usado junto em um cassete de expressão.
[375] Em alguns casos, pode ser desejável usar uma sequência potenciadora a fim de aumentar e/ou estabilizar expressão acima da- quela que ocorre devido ao promotor. Sequências potenciadoras re- presentativas incluem, sem limitação, um elemento regulador pós- transcripcional (por exemplo, um elemento regulador pós- transcripcional do vírus da hepatite woodchuck (tcc WPRE) ou um elemento regulador pós-transcripcional do Vírus da Hepatite B (tcc HPRE ou HBVPRE, Donello e outros, J Virol. 1998 Jun;72(6):5085-92; Sun e outros, DNA Cell Biol. 2009 Maio; 28(5): 233–240), ou vários WPREs encurtados, mutantes ou modificados, por exemplo, um WPRE encurtado de ~247 pbs contendo elementos gama e alfa míni- mos do WPRE (Choi e outros, Mol Brain. 2014; 7: 17; Donello e outros, J Virol. 1998 Jun; 72(6): 5085–5092; Zanta-Boussif e outros, Gene Therapy (2009) 16, 605–619) ou o potenciador 1RBP (Nicord e outros, J. Gene Vied. 9: 1015-23, 2007), um potenciador elemento de trans- porte constitutivo (CTE) (por exemplo, CTE do Vírus do Macaco Ma- son-Pfizer ou CTE do Vírus da Leucemia Aviária), o potenciador pre-
coce imediato de citomegalovírus (CMV), um derivado de um potenci- ador do gene da imunoglobulina ou SV40 ou o elemento de ação cis identificado no promotor proximal de camundongo, uma sequência re- guladora de íntron, por exemplo, um doador de união/aceitador de uni- ão de mini-íntron referido como SD-AS derivado de SV-40, um sítio de entrada de ribossomo interno (IRES), que pode ser usado para produ- zir mais de um polipeptídeo a partir de um transcrito de gene único, por exemplo, uma proteína que contém mais de uma cadeia de poli- peptídeo, ou duas proteínas diferentes, pode ser uma sequência de entrada de ribossomo interna de poliovírus, que apoia expressão de transgene em RPE, fotorreceptores e células de gânglio.
[376] A poliadenilação de um transcrito é importante para expor- tação nuclear, tradução e estabilidade de mRNA. Desta maneira, a efi- ciência de poliadenilação de transcrito é importante para expressão de transgene. Sequências de sinal de PoliA representativas incluem, sem limitação, um sinal de poliA de SV40, um sinal de poliA tardio de SV40, um sinal de poliA precoce de SV40, um sinal de poliadenilação de hormônio do crescimento bovino (poliA bGH), um poliA pequeno ou um sinal de poliadenilação de hormônio do crescimento humano (poliA hGH). Em alguns casos, uma sequência potenciadora a montante (USE) pode ser usada para aumentar a eficiência de um sinal de poliA, por exemplo, 2xUSE de SV40 tardio, USE de HIV-1 (vírus da imunode- ficiência humana 1), USE de GHV (Vírus da hepatite dos esquilos), USE de adenovírus (L3) (Adenovírus), USE de hTGBH (Pró-trombina humana) ou USE de hC2 (Gene do complemento C2 humano) (Schambach A, Galla M, Maetzig T, Loew R, Baum C. Improving trans- criptional termination of self-inactivating gamma-retroviral and lentiviral vectors. Mol Ther. 2007;15(6):1167–1173).
[377] Da mesma maneira que sequências promotoras, as outras sequências reguladoras usadas em um cassete de expressão podem ser um híbrido de, encurtadas/truncadas, modificadas ou de outro mo- do versões derivadas de uma sequência reguladora. Por exemplo, o WPRE encurtado, o 2xUSE de SV40 tardio, o poliA de SV40 tardio. Em adição aos elementos descritos aqui, um cassete de expressão pode conter também outras sequências reguladoras, por exemplo, ín- trons, UTRs e sequências similares. A inclusão de um sítio de união (isto é, éxon flanqueado por dois íntrons) foi demonstrada ser útil para aumentar a expressão de gene de proteínas de cassetes de expres- são.
[378] É conhecido na técnica que é comum para uma sequência reguladora ou uma sequência reguladora híbrida ter múltiplas versões e ter mais de um nome. Por exemplo, vários promotores, potenciado- res e sinais de poliA têm múltiplas versões, incluindo, sem limitação, o promotor CMV, promotor EF1α, o potenciador WPRE e o sinal de poliA de SV40. O promotor CAG tem nomes alternativos múltiplos incluindo, sem limitação, o promotor CBA, promotor CB ou promotor CAGGS. Ainda, é também conhecido na técnica que uma sequência reguladora pode ser encurtada, modificada ou combinada com outras sequências para gerar um derivado ou variante, por exemplo, o promotor CAG (tcc CBA, CB ou CAGGS) é um híbrido de potenciador precoce imediato de CMV, promotor beta-actina de galinha e gene beta-globina do coe- lho, o promotor smCBA é um promotor CAG truncado. O promotor CBSB é um promotor CAG encurtado, diferindo em cerca de 152 pb na extremidade 5’ do potenciador precoce imediato CMV. Ainda, uma se- quência reguladora pode ser chamada diferentemente, por exemplo, um elemento regulador pós-transcripcional tal como HPRE ou WPRE pode ser também referido como um potenciador. Quaisquer sequên- cias reguladoras descritas aqui compreendem todas as variações, de- rivados e/ou híbridos de tal sequência reguladora. Qualquer sequência exemplar provida aqui com relação a uma sequência reguladora é exemplar em natureza e não limita a definição ou escopo de tal se- quência reguladora ao mostrado na sequência exemplar.
[379] Em algumas modalidades, técnica de microRNA (miRNA) pode ser usada no projeto de cassete de expressão para obter especi- ficidade de expressão direcionada, por exemplo, através de repressão de expressão de transgene fora do alvo. Apenas a título de exemplo e não limitação, uma sequência-alvo para miR191 (um miRNA mostrado ser expresso exclusivamente em células de gânglio e retina interna) pode ser adicionada imediatamente a jusante de cDNA de CYP4V2 para inibir síntese de expressão de proteína CYP4V2 mediada por cassete em células de gânglio e células retinais internas. Similarmen- te, uma sequência-alvo para um miRNA que é exclusivamente expres- so em certos tipos de célula pode ser usada para reprimir expressão de proteína CYP4V2 mediada por cassete nesses tipos de células pa- ra obter expressão específica de tecido ou célula direcionada. D. Projeto de Cassetes de Expressão e Vetores de Administração Efi- cientes para Terapia genética com CYP4V2
[380] Uma discussão detalhada sobre o método de projeto de cassete de expressão e vetor de administração de CYP4V2 e vários projetos para esses estudos são providos na seção Exemplos aqui. Uso de promotor EFS e/ou Sinal de PoliA pequeno (SPA) em trata- mento de uma doença ocular
[381] Como discutido aqui, um vetor de administração de gene tem um limite de tamanho de empacotamento. Por exemplo, vetores de AAV de filamento único têm um limite de empacotamento de cerca de 4,7-5,0 kb, com a ultrapassagem do mesmo a eficiência de trans- dução e expressão cairia significantemente. Para AAVs autocomple- mentares (scAAVs), o limite de empacotamento é dividido pela metade para cerca de 2,4-2,5 kb. Desta maneira, o tamanho não importa para administração de gene mediada por vetor e terapia genética. Para ve-
tores autocomplementares de filamento duplo, é desejável e algumas vezes crítico usar sequências reguladoras de tamanho pequeno para fazer tamanho suficiente para o transgene (por exemplo, cDNA). Devi- do a esta limitação em tamanho, promotores grandes não são também adequados para uso com scAAV. Para terapia genética com CYP4V2, dado o tamanho do cDNA que é cerca de 1578 pb e as ITRs de AAV (com mutação) são cerca de 258 pb, há apenas cerca de 500-600 pb restantes para as sequências reguladoras. Devido ao fato de CYP4V2 ser quase que ubiquamente expresso, em algumas modalidades, é desejável usar um promotor constitutivo para direcionar a expressão de transgene de CYP4V2. No entanto, não há espaço para o promotor CAG constitutivo que a requerente usou no projeto de AAV de filamen- to único que é de cerca de 1,7 kb, ou para o promotor CBA encurtado (smCBA) que é de cerca de 953 pb ou para promotor CBh que é de cerca de 800 pb, nem para muitos outros promotores constitutivos tal como o promotor CMV que é de cerca de 600 pb. Ao invés, um promo- tor EFS de comprimento curto pode ser usado (sequência exemplar mostrada na SEQ ID NO: 34) para o projeto de scAAV. A mesma limi- tação de tamanho se aplica a outras sequências reguladoras, por exemplo, sinal de poliA. Um poliA de bGH é cerca de 225 pb, um poliA de SV40 é de cerca de 240 pb e um poliA de SV40 tardio é de cerca de 120 pb. Qualquer um deles tomaria uma porção grande do compri- mento de ~500 pb deixado para sequências reguladoras incluindo o promotor. Desta maneira, um sinal de poliA pequeno (SPA) foi usado, que é de cerca de apenas 54 pb (sequências exemplares mostradas em SEQ ID NO: 35) para o projeto de scAAV.
[382] O projeto usando um promotor EFS e um SPA ocupa ape- nas cerca de 300 pbs e junto com as ITRs de AAV ocupa um total de cerca de 600 pbs, desta maneira deixando espaço de empacotamento restante de cerca de 1,8-1,9 kb para o sequenciamento de ácido nu-
cleico codificando a proteína desejada e quaisquer outras sequências em um cassete de expressão projetado para um scAAV, e deixando espaço de empacotamento restante de cerca de 4,1-4,4 kb para o se- quenciamento de ácido nucleico codificando a proteína desejada e quaisquer outras sequências em um cassete de expresso projetado para um ssAAV. Como resultado, cDNAs de tamanho maior e/ou ou- tras sequências podem ser empacotados em um vetor de rAAV com o promotor EFS e o SPA, comparado com o uso de promotores maiores e sequências de sinal de poliA, incluindo, sem limitação, promotor CMV, promotor CAG, promotor smCBA, promotor CBh, promotor EF1 alfa, poliA bGH, poliA de SV40 e poliA de SV40 tardio.
[383] Um esquema do cassete de expressão compreendendo o promotor EFS e o SPA é provido na Figura 4b. O construto mostrado na Figura 7b inclui um cDNA de CYP4V2. O cDNA de CYP4V2 pode ser substituído por um outro gene de interesse para o cassete de ex- pressão para ser usado para outra expressão de transgene.
[384] O uso do promotor EFS e do SPA em um cassete de ex- pressão e um vetor de administração para direcionar uma sequência de codificação de ácido para tratar uma doença ocular foi testado nes- te estudo. Um vetor de scAAV2/1 contendo o promotor EFS, um cDNA de CYP4V2 e o SPAM chamado o scAAV1.EFS.CYP4V2op.SPA, foi gerado. O scAAV1.EFS.CYP4V2op.SPA foi aplicado nas células iPS- RPE de paciente com BCD. O scAAV1.EFS.CYP4V2op.SPA mostrou ação rápida e robusta em células iPS-RPE de paciente com BCD em apenas 4 dias apesar dos comprimentos curtos do promotor EFS e do SPA (vide Tabela 3). Ele demonstra que o promotor EFS e/ou SPA são sequências reguladoras de tamanho pequeno que são muito úteis em um sistema de scAAV para terapia genética ocular. Ainda, a ex- pressão robusta de vetores de scAAV faz o projeto de scAAv também adequado para outras vias de administração (por exemplo, administra-
ção intravítrea) em adição à administração sub-retinal.
[385] O uso do promotor EFS e/ou SPA não é limitado à terapia genética com CYP4V2 ou em um construto de scAAV. Eles podem ser usados para terapia genética envolvendo outros genes, onde o tama- nho do transgene e/ou um projeto de scAAV requer o uso de promotor e sinal de poliA de comprimento curto para direcionar expressão de proteína rápida e suficiente. E. Opções de Tratamento, Seleção de Indivíduo e Administração
[386] Terapia genética com CYP4V2 pode ser aplicada de múlti- plas maneiras. Em alguns casos, o tratamento pode ser aplicado in vivo a um indivíduo (por exemplo, um paciente com BCD) através de uma administração eficaz dos vetores de administração contendo o cassete de expressão de CYP4V2 às células, tecidos ou órgãos dire- cionados para tratamento, por exemplo, RPE, fotorreceptores, coroide, córnea, linfócitos, a retina ou o olho, do indivíduo. Em alguns casos, o tratamento pode ser aplicado in vitro nas células direcionadas (por exemplo, células iPS-RPE do paciente, células iPS-fotorreceptoras do paciente, células iPS-progenitoras fotorreceptoras, iPS-CEC, linfóci- tos). Então as células tratadas podem ser transplantadas para um indi- víduo com necessidade (por exemplo, um paciente com BCD). Em al- guns casos, o tratamento pode ser aplicado combinando ambas as abordagens in vivo e in vitro. Em alguns casos, terapia genética com CYP4V2 pode ser usada independentemente. Em alguns casos, tera- pia genética com CYP4V2 pode ser usada com uma outra opção de tratamento.
[387] Indivíduos que são candidatos para os presentes métodos de tratamento incluem aqueles que são diagnosticados com BCD. In- divíduos sofrendo de outras condições oftalmológicas clinicamente de- finidas (por exemplo, degeneração retinal herdada (IRD), retinite pig- mentosa (RP) ou distrofia da córnea) causada por mutações no gene
CYP4V2 podem ser também tratados usando os métodos descritos aqui. Um diagnóstico de BCD, IRD, RP, distrofia da córnea ou uma outra condição oftalmológica causada por mutações no gene CYP4V2 pode ser feito usando métodos conhecidos na técnica. Os métodos descritos aqui podem incluir identificação de um indivíduo, por exem- plo, uma criança, adolescente ou indivíduo adulto, que tem BCD ou uma outra condição oftalmológica causada por mutações no gene CYP4V2, ou que é suspeito de ter BCD ou uma outra condição oftal- mológica causada por mutações no gene CYP4V2 (por exemplo, com base na presença de sintomas da condição e nenhuma outra causa óbvia), e obtenção de uma amostra compreendendo DNA genômico do indivíduo, detectando a presença de mutações no gene CYP4V2 usando métodos biológicos moleculares conhecidos.
[388] Várias mutações foram identificadas no gene CYP4V2 e causando BCD, com pelo menos uma mutação em cada um dos 11 éxons do gene. Análise de genótipo mostrou que a mutação de CYP4V2 mais comum dentre pacientes com BCD é c.802- 8_810del17insGC (com referência a uma deleção na base 17 com du- as bases (GC) inseridas no lugar começando 8 bases a partir da ex- tremidade de íntron 6 de gene GYP4V2, também referido como IVS6- 8del/insGC; esta mutação de inserção-deleção está na junção do ín- tron 6-éxon 7 e a deleção de 17 pb inclui o sítio aceitador de união de éxon 7, levando a uma deleção em estrutura do éxon 7 de codificação de 62 aminoácidos) resultando no salto do éxon 7. (Xiao e outros, Bio- chem Biophys Res Commun. 409:181-6, 2011; Meng e outros, 2014, Mol. Vis., 20:1806-14; Wada e outros, Am J Ophthalmol. 139:894-9, 2005; Jiao e outros, European Journal of Human Genetics (2017) 25, 461-471). Vários tipos de mutações foram encontrados em mutações de CYP4V2 associadas com BCD, incluindo, mas não limitado a, errô- nea, sítio de união, mudança de estrutura, deleção, inserção, indel,
sem sentido, polimorfismos (por exemplo, polimorfismos de nucleotí- deo único) e término prematuro. Um sumário de mutações de CYP4V2 para seleção dentre pacientes com BCD humanos é provido na Tabela 1 e pode ser encontrado em várias publicações e bancos de dados online, por exemplo, LOVD (databases.lovd.nl/shared/genes/CYP4V2 na World Wide Web), OMIM (omim.org/allelicVariant/608614 na World Wide Web) e ClinVar (ncbi.nlm.nih.gov/clinvar?term=608614[MIM] na World Wide Web).
[389] Deve ser notado que as mutações de CYP4V2 humanas na Tabela 1 não são exaustivas. Mais mutações de CYP4V2 podem ser identificadas no futuro. Deve ser compreendido que nem todas as va- riações para a sequência de referência são mutações. Algumas varia- ções são não patológicas. Métodos para confirmar se uma variação genética é patológica, isto é, uma mutação, são conhecidos na técni- ca, incluindo, mas não limitado a, comparação da variação com muta- ções anteriormente clinicamente identificadas conhecidas e/ou deter- minação de se uma alteração correspondente em função existe. Por exemplo, um método para determinar se uma variação genética é uma variação patológica (isto é, uma mutação) é testar as funções bioquí- micas da linhagem celular iPS-RPE derivada do indivíduo como des- crito aqui e avaliar se existem quaisquer anormalidades comparado com aquelas de linhagem celular iPS-RPE de controle saudável.
[390] Pacientes com BCD ou uma outra condição oftalmológica devido a mutações de CYP4V2 que podem ser tratados usando um método descrito aqui preferivelmente retêm alguns fotorreceptores e função visual, por exemplo, conforme medido através de acuidade vi- sual, campo visual, função visual e/ou Tomografia de Coerência Óptica (OCT, por exemplo, Domínio Espectral-OCT (SD-OCT)).
[391] Antes da administração, o produto final sofrerá uma série de etapas (por exemplo, ultrapurificação) para satisfazer critérios de grau clínico. Produções de grau clínico estão comercialmente disponí- veis através de várias instalações GMP, incluindo, sem limitação, as instalações no NIH Gene Therapy Resource Program (GTRP) e orga- nizações de fabricação contratadas (CMOs).
[392] Antes da administração, o indivíduo pode testar para anti- corpos de neutralização preexistentes (NAb) contra o tipo de vetor de AAV que o indivíduo está para receber a administração. Em uma mo- dalidade, se o indivíduo tem NAb preexistente contra tal tipo de AAV, um vetor de AAV alternativo com reatividade cruzada baixa para o NAb preexistente do indivíduo ou um vetor de AAV com estrutura do capsídeo modificada pode ser usado para administração a tal indivíduo para diminuir as reações imunes e reter eficiência de transdução sufi- ciente pelo vetor de AAV. Outros métodos para minimizar resposta imune são conhecidos na técnica, incluindo, sem limitação, aplicação de agentes e protocolos de imunossupressão antes, durante e/ou pós- tratamento.
[393] Vetores virais ou não virais, ou combinações dos mesmos (por exemplo, vetores híbridos), podem ser administrados a células oculares de um indivíduo usando um ou mais meios físicos. Outras células como aqui usado se refere a, sem limitação, células do epitélio pigmentar da retina (RPE), células fotorreceptoras, células epiteliais da córnea, células da retina, células bipolares da retina, células bastão, células cone, células de gânglio, células coroidais e/ou células da len- te. Em adição a, ou alternativamente, vetores podem ser administra- dos a células ao redor ou vizinhas ou células que podem entrar em contato com as células direcionadas, incluindo, sem limitação, células no cérebro ou células no nervo óptico ou células sanguíneas.
[394] Tratamento in vitro pode usar qualquer método ou uma combinação de métodos e/ou agentes que eficazmente administrem um vetor à célula direcionada para tratamento (por exemplo, uma célu-
la iPS-RPE de um paciente com BCD). Tratamento in vitro pode ser feito através de uma ou mais de uma rodada de infecções. Em alguns casos, os vetores são aplicados em células culturadas diretamente pa- ra transfectar ou transduzir as células. Em alguns casos, outros méto- dos de administração e/ou melhora da eficiência de transfec- ção/transdução em células podem ser usados, incluindo, sem limita- ção, transfecções/transduções múltiplas, eletroporação, magnetofec- ção ou sonoporação. Métodos e agentes usados na infecção/trans- fecção de uma célula com um vetor ou um cassete de expressão são conhecidos na técnica, incluindo, sem limitação, como descrito na se- ção Exemplos aqui.
[395] As células tratadas in vitro podem então ser transplantadas para o olho do indivíduo. Por exemplo, as células iPS-RPE genetica- mente reparadas de um paciente com BCD podem ser transplantadas para o paciente através de injeção sub-retinal. Métodos, agentes e dispositivos usados em transplante de célula para o olho são conheci- dos na técnica, vide, por exemplo, Wert e outros, J Vis Exp. 2012; (69): 4286; WO 2016/179496; Schwartz e outros, Investigative Ophthalmo- logy & Visual Science Abril 2016, Vol.57, ORSFc1-ORSFc9.
[396] Para tratamento in vivo, o vetor e/ou cassete de expressão pode(m) ser administrado(s) às células direcionadas para tratamento in vivo (por exemplo, através de administração ao olho de um indivíduo com necessidade de tratamento para administração às células direcio- nadas para tratamento). Métodos de administração de uma molécula de ácido nucleico, um cassete de expressão, um vetor a uma célula ocular-alvo in vivo são conhecidos na técnica. Por exemplo, adminis- tração ao olho pode usar qualquer método (ou uma combinação de métodos e/ou agentes) que eficazmente administre um vetor à retina, ao espaço sub-retinal, à coroide ou geralmente ao segmento posterior do olho, da córnea, da lente ou do vítreo, dependendo das células di-
recionadas para tratamento. Administração pode ser através de qual- quer meio adequado incluindo, sem limitação, injeção (por exemplo, injeção sub-retinal, injeção intravítrea, injeção retinal direta, injeção direta ao espaço supracoroidal posterior do olho), colírios e pode ser aplicada em combinação com outras técnicas de administração (por exemplo, administração eletricamente assistida ao epitélio da córnea). Um ácido nucleico de CYP4V2, cassete de expressão e/ou vetor de administração também pode ser introduzido em células usando, por exemplo, bombardeamento de partículas de DNA (por exemplo, por uma pistola de gene), transferência de gene hidrodinâmica, colírios, eletroporação, magnetofecção ou sonoporação. Métodos e técnicas de administração ao olho são conhecidos no campo. Apenas a título de exemplo vide, sem limitação, Wert e outros, J Vis Exp. 2012; (69): 4286; WO 2016/179496; Mohan e outros, Prog Retin Eye Res. 2012 Jan; 31(1): 43–64.
[397] Em adição à administração convencional a células de RPE usando injeção sub-retinal, um aspecto dos métodos discutidos aqui é administração intravítrea da molécula de ácido nucleico (por exemplo, tendo uma sequência de ácido nucleico de CYP4V2 não mutante) para tratamento ou prevenção de uma doença do olho. Alguns vetores (por exemplo, AAV2 (quadY-F+T-V) e AAV 7m8) mostram promessa parti- cular para transdução eficiente na retina através de administração in- travítrea. Ainda, AAVs ou outros vetores virais podem ser modificados por meio de técnicas conhecidas no campo incluindo, por exemplo, “evolução dirigida” ou “projeto racional” para melhorar ou otimizar sua adequabilidade como vetores para administração de gene a um ou mais tipos de células ou tecidos (por exemplo, injeção intravítrea) que não através da injeção sub-retinal convencional. Vetores de scAAV podem ser também usados em administração intravítrea em adição à administração sub-retinal devido seu perfil de expressão imediato e robusto. Devido ao fato de CYP4V2 ser quase ubiquamente distribuído com expressão particularmente alta na retina, alterações genéticas e epigenéticas de CYP4V2 são particularmente adequadas para reparo através de administração intravítrea de um ou mais vetores. Métodos de terapia genética atuais geralmente requerem administração sub- retinal do vetor. Desta maneira, um dos avanços técnicos alcançados pelos materiais e métodos revelados aqui é a administração intravítrea de uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico do tipo selvagem ou não mutante ou uma sequência de ácido nucleico codificando polipeptídeos de edição genética) e/ou um polipeptídeo para tratamento e prevenção de doenças do olho associ- adas com alterações genéticas ou epigenéticas na sequência de ácido nucleico de CYP4V2.
[398] Certas técnicas e agentes podem ser usados para facilitar os processos de administração. Exemplos não limitantes incluindo o uso de um agente lubrificante de modo que aderência do vetor ao veí- culo de administração (por exemplo, uma agulha) é evitada. Ainda, o uso de fármacos imunossupressores antes, durante e/ou após o pro- cesso de administração pode aumentar a eficiência de infecção ou transdução.
[399] Um vetor pode ser formulado para administrar a células oculares de um indivíduo usando vários excipientes, diluentes e/ou carreadores farmaceuticamente e/ou fisiologicamente aceitáveis. Exemplos de excipientes, diluentes e/ou carreadores veículos adequa- dos para administração ao olho, que podem ser referidos como carre- adores farmaceuticamente aceitáveis, incluem água estéril, livre de pirógeno, e solução salina estéril, livre de pirógeno, tamponada (por exemplo, solução salina tamponada usando fosfato ou outros tampões tal como HEPES para manter pH em níveis fisiológicos apropriados), solução de cloreto de sódio isotônica, solução salina equilibrada,
emulsões (por exemplo, emulsões óleo/em água) e vários tipos de agentes umectantes. Em alguns casos, a formulação pode incluir ou- tros agentes medicinais, agentes farmacêuticos, agentes de estabiliza- ção, tampões, carreadores, adjuvantes e diluentes. Em alguns casos, a formulação pode incluir DBPS, glicerol ou Tween20 para armazena- mento a longo prazo.
[400] Métodos de determinação do meio mais eficaz de adminis- tração e dosagens terapeuticamente eficazes são conhecidos daque- les de habilidade na técnica e variarão com o vetor, sua estrutura do capsídeo, o projeto do vetor (por exemplo, ssAAV vs. scAAV), a com- posição do cassete de expressão, os níveis de expressão do vetor, o promotor, outras sequências reguladoras ou a molécula de ácido nu- cleico, o título do vetor, o tipo de célula-alvo, os níveis de expressão- alvo, o tamanho da área ou número de células direcionadas e o indiví- duo sendo tratado (por exemplo, idade, sexo, peso, estágio de desen- volvimento da doença e condição do indivíduo a ser tratado e reações imunes potenciais); a via de administração; a localização das células direcionadas para tratamento (por exemplo, retina vs. córnea); a natu- reza e nível de expressão do gene relevante em células e/ou tecido do tipo selvagem; e o regime requerido. Doses terapeuticamente eficazes podem ser determinadas e avaliadas em modelos de doença (por exemplo, modelo celular de BCD (por exemplo, linhagem celular iPS- RPE de pacientes com BCD) ou um modelo animal, e confirmadas ou refinadas por testes clínicos. Para tratamento de células in vivo, a dose é geralmente expressa como MOI e então multiplicar o MOI pelo nú- mero de células sendo tratadas. O MOI geralmente varia entre cerca de 1 x 10^3 GC a cerca de 1 x 10^6 GC por célula ou um MOI infecci- oso de cerca de 100 a cerca de 10.000 GC por célula (GC: cópias ge- nômicas, genoma de medição contendo partículas de AAV (tcc geno- ma de vetor (vg) ou partículas de genoma (gp)). Para tratamento in vivo, em adição aos fatores descritos acima, a dose real administrada pode ser também afetada pelas situações individuais específicas para cada paciente durante a administração, por exemplo, uma dose redu- zida durante a administração sub-retinal para paciente 6 no caso de Coroideremia descrito abaixo. Desta maneira, a dose terapeuticamen- te eficaz para uma administração única in vivo pode ser da ordem de a partir de cerca de 1 x 10^6 a 2 x 10^13 GC, inclusive (por exemplo, uma faixa de dose alta de cerca de 1 x 10^11 GC a cerca de 1 x 10^12 GC, uma faixa de dose média de cerca de 1 x 10^10 GC a cerca de 1 x 10^11 GC, uma faixa de dose baixa de cerca de 1 x 10^9 GC a cerca de 1 x 10^10 GC, uma faixa de dose muito baixa de cerca de 1 x 10^6 GC a cerca de 1 x 10^9 GC e uma faixa de dose muito alta de cerca de 1 x 10^12 GC a cerca de 2 x 10^13 GC), ou qualquer dose dentro dessas faixas que seja suficiente para prover o efeito desejado. Em uma modalidade, a composição é administrada em uma dose de cerca de 1 x 10^6 a 2 x 10^13 GC. Em outra modalidade, a dose administra- da in vivo é determinada multiplicando o número de células direciona- das para tratamento pelo MOI-alvo (por exemplo, 1 x 10^3 GC a cerca de 1 x 10^6 GC por célula)). O volume do agente contendo os vetores de rAAV em qualquer administração única ao olho pode variar de a partir de cerca de 1 uL (0,001 mL) a cerca de 1000 uL (1 mL).
[401] As composições como descrito aqui podem ser formuladas como uma dose única ou uma pluralidade de doses. Similarmente, administração pode ocorrer uma vez ou uma pluralidade de vezes (por exemplo, durante várias semanas, meses ou anos) e pode ser aplica- da ao mesmo olho ou ao olho contralateral. Sob circunstâncias de ad- ministrações múltiplas, os mesmos ou diferentes sorotipos de AAAV e/ou via(s) de administrações podem ser considerados. Administração pode ser também aplicada para tratar tecidos e células diferentes, por exemplo, uma administração se direcionando ao RPE e uma outra administração se direcionando à córnea.
[402] Métodos de geração de vetor viral, produção de GMP, puri- ficação, formulação e doses para uso em terapia genética (incluindo terapia genética ocular) são conhecidos daqueles de habilidade na técnica, e métodos de preparação de vetores virais podem ser realiza- dos através de qualquer número de companhias e métodos conforme demonstrado em vários estudos de terapia genética de grupos para LCA-2 abaixo. Cassetes de expressão providos aqui podem ser inseri- dos em qualquer um dos vetores virais exemplares listados abaixo. Alternativamente, vetores virais podem ser gerados com base nos exemplos providos abaixo. Vide Bainbridge e outros, 2008. N Engl J Med. 358:2231-9; Maguire e outros, 2008. N Engl J Med. 358:2240-8;; Hauswirth e outros, Hum Gene Ther. 2008 Out; 19(10): 979–990.
[403] Por exemplo, no estudo Bainbridge, o vetor tgAAG76, um vetor de vírus adenoassociado recombinante de sorotipo 2, foi usado para administração de gene. O vetor contém a sequência de codifica- ção RPE65 humana dirigida por um promotor RPE65 humano e termi- nada pelo sítio de poliadenilação de hormônio do crescimento bovino, como descrito em um outro local. O vetor foi produzido pela Targeted Genetics Corporation de acordo com as orientações da Boa Prática de Fabricação com o uso de uma linhagem celular de empacotamento B50, um vetor de embaralhamento híbrido de adenovírus-vírus adeno- associado contendo o genoma do vetor tgAAG76 e um vírus auxiliar de adenovírus 5. O vetor foi cheio em uma solução salina tamponada em um título de 1 x 10^11 partículas de vetor por mililitro e congelado em alíquotas de 1 ml a -70º C.
[404] Maguire usou o vetor viral AAV2.hRPE65v2 recombinante que é um vetor de AAV deficiente em replicação contendo cDNA de RPE65 que foi documentado para prover restauração sustentada, de longo prazo (>7,5 anos, com observação em andamento) de função visual em um modelo canino de LCA2 após uma injeção sub-retinal única de AAV2.RPE65. O plasmídeo cis usado para gerar AAV2.RPE65 contém o gene de resistência à canamicina. O vírus foi fabricado pelo The Center for Cellular and Molecular Therapeutics após transfecção tripla de células HEK293 e foi isolado e purificado através de microfluidização, filtragem, cromatografia de troca de catiô- nica(POROS 50HS; GE Healthcare, Piscataway, N.J.), ultracentrifuga- ção de gradiente de densidade e diafiltragem em PBS. Esta combina- ção provê pureza ótima do produto de vetor de AAV, incluindo remo- ção eficiente de capsídeos vazios e cloreto de césio residual. Uma porção do produto foi suplementada com PF68 NF Prill Poloxamer 188 (PF68; BASF, Ludwigshafen, Alemanha) para prover perdas subse- quentes de vetor para superfícies de contato de produto. O vírus purifi- cado, com ou sem PF68, foi então passado por um filtro de 0,22 µm usando uma seringa de 60 ml estéril e filtro de seringa e congelado armazenado (-80º C) em tubos estéreis até o uso. Uma injeção de 1,5x10^10 de genoma de vetor de AAV2.hRPE65v2 em um volume de 150 µl de solução salina tamponada com fosfato suplementada com Pluronic F-68 NF Prill Poloxamer 188 foi administrada ao espaço sub- retinal.
[405] O vetor viral usado por Hauswirth foi um vetor de vírus ade- noassociado recombinante sorotipo 2 (rAAV2), alterado para carregar o gene RPE65 humano (rAAV2-CBSB-hRPE65), que tinha sido anteri- ormente demonstrado restaurar visão em modelos animais com defici- ência em RPE65. O vetor viral de RPE65-LCA foi administrado através de injeção sub-retinal (5,96x10^10 genomas de vetor em 150 µl).
[406] Métodos e protocolos de administração de agentes terapêu- ticos (por exemplo, proteína, molécula de ácido nucleico, cassetes de expressão, vetores de terapia genética, células) incluindo, sem limita- ção, ao olho, e outros procedimentos e protocolos (incluindo, sem limi-
tação, testes de imunologia, exames do olho e imunossupressor) são conhecidos na técnica.
Por exemplo, o que segue é um exemplo de injeção sub-retinal de vetores de AAV usados por MacLaren em trata- mento de coroideremia.
Cirurgia foi primeiro realizada para descolar a retina através de uma cânula de Teflon 41G (DORC International BV, Zuidland, Países Baixos) usando solução salina equilibrada (Alcon La- boratories, Fort Worth, TX, USA). Uma vez a área-alvo retinal tendo sido descolada do epitélio de pigmento retinal de base, um volume fixo (0,1 mL) contendo 1 x 10^10 partículas de genoma de AAV2.REP1 foi injetado através de uma seringa nova no espaço sub-retinal que tinha sido criado nos primeiros cinco pacientes.
No paciente 6, uma dose reduzida de até 6 x 10^9 partículas de genoma foi injetada.
O vetor foi injetado lentamente através da mesma retinotomia, fazendo com que o descolamento se estendesse mais.
A cirurgia foi descomplicada nos cinco primeiros pacientes, mas no paciente 6, dificuldade em descola- mento da retina da mácula periférica necessitou a indução de desco- lamento de um ponto próximo da fóvea, o que causou estiramento vi- sível do feixe papilomacular.
Devido a questões de dano relacionado a estiramento desta estrutura vital em um paciente com visão 6/7,5, um volume menor de vetor (máximo 0,06 mL) foi injetado na segunda eta- pa.
Em todos os pacientes, o vetor excedente restante na seringa foi expelido através da cânula em um frasco de polipropileno e então congelado.
Este vetor excedente foi mais tarde testado quanto à po- tência com Western blot após transdução da linhagem celular HT1080 derivada de humano.
Os pacientes foram tratados com um curso oral de 10 dias de prednisolona, começando 2 dias antes da cirurgia a 1 mg/kg (70-100 mg) por 7 dias e então reduzido para 40 mg por 1 dia, 20 mg por 1 dia e 10 mg por 1 dia.
Amostras de sangue foram obtidas para testes imunológicos antes, e 1 semana e 5-6 semanas após ci- rurgia.
Vide MacLaren e outros, Lancet. 2014 Março 29; 383(9923):
1129–1137.
[407] No estudo de Hauswirth, administração foi realizada como segue. Após sedação intravenosa leve, o olho cirúrgico recebeu anes- tesia retrobulbar e foi então preparado e coberto de uma maneira esté- ril padrão. Um núcleo de 23 gauge de três portas padrão e vitrectomia periférica foram realizados. A conjuntiva na esclerotomia lateral direita foi dissecada com tesouras Westcott e fórceps 0,3. Hemostasia foi mantida com cautério de ponta de borracha. A esclerotomia foi aumen- tada com uma lâmina MRV de 20 gauge de modo que a cânula sub- retinal pudesse ser facilmente inserida no olho. O vetor foi sugado pa- ra uma cânula de injeção de 39 gauge (Synergetic, O’Fallon, MO) e foi introduzido no espaço sub-retinal. No final do procedimento, os sítios de esclerotomia foram presos com suturas Vicryl 7.0 e a conjuntiva foi fechada com suturas interrompidas. Antibióticos e esteroides subcon- juntivais foram administrados. Antibióticos e estereoides tópicos foram usados por 20 dias após a cirurgia. Vide, Hauswirth e outros, Hum Ge- ne Ther. 2008 Out; 19(10): 979–990.
[408] Para tratamento de terapia genética com CYP4V2 in vi- tro, avaliação pós-tratamento pode comparar morfologia celular e/ou disfunções bioquímicas de células do paciente, por exemplo, compa- rando os níveis dos compostos que mostraram anormalidades em cé- lulas iPS-RPE de paciente com BCD (ou células iPS-RPE ou iPS-CEC, se aplicável) antes e pós-tratamento, para avaliar se a morfologia e/ou a função bioquímica das células melhorou pós-tratamento.
[409] Para tratamento de terapia genética com CYP4V2 in vivo, avaliação pós-tratamento pode usar exames de olho e retinal (e testes da córnea, se aplicável) conhecidos na técnica para doenças retinais e da córnea, incluindo, sem limitação, adaptação ao escuro, sensibilida- de de contraste, teste de campo visual, teste de acuidade visual, tes- tes de visão colorida, ERG, OCT, imagem de fundo, exame da córnea,
testes funcionais tal como mobilidade, etc. Eficácia pode ser verificada através de um dos que seguem: visão melhorada, parada de progres- são da doença ou taxa mais lenta do que esperado de degeneração retinal ou perda de visão.
[410] Um desafio de terapia genética mediada por vetor viral são respostas imunes do indivíduo recebendo a terapia genética. Em adi- ção a riscos convencionalmente associados para o indivíduo, as res- postas imunes podem reduzir significantemente a eficiência de trans- dução dos vetores virais e/ou resultar em uma falha em estabelecer expressão de transgene de longo prazo. Mingozzi F, Meulenberg JJ, Hui DJ, Basner-Tschakarjan E, Hasbrouck NC, Edmonson SA, Hutnick NA, Betts MR, Kastelein JJ, Stroes ES, High KA, AAV-1-mediated gene transfer to skeletal muscle in humans results in dose-dependent activation of capsid-specific T cells. Blood. 2009 Sep 3; 114(10):2077-
86.
[411] Talvez, em parte devido ao ambiente imunológico único do olho, os efeitos imunológicos de vários vetores virais recombinantes (por exemplo, AAV, lentivírus, adenovírus) em terapia genética ocular parecem ser bastante benignos. Não obstante, uma resposta imune mediada por célula significante pode se desenvolver após administra- ção intraocular de adenovírus. Nem AAV nem lentivírus, no entanto, elicita uma resposta mediada por célula e são então vetores promisso- res para tratamento de doenças oculares (retinais) crônicas. J Bennett, Immune response following intraocular delivery of recombinant viral vectors, Gene Therapy (2003) 10, 977–982. doi:10.1038/sj.gt.3302030. Por outro lado, no entanto, estudo anterior mostrou que administração intravítrea de vetores de AAV resultou em um aumento em níveis de anticorpos anti-AAV em ambos o fluido viral bem como soro de prima- tas não humanos. Além disso, a presença de títulos de anticorpo de neutralização preexistentes no soro de macacos se relacionava forte-
mente com expressão de transgene fraca, decadente ou nenhuma se- guindo administração intravítrea de AAV. Kotterman e outros, Antibody Neutralization Poses a Barrier to Intravitreal Adeno-Associated Viral Vector Gene Delivery to Non-Human Primates, Gene Ther. 2015 Fe- vereiro; 22(2): 116–126. Desta maneira, é desejável reduzir respostas imunes em terapia genética ocular, especialmente aquelas de anticor- pos de neutralização (NAbs), para preservar eficiência de transdução e/ou expressão de transgene de longo prazo.
[412] Historicamente uma prática comum para companhias no campo da terapia genética tem sido usar vetor de AAV de um sorotipo. Ela tipicamente usa um tipo de vetor com boa eficiência de transdução e grande quantidade de dados de segurança em estudos animais e/ou testes clínicos de outra terapia genética. Por exemplo, AAV2 é o soro- tipo de AAV mais comumente usado para terapia genética ocular em testes clínicos. No entanto, o melhor sorotipo para um paciente não é sempre o melhor para um outro paciente devido às diferenças indivi- duais no sistema imune, por exemplo, anticorpos anti-AAV preexisten- tes. Por exemplo, prevalência de anticorpos de neutralização anti-AAV preexistentes contra sorotipos de AAV específicos é diferente entre países e populações. Ainda, reações imunes podem reduzir significan- temente a eficiência de transdução que pode reduzir a eficácia da te- rapia genética sendo aplicada e/ou necessitar que uma dose maior seja administrada.
[413] É provido aqui um método para reduzir respostas imunes a vetores virais, conservar eficiência de transdução, diminuir dose de vetor viral e/ou imunossupressor e/ou maximizar o efeito terapêutico para pacientes diferentes da mesma doença genética, em terapia ge- nética mediada por vetor viral, compreendendo: (a) estabelecimento de um grupo de mais de um vetor viral re- combinante (por exemplo, rAAVs) com eficiência de transdução sufici-
ente no tipo de célula-alvo para a terapia genética.
O grupo de vetor viral pode ser expandido criando variantes com mutações de região antigênica ou outras mutações ou variantes nos capsídeos dos ditos vetores virais após tais mutações ou variantes terem sido confirmadas com eficiência de transdução suficiente em células-alvo relevantes pa- ra a doença (por exemplo, em linhagens celulares iPS-RPE ou RPE para terapia genética com CYP4V2 para BCD). (b) detecção de anticorpos de vetor antiviral de neutralização preexistentes (NAbs) contra sorotipos de vetor viral diferentes e/ou mutações ou variantes de capsídeo no indivíduo com necessidade da terapia genética e/ou teste e comparação de vetores virais diferentes em células-alvo de doença específicas do paciente (por exemplo, célu- las iPS-RPE) derivadas de tal indivíduo. (c) seleção de um vetor viral a partir do dito grupo de vetores virais com (i) eficiência de transdução suficiente nas células-alvo de doença e (ii) reatividade cruzada baixa com os NAbs preexistentes no indivíduo e/ou (iii) bom resultado de resgate de fenótipo nas células- alvo de doença específicas do paciente do indivíduo (por exemplo, li- nhagens celulares iPS-RPE ou RPE específicas do paciente para te- rapia genética com CYP4V2 para BCD), em que tal grupo de vetor vi- ral compreendendo sorotipos diferentes e/ou vetores virais com capsí- deo modificado (por exemplo, incluindo, sem limitação, AAVs mutantes em capsídeo e/ou AAVs de variante de proteína do capsídeo). (d) uso do vetor viral selecionado de (c) para administração ao indivíduo. (e) repetição de (b) até (d) (apenas a parte em relação a NAbs preexistentes) antes de cada vez que o indivíduo necessitar uma ad- ministração de terapia genética, incluindo, sem limitação, uma admi- nistração de acompanhamento ao mesmo órgão (por exemplo, um olho ou um olho contralateral) ou a um outro órgão.
[414] Benefícios potenciais deste método incluem reduzir o uso de imunossupressores, dose menor de vetores de rAAV, eficiência de transdução maior e expressão de transgene a longo prazo e/ou por- centagem maior de pacientes elegíveis para a terapia genética.
[415] Seria compreendido que este método pode ser usado em conexão com outros vetores virais. Ainda, este método pode ser usado em todos os tipos de terapia genética ocular e terapia genética não ocular, seja ela relacionada com gene CYP4V2 ou outro(s) gene(s).
[416] Métodos de detecção de anticorpos anti-AAV preexistentes são conhecidos na técnica. É importante dizer que os anticorpos anti- AAV incluem ambos anticorpos de neutralização e anticorpos de não neutralização. Métodos para detectar anticorpos de neutralização anti- AAV preexistentes e outra resposta imune para AAVs são conhecidos na técnica. Melvin Y Rincon e outros, JMIR Res Protoc. 2016 Apr-Jun; 5(2): e102; Hauswirth e outros, Hum Gene Ther. 2008 Oct; 19(10): 979–990. Embora o efeito seja mais significante com anticorpos de neutralização, mesmo anticorpos de não neutralização podem disparar eliminação de vetor pelo sistema imune. Os anticorpos de não neutra- lização podem ser detectados através de ELISA. Boutin S, Monteilhet V, Veron P, Leborgne C, Benveniste O, Montus MF, Masurier C, Prevalence of serum IgG and neutralizing factors against adeno- associated virus (AAV) types 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the healthy popula- tion: implications for gene therapy using AAV vectors. Hum Gene Ther. 2010 Jun; 21(6):704-12.
[417] A menos que de outro modo definido, todos os termos téc- nicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comu- mente compreendido por um versado comum na técnica à qual os mé- todos e composições de matéria pertencem. Em adição às definições de termos providos aqui, definições de termos comuns em biologia molecular podem também ser encontradas em Glossary of Genetics:
Classical and Molecular, Rieger e outros, 1991, 5a Ed, Springer- Verlag; em Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel e outros, Eds., 1998 Supplement, Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc.; em Current Protocols in Cell Biology, Bonifacino e outros, Eds., 1999 Supplement, John Wiley & Sons, Inc.; e em Current Protocols in Neuroscience, Crawley e outros, Eds., 1999 Supplement, John Wiley & Sons, Inc.
[418] Métodos e materiais representativos são descritos aqui; ou- tros métodos e materiais adequados conhecidos na técnica podem ser também usados. Os métodos e materiais são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitantes.
EXEMPLOS
[419] A invenção é descrita ainda nos exemplos que seguem, que não limitam o escopo da invenção nem das reivindicações.
[420] Os estudos foram iniciados, planejados, organizados e pa- trocinados pela Reflection Biotechnologies Limited (“ReflectionBio”), uma companhia de biotecnologia fundada e dirigida por um paciente e a família vivendo com uma doença retinal rara. Pacientes com doença rara arcam com as inevitáveis probabilidades de mutações genéticas para a humanidade, mas são frequentemente ignorados pela socieda- de e pouco apoiados por recursos públicos. Uma companhia de bio- tecnologia dirigida por um paciente, ReflectionBio, aplica uma aborda- gem “Por Pacientes, Para Pacientes” para os pacientes unirem forças e desempenhar um papel mais ativo na condução de P&D científico e médico de doenças raras e outras doenças desafiadoras.
[421] Pacientes diagnosticados com BCD e tendo mutações de CYP4V2 bialélicas diferentes (incluindo mutação de CYP4V2 homozi- gota ou mutações de CYP4V2 heterozigotas compostas) foram incluí- dos neste estudo. Particularmente, um paciente (daqui em diante refe- rido como Paciente 1, P1 ou RB001) tem mutação c.802-
8_810del17insGC homozigota. A mutação c.802-8_810del17insGC resulta em uma deleção na estrutura de éxon 7 de codificação de 62 aminoácidos. A mutação c.802-8_810del17insGC é a mutação mais comum dentre pacientes com BCD. O Paciente 2 (P2 ou RB002) tem mutações de CYP4V2 heterozigotas compostas, cada uma das muta- ções é uma mudança de nucleotídeo única que resulta apenas em uma mudança de aminoácido na proteína CYP4V2 longa de 525 ami- noácidos.
[422] Consentimentos informados foram obtidos. Procedimentos seguiram as orientações da Declaração de Helsinki e foram aprovados por uma Banca de Revisão Institucional. Exemplos de Modelo de Doença Celular Humana BCD
[423] Clinicamente, BCD está associada com atrofia de RPE, que por sua vez causa morte de fotorreceptor e perda de visão. Desta ma- neira, é crítico criar e usar um modelo de RPE humano para estudar BCD e desenvolver tratamento para BCD. Exemplo 1 – Geração e Caracterização de Células-Tronco Pluripoten- tes Induzidas (iPSCs) Derivadas de Pacientes com BCD
[424] No estudo, métodos livres de integração foram usados para gerar iPSCs de pacientes com BCD. Tecnologias tradicionais usadas para reprogramação de iPSC (por exemplo, lentivírus, retrovírus) inte- gram ao genoma das células-alvo. As iPSCs e células resultantes dife- renciadas dessas iPSCs conterão DNA estranho e poderiam ser inse- guras e problemáticas para uso em terapia celular e aplicações de de- senvolvimento de fármaco. Ainda, a integração poderia ocorrer em uma região crítica do genoma, causando problemas com processos desenvolvimentais não relacionados. Comparado com métodos de re- programação tradicionais, métodos de reprogramação livres de inte- gração geram iPSCs que não contêm vetores ou transgenes detectá- veis, desta maneira tornando-os mais adequados para terapia celular e aplicações de desenvolvimento de fármaco.
[425] No estudo, dois métodos de reprogramação livres de inte- gração diferentes foram usados para gerar iPSCs de pacientes com BCD, um empregando vírus Sendai, o outro empregando vetores epis- somais. Dois tipos diferentes de amostras foram usados, uma é amos- tra de pele (fibroblastos da pele) e o outro é amostra de sangue (célu- las mono-onucleares de sangue periférico (PBMCs)). Qualquer método pode ser usado para gerar iPSCs específicas de paciente com BCD a partir da pele, sangue ou outras amostras, tais como amostras de uri- na e cabelo. A. Reprogramação de iPSC a partir de amostra de pele
[426] Biópsia de pele foi realizada em pacientes com BCD, e cé- lulas de fibroblasto humano foram obtidas a partir da biópsia. Células de fibroblasto específicas de paciente com BCD foram então repro- gramadas em linhagens celulares iPS usando vírus Sendai, um vírus de RNA livre de pegada que não carrega nenhum risco de alteração do genoma do hospedeiro. Outros vetores, incluindo, sem limitação, lentivírus, também podem ser usados em reprogramação de iPS, mas com um risco de integrar ao genoma da célula hospedeira. Vide Figura 1 para fotos de células iPS derivadas de pacientes com BCD. Células de fibroblasto de indivíduos saudáveis também foram reprogramadas da mesma maneira para gerar linhagens celulares iPS do tipo selva- gem (ou controle).
[427] Para gerar iPSCs, 5 x 104 fibroblastos foram plaqueados e culturados em placa de 12 cavidades até que as células se tornaram aderentes (por cerca de 12 horas) e eram em torno de 70%-80% con- fluentes. O meio de cultura foi removido, e as células foram transfecta- das com um vírus Sendai expressando Oct3/4, Sox2, Klf4 e c-Myc (CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit, A16517, Life Technologies) em um MOI de 5:5:3:5 em 500 µl de meio de cultura de fibroblasto. As células foram incubadas a 37º C e CO2 5% de um dia para o outro, após o que o meio contendo vírus foi removido e substi- tuído com meio KO-DMEM (KnockOut DMEM, substituição de soro KnockOut 15%, L-glutamina 1, aminoácidos não essenciais 1, penicili- na-estreptomicina 1, β-mercaptoetanol 0,1 mM, fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF) 10 ng/ml). As células transfectadas foram incubadas por cerca de 7 dias, com o meio mudado todos os dias.
[428] As células transfectadas foram lavadas em PBS, expostas à tripsina (por exemplo, TrypLE Express a 37º C por 4 min) e ressus- pensas em 2 ml de meio KO-DMEM contendo inibidor ROCK 10 µm. As células foram então plaqueadas em uma camada alimentadora de MEF tratada com mitomicina-C e retornadas para 37º C e CO2 5%. Depois de 24 horas e todos os dias seguintes, o meio foi removido e substituído com meio KO-DMEM (sem inibidor ROCK). As colônias eram visíveis 7-14 dias após passagem. Cada colônia de iPS foi mi- crodissecada em pedaços de cerca de 100-150 células, seguindo um rápido tratamento com meio KO-DMEM com inibidor ROCK 10 uM, e então culturada novamente em meio KO-DMEM a 37º C e CO2 5% por mais uma semana.
[429] Caracterização de iPSC foi realizada usando anticorpos primários de marcadores pluripotentes: OCT4 Santa Cruz sc-9081 Ra- bbit poly, SOX2 R&D Systems 245610 Mouse IgG, TRA-1-60 Millipore (Chemicon) MAB4381, Mouse, IgM, SSEA4 Millipore (Chemicon) MAB4304 Mouse IgG, Nanog R&D Systems AF1997 Goat poly. Tipi- camente para caracterização usando marcadores, as células foram lavadas, bloqueadas (por exemplo, com 3% de soro e 0,1% de Triton X), expostas a um anticorpo primário (1:200) e incubadas em tempera- tura ambiente por 2-3 horas. As células foram novamente lavadas, ex- postas a um anticorpo secundário e incubadas em temperatura ambi- ente por 60 min. As células passaram então por contratingimento nu-
clear (por exemplo, usando 1:10000 Dapi em PBST).
[430] Vide Figura 1(a) para iPSCs geradas a partir de fibroblastos de pacientes com BCD e caracterização através de Oct-4, Sox-2, SSEA-4, Nanog e Tra-1-60. B. Reprogramação de iPSC a partir de amostra de sangue
[431] Em adição a amostras de biópsia de pele, iPSCs foram também geradas a partir de amostras de sangue de paciente com BCD e controle saudável. As iPSCs foram geradas a partir de células mono-onucleares de sangue periférico (PBMCs) usando um método epissomal. O protocolo é descrito como abaixo.
[432] Ativação de células T: a) PBMCs congeladas foram descongeladas e cerca de 0,5 milhão de células viáveis foram submetidas à ativação de célula T usando Dynabeads (Human T activator, CD3/CD28, Thermo Fisher, Cat#11132D) de acordo com o protocolo do fabricante. b) Células T ativadas foram então expandidas em meio de cul- tura de célula sanguínea por 10-14 dias.
[433] Reprogramação: a) Para gerar linhagens de iPSC, células T ativadas foram dis- sociadas de dynabeads e eletroporadas com Episomal iPSC Repro- gramming Vectors (No. Cat.A14703, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) usando o Neon Transfection System (No. Cat. MPK10096, Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. b) Os dois conjuntos de células eletroporadas foram plaquea- dos em dois conjuntos de placas de 35 mm pré-culturadas com ali- mentadoras de CEF CF1 (#Cat: (ASF-1213, Applied StemCell, Milpi- tas, CA, USA). As células foram alimentadas diariamente com meio de crescimento iPSC humano. c) Depois de 2-3 semanas, colônias de iPSC do tipo ESC hu- manas foram pegas e transferidas para placas de 24 poços revestidas com matrigel para expansão. d) Linhagens de iPSC humanas específicas de paciente foram então cultivadas e passadas em Matrigel (No. Cat. Corning 354277) em Human iPSC Feeder-Free Growth Medium (mTeSR™1, No. Catá- logo 05850, StemCell Technologies Inc., Vancouver, Canadá) para 2- 3 mais passagens até número de célula suficiente obtido antes da cri- opreservação.
[434] Fosfatase alcalina: a) Para tingimento com fosfatase alcalina (AP), iPSCs foram fixadas e então tingidas com solução de tingimento de fosfatase alcali- na (Naphthol/fast red violet, Sigma). b) Imagens de célula foram capturadas usando um microscó- pio Olympus (IX51, Olympus, Tóquio, Japão).
[435] Vide Figura 1(b) para Imagens de contraste de fase de iPSCs geradas a partir de células mono-onucleares de sangue perifé- rico (PBMC) de amostras de sangue de um paciente com BCD e um controle saudável e resultados de tingimento com AP.
[436] Vide Figura 1(c) para imagens de cariótipo de iPSC deriva- do de paciente com BCD mostrando cariótipo humano aparentemente normal. Exemplo 2 – Diferenciação de iPSCs de Pacientes com BCD em Célu- las do Epitélio de Pigmento da Retina (RPE)
[437] Diferenciação de iPSC começou nas passagens 3 a 6 para todas as linhagens de iPSC de pacientes com BCD e controles saudá- veis. Para diferenciação, colônias de iPS foram culturadas para con- fluência em placas de cultura de 6 poços (Costar, Corning, Corning, NY) pretratadas com Matrigel diluído 1:50 (CORNING, 356230) em meio de diferenciação consistindo em Knock-Out (MO) DMEM (Ther- mo Fisher Scientific, 10829018), substituição de soro KO 15% (Thermo Fisher Scientific, 10829028), aminoácidos não essenciais 1% (Thermo
Fisher Scientific, 11140050), glutamina 2 mmol/L (Thermo Fisher Sci- entific, 35050061), penicilina-estreptomicina 50 U/ml (Thermo Fisher Scientific, 10378016) nicotinamida 10 mmol/L (Sigma-Aldrich, N0636) pelos primeiros 14 dias. Durante os 15º a 28º dias de diferenciação, meio de diferenciação foi suplementado com 100 ng/ml de Activin-A humana (PeproTech, 120-14). A partir do dia 29, Activin-A foi removida até que diferenciação fosse terminada. Após 8-10 semanas, agrupa- mentos pigmentados se formaram e foram manualmente pegos e pla- queados em placas revestidas com Matrigel. Essas células foram man- tidas em meio de RPE à base de MEM (modificação alfa, Sigma- Aldrich, M-4526), que contém suplemento N1 (5 ml por 500 ml de meio), Taurina (125 mg por 500 ml de meio), Hidrocortisona (10 µg por 500 ml de meio). Tri-iodo-tironina (0,0065 µg por 500 ml de meio) (to- dos da Sigma-Aldrich), 2 mmol/L de glutamina, 50 U/mL de penicili- na/estreptomicina, aminoácidos não essenciais 1% e soro bovino fetal 5% (todos da GIBCO-BRL). As células foram culturadas por mais 6-8 semanas para permitir que elas formassem uma mono-ocamada fun- cional para ensaios funcionais.
[438] Células de RPE diferenciadas de iPSCs de paciente com BCD foram observadas sob microscopia de luz e pigmento de RPE e formatos de célula hexagonais distintos foram vistos (vide Figura 2). Em adição a distinções morfológicas, células de RPE derivadas de iPS de pacientes com BCD também foram validadas pela presença de marcadores específicos de RPE, RPE65, CRALBP e MITF. Vide Figu- ra 2(b) para resultados de marcadores de RPE de células iPS-RPE de pacientes com BCD, mostrando a presença de marcadores específicos de RPE, RPE65, CRALBP e MITF.
[439] Protocolos múltiplos podem ser usados para diferenciar iPSCs em células de RPE. O protocolo de diferenciação de RPE des- crito aqui é um protocolo estendido que geralmente leva mais de 3 meses. Outros protocolos levam menos tempo, por exemplo, menos de 2 meses. Embora ambos protocolos mais curtos e estendidos pos- sam diferenciar iPSCs em células de RPE, pode haver diferenças em termos do risco de tumorigênese dentre células iPSC-RPE geradas por protocolos diferentes. O risco de tumorigênese associado com di- ferenciação de iPSC é atribuído a uma porção das células iPS restan- tes não diferenciadas ou não totalmente diferenciadas no final do pro- tocolo, e o protocolo estendido da mesma maneira contribui para a fal- ta de formação de tumor porque as iPSCs são totalmente diferencia- das em células de RPE maduras. O protocolo de prazo mais longo foi usado para assegurar a pureza das linhagens celulares iPS-RPE ge- radas para ensaios bioquímicos e outros e estudos funcionais, e apoiar a segurança de células iPSC-RPE para terapia celular incluindo, sem limitação, transplante autólogo. Exemplo 3 – Ensaios Bioquímicos, de Viabilidade Celular e outros para Modelo Celular de BCD e Estudos Funcionais de CYP4V2 Ensaios de Lipídeo:
[440] Estudos anteriores sobre BCD e função da enzima CYP4V2 focaram em ácidos graxos. Neste estudo, mais ensaios de lipídeo in- cluindo não apenas ácidos graxos, mas também ceramidas (Cer), es- fingomielinas (SM) e esfingosina e esfinganina (SOSA), foram usados para analisar as anormalidades/fenótipo bioquímico em modelo de do- ença BCD e analisar as funções bioquímicas da proteína CYP4V2.
[441] Ensaios bioquímicos em ácidos graxos livres (FFA), cera- midas (Cer), esfingomielinas (SM) e esfingosina e esfinganina (SOSA) foram conduzidos no Biomarkers Core Laboratory da Columbia Uni- versity (Nova York, NY, USA) com base em seus ensaios e protocolos relevantes.
[442] Ácidos graxos livres (FFA), ceramida, esfingosina e esfin- ganina foram extraídos usando clorofórmio:metanol. Em suma, cerca de 1 milhão de células iPS-RPE foram homogeneizadas em 150 uL de água. 100 uL de homogenato foram misturados com 3 mL de clorofór- mio:metanol (v:v=2:1) contendo padrões internos (Ácido palmítico-D31, ceramida C12, ceramida C25, esfingosina C17, esfinganina C17). A amostra foi vortexada bem e 0,5 mL de água foi adicionado para per- mitir separação de fase. A mistura foi vortexada novamente e centrifu- gada a 3.000 g por 10 minutos a 4°C. A fase orgânica inferior foi trans- ferida para um segundo tubo de vidro limpo usando uma pipeta Pas- teur. Dois ml de clorofórmio foram adicionados à fase aquosa residual, seguido por mistura com vórtex e centrifugação novamente para extra- ir quaisquer lipídeos restantes. As fases orgânicas inferiores foram agrupadas e evaporadas sob nitrogênio a 37º C. Os lipídeos extraídos foram reconstituídos em 50 µl de metanol:acetonitrila (v:v=1:1) e trans- feridos para frascos autoamostradores LC para injeção. Esfingomielina foi também extraída através de clorofórmio:metanol tal como outros lipídeos, mas apenas 2 µL de homogenato celular foram postos para preparação de amostra para esfingomielina. Todos os ensaios foram realizados em um sistema Waters Xevo TQ MS ACQUITY UPLC (Wa- ters, Milford, MA, USA). FFA foi eluído por uma coluna Waters AC- QUITY UPLC HSS C18 100 mm. Ceramida, esfingosina, esfinganina, esfingomielina foram separadas em uma coluna Waters ACQUITY UPLC BEH Phenyl 100 mm. FFA foi monitorado usando método de SIR negativo e outros através de aquisição de MRM positiva.
[443] Uma lista de compostos testados nos ensaios bioquímicos é provida na Tabela 2 abaixo. Certos compostos químicos foram com- prados para uso como padrões neste estudo (como escrito na Tabela
2. Nu-Chek: Nu-Chek Prep, Inc., Elysian, MN, USA; Cayman: Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA). Outros compostos usaram padrões existentes disponíveis na Biomarkers Core Laboratory of the Columbia University (New York, NY, USA). Todos os FFAs foram de-
tectados através de MS única, enquanto outros tipos de compostos foram detectados através de MS/MS.
TABELA 2: LISTA DE COMPOSTO DE TESTE
Ácidos Graxos (FFA) Descrição Vendedor No.
Ceramidas (Cer) Descrição catálogo C12 C12:0 (ÁCIDO LÁURICO) Nu-Chek N-12-A C14 C14 Ceramida (d18:1/14:0) C13 C13:0 (ÁCIDO TRIDECANOICO) Nu-Chek N-13-A C16:1 C16:1 Ceramida (d18:1/16:1) C14:1 Isômero 1 C16 C16 Ceramida (d18:1/16:0) C14:1 Isômero 2 C18:1 C18:1 Ceramida (d18:1/18:1) C14 Ácido mirístico C14:0 (ÁCIDO MIRÍSTICO) C18 C18 Ceramida (d18:1/18:0) C15 C15:0 (ÁCIDO PENTADECANOICO) Nu-Chek N-15-A C20:5 C20:5 Ceramida (d18:1/20:5) C16:1 n7 cis Δ 9 cis (ÁCIDO PALMITOLEICO) Nu-Chek U-40-A C20:4 C20:4 Ceramida (d18:1/20:4) C16:1 n9 cis Ácido cis-7-Hexadecenoico Cayman 10007290 C20:1 C20:1 Ceramida (d18:1/20:1)
182/321 C16:1 n7 trans Δ 9 trans (ÁCIDO PALMITELAÍDICO) Nu-Chek U-41-A C20 C20 Ceramida (d18:1/20:0) C16 Ácido palmítico C16:0 (ÁCIDO PALMÍTICO) C22:6 C22:6 Ceramida (d18:1/22:6) C17 C17:0 (ÁCIDO MARGÁRICO) Nu-Chek N-17-A C22:5 C22:5 Ceramida (d18:1/22:5) C18:3 n3 Alfa C18:3n-3:(ÁCIDO ALFA LINOLÊNICO) Nu-Chek U-62-A C22:1 C22:1 Ceramida (d18:1/22:1) C18:3 n6 Gama C18:3n-6 (ÁCIDO GAMA LINOLÊNICO) Nu-Chek U-63-A C22 C22 Ceramida (d18:1/22:0) C18:2 n6 9,12 cis Δ 9 cis,12 cis (ÁCIDO LINOLEICO) Nu-Chek U-59-A C24:1 C24:1 Ceramida (d18:1/24:1) C18:2 n6 9,12 trans Δ 9 trans 12 trans (ÁCIDO LINOELAÍDICO) Nu-Chek U-60-A C24 C24 Ceramida (d18:1/24:0) C18:1 Ácido oleico C18:1n-9 (ÁCIDO OLEICO) C26:1 C26:1 Ceramida (d18:1/26:1) C18 Ácido esteárico C18:0 (ÁCIDO ESTEÁRICO) C26 C26 Ceramida (d18:1/26:0) C19 C19:0 (ÁCIDO NONADECANOICO) Nu-Chek N-19-A C28:1 C28:1 Ceramida (d18:1/28:1) C20:5 n3 EPA ÁCIDO EICOSAPENTAENOICO (EPA) Nu-Chek U-99-A C28 C28 Ceramida (d18:1/28:0) C20:4 n6 AA ÁCIDO ARAQUIDÔNICO (AA) Nu-Chek U-71-A C20:4 Isômero Esfingomielinas (SM) C20:3 n6 ÁCIDO HOMOGAMA LINOLÊNICO Nu-Chek U-69-A C14:1 C14:1 Esfingomielina (d18:1/14:1) C20:3 Isômero 1 C14 C14 Esfingomielina (d18:1/14:0)
C20:3 Isômero 2 C16:1 C16:1 Esfingomielina (d18:1/16:1) C20:2 n6 ÁCIDO 11-14 EICOSADIENOICO Nu-Chek U-68-A C16 C16 Esfingomielina (d18:1/16:0) C20:2 Isomer C18:1 C18:1 Esfingomielina (d18:1/18:1) C20:1 n9 ÁCIDO 11-EICOSENOICO Nu-Chek U-66-A C18 C18 Esfingomielina (d18:1/18:0) C20 Ácido araquídico C20:0 (ÁCIDO ARAQUÍDICO) C20:5 C20:5 Esfingomielina (d18:1/20:5) C21 ÁCIDO HENEICOSANOICO Nu-Chek N-21-A C20:4 C20:4 Esfingomielina (d18:1/20:4) C22:6 n3 DHA ÁCIDO DOCOSAEXAENOICO (DHA) Nu-Chek U-84-A C20:1 C20:1 Esfingomielina (d18:1/20:1) C22:5 n3 DPA ÁCIDO 7-10-13-16-19 DOCOSAPENTAE- Nu-Chek U-101-A C20 C20 Esfingomielina (d18:1/20:0)
NOICO C22:5 n6 ÁCIDO 4-7-10-13-16 DOCOSAPENTAE- Nu-Chek U-102-A C22:6 C22:6 Esfingomielina (d18:1/22:6) 183/321
NOICO C22:4 n6 7-10-13-16 DOCOSATETRAENOICO Nu-Chek U-83-A C22:5 C22:5 Esfingomielina (d18:1/22:5) C22:1 n9 13-DOCOSENOICO (ERÚCICO) C22:1 C22:1 Esfingomielina (d18:1/22:1) C22 ÁCIDO BEÊNICO Nu-Chek N-22-A C22 C22 Esfingomielina (d18:1/22:0) C23 ÁCIDO TRICOSANOICO Nu-Chek N-23-A C24:1 C24:1 Esfingomielina (d18:1/24:1) C24:1 n9 ÁCIDO NERVÔNICO Nu-Chek U-88-A C24 C24 Esfingomielina (d18:1/24:0) C24 ÁCIDO LIGNOCÉRICO Nu-Chek N-24-A C26:1 C26:1 Esfingomielina (d18:1/26:1) C25 ÁCIDO PANTACOSANOICO Cayman 15197 C26 C26 Esfingomielina (d18:1/26:0) C26:1 C26:1 n9 (Ácido Hexacosaenoico) C28:1 C28:1 Esfingomielina (d18:1/28:1) C26 ÁCIDO HEXACOSANOICO Cayman 13354 C28 C28 Esfingomielina (d18:1/28:0)
SOSA SO Esfingosina (d18:1) SA Esfinganina (d18:0) SO-1P Esfingosina-1-Fosfato (d18:1) SA-1P Esfinganina-1-Fosfato (d18:0)
Ensaios de Ácido hidróxi-graxo:
[444] Ainda, LC-MS/MS foi usada para detectar ácidos hidro- graxos em células iPS-RPE, incluindo 16-HEPE, 17-HEPE, 18-HEPE, 19-HEPE, 20-HEPE, 17-HDHA, 18-HDHA, 19-HDHA, 20-HDHA, 21- HDHA, 22-HDHA, 19(20)-EpDPA (nome formal: ácido (±)19,20-epóxi- 4Z,7Z,10Z,13Z,16Z-docosapentaenoico, tcc (±)19,20 EDP, ácido (±)19,20-epóxi docosapentaenoico, (±)19,20-epóxi DPA, (±)19,20- EpDPE) e 19(20)-DiHDPA (nome formal: ácido (±)19,20-di-hidróxi- 4Z,7Z,10Z,13Z,16Z-docosapentaenoico, tcc: (±)19,20-DiHDoPE). Os compostos HDHA são hidróxi-metabolitos de DHA e os compostos HEPE são hidróxi-metabolitos de EPA, respectivamente. 19(20)- EpDPA é um metabolito de oxigenasse de DHA, derivado através da epoxidação da ligação dupla ω-3 de DHA. 19(20)-DiHPDA é também um metabolito de DHA. DHA é um ácido graxo importante e o ácido graxo ω-3 mais abundante para o cérebro e retina. Uma pesquisa an- terior indicou que CYP4V2 é uma hidroxilase para ácidos graxos ω-3, particularmente DHA.
[445] Materiais: padrões de ácido hidróxi-graxo (±)18-HEPE (Item No. 32840), (±)20-HDHA (Item No. 33750), (±)19(20)-EpDPA (Item No. 10175) e (±)19(20)-DiHDPA (Item No. 10007001) foram comprados da Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, USA). Ácido palmítico deuterado padrão interno (ácido graxo C16-D31) foi comprado da C/D/N Isotopes Inc. (#D-2002, Quebec, Canadá).
[446] Deve ser compreendido que em adição a métodos LC-MS ou LC-MS/MS descritos acima, as espécies e compostos químicos tes- tados no estudo também podem ser detectados e/ou quantificados usando outros métodos. Por exemplo, há métodos GC-MS ou GC- MS/MS para FFA com pretratamento de metilação. Para Cer e SM, FIA-MS/MS ou GC-MS/MS pode ser usado. Ensaio de Viabilidade Celular:
[447] Exposição à luz azul: células iPS-RPE foram semeadas em placas de 3,5 cm e placas de câmara de 4 poços. Depois de 2 meses, elas foram expostas à luz (azul) 430±20 nm a 1,5mW/cm2 por 1 hora em PBS(+) contendo 10 µg/ml de glicose. A densidade de semeadura de amostra foi usada para todas as linhagens celulares. Após exposi- ção à luz azul, células tratadas foram alimentadas com meio de RPE fresco e recuperadas em incubadora de CO2 5% e 37ºC de um dia pa- ra o outro.
[448] Em adição à 1 hora, durações de exposição à luz mais cur- tas ou mais longas podem ser usadas, por exemplo, nenhuma exposi- ção, 30 minutos, 45 minutos, 75 minutos, 90 minutos ou 120 minutos, etc. Similarmente, exposição à luz de um comprimento de onda dife- rente ou um espectro mais amplo pode ser também usada. Além dis- so, amostras de iPS-RPE de dias de cultura diferentes (por exemplo, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses ou 6 meses em cultura de RPE) podem ser usadas, por exemplo, para estudar o efeito de envelheci- mento.
[449] Ensaio de viabilidade celular: células vivas/saudáveis foram marcadas por corante de permeação em célula Calcein AM (Thermo Fisher Scientific, no. catálogo: C3099, USA) em uma concentração fi- nal de 3 µmol/ml PBS(+) (1 ml para cada placa de 3,5 cm ou 200 µl para cada câmara) e células mortas/doentes foram marcadas por Iode- to de Propídio (PI) (Thermo Fisher Scientific, no. catálogo: P3566, USA) em uma concentração final de 2 µg/ml de PBS(+) (1 ml para ca- da placa de 3,5 cm ou 200 µl para cada câmara) em temperatura am- biente por 1 hora. Uma vez que PI é de ligação a DNA e não permeia células vivas, ele é comumente usado para detectar células mortas em uma população. Então após lavagem com PBS(-), níveis fluorescentes celulares foram observados e fotos foram tiradas por microscópio fluo- rescente invertido (Nikon Eclipse Ts2R) em aumento de 20 vezes. Ra-
zões de célula morta/viva foram calculadas após fotos terem sido pro- cessadas por ImageJ (Fiji).
[450] Em adição a ensaios bioquímicos e teste de viabilidade ce- lular, testes de função de RPE podem ser realizados em células iPS- RPE de pacientes com BCD tais como atividade fagocítica, resistência transepitelial. Expressão de CYP4V2:
[451] Experimentos foram realizados para detectar e comparar níveis de expressão de CYP4V2 em células iPS-RPE controle e espe- cíficas de paciente com BCD. Expressão de CYP4V2 em linhagens celulares pode ser avaliada ou através de anticorpo anti-CYP4V2 (Western Blot) ou através de PCR quantitativa.
[452] Western Blot de CYP4V2: 45 µg de proteína de célula intei- ra de cada amostra de iPS-RPE foram processados em gel SDS page 7,5%, então transferidos a úmido para uma membrana. A membrana foi bloqueada com BSA 5% em PBST por 1 hora em temperatura am- biente, então incubada com anticorpo primário (Anti-CYP4V2 produzi- do em coelho, # catálogo Sigma Aldrich: SAB 1410565, USA) em uma concentração de 1:1000 em BSA 5% de um dia para o outro a 4ºC. Lavagem foi feita por 3 x 10 minutos com PBST. A membrana foi então incubada com anticorpo secundário IgG anti-coelho de cabra HRP (# catálogo Santa Cruz: sc-2004, USA) em uma concentração de 1:3000 em BSA 5% por 4 horas a 4ºC. Lavagem final foi feita por 3x10 minu- tos com PBST. GAPDH foi usado como controle de carregamento.
[453] Western blot de CYP4V2 detectou expressão de proteína CYP4V2 em amostras de iPS-RPE controle, mas não em amostra de iPS-RPE de paciente com BCD. Após tratamento por AAV.CYP4V2, proteína CYP4V2 foi detectada em amostras de iPS-RPE específicas de paciente com BCD.
[454] PCR em tempo real e quantificação de mRNA relativa:
amostras de iPS-RPE de controle saudável (WT), pacientes com BCD, tratadas com AAV.CYP4V2 de pacientes com BCD foram coletadas e lisadas com reagente TRIZOL (Invitrogen). RNA total foi isolado de acordo com as instruções do fabricante. Tratamento com DNase I (In- vitrogen) foi então realizado para prevenir contaminação de DNA ge- nômico. A reação de transcrição reversa foi conduzida pelo Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Fisher Scientific) com StepOne Real-time PCR System (Invitrogen) para quantificar níveis de expres- são de gene (38 ciclos). Iniciadores específicos para região de éxon 7 de CYP4V2 e CYP4V2op, respectivamente, foram usados. Actina foi usada como o gene de manutenção.
[455] Resultados: PCR quantitativa foi realizada para testar a ex- pressão de CYP4V2 e CYP4V2op em amostras celulares iPS-RPE. Os níveis de transcrito de CYP4V2 e CYP4V2op foram normalizados por uma amostra de paciente e uma amostra controle, respectivamente. Para CYP4V2, todas as amostras de controle não paciente expressa- ram níveis similares de CYP4V2, várias centenas de vezes maiores do que o nível de expressão de CYP4V2 na amostra do paciente. Após tratamento com AAV.CYP4V2, o nível de expressão de CYP4V2 da amostra do paciente aumentou mais do que uma centena de vezes para um nível comparado com as amostras controle de não paciente (Figura 3). Para CYP4V2op, todas as amostras tratadas com AAV ex- pressaram níveis muito mais altos comparado com amostras não tra- tadas (Figura 4). Esses resultados demonstraram que vetores de AAV eram capazes de administrar o cDNA de CYP4V2 a células iPS-RPE de pacientes com BCD e os cassetes de expressão eram capazes de expressar o gene. Exemplo 4 – Fenótipo em Modelo Celular de BCD e Constatações so- bre Funções de CYP4V2 Resultados de Teste de Lipídeo:
[456] Para determinar se e quais defeitos/anormalidades bioquí- micas (isto é, fenótipo) existem no modelo celular de BCD (por exem- plo, células iPS-RPE de paciente com BCD), os ensaios bioquímicos descritos no Exemplo 3 foram usados para detectar e quantificar áci- dos graxos, ceramidas, esfingomielinas, esfingosina, esfinganina e ácido hidróxi-graxos nas células iPS-RPE derivadas de pacientes com BCD comparado com aqueles das células iPS-RPE derivadas de con- troles saudáveis.
[457] Antes do teste, as células foram coletadas como segue. Aproximadamente 1 milhão de células iPS-RPE derivadas de um paci- ente com BCD foram lavadas duas vezes com PBS, então soltas da placa por um filtro de célula de plástico e transferidas para um tubo Eppendorf de 1,5 ml usando uma pipeta de 1 ml. O tubo Eppendorf foi posto em um congelador a -80°C antes do teste. Células iPS-RPE con- trole saudáveis foram coletadas da mesma maneira. Resultados de ensaio bioquímico são mostrados na Tabela 3 abaixo: Tabela não conferida - Favor devolver depois de formatar Tabela 3 Resultados do teste de ácidos graxos % em mol de WT P1 P1 AAV2.op P2 P2 AAV2tri.op P2 AAV2.op P2 AAV8.fv P2 ácidos gra- scA- xos totais AV1.op C12 0,2% ,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,0% 0,0% 0,1% C13 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% C14:1 Isôme- 0,1% 0,1% 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,1% 0,1% ro 1 C14:1 Isôme- 0,0% 0,1% 0,0% 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,1% ro 2 C14 Ácido 1,0% 0,6% 0,6% 0,7% 0,8% 0,8% 0,8% 1,1% mirístico C15 1,3% 0,5% 0,7% 0,5% 0,5% 0,6% 0,6% 0,7% C16:1 n7 cis 2,7% 2,4% 1,7% 2,3% 2,9% 2,9% 2,8% 3,8% C16:1 n9 cis 0,9% 0,9% 0,8% 1,0% 1,0% 1,1% 1,2% 1,6% C16:1 n7 0,4% 0,5% 0,4% 0,5% 0,5% 0,4% 0,5% 0,4% trans C16 Ácido 20,3% 14,2% 12,7% 14,8% 17,0% 17,2% 17,9% 17,4% palmítico C17 1,1% 0,5% 0,8% 0,5% 0,4% 0,5% 0,5% 0,4% C18:3 n3 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% Alpha
C18:3 n6 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% Gama C18:2 n6 9,12 1,6% 1,1% 0,9% 0,9% 0,9% 1,0% 1,0% 1,3% cis C18:2 n6 9,12 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,0% 0,1% 0,1% trans C18:1 n9 22,2% 20,9% 19,0% 18,5% 19,4% 20,8% 19,7% 28,6% Ácido oleico C18 Ácido 26,3% 17,9% 24,2% 19,4% 16,5% 16,6% 17,7% 14,4% esteárico C19 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% C20:5 n3 EPA 0,8% 1,9% 1,3% 1,9% 1,6% 1,7% 1,4% 1,6% C20:4 n6 AA 5,4% 15,2% 13,3% 14,7% 14,2% 13,2% 13,0% 7,9% C20:4 Isôme- 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% ro C20:3 n6 0,6% 0,8% 0,8% 0,9% 0,8% 0,9% 0,8% 0,6% C20:3 Isôme- 0,1% 0,3% 0,3% 0,4% 0,3% 0,3% 0,3% 0,1% ro 1 C20:3 Isôme- 3,8% 6,0% 5,5% 5,1% 5,5% 4,1% 4,2% 3,0% ro 2 C20:2 n6 0,4% 0,4% 0,5% 0,3% 0,4% 0,3% 0,4% 0,6% C20:2 Isôme- 0,6% 0,6% 0,8% 0,7% 0,8% 0,7% 0,7% 0,9% ro C20:1 n9 3,7% 2,9% 2,7% 2,7% 3,6% 3,4% 3,3% 6,1% C20 Ácido 0,8% 0,5% 0,5% 0,5% 0,6% 0,6% 0,5% 0,5% araquídico C21 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% C22:6 n3 DHA 2,2% 6,1% 5,6% 7,2% 6,2% 6,5% 6,5% 4,1% C22:5 n3 DPA 1,0% 2,0% 2,4% 2,8% 2,1% 2,6% 2,1% 1,7% C22:5 n6 0,1% 0,4% 0,5% 0,4% 0,3% 0,3% 0,4% 0,2% C22:4 n6 0,7% 1,3% 1,7% 1,4% 1,4% 1,3% 1,3% 1,0% C22:1 n9 0,5% 0,6% 0,6% 0,6% 0,7% 0,7% 0,7% 0,9% C22 0,2% 0,2% 0,2% 0,1% 0,2% 0,2% 0,2% 0,1% C23 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% C24:1 n9 0,3% 0,4% 0,4% 0,4% 0,4% 0,4% 0,5% 0,3% C24 0,1% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,1% C25 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% C26:1 0,0% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,0% C26 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% Sum 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0%
Total de 4,0% 10,0% 9,4% 11,9% 9,9% 10,8% 10,1% 7,4% ácidos gra- xos n-3
Nota de rodapé para a Tabela 3: WT: iPS-RPE controle do tipo selvagem: P1: iPS-RPE Pa- ciente 1; iPS-RPE Paciente 2. Amostras não tratadas e tratadas com AAV de pacientes eram de dia de cultura e linhagem de clone comparáveis.
Amostras de AAV2.op P1 e AAV2.op P2 foram tratadas por
AAV2.CYP4V2op (dia 1, MOI: 5 x 104 GC/célula) e coletadas 10 dias pós-tratamento. Amostra de AAV2trip.op P2 foi tratada por AAV2tri(Y- F).CYP4V2op (1 dia, MOI: 5 x 105 GC/célula) e coletada 10 dias pós- tratamento. Amostra de AAV8.fv P2 foi tratada por AAV8.CYP4V2fv (1 dia, MOI: 2 x 105 GC/célula) e coletada 10 dias pós-tratamento. Amos- tra de scAAV1.op P2 foi tratada por ssAAV1.CYP4V2op (1 dia, MOI: 2 x 105 GC/célula) e coletada 4 dias pós-tratamento.
[458] Os resultados mostraram que amostras celulares iPS-RPE de paciente com BCD têm um perfil de ácido graxo diferente daquele do controle. Em particular, amostras de paciente com BCD têm níveis muito maiores de DHA (22:6 n3) e total de ácidos graxos ômega-3 (ω- 3 ou n3) (soma de C18:3 n3 Alfa, C20:5 n3 EPA, C22:6 n3 DHA e C22:5 n3 DPA) do que aqueles de controle. Isso confirmou sugestões de um estudo anterior que CYF4V2 afeta metabolismo de ácido graxo ômega-3.
[459] Surpreendentemente, em adição a anormalidades em ní- veis de ácido graxo n3, células iPS-RPE de paciente com BCD tam- bém mostraram níveis maiores de C20:4 n6 (Ácido Araquidônico ou AA). Nível anormal de AA não foi relatado em estudos anteriores rela- cionados à BCD.
[460] Interessantemente, anormalidades em ácidos graxos n3 (incluindo DHA) e ácidos graxos n6 (incluindo AA) não foram encon- tradas em uma pesquisa anterior que testou níveis de ácido graxo em soro de pacientes com BCD. Os perfis de ácido graxo diferentes de células iPS-RPE de paciente com BCD e soro apoiam a hipótese que a função de CYP4V2 é substituída por outras enzimas em células não retinais ou não-RPE, muitas das quais são expressas em outros ór- gãos e tecidos junto com CYP4V2 exceto que CYP4V2 é a única en- zima CYP4 com nível de expressão relativamente alto em células de RPE.
[461] Em adição a ácidos graxos, células iPS-RPE de paciente com BCD podem ter fenótipo em outros compostos ou classes de composto. Foram conduzidos experimentos para avaliar fenótipo em outras classes de composto, incluindo, sem limitação, corticosteroide, esfingolipídeos e fosfolipídeos, incluindo esfingomielina, ceramida, es- fingosina e esfinganina, e em sinalização de lipídeo. Ainda, análise de experimento e proteômica de rastreamento isotópica (por exemplo, análise proteômica à base de espectrometria de massa) é realizada em células iPS-RPE de pacientes com BCD.
[462] Ainda, uma pesquisa anterior constatou que CYP4V2 é uma hidroxilase de ácido graxo ω-3 (DHA e EPA). Interessantemente, hidróxi-DHAs ou hidróxi-EPAs descritos no Exemplo 3 não foram de- tectados nem em células iPS-RPE controle saudáveis nem de pacien- tes com BCD usando LC-MS/MS. É possível que as funções enzimáti- cas de CYP4V2 sejam diferentes em células vivas vs. em uma reação química fora de células vivas que foi conduzida na pesquisa anterior, ou os ácidos hidróxi-graxos são intermediários que são convertidos de modo rápido em outros compostos ou formas em células vivas, ou os ácidos hidróxi-graxos estão em nível traço que pode ser detectado apenas quando uma amostra contém uma quantidade muito grande de células. Resultados de Ensaio de Viabilidade Celular:
[463] Clinicamente, BCD está associada com atrofia de RPE, que por sua vez causa morte de fotorreceptor e perda de visão. Ensaio de viabilidade celular (como descrito no Exemplo 3 acima) revelou atrofia de RPE em amostras celulares iPS-RPE de pacientes com BCD. Vide Figuras 5 e 6 para comparação de viabilidade celular entre amostras de iPS-RPE de pacientes controle e BCD (Figura 5 – sem exposição à luz azul; Figura 6 – após 1 hora de exposição à luz azul).
[464] Significantemente, essas imagens revelaram que:
(1) Após exposição à luz, níveis significantes de morte celular foram mostrados em amostras de iPS-RPE derivadas de pacientes com BCD (P1 e P2), muito maiores do que aqueles de controles (WT1 e WT2) (Vide Figura 6). Por exemplo, a razão de célula morta/viva de iPS-RPE P1 foi 20,87%, comparado com 3,0% para iPS-RPE WT2. O fenótipo clínico de BCD, atrofia de RPE, foi evidente no Modelo Celular de BCD. (2) Níveis diferentes de atrofia de RPE foram observados entre amostras de iPS-RPE P1 e P2 de BCD. iPS-RPE P1 mostrou um nível de morte celular maior do que iPS-RPE P2. (3) Mesmo sem exposição à luz azul, amostra de iPS-RPE de paciente com BCD (P1) mostrou atrofia de RPE (Figura 5).
[465] Pacientes com BCD diferem amplamente em idade de iní- cio de doença e progressão. Início de BCD varia de a partir do início da adolescência até a 3ª década de vida ou até mesmo além da 3ª dé- cada; levando à cegueira legal durante a 3ª década até a 6ª década de vida. Ainda, pacientes-irmãos com BCD com a mesma mutação em CYP4V2 podem ter diferença material em idade de início de doença e progressão. Anteriormente não havia nenhuma explicação para essas diferenças. A diferença em níveis de atrofia de RPE entre amostras de iPS-RPE de paciente com BCD diferentes proveem uma orientação no nível celular quanto à diferença em início de doença e progressão den- tre pacientes com BCD.
[466] Fenótipos múltiplos (ambos fenótipo de nível molecular tais como anormalidades bioquímicas (por exemplo, lipídeo) e fenótipo de nível celular tal como viabilidade celular) foram encontrados no Modelo Celular de BCD neste estudo, incluindo o fenótipo clínico de BCD (isto é, atrofia de RPE). Exemplo 5 – Uso de Células iPS e iPS-RPE de um Indivíduo BCD para Avaliar Candidatos a Fármaco e Faixa de Dosagem, Estudar BCD e
Função de CYP4V2 e em Terapia Celular e Avaliar Respostas Especí- ficas de paciente
[467] Como o modelo celular humano de doença BCD, células iPS e iPS-RPE de pacientes com BCD têm uma faixa ampla de aplica- ções, incluindo, sem limitação, estudar BCD e função de CYP4V2 (vi- de Exemplos 3 e 4 acima, por exemplo); avaliar candidatos a fármaco e faixa de dosagem para BCD e doenças relacionadas (vide os pre- sentes Exemplos).
[468] Métodos e exemplos para usar modelo celular de BCD (por exemplo, linhagem celular iPS-RPE específica de paciente com BCD ou linhagens celulares iPS-RPE com mutações de CYP4V2 artificial- mente geradas) são descritos em detalhes nos presentes Exemplos, que são relacionados ao uso do modelo celular de BCD em terapia genética e terapia celular. Em adição a testar terapia genética e como base celular para terapia celular, tal modelo celular de BCD pode ser usado para avaliar e testar eficácia e/ou segurança de outros agentes terapêuticos (por exemplo, candidatos a fármaco) e dosagem, formu- lação e vetor (vetores virais ou não virais) dos mesmos ou dispositivos ou mecanismos de administração para tratamento de BCD, IRD ou RP, da mesma maneira ou similar que a descrita em detalhes nos pre- sentes Exemplos.
[469] Em uso de modelo celular de BCD, a eficácia de um agente terapêutico pode ser avaliada através da comparação dos níveis de compostos nas várias espécies e atrofia de RPE descritos nos Exem- plos 3 e 4 acima e outros Exemplos aqui antes do tratamento e pós- tratamento por tal agente terapêutico e avaliar se as anormalidades nos níveis desses compostos e se atrofia de RPE no modelo celular de BCD melhoram pós-tratamento. Similarmente, doses, formulações (por exemplo, formulação para compostos químicos, ingredientes farma- cêuticos ativos ou tipo de vetor e/ou capsídeo para terapia genética ou tipo de vetor para edição genética) ou construtos-chave diferentes (por exemplo, um promotor ou outra sequência reguladora em um cassete de expressão de terapia genética) de um agente terapêutico podem ser comparados usando o modelo celular de BCD. Ainda, modelo celu- lar de BCD pode ser usado para testar a eficácia de um dispositivo médico ou método, incluindo, sem limitação, na administração de agentes terapêuticos a células oculares ou na melhora na eficiência de transdução ou transfecção. Seria compreendido que as células trata- das podem ser comparadas com células não tratadas ou com as mesmas células antes da exposição ao composto. Dosagens diferen- tes podem ser usadas para determinar a faixa de dosagem eficaz (medida por célula, por 1 milhão de células por 0,5 milhão de células, etc). Dados em relação aos níveis de compostos diferentes de ácidos graxos e outros compostos e atrofia de RPE declarados nos Exemplos 3 e 4 acima, em células iPS-RPE de pacientes com BCD (pós- tratamento vs. sem tratamento) comparado com aqueles em células de RPE ou iPS-RPE de controle saudável, podem ser usados para avaliar efeito terapêutico e faixa de dosagem eficaz.
[470] Ainda, linhagens celulares iPS específicas de paciente com BCD, linhagens celulares iPS-RPE e outras linhagens celulares deri- vadas de iPS podem ser usadas para avaliar tais respostas individuais do paciente a um agente terapêutico, dose ou dispositivo. As células iPS específicas do paciente, células iPS-RPE e outras células deriva- das de iPS possuem características específicas para cada paciente, incluindo, sem limitação, resposta imune (por exemplo, imunidade in- tracelular, imunidade RPE), genótipo (por exemplo, mutações diferen- tes entre pacientes que podem resultar em uma resposta diferente). Tal aplicação pode ser usada para desenvolver e avaliar agente tera- pêutico individualizado (por exemplo, sorotipos de vetor de AAV dife- rentes ou mutações de capsídeo) ou dosagem ótima personalizada para pacientes diferentes da mesma doença. Esta abordagem pode ser usada para outras doenças, incluindo, sem limitação, outras doen- ças oculares.
[471] Uma vez que iPS-RPE específica para paciente com BCD revelou diferenças individuais em pacientes com BCD, ela pode ser usada para avaliar dosagem ótima individualizada e desenvolver me- dicina personalizada. Por exemplo, como visto nos Exemplos de tera- pia genética abaixo, na mesma dosagem de 1x10e5 MOI, AAV2.CYP4V2op atingiu níveis de resgate diferentes (isto é, níveis de eficácia diferentes) de atrofia de RPE entre iPS-RPE de P1 e P2. Esta é uma vantagem que o modelo celular de BCD tem sobre modelos animais.
[472] Células iPS-RPE específicas de paciente com BCD (isto é, modelo celular de BCD) podem ser usadas para avaliar e sugerir do- sagem terapêutica eficaz para tratamento in vivo ao multiplicar o nível de dosagem ótimo (por exemplo, indicado como MOI para terapia ge- nética in vitro) determinado em modelo celular de BCD in vitro pelo número estimado de células oculares (por exemplo, células de RPE) direcionadas para tratamento in vivo para se chegar ao nível de dose de vetores de terapia genética para uso in vivo (por exemplo, GC ou gp). Tal nível de dose de vetor é ajustado por um multiplicador (por exemplo 1 a 10) (por exemplo, 1 a 5 para injeção sub-retinal ou 5 a 10 para injeção intravítrea); os outros fatores afetando o multiplicador a serem aplicados incluem o tamanho da área direcionada e o indivíduo sendo tratado (por exemplo, a idade, peso, estágio de desenvolvimen- to da doença e condição do indivíduo a ser tratado e reações imunes potenciais (isto é, NAbs preexistentes); a localização e densidade das células direcionadas para tratamento) para sugerir a faixa de dose efi- caz terapêutica para tratamento in vivo, que pode ser confirmada ou refinada mais por testes clínicos. Este método pode ser também usado para avaliar ou sugerir dose ótima personalizada para tratamento in vivo para paciente individual. Exemplo 6 – Modelo Celular de BCD com Mutações de CYP4V2 Cria- das Artificialmente
[473] Devido ao fato de BCD ser uma doença rara, amostras de paciente podem ser difíceis de obter. Para superar esta dificuldade, um modelo celular de BCD pode ser gerado usando tecnologias de edição genética tal como CRISPR para criar mutações artificiais no gene CYP4V2 em células de paciente não BCD tais como linhagens celulares-tronco embriônica (ES) ou células iPS de um indivíduo sem BCD.
[474] Por exemplo, como demonstrado nos presentes Exemplos, sgRNA1, sgRNA2, sgRNA3, sgRNA4 e sgRNA5 (vide SEQ ID NOs: 48 a 52 para a sequência de elemento protoespaçador em cada um de sgRNA1, sgRNA2, sgRNA3, sgRNA4 e sgRNA5, respectivamente; Vi- de SEQ ID NO; 55 e 59 para sequência adicional para sgRNAs IVT) foram usados em combinação com proteína SpCas9 para criar cliva- gem em uma região do gene CYP4V2 em DNA genômico do paciente com BCD contendo a mutação c.802-8_810del17insGC, a mutação de CYP4V2 mais comum dentre pacientes com BCD. Dentre eles, sgRNA 3, sgRNA 4 e sgRNA 5 não são específicos para a sequência de mu- tação c.802-8_810del17insGC e desta maneira podem criar quebra de DNA de filamento duplo (DSB) no gene CYP4V2 de uma célula saudá- vel (por exemplo, uma ES ou iPSC sem uma mutação de CYP4V2). Em particular, após transfecção, sgRNA4 e Cas9 podem criar uma DSB em éxon 7 de gene CYP4V2, que pode resultar em uma mutação em éxon 7 (em um ou ambos os alelos) quando o DNA é reparado através de união de extremidade não homóloga (NHEJ) em células, por exemplo, um erro de indel criado por NHEJ pode resultar em uma mutação de mudança de estrutura. Como resultado, algumas células podem ter mutações de CYP4V2 criadas artificialmente e podem ser usadas como um modelo de doença celular BCD ou usadas para gerar modelo celular de BCD (por exemplo, diferenciar as células ES ou iPS em células de RPE para gerar mutação de CYP4V2 contendo células ES-RPE-iPS-RPE). Similarmente, dois conjuntos de gRNAs projetados para criar DSB em regiões diferentes do gene CYP4V2 podem ser usados para gerar uma mutação de deleção ou inativação grande den- tro do gene CYP4V2 ou inativar o gene CYP4V2 inteiro em células, desta maneira gerando um modelo celular de BCD contendo uma(s) mutação(ões) de CYP4V2. Discussão mais detalhada de como usar sistema CRISPR para cortar e/ou corrigir uma sequência alvo e como validar os resultados é provida nos Exemplos e presente descrição.
[475] O modelo celular de BCD com mutações de CYP4V2 cria- das artificialmente pode ser usado para imitar modelo celular específi- co de paciente com BCD em estudo de BCD e funções de CYP4V2, bem como em aplicações relacionadas como aqui discutido, incluindo, mas não limitado a, teste e comparação de candidatos a fármaco, de- terminando a faixa de dosagem e testando dispositivo médico ou mé- todo de administração.
[476] O mesmo método pode ser usado para gerar modelos de doença celular com mutações criadas artificialmente para uma doença ocular ou outra, incluindo as associadas com a mutação ou defeito ge- nético em um ou mais gene(s) mostrados na Tabela 4. Exemplo 7 – Geração e Uso de Controle Isogênico para Doenças Ocu- lares
[477] Uma linhagem celular iPS específica de paciente isogênica com mutação corrigida e/ou outras linhagens celulares derivadas da mesma (por exemplo, células iPS-RPE, iPS-RPCs, iPS-CECs, células iPS-CE ou outras células iPS-oculares) pode ser usada como um con- trole isogênico em estudo de uma doença e/ou nas implicações da mu-
tação específica ou gene defeituoso.
Um controle convencional (por exemplo, uma linhagem celular, por exemplo, uma linhagem celular ES-RPR ou iPS-RPE) derivado de ES ou um outro indivíduo possui diferenças individuais incluindo diferenças genéticas de um paciente em adição a diferenças no gene relacionado à doença.
Este Exemplo provê um método para eliminar diferenças individuais entre controles e o “ruído de base” que resultou das mesmas.
Ele compreende geração e uso de um controle isogênico com mutação corrigida de um paciente para comparar com a mesma linhagem celular do paciente carregando a mutação.
Uma vez que um modelo de doença específico de paciente e um controle isogênico com mutação corrigida derivado do mesmo paciente não têm quaisquer diferenças individuais, eles podem ser analisados e comparados para identificar com precisão o fenótipo, anormalidades bioquímicas e outros defeitos estruturais ou funcionais associados com a mutação ou gene defeituoso do paciente.
Um con- trole isogênico com mutação corrigida pode ser gerado usando tecno- logias de edição genética incluindo, sem limitação, CRISPR, ZFN e TALEN.
Um exemplo específico de como usar edição genética CRISPR para corrigir a mutação c.802-8_810del17insGC, a mutação mais comum dentre pacientes com BCD, desta maneira gerando um controle isogênico a partir de um paciente com BCD, é provido nos presentes Exemplos.
A mesma abordagem pode ser usada para criar controle isogênico para outras doenças oculares.
Controles isogênicos têm vantagens significantes com relação a controles convencionais e podem ser indispensáveis em estudo de doenças oculares com um fenótipo sutil (por exemplo, degeneração macular relacionada à idade (AMD)). Ainda, controles isogênicos podem ser usados para comparar e identificar as diferenças de impacto de fatores de risco genéticos múltiplos, mutações e/ou genes múltiplos em uma doença ocular atra- vés da criação de controle isogênico com cada um do fator de risco genético, mutação ou gene corrigido e comparar tal controle isogênico com o modelo de doença para determinar o impacto de fator de risco relacionado, mutação ou gene na doença ocular e outras, incluindo as associadas com a mutação ou defeito genético em um ou mais genes mostrados na Tabela 4.
[478] Um controle isogênico pode ser comparado com um mode- lo de doença celular específico de paciente para identificar fenótipo, anormalidades bioquímicas e outros defeitos estruturais e funcionais associados com a mutação genética e/ou a proteína defeituosa relaci- onada. Um Exemplo específico não limitante e discussões de como usar bioensaios para identificar anormalidades bioquímicas/fenótipo entre linhagens celulares de paciente e controles são providos aqui nos Exemplos 3 e 4 acima, incluindo, sem limitação, rastreamentos lipidômicos, proteômicos e isotópicos. Discussão sobre Modelo Humano de Doença Celular BCD
[479] Dado que BCD é uma doença rara, é impraticável obter cé- lulas de RPE humanas manifestando a doença de pacientes com BCD através de biópsia. A falta de um modelo humano de doença BCD limi- tou pesquisa anterior sobre BCD a uso de células causadoras de do- ença não BCD (por exemplo, fibroblastos e linfócitos, que não são par- te do olho) e soro de pacientes com BCD como objetos de estudo. Os resultados desses estudos foram centrados em anabolismo de ácido graxo.
[480] No estudo descrito aqui, linhagens celulares iPS derivadas de pacientes com BCD foram geradas com sucesso e utilizadas para gerar células de RPE de doença BCD específicas de paciente, que carregam fenótipo da doença BCD in vitro. O fenótipo de BCD foi iden- tificado diretamente em células iPS-RPE específicas de paciente com BCD, o tipo de célula principal afetado em BCD. Antes do presente estudo, não era conhecido se linhagens celulares iPS e linhagens ce-
lulares iPS-RPE poderiam ser geradas com sucesso devido, em parte, a anabolismo de ácido graxo associado com BCD.
[481] Teste bioquímico mostrou que células iPS-RPE de pacien- tes com BCD têm níveis anormais de ácidos graxos comparado com aqueles de células iPS-RPE de controle saudável, incluindo aquelas que não foram relatadas em estudos BCD anteriores. O fenótipo in vi- tro de células iPS-RPE específicas de doença BCD provê mais intros- pecções para as vias reguladas por CYP4V2 e patogênese de BCD, e provê introspecções valiosas na patogênese de BCD e função de pro- teína BYC4V2, e ainda apoia o uso de linhagens celulares iPS-RPE de pacientes com BCD como um modelo de doença humano para BCD viável e robusto.
[482] As linhagens celulares iPS, linhagens celulares iPS-RPE e outras linhagens celulares iPS-oculares de pacientes com BCD têm aplicações adicionais, tal como uso para avaliação de fármaco, desen- volvimento de novos agentes terapêuticos ou determinação de faixas de dosagem, bem como uso em terapia celular.
[483] Em adição a iPS, iPS-RPE e outras linhagens celulares iPS-oculares específicas de paciente com BCD, um modelo celular humano de doença BCD pode ser desenvolvido através de edição ge- nética para criar mutações de CYP4V2 patológicas artificialmente em outras linhagens celulares derivadas de células ES ou células iPS de indivíduos não BCD, incluindo, sem limitação, linhagens celulares ES, linhagens celulares iPS e linhagens celulares RPE.
[484] Ainda, métodos para gerar controles isogênicos para doen- ças oculares são providos. Controles isogênicos não possuem diferen- ças individuais de um modelo de doença específica de paciente. Desta maneira um controle isogênico tem suas vantagens em estudo de do- enças oculares com relação a controles convencionais. Terapia genética com CYP4V2
Exemplo 8 – cDNAs Codificando a Proteína CYP4V2 Humana e um Proteína CYP4V2 Funcional
[485] Três cDNAs foram usados neste estudo. O cDNA com se- quência mostrada em SEQ ID NO: 1 (daqui em diante referido como CYP4V2st) e o cDNA com sequência mostrada em SEQ ID NO: 2 (da- qui em diante referido como CYP4V2op) ambos codificam a proteína CYP4V2 humana (sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO:
4. NP_997235.3). O cDNA com sequência mostrada na SEQ ID NO: 3 (daqui em diante referido como CYP4V2fv) codifica uma variante fun- cional da proteína CYP4V2 humana (sequência de aminoácido mos- trada na SEQ ID NO: 5).
[486] A SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácido de uma vari- ante funcional da proteína CYP4V2 humana (SEQ ID NO: 4). Ambas as proteínas (SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5) são proteínas CYP4V2 funcionais como aqui definido. A proteína CYP4V2 funcional mostrada em SEQ ID NO: 5 tem uma mudança de aminoácido da proteína CYP4V2 humana mostrada em SEQ ID NO: 4. O cDNA mostrado na SEQ ID NO: 3 codificando a proteína CYP4V2 funcional (SEQ ID NO: 5) tem duas diferenças de nucleotídeo do cDNA mostrado na SEQ ID NO: 1 que codifica a proteína CYP4V2 humana (SEQ ID NO: 4). Am- bos o cDNA com códon otimizado mostrado na SEQ ID NO: 2 e cDNA mostrado na SEQ ID NO: 1 codificam a proteína CYP4V2 humana (SEQ ID NO: 4) e compartilham uma identidade de sequência de 77%.
[487] Um cDNA com códon otimizado (CYP4V2fv-op) codificando a proteína CYP4V2 funcional de SEQ ID NO: 5 é provido aqui, o qual compreende a sequência de cDNA de CYP4V2op (SEQ ID NO: 2), ex- ceto que a sequência de CYP4V2fv-op retém a uma ou duas diferen- ças de nucleotídeo entre SEQ ID NOs: 1 e 3. Em adição a CYP4V2op e CYP4V2fv-op, outros cDNAs com códon otimizado ou sequências de ácido nucleico codificando a proteína CYP4V2 humana ou uma proteí-
na CYP4V2 funcional (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 29) podem ser gerados através de métodos descritos na presente descrição.
Uma molécula de ácido nucleico com códon otimizado codi- ficando a proteína CYP4V2 humana (SEQ ID NO: 4) ou uma proteína CYP4V2 funcional (SEQ ID NO: 5 ou qualquer uma de SEQ ID NOs: 6 a 29) pode ser testada em linhagens celulares iPS-RPE específicas de paciente com BCD (ou células de RPE com mutações em CYP4V2 artificialmente criadas) para determinar e/ou confirmar sua eficiência de expressão e resgatar a função para tratamento de BCD.
Tais testes incluem, sem limitação, expressão de proteína (por exemplo, Western blot específico para a proteína CYP4V2 funcional que ela codifica), PCR para detectar a expressão de gene relacionada e/ou eficácia em resgate das anormalidades bioquímicas e atrofia de RPE em linhagens celulares iPS-RPE específicas para paciente com BCD por composi- ções (por exemplo, em um cassete de expressão e/ou um vetor) e mé- todos providos aqui.
SEQ ID NO: 1 (CYP4V2st cDNA, 1578 pb) ATGGCGGGGCTCTGGCTGGGGCTCGTGTGGCAGAA- GCTGCTGCTGTGGGGCGCGGCGAG- TGCCCTTTCCCTGGCCGGCGCCAGTCTGGTCCTGAGCCTGCTG- CAGAGGGTGGCGAGCTACGCGCGGAAATGGCAG- CAGATGCGGCCCATCCCCACGGTGGCCCGCGCCTACCCAC- TGGTGGGCCACGCGCTGCTGATGAAGCCGGACGGGCGA- GAATTTTTTCAGCAGATCATTGAGTACACAGAGGAATAC- CGCCACATGCCGCTGCTGAAGCTCTGGGTCGGGCCAG- TGCCCATGGTGGCCCTTTATAATGCAGAAAATGTG- GAGGTAATTTTAACTAGTTCAAAGCAAATTGACAAATCCTC- TATGTACAAGTTTTTAGAACCATGGCTTGGCCTAG- GACTTCTTACAAGTACTGGAAACAAATGGCGCTCCAGGAGAAA- GATGTTAACACCCACTTTCCATTTTACCATTCTGGAAGATTTCTTA-
GATATCATGAATGAACAAGCAAATATATTGGTTAAGAAACTT- GAAAAACACATTAACCAAGAA- GCATTTAACTGCTTTTTTTACATCACTCTTTGTGCCTTAGA- TATCATCTGTGAAACAGCTATGGGGAAGAA- TATTGGTGCTCAAAGTAATGATGATTCCGAGTATGTCCGTGCAG- TTTATAGAATGAGTGAGATGATATTTCGAAGAATAAA- GATGCCCTGGCTTTGGCTTGATCTCTGGTACCTTATGTTTAAA- GAAGGATGGGAACACAAAAAGAGCCTTCAGATCCTACAT- ACTTTTACCAACAGTGTCATCGCTGAAC- GGGCCAATGAAATGAACGCCAATGAAGACTGTAGAGGTGATGG- CAGGGGCTCTGCCCCCTCCAAAAATAAACGCAGGGCCTTTCTT- GACTTGCTTTTAAGTGTGACTGATGAC- GAAGGGAACAGGCTAAGTCATGAAGATATTCGAGAAGAAGTT- GACACCTTCATGTTTGAGGGGCACGATACAACTGCAGCTGCAA- TAAACTGGTCCTTATACCTGTT- GGGTTCTAACCCAGAAGTCCAGAAAAAAGTGGATCATGAATT- GGATGACGTGTTTGGGAAGTCTGACCGTCCCGCTACAGTAGAA- GACCTGAAGAAACTTCGGTATCTGGAATGTGTTATTAAGGA- GACCCTTCGCCTTTTTCCTTCTGTTCCTTTATTTGCCCGTAG- TGTTAGTGAAGATTGTGAAGTGGCAGGTTACAGAG- TTCTAAAAGGCACTGAAGCCGTCATCATTCCCTATGCATT- GCACAGAGATCCGAGATACTTCCCCAACCCCGAGGAG- TTCCAGCCTGAGCGGTTCTTCCCCGA- GAATGCACAAGGGCGCCATCCATATGCCTAC- GTGCCCTTCTCTGCTGGCCCCAGGAACTG- TATAGGTCAAAAGTTTGCTGTGATGGAAGAAAAGAC- CATTCTTTCGTGCATCCTGAGGCACTTTTGGATAGAATCCAAC- CAGAAAAGAGAAGAGCTTGGTCTAGAAGGACAGTTGAT- TCTTCGTCCAAGTAATGGCATCTGGATCAAGTTGAAGAGGA- GAAATGCAGATGAACGCTAA
SEQ ID NO: 2 (CYP4V2op cDNA, 1578 pb) ATGGCTGGACTGTGGCTGGGACTGGTGTGG- CAGAAACTGCTGCTGTGGGGGGCCGCTTCCGCACTGTCAC- TGGCTGGGGCTTCACTGGTGCTGAGCCTGCTG- CAGAGGGTGGCCTCCTACGCCAGAAAGTGGCAG- CAGATGAGGCCCATCCCTACCGTGGCCAGAGCCTATCCAC- TGGTGGGACACGCACTGCTGATGAAGCCTGACGGCAGAGAG- TTCTTTCAGCAGATCATCGAGTACACAGAGGAG- TATAGGCACATGCCACTGCTGAAGCTGTGGGTGG- GACCCGTGCCTATGGTGGCCCTGTACAACGCCGAGAATGTG- GAAGTGATCCTGACCAGCAGCAAGCAGATCGATAAGTCTAG- CATGTATAAGTTCCTGGAGCCTT- GGCTGGGCCTGGGCCTGCTGACCTCTACAGGCAACAAGTGGAG- GAGCCGGAGAAAGATGCTGACCCCAACATTCCAC- TTTACAATCCTGGAGGACTTCCTGGACATCATGAACGAG- CAGGCCAATATCCTGGTGAAGAAGCTGGAGAAGCACATCAAC- CAGGAGGCCTTTAATT- GCTTCTTTTACATCACCCTGTGCGCCCTG- GACATCATCTGTGAGACAGCTATGGGCAA- GAACATCGGCGCCCAGTCTAATGACGATAGCGAGTAC- GTGCGGGCCGTGTATAGAATGAGCGAGATGATCTTTAGGCG- CATCAAGATGCCCTGGCTGTGGCTGGATCTGTGG- TATCTGATGTTCAAGGAGGGCTGGGAGCACAAGAAGTCCCTG- CAGATCCTGCACACCTTTACAAACTCTGTGATCGCCGAGA- GAGCCAATGAGATGAACGCCAATGAGGACTG- TAGGGGCGATGGAAGGGGCAGCGCCCCTTCCAAGAACAAGCG- GAGAGCCTTCCTGGACCTGCTGCTGAGCGTGACCGAC- GATGAGGGCAATCGCCTGTCCCACGAGGACATCCGGGAG- GAGGTGGATACATTCATGTTTGAGGGACACGACAC- CACAGCCGCCGCCATCAACTGGTCCCTGTAC-
CTGCTGGGCTCTAATCCAGAGGTGCAGAAGAAGGTGGATCAC- GAGCTGGACGACGTGTTCGGCAAGTCCGACAGGCCAGCAAC- CGTGGAGGATCTGAAGAAGCTGAGATACCTGGAG- TGCGTGATCAAGGAGACAC- TGCGCCTGTTCCCCTCTGTGCCTCTGTTT- GCCCGGTCCGTGTCTGAGGACTGTGAGGTGGCCGGC- TATCGCGTGCTGAAGGGCACCGAGGCCGTGATCATCCCTTAC- GCCCTGCACCGGGACCCCAGGTATTTCCCTAACCCAGAGGAG- TTTCAGCCAGAGAGATTCTTTCCCGAGAATGCCCAGGG- CAGGCACCCTTACGCCTATGTGCCATTCTCCGCCGGAC- CAAGGAACTGCATCGGACAGAAGTTTGCCGTGATGGAGGA- GAAAACCATCCTGTCTTGTATCCTGAGACACTTCTGGATCGA- GAGCAATCAGAAGAGGGAGGAGCTGGGCCTG- GAGGGACAGCTGATCCTGCGGCCAAGCAACGGCATCTG-
GATCAAACTGAAAAGAAGGAACGCTGACGAGAGGTAA SEQ ID NO: 3 (CYP4V2fv cDNA, 1578 pb) ATGGCGGGGCTCTGGCTGGGGCTCGTGTGGCAGAA- GCTGCTGCTGTGGGGCGCGGCGAG- TGCCCTTTCCCTGGCCGGCGCCAGTCTGGTCCTGAGCCTGCTG- CAGAGGGTGGCGAGCTACGCGCGGAAATGGCAG- CAGATGCGGCCCATCCCCACGGTGGCCCGCGCCTACCCAC- TGGTGGGCCACGCGCTGCTGATGAAGCCGGACGGGCGA- GAATTTTTTCAGCAGATCATTGAGTACACAGAGGAATAC- CGCCACATGCCGCTGCTGAAGCTCTGGGTCGGGCCAG- TGCCCATGGTGGCCCTTTATAATGCAGAAAATGTG- GAGGTAATTTTAACTAGTTCAAAGCAAATTGACAAATCCTC- TATGTACAAGTTTTTAGAACCATGGCTTGGCCTAG- GACTTCTTACAAGTACTGGAAACAAATGGCGCTCCAGGAGAAA- GATGTTAACACCCACTTTCCATTTTACCATTCTGGAAGATTTCTTA- GATATCATGAATGAACAAGCAAATATATTGGTTAAGAAACTT-
GAAAAACACATTAACCAAGAA- GCATTTAACTGCTTTTTTTACATCACTCTTTGTGCCTTAGA- TATCATCTGTGAAACAGCTATGGGGAAGAA- TATTGGTGCTCAAAGTAATGATGATTCCGAGTATGTCCGTGCAG- TTTATAGAATGAGTGAGATGATATTTCGAAGAATAAA- GATGCCCTGGCTTTGGCTTGATCTCTGGTACCTTATGTTTAAA- GAAGGATGGGAACACAAAAAGAGCCTTAAGATCCTACAT- ACTTTTACCAACAGTGTCATCGCGGAAC- GGGCCAATGAAATGAACGCCAATGAAGACTGTAGAGGTGATGG- CAGGGGCTCTGCCCCCTCCAAAAATAAACGCAGGGCCTTTCTT- GACTTGCTTTTAAGTGTGACTGATGAC- GAAGGGAACAGGCTAAGTCATGAAGATATTCGAGAAGAAGTT- GACACCTTCATGTTTGAGGGGCACGATACAACTGCAGCTGCAA- TAAACTGGTCCTTATACCTGTT- GGGTTCTAACCCAGAAGTCCAGAAAAAAGTGGATCATGAATT- GGATGACGTGTTTGGGAAGTCTGACCGTCCCGCTACAGTAGAA- GACCTGAAGAAACTTCGGTATCTGGAATGTGTTATTAAGGA- GACCCTTCGCCTTTTTCCTTCTGTTCCTTTATTTGCCCGTAG- TGTTAGTGAAGATTGTGAAGTGGCAGGTTACAGAG- TTCTAAAAGGCACTGAAGCCGTCATCATTCCCTATGCATT- GCACAGAGATCCGAGATACTTCCCCAACCCCGAGGAG- TTCCAGCCTGAGCGGTTCTTCCCCGA- GAATGCACAAGGGCGCCATCCATATGCCTAC- GTGCCCTTCTCTGCTGGCCCCAGGAACTG- TATAGGTCAAAAGTTTGCTGTGATGGAAGAAAAGAC- CATTCTTTCGTGCATCCTGAGGCACTTTTGGATAGAATCCAAC- CAGAAAAGAGAAGAGCTTGGTCTAGAAGGACAGTTGAT- TCTTCGTCCAAGTAATGGCATCTGGATCAAGTTGAAGAGGA-
GAAATGCAGATGAACGCTAA SEQ ID NO: 4 (proteína CYP4V2 humana, NP_997235.3,
525 aa) MAGLWLGLVWQKLLLWGAA- SALSLAGASLVLSLLQRVASYARKWQQMRPIPTVARAYPLVGHALL- MKPDGREFFQQIIEYTEEYRHMPLLKLWVGPVPMVALYNAEN- VEVILTSSKQIDKSSMYKFLEPWLGLGLLTSTGNKWRSRRKMLT- PTFHFTILEDFLDIMNEQANILVKKLEKHINQEAFNCFFYITLCALDII- CETAMGKNIGAQSNDDSEYVRAVYRMSEMIFRRIKMPWLWLDLW- YLMFKEGWEHKKSLQILHTFTNSVIAERANEMNANEDCRGDGRG- SAPSKNKRRAFLDLLLSVTDDEGNRLSHEDIREEVDTFMFEGH- DTTAAAINWSLYLLGSNPEVQKKVDHELDDVFGKSDRPATVED- LKKLRYLECVIKETLRLFPSVPLFARSVSEDCEVAGYRVLKG- TEAVIIPYALHRDPRYFPNPEEFQPERFFPENAQGRHPYAYVPF- SAGPRNCIGQKFAVMEEKTILSCILRHFWIESNQKREELGLEGQLIL-
RPSNGIWIKLKRRNADER SEQ ID NO: 5 (nenhuma variante funcional de proteína CYP4V2 humana; 525 aa) MAGLWLGLVWQKLLLWGAA- SALSLAGASLVLSLLQRVASYARKWQQMRPIPTVARAYPLVGHALL- MKPDGREFFQQIIEYTEEYRHMPLLKLWVGPVPMVALYNAEN- VEVILTSSKQIDKSSMYKFLEPWLGLGLLTSTGNKWRSRRKMLT- PTFHFTILEDFLDIMNEQANILVKKLEKHINQEAFNCFFYITLCALDII- CETAMGKNIGAQSNDDSEYVRAVYRMSEMIFRRIKMPWLWLDLW- YLMFKEGWEHKKSLKILHTFTNSVIAERANEMNANEDCRGDGRG- SAPSKNKRRAFLDLLLSVTDDEGNRLSHEDIREEVDTFMFEGH- DTTAAAINWSLYLLGSNPEVQKKVDHELDDVFGKSDRPATVED- LKKLRYLECVIKETLRLFPSVPLFARSVSEDCEVAGYRVLKG- TEAVIIPYALHRDPRYFPNPEEFQPERFFPENAQGRHPYAYVPF- SAGPRNCIGQKFAVMEEKTILSCILRHFWIESNQKREELGLEGQLIL-
RPSNGIWIKLKRRNADER SEQ ID NO: 6 (fragment de CYP4V2 sem domínio de transmembrana; 490 aa) RVASYARKWQQMRPIPTVARAYPLVGHALLMKPDGREF- FQQIIEYTEEYRHMPLLKLWVGPVPMVALYNAEN- VEVILTSSKQIDKSSMYKFLEPWLGLGLLTSTGNKWRSRRKMLT- PTFHFTILEDFLDIMNEQANILVKKLEKHINQEAFNCFFYITLCALDII- CETAMGKNIGAQSNDDSEYVRAVYRMSEMIFRRIKMPWLWLDLW- YLMFKEGWEHKKSLQILHTFTNSVIAERANEMNANEDCRGDGRG- SAPSKNKRRAFLDLLLSVTDDEGNRLSHEDIREEVDTFMFEGH- DTTAAAINWSLYLLGSNPEVQKKVDHELDDVFGKSDRPATVED- LKKLRYLECVIKETLRLFPSVPLFARSVSEDCEVAGYRVLKG- TEAVIIPYALHRDPRYFPNPEEFQPERFFPENAQGRHPYAYVPF- SAGPRNCIGQKFAVMEEKTILSCILRHFWIESNQKREELGLEGQLIL-
RPSNGIWIKLKRRNADER Exemplo 9 – Projeto de Cassetes de Expressão e Vetores de Admin- istração Eficientes para Terapia genética com CYP4V2
[488] Como descrito aqui, um cassete de expressão e um vetor de administração compreendem vários elementos. Os resultados po- dem variar significantemente com base em projetos diferentes. Dada a grande quantidade de opções em cada um dos elementos importantes incluindo os, mas não limitado aos, listados abaixo e várias combina- ções dos mesmos, um projeto sério de cassetes de expressão e veto- res de administração eficientes é necessário para o sucesso da terapia genética com CYP4V2. Ainda, o processo do projeto precisa levar em consideração o fenótipo e características da doença (por exemplo, ti- pos de células e/ou tecidos direcionados para tratamento) e segurança (por exemplo, toxidez, resposta imune). Finalmente, um projeto precisa ser testado e verificado em um modelo de doença importante. (a) Tipo de vetor de administração; (b) Sorotipo do vetor e projeto/seleção do capsídeo; (c) Projeto de vetor adicional, por exemplo, ssAAV vs. scAAV;
(d) Projeto de cDNA; (e) Projeto/seleção de promotor; (f) Projeto/seleção de sinal de poliA; e (g) Quaisquer outras sequências reguladoras, por exemplo, um potenciador, ou sequência de junção/união.
[489] Para (a), um vetor viral foi escolhido para obter eficiência de transdução alta em células-alvo (por exemplo, RPE humano). Dentre vários tipos de vetores virais, vetores de AAV foram escolhidos devido ao seu perfil de segurança e o tamanho do ácido nucleico codificando CYP4V2 (por exemplo, um cDNA de CYP4V2) se ajusta no limite de empacotamento de vetores de AAV. Vetores com limite de empacota- mento maior, por exemplo, um vetor de HSV, um vetor de lentivírus, um vetor de Baculovírus ou adenovírus, pode ser também usado para terapia genética com CYP4V2. Em adição a vetores virais, vetores não virais, por exemplo, nanopartículas, incluindo, mas não limitado a, na- nopartículas de lipossomos, nanopartículas de lipídeo sólidas, lipople- xo de protamina lipossomo/DNA (LPD), podem ser também usados para terapia genética com CYP4V2.
[490] Para (b), devido ao fato das células de RPE serem o tipo de célula principal para tratamento em terapia genética com CYP4V2 para BCD, um sorotipo de AAV com eficiência de transdução suficiente em células de RPE é preferido. Ainda, os fatores que seguem foram con- siderados. Devido à expressão de CYP4V2 ser sido observada am- plamente em vários tecidos e órgãos humanos, por exemplo, coração, cérebro, placenta, pulmão, fígado, músculo esqueletal, rim, pâncreas, retina, RPE, córnea e linfócitos, e em adição a RPE, BCD também afe- ta coroide, fotorreceptores e, em alguns pacientes, a córnea, e que anormalidades foram anteriormente relatadas em fibroblastos da pele, linfócitos e soro de pacientes com BCD, sorotipos de AAV e estruturas do capsídeo que não restringem transdução de AAV apenas em célu-
las de RPE, mas também podem transduzir outras células/tecidos, por exemplo, fotorreceptores, coroide e/ou córnea, podem ser projetados e/ou selecionados, em adição a sorotipos de AAV e estruturas do cap- sídeo com boa eficiência de transdução em células de RPE. Como re- sultado, uma ampla gama de sorotipos de AAV e estruturas do capsí- deo é adequada e pode ser usada. AAV2, AAV5, AAV8, AAV1, AAV9 e um vetor de AAV com mutante de capsídeo (AAV2 (Y444F+Y500F+Y730F) foram selecionados para o estudo. Em adição à eficiência de transdução, um outro fator que foi considerado são os NABs preexistentes contra sorotipos de AAV diferentes na população geral e outras diferenças individuais potenciais dentre pacientes (inclu- indo, sem limitação, outros tipos de respostas imunes (por exemplo, imunidade intracelular ou imunidade RPE) ou devido à diferença em genótipo (por exemplo, mutações diferentes)). Neste projeto, múltiplos tipos de AAV foram usados e testados incluindo aqueles compartilhan- do reatividade cruzada baixa com NABs para diminuir as respostas imunes potenciais e maximizar os efeitos terapêuticos para pacientes diferentes.
[491] Para (c), devido ao fato do cDNA de CYP4V2 de compri- mento integral ser de 1578 pb (incluindo códons de início e parada), ambos projetos de ssAAV e scAAV podem ser usados em terapia ge- nética com CYP4V2. Projetos de ssAAV e scAAV têm, cada um, seus próprios prós e contras como aqui descrito. Comparado com ssAAV, um projeto de ssAAV oferece expressão rápida e estabilidade de DNA maior. No entanto, seu limite de empacotamento (cerca de 2,4-2,5 kb) restringe o uso de sequências reguladoras de tamanho maior e poten- cialmente mais ativas (por exemplo, promotor, sinal de PoliA). Ainda, dependendo do tamanho do promotor usado, um projeto de ssAAV pode necessitar encurtar ou continuar sem algumas sequências regu- ladoras opcionais (por exemplo, um potenciador). Ambos os vetores de ssAAV e scAAV foram projetados e gerados para uso em terapia genética com CYP4V2. Vários AAVs pseudotipificados contendo ge- noma de AAV2 (por exemplo, as ITRs AAV2 (SEQ ID NOs: 42 e 43) e um capsídeo de cada um dos tipos de AAV descritos em (b) acima fo- ram gerados. Para o scAAV, uma das duas ITRs AAV2 foi trunca- da/mutada (SEQ ID NO: 44).
[492] Para (d), como aqui discutido, há múltiplas proteínas CYP4V2 funcionais. Ainda, várias sequências de ácido nucleico po- dem codificar a mesma proteína. Três (3) cDNAs foram gerados no estudo; o primeiro (SEQ ID NO: 1, referido como CYP4V2st) codifican- do a proteína CYP4V2 humana (SEQ ID NO: 4), o segundo é um cDNA com códon otimizado (SEQ ID NO: 2, referido como CYP4V2op) codificando a proteína CYP4V2 humana (SEQ ID NO: 2) e o terceiro (SEQ ID NO: 2, referido como CYP4V2fv) codificando uma variante funcional da proteína CYP4V2 humana (SEQ ID NO: 5). Uma sequên- cia Kozak (sequências exemplares mostradas na SEQ ID NO: 37 ou 38) foi inserida antes do códon de início de cDNA.
[493] Para (e), similar ao raciocínio em (b), o promotor precisa funcionar bem para dirigir a expressão em células-alvo (por exemplo, células de RPE quando o tipo de célula-alvo para tratamento for RPE, células da córnea quando o tipo de célula-alvo for células da córnea). O promotor é um elemento principal no cassete de expressão de veto- res de terapia genética. Seleção de promotor ótimo pode aumentar a especificidade do alvo e expressão do gene. Dependendo do(s) tipo(s) de célula ou tecido direcionados para tratamento, o promotor usado em terapia genética com CYP4V2 pode ser ou um promotor constituti- vo ou um promotor específico de célula (por exemplo, um promotor específico para células de RPE, um promotor específico para ambos RPE e fotorreceptores, um promotor específico para células de RPE e células da coroide, um promotor específico para RPE, células fotorre-
ceptoras e da coroide, um promotor específico para células da córnea, um promotor específico para células de RPE, fotorreceptoras, da co- roide e córnea ou um promotor específico para células oculares). De- vido ao fato de CYP4V2 ser quase ubiquamente expresso e tipos de célula múltiplos serem afetados em BCD (a principal sendo RPE, ou- tros tipos de célula incluem, por exemplo, córnea, retina, linfócitos), promotores constitutivos foram escolhidos neste projeto para ampliar o efeito do cassete de expressão e vetor de administração em tipos de tecido e célula múltiplos.
Para o cassete de expressão usado em veto- res de ssAAV, um promotor constitutivo forte foi usado, o promotor CAG que é de ~1,7 kb de comprimento (sequência exemplar mostrada na SEQ ID NO: 32). O promotor CAG (também conhecido como pro- motor CBA, CAGGS ou CB) é um promotor sintético forte.
O promotor CAG é composto dos elementos reguladores que seguem: (C) elemen- to potenciador precoce de citomegalovírus (CMV); (A) a região de promotor e o primeiro éxon do gene de beta-Actina de galinha e um íntron quimérico de gene de beta-actina de galinha e o gene da beta- globina do coelho e (G) o aceitador de união do gene de beta-globina de coelho.
O promotor CAG foi usado porque ele tem atividade mais forte e de duração mais longa do que o promotor CMV (sequência exemplar mostrada na SEQ ID NO: 40), que é o promotor constitutivo mais comumente usado para dirigir a expressão em células de mamí- feros.
Para o cassete de expressão usado em vetores de scAAV, devi- do à limitação de tamanho de empacotamento de scAAV, um promotor constitutivo muito mais curto foi usado, o promotor fator de alongamen- to 1 alfa curto (EFS) (sequência exemplar mostrada na SEQ ID NO: 35). O promotor EFS é a versão miniaturizada do promotor EF-1 alfa (~1,2 kb, sequência exemplar mostrada na SEQ ID NO: 41). O promo- tor EF-1 alfa é um promotor constitutivo derivado de fator-1 alfa de alongamento humano (EF-1α). O promotor EFS pode ser também usado no projeto de cassete de expressão para ssAAVs. Em adição ao promotor CAG, promotor CMV, promotor EF1 alfa e promotor EFS, ou- tros promotores constitutivos podem ser usados, incluindo, sem limita- ção, um outro promotor viral tal como o promotor CMV, um derivado ou variante do CAG (tcc promotor CBA, CAGGS ou CB) tal como o promotor smCBA, promotor CBSB ou o promotor CBh, um outro pro- motor beta-actina tal como promotor beta-actina humano, um derivado ou variante do promotor EF-1 alfa, promotor PGK, o promotor UBC, o promotor GUSB, o promotor UCOE ou outros promotores descritos aqui. Ainda, um promotor específico de célula pode ser usado, incluin- do, sem limitação, os promotores específicos de célula ocular descritos aqui, por exemplo, um promotor VMD2 (tcc BEST1) ou um promotor RPE65 para dirigir expressão em RPE.
[494] Para (f), um poliA bGH foi usado (sequência exemplar mos- trada na SEQ ID NO: 34) para o projeto de cassete de expressão usa- do em ssAAVs e um sinal de poliA mais curto, poliA pequeno (SPA) (sequência exemplar mostrada na SEQ ID NO: 36) para o projeto de cassete de expressão usado em scAAVs. O SPA foi também usado em cassete de expressão para ssAAVs. Outros sinais de poliA (inclu- indo derivados ou variantes) podem ser também usados ao invés, in- cluindo, sem limitação, um sinal de poliA de SV40, um sinal de poliA de SV40 tardio (sequência exemplar mostrada na SEQ ID NO: 39) ou outros sinais de poliA como aqui descrito, incluindo, sem limitação, si- nal de poliA usado em combinação com um potenciador a montante (USE).
[495] Para (g), um potenciador WPRE foi usado (sequência exemplar mostrada na SEQ ID NO: 33) para o cassete de expressão usado em ssAAVs. Para projeto de cassete de expressão usado em scAAVs, dado o limite de tamanho, um potenciador não foi incluído. Deve ser notado que um potenciador é opcional em ambos os casse-
tes de expressão de CYP4V2 ssAAV e scAAV. Deve ser notado, no entanto, que é possível incluir sequências potenciadores de compri- mento curto, por exemplo, um WPRE encurtado contendo elementos gama e alfa mínimos do WPRE, em combinação com promotor de ta- manho diminuído e sinal de poliA no cassete de expressão de CYP4V2 de scAAV. Além de WPRE, outros potenciadores como des- crito aqui, tal como um potenciador HPRE ou um potenciador CTE, podem ser usados.
[496] Em alguns casos, o cassete de expressão de CYP4V2 in- clui um promotor (por exemplo, um promotor CAG (tcc CBA, CAGGS, CB), um promotor EF-1 alfa, um promotor smCBA, um promotor CBh, um promotor EFS, um promotor beta-actina humana, um promotor CMV, um promotor VMD2 ou um promotor RPE65), uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína CYP4V2 funcional (por exem- plo, um cDNA codificando a proteína CYP4V2 humana ou uma varian- te funcional ou fragmentos da mesma), opcionalmente ligada com uma sequência potenciadora (por exemplo, um potenciador WPRE, um po- tenciador HPRE ou um potenciador WPRE ou HPRE encurtado) e um sinal de poliA (por exemplo, um poliA de bGH, um SPA ou um PoliA de SV40, ou um fragmento dou derivado do mesmo, por exemplo, um po- liA de SV40 tardio) e outras sequências reguladoras (por exemplo, uma sequência Kozak). Vide SEQ ID NOs: 1-41 para sequências exemplares.
[497] Deve ser compreendido que (i) as sequências exemplares de várias sequências reguladoras providas na seção de SEQ são exemplares em natureza e há diferentes versões dessas sequências reguladoras que podem obter a mesma função ou uma similar e (ii) há diferentes variantes, fragmentos e/ou derivados dessas sequências que podem ser também usados, por exemplo, um promotor CAG trun- cado, um potenciador WPRE encurtado, um poliA de SV40 tardio.
[498] Com base na abordagem de projeto descrita acima, múlti- plos cDNAs de CYP4V2, cassetes de expressão de CYP4V2 e vetores de rAAV para uso em terapia genética com CYP4V2 foram gerados, incluindo: (1) Três cDNAs de CYP4V2 como mostrado nas SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, respectivamente.
CYP4V2st (SEQ ID NO: 1) e CYP4V2op (SEQ ID NOs 2) ambos codificam a proteína CYP4V2 humana (SEQ ID NO: 4). CYP4V2fv (SEQ ID NO: 3) codifica uma variante funcional da proteína CYP4V2 humana (SEQ ID NO: 5); (2) Dois cassetes de expressão de CYP4V2 (CYP4V2 significa uma sequência de ácido nucleico codificando a proteína CYP4V2 hu- mana ou uma proteína CYP4V2 funcional.
Vide Figura 7 para um de- senho esquemático): (i) CAG-CYP4V2-WPRE-poliA bGH (ii) EFS-CYP4V2-SPA (3) Os cDNAs de CYP4V2 e cassetes de expressão de CYP4V2 mencionados acima foram empacotados em seis vetores de AAV diferentes (AAV2, AAV5, AAV8, AAV1, AAV2(Y444F+Y500F+Y730F) e AAV9) para criar os vetores de rAAV que seguem contendo um cDNA de CYP4V2 e cassete de expressão, incluindo ambos construtos de vetor de ssAAV e scAAV: (i) AAV2/2-CAG-CYP4V2op-WPRE-poliA bGH recombinante (daqui em diante referido como AAV2.CYP4V2op), (ii) AAV2/2 (Y444F+Y500F+Y730F)-CAG-CYP4V2op-WPRE-poliA bGH recombinante (daqui em diante referido como AAV2tri(Y- F).CYP4V2op ou AAV2tri.CYP4V2op), (iii) AAV2/5-CAG-CYP4V2op-WPRE-poliA bGH recombinante (daqui em diante referido como AAV5.CYP4V2op). (iv) AAV2/5-CAG-CYP4V2st-WPRE-poliA bGH recombinante (daqui em diante referido como AAV5.CYP4V2st),
(v) AAV2/8-CAG-CYP4V2fv-WPRE-poliA bGH recombinante (daqui em diante referido como AAV8.CYP4V2fv), (vi) AAV2/1-EFS-CYP4V2op-SPA autocomplementar recombinante (daqui em diante referido como scAAV1.CYP4V2op), (vii) AAV2/5-EFS-CYP4V2op-SPA autocomplementar recombinante (daqui em diante referido como scAAV5.CYP4V2op), e (viii) AAV2/9-EFS-CYP4V2op-SPA autocomplementar recombinante (daqui em diante referido como scAAV9.CYP4V2op).
[499] Quando empacotado em um vetor de rAAV, o cassete de expressão foi flanqueado por duas ITRs de AAV2 (SEQ ID NOs: 42 e 43). Para scAAV, uma das ITRs de AAV2 foi truncada/mutada (SEQ ID NO: 44). Seria compreendido que genoma não AAV2, incluindo ITRs não AAV, pode ser usado também para empacotar o cassete de ex- pressão. Uma sequência Kozak (SEQ ID NO. 37 ou 38) foi inserida imediatamente antes dos cDNAs de CYP4V2. Vide Figura 7 para de- senhos esquemáticos mostrando o projeto desses cassetes de ex- pressão. Seria compreendido que um cDNA de CYP4V2 pode ser em- pacotado em cassetes de expressão diferentes e que um cassete de expressão de CYP4V2 pode ser empacotado em vetores de AAV dife- rentes. Por exemplo, o cDNA de CYP4V2op pode ser usado em am- bos o cassete de expressão de CAG-CYP4V2-WPRE-poliA bGH e cassete de expressão de EFS-CYP4V2-SPA. Ou o cassete de expres- são de CAG-CYP4V2-WPRE-poliA bGH ou cassete de expressão de EFS-CYP4V2-SPA pode ser empacotado em qualquer vetor de AAV adequado, incluindo, mas não limitado a, AAV1, AAV2, AAV2(Y444F+Y500F+Y730F), AAV5, AAV8, AAV8 (Y733F), AAV9, AAV6, AAV7, AAV4, AAV12, AAV-PHP.B e outros vetores. Um projeto de scAAV pode ser usado em qualquer vetor de AAV para criar um vetor de scAAV recombinante, por exemplo, scAAV1, scAAV2, scA- AV2(Y444F+Y500F+Y730F), scAAV5, scAAV8, scAAV8 (Y733F),
scAAV3, scAAV4, scAAV6, scAAV7, scAAV9, scAAV12, etc.
[500] Seria compreendido que processo de projeto similar pode ser usado em projeto de outros vetores (por exemplo, um vetor de len- tivírus ou um plasmídeo) para a terapia genética com CYP4V2. De- pendendo do tipo do vetor, certos elementos descritos acima podem não ser necessários ou podem precisar ser ajustados de acordo, por exemplo, uma sequência promotora.
[501] Em adição aos cDNAs, sequências reguladoras e tipos e projetos de AAV especificados aqui, outras opções de projeto para ca- da elemento-chave do cassete de expressão de CYP4V2 e vetor de administração podem ser também usadas. Um exemplo de como comparar eficiência de transdução de vários tipos de AAV e a resis- tência de promotores diferentes em um tipo de célula-alvo é provido aqui na seção Exemplos. Métodos similares podem ser usados para avaliar e comparar as opções de projeto para outros elementos-chave do cassete de expressão e vetor de administração, por exemplo, cDNA, potenciador, sinal de poliA, ssAAV vs. scAAV, AAV vs. HSV, etc. Ainda, como provido aqui, a eficiência de um cassete de expres- são de CYP4V2 e vetor de administração pode ser avaliada e compa- rada através de teste em modelo celular de BCD, por exemplo, células iPS-RPE de pacientes BCE, com métodos descritos aqui e/ou outros métodos para avaliar anormalidades bioquímicas, função ou atrofia de RPE.
[502] Os cDNAs de CYP4V2, cassetes de expressão e vetores de administração descritos acima foram testados em linhagens celula- res iPS-RPE humanas específicas de paciente com BCD e os resulta- dos são mostrados e discutidos nos Exemplos que seguem.
[503] Ainda, as sequências de junção/ligantes entre várias se- quências reguladoras (incluindo, sem limitação, entre ITR e um promo- tor, entre um potenciador e um sinal de poliA, ou entre um sinal de po-
liA e ITR) ou entre uma sequência reguladora e um cDNA (incluindo, sem limitação, entre um promotor e um cDNA, entre um cDNA e um potenciador ou entre um cDNA e um sinal de poliA) podem também desempenhar um papel em regulagem da expressão do gene-alvo (por exemplo, CYP4V2). Sequências de cassetes de expressão de CYP4V2 diferentes (inclusive de ITRs e sequências de junção/ligantes) usadas no estudo são listadas no Exemplo 11 abaixo.
[504] Sequências exemplares de certas sequências reguladoras e sequências de TIR discutidas neste Exemplo são providas como se- gue: SEQ ID NO: 32 (promotor CAG, 1715 pb) GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAAT- TACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTA- CATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGA- CCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAG- TAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATT- TACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATG- CCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCG- CCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTAC- TTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGG- TCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCAC- TCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATT- TATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGG- CGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGG- CGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGG- CGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTA- TGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCG- CGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTG- CCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGAC- TGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTT-
CTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCG- TTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGA- GGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCG- TGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTG- CCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTG- TGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGG- TGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTG- CGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGG- CGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCAC- CCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTG- CGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTG- CCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGG- CGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCG- CGGCGGCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAG- CCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCA- GGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGGCGGAGCCGAAATCTGGGA- GGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGCGAAGCGGTG- CGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTG- CGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCATCTCCAGCCTCGGGG- CTGCCGCAGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCA- GGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAG- CCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAG- CTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGG-
CAAA SEQ ID NO: 33 (potenciador WPRE, 589 pb) AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGAC- TGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACG- CTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGG- CTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTA- TGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTG-
CACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTG- CCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTT- CCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTG- CCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGA- CAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGG- CTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTT- CTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTT- CCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCG- CCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCG-
CCTCCCCGC SEQ ID NO: 34 (poliA bGH, 225 pb) CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTG- CCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCAC- TCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTG- TCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAG- GACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATG-
CTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG SEQ ID NO: 35 (promotor EFS, 235 pb) g attggctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc ccacagtccc cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg aaccggtgcc tagagaaggt ggcg- cggggt aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg gggga- gaacc gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgcca- gaac acag SEQ ID NO: 36 (SPA, 54 pb) GATCCAATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTG-
TTGGTTTTTTGTGTG SEQ ID NO: 37 (sequência Kozak, 6 pb)
GCCACC SEQ ID NO: 38 (sequência Kozak, 5 pb)
CCACC
SEQ ID NO: 39 (PoliA tardio SV40, 120 pb) TTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAA- TAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTC-
TAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAT SEQ ID NO: 40 (promotor CMV, 576 pb) TAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATA- TATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCG- CCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAA- TGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGA- CGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAG- TACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCA- ATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGAC- CTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGT- CATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAA- TGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAG- TCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAA- TCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGA- CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAG-
CAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAG SEQ ID NO: 41 (promotor EF-1 alfa, 1184 pb) cgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacag- tccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcg- cggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtggggga- gaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgcca- gaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatgg- cccttgcgtgccttgaattacttccacctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagctt- cgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtg- cttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcg- cgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcga- cgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtattt-
cggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgagg- cggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctg- ctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccgg- tcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaa- atggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaaggg- cctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcac- ctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatg- cgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatg- taattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcaga- cagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtga SEQ ID NO: 42 (ITR Esquerda 5’ AAV2, 141 pb) cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgca- gagag ggagtggcca actccatcac taggggttcc t SEQ ID NO: 43 (ITR Direita 3’ AAV2, 141 pb) ag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct gcctgcagg SEQ ID NO: 44 (iTR 5’ AAV2 mugante em construto de scAAV, 117 pb) cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgca- gagag ggagtgg SEQ ID NO: 45 (ITR 3’ AAV2 em construto de scAAV, 141 pb) aggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgct- cactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct ca- gtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc agg Exemplo 10 – Métodos de Uso de Modelo Celular de BCD para Testar, Comparar e Avaliar Sorotipos de AAV e Estrutura do Capsídeo, Ativi-
dade de Promotor e Outra Sequência Reguladora e Níveis de Expres- são de cDNA, bem como Eficácia Geral do Vetor e Níveis de Dosagem em Terapia genética com CYP4V2 e Avaliar Vetor Ótimo Personaliza- do e Dosagem para Pacientes Diferentes
[505] O modelo celular de BCD (por exemplo, linhagens celulares iPS-RPE específicas de paciente com BCD ou ES-RPE, linhagens ce- lulares iPS-RPE ou RPE com mutações em CYP4V2 artificialmente geradas) pode ser usado em avaliação de fármaco e dosagem. Amos- tras de iPS-RPE específicas de paciente com BCD foram usadas para testar, comparar e avaliar vários componentes e dosagens para tera- pia genética com CYP4V2, incluindo tipo de vetor (por exemplo, soro- tipos de AAV e estrutura do capsídeo), sequências promotoras, poten- ciadoras, de sinal poliA e outras no cassete de expressão de CYP4V2 e cDNA de CYP4V2, bem como a eficiência total de um vetor e níveis de dosagem. Resgate de fenótipo foi usado para testar e comparar eficácia.
[506] Vetores de sorotipos diferentes (por exemplo, AAV1, AAV2, AAV5, AAV8, AAV9) ou capsídeo (por exemplo, AAV com muta- ção(ões) no capsídeo, por exemplo, AAV2 vs AAV2tri(Y-F)) ou estrutu- ra (por exemplo, scAAV vs. ssAAV) podem ser testados, comparados usando vetores diferentes com o mesmo cassete de expressão. Por exemplo, AAV2.CYP4V2op, AAV2tri(Y-F).CYP4V2op e AAV5.CYP4V2op todos têm o mesmo cassete de expressão, mas são diferentes em sorotipo/capsídeo de AAV. scAAV1.CYP4V2op, scA- AV5.CYP4V2op e scAAV9.CYP4V2op todos compartilham o mesmo cassete de expressão, mas são diferentes em sorotipo de AAV. Resul- tados de resgate de fenótipo podem ser usados para testar e comparar diferença em eficiência de sorotipo/capsídeo de AAV (por exemplo, AAV2 vs AAV2tri(Y-F) vs AAV5) e estrutura (por exemplo, scAAV5 vs ssAAV5) em transdução e administração do cDNA de CYP4V2 em cé-
lulas de RPE de paciente com BCD.
[507] O mesmo método pode ser usado para testar e comparar nível de atividade de cassete de expressão diferente, cDNA ou se- quências reguladoras ou outras sequências (por exemplo, sequências de junção/união) através de teste de eficácia de resgate de fenótipo de vetores de rAAV do mesmo construto (exceto pelo elemento sendo testado e comparado).
[508] Ainda, como descrito nos presentes Exemplos, dosagens diferentes (por exemplo, 1x10e4 e 1x10e5) do mesmo vetor (por exemplo, vetor de rAAV, por exemplo, scAAV1.CYP4V2op) podem ser aplicadas a amostras de iPS-RPE do mesmo paciente para avaliar a faixa de dosagem terapêutica eficaz (medida através de MOI por célu- la).
[509] Ainda, dado que o modelo celular de BCD exibiu diferenças individuais, ele pode ser também usado para avaliar e encontrar a do- sagem e construto de vetor ótimos personalizados para cada paciente individualmente.
[510] Vide Exemplos relacionados e presente descrição para discussão mais relacionada. Exemplo 11 – Geração de Vários Vetores de Vírus Adenoassociado Recom-binante (rAAV) Carregando uma Sequência de Ácido Nucleico de Codificação de CYP4V2 Funcional e Cassete de Expressão
[511] Vários vetores de AAV.CYP4V2 projetados para este estu- do (vide Exemplos aqui), incluindo AAV2.CYP4V2op, AAV2tri(Y- F).CYP4V2op, AAV5.CYP4V2st, AAV5.CYP4V2op, AAV8.CYP4V2fv e scA-AV1.CYP4V2op, foram feitos sob encomenda pela Vector BioLabs (Malvern, PA, USA). Vetores de AAV recombinantes da Vector Bio- Labs são livres de auxiliar. O processo de produção envolve: (1) clo- nagem de um plasmídeo cis de pAAV, que é um plasmídeo contendo ITR de AAV2 que inclui o cDNA de CYP4V2 relevante (isto é,
CYP4V2st, CYP4V2op ou CYP4V2fv) e sequências reguladoras de um cassete de expressão de CYP4V2, (2) preparação em larga escala de plasmídeo cis de pAAV e plasmídeos complementares (um plasmídeo que carrega os genes Rep-Cap de AAV relevantes e um plasmídeo que provê os genes auxiliares isolados de adenovírus) usando Qiagen Endofree Mega Prep kit, (3) cotransfecção em larga escala dos três plasmídeos descritos acima em placas de células HEK293. (4) Dois dias após transfecção, péletes de célula foram coletados, e vírus foram liberados usando três ciclos de congelamento/descongelamento. Vírus de AAV foram purificados usando ultracentrifugação de gradiente CsCl, seguido por dessalinização e (5) título viral (cópias de genoma (GC)/ml) foi determinado usando PCR em tempo real. Os vetores de rAAV purificados foram armazenados a -80ºC até uso.
[512] Sequências de cassetes de expressão de CYP4V2 diferen- tes (inclusivo de sequências de ITRs e de junção/ligantes) empacota- das em vários vetores de AAV.CYP4V2 para o estudo são listadas como segue. SEQ ID NO: 60 – Sequência de cassete de expressão de CYP4V2 em AAV2.CYP4V2op, AAV2tri(Y-F).CYP4V2op e AAV5.CYP4V2op.: ITR Esquerda: 1-141 Promotor CAG: 237-1951 cDNA CYP4V2op: 2002-3579 Potenciador WPRE: 3736-4324 poliA bGH: 4350-4574 ITR Direita 4659-4799 1 CCTGCAGGCA GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGG-
CCGC CCGGGCAAAG 51 CCCGGGCGTC GGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAG-
TGA GCGAGCGAGC
101 GCGCAGAGAG GGAGTGGCCA ACTCCATCAC TAGGGG-
TTCC TGCGGCCAAT 151 TCAGTCGATA ACTATAACGG TCCTAAGGTA GCGATTTAAA
TACGCGCTCT 201 CTTAAGGTAG CCCCGGGACG CGTCAATTGA GATCTCGA-
CA TTGATTATTG 251 ACTAGTTATT AATAGTAATC AATTACGGGG TCATTAGTTC
ATAGCCCATA 301 TATGGAGTTC CGCGTTACAT AACTTACGGT AAATGGCCCG
CCTGGCTGAC 351 CGCCCAACGA CCCCCGCCCA TTGACGTCAA TAATGACGTA
TGTTCCCATA 401 GTAACGCCAA TAGGGACTTT CCATTGACGT CAATGGGTGG
ACTATTTACG 451 GTAAACTGCC CACTTGGCAG TACATCAAGT GTATCATATG
CCAAGTACGC 501 CCCCTATTGA CGTCAATGAC GGTAAATGGC CCGCCTGG-
CA TTATGCCCAG 551 TACATGACCT TATGGGACTT TCCTACTTGG CAGTACATCT
ACGTATTAGT 601 CATCGCTATT ACCATGGGTC GAGGTGAGCC CCACGTTCTG
CTTCACTCTC 651 CCCATCTCCC CCCCCTCCCC ACCCCCAATT TTGTATTTAT
TTATTTTTTA 701 ATTATTTTGT GCAGCGATGG GGGCGGGGGG
GGGGGGGGCG CGCGCCAGGC 751 GGGGCGGGGC GGGGCGAGGG GCGGGGCGGG
GCGAGGCGGA GAGGTGCGGC 801 GGCAGCCAAT CAGAGCGGCG CGCTCCGAAA GTTT-
CCTTTT ATGGCGAGGC
851 GGCGGCGGCG GCGGCCCTAT AAAAAGCGAA GCGCG-
CGGCG GGCGGGAGTC 901 GCTGCGTTGC CTTCGCCCCG TGCCCCGCTC CGCGCCG-
CCT CGCGCCGCCC 951 GCCCCGGCTC TGACTGACCG CGTTACTCCC ACAGG-
TGAGC GGGCGGGACG 1001 GCCCTTCTCC TCCGGGCTGT AATTAGCGCT TGGTTTAATG
ACGGCTCGTT 1051 TCTTTTCTGT GGCTGCGTGA AAGCCTTAAA GGG-
CTCCGGG AGGGCCCTTT 1101 GTGCGGGGGG GAGCGGCTCG GGGGGTGCGT GCGTG-
TGTGT GTGCGTGGGG 1151 AGCGCCGCGT GCGGCCCGCG CTGCCCGGCG GCTG-
TGAGCG CTGCGGGCGC 1201 GGCGCGGGGC TTTGTGCGCT CCGCGTGTGC GCGAGGG-
GAG CGCGGCCGGG 1251 GGCGGTGCCC CGCGGTGCGG GGGGGCTGCG AGGGGA-
ACAA AGGCTGCGTG 1301 CGGGGTGTGT GCGTGGGGGG GTGAGCAGGG GGTG-
TGGGCG CGGCGGTCGG 1351 GCTGTAACCC CCCCCTGCAC CCCCCTCCCC GAGTTG-
CTGA GCACGGCCCG 1401 GCTTCGGGTG CGGGGCTCCG TGCGGGGCGT GGCG-
CGGGGC TCGCCGTGCC 1451 GGGCGGGGGG TGGCGGCAGG TGGGGGTGCC GGG-
CGGGGCG GGGCCGCCTC 1501 GGGCCGGGGA GGGCTCGGGG GAGGGGCGCG GCGG-
CCCCGG AGCGCCGGCG 1551 GCTGTCGAGG CGCGGCGAGC CGCAGCCATT GCCTTT-
TATG GTAATCGTGC
1601 GAGAGGGCGC AGGGACTTCC TTTGTCCCAA ATCTGGCG-
GA GCCGAAATCT 1651 GGGAGGCGCC GCCGCACCCC CTCTAGCGGG CGCGGG-
CGAA GCGGTGCGGC 1701 GCCGGCAGGA AGGAAATGGG CGGGGAGGGC CTTCGTG-
CGT CGCCGCGCCG 1751 CCGTCCCCTT CTCCATCTCC AGCCTCGGGG CTGCCG-
CAGG GGGACGGCTG 1801 CCTTCGGGGG GGACGGGGCA GGGCGGGGTT CGGCTT-
CTGG CGTGTGACCG 1851 GCGGCTCTAG AGCCTCTGCT AACCATGTTC ATGCCTTCTT
CTTTTTCCTA 1901 CAGCTCCTGG GCAACGTGCT GGTTATTGTG CTGTCT-
CATC ATTTTGGCAA 1951 AGAATTCTAA TACGACTCAC TATAGGGAGA CCCAAGCTGG
CTAGAGCCAC 2001 CATGGCTGGA CTGTGGCTGG GACTGGTGTG GCA-
GAAACTG CTGCTGTGGG 2051 GGGCCGCTTC CGCACTGTCA CTGGCTGGGG CTTCAC-
TGGT GCTGAGCCTG 2101 CTGCAGAGGG TGGCCTCCTA CGCCAGAAAG TGGCAG-
CAGA TGAGGCCCAT 2151 CCCTACCGTG GCCAGAGCCT ATCCACTGGT GGGACACG-
CA CTGCTGATGA 2201 AGCCTGACGG CAGAGAGTTC TTTCAGCAGA TCATCGAG-
TA CACAGAGGAG 2251 TATAGGCACA TGCCACTGCT GAAGCTGTGG GTGGGAC-
CCG TGCCTATGGT 2301 GGCCCTGTAC AACGCCGAGA ATGTGGAAGT
GATCCTGACC AGCAGCAAGC
2351 AGATCGATAA GTCTAGCATG TATAAGTTCC TGGAGCCTTG
GCTGGGCCTG 2401 GGCCTGCTGA CCTCTACAGG CAACAAGTGG AGGAG-
CCGGA GAAAGATGCT 2451 GACCCCAACA TTCCACTTTA CAATCCTGGA GGACTTCCTG
GACATCATGA 2501 ACGAGCAGGC CAATATCCTG GTGAAGAAGC TGGAGAAG-
CA CATCAACCAG 2551 GAGGCCTTTA ATTGCTTCTT TTACATCACC CTGTGCGCCC
TGGACATCAT 2601 CTGTGAGACA GCTATGGGCA AGAACATCGG CGCCCAG-
TCT AATGACGATA 2651 GCGAGTACGT GCGGGCCGTG TATAGAATGA GCGAGA-
TGAT CTTTAGGCGC 2701 ATCAAGATGC CCTGGCTGTG GCTGGATCTG TGGTA-
TCTGA TGTTCAAGGA 2751 GGGCTGGGAG CACAAGAAGT CCCTGCAGAT CCTGCA-
CACC TTTACAAACT 2801 CTGTGATCGC CGAGAGAGCC AATGAGATGA ACGCCAA-
TGA GGACTGTAGG 2851 GGCGATGGAA GGGGCAGCGC CCCTTCCAAG AACAAG-
CGGA GAGCCTTCCT 2901 GGACCTGCTG CTGAGCGTGA CCGACGATGA GGGCAA-
TCGC CTGTCCCACG 2951 AGGACATCCG GGAGGAGGTG GATACATTCA
TGTTTGAGGG ACACGACACC 3001 ACAGCCGCCG CCATCAACTG GTCCCTGTAC CTG-
CTGGGCT CTAATCCAGA 3051 GGTGCAGAAG AAGGTGGATC ACGAGCTGGA CGACGTG-
TTC GGCAAGTCCG
3101 ACAGGCCAGC AACCGTGGAG GATCTGAAGA AGCTGAGA-
TA CCTGGAGTGC 3151 GTGATCAAGG AGACACTGCG CCTGTTCCCC TCTGTG-
CCTC TGTTTGCCCG 3201 GTCCGTGTCT GAGGACTGTG AGGTGGCCGG CTATCG-
CGTG CTGAAGGGCA 3251 CCGAGGCCGT GATCATCCCT TACGCCCTGC ACCGGGA-
CCC CAGGTATTTC 3301 CCTAACCCAG AGGAGTTTCA GCCAGAGAGA TTCTTT-
CCCG AGAATGCCCA 3351 GGGCAGGCAC CCTTACGCCT ATGTGCCATT CTCCGCCG-
GA CCAAGGAACT 3401 GCATCGGACA GAAGTTTGCC GTGATGGAGG AGAAAAC-
CAT CCTGTCTTGT 3451 ATCCTGAGAC ACTTCTGGAT CGAGAGCAAT CA-
GAAGAGGG AGGAGCTGGG 3501 CCTGGAGGGA CAGCTGATCC TGCGGCCAAG CAACGG-
CATC TGGATCAAAC 3551 TGAAAAGAAG GAACGCTGAC GAGAGGTAAA AGCTTGG-
TAC CGATATCGCG 3601 GCCGCCCTAG GGAGCTCCTC GAGGCGGCCC GCTCGAG-
TCT AGAGGGCCCT 3651 TCGAAGGTAA GCCTATCCCT AACCCTCTCC TCGGTCTCGA
TTCTACGCGT 3701 ACCGGTCATC ATCACCATCA CCATTGAGTT TCGATAATCA
ACCTCTGGAT 3751 TACAAAATTT GTGAAAGATT GACTGGTATT CTTAACTATG
TTGCTCCTTT 3801 TACGCTATGT GGATACGCTG CTTTAATGCC TTTGTATCAT
GCTATTGCTT
3851 CCCGTATGGC TTTCATTTTC TCCTCCTTGT ATAAATCCTG
GTTGCTGTCT 3901 CTTTATGAGG AGTTGTGGCC CGTTGTCAGG CAACG-
TGGCG TGGTGTGCAC 3951 TGTGTTTGCT GACGCAACCC CCACTGGTTG GGG-
CATTGCC ACCACCTGTC 4001 AGCTCCTTTC CGGGACTTTC GCTTTCCCCC TCCCTATTGC
CACGGCGGAA 4051 CTCATCGCCG CCTGCCTTGC CCGCTGCTGG ACAGGGG-
CTC GGCTGTTGGG 4101 CACTGACAAT TCCGTGGTGT TGTCGGGGAA ATCATCG-
TCC TTTCCTTGGC 4151 TGCTCGCCTG TGTTGCCACC TGGATTCTGC GCGGGA-
CGTC CTTCTGCTAC 4201 GTCCCTTCGG CCCTCAATCC AGCGGACCTT CCTT-
CCCGCG GCCTGCTGCC 4251 GGCTCTGCGG CCTCTTCCGC GTCTTCGCCT TCGCCCT-
CAG ACGAGTCGGA 4301 TCTCCCTTTG GGCCGCCTCC CCGCATCGAA ACCCG-
CTGAT CAGCCTCGAC 4351 TGTGCCTTCT AGTTGCCAGC CATCTGTTGT TTGCCCCTCC
CCCGTGCCTT 4401 CCTTGACCCT GGAAGGTGCC ACTCCCACTG TCCTTTCCTA
ATAAAATGAG 4451 GAAATTGCAT CGCATTGTCT GAGTAGGTGT CATTCTATTC
TGGGGGGTGG 4501 GGTGGGGCAG GACAGCAAGG GGGAGGATTG GGAAGA-
CAAT AGCAGGCATG 4551 CTGGGGATGC GGTGGGCTCT ATGGCTTCTG AGGCGGA-
AAG AACCAGATCC
4601 TCTCTTAAGG TAGCATCGAG ATTTAAATTA GGGATAACAG
GGTAATGGCG 4651 CGGGCCGCAG GAACCCCTAG TGATGGAGTT GGCCAC-
TCCC TCTCTGCGCG 4701 CTCGCTCGCT CACTGAGGCC GGGCGACCAA AGGTCG-
CCCG ACGCCCGGGC 4751 TTTGCCCGGG CGGCCTCAGT GAGCGAGCGA GCGCGCA-
GCT GCCTGCAGG SEQ ID NO: 61 – Sequência de cassete de expressão de CYP4V2 em AAV5.CYP4V2st. AAV5.CYP4V2st tem o mesmo promo- tor (CAG), potenciador (WPRE) e poliA (bGH-polyA) como AAV2.CYP4V2op, AAV2tri(Y-F).CYP4V2op e AAV5.CYP4V2op (SEQ ID NO: 60) mas sequências de cDNA de CYP4V2 e junção/ligantes diferentes: ITR Esquerda: 1-141 Promotor CAG: 166-1880 cDNAC YP4V2st: 1938-3515 Potenciador WPRE: 3551-4139 poliA bGH: 4163-4387 ITR Direita: 4399-4539 1 CCTGCAGGCA GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGC
CCGGGCAAAG 51 CCCGGGCGTC GGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAG-
TGA GCGAGCGAGC 101 GCGCAGAGAG GGAGTGGCCA ACTCCATCAC TAGGGG-
TTCC TGCGGCCTAA 151 GGCAATTGAG ATCTCGACAT TGATTATTGA CTAGTTATTA
ATAGTAATCA 201 ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT ATGGAGTTCC
GCGTTACATA
251 ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC
GCCCAACGAC CCCCGCCCAT 301 TGACGTCAAT AATGACGTAT GTTCCCATAG TAACGCCAAT
AGGGACTTTC 351 CATTGACGTC AATGGGTGGA CTATTTACGG TAAACTGCCC
ACTTGGCAGT 401 ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC CCCTATTGAC
GTCAATGACG 451 GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT ACATGACCTT
ATGGGACTTT 501 CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA
CCATGGGTCG 551 AGGTGAGCCC CACGTTCTGC TTCACTCTCC CCATCTCCCC
CCCCTCCCCA 601 CCCCCAATTT TGTATTTATT TATTTTTTAA TTATTTTGTG
CAGCGATGGG 651 GGCGGGGGGG GGGGGGGCGC GCGCCAGGCG GGG-
CGGGGCG GGGCGAGGGG 701 CGGGGCGGGG CGAGGCGGAG AGGTGCGGCG GCAG-
CCAATC AGAGCGGCGC 751 GCTCCGAAAG TTTCCTTTTA TGGCGAGGCG GCGGCGG-
CGG CGGCCCTATA 801 AAAAGCGAAG CGCGCGGCGG GCGGGAGTCG CTGCG-
TTGCC TTCGCCCCGT 851 GCCCCGCTCC GCGCCGCCTC GCGCCGCCCG CCCCGG-
CTCT GACTGACCGC 901 GTTACTCCCA CAGGTGAGCG GGCGGGACGG CCCTT-
CTCCT CCGGGCTGTA 951 ATTAGCGCTT GGTTTAATGA CGGCTCGTTT CTTTTCTGTG
GCTGCGTGAA
1001 AGCCTTAAAG GGCTCCGGGA GGGCCCTTTG
TGCGGGGGGG AGCGGCTCGG 1051 GGGGTGCGTG CGTGTGTGTG TGCGTGGGGA GCGCCG-
CGTG CGGCCCGCGC 1101 TGCCCGGCGG CTGTGAGCGC TGCGGGCGCG GCG-
CGGGGCT TTGTGCGCTC 1151 CGCGTGTGCG CGAGGGGAGC GCGGCCGGGG GCGGTG-
CCCC GCGGTGCGGG 1201 GGGGCTGCGA GGGGAACAAA GGCTGCGTGC GGGGTG-
TGTG CGTGGGGGGG 1251 TGAGCAGGGG GTGTGGGCGC GGCGGTCGGG CTGTAAC-
CCC CCCCTGCACC 1301 CCCCTCCCCG AGTTGCTGAG CACGGCCCGG CTTCGGG-
TGC GGGGCTCCGT 1351 GCGGGGCGTG GCGCGGGGCT CGCCGTGCCG
GGCGGGGGGT GGCGGCAGGT 1401 GGGGGTGCCG GGCGGGGCGG GGCCGCCTCG
GGCCGGGGAG GGCTCGGGGG 1451 AGGGGCGCGG CGGCCCCGGA GCGCCGGCGG CTG-
TCGAGGC GCGGCGAGCC 1501 GCAGCCATTG CCTTTTATGG TAATCGTGCG AGAGGGCG-
CA GGGACTTCCT 1551 TTGTCCCAAA TCTGGCGGAG CCGAAATCTG GGAGGCG-
CCG CCGCACCCCC 1601 TCTAGCGGGC GCGGGCGAAG CGGTGCGGCG CCGGCA-
GGAA GGAAATGGGC 1651 GGGGAGGGCC TTCGTGCGTC GCCGCGCCGC
CGTCCCCTTC TCCATCTCCA 1701 GCCTCGGGGC TGCCGCAGGG GGACGGCTGC CTT-
CGGGGGG GACGGGGCAG
1751 GGCGGGGTTC GGCTTCTGGC GTGTGACCGG CGGCTC-
TAGA GCCTCTGCTA 1801 ACCATGTTCA TGCCTTCTTC TTTTTCCTAC AGCTCCTGGG
CAACGTGCTG 1851 GTTATTGTGC TGTCTCATCA TTTTGGCAAA GAATTCTAAT
ACGACTCACT 1901 ATAGGGAGAC CCAAGCTGGC TAGCCAAAGC TTCCAC-
CATG GCGGGGCTCT 1951 GGCTGGGGCT CGTGTGGCAG AAGCTGCTGC TGTGGGG-
CGC GGCGAGTGCC 2001 CTTTCCCTGG CCGGCGCCAG TCTGGTCCTG AGCCTG-
CTGC AGAGGGTGGC 2051 GAGCTACGCG CGGAAATGGC AGCAGATGCG
GCCCATCCCC ACGGTGGCCC 2101 GCGCCTACCC ACTGGTGGGC CACGCGCTGC
TGATGAAGCC GGACGGGCGA 2151 GAATTTTTTC AGCAGATCAT TGAGTACACA GAGGAATACC
GCCACATGCC 2201 GCTGCTGAAG CTCTGGGTCG GGCCAGTGCC CATGG-
TGGCC CTTTATAATG 2251 CAGAAAATGT GGAGGTAATT TTAACTAGTT CAAAGCAAAT
TGACAAATCC 2301 TCTATGTACA AGTTTTTAGA ACCATGGCTT GGCCTAGGAC
TTCTTACAAG 2351 TACTGGAAAC AAATGGCGCT CCAGGAGAAA GATGTTAA-
CA CCCACTTTCC 2401 ATTTTACCAT TCTGGAAGAT TTCTTAGATA TCATGAATGA
ACAAGCAAAT 2451 ATATTGGTTA AGAAACTTGA AAAACACATT AACCAAGAAG
CATTTAACTG
2501 CTTTTTTTAC ATCACTCTTT GTGCCTTAGA TATCATCTGT
GAAACAGCTA 2551 TGGGGAAGAA TATTGGTGCT CAAAGTAATG ATGATTCCGA
GTATGTCCGT 2601 GCAGTTTATA GAATGAGTGA GATGATATTT CGAAGAATAA
AGATGCCCTG 2651 GCTTTGGCTT GATCTCTGGT ACCTTATGTT TAAAGAAGGA
TGGGAACACA 2701 AAAAGAGCCT TCAGATCCTA CATACTTTTA CCAACAGTGT
CATCGCTGAA 2751 CGGGCCAATG AAATGAACGC CAATGAAGAC
TGTAGAGGTG ATGGCAGGGG 2801 CTCTGCCCCC TCCAAAAATA AACGCAGGGC CTTTCTTGAC
TTGCTTTTAA 2851 GTGTGACTGA TGACGAAGGG AACAGGCTAA GTCATGAA-
GA TATTCGAGAA 2901 GAAGTTGACA CCTTCATGTT TGAGGGGCAC GATA-
CAACTG CAGCTGCAAT 2951 AAACTGGTCC TTATACCTGT TGGGTTCTAA CCCAGAAGTC
CAGAAAAAAG 3001 TGGATCATGA ATTGGATGAC GTGTTTGGGA AGTCTGA-
CCG TCCCGCTACA 3051 GTAGAAGACC TGAAGAAACT TCGGTATCTG GAATGTGTTA
TTAAGGAGAC 3101 CCTTCGCCTT TTTCCTTCTG TTCCTTTATT TGCCCGTAGT
GTTAGTGAAG 3151 ATTGTGAAGT GGCAGGTTAC AGAGTTCTAA AAGGCACTGA
AGCCGTCATC 3201 ATTCCCTATG CATTGCACAG AGATCCGAGA TACTTCCCCA
ACCCCGAGGA
3251 GTTCCAGCCT GAGCGGTTCT TCCCCGAGAA TGCA-
CAAGGG CGCCATCCAT 3301 ATGCCTACGT GCCCTTCTCT GCTGGCCCCA GGAACTG-
TAT AGGTCAAAAG 3351 TTTGCTGTGA TGGAAGAAAA GACCATTCTT TCGTGCATCC
TGAGGCACTT 3401 TTGGATAGAA TCCAACCAGA AAAGAGAAGA GCTTGGTCTA
GAAGGACAGT 3451 TGATTCTTCG TCCAAGTAAT GGCATCTGGA TCAAGTTGAA
GAGGAGAAAT 3501 GCAGATGAAC GCTAAGCGGC CGCAACTCGA GACTC-
TAGAG GTTAATCGAT 3551 AATCAACCTC TGGATTACAA AATTTGTGAA AGATTGACTG
GTATTCTTAA 3601 CTATGTTGCT CCTTTTACGC TATGTGGATA CGCTGCTTTA
ATGCCTTTGT 3651 ATCATGCTAT TGCTTCCCGT ATGGCTTTCA TTTTCTCCTC
CTTGTATAAA 3701 TCCTGGTTGC TGTCTCTTTA TGAGGAGTTG TGGCCCGTTG
TCAGGCAACG 3751 TGGCGTGGTG TGCACTGTGT TTGCTGACGC AAC-
CCCCACT GGTTGGGGCA 3801 TTGCCACCAC CTGTCAGCTC CTTTCCGGGA CTTTCGCTTT
CCCCCTCCCT 3851 ATTGCCACGG CGGAACTCAT CGCCGCCTGC CTTG-
CCCGCT GCTGGACAGG 3901 GGCTCGGCTG TTGGGCACTG ACAATTCCGT GGTGTTG-
TCG GGGAAATCAT 3951 CGTCCTTTCC TTGGCTGCTC GCCTGTGTTG CCACCTG-
GAT TCTGCGCGGG
4001 ACGTCCTTCT GCTACGTCCC TTCGGCCCTC AATCCAG-
CGG ACCTTCCTTC 4051 CCGCGGCCTG CTGCCGGCTC TGCGGCCTCT TCCGCG-
TCTT CGCCTTCGCC 4101 CTCAGACGAG TCGGATCTCC CTTTGGGCCG CCTCCCCG-
CA TCGAAACCCG 4151 CTGACTAGAC GACTGTGCCT TCTAGTTGCC AGCCATCTGT
TGTTTGCCCC 4201 TCCCCCGTGC CTTCCTTGAC CCTGGAAGGT GCCAC-
TCCCA CTGTCCTTTC 4251 CTAATAAAAT GAGGAAATTG CATCGCATTG TCTGAGTAGG
TGTCATTCTA 4301 TTCTGGGGGG TGGGGTGGGG CAGGACAGCA AGGGG-
GAGGA TTGGGAAGAC 4351 AATAGCAGGC ATGCTGGGGA TGCGGTGGGC TCTATGG-
CCG CGGGCCGCAG 4401 GAACCCCTAG TGATGGAGTT GGCCACTCCC TCTCTG-
CGCG CTCGCTCGCT 4451 CACTGAGGCC GGGCGACCAA AGGTCGCCCG ACG-
CCCGGGC TTTGCCCGGG 4501 CGGCCTCAGT GAGCGAGCGA GCGCGCAGCT GCCTG-
CAGG SEQ ID NO: 62 – Sequência de cassete de expressão de CYP4V2 em AAV8.CYP4V2fv. AAV8.CYP4V2fv tem as mesmas se- quências de promotor (CAG), potenciador (WPRE) e poliA (bGH-poliA) e junção/ligante que AAV5.CYP4V2st (SEQ ID NO: 61) e difere apenas em sequência de cDNA de CYP4V2: ITR Esquerda: 1-141 Promotor CAG: 166-1880 cDNA CYP4V2fv: 1938-3515 Potenciador WPRE: 3551-4139 poliA bGH: 4163-4387 ITR Direita: 4399-4539 1 CCTGCAGGCA GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGG-
CCGC CCGGGCAAAG 51 CCCGGGCGTC GGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAG-
TGA GCGAGCGAGC 101 GCGCAGAGAG GGAGTGGCCA ACTCCATCAC TAGGGG-
TTCC TGCGGCCTAA 151 GGCAATTGAG ATCTCGACAT TGATTATTGA CTAGTTATTA
ATAGTAATCA 201 ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT ATGGAGTTCC
GCGTTACATA 251 ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC
GCCCAACGAC CCCCGCCCAT 301 TGACGTCAAT AATGACGTAT GTTCCCATAG TAACGCCAAT
AGGGACTTTC 351 CATTGACGTC AATGGGTGGA CTATTTACGG TAAACTGCCC
ACTTGGCAGT 401 ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC CCCTATTGAC
GTCAATGACG 451 GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT ACATGACCTT
ATGGGACTTT 501 CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA
CCATGGGTCG 551 AGGTGAGCCC CACGTTCTGC TTCACTCTCC CCATCTCCCC
CCCCTCCCCA 601 CCCCCAATTT TGTATTTATT TATTTTTTAA TTATTTTGTG
CAGCGATGGG
651 GGCGGGGGGG GGGGGGGCGC GCGCCAGGCG GGG-
CGGGGCG GGGCGAGGGG 701 CGGGGCGGGG CGAGGCGGAG AGGTGCGGCG GCAG-
CCAATC AGAGCGGCGC 751 GCTCCGAAAG TTTCCTTTTA TGGCGAGGCG GCGGCGG-
CGG CGGCCCTATA 801 AAAAGCGAAG CGCGCGGCGG GCGGGAGTCG CTGCG-
TTGCC TTCGCCCCGT 851 GCCCCGCTCC GCGCCGCCTC GCGCCGCCCG CCCCGG-
CTCT GACTGACCGC 901 GTTACTCCCA CAGGTGAGCG GGCGGGACGG CCCTT-
CTCCT CCGGGCTGTA 951 ATTAGCGCTT GGTTTAATGA CGGCTCGTTT CTTTTCTGTG
GCTGCGTGAA 1001 AGCCTTAAAG GGCTCCGGGA GGGCCCTTTG
TGCGGGGGGG AGCGGCTCGG 1051 GGGGTGCGTG CGTGTGTGTG TGCGTGGGGA GCGCCG-
CGTG CGGCCCGCGC 1101 TGCCCGGCGG CTGTGAGCGC TGCGGGCGCG GCG-
CGGGGCT TTGTGCGCTC 1151 CGCGTGTGCG CGAGGGGAGC GCGGCCGGGG GCGGTG-
CCCC GCGGTGCGGG 1201 GGGGCTGCGA GGGGAACAAA GGCTGCGTGC GGGGTG-
TGTG CGTGGGGGGG 1251 TGAGCAGGGG GTGTGGGCGC GGCGGTCGGG CTGTAAC-
CCC CCCCTGCACC 1301 CCCCTCCCCG AGTTGCTGAG CACGGCCCGG CTTCGGG-
TGC GGGGCTCCGT 1351 GCGGGGCGTG GCGCGGGGCT CGCCGTGCCG
GGCGGGGGGT GGCGGCAGGT
1401 GGGGGTGCCG GGCGGGGCGG GGCCGCCTCG
GGCCGGGGAG GGCTCGGGGG 1451 AGGGGCGCGG CGGCCCCGGA GCGCCGGCGG CTG-
TCGAGGC GCGGCGAGCC 1501 GCAGCCATTG CCTTTTATGG TAATCGTGCG AGAGGGCG-
CA GGGACTTCCT 1551 TTGTCCCAAA TCTGGCGGAG CCGAAATCTG GGAGGCG-
CCG CCGCACCCCC 1601 TCTAGCGGGC GCGGGCGAAG CGGTGCGGCG CCGGCA-
GGAA GGAAATGGGC 1651 GGGGAGGGCC TTCGTGCGTC GCCGCGCCGC
CGTCCCCTTC TCCATCTCCA 1701 GCCTCGGGGC TGCCGCAGGG GGACGGCTGC CTT-
CGGGGGG GACGGGGCAG 1751 GGCGGGGTTC GGCTTCTGGC GTGTGACCGG CGGCTC-
TAGA GCCTCTGCTA 1801 ACCATGTTCA TGCCTTCTTC TTTTTCCTAC AGCTCCTGGG
CAACGTGCTG 1851 GTTATTGTGC TGTCTCATCA TTTTGGCAAA GAATTCTAAT
ACGACTCACT 1901 ATAGGGAGAC CCAAGCTGGC TAGCCAAAGC TTCCAC-
CATG GCGGGGCTCT 1951 GGCTGGGGCT CGTGTGGCAG AAGCTGCTGC TGTGGGG-
CGC GGCGAGTGCC 2001 CTTTCCCTGG CCGGCGCCAG TCTGGTCCTG AGCCTG-
CTGC AGAGGGTGGC 2051 GAGCTACGCG CGGAAATGGC AGCAGATGCG
GCCCATCCCC ACGGTGGCCC 2101 GCGCCTACCC ACTGGTGGGC CACGCGCTGC
TGATGAAGCC GGACGGGCGA
2151 GAATTTTTTC AGCAGATCAT TGAGTACACA GAGGAATACC
GCCACATGCC 2201 GCTGCTGAAG CTCTGGGTCG GGCCAGTGCC CATGG-
TGGCC CTTTATAATG 2251 CAGAAAATGT GGAGGTAATT TTAACTAGTT CAAAGCAAAT
TGACAAATCC 2301 TCTATGTACA AGTTTTTAGA ACCATGGCTT GGCCTAGGAC
TTCTTACAAG 2351 TACTGGAAAC AAATGGCGCT CCAGGAGAAA GATGTTAA-
CA CCCACTTTCC 2401 ATTTTACCAT TCTGGAAGAT TTCTTAGATA TCATGAATGA
ACAAGCAAAT 2451 ATATTGGTTA AGAAACTTGA AAAACACATT AACCAAGAAG
CATTTAACTG 2501 CTTTTTTTAC ATCACTCTTT GTGCCTTAGA TATCATCTGT
GAAACAGCTA 2551 TGGGGAAGAA TATTGGTGCT CAAAGTAATG ATGATTCCGA
GTATGTCCGT 2601 GCAGTTTATA GAATGAGTGA GATGATATTT CGAAGAATAA
AGATGCCCTG 2651 GCTTTGGCTT GATCTCTGGT ACCTTATGTT TAAAGAAGGA
TGGGAACACA 2701 AAAAGAGCCT TAAGATCCTA CATACTTTTA CCAACAGTGT
CATCGCGGAA 2751 CGGGCCAATG AAATGAACGC CAATGAAGAC
TGTAGAGGTG ATGGCAGGGG 2801 CTCTGCCCCC TCCAAAAATA AACGCAGGGC CTTTCTTGAC
TTGCTTTTAA 2851 GTGTGACTGA TGACGAAGGG AACAGGCTAA GTCATGAA-
GA TATTCGAGAA
2901 GAAGTTGACA CCTTCATGTT TGAGGGGCAC GATA-
CAACTG CAGCTGCAAT 2951 AAACTGGTCC TTATACCTGT TGGGTTCTAA CCCAGAAGTC
CAGAAAAAAG 3001 TGGATCATGA ATTGGATGAC GTGTTTGGGA AGTCTGA-
CCG TCCCGCTACA 3051 GTAGAAGACC TGAAGAAACT TCGGTATCTG GAATGTGTTA
TTAAGGAGAC 3101 CCTTCGCCTT TTTCCTTCTG TTCCTTTATT TGCCCGTAGT
GTTAGTGAAG 3151 ATTGTGAAGT GGCAGGTTAC AGAGTTCTAA AAGGCACTGA
AGCCGTCATC 3201 ATTCCCTATG CATTGCACAG AGATCCGAGA TACTTCCCCA
ACCCCGAGGA 3251 GTTCCAGCCT GAGCGGTTCT TCCCCGAGAA TGCA-
CAAGGG CGCCATCCAT 3301 ATGCCTACGT GCCCTTCTCT GCTGGCCCCA GGAACTG-
TAT AGGTCAAAAG 3351 TTTGCTGTGA TGGAAGAAAA GACCATTCTT TCGTGCATCC
TGAGGCACTT 3401 TTGGATAGAA TCCAACCAGA AAAGAGAAGA GCTTGGTCTA
GAAGGACAGT 3451 TGATTCTTCG TCCAAGTAAT GGCATCTGGA TCAAGTTGAA
GAGGAGAAAT 3501 GCAGATGAAC GCTAAGCGGC CGCAACTCGA GACTC-
TAGAG GTTAATCGAT 3551 AATCAACCTC TGGATTACAA AATTTGTGAA AGATTGACTG
GTATTCTTAA 3601 CTATGTTGCT CCTTTTACGC TATGTGGATA CGCTGCTTTA
ATGCCTTTGT
3651 ATCATGCTAT TGCTTCCCGT ATGGCTTTCA TTTTCTCCTC
CTTGTATAAA 3701 TCCTGGTTGC TGTCTCTTTA TGAGGAGTTG TGGCCCGTTG
TCAGGCAACG 3751 TGGCGTGGTG TGCACTGTGT TTGCTGACGC AAC-
CCCCACT GGTTGGGGCA 3801 TTGCCACCAC CTGTCAGCTC CTTTCCGGGA CTTTCGCTTT
CCCCCTCCCT 3851 ATTGCCACGG CGGAACTCAT CGCCGCCTGC CTTG-
CCCGCT GCTGGACAGG 3901 GGCTCGGCTG TTGGGCACTG ACAATTCCGT GGTGTTG-
TCG GGGAAATCAT 3951 CGTCCTTTCC TTGGCTGCTC GCCTGTGTTG CCACCTG-
GAT TCTGCGCGGG 4001 ACGTCCTTCT GCTACGTCCC TTCGGCCCTC AATCCAG-
CGG ACCTTCCTTC 4051 CCGCGGCCTG CTGCCGGCTC TGCGGCCTCT TCCGCG-
TCTT CGCCTTCGCC 4101 CTCAGACGAG TCGGATCTCC CTTTGGGCCG CCTCCCCG-
CA TCGAAACCCG 4151 CTGACTAGAC GACTGTGCCT TCTAGTTGCC AGCCATCTGT
TGTTTGCCCC 4201 TCCCCCGTGC CTTCCTTGAC CCTGGAAGGT GCCAC-
TCCCA CTGTCCTTTC 4251 CTAATAAAAT GAGGAAATTG CATCGCATTG TCTGAGTAGG
TGTCATTCTA 4301 TTCTGGGGGG TGGGGTGGGG CAGGACAGCA AGGGG-
GAGGA TTGGGAAGAC 4351 AATAGCAGGC ATGCTGGGGA TGCGGTGGGC TCTATGG-
CCG CGGGCCGCAG
4401 GAACCCCTAG TGATGGAGTT GGCCACTCCC TCTCTG-
CGCG CTCGCTCGCT 4451 CACTGAGGCC GGGCGACCAA AGGTCGCCCG ACG-
CCCGGGC TTTGCCCGGG 4501 CGGCCTCAGT GAGCGAGCGA GCGCGCAGCT GCCTG-
CAGG SEQ ID NO: 63 – Sequência de cassete de expressão de CYP4V2 em AAV5.CYP4V2op (novo). AAV5.CYP4V2op (novo) tem as mesmas sequências de promotor (CAG), potenciador (WPRE) e poliA (poliA bGH) e as mesmas de junção/ligante que AAV5.CYP4V2st (SEQ ID NO: 61) e AAV8.CYP4V2fv (SEQ ID NO: 62) mas sequên- cias de cDNA de CYP4V2 diferentes: ITR esquerda: 1-141 Promotor CAG: 166-1880 cDNA CYP4V2op: 1938-3515 Potenciador WPRE: 3551-4139 poliA bGH: 4163-4387 ITR direita: 4399-4539
CCTGCAGGCA GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGC CCGGGCAAAG CCCGGGCGTC GGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAGTGA GCGAGCGAGC GCGCAGAGAG GGAGTGGCCA ACTCCATCAC TAGGGGTTCC TGCGGCCTAA GGCAATTGAG ATCTCGACAT TGATTATTGA CTAGTTATTA ATAG- TAATCA ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT ATGGAGTTCC GCG- TTACATA ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT AATGACGTAT GTTCCCATAG TAACGCCAAT AGG- GACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA CTATTTACGG TAAACTGCCC AC- TTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT ACATGACCTT ATGGGACTTT CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA CCATGGGTCG AGGTGAGCCC CACGTTCTGC TTCACTCTCC CCATCTCCCC CCCCTCCCCA CCCCCAATTT TGTATTTATT TATTTTTTAA TTATTTTGTG CAG- CGATGGG GGCGGGGGGG GGGGGGGCGC GCGCCAGGCG GGGCGGGGCG GGGCGAGGGG CGGGGCGGGG CGAGGCGGAG AGGTGCGGCG GCAGCCAATC AGAGCGGCGC GCTCCGAAAG TTTCCTTTTA TGGCGAGGCG GCGGCGGCGG CGGCCCTATA AAAAGCGAAG CGCGCGGCGG GCGGGAGTCG CTGCGTTGCC TTCGCCCCGT GCCCCGCTCC GCGCCGCCTC GCGCCGCCCG CCCCGGCTCT GACTGACCGC GTTACTCCCA CAGGTGAGCG GGCGGGACGG CCCTTCTCCT CCGGGCTGTA ATTAGCGCTT GGTTTAATGA CGGCTCGTTT CTTTTCTGTG GCTGCGTGAA AGCCTTAAAG GGCTCCGGGA GGGCCCTTTG TGCGGGGGGG AGCGGCTCGG GGGGTGCGTG CGTGTGTGTG TGCGTGGGGA GCGCCGCGTG CGGCCCGCGC TGCCCGGCGG CTGTGAGCGC TGCGGGCGCG GCGCGGGGCT TTGTGCGCTC CGCGTGTGCG CGAGGGGAGC GCGGCCGGGG GCGGTGCCCC GCGGTGCGGG GGGGCTGCGA GGGGAACAAA GGCTGCGTGC GGGGTGTGTG CGTGGGGGGG TGAGCAGGGG GTGTGGGCGC GGCGGTCGGG CTGTAACCCC CCCCTGCACC CCCCTCCCCG AGTTGCTGAG CACGGCCCGG CTTCGGGTGC GGGGCTCCGT GCGGGGCGTG GCGCGGGGCT CGCCGTGCCG GGCGGGGGGT GGCGGCAGGT GGGGGTGCCG GGCGGGGCGG GGCCGCCTCG GGCCGGGGAG GGCTCGGGGG AGGGGCGCGG CGGCCCCGGA GCGCCGGCGG CTGTCGAGGC GCGGCGAGCC GCAGCCATTG CCTTTTATGG TAATCGTGCG AGAGGGCGCA GGGACTTCCT TTGTCCCAAA TCTGGCGGAG CCGAAATCTG GGAGGCGCCG CCGCACCCCC TCTAGCGGGC GCGGGCGAAG CGGTGCGGCG CCGGCAGGAA GGAAATGGGC GGGGAGGGCC TTCGTGCGTC GCCGCGCCGC CGTCCCCTTC TCCATCTCCA GCCTCGGGGC TGCCGCAGGG GGACGGCTGC CTTCGGGGGG GACGGGGCAG GGCGGGGTTC GGCTTCTGGC GTGTGACCGG CGGCTCTAGA GCCTCTGCTA ACCATGTTCA TGCCTTCTTC TTTTTCCTAC AGCTCCTGGG CAA- CGTGCTG GTTATTGTGC TGTCTCATCA TTTTGGCAAA GAATTCTAAT ACGA- CTCACT ATAGGGAGAC CCAAGCTGGC TAGCCAAAGC TTCCACC ATGGCTGGACTGTGGCTGGGACTGGTGTGGCAGAAACTGCTG- CTGTGGGGGGCCGCTTCCG- CACTGTCACTGGCTGGGGCTTCACTGGTGCTGAGCCTGCTGCA- GAGGGTGGCCTCCTACGCCA- GAAAGTGGCAGCAGATGAGGCCCATCCCTACCGTGGCCAGAG- CCTATCCACTGGTGGGACACG- CACTGCTGATGAAGCCTGACGGCAGAGAGTTCTTTCAGCAGAT- CATCGAGTACACAGAGGAG- TATAGGCACATGCCACTGCTGAAGCTGTGGGTGGGACCCGTG- CCTATGGTGGCCCTGTA- CAACGCCGAGAATGTGGAAGTGATCCTGACCAGCAGCAAGCA- GATCGATAAGTCTAGCATGTA- TAAGTTCCTGGAGCCTTGGCTGGGCCTGGGCCTGCTGACCTC- TACAGGCAACAAGTGGAGGA- GCCGGAGAAAGATGCTGACCCCAACATTCCACTTTACAATCCTG- GAGGACTTCCTGGACAT- CATGAACGAGCAGGCCAATATCCTGGTGAAGAAGCTGGAGAAG- CACATCAACCAGGAGGCCTT- TAATTGCTTCTTTTACATCACCCTGTGCGCCCTGGACATCATCTG- TGAGACAGCTATGGGCAA- GAACATCGGCGCCCAGTCTAATGACGATAGCGAGTACGTG- CGGGCCGTGTATAGAATGAGCGA- GATGATCTTTAGGCGCATCAAGATGCCCTGGCTGTGGCTGGA- TCTGTGGTATCTGATGTT- CAAGGAGGGCTGGGAGCACAAGAAGTCCCTGCAGATCCTGCA- CACCTTTACAAACTCTG- TGATCGCCGAGAGAGCCAATGAGATGAACGCCAATGAGGACTG- TAGGGGCGATGGAAGGGG- CAGCGCCCCTTCCAAGAACAAGCGGAGAGCCTTCCTGGACCTG- CTGCTGAGCGTGACCGA- CGATGAGGGCAATCGCCTGTCCCACGAGGACATCCGGGAGGA- GGTGGATACATTCATG- TTTGAGGGACACGACACCACAGCCGCCGCCATCAACTGG- TCCCTGTACCTGCTGGGCTCTAA- TCCAGAGGTGCAGAAGAAGGTGGATCACGAGCTGGACGACGTG- TTCGGCAAGTCCGACAGG- CCAGCAACCGTGGAGGATCTGAAGAAGCTGAGATACCTGGAG- TGCGTGATCAAGGAGACAC- TGCGCCTGTTCCCCTCTGTGCCTCTGTTTGCCCGGTCCGTG- TCTGAGGACTGTGAGGTGG- CCGGCTATCGCGTGCTGAAGGGCACCGAGGCCGTGAT- CATCCCTTACGCCCTGCACCGGGAC- CCCAGGTATTTCCCTAACCCAGAGGAGTTTCAGCCAGAGAGATT- CTTTCCCGAGAATGCCCA- GGGCAGGCACCCTTACGCCTATGTGCCATTCTCCGCCGGAC- CAAGGAACTGCATCGGACA- GAAGTTTGCCGTGATGGAGGAGAAAACCATCCTGTCTTGTA- TCCTGAGACACTTCTGGATCGA- GAGCAATCAGAAGAGGGAGGAGCTGGGCCTGGAGGGACAG- CTGATCCTGCGGCCAAGCAACGG- CATCTGGATCAAACTGAAAAGAAGGAACGCTGACGAGAGGTAAG- CGGC CGCAACTCGA GACTC-TAGAG GTTAATCGAT AATCAACCTC TGGATTACAA AATTTGTGAA AGATTGACTG GTA- TTCTTAA CTATGTTGCT CCTTTTACGC TATGTGGATA CGCTGCTTTA ATG- CCTTTGT ATCATGCTAT TGCTTCCCGT ATGGCTTTCA TTTTCTCCTC CTTG- TATAAA TCCTGGTTGC TGTCTCTTTA TGAGGAGTTG TGGCCCGTTG TCA- GGCAACG TGGCGTGGTG TGCACTGTGT TTGCTGACGC AACCCCCACT GGTTGGGGCA TTGCCACCAC CTGTCAGCTC CTTTCCGGGA CTTTCGCTTT CCCCCTCCCT ATTGCCACGG CGGAACTCAT CGCCGCCTGC CTTGCCCGCT GCTGGACAGG GGCTCGGCTG TTGGGCACTG ACAATTCCGT GGTGTTGTCG GGGAAATCAT CGTCCTTTCC TTGGCTGCTC GCCTGTGTTG CCACCTGGAT TCTGCGCGGG ACGTCCTTCT GCTACGTCCC TTCGGCCCTC AATCCAGCGG AC- CTTCCTTC CCGCGGCCTG CTGCCGGCTC TGCGGCCTCT TCCGCGTCTT CGCCTTCGCC CTCAGACGAG TCGGATCTCC CTTTGGGCCG CCTCCCCGCA TCGAAACCCG CTGACTAGAC GACTGTGCCT TCTAGTTGCC AGCCATCTGT TGTTTGCCCC TCCCCCGTGC CTTCCTTGAC CCTGGAAGGT GCCACTCCCA CTGTCCTTTC CTAATAAAAT GAGGAAATTG CATCGCATTG TCTGAGTAGG TGT- CATTCTA TTCTGGGGGG TGGGGTGGGG CAGGACAGCA AGGGGGAGGA TTGGGAAGAC AATAGCAGGC ATGCTGGGGA TGCGGTGGGC TCTATGGCCG CGGGCCGCAG GAACCCCTAG TGATGGAGTT GGCCACTCCC TCTCTGCGCG CTCGCTCGCT CACTGAGGCC GGGCGACCAA AGGTCGCCCG ACGCCCGGGC TTTGCCCGGG
CGGCCTCAGT GAGCGAGCGA GCGCGCAGCT GCCTGCAGG SEQ ID NO: 64 – Sequência de cassete de expressão de CYP4V2 em scAAV1.CYP4V2op, scAAV5.CYP4V2op e scA- AV9.CYP4V2op. ITR esquerda (truncada): 1-117 Promotor EFS: 130-364 cDNA CYP4V2op: 520-2097 SPA: 2116-2169 ITR direita: 2263-2403 1 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 61 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggacg 121 cgtaggcctg attggctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc cca- cagtccc 181 cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg aaccggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt 241 aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggg- gagaacc 301 gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgcca- gaac 361 acaggtgtcg tgacgcgacc aggtatgcat ctgcagctct aaggtaaata taaaattttt 421 aagtgtataa tgtgttaaac tactgattct aattgtttct ctcttttaga ttccaacctt 481 tggaactgac tgcagggatc caagctttct agagccacca tggctggact gtgg-
ctggga 541 ctggtgtggc agaaactgct gctgtggggg gccgcttccg cactgtcact ggctggggct 601 tcactggtgc tgagcctgct gcagagggtg gcctcctacg ccagaaagtg gca- gcagatg 661 aggcccatcc ctaccgtggc cagagcctat ccactggtgg gacacgcact gctgatgaag 721 cctgacggca gagagttctt tcagcagatc atcgagtaca cagaggagta taggcacatg 781 ccactgctga agctgtgggt gggacccgtg cctatggtgg ccctgtacaa cgccgagaat 841 gtggaagtga tcctgaccag cagcaagcag atcgataagt ctagcatgta taagttcctg 901 gagccttggc tgggcctggg cctgctgacc tctacaggca acaagtggag gagccggaga 961 aagatgctga ccccaacatt ccactttaca atcctggagg acttcctgga ca- tcatgaac 1021 gagcaggcca atatcctggt gaagaagctg gagaagcaca tcaaccagga ggcctttaat 1081 tgcttctttt acatcaccct gtgcgccctg gacatcatct gtgagacagc ta- tgggcaag 1141 aacatcggcg cccagtctaa tgacgatagc gagtacgtgc gggccgtgta tagaatgagc 1201 gagatgatct ttaggcgcat caagatgccc tggctgtggc tggatctgtg gta- tctgatg 1261 ttcaaggagg gctgggagca caagaagtcc ctgcagatcc tgcacacctt ta- caaactct 1321 gtgatcgccg agagagccaa tgagatgaac gccaatgagg actgtagggg cgatggaagg 1381 ggcagcgccc cttccaagaa caagcggaga gccttcctgg acctgctgct gagcgtgacc 1441 gacgatgagg gcaatcgcct gtcccacgag gacatccggg aggaggtgga ta-cattcatg 1501 tttgagggac acgacaccac agccgccgcc atcaactggt ccctgtacct gctgggctct 1561 aatccagagg tgcagaagaa ggtggatcac gagctggacg acgtgttcgg ca-agtccgac 1621 aggccagcaa ccgtggagga tctgaagaag ctgagatacc tggagtgcgt gatcaaggag 1681 acactgcgcc tgttcccctc tgtgcctctg tttgcccggt ccgtgtctga ggactg- tgag 1741 gtggccggct atcgcgtgct gaagggcacc gaggccgtga tcatccctta cgccctgcac 1801 cgggacccca ggtatttccc taacccagag gagtttcagc cagagagatt cttt- cccgag 1861 aatgcccagg gcaggcaccc ttacgcctat gtgccattct ccgccggacc aaggaactgc 1921 atcggacaga agtttgccgt gatggaggag aaaaccatcc tgtcttgtat cctgagacac 1981 ttctggatcg agagcaatca gaagagggag gagctgggcc tggagggaca gctgatcctg 2041 cggccaagca acggcatctg gatcaaactg aaaagaagga acgctgacga gaggtaaaag 2101 cttgaattcc tcgaggatcc aataaaagat ctttattttc attagatctg tgtgttggtt 2161 ttttgtgtgt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc 2221 ctggaaggtg ccactcccag tttaaactta attaagggcc gcaggaaccc ctagtgatgg 2281 agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg 2341 cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc ag-ctgcctgc 2401 agg
[513] Para avaliar a diferença em eficácia entre cDNAs de CYP4V2st e CYP4V2op em terapia genética com CYP4V2, dois veto- res de AAV4 com as mesmas sequências promotoras (CAG), potenci- adoras (WPRE) e poliA (bGH-poliA) e as mesmas de junção/ligantes, uma carregando o cDNA de CYP4V2st (AAV5.CYP4V2st (SEQ ID NO: 61)) e a outra carregando o cDNA de CYP4V2op (AAV5.CYP4V2op (novo) (SEQ ID NO: 63)) são comparados quanto à eficácia em resga- te de atrofia de RPE em iPS-RPE derivada de paciente com BCD usando ensaio de viabilidade celular descrito aqui.
[514] Para avaliar se sequências de junção/ligantes diferentes usadas nas SEQ ID NO: 60 e SEQ ID NO: 63 afetam a expressão de cDNA de CYP4V2 ou cassete de expressão, dois vetores de AAV5 (AAV5.CYP4V2op (SEQ ID NO: 60) e AAV5.CYP4V2op (novo) (SEQ ID NO: 63)) com o mesmo promotor (CAG), potenciador (WPRE) e po- liA (bGH-poliA) e o mesmo cDNA de CYP4V2 (CYP4V2op (SEQ ID NO: 2)) mas sequências de junção/ligantes diferentes são comparados quanto à eficácia em resgate de atrofia de RPE em iPS-RPE derivada de paciente com BCD usando ensaio de viabilidade celular descrito aqui.
[515] Deve ser compreendido que cDNAs de CYP4V2 diferentes (SEQ ID NOs: 1, 2 3 ou outras) podem ser usados em qualquer casse- te de expressão de CYP4V2 descrito aqui em lugar do cDNA de CYP4V2 contido nas sequências de cassete de expressão providas aqui para uso em terapia genética com CYP4V2. Deve ser também compreendido que cada cassete de expressão de CYP4V2 descrito aqui pode ser empacotado em vetores de rAAV de vários soroti- pos/capsídeos para uso em terapia genética de CYP4V2, incluindo aqueles diferentes dos usados neste estudo (por exemplo, AAV1,
AAV2, AAV2(Y444F+Y500F+Y730F), AAV5, AAV8 e AAV9). Ainda, o cassete de expressão de CYP4V2 empacotado em vetores de scA-AV usados neste estudo podem ser também empacotados em vetores de ssAAV para uso em terapia genética com CYP4V2, após mudança da ITR de AAV mutante usada em construto de scAAV para ITR de AAV não mutante usada em construto de ssAAV. Além disso, os cDNAs de CYP4V2 ou cassetes de expressão (com ou sem as ITRs de AAV) descritos aqui podem ser empacotados em outros vetores virais (isto é, vetores não AAV, tais como retrovírus, lentivírus, adenovírus e vírus herpes simples ou outros vetores virais) ou vetores não virais (por exemplo, plasmídeos, nanopartículas ou nanopartículas à base de lipí- deo (por exemplo, complexo de lipossoma-protamina-DNA (LPD)) para uso em terapia genética com CYP4V2. Exemplo 12 – Tratamento de Células iPS-RPE derivadas de Paciente com BCD por AAV. CYP4V2
[516] Células iPS-RPE derivadas de pacientes com BCD foram infectadas com vários vetores de AAV.CYP4V2 descritos acima em meio RPE livre de soro. Após 1 dia, o meio contendo vírus foi substitu- ído com meio RPE contendo soro fresco para continuar a cultura de RPE. Para avaliar efeitos terapêuticos de dosagem diferente, multipli- cidade de infecção diferente (MOI, cópias genômicas (GC)/célula) foi testada. Exemplo 13 – Ensaio para Avaliar o Efeito de Terapia genética com AAV.CYP4V2
[517] Após infecção por AAV.CYP4V2, as células iPS-RPE de pacientes com BCD foram culturadas em meio RPE por pelo menos 4 dias para scAAV ou pelo menos 10 dias para ssAAV antes das células terem sido coletadas para teste. Protocolos de coleta de célula e pro- tocolos de preparação de amostra foram seguidos como anteriormente descrito.
[518] Os testes bioquímicos descritos nos Exemplos aqui para detecção de ácidos graxos, ceramidas (Cer), esfingomielinas (SM) e esfingosina e esfinganina (SOSA) foram realizados em células iPS- RPE de paciente com BCD tratado com AAV.CYP4V2 e o mesmo pro- tocolo de teste bioquímico usando LC-MS foi seguido. A Tabela 3 aci- ma mostra os resultados em células iPS-RPE controle saudáveis, célu- las iPS-RPE de paciente com BCD sem tratamento com AAV.CYP4V2 e pós-tratamento AAV.CYP4V2.
[519] Os resultados demonstraram que fenótipo em células iPS- RPE de paciente com BCD (por exemplo, níveis de ácido graxo anor- mais (por exemplo, DHA, AA e total de ácidos graxos n3) comparado com controle) foi melhorado ou corrigido por terapia genética com AAV.CYP4V2. Isso estabeleceu a eficácia de terapia genética com AAV.CYP4V2 em linhagens celula-res iPS-RPE derivadas de paciente com BCD. Devido ao fato de BCD ser principalmente causada por de- generação de RPE, a eficácia de terapia genética com AAV.CYP4V2 em linhagens celulares iPS-RPE específicas de paciente com BCD estabeleceu a eficácia de terapia genética com AAV.CYP4V2 para pa- cientes com BCD.
[520] Significantemente, o tratamento com scAAV1.CYP4V2op obteve a melhora mais significante em um tempo muito curto (apenas 4 dias após tratamento). Isso provou que scAAV é de ação rápida por- que ele não requer que o maquinário celular sintetize um filamento de DNA complementar. Pela mesma razão, é esperado que janela de tempo maior entre tratamento com AAV.CYP4V2 e coleta celular para teste possa gerar melhoras mais significantes em resultados, particu- larmente para terapia genética com CYP4V2 empacotado em vetores de ssAAV.
[521] Os resultados rápidos e robustos obtidos pelo vetor de scAAV em células de RPE humanas estabeleceram que vetores de scAAV podem ser particularmente úteis no resgate de paciente huma- no com doenças em estágio inicial e/ou em estágio avançado de RPE ou degenerações retinais. Ainda, o perfil de expressão robusto de ve- tores de scAAV o torna adequado para administração intravítrea para administração à retina. Resgate de atrofia de RPE por AAV.CYP4V2
[522] Amostras de iPS-RPE derivadas de paciente com BCD fo- ram expostas à luz azul por 1 hora, então ensaio de viabilidade celular foi realizado nas amostras no dia seguinte como anteriormente des- crito aqui.
[523] Imagens de viabilidade celular comparando amostras de iPS-RPE de paciente sem vs. com tratamento com AAV.CYP4V2 são mostradas nas Figuras aqui.
[524] Cada um de tratamento de AAV2.CYP4V2op e scA- AV1.CYP4V2op mostrou resgate de atrofia de RPE em amostras de iPS-RPE derivadas de paciente com BCD comparado com amostras de paciente não tratadas (Figura 8, MOI=1x10e5 GC/célula). Interes- santemente, eficácia de resgate por AAV2.CYP4Vop e scA- AV1.CYP4V2op em 1x10e5 MOI é maior em iPS-RPE P2 do que em iPS-RPE P1. Isso sugere que dosagem ótima para uso de terapia ge- nética de AAV.CYP4V2 para tratar BCD pode variar com base em dife- renças individuais entre pacientes e que iPS-RPE específica de paci- ente com BCD é uma ferramenta útil na avaliação de dose ótima per- sonalizada para pacientes diferentes.
[525] Cada um de tratamento com AAV5.CYP4V2op, AAV5.CYP4V2st e AAV8.CYP4V2fv resgatou atrofia de RPE em amostras de iPS-RPE derivadas de paciente com BCD comparado com amostra de paciente não tratada (Figura 9, MOI=1x10e5).
[526] Cada um de tratamento com AAV5.CYP4V2op, scA- AV1.CYP4V2op e scAAV5.CYP4V2op resgatou atrofia de RPE em amostra de iPS-RPE derivada de paciente com BCD comparado com amostra de paciente não tratada (Figura 10, MOI=1x10e4).
[527] Tratamento com scAAV.CYP4V2op resgatou atrofia de RPE em amostra de iPS-RPE derivada de paciente com BCD compa- rado com amostra de paciente não tratada (Figura 11. MOI=1x10e5 2 semanas após tratamento).
[528] Significantemente, tratamento com AAV.CYP4V2 em uma dose menor (MOI=1x10e4) em amostras de P2 obteve resultados simi- lares ou melhores do que uma dose maior (MOI=1x10e5 GC/célula) de tratamento pelo mesmo vetor em amostras P1. Isso demonstrou no nível celular que para obter a mesma eficácia ou eficácia similar em resgate de atrofia de RPE, pacientes diferentes podem precisar de do- sagem diferente. Em outras palavras, um vetor e um nível de dose si- milar para todos os pacientes da mesma doença podem não ser a abordagem mais medicamente ou economicamente eficiente para te- rapia genética. Modelo celular de BCD e modelos celulares similares para outras doenças oculares podem prover uma orientação sobre do- se ótima personalizada.
[529] Outros vetores de AAV.CYP4V2 são também testados e mostram atrofia de RPE melhorada em amostra de iPS-RPE de paci- ente com BCD, incluindo tratamento com AAV2tri(Y-F).CYP4V2op (MOI de 1x10e4) e AAV5.CYP4V2op(novo) (SEQ ID NO: 63) em níveis de MOI diferentes (1x10e4 e 1x10e5 GC/célula). Ainda, as imagens de viabilidade celular foram processadas por ImageJ(Fiji) para contar o número de células mortas e vivas nas amostras de iPS-RPE. Quatro áreas/imagens diferentes de cada amostra foram usadas para contar e as razões de células mortas/vivas de imagens múltiplas da mesma amostra tiveram a média tirada. Razões de célula morta/viva demons- traram atrofia de célula de RPE resgatada por tratamento com AAV.CYP4V2 em iPS-RPE derivada de paciente com BCD. Por exem-
plo, a razão de célula morta/viva de WT2 é 3,0%, P1 (nenhum trata- mento com AAV.CYP4V2) é 20,87% e P1 tratado por AAV5.CYP4V2st é 9,69%. Tratamento por outros vetores de AAV.CYP4V2 também re- duziu a razão de célula/morta viva em amostras de iPS-RPE de paci- ente com BCD.
[530] Esses resultados demonstraram que: (1) Vários vetores de AAV.CYP4V2, cassetes de expressão e cDNAs de CYP4V2 resgataram atrofia de RPE em BCD; (2) Vetor de AAV autocomplementar (scAAV) é rápido em obter eficácia de resgate; (3) Eficácia pode ser obtida em níveis de dosagem diferentes. Exemplo 14 – Segurança de Vetores de AAV.CYP4V2 e Fabricação de GMP para Uso Clínico
[531] Estudos anteriores demonstraram que CYP4V2 é quase ubiquamente expresso em órgãos humanos e nível de expressão den- tro do olho é alto na retina. Ainda, a segurança de vetores de AAV foi estabelecida em estudos de terapia genética e testes clínicos para ou- tras doenças. Desta maneira, é razoável esperar que vetores de AAV.CYP4V2 sejam seguros para usar em terapia genética.
[532] Neste estudo, vários vetores de AAV.CYP4V2 foram usa- dos para tratar amostras de iPS-RPE humanas em uma dose alta (por exemplo, 1x10e5 MOI). Nenhuma diferença material em morte celular entre amostras não tratadas e tratadas com AAV.CYP4V2 foi observa- da, exceto que AAV.CYP4V2 resgatou atrofia de RPE em amostras de iPS-RPE derivadas de paciente com BCD como descrito no Exemplo acima. Isso estabeleceu a segurança de vetores de AAV.CYP4V2 e demonstrou que níveis de expressão altos do gene de codificação de CYP4V2 transduzido podem ser obtidos sem evidência de toxidez sig- nificante.
[533] Em adição a teste em linhagens celulares, a segurança de terapia genética com AAV.CYP4V2 pode ser também testada em ani- mais, por exemplo, em camundongos, ratos ou primatas não humanos e/ou através de testes clínicos em humanos. Vários métodos de fabri- cação e plataformas estão disponíveis para produzir vetores de AAV recombinantes para uso clínico humano. Por exemplo, e sem limita- ção, fabricação de GMP de vetores de rAAV pode usar um método de transfecção de 2 plasmídeos ou um método de transfecção de 3 plas- mídeos, pode usar linhagens celulares de mamífero tal como HEK293, A459 ou 293T, ou linhagens celulares de inseto tal como a plataforma baculovírus/célula Sf9, pode usar cultura de célula aderente ou sus- pensão. Ainda, vários métodos, processos e/ou plataformas, incluindo, sem limitação, sistema de produção à base de vírus herpes simples (HSV), biorreatores de uso único (por exemplo, iCELLis), HYPERSta- cks, garrafas rolantes e cromatografia de coluna, podem ser usados para aumentar rendimento ou título ou melhorar pureza e/ou evitar contaminação potencial. Esses métodos, processos, técnicas e plata- formas de produção clínica de vetor de rAAV são conhecidos na técni- ca e estão comercialmente disponíveis por organizações de fabricação contratadas (CMOs) ou instalações de GMP acadêmicas, por exemplo, Lonza (USA), Cobra Biologics (UK), Nationwide Children’s Hospital (NCH. Ohio, USA), Children's Hospital of Philadelphia (CHOP. USA), WuXi Biologics (China e USA). Vetores de AAV.CYP4V2 para uso clí- nico humano podem ser fabricados usando qualquer um ou mais dos métodos, processos, técnicas, plataformas e instalações de GMP mencionados aqui e/ou outros conhecidos na técnica ou a serem de- senvolvidos no futuro. Exemplo 15 – Seleção de Indivíduo e Administração de AAV.CYP4V2 in vivo para Tratar BCD
[534] Um critério de elegibilidade de indivíduo exemplar para tes- te clínico humano de AAV.CYP4V2 é listado como segue:
Critérios de Inclusão
[535] Os indivíduos são elegíveis para participação no estudo se eles satisfizerem todos os critérios de inclusão que seguem:
1. Forem capazes de prover consentimento informado para participação no estudo.
2. ≥18 anos de idade.
3. Tiverem um diagnóstico geneticamente confirmado de mu- tação de CYP4V2 bialélica.
4. Tiverem doença ativa clinicamente visível dentro da região macular no olho de estudo.
5. Tiverem uma melhor acuidade visual corrigida (BCVA) de 34-73 letras ETDRS (equivalente a pior do que ou igual a 20/40 de acuidade Snellen, mas melhor do que ou igual a 20/200 acuidade Snellen) no olho de estudo. Critérios de Exclusão
[536] Os indivíduos não são elegíveis para participação no estu- do se eles satisfizerem qualquer um dos critérios de exclusão que se- guem.
1. Tiverem uma história de ambliopia no olho elegível.
2. Forem incapazes de usar métodos de contracepção de bar- reira, por um período de 3 meses, se tratados com AAV.
3. Cirurgia intraocular anterior realizada no olho de estudo dentro de 3 meses da primeira visita.
4. Tiverem qualquer outra doença/distúrbio ocular ou não ocu- lar significante que, na opinião do investigador, possa ou pôr o indiví- duo sob risco devido à participação no estudo ou possa influenciar os resultados do estudo ou a habilidade do indivíduo em particular no es- tudo. Isso inclui, mas não está limitado a, um indivíduo: ● com uma contraindicação para corticosteroide oral (por exemplo, prednisolona/prednisona)
● com uma catarata clinicamente significante ● que, na opinião clínica do investigador de estudo, não é um candida- to apropriado para o procedimento cirúrgico (por exemplo, cirurgia sub- retinal).
5. Tiverem participado em um outro estudo de pesquisa en- volvendo um produto investigacional nas 12 últimas semanas ou rece- bido uma terapia à base de gene/célula em qualquer momento anteri- or.
[537] Para uso AAV.CYP4V2 para tratar BCD, o paciente deve ter diagnóstico genético ou molecular confirmado de BCD, isto é, con- firmação de mutação de CYP4V2 bialélica através de teste genético (teste de gene único ou teste de painel de gene múltiplo se medica- mente necessário). Devido ao fato de BCD ser algumas vezes diag- nosticada como distúrbio retinal herdado (IRD), degeneração retinal (RD) ou retinite pigmentosa (RP), AAV.CYP4V2 pode ser também usado para tratar um paciente de IRD, RD ou RP com mutação de CYP4V2 bialélica geneticamente confirmada.
[538] Para tratamento com AAV.CYP4V2 in vivo, o paciente deve ter células retinais viáveis conforme determinado por tomografia de coerência óptica (COT) e/ou oftalmoscopia. Preferivelmente, o pacien- te deve ter alguma visão restante (por exemplo, melhor acuidade visu- al corrigida (BCVA) melhor do que ou igual a 20/200 (0,1 décimo no olho a ser tratado).
[539] Vários meios/via de administração podem ser usados para administrar vetores de AAV.CYP4V2 a células-alvo (por exemplo, célu- las retinais ou da córnea) in vivo, incluindo, sem limitação, administra- ção à retina pode ser realizada através de injeção sub-retinal, injeção intravítrea (usando vetores de AAV adequados para administração in- travítrea, por exemplo, AAV2(Y444F+Y500+Y730F), AAV 7m8 ou seus derivados) ou administração através da corrente sanguínea (usando vetores de AAV que podem penetrar na barreira sangue-retinal, por exemplo, AAV9 ou AAV-PHP.B). Ainda, vetores de AAV.CYP4V2 po- dem ser também encapsulados em um dispositivo a ser implantado intravitrealmente como uma maneira de administração.
[540] Métodos cirúrgicos/de administração relacionados à terapia genética, bem como certas técnicas para melhorar a eficiência de ad- ministra-ção/transdução (por exemplo, descascamento da membrana de limitação interna (ILM) e vitrectomia (VIT)), são conhecidos na téc- nica. Imunossupressores, por exemplo, corticosteroides, podem ser usados antes, durante e/ou após administração de AAV para minimizar respostas imunes.
[541] Em adição a tratamento de pacientes in vivo, terapia gené- tica com CYP4V2 (incluindo terapia genética AAV.CYP4V2) pode ser também usada para tratar as células-alvo (por exemplo, células de RPE derivadas de iPS de paciente com BCD, células retinais, células do epitélio da córnea ou células da córnea) in vitro e então transplante de tais células para o paciente como uma terapia celular. Métodos de uso de vetores de AAV.CYP4V2 para tratar células iPS-RPE de paci- ente com BCD são providos nos presentes Exemplos e descrição. Mé- todos de implante/transplante de célula, por exemplo, para a retina ou córnea, são conhecidos na técnica. Por exemplo, os mesmos métodos ou métodos similares e técnicas cirúrgicas para transplante de células ES-RPE para a retina podem ser usados para transplantar células iPS- RPE do paciente com BCD.
[542] Doses terapeuticamente eficazes podem ser determinadas e avaliadas em modelos de doença (por exemplo, modelo celular de BCD (por exemplo, linhagem celular iPS-RPE derivada de pacientes com BCD) ou um modelo animal, e confirmadas ou refinadas por tes- tes clínicos. Para tratamento de células in vitro, a dose é geralmente expressa como MOI e então multiplicar o MOI pelo número de células sendo tratadas.
O MOI geralmente varia entre cerca de 1 x 10^3 GC a cerca de 1 x 10^6 GC por célula ou um MOI infeccioso de cerca de 100 a cerca de 10.000 GC por célula (GC: cópias genômicas, medição de genoma contendo partículas de AAV (tcc genoma de vetor (vg) ou partículas de genoma (gp)). Para tratamento in vivo, fatores clínicos típicos devem ser considerados para determinar a dose, tais como via de administração, o tamanho da área ou número de células direciona- das e o indivíduo sendo tratado (por exemplo, a idade, peso, estágio de desenvolvimento da doença e condição do indivíduo a ser tratado e reações imunes potenciais); a localização das células direcionadas para tratamento (por exemplo, retina vs. córnea). Ainda, a eficiência de transdução e eficácia de resgate do vetor de AAV.CYP4V2 sendo usa- do devem ser também consideradas.
Finalmente, se possível, diferen- ças individuais em dose ótima no nível celular dentre pacientes devem ser consideradas também, o que pode ser avaliado nas células iPS- RPE específicas do paciente.
Desta maneira, a dose terapeuticamente eficaz para uma administração local única ao olho in vivo pode ser da ordem de a partir de cerca de 1 x 10^6 a cerca de 2 x 10^13 GC, inclu- sive (por exemplo, uma faixa de dose alta de cerca de 1 x 10^11 GC a cerca de 1 x 10^12 GC, uma faixa de dose média de cerca de 1 x 10^10 GC a cerca de 1 x 10^11 GC, uma faixa de dose baixa de cerca de 1 x 10^9 GC a cerca de 1 x 10^10 GC, uma faixa de dose muito baixa de cerca de 1 x 10^6 GC a cerca de 1 x 10^9 GC e uma faixa de dose muito alta de cerca de 1 x 10^12 GC a cerca de 2 x 10^13 GC), ou qualquer dose dentro dessas faixas que seja suficiente para prover o efeito desejado.
Em uma modalidade, a composição é administrada em uma dose de cerca de 1 x 10^6 a cerca de 2 x 10^13 GC.
Em uma outra modalidade, a dose administrada in vivo e determinada multipli- cando o número de células direcionadas para tratamento pelo MOI- alvo (por exemplo, cerca de 1 x 10^3 GC a cerca de 1 x 10^6 GC por célula). O volume do agente contendo os vetores de rrAV em qualquer administração local única ao olho pode variar de a partir de cerca de 1 uL (0,01 mL) a cerca de 1000 uL (1 mL). Tratamento através de admi- nistração pela corrente sanguínea requer uma dose muito maior e po- de estar na faixa de cerca de 1 x 10^6 a cerca de 2 x 10^14 GC por kg de peso corporal.
[543] Vide “E. Opções de Tratamento, Seleção de Indivíduo e Administração” e outra descrição aqui para mais relato. Exemplo 16 – Avaliação Pós-tratamento
[544] Uma vez que sintomas clínicos de BCD são similares àque- les de muitos outros tipos de IRDs, RDs e RP, por exemplo, perda em acuidade visual, campos visuais restritos, cegueira noturna, adaptação reduzida ao escuro, sensibilidade a contraste e visão colorida, mudan- ças na retina (e em córnea para alguns pacientes) e respostas diminu- ídas em eletrorretinograma (ERG), medições relacionadas podem ser usadas para avaliar o estado de doença e progressão pré- e pós- tratamento de um paciente com BCD, desta maneira avaliando resul- tado do tratamento. Essas medições e exames e testes relacionados são conhecidos na técnica para doenças retinais e da córnea. Por exemplo, e sem limitação, melhor acuidade visual corrigida (usando gráfico de acuidade visual) pode ser usada como a medida de resulta- do primário para terapia genética para BCD, com uma ou mais do que segue como medidas de resultados secundário: microperimetria (mu- dança em sensibilidade), autofluorescência do fundo (AF) (mudança em AF), tomografia de coerência óptica (OCT) (zona elipsoide e es- pessura retinal), sensibilidade a contraste (gráfico Pelli-Robson), visão colorida (testes de tonalidade Farnsworth-Munsell 100) e ERG (mu- danças em ERG). Ainda, testes funcionais tal como teste de mobilida- de podem ser também usados como medida de resultado primário ou secundário. Avaliações podem ser realizadas em pontos de tempo di-
ferentes após tratamento, por exemplo, 2 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 6 meses e 12 meses. Os resultados po-dem ser usados para avaliar resultado do tratamento. Eficácia pode ser mos-trada como um do que segue: melhora em uma ou mais medições de resultado primá- rio ou secundário, parada de progressão da doença ou diminuição mais lenta do que esperado de degeneração retinal ou perda de visão (usando dados de um estudo de história natural se necessário). Exemplo 17: Método para Reduzir as Respostas Imunes e se Endere- çar a Diferenças Individuais em Terapia Genética
[545] Terapia genética mediada por vetor viral pode disparar res- postas imunes celulares, locais ou sistêmicas, que podem oferecer ris- cos à segurança. Reações imunes podem também diminuir eficiência de transdução e desta maneira diminuir o efeito de tratamento de tera- pia genética mediada por vetor viral. Respostas imunes podem ocorrer na forma da resposta humoral (ou resposta mediada por anticorpo) reconhecendo antígenos ou patógenos que estão na linfa ou sangue e/ou imunidade mediada por célula. Para minimizar respostas imunes, imunossupressores tais como corticosteroides são frequentemente usados em conexão com uma administração de terapia genética. Fár- macos imunossupressores têm efeitos, por exemplo, que podem cau- sar pressão intraocular aumentada, cataratas e outros eventos adver- sos (por exemplo, uso prolongado de imunossupressor pode aumentar o risco de câncer). Em adição à resposta imune, outras diferenças in- dividuais existem dentre os pacientes, por exemplo, em resposta a ti- pos diferentes (por exemplo, sorotipo diferente ou mutação/estrutura de capsídeo diferente) de vetores, ou em resposta ao mesmo vetor na mesma dose.
[546] Um método para reduzir respostas imunes a vetores virais, preservar eficiência de transdução, diminuir dose de vetor viral e/ou imunossupressor e/ou maximizar efeito terapêutico para pacientes di-
ferentes da mesma doença genética, em terapia genética mediada por vetor viral, compreendendo: (a) estabelecimento de um grupo de mais de um vetor viral re- combinante (por exemplo, rAAVs) com eficiência de transdução sufici- ente no tipo de célula-alvo para a terapia genética.
O grupo de vetor viral pode ser expandido criando variantes com mutações de região antigênica ou outras mutações ou variantes no capsídeo dos ditos ve- tores virais após tais mutações ou variações serem confirmadas com eficiência de transdução suficiente em células-alvo relevantes para a doença (por exemplo, em linhagens celulares iPS-RPE ou RPE para terapia genética com CYP4V2 para BCD). (b) detecção de anticorpos de vetor antiviral de neutralização preexistentes (NAbs) contra sorotipos de vetor viral diferentes e/ou mutações ou variantes de capsídeo no indivíduo com necessidade da terapia genética e/ou teste e comparação de vetores virais diferentes em células-alvo de doença específicas de paciente (por exemplo, célu- las iPS-RPE) derivadas de tal indivíduo. (c) seleção de um vetor viral a partir do dito grupo de vetores virais com (i) eficiência de transdução suficiente nas células-alvo de doença e (ii) reatividade cruzada baixa com os NAbs preexistentes no indivíduo e/ou (iii) bom resultado de resgate de fenótipo nas células- alvo de doença específicas de paciente do indivíduo (por exemplo, li- nhagens celulares iPS-RPE específicas de paciente para terapia gené- tica com CYP4V2 para BCD), em que tal grupo de vetor viral compre- ende sorotipos diferentes e/ou vetores virais com capsídeo modificado (por exemplo, incluindo, sem limitação, AAVs mutantes em capsídeo e/ou AAVs com variante de proteína do capsídeo). (d) uso do vetor viral selecionado de (c) para administração ao indivíduo. (e) repetição de (b) a (d) (apenas a parte relacionada a NAbs preexistentes) antes de cada vez que o indivíduo necessitar uma ad- ministração de terapia genética, incluindo, sem limitação, uma admi- nistração de acompanhamento ao mesmo órgão (por exemplo, um olho ou um olho contralateral) ou a um outro órgão.
[547] Especificamente, vários vetores de rAAV incluindo cinco sorotipos de AAV diferentes (AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 e AAV9) e um AAV com mutação no capsídeo (AAV2.tri(Y-F)) foram gerados e testa- dos para avaliar diferenças entre linhagens celulares de paciente dife- rentes neste estudo. Exemplo 18: Uso de scAAV em Resgate Rápido de Doenças Retinais e Uso de EFS e/ou SPA em um vetor de scAAV ou um de AAV em Tratamento de Doenças Oculares
[548] Como demonstrado no Exemplo 13, tratamento com scA- AV.CYP4V2 obteve resgate robusto de fenótipo bioquímico em células iPS-RPE de paciente com BCD em um tempo muito curto (apenas 4 dias). Ainda, scAAV.CYP4V2 mostrou resgate de atrofia de RPE em linhagem celular iPS-RPE de paciente com BCD duas semanas após tratamento com AAV (vide Figura 11). A expressão rápida e robusta em células iPS-RPE humanas dirigida pelo promotor EFS (sequência exemplar mostrada na SEQ ID NO: 35) e SPA (sequência exemplar mostrada na SEQ ID NO: 36) em um vetor de scAAV demonstrou a adequabilidade de promotor EFS e/ou SPA na direção de expressão de um transgene em células oculares humanas e tratamento de doen- ças oculares humanas. O resgate rápido obtido por vetores de scAAV com o promotor EFS e SPA os tornam particularmente úteis em trata- mento de doenças de progressão rápida ou pacientes de estágio de doença avançado.
[549] Ainda, o estudo provou a expressão rápida e robusta de um projeto de scAAV em células retinais humanas. Isso torna a terapia genética mediada por scAAV particularmente útil em tratamento de paciente com doença retinal inicial ou em tratamento de um paciente em estágio avançado que necessite um resgate rápido. Discussão sobre Terapia Genética com CYP4V2
[550] BCD é uma doença do olho cegante rara para a qual atu- almente não existe nenhum tratamento aprovado disponível. Em pes- quisa clínica envolvendo o uso de linhagens celulares iPS-RPE espe- cíficas de paciente com BCD, a eficácia de vários projetos de vetor de AAV.CYP4V2 e cassete de expressão no resgate do fenótipo em célu- las iPS-RPE específicas de paciente com BCD foi provada neste estu- do conforme avaliado através de ensaios de ácido graxo e lipídeo. Ainda, doses diferentes (MOI) foram testadas, as quais servem como uma orientação para determinação da faixa de dose para tratamento in vivo. Finalmente, não há nenhuma evidência significante de toxidez associada com terapia genética com AAV.CYP4V2. Exemplos de Terapia Celular e Terapia de edição genética CRISP Exemplo 19 – Uso de Células iPSCs, iPS-RPE ou iPS-oculares de um Indivíduo BCD em Terapia Celular
[551] BCD é uma doença de início relativamente tardio. Sintomas em pacientes com BCD são geralmente desenvolvidos nas 2ª, 3ª e até mesmo 4ª décadas de vida. Ainda, processo de reprogramação de iPS pode ter um pouco de efeito de “reiniciar o relógio”. Desta maneira, as células iPS-RPE e outras células iPS-oculares derivadas de um paci- ente com BCD podem ser usadas como uma terapia celular para transplante para o paciente com BCD mesmo sem qualquer reparo genético das mutações de CYP4V2 nas células iPS-RPE.
[552] Alternativamente, iPSCs, células iPS-RPE, iPS-PRCs, célu- las iPS-CE, iPS-CECs e/ou outras células iPS-oculares derivadas de um paciente com BCD podem ser geneticamente reparadas antes de transplante de terapia celular. Reparo genético também pode ser obti- do ou através de terapia de gene CYP4V2 como descrito nos Exem-
plos acima ou através de edição genética. Vide os presentes Exem- plos para descrição mais detalhada sobre edição genética. Exemplo 20 – Células Autólogas de Paciente Geneticamente Repara- das para Terapia Celular Ocular
[553] Células derivadas de iPSC específicas de paciente (por exemplo, células iPS-RPE, iPS-CECs, células iPS-CE, iPS-PRCs ou células iPS-oculares) podem ser usadas como uma fonte de células autólogas para transplante em terapia celular para doenças oculares, incluindo, sem limitação, doenças retinais e da córnea. Comparado com células geradas a partir de fontes alogênicas, tais como células de ES (por exemplo, células de ES-RPE, ES-CEC ou ES-PRC e teci- dos formados de tais células derivadas de ES) ou células de iPS de um outro indivíduo, tais células autólogas derivadas de iPS específicas de paciente e tecidos feitos de tais células geralmente requerem pouca ou nenhuma imunossupressão do paciente e não têm questões éticas relacionadas ao uso de ES e células derivadas de ES.
[554] No entanto, iPSCs geradas a partir de células-fonte de pa- ciente (por exemplo, fibroblastos e células sanguíneas) e células e te- cidos derivados de tais iPSCs específicas de paciente (por exemplo, células iPS-RPE específicas de paciente, iPS-PRCs, iPS-CECs, célu- las iPS-CE e células iPS-oculares) ainda possuem mutações causado- ras de doença e fenótipo relacionado. Para gerar células e/ou tecidos derivados de paciente saudáveis, mutações patológicas podem ser geneticamente reparadas ou corrigidas com tecnologia de edição ge- nética, incluindo, sem limitação, as repetições palindrômicas curtas regularmente interespaçadas agrupadas (CRISPR), que podem ser projetadas para corrigir uma mutação-alvo na célula de um paciente. Essas iPSCs saudáveis geneticamente reparadas então podem ser usadas para gerar vários tipos de célula (por exemplo, células iPS- RPE, iPS-CECs, células iPS-CE, iPS-PRCs ou outras células iPS-
oculares) que não carregam mais as mutações patológicas do pacien- te.
[555] Ainda, esse estudo de prova de conceito demonstra que essas iPSCs com gene corrigido e/ou células derivadas de iPS com gene corrigido (por exemplo, células iPS-RPE) não têm mais o fenóti- po (por exemplo, perfil bioquímico anormal conforme avaliado por bio- ensaios, por exemplo, lipidômicos e proteômicos) como visto em célu- las derivadas de iPS (não corrigidas) do paciente. Desta maneira, es- sas células com gene corrigido servem como uma fonte de células au- tólogas geneticamente reparadas, regenerativas, que podem ser usa- das como células de substituição em terapia celular. Composições e métodos com relação a células autólogas do paciente com gene corri- gido são descritos em detalhes aqui e nos Exemplos abaixo.
[556] Um outro tipo de células de paciente geneticamente repa- radas são iPSCs de paciente ou células derivadas de iPS (por exem- plo, células iPS-RPE, iPS-PRCs, células iPS-CE, iPS-CECs e células iPS-oculares, células iPS- de neurônio) tratadas por terapia de suple- mentação genética (por exemplo, terapia genética com CYP4V2) como aqui descrito acima. Após tratamento com terapia genética, as células específicas do paciente possuem uma cópia saudável do gene mutado (por exemplo, um cDNA) e/ou expressam uma proteína funcional codi- ficada pelo transgene saudável. Ainda, as células específicas de paci- ente tratadas com terapia genética demonstram perfil bioquímico me- lhorado ou normalizado ou outro fenótipo visto em células de paciente não tratadas. Desta maneira, elas também podem ser usadas como uma fonte de células autólogas geneticamente reparadas para uso como células de substituição em terapia celular, por exemplo, células iPS-RPE, iPS-PRCs, iPS-CECs, células iPS-CE e células iPS-oculares específicas de paciente com BCD tratadas com terapia genética com CYP4V2 como células autólogas de paciente geneticamente repara-
das para uso em terapia celular para BCD. Composições e métodos com relação a células específicas de paciente com BCD tratadas com terapia genética com CYP4V2 são descritos em detalhes nos presen- tes Exemplos abaixo. Discussão abaixo foca no tipo de reparo genéti- co através da correção da mutação em DNA genômico.
[557] Substituição de célula autóloga para doenças degenerati- vas oculares e retinais associadas com mutações genéticas depende da habilidade em reparar uma mutação patogênica do paciente ao cor- rigir geneticamente a mutação através de edição genética ou reparar ou mitigar a consequência da mutação (por exemplo, através da admi- nistração de uma cópia saudável de um transgene relativo ao gene da doença, por exemplo, terapia genética com CYP4V2) antes do trans- plante. Aqui, iPSCs específicas de paciente de um paciente com BCD com a mutação de CYP4V2 mais comum (c.802-8_810del17insGC) foram geradas e os componentes de edição genética de CRISPR (RNA-guia de CRISPR e modelo doador) e vários construtos (plasmí- deo e RNP) para corrigir esta mutação foram desenvolvidos. Em-bora CRISPR/Cas9 seja usado aqui como um meio para edição genética, é antecipado que outro sistema de CRISPR (por exemplo, Cpf1) e outras técnicas de edição genética incluindo, mas não limitado a, TALEN bem como técnicas de edição genética emergentes e futuras tal como CRISPR/Cpf1 podem ser usadas para obter os mesmos resultados ou resultados similares. É também esperado que edição genética possa ser aplicada não apenas a iPSCs, mas também às células-fonte origi- nais que serão usadas para gerar as iPSCs, bem como às células ge- radas a partir das iPSCs, para corrigir a(s) mutação(ões) patogênica(s) em tais células.
[558] Embora as linhagens celulares derivadas de iPS sejam ge- radas em uma base específica de paciente, sua aplicação em terapia celular não tem que ser. Um fator-chave limitando o uso amplo de te-
rapia celular à base de iPSC são diferenças imunológicas dentre indi- víduos humanos. Há muitas abordagens para resolver este problema. Por exemplo, uma abordagem é desenvolver vários bancos de células que contêm um número limitado de linhagens com haplotipos de HLA comuns, projetados para obter compatibilidade imunológica com uma porção grande da população de paciente. Tal banco de células pode ser criado através da geração de iPSCs a partir de paciente com ha- plotipos selecionados ou através de manipulação genética de genóti- pos de HLA. Uma outra abordagem é produzir um tipo de célula que fosse imunologicamente silencioso sem importar o genótipo do pacien- te.
[559] O que segue descreve os métodos de como gerar células autólogas específicas de paciente geneticamente reparadas, como avaliar o efeito do reparo genético nas células e como usá-las em te- rapia celular. Os exemplos providos aqui são relacionados à geração de células autólogas de paciente geneticamente reparadas de um pa- ciente com BCD com a mutação c.802-8_810del17insGC no gene CYP4V2, a mutação mais comum dentre pacientes com BCD. Os mesmos métodos podem ser usados para gerar células autólogas de paciente geneticamente reparadas de um paciente com uma mutação diferente em CYP4V2 ou um paciente com uma mutação em um outro gene associado com uma doença ocular ou um paciente com uma mu- tação em um gene associado com outros tipos de doenças, incluindo, sem limitação, em qualquer gene contido na Tabela 4. Tabela 4 Lista de Gene-alvo ABCA4, ABCC6, ABHD12, ADAM9, AHI1, AIPL1, ALMS1, ARL13B, ARL6, ARMS2, ATXN7, BBS1, BBS10, BBS12, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS9, BEST1, C1QTNF5, C2, C2orf71, C3, C5orf42, C8orf37, CA4, CABP4, CAC-NA1F, CACNA2D4, CAPN5, CC2D2A, CDH23,
CDH3, CDHR1, CEP164, CEP290, CEP41, CERKL, CFB, CFH, CHM, CHR2, CIB2, CLN3, CLN5, CLN6, CLN8, CLRN1, CNGA1, CNGA3, CNGB1, CNGB3, CNNM4, COL11A1, COL2A1, COL9A1, CRB1, CRX, CYP4V2, DFNB31, DHDDS, EFEMP1, ELOVL4, ERCC6, EYS, FAM161A, FBLN5, FLVCR1, FSCN2, FZD4, GNAT1, GNAT2, GNPTG, GPR143, GPR179, GPR98, GRK1, GRM6, GRN, GUCA1A, GUCA1B, GUCY2D, HARS, HMCN1, HTRA1, IDH3B, IFT140, IFT80, IMPDH1, IMPG2, INPP5E, INVS, IQCB1, ITM2B, JAG1, KCNJ13, KCNV2, KCTD7, KIF11, KLHL7, LCA5, LRAT, LRIT3, LRP5, LZTFL1, MAK, MERTK, MFN2, MFRP, MFSD8, MKKS, MKS1, MT-ND4, MTTP, MYO7A, NDP, NEK4, NEK8, NMNAT1, NPHP1, NPHP3, NPHP4, NR2E3, NRL, NUB1, NYX, OA1, OAT, OCA1, OCA2, OFD1, OPA1, OPA3, OPN1LW, OPN1MW, OPN1SW, OTX2, PANK2, PAX2, PCDH15, PDE6A, PDE6B, PDE6C, PDE6G, PDE6H, PDGF, PDZD7, PEX1, PEX10, PEX14, PEX16, PEX19, PEX2, PEX5, PEX6, PEX7, PGK1, PHYH, PITPNM3, PLA2G5, PPT1, PRCD, PROM1, PRPF3, PRPF31, PRPF6, PRPF8, PRPH2, RAB28, RAX2, RBP3, RBP4, RD3, RDH12, RDH5, RDS, RGR, RGS9, RGS9BP, RHO, RIMS1, RLBP1, ROM1, RP1, RP1L1, RP2, RP9, RPE65, RPGR, RPGRIP1, RPGRIP1L, RS1, SAG, SDCCAG8, SEMA4A, SLC24A1, SLC45A2, SNRNP200, SPATA7, TEAD1, TIMM8A, TIMP3, TLR3, TLR4, TMEM126A, TMEM231, TMEM237, TMEM67, TOPORS, TPP1, TREX1, TRIM32, TRPM1, TSPAN12, TTC21B, TTC8, TTPA, TULP1, TYR, TYRP1, UNC119, USH1C, USH1G, USH2A, VCAN, VPS13B, WDPCP, WDR19, WFS1, WHRN, ZNF423, ZNF513, ACO2, AFG3L2, AUH, C12orf65, CISD2, CYP1B1, FOXC1, FOXF2, LTBP2, MTPAP, MYOC, NDUFS1, NR2F1, OPTN, PAX6, PITX2, POLG, SPG7, TEK, TXNRD2, ATXN2, RO-BO3, PHOX2A, HOXA1, SALL4, CHN1, TUBB3, KIF21A, HOXB1, FAM47E, GBA, GCH1, HTRA2, LRRK2, PARK2, PINK1, SNCA, SYNJ1, NPC1, NPC2, CYP4A11, CYP4A22,
CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F22, CYP4X1, CYP4Z1, CYP46A1
[560] Usando BCD, uma doença com mutações em CYP4V2, como um exemplo, iPSCs foram geradas a partir de células específi- cas de paciente carregando a mutação específica do paciente com BCD. As iPSCs específicas de paciente são transfectadas com RNAs- guia de CRISPR (gRNA), endonuclease Cas9 e um modelo de homo- logia de doador. Cópias de gene CYP4V2 mostram correção de muta- ção e conversão no alelo do tipo selvagem. As iPSCs corrigidas são então usadas para gerar células iPS-RPE com gene corrigido. As célu- las iPS-RPE com gene corrigido são então testadas para confirmar que elas não têm mais fenótipo (por exemplo, perfil bioquímico anor- mal (por exemplo, perfil de ácidos graxo)). Essas células autólogas de paciente geneticamente reparadas podem ser transplantadas (ou dire- tamente (por exemplo, suspensão celular) ou em outras formas, tal como parte de uma camada, uma folha, uma matriz, uma base ou um tecido) para o mesmo paciente como uma terapia celular autóloga pa- ra BCD. (i) Geração de Linhagens iPSC Específicas de Paciente com BCD:
[561] iPSCs foram geradas a partir de células específicas de pa- ciente a partir de um paciente com BCD carregando mutação c.802- 8_810del17insGC homozigota no gene CYP4V2 como aqui descrito. Vide Exemplo 1 quanto a métodos para gerar iPSCs específicas de paciente. A mutação do paciente com BCD foi identificada através de sequenciamento (ii) Projeto, Avaliação e Seleção de componentes de edição genética CRISPR e construtos se direcionando à mutação:
[562] Vide os Exemplos aqui sobre terapia de adição de gene CRISPR para uma descrição detalhada.
[563] (gRNAs de CRISPR foram selecionados para minimizar a edição fora do alvo e maximizar especificidade com uma sequência- alvo diretamente centrada no sítio de mutação. gRNAs múltiplos com especificidade alta para a região contendo a mutação de CYP4V2 es- pecífica para paciente foram avaliados. Os gRNAs candidatos foram separadamente inseridos em um vetor de expressão também conten- do a endonuclease Cas9 responsável pela mediação da clivagem de DNA-alvo e transfectados em uma linhagem celular 293. DNA genômi- co do paciente foi amplificado através de PCR usando iniciadores para a região de CYP4V2, e os produtos de PCR foram analisados quanto à atividade de clivagem de DNA. Um ensaio de pesquisa foi usado ava- liar qual candidato a gRNA tem atividade relativamente alta para o sítio de mutação. O gRNA com a eficiência de corte mais alta é usado para edição genética). (iii) Edição genética em iPSCs:
[564] Vide Exemplos abaixo sobre terapia de adição de gene CRISPR para uma descrição detalhada.
[565] Para doenças recessivas genéticas tal como BCD, correção de gene em um alelo ou mutação é suficiente. Construtos de CRISPR múltiplos se direcionando a mutações diferentes podem ser usados para corrigir mutações múltiplas carregadas por uma célula. (iv) Geração de células iPS-RPE ou outras células iPS-oculares de iPSC com Gene Corrigido:
[566] Após confirmar correção precisa da mutação patogênica sem nenhuma ou mínima edição fora do alvo através de sequencia- mento, a iPSC corrigida por edição genética é usada para diferenciar em e gerar células iPS-RPE ou o outro tipo de células iPS-oculares (por exemplo, iPS-PRCs, iPS-CECs ou células iPS-CE) afetados pela doença relevante como aqui descrito. As células iPS-RPE corrigidas derivadas de paciente com BCD então passam pela mesma confirma- ção de destino de RPE (por exemplo, morfologia de RPE distinta (por exemplo, pigmento e/ou formato hexagonal) e/ou marcadores específi- cos de RPE). (v) Bioensaios para confirmar livre de fenótipo
[567] Bioensaios são usados para confirmar que essas iPSCs com gene corrigido e/ou células derivadas de iPS com gene corrigido (por exemplo, células iPS-RPE) não têm mais o fenótipo como visto em células derivadas de iPS (não corrigidas) do paciente. Os bioen- saios podem ser qualquer tipo de ensaio biológico que possa identifi- car e avaliar o fenótipo de tipo celular e/ou molecular em células de paciente uma vez que ele se refere a uma doença específica. Por exemplo, eles podem incluir, sem limitação, testes lipidômicos, pro- teômicos, de expressão de proteína e/ou outros bioquímicos. Para BCD, o bioensaio inclui testes de ácidos graxos e ceramidas como descrito nos presentes Exemplos. Os resultados indicam que essas células iPS-RPE com gene corrigido derivadas do paciente com BCD não têm mais o defeito/disfunção bioquímico relevante como visto em células iPS-RPE não corrigidas derivadas de pacientes com BCD. Isso prova que células iPS-RPE, com gene corrigido, são livres de fenótipo e desta maneira são uma fonte de células de substituição adequadas para terapia celular. (vi) Transplante:
[568] Essas células autólogas de paciente geneticamente repa- radas (por exemplo, células iPS-RPE, iPS-PRCs, células iPS-CE, iPS- CECs e outras células iPS-oculares) podem ser transplantadas (ou diretamente ou como parte de uma camada, uma folha, uma matriz, uma base ou um tecido) para o mesmo paciente como uma terapia celular para BCD. Exemplo 21- Exemplo Específico de Terapia de Edição genética CRISPR para uma Doença Ocular
[569] CRISPR/Cas9 é altamente específico quando gRNAs são projetados corretamente, mas especificidade e edição fora do alvo é ainda uma grande preocupação, particularmente uma vez que CRISPR está sendo desenvolvido para uso clínico. O Exemplo que segue descreve em detalhes métodos para desenvolvimento de cons- trutos de terapia de edição genética CRISPR com especificidade no alvo alta e risco de edição fora do alvo baixo para uso em tratamento de doença ocular. Ainda, a mutação c.802-8_810del17insGC repre- senta uma das mutações mais desafiadoras de corrigir dentre todas as mutações de CYP4V2 conhecidas e outras doenças oculares genéti- cas. A maioria das mutações de CYP4V2 são mudança, inserção ou deleção de nucleotídeo simples (vide Tabela 1: Selecionar Mutações de CYP4V2 dentre Pacientes com BCD), enquanto a mutação c.802- 8_810del17insGC envolve uma deleção de 17 pb e uma inserção de 2 pb e ambos um íntron e um éxon.
[570] Vários conjuntos de construtos de terapia de edição genéti- ca CRISPR para corrigir a mutação de CYP4V2 patológica mais co- mum (muta-ção c.802-8_810del17insGC) foram projetados e construí- dos. O que segue é uma descrição detalhada do projeto, composições e métodos de uso desses construtos de Edição genética CYP4V2 CRISPR para corrigir a mutação e tratar BCD. (a) Análise da Mutação
[571] A mutação c.802-8_810del17insGC envolve ambos um ín- tron e um éxon, e ambas uma deleção e uma inserção, e afeta um sítio aceptor de união.
[572] A mutação c.802-8_810del17insGC se refere a uma dele- ção de 17 bases com duas bases (GC) inseridas no lugar começando 8 bases a partir da extremidade de íntron 6 de gene CYP4V2, também referida como IVS6-8 del/insGC; vide SEQ ID NO: 46 mostrando se- quência da região de DNA genômica de CYP4V2 compreendendo a mutação c.802-8_810del17insGC e SEQ ID NO: 47 mostrando a se-
quência do tipo selvagem correspondente. A mutação c.802- 8_810del17insGC é ilustrada na sequência que segue que mostra jun- ção de íntron 6-éxon 7 de CYP4V2 hu-mano. Sequência de íntron 6 é mostrada em letras minúsculas e a sequência do éxon 7 em letras maiúsculas. A deleção de 17 pbs e a inserção de GC estão em parên- teses): caa aca gaa gca tgt gat tat cat tca aa (tca tac agG TCA TCG CT) (GC) GAA CGG GCC AAT GAA ATG AAC GCC AAT GA) é pre- visto resultado no pulo do éxon 7. O CYP4V2 do tipo selvagem tem a sequência que segue: CAA ACA GAA GCA TGT GAT TAT CAT TCA AA(T CAT ACA GGT CAT CGC T)GA ACG GGC CAA TGA AAT GAA CGC CAA TGA (SEQ ID NO:47), enquanto o CYP4V2 mutante c.802- 8_810del17insGC tem a sequência que segue: CAA ACA GAA GCA TGT GAT TAT CAT TCA AA(G C)GA ACG GGC CAA TGA AAT GAA CGC CAA TGA (SEQ ID NO:46). Os nucleotídeos em parênteses na sequência do tipo selvagem são os 17 nucleotídeos que são deletados e os nucleotídeos em parênteses na sequência mutante são os 2 nu- cleotídeos que são inseridos seguindo a deleção de par de base 17.
[573] Para obter taxa de reparo boa usando CRISPR, uma cliva- gem gerada por Cas mais próximo possível da sequência mutada é desejada. A região do DNA genômico de CYP4V2 contendo a mutação c.802-8_810del17insGC tem sítios PAM de SpCas9 (NGG) múltiplos. Desta maneira, SpCas9 regular pode ser usado para corrigir esta mu- tação. Alternativamente, Cas9 de outras espécies, uma Cas9 mutada ou outra nuclease de CRISPR (por exemplo, Cpf1) com um PAM dife- rente (por exemplo, TTTN para Cpf1 que está presente na sequência mutada) pode ser usada para corrigir a mutação c.802- 8_810del17insGC e/ou outras mutações. (b) Projeto e seleção de gRNA de CRISRP
[574] Com base nos vários sítios de PAM presentes na região da mutação c.802-8_810del17insGC do gene CYP4V2, sequências de elemento protoespaçador relacionado múltiplas (daqui em diante refe- ridas como gRNA, tipicamente é de 20 nt de comprimento, mas podem estar em comprimento diferente, por exemplo, 17-22 nt para uso com Cas9) foram avaliadas usando software DeskGen. Cinco (5) candida- tos a gRNA foram selecionados usando os critérios que seguem: a) a proximidade do sítio de clivagem de gRNA/Cas9 com o sítio de corre- ção-alvo; e b) os perfis fora do alvo previstos do gRNA (vide Tabela 5 e Figura 12; vide SEQ ID NOs: 48 a 52 para sequências de gRNA). Tabela 5. Sequências de candidatos a gRNA Classificação Fora gRNA Sequência do alvo score CYP4V2 g1 87 5’-TGA TTA TCA TTC AAA GCG AA CGG-3’ CYP4V2 g2 98 5’-GAT TAT CAT TCA AAG CGA AC GGG-3’ CYP4V2 g3 73 5’-GAT AAT CAC ATG CTT CTG TT TGG-3’ CYP4V2 g4 70 5’-TTC ATT GGC GTT CAT TTC AT TGG-3’ CYP4V2 g5 32 5’-CAC ATG CTT CTG TTT GGA CT TGG-3’
[575] O sítio de PAM correspondendo a cada candidato de gRNA é destacado em negrito. Para evitar confusão, sequência de PAM não é parte da sequência de gRNA (elemento protoespaçador). (c) Validação de gRNA usando DNA Genômico de Paciente
[576] DNA genômico de um paciente com BCD (P1) com muta- ções c.802-8_810del17insGC foi usado para selecionar e validar os gRNAs. Amplicons de DNA flanqueando uma região de CYP4V2 con- tendo o sítio de mutação e vários sítios-alvo foram preparados usando iniciadores (vide Tabela 6 e Figura 12). Amplicons de DNA, RNA-guia único (sgRNA) preparado através de transcrição in vitro (IVT) (cada um compreendendo um do gRNA1, gRNA2, gRNA3, gRNA4 ou gRNA5) e proteína SpCas9 foram misturados e incubados a 37º C por 1 h. sgRNA ativo mediou proteína Cas9 para criar quebras de filamen- to duplo nos Amplicons e exibir vários padrões de fragmento (Tabela 7). As reações foram carregadas e fragmentos de DNA foram nova- mente determinados em gel de agarose 1,5%.
Tabela 6. Iniciadores usados em validação de gRNA Sequências Amplicon (pb) CYP4V2 1F 5’-CAG AAA TCG CAA GCA TAG AGG GTG AAT TCA-3’ 1062pb CYP4V2 1R 5’-CTG TTG GAG GGC TCT TAA CTG TCC-3’ Tabela 7. Fragmentos de DNA preditos criados por gRNAs ativos gRNA Tamanho do amplicon do DNA (pb) Tamanhos do fragmento (pb) g1 442 620 g2 443 619 g3 1062pb 416 646 g4 455 607 g5 410 652
[577] Para confirmar que os fragmentos são na verdade origina- dos de amplicon, amostras de DNA de amplicon não tratado (Figura 16, painel superior) e o fragmento menor de tratado com g2 (Figura 16, painel do meio) foram submetidas a sequenciamento Sanger (Figura 14). Todos os 5 gRNAs mostraram atividades de clivagem preditas.
[578] Em adição a ou no lugar de validação em DNA genômico de paciente carregando a mutação, atividades de gRNAs podem tam- bém ser validadas em células de paciente, incluindo, sem limitação, células somáticas, células-tronco, iPSCs ou células derivadas de uma célula-tronco. (d) Construção de vetores de expressão de gRNA
[579] Três gRNAs (g1, g2 e g3) com as mais altas atividades e mais altas classificações fora do alvo foram clonados em vetor de ex- pressão de gRNA pX-U6-CBh-Cas9-Puro através da inserção de um cassete oligo de filamento duplo de cada gRNA ativo. Cada cassete foi sintetizado com base em uma das sequências de gRNA de g1, g2 e g3. Ilustrações esquemáticas mostrando o construto do vetor de ex- pressão e o sítio de inserção do gRNA são providas na Figura 15 e na Figura 16. Vide Figura 17 para uma ilustração mais detalhada (usando g1 como exemplo) mostrando a sequência de sgRNA IVT inteira (SEQ ID NO: 55 (não incluindo a sequência do elemento protoespaçador ou o “G” opcional”)) seguindo o promotor U6. O nucleotídeo “G” (SEQ ID NO: 59) inserido no início de cada sequência de elemento protoespa- çador (gRNA) é opcional. Ele é principalmente para aumentar a efici- ência de transcrição do promotor U6. Ele não é necessário se a se- quência do elemento protoespaçador começar com um resíduo “G” ou se um promotor não UT for usado (por exemplo, promotor H1). Todos os construtos de gRNA foram verificados através de ambos digestão e sequenciamento de enzima de restrição.
[580] Três plasmídeos cada um expressando um RNA superior (g1, g2 ou g3) e coexpressando hSpCas9 e genes de resistência à pu- romicina, a saber pX459-hSpCas9-2a-Puro, foram desenvolvidos (Fi- guras 15 e 16) e incluídos como um dos construtos (vide Tabela 8 abaixo) para correção de gene da mutação c.802-8_810del7insGC.
[581] Seria compreendido que o RNA-guia, proteína Cas e/ou marcador de seleção (por exemplo, gene de resistência à puromicina e/ou GFP, EGFP ou RFP) podem ser empacotados em um plasmídeo ou em plasmídeo separado. Ainda, quando mais de um gRNA é usado (ou para corrigir mutações múltiplas ou corrigir a mesma mutação, por exemplo, um gRNA de emparelhamento para uso com Cas9 Nickase), eles podem ser empacotados no mesmo vetor ou em vetores separa- dos.
[582] Em adição ao vetor de plasmídeo descrito aqui, vários ou- tros vetores podem ser usados para empacotar componentes de edi- ção genética de CRISPR (RNA-guia e/ou proteína Cas), e/ou marca- dor de seleção, incluindo, sem limitação, vetor de plasmídeo pX458, vetores de vírus adenoassociado (AAV) e/ou vetores de lentivírus. Em adição a construtos de DNA codificando os componentes de CRISPR, RNA-guia, proteína Cas e/ou marcadores de seleção podem ser usa- dos diretamente ou em um construto de mRNA ou construto de RNP. (e) Construção e validação de RNP de CRISPR
[583] Em adição a um construto de DNA em um vetor (por exem- plo, um plasmídeo pX459 como acima descrito), um construto de ribo- nucleoproteína (RNP) de CRISPR foi desenvolvido para cada um de g1, g2, g3, g4 e g5 (vide Tabelas 5 e 8). Cada construto de RNP com- preende (i) um RNA-guia simples quimérico (sgRNA) compreendendo o elemento protoespaçador relevante (vide Tabelas 5 e 8 e presente descrição detalhada); e (ii) uma proteína SpCas9 formando um com- plexo de ribonucleoproteína (RNP). As atividades de clivagem de vá- rios construtos de RNP (sgRNA1:Cas9, sgR-NA2:Cas9, sgR- NA3:Cas9, sgRNA4:Cas9, sgRNA5:Cas9) no sítio-alvo do gene CYP4V2 foram validadas em DNA genômico de paciente (vide Figuras 12, 13 e 14) como descrito no parágrafo (c) acima.
[584] Um sgRNA é tipicamente de cerca de 100nt de comprimen- to, mas pode variar em comprimentos compreendendo uma sequência de elemento protoespaçador de 17nt-22nt. Um sgRNA pode ser IVT derivado ou sintético. sgRNAs de IVT correspondendo a g1, g2, g3, g4 e g5 foram gerados e validados como acima descrito. sgRNAs sintéti- cos correspondendo a g1 e g2 foram encomendados da Synthego (Si- licon Valley, CA, USA) como descrito abaixo.
[585] No lugar de sgRNA, um dúplex de crRNA (sequência exemplar em SEQ ID NO: 53) e tracrRNA (sequência exemplar em SEQ ID NO: 54) pode ser usado junto com uma proteína Cas (por exemplo, Cas9) para formar um complexo de RNP de CRISPR (crR- NA:tracrRNA: Cas9). Quando usando uma proteína Cpf1, nenhum tracrRNA é necessário.
[586] Um sgRNA ou crRNA:tracrRNA pode ser quimicamente modificado para proteger contra degradação de RNA intracelular. Por exemplo, um RNA sintético quimicamente modificado pode conter aná- logos de 2’-O-metila e ligações internucleotídeo de 3’ fosforotioato nas três bases terminais 5’ e 3’ do gRNA (Synthego (Silicon Valley, CA,
USA). sgRNA ou crRNA e tracrRNA sintéticos com base em uma dada sequência de elemento protoespaçador (por exemplo, g1, g2, g3, g4 ou g5 de CRISPR (vide SEQ ID NOs: 48 a 52) estão comercialmente disponíveis, por exemplo, da Synthego Corporation (Silicon Valley, CA, USA) ou IDT, com modificação química disponível como uma opção. (f) Construção de Modelo Doador
[587] Em um reparo direcionado à homologia (HDR), um modelo doador é usado para prover a sequência de ácido nucleico doadora necessária para corrigir a sequência mutada do gene-alvo. Dois mode- los doadores separados para HDR foram gerados na forma de Oligo Desoxinucleotídeo de filamento simples (ssODN). O primeiro, referido como modelo doador de CYP4V2 ou CYP4V2 ssODN1 (SEQ ID NO: 56), contém a correção de 17 pb e tem a sequência como segue: 5’-
AGA AAA ATA AAT GAA AGA AAC TAG CAT ATT TTA TAA GAA AAT GTG TTA ACT AGG GTG CAT CCA AGT CCA AAC AGA AGC ATG TGA TTA TCA TTC AAA TCA TAC AGG TCA TCG CTG AAC GGG CCA ATG AAA TGA ACG CCA ATG AAG ACT GTA GAG GTG
ATG GCA GGG GCT CTG CCC CCT CCA AAA ATA AAC GCA GGG CCT TT-3’; enquanto o segundo modelo doador, referido como modelo doador de CYP4V2 ou CYP4V2 ssODN2 (SEQ ID NO: 57), é o com- plemento reverso do modelo doador de CYP4V2 1.
[588] Qualquer um dos modelos doadores pode ser usado com qualquer gRNA ou sgRNA (g1, g2, g3, g4 ou g5) descrito acima, e uma proteína Cas9 para gerar reparo direcionado à homologia (HDR) para corrigir a mutação CYP4V2-alvo (c.802-8_810del17insGC).
[589] Os modelos de doador providos aqui são de 200nt de com- primento. Modelos de doador de vários comprimentos podem ser usa- dos. Um modelo de doador pode ser simétrico ou assimétrico com re- lação ao sítio-alvo. Um modelo de doador pode ser provido por um ssDNA, ssODN ou um vetor (por exemplo, um vetor de plasmídeo ou de AAV) contendo ou codificando a sequência de ácido nucleico doa- dora. Se o modelo de doador tiver uma sequência intacta complemen- tar ao elemento protoespaçador no RNA-guia de CRISPR e a sequên- cia de PAM direcionada pela proteína Cas, para evitar que esse mode- lo de doador seja degradado pela proteína Cas (por exemplo, Cas9) em células, mutações podem ser feitas no modelo doador, por exem- plo, para mutar o “NGG” PAM Cas9 no modelo doador e mudá-lo para “NGT” ou uma outra sequência não PAM. No entanto, se a mutação de PAM pretendida ser introduzida pelo modelo de doador estiver dentro de região de codificação, é necessário que se tenha cuidado que seja garantido que ela seja uma mutação silenciosa.
[590] Modelos de doador podem ser feitos sinteticamente e estão comercialmente disponíveis. Por exemplo, oligos de DNA de uma dada sequência podem ser encomendados (Ultramer® DNA Oligonucleoti- des, Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa, USA). (g) Proteína Cas e Marcador de Seleção
[591] Proteínas/nucleases associadas a CRISPR (Cas) (por exemplo, Cas9 ou Cpf1) estão comercialmente disponíveis, incluindo, sem limitação, codificadas por um plasmídeo ou como proteína re- combinante para uso em um construto de RNP. Uma proteína Cas também pode incluir uma, duas ou mais sequências de localização nu- clear (NLS) (por exemplo, No. catálogo: 1074182, Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa, USA; No. catálogo: A034a-a- 1000, Feldan (Quebec, Canadá); Cpf1: No. catálogo: 1076158 (IDT)) e pode ser também fundida com um marcador de seleção (por exemplo, uma proteína SpCas9 fundida com EGFP, No. catálogo: PR-137211-E (Novatein Biosciences, Woburn, MA, USA).
[592] Quando transfectando um construto de edição genética de CRISP in vitro em células, um marcador de seleção pode ser usado para avaliar a taxa de transfecção e/ou auxiliar em pegar as células para o processamento da etapa seguinte. Vários marcadores de sele- ção incluindo, sem limitação fluorescência (por exemplo, GFP, EGFP, RFP) e/ou puromicina), podem ser usados no processo. Um marcador de seleção pode ser integrado com qualquer componente de um cons- truto de CRISPR ou pode ser provido separadamente em um processo de transfecção. Por exemplo, um marcador de fluorescência pode ser combinado com o tracrRNA (IDT) ou a proteína Cas9 (Novatein Bios- ciences, No. catálogo: PR-137211-E) para imagem e classificação manual ou FACS convenientes de células transfectadas. Um gene de resistência à puromicina pode ser provido em um vetor que é cotrans- fectado com o construto de CRISPR para seleção usando puromicina. Seleção usando puromicina é ilustrada nos Exemplos. Marcadores de seleção de vários tipos tais como marcador de seleção de antibióticos (por exemplo, puromicina) ou marcação com fluorescência estão co- mercialmente disponíveis e podem ser integrados ao componente de CRISPR (por exemplo, a proteína Cas9 ou o RNA-guia de CRISPR) ou providos separadamente (por exemplo, um plasmídeo de expressão expressando o gene de resistência à puromicina), incluindo, sem limi- tação: IDT, Sigma Al-drich, Novatein Biosciences, Clonetech Laborato- ries e InvivoGen. (h) Construtos e protocolo recomendado
[593] A tabela que segue (Tabela 8) mostra os construtos de edi- ção genética de CRISPR (plasmídeo e RNP) gerados para cada um dos 3 gRNAs (gRNA1, gRNA2 e gRNA3). Eles contêm três construtos de plasmídeo de gRNA ou respectivo gRNA, dois modelos de doador (complementares avançado e reverso) e proteína SpCas9. Tabela 8. Construtos de plasmídeo e RNP para Terapia de Correção de gene CRISPR para mutação de CYP4V2 (c.802- 8_810del17insGC)1
No.
Item Tipo Nome
1 DNA construto/plasmídeo2 CYP4V2-g1 (Vide Tabela 5 e SEQ ID NO: 48 para sequência)
2 DNA construto/plasmídeo2 CYP4V2-g2 (Vide Tabela 5 e SEQ ID NO: 49 para sequência)
3 DNA construto/plasmídeo2 CYP4V2-g3 (Vide Tabela 5 e SEQ ID NO: 50 para sequência)
4 sgRNA3 CYP4V2-g1 (Vide Tabela 5 e SEQ ID NO: 48 para sequência)
5 sgRNA3 CYP4V2-g2 (Vide Tabela 5 e SEQ ID NO: 49 para sequência)
6 sgRNA3 CYP4V2-g3 (Vide Tabela 5 e SEQ ID NO: 50 para sequência)
7 Modelo doador4 Modelo doador de CYP4V2 1 (Vide para (f) e SEQ ID NO: 56)
8 Modelo doador4 Modelo doador de CYP4V2 2 (Vide para (f) e SEQ ID NO: 57)
9 Proteína SpCas9 (Vide SEQ ID NO: 58 para sequência exemplar)
1 Os construtos para correção da mutação c.802-8_810del17insGC, a muta-ção de CYP4V2 mais comum dentre pacientes com BCD. gRNAs de CRISPR e construtos para correção de outras mutações de CYP4V2 podem ser projetados e validados usando os métodos como aqui descrito.
Em adi-ção a construtos de plasmídeo e RNP, outros construtos incluindo, sem limi-tação, mRNA e vetor viral, podem ser também usados para prover/expressar um ou mais componentes de CRISPR. 2 Um plasmídeo pX459 codificando os componentes de CRISPR (sgR- NA e proteína SpCas9) e gene de resistência à puromicina (Puro) co- mo marcador de seleção.
Vide Figura 17 mostrando construto de DNA e sequência codificando o sgRNA (usando g1 como exemplo e Figuras 15 e 16 para construto e mapa de vetor). Cada sequência de sgRNA contém (a) um elemento protoespaçador de 20nt (SEQ ID NOs: 48, 49 ou 50 para g1, g2 e g3, respectivamente) e (b) uma sequência de 82nt (SEQ ID NO: 55 (sequência mostrada em formato de DNA conforme incluído no DNA de plasmídeo; para sequência de RNA, usar “U” para substituir “T” na sequência de DNA.
O vetor pX459 contém um nucleo- tídeo “G” (SEQ ID NO: 59 e Figura 17) imediatamente após a sequên-
cia de promotor U6 humano e antes da sequência do elemento protoe- spaçador para aumentar a eficiência de transcrição dirigida pelo pro- motor U6, que está também incluído no sgRNA derivado de IVT. Os componentes de CRISPR (gRNA e proteína Cas) podem ser também clonados em outros vetores, incluindo, sem limitação, vetores virais tais como vetores de lentivírus ou vetores de AAV. gRNA e proteína Cas (por exemplo, proteína Cas9) de CRISPR podem ser clonados em vetores separados ou em um vetor. 3 sgRNA baseado em vários elementos protoespaçadores (CYP4V2 g1, CYP4V2 g2 ou CYP4V2 g3, vide Tabela 5 e SEQ ID NO: 48, 49 ou 50, respectivamente). Vide descrição acima para os sgRNAs de IVT. Em adição a sgRNAs de IVT, sgRNAs sintéticos com modificações quími- cas foram encomendados da Synthego Corporation (Silicon Valley, CA, USA). Ao invés de sgRNA, um dúplex de crRNA (compreendendo a sequência de protoespaçador de 20nt de CYP4V2 g1, g2 ou g3 e sequência restante do crRNA (sequência exemplar mostrada na SEQ ID NO: 53)) e um tracrRNA (sequência exemplar mostrada na SEQ ID NO: 54)) pode ser usado. 4 Um modelo de doador para reparo direcionado à homologia (HDR). Modelos de doador de comprimentos diferentes podem ser também usados, e podem ser construídos em formas diferentes, incluindo, sem limitação, como ssODN ou em um vetor (por exemplo, em um vetor de vírus adenoassociado (AAV) (por exemplo, AAV2 ou AAV6). Concen- tração de cada reagente é em cerca de 1000 (ng/µL).
[594] Os protocolos que seguem são para administração de construtos de reparo de gene de CRISPR de mutação de CYP4V2 às iPSCs do paciente através de eletroporação e nucleofecção. Outros métodos, incluindo, sem limitação, lipofecção, transdução de vetor viral (por exemplo, vetor de lentivírus) ou AAV (por exemplo, uso de AAV6 para administrar o modelo de doador) ou microinjeção podem ser tam-
bém usados. iPSCs P1 de passagens 11 a 14 são usadas. Protocolo No. 1 (Eletroporação usando plasmídeos):
1. Seguindo as instruções do Neon® transfection system (Life Technologies), usar mistura contendo 2,5 µg (2,5 µl de estoque) de pX459.gRNA (Item No. 1 ou 2 ou 3. Não combinar gRNAs) e 2,5 µg (2,5 µl de estoque) ssODN (Ou item No. 7 ou 8) para cerca de 1 mi- lhão de células.
2. Aplicar condições de eletroporação (EP): a) 1100V, 30ms, 1 pulso; ou b) 1200V, 30ms, 1 pulso.
3. Após EP, separar as células uniformemente em 3 poços de uma placa de 6 poços com inibidor Rock (10 µM).
4. Dois dias após plaqueamento, adicionar puromicina como indicado na Tabela 9.
5. Dois dias após adição de Puromicina, substituir o meio usado com meio livre de puromicina fresco.
6. Manter as culturas por 2 semanas antes de pegar as colô- nias. Tabela 9. Condições e nível de concentração de puromicina para iPSCs doentes Concentraçãod e puromicina (µg/ml) 1100V 30ms 0,1 0,15 0,2 1p 1200V 30ms 0,1 0,15 0,2 1p Protocolo No. 2 (Eletroporação usando RNP):
[595] 1. Usar balde de gelo. Descongelar um sgRNA (Item No. 4 ou 5 ou 6; não combinar gRNAs), um modelo de doador de ssODN (ou item No. 7 ou 8) e proteína SpCas9 (Item No. 9), bem como o vetor de expressão de Cas9-Puro em gelo. O vetor de expressão de Cas9-Puro é usado como um marcador de seleção. Ele é um plasmídeo pX459- hSpCas9-2A-Puro e tem uma estrutura mostrada na Figura 15, exceto que ele não clonou em gRNA.
[596] 2. Marcar tubos Eppendorf de 1,7 ml e placas de 6 poços clara-mente. Para cada amostra, preparar um tubo Eppendorf e 1 po- ço. Adicionar 3 ml de meio de cultura (TeSR-E8 da StemCell Techno- logies (No. Cat. 05940) a cada cavidade.
[597] 3. Preparar uma placa de 10 cm com 25 ml de PBS para lavar a ponta Neon®.
[598] 4. Preparar placa de 6 poços para plaqueamento das célu- las eletroporadas. Adicionar 3 ml de meio de cultura a cada poço.
[599] 5. Em cada tubo Eppendorf, adicionar 4 µg (4 µl de esto- que) de sgRNA (Item 4, 5 ou 6. Não combinar os sgRNAs) e 10 µg (10 µl de estoque) de proteína SpCas9 (Item No. 9), deixar o tubo em tem- peratura ambiente por pelo menos 10 min.
[600] 6. Adicionar 5 µg (5 µl de estoque) de ssODN (ou item No. 7 ou 8) e 2,5 µg (2,5 µl de estoque) de vetor de expressão de Cas9- Puro em cada tubo.
[601] 7. Ressuspender as células em tampão Neon® EP apropri- ado para densidade final 1x107 células/ml.
[602] 8. Separar em alíquotas 105 µl de suspensão celular e adi- cionar a cada tubo Eppendorf com mistura de RNP CRISPR.
[603] 9. Adicionar 3 ml de Tampão E2 à pipeta Neon® e pôr a pipeta Neon® na estação de pipeta Neon®.
[604] 10. Usar 100 µl de Neon® tip. Aspirar 100 µl de mistura EP de cada tubo Eppendorf e inserir em pipeta Neon®.
[605] 11. Aplicar uma das condições de EP na Tabela 9 acima e se-guir as etapas 3 a 6 do Protocolo No. 1 acima.
[606] Nota: se iPSCs não crescem bem, meio de condição é re- comen-dado. Coletar o meio usado (sem Puromicina) e filtra-lo para retirar os restos de célula. Mistura em uma razão 1:1 de meio usado e meio fresco. O uso de Matrigel (No. Cat. Corning 354277) e do meio TeSR-E8 da StemCell Technologies (No. Cat. 05940) é recomendado para cultura de iPSCs hu-manas em condições livres de alimentador através do processo de edição genética. A adição de inibidor Rock (concentração final 10 µM) ao meio por 48 horas quando plaqueando as células após EP ajudará a preservar a via-bilidade celular. Protocolo No. 3 (Nucleofecção usando RNP):
[607] 1. Nucleofector Lonza 4D, ajuste de parâmetro: programa Lonza, DS-150
[608] 2. Preparar RNP (cas9+RNA) e ssODN separadamente (trazer o volume para um máximo de 10 µl), misturar antes do uso. Vi- de Tabela 10. (1) ssODN Avançado gRNA1 +CYP4V2 (2) gRNA2 +CYP4V2 For- ward ssODN (3) ssODN Reverso gRNA1 +CYP4V2 (4) gRNA2 +CYP4V2 Rever- se ssODN Tabela 10 Cada grupo de gRNA 30µM (µL) Cas9 20µM (µL) ssODN 30µM (µL) PBS (µL) reação Células iPS P1 4 1 4 1 Tampão do estojo/cada Volume (µL) /amostra 4 amostras (µL) grupo Solução 16,4 65,6 Suplemento 3,6 14,4
3. Coletar e contar as células: 5*105 células iPS
4. Suspender a célula com RNP+ssODN (10 µL) pipetando suavemen- te para cima e para baixo 3-5 vezes
5. Adicionar tampão do estojo Lonza 20 µL à suspensão celular, mini- mizar o tempo de incubação antes da nucleofecção.
6. Carregar a mistura (30 µL) no poço do estojo Lonza. Checar a im- pedância.
7. Eletroporar as células usando o parâmetro de ajuste (DS150).
8. Ressuspender gentilmente as células eletroporadas adicionando 70 µL de mTeSR (com inibidor Rock) diretamente ao poço do estojo.
9. Plaquear as células em meio de passagem em um poço de placa de 6 poços.
10. Observar viabilidade celular 24 horas após eletroporação e substi- tuir o meio com meio de cultura. Nota: nenhum marcador de seleção é usado para este protocolo. Célu- las que sobreviveram à nucleofecção são pegas para expansão de cé- lula única. Em adição ao programa Lonza DS-150, outros parâmetros tal como CB-150 podem ser também usados. Exemplo 22: Geração de Linhagem celular de Paciente Geneticamente Re-parada e Uso de RNP em Geração de Linhagem celular de Pacien- te Gene-ticamente Reparada e em Terapia Celular Ocular
[609] Cada um de construto de plasmídeo de expressão conten- do g1 ou g2 de CRISPR (Item No. 1 ou 2) e construto de RNP de CRISPR contendo sgRNA1 ou sgRNA2 (Item No. 4 ou 5, Synthego, Silicon Valley, CA, USA) e SpCas9 (Item No. 9, No. Cat.: A034a-a- 1000 da Feldan (Quebec, Canadá) ou da Synthego (por exemplo, nu- clease Cas9 2NLS, S. pyogenes), ao lado de um modelo de doador de CYP4V2 (Item No. 7 ou No. 8, ssODN, Ultramer DNA Oligonucleoti- des, Integrated DNA Technologies (IDT), Coralviile, Iowa, USA), é usado para transfectar iPSCs de paciente carregando a mutação c.802-8_810del17insGC. Avaliação de Correção de Gene através de Reparo direcionado à Ho- mologia (HDR):
[610] Após transfecção, as células pegas são coletadas para PCR seguido por sequenciamento de amplicon direcionado para avali- ar correção de gene na região de CYP4V2 contendo a mutação c.802- 8_810del17insGC. Sequenciamento profundo de células transfectadas mostra que as leituras continham correção precisa da mutação, com inserção da "TCATACAGGTCATCGCT" em 17 pb e deleção de “GC”, resultando em correção da mutação para a sequência do tipo selva- gem (SEQ ID NO: 47). Correção de mutação não é vista em quaisquer iPSCs controle não transfectadas. Os resultados também servem co- mo uma indicação de fre-quência de HDR dentre células transfecta- das. Obtenção de clones de iPS com nenhuma ou mínima edição fora do alvo
[611] Após avaliação de HDR, a transfecção é realizada nova- mente em iPSCs de paciente carregando a mutação c.802- 8_810del17insGC. Células transfectadas passam por clonagem e ex- pansão de célula única. Linhagens celulares clonais com HDR no alvo confirmado são então avaliadas quanto à edição fora do alvo através de sequenciamento. Para aplicação clínica, sequenciamento de ge- noma inteiro (cobertura de 60x) é usado para comparar as linhagens celulares editadas e não transfectadas do mesmo paciente. Uma li- nhagem celular iPS clonal editada sem nenhuma edição fora do alvo ou edição fora do alvo mínima sem nenhuma consequência adversa material no genoma é selecionada. Diferenciação de iPS geneticamente corrigida no tipo desejado de cé- lulas
[612] A linhagem celular clonal iPS selecionada é então diferen- ciada em células iPS-RPE (vide os Exemplos aqui). A linhagem celular clonal iPS selecionada pode ser diferenciada em outros tipos de célu- las que são desejadas para uso em terapia celular (por exemplo, célu- las iPS-RPE, iPS-PRCs, células iPS-CE, iPS-CECs ou outras células iPS-oculares). Bioensaio para confirmar que células iPS geneticamente reparadas ou derivadas de iPS não têm mais fenótipo
[613] As células iPS-RPE geneticamente corrigidas (ou geneti- camente reparadas) são testadas quanto à função bioquímica (vide os Exemplos aqui) e confirmadas que não têm mais fenótipo como visto em células iPS-RPE de paciente não tratado. Expressão de CYP4V2 é detectada em células iPS-RPE de paciente geneticamente reparadas.
[614] Diferente de um plasmídeo ou outros construtos de vetor (por exemplo, AAV, lentivírus) que resultam em expressão sustentada de componentes de CRISPR que ele codifica (por exemplo, RNA, a nuclease Cas e/ou o modelo de doador), um construto de RNP CRISPR é rápido em começar atividade e rápido em parar atividade. Componentes de um construto de RNP são degradados relativamente rapidamente nas células transfectadas. Desta maneira, o uso de cons- trutos de RNP diminui o risco de edição fora do alvo comparado com plasmídeos e outros construtos. Isso torna o construto de RNA particu- larmente adequado para transplante, bem como para tratamento in vivo (por exemplo, injeção dos construtos de RNP no olho de um indi- víduo para correção de gene in vivo). Em adição a tratamento de BCD, os construtos de RNP CRISPR e métodos providos aqui podem ser usados em tratamento de outras doenças, incluindo doenças associa- das com um gene mutado ou defeituoso mostrado na Tabela 4. Exemplo 23: Uso de Células Geneticamente Reparadas em Terapia Celular Ocular
[615] As células iPS-RPE, iPS-PRCs, iPS-CECs, células iPS-CE ou outras células iPS-oculares geneticamente reparadas podem ser transplantadas no olho do paciente como uma terapia celular ocular. Por exemplo, elas podem ser usadas como células de substituição au- tólogas para células de RPE, fotorreceptores ou outras células ocula- res mortas ou degeneradas em um paciente com BCD. As células ge- neticamente reparadas podem ser transplantadas ou diretamente (por exemplo, suspensão celular) ou em outras formas, incluindo, sem limi-
tação, como parte de uma camada, uma folha, uma matriz, uma base ou um tecido. A quantidade de células geneticamente reparadas usa- das em um transplante depende do tipo de célula direcionado para substituição, do tamanho da área que precisa de células de substitui- ção e o indivíduo sendo tratado (por exemplo, a idade, sexo, peso, es- tágio desenvolvimental da doença e condição do indivíduo a ser trata- do); a via de administração; a localização do transplante (por exemplo, retina vs. córnea); a forma do transplante (por exemplo, suspensão celular vs. como parte de uma camada, uma folha, uma matriz, uma base ou um tecido); e o regime requerido. A quantidade de células em um transplante único para o olho de um dado tipo de célula (por exemplo, células de RPE, fotorreceptores, CECs ou células CE) pode variar de a partir de cerca de 1.000 células a 10 milhões de células.
[616] Se necessário, as células podem ser fabricadas em uma instalação GMP para uso clínico. Instalações GMP para produtos de terapia celular estão comercialmente disponíveis de institutos de pes- quisa, organizações de fabricação contratadas (CMOs) e organizações de pesquisa contratadas (CROs), por exemplo, Cellular Therapy Inte- grated Services at Case Western Reserve University, Center for Cell and Gene Therapy at Baylor College of Medicine, CELLforCURE, New York Stem Cell Foundation and Lonza.
[617] Administração autóloga específica para paciente pode usar os mesmos métodos de administração que usados em terapia celular ocular alogênica (por exemplo, transplante de RPE derivado de célula- tronco embriônica (ES-RPE)) para doenças de degeneração retinal, incluindo aquelas afetadas por degeneração do RPE, tal como dege- neração macular relacionada à idade (AMD). Tais métodos de admi- nistração/cirúrgicos são conhecidos na técnica. Exemplo 24. Tratamento de Combinação de Terapia Genética e Tera- pia Ce-lular para Doenças Oculares
[618] As presentes descrições foram sobre composições e méto- dos para uso em terapia genética e terapia celular para BCD. Para do- enças oculares, terapia genética e terapia celular têm, cada uma, seus próprios prós e contras. Por um lado, terapia genética funciona melhor em estágio de doença inicial a médio quando o paciente ainda tem muitas células retinais (ou oculares) restantes para receberem e serem resgatadas pelo tratamento de terapia genética. No entanto, terapia genética não funciona bem ou pode não funcionar de modo algum pa- ra pacientes em estágio avançado que não têm as células oculares relevantes restando (por exemplo, RPE ou PRC). Terapia celular, por outro lado, provê células de substituição para substituir as células mor- tas ou degeneradas no olho do paciente e tem suas vantagens com relação à terapia genética particularmente para pacientes em estágio avançado e doenças dominantemente herdadas. No entanto, terapia celular não pode resgatar as células “originais” remanescentes no olho do paciente, cuja sobrevivência não apenas preserva a visão restante do paciente, mas também beneficia da integração das células de subs- tituição.
[619] Para superar as limitações de terapia genética e terapia ce- lular e trazer benefícios máximos para os pacientes, um tratamento de combinação de terapia genética e terapia celular foi desenvolvido para BCD, que pode ser também usado para outras doenças oculares. Tai método compreende: (a) aplicação de terapia genética (por exemplo, terapia genéti- ca AAV.CYP4V2 ou terapia de correção de gene CRISPR) no olho do paciente in vivo; e (b) geração in vitro de células iPS-oculares autólogas específi- cas de paciente geneticamente reparadas (por exemplo, célu-las iPS- RPE, iPS-PRCs, células iPS-CE, iPS-CECs ou outros tipos de células oculares que são afetadas pela doença) e transplante dessas células para o olho do paciente; em que (a) e (b) podem ser aplicados sequencialmente (primeiro (a), então (b) ou primeiro (b), então (a)) ou simultaneamente (por exemplo, injeção de vetores de terapia genética e células em uma administra- ção). Cada um de (a) e (b) pode ser aplicado uma ou mais vezes ao mesmo olho. Dependendo da doença, estágio da doença e situação individual do paciente, (a) e (b) podem se direcionar aos mesmos tipos ou tipos dife-rentes de células oculares. Por exemplo, no caso de BCD, vetores de terapia genética dirigidos por um promotor ubiquitina podem resultar em expressão de CYP4V2 em células de RPE, fotorre- ceptores e outras células retinais, enquanto terapia celular pode focar na provisão de células de RPE e/ou fotorreceptores regenerados. Nes- te caso, terapia celular pode se beneficiar de provisão de células no- vas (por exemplo, células de RPE ou fotorreceptoras), enquanto tera- pia genética pode melhorar o efeito de terapia celular ao resgatar as células de RPE ou fotorreceptoras remanescentes e/ou melhorar as condições de células coroides cuja saúde afeta as condições de célu- las oculares. A combinação do efeito de “resgate” e “substituição” de terapia genética e terapia celular, respectivamente, torna o tratamento de combinação uma melhoria ou da terapia genética ou terapia celular. Este método de tratamento de combinação pode ser aplicado a doen- ças oculares e outras causadas por uma ou mais mutações genéticas, incluindo, sem limitação, doenças associadas com um gene mutado ou defeituoso mostrado na Tabela 4.
[620] Deve ser compreendido que, embora os métodos e compo- sições de importância tenham sido descritos aqui em conjunto com vários aspectos diferentes, a descrição acima dos vários aspectos pre- tende ilustrar e não limitar o escopo dos métodos e composições de importância. Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do escopo das reivindicações que seguem.
[621] São revelados métodos e composições que podem ser usados para, podem ser usados em conjunto com, podem ser usados em preparação para ou são produtos dos métodos e composições re- velados. Esses e outros materiais são revelados aqui, e é compreen- dido que combinações, subconjuntos, interações, grupos, etc., desses métodos e composições são revelados. Isto é, embora referência es- pecífica a cada uma de várias combinações e permutas individuais e coletivas dessas composições e métodos possa não ser explicitamen- te revelada, cada uma é especificamente compreendida e descrita aqui. Por exemplo, se uma composição particular de importância ou um método particular é revelado e discutido e várias composições ou métodos são discutidos, cada uma e toda combinação e permuta das composições e dos métodos são especificamente compreendidas a menos que especificamente indicado o contrário. Da mesma maneira, qualquer subconjunto ou combinação desses é também especifica- mente compreendido e revelado.
SEQUÊNCIAS
LISTA DE SEQUÊNCIAS * Todos os números de referência usados nas sequências são nú- meros de referência NCBI a menos que de outro modo mencionado.
Parte I: Sequências de Terapia Genética A. Sequências de cDNA e proteína CYP4V2 SEQ ID NO:1 – uma sequência de cDNA (1578 pb) codificando a proteína CYP4V2 humana (SEQ ID NO: 4), aqui referida como CYP4V2st. SEQ ID NO:2 – uma sequência de cDNA com códon otimizado (1578 pb) codificando a proteína CYP4V2 humana (SEQ ID NO: 4), refe- rida aqui como CYP4V2op. SEQ ID NO:3 – uma sequência de cDNA (1578 pb) codificando uma proteína CYP4V2 funcional (SEQ ID NO: 5), aqui referida como CYP4V2fv. SEQ ID NO:4 – sequência de aminoácido (525 aa) da proteína CYP4V2 humana(NP_997235.3) SEQ ID NO:5 – sequência de aminoácido (525 aa) de uma variante funcional da proteína CYP4V2 humana SEQ ID NO:6 – fragmento de proteína CYP4V2 humana sem domínio de transmembrana (490 aa) SEQ ID NO:7 – sequência de aminoácido de CYP46A1 humana
SEQ ID NO:8 – sequência de aminoácido de CYP4A11 humana SEQ ID NO:9 – sequência de aminoácido de CYP4A22 humana SEQ ID NO:10 – sequência de aminoácido de CYP4B1 humana SEQ ID NO:11 – sequência de aminoácido de CYP4F2 humana SEQ ID NO:12 – sequência de aminoácido de CYP4F3 humana SEQ ID NO:13 – sequência de aminoácido de CYP4F8 humana SEQ ID NO:14 – sequência de aminoácido de CYP4F11 humana SEQ ID NO:15 – sequência de aminoácido de CYP4F12 humana SEQ ID NO:16 – sequência de aminoácido de CYP4F22 humana SEQ ID NO:17 – sequência de aminoácido de CYP4X1 humana SEQ ID NO:18 – sequência de aminoácido de CYP4Z1 humana SEQ ID NO:19 – sequência de aminoácido de CYP4V2 de chimpanzé SEQ ID NO:20 – sequência de aminoácido de CYP4V2 Macaco Rhesus SEQ ID NO:21 – sequência de aminoácido de CYP4V2 de cachorro SEQ ID NO:22 – sequência de aminoácido de CYP4V2 de gado SEQ ID NO:23 – sequência de aminoácido de CYP4V2 de camundongo doméstico SEQ ID NO:24 – sequência de aminoácido de CYP4V2 de rate Nor- way SEQ ID NO:25 – sequência de aminoácido de CYP4V2 de galinha SEQ ID NO:26 – sequência de aminoácido de CYP4V2 de sapo-com- garras tropical SEQ ID NO:27 – sequência de aminoácido de CYP4V2 de cavalo SEQ ID NO:28 – sequência de aminoácido de CYP4V2 de coelho SEQ ID NO:29 – sequência de aminoácido de CYP4V2 de mosca da fruta SEQ ID NO:30 – sequência de elemento de assinatura de P450 SEQ ID NO:31 – sequência de elemento de assinatura de P450 SEQ
B.
Sequências reguladoras exemplares e sequências de ITR
SEQ ID NO:32 – sequência de promotor CAG SEQ ID NO:33 – sequência de potenciador WPRE SEQ ID NO:34 – sequência de poliA bGH SEQ ID NO:35 – sequência de promotor EFS SEQ ID NO:36 – sequência de poliA pequeno (SPA) SEQ ID NO:37 – sequência Kozak SEQ ID NO:38 – sequência Kozak SEQ ID NO:39 – sequência de PoliA tardio SV40 SEQ ID NO:40 – sequência de promotor CMV SEQ ID NO:41 – sequência de promotor EF-1 alfa SEQ ID NO:42 – sequência de ITR Esquerda 5’ AAV2 SEQ ID NO:43 – sequência de ITR Direita 3’ AAV2 SEQ ID NO:44 – sequência de ITR 5’ AAV2 mutante usada em scAAV SEQ ID NO:45 – sequência de ITR 3’ AAV2 usada em scAAV
Parte II.
Sequências de Terapia Celular SEQ ID NO:46 – região de gene CYP4V2 humano contendo mutação c.802-8_810del17insGC SEQ ID NO:47 – região de gene CYP4V2 humano do tipo selvagem sem a mutação c.802-8_810del17insGC SEQ ID NO:48 – gRNA 1 SEQ ID NO:49 – gRNA 2 SEQ ID NO:50 – gRNA 3 SEQ ID NO:51 – gRNA 4
SEQ ID NO:52 – gRNA 5 SEQ ID NO:53 – sequência exemplar de crRNA SEQ ID NO:54 – sequência exemplar de tracrRNA SEQ ID NO:55 – sequência exemplar desgRNA SEQ ID NO:56 – sequência do modelo doador 1 SEQ ID NO:57 – sequência do modelo doador 2 SEQ ID NO:58 – sequência de aminoácido de SpCas9 SEQ ID NO:59 – nucleotídeo adicional inserido imediata- mente após a sequência de promotor U6 e antes da sequência do elemento protoespa- çador em um construto de plasmídeo e em um sgRNA IVT Parte III: Sequências de Cassete de Expressão de CYP4V2 (in- clusive de ITRs de AAV e sequências de junção/ligantes).
SEQ ID NO: 60 – Sequência de cassete de expressão de CYP4V2 em AAV2.CYP4V2op, AAV2tri(Y-F).CYP4V2op e AAV5.CYP4V2op. SEQ ID NO: 61 – Sequência de cassete de expressão de CYP4V2 em AAV5.CYP4V2st. AAV5.CYP4V2st tem as mesmas sequências de pro- motor (CAG), potenciador (WPRE) e poliA (bGH-polyA) que AAV2.CYP4V2op, AAV2tri(Y-F).CYP4V2op e AAV5.CYP4V2op (SEQ ID NO: 60) mas cDNA de CYP4V2 diferente em sequências de jun- ção/ligantes. SEQ ID NO: 62 – Sequência de cassete de expressao de CYP4V2 em AAV8.CYP4V2fv. AAV8.CYP4V2fv tem as mesmas sequências de pro- motor (CAG), potenciador (WORE) e poliA (bGH-poliA) e jun- ção/ligante que AAV5.CYP4V2st (SEQ ID NO: 61) e diferem apenas em sequência de cDNA de CYP4V2. SEQ ID NO: 63 – Sequência de cassete de expressão de CYP4V2 em AAV5.CYP4V2op (novo). AAV5.CYP4V2op (novo) tem as mesmas se- quências de promotor (CAG), potenciador (WPRE) e poliA (bGH- poliA) e as mesmas de junção/ligante que AAV5.CYP4V2st (SEQ ID NO: 61) e AAV8.CYP4V2fv (SEQ ID NO: 62) mas sequências de cDNA de CYP4V2 diferentes. SEQ ID NO: 64 – Sequência de cassete de expressão de CYP4V2 em scAAV1.CYP4V2op, scAAV5.CYP4V2op e scAAV9.CYP4V2op.
SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1 (CYP4V2st cDNA, 1578 pb) ATGGCGGGGCTCTGGCTGGGGCTCGTGTGGCAGAAGCTGCTGCTGTGGGGCGCGGCGAGTG- CCCTTTCCCTGGCCGGCGCCAGTCTGGTCCTGAGCCTGCTGCAGAGGGTGGCGAGCTACG- CGCGGAAATGGCAGCAGATGCGGCCCATCCCCACGGTGGCCCGCGCCTACCCACTGGTGGG- CCACGCGCTGCTGATGAAGCCGGACGGGCGAGAATTTTTTCAGCAGATCATTGAGTACACA- GAGGAATACCGCCACATGCCGCTGCTGAAGCTCTGGGTCGGGCCAGTGCCCATGGTGG- CCCTTTATAATGCAGAAAATGTGGAGGTAATTTTAACTAGTTCAAAGCAAATTGACAAA- TCCTCTATGTACAAGTTTTTAGAACCATGGCTTGGCCTAGGACTTCTTACAAGTACTGGA- AACAAATGGCGCTCCAGGAGAAAGATGTTAACACCCACTTTCCATTTTACCATTCTGGAA- GATTTCTTAGATATCATGAATGAACAAGCAAATATATTGGTTAAGAAACTTGAAAAACACA- TTAACCAAGAAGCATTTAACTGCTTTTTTTACATCACTCTTTGTGCCTTAGATATCATCTG- TGAAACAGCTATGGGGAAGAATATTGGTGCTCAAAGTAATGATGATTCCGAGTATGTCCG-
TGCAGTTTATAGAATGAGTGAGATGATATTTCGAAGAATAAAGATGCCCTGGCTTTGG- CTTGATCTCTGGTACCTTATGTTTAAAGAAGGATGGGAACACAAAAAGAGCCTTCAGATCC- TACATACTTTTACCAACAGTGTCATCGCTGAACGGGCCAATGAAATGAACGCCAATGAAGA- CTGTAGAGGTGATGGCAGGGGCTCTGCCCCCTCCAAAAATAAACGCAGGGCCTTTCTTGAC- TTGCTTTTAAGTGTGACTGATGACGAAGGGAACAGGCTAAGTCATGAAGATATT- CGAGAAGAAGTTGACACCTTCATGTTTGAGGGGCACGATACAACTGCAGCTGCAATAAAC- TGGTCCTTATACCTGTTGGGTTCTAACCCAGAAGTCCAGAAAAAAGTGGATCATGAATTG- GATGACGTGTTTGGGAAGTCTGACCGTCCCGCTACAGTAGAAGACCTGAAGAAACTTCGG- TATCTGGAATGTGTTATTAAGGAGACCCTTCGCCTTTTTCCTTCTGTTCCTTTATTTG- CCCGTAGTGTTAGTGAAGATTGTGAAGTGGCAGGTTACAGAGTTCTAAAAGGCACTGAAG- CCGTCATCATTCCCTATGCATTGCACAGAGATCCGAGATACTTCCCCAACCCCGAGGAGTT- CCAGCCTGAGCGGTTCTTCCCCGAGAATGCACAAGGGCGCCATCCATATGCCTACGTG- CCCTTCTCTGCTGGCCCCAGGAACTGTATAGGTCAAAAGTTTGCTGTGATGGAAGAAAAGA- CCATTCTTTCGTGCATCCTGAGGCACTTTTGGATAGAATCCAACCAGAAAAGAGAAGAG- CTTGGTCTAGAAGGACAGTTGATTCTTCGTCCAAGTAATGGCATCTGGATCAAG-
TTGAAGAGGAGAAATGCAGATGAACGCTAA SEQ ID NO: 2 (CYP4V2op cDNA, 1578 pb) ATGGCTGGACTGTGGCTGGGACTGGTGTGGCAGAAACTGCTGCTGTGGGGGGCCGCTTCCG- CACTGTCACTGGCTGGGGCTTCACTGGTGCTGAGCCTGCTGCAGAGGGTGGCCTCCTACG- CCAGAAAGTGGCAGCAGATGAGGCCCATCCCTACCGTGGCCAGAGCCTATCCACTGGTGG- GACACGCACTGCTGATGAAGCCTGACGGCAGAGAGTTCTTTCAGCAGATCATCGAGTACA- CAGAGGAGTATAGGCACATGCCACTGCTGAAGCTGTGGGTGGGACCCGTGCCTATGGTGG- CCCTGTACAACGCCGAGAATGTGGAAGTGATCCTGACCAGCAGCAAGCAGATCGATAAGTC- TAGCATGTATAAGTTCCTGGAGCCTTGGCTGGGCCTGGGCCTGCTGACCTCTACAGGCAA- CAAGTGGAGGAGCCGGAGAAAGATGCTGACCCCAACATTCCACTTTACAATCCTGGAGGAC- TTCCTGGACATCATGAACGAGCAGGCCAATATCCTGGTGAAGAAGCTGGAGAAGCACAT- CAACCAGGAGGCCTTTAATTGCTTCTTTTACATCACCCTGTGCGCCCTGGACATCATCTG- TGAGACAGCTATGGGCAAGAACATCGGCGCCCAGTCTAATGACGATAGCGAGTACGTG- CGGGCCGTGTATAGAATGAGCGAGATGATCTTTAGGCGCATCAAGATGCCCTGGCTGTGG- CTGGATCTGTGGTATCTGATGTTCAAGGAGGGCTGGGAGCACAAGAAGTCCCTGCAGA- TCCTGCACACCTTTACAAACTCTGTGATCGCCGAGAGAGCCAATGAGATGAACGCCAA- TGAGGACTGTAGGGGCGATGGAAGGGGCAGCGCCCCTTCCAAGAACAAGCGGAGAGCCTT- CCTGGACCTGCTGCTGAGCGTGACCGACGATGAGGGCAATCGCCTGTCCCACGAGGACA- TCCGGGAGGAGGTGGATACATTCATGTTTGAGGGACACGACACCACAGCCGCCGCCAT- CAACTGGTCCCTGTACCTGCTGGGCTCTAATCCAGAGGTGCAGAAGAAGGTGGATCACGAG- CTGGACGACGTGTTCGGCAAGTCCGACAGGCCAGCAACCGTGGAGGATCTGAAGAAGCTGA- GATACCTGGAGTGCGTGATCAAGGAGACACTGCGCCTGTTCCCCTCTGTGCCTCTGTTTG- CCCGGTCCGTGTCTGAGGACTGTGAGGTGGCCGGCTATCGCGTGCTGAAGGGCACCGAGG- CCGTGATCATCCCTTACGCCCTGCACCGGGACCCCAGGTATTTCCCTAACCCAGAGGAG- TTTCAGCCAGAGAGATTCTTTCCCGAGAATGCCCAGGGCAGGCACCCTTACGCCTATGTG- CCATTCTCCGCCGGACCAAGGAACTGCATCGGACAGAAGTTTGCCGTGATGGAGGA- GAAAACCATCCTGTCTTGTATCCTGAGACACTTCTGGATCGAGAGCAATCAGAAGAGGGAG- GAGCTGGGCCTGGAGGGACAGCTGATCCTGCGGCCAAGCAACGGCATCTGGATCAAAC-
TGAAAAGAAGGAACGCTGACGAGAGGTAA SEQ ID NO: 3 (CYP4V2fv cDNA, 1578 pb) ATGGCGGGGCTCTGGCTGGGGCTCGTGTGGCAGAAGCTGCTGCTGTGGGGCGCGGCGAGTG- CCCTTTCCCTGGCCGGCGCCAGTCTGGTCCTGAGCCTGCTGCAGAGGGTGGCGAGCTACG- CGCGGAAATGGCAGCAGATGCGGCCCATCCCCACGGTGGCCCGCGCCTACCCACTGGTGGG- CCACGCGCTGCTGATGAAGCCGGACGGGCGAGAATTTTTTCAGCAGATCATTGAGTACACA- GAGGAATACCGCCACATGCCGCTGCTGAAGCTCTGGGTCGGGCCAGTGCCCATGGTGG- CCCTTTATAATGCAGAAAATGTGGAGGTAATTTTAACTAGTTCAAAGCAAATTGACAAA- TCCTCTATGTACAAGTTTTTAGAACCATGGCTTGGCCTAGGACTTCTTACAAGTACTGGA- AACAAATGGCGCTCCAGGAGAAAGATGTTAACACCCACTTTCCATTTTACCATTCTGGAA-
GATTTCTTAGATATCATGAATGAACAAGCAAATATATTGGTTAAGAAACTTGAAAAACACA- TTAACCAAGAAGCATTTAACTGCTTTTTTTACATCACTCTTTGTGCCTTAGATATCATCTG- TGAAACAGCTATGGGGAAGAATATTGGTGCTCAAAGTAATGATGATTCCGAGTATGTCCG- TGCAGTTTATAGAATGAGTGAGATGATATTTCGAAGAATAAAGATGCCCTGGCTTTGG- CTTGATCTCTGGTACCTTATGTTTAAAGAAGGATGGGAACACAAAAAGAGCCTTAAGATCC- TACATACTTTTACCAACAGTGTCATCGCGGAACGGGCCAATGAAATGAACGCCAATGAAGA- CTGTAGAGGTGATGGCAGGGGCTCTGCCCCCTCCAAAAATAAACGCAGGGCCTTTCTTGAC- TTGCTTTTAAGTGTGACTGATGACGAAGGGAACAGGCTAAGTCATGAAGATATT- CGAGAAGAAGTTGACACCTTCATGTTTGAGGGGCACGATACAACTGCAGCTGCAATAAAC- TGGTCCTTATACCTGTTGGGTTCTAACCCAGAAGTCCAGAAAAAAGTGGATCATGAATTG- GATGACGTGTTTGGGAAGTCTGACCGTCCCGCTACAGTAGAAGACCTGAAGAAACTTCGG- TATCTGGAATGTGTTATTAAGGAGACCCTTCGCCTTTTTCCTTCTGTTCCTTTATTTG- CCCGTAGTGTTAGTGAAGATTGTGAAGTGGCAGGTTACAGAGTTCTAAAAGGCACTGAAG- CCGTCATCATTCCCTATGCATTGCACAGAGATCCGAGATACTTCCCCAACCCCGAGGAGTT- CCAGCCTGAGCGGTTCTTCCCCGAGAATGCACAAGGGCGCCATCCATATGCCTACGTG- CCCTTCTCTGCTGGCCCCAGGAACTGTATAGGTCAAAAGTTTGCTGTGATGGAAGAAAAGA- CCATTCTTTCGTGCATCCTGAGGCACTTTTGGATAGAATCCAACCAGAAAAGAGAAGAG- CTTGGTCTAGAAGGACAGTTGATTCTTCGTCCAAGTAATGGCATCTGGATCAAG-
TTGAAGAGGAGAAATGCAGATGAACGCTAA SEQ ID NO: 4 (PROTEÍNA CYP4V2 humana, NP_997235.3, 525 aa) MAGLWLGLVWQKLLLWGAASALSLAGASLVLSLLQRVASYARKWQQMRPIPTVA- RAYPLVGHALLMKPDGREFFQQIIEYTEEYRHMPLLKLWVGPVPMVALYNAENVE- VILTSSKQIDKSSMYKFLEPWLGLGLLTSTGNKWRSRRKMLTPTFHFTILEDFLDIMNEQA- NILVKKLEKHINQEAFNCFFYITLCALDIICETAMGKNIGAQSNDDSEYVRAVYRMSEMI- FRRIKMPWLWLDLWYLMFKEGWEHKKSLQILHTFTNSVIAERANEMNANEDCRGDGRGSAP- SKNKRRAFLDLLLSVTDDEGNRLSHEDIREEVDTFMFEGHDTTAAAINWSLYLLGSN- PEVQKKVDHELDDVFGKSDRPATVEDLKKLRYLECVIKETLRLFPSVPLFARSVSEDCE- VAGYRVLKGTEAVIIPYALHRDPRYFPNPEEFQPERFFPENAQGRHPYAYVPFSAGPRN-
CIGQKFAVMEEKTILSCILRHFWIESNQKREELGLEGQLILRPSNGIWIKLKRRNADER SEQ ID NO: 5 (variante funcional de proteína CYP4V2 humana; 525 aa) MAGLWLGLVWQKLLLWGAASALSLAGASLVLSLLQRVASYARKWQQMRPIPTVA- RAYPLVGHALLMKPDGREFFQQIIEYTEEYRHMPLLKLWVGPVPMVALYNAENVE- VILTSSKQIDKSSMYKFLEPWLGLGLLTSTGNKWRSRRKMLTPTFHFTILEDFLDIMNEQA- NILVKKLEKHINQEAFNCFFYITLCALDIICETAMGKNIGAQSNDDSEYVRAVYRMSEMI- FRRIKMPWLWLDLWYLMFKEGWEHKKSLKILHTFTNSVIAERANEMNANEDCRGDGRGSAP- SKNKRRAFLDLLLSVTDDEGNRLSHEDIREEVDTFMFEGHDTTAAAINWSLYLLGSN- PEVQKKVDHELDDVFGKSDRPATVEDLKKLRYLECVIKETLRLFPSVPLFARSVSEDCE- VAGYRVLKGTEAVIIPYALHRDPRYFPNPEEFQPERFFPENAQGRHPYAYVPFSAGPRN-
CIGQKFAVMEEKTILSCILRHFWIESNQKREELGLEGQLILRPSNGIWIKLKRRNADER SEQ ID NO: 6 (fragmento funcional de CYP4V2 (sem domínio de transmembrana; 490 aa) RVASYARKWQQMRPIPTVARAYPLVGHALLMKPDGREFFQQIIEYTEEYRHMPLLKLWVG- PVPMVALYNAENVEVILTSSKQIDKSSMYKFLEPWLGLGLLTSTGNKWRSRRKMLTPT- FHFTILEDFLDIMNEQANILVKKLEKHINQEAFNCFFYITLCALDIICETAMGKNI- GAQSNDDSEYVRAVYRMSEMIFRRIKMPWLWLDLWYLMFKEGWEHKKSLQILHTFTNSVI- AERANEMNANEDCRGDGRGSAPSKNKRRAFLDLLLSVTDDEGNRLSHEDIREEVDTFM- FEGHDTTAAAINWSLYLLGSNPEVQKKVDHELDDVFGKSDRPATVEDLKKLRYLECVI- KETLRLFPSVPLFARSVSEDCEVAGYRVLKGTEAVIIPYALHRDPRYFPNPEEFQPER- FFPENAQGRHPYAYVPFSAGPRNCIGQKFAVMEEKTILSCILRHFWIESNQKREELGLE-
GQLILRPSNGIWIKLKRRNADER
SEQ ID NO: 7 (CYP46A1, NP_006659, 500 aa) MSPGLLLLGSAVLLAFGLCCTFVHRARSRYEHIPGPPRPSFLLGHLPCFWKKDE- VGGRVLQDVFLDWAKKYGPVVRVNVFHKTSVIVTSPESVKKFLMSTKYNKDSKMYRAL- QTVFGERLFGQGLVSECNYERWHKQRRVIDLAFSRSSLVSLMETFNEKAEQLVEILEAKAD- GQTPVSMQDMLTYTAMDILAKAAFGMETSMLLGAQKPLSQAVKLMLEGITASRNTLAKFL- PGKRKQLREVRESIRFLRQVGRDWVQRRREALKRGEEVPADILTQILKAEEGAQDDE- GLLDNFVTFFIAGHETSANHLAFTVMELSRQPEIVARLQAEVDEVIGSKRYLDFEDLGR- LQYLSQVLKESLRLYPPAWGTFRLLEEETLIDGVRVPGNTPLLFSTYVMGRMDTYFEDPLT- FNPDRFGPGAPKPRFTYFPFSLGHRSCIGQQFAQMEVKVVMAKLLQRLEFRLVPGQRF-
GLQEQATLKPLDPVLCTLRPRGWQPAPPPPPC SEQ ID NO: 8 (CYP4A11, NP_000769, 519 aa) msvsvlspsr llgdvsgilq aasllillll likavqlylh rqwllkalqq fpcppshwlf ghiqelqqdq elqriqkwve tfpsacphwl wggkvrvqly dpdymkvilg rsdpkshgsy rflapwigyg llllngqtwf qhrrmltpaf hydilk- pyvg lmadsvrvml dkweellgqd splevfqhvs lmtldtimkc afshqgsiqv drnsqsyiqa isdlnnlvfs rvrnafhqnd tiysltsagr wthracqlah qhtd- qviqlr kaqlqkegel ekikrkrhld fldilllakm engsilsdkd lraevdtfmf eghdttasgi swilyalath pkhqercree ihsllgdgas itwnhldqmp yttmci- keal rlyppvpgig relstpvtfp dgrslpkgim vllsiyglhh npkvwpnpev fdpfrfapgs aqhshaflpf sggsrncigk qfamnelkva taltllrfel lpd- ptripip iarlvlkskn gihlrlrrlp npcedkdql SEQ ID NO: 9 (CYP4A22, NP_001010969, 519 aa) msvsvlspsr rlggvsgilq vtsllillll likaaqlylh rqwllkalqq fpcppshwlf ghiqefqhdq elqriqervk tfpsacpywi wggkvrvqly dpdymkvilg rsdpkshgsy kflaprigyg llllngqtwf qhrrmltpaf hndilk- pyvg lmadsvrvml dkweellgqd splevfqhvs lmtldtimks afshqgsiqv drnsqsyiqa isdlnslvfc cmrnafhend tiysltsagr wthracqlah qhtd- qviqlr kaqlqkegel ekikrkrhld fldilllakm engsilsdkd lraevdtfmf eghdttasgi swilyalath pkhqercree ihgllgdgas itwnhldqmp yttmci- keal rlyppvpgig relstpvtfp dgrslpkgim vllsiyglhh npkvwpnlev fdpsrfapgs aqhshaflpf sggsrncigk qfamnqlkva raltllrfel lpd- ptripip marlvlkskn gihlrlrrlp npcedkdql SEQ ID NO: 10 (CYP4B1, NP_000770, 511 aa) mvpsflslsf sslglwasgl ilvlgflkli hlllrrqtla kamdkfpgpp thwl- fghale iqetgsldkv vswahqfpya hplwfgqfig flniyepdya kavysrgdpk apdvydfflq wigrgllvle gpkwlqhrkl ltpgfhydvl kpyvavftes trim- ldkwee karegksfdi fcdvghmaln tlmkctfgrg dtglghrdss yylavsdltl lmqqrlvsfq yhndfiywlt phgrrflrac qvahdhtdqv irerkaalqd ekvrk- kiqnr rhldfldill gardeddikl sdadlraevd tfmfeghdtt tsgiswflyc malypehqhr creevreilg dqdffqwddl gkmtyltmci kesfrlyppv pqvyrqlskp vtfvdgrslp agslismhiy alhrnsavwp dpevfdslrf stenaskrhp fafmpfsagp rncigqqfam semkvvtamc llrfefsldp srl- pikmpql vlrskngfhl hlkplgpgsg k SEQ ID NO: 11 (CYP4F2, NP_001073, 520 aa) msqlslswlg lwpvaaspwl llllvgaswl lahvlawtya fydncrrlrc fpqp- prrnwf wghqgmvnpt eegmrvltql vatypqgfkv wmgpisplls lchpdiirsv inasaaiapk dkffysflep wlgdglllsa gdkwsrhrrm ltpafhfnil kpymkifnes vnimhakwql lasegsacld mfehislmtl dslqkcvfsf dshcqekpse yiaailelsa lvskrhheil lhidflyylt pdgqrfrrac rlvhdftdav iqerrrtlps qgvddflqak aksktldfid vlllskdedg kklsdedira eadtfmfegh dttasglswv lyhlakhpey qercrqevqe llkdrepkei ewddlahlpf ltmcmkeslr lhppvpvisr hvtqdivlpd grvip- kgiic lisvfgthhn pavwpdpevy dpfrfdpeni kersplafip fsagprncig qtfamaemkv vlaltllrfr vlpdhteprr kpelvlraeg glwlrvepls
SEQ ID NO: 12 (CYP4F3, NP_000887, 520 aa) mpqlslsslg lwpmaaspwl llllvgaswl larilawtyt fydnccrlrc fpqppkrnwf lghlglihss eegllytqsl actfgdmccw wvgpwhaivr ifhptyikpv lfapaaivpk dkvfysflkp wlgdglllsa gekwsrhrrm ltpafhfnil kpymkifnes vnimhakwql lasegsarld mfehislmtl dslqkcvfsf dshcqekpse yiaailelsa lvtkrhqqil lyidflyylt pdgqrfrrac rlvhdftdav iqerrrtlps qgvddflqak aksktldfid vlllskdedg kklsdedira eadtfmfegh dttasglswv lyhlakhpey qercrqevqe llkdrepkei ewddlaqlpf ltmcikeslr lhppvpavsr cctqdi- vlpd grvipkgiic lisvfgthhn pavwpdpevy dpfrfdpkni kersplafip fsagprncig qafamaemkv vlgltllrfr vlpdhteprr kpelvlraeg glwl- rvepls
SEQ ID NO: 13 (CYP4F8, NP_009184, 520 aa) msllslswlg lrpvaaspwl lllvvgaswl larilawtya fyhngrrlrc fpqprkqnwf lghlglvtpt eeglrvltql vatypqgfvr wlgpitpiin lchpdivrsv intsdaitdk divfyktlkp wlgdglllsv gdkwrhhrrl ltpafhfnil kpyikifsks animhakwqr lamegstcld vfehislmtl dslqkcifsf dsncqekpse yitaimelsa lvvkrnnqff rykdflyflt pcgrrfhrac rlvhdftdav iqerrrtlts qgvddflqak aksktldfid vlllsedkng kelsdedira eadtfmfggh dttasglswv lynlarhpey qercrqevqe llkdrepkei ewddlaqlpf ltmclkeslr lhppiptfar gctqdvvlpd srvipkgnvc ninifaihhn psvwpdpevy dpfrfdpena qkrspmafip fsagprncig qkfamaemkv vlaltllrfr ilpdhreprr tpeivlraed glwlrveplg
SEQ ID NO: 14 (CYP4F11, NP_067010, 524 aa) mpqlslswlg lgpvaaspwl llllvggswl larvlawtyt fydncrrlqc fpqppkqnwf wghqglvtpt eegmktltql vttypqgfkl wlgptfplli lchpdiirpi tsasaavapk dmifygflkp wlgdglllsg gdkwsrhrrm ltpafhfnil kpymkifnks vnimhdkwqr lasegsarld mfehislmtl dslqkcvfsf esncqekpse yiaailelsa fvekrnqqil lhtdflyylt pdgqrfrrac hlvhdftdav iqerrctlpt qgiddflknk aksktldfid vlllskdedg kelsdedira eadtfmfegh dttasglswv lyhlakhpey qeqcrqevqe llkdrepiei ewddlaqlpf ltmcikeslr lhppvpvisr cctqdfvlpd grvipkgivc liniigihyn ptvwpdpevy dpfrfdqeni kersplafip fsagprncig qafamaemkv vlaltllhfr ilpthteprr kpelil- raeg glwlrveplg ansq
SEQ ID NO: 15 (CYP4F12, NP_076433, 524 aa) msllslpwlg lrpvatspwl llllvvgswl larilawtya fynncrrlqc fpqppkrnwf wghlglitpt eeglknstqm satysqgftv wlgpiipfiv lchpd- tirsi tnasaaiapk dnlfirflkp wlgegillsg gdkwsrhrrm ltpafhfnil ksyitifnks animldkwqh lasegssrld mfehislmtl dslqkcifsf dshcqerpse yiatilelsa lvekrsqhil qhmdflyyls hdgrrfhrac rlvhdftdav irerrrtlpt qgiddffkdk aksktldfid vlllskdedg kalsdedira eadtfmfggh dttasglswv lynlarhpey qercrqevqe llkdrd- pkei ewddlaqlpf ltmcvkeslr lhppapfisr cctqdivlpd grvipkgitc lidiigvhhn ptvwpdpevy dpfrfdpens kgrsplafip fsagprncig qafamaemkv vlalmllhfr flpdhteprr klelimraeg glwlrvepln vslq
SEQ ID NO: 16 (CYP4F22, NP_775754, 531 aa) mlpitdrllh llglektafr iyavstlllf llfflfrlll rflrlcrsfy it- crrlrcfp qpprrnwllg hlgmylpnea glqdekkvld nmhhvllvwm gpvlpllvlv hpdyikpllg asaaiapkdd lfygflkpwl gdglllskgd kws- rhrrllt pafhfdilkp ymkifnqsad imhakwrhla egsavsldmf ehislmtlds lqkcvfsyns ncqekmsdyi saiielsals vrrqyrlhhy ldfiyyrsad grrfr- qacdm vhhftteviq errralrqqg aeawlkakqg ktldfidvll lardedgkel sdediraead tfmfeghdtt ssgiswmlfn lakypeyqek creeiqevmk greleelewd dltqlpfttm cikeslrqyp pvtlvsrqct ediklpdgri ip- kgiiclvs iygthhnptv wpdskvynpy rfdpdnpqqr splayvpfsa gprn- cigqsf amaelrvvva ltllrfrlsv drtrkvrrkp elilrtengl wlkveplppr a
SEQ ID NO: 17 (CYP4X1, NP_828847, 509 aa) mefswletrw arpfylafvf clalgllqai klylrrqrll rdlrpfpapp thwflghqkf iqddnmekle eiiekypraf pfwigpfqaf fciydpdyak tllsrtdpks qylqkfsppl lgkglaaldg pkwfqhrrll tpgfhfnilk ayievmahsv kmmldkweki cstqdtsvev yehinsmsld iimkcafske tncqtnsthd pyakaifels kiifhrlysl lyhsdiifkl spqgyrfqkl srvlnqytdt iiqerkkslq agvkqdntpk rkyqdfldiv lsakdesgss fsdidvhsev stfllaghdt laasiswily clalnpehqe rcreevrgil gdgssitwdq lgemsyttmc iketcrlipa vpsisrdlsk pltfpdgctl pagitvvlsi wglhhnpavw knpkvfdplr fsqensdqrh pyaylpfsag srn- cigqefa mielkvtial illhfrvtpd ptrpltfpnh filkpkngmy lhlkklsec
SEQ ID NO: 18 (CYP4Z1, NP_835235, 505 aa) mepswlqelm ahpflllill cmslllfqvi rlyqrrrwmi ralhlfpapp ahwfy- ghkef ypvkefevyh klmekypcav plwvgpftmf fsvhdpdyak illkrqdpks avshkilesw vgrglvtldg skwkkhrqiv kpgfnisilk ifitmmsesv rmmlnk- weeh iaqnsrlelf qhvslmtlds imkcafshqg siqldstlds ylkavfnlsk isnqrmnnfl hhndlvfkfs sqgqifskfn qelhqftekv iqdrkeslkd klkqdttqkr rwdfldills aksentkdfs eadlqaevkt fmfaghdtts saiswilycl akypehqqrc rdeirellgd gssitwehls qmpyttmcik eclr- lyapvv nisrlldkpi tfpdgrslpa gitvfiniwa lhhnpyfwed pqvfnplrfs rensekihpy afipfsaglr ncigqhfaii eckvavaltl lrfklapdhs rppqpvrqvv lkskngihvf akkvc
SEQ ID NO: 19 (isoforma X1 4V2 P50 do citocromo [chimpanzé Pan troglodytes)], XP_001165629.1, 525 aa) maglwlglvw qklllwgaas avslagaslv lsllqrvaty arkwqqmrpi ptva- rayplv ghallmkpdg reffqqiiey teeyrhmpll klwvgpvpmv alynaenvev iltsskqidk ssmykflepw lglglltstg nkwrsrrkml tptfhftile dfldim- neqa ntlvkklekh inqeafncff yitlcaldii cetamgknig aqsnddseyv ravyrmsemi frrikmpwlw ldlwylmfke gwehkkslki lhtftnsvia eranem- nane dcrgdgrgsa psknkrrafl dlllsvtdde gnrlshedir eevdtfmfeg hdttaaainw slyllgsnpe vqkkvdheld dvfgksdrpa tvedlkklry lecvi- ketlr lfpsvplfar svsedcevag yrvlkgteav iipyalhrdp ryfpnpeefq perffpknaq grhpyayvpf sagprncigq kfavmeekti lscilrhfwi esn- qkreelg legqlilrps ngiwiklkrr nader
SEQ ID NO: 20 (4V2 P450 citocromo [Macaca mulatta (Rhesus Ma- caque, Rhesus Monkey)], NP_001180767.1, 525 aa) magiwlglvw qklllwgaas avslagaslv lsllqrvasy vrkwqqmrpi ptva- rayplv ghallmkrdg reffqqiiey teeyrhmpll klwvgpvpmv alynaenvev iltsskqidk ssmykflepw lglglltstg nkwrsrrkml tptfhftile dfldim-
neqa nilvkklekh vnqeafncfv yitlcaldii cetamgknig aqsnddseyv ravyrmsemi frrikmpwlw ldlwylmfke gwehkkslki lhaftnnvia eranem- nvde dcrgdgrdsa psknkrrafl dlllsvtdde gnrlshedir eevdtfmfeg hdttaaamnw slyllgsnpe vqkkvdheld dvfgrsdrpa tvedlkklry lecvi- ketlr lfpsvplfar svsedcevag yrvlkgteav iipyalhrdp ryfpnpeefr perffpenaq grhpyayvpf sagprncigq kfavmeekti lscilrhfwi esn- qkreelg legqlilrpt ngiwiklkrr nadep
SEQ ID NO: 21 (4V2 P450 citocromo [Canis lupus familiaris (ca- chorro)], XP_013975571.1, 539 aa) mlkvkwkenv fregdkdsnm ldavqlpsik vesalsdaea ggspggrrpv ltvergrlaq gsmssllknp kdttrnslki kyflpeffqq vilyseesrh lpll- klwlgp ipivaiysae nveviltssr qidksyvykf lepwlglgll tstgnkwrsr rkmltptfhf tiledfldvm nehanilvnk lekhvnqeaf ncffyitlca ldiice- tamg knigaqnned seyvraiyrm sdtihrrmkm pwlwldflfl mfkegrehkr nleilhnftn nviterasel krdeehgsad kdcspsknkr rafldlllnv tddegn- klrh edvreevdtf mfeghdttaa ainwslyllg sypevqkqvd seledvfgks drpatledlk klkylecvik eslrlfpsvp lfarnlnedc vvagykvvkg sqaiiipyal hrdpryfpnp eefqperffp enlqgrhpya yipfsagprn cigqrfaime ektvlscvlr hfwvesnqkr eelglageli lrptngiwik lkrrna- des
SEQ ID NO: 22 (4V2 P450 citocromo [Bos taurus (gado)], NP_001029545, 527 aa) mlapwllsvg pklllwsglc avslagatlt lnllkmvasy arkwrqmrpv ptigd- pyplv ghalmmkpda rdffqqiidf teecrhlpll klwlgpvplv alynaetvev ilssskhiek symykflepw lglglltstg nkwrsrrkml tptfhftile dfldvmneqa nilvtklekh vnqeafncff yvtlctldii cetamgknig aqrnddseyv ravyrmsdsi hqrmkmpwlw ldlifymfkn grehrrslki vhdftnnvit eranemkrhe egtsndkekd fpprktkcra fldlllnvtd dqgn- klshed ireevdtfmf eghdttaaai nwslyllgwy pevqqrvdte leevfgksdr pvtledlkkl kyldcvikes lrlfpsvpff arnltedcev aghkivqgcq viiv- pyalhr dpkyfpdpee fkperffpen lkgrhtyayv pfsagprnci gqkfaimeek tilscilrhf wvesnqkree lglagelilr psngiwiklk rrntdes
SEQ ID NO: 23 (Cyp4v3, 4V2 P450 citocromo [Mus musculus (ca- mundongo doméstico)], NP_598730.1, 525 aa) mlwlwlglsg qklllwgaas avslagatil isifpmlvsy arkwqqmrsi psva- rayplv ghalymkpnn aeffqqliyy teefrhlpii klwigpvplv alykaenvev iltsskqidk sflykflqpw lglglltstg skwrtrrkml tptfhftile nfldvmneqa nilvnklekh vnqeafncff yitlcaldii cetamgknig aqsnndseyv rtvyrmsdmi yrrmkmpwlw fdlwylvfke grdhkrglkc lht- ftnnvia ervkerkaee dwtgagrgpi psknkrkafl dlllsvtdee gnrlsqedir eevdtfmfeg hdttaaainw slyllgtnpe vqrkvdqeld evfgrshrpv tledlk- klky ldcviketlr vfpsvplfar slsedcevgg ykvtkgteai iipyalhrdp ryfpdpeefr perffpensq grhpyayvpf sagprncigq kfavmeekti lacilr- qfwv esnqkreelg lagdlilrpn ngiwiklkrr heddp
SEQ ID NO: 24 (Cyp4v3, 4V2 P450 citocromo [Rattus norvegicus (rato Norway)], NP_001129072, 525 aa) mlwlwlglsg qklllwgaas avsvagatvl lnilqmlvsy arkwqqmrpi psva- rayplv ghalfmkpnn teffqqiiqy teefrhlpii klwigpvplv alykaenvev iltsskqidk sfmykflqpw lglglltstg skwrarrkml tpsfhftile dfldvmneqa nilvnklekh vnqeafncff pitlcaldii cetamgknig aqsngdseyv rtvyrmsdmi yrrmkmpwfw fdlwylmfke grdhkkglks lht-
ftnnvia ervnarkaeq dcigagrgpl psktkrkafl dlllsvtdee gnklshedir eevdtfmfeg hdttaaainw slyllgsnpe vqrkvdkeld dvfgrshrpv tledlk- klky ldcviketlr vfpsvplfar slsedcevag ykiskgteav iipyalhrdp ryfpdpeefq perffpensq grhpyayvpf sagprncigq kfavmeekti lacil- refwi esnqkreelg lagdlilrpn ngiwiklkrr heddp
SEQ ID NO: 25 (4V2 P450 citocromo [Gallus gallus (galinha)], NP_001001879, 530 aa) mameitlgsm egtqllpwva gaitllltvv tvhflpslln ywwwwwvmkp ipgir- pcypf vgnalllern gegffkqlqq yadefrkmpm fklwlgplpv tvlfhpdsve vilssskhik ksflytflhp wlgtglltst gdkwrsrrkm itptfhfail ndflevmneq ggvlleklek hvdkepfnif tditlcaldi icetamgknl gaqdnk- dsey vravyrmsdl iqqrqkspwl whdlmyllfk egrehernlk ilhgftdtvi aekvaelent kltkhdtdvn teeesgskkr eafldmllna tddegkklsy kdiree- vdtf mfeghdttaa amnwvlyllg hhpeaqkkvh qeldevfgnt erpvtvddlk klrylecvvk ealrlfpsvp mfarslqedc yisgyklpkg tnvlvltyvl hrd- peifpep defrperffp enskgrhpya yvpfsagprn cigqrfaqme ektllalilr rfwvdcsqkp eelglsgeli lrpnngiwvq lkrrpktvte
SEQ ID NO: 26 (membro 2 subfamília V família 4 P450 citocromo [Xenopus tropicalis (sapo-com-garras tropical)], NP_001072667.1, 523 aa) melggevhll vwvaaavvll tllalsilpa lqdyvrkrri lkpipgpgpn yplig- dalfl knnggdfflq iceytesyrl qpllkvwigt ipfivvyhad tvepvlsssk hmdkaflykf lhpwlgkgll tstgekwrsr rkmitptfhf ailseflevm neqs- kilvek lqthvdgesf dcfmdvtlca ldiisetamg rkiqaqsnrd seyvqaiykm sdiiqrrqkm pwlwldflya hlrdgkehdk nlkilhsftd kaileraeel kkm- geqkkeh cdsdpesdkp kkrsafldml lmatddagnk msymdireev dtfmfeghdt taaalnwslf llgshpeaqr qvhkeldevf gksdrpvtmd dlkklrylea vikesl- riyp svplfgrtvt edcsirgfhv pkgvnvviip yalhrdpeyf pepeefrper ffpenasgrn pyayipfsag lrncigqrfa lmeekvvlss ilrnywveas qkreel- cllg elilrpqdgm wiklknreta pta
SEQ ID NO: 27 (4V2 P450 citocromo [Equus caballus (cavalo)], XP_014592182.1, 469 aa) mfvliefkik yslsdffqql iyyteenrhl pllklwlgpv pvvifynaen ve- viltssrq idksymykfl kpwlglgllt stgnkwrsrr kmltptfhft nle- dfldvmn eqanilvnkl ekhvnqeafn cflyitlcal diicetamgk nigaqrnnds eyvravyrms dmihrrmkmp wlwldifflm fkegrehrrl lkilhnftnn vivera- semk kdeersrsdd ggsapsknkr rafldlllnv tddegnklsh edirqevdtf mfeghdttaa ainwslyllg cypevqkkvd seleevfgks drpatledlk klkylecvmk etlrlfpsvp lfarnlnedc evagykivkg sqaiivsyal hrds- ryfpnp eefkperffp ensqgrhpya yvpfsagprn cigqkfavme ekiilscilr hfwvesnqkr eelglageli lrpsngiwik lkrrntees
SEQ ID NO: 28 (4V2 P450 citocromo [Oryctolagus cuniculus (coe- lho)], XP_002709379.1, 524 aa) mwlwlglvgq kllfwgaasa vslagaslfl nllqmvasya rkwqqmrpip ti- grpyplvg halymkpsgk effqqliqyt eeyrhlpllk lwlgplpiva lynaenve- vi lnsskqinks smyqflepwl glglltstgy kwrsrrkmlt ptfhftiled fldimneqan ilvhklekhv dqeafncffy itlcaldiic etamgkniga qsnedseyvr avyrmsdvif rrmkmpwlwl dlwylmfkeg wehkrclkil hrftnn- viae rvsemktdee hrdadsncap stmkrkafld llltvtdeeg nklshedire evdtfmfegh dttaaainws lyllgshpev qrkvddelde vfgksdrpat sedlk- klkyl ecviketlrl fpsvplfars lsddcevagf rvvkgtqavi vpyalhrdpk yfpnpeefrp erffpenaqg rhpyayvpfs agprncigqk faimeektil scil- rklwve snqkmeelgl agelilrptn giwiklkrrn adka SEQ ID: 29 (4c3 P450 citocromo [Drosophila melanogaster (mosca da fruta)], NP_524598, 535 aa) msskvitslm aesillskvg qvisgyspit vfllgsilif lvvynkrrsr lvkyiekipg paampflgna iemnvdhdel fnrvigmqkl wgtriginrv wqgta- prvll fepetvepil nsqkfvnksh dydylhpwlg eglltstdrk whsrrkiltp afhfkilddf idvfneqsav larklavevg seafnlfpyv tlctldivce tamgr- riyaq snseseyvka vygigsivqs rqakiwlqsd fifsltaeyk lhqsyintlh gfsnmvirer kaelailqen nnnnnnnapd ayddvgkkkr lafldllida skeg- tvlsne direevdtfm feghdttsaa iswtlfllgc hpeyqervve eldsifgddk etpatmknlm dmryleccik dslrlfpsvp mmarmvgedv niggkivpag tqaiim- tyal hrnprvfpkp eqfnpdnflp encagrhpfa yipfsagprn cigqkfaile ekavistvlr kykieavdrr edltllgeli lrpkdglrvk itprd SEQ ID NO: 30 (elemento de assinatura P450, "x" significa qualquer aminoácido) FxxGxxxCxG SEQ ID NO: 31 (elemento de assinatura P450, "x" significa qualquer aminoácido) ExxR SEQ ID NO: 32 (promotor CAG, 1715 pb) GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAG- CCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCG- CCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATA- GGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTA- CATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCG- CCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACG- TATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCAC- TCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTA- TTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGG- CGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCG- CTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCG- CGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCG- CCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGG- CCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGG- CTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGG- CTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTG- CCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCG- CGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAA- CAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGG- TCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTT- CGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGG- CGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGA- GGGGCGCGGCGGCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTG- CCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGGCGGAG- CCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGCGAAGCGGTGCGGCG- CCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTT- CTCCATCTCCAGCCTCGGGGCTGCCGCAGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCA- GGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTT- CATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCAT-
CATTTTGGCAAA
SEQ ID NO: 33 (potenciador WPRE, 589 pb) AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTG- CTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCG- TATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTG- TGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCAC- TGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCC- TATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTG- TTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCG- CCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAA- TCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCG-
CCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGC SEQ ID NO: 34 (poliA bGH, 225 pb) CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGAC- CCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTG- TCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGA-
TTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG SEQ ID NO: 35 (promotor EFS, 235 pb) g attggctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc ccacagtccc cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg aaccggtgcc tagagaaggt ggcg- cggggt aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacggg- tttg ccgccagaac acag SEQ ID NO: 36 (SPA, 54 pb)
GATCCAATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTG SEQ ID NO: 37 (sequência Kozak, 6 pb)
GCCACC SEQ ID NO: 38 (sequência Kozak, 5 pb)
CCACC SEQ ID NO: 39 (PoliA tardio SV40, 120 pb) TTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAA-
TAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAT SEQ ID NO: 40 (promotor CMV, 576 pb) TAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAAC- TTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAA- TGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTA- TTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCC- TATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGG- GACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGG- TTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAG- TCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTT- CCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGG-
GAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAG SEQ ID NO: 41 (promotor EF-1 alfa, 1184 pb) cgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaag- ttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgg- gaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtata-
taagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacagg- taagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtg- ccttgaattacttccacctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttgga- agtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgag- ttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctg- tctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacg- ctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcgg- tttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgagg- cggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctg- ctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctgg- cccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggag- ctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaagga- aaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccg- tccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttgggggga- ggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccag- cttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggtt- cattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtga SEQ ID NO: 42 (ITR Esquerda 5' AAV, 141 pb) cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccggg- cgtc gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac taggggttcc t SEQ ID NO: 43 (ITR Direita 3' AAV, 141 pb) ag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cac- tgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct gcctgcagg SEQ ID NO: 44 (ITR 5’ AAV2 mutante em construto de scAAV, 117 pb) cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccggg- cgtc gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtgg SEQ ID NO: 45 ITR 3’ AAV2 em construto de scAAV, 141 pb) aggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcac- tga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct ca- gtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc agg SEQ ID NO: 46 (região de gene CYP4V2 humano contendo mutação c.802-8_810del17insGC)
CAAACAGAAGCATGTGATTATCATTCAAAGCGAACGGGCCAATGAAATGAACGCCAATGA SEQ ID NO: 47 (região de gene CYP4V2 humano do tipo selvagem sem a mutação c.802-8_810del17insGC) CAAACAGAAGCATGTGATTATCATTCAAATCATACAGGTCATCGCTGAACGGGCCAATGAA-
ATGAACGCCAATGA SEQ ID NO: 48 (elemento protoespaçador g1, sequência de RNA, 20 nt)
UGAUUAUCAUUCAAAGCGAA SEQ ID NO: 49 (elemento protoespaçador g2, sequência de RNA, 20 nt)
GAUUAUCAUUCAAAGCGAAC
SEQ ID NO: 50 (elemento protoespaçador g3, sequência de RNA, 20 nt)
GAUAAUCACAUGCUUCUGUU SEQ ID NO: 51 (elemento protoespaçador g4, sequência de RNA, 20 nt)
UUCAUUGGCGUUCAUUUCAU SEQ ID NO: 52 (elemento protoespaçador g5, sequência de RNA, 20 nt)
CACAUGCUUCUGUUUGGACU SEQ ID NO: 53 (sequência de crRNA exemplar (excluindo a se- quência de elemento protoespaçador 5’, 16 nt)
GUUUUAGAGCUAUGCU SEQ ID NO: 54 (sequência de tracrRNA exemplar, 67 nt) AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGA-
GUCGGUGCUUU SEQ ID NO: 55 (sequência de sgRNA exemplar, Excluindo a sequência de elemento protoespaçador 5’ e o “G” opcional antes do elemento protoespaçador. Sequência mostrada em formato de DNA como em um construto de plasmídeo. Para se- quência em formato de RNA, usar “U” para substituir “T”, 82 nt) gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaag- tggcaccgagtcggtgctttttt SEQ ID NO: 56 (sequência modelo 1 doadora de CYP4V2, 200 ba- ses)
AGA AAA ATA AAT GAA AGA AAC TAG CAT ATT TTA TAA GAA AAT GTG TTA ACT AGG GTG CAT CCA AGT CCA AAC AGA AGC ATG TGA TTA TCA TTC AAA TCA TAC AGG TCA TCG CTG AAC GGG CCA ATG AAA TGA ACG CCA ATG AAG ACT GTA GAG GTG ATG GCA GGG GCT CTG CCC CCT CCA
AAA ATA AAC GCA GGG CCT TT SEQ ID NO: 57 (sequência modelo 2 doadora de CYP4V2, o comple- mento reverso de sequência modelo 1 doadora de CYP4V2, 200 ba- ses)
AA AGG CCC TGC GTT TAT TTT TGG AGG GGG CAG AGC CCC TGC CAT CAC CTC TAC AGT CTT CAT TGG CGT TCA TTT CAT TGG CCC GTT CAG CGA TGA CCT GTA TGA TTT GAA TGA TAA TCA CAT GCT TCT GTT TGG ACT TGG ATG CAC CCT AGT TAA CAC ATT TTC TTA TAA AAT ATG CTA GTT
TCT TTC ATT TAT TTT TCT SEQ ID NO: 58 (sequência de aminoácido exemplar de SpCas9 (1368 aa)) MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEA- TRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNI- VDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVD- KLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGN- LIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDA-
ILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFD- QSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQI- HLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEE- TITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKY- VTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNAS- LGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDD- KVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTF- KEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMA- RENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVD- QELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWR- QLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNT- KYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIK- KYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEI- RKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSD- KLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKN- PIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVN- FLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVL- SAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLI-
HQSITGLYETRIDLSQLGGD SEQ ID NO: 59 (nucleotídeo adicional inserido imediatamente após a sequência de promotor U6 e antes da sequência de ele- mento protoespaçador em um construto de plasmídeo e em um sgR- NA IVT, 1 nt) SEQ ID NO: 60 – Sequência de cassete de expressão de CYP4V2 em AAV2.CYP4V2op, AAV2tri(Y-F).CYP4V2op e AAV5.CYP4V2op.: ITR Esquerda: 1-141 Promotor CAG: 237-1951 cDNA CYP4V2op: 2002-3579 Potenciador WPRE: 3736-4324 poliA bGH: 4350-4574 ITR Direita 4659-4799 1 CCTGCAGGCA GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGC CCGGGCAAAG 51 CCCGGGCGTC GGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAGTGA GCGAGCGAGC 101 GCGCAGAGAG GGAGTGGCCA ACTCCATCAC TAGGGGTTCC TGCGGCCAAT 151 TCAGTCGATA ACTATAACGG TCCTAAGGTA GCGATTTAAA TACGCGCTCT 201 CTTAAGGTAG CCCCGGGACG CGTCAATTGA GATCTCGACA TTGATTATTG 251 ACTAGTTATT AATAGTAATC AATTACGGGG TCATTAGTTC ATAGCCCATA 301 TATGGAGTTC CGCGTTACAT AACTTACGGT AAATGGCCCG CCTGGCTGAC 351 CGCCCAACGA CCCCCGCCCA TTGACGTCAA TAATGACGTA TGTTCCCATA 401 GTAACGCCAA TAGGGACTTT CCATTGACGT CAATGGGTGG ACTATTTACG 451 GTAAACTGCC CACTTGGCAG TACATCAAGT GTATCATATG CCAAGTACGC 501 CCCCTATTGA CGTCAATGAC GGTAAATGGC CCGCCTGGCA TTATGCCCAG 551 TACATGACCT TATGGGACTT TCCTACTTGG CAGTACATCT ACGTATTAGT 601 CATCGCTATT ACCATGGGTC GAGGTGAGCC CCACGTTCTG CTTCACTCTC 651 CCCATCTCCC CCCCCTCCCC ACCCCCAATT TTGTATTTAT TTATTTTTTA 701 ATTATTTTGT GCAGCGATGG GGGCGGGGGG GGGGGGGGCG CGCGCCAGGC 751 GGGGCGGGGC GGGGCGAGGG GCGGGGCGGG GCGAGGCGGA GAGGTGCGGC 801 GGCAGCCAAT CAGAGCGGCG CGCTCCGAAA GTTTCCTTTT ATGGCGAGGC 851 GGCGGCGGCG GCGGCCCTAT AAAAAGCGAA GCGCGCGGCG GGCGGGAGTC 901 GCTGCGTTGC CTTCGCCCCG TGCCCCGCTC CGCGCCGCCT CGCGCCGCCC 951 GCCCCGGCTC TGACTGACCG CGTTACTCCC ACAGGTGAGC GGGCGGGACG
1001 GCCCTTCTCC TCCGGGCTGT AATTAGCGCT TGGTTTAATG ACGGCTCGTT 1051 TCTTTTCTGT GGCTGCGTGA AAGCCTTAAA GGGCTCCGGG AGGGCCCTTT 1101 GTGCGGGGGG GAGCGGCTCG GGGGGTGCGT GCGTGTGTGT GTGCGTGGGG 1151 AGCGCCGCGT GCGGCCCGCG CTGCCCGGCG GCTGTGAGCG CTGCGGGCGC 1201 GGCGCGGGGC TTTGTGCGCT CCGCGTGTGC GCGAGGGGAG CGCGGCCGGG 1251 GGCGGTGCCC CGCGGTGCGG GGGGGCTGCG AGGGGAACAA AGGCTGCGTG 1301 CGGGGTGTGT GCGTGGGGGG GTGAGCAGGG GGTGTGGGCG CGGCGGTCGG 1351 GCTGTAACCC CCCCCTGCAC CCCCCTCCCC GAGTTGCTGA GCACGGCCCG 1401 GCTTCGGGTG CGGGGCTCCG TGCGGGGCGT GGCGCGGGGC TCGCCGTGCC 1451 GGGCGGGGGG TGGCGGCAGG TGGGGGTGCC GGGCGGGGCG GGGCCGCCTC 1501 GGGCCGGGGA GGGCTCGGGG GAGGGGCGCG GCGGCCCCGG AGCGCCGGCG 1551 GCTGTCGAGG CGCGGCGAGC CGCAGCCATT GCCTTTTATG GTAATCGTGC 1601 GAGAGGGCGC AGGGACTTCC TTTGTCCCAA ATCTGGCGGA GCCGAAATCT 1651 GGGAGGCGCC GCCGCACCCC CTCTAGCGGG CGCGGGCGAA GCGGTGCGGC 1701 GCCGGCAGGA AGGAAATGGG CGGGGAGGGC CTTCGTGCGT CGCCGCGCCG 1751 CCGTCCCCTT CTCCATCTCC AGCCTCGGGG CTGCCGCAGG GGGACGGCTG 1801 CCTTCGGGGG GGACGGGGCA GGGCGGGGTT CGGCTTCTGG CGTGTGACCG 1851 GCGGCTCTAG AGCCTCTGCT AACCATGTTC ATGCCTTCTT CTTTTTCCTA 1901 CAGCTCCTGG GCAACGTGCT GGTTATTGTG CTGTCTCATC ATTTTGGCAA 1951 AGAATTCTAA TACGACTCAC TATAGGGAGA CCCAAGCTGG CTAGAGCCAC 2001 CATGGCTGGA CTGTGGCTGG GACTGGTGTG GCAGAAACTG CTGCTGTGGG 2051 GGGCCGCTTC CGCACTGTCA CTGGCTGGGG CTTCACTGGT GCTGAGCCTG 2101 CTGCAGAGGG TGGCCTCCTA CGCCAGAAAG TGGCAGCAGA TGAGGCCCAT 2151 CCCTACCGTG GCCAGAGCCT ATCCACTGGT GGGACACGCA CTGCTGATGA 2201 AGCCTGACGG CAGAGAGTTC TTTCAGCAGA TCATCGAGTA CACAGAGGAG 2251 TATAGGCACA TGCCACTGCT GAAGCTGTGG GTGGGACCCG TGCCTATGGT 2301 GGCCCTGTAC AACGCCGAGA ATGTGGAAGT GATCCTGACC AGCAGCAAGC 2351 AGATCGATAA GTCTAGCATG TATAAGTTCC TGGAGCCTTG GCTGGGCCTG 2401 GGCCTGCTGA CCTCTACAGG CAACAAGTGG AGGAGCCGGA GAAAGATGCT 2451 GACCCCAACA TTCCACTTTA CAATCCTGGA GGACTTCCTG GACATCATGA 2501 ACGAGCAGGC CAATATCCTG GTGAAGAAGC TGGAGAAGCA CATCAACCAG 2551 GAGGCCTTTA ATTGCTTCTT TTACATCACC CTGTGCGCCC TGGACATCAT 2601 CTGTGAGACA GCTATGGGCA AGAACATCGG CGCCCAGTCT AATGACGATA 2651 GCGAGTACGT GCGGGCCGTG TATAGAATGA GCGAGATGAT CTTTAGGCGC 2701 ATCAAGATGC CCTGGCTGTG GCTGGATCTG TGGTATCTGA TGTTCAAGGA 2751 GGGCTGGGAG CACAAGAAGT CCCTGCAGAT CCTGCACACC TTTACAAACT 2801 CTGTGATCGC CGAGAGAGCC AATGAGATGA ACGCCAATGA GGACTGTAGG 2851 GGCGATGGAA GGGGCAGCGC CCCTTCCAAG AACAAGCGGA GAGCCTTCCT 2901 GGACCTGCTG CTGAGCGTGA CCGACGATGA GGGCAATCGC CTGTCCCACG 2951 AGGACATCCG GGAGGAGGTG GATACATTCA TGTTTGAGGG ACACGACACC 3001 ACAGCCGCCG CCATCAACTG GTCCCTGTAC CTGCTGGGCT CTAATCCAGA 3051 GGTGCAGAAG AAGGTGGATC ACGAGCTGGA CGACGTGTTC GGCAAGTCCG 3101 ACAGGCCAGC AACCGTGGAG GATCTGAAGA AGCTGAGATA CCTGGAGTGC 3151 GTGATCAAGG AGACACTGCG CCTGTTCCCC TCTGTGCCTC TGTTTGCCCG 3201 GTCCGTGTCT GAGGACTGTG AGGTGGCCGG CTATCGCGTG CTGAAGGGCA 3251 CCGAGGCCGT GATCATCCCT TACGCCCTGC ACCGGGACCC CAGGTATTTC 3301 CCTAACCCAG AGGAGTTTCA GCCAGAGAGA TTCTTTCCCG AGAATGCCCA 3351 GGGCAGGCAC CCTTACGCCT ATGTGCCATT CTCCGCCGGA CCAAGGAACT 3401 GCATCGGACA GAAGTTTGCC GTGATGGAGG AGAAAACCAT CCTGTCTTGT 3451 ATCCTGAGAC ACTTCTGGAT CGAGAGCAAT CAGAAGAGGG AGGAGCTGGG 3501 CCTGGAGGGA CAGCTGATCC TGCGGCCAAG CAACGGCATC TGGATCAAAC 3551 TGAAAAGAAG GAACGCTGAC GAGAGGTAAA AGCTTGGTAC CGATATCGCG 3601 GCCGCCCTAG GGAGCTCCTC GAGGCGGCCC GCTCGAGTCT AGAGGGCCCT 3651 TCGAAGGTAA GCCTATCCCT AACCCTCTCC TCGGTCTCGA TTCTACGCGT 3701 ACCGGTCATC ATCACCATCA CCATTGAGTT TCGATAATCA ACCTCTGGAT
3751 TACAAAATTT GTGAAAGATT GACTGGTATT CTTAACTATG TTGCTCCTTT 3801 TACGCTATGT GGATACGCTG CTTTAATGCC TTTGTATCAT GCTATTGCTT 3851 CCCGTATGGC TTTCATTTTC TCCTCCTTGT ATAAATCCTG GTTGCTGTCT 3901 CTTTATGAGG AGTTGTGGCC CGTTGTCAGG CAACGTGGCG TGGTGTGCAC 3951 TGTGTTTGCT GACGCAACCC CCACTGGTTG GGGCATTGCC ACCACCTGTC 4001 AGCTCCTTTC CGGGACTTTC GCTTTCCCCC TCCCTATTGC CACGGCGGAA 4051 CTCATCGCCG CCTGCCTTGC CCGCTGCTGG ACAGGGGCTC GGCTGTTGGG 4101 CACTGACAAT TCCGTGGTGT TGTCGGGGAA ATCATCGTCC TTTCCTTGGC 4151 TGCTCGCCTG TGTTGCCACC TGGATTCTGC GCGGGACGTC CTTCTGCTAC 4201 GTCCCTTCGG CCCTCAATCC AGCGGACCTT CCTTCCCGCG GCCTGCTGCC 4251 GGCTCTGCGG CCTCTTCCGC GTCTTCGCCT TCGCCCTCAG ACGAGTCGGA 4301 TCTCCCTTTG GGCCGCCTCC CCGCATCGAA ACCCGCTGAT CAGCCTCGAC 4351 TGTGCCTTCT AGTTGCCAGC CATCTGTTGT TTGCCCCTCC CCCGTGCCTT 4401 CCTTGACCCT GGAAGGTGCC ACTCCCACTG TCCTTTCCTA ATAAAATGAG 4451 GAAATTGCAT CGCATTGTCT GAGTAGGTGT CATTCTATTC TGGGGGGTGG 4501 GGTGGGGCAG GACAGCAAGG GGGAGGATTG GGAAGACAAT AGCAGGCATG 4551 CTGGGGATGC GGTGGGCTCT ATGGCTTCTG AGGCGGAAAG AACCAGATCC 4601 TCTCTTAAGG TAGCATCGAG ATTTAAATTA GGGATAACAG GGTAATGGCG 4651 CGGGCCGCAG GAACCCCTAG TGATGGAGTT GGCCACTCCC TCTCTGCGCG 4701 CTCGCTCGCT CACTGAGGCC GGGCGACCAA AGGTCGCCCG ACGCCCGGGC 4751 TTTGCCCGGG CGGCCTCAGT GAGCGAGCGA GCGCGCAGCT GCCTGCAGG
SEQ ID NO: 61 – Sequência de cassete de expressão de CYP4V2 em AAV5.CYP4V2st.
AAV5.CYP4V2st tem as mesmas sequências de pro- motor (CAG), potenciador (WPRE) e poliA (poliA bGH) que AAV2.CYP4V2op, AAV2tri(Y-F).CYP4V2op e AAV5.CYP4V2op (SEQ ID NO: 60) mas diferentes de cDNA de CYP4V1 e junção/ligante: ITR Esquerda: 1-141 Promotor CAG: 166-1880 cDNA CYP4V2st: 1938-3515 Potenciador WPRE: 3551-4139 poliA bGH: 4163-4387 ITR Direita: 4399-4539
1 CCTGCAGGCA GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGC CCGGGCAAAG 51 CCCGGGCGTC GGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAGTGA GCGAGCGAGC 101 GCGCAGAGAG GGAGTGGCCA ACTCCATCAC TAGGGGTTCC TGCGGCCTAA 151 GGCAATTGAG ATCTCGACAT TGATTATTGA CTAGTTATTA ATAGTAATCA 201 ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT ATGGAGTTCC GCGTTACATA 251 ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC GCCCAACGAC CCCCGCCCAT 301 TGACGTCAAT AATGACGTAT GTTCCCATAG TAACGCCAAT AGGGACTTTC 351 CATTGACGTC AATGGGTGGA CTATTTACGG TAAACTGCCC ACTTGGCAGT 401 ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC CCCTATTGAC GTCAATGACG 451 GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT ACATGACCTT ATGGGACTTT 501 CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA CCATGGGTCG 551 AGGTGAGCCC CACGTTCTGC TTCACTCTCC CCATCTCCCC CCCCTCCCCA 601 CCCCCAATTT TGTATTTATT TATTTTTTAA TTATTTTGTG CAGCGATGGG 651 GGCGGGGGGG GGGGGGGCGC GCGCCAGGCG GGGCGGGGCG GGGCGAGGGG 701 CGGGGCGGGG CGAGGCGGAG AGGTGCGGCG GCAGCCAATC AGAGCGGCGC 751 GCTCCGAAAG TTTCCTTTTA TGGCGAGGCG GCGGCGGCGG CGGCCCTATA 801 AAAAGCGAAG CGCGCGGCGG GCGGGAGTCG CTGCGTTGCC TTCGCCCCGT 851 GCCCCGCTCC GCGCCGCCTC GCGCCGCCCG CCCCGGCTCT GACTGACCGC 901 GTTACTCCCA CAGGTGAGCG GGCGGGACGG CCCTTCTCCT CCGGGCTGTA 951 ATTAGCGCTT GGTTTAATGA CGGCTCGTTT CTTTTCTGTG GCTGCGTGAA 1001 AGCCTTAAAG GGCTCCGGGA GGGCCCTTTG TGCGGGGGGG AGCGGCTCGG
1051 GGGGTGCGTG CGTGTGTGTG TGCGTGGGGA GCGCCGCGTG CGGCCCGCGC 1101 TGCCCGGCGG CTGTGAGCGC TGCGGGCGCG GCGCGGGGCT TTGTGCGCTC 1151 CGCGTGTGCG CGAGGGGAGC GCGGCCGGGG GCGGTGCCCC GCGGTGCGGG 1201 GGGGCTGCGA GGGGAACAAA GGCTGCGTGC GGGGTGTGTG CGTGGGGGGG 1251 TGAGCAGGGG GTGTGGGCGC GGCGGTCGGG CTGTAACCCC CCCCTGCACC 1301 CCCCTCCCCG AGTTGCTGAG CACGGCCCGG CTTCGGGTGC GGGGCTCCGT 1351 GCGGGGCGTG GCGCGGGGCT CGCCGTGCCG GGCGGGGGGT GGCGGCAGGT 1401 GGGGGTGCCG GGCGGGGCGG GGCCGCCTCG GGCCGGGGAG GGCTCGGGGG 1451 AGGGGCGCGG CGGCCCCGGA GCGCCGGCGG CTGTCGAGGC GCGGCGAGCC 1501 GCAGCCATTG CCTTTTATGG TAATCGTGCG AGAGGGCGCA GGGACTTCCT 1551 TTGTCCCAAA TCTGGCGGAG CCGAAATCTG GGAGGCGCCG CCGCACCCCC 1601 TCTAGCGGGC GCGGGCGAAG CGGTGCGGCG CCGGCAGGAA GGAAATGGGC 1651 GGGGAGGGCC TTCGTGCGTC GCCGCGCCGC CGTCCCCTTC TCCATCTCCA 1701 GCCTCGGGGC TGCCGCAGGG GGACGGCTGC CTTCGGGGGG GACGGGGCAG 1751 GGCGGGGTTC GGCTTCTGGC GTGTGACCGG CGGCTCTAGA GCCTCTGCTA 1801 ACCATGTTCA TGCCTTCTTC TTTTTCCTAC AGCTCCTGGG CAACGTGCTG 1851 GTTATTGTGC TGTCTCATCA TTTTGGCAAA GAATTCTAAT ACGACTCACT 1901 ATAGGGAGAC CCAAGCTGGC TAGCCAAAGC TTCCACCATG GCGGGGCTCT 1951 GGCTGGGGCT CGTGTGGCAG AAGCTGCTGC TGTGGGGCGC GGCGAGTGCC 2001 CTTTCCCTGG CCGGCGCCAG TCTGGTCCTG AGCCTGCTGC AGAGGGTGGC 2051 GAGCTACGCG CGGAAATGGC AGCAGATGCG GCCCATCCCC ACGGTGGCCC 2101 GCGCCTACCC ACTGGTGGGC CACGCGCTGC TGATGAAGCC GGACGGGCGA 2151 GAATTTTTTC AGCAGATCAT TGAGTACACA GAGGAATACC GCCACATGCC 2201 GCTGCTGAAG CTCTGGGTCG GGCCAGTGCC CATGGTGGCC CTTTATAATG 2251 CAGAAAATGT GGAGGTAATT TTAACTAGTT CAAAGCAAAT TGACAAATCC 2301 TCTATGTACA AGTTTTTAGA ACCATGGCTT GGCCTAGGAC TTCTTACAAG 2351 TACTGGAAAC AAATGGCGCT CCAGGAGAAA GATGTTAACA CCCACTTTCC 2401 ATTTTACCAT TCTGGAAGAT TTCTTAGATA TCATGAATGA ACAAGCAAAT 2451 ATATTGGTTA AGAAACTTGA AAAACACATT AACCAAGAAG CATTTAACTG 2501 CTTTTTTTAC ATCACTCTTT GTGCCTTAGA TATCATCTGT GAAACAGCTA 2551 TGGGGAAGAA TATTGGTGCT CAAAGTAATG ATGATTCCGA GTATGTCCGT 2601 GCAGTTTATA GAATGAGTGA GATGATATTT CGAAGAATAA AGATGCCCTG 2651 GCTTTGGCTT GATCTCTGGT ACCTTATGTT TAAAGAAGGA TGGGAACACA 2701 AAAAGAGCCT TCAGATCCTA CATACTTTTA CCAACAGTGT CATCGCTGAA 2751 CGGGCCAATG AAATGAACGC CAATGAAGAC TGTAGAGGTG ATGGCAGGGG 2801 CTCTGCCCCC TCCAAAAATA AACGCAGGGC CTTTCTTGAC TTGCTTTTAA 2851 GTGTGACTGA TGACGAAGGG AACAGGCTAA GTCATGAAGA TATTCGAGAA 2901 GAAGTTGACA CCTTCATGTT TGAGGGGCAC GATACAACTG CAGCTGCAAT 2951 AAACTGGTCC TTATACCTGT TGGGTTCTAA CCCAGAAGTC CAGAAAAAAG 3001 TGGATCATGA ATTGGATGAC GTGTTTGGGA AGTCTGACCG TCCCGCTACA 3051 GTAGAAGACC TGAAGAAACT TCGGTATCTG GAATGTGTTA TTAAGGAGAC 3101 CCTTCGCCTT TTTCCTTCTG TTCCTTTATT TGCCCGTAGT GTTAGTGAAG 3151 ATTGTGAAGT GGCAGGTTAC AGAGTTCTAA AAGGCACTGA AGCCGTCATC 3201 ATTCCCTATG CATTGCACAG AGATCCGAGA TACTTCCCCA ACCCCGAGGA 3251 GTTCCAGCCT GAGCGGTTCT TCCCCGAGAA TGCACAAGGG CGCCATCCAT 3301 ATGCCTACGT GCCCTTCTCT GCTGGCCCCA GGAACTGTAT AGGTCAAAAG 3351 TTTGCTGTGA TGGAAGAAAA GACCATTCTT TCGTGCATCC TGAGGCACTT 3401 TTGGATAGAA TCCAACCAGA AAAGAGAAGA GCTTGGTCTA GAAGGACAGT 3451 TGATTCTTCG TCCAAGTAAT GGCATCTGGA TCAAGTTGAA GAGGAGAAAT 3501 GCAGATGAAC GCTAAGCGGC CGCAACTCGA GACTCTAGAG GTTAATCGAT 3551 AATCAACCTC TGGATTACAA AATTTGTGAA AGATTGACTG GTATTCTTAA 3601 CTATGTTGCT CCTTTTACGC TATGTGGATA CGCTGCTTTA ATGCCTTTGT 3651 ATCATGCTAT TGCTTCCCGT ATGGCTTTCA TTTTCTCCTC CTTGTATAAA 3701 TCCTGGTTGC TGTCTCTTTA TGAGGAGTTG TGGCCCGTTG TCAGGCAACG 3751 TGGCGTGGTG TGCACTGTGT TTGCTGACGC AACCCCCACT GGTTGGGGCA
3801 TTGCCACCAC CTGTCAGCTC CTTTCCGGGA CTTTCGCTTT CCCCCTCCCT 3851 ATTGCCACGG CGGAACTCAT CGCCGCCTGC CTTGCCCGCT GCTGGACAGG 3901 GGCTCGGCTG TTGGGCACTG ACAATTCCGT GGTGTTGTCG GGGAAATCAT 3951 CGTCCTTTCC TTGGCTGCTC GCCTGTGTTG CCACCTGGAT TCTGCGCGGG 4001 ACGTCCTTCT GCTACGTCCC TTCGGCCCTC AATCCAGCGG ACCTTCCTTC 4051 CCGCGGCCTG CTGCCGGCTC TGCGGCCTCT TCCGCGTCTT CGCCTTCGCC 4101 CTCAGACGAG TCGGATCTCC CTTTGGGCCG CCTCCCCGCA TCGAAACCCG 4151 CTGACTAGAC GACTGTGCCT TCTAGTTGCC AGCCATCTGT TGTTTGCCCC 4201 TCCCCCGTGC CTTCCTTGAC CCTGGAAGGT GCCACTCCCA CTGTCCTTTC 4251 CTAATAAAAT GAGGAAATTG CATCGCATTG TCTGAGTAGG TGTCATTCTA 4301 TTCTGGGGGG TGGGGTGGGG CAGGACAGCA AGGGGGAGGA TTGGGAAGAC 4351 AATAGCAGGC ATGCTGGGGA TGCGGTGGGC TCTATGGCCG CGGGCCGCAG 4401 GAACCCCTAG TGATGGAGTT GGCCACTCCC TCTCTGCGCG CTCGCTCGCT 4451 CACTGAGGCC GGGCGACCAA AGGTCGCCCG ACGCCCGGGC TTTGCCCGGG 4501 CGGCCTCAGT GAGCGAGCGA GCGCGCAGCT GCCTGCAGG
SEQ ID NO: 62 – Sequência de cassete de expressão de CYP4V1 em AAV8.CYP4V2fv.
AAV8.CYP4V2fv tem as mesmas sequências de pro- motor (CAG), potenciador (WPRE) e poliA (poliA bGH) e de jun- ção/ligante que AAV5.CYP4V2st (SEQ ID NO: 61) e difere apenas em sequência de cDNA de CYP4V2:
ITR esquerda: 1-141 Promotor CAG: 166-1880 CYP4V2fv cDNA: 1938-3515 Potenciador WPRE: 3551-4139 PoliA bGH: 4163-4387 ITR Direita: 4399-4539
1 CCTGCAGGCA GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGC CCGGGCAAAG 51 CCCGGGCGTC GGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAGTGA GCGAGCGAGC 101 GCGCAGAGAG GGAGTGGCCA ACTCCATCAC TAGGGGTTCC TGCGGCCTAA 151 GGCAATTGAG ATCTCGACAT TGATTATTGA CTAGTTATTA ATAGTAATCA 201 ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT ATGGAGTTCC GCGTTACATA 251 ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC GCCCAACGAC CCCCGCCCAT 301 TGACGTCAAT AATGACGTAT GTTCCCATAG TAACGCCAAT AGGGACTTTC 351 CATTGACGTC AATGGGTGGA CTATTTACGG TAAACTGCCC ACTTGGCAGT 401 ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC CCCTATTGAC GTCAATGACG 451 GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT ACATGACCTT ATGGGACTTT 501 CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA CCATGGGTCG 551 AGGTGAGCCC CACGTTCTGC TTCACTCTCC CCATCTCCCC CCCCTCCCCA 601 CCCCCAATTT TGTATTTATT TATTTTTTAA TTATTTTGTG CAGCGATGGG 651 GGCGGGGGGG GGGGGGGCGC GCGCCAGGCG GGGCGGGGCG GGGCGAGGGG 701 CGGGGCGGGG CGAGGCGGAG AGGTGCGGCG GCAGCCAATC AGAGCGGCGC 751 GCTCCGAAAG TTTCCTTTTA TGGCGAGGCG GCGGCGGCGG CGGCCCTATA 801 AAAAGCGAAG CGCGCGGCGG GCGGGAGTCG CTGCGTTGCC TTCGCCCCGT 851 GCCCCGCTCC GCGCCGCCTC GCGCCGCCCG CCCCGGCTCT GACTGACCGC 901 GTTACTCCCA CAGGTGAGCG GGCGGGACGG CCCTTCTCCT CCGGGCTGTA 951 ATTAGCGCTT GGTTTAATGA CGGCTCGTTT CTTTTCTGTG GCTGCGTGAA 1001 AGCCTTAAAG GGCTCCGGGA GGGCCCTTTG TGCGGGGGGG AGCGGCTCGG 1051 GGGGTGCGTG CGTGTGTGTG TGCGTGGGGA GCGCCGCGTG CGGCCCGCGC 1101 TGCCCGGCGG CTGTGAGCGC TGCGGGCGCG GCGCGGGGCT TTGTGCGCTC 1151 CGCGTGTGCG CGAGGGGAGC GCGGCCGGGG GCGGTGCCCC GCGGTGCGGG
1201 GGGGCTGCGA GGGGAACAAA GGCTGCGTGC GGGGTGTGTG CGTGGGGGGG 1251 TGAGCAGGGG GTGTGGGCGC GGCGGTCGGG CTGTAACCCC CCCCTGCACC 1301 CCCCTCCCCG AGTTGCTGAG CACGGCCCGG CTTCGGGTGC GGGGCTCCGT 1351 GCGGGGCGTG GCGCGGGGCT CGCCGTGCCG GGCGGGGGGT GGCGGCAGGT 1401 GGGGGTGCCG GGCGGGGCGG GGCCGCCTCG GGCCGGGGAG GGCTCGGGGG 1451 AGGGGCGCGG CGGCCCCGGA GCGCCGGCGG CTGTCGAGGC GCGGCGAGCC 1501 GCAGCCATTG CCTTTTATGG TAATCGTGCG AGAGGGCGCA GGGACTTCCT 1551 TTGTCCCAAA TCTGGCGGAG CCGAAATCTG GGAGGCGCCG CCGCACCCCC 1601 TCTAGCGGGC GCGGGCGAAG CGGTGCGGCG CCGGCAGGAA GGAAATGGGC 1651 GGGGAGGGCC TTCGTGCGTC GCCGCGCCGC CGTCCCCTTC TCCATCTCCA 1701 GCCTCGGGGC TGCCGCAGGG GGACGGCTGC CTTCGGGGGG GACGGGGCAG 1751 GGCGGGGTTC GGCTTCTGGC GTGTGACCGG CGGCTCTAGA GCCTCTGCTA 1801 ACCATGTTCA TGCCTTCTTC TTTTTCCTAC AGCTCCTGGG CAACGTGCTG 1851 GTTATTGTGC TGTCTCATCA TTTTGGCAAA GAATTCTAAT ACGACTCACT 1901 ATAGGGAGAC CCAAGCTGGC TAGCCAAAGC TTCCACCATG GCGGGGCTCT 1951 GGCTGGGGCT CGTGTGGCAG AAGCTGCTGC TGTGGGGCGC GGCGAGTGCC 2001 CTTTCCCTGG CCGGCGCCAG TCTGGTCCTG AGCCTGCTGC AGAGGGTGGC 2051 GAGCTACGCG CGGAAATGGC AGCAGATGCG GCCCATCCCC ACGGTGGCCC 2101 GCGCCTACCC ACTGGTGGGC CACGCGCTGC TGATGAAGCC GGACGGGCGA 2151 GAATTTTTTC AGCAGATCAT TGAGTACACA GAGGAATACC GCCACATGCC 2201 GCTGCTGAAG CTCTGGGTCG GGCCAGTGCC CATGGTGGCC CTTTATAATG 2251 CAGAAAATGT GGAGGTAATT TTAACTAGTT CAAAGCAAAT TGACAAATCC 2301 TCTATGTACA AGTTTTTAGA ACCATGGCTT GGCCTAGGAC TTCTTACAAG 2351 TACTGGAAAC AAATGGCGCT CCAGGAGAAA GATGTTAACA CCCACTTTCC 2401 ATTTTACCAT TCTGGAAGAT TTCTTAGATA TCATGAATGA ACAAGCAAAT 2451 ATATTGGTTA AGAAACTTGA AAAACACATT AACCAAGAAG CATTTAACTG 2501 CTTTTTTTAC ATCACTCTTT GTGCCTTAGA TATCATCTGT GAAACAGCTA 2551 TGGGGAAGAA TATTGGTGCT CAAAGTAATG ATGATTCCGA GTATGTCCGT 2601 GCAGTTTATA GAATGAGTGA GATGATATTT CGAAGAATAA AGATGCCCTG 2651 GCTTTGGCTT GATCTCTGGT ACCTTATGTT TAAAGAAGGA TGGGAACACA 2701 AAAAGAGCCT TAAGATCCTA CATACTTTTA CCAACAGTGT CATCGCGGAA 2751 CGGGCCAATG AAATGAACGC CAATGAAGAC TGTAGAGGTG ATGGCAGGGG 2801 CTCTGCCCCC TCCAAAAATA AACGCAGGGC CTTTCTTGAC TTGCTTTTAA 2851 GTGTGACTGA TGACGAAGGG AACAGGCTAA GTCATGAAGA TATTCGAGAA 2901 GAAGTTGACA CCTTCATGTT TGAGGGGCAC GATACAACTG CAGCTGCAAT 2951 AAACTGGTCC TTATACCTGT TGGGTTCTAA CCCAGAAGTC CAGAAAAAAG 3001 TGGATCATGA ATTGGATGAC GTGTTTGGGA AGTCTGACCG TCCCGCTACA 3051 GTAGAAGACC TGAAGAAACT TCGGTATCTG GAATGTGTTA TTAAGGAGAC 3101 CCTTCGCCTT TTTCCTTCTG TTCCTTTATT TGCCCGTAGT GTTAGTGAAG 3151 ATTGTGAAGT GGCAGGTTAC AGAGTTCTAA AAGGCACTGA AGCCGTCATC 3201 ATTCCCTATG CATTGCACAG AGATCCGAGA TACTTCCCCA ACCCCGAGGA 3251 GTTCCAGCCT GAGCGGTTCT TCCCCGAGAA TGCACAAGGG CGCCATCCAT 3301 ATGCCTACGT GCCCTTCTCT GCTGGCCCCA GGAACTGTAT AGGTCAAAAG 3351 TTTGCTGTGA TGGAAGAAAA GACCATTCTT TCGTGCATCC TGAGGCACTT 3401 TTGGATAGAA TCCAACCAGA AAAGAGAAGA GCTTGGTCTA GAAGGACAGT 3451 TGATTCTTCG TCCAAGTAAT GGCATCTGGA TCAAGTTGAA GAGGAGAAAT 3501 GCAGATGAAC GCTAAGCGGC CGCAACTCGA GACTCTAGAG GTTAATCGAT 3551 AATCAACCTC TGGATTACAA AATTTGTGAA AGATTGACTG GTATTCTTAA 3601 CTATGTTGCT CCTTTTACGC TATGTGGATA CGCTGCTTTA ATGCCTTTGT 3651 ATCATGCTAT TGCTTCCCGT ATGGCTTTCA TTTTCTCCTC CTTGTATAAA 3701 TCCTGGTTGC TGTCTCTTTA TGAGGAGTTG TGGCCCGTTG TCAGGCAACG 3751 TGGCGTGGTG TGCACTGTGT TTGCTGACGC AACCCCCACT GGTTGGGGCA 3801 TTGCCACCAC CTGTCAGCTC CTTTCCGGGA CTTTCGCTTT CCCCCTCCCT 3851 ATTGCCACGG CGGAACTCAT CGCCGCCTGC CTTGCCCGCT GCTGGACAGG 3901 GGCTCGGCTG TTGGGCACTG ACAATTCCGT GGTGTTGTCG GGGAAATCAT
3951 CGTCCTTTCC TTGGCTGCTC GCCTGTGTTG CCACCTGGAT TCTGCGCGGG 4001 ACGTCCTTCT GCTACGTCCC TTCGGCCCTC AATCCAGCGG ACCTTCCTTC 4051 CCGCGGCCTG CTGCCGGCTC TGCGGCCTCT TCCGCGTCTT CGCCTTCGCC 4101 CTCAGACGAG TCGGATCTCC CTTTGGGCCG CCTCCCCGCA TCGAAACCCG 4151 CTGACTAGAC GACTGTGCCT TCTAGTTGCC AGCCATCTGT TGTTTGCCCC 4201 TCCCCCGTGC CTTCCTTGAC CCTGGAAGGT GCCACTCCCA CTGTCCTTTC 4251 CTAATAAAAT GAGGAAATTG CATCGCATTG TCTGAGTAGG TGTCATTCTA 4301 TTCTGGGGGG TGGGGTGGGG CAGGACAGCA AGGGGGAGGA TTGGGAAGAC 4351 AATAGCAGGC ATGCTGGGGA TGCGGTGGGC TCTATGGCCG CGGGCCGCAG 4401 GAACCCCTAG TGATGGAGTT GGCCACTCCC TCTCTGCGCG CTCGCTCGCT 4451 CACTGAGGCC GGGCGACCAA AGGTCGCCCG ACGCCCGGGC TTTGCCCGGG 4501 CGGCCTCAGT GAGCGAGCGA GCGCGCAGCT GCCTGCAGG SEQ ID NO: 63 – Sequência de cassete de expressão de CYP4V2 em AAV5.CYP4V2op (novo). AAV5.CYP4V2op (novo) tem as mesmas se- quências de promotor (CAG), potenciador (WPRE) e poliA (poliA bGH) e as mesmas de junção/ligante que AAV5.CYP4V2st (SEQ ID NO: 61) e AAV8.CYP4V2fv (SEQ ID NO: 62) mas sequências de cDNA de CYP4V2 diferentes: ITR esquerda: 1-141 Promotor CAG: 166-1880 cDNA CYP4V2op: 1938-3515 Potenciador WPRE: 3551-4139 poliA bGH: 4163-4387 ITR direita: 4399-4539
CCTGCAGGCA GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGC CCGGGCAAAG CCCGGGCGTC GGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAGTGA GCGAGCGAGC GCGCAGAGAG GGAGTGGCCA ACTCCATCAC TAGGGGTTCC TGCGGCCTAA GGCAATTGAG ATCTCGACAT TGATTATTGA CTAGTTATTA ATAGTAATCA ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT ATGGAGTTCC GCGTTACATA ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT AATGACGTAT GTTCCCATAG TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA CTATTTACGG TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT ACATGACCTT ATGGGACTTT CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA CCATGGGTCG AGGTGAGCCC CACGTTCTGC TTCACTCTCC CCATCTCCCC CCCCTCCCCA CCCCCAATTT TGTATTTATT TATTTTTTAA TTATTTTGTG CAGCGATGGG GGCGGGGGGG GGGGGGGCGC GCGCCAGGCG GGGCGGGGCG GGGCGAGGGG CGGGGCGGGG CGAGGCGGAG AGGTGCGGCG GCAGCCAATC AGAGCGGCGC GCTCCGAAAG TTTCCTTTTA TGGCGAGGCG GCGGCGGCGG CGGCCCTATA AAAAGCGAAG CGCGCGGCGG GCGGGAGTCG CTGCGTTGCC TTCGCCCCGT GCCCCGCTCC GCGCCGCCTC GCGCCGCCCG CCCCGGCTCT GACTGACCGC GTTACTCCCA CAGGTGAGCG GGCGGGACGG CCCTTCTCCT CCGGGCTGTA ATTAGCGCTT GGTTTAATGA CGGCTCGTTT CTTTTCTGTG GCTGCGTGAA AGCCTTAAAG GGCTCCGGGA GGGCCCTTTG TGCGGGGGGG AGCGGCTCGG GGGGTGCGTG CGTGTGTGTG TGCGTGGGGA GCGCCGCGTG CGGCCCGCGC TGCCCGGCGG CTGTGAGCGC TGCGGGCGCG GCGCGGGGCT TTGTGCGCTC CGCGTGTGCG CGAGGGGAGC GCGGCCGGGG GCGGTGCCCC GCGGTGCGGG GGGGCTGCGA GGGGAACAAA GGCTGCGTGC GGGGTGTGTG CGTGGGGGGG TGAGCAGGGG GTGTGGGCGC GGCGGTCGGG CTGTAACCCC CCCCTGCACC CCCCTCCCCG AGTTGCTGAG CACGGCCCGG CTTCGGGTGC GGGGCTCCGT GCGGGGCGTG GCGCGGGGCT CGCCGTGCCG GGCGGGGGGT GGCGGCAGGT GGGGGTGCCG GGCGGGGCGG GGCCGCCTCG GGCCGGGGAG GGCTCGGGGG AGGGGCGCGG CGGCCCCGGA GCGCCGGCGG CTGTCGAGGC GCGGCGAGCC GCAGCCATTG CCTTTTATGG TAATCGTGCG AGAGGGCGCA GGGACTTCCT TTGTCCCAAA TCTGGCGGAG CCGAAATCTG GGAGGCGCCG CCGCACCCCC TCTAGCGGGC GCGGGCGAAG CGGTGCGGCG CCGGCAGGAA GGAAATGGGC GGGGAGGGCC TTCGTGCGTC GCCGCGCCGC CGTCCCCTTC TCCATCTCCA GCCTCGGGGC TGCCGCAGGG GGACGGCTGC CTTCGGGGGG GACGGGGCAG GGCGGGGTTC GGCTTCTGGC GTGTGACCGG CGGCTCTAGA GCCTCTGCTA ACCATGTTCA TGCCTTCTTC TTTTTCCTAC AGCTCCTGGG CAACGTGCTG GTTATTGTGC TGTCTCATCA TTTTGGCAAA GAATTCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAC CCAAGCTGGC TAGCCAAAGC TTCCACC ATGGCTGGACTGTGGCTGGGACTGGTGTGGCAGAAACTGCTGCTGTGGGGGGCCGCTTCCG- CACTGTCACTGGCTGGGGCTTCACTGGTGCTGAGCCTGCTGCAGAGGGTGGCCTCCTACG- CCAGAAAGTGGCAGCAGATGAGGCCCATCCCTACCGTGGCCAGAGCCTATCCACTGGTGG- GACACGCACTGCTGATGAAGCCTGACGGCAGAGAGTTCTTTCAGCAGATCATCGAGTACA- CAGAGGAGTATAGGCACATGCCACTGCTGAAGCTGTGGGTGGGACCCGTGCCTATGGTGG- CCCTGTACAACGCCGAGAATGTGGAAGTGATCCTGACCAGCAGCAAGCAGATCGATAAGTC- TAGCATGTATAAGTTCCTGGAGCCTTGGCTGGGCCTGGGCCTGCTGACCTCTACAGGCAA- CAAGTGGAGGAGCCGGAGAAAGATGCTGACCCCAACATTCCACTTTACAATCCTGGAGGAC- TTCCTGGACATCATGAACGAGCAGGCCAATATCCTGGTGAAGAAGCTGGAGAAGCACAT- CAACCAGGAGGCCTTTAATTGCTTCTTTTACATCACCCTGTGCGCCCTGGACATCATCTG- TGAGACAGCTATGGGCAAGAACATCGGCGCCCAGTCTAATGACGATAGCGAGTACGTG- CGGGCCGTGTATAGAATGAGCGAGATGATCTTTAGGCGCATCAAGATGCCCTGGCTGTGG- CTGGATCTGTGGTATCTGATGTTCAAGGAGGGCTGGGAGCACAAGAAGTCCCTGCAGA- TCCTGCACACCTTTACAAACTCTGTGATCGCCGAGAGAGCCAATGAGATGAACGCCAA- TGAGGACTGTAGGGGCGATGGAAGGGGCAGCGCCCCTTCCAAGAACAAGCGGAGAGCCTT- CCTGGACCTGCTGCTGAGCGTGACCGACGATGAGGGCAATCGCCTGTCCCACGAGGACA- TCCGGGAGGAGGTGGATACATTCATGTTTGAGGGACACGACACCACAGCCGCCGCCAT- CAACTGGTCCCTGTACCTGCTGGGCTCTAATCCAGAGGTGCAGAAGAAGGTGGATCACGAG- CTGGACGACGTGTTCGGCAAGTCCGACAGGCCAGCAACCGTGGAGGATCTGAAGAAGCTGA- GATACCTGGAGTGCGTGATCAAGGAGACACTGCGCCTGTTCCCCTCTGTGCCTCTGTTTG- CCCGGTCCGTGTCTGAGGACTGTGAGGTGGCCGGCTATCGCGTGCTGAAGGGCACCGAGG- CCGTGATCATCCCTTACGCCCTGCACCGGGACCCCAGGTATTTCCCTAACCCAGAGGAG- TTTCAGCCAGAGAGATTCTTTCCCGAGAATGCCCAGGGCAGGCACCCTTACGCCTATGTG- CCATTCTCCGCCGGACCAAGGAACTGCATCGGACAGAAGTTTGCCGTGATGGAGGA- GAAAACCATCCTGTCTTGTATCCTGAGACACTTCTGGATCGAGAGCAATCAGAAGAGGGAG- GAGCTGGGCCTGGAGGGACAGCTGATCCTGCGGCCAAGCAACGGCATCTGGATCAAAC- TGAAAAGAAGGAACGCTGACGAGAGGTAAGCGGC CGCAACTCGA GACTCTAGAG GTTA- ATCGAT AATCAACCTC TGGATTACAA AATTTGTGAA AGATTGACTG GTATTCTTAA CTATGTTGCT CCTTTTACGC TATGTGGATA CGCTGCTTTA ATGCCTTTGT ATCATGCTAT TGCTTCCCGT ATGGCTTTCA TTTTCTCCTC CTTGTATAAA TCCTGGTTGC TGTCTCTTTA TGAGGAGTTG TGGCCCGTTG TCAGGCAACG TGGCGTGGTG TGCACTGTGT TTGCTGACGC AACCCCCACT GGTTGGGGCA TTGCCACCAC CTGTCAGCTC CTTTCCGGGA CTTTCGCTTT CCCCCTCCCT ATTGCCACGG CGGAACTCAT CGCCGCCTGC CTTGCCCGCT GCTGGACAGG GGCTCGGCTG TTGGGCACTG ACAATTCCGT GGTGTTGTCG GGGAAATCAT CGTCCTTTCC TTGGCTGCTC GCCTGTGTTG CCACCTGGAT TCTGCGCGGG ACGTCCTTCT GCTACGTCCC TTCGGCCCTC AATCCAGCGG ACCTTCCTTC CCGCGGCCTG CTGCCGGCTC TGCGGCCTCT TCCGCGTCTT CGCCTTCGCC CTCAGACGAG TCGGATCTCC CTTTGGGCCG CCTCCCCGCA TCGAAACCCG CTGACTAGAC GACTGTGCCT TCTAGTTGCC AGCCATCTGT TGTTTGCCCC TCCCCCGTGC CTTCCTTGAC CCTGGAAGGT GCCACTCCCA CTGTCCTTTC CTAATAAAAT GAGGAAATTG CATCGCATTG TCTGAGTAGG TGTCATTCTA TTCTGGGGGG TGGGGTGGGG CAGGACAGCA AGGGGGAGGA TTGGGAAGAC AATAGCAGGC ATGCTGGGGA TGCGGTGGGC TCTATGGCCG CGGGCCGCAG GAACCCCTAG TGATGGAGTT GGCCACTCCC TCTCTGCGCG CTCGCTCGCT CACTGAGGCC GGGCGACCAA AGGTCGCCCG ACGCCCGGGC TTTGCCCGGG
CGGCCTCAGT GAGCGAGCGA GCGCGCAGCT GCCTGCAGG SEQ ID NO: 64 – Sequência de cassete de expressão de CYP4V2 em scAAV1.CYP4V2op, scAAV5.CYP4V2op e scAAV9.CYP4V2op. ITR esquerda (truncada): 1-117 Promotor EFS: 130-364 cDNA CYP4V2op: 520-2097 SPA: 2116-2169 ITR direita: 2263-2403 1 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccggg- caaag cccgggcgtc 61 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgca- gagag ggagtggacg 121 cgtaggcctg attggctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcaca- tcgc ccacagtccc 181 cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg aaccggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt 241 aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc 301 gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacggg- tttg ccgccagaac 361 acaggtgtcg tgacgcgacc aggtatgcat ctgcagctct aaggtaa- ata taaaattttt 421 aagtgtataa tgtgttaaac tactgattct aattgtttct ctcttt- taga ttccaacctt 481 tggaactgac tgcagggatc caagctttct agagccacca tggctg- gact gtggctggga 541 ctggtgtggc agaaactgct gctgtggggg gccgcttccg cactgt- cact ggctggggct 601 tcactggtgc tgagcctgct gcagagggtg gcctcctacg cca- gaaagtg gcagcagatg 661 aggcccatcc ctaccgtggc cagagcctat ccactggtgg gacacg- cact gctgatgaag 721 cctgacggca gagagttctt tcagcagatc atcgagtaca cagagga- gta taggcacatg 781 ccactgctga agctgtgggt gggacccgtg cctatggtgg ccctgta- caa cgccgagaat 841 gtggaagtga tcctgaccag cagcaagcag atcgataagt ctag- catgta taagttcctg 901 gagccttggc tgggcctggg cctgctgacc tctacaggca acaagtg- gag gagccggaga 961 aagatgctga ccccaacatt ccactttaca atcctggagg actt- cctgga catcatgaac 1021 gagcaggcca atatcctggt gaagaagctg gagaagcaca tcaacca- gga ggcctttaat 1081 tgcttctttt acatcaccct gtgcgccctg gacatcatct gtgaga- cagc tatgggcaag 1141 aacatcggcg cccagtctaa tgacgatagc gagtacgtgc gggccg- tgta tagaatgagc 1201 gagatgatct ttaggcgcat caagatgccc tggctgtggc tgga- tctgtg gtatctgatg 1261 ttcaaggagg gctgggagca caagaagtcc ctgcagatcc tgcacac- ctt tacaaactct
1321 gtgatcgccg agagagccaa tgagatgaac gccaatgagg actg- tagggg cgatggaagg 1381 ggcagcgccc cttccaagaa caagcggaga gccttcctgg acctg- ctgct gagcgtgacc 1441 gacgatgagg gcaatcgcct gtcccacgag gacatccggg aggagg- tgga tacattcatg 1501 tttgagggac acgacaccac agccgccgcc atcaactggt ccctg- tacct gctgggctct 1561 aatccagagg tgcagaagaa ggtggatcac gagctggacg acgtgtt- cgg caagtccgac 1621 aggccagcaa ccgtggagga tctgaagaag ctgagatacc tggagtg- cgt gatcaaggag 1681 acactgcgcc tgttcccctc tgtgcctctg tttgcccggt ccgtg- tctga ggactgtgag 1741 gtggccggct atcgcgtgct gaagggcacc gaggccgtga tcatccctta cgccctgcac 1801 cgggacccca ggtatttccc taacccagag gagtttcagc cagaga- gatt ctttcccgag 1861 aatgcccagg gcaggcaccc ttacgcctat gtgccattct ccgccg- gacc aaggaactgc 1921 atcggacaga agtttgccgt gatggaggag aaaaccatcc tgtcttg- tat cctgagacac 1981 ttctggatcg agagcaatca gaagagggag gagctgggcc tggagg- gaca gctgatcctg 2041 cggccaagca acggcatctg gatcaaactg aaaagaagga acgctga- cga gaggtaaaag 2101 cttgaattcc tcgaggatcc aataaaagat ctttattttc attaga- tctg tgtgttggtt 2161 ttttgtgtgt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccg- tgcc ttccttgacc 2221 ctggaaggtg ccactcccag tttaaactta attaagggcc gcagga- accc ctagtgatgg 2281 agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccggg- cga ccaaaggtcg 2341 cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcg- cgc agctgcctgc 2401 agg

Claims (334)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição para tratamento ou prevenção de uma do- ença ocular em um indivíduo humano caracterizada pelo fato de que compreende um vetor, o vetor compreendendo um cassete de expres- são, o cassete de expressão compreendendo uma molécula de ácido nucleico ou uma variante não patogênica da mesma codificando uma proteína CYP4V2 funcional ou não mutante operavelmente ligada a uma ou mais sequência reguladora, em que a doença é associada com a disfunção, distrofia, distúrbio, degeneração, atrofia e/ou morte de células oculares.
2. Composição para prevenção, parada, diminuição da pro- gressão de, tratamento ou melhora da disfunção, distrofia, distúrbio, degeneração, atrofia e/ou morte de uma célula ocular caracterizada pelo fato de que compreende um vetor, o vetor compreendendo um cassete de expressão, o cassete de expressão compreendendo uma molécula de ácido nucleico ou uma variante não patogênica da mesma codificando uma proteína CYP4V2 funcional ou não mutante opera- velmente ligada a uma ou mais sequência reguladora.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ca- racterizada pelo fato de que a doença ocular ou degeneração de célula ocular é uma degeneração retinal herdada (IRD) ou retinite pigmento- sa (RP) com mutação bialélica no gene CYP4V2.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, ca-racterizada pelo fato de que a doença é degeneração de célula ocular em associação com Distrofia Cristalina de Bietti (também co- nhecida como Distrofia Cristalina Corneorretinal de Bietti; BCD).
5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o vetor é um vetor viral, um plasmídeo ou um vetor não viral.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracteri-
zada pelo fato de que o vetor viral é selecionado do grupo consistindo em um vetor de vírus adenoassociado, um vetor de adenovírus, um vetor de lentivírus, um vetor de vírus herpes simples, um vetor de ba- culovírus, um vetor de vírus Sendai e um vetor de retrovírus.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, ca- racterizada pelo fato de que o vetor é um vetor de AAV recombinante (rAAV).
8. Composição, de acordo com a reivindicação 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que o genoma de AAV ou a proteína do capsídeo de AAV no rAAV é de qualquer um de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 ou um outro sorotipo ou isolato ou Glade de AAV ou qualquer derivado, variante ou híbrido do mesmo.
9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 5 a 8, caracterizada pelo fato de que o rAAV é um AAV pseu- dotipificado (por exemplo, AAV2/5, AAV2/8, AAV2/1, AAV2/9, AAV2/6, AAV2/4, AAV2/6, AAV5/2, AAV8/1, AAV8/2, AAV2/7, AAV2/12 andA- AV2/10) ou um AAV híbrido (por exemplo, AAV-DJ, AAV-DJ/8 ou AAV- DJ/9).
10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 5 a 9, caracterizada pelo fato de que o rAAV compreende uma ou mais mutações de capsídeo (por exemplo, mutações Y-F, K-R, T-A, S-A e/ou T-V (por exemplo, AAV2 com uma ou mais mutações de cap- sídeo dentre Y444F, Y500F, Y730F, Y252F, Y272F, Y700F, Y704F e T491V, ou a mutação correspondente para um sorotipo de AAV dife- rente (por exemplo, AAV2 (Y444F +Y500F+Y730F), AAV2 (quadY- F+T-V) ou AAV2/8 (Y733F)))).
11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 5 a 10, caracterizada pelo fato de que o sorotipo do rAAV é selecionado ou derivado do grupo consistindo em AAV1, AAV2, AAV3,
AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Anc80, rh10 e/ou ShH10.
12. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 5 a 11, caracterizada pelo fato de que o rAAV é selecionado ou derivado do grupo consistindo em AAV2/5, AAV2/8, AAV2/2, AAV2 (Y444F+Y500F+Y730F), AAV2/1, AAV2/9, AAV2/8(Y733F), AAV2/6, AAV2/4, AAV2/7, AAV5, AAV2, AAV8, AAV1, AAV9, AAV6, AAV10, AAV4, AAV7, AAV12, Anc80, AAV 7m8, AAV-DJ, ShH10, AAV-PHP.B ou um híbrido, um derivado ou variante do mesmo.
13. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 5 a 12, caracterizada pelo fato de que o vetor de rAAV é um vetor de AAV de filamento único ou um vetor de AAV autocomplemen- tar (scAAV).
14. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracte- rizada pelo fato de que o vetor é um plasmídeo, um ácido nucleico nu, lipossomos (por exemplo, lipossomos catiônicos ou aniônicos), den- drímeros, nanopartícula, polímeros (por exemplo, poliplexos), sistema de lipídeo-polímero, nanopartícula de lipídeo sólida ou lipoplexo de li- possomo protamina/DNA (LPD).
15. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizada pelo fato de que a proteína CYP4V2 funcional ou não mutante codificada pela sequência de ácido nucleico compreende um polipeptídeo tendo pelo menos 80% de iden- tidade de sequência de aminoácido (por exemplo, pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) com qualquer uma das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4-6.
16. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizada pelo fato de que a molécula de áci-
do nucleico tem pelo menos 75% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3.
17. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizada pelo fato de que a molécula de áci- do nucleico tem pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3.
18. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizada pelo fato de que a molécula de áci- do nucleico compreende uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3.
19. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizada pelo fato de que a molécula de áci- do nucleico compreende uma sequência otimizada no códon codifi- cando uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada da SEQ ID NO: 4, 5 ou 6.
20. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizada pelo fato a sequência reguladora compreende um promotor.
21. Composição, de acordo com a reivindicação 20, carac- terizada pelo fato de que o promotor é um promotor específico de célu- la de RPE, um promotor específico de célula retinal, um promotor es- pecífico de célula da córnea, um promotor específico de célula ocular ou um promotor constitutivo.
22. Composição, de acordo com a reivindicação 20, carac- terizada pelo fato de que o promotor é um promotor beta-actina ou um promotor viral ou um híbrido do mesmo.
23. Composição, de acordo com a reivindicação 20, carac- terizada pelo fato de que o promotor é selecionado do grupo consistin- do em um promotor CAG (promotor potenciador precoce CMV híbri- do/beta-actina da Galinha, também conhecido como promotor CA-
GGS, promotor CB ou promotor CBA), um promotor beta-actina da ga- linha, um promotor CBA pequeno (smCBA), um promotor CBSB, ou um promotor CBh, um outro promotor beta-actina tal como o promotor beta-actina humana, um promotor fator de alongamento 1 alfa curto (EFS), um promotor fator de alongamento 1 alfa (EF-1 alfa), um pro- motor CMV, um promotor PGK, um promotor UBC, um promotor GUSB, um promotor UCOE, um promotor VMD2 (distrofia macular vite- liforme 2; também conhecida como BEST1), um promotor RPE65 ou um híbrido, uma variante ou um derivado do mesmo.
24. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizada pelo fato de que a sequência regu- ladora é um sinal de poliA selecionado do grupo consistindo em sinal de poliadenilação de hormônio do crescimento bovino (poliA bGH), um sinal de poliA pequeno (SPA), um sinal de poliadenilação de hormônio do crescimento humano (poli hGH), um sinal de poliA de SV40, sinal de poliA de SV40 tardio ou um derivado, um híbrido ou uma variante do mesmo.
25. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizada pelo fato de que a sequência regu- ladora compreende uma sequência Kozak.
26. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizada pelo fato de que a sequência regu- ladora compreende um potenciador.
27. Composição, de acordo com a reivindicação 26, carac- terizada pelo fato de que o potenciador é um potenciador viral, incluin- do, sem limitação, um potenciador WPRE, um potenciador HPRE, um potenciador CTE ou um derivado ou híbrido ou variante do mesmo.
28. Composição para tratamento ou prevenção de BCD ou para produção de uma composição para tratamento ou prevenção de BCD caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico compartilhando pelo menos 80% de identidade de se- quência com qualquer uma da sequência de cassete de expressão de CYP4V2 em SEQ ID NOs: 60 a 64.
29. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizada pelo fato de que a composição é formulada com um veículo farmaceuticamente aceitável e componen- tes adicionais adequados para a via de administração específica.
30. Método de tratamento ou prevenção de uma doença ocular em um indivíduo humano, caracterizado pelo fato de que com- preende administrar um vetor ao indivíduo, em que o vetor compreen- de um cassete de expressão, o cassete de expressão compreendendo uma molécula de ácido nucleico ou uma variante não patogênica da mesma codificando uma proteína CYP4V2 funcional ou não mutante operavelmente ligada a uma ou mais sequência reguladora, em que a doença é associada com disfunção, distrofia, distúrbio, degeneração, atrofia e/ou morte de células oculares.
31. Método de prevenção, parada, diminuição da progres- são de, tratamento ou melhora da disfunção, distrofia, distúrbio, dege- neração, atrofia e/ou morte de uma célula ocular caracterizado pelo fato de que compreende administração de um vetor à célula ocular, em que vetor compreende um cassete de expressão, o cassete de ex- pressão compreendendo uma molécula de ácido nucleico ou uma va- riante não patogênica da mesma codificando uma proteína CYP4V2 funcional ou não mutante operavelmente ligada a uma ou mais se- quência reguladora.
32. Método, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, carac- terizado pelo fato de que as células oculares são células retinais, célu- las da córnea, células coroidais, células do epitélio pigmentar da retina (RPE), células fotorreceptoras e/ou células epiteliais coroidais.
33. Método, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, carac-
terizado pelo fato de que a doença ocular ou degeneração de célula ocular é uma degeneração retinal herdada (IRD) ou retinite pigmento- sa (RP) com mutação bialélica no gene CYP4V2.
34. Método, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, carac- terizado pelo fato de que a doença é a degeneração de célula ocular associada com Distrofia Cristalina de Bietti (também conhecida como Distrofia Cristalina Corneorretinal de Bietti; BCD).
35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 30 a 34, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor viral, um plasmídeo ou um vetor não viral.
36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracteriza- do pelo fato de que o vetor viral é selecionado do grupo consistindo em um vetor de vírus adenoassociado (AAV), um vetor de adenovírus, um vetor de lentivírus, um vetor de vírus herpes simples, um vetor de baculovírus, um vetor de vírus Sendai e um vetor de retrovírus.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracteriza- do pelo fato de que o vetor é um vetor de AAV recombinante (rAAV).
38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracteriza- do pelo fato de que o rAAV compreende um genoma de AAV ou um derivado do mesmo e/ou uma proteína do capsídeo de AAV ou um de- rivado ou variante da mesma.
39. Método, de acordo com a reivindicação 37 ou 38, carac- terizado pelo fato de que o rAAV é um AAV quimérico, um AAV emba- ralhado ou um AAV com capsídeo modificado.
40. Método de acordo com a reivindicação 36, 27, 38 ou 39, caracterizado pelo fato de que o genoma de AAV ou a proteína do capsídeo de AAV no rAAV é de qualquer um de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 ou um outro sorotipo ou isolato ou Glade de AAV ou qualquer derivado, variante ou híbrido do mesmo.
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 37 a 40, caracterizado pelo fato de que o rAAV é um AAV pseu- dotipificado (por exemplo, AAV2/5, AAV2/8, AAV2/1, AAV2/9, AAV2/6, AAV2/4, AAV2/6, AAV5/2, AAV8/1, AAV8/2, AAV2/7, AAV2/12 andA- AV2/10) ou um AAV híbrido (por exemplo, AAV-DJ, AAV-DJ/8 ou AAV- DJ/9).
42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 37 a 41, caracterizado pelo fato de que o rAAV compreende uma ou mais mutações de capsídeo (por exemplo, mutações Y-F, K-R, T-A, S-A e/ou T-V (por exemplo, AAV2 com uma ou mais mutações de cap- sídeo dentre Y444F, Y500F, Y730F, Y252F, Y272F, Y700F, Y704F e T491V, ou a mutação correspondente para um sorotipo de AAV dife- rente (por exemplo, AAV2 (Y444F +Y500F+Y730F), AAV2 (quadY- F+T-V) ou AAV2/8 (Y733F)))).
43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 37 a 42, caracterizado pelo fato de que o sorotipo do rAAV é se- lecionado ou derivado do grupo consistindo em AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Anc80, rh10 e/ou ShH10.
44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 37 a 42, caracterizado pelo fato de que o rAAV é selecionado ou derivado do grupo consistindo em AAV2/5, AAV2/8, AAV2/2, AAV2 (Y444F+Y500F+Y730F), AAV2/1, AAV2/9, AAV2/8(Y733F), AAV2/6, AAV2/4, AAV2/7, AAV5, AAV2, AAV8, AAV1, AAV9, AAV6, AAV10, AAV4, AAV7, AAV12, Anc80, AAV 7m8, AAV-DJ, ShH10, AAV-PHP.B ou um híbrido, um derivado ou variante do mesmo.
45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 37 a 44, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV é um ve- tor de AAV de filamento único ou um vetor de AAV autocomplementar (scAAV).
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 30 a 34, caracterizado pelo fato de que o vetor é um plasmídeo, um ácido nucleico nu, lipossomos (por exemplo, lipossomos catiônicos ou aniônicos), dendrímero, nanopartícula, polímeros (por exemplo, po- liplexos), sistema de lipídeo-polímero, nanopartícula de lipídeo sólida ou lipoplexo de lipossomo protamina/DNA (LPD).
47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 30 a 46, caracterizado pelo fato de que a proteína CYP4V2 funci- onal ou não mutante codificada pela sequência de ácido nucleico compreende um polipeptídeo tendo pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácido (por exemplo, pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) com qual- quer uma das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4-6.
48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 30 a 47, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nu- cleico tem pelo menos 75% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3.
49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 30 a 48, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nu- cleico tem pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3.
50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 30 a 49, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nu- cleico compreende uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3.
51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 30 a 50, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nu- cleico compreende uma sequência com códon otimizado codificando uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido selecio- nada de SEQ ID NO: 4, 5 ou 6.
52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 30 a 51, caracterizado pelo fato de que a sequência reguladora compreende um promotor.
53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracteriza- do pelo fato de que o promotor é um promotor específico de célula de RPE, um promotor específico de célula retinal, um promotor específico de célula da córnea, um promotor específico de célula ocular ou um promotor constitutivo.
54. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracteriza- do pelo fato de que o promotor é um promotor beta-actina ou um pro- motor viral ou um híbrido do mesmo.
55. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracteriza- do pelo fato de que o promotor é selecionado do grupo consistindo em um promotor CAG (promotor potenciador precoce CMV híbrido/beta- actina da Galinha, também conhecido como promotor CAGGS, promo- tor CB ou promotor CBA), um promotor beta-actina da galinha, um promotor CBA pequeno (smCBA), um promotor CBSB, ou um promo- tor CBh, um outro promotor beta-actina tal como o promotor beta- actina humana, um promotor fator de alongamento 1 alfa curto (EFS), um promotor fator de alongamento 1 alfa (EF-1 alfa), um promotor CMV, um promotor PGK, um promotor UBC, um promotor GUSB, um promotor UCOE, um promotor VMD2 (distrofia macular viteliforme 2; também conhecida como BEST1), um promotor RPE65 ou um híbrido, uma variante ou um derivado do mesmo.
56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 30 a 55, caracterizado pelo fato de que a sequência reguladora compreende um sinal de poliadenilação (poliA).
57. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracteriza-
do pelo fato de que o sinal de poliA é um sinal de poliadenilação de hormônio do crescimento bovino (poliA bGH), um sinal de poliA pe- queno (SPA), um sinal de poliadenilação de hormônio do crescimento humano (poli hGH), um sinal de poliA de SV40, sinal de poliA de SV40 tardio ou um derivado, um híbrido ou uma variante do mesmo.
58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 30 a 57, caracterizado pelo fato de que a sequência reguladora compreende uma sequência Kozak.
59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 30 a 57, caracterizado pelo fato de que a sequência reguladora compreende um potenciador.
60. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracteriza- do pelo fato de que o potenciador é um potenciador viral, incluindo, sem limitação, um potenciador WPRE, um potenciador HPRE, um po- tenciador CTE ou um derivado ou híbrido ou variante do mesmo.
61. Método para tratamento ou prevenção de BCD caracte- rizado pelo fato de que compreende administrar um vetor compreen- dendo uma molécula de ácido nucleico compartilhando pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma da sequência de cassete de expressão de CYP4V2 nas SEQ ID NOs: 60 a 64.
62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 30 a 61, caracterizado pelo fato de que a composição é formula- da com um veículo farmaceuticamente aceitável e componentes adici- onais adequados para a via de administração específica.
63. Composição para uso na produção de um vetor para tratamento ou prevenção de BCD, caracterizada pelo fato de que a composição compreende uma molécula de ácido nucleico compreen- dendo pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma da sequência do cassete de expressão de CYP4V2 nas SEQ ID NOs: 60 a 64.
64. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 30 a 63, caracterizado pelo fato de que para tratamento in vitro, a célula-alvo é infectada em uma dose (MOI) de cerca de 1 x 10^3 GC a cerca de 1 x 10^6 GC por célula (GC: cópias genômicas, genoma de medição contendo partículas de AAV).
65. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 30 a 64, caracterizado pelo fato de que para administração in vi- vo ao olho de um indivíduo, uma administração única pode ser da or- dem de a partir de cerca de 1 x 10^6 a 2 x 10^13 GC (por exemplo, uma faixa de dose alta de cerca de 1 x 10^11 GC a cerca de 1 x 10^12 GC, uma faixa de dose média de cerca de 1 x 10^10 GC a cerca de 1 x 10^11 GC, uma faixa de dose baixa de cerca de 1 x 10^9 GC a cerca de 1 x 10^10 GC, uma faixa de dose muito baixa de cerca de 1 x 10^6 GC a cerca de 1 x 10^9 GC e uma faixa de dose muito alta de cerca de 1 x 10^12 GC a cerca de 2 x 10^13 GC) ou qualquer dose dentro dessas faixas que seja suficiente para prover o efeito desejado.
66. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 30 a 65, caracterizado pelo fato de que a etapa de administração acontece antes do início dos sintomas da doença ou após o início dos sintomas da doença.
67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 30 a 66, caracterizado pelo fato de que a administração e/ou ad- ministração direcionada é ao olho e/ou a uma célula ocular.
68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 30 a 67, caracterizado pelo fato de que a administração é através de injeção sub-retinal, injeção intravítrea ou através de implante intra- vítreo de um dispositivo encapsulando o vetor.
69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 30 a 68, caracterizado pelo fato de que a administração é através de qualquer outro método de administração que eficazmente adminis-
tre os vetores ao local sub-retinal, ao segmento posterior do olho, à córnea, à retina, à coroide, às células do RPE, aos fotorreceptores ou às células epiteliais da córnea, às células de CE do indivíduo.
70. Método, de acordo com a reivindicação 67, caracteriza- do pelo fato de que a administração ao olho é obtida através da admi- nistração através da corrente sanguínea.
71. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que as células oculares são selecionadas do grupo consistindo em células do epitélio pigmen- tar da retina (RPE), células fotorreceptoras (PRCs), células epiteliais da córnea (CECs), células endoteliais coroidais (CE), células retinais, células da córnea, células da lente, células de gânglio, células do ner- vo óptico e/ou células coroidais, bem como os ditos tipos de células derivadas de uma célula-tronco (incluindo, sem limitação, uma iPSC, uma célula ES, uma MSC, uma célula-tronco adulta e/ou uma célula- tronco específica de tecido).
72. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 30 a 71, caracterizado pelo fato de que o vetor é formulado com um veículo farmaceuticamente aceitável e componentes adicionais adequados para a via de administração específica.
73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 30 a 72, caracterizado pelo fato de que compreende ainda identi- ficação de um indivíduo tendo BCD ou sob risco de desenvolver BCD ou tendo mutação de CYP4V2 bialélica.
74. Método de tratamento ou prevenção de Distrofia Crista- lina de Bietti (BCD) em um indivíduo humano, caracterizado pelo fato de que compreende administrar às células oculares do indivíduo um vetor compreendendo uma molécula de ácido nucleico compreenden- do a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2 codificando uma proteína CYP4V2 humana ou uma sequência de ácido nucleico com-
partilhando pelo menos 90% de identidade de sequência com a se- quência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, operavelmente ligada a uma ou mais sequência reguladora.
75. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracteriza- do pelo fato de que o vetor é um vetor de vírus adenoassociado (AAV).
76. Método, de acordo com as reivindicações 74 e 75, ca- racterizado pelo fato de que a sequência reguladora é um promotor.
77. Molécula de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2 codi- ficando uma proteína CYP4V2 humana ou uma sequência de ácido nucleico compartilhando pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2.
78. Cassete de expressão caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindica- ção 77 e uma ou mais sequência reguladora operavelmente ligada à tal sequência de ácido nucleico.
79. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende a mo- lécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 77 ou o casse- te de expressão como definido na reivindicação 78.
80. Vetor, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor viral ou é selecionado do grupo consistindo em um vetor de vírus adenoassociado recombinante (rA- AV), um vetor de adenovírus recombinante, um vetor de lentivírus re- combinante, um vetor de vírus herpes simples recombinante, um vetor de baculovírus recombinante, um vetor de vírus Sendai recombinante e um vetor de retrovírus recombinante.
81. Vetor, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor de plasmídeo ou um não viral.
82. Vetor, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que o vetor não viral é selecionado de um ácido nucleico nu, lipossomos (por exemplo, lipossomos catiônicos ou aniônicos), dendrímeros, nanopartícula, polímeros (por exemplo, poliplexos), sis- tema de lipídeo-polímero, nanopartícula de lipídeo sólida ou lipoplexo de lipossomo protamina/DNA (LPD).
83. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que com- preende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 77 e/ou o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 79 a 82.
84. Método para reduzir respostas imunes a vetores virais, preservar eficiência de transdução, diminuir dose de vetor viral e/ou imunossupressor e/ou maximizar efeito terapêutico para diferentes pa- cientes da mesma doença genética, em terapia genética mediada por vetor viral, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) estabelecimento de um grupo de mais de um vetor viral recombinante (por exemplo, rAAVs) com eficiência de transdução sufi- ciente no tipo de célula-alvo para a terapia genética através da criação de variantes com mutações de região antigênica ou outras mutações ou variantes nos capsídeos dos ditos vetores virais após tais mutações ou variações serem confirmadas com eficiência de transdução sufici- ente nas células-alvo relevantes para a doença (por exemplo, em li- nhagens celulares iPS-RPE ou RPE para terapia genética com CYP4V2 para BCD); (b) detecção de anticorpos de vetor antiviral de neutraliza- ção preexistentes (NAbs) contra sorotipos de vetor viral diferentes e/ou mutações ou variantes de capsídeo no indivíduo com necessidade da terapia genética, e/ou teste e comparação de vetores virais diferentes em células específicas do paciente (por exemplo, células iPS-RPE) derivadas de tal indivíduo; (c) seleção de um vetor viral a partir do dito grupo de veto- res virais com (i) eficiência de transdução suficiente nas células-alvo doentes e (ii) reatividade cruzada baixa com os NAbs preexistentes no indivíduo e/ou (iii) bom resultado de resgate de fenótipo nas células- alvo doentes específicas de paciente do indivíduo (por exemplo, linha- gens celulares iPS-RPE ou RPE para terapia genética com CYP4V2 para BCD), em que tal grupo de vetor viral compreende vetores virais de sorotipos diferentes e/ou com capsídeo modificado (por exemplo, incluindo, sem limitação, AAVs com capsídeo mutante e/ou AAVs com variante de proteína do capsídeo). (d) uso do vetor viral selecionado de (c) para administração ao indivíduo; e (e) repetição de (b) a (d) (apenas a parte relacionada a NAbs preexistentes) antes de cada vez que o indivíduo necessitar uma administração de terapia genética, incluindo, sem limitação, uma ad- ministração de acompanhamento para o órgão (por exemplo, um olho ou um olho contralateral) ou a um outro órgão.
85. Método de uso de terapia genética mediada por vetor de AAV em tratamento ou prevenção de doenças retinais humanas caracterizado pelo fato de que o vetor de AAV compreende uma molé- cula de ácido nucleico compreendendo um promotor EFS (SEQ ID NO: 35) e/ou um poliA pequeno (SEQ ID NO: 36) operavelmente ligado ao transgene terapêutico ou uma molécula de ácido nucleico compartilha pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 35 ou pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36.
86. Método, de acordo com a reivindicação 85, caracteriza- do pelo fato de que o vetor de AAV é um AAV de filamento único.
87. Método, de acordo com a reivindicação 85, caracteriza- do pelo fato de que o vetor de AAV é um AAV autocomplementar (scAAV).
88. Modelo de doença celular caracterizado pelo fato de que compreende uma composição de linhagem celular compreenden-
do (a) uma célula-tronco provida a partir de um indivíduo ou reprogra- mada a partir de uma célula provida a partir de um indivíduo ou (2) uma célula derivada de uma célula-tronco provida a partir de um indi- víduo ou reprogramada a partir de uma célula provida a partir de um indivíduo compreendendo uma ou mais mutações em um gene-alvo.
89. Composição, de acordo com a reivindicação 88, carac- terizada pelo fato de que a célula-tronco é uma célula-tronco pluripo- tente induzida (iPS).
90. Composição, de acordo com a reivindicação 88, carac- terizada pelo fato de que a célula-tronco é uma célula-tronco embriôni- ca (ES), célula-tronco somática (ou adulta), célula-tronco específica de tecido ou célula-tronco mesenquimal (MSC).
91. Composição, de acordo com a reivindicação 88, carac- terizada pelo fato de que a célula provida a partir de um indivíduo é uma célula somática.
92. Composição, de acordo com a reivindicação 88, carac- terizada pelo fato de que a célula provida a partir de um indivíduo é uma célula de pele, um fibroblasto ou uma célula sanguínea.
93. Composição, de acordo com a reivindicação 88 ou 92, caracterizada pelo fato de que a célula provida a partir de um indivíduo é um fibroblasto de pele ou uma célula mononuclear de sangue perifé- rico (PBMC).
94. Composição, de acordo com a reivindicação 88, carac- terizada pelo fato de que a célula provida a partir de um indivíduo é uma célula urinária, uma célula epitelial renal, um folículo piloso ou uma célula papilar dermal.
95. Composição, de acordo com a reivindicação 88, carac- terizada pelo fato de que a célula derivada de uma célula-tronco é uma célula ocular.
96. Composição, de acordo com a reivindicação 95, carac-
terizada pelo fato de que a célula ocular é uma célula do epitélio pig- mentar da retina (RPE), célula fotorreceptora (PRC, incluindo célula bastão, célula cone e célula progenitora fotorreceptora), célula retinal, célula da córnea, célula epitelial da córnea (CEC), célula do nervo óp- tico, célula da lente, célula endotelial coroidal (CE), célula do nervo óptico ou célula coroidal.
97. Composição, de acordo com a reivindicação 88, carac- terizada pelo fato de que a célula derivada de uma célula-tronco é uma célula de neurônio.
98. Composição, de acordo com a reivindicação 88, carac- terizada pelo fato de que a mutação é endógena para o indivíduo.
99. Composição, de acordo com a reivindicação 88 ou 89, caracterizada pelo fato de que a mutação é introduzida artificialmente através de edição genética ou manipulação genética.
100. Composição, de acordo com a reivindicação 88, carac- terizada pelo fato de que a linhagem celular compreende uma plurali- dade de mutações que são endógenas e/ou exógenas para o indiví- duo.
101. Composição, de acordo com a reivindicação 88, carac- terizada pelo fato de que o indivíduo é um mamífero.
102. Composição, de acordo com a reivindicação 88, carac- terizada pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.
103. Composição, de acordo com a reivindicação 88, carac- terizada pelo fato de que o gene-alvo compreende um conjunto de ge- ne mostrado na Tabela 4.
104. Composição, de acordo com a reivindicação 88, carac- terizada pelo fato de que o gene-alvo compreende um gene CYP4V2, CYP1B1, MYO7A, DFNB31, USH1C, USH1G, CDH23, PCDH15, CLRN1, ACO2, AFG3L2, ATXN2, AUH, C12orf65, CISD2, FOXC1, FOXF2, LTBP2, MTPAP, MYOC, NDUFS1, NR2F1, OPA1, OPA3,
OPTN, PAX6, PDGF, PITX2, POLG, SPG7, TEK, TXNRD2, WFS1, ABCA4, REP-1, RPE65, CEP290, PDE6B, RPGR, MERTK, MT-ND4, FAM47E, GBA, GCH1, HTRA2, LRRK2, PARK2, PINK1, SNCA, SYNJ1, NPC1, NPC2, CYP4A11, CYP4A22, CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F22, CYP4X1, CYP4Z1 ou gene CYP46A ou um gene CYP4V2, CYP1B1, MYO7A, DFNB31, USH1C, USH1G, CDH23, PCDH15, CLRN1, ACO2, AFG3L2, ATXN2, AUH, C12orf65, CISD2, FOXC1, FOXF2, LTBP2, MTPAP, MYOC, NDUFS1, NR2F1, OPA1, OPA3, OPTN, PAX6, PDGF, PITX2, POLG, SPG7, TEK, TXNRD2, WFS1, ABCA4, REP-1, RPE65, CEP290, PDE6B, RPGR, MERTK, MT-ND4, FAM47E, GBA, GCH1, HTRA2, LRRK2, PARK2, PINK1, SNCA, SYNJ1, NPC1, NPC2, CYP4A11, CYP4A22, CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F22, CYP4X1, CYP4Z1 ou-CYP46A mutado ou defei- tuoso que codifica uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial.
105. Composição, de acordo com a reivindicação 88, carac- terizada pelo fato de que o gene-alvo é CYP4V2.
106. Composição, de acordo com a reivindicação 105, ca- racterizada pelo fato de que a linhagem celular compreende uma célu- la iPS.
107. Composição, de acordo com a reivindicação 105, ca- racterizada pelo fato de que a linhagem celular compreende uma célu- la iPS-RPE.
108. Composição, de acordo com a reivindicação 105, ca- racterizada pelo fato de que a linhagem celular compreende uma célu- la iPS-fotorreceptora (iPS-PRC), uma célula iPS-epitelial da córnea (iPS-CEC), uma célula iPS-endotelial coroidal (CE), uma célula iPS-da córnea, uma célula iPS-coroidal, uma célula iPS-do nervo óptico, uma célula iPS-ocular ou uma célula iPS-do neurônio.
109. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 88 ou 105 a 108, caracterizada pelo fato de que a mutação de CYP4V2 na linhagem celular é endógena ao indivíduo.
110. Composição, de acordo com a reivindicação 88 ou 109, caracterizada pelo fato de que o indivíduo tem uma mutação pa- tológica no gene CYP4V2 ou em um ortólogo do gene CYP4V2.
111. Composição, de acordo com a reivindicação 88 ou 109, caracterizada pelo fato de que o indivíduo tem pelo menos uma mutação homozigota ou duas mutações heterozigotas compostas mostradas na Tabela 1.
112. Composição, de acordo com a reivindicação 88, carac- terizada pelo fato de que o indivíduo tem degeneração retinal herdada (IRD) ou retinite pigmentosa (RP).
113. Composição, de acordo com a reivindicação 88, carac- terizada pelo fato de que o indivíduo tem Distrofia Cristalina de Bietti (BCD, tcc Distrofia Cristalina Corneorretinal de Bietti, Retinopatia Cris- talina de Bietti, Distrofia Retinal de Bietti) ou está sob risco de desen- volver BCD.
114. Composição, de acordo com a reivindicação 88 ou 105, caracterizada pelo fato de que a linhagem celular compreende pelo menos uma mutação de CYP4V2 que é exógena ao indivíduo e é introduzida artificialmente através de edição genética ou manipulação genética.
115. Composição, de acordo com a reivindicação 88 ou 114, caracterizada pelo fato de que a linhagem celular compreende uma célula iPS, uma célula ES, MSC, célula-tronco específico de teci- do ou célula-tronco adulta, ou uma célula de RPE, célula fotorrecepto- ra, célula epitelial da córnea, célula endotelial coroidal (CE) ou célula coroidal derivada de uma célula iPS, célula ES, MSC, célula-tronco específica de tecido ou célula-tronco adulta.
116. Composição de modelo celular humano de BCD ou uma composição de modelo celular de disfunção de CYP4V2, caracte- rizada pelo fato de que compreende uma célula iPS ou linhagem celu- lar iPS ou uma célula iPS-RPE ou linhagem celular iPS-RPE derivada de uma célula ou uma linhagem celular de um paciente com BCD ou derivada de uma célula ou uma linhagem celular com mutação de CYP4V2 bialélica artificialmente criada.
117. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 88 ou 105 a 115, caracterizada pelo fato de que a linhagem celular tem um perfil bioquímico anormal em um ou mais compostos dos grupos de compostos que seguem: (i) ácidos graxos, (ii) cerami- das, (iii) esfingomielinas, (iv) esfingosina, (v) esfinganina, (vi) ácidos hidróxi graxos, (vii) corticosteroide ou (viii) proteínas (exceto CYP4V2) ou função de RPE anormal ou nível de atrofia, degeneração ou morte celular maior comparado com uma linhagem celular correspondente de um controle saudável.
118. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 88 ou 105 a 117, caracterizada pelo fato de que a linhagem celular tem um perfil bioquímico anormal em um ou mais compostos mostrados na Tabela 2 comparado com a linhagem celular correspon- dente de um controle saudável.
119. Método de detecção de anormalidades ou fenótipo em um modelo celular de doença, caracterizado pelo fato de que compre- ende avaliação e comparação de níveis de viabilidade celular da linha- gem celular de um paciente (ou uma linhagem celular geneticamente editada ou manipulada compreendendo uma mutação exógena no ge- ne causando tal doença) e um controle saudável.
120. Método de detecção de anormalidades ou fenótipo em um modelo celular de doença, caracterizado pelo fato de que compre- ende avaliação e comparação dos níveis de função de RPE (por exemplo, atividade fagocítica, resistência transepitelial) da linhagem celular de um paciente (ou uma linhagem celular geneticamente edita- da ou manipulada compreendendo uma mutação exógena no gene causando tal doença) e um controle saudável, em que a linhagem ce- lular é uma linhagem celular de RPE (incluindo linhagem celular de RPE derivada de uma célula-tronco).
121. Método, de acordo com a reivindicação 119 ou 120, caracterizado pelo fato de que a comparação entre linhagens celulares é feita sem exposição à luz.
122. Método, de acordo com a reivindicação 119 ou 120, caracterizado pelo fato de que as comparações entre linhagens celula- res são feitas após exposição à luz.
123. Método, de acordo com a reivindicação 119, 120 ou 122, caracterizado pelo fato de que as comparações entre linhagens celulares são feitas após exposição à luz azul.
124. Método, de acordo com a reivindicação 119, 121, 122 ou 123, caracterizado pelo fato de que a viabilidade celular é medida através da razão de célula morta/viva, razão de célula doente/saudável ou razões similares ou porcentagem de células mortas/totais ou célu- las vivas/totais.
125. Método de detecção de anormalidades ou fenótipo em um modelo celular de doença caracterizado pelo fato de que compre- ende avaliação e comparação dos níveis de um ou mais compostos entre a linhagem celular de um paciente (ou uma linhagem celular ge- neticamente editada ou manipulada compreendendo uma mutação exógena no gene causando tal doença) e um controle saudável, em que o um ou mais composto é selecionado dos grupos que seguem: (i) ácidos graxos, (ii) ceramidas, (iii) esfingomielinas, (iv) esfingosina, (v) esfinganina, (vi) ácidos hidroxi graxos, (vii) corticosteroide e/ou (viii) proteínas.
126. Método, de acordo com a reivindicação 125 ou 126, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos compostos avaliados é mostrado na Tabela 2.
127. Método, de acordo com a reivindicação 125 ou 126, caracterizado pelo fato de que a identificação e/ou avaliação de níveis de composto é realizada usando LC-MS, LC-MS/MS, GC-MS, GC- MS/MS e/ou FIA-MS/MS.
128. Método, de acordo com a reivindicação 119, 120 ou 125, caracterizado pelo fato de que o modelo celular de doença com- preende um gene mutado ou defeituoso mostrado na Tabela 4.
129. Método, de acordo com a reivindicação 119, 120 ou 125, caracterizado pelo fato de que o modelo de celular de doença compreende um gene mutado ou defeituoso dentre o gene CYP4V2, CYP1B1, MYO7A, DFNB31, USH1C, USH1G, CDH23, PCDH15, CLRN1, ACO2, AFG3L2, ATXN2, AUH, C12orf65, CISD2, FOXC1, FOXF2, LTBP2, MTPAP, MYOC, NDUFS1, NR2F1, OPA1, OPA3, OPTN, PAX6, PDGF, PITX2, POLG, SPG7, TEK, TXNRD2, WFS1, ABCA4, REP-1, RPE65, CEP290, PDE6B, RPGR, MERTK, MT-ND4, FAM47E, GBA, GCH1, HTRA2, LRRK2, PARK2, PINK1, SNCA, SYNJ1, NPC1, NPC2, CYP4A11, CYP4A22, CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F22, CYP4X1, CYP4Z1 ou CYP46A.
130. Método de avaliação de um agente de teste quanto à eficácia terapêutica contra BCD caracterizado pelo fato de que com- preende: contatar as células de uma linhagem celular iPS-RPE deri- vada de um paciente com BCD ou uma linhagem celular iPS-RPE compreendendo um gene CYP4V2 mutado ou defeituoso como um resultado de edição ou manipulação genética artificial com um agente de teste; e avaliar as células para normalização em níveis de um ou mais compostos mostrados na Tabela 2; um aumento em sequência de ácido nucleico de CYP4V2 não defeituoso nas células; um aumento na quantidade de polipeptídeos de CYP4V2 nas células; e/ou estrutu- ra, morfologia ou função celular melhorada, ou viabilidade celular me- lhorada, comparado com antes do contato por tal agente de teste; em que normalização em níveis de um ou mais compostos mostrado na Tabela 2; um aumento em sequência de ácido nucleico de CYP4V2 não defeituoso nas células; um aumento na quantidade de polipeptídeos CYP4V2 nas células; e/ou estrutura, morfologia, função ou viabilidade celular melhorada, comparado com antes do tratamento por tal agente de teste, é indicativo de um agente de teste que exibe eficácia terapêutica contra BCD; em que a comparação entre linhagens celulares pode ser feita após exposição à luz e/ou sem exposição à luz.
131. Método, de acordo com a reivindicação 130, caracteri- zado pelo fato de que os agentes de teste são selecionados do grupo consistindo em ácidos nucleicos ou análogos dos mesmos, vetores contendo sequência de ácido nucleico ou codificando polipeptídeos, polipeptídeos ou análogos dos mesmos, anticorpos, agentes químicos, moléculas pequenas e/ou qualquer combinação dos mesmos.
132. Método, de acordo com a reivindicação 130, caracteri- zado pelo fato de que as células são avaliadas usando técnicas de PCR, imunoensaios, sequenciamento, ensaio bioquímico, ensaio de função, ensaio de viabilidade celular, microscopia ou combinação dos mesmos.
133. Método de avaliação da eficácia ou eficiência de uma formulação, vetor ou construto, caracterizado pelo fato de que com- preende um agente de teste para BCD caracterizado pelo fato de que compreende:
contatar amostras celulares múltiplas de uma linhagem ce- lular iPS-RPE derivada de um paciente com BCD ou uma linhagem celular iPS-RPE compreendendo um gene CYP4V2 mutado ou defei- tuoso como um resultado de edição ou manipulação genética artificial com um agente de testes formulado ou empacotado em várias formu- lações, vetores ou construtos; e avaliar as amostras celulares para normalização em níveis de um ou mais compostos mostrados na Tabela 2; um aumento em sequência de ácido nucleico de CYP4V2 não defeituoso nas células; um aumento na quantidade de polipeptídeos de CYP4V2 nas células; estrutura, morfologia, função ou viabilidade celular melhorada; e/ou tolerância ou morte celular, comparado com antes do tratamento por tal agente de teste e/ou amostras celulares tratadas pelo mesmo agen- te de teste, mas formulada ou empacotada em uma formulação, vetor ou construto diferente, para determinar e comparar a eficiência ou efi- cácia de tal formulação, vetor ou construto; em que as células são avaliadas usando técnicas de PCR, imunoensaios, sequenciamento, ensaio bioquímico, ensaio de viabili- dade celular, microscopia ou combinação dos mesmos; em que a comparação dentre linhagens celulares pode ser feita após exposição à luz e/ou sem exposição à luz.
134. Método de avaliação de faixa de dosagem eficaz e se- gura de um agente de teste para BCD caracterizado pelo fato de que compreende: contatar amostras celulares múltiplas de uma linhagem ce- lular iPS-RPE derivada de um paciente com BCD ou uma linhagem celular iPS-RPE compreendendo um gene CYP4V2 mutado ou defei- tuoso como um resultado de edição ou manipulação genética artificial com um agente de testes em uma dose diferente para cada amostra celular;
avaliar as amostras celulares para normalização em níveis de um ou mais compostos mostrados na Tabela 2; um aumento em sequência de ácido nucleico de CYP4V2 não defeituoso nas células; um aumento na quantidade de polipeptídeos de CYP4V2 nas células; estrutura, morfologia, viabilidade ou função celular melhorada; e/ou tolerância ou morte celular, como comparado antes do tratamento por tal agente de teste e/ou amostras celulares tratadas pelo mesmo agen- te de teste, mas com uma dose diferente, para determinar e comparar a efetividade e segurança de doses diferentes desta maneira determi- nando uma faixa de dosagem apropriada; em que as células são avaliadas usando técnicas de PCR, imunoensaios, sequenciamento, ensaio bioquímico, ensaio de função, ensaio de viabilidade celular, microscopia ou combinação dos mes- mos; em que a comparação dentre linhagens celulares pode ser feita após exposição à luz e/ou sem exposição à luz.
135. Método de triagem ou avaliação da eficácia ou eficiên- cia de um dispositivo ou método de administração para administração de um agente terapêutico à retina ou células retinais, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) contato de uma amostra celular de uma linhagem celular iPS-RPE derivada de um paciente com BCD ou uma linhagem celular iPS-RPE compreendendo um gene CYP4V2 mutado ou defeituoso como um resultado de edição ou manipulação genética artificial com um agente de teste sem emprego do dispositivo ou método de admi- nistração; (ii) contato de uma outra amostra celular de uma linhagem celular iPS-RPE derivada de um paciente com BCD ou uma linhagem celular iPS-RPE compreendendo um gene CYP4V2 mutado ou defei- tuoso como um resultado de edição ou manipulação genética artificial com o agente de teste da mesma dosagem que em (i), empregando o dispositivo ou método de administração; (iii) avaliação e comparação das amostras celulares de (i) e (ii) para normalização em níveis de um ou mais composto mostrado na Tabela 2; um aumento em sequência de ácido nucleico de CYP4V2 não defeituoso nas células; um aumento na quantidade de polipeptí- deos CYP4V2 nas células; estrutura, morfologia ou função celular me- lhorada; tolerância ou morte celular; e/ou os níveis do agente de teste nas células, comparado com antes do tratamento por tal agente de teste e/ou tratamento pelo mesmo agente de teste da mesma dose mas sem emprego do dispositivo ou métodos de administração, para determinar a eficácia ou eficiência de tal dispositivo ou técnica de ad- ministração; em que as células são avaliadas usando técnicas de PCR, imunoensaios, sequenciamento, ensaio bioquímico, ensaio de função, viabilidade celular, microscopia ou combinação dos mesmos; em que a comparação entre as linhagens celulares pode ser feita após exposição à luz e/ou sem exposição à luz.
136. Método, de acordo com a reivindicação 135, caracteri- zado pelo fato de que as células retinais são células de RPE.
137. Método de geração de um controle isogênico caracte- rizado pelo fato de que compreende corrigir geneticamente a mutação em uma linhagem celular do paciente através de qualquer uma das reivindicações em terapia de edição genética ou presentes reivindica- ções de RNP.
138. Método de uso de células iPS-oculares específicas de paciente para avaliar ou sugerir dosagem terapêutica eficaz para tra- tamento in vivo caracterizado pelo fato de que compreende multiplicar o nível de dose ótimo (por exemplo, indicado como MOI para terapia de gene in vitro) determinado em modelo celular iPS-ocular específico de paciente in vitro pelo número estimado de células oculares (por exemplo, células de RPE, células fotorreceptoras ou células de RPE e células fotorreceptoras) direcionadas para tratamento in vivo para se chegar ao nível de dose de vetores de terapia de gene para uso in vivo (por exemplo, GC ou gp) e tal nível de dose de vetor é ajustado por um multiplicador (por exemplo, 1 a 10) (por exemplo, 1 a 5 para injeção sub-retinal ou 5 a 10 para injeção intravítrea); os outros fatores afetan- do o multiplicador a ser aplicado incluem o tamanho da área direcio- nada, e o indivíduo sendo tratado (por exemplo, a idade, peso, estágio de desenvolvimento da doença e condição do indivíduo a ser tratado e reações imunes potenciais (isto é, NAbs preexistentes); a localização e densidade das células oculares direcionadas para tratamento) ou su- gerir a faixa de dose terapêutica eficaz para tratamento in vivo, que pode ser confirmada ou refinada mais por testes clínicos.
139. Método, de acordo com a reivindicação 138, caracteri- zado pelo fato de que o método é usado para avaliar ou sugerir dose ótima personalizada usada em tratamento in vivo para um paciente individual.
140. Método, de acordo com a reivindicação 138 ou 139, caracterizado pelo fato de que a doença é um distúrbio retinal herdado (IRD) ou retinite pigmentosa (RP).
141. Método, de acordo com a reivindicação 138 ou 139, caracterizado pelo fato de que a doença é BCD e as células iPS- oculares são células iPS-RPE e as células oculares direcionadas para tratamento in vivo são células de RPE.
142. Composição caracterizada pelo fato de que compre- ende: (a) um RNA-guia de CRISPR direcionando a uma sequência de ácido nucleico (a “sequência-alvo”) de ou dentro de 100 pbs para o gene CYP4V2 e (b) uma proteína associada a CRISPR funcional (Cas).
143. Composição, de acordo com a reivindicação 142, ca- racterizada pelo fato de que compreende ainda (c) uma sequência de ácido nucleico doadora compreendendo toda ou uma porção de uma sequência do tipo selvagem ou uma sequência funcional do gene CYP4V2 para correção, rompimento ou substituição do gene CYP4V2 ou uma porção do mesmo.
144. Composição, de acordo com a reivindicação 142 ou 143, caracterizada pelo fato de que um ou mais componentes da mesma são providos na forma de uma molécula de DNA codificando tal componente, uma molécula de mRNA codificando tal componente, uma molécula de RNA, um polipeptídeo e/ou uma ribonucleoproteína (RNP) ou complexo de proteína-RNA.
145. Composição, de acordo com a reivindicação 142 ou 143, caracterizada pelo fato de que dois ou mais componentes da mesma estão em molécula separada ou combinados em uma molécu- la ou em um complexo, estão em vetores separados ou combinados em um vetor, estão em um ou mais complexo de ácido nucleico, estão em um ou mais complexo de RNP.
146. Composição, de acordo com a reivindicação 143, ca- racterizada pelo fato de que a sequência de ácido nucleico doadora é provida em um oligonucleotídeo doador de filamento único (ssODN) ou um vetor.
147. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 142 a 146, caracterizada pelo fato de que o vetor é um plas- mídeo, um vetor de AAV recombinante, um vetor de lentivírus recom- binante e/ou uma combinação dos mesmos.
148. Composição caracterizada pelo fato de que compre- ende uma célula com uma mutação de CYP4V2 patológica compreen- dendo uma composição de qualquer uma das reivindicações 142 a
147.
149. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 142 a 148, caracterizada pelo fato de que (a) o RNA-guia de CRISPR compreende (i) um RNA de CRISP (crRNA) que compreende uma sequência de elemento protoespaçador que é complementar à sequência-alvo de ou dentro de 100 pbs a um gene-alvo (o “gene- alvo”) e uma sequência que corresponde a uma região complementar do crRNA de transativação (tracrRNA) e (ii) um tracrRNA que compre- ende uma região que é complementar à região correspondente do crRNA e uma sequência que interage com uma proteína associada a CRISPR 9 (Cas9) e (b) a proteína associada a CRISPR funcional compreende Cas9.
150. Composição, de acordo com a reivindicação 149, ca- racterizada pelo fato de que o elemento protoespaçador é de cerca de 20 bases, cerca de 19 bases, cerca de 21 bases, cerca de 19-21 ba- ses, cerca de 18-22 bases ou cerca de 16-24 bases.
151. Composição, de acordo com a reivindicação 149 ou 150, caracterizada pelo fato de que o crRNA e o tracrRNA estão em moléculas separadas.
152. Composição, de acordo com a reivindicação 149 ou 150, caracterizada pelo fato de que o crRNA e o tracrRNA são combi- nados em um RNA-guia único (sgRNA).
153. Composição, de acordo com a reivindicação 152, ca- racterizada pelo fato de que o sgRNA é de cerca de 88-150 pbs.
154. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 149 a 153, caracterizada pelo fato de que a Cas9 compreen- de um ortólogo de Cas9 ou Cas9 mutante selecionada de: Streptococ- cus pyogenes (SpCas9), SpCas9 nickase (Cas9n D10A), SpCas9 (D1135E), eSpCas9, SpCas9-HF1, SpCas9 VRER, SpCas9 VQR, SpCas9EQR, Staphylococcus aureus (SaCas9), Neisseria Meningiti- dis, Streptococcus thermophilus, Streptococcus pneumnoniae,
Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Streptococcus mutans, Pas- teurella multocida, Bifidobacterium longum, Ba-cillus smithii, Trepone- ma denticola, mycoplasma canis e enterococcus fae-calis.
155. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 142 a 148, caracterizada pelo fato de que (a) o RNA-guia de CRISPR compreende um crRNA que compreende uma sequência de elemento protoespaçador que é complementar à sequência-alvo de ou dentre 100 pbs para um gene-alvo e (b) a proteína associada a CRISPR funcional compreende Cpf1.
156. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 142 a 155, caracterizada pelo fato de que a proteína associ- ada a CRISPR, Cas9, ou Cpf1, compreende ainda uma, duas, três ou mais sequências de localização nuclear (NLS) no terminal N e/ou ter- minal C, e/ou um marcador de seleção, incluindo, sem limitação, GFP ou EGFP.
157. Composição, de acordo com a reivindicação 142, ca- racterizada pelo fato de que a sequência do elemento protoespaçador é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 48 a 52 ou com- partilha pelo menos 85% de identidade de sequência com qualquer uma de SEQ ID NO: 48 a 52 para uso com uma proteína Cas que tem NGG como um motivo adjacente protoespaçador (PAM) para se dire- cionar à mutação c.802-8_810del17insGC do gene CYP4V2.
158. Composição, de acordo com a reivindicação 142, 143 ou 157, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácido nucleico doadora é selecionada de SEQ ID NOs: 56 e 57 ou compartilha pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID NO: 56 ou 57, ou uma sequência que é complementar a ela, para uso para corrigir, romper ou substituir a mutação c.802-8_810del17insGC do gene CYP4V2.
159. Método de tratamento ou prevenção de BCD em um indivíduo ou uma célula com um gene CYP4V2 mutado caracterizado pelo fato de que compreende: (i) identificação da mutação patológica no indivíduo ou na célula através de sequenciamento; (ii) encontro de sítios de PAM relacionados a Cas dentro da regi-ão se estendendo de a partir de cerca de 100 pbs a montante do primeiro nucleotídeo envolvido na mutação a cerca de 100 pbs a ju- sante do último nucleotídeo envolvido na mutação; (iii) identificação de várias sequências de elemento protoe- spaçador direcionando à sequência de CYP4V2 relevante para cada sítio de PAM identificado em (ii); (iv) avaliação do nível de atividade de cada RNA-guia de CRISPR compreendendo uma sequência de elemento protoespaçador identificada em (iii) e perfil de edição fora do alvo com base na se- quência de elemento protoespaçador e PAM; (v) seleção de um ou mais projeto de RNA-guia de CRISPR com base em (iv); (vi) projeto de uma ou mais sequência de ácido nucleico doadora com base em reparo direcionado à homologia (HDR) para correção, rompimento ou substituição da mutação de CYP4V2 direcio- nada; (vii) construto da sequência de ácido nucleico de do RNA- guia de CRISPR, Cas ou doadora como provido nas reivindicações de composição 1 a 18; (viii) opcionalmente validação e seleção adicional dos com- ponentes de (vii) em uma célula isolada do indivíduo; ou uma célula iPS derivada do indivíduo ou uma célula diferenciada de uma célula- tronco derivada do indivíduo ou o DNA genômico isolado do indivíduo para avaliar o nível de atividade e/ou perfil de edição fora do alvo; e (ix) administração dos componentes em (viii) ao indivíduo ou à célula através de um sistema de administração selecionado do grupo consistindo em uma ribonucleoproteína ou complexo de proteí- na-RNA, um vetor, uma proteína, uma molécula de ácido nucleico, uma nanopartícula, um lipossoma, uma micela, um virossoma, um complexo de ácido nucleico, e/ou combinação dos mesmos, em que a administração é realizada através de eletroporação ou através de transfecção mediada por lipídeo ou nucleofeção ou transdução viral ou injeção ou uma combinação dos mesmos.
160. Composição de edição genética para correção ou substituição da mutação c.802-8_810del17insGC em um gene CYP4V2 em um indivíduo in vivo ou em uma célula in vitro caracteri- zada pelo fato de que compreende: (i) um RNA-guia de CRISPR compreendendo uma sequên- cia de elemento protoespaçador selecionada de uma de SEQ ID NO: 48 a 52 ou compartilhando pelo menos 80% de identidade de sequên- cia com uma das sequências em SEQ ID NOs: 48 a 52; (ii) uma sequência de ácido nucleico doadora selecionada de uma de SEQ ID NOs: 56 e 57 ou compartilha pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de SEQ ID NOs: 56 e 57, ou uma sequência que é complementar à mesma; e (iii) uma proteína Cas9 (sequência exemplar mostrada na SEQ ID NO: 58), contendo opcionalmente 1, 2, 3 ou mais NLS, e/ou um marcador de seleção incluindo, sem limitação, GFP ou EGFP.
161. Composição, de acordo com a reivindicação 160, ca- racterizada pelo fato de que um nucleotídeo G opcional (SEQ ID NO: 59) é adicionado antes da sequência de elemento protoespaçador.
162. Composição, de acordo com a reivindicação 160 ou 161, caracterizada pelo fato de que o RNA-guia de CRISPR compre- ende um crRNA (sequência exemplar (excluindo a sequência do ele- mento protoespaçador 5’) mostrado na SEQ ID NO: 53) e um tracrRNA
(sequência exemplar mostrada na SEQ ID NO: 54); e a sequência de elemento protoespaça-dor está contida no crRNA.
163. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 160 a 162, caracterizada pelo fato de que o RNA-guia de CRISPR com-preende um RNA-guia único (sgRNA) compreendendo a sequência de elemento protoespaçador (sequência de sgRNA exem- plar (excluindo a sequência de elemento protoespaçador 5’) mostrada na SEQ ID NO: 55).
164. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 160 a 163, caracterizada pelo fato de que um ou mais com- ponentes de (i), (ii) e (iii) são providos na forma de uma molécula de DNA codificando tal componente, uma molécula de mRNA codificando tal componente, uma molécula de ácido nucleico, um vetor, uma molé- cula de RNA, um polipeptídeo, uma ribonucleoproteína (RNP) ou um complexo de proteína-RNA e/ou combinações dos mesmos.
165. Método de tratamento ou prevenção de uma doença do olho em um indivíduo, em que a doença é associada com uma alte- ração genética ou epigenética patológica no gene CYP4V2, caracteri- zado pelo fato de que compreende administrar uma composição celu- lar ao indivíduo, em que a composição celular compreende: células do epitélio pigmentar da retina (RPE), fotorreceptoras ou progenitoras de fotorreceptoras (PRCs), células epiteliais da córnea (CECs), células endoteliais coroidais (CE) e/ou outras células oculares ou outras célu- las derivadas de uma célula-tronco.
166. Método, de acordo com a reivindicação 165, caracteri- zado pelo fato de que a célula-tronco é uma célula-tronco embriônica (ES), uma célula iPC, uma MSC, uma célula-tronco adulta ou uma cé- lula-tronco específica de tecido.
167. Método, de acordo com a reivindicação 165, caracteri- zado pelo fato de que a célula-tronco é de ou derivada de um ou mais indivíduos não tendo BCD ou não tendo um gene CYP4V2 patológico.
168. Método, de acordo com a reivindicação 165, caracteri- zado pelo fato de que a célula-tronco é de ou derivada de um ou mais indivíduos com mutações patológicas no gene CYP4V2.
169. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 165 a 168, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um indi- víduo humano.
170. Composição celular caracterizada pelo fato de que compreende (a) uma célula-tronco reprogramada a partir de uma célu- la isolada de ou uma célula-tronco isolada de um indivíduo afetado por BCD ou tendo mutações patológicas no gene CYP4V2 ou (2) uma cé- lula diferenciada de uma célula-tronco isolada de um indivíduo ou re- programada de uma célula isolada de um indivíduo afetado por BCD ou tendo mutações patológicas no gene CYP4V2.
171. Composição, de acordo com a reivindicação 170, ca- racterizada pelo fato de que a célula-tronco reprogramada a partir de uma célula isolada do indivíduo é uma célula iPC.
172. Composição, de acordo com a reivindicação 170, ca- racterizada pelo fato de que a célula iPS é reprogramada a partir de uma célula somática do indivíduo.
173. Composição, de acordo com a reivindicação 170, ca- racterizada pelo fato de que a célula iPS é reprogramada a partir de uma célula da pele, uma célula sanguínea, uma célula urinária, uma célula capilar, um fibroblasto, uma célula mononuclear de sangue peri- férico (PBMC), uma célula epitelial renal, um folículo piloso ou uma célula papilar dermal.
174. Composição, de acordo com a reivindicação 170, ca- racterizada pelo fato de que a célula-tronco isolada do indivíduo é uma MSC, uma célula-tronco adulta ou uma célula-tronco específica de te- cido.
175. Composição, de acordo com a reivindicação 170, ca- racterizada pelo fato de que a célula diferenciada de uma célula-tronco é uma célula ocular.
176. Composição, de acordo com a reivindicação 170 ou 175, caracterizada pelo fato de que a célula diferenciada de uma célu- la-tronco é uma célula de RPE, uma PRC, uma célula retinal, uma cé- lula da córnea, uma célula coroidal, uma CEC ou uma célula CE.
177. Composição, de acordo com a reivindicação 170, ca- racterizada pelo fato de que a célula diferenciada de uma célula-tronco é uma célula iPS-RPE, iPS-PRC, iPS-CEC ou iPS-CE.
178. Composição, de acordo com a reivindicação 170, ca- racterizada pelo fato de que (i) a célula isolada de um indivíduo afeta- do por BCD ou tendo mutações patogênicas no gene CYP4V2 para uso para reprogramar em uma iPSC, (ii) a célula-tronco isolada de um indivíduo ou célula iPS reprogramada a partir de uma célula isolada de um indivíduo afetado por BCD ou tendo mutações patológicas no gene CYP4V2 ou (iii) a célula diferenciada de uma célula-tronco isolada de um indivíduo ou uma célula iPS reprogramada a partir de uma célula isolada de um indivíduo afetado por BCD ou tendo mutações patológi- cas no gene CYP4V2 é geneticamente reparada para melhorar o efeito do gene CYP4V2 mutado.
179. Composição, de acordo com a reivindicação 178, ca- racterizada pelo fato de que reparo genético é através de terapia de transferência genética.
180. Composição, de acordo com a reivindicação 178, ca- racterizada pelo fato de que reparo genético é através de terapia de transferência genética usando qualquer composição ou método de qualquer uma das reivindicações de terapia genética.
181. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o reparo genéti-
co é através de terapia de edição genética.
182. Composição, de acordo com a reivindicação 181, ca- racterizada pelo fato de que reparo genético é através de terapia de edição genética através do uso de qualquer composição ou método de qualquer uma das reivindicações de terapia de gene CRISPR.
183. Método de tratamento ou prevenção de uma doença do olho em um indivíduo afetado por BCD ou tendo alterações genéti- cas ou epigenéticas patológicas no gene CYP4V2, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma composição de qualquer uma das reivindicações relacionadas a composições celulares autólo- gas de CYP4V2 ao indivíduo, em que a composição celular compre- ende: células geneticamente reparadas compreendendo células do epitélio pigmentar da retina (RPE), fotorreceptores ou progenitores fo- torreceptores (PRCs), células epiteliais da córnea (CECs), células en- doteliais coroidais (CE) e/ou outras células oculares ou outras células derivadas de uma célula-tronco do indivíduo.
184. Método, de acordo com a reivindicação 183, caracteri- zado pelo fato de que a célula-tronco é uma célula iPC, uma MSC, uma célula-tronco adulta ou uma célula-tronco específica de tecido.
185. Método, de acordo com a reivindicação 184, caracteri- zado pelo fato de que a célula iPS é reprogramada usando um ou mais dos fatores de transcrição OCT4, SOX2, KLF4 e c-MYC.
186. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que as células genetica- mente reparadas demonstram um ou mais do que segue: normaliza- ção em níveis de um ou mais composto mostrado na Tabela 2; um aumento em sequência de ácido nucleico de CYP4V2 não defeituoso nas células; um aumento na quantidade de polipeptídeos de CYP4V2 funcional nas células; e/ou estrutura, morfologia, viabilidade ou função celular melhorada, comparado com antes do reparo genético ser reali-
zado.
187. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a quantidade de cé- lulas administradas é cerca de 1.000 a cerca de 10 milhões de células em uma administração única.
188. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a administração é através de injeção, injeção sub-retinal ou injeção intravítrea.
189. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a administração é através de outro método de administração que administra eficazmente as células ao local sub-retinal, ao segmento posterior ou à córnea do olho do indivíduo.
190. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que as células são admi- nistradas através de injeção de suspensão celular.
191. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que as células são admi- nistradas como parte de uma folha, uma matriz, uma base, um tecido ou uma estrutura retinal 3D.
192. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que as células de RPE são administradas usando bases naturais e/ou sintéticas para gerar uma monocamada de RPE funcional.
193. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um in- divíduo hu-mano.
194. Composição celular caracterizada pelo fato de que compreende (a) uma célula-tronco reprogramada a partir de uma célu- la isolada de ou uma célula-tronco isolada de um indivíduo afetado por uma doença causada por um gene mutado ou defeituoso em um gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou par- cial ou (2) uma célula diferenciada de uma célula-tronco isolada de um indivíduo ou reprogramada a partir de uma célula isolada de um indiví- duo afetado por uma doença causada por um gene mutado ou defeitu- oso ou gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defei- tuosa ou parcial.
195. Composição, de acordo com a reivindicação 194, ca- racterizada pelo fato de que a célula-tronco reprogramada a partir de uma célula isolada do indivíduo é uma célula iPS.
196. Composição, de acordo com a reivindicação 195, ca- racterizada pelo fato de que a célula iPS é reprogramada a partir de uma célula somática do indivíduo.
197. Composição, de acordo com a reivindicação 195 ou 196, caracterizada pelo fato de que a célula iPS é reprogramada a par- tir de uma célula da pele, uma célula sanguínea, uma célula urinária, uma célula capilar, um fibroblasto, uma célula mononuclear de sangue periférico (PBMC), uma célula epitelial renal, um folículo piloso ou uma célula papilar dermal.
198. Composição, de acordo com a reivindicação 194, ca- racterizada pelo fato de que a célula-tronco isolada do indivíduo é uma MSC, uma célula-tronco adulta ou uma célula-tronco específica de te- cido.
199. Composição, de acordo com a reivindicação 194, ca- racterizada pelo fato de que o gene está envolvido em desenvolvimen- to ou função ocular e/ou mutação do qual causa ou é um fator de risco para causar uma doença ocular.
200. Composição, de acordo com a reivindicação 194, ca- racterizada pelo fato de que o gene está envolvido em desenvolvimen- to ou função neuronal e/ou mutação do qual causa ou é um fator de risco para causar uma doença neurodegenerativa.
201. Composição, de acordo com a reivindicação 194, ca- racterizada pelo fato de que o gene é um gene P450 do citocromo.
202. Composição, de acordo com a reivindicação 194, ca- racterizada pelo fato de que o gene é um mostrado na Tabela 4.
203. Composição, de acordo com a reivindicação 194, ca- racterizada pelo fato de que o gene compreende um gene CYP4V2, CYP1B1, MYO7A, DFNB31, USH1C, USH1G, CDH23, PCDH15, CLRN1, ACO2, AFG3L2, ATXN2, AUH, C12orf65, CISD2, FOXC1, FOXF2, LTBP2, MTPAP, MYOC, NDUFS1, NR2F1, OPA1, OPA3, OPTN, PAX6, PDGF, PITX2, POLG, SPG7, TEK, TXNRD2, WFS1, ABCA4, REP-1, RPE65, CEP290, PDE6B, RPGR, MERTK, MT-ND4, FAM47E, GBA, GCH1, HTRA2, LRRK2, PARK2, PINK1, SNCA, SYNJ1, NPC1, NPC2, CYP4A11, CYP4A22, CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F22, CYP4X1, CYP4Z1 ou gene CYP46A ou um gene CYP4V2, CYP1B1, MYO7A, DFNB31, USH1C, USH1G, CDH23, PCDH15, CLRN1, ACO2, AFG3L2, ATXN2, AUH, C12orf65, CISD2, FOXC1, FOXF2, LTBP2, MTPAP, MYOC, NDUFS1, NR2F1, OPA1, OPA3, OPTN, PAX6, PDGF, PITX2, POLG, SPG7, TEK, TXNRD2, WFS1, ABCA4, REP-1, RPE65, CEP290, PDE6B, RPGR, MERTK, MT-ND4, FAM47E, GBA, GCH1, HTRA2, LRRK2, PARK2, PINK1, SNCA, SYNJ1, NPC1, NPC2, CYP4A11, CYP4A22, CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F22, CYP4X1, CYP4Z1 ou CYP46A mutado ou defei- tuoso.
204. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a célula diferen- ciada de uma célula-tronco é qualquer tipo de célula.
205. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a célula diferen-
ciada de uma célula-tronco é uma célula ocular.
206. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a célula diferen- ciada de uma célula-tronco é uma célula de RPE, uma PRC, uma célu- la retinal, uma célula da córnea, uma célula coroidal, uma CEC, uma célula CE ou uma célula do nervo óptico.
207. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a célula diferen- ciada a partir de uma célula-tronco é uma célula iPS-RPE, iPS-PRC, iPS-CEC ou iPS-CE.
208. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a célula diferen- ciada de uma célula-tronco é um neurônio.
209. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações precedentes, caracterizada pelo fato de que (i) a célula isola- da de um indivíduo afetado por uma doença causada por um gene mu- tado ou defeituoso ou um gene codificando uma proteína tendo uma função ou atividade defeituosa ou parcial para uso para reprogramar em uma iPSC, (ii) a célula-tronco isolada de um indivíduo ou célula iPS reprogramada a partir de uma célula isolada de um indivíduo afetado por uma doença causada por um gene mutado ou defeituoso ou um gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial ou (iii) a célula diferenciada de uma célula-tronco isolada de um indivíduo ou uma célula iPS reprogramada a partir de uma célula isolada de um indivíduo afetado por uma doença causada por um gene mutado ou defeituoso ou um gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial é geneticamente reparada para melhorar o efeito do gene mutado ou defeituoso.
210. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o reparo genéti-
co é através de terapia de transferência genética.
211. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações precedentes, caracterizada pelo fato de que reparo genético é através de terapia de transferência genética usando qualquer com- posição ou método de qualquer uma das reivindicações relacionadas à terapia genética.
212. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações precedentes, caracterizada pelo fato de que reparo genético é através de terapia de edição genética.
213. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações precedentes, caracterizada pelo fato de que reparo genético é através de terapia de edição genética usando qualquer composição ou método de qualquer uma das reivindicações relacionadas à terapia de edição genética CRISPR.
214. Método de tratamento ou prevenção de uma doença em um indivíduo afetado por uma doença causada por um gene muta- do ou defeituoso ou um gene codificando uma proteína tendo uma função ou ativi-dade defeituosa ou parcial mostrada na Tabela 4 carac- terizado pelo fato de que compreende administrar uma composição celular de qualquer uma das reivindicações relacionadas a uma com- posição de célula autóloga ao indivíduo, em que a composição celular compreende: células geneticamente reparadas compreendendo célu- las do epitélio pigmentar da retina (RPE), fotorreceptores ou progenito- res fotorreceptores (PRCs), células epiteliais da córnea (CECs), neu- rônios, células endoteliais coroidais (CE) e/ou outras células oculares ou outras células derivadas de uma célula-tronco do indivíduo, e em que o gene mutado ou defeituoso na composição celular foi genetica- mente reparado.
215. Método de tratar autologamente um indivíduo caracte- rizado pelo fato de que compreende:
(h) prover células a partir de um indivíduo tendo uma doença do olho; (ii) induzir pluripotência nas células do indivíduo para produzir iPSCs; (iii) reparar geneticamente uma ou mais mutações em um gene muta- do ou defeituoso mostrado na Tabela 4 nas iPSCs deriva-das do indi- víduo através de terapia de adição de gene; (iv) diferenciar as iPSCs em células oculares ou outras células con- forme necessário para transplante de substituição; (v) alternativa para a etapa (iii), reparar geneticamente as células deri- vadas de iPS através de terapia de transferência genética; e (vi) introduzir as células derivadas de iPS no indivíduo, desta maneira tratando autologamente o indivíduo tendo a doença associada com um gene mutado ou defeituoso (o “gene-alvo”).
216. Método, de acordo com a reivindicação 214 ou 215, caracterizado pelo fato de que a célula-tronco é uma célula iPC, uma MSC, uma célula-tronco adulta ou uma célula-tronco específica de te- cido.
217. Método, de acordo com a reivindicação 216, caracteri- zado pelo fato de que a célula iPS é reprogramada usando um ou mais dos fatores de transcrição OCT4, SOX2, KLF4 e c-MYC.
218. Método, de acordo com a reivindicação 214 ou 215, caracterizado pelo fato de que as células geneticamente reparadas demonstram um ou mais do que segue: um aumento em sequência de ácido nucleico de gene-alvo não defeituoso nas células; um aumento na quantidade de polipeptídeos funcionais codificados pelo gene-alvo nas células; estrutura, morfologia, viabilidade ou função melhorada e/ou função bioquímica melhorada ou normalizada nas células, com- parado com antes do reparo genético ser realizado.
219. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a quantidade de cé-
lulas administradas é cerca de 1.000 a cerca de 10 milhões de células em uma única administração.
220. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a administração é através de injeção, injeção sub-retinal ou injeção intravítrea.
221. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a administração é através de qualquer outro método de administração que eficazmente administre as células ao local sub-retinal, ao segmento posterior ou à córnea do olho do indivíduo ou ao tecido ou órgão com necessidade das células de substituição.
222. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que as células são admi- nistradas através de injeção de suspenção celular.
223. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que as células são admi- nistradas como parte de uma folha, uma matriz, uma base, um tecido ou uma estrutura retinal 3D.
224. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que as células de RPE são administradas usando bases naturais e/ou sintéticas para gerar uma monocamada de RPE funcional.
225. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um in- divíduo humano.
226. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a doença é associa- da com uma alteração genética ou epigenética ou fator de risco no in- divíduo em um gene mostrado na Tabela 4.
227. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-
ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a doença é degene- ração de fotorreceptor, degeneração de célula do epitélio pigmentar da retina, degeneração retinal, degeneração da córnea e/ou distúrbios coroidais.
228. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a doença é uma de- generação retinal herdada (IRD).
229. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a doença é retinite pigmentosa (RP).
230. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a doença é Distrofia Cristalina de Bietti (também conhecida como Distrofia Cristalina Cor- neorretinal de Bietti; BCD).
231. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a doença é relacio- nada à degeneração neurológica.
232. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a doença é distrofia da córnea.
233. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem BCD ou está sob risco de desenvolver BCD.
234. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações precedentes, caracterizada pelo fato de que as células são fibroblastos, células sanguíneas ou células oculares.
235. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações precedentes, caracterizada pelo fato de que as células são obtidas da urina ou de cabelo ou folículos pilosos.
236. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin-
dicações precedentes, caracterizada pelo fato de que as células ocula- res são células epiteliais do pigmento da retina (RPE), células epiteli- ais da córnea (CECs), células endoteliais coroidais (CE) ou células fo- torreceptoras (PRCs).
237. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a alteração ge- nética ou epigenética é selecionada do grupo consistindo em uma mu- tação, uma inserção, um polimorfismo de nucleotídeo único, metilação imprópria, desmetilação imprópria e combinações dos mesmos.
238. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a alteração ge- nética ou epigenética é uma mutação.
239. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a alteração ge- nética ou epigenética nas células iPS-oculares do indivíduo foi geneti- camente reparada usando terapia de edição genética.
240. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o método de te- rapia de edição genética utiliza uma nuclease dedo-de-zinco, tecnolo- gia TALEN ou tecnologia CRISPR.
241. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a alteração ge- nética ou epigenética nas células iPSC-oculares do indivíduo foi gene- ticamente repa-rada usando terapia de transferência genética.
242. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o método de te- rapia de transferência genética utiliza um vetor de AAV recombinante ou um outro vetor viral ou vetor não viral para administrar uma cópia saudável do gene-alvo (por exemplo, cDNA) às células a serem trans- plantadas.
243. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a etapa de adminis- tração acontece antes do início de sintomas da doença ou após o iní- cio de sintomas da doença.
244. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a administração é ao olho ou um outro órgão ou tecido compreendendo neurônios.
245. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a administração é através de injeção, injeção sub-retinal ou intravítrea, injeção retinal di- reta, ou através de implante intravítreo de um dispositivo encapsulan- do o vetor.
246. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a administração é através de qualquer outro método de administração que administre eficazmente as células ao local sub-retinal, ao segmento posterior ou à córnea do olho do indivíduo ou ao tecido ou órgão com necessidade de células de substituição.
247. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, antes da administração ou transplante, realização de análise genotípi- ca nas células para identificar a presença ou ausência da alteração genética ou epigenética em um ou mais genes mostrados na Tabela 4.
248. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a alteração genética ou epigenética é uma mutação.
249. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a mutação é na mo- lécula de ácido nucleico de CYP4V2.
250. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-
ções precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda antes da administração, avaliação do olho do indivíduo para identificar a(s) área(s) e extensão de fotorreceptores, células retinais ou células da córnea danificadas ou retidas.
251. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, seguindo administração, monitoramento do indivíduo.
252. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que o monitoramento compreende realização de imagens retinais não invasivas, testes da córnea, adaptação ao escuro, sensibilidade a contraste, perimetria, ERG, OCT, testes de acuidade visual e/ou estudos funcionais.
253. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que o monitoramento compreende avaliação do indivíduo quanto a uma resposta imune.
254. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, seguindo administração, avaliação do olho do indivíduo para identificar a(s) área(s) e extensão de fotorreceptores, células retinais ou células da córnea danificados ou retidos.
255. Composição caracterizada pelo fato de que compre- ende: (a) um RNA-guia de CRISPR direcionando a uma sequência de ácido nucleico (a “sequência-alvo”) de ou dentro de 100 pbs para um gene-alvo (o “gene-alvo”) e (b) uma proteína associada a CRISPR fun- cional, em uma ribonucleoproteína (RNP) ou complexo de proteína- RNA.
256. Composição, de acordo com a reivindicação 255, ca- racterizada pelo fato de que compreende (c) uma sequência de ácido nucleico doadora compreendendo toda ou uma porção de uma se- quência do tipo selvagem ou uma sequência funcional do gene-alvo para correção ou substituição de tal gene-alvo ou uma porção do mesmo.
257. Composição, de acordo com a reivindicação 255 ou 256, caracterizada pelo fato de que o gene-alvo está envolvido em de- senvolvimento ou função ocular e/ou mutação do qual causa ou é um fator de risco para causar uma doença ocular.
258. Composição, de acordo com a reivindicação 255 ou 256, caracterizada pelo fato de que o gene-alvo está envolvido em de- senvolvimento ou função neuronal e/ou mutação do qual causa ou é um fator de risco para causar uma doença neurodegenerativa.
259. Composição, de acordo com a reivindicação 255 ou 256, caracterizada pelo fato de que o gene-alvo é gene P450 do cito- cromo.
260. Composição, de acordo com a reivindicação 255 ou 256, caracterizada pelo fato de que o gene-alvo compreende um gene mostrado na Tabela 4 que é mutado ou defeituoso ou codifica uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial.
261. Composição, de acordo com a reivindicação 256, ca- racterizada pelo fato de que a sequência de ácido nucleico é provida em um oligonucleotídeo doador de filamento único (ssODN) ou um ve- tor.
262. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 255 a 261, caracterizada pelo fato de que (a) o RNA-guia de CRISPR compreendendo (i) um RNA de CRISPR (crRNA) que com- preende uma sequência de elemento protoespaçador que é comple- mentar à sequência-alvo de ou dentro de 100 pbs para um gene-alvo e uma sequência que corresponde a uma região complementar do crR- NA de transativação (tracrRNA) e (ii) um tracrRNA que compreende uma região que é complementar a regiões correspondentes do crRNA e uma sequência que interage com uma proteína 9 associada a
CRISPR (Cas9) e (b) a proteína associada a CRISPR funcional com- preende Cas9.
263. Composição, de acordo com a reivindicação 261 ou 262, caracterizada pelo fato de que o crRNA e o tracrRNA estão em moléculas de ácido nucleico diferentes.
264. Composição, de acordo com a reivindicação 261 ou 262, caracterizada pelo fato de que o crRNA e o tracrRNA são combi- nados em um RNA-guia único (sgRNA).
265. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 261-264, caracterizada pelo fato de que a Cas9 compreende um ortólogo de Cas9 ou uma Cas9 mutante selecionado de: Strepto- coccus pyogenes (SpCas9), SpCas9 nickase (Cas9n D10A), SpCas9 (D1135E), eS-pCas9, SpCas9-HF1, SpCas9 VRER, SpCas9 VQR, SpCas9EQR, Sta-phylococcus aureus (SaCas9), Neisseria Meningiti- dis, Streptococcus thermophilus, Streptococcus pneumnoniae, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Streptococcus mutans, Pas- teurella multocida, Bifidobacterium longum, Bacillus smithii, Trepone- ma denticola, mycoplasma canis e enterococcus faecalis.
266. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 255 a 265, caracterizada pelo fato de que (a) o RNA-guia de CRISPR compreende um crRNA que compreende uma sequência de elemento protoespaçador que é complementar à sequência-alvo de ou dentro de 100 pbs para um gene-alvo e (b) a proteína associada a CRISPR funcional compreende Cpf1.
267. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 255 a 266, caracterizada pelo fato de que a proteína associ- ada a CRISPR, Cas9 ou Cpf1 compreende ainda uma, duas, três ou mais sequências de localização nuclear (NLS) no terminal N e/ou ter- minal C e/ou um marcador de seleção, incluindo, sem limitação, GFP ou EGFP.
268. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 255 a 267, caracterizada pelo fato de que o elemento protoe- spaçador é 100% complementar à sequência-alvo ou contém 1, 2, 3, 4 ou 5 incompatibilidades de nucleotídeo com a sequência-alvo.
269. Composição, de acordo com a reivindicação 255 ou 256, caracterizada pelo fato de que a sequência de crRNA compreen- de ainda um nucleotídeo G opcionalmente adicionado à sequência de crRNA imediatamente antes do elemento protoespaçador.
270. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 255 a 269, caracterizada pelo fato de que o RNA-guia de CRISPR, crR-NA e/ou o tracrRNA, ou o sgRNA, é quimicamente modi- ficado.
271. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 255 a 270, caracterizada pelo fato de que a versão do tipo selvagem do gene-alvo codificada uma enzima.
272. Composição, de acordo com a reivindicação 255 ou 256, caracterizada pelo fato de que o gene-alvo compreende um gene CYP4V2, CYP1B1, MYO7A, DFNB31, USH1C, USH1G, CDH23, PCDH15, CLRN1, ACO2, AFG3L2, ATXN2, AUH, C12orf65, CISD2, FOXC1, FOXF2, LTBP2, MTPAP, MYOC, NDUFS1, NR2F1, OPA1, OPA3, OPTN, PAX6, PDGF, PITX2, POLG, SPG7, TEK, TXNRD2, WFS1, ABCA4, REP-1, RPE65, CEP290, PDE6B, RPGR, MERTK, MT-ND4, FAM47E, GBA, GCH1, HTRA2, LRRK2, PARK2, PINK1, SNCA, SYNJ1, NPC1, NPC2, CYP4A11, CYP4A22, CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F22, CYP4X1, CYP4Z1 ou gene CYP46A ou um gene CYP4V2, CYP1B1, MYO7A, DFNB31, USH1C, USH1G, CDH23, PCDH15, CLRN1, ACO2, AFG3L2, ATXN2, AUH, C12orf65, CISD2, FOXC1, FOXF2, LTBP2, MTPAP, MYOC, NDUFS1, NR2F1, OPA1, OPA3, OPTN, PAX6, PDGF, PITX2, POLG, SPG7, TEK, TXNRD2, WFS1, ABCA4, REP-1,
RPE65, CEP290, PDE6B, RPGR, MERTK, MT-ND4, FAM47E, GBA, GCH1, HTRA2, LRRK2, PARK2, PINK1, SNCA, SYNJ1, NPC1, NPC2, CYP4A11, CYP4A22, CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F22, CYP4X1, CYP4Z1 ou CYP46A muta- do ou defeituoso que codifica uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial.
273. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 255 a 272, caracterizada pelo fato de que qualquer um ou mais componentes da mesma incluindo o RNA-guia de CRISPR, pro- teína associada a CRISPR, e/ou a sequência de ácido nucleico doado- ra, é provido separadamente e/ou adicionalmente em um vetor, um DNA e/ou um mRNA que pode transcrever e/ou traduzir em tal com- ponente.
274. Formulação farmaceuticamente aceitável caracteriza- da pelo fato de que compreende a composição como definida na rei- vindicação 255 ou 273.
275. Método de tratamento de uma doença de um indivíduo causada por um gene mutado ou defeituoso, ou um gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial, caracte- rizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 255 a
274.
276. Método de tratamento de uma doença ocular ou me- lhora de um fator de risco associado à mesma de um indivíduo causa- da por um gene mutado ou defeituoso, ou um gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma composi- ção como definida em qualquer uma das reivindicações 255 a 157.
277. Método de tratamento de uma doença neurodegenera- tiva ou melhora de um fator de risco relacionado à mesma de um indi-
víduo causada por um gene mutado ou defeituoso, ou um gene codifi- cando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 255, 256 ou 258-276.
278. Método de tratamento de uma doença ou melhora de um fator de risco relacionado à mesma de um indivíduo causada por um gene P450 do citocromo mutado ou defeituoso, ou um gene P450 do citocromo codificando uma proteína tendo função ou atividade de- feituosa ou parcial, caracterizado pelo fato de que compreende admi- nistrar ao indivíduo uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 255 a 277.
279. Método, de acordo com a reivindicação 278, caracteri- zado pelo fato de que o gene mutado ou defeituoso, ou gene codifi- cando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial, rompido, corrigido ou substituído, é uma versão mutada ou defeituosa de um gene mostrado na Tabela 4 ou uma versão de um gene mos- trado na Tabela 4 que codifica uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial.
280. Método, de acordo com a reivindicação 278, caracteri- zado pelo fato de que o gene mutado ou defeituoso, ou gene codifi- cando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial, está presente em fibroblastos, células sanguíneas, de RPE, fotorre- ceptoras, retinais, da córnea, coroidais, oculares, do nervo óptico, de neurônio ou tronco ou qualquer tipo de células derivadas de uma célu- la-tronco.
281. Método, de acordo com a reivindicação 278 ou 279, caracterizado pelo fato de que a composição no mesmo é administra- da a fibroblastos, células sanguíneas, de RPE, fotorreceptoras, reti- nais, da córnea, coroidais, oculares, do nervo óptico, de neurônio ou tronco ou qualquer tipo de células derivadas de uma célula-tronco.
282. Método, de acordo com a reivindicação 281, caracteri- zado pelo fato de que administração é realizada através de eletropora- ção ou através de transfecção mediada por lipídeo ou nucleofecção ou transdução viral ou injeção ou uma combinação dos mesmos.
283. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 278 a 282, caracterizado pelo fato de que qualquer um ou mais componentes do mesmo incluindo o RNA-guia de CRISPR, proteína associada a CRISPR e/ou a sequência de ácido nucleico doadora é administrado ao indivíduo ou às células através de um sistema de ad- ministração selecionado do grupo consistindo em uma ribonucleopro- teína ou complexo de proteína-RNA, uma nanopartícula, um liposso- mo, uma micela, um virossoma, um complexo de ácido nucleico e/ou uma combinação dos mesmos.
284. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 278 a 283, caracterizado pelo fato de que o tratamento é realiza- do para um indivíduo in vivo.
285. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 278-283, caracterizado pelo fato de que o tratamento é realizado in vitro em fibroblastos, células sanguíneas, de RPE, fotorreceptoras, retinais, da córnea, coroidais, oculares, do nervo óptico, de neurônio ou tronco ou qualquer tipo de células derivadas de uma célula-tronco.
286. Método, de acordo com a reivindicação 285, caracteri- zada pelo fato de que as células tratadas são transplantadas para um indivíduo in vivo, ou se a célula-tratada for uma célula-tronco, tal célu- la-tronco é diferenciada no tipo desejado de células para transplante e então as células diferenciadas são transplantadas para um indivíduo in vivo.
287. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 278 a 280, caracterizado pelo fato de que o gene mutado ou de-
feituoso, ou gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial, é substituído.
288. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 278 a 280, caracterizado pelo fato de que o gene mutado ou de- feituoso, ou gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial, tem uma ou mais mutações corrigidas ou substi- tuídas.
289. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 278 a 280, caracterizado pelo fato de que o gene mutado ou de- feituoso, ou gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial, é rompido.
290. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 278 a 280, caracterizado pelo fato de que o gene mutado ou de- feituoso, ou gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial, tem 1-20, 21-40, 41-60, 61-80, 81-100, 101- 1000, 1001-10000 pares de base de nucleotídeos ou mutações rompi- dos, corrigidos ou substituídos.
291. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 278 a 280, caracterizado pelo fato de que uma região do gene mutado ou defeituoso, ou gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial, é rompido, corrigido ou substituído.
292. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 278 a 280, caracterizado pelo fato de que uma região de menos do que cerca de 10, 8, 6, 4, 2 ou 1 kb do gene mutado ou defeituoso, ou gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeitu- osa ou parcial, é rompido, corrigido ou substituído.
293. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 278 a 280, caracterizado pelo fato de que o gene mutado ou de- feituoso, ou gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial, é rompido, corrigido ou substituído através de inserção e/ou deleção de nucleotídeos.
294. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 278 a 280, caracterizado pelo fato de que o gene mutado ou de- feituoso, ou gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial, é rompido, corrigido ou substituído em um alelo ou ambos os alelos.
295. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 278 a 280, caracterizado pelo fato de que dois ou mais RNAs- guia de CRISPR, proteínas associadas a CRISPR e/ou sequências de ácido nucleico doadoras são usados para romper, corrigir ou substituir uma ou mais mutações ou defeitos no gene mutado ou defeituoso ou gene codificando uma proteína tendo função defeituosa ou parcial.
296. Método, de acordo com a reivindicação 278, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é um mamífero.
297. Método, de acordo com a reivindicação 278, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é um humano.
298. Método, de acordo com a reivindicação 278, caracteri- zado pelo fato de que o método melhora desenvolvimento ou função ocular ou previne degeneração ocular, retinal ou da córnea.
299. Método, de acordo com a reivindicação 278, caracteri- zado pelo fato de que o método melhora o desenvolvimento ou função neurológico ou previne degeneração neural.
300. Método, de acordo com a reivindicação 278, caracteri- zado pelo fato de que o método melhora expressão ou função de uma enzima P450.
301. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 255, 257, 258 ou 259, caracterizada pelo fato de que com- preende ainda (c) uma sequência de ácido nucleico doadora compre- endendo todo ou uma porção de um gene-alvo mostrado na Tabela 4 com uma mutação ou alteração para geração de um gene mutado ou alterado ou porção do mesmo.
302. Composição caracterizada pelo fato de que compre- ende uma célula com um gene mutado ou defeituoso mostrado na Ta- bela 4.
303. Composição caracterizada pelo fato de que compre- ende uma célula com um gene CYP4V2, CYP1B1, MYO7A, DFNB31, USH1C, USH1G, CDH23, PCDH15, CLRN1, ACO2, AFG3L2, ATXN2, AUH, C12orf65, CISD2, FOXC1, FOXF2, LTBP2, MTPAP, MYOC, NDUFS1, NR2F1, OPA1, OPA3, OPTN, PAX6, PDGF, PITX2, POLG, SPG7, TEK, TXNRD2, WFS1, ABCA4, REP-1, RPE65, CEP290, PDE6B, RPGR, MERTK, MT-ND4, FAM47E, GBA, GCH1, HTRA2, LRRK2, PARK2, PINK1, SNCA, SYNJ1, NPC1, NPC2, CYP4A11, CYP4A22, CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F22, CYP4X1, CYP4Z1 ou CYP46A mutado ou defei- tuoso compreendendo uma composição de qualquer uma das presen- tes reivindicações.
304. Composição, de acordo com a reivindicação 303, ca- racterizada pelo fato de que o vetor é um vetor de AAV.
305. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a sequência do elemento protoespaçador é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 48 a 52, ou compartilha pelo menos 80% de identidade de se- quência com uma das SEQ ID NOs: 48 a 52, para uso com uma prote- ína Cas que tem NGG como motivo adjacente a protoespaçador (PAM) para se direcionar à mutação c.802-8_810del17insGC do gene CYP4V2.
306. Composição, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácido nucleico doadora é selecionada de SEQ ID NOs: 56 e 57, ou compartilha pelo menos 90% de identidade de sequência com uma de
SEQ ID NO: 56 e 57, ou uma sequência que é complementar à mes- ma, para uso para corrigir, romper ou substituir a mutação c.802- 8_810del17insGC do gene CYP4V2.
307. Método de tratamento de uma doença de um indivíduo causada por um gene mutado ou defeituoso, ou um gene codificando uma proteína tendo função ou atividade defeituosa ou parcial, caracte- rizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma combinação de (i) uma composição direcionando a células doentes existentes no indivíduo compreendendo uma composição de terapia de edição genética ou uma composição de terapia de transferência genética e (ii) uma composição celular compreendendo células de substituição.
308. Método, de acordo com a reivindicação 307, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.
309. Método, de acordo com a reivindicação 307, caracteri- zado pelo fato de que a doença causa degeneração nas células do indivíduo.
310. Método, de acordo com as reivindicações 307 e 308, caracterizado pelo fato de que a degeneração ocorre em uma célula de RPE, uma RPC, uma CEC, uma célula CE, uma célula retinal, uma célula da córnea, uma célula coroidal, uma célula do nervo óptico, uma célula ocular, um neurônio, uma célula neuronal, uma célula cerebral, uma célula do fígado, uma célula do pulmão e uma célula cardíaca.
311. Método, de acordo com a reivindicação 307, caracteri- zado pelo fato de que a doença é causada por um gene mostrado na Tabela 4.
312. Método, de acordo com a reivindicação 307, caracteri- zado pelo fato de que a composição de terapia de edição genética é uma composição como definida em qualquer uma das presentes rei- vindicações de terapia de edição genética.
313. Método, de acordo com a reivindicação 307, caracteri- zado pelo fato de que a composição de terapia de transferência gené- tica é uma composição como definida em qualquer uma das presentes reivindicações de terapia de transferência genética.
314. Método, de acordo com a reivindicação 307, caracteri- zado pelo fato de que a composição celular compreende uma compo- sição como definida em qualquer uma das reivindicações de terapia celular ou das presentes reivindicações de terapia celular autóloga.
315. Método, de acordo com a reivindicação 307, caracteri- zado pelo fato de que a composição celular é alogeneica para o indiví- duo sendo tratado.
316. Método, de acordo com a reivindicação 307, caracteri- zado pelo fato de que a composição celular é autóloga para o indiví- duo sendo tratado.
317. Método, de acordo com a reivindicação 307 ou 314, caracterizado pelo fato de que a composição celular é geneticamente reparada antes da administração ao indivíduo.
318. Método, de acordo com a reivindicação 307 ou 317, caracterizado pelo fato de que o reparo genético é através de terapia de edição genética.
319. Método, de acordo com a reivindicação 307 ou 318, caracterizado pelo fato de que a terapia de edição genética é através de qualquer uma das reivindicações nas presentes reivindicações de terapia de edição genética.
320. Método, de acordo com a reivindicação 307, 318 ou 319, caracterizado pelo fato de que a terapia de edição genética é através de qualquer uma das presentes reivindicações de RNP CRISPR.
321. Método, de acordo com a reivindicação 307 ou 317, caracterizado pelo fato de que o reparo genético é através de terapia de transferência genética.
322. Método, de acordo com a reivindicação 307 ou 321, caracterizado pelo fato de que a terapia de transferência genética é através de qualquer uma das presentes reivindicações de terapia de transferência genética ou terapia genética.
323. Método, de acordo com a reivindicação 307, caracteri- zado pelo fato de que as composições de (i) e (ii) são administradas em uma administração única.
324. Método, de acordo com a reivindicação 307, caracteri- zado pelo fato de que as composições de (i) e (ii) são administradas separadamente ou em administrações separadas.
325. Método, de acordo com a reivindicação 307, caracteri- zado pelo fato de que as células de substituição são derivadas de uma célula-tronco.
326. Método, de acordo com as reivindicações 307 e 325, caracterizado pelo fato de que as células de substituição são deriva- das de uma célula iPS.
327. Método, de acordo com a reivindicação 307 ou 326, caracterizado pelo fato de que a célula iPS é derivada do mesmo indi- víduo sendo tratado.
328. Método, de acordo com a reivindicação 307 ou 326, caracterizado pelo fato de que a célula de substituição é uma célula iPS-RPE, iPS-PRC, iPS-CEC ou iPS-CE.
329. Método, de acordo com a reivindicação 307 ou 326, caracterizado pelo fato de que a célula de substituição é uma célula iPS-ocular.
330. Método, de acordo com a reivindicação 307 ou 326, caracterizado pelo fato de que a célula de substituição é uma célula iPS-neurônio.
331. Método, de acordo com a reivindicação 307, caracteri-
zado pelo fato de que o método melhora o desenvolvimento ou função ocular ou previne degeneração ocular, retinal ou da córnea no indiví- duo.
332. Método, de acordo com a reivindicação 307, caracteri- zado pelo fato de que o método melhora o desenvolvimento ou função neurológico ou previne degeneração neural no indivíduo.
333. Método, de acordo com a reivindicação 307, caracteri- zado pelo fato de que o método melhora expressão ou função de uma enzima P450 no indivíduo.
334. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 307 a 332, caracterizado pelo fato de que o indivíduo sofre de degenerações oculares, retinais, da córnea, coroidais ou neuronais.
BR112020001940-2A 2017-07-31 2018-07-31 modelos celulares de e terapias para doenças oculares BR112020001940A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762539473P 2017-07-31 2017-07-31
US62/539,473 2017-07-31
PCT/IB2018/055755 WO2019025984A1 (en) 2017-07-31 2018-07-31 CELLULAR MODELS AND THERAPIES FOR OCULAR DISEASES

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020001940A2 true BR112020001940A2 (pt) 2020-08-18

Family

ID=65232366

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020001940-2A BR112020001940A2 (pt) 2017-07-31 2018-07-31 modelos celulares de e terapias para doenças oculares

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20200255859A1 (pt)
EP (1) EP3662066B1 (pt)
JP (2) JP7448953B2 (pt)
KR (1) KR20200036912A (pt)
CN (1) CN111630170A (pt)
AU (1) AU2018311504A1 (pt)
BR (1) BR112020001940A2 (pt)
CA (1) CA3071769A1 (pt)
IL (1) IL272339B2 (pt)
MX (1) MX2020001340A (pt)
NZ (1) NZ761655A (pt)
SG (1) SG11202000840YA (pt)
TW (1) TWI820034B (pt)
WO (1) WO2019025984A1 (pt)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10704021B2 (en) 2012-03-15 2020-07-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
CA2935960C (en) 2014-01-08 2023-01-10 Bart Lipkens Acoustophoresis device with dual acoustophoretic chamber
US11377651B2 (en) 2016-10-19 2022-07-05 Flodesign Sonics, Inc. Cell therapy processes utilizing acoustophoresis
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
GB201508026D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Capsid
EP3645021A4 (en) 2017-06-30 2021-04-21 Intima Bioscience, Inc. ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTORS FOR GENE THERAPY
BR112020009889A2 (pt) 2017-12-14 2020-11-03 Flodesign Sonics, Inc. acionador e controlador de transdutor acústico
BR112020010479A2 (pt) 2018-02-15 2020-11-24 Sigma-Aldrich Co. Llc sistemas cas9 geneticamente modificados para modificação de genoma eucariótico
EP3774854A1 (en) 2018-04-03 2021-02-17 Stridebio, Inc. Antibody-evading virus vectors
US11993776B2 (en) 2018-04-17 2024-05-28 Ascidian Therapeutics, Inc. Trans-splicing molecules
WO2020168102A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Sigma-Aldrich Co. Llc Crispr/cas fusion proteins and systems
CN113474461A (zh) * 2019-02-25 2021-10-01 诺华股份有限公司 治疗bietti晶体营养不良的组合物和方法
AU2020229085A1 (en) * 2019-02-25 2021-08-19 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Compositions and methods to treat bietti crystalline dystrophy
US20220047618A1 (en) * 2019-02-28 2022-02-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Adeno-associated virus vectors for the delivery of therapeutics
TW202102525A (zh) 2019-03-21 2021-01-16 美商史崔德生物公司 重組腺相關病毒載體
CN109979539B (zh) * 2019-04-10 2020-10-02 电子科技大学 基因序列优化方法、装置及数据处理终端
JP2022543668A (ja) 2019-08-09 2022-10-13 ナットクラッカー セラピューティクス， インコーポレイテッド マイクロ流体装置およびその使用方法
CA3151021A1 (en) * 2019-08-14 2021-02-18 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Aav capsid variants for gene therapy
CN110684737B (zh) * 2019-08-29 2021-06-18 中山大学中山眼科中心 一种rpe65基因突变患者的诱导多能干细胞
US20240131185A1 (en) * 2019-10-17 2024-04-25 Stridebio, Inc. Aav transfer cassette
MX2022004352A (es) * 2019-10-17 2022-07-19 Stridebio Inc Vectores virales adenoasociados para el tratamiento de la enfermedad de niemann-pick tipo c.
EP4268895A3 (en) * 2019-12-09 2024-01-10 Chigenovo Co., Ltd. Uses of cyp4v2 and rdcvf in preparation of drugs
WO2021159069A2 (en) * 2020-02-07 2021-08-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Reprogramming the metabolome to delay onset or treat neurodegeneration
CN111349148A (zh) * 2020-03-13 2020-06-30 辉大(上海)生物科技有限公司 一种腺相关病毒载体及其用途
CN113106124B (zh) * 2020-06-09 2022-09-23 北京中因科技有限公司 表达cyp4v2的aav载体及其用途
CN111500635B (zh) * 2020-07-02 2020-10-09 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 一种包含携带核酸分子的载体的试剂盒
EP4185335A1 (en) * 2020-07-21 2023-05-31 Frontera Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of ocular diseases
RU2741092C1 (ru) * 2020-07-23 2021-01-22 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кузбасская государственная сельскохозяйственная академия" Генетическая конструкция для получения устойчивых к вирусу лейкоза эмбрионов крупного рогатого скота
WO2022021149A1 (zh) * 2020-07-29 2022-02-03 北京中因科技有限公司 Aav介导的rpgr x连锁视网膜变性的基因编辑治疗
CN111849998A (zh) * 2020-07-29 2020-10-30 武汉纽福斯生物科技有限公司 编码人卵黄状黄斑病蛋白1的核酸分子及其应用
CN111826378B (zh) * 2020-08-05 2022-05-27 武汉纽福斯生物科技有限公司 一种编码人受体酪氨酸激酶Mer的核苷酸序列及其应用
CN111733174B (zh) * 2020-08-07 2021-02-09 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 一种分离的核酸分子及其用途
EP4219719A4 (en) * 2020-09-24 2024-06-05 Chigenovo Co Ltd NUCLEIC ACID MOLECULE TARGETING THE MUTATION SITE OF THE CYP4V2 GENE AND ITS USE
EP4230740A4 (en) * 2020-10-13 2024-05-22 Chigenovo Co Ltd NUCLEIC ACID MOLECULE FOR THE TREATMENT OF CRYSTAL BIETTI DYSTROPHY AND ITS USE
RU2749459C1 (ru) * 2020-11-10 2021-06-11 Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) Универсальный интеграционный вектор pVEAL и рекомбинантная плазмида pVEAL-15742, обеспечивающая синтез и секрецию scFv-Fc антител ADI-15742 против вируса Эбола в клетках млекопитающих и полученная с использованием вектора pVEAL
WO2022140551A1 (en) * 2020-12-23 2022-06-30 The Schepens Eye Research Institute, Inc. Methods and compositions for the treatment of corneal endothelium disorders
CN112852871A (zh) * 2021-01-15 2021-05-28 西南大学 高效编辑家蚕基因组的Cas9系统及其应用
GB202104611D0 (en) * 2021-03-31 2021-05-12 Univ Oxford Innovation Ltd Gene therapy for retinal disease
CN113318230B (zh) * 2021-06-11 2022-08-26 上海交通大学医学院附属第九人民医院 Optineurin在眼部黑色素瘤诊治中的应用
CN118019757A (zh) * 2021-07-14 2024-05-10 梅里特斯英国第二有限公司 Kcnv2基因疗法
EP4370663A1 (en) * 2021-07-15 2024-05-22 Shanghai Vitalgen Biopharma Co., Ltd. Recombinant adeno-associated viral vectors for treating bietti crystalline dystrophy
WO2023140837A1 (en) * 2022-01-19 2023-07-27 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Optimized aav-based vaccine
WO2023028117A1 (en) * 2021-08-24 2023-03-02 Yeh, Teng-Kuang Methods of treating cdgsh iron sulfur domain 2 insufficiency-associated disorders
CN114381465B (zh) * 2021-12-22 2024-01-16 苏州诺洁贝生物技术有限公司 优化的cyp4v2基因及其用途
WO2023147058A2 (en) * 2022-01-27 2023-08-03 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Compositions for treating neurological disease
KR20240000814A (ko) * 2022-06-24 2024-01-03 연세대학교 산학협력단 망막색소상피에 특이적으로 작동하는 CRISPR/Cas 복합체를 유효성분으로 포함하는 망막질환 치료용 약학조성물
WO2024092086A1 (en) * 2022-10-26 2024-05-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for regenerating corneal endothelium
CN116738352B (zh) * 2023-08-14 2023-12-22 武汉大学人民医院（湖北省人民医院） 视网膜血管阻塞疾病的视杆细胞异常分类方法及装置

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5792751A (en) 1992-04-13 1998-08-11 Baylor College Of Medicine Tranformation of cells associated with fluid spaces
US6093570A (en) 1995-06-07 2000-07-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Helper virus-free AAV production
WO1998010086A1 (en) 1996-09-06 1998-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods using cre-lox for production of recombinant adeno-associated viruses
US6114148C1 (en) 1996-09-20 2012-05-01 Gen Hospital Corp High level expression of proteins
ATE298371T1 (de) 1997-09-24 2005-07-15 Univ California Nicht-primaten lentivirale vektoren und verpackungssysteme
US6106826A (en) 1997-12-17 2000-08-22 Wisconsin Alumni Research Foundation Replication competent, avirulent Herpes simplex virus as a vector for neural and ocular gene therapy
US7122181B2 (en) 2000-12-19 2006-10-17 Research Development Foundation Lentiviral vector-mediated gene transfer and uses thereof
WO2003070256A1 (en) 2002-02-15 2003-08-28 Research Development Foundation Hyaluronic acid mediated adenoviral transduction
WO2004023973A2 (en) * 2002-09-12 2004-03-25 Incyte Corporation Molecules for diagnostics and therapeutics
US8326547B2 (en) 2009-10-07 2012-12-04 Nanjingjinsirui Science & Technology Biology Corp. Method of sequence optimization for improved recombinant protein expression using a particle swarm optimization algorithm
US20120108651A1 (en) 2010-11-02 2012-05-03 Leiden University Medical Center (LUMC) Acting on Behalf of Academic Hospital Leiden (AZL) Genetic polymorphisms associated with venous thrombosis and statin response, methods of detection and uses thereof
DE202013012242U1 (de) 2012-05-25 2016-02-02 Emmanuelle Charpentier Zusammensetzungen für die durch RNA gesteuerte Modifikation einer Ziel-DNA und für die durch RNA gesteuerte Modulation der Transkription
EP2692868A1 (en) * 2012-08-02 2014-02-05 Universitat Autònoma De Barcelona Adeno-associated viral (AAV) vectors useful for transducing adipose tissue
PL2931898T3 (pl) 2012-12-12 2016-09-30 Le Cong Projektowanie i optymalizacja systemów, sposoby i kompozycje do manipulacji sekwencją z domenami funkcjonalnymi
JP6552965B2 (ja) 2012-12-12 2019-07-31 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 配列操作のための改善された系、方法および酵素組成物のエンジニアリングおよび最適化
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
DK2954051T3 (da) * 2013-02-08 2019-07-08 Univ Pennsylvania Modificeret kapsid til genoverførsel til behandling af nethinden
CN103374575B (zh) 2013-04-16 2015-01-07 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 Cyp4v2基因突变体及其应用
CN103374574B (zh) * 2013-04-16 2015-01-07 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 Cyp4v2基因突变体及其应用
EP3564379A1 (en) 2013-09-13 2019-11-06 California Institute of Technology Selective recovery
CN103468820B (zh) * 2013-09-27 2015-06-10 中国人民解放军第三军医大学 检测cyp4v2基因常见突变的试剂盒
US10105452B2 (en) 2013-12-06 2018-10-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for expressing a polynucleotide of interest in the retinal pigment epithelium of a subject
CN104745594B (zh) * 2013-12-31 2019-10-25 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 Cyp4v2基因突变体及其应用
CN104745591B (zh) 2013-12-31 2020-04-03 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 Cyp4v2基因突变体及其应用
CN104745592B (zh) * 2013-12-31 2020-02-21 第三军医大学第一附属医院 Cyp4v2基因突变体及其应用
KR20170095365A (ko) 2014-12-18 2017-08-22 유니베르시테 피에르 에 마리에 쿠리에 (파리 6) 망막 변성의 치료를 위한 otx2를 과발현하는 형질전환 rpe 세포
WO2016179496A1 (en) 2015-05-07 2016-11-10 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Methods of delivering an agent to the eye
GB201519086D0 (en) * 2015-10-28 2015-12-09 Syncona Partners Llp Gene Therapy
EP3452101A2 (en) * 2016-05-04 2019-03-13 CureVac AG Rna encoding a therapeutic protein

Also Published As

Publication number Publication date
MX2020001340A (es) 2020-08-31
CN111630170A (zh) 2020-09-04
SG11202000840YA (en) 2020-02-27
AU2018311504A1 (en) 2020-03-12
TWI820034B (zh) 2023-11-01
IL272339A (en) 2020-03-31
JP7448953B2 (ja) 2024-03-13
JP2024059813A (ja) 2024-05-01
EP3662066A4 (en) 2021-06-23
KR20200036912A (ko) 2020-04-07
IL272339B2 (en) 2024-05-01
WO2019025984A1 (en) 2019-02-07
NZ761655A (en) 2024-03-22
US20200255859A1 (en) 2020-08-13
TW201920679A (zh) 2019-06-01
IL272339B1 (en) 2024-01-01
JP2021500917A (ja) 2021-01-14
EP3662066B1 (en) 2024-06-05
EP3662066A1 (en) 2020-06-10
CA3071769A1 (en) 2019-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3662066B1 (en) Cellular models of and therapies for ocular diseases
US20200407750A1 (en) Novel adeno-associated virus (aav) vectors, aav vectors having reduced capsid deamidation and uses therefor
CN105408486B (zh) 衣壳修饰的raav3载体组合物以及在人肝癌基因治疗中的用途
JP2021500917A5 (pt)
KR20210006327A (ko) 캡시드 탈아미드화가 감소된 신규 아데노-연관 바이러스(aav) 벡터 및 이의 용도
US11155817B2 (en) Therapeutic for treatment of diseases including the central nervous system
JP2024038518A (ja) 常染色体優性疾患のための遺伝子編集
BR112019017839A2 (pt) vetor clade f de vírus adeno-associado (aav) e sua utilização
JP2020500541A (ja) ヒト化デュシェンヌ型筋ジストロフィー変異を有するｄｍｄレポーターモデル
TW202233844A (zh) Aav衣殼及含有其之組成物
WO2020014625A1 (en) Methods of treating non-syndromic sensorineural hearing loss
JP2021520837A (ja) トランススプライシング分子
WO2020038473A1 (zh) 重组人ⅱ型线粒体动力蛋白样gtp酶基因序列及其应用
CN111601620A (zh) 用于21-羟化酶缺乏症的腺相关病毒基因疗法
KR20210086638A (ko) 진행성 가족성 간내 담즙정체 3형 (pfic3)의 치료를 위한 코돈-최적화 전이유전자
WO2020187272A1 (zh) 一种用于基因治疗的融合蛋白及其应用
US20240026324A1 (en) Methods and compositions for modulating a genome
US20220177918A1 (en) Methods for treating inherited eye defects
WO2024069144A1 (en) Rna editing vector

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]