BR112019017839A2 - vetor clade f de vírus adeno-associado (aav) e sua utilização - Google Patents

Abstract

a invenção trata de um vetor recombinante de vírus adeno-associado (raav) que compreende um capsídeo aavhu68 produzido em um sistema de produção que compreende uma sequência de nucleótidos de seq id no: 1, ou uma sequência de pelo menos 75% idêntica à mesma, que codifica a seq id no: 2. o cápsídeo aavhu68 compreende subpopulações de resíduos de asparagina altamente desamidadas em asparagina - pares de glicina na sequência de aminoidos de seq id no: 2. também são fornecidas composições que contêm o raav e usos dos mesmos. além disso, de raav tendo uma cside do aav modificadas compreendendo, pelo menos, uma sub-população de proteínas vpl ou vp2 possuindo um val na posição do aminoácido 157 com referência à numeração vpl aavhu68.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “VETOR DE VÍRUS ADENOASSOCIADO (AAV) CLADE F E USOS DO MESMO”.

DECLARAÇÃO CONCERNENTE A PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO PATROCINADO PELO GOVERNO FEDERAL [001 ] Este pedido contém trabalho suportado pela Agência de Projetos de Pesquisa Avançada de Defesa (DARPA) sob W911NF-13-20036. O governo dos EUA pode ter determinados direitos sobre esta invenção.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [002] Vírus adenoassociado (AAV), um membro da família Parvovirus, é um pequeno vírus icosaédrico sem envelope, com genomas de DNA linear de fita simples (ssDNA) de cerca de 4,7 kilobases (kb) longo. O genoma do tipo selvagem compreende repetições terminais invertidas (ITRs) em ambas as extremidades da fita de DNA e dois quadros de leitura abertos (ORFs): rep e cap. O Rep é composto por quatro genes sobrepostos que codificam proteínas rep necessárias para o ciclo de vida do AAV, e o cap contém sequências nucleotídicas sobrepostas de proteínas do capsídeo: VP1, VP2 e VP3, que se automontam para formar um capsídeo de simetria icosaédrica.

[003] O AAV é atribuído ao gênero Dependovirus, porque o vírus foi descoberto como contaminante em estoques de adenovirus purificados. O ciclo de vida do AAV inclui uma fase latente na qual os genomas do AAV, após a infecção, são especificamente integrados nos cromossomos hospedeiros e uma fase infecciosa na qual, após a infecção pelo vírus adenovirus ou herpes simplex, os genomas integrados são subsequentemente resgatados, replicados e empacotados em vírus infecciosos. As propriedades da não-patogenicidade, ampla gama de infectividade do hospedeiro, incluindo células não-divisórias e a integração cromossômica potencial do sítio específico tornam o AAV uma ferramenta

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2/144 atraente para a transferência de genes.

[004] Os vetores de vírus adenoassociados recombinantes (rAAV) derivados do parvovirus humano com defeito de replicação foram descritos como veículos adequados para a entrega de genes. Normalmente, os genes rep funcionais e o gene cap são removidos do vetor, resultando em um vetor incompetente para replicação. Essas funções são fornecidas durante o sistema de produção vetorial, mas ausentes no vetor final.

[005] Até o momento, houve vários AAVs bem caracterizados isolados de primatas humanos ou não humanos (NHP). Verificou-se que os AAV de diferentes sorotipos exibem diferentes eficiências de transfecção e exibem tropismo para diferentes células ou tecidos. Muitos Clade s de AAV diferentes foram descritos no documento WO 2005/033321, incluindo o Clade F, que é identificado nele como tendo apenas três membros, AAV9, AAVhu31 e AAVhu32. Uma análise estrutural de AAV9 é fornecida em M.A. DiMattia et al, J. Virol. (Junho 2012) vol. 86 no. 12 6947-6958. Este artigo relata que o AAV9 possui 60 cópias (no total) das três proteínas variáveis (vps) que são codificadas pelo gene cap e possuem sequências sobrepostas. Isso inclui VP1 (87 kDa), VP2 (73 kDa) e VP3 (62 kDa), que estão presentes em uma proporção prevista de 1:1:10, respectivamente. Toda a sequência do VP3 está dentro do VP2 e todo o VP2 está dentro do VP1. O VP1 possui um domínio N-terminal exclusivo. As coordenadas refinadas e os fatores de estrutura estão disponíveis no item n^Q de acesso. 3UX1 do banco de dados RCSB PDB.

[006] Várias variantes diferentes de AAV9 foram projetadas para desarmar ou atingir tecidos diferentes. Ver, por exemplo, N. Pulicheria, Engineering Liver-detargeted AAV9 Vectors for Cardiac and Musculoskeletal Gene Transfer, Molecular Therapy, Vol, 19, no. 6, p. 1070-1078 (Junho 2011). Também foi relatado o desenvolvimento de variantes do

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AAV9 para entregar genes através da barreira hematoencefálica. Ver, por exemplo, B.E. Deverman et al, Nature Biotech, Vol. 34, No. 2, p 204 - 211 (publicado online 1 Fev 2016) and Caltech press release, A. Wetherston, www.neurology-central.com/2016/02/10/successful-delivery-ofgenes-through-the-blood-brain-barrier/, accessed 10/05/2016. Ver também WO 2016/0492301 e US 8.734.809.

[007] O que é desejável são construtos baseados em AAV para entrega de moléculas heterólogas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [008] São descritas novas sequências de capsídeo e rep de AAVhu68, que são úteis na fabricação e em vetores para a entrega de moléculas de ácido nucleico às células hospedeiras. Em certas modalidades, é fornecido um AAV recombinante que possui um capsídeo AAVhu68 que é codificado por uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de ácido nucleico pelo menos 70% idêntica à SEQ ID NO: 1, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntico à SEQ ID NO: 1, que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[009] Em uma modalidade, é fornecido um vírus adenoassociado recombinante (rAAV) que compreende: (A) um capsídeo AAV68 compreendendo um ou mais dentre: (1) proteínas do capsídeo AAV hu68 compreendendo: proteínas AAVhu68 vp1 produzidas por expressão de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos prevista de 1 a 736 da SEQ ID NO: 2, proteínas vp1 produzidas a partir da SEQ ID NO: 1 ou proteínas vp1 produzidas a partir de uma sequência de ácido nucleico pelo menos 70% idêntica à SEQ ID NO: 1 que codifica a sequência de aminoácidos prevista de 1 a 736 da SEQ ID NO: 2, proteínas AAVhu68 vp2 produzidas por expressão de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos

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4/144 prevista de pelo menos cerca dos aminoácidos 138 a 736 da SEQ ID NO: 2, proteínas vp2 produzidas a partir de uma sequência compreendendo pelo menos os nucleotídeos 412 a 2211 da SEQ ID NO: 1, ou proteínas vp2 produzidas a partir de uma sequência de ácido nucleico pelo menos 70% idêntica a pelo menos os nucleotídeos 412 a 2211 da SEQ ID NO: 1 que codifica a sequência de aminoácidos prevista de pelo menos cerca dos aminoácidos 138 a 736 da SEQ ID NO: 2, proteínas AAVhu68 vp3 produzidas por expressão de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos prevista de pelo menos cerca dos aminoácidos 203 a 736 da SEQ ID NO: 2, proteínas vp3 produzidas a partir de uma sequência compreendendo pelo menos os nucleotídeos 607 a 2211 da SEQ ID NO: 1, ou proteínas vp3 produzidas a partir de uma sequência de ácido nucleico pelo menos 70% idêntica a pelo menos os nucleotídeos 607 a 2211 da SEQ ID NO: 1 que codifica a sequência de aminoácidos prevista de pelo menos cerca dos aminoácidos 203 a 736 da SEQ ID NO: 2; e/ou (2) proteínas do capsídeo AAV compreendendo uma população heterogênea de proteínas vp1 opcionalmente compreendendo uma valina na posição 157 e/ou um ácido glutâmico na posição 67, uma população heterogênea de proteínas vp2 opcionalmente compreendendo uma valina na posição 157 e uma população heterogênea de proteínas vp3, em que pelo menos uma subpopulação das proteínas vp1 e vp2 compreende uma valina na posição 157 e opcionalmente compreendendo ainda um ácido glutâmico na posição 67 com base na numeração do capsídeo vp1 da SEQ ID NO: 2; e/ou (3) uma população heterogênea de proteínas vp1 que são o produto de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, uma população heterogênea de proteínas vp2 que são o produto de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de pelo menos cerca dos aminoácidos 138 a 736 da SEQ ID NO: 2 e uma população heterogênea de

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5/144 proteínas vp3 que são o produto de uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos os aminoácidos 203 a 736 da SEQ ID NO: 2, em que: as proteínas vp1, vp2 e vp3 contêm subpopulações com modificações de aminoácidos compreendendo pelo menos duas asparaginas (N) altamente desamidadas em pares asparagina-glicina na SEQ ID NO: 2 e, opcionalmente, compreendendo subpopulações compreendendo outros aminoácidos desamidados, em que a desamidação resulta em uma alteração de aminoácidos; e (B) um genoma de vetor no capsídeo AAVhu68, o genoma de vetor compreendendo uma molécula de ácido nucleico compreendendo sequências repetidas terminais invertidas AAV e uma sequência de ácido nucleico não-AAV que codifica um produto operacionalmente ligado a sequências que direcionam a expressão do produto em uma célula hospedeira. Por exemplo, quatro resíduos (N57, N329, N452, N512) exibem rotineiramente altos níveis de desamidação. Resíduos adicionais (N94, N253, N270, N304, N409, N477 e Q599) também exibem níveis de desamidação de até -20% em vários lotes.

[010] Em certas modalidades, as asparaginas desamidadas são desamidadas em ácido aspártico, ácido iso-aspártico, um par de ácido aspártico interconversor/ácido iso-aspártico, ou combinações dos mesmos. Em certas modalidades, a(s) glutamina(s) desamidada(s) é(são) desamidada(s) em ácido (a)-glutâmico, ácido γ-glutâmico, um par de interconversão de ácido (a)-glutâmico/ácido γ-glutâmico ou combinações dos mesmos.

[011] Em certas modalidades, o capsídeo AAVhu68 compreende subpopulações possuindo um ou mais de: (a) pelo menos 65% das asparaginas (N) em pares asparagina-glicina localizados nas posições 57 das proteínas vp1 são desamidadas, com base na numeração de SEQ ID NO: 2; (b) pelo menos 75% das N em pares asparagina-glicina na posição 329 das proteínas vp1, v2 e vp3 são desamidadas, com base

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6/144 na numeração de resíduos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; (c) pelo menos 50% das N em pares asparagina-glicina na posição 452 das proteínas vp1, v2 e vp3 são desamidadas, com base na numeração de resíduos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; e/ou (d) pelo menos 75% das N em pares asparagina-glicina na posição 512 das proteínas vp1, v2 e vp3 são desamidadas, com base na numeração de resíduos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:

2. Em certas modalidades, o capsídeo hu68 compreende uma subpopulação de vp1 na qual 75% a 100% das N na posição 57 das proteínas vp1 são desamidadas, conforme determinado por espectrometria de massas. Em certas modalidades, o capsídeo hu68 compreende uma subpopulação de proteínas vp1, proteínas vp2 e/ou proteínas vp3 nas quais 75% a 100% das N na posição 329, com base na numeração da SEQ ID NO: 2, são desamidadas conforme determinado usando espectrometria de massas. Em certas modalidades, o capsídeo hu68 compreende uma subpopulação de proteínas vp1, proteínas vp2 e/ou proteínas vp3 nas quais 75% a 100% das N na posição 452, com base na numeração da SEQ ID NO: 2, são desamidadas conforme determinado usando espectrometria de massas. Em certas modalidades, o capsídeo hu68 compreende uma subpopulação de proteínas vp1, proteínas vp2 e/ou proteínas vp3 nas quais 75% a 100% das N na posição 512, com base na numeração da SEQ ID NO: 2, são desamidadas. Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica as proteínas é SEQ ID NO:1, ou uma sequência de pelo menos 80% a pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 1 que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2. Em certas modalidades, a sequência é pelo menos 80% a 97% idêntica à SEQ ID NO:1. Em certas modalidades, o capsídeo rAAVhu68 compreende ainda pelo menos uma subpopulação de proteínas vp1, vp2 e/ou vp3 possuindo modificações de aminoácidos em relação à SEQ ID NO: 2 compreendendo pelo menos cerca de 50 a 100% de

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7/144 desamidação de pelo menos quatro posições selecionadas de uma ou mais dentre N57, 329, 452, 512, ou combinações das mesmas. Em certas modalidades, o capsídeo hu68 compreende subpopulações de proteínas vp1, vp2 e/ou vp3 que compreendem ainda de 1% a cerca de 40% de desamidação em pelo menos uma ou mais das posições N94, N113, N252, N253, Q259, N270, N303, N304, N305, N319, N328, N336, N409, N410, N477, N515, N598, Q599, N628, N651, N663, N709, ou combinações das mesmas. Em certas modalidades, o capsídeo hu68 compreende as subpopulações de proteínas vp1, vp2 e/ou vp3 que compreendem ainda uma ou mais modificações selecionadas dentre uma ou mais modificações em um ou mais dos seguintes: lisina acetilada, serina e/ou treonina fosforilada, ácido aspártico isomerizado, triptofano e/ou metionina oxidada, ou um aminoácido amidado. Em certas modalidades, o rAAVhu68 compreende cerca de 60 proteínas totais do capsídeo em uma proporção de cerca de 1 vp1 a cerca de 1 a 1,5 vp2 a 3 a 10 proteínas vp3. Em certas modalidades, o capsídeo AAVhu68 compreende cerca de 60 proteínas totais do capsídeo em uma proporção de cerca de 1 vp1 a cerca de 1 vp2 a 3 a 9 proteínas vp3. Em certas modalidades, o genoma do vetor compreende sequências AAV ITR de uma fonte de AAV diferente de AAVhu68.

[012] Em certas modalidades, é fornecida uma composição que compreende uma população mista de vírus adenoassociado recombinante hu68 (rAAVhu68), em que cada um dos rAAVhu68 é selecionado independentemente a partir de um rAAVhu68, conforme descrito neste documento. Em certas modalidades, o capsídeo AAVhu68 regular compreende cerca de 60 proteínas totais do capsídeo em uma proporção de cerca de 1 vp1 a cerca de 1 a 1,5 vp2 a 3 a 10 proteínas vp3. Em certas modalidades, o capsídeo AAVhu68 regular compreende cerca de 60 proteínas totais do capsídeo em uma proporção de cerca de 1 vp1 a

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8/144 cerca de 1 vp2 a 3 a 6 proteínas vp3. Em certas modalidades, a composição é formulada para entrega intratecal e o genoma do vetor compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um produto para entrega ao sistema nervoso central. Em certas modalidades, a composição é formulada para distribuição intratecal. Em certas modalidades, o genoma do vetor compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo anti-HER2. Em certas modalidades, a composição é formulada para distribuição intranasal ou intramuscular. Em certas modalidades, uma composição compreende pelo menos um estoque de vetores rAAVhu68 e um veículo, excipiente e/ou conservante opcional. [013] Em certas modalidades, é fornecido o uso de um rAAVhu68 ou de uma composição como aqui descrito para a entrega de um produto genético desejado a um sujeito em necessidade.

[014] Em certas modalidades, é fornecido um sistema de produção de rAAV útil para produzir um AAVhu68 recombinante. O sistema de produção compreende: (a) uma sequência de ácido nucleico do capsídeo AAVhu68 que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; (b) uma molécula de ácido nucleico adequada para o empacotamento no capsídeo AAVhu68, a referida molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos uma repetição terminal invertida de AAV (ITR) e uma sequência de ácido nucleico não-AAV que codifique um produto genético operativamente ligado a sequências que expressam diretamente o produto em uma célula hospedeira; e (c) funções de rep e funções auxiliares do AAV suficientes para permitir o empacotamento da molécula de ácido nucleico no capsídeo AAVhu68 recombinante. Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico de (a) compreende pelo menos a SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de pelo menos 70% a pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO:1 que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2. Em certas modalidades, o sistema opcionalmente compreende ainda uma sequência de ácido nucleico de

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9/144 cerca de nt 607 a cerca de nt 2211 da SEQ ID NO: 1 que codifica a AAVhu68 vp3 de cerca de aa 203 a cerca do aminoácido 736 da SEQ ID NO: 2. Em certas modalidades, o sistema compreende células 293 de rim embrionário humano ou um sistema de baculovírus.

[015] Em certas modalidades, é fornecido um método para reduzir a desamidação de um capsídeo AAVhu68. O método compreende a produção de um capsídeo de AAVhu68 a partir de uma sequência de ácido nucleico contendo códons de vp de AAVhu68 modificados, com a sequência de ácido nucleico compreendendo códons de glicina independentemente modificados em de um a três dos pares de arginina glicina localizados nas posições 58, 330, 453 e/ou 513 na SEQ ID NO: 2, de modo que o códon modificado codifique um aminoácido diferente de glicina. Em certas modalidades, o método compreende a produção de um capsídeo AAVhu68 a partir de uma sequência de ácido nucleico contendo códons de vp de AAVhu68, com a sequência de ácido nucleico compreendendo códons de arginina independentemente modificados em de um a três dos pares de arginina - glicina localizados nas posições 57, 329, 452 e/ou 512 na SEQ ID NO:2, de modo de que o códon modificado codifique um aminoácido diferente de arginina. Em certas modalidades, cada códon modificado codifica um aminoácido diferente. Em certas modalidades, dois ou mais códons modificados codificam o mesmo aminoácido. Em certas modalidades, um capsídeo AAVhu68 mutante, conforme descrito neste documento, contém uma mutação em um par arginina-glicina, de modo que a glicina seja alterada para uma alanina ou serina. Um capsídeo AAVhu68 mutante pode conter um, dois ou três mutantes, onde o AAVhu68 de referência contém nativamente quatro pares NG. Em certas modalidades, um capsídeo AAVhu68 mutante contém apenas uma única mutação em um par NG. Em certas modalidades, um capsídeo AAV mutante contém mutações em dois pares de NG diferentes. Em certas modalidades, um capsídeo AAVhu68

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10/144 mutante contém mutações em dois pares NG diferentes que estão localizados em uma localização estruturalmente separada no capsídeo AAVhu68. Em certas modalidades, a mutação não está na região exclusiva de VP1. Em certas modalidades, uma das mutações está na região exclusiva de VP1. Opcionalmente, um capsídeo AAVhu6 mutante não contém modificações nos pares NG, mas contém mutações para minimizar ou eliminar a desamidação em uma ou mais asparaginas, ou uma glutamina, localizadas fora de um par NG.

[016] Em certas modalidades, é fornecido um rAAVhu68 mutante que compreende um capsídeo rAAVhu68 modificado com desamidação reduzida em comparação com um capsídeo AAVhu68 não modificado, que é produzido usando o método aqui descrito.

[017] Ainda em um aspecto adicional, é fornecido um método para aumentar o rendimento e/ou a eficiência de empacotamento de um vetor adenoassociado recombinante (rAAV). O método compreendendo a manipulação de um gene do capsídeo AAV para expressar uma proteína vp1 Vai na posição de aminoácido 157, em que a numeração dos resíduos de aminoácidos se baseia na vp1 completa de AAVhu68 [SEQ ID NO:2]. Em certas modalidades, é fornecido um Clade F rAAV com um ácido glutâmico (Glu ou E) na posição de aminoácido 67 com base na numeração da SEQ ID NO: 2.

[018] Ainda em uma modalidade adicional, é fornecido um rAAV manipulado produzido de acordo com este método.

[019] Em uma modalidade adicional, é fornecida uma partícula AAVhu68 que expressa um anticorpo anti-HER2 útil para tratamento e/ou profilaxia de cânceres HER2+.

[020] Em ainda uma outra modalidade, uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína rep AAVhu68 ou um fragmento funcional da mesma sob o controle de sequências de controle reguladoras exógenas cuja expressão direta em

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11/144 uma célula hospedeira é fornecida. Em uma modalidade, a proteína rep possui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, ou um fragmento funcional da mesma.

[021 ] Estes e outros aspectos da invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada seguinte da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [022] A FIGURA 1 fornece um alinhamento mostrando a sequência de aminoácidos da proteína de capsídeo vp1 de AAVhu68 [SEQ ID NO: 16] (marcado como hu.68.vp1 em alinhamento), com AAV9 [SEQ ID NO: 6], AAVhu31 (rotulado hu.31 em alinhamento) [SEQ ID NO: 10] e AAVhu32 (marcado hu.32 em alinhamento) [SEQ ID NO: 11]. Comparadas a AAV9, AAVhu31 e AAVhu32, duas mutações (A67E e A157V) foram consideradas críticas no AAVhu68 e circuladas na FIGURA.

[023] As FIGURAS 2A-2C fornecem um alinhamento da sequência de ácido nucléico que codifica a proteína de capsídeo vp1 de AAVhu68, com AAV9, AAVhu31 [SEQ ID NO:12] e AAVhu32 [SEQ ID NO:13].

[024] As FIGURAS 3A-3B fornecem gráficos mostrando os rendimentos de AAVhu.68 em comparação com o AAV9. A experiência foi realizada como descrito no Exemplo 2. n=6. O valor de P foi calculado e mostrado nas figuras.

[025] A FIGURA 3A mostra os rendimentos de AAVhu.68 e AAV9 do lisado total. O valor de p foi calculado como 0,4173 e determinado como não significativo.

[026] A FIGURA 3B mostra os rendimentos de AAVhu.68 e AAV9 do sobrenadante da cultura. O rendimento de AAVhu.68 no sobrenadante é significativamente maior que o do AAV9 com um valor de p em 0,0003.

[027] As FIGURAS 4A-4C fornecem coloração imuno-histoquímica de vários órgãos (coração, fígado, pulmão e músculo) de camundongos administrados com 5x10¹¹ GC AAVhu68.CB7.nl_acZ. As amostras foram

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12/144 preparadas e processadas como descrito no Exemplo 3. As amostras foram contrastadas com Eosin mostradas em vermelho. Uma coloração positiva para LacZ mostrada em azul indica uma transdução bem-sucedida de AAVhu68.

[028] A FIGURA 4A fornece coloração imuno-histoquímica de vários órgãos (coração, fígado, pulmão e músculo) de camundongos administrados com 5x10¹¹ GC AAVhu68.CB7.nl_acZ por via intravenosa (IV). Todos os órgãos testados demonstraram transdução do AAVhu68, enquanto foi observado um tropismo favorável ao coração e ao fígado, sobre pulmão e músculo.

[029] A FIGURA 4B fornece coloração imuno-histoquímica de vários órgãos (coração, fígado, pulmão e músculo) de camundongos administrados com 5x10¹¹ GC AAVhu68.CB7.nl_acZ intramuscularmente (IM). Coração, fígado e músculo demonstraram alta taxa de transdução de AAVhu68, enquanto nenhuma transdução detectável no pulmão foi observada.

[030] A FIGURA 4C fornece coloração imuno-histoquímica de vários órgãos (coração, fígado, pulmão e músculo) de camundongos administrados com 5x10¹¹ GC AAVhu68.CB7.nl_acZ intranasalmente (IN). Foi observada transdução dispersa no coração, fígado, músculo e pulmão.

[031] As FIGURAS 5A-5C fornecem imagens microscópicas fluorescentes de várias regiões do cérebro (hipocampo, FIG 5A; córtex motor, FIG 5B; e cerebelo, FIG 5C) de camundongos administrados com AAVhu68.GFP ou AAV9.GFP nas doses de 1x10¹⁰ GC ou 1x10¹¹ GC. As amostras foram preparadas e processadas como descrito no Exemplo 4. Um sinal positivo da GFP mostrado em verde indica uma transdução bem-sucedida dos vetores AAV.

[032] A FIGURA 5A fornece imagens microscópicas fluorescentes de lâminas de hipocampo de camundongos administrados com AAVhu68.GFP

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13/144 ou AAV9.GFP nas doses de 1x10¹⁰ GC ou 1x10¹¹ GC. Amostras correspondentes de camundongos não tratados corados com corante de ácido nucleico mostrado em azul foram fornecidas como controle negativo. A transdução dos vetores de AAV foi observada em todas as amostras testadas, exceto uma de camundongos injetados com 1x10¹⁰ GC de AAV9.GFP.

[033] A FIGURA 5B fornece imagens microscópicas fluorescentes de córtex motor de camundongos administrados com AAVhu68.GFP ou AAV9.GFP nas doses de 1x10¹° GC ou 1x10¹¹ GC. Uma melhor transdução de AAVhu68.GFP comparado ao de AAV9 foi observado.

[034] A FIGURA 5C fornece imagens microscópicas fluorescentes de lâminas de cerebelo de camundongos administrados com AAVhu68.GFP ou AAV9.GFP nas doses de 1x10¹°GCou 1x10¹¹ GC. Uma transdução bem-sucedida de AAVhu68.A GFP foi observada quando os camundongos foram injetados com 1x10¹¹ GC do vetor.

[035] As FIGURAS 6A-6D fornecem imagens microscópicas de vários órgãos (fígado, rim, coração e pâncreas) de camundongos administrados com AAVhu68.GFP por via intravenosa. As amostras foram preparadas e processadas como descrito no Exemplo 4. Um sinal positivo da GFP mostrado em verde indica uma transdução bem-sucedida dos referidos vetores AAV. Imagens de campo brilhantes mostradas em preto e branco foram fornecidas para a morfologia do órgão, enquanto o canal fluorescente vermelho correspondente foi fornecido como controle negativo, quando aplicável.

[036] A FIGURA 6A fornece imagens microscópicas de uma seção representativa do fígado de camundongos administrados com AAVhu68.GFP por via intravenosa. Sinal positivo mostrado em verde foi observado.

[037] A FIGURA 6B fornece imagens microscópicas de uma seção renal representativa de camundongos administrados com AAVhu68.GFP

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14/144 por via intravenosa. Sinal positivo mostrado em verde foi observado.

[038] A FIGURA 6C fornece imagens microscópicas de uma seção cardíaca representativa de camundongos administrados com AAVhu68.GFP por via intravenosa. Sinal positivo mostrado em verde foi observado.

[039] A FIGURA 6D fornece imagens microscópicas de uma seção do pâncreas representativa de camundongos administrados com AAVhu68.GFP por via intravenosa. Sinal positivo mostrado em verde foi observado.

[040] A FIGURA 7 é uma imagem de um aparelho para distribuição intracisternal, incluindo agulha introdutora opcional para o método de inserção coaxial, que inclui uma seringa vetorial de 10 cc, uma seringa de descarga pré-cheia de 10 cc, um conjunto de extensão do conector T, uma agulha espinhal de 22G x 5, uma agulha introdutora opcional de 18Gx3,5.

[041 ] As FIGURAS 8A-8B ilustram o rendimento de produção para dois vetores AAVhu68 diferentes preparados em pequena escala (FIG 8A) e em escala muito grande (mega, FIG 8B) em comparação com vetores com capsídeos diferentes. Os dados para as preparações de vetor em pequena escala foram gerados usando vetores com um capsídeo AAVhu68, AAV9, AAV8 ou AAV8 e com um genoma de vetor compreendendo um promotor de citomegalovírus (CMV), uma sequência de codificação de luciferase de vaga-lume e um SV40 poli A (CMV.ffLuciferase.SV40). As preparações em mega escala foram avaliadas usando os vetores triplo AAVhu68, AAV9, AAV8 ou AAV8 com um genoma de vetor com promotor de CMV, um íntron, uma sequência de codificação de imunoadesina (201 Ig IA) e um SV40 poli A.

[042] A FIGURA 9 fornece pureza de produção para vetores AAVhu68 preparados em mega escala em comparação com vetores com capsídeos diferentes, incluindo o AAV8triplo, AAV9 e AAV8. As preparações

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15/144 foram avaliadas usando vetores triplos AAVhu68, AAV9, AAV8 ou AAV8 com um genoma de vetor compreendendo um promotor de CMV, um íntron, uma sequência de codificação de imunoadesina (201 Ig IA) e um SV40 poli A.

[043] As FIGURAS 10A -10B fornecem o nível de expressão do transgene de vetores AAVhu68 em camundongos RAG KO machos (n = 5/grupo) injetados por via intramuscular com 3x10¹¹ GC/camundongos (FIG 10A) ou 3x10¹⁰GC/camundongo (FIG 10B) do vetor comparado ao de vetores com capsídeos diferentes, incluindo AAV8triplo, AAV9 e AAV8. O transgene expresso pelos vetores rAAV é uma sequência codificadora de imunoadesina (201 Ig IA). A Experiência foi realizada conforme descrito em detalhes no Exemplo 8.

[044] As FIGURAS 11A-11B fornecem o nível de expressão do transgene de vetores AAVhu68 no fígado (FIG 11 A) ou no músculo (FIG 11B) de camundongos machos C57BL/6J (n = 5/grupo) injetados intramuscularmente com 3x10¹¹ GC/camundongos do vetor em comparação com a de vetores com capsídeos diferentes, incluindo o AAV8triplo, AAV9 e AAV8. O transgene expresso pelos vetores rAAV é a luciferase de Vagalume. A Experiência foi realizada conforme descrito em detalhes no Exemplo 9.

[045] A FIGURA 12 fornece o nível de expressão do transgene de vetores AAVhu68 em macacos cynomolgos machos e fêmeas injetados intramuscularmente com 1x10¹³ GC/kg de peso corporal do vetor em comparação com os vetores com capsídeos diferentes, incluindo o AAV8triplo, AAV9 e AAV8. O transgene expresso pelos vetores rAAV é uma sequência codificadora de imunoadesina (201 Ig IA). A Experiência foi realizada conforme descrito em detalhes no Exemplo 10.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [046] São fornecidas aqui sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos de um novo vírus adenoassociado isolado (AAV), que é denominado

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16/144 aqui AAVhu68, que está dentro do Clade F. AAVhu68 (anteriormente denominado aqui AAV3G2) varia de outro vírus Clade F de AAV9 (SEQ ID NO: 5) por dois aminoácidos codificados nas posições 67 e 157 da vp1, SEQ ID NO: 2. Por outro lado, o outro Clade F de AAV (AAV9, hu31, hu31) têm um Ala na posição 67 e um Ala na posição 157. São fornecidos novos capsídeos AAVhu68 e/ou capsídeos manipulados de AAV com valina (Vai ou V) na posição 157 com base na numeração da SEQ ID NO: 2 e, opcionalmente, um ácido glutâmico (Glu ou E) na posição 67. Em certas modalidades, a proporção de proteínas vp3 no capsídeo AAVhu68 em relação às proteínas vp1 e vp2 é menor do que o descrito anteriormente para os capsídeos de AAV9 e outro de Clade F de AAVs. Em certas modalidades, o capsídeo AAVhu68 é composto por proteínas vp1 de AAVhu68, proteínas vp2 de AAVhu68 e proteínas vp3 de AAVhu68 em uma proporção de cerca de 1 vp1: 1 a cerca de 1,5 vp2: a 3 a cerca de 10 vp3. Em certas modalidades, um estoque de vírus rAAVhu68 ou uma população de rAAVhu68 é uma composição que tem uma média de cerca de 60 proteínas vp 1, vp2 e vp3 totais no capsídeo AAVhu68, que estão presentes na proporção vp1: vp2: vp3 média de cerca de 1: cerca de 1: a cerca de 3 a 6. Estes capsídeos AAV descritos aqui são úteis para gerar vetores AAV recombinantes (rAAV) que são fornecidos com bom rendimento e/ou eficiência de empacotamento e fornecem vetores rAAV úteis na transdução de vários tipos diferentes de células e tecidos. Tais células e tipos de tecidos podem incluir, sem limitação, pulmão, coração, músculo, fígado, pâncreas, rim, cérebro, hipocampo, córtex motor, cerebelo, células epiteliais nasais, células musculares cardíacas ou cardiomiócitos, hepatócitos, células endoteliais pulmonares, miócitos, pulmões células epiteliais, células de ilhotas, células acinares, células renais e neurônios motores.

[047] Um “AAV recombinante” ou “rAAV” é uma partícula viral resistente a DNAse contendo dois elementos, um capsídeo AAV e um genoma

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17/144 de vetor contendo pelo menos sequências de codificação não-AAV empacotadas dentro do capsídeo AAV. Salvo indicação em contrário, este termo pode ser usado de forma intercambiável com a frase vetor rAAV. O rAAV é um vírus deficiente na replicação ou vetor viral, uma vez que não possui qualquer gene AAV rep funcional ou gene AAV cap funcional e não pode gerar descendência. Em certas modalidades, as únicas sequências de AAV são as sequências repetidas terminais invertidas (ITRs) de AAV, tipicamente localizadas nas extremidades 5' e 3' extremas do genoma do vetor, a fim de permitir que as sequências reguladoras e de genes localizadas entre as ITRs sejam empacotadas dentro do capsídeo AAV.

[048] Conforme utilizado neste documento, um genoma de vetor refere-se à sequência de ácido nucleico empacotada dentro do capsídeo rAAV que forma uma partícula viral. Tal sequência de ácido nucleico contém sequências repetidas terminais invertidas AAV (ITRs). Nos exemplos apresentados neste documento, um genoma de vetor contém, no mínimo, de 5 'a 3', uma AAV 5' ITR, sequência(s) de codificação e uma AAV 3' ITR. Podem ser selecionadas ITRs do AAV2, um AAV de origem diferente do capsídeo ou que não sejam as ITRs completas. Em certas modalidades, as ITRs são da mesma fonte de AAV que o AAV, que fornece a função rep durante a produção ou um AAV transcomplementar. Além disso, outras ITRs podem ser utilizadas. Além disso, o genoma do vetor contém sequências reguladoras que direcionam a expressão dos produtos gênicos. Os componentes adequados de um genoma de vetor são discutidos em mais detalhes neste documento.

[049] Um rAAVhu68 é composto por um capsídeo AAVhu68 e um genoma de vetor. Um capsídeo AAVhu68 é um conjunto de uma população heterogênea de proteínas vp1, uma população heterogênea de proteínas vp2 e uma população heterogênea de proteínas vp3. Conforme utilizado neste documento, quando utilizado para se referir às proteínas do

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18/144 capsídeo vp, o termo heterogêneo ou qualquer variação gramatical dos mesmos, refere-se a uma população que consiste em elementos que não são iguais, por exemplo, possuindo monômeros vp1, vp2 ou vp3 (proteínas) com diferentes sequências de aminoácidos modificadas. A SEQ ID NO: 2 fornece a sequência de aminoácidos codificada da proteína vp1 de AAVhu68.

[050] O capsídeo AAVhu68 contém subpopulações nas proteínas vp1, nas proteínas vp2 e nas proteínas vp3 que possuem modificações a partir dos resíduos de aminoácidos previstos na SEQ ID NO: 2. Essas subpopulações incluem, no mínimo, certos resíduos de asparagina (N ou Asn) desamidada. Por exemplo, certas subpopulações compreendem pelo menos uma, duas, três ou quatro posições de asparaginas (N) altamente desamidadas em pares asparagina-glicina na SEQ ID NO: 2 e opcionalmente compreendendo ainda outros aminoácidos desamidados, em que a desamidação resulta em uma alteração de aminoácidos e outras modificações opcionais. A SEQ ID NO: 14 fornece uma sequência de aminoácidos de um capsídeo AAVhu68 modificado, ilustrando posições que podem ter alguma porcentagem de aminoácidos desamidados ou modificados de outra forma. As várias combinações dessas e de outras modificações são aqui descritas.

[051] Conforme utilizado neste documento, uma subpopulação de proteínas vp refere-se a um grupo de proteínas vp que possui pelo menos uma característica definida em comum e que consiste em pelo menos um membro do grupo a menos do que todos os membros do grupo de referência, a menos que especificado de outra forma. Por exemplo, uma subpopulação de proteínas vp1 é pelo menos uma (1) proteína vp1 e menor que todas as proteínas vp1 em um capsídeo AAV montado, a menos que especificado de outra forma. Uma subpopulação de proteínas vp3 pode ser uma (1) proteína vp3 a menos do que todas as proteínas vp3 em um capsídeo AAV montado, a menos que

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19/144 especificado de outra forma. Por exemplo, as proteínas vp1 podem ser uma subpopulação de proteínas vp; As proteínas vp2 podem ser uma subpopulação separada de proteínas vp, e vp3 são ainda uma subpopulação adicional de proteínas vp em um capsídeo AAV montado. Em outro exemplo, as proteínas vp1, vp2 e vp3 podem conter subpopulações com diferentes modificações, por exemplo, pelo menos uma, duas, três ou quatro asparaginas altamente desamidadas, por exemplo, em pares asparagina-glicina.

[052] Salvo indicação em contrário, altamente desamidado referese a pelo menos 45% desamidado, pelo menos 50% desamidado, pelo menos 60% desamidado, pelo menos 65% desamidado, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 97%, 99%, até cerca de 100% desamidado em uma posição de aminoácido referenciada, em comparação com a sequência de aminoácidos prevista na posição de aminoácido de referência (por exemplo, pelo menos 80% das asparaginas no aminoácido 57 da SEQ ID NO: 2 podem ser desamidadas com base nas proteínas vp1 totais ou 20% das asparaginas no aminoácido 409 da SEQ ID NO: 2 podem ser desamidadas com base no total de proteínas vp1, vp2 e vp3). Tais percentagens podem ser determinadas utilizando gel 2D, técnicas de espectrometria de massas ou outras técnicas adequadas.

[053] Sem desejar estar vinculado pela teoria, acredita-se que a desamidação de resíduos pelo menos altamente desamidados nas proteínas vp no capsídeo AAVhu68 seja de natureza principalmente não enzimática, sendo causada por grupos funcionais dentro da proteína do capsídeo que desamidam asparaginas selecionadas e, em menor grau, resíduos de glutamina. A montagem eficiente do capsídeo da maioria das proteínas vp1 de desamidação indica que estes eventos ocorrem após a montagem do capsídeo ou que a desamidação em monômeros individuais (vp1, vp2 ou vp3) é bem tolerada estruturalmente e em

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20/144 grande parte não afeta a dinâmica de montagem. A desamidação extensa na região exclusiva de VP1 (VP1 -u) (~aa 1-137), geralmente considerada como localizada internamente antes da entrada celular, sugere que a desamidação de VP pode ocorrer antes da montagem do capsídeo.

[054] Sem desejar ser limitado pela teoria, a desamidação das N pode ocorrer quando o átomo de nitrogênio da cadeia principal do seu resíduo C-terminal conduz um ataque nucleofílico ao átomo de carbono do grupo amida da cadeia lateral de Asn. Acredita-se que, assim, um resíduo intermediário de succinimida fechada em anel se forma. O resíduo de succinimida então conduz uma hidrólise rápida para levar ao produto final ácido aspártico (Asp) ou ácido iso aspártico (IsoAsp). Portanto, em certas modalidades, a desamidação de asparagina (N ou Asn) leva a um Asp ou IsoAsp, que pode interconverter através do intermediário succinimida, por exemplo, conforme ilustrado abaixo.

C ''OH ° r r? ο· Ίo f NHj .jf I 'NH₃ r\ ; + Η1Ϊó i N i i l /n—í Ácido aspártico

i) K Í -4:O ⁰ [ o ⁰ | ^òA x

Asparagina Intermediário Succinimidaf 3 , A,. ^oíí

Y Y ò

Ácido Iso-aspártico [055] Conforme fornecido neste documento, cada N desamidada da SEQ ID NO: 2 pode independentemente ser ácido aspártico (Asp), ácido isoaspártico (isoAsp), aspartato e/ou uma mistura de interconversão de Asp e isoAsp, ou combinações dos mesmos. Qualquer proporção adequada de ácido a- e isoaspártico pode estar presente. Por exemplo, em certas modalidades, a proporção pode ser de 10:1 a 1:10 aspártico para iso-aspártico, cerca de 50:50 aspártico: iso-aspártico ou cerca de 1:3 aspártico: iso-aspártico, ou outra proporção selecionada.

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21/144 [056] Em certas modalidades, uma ou mais glutamina (Q) na SEQ ID NO: 2 desamida em ácido glutâmico (Glu), ou seja, ácido a-glutâmico, ácido γ-glutâmico (Glu) ou uma mistura de α e γ-glutâmico ácido, que pode se interconverter através de um intermediário comum da glutarinimida. Qualquer proporção adequada de ácido a- e γ-glutâmico pode estar presente. Por exemplo, em certas modalidades, a proporção pode ser de 10:1 a 1:10 α a γ, cerca de 50:50 α: γ, ou cerca de 1:3 α: γ, ou outra proporção selecionada.

Ácido glutâmico

Ííí-G&Q

Glutamina (Gin) Intermediário de glutarimida

Ácido isoglutâmico [057] Assim, um rAAVhu68 inclui subpopulações no capsídeo rAAVhu68 das proteínas vp1, vp2 e/ou vp3 com aminoácidos desamidados, incluindo, no mínimo, pelo menos uma subpopulação compreendendo pelo menos uma asparagina altamente desamidada. Além disso, outras modificações podem incluir isomerização, particularmente em posições de resíduos de ácido aspártico (D ou Asp) selecionadas. Ainda em outras modalidades, as modificações podem incluir uma amidação em uma posição Asp.

[058] Em certas modalidades, um capsídeo AAVhu68 contém subpopulações de vp1, vp2 e vp3 possuindo pelo menos 4 a pelo menos cerca de 25 posições de resíduos de aminoácidos desamidadas, das quais pelo menos 1 a 10% são desamidadas em comparação com a

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22/144 sequência de aminoácidos codificada da SEQ ID NO: 2. A maioria destes pode ser resíduos-N. Contudo, os resíduos Q também podem ser desamidados.

[059] Em certas modalidades, um capsídeo AAV68 é ainda caracterizado por um ou mais dos seguintes. As proteínas do capsídeo AAV hu68 compreendem: proteínas vp1 de AAVhu68 produzidas por expressão de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos prevista de 1 a 736 da SEQ ID NO: 2, proteínas vp1 produzidas a partir de SEQ ID NO: 1 ou proteínas vp1 produzidas a partir de uma sequência de ácido nucleico pelo menos 70% idêntica à SEQ ID NO: 1 que codifica a sequência de aminoácidos prevista de 1 a 736 da SEQ ID NO: 2; proteínas vp2 de AAVhu68 produzidas por expressão de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos prevista de pelo menos cerca de aminoácidos 138 a 736 da SEQ ID NO: 2, proteínas vp2 produzidas a partir de uma sequência compreendendo pelo menos os nucleotídeos 412 a 2211 da SEQ ID NO: 1 ou proteínas vp2 produzidas a partir de uma sequência de ácido nucleico pelo menos 70% idêntica a pelo menos os nucleotídeos 412 a 2211 da SEQ ID NO: 1 que codifica a sequência de aminoácidos prevista de pelo menos os aminoácidos 138 a 736 da SEQ ID NO: 2 e/ou proteínas vp3 de AAVhu68 produzidas por expressão de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos prevista de pelo menos cerca dos aminoácidos 203 a 736 da SEQ ID NO: 2, proteínas vp3 produzidas a partir de uma sequência compreendendo pelo menos nucleotídeos 607 a 2211 da SEQ ID NO: 1 ou proteínas vp3 produzidas a partir de uma sequência de ácidos nucleicos pelo menos 70% idêntica a pelo menos os nucleotídeos 607 a 2211 da SEQ ID NO: 1 que codificam a sequência de aminoácidos prevista de pelo menos aproximadamente aminoácidos 203 a 736 da SEQ ID NO: 2.

[060] Adicionalmente ou alternativamente, é fornecido um capsídeo

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AAV que compreende uma população heterogênea de proteínas vp1 opcionalmente, compreendendo uma valina na posição 157, uma população heterogênea de proteínas vp2 opcionalmente compreendendo uma valina na posição 157 e uma população heterogênea de proteínas vp3, em que pelo menos uma subpopulação das proteínas vp1 e vp2 compreendem uma valina na posição 157 e opcionalmente compreendem ainda um ácido glutâmico na posição 67 com base na numeração do capsídeo vp1 da SEQ ID NO: 2. Adicionalmente ou alternativamente, é fornecido um capsídeo AAVhu68 que compreende uma população heterogênea de proteínas vp1 que são o produto de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, uma população heterogênea de proteínas vp2 que são o produto de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de pelo menos cerca dos aminoácidos 138 a 736 da SEQ ID NO: 2 e uma população heterogênea de proteínas vp3 que são o produto de uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos os aminoácidos 203 a 736 da SEQ ID NO: 2, em que: as proteínas vp1, vp2 e vp3 contêm subpopulações com modificações de aminoácidos [061] As proteínas AAVhu68 vp1, vp2 e vp3 são tipicamente expressas como variantes de junção alternativas codificadas pela mesma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos vp1 completa da SEQ ID NO: 2 (aminoácido 1 a 736). Opcionalmente, a sequência de codificação de vp1 é usada sozinha para expressar as proteínas vp1, vp2 e vp3. Alternativamente, esta sequência pode ser coexpressa com uma ou mais sequências de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos AAVhu68vp3 da SEQ ID NO: 2 (cerca de aa 203 a 736) sem a região exclusiva de vp1 (cerca de aa 1 a cerca de aa 137) e/ou regiões exclusivas de vp2 (cerca de aa 1 a cerca de aa 202), ou uma cadeia complementar a esta, o mRNA ou tRNA correspondente (cerca de nt 607 a cerca de nt 2211 da SEQ ID NO: 1), ou uma

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24/144 sequência pelo menos 70% a pelo menos 99% (por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) idêntica à SEQ ID NO: 1 que codifica aa 203 a 736 da SEQ ID NO: 2. Adicionalmente, ou alternativamente, a sequência de codificação de vp1 e/ou codificação de vp2 pode ser coexpressa com a sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de AAVhu68vp2 da SEQ ID NO: 2 (cerca de aa 138 a 736) sem o região exclusiva de vp1 (cerca de aa 1 a cerca de 137), ou uma cadeia complementar a esta, o mRNA ou tRNA correspondente (nt 412 a 22121 da SEQ ID NO: 1) ou uma sequência pelo menos 70% a pelo menos 99% (por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) idêntica à SEQ ID NO: 1 que codifica cerca de aa 138 a 736 da SEQ ID NO: 2.

[062] Conforme descrito neste documento, um rAAVhu68 possui um capsídeo rAAVhu68 produzido em um sistema de produção que expressa capsídeos de um ácido nucleico de AAVhu68 que codifica a sequência de aminoácidos da vp1 da SEQ ID NO: 2, e opcionalmente sequências adicionais de ácido nucleico, por exemplo, codificando uma proteína vp3 livre das regiões exclusivas de vp1 e/ou vp2. O rAAVhu68 resultante da produção utilizando uma única sequência de ácido nucleico vp1 produz as populações heterogêneas de proteínas vp1, proteínas vp2 e proteínas vp3. Mais particularmente, o capsídeo AAVhu68 contém subpopulações nas proteínas vp1, nas proteínas vp2 e nas proteínas vp3 que possuem modificações a partir dos resíduos de aminoácidos previstos na SEQ ID NO: 2. Essas subpopulações incluem, no mínimo, resíduos de asparagina (N ou Asn) desamidada. Por exemplo, asparaginas em pares asparagina - glicina são altamente desamidadas. [063] Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico de AA

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Vhu68vp1 possui a sequência da SEQ ID NO: 1, ou uma cadeia complementar à mesma, por exemplo, o mRNA ou tRNA correspondente. Em certas modalidades, as proteínas vp2 e/ou vp3 podem ser expressas adicionalmente ou alternativamente a partir de diferentes sequências de ácidos nucleicos que a vp1, por exemplo, para alterar a proporção das proteínas vp em um sistema de expressão selecionado. Em certas modalidades, também é fornecida uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos AAVhu68 vp3 da SEQ ID NO: 2 (cerca de aa 203 a 736) sem a região exclusiva de vp1 (cerca de aa 1 a cerca de aa 137) e/ou regiões exclusivas de vp2 (cerca de aa 1 a cerca de aa 202), ou uma cadeia complementar à mesma, o mRNA ou tRNA correspondente (cerca de nt 607 a cerca de nt 2211 da SEQ ID NO: 1). Em certas modalidades, também é fornecida uma sequência de ácido nucléico que codifica a sequência de aminoácidos AAVhu68 vp2 da SEQ ID NO: 2 (cerca de um a 138 a 736) sem a região exclusiva de vp1 (cerca de um a 1 a cerca de 137) ou uma cadeia complementar à mesma, o mRNA ou tRNA correspondente (nt 412 a 2211 da SEQ ID NO: 1).

[064] No entanto, outras sequências de ácido nucléico que codificam a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 podem ser selecionadas para utilização na produção de capsídeos rAAVhu68. Em certas modalidades, a sequência de ácido nucléico possui a sequência de ácido nucléico da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência pelo menos 70% a 99% idêntica, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99%, idêntica à SEQ ID NO: 1 que codifica a SEQ ID NO: 2. Em certas modalidades, a sequência de ácido nucléico possui a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência pelo menos 70% a 99%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99%, idêntica a cerca de nt

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412 a cerca de nt 2211 da SEQ ID NO: 1 que codifica a proteína do capsídeo vp2 (cerca de aa 138 a 736) da SEQ ID NO: 2. Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico possui a sequência de ácido nucleico de cerca de nt 607 a cerca de nt 2211 da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência pelo menos 70% a 99%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99%, idêntica a nt da SEQ ID NO:1 que codifica a proteína do capsídeo vp3 (cerca de aa 203 a 736) da SEQ ID NO:

2.

[065] É do conhecimento da técnica projetar sequências de ácidos nucleicos que codificam esse capsídeo AAVhu68, incluindo DNA (genômico ou cDNA) ou RNA (por exemplo, mRNA). Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína do capsídeo AAVhu68vp1 é fornecida na SEQ ID NO: 1. Veja também as FIGURAS 1B1 D. Em outras modalidades, uma sequência de ácido nucleico de 70% a 99,9% de identidade com a SEQ ID NO: 1 pode ser selecionada para expressar as proteínas do capsídeo AAVhu68. Em certas outras modalidades, a sequência de ácido nucleico é pelo menos cerca de 75% idêntica, pelo menos 80% idêntica, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% idêntica, ou pelo menos 99% a 99,9% idêntica à SEQ ID NO: 1. Tais sequências de ácido nucleico podem ser otimizadas por códon para expressão em um sistema selecionado (isto é, tipo de célula) e podem ser concebidas por vários métodos. Essa otimização pode ser realizada utilizando métodos que estão disponíveis on-line (por exemplo, GeneArt), métodos publicados ou uma empresa que fornece serviços de otimização de códons, por exemplo, DNA2.0 (Menlo Park, CA). Um método de otimização de códons é descrito, por exemplo, na Publicação de Patente Internacional US No. WO 2015/012924, que é incorporada neste documento por referência na sua totalidade. Veja também, por exemplo, a Publicação de Patente dos

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EUA 2014/0032186 e a Publicação de Patente US 2006/0136184. Adequadamente, o comprimento total da estrutura de leitura aberta (ORF) para o produto é modificado. No entanto, em algumas modalidades, apenas um fragmento da ORF pode ser alterado. Utilizando um destes métodos, podem-se aplicar as frequências a qualquer sequência polipeptídica e produzir um fragmento de ácido nucleico de uma região codificadora optimizada por códons que codifica o polipeptídeo. Estão disponíveis várias opções para efetuar as alterações reais aos códons ou para sintetizar as regiões de codificação otimizadas por códons concebidas como aqui descrito. Tais modificações ou síntese podem ser realizadas utilizando manipulações biológicas moleculares padrões e de rotina bem conhecidas dos versados na técnica. Em uma abordagem, uma série de pares de oligonucleotídeos complementares de 80-90 nucleotídeos cada um em comprimento e abrangendo o comprimento da sequência desejada são sintetizados através de métodos padrão. Estes pares de oligonucleotídeos são sintetizados de tal modo que após o emparelhamento, formam fragmentos de cadeia dupla de 80-90 pares de bases, contendo extremidades coesivas, por exemplo, cada oligonucleotídeo no par é sintetizado para se estender 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, ou mais bases além da região que é complementar ao outro oligonucleotídeo no par. As extremidades de cadeia simples de cada par de oligonucleotídeos são concebidas para emparelhar-se com a extremidade de cadeia simples de outro par de oligonucleotídeos. Os pares de oligonucleotídeos são permitidos emparelharem-se, e aproximadamente cinco a seis destes fragmentos de cadeia dupla são então permitidos emparelharem-se juntos através das extremidades coesivas de cadeia simples, e depois são ligados e clonados em um vetor de clonagem bacteriano padrão, por exemplo, um vetor TOPO® disponível pela Invitrogen Corporation, Carlsbad, Califórnia. O construto é então sequenciado por métodos padrão. Vários destes construtos consistindo em 5 a 6 fragmentos de fragmentos de 80 a 90

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28/144 pares de bases ligados entre si, isto é, fragmentos de cerca de 500 pares de bases, são preparados de tal modo que toda a sequência desejada é representada em uma série de construtos plasmáticos. As inserções destes plasmídeos são então cortadas com enzimas de restrição apropriadas e ligadas em conjunto para formar o construto final. O construto final é então clonado em um vetor de clonagem bacteriana padrão e sequenciada. Métodos adicionais seriam imediatamente evidentes para o versado na técnica. Além disso, a síntese genética está prontamente disponível comercialmente.

[066] Em certas modalidades, a asparagina (N) nos pares N-G nas proteínas AAVhu68 vp1, vp2 e vp3 é altamente desamidada. Em certas modalidades, um capsídeo AAVhu68 contém subpopulações de proteínas do capsídeo AAV vp1, vp2 e/ou vp3 possuindo pelo menos quatro posições de asparagina (N) nas proteínas do capsídeo AAVhu68 que sejam altamente desamidadas. Em certas modalidades, cerca de 20 a 50% dos pares N-N (exclusivos das trigêmeas N-N-N) apresentam desamidação. Em certas modalidades, a primeira N é desamidada. Em certas modalidades, a segunda N é desamidada. Em certas modalidades, a desamidação está entre cerca de 15% e cerca de 25% de desamidação. A desamidação no Q na posição 259 da SEQ ID NO: 2 é de cerca de 8% a cerca de 42% das proteínas do capsídeo vp1, vp2 e vp3 de AAVhu68 de uma proteína AAVhu68.

[067] Em certas modalidades, o capsídeo rAAVhu68 é ainda caracterizado por uma amidação em D297 das proteínas vp1, vp2 e vp3. Em certas modalidades, cerca de 70% a cerca de 75% do D na posição 297 das proteínas vp1, vp2 e/ou vp3 em um capsídeo AAVhu68 são amidadas, com base na numeração da SEQ ID NO: 2.

[068] Em certas modalidades, pelo menos um Asp no vp1, vp2 e/ou vp3 do capsídeo é isomerizado em D-Asp. Esses isômeros estão geralmente presentes em uma quantidade inferior a cerca de 1 % da Asp

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29/144 em uma ou mais posições de resíduo 97, 107, 384, com base na numeração da SEQ ID NO: 2.

[069] Em certas modalidades, um rAAVhu68 possui um capsídeo AAVhu68 com proteínas vp1, vp2 e vp3 com subpopulações compreendendo combinações de um, dois, três, quatro ou mais resíduos desamidados nas posições definidas na tabela abaixo. A desamidação no rAAV pode ser determinada usando eletroforese em gel 2D e/ou espectrometria de massas e/ou técnicas de modelagem de proteínas. A cromatografia on-line pode ser realizada com uma coluna Acclaim PepMap e um sistema Thermo UltiMate 3000 RSLC (Thermo Fisher Scientific) acoplado a um Q Exactive HF com uma fonte NanoFIex (Thermo Fisher Scientific). Os dados da MS são adquiridos usando um método top-20 dependente de dados para o Q Exactive HF, escolhendo dinamicamente os íons precursores ainda não sequenciados mais abundantes das varreduras da pesquisa (200-2000 m/z). O sequenciamento é realizado através de fragmentação de dissociação de colisão de alta energia com um valor alvo de 1e5 íons determinados com controle de ganho automático preditivo e um isolamento de precursores foi realizado com uma janela de 4 m/z. Os exames foram adquiridos com uma resolução de 120.000 a m/z 200. A resolução para os espectros de HCD pode ser configurada para 30.000 a m/z 200, com um tempo máximo de injeção de íons de 50 ms e uma energia de colisão normalizada de 30.0 nível de RF da lente S pode ser fixado em 50, para fornecer a transmissão ideal da região m/z ocupada pelos peptídeos da massa digerida. Os íons precursores com estados de carga únicos, não atribuídos ou de seis ou mais podem ser excluídos da seleção de fragmentação. O software BioPharma Finder 1.0 (Thermo Fischer Scientific) pode ser usado para análise dos dados adquiridos. Para o mapeamento peptídico, as buscas são realizadas usando um banco de dados FASTA de proteína de entrada única com um conjunto de carbamidometilação como uma modificação fixa; e oxidação, desamidação e fosforilação

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30/144 ajustadas como modificações variáveis, uma precisão de massa de 10 ppm, uma alta especificidade de protease e um nível de confiança de 0,8 para espectros de MS/MS. Exemplos de proteases adequadas podem incluir, por exemplo, tripsina ou quimotripsina. A identificação espectrométrica de massas de peptídeos desamidados é relativamente simples, pois a desamidação aumenta a massa da molécula intacta +0,984 Da (a diferença de massa entre os grupos -OH e -NH2). A percentagem de desamidação de um peptídeo particular é a área de massa determinada do peptídeo desamidado dividida pela soma da área dos peptídeos desamidados e nativos. Considerando 0 número de possíveis sítios de desamidação, as espécies isobáricas que são desamidadas em diferentes sítios podem comigrar em um único pico. Consequentemente, os íons de fragmentos originários de peptídeos com múltiplos sítios potenciais de desamidação podem ser utilizados para localizar ou diferenciar múltiplos sítios de desamidação. Nestes casos, as intensidades relativas dentro dos padrões de isótopos observados podem ser utilizadas para determinar especificamente a abundância relativa dos diferentes isômeros peptídicos desamidados. Este método assume que a eficiência da fragmentação para todas as espécies isoméricas é a mesma e independente do sítio de desamidação. Será entendido por um versado na técnica que podem ser usadas diversas variações destes métodos ilustrativos. Por exemplo, espectrômetros de massas adequados podem incluir, por exemplo, um espectrômetro de massas de tempo de voo quadrupolo (QTOF), como um Waters Xevo ou Agilent 6530 ou um instrumento orbitrap, como 0 Orbitrap Fusion ou Orbitrap Velos (Thermo Fisher). Os sistemas de cromatografia líquida apropriados incluem, por exemplo, 0 sistema Acquity UPLC dos sistemas Waters ou Agilent (série 1100 ou 1200). O software de análise de dados adequado pode incluir, por exemplo, MassLynx (Waters), Pinpoint e Pepfinder (Thermo Fischer Scientific), Mascote (Matrix Science), Peaks DB (Bioinformatics Solutions). Ainda outras técnicas podem ser

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31/144 descritas, por exemplo, em X. Jin et al, Hu Gene Therapy Methods, vol.

28, n° 5, pp. 255-267, publicado online em 16 de junho de 2017.

Desamidação Baseado no AAVHu68 Previsto [SEQ ID NO: 2]	% Média com base nas proteínas VP1/VP2/VP3 no capsídeo AAVhu68
Resíduo Desamidado + 1 (AA vizinho)	Amplo Intervalo de Percentagens (%)	Intervalos estreitos (%)
N57 (N-G)	78 a 100%	80 a 100, 85 a 97
N66 (N-E)	0a5	0, 1 a 5
N94 (N-H)	0 a 15,	0, 1 a 15, 5 a 12, 8
N113 (N-L)	0a2	0, 1 a 2
-N253 (N-N)	10 a 25	15 a 22
Q259 (Q-i)	8 a 42	10 a 40, 20 a 35
-N270 (N-D)	12 a 30	15 a 28
-N304 (N-N) (posição 303 também N)	0a5	1 a4
N319 (N-l)	0a5	0, 1 a 5, 1 a 3
N329 * (N-G)*(posição 328 também N)	65 a 100	70 a 95,85 a 95,80 a 100, 85 a 100,
N336 (N-N)	0 a 100	0, 1 a 10, 25 a 100, 30 a 100, 30 a 95
-N409 (N-N)	15 a 30	20 a 25
N452 (N-G)	75 a 100	80 a 100, 90 a 100, 95 a 100,
N477 (N-Y)	0a8	0, 1 a 5
N512 (N-G)	65 a 100	70 a 95,85 a 95,80 a 100, 85 a 100,
-N515 (N-S)	0 a 25	0, 1 a 10, 5 a 25, 15 a 25
-Q599 (Asn-Q-Gly)	1 a 20	2 a 20, 5 a 15

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Desamidação Baseado no AAVHu68 Previsto [SEQ ID NO: 2]	% Média com base nas proteínas VP1/VP2/VP3 no capsídeo AAVhu68
Resíduo Desamidado + 1 (AA vizinho)	Amplo Intervalo de Percentagens (%)	Intervalos estreitos (%)
N628 (N-F)	0a 10	0, 1 a 10, 2 a 8
N651 (N-T)	0a3	0, 1 a 3
N663 (N-K)	0a5	0, 1 a5, 2a4
N709 (N-N)	0 a 25	0, 1 a 22, 15 a 25
N735	0 a 40	0, 1 a 35, 5 a 50, 20 a 35

070] Em certas modalidades, o capsídeo AAVhu68 é caracterizado por possuir proteínas de capsídeo nas quais pelo menos 45% dos resíduos N são desamidados em pelo menos uma das posições N57, N329, N452 e/ou N512 com base na numeração da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em certas modalidades, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos 90% dos resíduos N em uma ou mais destas posições N-G (isto é, N57, N329, N452 e/ou N512, com base na numeração da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2) são desamidados. Nestas e em outras modalidades, um capsídeo AAVhu68 é ainda caracterizado por ter uma população de proteínas em que cerca de 1% a cerca de 20% dos resíduos N possuem desamidações em uma ou mais posições: N94, N253, N270, N304, N409, N477 e/ou Q599, com base na numeração da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em certas modalidades, o AAVhu68 compreende pelo menos uma subpopulação de proteínas vp1, vp2 e/ou vp3 que são desamidadas em uma ou mais das posições N35, N57, N66, N94, N113, N252, N253, Q259, N270, N303, N304. N305, N319, N328, N329, N336, N409, N410, N452, N477, N515, N598,

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Q599, N628, N651, N663, N709, N735, com base na numeração da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou combinações das mesmas. Em certas modalidades, as proteínas do capsídeo podem ter um ou mais aminoácidos amidados.

[071] Ainda são observadas outras modificações, a maioria das quais não resulta na conversão de um aminoácido em um resíduo de aminoácido diferente. Opcionalmente, pelo menos uma Lys na vp1, vp2 e vp3 do capsídeo é acetilada. Em certas modalidades, pelo menos um Asp na vp1, vp2 e/ou vp3 do capsídeo é isomerizado em D-Asp. Opcionalmente, pelo menos um S (Ser, Serina) na vp1, vp2 e/ou vp3 do capsídeo é fosforilado. Opcionalmente, pelo menos um T (Thr, Treonina) na vp1, vp2 e/ou vp3 do capsídeo é fosforilado. Opcionalmente, pelo menos um W (trp, triptofano) na vp1, vp2 e/ou vp3 do capsídeo é oxidado. Opcionalmente, pelo menos um M (Met, Metionina) na vp1, vp2 e/ou vp3 do capsídeo é oxidado. Em certas modalidades, as proteínas do capsídeo possuem uma ou mais fosforilações. Por exemplo, certas proteínas de capsídeo vp1 podem ser fosforiladas na posição 149.

[072] Em certas modalidades, um capsídeo AAVhu68 compreende uma população heterogênea de proteínas vp1 que são o produto de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, em que as proteínas vp1 compreendem um ácido glutâmico (Glu) na posição 67 e/ou uma valina (Vai) na posição 157; uma população heterogênea de proteínas vp2 compreendendo opcionalmente uma valina (Vai) na posição 157; e uma população heterogênea de proteínas vp3. O capsídeo AAVhu68 contém pelo menos uma subpopulação em que pelo menos 65% das asparaginas (N) em pares asparagina - glicina localizados na posição 57 das proteínas vp1 e pelo menos 70% de asparaginas (N) em pares asparagina - glicina nas posições 329, 452 e/ou 512 das proteínas vp1, v2 e vp3 são desamidadas, com base na numeração do resíduo da sequência de aminoácidos da

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SEQ ID NO: 2, em que a desamidação resulta em uma alteração de aminoácidos. Conforme discutido em mais detalhes neste documento, as asparaginas desamidadas podem ser desamidadas em ácido aspártico, ácido iso-aspártico, um par de ácido aspártico/ácido iso-aspártico interconversor ou combinações dos mesmos.

[073] Em certas modalidades, os rAAVhu68 são ainda caracterizados por um ou mais dos seguintes: (a) cada uma das proteínas vp2 é independentemente o produto de uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos a proteína vp2 da SEQ ID NO: 2; (b) cada uma das proteínas vp3 é independentemente o produto de uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos a proteína vp3 da SEQ ID NO: 2; (c) a sequência de ácido nucleico que codifica as proteínas vp1 é a SEQ ID NO: 1, ou uma sequência pelo menos 70% a pelo menos 99% (por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos, 98% ou pelo menos 99%) idêntica à SEQ ID NO: 1, que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Opcionalmente, essa sequência é usada sozinha para expressar as proteínas vp1, vp2 e vp3. Alternativamente, esta sequência pode ser co-expressa com uma ou mais sequências de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos vp3 de AAVhu68 da SEQ ID NO: 2 (cerca de aa 203 a 736) sem a região exclusiva de vp1 (cerca de aa 1 a cerca de aa 137) e/ou regiões exclusivas de vp2 (cerca de aa 1 a cerca de aa 202), ou uma cadeia complementar a esta, o mRNA ou tRNA correspondente (cerca de nt 607 a cerca de nt 2211 da SEQ ID NO: 1), ou uma sequência pelo menos 70% a pelo menos 99% (por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) idêntica à SEQ ID NO: 1 que codifica aa 203 a 736 da SEQ ID NO: 2. Adicionalmente, ou alternativamente, a sequência de codificação de vp1 e/ou codificação de vp2 pode ser coexpressa com a sequência de ácido nucleico que codifica a sequência

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35/144 de aminoácidos de vp2 de AAVhu68 da SEQ ID NO: 2 (cerca de aa 138 a 736) sem o região exclusiva de vp1 (cerca de aa 1 a cerca de 137), ou uma cadeia complementar a esta, o mRNA ou tRNA correspondente (nt 412 a 2211 da SEQ ID NO: 1) ou uma sequência pelo menos 70% a pelo menos 99% (por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) idêntica à SEQ ID NO: 1 que codifica cerca de aa 138 a 736 da SEQ ID NO: 2.

[074] Adicionalmente ou alternativamente, o capsídeo rAAVhu68 compreende pelo menos uma subpopulação de proteínas vp1, vp2 e/ou vp3 que são desamidadas em uma ou mais das posições N57, N66, N94, N113, N252, N253, Q259, N270, N303, N304, N305, N319, N328, N329, N336, N409, N410, N452, N477, N512, N515, N598, Q599, N628, N651, N663, N709, com base na numeração da SEQ ID NO: 2 ou combinações das mesmas; (e) o capsídeo rAAVhu68 compreende uma subpopulação de proteínas vp1, vp2 e/ou vp3 que compreendem desamidação de 1% a 20% em uma ou mais das posições N66, N94, N113, N252, N253, Q259, N270, N303, N304, N305, N319, N328, N336, N409, N410, N477, N515, N598, Q599, N628, N651, N663, N709, com base na numeração da SEQ ID NO: 2 ou combinações das mesmas; (f) o capsídeo rAAVhu68 compreende uma subpopulação de vp1 na qual são desamidadas 65% a 100% das N na posição 57 das proteínas vp1, com base na numeração da SEQ ID NO: 2; (g) o capsídeo rAAVhu68 compreende uma subpopulação de proteínas vp1 na qual são desamidadas 75% a 100% das N na posição 57 das proteínas vp1; (h) o capsídeo rAAVhu68 compreende subpopulação de proteínas vp1, proteínas vp2 e/ou proteínas vp3 nas quais 80% a 100% das N na posição 329, com base na numeração da SEQ ID NO: 2, são desamidadas; (i) o capsídeo rAAVhu68 compreende subpopulação de proteínas vp1, proteínas vp2 e/ou proteínas vp3 nas quais 80% a 100% das N na posição 452, com

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36/144 base na numeração da SEQ ID NO: 2, são desamidadas; (j) o capsídeo rAAVhu68 compreende subpopulação de proteínas vp1, proteínas vp2 e/ou proteínas vp3 nas quais 80% a 100% das N na posição 512, com base na numeração da SEQ ID NO: 2, são desamidadas; (k) o rAAV compreende cerca de 60 proteínas totais do capsídeo em uma proporção de cerca de 1 vp1 a cerca de 1 a 1,5 vp2 a 3 a 10 proteínas vp3; (I) o rAAV compreende cerca de 60 proteínas totais do capsídeo em uma proporção de cerca de 1 vp1 a cerca de 1 vp2 a 3 a 9 proteínas vp3.

[075] Em certas modalidades, o AAVhu68 é modificado para alterar a glicina em urn par asparagina-glicina, a fim de reduzir a desamidação. Em outras modalidades, a asparagina é alterada para um aminoácido diferente, por exemplo, uma glutamina que desamida a uma velocidade menor; ou a um aminoácido que não possui grupos amida (por exemplo, glutamina e asparagina contêm grupos amida); e/ou a um aminoácido que não possui grupos amina (por exemplo, lisina, arginina e histidina contêm grupos amida). Conforme utilizado neste documento, aminoácidos que não possuem grupos laterais amida ou amina referemse a, por exemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cistina, fenilalanina, tirosina ou triptofano e/ou prolina. Modificações como as descritas podem estar em um, dois ou três dos pares asparagina-glicina encontrados na sequência de aminoácidos AAVhu68 codificada. Em certas modalidades, essas modificações não são feitas em todos os quatro pares de asparagina - glicina. Assim, um método para reduzir a desamidação de AAVhu68 e/ou variantes de AAVhu68 manipuladas com taxas de desamidação mais baixas. Adicionalmente ou alternativamente, um ou mais outros aminoácidos amidos podem ser alterados para um aminoácido não amida para reduzir a desamidação do AAVhu68.

[076] Essas modificações de aminoácidos podem ser feitas por técnicas convencionais de manipulação genética. Por exemplo, pode

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37/144 ser gerada uma sequência de ácido nucleico contendo códons de AAVhu68 modificados, em que um a três dos códons que codificam glicina na posição 58, 330, 453 e/ou 513 na SEQ ID NO: 2 (pares de argininaglicina) são modificados para codificar um aminoácido diferente de glicina. Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico contendo códons de arginina modificados pode ser manipulada em um a três dos pares de arginina-glicina localizados na posição 57, 329, 452 e/ou 512 na SEQ ID NO: 2, de modo que o códon modificado codifique um aminoácido diferente de arginina. Cada códon modificado pode codificar um aminoácido diferente. Alternativamente, um ou mais dos códons alterados podem codificar o mesmo aminoácido. Em certas modalidades, estas sequências de ácido nucleico de AAVhu68 modificadas podem ser utilizadas para gerar um rAAVhu68 mutante possuindo um capsídeo com desamidação inferior ao capsídeo de hu68 nativo. Tal rAAVhu68 mutante pode ter imunogenicidade reduzida e/ou estabilidade aumentada durante o armazenamento, particularmente armazenamento na forma de suspensão. Conforme utilizado neste documento, um códon refere-se a três nucleotídeos em uma sequência que codifica um aminoácido.

[077] Conforme utilizado neste documento, sequência de aminoácidos codificada refere-se ao aminoácido que é previsto com base na tradução de um códon de DNA conhecido de uma sequência de ácido nucleico referenciada sendo traduzida em um aminoácido. A tabela a seguir ilustra os códons de DNA e vinte aminoácidos comuns, mostrando o código de uma letra (SLC) e o código de três letras (3LC).

Aminoácido	SLC	3 LC	||Códons de DNA |
Isoleucina	1	lie	ATT. ATC. ATA
Leucina	L	Leu	CTT. CTC. CTA. CTG. TTA. TTG
Valina	V	Vai	GTT. GTC. GTA. GTG ]
Fenilalanina	F	Phe	TTT. TTC ]

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(Metionina Cistcína	M C	Met Cys	ATG ü TGT. TGC )
(Alanina	A	Ala	GCT. GCC. GCÁ. GCG ([
(Glicina	G	Gly	GGT.GGC.GGA.GGG |
(Prolina	P	Pro	CCT ccc CCA CCG ]
jTreonina	T	Thr	ACT, ACC. ACÁ. ÀCG (j
(Serina	S	Ser	TCT TCC TCA TCG AGT AGC ]
ΠΊ resina	Y	Tyr	TAT, TÁC ii
(Triptofano	W	Trp	tgg 1
Glutamina	Q	Gin	CAA. CAG ]
(Asparagina	N	Asn	ÁAT. ÃÁC j
(Histidina	H	His	CAT. CAC ]
[Ácido glutâmico	E	Glu	GÁA. GÁG ii
(Ácido aspártico	D	Âsp	GAT. GAC ]
(Lisina	k	Lys	AAA. AAG ]
(Arginina	R	Arg	CGT. CGC. CGA. CGG. AGÁ, ÁGG (j
Códons de Parada	Parada		TAA. TAG. TGA ]

[078] Os capsídeos AAVhu68 podem ser úteis em certas modalidades. Por exemplo, esses capsídeos podem ser utilizados na geração de anticorpos monoclonais e/ou na geração de reagentes úteis em ensaios para monitorar os níveis de concentração de AAVhu68 em pacientes de terapia gênica. As técnicas para gerar anticorpos anti-AAVhu68 úteis, marcar esses anticorpos ou capsídeos vazios e formatos de ensaio adequados são conhecidos pelos versados na técnica.

[079] Em certas modalidades, é aqui fornecida uma sequência de ácido nucléico da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99%, que codifica a sequência de aminoácidos vp1 da SEQ ID NO: 2 com uma modificação (por exemplo, aminoácido desamidado) como descrito aqui. Em certas modalidades, a sequência de aminoácidos vp1 é reproduzida na SEQ ID NO: 14.

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39/144 [080] Conforme utilizado neste documento, o termo Clade , no que se refere a grupos de AAV, refere-se a um grupo de AAV que são filogeneticamente relacionados entre si, conforme determinado usando um algoritmo Neighbor-Joining por um valor de inicialização de pelo menos 75% (de pelo menos 1000 réplicas) e uma medição da distância de correção de Poisson de, no máximo, 0,05, com base no alinhamento da sequência de aminoácidos vp1 de AAV. O algoritmo Neighbor-Joining foi descrito previamente na literatura. Veja, por exemplo, M. Nei e S. Kumar, Molecular Evolution and Phylogenetics (Oxford University Press, Nova York (2000)). Estão disponíveis programas de computador que podem ser usados para implementar esse algoritmo. Por exemplo, o programa MEGA v2.1 implementa o método Nei-Gojobori modificado. Utilizando estas técnicas e programas de computador, e a sequência de uma proteína do capsídeo AAV vp1, um versado na técnica pode prontamente determinar se um AAV selecionado está contido em um dos Clade s identificados neste documento, em outro Clade , ou se encontra fora destes Clade s. Veja, por exemplo, G Gao, et al, J Virol, 2004 Jun; 78(10: 6381-6388, que identifica os Clade s A, B, C, D, E e F, e fornece sequências de ácidos nucleicos do novo AAV, números de acesso do GenBank AY530553 a AY530629. Veja também WO 2005/033321.

[081] Em uma modalidade, a invenção fornece uma molécula manipulada compreendendo uma sequência espaçadora entre a sequência de codificação vp1 de AAVhu68 e as sequências de codificação de rep de AAVhu68. Esta sequência de codificação é: atgacttaaaccaggt, SEQ ID NO: 9. A sequência de codificação para rep52 de AAVhu68 é reproduzida na SEQ ID NO: 3. A sequência da proteína rep52 é reproduzida na SEQ ID NO: 4.

[082] Em uma modalidade, é fornecido um método para aumentar os rendimentos de um rAAV e, assim, aumentar a quantidade de um rAAV que está presente no sobrenadante antes ou sem a necessidade

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40/144 de lise celular. Este método envolve a manipulação de um gene capsídeo de VP1 de AAV para expressar uma proteína do capsídeo com a Glu na posição 67, e não o Vai na posição 157 com base em um alinhamento com a numeração de aminoácidos da proteína do capsídeo vp1 de AAVhu68. Em outras modalidades, o método envolve a manipulação de um gene capsídeo VP1 de AAVhu68 para expressar uma proteína de capsídeo com o Vai na posição 157, e não a Glu na posição 67. Esse outro AAV pode ser facilmente selecionado dentre outro Clade F de AAV ou AAV no Clade A, B, C, D ou E. Em certas modalidades, o AAV é selecionado dentre o Clade C, D, E ou F. Em outras modalidades, o AAV é selecionado a partir do Clade C, D ou E.

[083] Em outras modalidades, o método envolve aumentar o rendimento de um rAAV e, assim, aumentar a quantidade de um rAAV que está presente no sobrenadante antes ou sem a necessidade de lise celular. Este método envolve a manipulação de um gene capsídeo de VP1 de AAV para expressar uma proteína de capsídeo com Glu na posição 67, Vai na posição 157, ou ambos com base em um alinhamento com a numeração de aminoácidos da proteína do capsídeo vp1 de AAVhu68. Em outras modalidades, o método envolve a manipulação do gene de capsídeo VP2 para expressar uma proteína de capsídeo com o Vai na posição 157. Em ainda outras modalidades, o rAAV tem um capsídeo modificado compreendendo proteínas de capsídeo vp1 e vp2 Glu na posição 67 e Vai na posição 157.

[084] Em ainda outras modalidades, o AAVhu68 pode ser manipulado para ter um Ser, Gly, Ser ou Thr na posição 67, com referência à numeração vp1 [SEQ ID NO: 2], mantendo o Vai na posição 157. Em ainda outras modalidades, o AAVhu68 pode ser manipulado para ter uma lie ou Leu na posição 157, com referência à numeração de vp1 [SEQ ID NO: 2]. Em ainda outra modalidade, o AAVhu68 pode ser manipulado para ter um Ser, Gly, Ser ou Thr na posição 67 e uma lie ou

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Leu na posição 157, com referência à numeração vp1 [SEQ ID NO: 2]. [085] Em uma modalidade adicional, um método para empacotar um transgene em um Clade F de AAV que fornece pelo menos um aumento de 15% no rendimento do vetor empacotado em comparação com o AAV9, o referido método compreendendo: cultivar uma cultura de células hospedeiras de acordo com condições adequadas. Em certas modalidades, o aumento é um aumento de pelo menos 90% no rendimento. Em outras modalidades, o aumento é um aumento de pelo menos 200% no rendimento.

[086] Em uma comparação entre AAVhu68 e AAVrhIO, verificouse que o AAVhu68 fornece melhor eficiência de transdução que o AAVrhIO em doses baixas (por exemplo, cerca de 1 x 10⁹GC) após administração intracerebroventricular. Em uma comparação adicional entre AAVhu68 e AAV9, verificou-se que o AAVhu68 fornece melhor eficiência de transdução do que o AAV9 no cerebelo, córtex motor e hipocampo do cérebro (por exemplo, cerca de 1 x 10¹¹ GC) após administração intracerebroventricular.

[087] Em certas modalidades, a invenção fornece um vetor AAVhu68 compreendendo um genoma de vetor que expressa um anticorpo direcionado contra um receptor HER2. Esse vetor é útil no tratamento e/ou prevenção de cânceres.

[088] Conforme utilizado neste documento, um capsídeo AAV9 é um capsídeo AAV auto-montado composto por várias proteínas AAV9 vp. As proteínas AAV9 vp são tipicamente expressas como variantes de junção alternativas codificadas por uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 5 ou uma sequência pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% idêntica a ela, que codifica a sequência de aminoácidos vp1 da SEQ ID NO: 6 (Acesso do GenBank: AAS99264). Estas variantes de junção resultam em proteínas de diferentes comprimentos

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42/144 da SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades, “capsídeo AAV9” inclui um AAV com uma sequência de aminoácidos que é 99% idêntica a AAS99264 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 6. Veja também US7906111 e WO 2005/033321. Conforme utilizado neste documento, variantes de AAV9 incluem as descritas em, por exemplo, WQ2016/049230, US 8,927,514, US 2015/0344911 e US 8,734,809.

[089] Métodos para gerar capsídeos, e, portanto, sequências de codificação, e métodos para a produção de vetores virais de rAAV foram descritos. Veja, por exemplo, Gao, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6081 -6086 (2003) e US 2013/0045186A1.

[090] O termo homologia substancial ou similaridade substancial, quando se refere a um ácido nucleico, ou fragmento do mesmo, indica que, quando alinhado de maneira ideal com inserções ou deleções nucleotídicas apropriadas ou deleções com outro ácido nucleico (ou sua cadeia complementar), há uma sequência nucleotídica identidade em pelo menos cerca de 95 a 99% das sequências alinhadas. De preferência, a homologia é sobre a sequência completa, ou um quadro de leitura aberto da mesma, ou outro fragmento adequado que tenha pelo menos 15 nucleotídeos de comprimento. Exemplos de fragmentos adequados são descritos aqui.

[091 ] Os termos “identidade de sequência”, “porcentagem de identidade de sequência” ou “porcentagem idêntica” no contexto de sequências de ácidos nucleicos referem-se aos resíduos nas duas sequências que são os mesmos quando alinhados para correspondência máxima. O comprimento da comparação de identidade de sequência pode ser ao longo do comprimento completo do genoma, o comprimento total de uma sequência de codificação de gene ou um fragmento de pelo menos cerca de 500 a 5000 nucleotídeos, é desejado. No entanto, a identidade entre fragmentos menores, por exemplo, de pelo menos cerca de nove nucleotídeos, usualmente pelo menos cerca de 20 a 24 nucleotídeos,

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43/144 pelo menos cerca de 28 a 32 nucleotídeos, pelo menos cerca de 36 ou mais nucleotídeos, também pode ser desejada. Da mesma forma, a porcentagem de identidade de sequência pode ser prontamente determinada para sequências de aminoácidos, em toda a extensão de uma proteína ou um fragmento da mesma. Adequadamente, um fragmento tem pelo menos cerca de 8 aminoácidos de comprimento e pode ter até cerca de 700 aminoácidos. Exemplos de fragmentos adequados são descritos aqui.

[092] O termo homologia substancial ou similaridade substancial, ao se referir a aminoácidos ou fragmentos dos mesmos, indica que, quando perfeitamente alinhado com inserções ou deleções de aminoácidos apropriadas com outro aminoácido (ou sua cadeia complementar), há uma sequência de aminoácidos identidade em pelo menos cerca de 95 a 99% das sequências alinhadas. De preferência, a homologia é sobre a sequência completa, ou uma proteína da mesma, por exemplo, uma proteína cap, uma proteína rep ou um fragmento da mesma com pelo menos 8 aminoácidos, ou mais desejável, com pelo menos 15 aminoácidos de comprimento. Exemplos de fragmentos adequados são descritos aqui.

[093] O termo altamente conservado significa pelo menos 80% de identidade, preferencialmente pelo menos 90% de identidade e, mais preferencialmente, mais de 97% de identidade. A identidade é prontamente determinada por um versado na técnica, recorrendo a algoritmos e programas de computador conhecidos por aqueles versados na técnica.

[094] Geralmente, quando se refere a “identidade”, “homologia” ou “semelhança” entre dois vírus adenoassociados diferentes, “identidade”, “homologia” ou “semelhança” é determinada em referência a sequências “alinhadas”. Sequências “alinhadas” ou “alinhamentos” referem-se a sequências de múltiplos ácidos nucleicos ou sequências de proteínas

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44/144 (aminoácidos), frequentemente contendo correções para bases ou aminoácidos ausentes ou adicionais em comparação com uma sequência de referência. Nos exemplos, os alinhamentos de AAV são realizados usando as sequências publicadas de AAV9 como ponto de referência. Os alinhamentos são realizados usando qualquer um dos vários Programas de Alinhamento de Sequência Múltipla disponíveis publicamente ou comercialmente. Exemplos de tais programas incluem “Clustal Omega” “Clustal W”, “CAP Sequence Assembly”, “MAP” e “MEME”, que são acessíveis através de servidores da Web na Internet. Outras fontes para tais programas são conhecidas dos versados na técnica. Alternativamente, os utilitários vetor NTI também são usados. Existem também vários algoritmos conhecidos na técnica que podem ser utilizados para medir a identidade de sequência de nucleotídeos, incluindo os contidos nos programas descritos acima. Como outro exemplo, as sequências polinucleotídicas podem ser comparadas utilizando o Fasta™, um programa no GCG Versão 6.1. O Fasta™ fornece alinhamentos e porcentagem de identidade de sequência das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de consulta e busca. Por exemplo, a identidade de sequência percentual entre as sequências de ácido nucleico pode ser determinada usando Fasta™ com seus parâmetros padrão (um tamanho de palavra de 6 e o fator NOPAM para a matriz de pontuação) conforme fornecidos no GCG Versão 6.1, incorporado neste documento por referência. Programas de alinhamento de sequências múltiplas estão também disponíveis para sequências de aminoácidos, por exemplo, os programas “Clustal Omega”, “Clustal X”, “MAP”, “PIMA, “MAS”, “BLOCKMAKER”, “MEME” e “Match Box”. Geralmente, qualquer um destes programas é usado nas configurações padrão, embora um versado na técnica possa alterar estas configurações conforme necessário. Alternativamente, um versado na técnica pode usar outro algoritmo ou programa de computador que forneça pelo menos o mesmo nível de identidade ou alinhamento que

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45/144 aquele fornecido pelos algoritmos e programas referenciados. Veja, por exemplo, J.D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., “A comprehensive comparison of multiple sequence alignments”, 27(13):2682-2690 (1999).

I. Vetores rAAV [095] Como indicado acima, as novas sequências e proteínas de AAVhu68 são úteis na produção de rAAV e também são úteis em vetores de AAV recombinantes que podem ser vetores de entrega antissenso, vetores de terapia genética ou vetores de vacina. Além disso, os capsídeos de AAV manipulados aqui descritos, por exemplo, aqueles com aminoácidos mutantes na posição 67, 157 ou ambos em relação à numeração da proteína do capsídeo vp1 na SEQ ID NO: 2, podem ser usados para manipular vetores de rAAV para a entrega de um número de moléculas de ácido nucleico adequadas para atingir células e tecidos.

[096] As sequências genômicas que são empacotadas em um capsídeo do AAV e entregues a uma célula hospedeira são tipicamente compostas de, no mínimo, um transgene e suas sequências reguladoras e repetições terminais invertidas do AAV (ITRs). O AAV de cadeia simples e o AAV auto-complementar (sc) são abrangidos pelo rAAV. O transgene é uma sequência de codificação de ácido nucleico, heteróloga às sequências vetoriais, que codifica um polipéptido, proteína, molécula de RNA funcional (por exemplo, miRNA, inibidor de miRNA) ou outro produto genético de interesse. A sequência de codificação de ácido nucleico está operacionalmente ligada a componentes reguladores de uma maneira que permite transcrição, tradução e/ou expressão de transgene em uma célula de um tecido-alvo.

[097] As sequências de AAV do vetor compreendem tipicamente as sequências de repetição terminal invertidas de 5' e 3' de ação cis (ver, por exemplo, BJ Carter, no Handbook of Parvoviruses, ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168 (1990)). As sequências ITR têm cerca

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46/144 de 145 pb de comprimento. Preferencialmente, substancialmente, todas as sequências que codificam os ITRs são usadas na molécula, embora seja permitido algum grau de modificação menor dessas sequências. A capacidade de modificar essas sequências ITR está dentro da habilidade da técnica. (Veja, por exemplo, textos como Sambrook et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); e K. Fisher et al., J. Virol., 70:520 532 (1996)). Um exemplo de tal molécula empregada na presente invenção é um plasmídeo cis-acting contendo o transgene, no qual a sequência de transgenes selecionados e os elementos regulatórios associados são flanqueados pelas sequências 5' e 3' ITR de AAV. Em uma modalidade, as ITRs são de um AAV diferente daquele que fornece um capsídeo. Em uma modalidade, as sequências ITR de AAV2. Uma versão abreviada da ITR 5', denominada AITR, foi descrita, em que o local da resolução terminal (trs) e a sequência D são excluídos. Em outras modalidades, são utilizadas ITRs AAV 5' e 3' completas. No entanto, pode ser selecionado um AAV de outras fontes adequadas. Quando a fonte das ITRs vier de AAV2 e o capsídeo de AAV for de outra fonte de AAV, o vetor resultante pode ser denominado pseudotipado. No entanto, outras configurações desses elementos podem ser adequadas.

[098] Para além dos para os principais elementos identificados acima para os vetores AAV recombinantes, o vetor também inclui elementos de controle convencionais necessários que estão operativamente ligados ao transgene de uma maneira que permita a sua transcrição, tradução e/ou expressão em uma célula transfectada com o vetor plasmídeo ou infectada com o vírus produzido pela invenção. Tal como aqui utilizado, as sequências operacionalmente ligadas incluem ambas as sequências de controle de expressão que são contíguas ao gene de interesse e as sequências de controle de expressão que atuam em trans ou a uma distância para controlar o gene de interesse.

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47/144 [099] Os elementos de controle regulatório contêm tipicamente uma sequência promotora como parte das sequências de controle de expressão, por exemplo, localizadas entre a sequência ITR 5' selecionada e a sequência de codificação. Promotores constitutivos, promotores reguláveis [ver, por exemplo, WO 2011/126808 e WO 2013/04943], promotores específicos de tecidos, ou um promotor responsive a estímulos fisiológicos podem ser utilizados nos vetores descritos neste documento. O(s) promotor(es) pode(m) ser selecionado(s) de diferentes fontes, por exemplo, intensificador/promotor imediato e precoce do citomegalovírus humano (CMV), promotor/intensificador precoce do SV40, promotor do polimovírus JC, proteína básica de mielina (MBP) ou promotores de proteína ácida fibrilar glial (GFAP), promotor associado à latência do vírus herpes simplex (HSV-1) (LAP), promotor de repetição terminal longa (LTR) do vírus do sarcoma maligno (RSV), promotor específico de neurônio (NSE), promotor de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), hSYN, promotor do hormônio concentrador de melanina (MCH), CBA, promotor de metaloproteína de matriz (MPP) e promotor de beta-actina de frango. Além de um promotor, um vetor podem conter um ou mais outros sequências apropriadas de iniciação, terminação, intensificador de transcrição, sinais de processamento de RNA eficientes, como sinais de emenda e poliadenilação (poliA); sequências que estabilizam o mRNA citoplasmático, por exemplo, WPRE; sequências que aumentam a eficiência da tradução (ou seja, sequência de consenso de Kozak); sequências que melhoram a estabilidade das proteínas; e quando desejado, sequências que aumentam a secreção do produto codificado. Um exemplo de um intensificador adequado é o intensificador de CMV. Outros potenciadores adequados incluem aqueles que são apropriados para as indicações desejadas de tecido alvo. Em uma modalidade, o cassete de expressão compreende um ou mais intensificadores de expressão. Em uma modalidade, o cassete de expressão contém dois ou mais

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48/144 intensificadores de expressão. Esses intensificadores podem ser os mesmos ou podem diferir um do outro. Por exemplo, um intensificador pode incluir um intensificador precoce imediato de CMV. Esse intensificador pode estar presente em duas cópias que estão localizadas adjacentemente entre si. Alternativamente, as cópias duplas do intensificador podem ser separadas por uma ou mais sequências. Ainda em outra modalidade, o cassete de expressão contém ainda um íntron, por exemplo, o íntron beta-actina de frango. Outros introns adequados incluem aqueles conhecidos na técnica, por exemplo, conforme descritos em WO 2011/126808. Exemplos de sequências poliA adequadas incluem, por exemplo, SV40, SV50, hormônio do crescimento bovino (bGH), hormônio do crescimento humano e poliAs sintéticos. Opcionalmente, uma ou mais sequências podem ser selecionadas para estabilizar o mRNA. Um exemplo dessa sequência é uma sequência WPRE modificada, que pode ser manipulada a montante da sequência poliA e a jusante da sequência de codificação [ver, por exemplo, MA Zanta-Boussif, et al., Gene Therapy (2009) 16: 605-619.

[100] Esses rAAVs são particularmente adequados para a entrega de genes para fins terapêuticos e para imunização, incluindo a indução de imunidade protetora. Além disso, as composições da invenção também podem ser utilizadas para a produção de um produto gênico desejado in vitro. Para produção in vitro, um produto desejado (por exemplo, uma proteína) pode ser obtido a partir de uma cultura desejada após a transfecção das células hospedeiras com um rAAV contendo a molécula que codifica o produto desejado e cultivar a cultura de células sob condições que permitem a expressão. O produto expresso pode então ser purificado e isolado, conforme desejado. Técnicas adequadas para transfecção, cultura de células, purificação e isolamento são conhecidas pelos versados na técnica.

[101] Em certas modalidades, um rAAV ou composição como aqui

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49/144 fornecido não contém um anticorpo anti-influenza ou construto de imunoglobulina. Em certas modalidades, um rAAV ou composição como aqui fornecido não contém uma sequência de codificação SMN.

Genes Terapêuticos e Produtos Genéticos [102] Os produtos úteis codificados pelo transgene incluem uma variedade de produtos gênicos que substituem um gene defeituoso ou deficiente, inativam ou “knock-out”, ou “knock-down” ou reduzem a expressão de um gene que está se expressando em um nível indesejável alto, ou entregar um produto genético que tenha um efeito terapêutico desejado. Na maioria das modalidades, a terapia será terapia genética somática, isto é, transferência de genes para uma célula do corpo que não produz espermatozóides ou óvulos. Em certas modalidades, os transgenes expressam proteínas têm a sequência de sequências humanas nativas. No entanto, em outras modalidades, proteínas sintéticas são expressas. Tais proteínas podem ser destinadas ao tratamento de seres humanos, ou em outras modalidades, projetadas para o tratamento de animais, incluindo animais de companhia, como populações de cães ou felinos, ou para o tratamento de animais ou outros animais que entram em contato com populações humanas.

[103] Exemplos de produtos genéticos adequados podem incluir aqueles associados à hipercolesterolemia familiar, distrofia muscular, fibrose cística e doenças raras ou órfãs. Exemplos de tais doenças raras podem incluir atrofia muscular espinhal (SMA), doença de Huntingdon, síndrome de Rett (por exemplo, proteína 2 de ligação a metil-CpG (MeCP2); UniProtKB - P51608), esclerose lateral amiotrófica (ALS), distrofia muscular do tipo Duchenne, Ataxia de Friedrichs (por exemplo, frataxina), progranulina (PRGN) (associada a degenerações cerebrais que não são de Alzheimer, incluindo demência frontotemporal (FTD), afasia progressiva não fluente (PNFA) e demência semântica), entre ou

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50/144 tros. Veja, por exemplo, www.orpha.net/consor/cgi-bin/Disease_SearchJJst.php; rarediseases.info.nih.gov/diseases.

[104] Exemplos de genes adequados podem incluir, por exemplo, hormônios e fatores de crescimento e diferenciação, incluindo, sem limitação, insulina, glucagon, peptídeo semelhante ao glucagon-1 (GLP1), hormônio do crescimento (GH), hormônio paratireoide (PTH), fator de liberação do hormônio do crescimento (GRF), hormônio folículo estimulante (FSH), hormônio luteinizante (LH), gonadotrofina coriônica humana (hCG), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), angiopoietinas, angiostatina, fator estimulador de colônias de granulócitos (GCSF), eritropoietina (EPO) (incluindo, por exemplo, epo humano, canino ou felino), fator de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF), fatores neutróficos, incluindo, por exemplo, fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF), fator de crescimento ácido de fibroblastos (aFGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fatores de crescimento de insulina I e II (IGF-I e IGF-II), qualquer um da superfamília do fator de crescimento transformador a, incluindo TGFa, ativinas, inibinas ou qualquer uma das proteínas morfogênicas ósseas (BMP) BMPs 1-15, qualquer um da família de fatores de crescimento de heregluína/neuregulina/ARIA/neu fator de diferenciação (NDF), fator de crescimento do nervo (NGF), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), neurotrofinas NT-3 e NT-4/5, fator neurotrófico ciliar (CNTF), fator neurotrófico derivado da linhagem celular glial (GDNF), neurturina, agrina, qualquer um da família de semaforinas/colapsinas, netrin-1 e netrin-2, fator de crescimento de hepatócitos (HGF), efrinas, noggin, ouriço sônico e hidroxilase de tirosina.

[105] Outros produtos úteis do transgene incluem proteínas que regulam o sistema imunológico, incluindo, sem limitação, citocinas e linfocinas, como trombopoietina (TPO), interleucinas (IL) IL-1 a IL-36 (incluindo, por exemplo, interleucinas humanas IL-1, IL-1 a, IL-1 β, IL-2, IL-

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3, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, IL-11, IL-12, IL-13, IL-18, IL-31, IL-35), proteína quimioatraente de monócitos, fator inibidor da leucemia, fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos, ligante Fas, fatores de necrose tumoral a e β, interferons α, β e γ, fator de células-tronco, fator de células-tronco, ligante flk-2/flt3. Os produtos de genes produzidos pelo sistema imunológico também são úteis na invenção. Estes incluem, sem limitações, imunoglobulinas IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, imunoglobulinas quiméricas, anticorpos humanizados, anticorpos de cadeia única, receptores de células T, receptores de células T quiméricos, receptores de células T de cadeia única, moléculas MHC classe I e classe II, bem como imunoglobulinas manipuladas e moléculas de MHC. Por exemplo, em certas modalidades, os anticorpos rAAV podem ser projetados para fornecer anticorpos caninos ou felinos, por exemplo, como anti-lgE, antiIL31, anti-CD20, anti-NGF, anti-GnRH. Os produtos genéticos úteis também incluem proteínas reguladoras do complemento, como proteínas reguladoras do complemento, proteína de cofator de membrana (MCP), fator acelerador de declínio (DAF), CR1, CF2, CD59 e inibidor da esterase C1 (C1-INH).

[106] Ainda outros produtos genéticos úteis incluem qualquer um dos receptores de hormônios, fatores de crescimento, citocinas, linfocinas, proteínas reguladoras e proteínas do sistema imunológico. A invenção abrange receptores para regulação do colesterol e/ou modulação lipídica, incluindo o receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDL), receptor de lipoproteína de alta densidade (HDL), o receptor de lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL) e receptores scavenger. A invenção também abrange produtos genéticos, tais como membros da superfamília de receptores de hormônios esteroides, incluindo receptores glicocorticoides e receptores de estrogênio, receptores de vitamina D e outros receptores nucleares. Além disso, produtos genéticos úteis incluem fatores de transcrição como jun, fos, max, mad, fator de resposta

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52/144 sérica (SRF), AP-1, AP2, myb, MyoD e miogenina, proteínas contendo caixa de ETS, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, SP1, proteínas de ligação à caixa de CCAAT, fator de regulação de interferon (IRF-1), proteína do tumor de Wilms, proteína de ligação ao ETS, proteínas de ligação à caixa GATA, STAT, por exemplo, GATA-3, e a família de proteínas de hélice alada da cabeça da forquilha.

[107] Outros produtos genéticos úteis incluem carbamoil sintetase I, ornitina transcarbamilase (OTC), arginosuccinato sintetase, arginosuccinato liase (ASL) para o tratamento da deficiência de arginosuccinato liase, arginase, fumarilacetato hidrolase, fenilalanina hidroxilase, alfa-1-antitripsina, alfa-fetoproteína de rhesus (AFP), gonadotrofina coriônicade rhesus (CG), glicose-6-fosfatase, porfobilinogênio desaminase, beta-sintase de cistationina, descarboxilase de cetoácido de cadeia ramificada, albumina, isovaleril-coA desidrogenase, propionil CoA carboxilase, metil-malonil-CoA mutase, glutaril-CoA desidrogenase, insulina, beta-glucosidase, piruvato-carboxilato, fosforilase hepática, fosforilase-quinase, glicina descarboxilase, proteína H, proteína T, um gene regulador do transmembrana de fibrose cística (CFTR) e um gene da distrofina [por exemplo, uma mini- ou micro-distrofina]. Ainda outros produtos genéticos úteis incluem enzimas que podem ser úteis na terapia de reposição enzimática, que é útil em várias condições resultantes da atividade deficiente da enzima. Por exemplo, enzimas que contêm manose-6-fosfato podem ser utilizadas em terapias para doenças de armazenamento lisossômico (por exemplo, um gene adequado inclui aquele que codifica a β-glucuronidase (GUSB)).

[108] Em certas modalidades, o rAAV pode ser usado em sistemas de edição de genes, sistema esse que pode envolver um rAAV ou coadministração de vários estoques de rAAV. Por exemplo, o rAAV pode ser manipulado para fornecer SpCas9, SaCas9, ARCUS, Cpf 1 e outros

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53/144 construtos de edição de genes adequados.

[109] Ainda outros produtos genéticos úteis incluem aqueles usados para o tratamento da hemofilia, incluindo a hemofilia B (incluindo o fator IX) e a hemofilia A (incluindo o fator VIII e suas variantes, como a cadeia leve e a cadeia pesada do heterodímero e o domínio excluído B; Patente US N° 6.200.560 e Patente US N° 6.221.349). Em algumas modalidades, o minigene compreende 57 primeiros pares de bases da cadeia pesada do Fator VIII que codifica a sequência de sinal de 10 aminoácidos, bem como a sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento humano (hGH). Em modalidades alternativas, o minigene compreende ainda os domínios A1 e A2, bem como 5 aminoácidos do N-terminal do domínio B e/ou 85 aminoácidos do C-terminal do domínio B, bem como o Domínios A3, C1 e C2. Em ainda outras modalidades, os ácidos nucleicos que codificam a cadeia pesada e a cadeia leve do Fator VIII são fornecidos em um único minigene separado por 42 ácidos nucleicos que codificam 14 aminoácidos do domínio B [Patente US N°. 6.200.560], [110] Outros produtos genéticos úteis incluem polipeptídeos de ocorrência não natural, como polipeptídeos quiméricos ou híbridos com uma sequência de aminoácidos de ocorrência não natural contendo inserções, deleções ou substituições de aminoácidos. Por exemplo, imunoglobulinas de manipulação de cadeia única podem ser úteis em certos pacientes imunocomprometidos. Outros tipos de sequências de genes de ocorrência não natural incluem moléculas antissenso e ácidos nucléicos catalíticos, como as ribozimas, que podem ser usadas para reduzir a superexpressão de um alvo.

[111] A redução e/ou modulação da expressão de um gene é particularmente desejável para o tratamento de condições hiperproliferativas caracterizadas por células hiperproliferantes, assim como cânceres e psoríase. Polipeptídeos alvo incluem aqueles polipeptídeos que são

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54/144 produzidos exclusivamente ou em níveis mais altos em células hiperproliferativas em comparação com células normais. Os antígenos alvo incluem polipeptídeos codificados por oncogenes como myb, myc, fyn e o gene de translocação bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk e EGRF. Além dos produtos de oncogene como antígenos alvo, polipeptídeos alvo para tratamentos contra o câncer e regimes de proteção incluem regiões variáveis dos anticorpos feitas por linfomas de células B e regiões variáveis dos receptores de célula T de linfomas de células T que, em algumas modalidades, são também usados antígenos alvo para doença auto-imune. Outros polipeptídeos associados ao tumor podem ser usados como polipeptídeos alvo, tais como polipeptídeos que são encontrados em níveis mais altos nas células tumorais, incluindo o polipeptídeo reconhecido pelo anticorpo monoclonal 17-1A e polipeptídeos de ligação ao folato.

[112] Outros polipeptídeos e proteínas terapêuticos adequados incluem aqueles que podem ser úteis para o tratamento de indivíduos que sofrem de doenças e distúrbios autoimunes, conferindo uma resposta imune protetora de base ampla contra alvos que estão associados à autoimunidade, incluindo receptores celulares e células que produzem anticorpos autodirecionados. Doenças auto-imunes mediada da célula T incluem artrite de reumatoide (RA), esclerose múltipla (MS), síndrome de Sjõgren, sarcoidose, diabetes melito insulino dependente (IDDM), tireoidite autoimune, artrite reativa, espondilite anquilosante, esclerodermia, polimiosite, dermatomiosite, psoríase, vasculite, Granulomatose de Wegener, doença de Crohn e oolite ulcerativa. Cada uma destas doenças é caracterizada pelos receptores da célula T (TCRs) que ligam os antígenos endógenos e iniciam a cascata inflamatória associada com as doenças auto-imunes.

[113] Outros genes ilustrativos que podem ser entregues via rAAV incluem, sem limitação, glicose-6-fosfatase, associada à doença ou deficiência

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55/144 de armazenamento de glicogênio tipo 1A (GSD1), fosfoenolpiruvato-carboxiquinase (PEPCK), associado à deficiência de PEPCK; quinase tipo 5 dependente de ciclina (CDKL5), também conhecida como serina/treonina quinase 9 (STK9) associada a convulsões e comprometimento grave do desenvolvimento neurológico; uridil transferase de galactose-1 fosfato, associada a galactosemia; fenilalanina hidroxilase, associada a fenilcetonúria (PKU); alfa-cetoácido desidrogenase de cadeia ramificada, associada à doença da urina do xarope de bordo; fumarolacetoacetato hidrolase, associado à tirosinemia tipo 1; metilmalonil-CoA mutase, associada à acidemia metilmalônica; acil CoA desidrogenase de cadeia média, associada à deficiência de acetil CoA de cadeia média; transcarbamilase de ornitina (OTC), associada à deficiência de transcarbamilase de ornitina; sintetase do ácido argininosuccínico (ASS1), associada à citrulinemia; deficiência de lecitina-colesterol aciltransferase (LCAT); uma acidemia metilmalônica (MMA); Doença de Niemann-Pick, tipo C1); acidemia propiônica (PA); proteína do receptor da lipoproteína de baixa densidade (LDLR), associada à hipercolesterolemia familiar (HF); UDPglucouronosiltransferase, associada à doença de Crigler-Najjar; adenosina desaminase, associada à doença de imunodeficiência combinada grave; hipoxantina guanina fosforibosil transferase, associado à síndrome de Gout e Lesch-Nyhan; biotimidase, associada à deficiência de biotimidase; alfa-galactosidase A (a-Gal A) associada à doença de Fabry); ATP7B associado à doença de Wilson; beta-glucocerebrosidase, associada à doença de Gaucher tipo 2 e 3; proteína de membrana peroxissômica de 70 kDa, associada à síndrome de Zellweger; arilsulfatase A (ARSA) associada à leucodistrofia metacromática, enzima galactocerebrosidase (GALC) associado à doença de Krabbe, alfa-glucosidase (GAA) associada à doença de Pompe; gene da esfingomielinase (SMPD1) associado à doença de Niemann Pick tipo A; argininosuccinato sintase associada com citrulinemia tipo II de início adulto (CTLN2);

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56/144 carbamoil-fosfato sintase 1 (CPS1) associada a distúrbios do ciclo da ureia; proteína do neurônio motor de sobrevivência (SMN), associada à atrofia muscular espinhal; ceramidase associada à lipogranulomatose de Farber; b-hexosaminidase associada à gangliosidose GM2 e doenças de Tay-Sachs e Sandhoff; aspartilglucosaminidase associada à aspartilglucosaminúria; a-fucosidase associada à fucosidose; a-manosidase associada à alfa-manosidose; porfobilinogênio desaminase, associado à porfiria aguda intermitente (AIP); alfa-1 antitripsina para tratamento da deficiência de alfa-1 antitripsina (enfisema); eritropoietina para tratamento de anemia devido a talassemia ou insuficiência renal; fator de crescimento endotelial vascular, angiopoietina-1, e fator de crescimento de fibroblastos para o tratamento de doenças isquêmicas; trombomodulina e inibidor da via do fator tecidular para o tratamento de vasos sanguíneos ocluídos, como visto, por exemplo, em aterosclerose, trombose ou embolias; aminoácido aromático descarboxilase (AADC) e tirosina hidroxilase (TH) para o tratamento da doença de Parkinson; o receptor beta adrenérgico, antissenso ou uma forma mutante de fosfolambano, adenosina trifosfatase-2 de retículo do sarco(endo)plasmático (SERCA2), e a adenilil ciclase cardíaca para o tratamento da insuficiência cardíaca congestiva; um gene supressor de tumor tal como p53 para o tratamento de vários cânceres; uma citocina tal como uma das várias interleucinas para o tratamento de distúrbios e cânceres inflamatórios e imunológicos; distrofina ou minidistrofina e utrofina ou miniutrofina para o tratamento de distrofias musculares; e insulina ou GLP-1 para o tratamento de diabetes.

[114] Genes e doenças adicionais de interesse incluem, por exemplo, doenças relacionadas ao gene da distonina, como a Neuropatia Hereditária Sensorial e Autonômica do Tipo VI (o gene DST codifica a distonina; podem ser necessários dois vetores de AAV devido ao tamanho da proteína (~ 7570 aa); doenças relacionada a SCN9A, nas quais mutantes de

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57/144 perda de função causam incapacidade de sentir dor e mutantes de ganho de função causam condições de dor, como eritromelagia. Outra condição é Charcot-Marie-Tooth tipo 1F e 2E devido a mutações no gene NEFL (cadeia leve do neurofilamento) caracterizada por neuropatia motora periférica progressiva e sensorial com expressão clínica e eletrofisiológica variável.

[115] Em certas modalidades, o rAAV aqui descrito pode ser usado no tratamento de distúrbios de mucopolissacaridose (MPS). Esse rAAV pode conter uma sequência de ácido nucleico que codifica a-L-iduronidase (IDUA) para o tratamento de MPS I (síndromes de Hurler, HurlerScheie e Scheie); uma sequência de ácido nucleico que codifica a iduronato-2-sulfatase (IDS) para o tratamento de MPS II (síndrome de Hunter); uma sequência de ácido nucleico que codifica sulfamidase (SGSH) para o tratamento de MPSIII A, B, C e D (síndrome de Sanfilippo); uma sequência de ácido nucleico que codifica N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatase (GALNS) para o tratamento de MPS IV A e B (síndrome de Morquio); uma sequência de ácido nucleico que codifica a arilsulfatase B (ARSB) para o tratamento de MPS VI (síndrome de MaroteauxLamy); uma sequência de ácido nucleico que codifica hialuronidase para tratamento de MPSI IX (deficiência de hialuronidase) e uma sequência de ácido nucleico que codifica beta-glucuronidase para tratamento de MPS VII (síndrome de Sly).

Transgenes imunogênicos [116] Em algumas modalidades, um vetor rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica um produto genético associado ao câncer (por exemplo, supressores de tumor) pode ser usado para tratar o câncer, administrando um rAAV abrigando o vetor rAAV a um sujeito com câncer. Em algumas modalidades, um vetor rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica um pequeno ácido nucleico interferente (por exemplo, shRNAs, miRNAs) que inibe a expressão de um produto

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58/144 genético associado ao câncer (por exemplo, oncogenes) pode ser usado para tratar o câncer, administrando um rAAV abrigando o vetor rAAV para um sujeito com câncer. Em algumas modalidades, um vetor rAAV compreendendo um ácido nucleico que codifica um produto genético associado ao câncer (ou um RNA funcional que inibe a expressão de um gene associado ao câncer) pode ser usado para fins de pesquisa, por exemplo, para estudar o câncer ou identificar terapêuticas que tratam o câncer. A seguir, é apresentada uma lista não limitativa de genes exemplares que estão associados ao desenvolvimento de câncer (por exemplo, oncogenes e supressores de tumores): AARS, ABCB1, ABCC4, ABI2, ABL1, ABL2, ACK1, ACP2, ACY1, ADSL, AK1, AKR1C2, AKT1, ALB, ANPEP, ANXA5, ANXA7, AP2M1, APC, ARHGAP5, ARHGEF5, ARID4A, ASNS, ATF4, ATM, ATP5B, ATP5O, AXL, BARD1, BAX, BCL2, BHLHB2, BLMH, BRAF, BRCA1, BRCA2, BTK, CANX, CAP1, CAPN1, CAPNS1, CAV1, CBFB, CBLB, CCL2, CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, CCT5, CCYR61, CD24, CD44, CD59, CDC20, CDC25, CDC25A, CDC25B, CDC2L5, CDK10, CDK4, CDK5, CDK9, CDKL1, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2D, CEBPG, CENPC1, CGRRF1, CHAF1A, CIB1, CKMT1, CLK1, CLK2, CLK3, CLNS1A, CLTC, COL1A1, COL6A3, COX6C, COX7A2, CRAT, CRHR1, CSF1R, CSK, CSNK1G2, CTNNA1, CTNNB1, CTPS, CTSC, CTSD, CUL1, CYR61, DCC, DCN, DDX10, DEK, DHCR7, DHRS2, DHX8, DLG3, DVL1, DVL3, E2F1, E2F3, E2F5, EGFR, EGR1, EIF5, EPHA2, ERBB2, ERBB3, ERBB4, ERCC3, ETV1, ETV3, ETV6, F2R, FASTK, FBN1, FBN2, FES, FGFR1, FGR, FKBP8, FN1, FOS, FOSL1, FOSL2, FOXG1A, FOXO1A, FRAP1, FRZB, FTL, FZD2, FZD5, FZD9, G22P1, GAS6, GCN5L2, GDF15, GNA13, GNAS, GNB2, GNB2L1, GPR39, GRB2, GSK3A, GSPT1, GTF2I, HDAC1, HDGF, HMMR, HPRT1, HRB, HSPA4, HSPA5, HSPA8, HSPB1, HSPH1, HYAL1, HYOU1, ICAM1, ID1, ID2, IDUA, IER3, IFITM1, IGF1R, IGF2R, IGFBP3,

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IGFBP4, IGFBP5, IL1B, ILK, ING1, IRF3, ITGA3, ITGA6, ITGB4, JAK1, JARID1A, JUN, JUNB, JUND, K-ALPHA-1, KIT, KITLG, KLK10, KPNA2, KRAS2, KRT18, KRT2A, KRT9, LAMB1, LAMP2, LCK, LCN2, LEP, LlTAF, LRPAP1, LTF, LYN, LZTR1, MADH1, MAP2K2, MAP3K8, MAPK12, MAPK13, MAPKAPK3, MAPRE1, MARS, MAS1, MCG, MCM2, MCM4, MDM2, MDM4, MET, MGST1, MICB, MLLT3, MME, MMP1, MMP14, MMP17, MMP2, MNDA, MSH2, MSH6, MT3, MYB, MYBL1, MYBL2, MYC, MYCL1, MYCN, MYD88, MYL9, MYLK, NE01, NF1, NF2, NFKB1, NFKB2, NFSF7, NID, NINE, NMBR, NME1, NME2, NME3, N0TCH1, N0TCH2, N0TCH4, NPM1, NQ01, NR1D1, NR2F1, NR2F6, NRAS, NRG1, NSEP1, OSM, PA2G4, PABPC1, PCNA, PCTK1, PCTK2, PCTK3, PDGFA, PDGFB, PDGFRA, PDPK1, PEA15, PFDN4, PFDN5, PGAM1, PHB, PIK3CA, PIK3CB, PIK3CG, PIM1, PKM2, PKMYT1, PLK2, PPARD, PPARG, PPIH, PPP1CA, PPP2R5A, PRDX2, PRDX4, PRKAR1A, PRKCBP1, PRNP, PRSS15, PSMA1, PTCH, PTEN, PTGS1, PTMA, PTN, PTPRN, RAB5A, RAC1, RAD50, RAF1, RALBP1, RAP1A, RARA, RARB, RASGRF1, RB1, RBBP4, RBL2, REA, REL, RELA, RELB, RET, RFC2, RGS19, RHOA, RHOB, RHOC, RHOD, RIPK1, RPN2, RPS6 KB1, RRM1, SARS, SELENBP1, SEMA3C, SEMA4D, SEPP1, SERPINH1, SFN, SFPQ, SFRS7, SHB, SHH, SIAH2, SIVA, SIVA TP53, SKI, SKIL, SLC16A1, SLC1A4, SLC20A1, SMO, esfingomielina fosfodiesterase 1 (SMPD1), SNAI2, SND1, SNRPB2, SOCS1, SOCS3, SOD1, SORT1, SPINT2, SPRY2, SRC, SRPX, STAT1, STAT2, STAT3, STAT5B, STC1, TAF1, TBL3, TBRG4, TCF1, TCF7L2, TFAP2C, TFDP1, TFDP2, TGFA, TGFB1, TGFBI, TGFBR2, TGFBR3, THBS1, TIE, TIMP1, TIMP3, TJP1, TK1, TLE1, TNF, TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF6, TNFSF7, TNK1, TOB1, TP53, TP53BP2, TP5313, TP73, TPBG, TPT1, TRADD, TRAM1, TRRAP, TSG101, TUFM, TXNRD1, TYRO3, UBC, UBE2L6, UCHL1, USP7, VDAC1, VEGF, VHL, VIL2, WEE1, WNT1,

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WNT2, WNT2B, WNT3, WNT5A, WT1, XRCC1, YES1, YWHAB, YWHAZ, ZAP70, e ZNF9.

[117] Um vetor rAAV pode compreender como urn transgene, um ácido nucleico que codifica uma proteína ou RNA funcional que modula a apoptose. A seguir, é apresentada uma lista não limitativa de genes associados à apoptose e ácidos nucleicos que codificam os produtos desses genes e seus homólogos e que codificam pequenos ácidos nucleicos interferentes (por exemplo, shRNAs, miRNAs) que inibem a expressão desses genes e seus homólogos são úteis como transgenes em certas modalidades da invenção: RPS27A, ABL1, AKT1, APAF1, BAD, BAG1, BAG3, BAG4, BAK1, BAX, BCL10, BCL2, BCL2A1, BCL2L1, BCL2L10, BCL2L11, BCL2L12, BCL2L13, BCL2L2, BCLAF1, BFAR, BID, BIK, NAIP, BIRC2, BIRC3, XIAP, BIRC5, BIRC6, BIRC7, BIRC8, BNIP1, BNIP2, BNIP3, BNIP3L, BOK, BRAF, CARD10, CARD11, NLRC4, CARD14, NOD2, NOD1, CARD6, CARDS, CARDS, CASP1, CASP10, CASP14, CASP2, CASP3, CASP4, CASP5, CASP6, CASP7, CASP8, CASP9, CFLAR, CIDEA, CIDEB, CRADD, DAPK1, DAPK2, DFFA, DFFB, FADD, GADD45A, GDNF, HRK, IGF1R, LTA, LTBR, MCL1, NOL3, PYCARD, RIPK1, RIPK2, TNF, TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF10C, TNFRSF10D, TNFRSF11B, TNFRSF12A, TNFRSF14, TNFRSF19, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF21, TNFRSF25, CD40, FAS, TNFRSF6B, CD27, TNFRSF9, TNFSF10, TNFSF14, TNFSF18, CD40LG, FASLG, CD70, TNFSF8, TNFSF9, TP53, TP53BP2, TP73, TP63, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, e TRAF5.

[118] Produtos genéticos úteis também incluem miRNAs. Os miRNAs e outros pequenos ácidos nucleicos interferentes regulam a expressão gênica através da clivagem/degradação do transcrito alvo do RNA ou repressão translacional do RNA mensageiro alvo (mRNA). Os miRNAs são expressos nativamente, tipicamente como produtos finais de

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RNA não traduzidos de 19 a 25. Os miRNAs exibem sua atividade por meio de interações específicas de sequência com as regiões 3' não traduzidas (UTR) dos mRNAs alvo. Esses miRNAs expressos endogenamente formam precursores hairpin que são subsequentemente processados em um duplex de miRNA e posteriormente em uma molécula de miRNA de fita única madura. Esse miRNA maduro guia um complexo multiproteico, miRISC, que identifica o sítio alvo, por exemplo, nas regiões 3' de UTR, dos mRNAs alvo com base em sua complementaridade com o miRNA maduro.

[119] A seguinte lista não limitativa de genes de miRNA e seus homólogos são úteis como genes ou como alvos para pequenos ácidos nucleicos interferentes codificados por genes (por exemplo, esponjas de miRNA, oligonucleotídeos antissenso, RNAs TuD) em certas modalidades dos métodos: hsa-let-7a, hsa-let-7a*, hsa-let-7b, hsa-let-7b*, hsalet-7c, hsa-let-7c*, hsa-let-7d, hsa-let-7d*, hsa-let-7e, hsa-let-7e*, hsalet-7f, hsa-let-7f-1*, hsa-let-7f-2*, hsa-let-7g, hsa-let-7g*, hsa-let-71, hsa-let-71*, hsa-miR-1, hsa-miR-100, hsa-miR-100*, hsa-miR-101, hsamiR-101*, hsa-miR-103, hsa-miR-105, hsa-miR-105*, hsa-miR-106a, hsa-miR-106a*, hsa-miR-106b, hsa-miR-106b*, hsa-miR-107, hsa-miR10a, hsa-miR-10a*, hsa-miR-10b, hsa-miR-10b*, hsa-miR-1178, hsamiR-1179, hsa-miR-1180, hsa-miR-1181, hsa-miR-1182, hsa-miR1183, hsa-miR-1184, hsa-miR-1185, hsa-miR-1197, hsa-miR-1200, hsa-miR-1201, hsa-miR-1202, hsa-miR-1203, hsa-miR-1204, hsa-miR1205, hsa-miR-1206, hsa-miR-1207-3p, hsa-miR-1207-5p, hsa-miR1208, hsa-miR-122, hsa-miR-122*, hsa-miR-1224-3p, hsa-miR-12245p, hsa-miR-1225-3p, hsa-miR-1225-5p, hsa-miR-1226, hsa-miR1226*, hsa-miR-1227, hsa-miR-1228, hsa-miR-1228*, hsa-miR-1229, hsa-miR-1231, hsa-miR-1233, hsa-miR-1234, hsa-miR-1236, hsa-miR1237, hsa-miR-1238, hsa-miR-124, hsa-miR-124*, hsa-miR-1243, hsamiR-1244, hsa-miR-1245, hsa-miR-1246, hsa-miR-1247, hsa-miR

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1248, hsa-miR-1249, hsa-miR-1250, hsa-miR-1251, hsa-miR-1252, hsa-miR-1253, hsa-miR-1254, hsa-miR-1255a, hsa-miR-1255b, hsamiR-1256, hsa-miR-1257, hsa-miR-1258, hsa-miR-1259, hsa-miR125a-3p, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-125b, hsa-miR-125b-1*, hsa-miR125b-2*, hsa-miR-126, hsa-miR-126*, hsa-miR-1260, hsa-miR-1261, hsa-miR-1262, hsa-miR-1263, hsa-miR-1264, hsa-miR-1265, hsa-miR1266, hsa-miR-1267, hsa-miR-1268, hsa-miR-1269, hsa-miR-1270, hsa-miR-1271, hsa-miR-1272, hsa-miR-1273, hsa-miR-127-3p, hsamiR-1274a, hsa-miR-1274b, hsa-miR-1275, hsa-miR-127-5p, hsa-miR1276, hsa-miR-1277, hsa-miR-1278, hsa-miR-1279, hsa-miR-128, hsamiR-1280, hsa-miR-1281, hsa-miR-1282, hsa-miR-1283, hsa-miR1284, hsa-miR-1285, hsa-miR-1286, hsa-miR-1287, hsa-miR-1288, hsa-miR-1289, hsa-miR-129*, hsa-miR-1290, hsa-miR-1291, hsa-miR1292, hsa-miR-1293, hsa-miR-129-3p, hsa-miR-1294, hsa-miR-1295, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-1296, hsa-miR-1297, hsa-miR-1298, hsamiR-1299, hsa-miR-1300, hsa-miR-1301, hsa-miR-1302, hsa-miR1303, hsa-miR-1304, hsa-miR-1305, hsa-miR-1306, hsa-miR-1307, hsa-miR-1308, hsa-miR-130a, hsa-miR-130a*, hsa-miR-130b, hsa-miR130b*, hsa-miR-132, hsa-miR-132*, hsa-miR-1321, hsa-miR-1322, hsamiR-1323, hsa-miR-1324, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b, hsa-miR-134, hsa-miR-135a, hsa-miR-135a*, hsa-miR-135b, hsa-miR-135b*, hsamiR-136, hsa-miR-136*, hsa-miR-137, hsa-miR-138, hsa-miR-138-Γ, hsa-miR-138-2*, hsa-miR-139-3p, hsa-miR-139-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-141, hsa-miR-141*, hsa-miR-142-3p, hsamiR-142-5p, hsa-miR-143, hsa-miR-143*, hsa-miR-144, hsa-miR-144*, hsa-miR-145, hsa-miR-145*, hsa-miR-146a, hsa-miR-146a*, hsa-miR146b-3p, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-147, hsa-miR-147b, hsa-miR148a, hsa-miR-148a*, hsa-miR-148b, hsa-miR-148b*, hsa-miR-149, hsa-miR-149*, hsa-miR-150, hsa-miR-150*, hsa-miR-151-3p, hsa-miR151-5p, hsa-miR-152, hsa-miR-153, hsa-miR-154, hsa-miR-154*, hsa

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63/144 miR-155, hsa-miR-155*, hsa-miR-15a, hsa-miR-15a*, hsa-miR-15b, hsa-miR-15b*, hsa-miR-16, hsa-miR-16-Γ, hsa-miR-16-2*, hsa-miR-17, hsa-miR-17*, hsa-miR-181a, hsa-miR-181a*, hsa-miR-181a-2*, hsamiR-181b, hsa-miR-181c, hsa-miR-181c*, hsa-miR-181d, hsa-miR-182, hsa-miR-182*, hsa-miR-1825, hsa-miR-1826, hsa-miR-1827, hsa-miR183, hsa-miR-183*, hsa-miR-184, hsa-miR-185, hsa-miR-185*, hsamiR-186, hsa-miR-186*, hsa-miR-187, hsa-miR-187*, hsa-miR-188-3p, hsa-miR-188-5p, hsa-miR-18a, hsa-miR-18a*, hsa-miR-18b, hsa-miR18b*, hsa-miR-190, hsa-miR-190b, hsa-miR-191, hsa-miR-191*, hsamiR-192, hsa-miR-192*, hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR193b, hsa-miR-193b*, hsa-miR-194, hsa-miR-194*, hsa-miR-195, hsamiR-195*, hsa-miR-196a, hsa-miR-196a*, hsa-miR-196b, hsa-miR-197, hsa-miR-198, hsa-miR-199a-3p, hsa-miR-199a-5p, hsa-miR-199b-5p, hsa-miR-19a, hsa-miR-19a*, hsa-miR-19b, hsa-miR-19b-1*, hsa-miR19b-2*, hsa-miR-200a, hsa-miR-200a*, hsa-miR-200b, hsa-miR-200b*, hsa-miR-200c, hsa-miR-200c*, hsa-miR-202, hsa-miR-202*, hsa-miR203, hsa-miR-204, hsa-miR-205, hsa-miR-206, hsa-miR-208a, hsa-miR208b, hsa-miR-20a, hsa-miR-20a*, hsa-miR-20b, hsa-miR-20b*, hsamiR-21, hsa-miR-21*, hsa-miR-210, hsa-miR-211, hsa-miR-212, hsamiR-214, hsa-miR-214*, hsa-miR-215, hsa-miR-216a, hsa-miR-216b, hsa-miR-217, hsa-miR-218, hsa-miR-218-Γ, hsa-miR-218-2*, hsa-miR21 9-1 -3p, hsa-miR-219-2-3p, hsa-miR-219-5p, hsa-miR-22, hsa-miR22*, hsa-miR-220a, hsa-miR-220b, hsa-miR-220c, hsa-miR-221, hsamiR-221*, hsa-miR-222, hsa-miR-222*, hsa-miR-223, hsa-miR-223*, hsa-miR-224, hsa-miR-23a, hsa-miR-23a*, hsa-miR-23b, hsa-miR-23b*, hsa-miR-24, hsa-miR-24-Γ, hsa-miR-24-2*, hsa-miR-25, hsa-miR-25*, hsa-miR-26a, hsa-miR-26a-1*, hsa-miR-26a-2*, hsa-miR-26b, hsa-miR26b*, hsa-miR-27a, hsa-miR-27a*, hsa-miR-27b, hsa-miR-27b*, hsamiR-28-3p, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-296-3p, hsa-miR-296-5p, hsa-miR297, hsa-miR-298, hsa-miR-299-3p, hsa-miR-299-5p, hsa-miR-29a,

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64/144 hsa-miR-29a*, hsa-miR-29b, hsa-miR-296-Γ, hsa-miR-296-2*, hsamiR-29c, hsa-miR-29c*, hsa-miR-300, hsa-miR-301a, hsa-miR-301b, hsa-miR-302a, hsa-miR-302a*, hsa-miR-302b, hsa-miR-302b*, hsamiR-302c, hsa-miR-302c*, hsa-miR-302d, hsa-miR-302d*, hsa-miR302e, hsa-miR-302f, hsa-miR-30a, hsa-miR-30a*, hsa-miR-30b, hsamiR-30b*, hsa-miR-30c, hsa-miR-30c-1*, hsa-miR-30c-2*, hsa-miR30d, hsa-miR-30d*, hsa-miR-30e, hsa-miR-30e*, hsa-miR-31, hsa-miR3Γ, hsa-miR-32, hsa-miR-32*, hsa-miR-320a, hsa-miR-320b, hsa-miR320c, hsa-miR-320d, hsa-miR-323-3p, hsa-miR-323-5p, hsa-miR-3243p, hsa-miR-324-5p, hsa-miR-325, hsa-miR-326, hsa-miR-328, hsamiR-329, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-330-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR331-5p, hsa-miR-335, hsa-miR-335*, hsa-miR-337-3p, hsa-miR-337-5p, hsa-miR-338-3p, hsa-miR-338-5p, hsa-miR-339-3p, hsa-miR-339-5p, hsa-miR-33a, hsa-miR-33a*, hsa-miR-33b, hsa-miR-33b*, hsa-miR-340, hsa-miR-340*, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-342-5p, hsa-miR-345, hsamiR-346, hsa-miR-34a, hsa-miR-34a*, hsa-miR-34b, hsa-miR-34b*, hsa-miR-34c-3p, hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-361-3p, hsa-miR-361-5p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-363, hsa-miR-363*, hsamiR-365, hsa-miR-367, hsa-miR-367*, hsa-miR-369-3p, hsa-miR-3695p, hsa-miR-370, hsa-miR-371-3p, hsa-miR-371-5p, hsa-miR-372, hsamiR-373, hsa-miR-373*, hsa-miR-374a, hsa-miR-374a*, hsa-miR-374b, hsa-miR-374b*, hsa-miR-375, hsa-miR-376a, hsa-miR-376a*, hsa-miR376b, hsa-miR-376c, hsa-miR-377, hsa-miR-377*, hsa-miR-378, hsamiR-378*, hsa-miR-379, hsa-miR-379*, hsa-miR-380, hsa-miR-380*, hsa-miR-381, hsa-miR-382, hsa-miR-383, hsa-miR-384, hsa-miR-4093p, hsa-miR-409-5p, hsa-miR-410, hsa-miR-411, hsa-miR-4H*, hsamiR-412, hsa-miR-421, hsa-miR-422a, hsa-miR-423-3p, hsa-miR-4235p, hsa-miR-424, hsa-miR-424*, hsa-miR-425, hsa-miR-425*, hsa-miR429, hsa-miR-431, hsa-miR-43r, hsa-miR-432, hsa-miR-432*, hsamiR-433, hsa-miR-448, hsa-miR-449a, hsa-miR-449b, hsa-miR-450a,

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65/144 hsa-miR-450b-3p, hsa-miR-450b-5p, hsa-miR-451, hsa-miR-452, hsamiR-452*, hsa-miR-453, hsa-miR-454, hsa-miR-454*, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-455-5p, hsa-miR-483-3p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-484, hsamiR-485-3p, hsa-miR-485-5p, hsa-miR-486-3p, hsa-miR-486-5p, hsamiR-487a, hsa-miR-487b, hsa-miR-488, hsa-miR-488*, hsa-miR-489, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-490-5p, hsa-miR-491-3p, hsa-miR-491-5p, hsa-miR-492, hsa-miR-493, hsa-miR-493*, hsa-miR-494, hsa-miR-495, hsa-miR-496, hsa-miR-497, hsa-miR-497*, hsa-miR-498, hsa-miR-4993p, hsa-miR-499-5p, hsa-miR-500, hsa-miR-500*, hsa-miR-501-3p, hsa-miR-501-5p, hsa-miR-502-3p, hsa-miR-502-5p, hsa-miR-503, hsamiR-504, hsa-miR-505, hsa-miR-505*, hsa-miR-506, hsa-miR-507, hsamiR-508-3p, hsa-miR-508-5p, hsa-miR-509-3-5p, hsa-miR-509-3p, hsamiR-509-5p, hsa-miR-510, hsa-miR-511, hsa-miR-512-3p, hsa-miR512-5p, hsa-miR-513a-3p, hsa-miR-513a-5p, hsa-miR-513b, hsa-miR513c, hsa-miR-514, hsa-miR-515-3p, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-516a3p, hsa-miR-516a-5p, hsa-miR-516b, hsa-miR-517*, hsa-miR-517a, hsa-miR-517b, hsa-miR-517c, hsa-miR-518a-3p, hsa-miR-518a-5p, hsa-miR-518b, hsa-miR-518c, hsa-miR-518c*, hsa-miR-518d-3p, hsamiR-518d-5p, hsa-miR-518e, hsa-miR-518e*, hsa-miR-518f, hsa-miR518f*, hsa-miR-519a, hsa-miR-519b-3p, hsa-miR-519c-3p, hsa-miR519d, hsa-miR-519e, hsa-miR-519e*, hsa-miR-520a-3p, hsa-miR-520a5p, hsa-miR-520b, hsa-miR-520c-3p, hsa-miR-520d-3p, hsa-miR-520d5p, hsa-miR-520e, hsa-miR-520f, hsa-miR-520g, hsa-miR-520h, hsamiR-521, hsa-miR-522, hsa-miR-523, hsa-miR-524-3p, hsa-miR-5245p, hsa-miR-525-3p, hsa-miR-525-5p, hsa-miR-526b, hsa-miR-526b*, hsa-miR-532-3p, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-539, hsa-miR-541, hsamiR-541*, hsa-miR-542-3p, hsa-miR-542-5p, hsa-miR-543, hsa-miR544, hsa-miR-545, hsa-miR-545*, hsa-miR-548a-3p, hsa-miR-548a-5p, hsa-miR-548b-3p, hsa-miR-5486-5p, hsa-miR-548c-3p, hsa-miR-548c5p, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-548d-5p, hsa-miR-548e, hsa-miR-548f,

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66/144 hsa-miR-548g, hsa-miR-548h, hsa-miR-548i, hsa-miR-548j, hsa-miR548k, hsa-miR-5481, hsa-miR-548m, hsa-miR-548n, hsa-miR-548o, hsa-miR-548p, hsa-miR-549, hsa-miR-550, hsa-miR-550*, hsa-miR551a, hsa-miR-551b, hsa-miR-551 b*, hsa-miR-552, hsa-miR-553, hsamiR-554, hsa-miR-555, hsa-miR-556-3p, hsa-miR-556-5p, hsa-miR557, hsa-miR-558, hsa-miR-559, hsa-miR-561, hsa-miR-562, hsa-miR563, hsa-miR-564, hsa-miR-566, hsa-miR-567, hsa-miR-568, hsa-miR569, hsa-miR-570, hsa-miR-571, hsa-miR-572, hsa-miR-573, hsa-miR574-3p, hsa-miR-574-5p, hsa-miR-575, hsa-miR-576-3p, hsa-miR-5765p, hsa-miR-577, hsa-miR-578, hsa-miR-579, hsa-miR-580, hsa-miR581, hsa-miR-582-3p, hsa-miR-582-5p, hsa-miR-583, hsa-miR-584, hsa-miR-585, hsa-miR-586, hsa-miR-587, hsa-miR-588, hsa-miR-589, hsa-miR-589*, hsa-miR-590-3p, hsa-miR-590-5p, hsa-miR-591, hsamiR-592, hsa-miR-593, hsa-miR-593*, hsa-miR-595, hsa-miR-596, hsamiR-597, hsa-miR-598, hsa-miR-599, hsa-miR-600, hsa-miR-601, hsamiR-602, hsa-miR-603, hsa-miR-604, hsa-miR-605, hsa-miR-606, hsamiR-607, hsa-miR-608, hsa-miR-609, hsa-miR-610, hsa-miR-611, hsamiR-612, hsa-miR-613, hsa-miR-614, hsa-miR-615-3p, hsa-miR-6155p, hsa-miR-616, hsa-miR-616*, hsa-miR-617, hsa-miR-618, hsa-miR619, hsa-miR-620, hsa-miR-621, hsa-miR-622, hsa-miR-623, hsa-miR624, hsa-miR-624*, hsa-miR-625, hsa-miR-625*, hsa-miR-626, hsamiR-627, hsa-miR-628-3p, hsa-miR-628-5p, hsa-miR-629, hsa-miR629*, hsa-miR-630, hsa-miR-631, hsa-miR-632, hsa-miR-633, hsa-miR634, hsa-miR-635, hsa-miR-636, hsa-miR-637, hsa-miR-638, hsa-miR639, hsa-miR-640, hsa-miR-641, hsa-miR-642, hsa-miR-643, hsa-miR644, hsa-miR-645, hsa-miR-646, hsa-miR-647, hsa-miR-648, hsa-miR649, hsa-miR-650, hsa-miR-651, hsa-miR-652, hsa-miR-653, hsa-miR654-3p, hsa-miR-654-5p, hsa-miR-655, hsa-miR-656, hsa-miR-657, hsa-miR-658, hsa-miR-659, hsa-miR-660, hsa-miR-661, hsa-miR-662, hsa-miR-663, hsa-miR-663b, hsa-miR-664, hsa-miR-664*, hsa-miR

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665, hsa-miR-668, hsa-miR-671-3p, hsa-miR-671-5p, hsa-miR-675, hsa-miR-7, hsa-miR-708, hsa-miR-708*, hsa-miR-7-1*, hsa-miR-7-2*, hsa-miR-720, hsa-miR-744, hsa-miR-744*, hsa-miR-758, hsa-miR-760, hsa-miR-765, hsa-miR-766, hsa-miR-767-3p, hsa-miR-767-5p, hsamiR-768-3p, hsa-miR-768-5p, hsa-miR-769-3p, hsa-miR-769-5p, hsamiR-770-5p, hsa-miR-802, hsa-miR-873, hsa-miR-874, hsa-miR-8753p, hsa-miR-875-5p, hsa-miR-876-3p, hsa-miR-876-5p, hsa-miR-877, hsa-miR-877*, hsa-miR-885-3p, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-886-3p, hsamiR-886-5p, hsa-miR-887, hsa-miR-888, hsa-miR-888*, hsa-miR-889, hsa-miR-890, hsa-miR-891a, hsa-miR-891b, hsa-miR-892a, hsa-miR892b, hsa-miR-9, hsa-miR-9*, hsa-miR-920, hsa-miR-921, hsa-miR922, hsa-miR-923, hsa-miR-924, hsa-miR-92a, hsa-miR-92a-1*, hsamiR-92a-2*, hsa-miR-92b, hsa-miR-92b*, hsa-miR-93, hsa-miR-93*, hsa-miR-933, hsa-miR-934, hsa-miR-935, hsa-miR-936, hsa-miR-937, hsa-miR-938, hsa-miR-939, hsa-miR-940, hsa-miR-941, hsa-miR-942, hsa-miR-943, hsa-miR-944, hsa-miR-95, hsa-miR-96, hsa-miR-96*, hsa-miR-98, hsa-miR-99a, hsa-miR-99a*, hsa-miR-99b, e hsa-miR99b*. Por exemplo, o miRNA direcionado ao quadro de leitura aberto 72 do cromossomo 8 (C9orf72) que expressa superóxido dismutase (SOD1), associado à esclerose lateral amiotrófica (ELA) pode ser de interesse.

[120] Um miRNA inibe a função dos mRNAs alvo e, como resultado, inibe a expressão dos polipeptídeos codificados pelos mRNAs. Assim, o bloqueio (parcial ou total) da atividade do miRNA (por exemplo, silenciando o miRNA) pode efetivamente induzir ou restaurar a expressão de um polipeptídeo cuja expressão é inibida (desexpressar o polipeptídeo). Em uma modalidade, a desrepressão de polipeptídeos codificados por alvos de mRNA de um miRNA é realizada inibindo a atividade de miRNA nas células através de qualquer um de uma variedade de métodos. Por exemplo, o bloqueio da atividade de um miRNA pode

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68/144 ser realizado por hibridação com um pequeno ácido nucleico interferente (por exemplo, oligonucleotídeo antissenso, esponja do miRNA, TuD RNA) que é complementar ou substancialmente complementar ao miRNA, bloqueando assim a interação do miRNA com seu mRNA alvo. Como aqui utilizado, um pequeno ácido nucleico interferente que é substancialmente complementar a um miRNA é aquele que é capaz de hibridar com um miRNA e bloquear a atividade do miRNA. Em algumas modalidades, um pequeno ácido nucleico interferente que é substancialmente complementar a um miRNA é um pequeno ácido nucleico interferente que é complementar ao miRNA, exceto 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17 ou 18 bases. Um inibidor de miRNA é um agente que bloqueia a função, expressão e/ou processamento do miRNA. Por exemplo, essas moléculas incluem, entre outras, antissenso específico para microRNA, esponjas de microRNA, RNAs de chamarizes difíceis (RNAs TuD) e oligonucleotídeos de microRNA (oligonucleotídeos de fita dupla, grampo de cabelo, oligonucleotídeos curtos) que inibem a interação do miRNA com um complexo Drosha.

[121] Ainda outros genes úteis podem incluir aqueles que codificam imunoglobulinas que conferem imunidade passiva a um patógeno. Uma molécula de imunoglobulina é uma proteína que contém as porções imunologicamente ativas de uma cadeia pesada de imunoglobulina e cadeia leve de imunoglobulina acopladas covalentemente e capazes de combinar especificamente com o antígeno. As moléculas de imunoglobulina são de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2) ou subclasse. Os termos anticorpo e imunoglobulina podem ser usados de forma intercambiável neste documento.

[122] Uma cadeia pesada de imunoglobulina é um polipeptídeo que contém pelo menos uma porção do domínio de ligação ao antígeno de uma imunoglobulina e pelo menos uma porção de uma região variável

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69/144 de uma cadeia pesada de imunoglobulina ou pelo menos uma porção de uma região constante de uma imunoglobulina pesada cadeia. Assim, a cadeia pesada derivada de imunoglobulina possui regiões significativas da homologia da sequência de aminoácidos com um membro da superfamília do gene da imunoglobulina. Por exemplo, a cadeia pesada em um fragmento Fab é uma cadeia pesada derivada de imunoglobulina.

[123] Uma cadeia leve de imunoglobulina é um polipeptídeo que contém pelo menos uma porção do domínio de ligação ao antígeno de uma imunoglobulina e pelo menos uma porção da região variável ou pelo menos uma porção de uma região constante de uma cadeia leve de imunoglobulina. Assim, a cadeia leve derivada de imunoglobulina possui regiões significativas da sequência de aminoácidos com um membro da superfamília do gene da imunoglobulina.

[124] Uma imunoadesina é uma molécula quimérica semelhante a anticorpo que combina o domínio funcional de uma proteína de ligação, geralmente um receptor, ligante, ou molécula de adesão celular, com domínios constantes de imunoglobulina, geralmente incluindo as regiões de dobradiça e Fc.

[125] Um fragmento de ligação ao antígeno (Fab) é uma região em um anticorpo que se liga a antígenos. É composto por um domínio constante e um variável de cada uma das cadeias pesada e cadeia leve.

[126] O construto antipatógeno é selecionado com base no agente causador (patógeno) da doença contra a qual a proteção é solicitada. Esses patógenos podem ser de origem viral, bacteriana ou fúngica e podem ser usados para prevenir a infecção em seres humanos contra doenças humanas, ou em mamíferos não humanos ou outros animais para prevenir doenças veterinárias.

[127] O rAAV pode incluir genes que codificam anticorpos e, particularmente, anticorpos neutralizantes contra um patógeno viral. Tais anticorpos antivirais podem incluir anticorpos anti-influenza direcionados

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70/144 contra um ou mais dos vírus influenza A, influenza B e influenza C. Os vírus do tipo A são os patógenos humanos mais virulentos. Os sorotipos de influenza A que foram associados a pandemias incluem o H1N1, que causou a gripe espanhola em 1918 e a gripe suína em 2009; H2N2, que causou a gripe asiática em 1957; H3N2, que causou a gripe de Hong Kong em 1968; H5N1, que causou a gripe aviária em 2004; H7N7; H1N2; H9N2; H7N2; H7N3; e H10N7. Outros vírus patogênicos alvo incluem arenavirus (incluindo funina, machupo e Lassa), filovírus (incluindo Marburg e Ebola), hantavirus, picornoviridae (incluindo rinovírus, echovirus), coronavirus, paramixovirus, morbillivírus, vírus sincicial respiratório, togavirus, coxsack vírus, Vírus JC, parvovirus B19, parainfluenza, adenovirus, reovírus, varíola (Variola major (Smallpox)) e Vaccinia (Cowpox) da família dos poxvirus e varicela-zoster (pseudorrabiscos). As febres hemorrágicas virais são causadas por membros da família arenavirus (febre de Lassa) (cuja família também está associada à coriomeningite linfocítica (LCM)), filovírus (vírus ebola) e hantavirus (puremala). Os membros do picornavírus (uma subfamília derinovírus) estão associados ao resfriado comum em seres humanos. A família coronavirus, que inclui vários vírus não humanos, como vírus da bronquite infecciosa (aves de capoeira), vírus gastroentérico transmissível porcino (porco), vírus da encefalomielite por hemaglutina suína (porco), vírus da peritonite infecciosa felina (gato), coronavirus entérico felino (gato), coronavirus canino (cão). Os coronavirus respiratórios humanos têm sido associados a um resfriado comum, hepatite não A, B ou C e síndrome respiratória aguda súbita (SARS). A família dos paramixovírus inclui o vírus parainfluenza tipo 1, vírus parainfluenza tipo 3, vírus bovino parainfluenza tipo 3, rubulavírus (vírus da caxumba, vírus parainfluenza tipo 2, vírus parainfluenza tipo 4, vírus da doença de Newcastle (galinhas), peste bovina, morbillivírus, que inclui sarampo e cinomose canina e pneumovírus, que inclui vírus sincicial respiratório (RSV). A família de

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71/144 parvovirus inclui parvovirus felino (enterite felina), panleucopeniavirus felino, parvovirus canino e parvovirus suíno. A família de adenovirus inclui virus (EX, AD7, ARD, O.B.) que causam doenças respiratórias. Assim, em certas modalidades, um vetor rAAV como aqui descrito pode ser modificado para expressar um anticorpo antiebola, por exemplo, 2G4, 4G7,13C6, um anticorpo anti-influenza, por exemplo, FI6, CR8033 e anticorpo anti-RSV, por exemplo, palivizumabe, motavizumabe.

[128] Um construto de anticorpo neutralizante contra um patógeno bacteriano também pode ser selecionado para uso na presente invenção. Em uma modalidade, o construto de anticorpo neutralizante é direcionado contra a própria bactéria. Em outra modalidade, o construto de anticorpo neutralizante é direcionado contra uma toxina produzida pelas bactérias. Exemplos de patógenos bacterianos transportados pelo ar incluem, por exemplo, Neisseria meningitidis (meningite), Klebsiella pneumonia (pneumonia), Pseudomonas aeruginosa (pneumonia), Pseudomonas pseudomallei (pneumonia), Pseudomonas mallei (pneumonia), Acinetobacter (pneumonia), Moraxella catarrhalis, Moraxella lacunata, Alkaligenes, Cardiobacterium, Haemophilus influenzae (flu), Haemophilus parainfluenzae, Bordetella pertussis (coqueluche), Francisella tularensis (pneumonia/febrr), Legionella pneumonia (Doença dos legionários), Chlamydia psittaci (pneumonia), Chlamydia pneumoniae (pneumonia), Mycobacterium tuberculosis (tuberculose(TB)), Mycobacterium kansasii (TBj, Mycobacterium avium (pneumonia), Nocardia asteroides (pneumonia), Bacillus anthracis (anthrax), Staphylococcus aureus (pneumonia), Streptococcus pyogenes (escarlatina), Streptococcus pneumoniae (pneumonia), Corynebacteria diphtheria (difteria), Mycoplasma pneumoniae (pneumonia).

[129] O rAAV pode incluir genes que codificam anticorpos e anticorpos neutralizantes particularmente contra um patógeno bacteriano, como o agente causador do antraz, uma toxina produzida por Bacillius

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72/144 anthracis. Anticorpos neutralizantes contra o agente protetor (PA), um dos três peptídeos que formam o toxoide, foram descritos. Os outros dois polipeptídeos consistem em fator letal (LF) e fator de edema (EF). Os anticorpos neutralizantes anti-PA foram descritos como sendo eficazes na imunização passiva contra o antraz. Ver, por exemplo, a patente US número 7.442.373; R. Sawada-Hirai et al., J. Immune Based Ther Vaccines. 2004; 2:5. (on-line 2004,12 de maio). Ainda outros anticorpos neutralizantes da toxina antiantraz foram descritos e/ou podem ser gerados. Da mesma forma, anticorpos neutralizantes contra outras bactérias e/ou toxinas bacterianas podem ser usados para gerar um construto antipatógeno entregue por AAV, como descrito aqui.

[130] Os anticorpos contra doenças infecciosas podem ser causados por parasitas ou fungos, incluindo, por exemplo, espécies de Aspergillus, Absidia corymbifera, Rhixpus stolonifer, Mucor plumbeaus, Cryptococcus neoformans, Histoplasm capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Penicillium species, Micropolyspora faeni, Thermoactinomyces vulgaris, Alternaria alternate, Clade sporium species, Helminthosporium e Stachybotrys.

[131] O rAAV pode incluir genes que codificam anticorpos, e particularmente anticorpos neutralizantes, contra fatores patogênicos de doenças como a doença de Alzheimer (AD), doença de Parkinson (PD), GBA-Parkinson, artrite reumatoide (RA), síndrome do intestino irritável (IBS), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), câncer, tumores, esclerose sistêmica, asma e outras doenças. Tais anticorpos podem ser., Sem limitação, por exemplo, alfa-sinucleína, fator de crescimento endotelial anti-vascular (VEGF) (anti-VEGF), anti-VEGFA, anti-PD-1, antiPDL1, anti-CTLA- 4, anti-TNF-alfa, anti-IL-17, anti-IL-23, anti-IL-21, antiIL-6, receptor anti-IL-6, anti-IL-5, anti-IL-7, anti-fator XII, anti-IL-2, antiHIV, anti-lgE, receptor de fator de necrose antitumoral-1 (TNFR1), antientalhe 2/3, anti-entalhe 1, anti-OX40, atirosina quinase 3 do receptor

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73/144 anti-erb-b2 (ErbB3), anti-ErbB2, antígeno de maturação de células antibeta, estimulador de linfócitos anti-B, anti-CD20, anti-HER2, fator de estimulação de colônias de macrófagos anti-granulócitos, antioncostatina M (OSM), proteína do gene 3 de ativação antilinfócito (LAG3), antiCCL20, componente P amiloide sérico (SAP), inibidor de antiprolil hidroxilase, anti-CD38, antiglicoproteina llb/llla, anti-CD52, anti-CD30, antiIL-1 beta, receptor do fator de crescimento antiepidérmico, anti-CD25, ligante anti-RANK, proteína C5 do sistema anticomplemento, antiCD11a, receptor anti-CD3, integrina anti-alfa-4 (a4), anti- Proteína RSV F e anti-integrina cup?. Ainda outros patógenos e doenças serão evidentes para um versado na técnica. Outros anticorpos adequados podem incluir aqueles úteis no tratamento da doença de Alzheimer, como, por exemplo, anti-beta-amiloide (por exemplo, crenezumab, solanezumab, aducanumab), fibrila anti-beta-amiloide, placas anti-beta-amiloide, antitau, um bapineuzamab, entre outros. Outros anticorpos adequados para o tratamento de uma variedade de indicações incluem os descritos, por exemplo, em PCT/US2016/058968, depositado em 27 de outubro de 2016, publicado como WO 2017/075119A1.

II. Produção vetorial de rAAV [132] Para uso na produção de um vetor viral de AAV (por exemplo, um AAV recombinante (r)), os cassetes de expressão podem ser transportados em qualquer vetor adequado, por exemplo, um plasmídeo, que é entregue a uma célula hospedeira de empacotamento. Os plasmídeos úteis nesta invenção podem ser manipulados de modo a serem adequados para replicação e empacotamento in vitro em células procarióticas, células de insetos, células de mamíferos, entre outros. Técnicas de transfecção adequadas e células hospedeiras de empacotamento são conhecidas e/ou podem ser prontamente projetadas por um versado na técnica.

[133] Os métodos para gerar e isolar AAVs adequados para uso

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74/144 como vetores são conhecidos na técnica. Verem geral, por exemplo, Grieger & Samulski, 2005, Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production and clinical applications, Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 99: 119-145; Buning et al., 2008, Recent developments in adeno-associated virus vector technology, J. Gene Med. 10: 717-733; e as referências citadas abaixo, cada uma das quais é incorporada neste documento por referência na sua totalidade. Para empacotar um gene em virions, os ITRs são os únicos componentes de AAV necessários em cis no mesmo construto que a molécula de ácido nucleico que contém o(s) cassete(s) de expressão. Os genes cap e rep podem ser fornecidos em trans.

[134] Em uma modalidade, os cassetes de expressão aqui descritos são modificados por manipulação genética em um elemento genético (por exemplo, um plasmídeo shuttle) que transfere as sequências de construto de imunoglobulina transportadas nela para uma célula hospedeira de empacotamento para produção de um vetor viral. Em uma modalidade, o elemento genético selecionado pode ser entregue a uma célula de empacotamento de AAV por qualquer método adequado, incluindo transfecção, eletroporação, distribuição de lipossomas, técnicas de fusão de membrana, grânulos revestidos com DNA de alta velocidade, infecção viral e fusão de protoplasto. Também podem ser feitas células de empacotamento de AAV estáveis. Alternativamente, os cassetes de expressão podem ser usados para gerar um vetor viral que não seja o AAV, ou para a produção de misturas de anticorpos in vitro. Os métodos usados para fazer tais construtos são conhecidos daqueles versados na manipulação de ácido nucleico e incluem manipulação genética, manipulação recombinante e técnicas sintéticas. Ver, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ed. Green and Sambrook, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012).

[135] O termo intermediário AAV ou intermediário do vetor AAV

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75/144 refere-se a um capsídeo rAAV montado que não possui as sequências genômicas desejadas nele embaladas. Estes também podem ser denominados capsídeos vazios. Esse capsídeo pode não conter nenhuma sequência genômica detectável de um cassete de expressão ou apenas sequências genômicas parcialmente empacotadas, que são insuficientes para obter o produto genômico. Esses capsídeos vazios não são funcionais para transferir o gene de interesse a uma célula hospedeira.

[136] O vírus adenoassociado recombinante (AAV) descrito neste documento pode ser gerado utilizando técnicas que são conhecidas. Ver, por exemplo, WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; US 7588772 B2. Esse método envolve a cultura de uma célula hospedeira que contém uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína de capsídeo de AAV; um gene de rep. funcional; um cassete de expressão composto por, no mínimo, repetições terminais invertidas de AAV (ITRs) e um transgene; e funções auxiliares suficientes para permitir o empacotamento do cassete de expressão na proteína do capsídeo de AAV. Métodos para gerar capsídeos, e, sequências de codificação para as mesmas, e métodos para a produção de vetores virais de rAAV foram descritos. Veja, por exemplo, Gao, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6081-6086 (2003) e US 2013/0045186A1.

[137] Em uma modalidade, é fornecida uma cultura de células de produção útil para a produção de um AAVhu68 recombinante. Essa cultura celular contém um ácido nucleico que expressa a proteína do capsídeo AAVhu68 na célula hospedeira; uma molécula de ácido nucleico adequada para empacotamento no capsídeo AAVhu68, por exemplo, um genoma de vetor que contém ITRs de AAV e uma sequência de ácido nucleico não-AAV que codifica um produto de gene operacional mente ligado a sequências que direcionam a expressão do produto em uma célula hospedeira; e funções de rep AAV suficientes e funções auxiliares de adenovirus para

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76/144 permitir o empacotamento da molécula de ácido nucleico no capsídeo AAVhu68 recombinante. Em uma modalidade, a cultura de células é composta de células de mamífero (por exemplo, células 293 de rim embrionário humano, entre outras) ou células de inseto (por exemplo, baculovírus).

[138] Opcionalmente, as funções rep são fornecidas por um AAV diferente de hu68. Em certas modalidades, pelo menos partes das funções rep são de AAVhu68. Ver, por exemplo, as sequências rep codificam as proteínas rep da SEQ ID NO: 4 e seus fragmentos funcionais. O rep AAV pode ser codificado pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 3. Em outra modalidade, a proteína rep é uma proteína heteróloga que não seja AAVhu68rep, por exemplo, mas não se limita a proteína rep AAV1, proteína rep AAV2, proteína rep AAV3, proteína rep AAV4, proteína rep AAV5, proteína rep AAV6, proteína rep AAV7, proteína rep AAV8; ou rep 78, rep 68, rep 52, rep 40, rep68/78 e rep40/52; ou um fragmento do mesmo; ou outra fonte. Opcionalmente, as sequências rep e cap estão no mesmo elemento genético na cultura de células. Pode haver um espaçador entre a sequência rep e o gene cap. Opcionalmente, o espaçador é atgacttaaaccaggt, SEQ ID NO: 9. Qualquer uma destas sequências do capsídeo AAVhu68 ou AAV mutante pode estar sob o controle de sequências de controle reguladoras exógenas que direcionam sua expressão em uma célula hospedeira.

[139] Em uma modalidade, as células são fabricadas em uma cultura de células adequada (por exemplo, células HEK 293). Os métodos para fabricar os vetores de terapia gênica descritos neste documento incluem métodos bem conhecidos na técnica, tais como geração de DNA plasmídico, utilizado para a produção dos vetores de terapia gênica, geração dos vetores e purificação dos vetores. Em algumas modalidades, o vetor de terapia gênica é um vetor de AAV e os plasmídeos gerados são um plasmídeo cis AAV que codifica o genoma de AAV e o

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77/144 gene de interesse, um plasmídeo trans de AAV contendo genes rep e cap de AAV e um plasmídeo auxiliar de adenovirus. O processo de geração de vetores pode incluir etapas do método, como iniciação de cultura celular, passagem de células, semeadura de células, transfecção de células com o DNA plasmídico, troca de meio pós-transfecção para meio livre de soro e coleta de células contendo o vetor e os meios de cultura. As células e meios de cultura contendo os vetores coletados são referidas neste documento como coletas de células brutas. Em ainda outro sistema, os vetores de terapia genética são introduzidos nas células de insetos por infecção com vetores baseados em baculovírus. Para revisões sobre estes sistemas de produção, ver geralmente, por exemplo, Zhang et al., 2009, Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production, Human Gene Therapy 20:922-929, o conteúdo de cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Métodos de produção e utilização destes e de outros sistemas de produção de AAV são também descritos nas seguintes patentes doe EUA, o conteúdo de cada um das quais é incorporado neste documento por referência na sua totalidade: 5.139.941; 5.741.683; 6.057.152; 6.204.059; 6.268.213; 6.491.907; 6.660.514; 6.951.753; 7.094.604; 7.172.893; 7.201.898; 7.229.823; e 7.439.065.

[140] A coleta de células brutas pode então ser as etapas do método em questão, como a concentração da coleta vetoral, a diafiltração da colega vetoral, a microfluidização da coleta vetoral, a digestão de nuclease da coleta vetoral, a filtração do intermediário microfluidizado, a purificação bruta por cromatografia, a purificação bruta por ultracentrifugação, a permuta de tampão por filtração de luxo tangencial e/ou a formulação e a filtração para preparar o vetor de volume.

[141 ] Uma purificação por cromatografia de afinidade de duas etapas a uma elevada concentração de sal, seguida de uma cromatografia

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78/144 de resina por permuta aniônica, é usada para purificar o produto da droga vetoral e para remover os capsídeos vazios. Esses métodos são descritos em mais detalhes no Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2016 /065970, depositado em 9 de dezembro de 2016, e seus documentos prioritários, Pedido de Patente US No. 62/322.071, depositado em 13 de abril de 2016 e 62/226.357, depositado em 11 de dezembro de 2015 e intitulado Scalable Purification Method for AAV9, incorporado a este documento por referência. Métodos de purificação de AAV8, Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2016/065976, depositado em 9 de dezembro de 2016 e os documentos prioritários dos Pedidos de Patente US Nos. 62/322.098, depositado em 13 de abril de 2016, e 62/266.341, depositado em 11 de dezembro de 2015, e rh10, Pedido de Patente Internacional No. PCT/US16/66013, depositado em 9 de dezembro de 2016, e seus documentos de prioridade, o Pedido de Patente No. 62/322.055, depositado em 13 de abril de 2016, e 62/266.347, intitulado Scalable purificação método para AAVrhIO, também depositado em 11 de dezembro de 2015, e para AAV1, o Pedido de Patente Internacional N°. PCT/US2016/065974, depositado em 9 de dezembro de 2016, e seus documentos prioritários, os Pedidos de Patente US Nos. 62/322.083, depositado em 13 de abril de 2016, e 62/26.351, intitulado Scalable Purification Method for AAV1, depositado em 11 de dezembro de 2015, todos incorporados a este documento por referência.

[142] Para calcular o conteúdo de partículas vazias e completas, os volumes de banda VP3 de uma amostra selecionada (por exemplo, neste documento, uma preparação purificada por gradiente de iodixanol em que o # de GC = # de partículas) é representada graficamente em comparação com partículas de GC carregadas. A equação linear resultante (y = mx + c) é usada para calcular o número de partículas nos volumes de banda dos picos do artigo de teste. O número de partículas

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79/144 (pt) por 20 μΙ_ carregados é então multiplicado por 50 para gerar partículas (pt)/ml_. Pt/mL dividido por GC/mL dá a proporção de partículas por cópias do genoma (pt/GC). Pt/mL-GC/mL gera pt/mL vazio. O pt/mL vazio dividido por pt/mL e x 100 dá o percentual de partículas vazias.

[143] Geralmente, os métodos para avaliar os capsídeos vazios e as partículas do vetor de AAV com genomas empacotados são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Grimm et al. Gene Therapy (1999) 6:1322-1330; Sommer et al. Molec. Ther. (2003) 7:122-128. Para testar o capsídeo desnaturado, os métodos incluem submeter o estoque de AAV tratado a uma eletroforese de gel de SDS-poliacrilamida, consistindo em qualquer gel capaz de separar as três proteínas de capsídeo, por exemplo, um gradiente de gel contendo tris-acetato a 3-8% no tampão, depois executar o gel até o material da amostra ser separado e transferir o gel para as membranas de náilon ou nitrocelulose, de preferência náilon. Os anticorpos do capsídeo anti-AAV são então utilizados como anticorpos primários que se ligam a proteínas de capsídeo desnaturadas, de preferência um anticorpo monoclônico anti-capsídeo de AAV, mais preferencialmente o anticorpo monoclônico anti-AAV-2 B1 (Wobus et al. J. Virol. (2000) 74:9281-9293). Então, um anticorpo secundário é utilizado, um que se liga ao anticorpo primário e contém um meio para detectar a ligação ao anticorpo primário, mais preferencialmente um anticorpo anti-lgG contendo uma molécula de detecção ligada covalentemente a este, mais preferencialmente um anticorpo de IgG anticamundongo de ovelha ligado covalentemente à peroxidase de rábano silvetre. Um método para detectar a ligação é utilizado para determinar semiquantitativamente a ligação entre os anticorpos primário e secundário, de preferência um método de detecção capaz de detectar emissões de isótopos radioativos, radiação eletromagnética ou alterações colorimétricas, mais preferencialmente um kit de detecção de quimiluminescência. Por exemplo, para a SDS-PAGE, amostras de frações de

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80/144 coluna podem ser tomadas e aquecidas em tampão de carga de SDSPAGE contendo um agente redutor (por exemplo, DTT) e as proteínas do capsídeo foram resolvidas em géis de poliacrilamida pré-moldados (por exemplo, Novex). Uma coloração prata pode ser realizada utilizando SilverXpress (Invitrogen, CA), de acordo com as instruções do fabricante ou outro método de coloração adequado, isto é, por coloração SYPRO ruby ou coomassie. Em uma modalidade, a concentração de genomas de vetores de AAV (vg) em frações de coluna pode ser medida por PCR quantitativa em tempo real (Q-PCR). As amostras são diluídas e digeridas com DNase I (ou outra nuclease adequada) para remover o DNA exógeno. Após a desativação da nuclease, as amostras são posteriormente diluídas e amplificadas utilizando iniciadores e uma sonda fluorogênica TaqMan™ específica para a sequência de DNA entre os iniciadores. O número de ciclos necessários para atingir um nível definido de fluorescência (ciclo limite, Ct) é medido para cada amostra em um Sistema de Detecção de Sequências Applied Biosystems Prism 7700. Um DNA plasmídico contendo sequências idênticas às contidas no vetor AAV é empregado para gerar uma curva-padrão na reação QPCR. Os valores do limiar do ciclo (Ct) obtidos das amostras são utilizados para determinar o título do genoma vetorial normalizando-o ao valor Ct da curva-padrão do plasmídeo. Ensaios de ponto final baseados na PCR digital também podem ser usados.

[144] Em um aspecto, utiliza-se um método de q-PCR otimizado que utiliza uma serina protease de amplo espectro, por exemplo, a proteinase K (tal como disponibilizado comercialmente pela Qiagen). Mais particularmente, o ensaio de título de genoma qPCR otimizado é semelhante a um ensaio-padrão, exceto pelo fato de que após a digestão com DNase I as amostras são diluídas com tampão de proteinase K e tratadas com proteinase K seguida de desativação térmica. As amostras adequadas são diluídas com tampão de proteinase K em uma quantidade igual

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81/144 ao tamanho da amostra. O tampão de proteinase K pode ser concentrado 2 vezes ou mais. Em geral, o tratamento com proteinase K é de cerca de 0,2 mg/mL, mas pode variar entre 0,1 mg/mL e cerca de 1 mg/mL. A etapa de tratamento geralmente é conduzida a cerca de 55°C durante cerca de 15 minutos, mas pode ser realizada a uma temperatura mais baixa (por exemplo, cerca de 37°C a cerca de 50°C) durante um período de tempo mais longo (por exemplo, cerca de 20 minutos a cerca de 30 minutos) ou a uma temperatura mais alta (por exemplo, até cerca de 60°C) por um período de tempo mais curto (por exemplo, por cerca de 5 a 10 minutos). De modo semelhante, a desativação se dá geralmente a cerca de 95°C durante cerca de 15 minutos, mas a temperatura pode ser diminuída (por exemplo, cerca de 70°C a cerca de 90°C) e o tempo prolongado (por exemplo, de cerca de 20 minutos a cerca de 30 minutos). As amostras são então diluídas (por exemplo, 1000 vezes) e submetidas a uma análise TaqMan, conforme descrito no ensaio padrão.

[145] Além disso, ou alternativamente, a PCR digital gota a gota (ddPCR) pode ser usada. Por exemplo, foram descritos métodos para determinar títulos de genoma de vetores de AAV auto-complementares e de fita simples por ddPCR. Veja, por exemplo, M. Lock et al, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods, abril de 2014;25(2):11525. doi: 10,1089/hgtb.2013,131. EPub 14 de fevereiro de 2014.

[146] Em resumo, o método para separar partículas de rAAVhu68 com sequências gênicas empacotadas de intermediários de AAVhu68 deficientes em genoma envolve submeter uma suspensão compreendendo partículas virais recombinantes de AAVhu68 e intermediários do capsídeo de AAVhu68 a uma cromatografia líquida de desempenho rápido, em que as partículas virais de AAVhu68 e intermediários de AAVhu68 são ligadas a uma resina de permuta aniônica forte equilibrada a um pH de 10,2 e submetidas a um gradiente salino enquanto se monitora o eluato quanto à absorvência ultravioleta a cerca de 260 e a cerca

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82/144 de 280. Embora menos ideal para o rAAV9hu68, o pH pode estar no intervalo de cerca de 10,0 a 10,4. Neste método, os capsídeos totais de AAVhu68 são coletados a partir de uma fração que é eluída quando a razão de A260/A280 atinge um ponto de inflexão. Em um exemplo, para a Etapa de Cromatografia de Afinidade, o produto diafiltrado pode ser aplicado a uma resina de afinidade Capture Select™ Poros- AAV2/9 (Life Technologies), que captura com eficácia o sorótipo AAV2/hu68. Sob essas condições iônicas, um percentual significativo de DNA e proteínas celulares residuais flui através da coluna, ao mesmo tempo em que as partículas de AAV são capturas com eficiência.

III. Composições e Utilizações [147] São fornecidas aqui composições contendo pelo menos um estoque de rAAV (por exemplo, um estoque de rAAVhu68 ou um estoque de rAAV mutante) e um veículo opcional, excipiente e/ou conservante. Um estoque de rAAV refere-se a uma pluralidade de vetores de rAAV que são os mesmos, por exemplo, como nas quantidades descritas abaixo na discussão de concentrações e unidades de dosagem.

[148] Como usado aqui, transportador inclui quaisquer solventes, mídia de dispersão, veículos, revestimentos, diluentes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores de absorção, tampões, soluções carreadoras, suspensões, coloides e similares. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecida na técnica. Ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições. A frase farmaceuticamente aceitável refere-se a entidades moleculares e composições que não produzem uma reação alérgica ou similar desagradável quando administrada a um hospedeiro. Os veículos de entrega, tais como lipossomas, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas lipídicas, vesículas e similares, podem ser utilizados para a introdução das composições da presente invenção em células hospedeiras adequadas.

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Em particular, o vetor rAAV entregou genomas vetoriais podem ser formulados para administração quer encapsulada em uma partícula lipídica, um lipossoma, uma vesícula, uma nanoesfera ou uma nanopartícula ou semelhante.

[149] Em uma modalidade, uma composição inclui uma formulação final adequada para entrega a um sujeito, por exemplo, é uma suspensão líquida aquosa tamponada a uma concentração de pH e sal fisiologicamente compatível. Opcionalmente, um ou mais tensoativos estão presentes na formulação. Em outra modalidade, a composição pode ser transportada como um concentrado que é diluído para administração a um sujeito. Em outras modalidades, a composição pode ser liofilizada e reconstituída no momento da administração.

[150] Um tensoativo adequado, ou uma combinação de tensoativos, pode ser selecionado dentre tensoativos não iônicos que não sejam tóxicos. Em uma modalidade, um tensoativo de copolímero em bloco difuncional que termina em grupos hidroxila primários é selecionado, por exemplo, como Pluronic® F68 [BASF], também conhecido como Poloxamer 188, que tem um pH neutro e um peso molecular médio de 8400. Outros tensoativos e outros poloxâmeros podem ser selecionados, quais sejam, copolímeros tribloco não iônicos compostos por uma cadeia hidrofóbica central de polioxipropileno (óxido de polipropileno) flanqueado por duas cadeias hidrofílicas de polioxietileno (poli(óxido de etileno)), SOLUTOL HS 15 (Macrogol-15 Hidroxiestearato), LABRASOL (glicero poli-caprilico), éter de polioxi-10 oleil, TWEEN (ésteres de ácido graxo e polioxietileno sorbitano), etanol e polietilenoglicol. Em uma modalidade, a formulação contém um poloxâmero. Esses copolímeros geralmente são nomeados com a letra P (de poloxâmero) seguidos de três dígitos: os dois primeiros dígitos x 100 dão a massa molecular aproximada do núcleo de polioxipropileno e o último dígito x 10 indica o percentual de polioxietileno. Em uma modalidade, o Poloxamer 188 é selecionado. O

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84/144 tensoativo pode estar presente em uma quantidade de cerca de 0,0005% até cerca de 0,001% da suspensão.

[151] Os vetores são administrados em quantidades suficientes para transfectar as células e fornecer níveis suficientes de transferência e expressão gênica para fornecer um benefício terapêutico sem efeitos adversos indevidos, ou com efeitos fisiológicos clinicamente aceitáveis, que podem ser determinados pelos versados na técnica médica. As vias de administração convencionais e farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitadas a entrega direta a um órgão desejado (por exemplo, fígado (opcionalmente através da artéria hepática), pulmão, coração, olho, rim), oral, inalação, intranasal, vias de administração parentais intratecal, intratraqueal, intra-arterial, intraocular, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica e outras vias parentais de administração. As vias de administração podem ser combinadas, se desejado.

[152] As dosagens do vetor viral dependerão principalmente de fatores como a condição a ser tratada, a idade, peso e saúde do paciente e, portanto, podem variar entre os pacientes. Por exemplo, uma dosagem humana terapeuticamente eficaz do vetor viral está geralmente na faixa de cerca de 25 a cerca de 1000 microlitros a cerca de 100 mL de solução contendo concentrações de cerca de 1 x 10⁹ a 1 x 10¹⁶ vetor de vírus genoma. A dosagem será ajustada para equilibrar o benefício terapêutico contra quaisquer efeitos colaterais e tais dosagens podem variar dependendo da aplicação terapêutica para a qual o vetor recombinante é empregado. Os níveis de expressão do produto transgene podem ser monitorados para determinar a frequência da dosagem resultando em vetores virais, preferencialmente vetores AAV contendo o minigene. Opcionalmente, regimes de dosagem similares aos descritos para fins terapêuticos podem ser utilizados para imunização utilizando as composições da invenção.

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85/144 [153] As composições de virus com defeito de replicação podem ser formuladas em unidades de dosagem para conter uma quantidade de vírus com defeito de replicação que está na faixa de cerca de 1,0 x 10⁹ GC a cerca de 1,0 x 10¹⁶ GC (para tratar um sujeito médio de 70 kg em peso corporal) incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro da faixa e, de preferência, 1,0 x 10¹² GC a 1,0 x 10¹⁴ GC para um paciente humano. Em uma modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x10⁹, 2x10⁹, 3x10⁹, 4x10⁹, 5x10⁹, 6x10⁹, 7x10⁹, 8x10⁹, ou 9x10⁹ GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro da faixa. Em outra modalidade, as composições são formuladas para conter a pelo menos 1 x10¹⁰, 2x1O¹⁰, 3x10¹°, 4x1O¹⁰, 5x1O¹⁰, 6x10¹°, 7x1O¹⁰, 8x10¹°, ou 9x10¹° GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro da faixa. Em outra modalidade, as composições sãp formuladas para conter pelo menos 1 x10¹¹, 2x10¹¹, 3x10¹¹, 4x10¹¹, 5x10¹¹, 6x10¹¹, 7x10¹¹, 8x10¹¹, ou 9x10¹¹ GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro da faixa. Em outra modalidade, as composições são formuladas para conter a pelo menos 1 x10¹², 2x10¹², 3x10¹², 4x10¹², 5x10¹², 6x10¹², 7x10¹², 8x10¹², ou 9x10¹² GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro da faixa. Em outra modalidade, as composições são formuladas para conter a pelo menos 1x10¹³, 2x10¹³, 3x10¹³, 4x10¹³, 5x10¹³, 6x10¹³, 7x10¹³, 8x10¹³, ou 9x10¹³ GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro da faixa. Em outra modalidade, as composições são formuladas para conter a pelo menos 1x10¹⁴, 2x10¹⁴, 3x10¹⁴, 4x10¹⁴, 5x10¹⁴, 6x10¹⁴, 7x10¹⁴, 8x10¹⁴, ou 9x10¹⁴ GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro da faixa. Em outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x10¹⁵, 2x10¹⁵, 3x10¹⁵, 4x10¹⁵, 5x10¹⁵, 6x10¹⁵, 7x10¹⁵, 8x10¹⁵, ou 9x10¹⁵ GC por dose, incluindo todos

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86/144 os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro da faixa. Em uma modalidade, para aplicação humana a dose pode variar de 1x10¹⁰ a cerca de 1x10¹² GC por dose incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionadas dentro da faixa.

[154] Estas doses acima podem ser administradas em uma variedade de volumes de formulação de veículo, excipiente ou tampão, variando de cerca de 25 a cerca de 1000 microlitros, ou volumes maiores, incluindo todos os números dentro do intervalo, dependendo do tamanho da área a ser tratada, o título viral usado, a via de administração e o efeito desejado do método. Em uma modalidade, o volume de veículo, excipiente ou tampão é pelo menos cerca de 25 pl_. Em uma modalidade, o volume é de cerca de 50 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 75 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 100 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 125 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 150 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 175 μΙ_. Ainda em outra modalidade, o volume é de cerca de 200 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 225 μΙ_. Ainda em outra modalidade, o volume é de cerca de 250 μΙ_. Ainda em outra modalidade, o volume é de cerca de 275 μΙ_. Ainda em outra modalidade, o volume é de cerca de 300 μΙ_. Ainda em outra modalidade, o volume é de cerca de 325 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 350 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 375 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 400 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 450 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 500 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 550 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 600 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 650 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de cerca de 700 μΙ_. Em outra modalidade, o volume é de entre cerca de 700 e 1000 μΙ_.

[155] Em certas modalidades, a dose pode estar na faixa de cerca

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87/144 de 1 x 10⁹ GC/g de massa cerebral a cerca de 1 x 10¹² GC/g de massa cerebral. Em certas modalidades, a dose pode estar na faixa de cerca de 3 x 10¹⁰ GC/g massa cerebral para cerca de 3 x 10¹¹ GC/g massa cerebral. Em certas modalidades, a dose pode estar na faixa de cerca de 5 x 10¹° GC/g de massa cerebral a cerca de 1,85 x 10¹¹ GC/g de massa cerebral.

[156] Em uma modalidade os construtos virais podem ser administrados em doses desde pelo menos cerca de 1x10⁹GCs a cerca de 1 x 10¹⁵, ou a cerca de 1 x 10¹¹ a 5 x 10¹³ GC. Os volumes adequados para administrar estas doses e concentrações podem ser determinados por alguém versado na técnica. Por exemplo, podem ser selecionados volumes de cerca de 1 pL a 150 mL, com os volumes mais altos sendo selecionados para os adultos. Em geral, para recém-nascidos, um volume adequado é de cerca de 0,5 mL a cerca de 10 mL, para crianças mais velhas, de cerca de 0,5 mL a cerca de 15 mL podem ser selecionados. Para crianças pequenas, um volume de cerca de 0,5 mL a cerca de 20 mL pode ser selecionado. Para crianças, volumes de até 30 mL podem ser selecionados. Para pré-adolescentes e adolescentes, volumes até cerca de 50 mL podem ser selecionados. Em outras modalidades, ainda, um paciente pode receber uma administração intratecal em um volume de cerca de 5 mL a cerca de 15 mL selecionados ou cerca de 7,5 mL a cerca de 10 mL. Outros volumes e doses adequados podem ser determinados. A dosagem será ajustada para equilibrar o benefício terapêutico contra quaisquer efeitos colaterais e tais dosagens podem variar dependendo da aplicação terapêutica para a qual o vetor recombinante é empregado.

[157] Os vetores recombinantes descritos acima podem ser entregues às células hospedeiras de acordo com os métodos publicados. O rAAV, de preferência suspenso em um veículo fisiologicamente compatível, pode ser administrado a um paciente mamífero humano ou não

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88/144 humano. Em certas modalidades, para administração a um paciente humano, o rAAV é adequadamente suspenso em uma solução aquosa contendo solução salina, um tensoativo e um sal ou mistura de sais fisiologicamente compatível. Adequadamente, a formulação é ajustada a um pH fisiologicamente aceitável, por exemplo, no intervalo de pH de 6 a 9 ou pH de 6,5 a 7,5, pH de 7,0 a 7,7 ou pH de 7,2 a 7,8. Na medida em que o pH do fluido cérebro-espinhal é de cerca de 7,28 a cerca de 7,32, para administração intratecal, pode ser desejável um pH dentro deste intervalo; enquanto que para administração intravenosa, um pH de cerca de 6,8 a cerca de 7,2 pode ser desejável. No entanto, outros pHs dentro dos intervalos mais amplos e esses subintervalos podem ser selecionados para outra via de administração.

[158] Em outra modalidade, a composição inclui um veículo, diluente, excipiente e/ou adjuvante. Os transportadores adequados podem ser facilmente selecionados por um versado na técnica em vista da indicação para a qual o vírus de transferência é direcionado. Por exemplo, um veículo adequado inclui solução salina, que pode ser formulada com uma variedade de soluções tampão (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato). Outros veículos exemplificativos incluem solução salina estéril, lactose, sacarose, fosfato de cálcio, gelatina, dextrano, ágar, pectina, óleo de amendoim, óleo de gergelim e água. O tampão/veículo deve incluir um componente que impede que o rAAV cole na tubagem de infusão, mas não interfira com a atividade de ligação In vivo ao rAAV. Um tensoativo adequado, ou uma combinação de tensoativos, pode ser selecionado dentre tensoativos não iônicos que não sejam tóxicos. Em uma modalidade, um tensoativo de copolímero em bloco difuncional que termina em grupos hidroxil primários é selecionado, por exemplo, como Pluronic® F68 [BASF], também conhecido como Poloxamer 188, que tem um pH neutro e um peso molecular médio de 8400. Outros tensoativos e outros poloxâmeros podem ser selecionados, quais sejam, copolímeros

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89/144 tribloco não iônicos compostos por uma cadeia hidrofóbica central de polioxipropileno (óxido de polipropileno) flanqueado por duas cadeias hidrofílicas de polioxietileno (poli(óxido de etileno)), SOLUTOL HS 15 (Macrogol-15 Hidroxiestearato), LABRASOL (glicero policaprílico), éter de polioxi-oleil, TWEEN (ésteres de ácido graxo e polioxietileno sorbitano), etanol e polietilenoglicol. Em uma modalidade, a formulação contém um poloxâmero. Esses copolímeros geralmente são nomeados com a letra P (de poloxâmero) seguidos de três dígitos: os dois primeiros dígitos x 100 dão a massa molecular aproximada do núcleo de polioxipropileno e o último dígito x 10 indica o percentual de polioxietileno. Em uma modalidade, o Poloxamer 188 é selecionado. O tensoativo pode estar presente em uma quantidade de cerca de 0,0005% até cerca de 0,001% da suspensão. Em um exemplo, a formulação pode conter, por exemplo, uma solução salina tamponada contendo um ou mais dentre: cloreto de sódio, bicarbonate de sódio, dextrose, sulfato de magnésio (por exemplo, sulfato de magnésio VELO), cloreto de potássio, cloreto de cálcio (por exemplo, cloreto de cálcio ·2Η2θ), fosfato de sódio dibásico, e suas misturas, em água. Adequadamente, para a administração intratecal, a osmolaridade está dentro de um intervalo compatível com o líquido cefalorraquidiano (por exemplo, de cerca de 275 a cerca de 290); ver, por exemplo, emedicine.medscape.com/article/2093316-overview. Opcionalmente, para a administração intratecal, pode ser utilizado um diluente comercialmente disponível como agente de suspensão ou em combinação com outro agente de suspensão e outros excipientes opcionais. Ver, por exemplo, a solução Elliotts B® [Lukare Medicai]. Em outras modalidades, a formulação pode conter um ou mais potenciadores de permeação. Exemplos de intensificadores de permeação adequados podem incluir, por exemplo, manitol, glicolato de sódio, taurocolato de sódio, desoxicolato de sódio, salicilato de sódio, caprilato de sódio, caprato de sódio, lauril sulfato de sódio, éter de polioxietileno-9-laurel ou EDTA.

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90/144 [159] Opcionalmente, as composições da invenção podem conter, além do rAAV e veículo(s), outros ingredientes farmacêuticos convencionais, tais como conservantes ou estabilizadores químicos. Preservantes exemplares adequados incluem clorobutanol, sorbato de potássio, ácido sórbico, dióxido de enxofre, gaiato de propil, parabenos, etil vanilina, glicerina, fenol e paraclorofenol. Estabilizadores químicos adequados incluem gelatina e albumina.

[160] As composições de acordo com a presente invenção podem compreender um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como definido acima. Adequadamente, as composições descritas neste documento compreendem uma quantidade eficaz de um ou mais AAV suspensos em um veículo farmaceuticamente adequado e/ou misturado com excipientes adequados projetados para distribuição ao sujeito por injeção, bomba osmótica, cateter intratecal, ou para entrega por outro dispositivo ou via. Em um exemplo, a composição é formulada para entrega intratecal.

[161] Conforme usados neste documento, o termo administração intratecal refere-se a uma via de administração de drogas através de uma injeção no canal espinhal, mais especificamente no espaço subaracnoide, para que elas alcancem o fluido cerebroespinhal (CSF). A administração intratecal pode incluir punção lombar, intraventricular (incluindo intracerebroventricular (ICV)), suboccipital/intracisternal e/ou C1-2. Por exemplo, o material pode ser introduzido para difusão ao longo do espaço subaracnoide por meio de punção lombar. Em outro exemplo, a injeção pode ser na cisterna magna.

[162] Como usado aqui, o termo administração intracisternal refere-se a uma via de administração de drogas diretamente no líquido cefalorraquidiano da cisterna magna cerebelomedular, mais especificamente através de uma punção suboccipital ou por injeção direta na cisterna magna ou por tubo posicionado permanentemente.

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IV. Aparelho e Método de Administração de uma Composição Farmacêutica no Fluido Cerebrospinhal [163] Em um aspecto, os vetores fornecidos neste documento podem ser administrados por via intratecal através do método e/ou do dispositivo proporcionado nesta seção e descritos adicionalmente na FIGURA 7. Em alternativa, outros dispositivos e métodos podem ser selecionados. O método compreende as etapas de avanço de uma agulha espinhal na cisterna magna de um paciente, ligação de um comprimento de tubulação flexível em um cubo próximo da agulha espinhal e uma portal de saída de uma válvula para uma extremidade próxima da tubulação flexível, e após as referidas etapas de avanço e ligação e após permitir à tubulação se autoativar com o fluido cerebroespinhal do paciente, ligar um primeiro recipiente contendo uma quantidade de solução isotônica a uma porta de entrada de descarga da válvula e, a partir disso, ligar um segundo recipiente contendo uma quantidade de uma composição farmacêutica a uma porta de entrada de vetor da válvula. Depois de ligar os primeiro e segundo recipientes à válvula, abre-se um caminho para o fluxo de fluido entre a porta de entrada do vetor e a porta de saída da válvula, e a composição farmacêutica é injetada no paciente através da agulha espinhal, e, após a injeção da composição farmacêutica, abre-se um caminho para o fluxo de fluido pela porta de entrava de descarga e a porta de saída da válvula, e a solução isotônica é injetada na agulha espinhal para descarga da composição farmacêutica no paciente.

[164] Em outro aspecto, é proporcionado um dispositivo para administração intracisternal de uma composição farmacêutica. O dispositivo inclui um primeiro recipiente contendo uma quantidade de uma composição farmacêutica, um segundo recipiente contendo uma solução isotônica e uma agulha espinhal através da qual a composição farmacêutica pode ser ejetada diretamente do dispositivo para o fluido cerebroespinhal, dentro da cisterna magna de um paciente. O dispositivo

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92/144 inclui ainda uma válvula que tem uma primeira porta de entrada interligada ao primeiro vaso, uma segunda porta de entrada interligada ao segundo vaso, uma porta de saída interligada à agulha espinhal e um fecho luer para controlar o fluxo da composição farmacêutica e da solução isotônica através da agulha espinhal.

[165] Conforme usado aqui, Tomografia Computadorizada (CT) refere-se a uma radiografia em que uma imagem tridimensional de uma estrutura corporal é construída por computador a partir de uma série de imagens transversais planas feitas ao longo de um eixo.

[166] O aparelho ou dispositivo médico 10, como mostrado na FIGURA 7, inclui um ou mais vasos, 12 e 14, interligados através de uma válvula 16. Os vasos 12 e 14 proporcionam uma nova fonte de uma composição farmacêutica, droga, vetor ou substância semelhante e uma nova fonte de uma solução isotônica, tal como solução salina, respectivamente. Os vasos 12 e 14 podem ser qualquer forma de dispositivo médico que permita a injeção de fluidos em um paciente.

[167] A título de exemplo, cada recipiente, 12 e 14, pode ser fornecido na forma de uma seringa, cânula ou semelhante. Por exemplo, na modalidade ilustrada, o recipiente 12 é fornecido como uma seringa separada, contendo uma quantidade de uma composição farmacêutica e é referido neste documento como uma seringa de vetor. Apenas para fins de exemplo, o recipiente 12 pode conter cerca de 10 cc de uma composição farmacêutica ou semelhante.

[168] Do mesmo modo, o recipiente 14 pode ser proporcionado na forma de uma seringa, célula ou semelhante separada que contém uma quantidade de solução salina e pode ser referida como uma seringa de descarga. Apenas para fins de exemplo, o recipiente 14 pode conter cerca de 10 cc de uma solução salina.

[169] Como alternativa, os vasos 12 e 14 podem ser fornecidos em formas diferentes de seringas e podem ser integrados em um único dispositivo,

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93/144 tal como um dispositivo de injeção médica integrado que tem um par de câmaras separadas, uma para a composição farmacêutica e outra para solução salina. Além disso, o tamanho das câmaras ou dos vasos pode ser proporcionado conforme necessário para conter uma quantidade desejada de fluido.

[170] Na modalidade ilustrada, a válvula 16 é fornecida na forma de uma torneira de 4 vias com uma seringa luer-lock macho giratória 18. A válvula 16 interliga os vasos 12 e 14 (isto é, a seringa de vetor e a seringa de descarga na modalidade ilustrada), e a luer-lock macho giratória abre um caminho pela válvula 16, a ser aberto e fechado para cada um dos vasos 12 e 14. Deste modo, o caminho pela válvula 16 pode ser fechado tanto para a seringa de vetor quanto para a seringa de descarga ou pode ser aberto para uma seringa de vetor ou para uma seringa de descarga selecionada. Como alternativa a uma torneira de 4 vias, a válvula pode ser uma torneira de 3 vias ou um dispositivo de controle de fluido.

[171] Na modalidade ilustrada, a válvula 16 está ligada a uma extremidade de um comprimento de uma tubagem de extensão 20 ou a um duto semelhante para fluidos. A tubagem 20 pode ser selecionada com base em um comprimento desejado ou em um volume interno. Apenas a título de exemplo, a tubagem pode ter cerca de 6 a 7 polegadas de comprimento.

[172] Na modalidade ilustrada, uma extremidade oposta 22 da tubagem 12 é conectada a um conjunto de extensão de conector em T 24, que, por sua vez, é conectada a uma agulha espinhal 26. A título de exemplo, a agulha 26 pode ser uma agulha espinhal de cinco polegadas de calibre 22 ou 25. Além disso, como opção, a agulha espinhal 26 pode ser ligada a uma agulha introdutora 28, tal como uma agulha introdutora de calibre 18 de três polegadas e meia.

[173] Em uso, a agulha espinhal 26 e/ou a agulha introdutora opcional

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94/144 pode ser avançada no paciente até a cisterna magna. Após o avanço da agulha, podem ser obtidas imagens da Tomografia Computadorizada (CT) que permitem a visualização da agulha 26 e/ou 28 e dos tecidos moles relevantes (por exemplo, músculos paravertebrais, ossos, tronco cerebral e medula espinhal). A colocação correta da agulha será confirmada pela observação do fluido cerebroespinhal (CSF) no centro da agulha e pela visualização da ponta da agulha dentro da cisterna magna. Depois disso, a tubagem de extensão relativamente curta 20 pode ser ligada à agulha espinhal inserida 26 e a torneira de 4 vias 16 pode então ser ligada à extremidade oposta da tubagem 20.

[174] Deixa-se a montagem acima se tornar auto-ativada com o CSF do paciente. Posteriormente, a seringa de descarga da solução salina normal preenchida 14 é ligada a uma porta de entrada de descarga da torneira de 4 vias 16 e depois a seringa de vetor 12 contendo uma composição farmacêutica é ligada a uma porta de entrada de vetor da torneira de 4 vias 16. Posteriormente, a porta de saída da torneira 16 é aberta para a seringa de vetor 12 e o conteúdo da seringa de vetor pode ser lentamente injetado através da válvula 16 e do aparelho montado e para o paciente ao longo de um período de tempo. Apenas para fins de exemplo, esse período de tempo pode ser de cerca de 1 -2 minutos e/ou qualquer outro período de tempo desejado.

[175] Depois de o conteúdo da seringa de vetor 12 ser injetado, a fechadura giratória 18 na torneira 16 é girada para uma segunda posição de modo que a torneira 16 e o conjunto de agulha possam ser lavados com uma quantidade desejada de solução salina normal utilizando a seringa de lavagem preenchida 14. Apenas a título de exemplo, 1 a 2 cc de solução salina normal podem ser usados, embora quantidades maiores ou menores possam ser usadas conforme a necessidade. A solução salina normal assegura que toda a ou a maior parte da composição farmacêutica seja forçada a ser injetada através do dispositivo

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95/144 montado e no paciente, e de modo que pouco ou nada da composição farmacêutica permaneça no dispositivo montado.

[176] Depois que o dispositivo montado tiver sido lavado com a solução salina, o dispositivo montado em sua totalidade, incluindo a(s) agulha(s), a tubagem de extensão, a torneira e as seringas são removidos lentamente do indivíduo e colocadas em uma bandeja cirúrgica para descartar em um recipiente de resíduos de risco biológico ou um contêiner rígido (para a(s) agulha(s)).

[177] Um processo de triagem pode ser realizado por um investigador principal, o que pode levar a um procedimento intracisternal (IC). O investigador principal pode descrever o processo, o procedimento, o procedimento de administração em si e todos os possíveis riscos de segurança para que o indivíduo (ou responsável designado) seja totalmente informado. O histórico médico, as medicações concomitantes, o exame físico, os sinais vitais, o eletrocardiograma (ECG) e os resultados de exames laboratoriais são obtidos ou realizados e fornecidos a um neurorradiologista, neurocirurgião e anestesista para uso na avaliação de triagem da elegibilidade do paciente para o procedimento IC.

[178] A fim de permitir tempo adequado para analisar a elegibilidade, os seguintes procedimentos devem ser realizados a qualquer momento entre a primeira visita de triagem e até uma semana antes da visita do estudo. Por exemplo, no Dia 0, podem ser obtidas as Imagens de Ressonância Magnética (MRI) de cabeça/pescoço com e sem gadolínio (ou seja, eGFR> 30 mL/min/1,73 m2). Além da ressonância magnética de cabeça/pescoço, o investigador determinará a necessidade de avaliações adicionais do pescoço através de estudos de flexão/extensão. O protocolo de ressonância magnética incluirá imagens dos protocolos T1, T2, DTI, FLAIR e CINE.

[179] Ademais, o MRA/MRV de cabeça/pescoço, de acordo com o protocolo institucional (isto é, indivíduos com um histórico de operações

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96/144 intra/transdurais podem ser excluídos ou precisar de outros testes (por exemplo, cisternografia de radionucleotídeos)) que permitam uma avaliação adequada do fluxo de CSF e a identificação de possíveis bloqueios ou falta de comunicação entre os espaços de CSF.

[180] O neurorradiologista, o neurocirurgião e o anestesiologista discutem e determinam a elegibilidade de cada indivíduo para os procedimentos IC com base em todas as informações disponíveis (exames, histórico médico, exames físicos e laboratoriais, etc.). Uma avaliação pré-operatória de anestesia também pode ser obtida do Dia -28 ao Dia 1, o que possibilita uma avaliação detalhada das vias aéreas, pescoço (encurtado/engrossado) e da amplitude de movimento da cabeça (grau de flexão do pescoço), mantendo em mente as necessidades fisiológicas especiais de um sujeito com MPS.

[181 ] Antes de um procedimento de IC, o CT Suite confirmará que os seguintes equipamentos e medicamentos estão presentes: Kit de punção lombar (LP) para adultos (fornecido por instituição); BD (Becton Dickinson) 22 ou 25 gauge x 3 - 7” agulha espinhal (Quincke bisel); Agulha introdutora coaxial, usada a critério do intervencionista (para introdução de agulha espinhal); torneira de 4 furos pequeno com trava luer macho giratório (Spin); Conjunto de extensão do conector em T (tubulação) com adaptador de trava luer fêmea, comprimento aproximado de 6,7 polegadas; Omnipaque 180 (iohexol), para administração intratecal; Contraste iodado para administração intravenosa (IV); Solução injetável de lidocaína a 1% (se não for fornecida em kit de LP adulto); Seringa pré-preenchida de 10 cc salina normal (estéril); Marcador (s) radiopaco (s); Equipamento de preparação cirúrgica/lâmina de barbear; Almofadas/suportes para permitir o posicionamento adequado do sujeito intubado; Equipamento de intubação endotraqueal, máquina de anestesia geral e ventilador mecânico; Equipamento de monitorização neurofisiológica intraoperatória (IONM) (e pessoal necessário); e vetor contendo

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97/144 seringa 10cc; preparado e transportado para a sala CT/sala de cirurgia (OR) de acordo com o Manual de Farmácia separado.

[182] O consentimento informado para o procedimento será confirmado e documentado no prontuário e/ou arquivo de estudo. O consentimento separado para o procedimento da equipe de radiologia e anestesiologia será obtido conforme os requisitos institucionais. O indivíduo tem um acesso intravenoso colocado dentro da unidade hospitalar apropriada de acordo com as diretrizes institucionais (por exemplo, dois locais de acesso IV). Os fluidos intravenosos serão administrados a critério do anestesiologista. A critério do anestesiologista e de acordo com as diretrizes institucionais, o indivíduo pode ser induzido e submetido à intubação endotraqueal com a administração de anestesia geral em uma unidade de cuidado adequada ao paciente, área de espera ou procedimento cirúrgico/tomografia computadorizada.

[183] Uma punção lombar é realizada, primeiramente para remover 5 cc de líquido cefalorraquidiano (CSF) e, posteriormente, para injetar contraste (Omnipaque 180) por via intratecal, para auxiliar a visualização da cisterna magna. Podem ser realizadas manobras adequadas de colocação no indivíduo a fim de facilitar a difusão do contraste na cisterna magna.

[184] O equipamento de monitoramento neurofisiológico intraoperatório (IONM) está ligado ao indivíduo. O indivíduo é colocado na mesa do scanner de CT na posição decúbito lateral ou de bruços. Uma equipe adequada deve estar presente para garantir a segurança do indivíduo durante o transporte e a colocação. Se considerado apropriado, o sujeito pode ser posicionado de uma maneira que forneça a flexão do pescoço para o grau determinado como seguro durante a avaliação pré-operatória e com os sinais do monitor neurofisiológico normal documentados após o posicionamento.

[185] A equipe a seguir pode ser confirmada como presente e identificada no local: o intervencionista/neurocirurgiãoque realizam o procedimento;

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98/144 o anestesiologista e a(s) técnica(s) respiratória(s); as enfermeiras e os assistentes médicos; os técnicos de CT (ou OR); os técnicos de neuropsicologia; e o coordenador local. Um intervalo pode ser completado pelo protocolo do hospital/de uma comissão conjunta a fim de verificar o indivíduo, o procedimento, o local, o posicionamento e a presença corretos de todos os equipamentos necessários na sala. O investigador local principal pode então confirmar com a equipe se ele/ela pode continuar com a preparação do indivíduo.

[186] A pele do indivíduo sob a base craniana é raspada, conforme necessário. As imagens da tomografia computadorizada são realizadas, seguidas por tomografia computadorizada de planejamento pré-procedimento com contraste IV, se considerado necessário pelo intervencionista para localizar o local alvo e para visualizar a vascularização. Uma vez que o local do alvo (cisterna magna) é identificado e a trajetória da agulha é planejada, a pele é preparada e coberta usando uma técnica estéril de acordo com as diretrizes institucionais. Um marcador radiopaco é colocado na localização da pele desejada, conforme indicado pelo intervencionista. A pele sob o marcador é anestesiada através de infiltração com lidocaína a 1%. Uma agulha espinhal de 22G ou 25G é avançada na direção da cisterna magna, com a opção de usar uma agulha introdutora coaxial.

[187] Após o avanço da agulha, as imagens de tumografia computacional são obtidas usando a espessura de corte CT mais fina possível, usando equipamento institucional (idealmente < 2,5 mm). Imagens de tomografia computacional em série usando a dose de radiação mais baixa possível, que permita a visualização adequada da agulha e dos tecidos moles relevantes (por exemplo, dos músculos paraespinhais, ósseos, do tronco cerebral e da medula espinhal) são obtidos. A colocação correta da agulha é confirmada pela observação do CSF no centro da agulha e visualização da ponta da agulha dentro da cisterna

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99/144 magna.

[188] O intervencionista confirma que a seringa de vetor está posicionada próxima, mas fora do campo estéril. Antes de manusear ou administrar a composição farmacêutica na seringa do vetor, luvas, uma máscara e uma proteção para os olhos são colocadas pela equipe que auxilia o procedimento dentro do campo estéril.

[189] A tubulação de extensão é anexada à agulha espinhal inserida, que é então anexada à torneira do tipo stopcock de 4 vias. Uma vez que este aparelho esteja autoativado com o CSF do indivíduo, a seringa de descarga com solução salina normal preenchida de 10cc é fixada à porta de abertura de descarga da torneira do tipo stopcock de 4 vias. A seringa do vetor é então fornecida ao intervencionista e fixada a uma porta de entrada do vetor na torneira do tipo stopcock de 4 vias.

[190] Após a porta de saída da torneira do tipo stopcock ser aberta para a seringa de vetor, colocando o fecho giratório da torneira do tipo stopcock em uma primeira posição, os conteúdos da seringa do vetor são injetados lentamente (em aproximadamente 1-2 minutos), com o cuidado de não aplicar um excesso de força no êmbolo da seringa durante a injeção. Depois de o conteúdo da seringa do vetor ser injetado, o fecho com cabeça injetora da torneira do tipo stopcock é girada até uma segunda posição para que a torneira do tipo stopcock e o conjunto de agulhas possam ser descarregados com 1-2cc de solução salina usando a seringa de descarga preenchida fixada.

[191] Quando estiver pronto, o interventor alertará os funcionários de que ele ou ela removerá o aparelho do indivíduo. Em um único movimento, a agulha, a tubagem de extensão, a torneira do tipo stopstock e as seringas serão removidos lentamente do paciente e colocados em uma bandeja cirúrgica para serem descartados em um receptáculo de resíduos com risco biológico ou recipiente rígido (para a agulha).

[192] O local de inserção da agulha será examinado quanto a sinais

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100/144 de sangramento ou vazamento de CSF e tratado conforme indicado pelo investigador. O local é envolvido com gaze, fita cirúrgica e/ou curativo de Tegaderm, conforme indicado. O indivíduo é então removido do scanner da tumografia computadorizada e colocado sobre uma maca. Uma equipe adequada deve estar presente para garantir a segurança do indivíduo durante o transporte e a colocação.

[193] A anestesia é descontinuada e os indivíduos serão cuidados seguindo as diretrizes institucionais para os cuidados pós-anestésicos. Os monitores neurofisiológicos são removidos do indivíduo. A cabeça da maca sobre a qual o indivíduo se encontra deve ser ligeiramente levantada (~ 30 graus) durante a recuperação. O indivíduo é transportado para uma unidade de cuidados pós-anestésicos adequada, de acordo com as diretrizes institucionais. Depois que o indivíduo tiver recuperado a consciência adequadamente e estiver em condição estável, ele ou ela será admitido no andar/na unidade apropriados para as avaliações obrigatórias do protocolo. As avaliações neurológicas serão seguidas de acordo com o protocolo e o Investigador Principal supervisionará os cuidados do paciente em colaboração com a equipe do hospital e da pesquisa.

[194] Em uma modalidade, um método de administração de uma composição fornecida neste documento compreende as etapas de: avançar uma agulha espinhal na cisterna magna de um paciente; conectar um comprimento de tubagem flexível a um centro próximo da agulha espinhal e uma porta de saída de uma válvula para a extremidade próxima da tubagem flexível; depois do referido avanço e das etapas de conexão e depois de permitir que a tubagem seja auto-ativada com o fluido cerebroespinhal do paciente, conectar um primeiro vaso contendo uma quantidade de solução isotônica a uma porta de entrada de descarga da válvula e, em seguida, conectar um segundo vaso contendo uma quantidade de uma composição farmacêutica a uma porta

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101/144 de entrada do vetor da válvula; depois de conectar o primeiro e o segundo vaso à válvula, abrir o caminho para que o fluido flua entre a porta de entrada do vetor e a porta de saída da válvula e injetar a composição farmacêutica no paciente pela agulha espinhal; e, depois de injetar a composição farmacêutica, abrir um caminho para o fluido fluir pela porta de entrada de descarga e a porta de saída da válvula e injetar a solução isotônica na agulha espinhal para descarregar a composição farmacêutica no paciente. Em certas modalidades, o método também compreende conformar a colocação apropriada de uma ponta distai da agulha espinhal na cisterna magna antes de ligar a tubagem e a válvula ao centro da agulha espinhal. Em certas modalidades, a etapa de confirmação inclui visualizar a ponta distai da agulha espinhal na cisterna magna com imagens de tumografia computadorizada (CT). Em certas modalidades, a etapa de confirmação inclui observar a presença do fluido cefalorraquidiano do paciente no centro da agulha espinhal.

[195] No método descrito anteriormente, a válvula pode ser uma torneira do tipo stopcock com um fecho luer giratório adaptada para girar a uma primeira posição, permitindo o fluxo da porta de entrada do vetor para a porta de saída, ao mesmo tempo em que bloqueia o fluxo pela porta de entrada de descarga e para uma segunda posição, o que permite o fluxo da porta de entrada de descarga para a porta de saída, ao mesmo tempo em que bloqueia o fluxo pela porta de entrada do vetor e em que o fecho luer giratório é posicionado na referida primeira posição na referida segunda posição quando a referida composição farmacêutica estiver sendo descarregada no referido paciente pela solução isotônica. Em certas modalidades, depois de injetar a solução isotônica na agulha espinhal para descarregar a composição farmacêutica no paciente, a agulha espinhal é removida do paciente com a tubagem, a válvula e o primeiro e segundo vasos ligados a eles na forma de um conjunto. Em certas modalidades, a válvula é uma torneira do tipo stopcock

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102/144 de 4 vias com um fecho luer macho giratório. Em certas modalidades, ο primeiro e segundo vasos são seringas separadas. Em certas modalidades, um conector em T está situado no centro da agulha espinhal e interliga a tubagem à agulha espinhal. Opcionalmente, a agulha espinhal inclui uma agulha introdutora na extremidade distai da agulha espinhal. A agulha raquidiana pode ser uma agulha raquidiana de cinco polegadas de agulha espinhal de calibre 22 ou 24. Em certas modalidades, a agulha introdutora é uma agulha introdutora de 3,5 polegadas de calibre 18.

[196] Em certos aspectos, o método utiliza um dispositivo que é composto, no mínimo, por um primeiro recipiente para conter uma quantidade de uma composição farmacêutica; um segundo recipiente para conter uma solução isotônica; uma agulha raquidiana através da qual a composição farmacêutica pode ser ejetada diretamente do dispositivo para o fluido cefaloraquidiano dentro da cisterna magna de um paciente; e uma válvula que tem uma primeira porta de entrada interligada ao primeiro recipiente, uma segunda porta de entrada interligada ao segundo recipiente, uma porta de saída interligada à agulha raquidiana e um fecho luer para controlar o fluxo da composição farmacêutica e a solução isotônica através da agulha raquidiana. Em certas modalidades, a válvula é uma torneira do tipo stopcock com um fecho luer giratório adaptado para girar até uma primeira posição, permitindo o fluxo da primeira porta de entrada até a porta de saída, ao mesmo tempo em que bloqueia o fluxo pela segunda porta de entrada e até uma segunda posição, permitindo o fluxo da segunda porta de entrada até a porta de saída, ao mesmo tempo em que bloqueia o fluxo pela primeira porta de entrada. Opcionalmente, a válvula é uma torneira de 4 vias com um fecho luer macho giratório. Em certas modalidades, o primeiro e segundo recipientes são seringas separadas. Em certas modalidades, a agulha raquidiana é interligada à válvula através de um comprimento de tubagem flexível. Um conector em T pode

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103/144 interligar a tubulação à agulha raquidiana. Em certas modalidades, a agulha raquidiana é uma agulha raquidiana de cinco polegadas de calibre 22 ou 24. Em certas modalidades, o dispositivo compreende ainda uma agulha introdutora ligada a uma extremidade distai da agulha raquidiana. Opcionalmente, a agulha introdutora é uma agulha introdutora de 3,5 polegadas de calibre 18.

[197] Este método e dispositivo podem cada um ser usados para administração ds composições aqui descritas. Alternativamente, outros métodos e dispositivos podem ser usados para tal administração intratecal.

[198] Em certas modalidades, é fornecida uma composição que compreende o anticorpo rAAVhu68.anti-HER2, de modo que os vetores AAV carregam os cassetes de expressão de ácido nucleico que codificam os construtos de imunoglobulina e as sequências reguladoras que direcionam a expressão da imunoglobulina na célula selecionada. Após a administração dos vetores no CNS, os vetores entregam os cassetes de expressão ao CNS e expressam os construtos de imunoglobulina proteica in vivo. O uso das composições aqui descritas em um método antineoplásico é descrito, assim como o uso dessas composições em regimes antineoplásicos, que podem opcionalmente envolver a entrega de um ou mais outros agentes antineoplásicos ou outros ativos.

[199] Uma composição pode conter um único tipo de vetor AAVhu68, como aqui descrito, que contém o cassete de expressão para a entrega in vivodo construto de imunoglobulina antineoplásica. Alternativamente, uma composição pode conter dois ou mais vetores AAV diferentes, cada um dos quais empacotou nela cassetes de expressão diferentes. Por exemplo, os dois ou mais AAV diferentes podem ter cassetes de expressão diferentes que expressam polipeptídeos de imunoglobulina que se montam in vivo para formar um único construto de imunoglobulina funcional. Em outro exemplo, os dois ou mais AAV podem ter

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104/144 cassetes de expressão diferentes que expressam polipeptídeos de imunoglobulina para alvos diferentes, por exemplo, dois fornecem dois construtos funcionais de imunoglobulina (por exemplo, um construto de imunoglobulina anti-Her2 e um segundo construto de imunoglobulina antineoplásica). Ainda em outra alternativa, os dois ou mais AAV diferentes podem expressar construtos de imunoglobulina direcionadas para o mesmo alvo, em que um dos construtos de imunoglobulina foi modificado para eliminar a ligação ao FcRn e um segundo construto de imunoglobulina que mantém sua capacidade ou possui capacidade aprimorada de se ligar a FcRn. Essa composição pode ser útil para fornecer simultaneamente anticorpos com maior retenção na área do cérebro e anticorpos para entrega sistêmica do construto de imunoglobulina.

[200] Opcionalmente, um ou ambos os construtos de imunoglobulina aqui descritas aumentaram a atividade do ADCC. Um regime como aqui descrito pode compreender, além de uma ou mais das combinações aqui descritas, combinação adicional com um ou mais fármacos biológicos antineoplásicos, fármaco antinoplásico de pequenas moléculas, agente quimioterapêutico, melhoradores imunológicos, radiação, cirurgia e similares. Um fármaco biológico como aqui descrito, é baseado em um peptídeo, polipeptídeo, proteína, enzima, molécula de ácido nucleico, vetor (incluindo vetores virais) ou similares.

[201] Adequadamente, as composições descritas neste documento compreendem uma quantidade eficaz antineoplásico de um ou mais AAVhu68 suspensos em um veículo farmaceuticamente adequado projetado para distribuição ao sujeito por injeção, bomba osmótica, cateter intratecal, ou para entrega por outro dispositivo ou via. Em um exemplo, a composição é formulada para entrega intratecal. Como aqui utilizado, a entrega intratecal abrange uma injeção no canal espinhal, mais especificamente no espaço subaracnoideo. No entanto, outras vias de entrega podem ser selecionadas e os veículos farmaceuticamente

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105/144 aceitáveis para as composições de AAV, incluindo, por exemplo, entrega de fluido intracraniano, intranasal, intracisternal, intracerebrospinal, entre outras rotas diretas ou sistêmicas adequadas, isto é, o reservatório Ommaya.

[202] As composições podem ser formuladas em unidades de dosagem para conter uma quantidade de AAV que está na faixa de cerca de 1 χ 10⁹ cópias do genoma (GC) a cerca de 5 χ 10¹³ GC (para tratar um sujeito médio de 70 kg em peso corporal). Em uma modalidade, é realizada uma punção lombar na qual são removidos de cerca de 15 ml_ (ou menos) a cerca de 40 ml_ de CSF e no qual o vetor é misturado ao CSF e/ou suspenso em um transportador compatível e entregue ao sujeito. Em um exemplo, a concentração do vetor é de cerca de 3 x 10 ¹³ GC, mas outras quantidades, como cerca de 1 χ 10⁹ GC, cerca de 5X 10⁹ GC, cerca de 1 X 10¹° GC, cerca de 5 X 10¹° GC, cerca de 1 X 10¹¹ GC, cerca de 5 X 10¹¹ GC, cerca de 1 X 10¹² GC, cerca de 5 X 10¹² GC, ou cerca de 1,0 x 10¹³ GC.

[203] Em uma modalidade, as composições aqui descritas são usadas em um método para retardar o crescimento de um tumor. Ainda em outra modalidade, as composições aqui descritas são úteis para diminuir o tamanho do tumor em um sujeito. Em uma modalidade adicional, as composições aqui descritas são úteis na redução do número de células cancerígenas em um câncer de tumor não sólido. Em outra modalidade, uma composição como aqui fornecida é usada em um método para aumentar a sobrevida global e/ou sobrevida livre de progressão em um paciente. Os construtos de imunoglobulina antineoplásica são selecionadas com vista ao neoplasma a ser tratado. Por exemplo, para o tratamento de um câncer de mama metastático no cérebro, pode-se projetar um cassete de expressão para um anticorpo anti-HER em um AAV recombinante, como descrito aqui. Opcionalmente, as composições de AAV como aqui descritas são administradas na ausência de um agente

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106/144 farmacológico ou químico extrínseco adicional, ou outra ruptura física da barreira hematoencefálica. Em uma terapia combinada, o construto de imunoglobulina entregue pelo AAV descrito aqui é administrado antes, durante ou após o início da terapia com outro agente, bem como qualquer combinação dos mesmos, ou seja, antes e durante, antes e depois, durante e depois ou antes, durante e após o início da terapia antineoplásica. Por exemplo, o AAV pode ser administrado entre 1 e 30 dias, preferencialmente 3 e 20 dias, mais preferencialmente entre 5 e 12 dias antes de iniciar a terapia de radiação. Em outra modalidade da invenção, a quimioterapia é administrada concomitantemente com, ou mais preferencialmente, subsequentemente à terapia de imunoglobulina mediada por AAV (anticorpo). Ainda em outras modalidades, as composições da invenção podem ser combinadas com outros produtos biológicos, por exemplo, fármacos de anticorpos monoclonais recombinantes, conjugados anticorpo-fármaco ou similares. Além disso, combinações de diferentes construtos de imunoglobulina entregues por AAV, como as discutidas acima, podem ser usadas em tais regimes. Qualquer método ou via adequada pode ser utilizada para administrar uma composição contendo AAVhu68.anti-Her2 como aqui descrito e, opcionalmente, para coadministrar agentes antineoplásicos e/ou antagonistas de outros receptores. Os regimes de agente antineoplásico utilizados de acordo com a invenção incluem qualquer regime que se acredite ser idealmente adequado para o tratamento da condição neoplásica do paciente. Diferentes neoplasias podem exigir o uso de anticorpos antitumorais específicos e agentes antineoplásicos específicos, que serão determinados de paciente para paciente. As vias de administração incluem, por exemplo, administração sistêmica, oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular. A dose do antagonista administrado depende de vários fatores, incluindo, por exemplo, o tipo de antagonistas, o tipo e a gravidade do tumor a ser tratado e a via de administração dos

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107/144 antagonistas.

[204] É de notar que o termo um ou uma se refere a um ou mais. Desse modo, os termos um (ou uma), um ou mais e pelo menos um são utilizados neste documento de forma intercambiável.

[205] As palavras compreendem, compreende e compreendendo devem ser interpretadas inclusivamente em vez de exclusivamente. As palavras consistir, consistindo e suas variantes devem ser interpretadas exclusivamente, e não de forma inclusiva. Embora várias modalidades no relatório sejam apresentadas utilizando o termo compreendendo, em outras circunstâncias uma modalidade relacionada também deve ser interpretada e descrita utilizando consistindo em ou consistindo essencialmente em.

[206] Conforme usado neste documento, o termo cerca de significa uma variabilidade de 10% (±10%) em relação à referência dada, salvo especificado em contrário.

[207] Como utilizados neste documento, doença, distúrbio e condição são utilizados alternadamente, para indicar um estado anormal em um sujeito.

[208] Salvo definido em contrário nesta especificação, os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que aquele entendido na técnica e por referência a textos publicados que proporcionem àqueles versados na técnica uma orientação geral para vários dos termos usados no presente pedido.

[209] O termo expressão é utilizado neste documento no seu sentido mais amplo e compreende a produção de RNA ou de RNA e proteína. No que diz respeito ao RNA, o termo “expressão” ou “tradução” refere-se em particular à produção de peptídeos ou proteínas. A expressão pode ser transitória ou estável.

[210] Conforme usado neste documento, o termo título de NAb mede a quantidade de anticorpos neutralizantes (por exemplo, NAb anti

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AAV) que neutraliza o efeito fisiológico do seu epítopo alvo (por exemplo, um AAV). Os títulos de NAb anti-AAV podem ser medidos conforme descrito em, por exemplo, Calcedo, R., et al., Worldwide Epidemiology of Neutralizing Antibodies to Adeno-Associated Viruses. Journal of Infectious Diseases, 2009. 199(3): p. 381-390, que é incorporado neste documento por referência.

[211] Como usado neste documento, uma cassete de expressão refere-se a uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de codificação, promotor e pode incluir outras sequências reguladoras para a mesma. Em certas modalidades, um genoma de vetor pode conter duas ou mais cassetes de expressão. Em outras modalidades, o termo “transgene” pode ser usado de forma intercambiável com “cassete de expressão”. Tipicamente, tal cassete de expressão para gerar um vetor viral contém a sequência de codificação para o produto gênico aqui descrito, flanqueada por sinais de empacotamento do genoma viral e outras sequências de controle de expressão, como as aqui descritas.

[212] A abreviatura sc refere-se à autocomplementaridade. AAV autocomplementar refere-se a um construto em que uma região de codificação transportada por uma sequência de ácidos nucleicos de AAV recombinante foi concebida para formar um molde de DNA de cadeia dupla intramolecular. Após a infecção, em vez de esperar pela síntese mediada por células da segunda cadeia, as duas metades complementares de scAAV irão se associar para formar uma unidade de DNA de cadeia dupla (dsDNA) que está pronta para replicação e transcrição imediatas. Ver, por exemplo, DM McCarty et al. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis, Gene Therapy, (agosto de 2001), vol. 8, número 16, páginas 1248-1254. Os AAVs autocomplementares são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos.

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6.596.535; 7.125.717; e 7.456.683, cada uma delas sendo incorporadas a este documento por referência em sua totalidade.

[213] Tal como aqui utilizado, o termo operacionalmente ligadas refere-se às sequências de controle de expressão que são contíguas ao gene de interesse e as sequências de controle de expressão que atuam em trans ou a uma distância para controlar o gene de interesse.

[214] O termo heterólogo, quando usado com referência a uma proteína ou um ácido nucléico, indica que a proteína ou o ácido nucléico compreende duas ou mais sequências ou subsequências que não são encontradas na mesma relação entre si na natureza. Por exemplo, o ácido nucléico geralmente é produzido de forma recombinante, possuindo duas ou mais sequências de genes não relacionados dispostos para produzir um novo ácido nucléico funcional. Por exemplo, em uma modalidade, o ácido nucléico tem um promotor de um gene disposto para direcionar a expressão de uma sequência de codificação de um gene diferente. Assim, com referência à sequência de codificação, o promotor é heterólogo.

[215] Um vírus com replicação defeituosa ou vetor viral referese a uma partícula viral sintética ou artificial na qual um cassete de expressão contendo um gene de interesse é empacotado em um capsídeo ou envelope viral, onde qualquer sequência genômica viral também empacotada dentro do capsídeo viral ou envelope são deficientes em replicação; ou seja, eles não podem gerar virions de progênies, mas retêm a capacidade de infectar células-alvo. Em uma modalidade, o genoma do vetor viral não inclui os genes de codificação das enzimas necessários para replicar (o genoma pode ser manipulado para ser sem soro - contendo apenas o gene de interesse flanqueado pelos sinais necessários para amplificação e empacotamento do genoma artificial), mas esses genes podem ser fornecidos durante a produção. Por conseguinte, considera-se seguro para uso em terapia gênica, uma vez que a replicação e a

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110/144 infecção por virions de progênie não podem ocorrer, exceto na presença da enzima viral necessária para a replicação.

[216] Em muitos casos, as partículas de rAAV são referidas como resistentes à DNase. Contudo, além dessa endonuclease (DNase), outras endonucleases e exonucleases podem ainda ser utilizadas na etapa de purificação descrita aqui, para remover ácidos nucleicos contaminantes. Essas nucleases podem ser selecionadas para degradar o DNA de cadeia simples e/ou um DNA e um RNA de cadeia dupla. Tais etapas podem conter uma única nuclease ou misturas de nucleases dirigidas a diferentes alvos, e podem ser endonucleases ou exonucleases.

[217] O termo resistentes às nucleases indica que o capsídeo de AAV foi completamente montado em torno do cassete de expressão, que é concebido para administrar um gene a uma célula hospedeira e protege essas sequências genômicas de degradação (digestão) durante as etapas de incubação de nuclease concebidas para remover ácidos nucleicos que possam estar presentes no processo de produção.

[218] Como aqui utilizado, uma quantidade eficaz refere-se à quantidade da composição de rAAV que entrega e expressa nas células alvo uma quantidade do produto do gene do genoma do vetor. Uma quantidade eficaz pode ser determinada com base em um modelo animal, em vez de um paciente humano. Exemplos de um modelo murino adequado são descritos neste documento.

[219] Em certas modalidades, um rAAV ou composição como aqui fornecido exclui um anticorpo anti-influenza ou construto de imunoglobulina. Em certas modalidades, um rAAV ou composição como aqui fornecido exclui um gene de atrofia muscular espinhal (SMA) ou sequência de codificação de SMN.

[220] O termo tradução no contexto da presente invenção referese a um processo no ribossoma, em que uma cadeia de mRNA controla a montagem de uma sequência de aminoácidos para gerar uma proteína ou

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111/144 um peptídeo.

[221] Conforme usado ao longo desta especificação e das reivindicações, os termos compreendendo, contendo, incluindo e suas variantes incluem outros componentes, elementos, números inteiros, etapas e similares. Por outro lado, o termo consistindo e suas variantes são exclusivos de outros componentes, elementos, números inteiros, etapas e similares.

[222] Deve-se notar que o termo um ou uma, refere-se a um ou mais, por exemplo, um intensificador, é entendido como representando um ou mais intensificadores. Assim, os termos um (ou uma), um ou mais e pelo menos um podem ser usados neste documento de forma intercambiável.

[223] Como descrito acima, o termo “cerca de” quando usado para modificar um valor numérico significa uma variação de ± 10%, a menos que especificado de outra forma.

[224] Os exemplos a seguir são apenas ilustrativos e não pretendem limitar a presente invenção.

EXEMPLOS [225] Em certas modalidades, observou-se que o capsídeo AAVhu68 possui melhor rendimento AAV9, que também está no Clade F. Uma ou ambas as alterações de aminoácidos, o ácido glutâmico (Glu) na posição 67 e a valina (Vai) na posição 157 podem conferir isso aumento do rendimento. Em certas modalidades, os vetores possuindo os capsídeos AAVhu68 fornecem pelo menos um aumento de 15% no rendimento do vetor empacotado em comparação com os vetores baseados no AAV9. Em uma comparação entre AAVhu68 e AAVrhIO, verificou-se que o AAVhu68 fornece melhor eficiência de transdução que o AAVrhIO em doses baixas (por exemplo, cerca de 1 x 10⁹) após administração intracerebroventricular.

EXEMPLO 1

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A. Identificação de AAVhu68 [226] O DNA tecidual foi extraído de amostras de tecido humano como modelo de PCR com colunas QIAamp (Qiagen) seguindo as recomendações do fabricante com as seguintes modificações. A DNA polimerase Q5 (Mistura Principal de Alta Fidelidade 2X Q5® Hot Start, NEB) foi escolhida por sua extraordinária alta fidelidade e eficiência robusta para recuperar o gene VP1 de AAVs nas amostras, conforme descrito por Gao, et al. [Proc Natl Acad Sei USA, 2002 Sep 3, 99(18): 1185411859 (Epub 2002 Aug 21)] com o conjunto de iniciador modificado como se segue: no lugar do AV1NS, GCTGCGYCAACTGGACCAATGAGAAC iniciador, prm504, [SEQ ID NO: 7] foi utilizado e no lugar do iniciador reverso AV2CAS, prm505 CGCAGAGACCAAGTTCAACTGAAACGA, [SEQ ID NO: 8], foi utilizado. As condições de PCR foram modificadas da seguinte forma:

	μΙ-
Água	9
prm504	1,25
prm505	1,25
molde	1
2X Q5	12,5

programa PCR

	Tempo (segundos)	Ciclo (s)
98	30	1
98	10	50
59	10
72	93
72	120	1

[227] As bandas de ~ 3 kb da PCR foram cortadas do gel; O DNA foi extraído com o QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) e clonado no kit de clonagem Zero Blunt® TOPO® PCR (Thermo Fisher Scientific). Os

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113/144 plasmídeos foram sequenciados para obter o comprimento total do gene AAV VP1. Para a maioria das amostras, pelo menos três plasmídeos foram totalmente sequenciados e sequências de consenso foram desenhadas como a sequência final do AAV para essa amostra.

[228] A sequência de ácido nucleico adquirida que codifica a proteína da capsídeo vp1 de AAVhu68 fornecida na SEQ ID NO: 1. Veja também as FIGs. 2A-2C. A sequência de aminoácidos da vp1 de AAVhu68 fornecida na FIGURA 1 e SEQ ID NO: 2. Em comparação com AAV9, AAVhu31 e AAVhu32, duas mutações (A67E e A157V) foram identificadas críticas em AAVhu68 (circulado na FIGURA 1).

[229] Este método de amplificação também forneceu uma sequência espaçadora entre a sequência de codificação vp1 e as sequências de codificação rep. Esta sequência de codificação é: atgacttaaaccaggt, SEQ ID NO: 9. A sequência de codificação para rep52 de AAVhu68 é reproduzida na SEQ ID NO: 3. A sequência da proteína rep52 é também reproduzida na SEQ ID NO: 4.

[230] O plasmídeo pAAV2/hu68 trans foi então produzido carregando o gene VP1 de hu68 em uma estrutura principal pAAV2/9 no lugar do gene AAV9 VP1, a fim de avaliar a eficiência de empacotamento, rendimento e propriedades de transdução. O plasmídeo pAAV2/9 contém ITRs 5' e 3' de AAV2 flanqueando o gene de capsídeo e está disponível no Penn Vector Core [Universidade da Pensilvnia, Phila, PA US, pennvectorcore.med.upenn.edu].

B. Caracterização de AAVhu68 [231] Embora este fenômeno não tenha sido previamente observado ou descrito em capsídeos de vírus adenoassociados, verificou-se que outras proteínas e peptídeos são suscetíveis, tanto in vivo quanto in vitro, a uma variedade de modificações químicas. Uma das modificações mais frequentes é a desamidação da asparagina, uma reação não enzimática espontânea. Em geral, os meios tempos de desamidação de

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114/144 asparaginila em condições fisiológicas (pH 7,4, 37°C) variam entre cerca de 1 e 1000 dias. Uma série semelhante de reações ocorre nos resíduos de glutamina para glutamato, mas essas reações são muito mais lentas que as de suas contrapartes de asparagina.

[232] Em peptídeos curtos, a formação de intermediários cíclicos é controlada pela sequência primária, enquanto nas proteínas as estruturas secundária, terciária e quaternária têm um efeito adicional. Assim, a taxa de desamidação de cada amida proteica é determinada exclusivamente. A identificação espectrométrica de massas de peptídeos desamidados é relativamente simples, pois a desamidação aumenta a massa da molécula intacta +0,984 Da (a diferença de massa entre os grupos -OH e -NH2). Como a desamidação é uma modificação estável na fase gasosa, os espectros de MS/MS podem revelar a posição da desamidação, mesmo na presença de vários locais potenciais de desamidação.

[233] Quatro vetores AAVhu68 foram produzidos usando um dos quatro genomas vetoriais que não são relevantes para este estudo, cada um produzido usando métodos convencionais de transfecção tripla em células 293. Para uma descrição geral dessas técnicas, ver, por exemplo, Bell CL, et al., “The AAV9 receptor and its modification to improve in vivo lung gene transfer in mice”, J Clin Invest. 2011 ;121:24272435. Resumidamente, um plasmídeo que codifica a sequência a ser empacotada (um produto genético expresso a partir de um promotor de β-actina de frango, urn intron e um hormônio de crescimento poli A) flanqueado por repetições terminais invertidas AAV2, foi empacotado por transfecção tripla de células HEK293 com plasmídeos codificando 0 gene rep AAV2 e 0 gene cap AAVhu68 e um plasmídeo auxiliar de adenovirus (pAdAF6). As partículas virais de AAV resultantes podem ser purificadas usando centrifugação em gradiente de CsCI, concentradas e congeladas para uso posterior.

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115/144 [234] Desnaturação e alquilação: a 100 pg da preparação viral descongelada (solução proteica), adicionam-se 2 μΙ de Ditiotreitol 1M (DTT) e 2 μΙ de cloridrato de guanidina 8M (GndHCI) e incuba-se a 90°C por 10 minutos. Deixa-se a solução esfriar até a temperatura ambiente, adicionam-se 5 μΙ de iodoacetamida 1M (IAM) preparada na hora e incube por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro. Após 30 minutos, extinguir a reação de alquilação adicionando 1 μΙ_ de 1M DTT.

[235] Digestão: À solução de proteína desnaturada, adicionam-se 20mM de bicarbonate de amônio, pH 7,5-8, em um volume que dilua a concentração final de GndHCI em 800mM. Adiciona-se solução de protease (tripsina ou quimotripsina) para uma proporção de protease 1:20 para proteína e incubar a 37°C durante à noite. Após a digestão, adiciona-se TFA a uma final de 0,5% para saciar a reação de digestão.

[236] Espectrometria de Massa: Aproximadamente 1 micrograma da mistura de digestão combinada é analisada por UHPLC-MS/MS. O LC é realizado em um sistema UltiMate 3000 RSLCnano (Thermo Scientific). A fase móvel A é a água MilliQ com ácido fórmico a 0,1 %. A fase móvel B é acetonitril com ácido fórmico a 0,1%. O gradiente de LC é executado de 4% B a 6% B ao longo de 15 min, depois a 10% B por 25 min (40 minutos no total) e depois a 30% B por 46 min (86 minutos no total). As amostras são carregadas diretamente na coluna. O tamanho da coluna é de 75 cm x 15 um ID e é embalado com mídia C18 de 2 microns (Acclaim PepMap). A LC é conectada a um espectrômetro de massa quadrupolo-Orbitrap (Q-Exactive HF, Thermo Scientific) via ionização por eletrofulverização nanoflex usando uma fonte. A coluna é aquecida a 35°C e é aplicada uma tensão de eletropulverização de 2,2 kV. O espectrômetro de massa é programado para adquirir espectros de massa em tandem dos 20 principais íons. Resolução total do MS para 120.000 e resolução do MS/MS para 30.000. A energia de colisão normalizada é definida como 30, controle automático de ganho para

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116/144 e5, MS de preenchimento máximo para 100 ms, MS/MS de preenchimento máximo para 50 ms.

[237] Processamento de dados: Os arquivos de dados RAW do espectrômetro de massa foram analisados por BioPharma Finder 1.0 (Thermo Scientific). Resumidamente, todas as pesquisas exigiram 10 ppm de tolerância à massa do precursor, 5ppm de tolerância à massa do fragmento, divagem tríptica, até 1 divagem perdida, modificação fixa da alquilação da cisteína, modificação variável da oxidação da metionina/triptofano, desamidação da asparagina/glutamina, fosforilação, metilação e amidação.

[238] Na tabela a seguir, T refere-se à tripsina e C refere-se à quimiotripsina.

Modificação
Enzima	T	T	T	T	C	C	C	C	T	T	T
% Cobertura	93,6	92	93,1	92,5	90,2	89,7	91,1	88,9	98,9	97	94,6	92,4
+ Desamidação (Desamida)
~ N35
N57+ Desamida	87,6	95,5	89,3	88,2	90,5	96,3	86,4	84,8	100,0	100,0	99,0	92,7
N66+ Desamida	4,7
N94+ Desamida	11,3	10,9	11,0	5,3	11,6	10,4	10,8	5,6	5,0	11,1	5,4	16,0
N113+ Desamida			1,8
-N253+ Desamida	17,7	22,0	21,1	15,0	17,0	22,6	20,5	15,6	4,2	5,5
Q259+ Desamida	35,2	25,6	21,0		35,4	26,3	20,9	9,2
-N270+ Desamida	16,4	25,1	23,2	16,6	15,9	24,9	23,5	16,1	0,2
-N304+ Desamida	2,6	2,9	2,8	1,3	2,5	2,8	2,9	1,3	16,6	10,3
-N314+ Desamida									6,5
N319+ Desamida	0,3	2,8	2,8	0,2		2,9	2,8	0,2
N329 + Desamida	72,7	85,6	89,1	86,8	71,0	87,2	88,7	84,7	85,5	79,4	78,9	91,8

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N336+ Desamida		30,8	9,3	100,0		31,0	9,2	95,7
-N409+ Desamida	21,3	22,9	23,9	24,0	22,0	23,4	24,7	24,2
N452+ Desamida	98,8	99,7	99,2	100,0	98,9	97,3	98,1	95,2	98,2	68,7	67,4	49,4
N477+ Desamida	4,4	4,3	4,3	2,6	4,5	4,4	4,3	2,6			0,8
N512+ Desamida	97,5	97,9	95,3	95,7	92,2	91,8	99,2	96,1	99,7	98,2	87,9	75,7
-N515+ Desamida	8,2	21,0	16,0		8,3	21,0	16,5	0,0	2,5	3,0		15,1
-Q599+ Desamida	4,0	15,4	10,1	13,6	4,0	15,5	10,0	13,8	15,8
N628+ Desamida	5,3		5,6		5,4	0,0	5,4	0,0
N651 + Desamida	0,9	1,6	1,6						0,5
N663+ Desamida	3,4		3,5	3,7	3,4	0,0	3,4	3,6
N709+ Desamida	0,6	0,8	20,2	0,6	0,6	0,8	19,8	0,6	0,3	1,3	0,1	0,2
N735									25,0	42,7		21,7
+ Acetilação (Ac):
K332 + Ac				100,0
~ K693 + Ac	13,0		13,5
~ K666 + Ac				93,8
~ K68 + Ac		59,2
+ Isomerização (ISO):
D97 + Iso	0,5	0,4	0,4	0,2	0,5		0,4	0,2
D107 + Iso		0,3		0,3		0,3
D384 + Iso	0,8				0,9
+ Fosforilação (fosfato)
S149 + Phos	5,8	5,7	5,2	9,8	5,7	5,9	5,2	9,9
~S499 + Phos				30,6
~T569 + Phos	0,9
~ S586 + Phos		3,6
+ Oxidação
~ W23 + Oxi		4,7	5,5			4,8	5,5
W247 + Oxi	1,5	0,4	0,7		1,4
W247+Oxi em quinurenina		0,1				0,1
W306 + Oxi	0,7	0,9	1,6	1,8	0,7	1,0	1,6	1,8

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W306+Oxidação em quinurenina			0,3				0,3
M404 + Oxi	0,1		0,2		0,1		0,2
M436 + Oxi	4,9		10,2	23,0	4,8		10,2	22,6
~ M518 + Oxi	29,9		1,5	10,6	29,9		1,5	10,5
~ M524 + Oxi	18,8	31,6	52,7		18,4	31,1	52,5	14,2
M559 + Oxi	19,0	21,6	19,6	20,9	19,6	21,3	20,1	20,9
~ M605 + Oxi	12,2	15,2			12,8	14,8
W619 + Oxi	1,0		0,6	1,5	1,0		0,6	1,5
W619+Oxida- Ção			20,3
~ M640 + Oxi	23,5	64,2	24,6		22,4	21,1	25,6
W695 + Oxi	0,3		0,4	0,4	0,3		0,4	0,4
+Amidação
~D297+Amida- Ção		72,9		73,3

239] No caso da proteína do capsídeo AAVhu68, 4 resíduos (N57, N329, N452, N512) exibem rotineiramente altos níveis de desamidação e na maioria dos casos> 90% em vários lotes. Resíduos de asparagina adicionais (N94, N253, N270, N304, N409, N477) e Q599) também exibem níveis de desamidação de até -20% em vários lotes. Os níveis de desamidação foram inicialmente identificados através de digestão com tripsina e verificados com digestão com quimotripsina.

EXEMPLO 2 - Rendimento de vetores AAVhu68 [240] Foram gerados e avaliados os vetores AAVhu68 e AAV9 portando vários marcadores, como GFP e LacZ. Cada um dos vetores foi gerado usando a técnica de transfecção tripla em células 293, como descrito por Gao et al [Gao, Guang-Ping, et al. Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences 99.18 (2002): 1185411859].

A. Produção de plasmídeo fra/?spAAVhu68 [241] A sequência de ácido nucleico que codifica a proteína da capsídeo vp1 fornecida na SEQ ID NO: 1.

[242] O plasmídeo pAAV2/hu68 trans foi produzido carregando ο

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119/144 gene VP1 de hu68 em uma estrutura principal pAAV2/9 no lugar do gene AAV9 VP1, a fim de avaliar a eficiência de empacotamento, rendimento e propriedades de transdução. O plasmídeo pAAV2/9 contém ITRs 5' e 3' de AAV2 flanqueando o gene de capsídeo e está disponível no Penn Vector Core [Universidade da Pensilvnia, Phila, PA US, pennvectorcore.med.upenn.edu].

B. Rendimento de vetores AAVhu68 [243] As células 293 foram cultivadas e mantidas em DMEM, 1X (Modificação de Dulbecco do meio essencial mínimo de Eagle) com 4,5 g/L de glicose, L-glutamina & piruvato de sódio suplementado com 10% de soro fetal bovino sob a atmosfera com 5% de CO2 a 37°C. As transfecções foram realizadas como descrito por Gao et al. [Gao, GuangPing, et al. Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences 99.18 (2002): 11854-11859.] com 0 plasmídeo de vetor substituído por pAAV2/hu68 ou pAAV2/9. O transgene (cassete de expressão) utilizado foi CB7.CI.ffl_uciferase.RBG. As células transfectadas foram ainda cultivadas em placas de 6 poços. O lisado total das células, bem como 0 sobrenadante, foram coletados para quantificação do vírus através da análise de TaqMan (Applied Biosystems) utilizando sondas e iniciadores direcionando a região poliA da beta-globina de coelho do transgene (cassete de expressão) como descrito em Gao et al [Gao, Guangping, et al. Purification of recombinant adeno-associated virus vectors by column chromatography and its performance in vivo. Human gene therapy 11.15 (2000): 2079-2091]. Os rendimentos de seis plasmídeos pAAV2/9 e seis pAAV2/hu. Foram comparados 68 plasmídeos em uma placa de 6 poços, cabeça a cabeça, em termos de título do sobrenadante e do título total do lisado. Cada plasmídeo foi de uma colônia de bactérias individual.

[244] Verificou-se que 0 rendimento de AAVhu68 era semelhante

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120/144 ao de AAV9 em termos de lisado total (FIGURA 3A, n=6, p=0,42). No entanto, no sobrenadante, o rendimento de AAVhu68 foi significativamente maior que o de AAV9 (FIGURA 3B, n=6, p=0,0003). Assim, demonstrou-se que o AAVhu68 é um vetor melhor em comparação com AAV9 em termos de produção, uma vez que o sobrenadante é colhido durante a escala de pilha de células e a produção de vírus.

EXEMPLO 3 - TRANSDUÇÃO IN VIVO DE AAVHU68.LACZ [245] AAVhu68.CB7.nLacZ (também referido como AAVhu68.LacZ) foi gerado através da inserção de uma sequência que codifica a β-galactosidase bacteriana localizada no núcleo (nLacZ) e depois produzida como descrito no Exemplo 2. Para avaliar a eficiência de embalagem, rendimento, propriedades de transdução, eficiência de transdução e tropismo de AAVhu68 in vivo, os camundongos foram injetados com 5 X 10¹¹ cópias do genoma do AAVhu68.Vetor LacZ via vários métodos de administração, tais como administração intravenosa, intramuscular e intranasal. Músculo, pulmão, fígado e coração foram coletados após o sacrifício dos camundongos duas semanas após a administração do vetor. Secções congeladas de cada órgão foram preparadas, processadas e analisadas como protocolo convencional detectando a expressão do gene LacZ [Bell, Peter, et al. An optimized protocol for detection of E. coli β-galactosidase in lung tissue following gene transfer. Histochemistry and cell biology 124.1 (2005): 77-85.]. Uma coloração positiva para LacZ mostrada em azul (FIGURAS 4A-4C) indica uma transdução bem-sucedida de AAVhu68.

[246] Como mostrado na FIG 4A, após os vetores introduzidos nos camundongos por injeção intravenosa (IV), todos os órgãos testados (coração, fígado, pulmão e músculo) demonstraram transdução de AAVhu68 enquanto observava-se um tropismo favorecendo coração e fígado sobre pulmão e músculo. Após os vetores introduzidos nos camundongos por injeção intramuscular (IM), coração, fígado e músculo

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121/144 demonstraram alta taxa de transdução de AAVhu68, enquanto nenhuma transdução detectável no pulmão foi observada. Se a administração intranasal foi realizada, foi observada transdução dispersa no coração, fígado, músculo e pulmão.

[247] Esses resultados revelaram que AAVhu68 demonstrou alta eficiência de transdução e um amplo tropismo de tecidos/órgãos.

EXEMPLO 4 - Transdução in vivo de AAVhu68.GFP comparado ao AAV9.GFP [248] AAVhu68.GFP e AAV9.A GFP foram geradas através da inserção de um gene que codifica a proteína fluorescente verde (GFP) como os genes que são então produzidos como descrito no Exemplo 2. Para avaliar a eficiência da embalagem, rendimento, propriedades de transdução, eficiência de transdução e tropismo de AAVhu68 e AAV9 in vivo, os camundongos foram administrados com AAVhu68.GFP ou AAV9.GFP nas doses de 1x10¹⁰ GC ou 1x10¹¹ GC. Cérebro, músculo, pulmão, fígado e coração foram coletados após o sacrifício dos camundongos duas semanas após a administração do vetor. Seções congeladas de cada órgão foram preparadas e processadas para visualizar a expressão de GFP como descrito por Wang et al [Wang L, et al., Hum Gene Ther. Novembro de 2011; 22 (11): 1389-401; Wang L. et al., Mol Ther. 2010 Jan; 18(1):126-34]. Uma coloração positiva para GFP mostrada em verde (FIGURAS 5A-5C e FIGURAS 6A-6D) indica uma transdução bem sucedida dos vetores testados.

[249] Seções de várias regiões do cérebro (hipocampo, córtex motor e cerebelo) de camundongos com administração intracerebroventricular dos vetores foram investigadas. A transdução dos vetores de AAV foi observada em todas as amostras de hipocampo testadas, exceto uma de camundongos injetados com 1x10¹⁰ GC de AAV9.GFP. Uma melhor transdução de AAVhu68.GFP comparado com o AAV9 foi obser

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122/144 vado no cortex motor. Além disso, a transdução no cerebelo de AAVhu68.A GFP foi observada quando os camundongos foram injetados apenas com 1x10¹¹ GC do vetor. Portanto, o AAVhu68 exibia uma eficiência de transdução mais alta, além de um tropismo mais amplo no cérebro em comparação ao AAV9.

[250] Em outra experiência, vários órgãos, como fígado, rim, coração e pâncreas, de camundongos administrados com AAVhu68.GFP intravenosamente foram preparados e processados como descrito por Wang et al. [Wang L, Calcedo R, Bell P, J Lin, Grant RL, Siegel DL, Wilson JM, Hum Gene Ther. 2011 Nov; 22(11 ):1389-401; Wang L, Calcedo R, Wang H, Bell P, Grant R, Vandenberghe LH, Sanmiguel J, Morizono H, Batshaw ML, Wilson JM, Mol Ther. 2010 Jan; 18(1):126-34]. Um sinal positivo da GFP mostrado em verde indica uma transdução bem-sucedida dos referidos vetores AAV. Imagens de campo brilhantes mostradas em preto e branco foram fornecidas para a morfologia do órgão, enquanto o canal fluorescente vermelho correspondente foi fornecido como um controle negativo.

[251] Sinal positivo forte mostrado em verde foi observado no fígado, enquanto rim, coração e pâncreas também demonstraram transdução do vetor referido, indicando um amplo tropismo de tecido/órgão do vetor AAVhu68.

EXEMPLO 5 - Transdução de produção e in vivo de vetores AAV com mutação A67E e A157V [252] Para aumentar o rendimento e/ou a eficiência de empacotamento de um vetor adenoassociado recombinante (rAAV), um gene do capsídeo AAV para expressar uma proteína vp1 com uma Glu na posição de aminoácido 67 e/ou um Vai na posição de aminoácido 157 é manipulada para o Vetores AAV, como AAV9, AAVhu31 e AAVhu32, em que a numeração dos resíduos de aminoácidos é baseada em AAVhu68 [SEQ ID NO: 5].

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123/144 [253] Os referidos vetores AAV são produzidos e avaliados quanto ao rendimento de cada vetor de acordo com o Exemplo 2. A eficiência da transdução in vivo e o tropismo de tecido/órgão/região são ainda avaliados por métodos convencionais, como ilustrado no Exemplo 3.

EXEMPLO 6 - AAVhu68 intratecal.CMV.PI.htrastuzumab.SV40 para a profilaxia de metástases cerebrais humanas para câncer de mama HER2 +

AAV9	Virus adenoassociado 9
AAV9.trastuzumab	AAV9CMV.PI.htrastuzumab.SV40 (AAV9 carregando uma cassete de expressão de trastuzumab)
BCA	Ensaio de ácido bicinconínico
BCBM	Metástases cerebrais no câncer de mama
Cl	íntron quimérico
CMV (Promotor)	Potenciador imediato de citomegalovírus/promotor de beta-actina de frango
CSF	Líquido cefalorraquidiano
ddPCR	Reação em cadeia da polimerase digital de gotículas
DNA	Ácido desoxirribonucleico
GC	Cópias do genoma
GLP	Boas práticas de laboratório
GTP	Programa de Terapia Gênica
HER2	Receptor do fator de crescimento epidérmico humano 2
AAVhu68	Sorotipo vírus adenoassociado hu68
AAVhu68.trastuzumab	hu68.CMV.PI.htrastuzumab.SV40 (AAVhu68 carregando um cassete de expressão de trastuzumab)
ICV	Intracerebroventricular
ID	Número de identificação
IT	Intratecal
mAb	Anticorpo monoclonal
MED	Dose essencial mínima
η	Número de Animais
PBS	Tampão salino fosfato
qPCR	Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa
RAG1/_	Nocaute do gene 1 de ativação da recombinação
RAG1	Gene de ativação de recombinação 1
rBG	Sequência poli A de β-globina de coelho

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RPM	Rotação por minuto
SD	Desvio-padrão
SOP	Procedimento operacional Padrão
SV40 (sinal Poli A)	Sinal de poliadenilação do vírus Simian 40

A. Resumo [254] O objetivo deste estudo foi testar a eficácia terapêutica do AAVhu68.CMV.PI.htrastuzumab.SV40 (AAVhu68.trastuzumab), um vírus recombinante adenoassociado do sorotipo AAVhu68 contendo um cassete de expressão de trastuzumab, para a profilaxia de metástases cerebrais humanas de câncer de mama HER2+ em um modelo de xenoenxerto de camundongo. O trastuzumabe (Herceptin®, Roche) é um anticorpo monoclonal humanizado (mAb) direcionado contra o HER2 que prolonga a sobrevida dos pacientes quando usado por via intravenosa com quimioterapia para tratar a doença sistêmica do HER2+. No entanto, a barreira hematoencefálica exclui o Herceptin®, administrado por via intravenosa, para entrar no sistema nervoso central, impossibilitando o tratamento eficaz das metástases cerebrais do câncer de mama HER2+. Vários relatos de casos indicam que o Herceptin® administrado por via intratecal pode aumentar a sobrevida de pacientes com doença leptomeníngea HER2+ ou interromper a progressão das metástases focais HER2+ [J. C. Bendell, et al, Central nervous system metastases in women who receive trastuzumab-based therapy for metastatic breast carcinoma. Cancer. 97, 2972- 2977 (2003); D. J. Slamon, et al., Use of Chemotherapy plus a Monoclonal Antibody against HER2 for Metastatic Breast Cancer That Overexpresses HER2. N. Engl. J. Med. 344, 783792 (2001), M. A. Cobleigh, et al, Multinational study of the efficacy and safety of humanized anti-HER2 monoclonal antibody in women who have HER2-overexpressing metastatic breast cancer that has progressed after chemotherapy for metastatic disease. J. Clin. Oncol. 17, 2639-2648 (1999), Zagouri F, et al., (2013). Intrathecal administration of trastuzumab for the treatment of meningeal carcinomatosis in HER2

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125/144 positive metastatic breast cancer: a systematic review and pooled analysis. Breast Cancer Res Treat, 139(1):13-22., Bousquet G, et al. (2016). Intrathecal Trastuzumab Halts Progression of CNS Metastases in Breast Cancer. J Clin Oncol. 34(16):e151-155]. No entanto, o CSF vira rapidamente, provavelmente comprometendo o efeito terapêutico do IT Herceptin® devido a um perfil farmacocinético do CSF amplamente flutuante. O objetivo do tratamento com AAVhu68.trastuzumab é impedir a ocorrência, retardar o crescimento, melhorar a sobrevida ou aumentar as medidas de qualidade de vida clínica associadas ao HER2+ BCBM, fornecendo expressão localizada e de longo prazo de AAVhu68.trastuzumab no próprio parênquima cerebral.

[255] O AAVhu68.trastuzumab foi administrado em quatro doses diferentes (1,00X10¹⁰, 3,00X10¹⁰, 1,00X10¹¹, e 3,00X10¹¹ GC/animal) por injeção intracranioventricular (ICV) em camundongos RAG1⁷ na idade de 6-9 semanas. BT474.As células Ml.fluc, derivadas de uma linha celular de carcinoma ductal humano HER2+, foram implantadas pelo menos 21 dias depois. Os camundongos foram observados diariamente e sacrificados no ponto final do estudo. O tecido cerebral foi coletado na necropsia para medir o volume do tumor. Concluiu-se a administração profilática de AAVhu68 por ICV.CMV.PI.htrastuzumab.SV40 em um modelo de xenoenxerto RAG1' de metástases cerebrais de câncer de mama HER2+ resultou em um volume de tumor significativamente reduzido em todas as doses testadas nesta experiência. No total, esses resultados demonstraram a potencial eficácia terapêutica do AAVhu68.trastuzumab para melhorar a sobrevida de pacientes com HER2+ BCBM.

B. O objetivo deste estudo foi investigar a dose essencial mínima (MED) de AAVhu68.trastuzumab para profilaxia tumoral em um modelo de xenoenxerto RAGT^/_ de HER2+ BCBM por meio do estudo do volume tumoral. O vetor é AAVhu68.CMV.PI.htrastuzumab.SV40 ou AAVhu68.trastuzumab.

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Título do ddPCR: 7,38X10¹³ GC/ml

Endotoxina: <2,0 EU/ml

Pureza: 100%

Solução salina de tampão fosfato (PBS) (sem controle de tratamento) [256] A capacidade do AAVhu68.trastuzumab em proporcionar profilaxia tumoral foi avaliada usando um modelo de xenoenxerto RAG1 /- murino de HER2+ BCBM. Um modelo de camundongo imunodeficiente permite o crescimento de tumores ortotópicos de origem humana em um camundongo sem rejeição pelo sistema imunológico do camundongo. Além disso, o camundongo RAG1-/- não possui IgG intrínseca, permitindo que o trastuzumabe seja quantificado pelo ELISA da proteína A.

Tabela: Desenho do Estudo

Ns do Grupo	Tratamento	Dose (GC/camundongos)		Genótipo (n)	Volume da dose (μΙ)	ROA	Célula Tumoral Implantação
1	AAVhu68.trastuzumab	1,0X1 o10		RAGVflO)	5	ICV	21 dias após o tratamento
2	AAVhu68.trastuzumab	3,0X1010		RAGVflO)	5	ICV
3	AAVhu68.trastuzumab	1,0X10		RAG1z(10)	5	ICV
4	AAVhu68.trastuzumab	3,0X10		RAG1z(10)	5	ICV
5	PBS	Sem tratamento		RAG1z(10)	5	ICV

257] O artigo de teste e o controle negativo foram diluídos com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) até a concentração apropriada. O vetor foi administrado ICV no ventrículo lateral esquerdo.

[258] A entrega intratecal de AAV pode ser realizada utilizando uma variedade de vias para o acesso ao CSF. A rota ICV foi escolhida por ser minimamente invasiva e não requer procedimento cirúrgico no camundongo (em comparação com a rota cisterna magna que requer

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127/144 incisões na pele e nos músculos do pescoço). Foi demonstrado anteriormente em nosso laboratório e por outros que uma única injeção do vetor AAV9 no líquido cefalorraquidiano (ICV ou cisterna magna) em camundongos e animais de grande porte atinge os neurônios em todo o cérebro [Dirren et al. (2014). Injeção Intracerebroventricular de Vetores de Vírus Adenoassociados 6 e 9 para Expressão de Transgene Específica de Tipo de Célula na Medula Espinhal. Hum. Gene. Therapy 25, 109-120, Snyder et al. (2011). Comparison Of Adeno-Associated Viral Vector Serotypes For Spinal Cord And Motor Neuron Gene Delivery. Hum. Gene Ther 22, 1129-1135, Bucher et al. (2014). Intracisternal Delivery Of AAV9 Results In Oligodendrocyte And Motor Neuron Transduction In The Whole Central Nervous System Of Cats. Gene Therapy 21, 522-528, Hinderer et al. (2014). Intrathecal Gene Therapy Corrects CNS Pathology In A Feline Model Of Mucopolysaccharidosis I. Mol Ther: 22, 2018-2027],

C. Implante de células tumorais em RAG1 -/-Camundongos [259] Para criar um modelo de xenoenxerto de camundongo para HER2+ BCBM, foi empregada uma linha celular de carcinoma ductal de células humanas HER2+ transduzida com luciferase de firefly, BT474M1 .ffluc. Para o procedimento de injeção, os camundongos foram anestesiados com cetamina/xilazina. Pelos no couro cabeludo e no pescoço estavam cortados. Um pelete de 17-β de estradiol de liberação no tempo (1,7 mg, liberação de 90 dias, Innovative Research of America) foi implantado por via subcutânea no dorso do pescoço e re-administrado a cada 90 dias durante o estudo. Os camundongos foram fixados em um aparelho estereotáxico. A pele exposta foi limpa com iodopovidona e etanol a 70%. Uma incisão anterior-posterior de 1 cm foi realizada no topo do crânio. Bregma foi identificado. Uma broca pneumática foi posicionada em bregma e depois movida 0,8 mm para a parte posterior e

2,2 mm para a esquerda da bregma, onde um orifício de trepanação foi

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128/144 perfurado no crânio. Uma seringa Hamilton de 25 μΙ_ foi carregada com 5 μΙ_ de suspensão de células tumorais (100.000 células no total em 50:50 MatriGel®: PBS). A agulha foi levada ao bregma e movida para as coordenadas indicadas acima, antes de penetrar 4,0 mm no parênquima cerebral. A agulha foi então levantada 1,0 mm de volta ao trilho da agulha para criar um bolso para injetar células tumorais. A agulha foi deixada no lugar por 5 minutos. Em seguida, 5 μΙ_ de suspensão de células foram injetados por 10 minutos usando um aparelho de injeção motorizada. A agulha foi deixada no lugar por 5 minutos após o término da injeção e depois removida lentamente. A incisão no crânio foi suturada com 4,0 vicryl e os camundongos receberam 15 mg/kg de enrofloxacina (Bayer) em PBS estéril, juntamente com 0,3 mg/kg de buprenorfina em PBS estéril, ambos por via subcutânea.

[260] Os camundongos foram monitorados diariamente. Quando moribundos, os camundongos foram sacrificados por superexposição ao CO2 seguida por deslocamento cervical. Na necropsia, os cérebros foram isolados e cortados coronariamente através da trilha da agulha de injeção do tumor.

[261 ] Volume do tumor: a medição do diâmetro do tumor do dia 35 foi realizada com pinças Vernier digitais (Thermo-Fisher). Os cérebros foram coletados na necropsia. Dissecção sem corte na trilha da agulha de injeção de tumor foi usada para isolar tumores do tecido cerebral circundante. O diâmetro do tumor foi então medido em 3 dimensões (x, y e z) e o volume do tumor foi calculado como o volume de um elipsoide, 4/3 * π * x/2 * y/2 * z/2. O hemisfério cerebral direito, o hemisfério contralateral ao sítio da injeção do vetor e implantação do tumor, foi preservado em formalina. Os tumores dissecados foram reunidos por coorte de dose e preservados em formalina. As comparações de volume tumoral foram realizadas usando o teste de Mann-Whitney no GraphPad Prism 7.

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D. Resultados [262] Volume tumoral: para determinar se a profilaxia do tumor IT AAVhu68.trastuzumab diminui o crescimento do tumor, medimos o diâmetro do tumor 35 dias após o implante. O volume médio de tumores do grupo que recebeu a dose mais alta de profilaxia tumoral de AAVhu68.trastuzumab (0,4 mm³, n=10) foi significativamente menor do que os camundongos que não receberam tratamento (26,1 mm³, n=9). Os camundongos que receberam doses mais baixas de AAVhu68.trastuzumab apresentaram tumores significativamente menores em comparação com nenhum tratamento. O volume mediano do tumor de camundongos que receberam 1,00X10¹⁰ GC/camundongo foi calculado como estatisticamente igual ao volume mediano do tumor de camundongos que receberam 3,00X10¹⁰ GC/camundongo (p=0,6029). De notar, dois camundongos no grupo 1, um ratinho no grupo 2, três camundongos no grupo 3 e três camundongos no grupo 4 não apresentaram tumor grosseiramente apreciável após a dissecção.

Grupo	Dose (GC/camundongo)	Número de camundongos	Volume de tumor médio (mm3)	Valor de p comparado a nenhum tratamento
1	1,00X1010	9*	6,4	0,0375
2	3,00X1010	10	8,1	0,0053
3	1,00X1 o11	9*	1,3	0,0026
4	3,00X1011	10	0,4	<0,0001

*Um animal em cada um desses grupos foi sacrificado antes da data de necropsia programada e, portanto, não foi incluído na análise.

[263] Em todas as doses, a administração de AAVhu68.trastuzumab por IT levou a um volume mediano significativamente menor do tumor no implante pós-tumoral D35 quando administrado profilaticamente em um modelo de xenoenxerto RAG1⁷ murino de HER2+ BCBM, que usa o HER2+ BT474.Linha celular de carcinoma ductal humano M1. O AAVhu68.trastuzumab MED medido neste estudo foi 1,00X10¹⁰ GC/camundongo.

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EXEMPLO 7 - Rendimento e pureza da produção para vetores AAVhu68 [264] Para comparar o rendimento de produção e/ou a pureza de um vetor adenoassociado recombinante (rAAV) com capsídeos diferentes, foram gerados e preparados dois conjuntos diferentes de vetores com capsídeos diferentes, incluindo AAVhu68, AAV8triplo, AAV8 e AAV9.

[265] Resumidamente, um conjunto de vetores com um capsídeo indicado e um genoma de vetor compreendendo um promotor de citomegalovírus (CMV), uma sequência de codificação de luciferase de firefly e um SV40 poli A (CMV.ffLuciferase.SV40) foram produzidos e avaliados quanto ao rendimento de cada vetor em pequena escala. Os resultados mostram que os vetores AAV9 forneceram o maior rendimento enquanto o vetor AAVhu68 seguiu como o segundo (FIG 8A). Os vetores triplos de AAV8 e AAV8 também proporcionaram um rendimento acima de 4x10¹³ GC (FIG 8A).

[266] O outro conjunto de vetores com um capsídeo indicado e um genoma de vetor compreendendo um promotor de CMV, um íntron, uma sequência de codificação de imunoadesina (201 Ig IA) e um SV40 poli A (CMV.PI.201 Ig IA.SV40) foram produzidos e avaliados quanto ao rendimento e pureza de cada vetor em mega escala de acordo com métodos convencionais. Os resultados são mostrados nas FIGURAS 8B e 9.

[267] Semelhante ao rendimento das preparações em pequena escala, os vetores AAV9 proporcionaram o maior rendimento em cerca de 5,7x10¹⁴ GC, enquanto o vetor AAVhu68 seguiu como o segundo em cerca de 3,8x10¹⁴ GC (FIG 8B). Os vetores AAV8 forneceram um rendimento de cerca de 3,6x10¹⁴ GC e o AAV8 triplo a cerca de 1,8x10¹⁴ GC (FIG 8B). As purezas das preparações testadas são comparáveis, variando de cerca de 97,4% a cerca de 98,6%.

EXEMPLO 8 - Vetores de rAAV em camundongos RAG KO machos.

[268] A expressão gênica foi testada in vivo usando vetores de

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131/144 rAAV com diferentes capsídeos, incluindo AAVhu68, AAV8triplo, AAV8 e AAV9 e expressando um produto de transgene secretado, 201 Ig IA.

[269] Camundongos RAG KO machos com 6-8 semanas de idade (n=5/grupo) foram intramuscularmente no músculo gastrocnêmio com 3x10¹¹ GC/camundongo ou 3x10¹⁰ GC/camundongo do vetor testado usando uma seringa de Hamilton. O soro foi coletado semanalmente de camundongos administrados com vetores que expressam proteínas secretadas por sangramentos submandibulares em tubos de coleta de soro. Os níveis de expressão de transgene foram medidos no soro por ELISA, como descrito em Greig et al., Intramuscular Injection of AAV8 in Mice and Macaques Is Associated with Substantial Hepatic Targeting and Transgene Expression, PLoS One. 13 de novembro de 2014; 9(11 ):e112268. doi: 10.1371/journal.pone.0112268. eCollection 2014.

[270] Como mostrado nas FIGs 10A e 10B, os vetores AAVhu68, AAV8 e AAV9 expressaram o transgene em um nível semelhante, enquanto o vetor triplo AAV8 expressa melhor após a injeção IM em camundongos. Na dose mais baixa testada (isto é, 3x10¹⁰ GC/camundongo), a diferença na expressão do AAV8triplo é substancial.

EXEMPLO 9 - Expressão transgênica de vetores rAAV em camundongos machos C57BL/6J.

[271] A expressão no fígado e músculo foi testada In vivo usando vetores de rAAV com diferentes capsídeos, incluindo AAVhu68, AAV8triplo, AAV8 e AAV9 e expressando uma luciferase firefly (ffLuc) como transgene.

[272] Camundongos machos C57BL/6J com 6-8 semanas de idade (n=5/grupo) foram intramuscularmente no músculo gastrocnêmio com 3x10¹¹GC/camundongo do vetor testado usando uma seringa de Hamilton. A expressão de ffLuc foi visualizada por imagem de bioluminescência de corpo inteiro semanalmente como descrito anteriormente (Greig et al., PLoS One 2014, citado acima).

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132/144 [273] Como mostrado nas FIGs 11A e 11B, os vetores AAVhu68, AAV8 e AAV9 foram expressos em um nível semelhante no músculo e no fígado, enquanto o vetor AAV8triplo reduziu a expressão no fígado e melhorou a expressão no músculo.

EXEMPLO 10 - Vetores de rAAV em macacos Cynomolgus machos e fêmeas.

[274] A expressão do transgene foi testada em macacos Cynomolgus usando vetores de rAAV com capsídeos diferentes, incluindo AAVhu68, AAV8triplo, AAV8 e AAV9 e expressando um transgene secretado, 201 Ig IA.

[275] Macacos cynomolgus machos e fêmeas com títulos de NAb para o vetor injetado <1: 5 no início dos estudos foram administrados com uma dose de 10¹³ GC/kg de peso corporal do vetor expressando 201 Ig IA de um dos quatro capsídeos do vetor (AAV8triplo, AAVhu68, AAV9 ou AAV8) por via intramuscular no músculo vasto lateral das pernas direita e esquerda como injeções de 1 ml por kg de peso corporal (concentração de 10¹³ GC/ml) para o estudo de biodistribuição de vetores. As amostras de sangue foram coletadas pré-estudo e semanalmente durante o estudo por punção venosa da veia femoral. Os níveis de expressão de transgene foram medidos no soro por ELISA como descrito anteriormente (Greig etal., PLoS One 2014, citado acima).

[276] Como mostrado na FIG12, o AAVhu68 e o AAV8triplo expressam melhor em comparação aos vetores AAV9 e AAV8 após a injeção IM.

[277] Todos os documentos citados nesta especificação são incorporados aqui por referência, assim como o Pedido de Patente Provisório US N° 62/614.002, apresentado em 5 de janeiro de 2018, o Pedido de Patente Provisório US N° 62/591.001, apresentado em 27 de novembro de 2017, e Pedido de Patente Provisório US N° 62/464.748, apresen

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133/144 tado em 28 de fevereiro de 2017. A Listagem de Sequências apresentada neste documento, rotulada 17-7986 Seq Listing_ST25.txt, e as sequências e o texto são incorporados por referência. Embora a invenção tenha sido descrita com referência a modalidades particulares, será apreciado que modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito da invenção. Tais modificações se destinam a permanecer dentro do escopo das reivindicações anexas.

[278] (Listagem Sequencial de Texto Livre) [279] As seguintes informações são fornecidas para sequências que contêm texto livre sob o identificador numérico <223>.

SEQ ID NO: (contendo texto livre)	Texto Livre sob <223>
2	<223> Construto sintético
3	<223> gene rep AAVhu68 de origem homo sapiens
4	<223> Construto sintético
5	<223> Capsídeo VP1 AAV9 de origem homo sapiens <220> <221 > CDS <222> (1) .. (2208) <223> Capsídeo VP1 AAV9
6	<223> Construto sintético
7	<223> Primário prm504
8	<223> Primário prm505
9	<223> Sequência espaçadora AAVhu68
10	<223> proteína do capsídeo AAVhu31 vp1
11	<223> proteína do capsídeo AAVhu32 vp1
12	<223> Sequência de codificação AAVhu31 vp1
13	<223> Sequência de codificação AAVhu32 vp1
14	<223> hu68vp1 modificado

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SEQ ID NO: (contendo texto livre)

Texto Livre sob <223>

<220> <221 > MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa pode ser W (Trp, triptofano) ou W. oxidado <220> <221 > MISC-FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (57)..(57) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (66)..(66) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE

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SEQ ID NO: (contendo texto livre)

Texto Livre sob <223>

<222> (94)..(94) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC-FEATURE <222> (97)..(97) <223> Xaa pode ser D (asp, ido aspártico) ou D. isomerizado. <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (107)..(107) <223> Xaa pode ser D (asp, ácido aspártico) ou D. isomerizado. <220> <221 > misc_feature <222> (113)..(113) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorre naturalmente <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (149)..(149) <223> Xaa pode ser S (Ser, serina) ou S fosforilado

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SEQ ID NO: (contendo texto livre)

Texto Livre sob <223>

<220> <221 > MISC_FEATURE <222> (149)..(149) <223> Xaa pode ser S (Ser, serina) ou S fosforilado <220> <221 > MISC-FEATURE <222> (247)..(247) <223> Xaa pode ser W (Trp, triptofano) ou W. oxidado (por exemplo, kinurenina). <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (253)..(253) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (259)..(259) <223> Xaa representa Q ou Q desamidado em ácido glutâmico (ácido alfa-glutâmico), ácido gama-glutâmico (Glu) ou uma mistura de ácido alfa e gama-glutâmico <220>

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SEQ ID NO: (contendo texto livre)

Texto Livre sob <223>

<221 > MISC_FEATURE <222> (270)..(270) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (297)..(297) &lt;223&gt; Xaa representa D (Asp, ácido aspártico) ou D a N amindado (Asn, asparagina) <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (304)..(304) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (306)..(306) <223> Xaa pode ser W (Trp, triptofano) ou W. oxidado (por exemplo, kinurenina). <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (314)..(314)

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SEQ ID NO: (contendo texto livre)

Texto Livre sob <223>

<223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC-FEATURE <222> (319)..(319) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (329)..(329) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (332)..(332) <223> Xaa pode ser K (lis, lisina) ou K acetilado <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (336)..(336) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220>

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SEQ ID NO: (contendo texto livre)

Texto Livre sob <223>

<221 > MISC_FEATURE <222> (384)..(384) <223> Xaa pode ser D (asp, ácido aspártico) ou D. isomerizado. <220> <221 > MISC-FEATURE <222> (404)..(404) <223> Xaa pode ser M (Met, Metionina) ou M. oxidado <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (409)..(409) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (436)..(436) <223> Xaa pode ser M (Met, Metionina) ou M. oxidado <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (452)..(452) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp

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SEQ ID NO: (contendo texto livre)

Texto Livre sob <223>

<220> <221 > MISC_FEATURE <222> (477)..(477) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC-FEATURE <222> (499)..(499) <223> Xaa pode ser S (Ser, serina) ou S fosforilado <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (512)..(512) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (515)..(515) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (518)..(518) <223> Xaa pode ser M (Met, Metionina) ou M. oxidado

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SEQ ID NO: (contendo texto livre)

Texto Livre sob <223>

<220> <221 > MISC_FEATURE <222> (524)..(524) <223> Xaa pode ser M (Met, Metionina) ou M. oxidado <220> <221 > MISC-FEATURE <222> (559)..(559) <223> Xaa pode ser M (Met, Metionina) ou M. oxidado <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (569)..(569) <223> Xaa pode ser T (Thr, treonina) ou T Fosforilada <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (586)..(586) <223> Xaa pode ser S (Ser, serina) ou S fosforilado <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (599)..(599) <223> Xaa representa Q ou Q desamidado em ácido glutâmico (ácido alfa-glutâmico), ácido gama-glutâmico (Glu) ou

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SEQ ID NO: (contendo texto livre)

Texto Livre sob <223>

uma mistura de ácido alfa e gama-glutâmico <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (605)..(605) <223> Xaa pode ser M (Met, Metionina) ou M. oxidado <220> <221 > MISC-FEATURE <222> (619)..(619) <223> Xaa pode ser W (Trp, triptofano) ou W. oxidado (por exemplo, kinurenina). <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (628)..(628) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (640)..(640) <223> Xaa pode ser M (Met, Metionina) ou M. oxidado <220> <221 > MISC_FEATURE

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SEQ ID NO: (contendo texto livre)

Texto Livre sob <223>

<222> (651)..(651) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC-FEATURE <222> (663)..(663) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (666)..(666) <223> Xaa pode ser K (lis, lisina) ou K acetilado <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (689)..(689) <223> Xaa pode ser K (lis, lisina) ou K acetilado <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (693)..(693) <223> Xaa pode ser K (lis, lisina) ou K acetilado <220> <221 > MISC_FEATURE

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SEQ ID NO: (contendo texto livre)	Texto Livre sob <223>
	<222> (695)..(695) <223> Xaa pode ser W (Trp, triptofano) ou W. oxidado <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (709)..(709) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC-FEATURE &lt;222&gt; (735)..(735) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp

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Claims (42)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Vírus Adenoassociado recombinante (rAAV) caracterizado pelo fato de compreender:

   (A) um capsídeo AAV68 compreendendo um ou mais dos seguintes:

   (1) as proteínas do capsídeo de de AAV hu68 compreendendo:

   uma população heterogênea de proteínas vp1 AAVhu68 selecionadas dentre: proteínas vp1 produzidas por expressão a partir de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos prevista de 1-736 de SEQ ID No: 2, proteínas vp1 produzida a partir de SEQ ID No: 1, ou proteínas vp1 produzidas a partir de uma sequência de ácido nucleico pelo menos 70% idêntica à SEQ ID No: 1, que codifica a sequência de aminoácidos prevista de 1 a 736 de SEQ ID No: 2, uma população heterogênea de proteínas vp2 AAVhu68 selecionadas dentre: proteínas vp2 produzidas por expressão a partir de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos prevista de pelo menos cerca dos aminoácidos 138-736 de SEQ ID NO: 2, proteínas vp2 produzidos a partir de uma sequência que compreende pelo menos os nucleotídeos 412 a 2211 da SEQ ID No. 1, ou proteínas vp2 produzidos a partir de uma sequência de ácido nucleico pelo menos 70% idêntica a pelo menos os nucleotídeos 412-2211 de SEQ ID No. 1, que codifica a sequência de aminoácidos prevista de pelo menos cerca dos aminoácidosaminoácidos 138 a 736 da SEQ ID No: 2, uma população heterogênea de proteínas vp3 AAVhu68 selecionadas dentre: proteínas vp3 produzidas por expressão de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos prevista de pelo menos cerca dos aminoácidos 203-736 de SEQ ID NO: 2, proteínas vp3 produzidos a partir de uma sequência que compreende

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2. 2/10 pelo menos os nucleotídeos 607 a 2211 da SEQ ID No.: 1, ou proteínas vp3 produzidos a partir de uma sequência de ácido nucleico pelo menos 70% idêntica a pelo menos os nucleotídeos 607-2211 de SEQ ID No.: 1, que codifica a sequência de aminoácidos prevista de pelo menos cerca de os aminoácidos 203 a 736 da SEQ ID No: 2; e / ou (2) as proteínas do capsídeo de AAV compreendendo uma população heterogênea de proteínas vp1, uma população heterogênea de proteínas vp2 compreendendo opcionalmente uma valina na posição 157, e uma população heterogênea de proteínas vp3, em que pelo menos uma subpopulação das proteínas vp2 e vp1 compreendem uma valina na posição 157 e que compreende ainda, opcionalmente, um ácido glutâmico na posição 67 com base na numeração do capsídeo vpl de SEQ ID NO: 2; e/ou (3) uma população heterogênea de proteínas vp1 que são o produto de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, uma população heterogênea de proteínas vp2, que são o produto de uma sequência de ácido nucleico que codifica para o aminoácido sequcia de pelo menos cerca dos aminoácidos 138-736 de SEQ ID nO: 2, e uma população heterogênea de proteínas vp3 que são o produto de uma sequência de ácido nucleico codificando pelo menos os aminoácidos 203-736 da SEQ ID nO: 2, em que: as proteínas vp1, vp2 e vp3 contêm subpopulações com modificações de aminoácidos compreendendo pelo menos dois asparaginas altamente desamidadas (N) em asparagina - pares de glicina na SEQ ID nO: 2 e compreendendo ainda, opcionalmente, subpopulações compreendendo outros aminoácidos desamidadas, em que os resultados de desamidação em uma alteração de um aminoácido; e (B) um genoma de vetor no capsídeo AAVhu68, o genoma de vetor compreendendo uma molécula de ácido nucleico compreen

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3. 3/10 dendo sequências repetidas terminais invertidas de AAV e uma sequência de ácido nucleico não-AAV que codifica um produto ligado de forma operacional a sequências que a expressão direta do produto em uma célula hospedeira.

   2. Vírus Adenoassociado recombinante (rAAV) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que as asparaginas desamidada são desamidados para ácido aspártico, ácido isoaspártico, um par ácido / ácido isoaspártico interconversão, ou combinações dos mesmos.

   3. Vírus Adenoassociado recombinante (rAAV) de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato que a cápside compreende ainda glutamina desamidada (s) que são desamidados com (a) ácido glutâmico, ácido γ-glutâmico, um Interconvertendo (a) ácido glutâmico / ácido glutâmico-γ par, ou combinações dos mesmos.
4. 4. Vírus Adenoassociado recombinante (rAAV) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato que o capsídeo AAVhu68 compreende subpopulações tendo um ou mais dos seguintes:

   (A) pelo menos 65% de asparaginas (N) em asparagina - glicina pares localizados nas posições 57 das proteínas vpl são desamidados, com base na numeração de SEQ ID NO: 2;

   (B) pelo menos 75% de N na asparagina - pares de glicina na posição 329 das proteínas vpl, v2 e vp3 são desamidados, com base na numeração de resíduos da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, (C) pelo menos 50% de N na asparagina - pares de glicina na posição 452 das proteínas vpl, vp2 e vp3 são desamidados, com base na numeração de resíduos da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e/ou (D) pelo menos 75% de N na asparagina - pares de glicina

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   4/10 na posição 512 do vp1, proteínas v2 e vp3 são desamidados, com base na numeração de resíduos da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
5. 5. Vírus Adenoassociado recombinante (rAAV) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato que o capsídeo rAAVhu68 compreende uma subpopulação de vp1 em que 75% a 100% de a N na posição 57 das proteínas vp1 são desamidados, como determinada por espectrometria de massa.
6. 6. Vírus Adenoassociado recombinante (rAAV) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato que o capsídeo rAAVhu68 compreende subpopulação de proteínas vp1, proteínas vp2 e / ou vp3 em que 75% a 100% de N na posição 329, com base na numeração de SEQ ID NO: 2, são desamidados como determinada por espectrometria de massa.
7. 7. Vírus Adenoassociado recombinante (rAAV) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato que o capsídeo rAAVhu68 compreende subpopulação de proteínas vp1, proteínas vp2 e / ou proteínas vp3 em que 75% a 100% de N na posição 452, com base na numeração de SEQ ID NO: 2, são desamidados como determinada por espectrometria de massa.
8. 8. Vírus Adenoassociado recombinante (rAAV) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato que o capsídeo rAAVhu68 compreende subpopulação de proteínas vp1, proteínas vp2 e / ou vp3 proteínas em que 75% a 100% de N na posição 512, com base na numeração de SEQ ID NO: 2, são desamidados.
9. 9. Vírus Adenoassociado recombinante (rAAV) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato que a sequência de ácido nucleico que codifica para as proteínas é a SEQ ID NO: 1, ou uma sequência de pelo menos 80% a pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 1, que codifica a sequência de aminoácidos de

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   5/10

   SEQ ID nO: 2.
10. 10. Virus Adenoassociado recombinante (rAAV) de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato que a sequência de ácido nucleico é pelo menos 80% a 97% idêntica à SEQ ID NO: 1.
11. 11. Vírus Adenoassociado recombinante (rAAV) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato que o capsídeo rAAVhu68 compreende ainda, pelo menos, subpopulação de vpl, VP2 e / ou VP3 proteínas possuindo modificações de aminoácidos a partir de SEQ ID NO: 2, compreendendo, pelo menos, cerca de SO a 100% desamidação, pelo menos, quatro posições selecionadas a partir de um ou mais de N57, 329, 452, 512, ou suas combinações.
12. 12. Vírus Adenoassociado recombinante (rAAV) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato que o capsídeo rAAVhu68 compreende subpopulações de proteínas vp1, vp2 e / ou vp3 que compreendem ainda de 1% a cerca de 40% de desamidação em pelo menos uma ou mais das posições N94, N113 , N252, N253, Q259, N270, N303, N304, N305, N319, N328, N336, N409, N410, N477, N515, N598, Q599, N628, N651, N663, N709, ou combinações dos mesmos.
13. 13. Vírus Adenoassociado recombinante (rAAV) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato que o capsídeo rAAVhu68 compreende subpopulações de proteínas vp1, vp2 e / ou vp3 que compreendem ainda uma ou mais modificações selecionadas a partir de uma ou mais a modificação em um ou mais dos seguintes: acetilado lisina, serina fosforilada e / ou treonina, isomerizado ácido aspártico, triptofano oxidado e / ou a metionina, ou um aminoácido amidado.
14. 14. Vírus Adenoassociado recombinante (rAAV) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato que o rAAV compreende cerca de 60 proteínas totais do capsídeo em

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    6/10 uma proporção de cerca de 1 vp1 para cerca de 1 a 1,5 vp2 a cerca de 3 a 10 proteínas vp3.
15. 15. Vírus Adenoassociado recombinante (rAAV) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato que o rAAV compreende cerca de 60 proteínas totais da capsídeo em uma proporção de cerca de 1 vp1 para 1 vp2 para de 3 a 9 proteínas vp3.
16. 16. Vírus Adenoassociado recombinante (rAAV) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato que as sequências de ITR de AAV são uma ITR 5' e uma ITR 3' de AAV a partir de uma fonte que não seja AAVhu68.
17. 17. Composição caracterizada pelo fato de compreender uma população mista de recombinante hu68 vírus adenoassociado (rAAVhu68), em que cada um dos rAAVhu68 é independentemente selecionado a partir de um rAAV como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16.
18. 18. Composição de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a média rAAVhu68 compreende cerca de 60 proteínas totais do capsídeo em uma proporção de cerca de 1 vpl para 1 a 15 vp2 para cerca de 3 a 10 proteínas vp3.
19. 19. Composição de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizada pelo fato de que o rAAV compreende média de cerca de 60 proteínas totais do capsídeo em uma proporção de cerca de 1 vp1 para 1vp2 para de 3 a 6 proteínas vp3.
20. 20. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizada pelo fato de que as sequências de ITR de AAV são uma ITR 5' e uma ITR 3' de AAV a partir de uma fonte que não seja AAVhu68.
21. 21. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi

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    7/10 cações 17 a 20, caracterizada pelo fato de que a composição é formulada para entrega intratecal e genoma vector compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um produto para administração ao sistema nervoso central.
22. 22. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizada pelo fato de que a composição é formulada para administração intravenosa.
23. 23. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 22, caracterizada pelo fato de que o genoma do vector compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo anti-HER2.
24. 24. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizada pelo fato de que a composição é formulada para entrega intranasal ou intramuscular.
25. 25. Vírus Adenoassociado recombinante (rAAV) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 ou uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 24, caracterizado pelo fato de ser para a entrega de um produto do gene desejado a um sujeito em necessidade do mesmo.
26. 26. Utilização de um AAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 ou uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 24, caracterizada pelo fato de ser para a entrega de um produto do gene desejado a um sujeito em necessidade do mesmo.
27. 27. Sistema de produção de rAAV útil para a produção de um AAVhu68 recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o sistema de produção compreende:

    (A) uma sequência de ácido nucleico do capsídeo AAVhu68 que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

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    8/10 (B) uma molécula de ácido nucleico adequada para a embalagem para o capsídeo AAVhu68, a referida molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos um de AAV de repetição terminal invertida (ITR) e uma sequência de ácido nucleico não-AAV que codifica um produto do gene ligado operativamente a sequências que a expressão direta de o produto em uma célula hospedeira; e (C) funções de AAV rep suficiente e funções do auxiliar para permitir a embalagem da molécula de ácido nucleico para o capsídeo AAVhu68 recombinante.
28. 28. Sistema de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico de (a) compreende, pelo menos, SEQ ID NO: 1, ou uma sequência de pelo menos 70% a pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 1, que codifica o amino sequência de ácido de SEQ ID NO: 2.
29. 29. Sistema de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende ainda, opcionalmente uma sequência de ácido nucleico de cerca de 607 a cerca de nt nt 2211 de SEQ ID NO: 1 que codifica a vp3 AAVhu68 de cerca do aa 203 até cerca do aminoácido 736 de SEQ ID NO: 2.
30. 30. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizado pelo fato de que a cultura de células compreende células de rim embrionário humano 293.
31. 31. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, caracterizado pelo fato de que o rep de AAV é de um AAV diferente.
32. 32. Sistema de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o rep de AAV é de AAV2.
33. 33. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 32, caracterizado pelo fato de que os genes de codificação rep de AAV de sequência e cap estão na mesma molécula de ácido nucleico,

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    9/10 em que existe, opcionalmente, um espaçador entre a sequência de rep e cap do gene.
34. 34. Sistema de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o espaçador é atgacttaaaccaggt SEQ ID NO: 9.
35. 35. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, 33 e 34, caracterizado pelo fato de que o rep de AAV é AAVhu68rep constituído pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, ou um seu fragmento funcional.
36. 36. Sistema de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o rep de AAV é codificado pela sequência de ácido nucléico de SEQ ID NO: 3.
37. 37. Molécula de ácido nucléico caracterizada pelo fato de compreender uma sequência de ácido nucléico que codifica uma proteína Rep AAVhu68 ou um fragmento funcional da mesma sob o controle de sequências de controle reguladoras exógenas que dirigem a respectiva expressão em uma célula hospedeira, em que a proteína Rep tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
38. 38. Método para reduzir a desamidação de um capsídeo AA Vhu68, caracterizado pelo fato de compreender a produção de um capsídeo AAVhu68 a partir de uma sequência de ácido nucléico contendo modificado códons vp AAVhu68, a sequência de ácido nucléico que compreende os códons de glicina modificados independentemente em

    1-3 da arginina - pares de glicina localizado na posição 58, 330, 453 e / ou 513 na SEQ ID nO: 2, de tal modo que o códon modificado codifica um aminoácido diferente de glicina.
39. 39. Método para reduzir a desamidação de um capsídeo AAVhu68, caracterizado pelo fato de compreender a produção de uma cápside AAVhu68 a partir de uma sequência de ácido nucléico contendo modificado códons vp AAVhu68, a sequência de ácido nucléico que compreende códons de arginina modificados independentemente em 1-

    Petição 870190107951, de 24/10/2019, pág. 181/188

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    3 da arginina - glicina pares localizados na posição 57, 329, 452 e I ou 512 na SEQ ID nO: 2, de tal modo que o códon modificado codifica um aminoácido diferente de arginina.
40. 40. Método de acordo com a reivindicação 38 ou 39, caracterizado pelo fato de que cada códon modificado codifica um aminoácido diferente.
41. 41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 ou 39, caracterizado pelo fato de que dois ou mais códons modificados codificam o mesmo aminoácido.
42. 42. Vírus Adenoassociado recombinante rAAVhu68 mutante caracterizado pelo fato de compreender um capsídeo hu68 com desamidação reduzida, em comparação com um capsídeo hu68 não modificado, que é produzido usando o método como definido em qualquer uma das reivindicações 38 a 41.