TW202140781A - 有用於治療gm1神經節苷脂症之組成物 - Google Patents

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Abstract

提供一種有用於治療GM1神經節苷脂症之治療方案，包含投予具有AAV衣殼及載體基因體之重組腺相關病毒(rAAV)載體，該載體基因體包含編碼人類β-半乳糖苷酶的序列。亦提供一種含有rAAV載體之組成物及治療患者中GM1神經節苷脂症之方法，該方法包含rAAV載體之投予。

Description

有用於治療GM1神經節苷脂症之組成物
本發明係關於有用於治療GM1神經節苷脂症之治療方案，包含投予具有AAV衣殼及載體基因體之重組腺相關病毒(rAAV)載體，該載體基因體包含編碼人類β-半乳糖苷酶的序列。亦關於含有rAAV載體之組成物及治療患者中GM1神經節苷脂症之方法，該方法包含rAAV載體之投予。
GM1神經節苷脂症(GM1 gangliosidosis)，下文稱為GM1，為一種由GLB1 基因突變引起的體染色體隱性胞溶體貯積症(autosomal recessive lysosomal storage disease)，該基因編碼胞溶體酸性β-半乳糖苷酶(lysosomal acid beta galactosidase(β-gal))，一種催化GM1神經節甘脂及硫酸角質素(keratan sulfate)的降解之第一步驟的酶(Brunetti-Pierri and Scaglia, 2008, GM1 ganglioside:Review of clinical, molecular, and therapeutic aspects,Molecular Genetics and Metabolism , 94:391-96)。該GLB1 基因位於染色體3並導致兩個交互剪接的mRNAs，一編碼β-gal胞溶體酶之2.5kb轉錄物，及一編碼彈性蛋白結合蛋白(elastin binding protein(EBP))之2.0kb轉錄物(Oshimaet al . 1988,  Cloning, sequencing, and expression of cDNA for human β-galactosidase,Biochemical and Biophysical Research Communications , 157:238-44;Morreauet al . 1989, Alternative splicing of beta-galactosidase mRNA generates the classic lysosomal enzyme and a beta-galactosidase-related protein,Journal of Biological Chemistry , 264:20655-63)。β-gal被合成為85kDa的前驅物，該前驅物被轉譯後糖基化為88kDa的形式並加工成成熟的64kDa胞溶體酶(D'Azzoet al . 1982, Molecular defect in combined beta-galactosidase and neuraminidase deficiency in man,Proceedings of the National Academy of Sciences , 79:4535-39)。於胞溶體中，該酶與保護性蛋白質組織蛋白酶A(protective protein cathepsin A(PPCA))和神經胺酸酶水解酶複合。
於攜帶產生很少或沒有殘留β-gal的GLB1 等位基因的患者中，GM1神經節苷脂蓄積於整個大腦的神經元中，導致快速進行性神經退化性疾病(Brunetti-Pierri and Scaglia 2008)。儘管尚不清楚導致疾病發病機制的分子機制，但假設包括神經元細胞死亡及脫髓鞘，伴隨有嚴重神經元空泡化之區域中的星形膠質細胞增生和小膠質細胞增生、神經元凋亡(Tessitoreet al. 2004, GM1-Ganglioside-Mediated Activation of the Unfolded Protein Response Causes Neuronal Death in a Neurodegenerative Gangliosidosis,Molecular Cell , 15:753-66)、軸突運輸異常導致髓磷脂缺乏(van der Voornet al. 2004, The leukoencephalopathy of infantile GM1 gangliosidosis:oligodendrocytic loss and axonal dysfunction,Acta Neuropathologica , 107:539-45)、擾亂的神經元-寡樹突神經膠質相互作用(Folkerth 1999, Abnormalities of Developing White Matter in Lysosomal Storage Diseases,Journal of Neuropathology and Experimental Neurology , 58:887-902; Kayeet al. 1992, Dysmyelinogenesis in animal model of GM1 gangliosidosis',Pediatric Neurology , 8:255-61)、及炎症反應(Jeyakumaret al. 2003, Central nervous system inflammation is a hallmark of pathogenesis in mouse models of GM1 and GM2 gangliosidosis,Brain , 126:974-87)。
目前並無針對GM1之改善病程進展的治療(disease-modifying therapies)。包括餵食管放置、呼吸治療及抗癲癇藥之支持性照護及對症治療為目前的治療途徑(Jarnes Utzet al. 2017, Infantile gangliosidoses:Mapping a timeline of clinical changes,Molecular Genetics and Metabolism , 121:170-79)。以麥格司他(miglustat)(一種葡苷基神經醯胺(glucosylceramide)合成酶抑制劑)之基質減量療法(Substrate reduction therapy(SRT))，已於GM1及GM2患者中評量。僅管麥格司他通常耐受性良好，但並未導致症狀管理或疾病進展方面的顯著改善，且某些患者會出現劑量限制的胃腸道副作用(Shapiroet al. , 2009, Regieret al. , 2016b)。當與生酮飲食合併使用時，麥格司他已顯示具有良好的耐受性，並於一些患者中增加生存率(Jarnes Utzet al. , 2017)。然而，應注意尚未進行過以麥格司他的隨機對照研究，且麥格司他並未獲批准用於治療GM1神經節苷脂症。於此疾病中，以骨髓或臍帶血的造血幹細胞移植(HSCT)經驗有限。對患有第2型GM1的患者進行的骨髓移植使症狀發作前的幼年型發作GM1-神經節苷脂症患者的白血球β-半乳糖苷酶水平正常化，不會改善長期臨床結果(Shieldet al. , 2005, Bone marrow transplantation correcting β-galactosidase activity does not influence neurological outcome in juvenile GM1-gangliosidosis.Journal of Inherited Metabolic Disease .28(5):797-798.)。HSCT的起效時間緩慢，使其不適合用於快速進展的第1型GM1疾病(Peters and Steward, 2003, Hematopoietic cell transplantation for inherited metabolic diseases:an overview of outcomes and practice guidelines.Bone Marrow Transplantation .31:229.)。腺相關病毒(Adeno-associated virus(AAV))，小病毒科(Parvovirus family)之一員，為具有約4.7千鹼基對(kb)長之單股線狀DNA(ssDNA)基因體的小的無套膜的二十面體病毒。野生型基因體包含於DNA股的兩端的反向末端重複(inverted terminal repeat(ITRs))，及兩個開讀框(open reading frames(ORFs)):rep 及cap 。rep 由四個重疊的基因組成，該等基因編碼AAV生命週期所需的rep蛋白，以及cap 含有衣殼蛋白：VP1、VP2及VP3的重疊核苷酸序列，其自組裝形成二十面體對稱的衣殼。
AAV被指定為依賴病毒(Dependovirus )屬，因為該病毒為作為經純化的腺病毒原種中的污染物而被發現。AAV的生命週期包括潛伏期及感染期，在潛伏期內，AAV基因體在感染後會被定點整合到宿主染色體中，而在感染期內，腺病毒或單純皰疹病毒(herpes simplex virus)感染後，整合的基因體隨後會被搶救、複製並包裝至傳染性病毒中。非致病性、廣泛宿主範圍(包括非分裂細胞)之感染力、及潛在的位點特異性染色體整合之特性使AAV成為有吸引力的基因轉移工具。
期望的是用於治療與異常GLB1 基因相關的病症的替代療法。
提供一種治療性重組的複製缺陷的腺相關病毒(rAAV)，其有用於有需要的人類患者中治療及/或減輕與GM1神經節苷脂症相關的症狀。該rAAV理想地係複製缺陷的且攜帶一載體基因體，該載體基因體包含於指導其在標靶的人類細胞中表現的調節序列的控制下編碼人類(h)β-半乳糖苷酶的GLB1 基因，如本文所使用，可被稱為rAAV.GLB1。於某些具體實施例，rAAV包含AAVhu68衣殼。本文中此rAAV被稱為rAAVhu68.GLB1，但於某些情形，術語rAAVhu68.GLB1載體、rAAVhu68.hGLB1、rAAVhu68.hGLB1載體、AAVhu68.GLB1、或AAVhu68.GLB1載體可交替使用而指相同構築體。
於一態樣，於此提供一種有用於人類患者中治療GM1神經節苷脂症之治療方案，其中該方案包含投予具有AAV衣殼及載體基因體之重組腺相關病毒(rAAV)載體，該載體基因體包含於引導其在標靶細胞中表現的調節序列的控制下編碼人類β-半乳糖苷酶的序列，該投予包含單劑之腦大池內(ICM)注射，該單劑包含：(i)約1.6x1013 至約1.6x1014 GC，其中該患者為約1個月至約4個月齡；(ii)約2.1x1013 至約2.1x1014 GC，其中該患者為至少4個月齡至低於8個月齡；(iii)約2.6x1013 至約2.6x1014 GC，其中該患者為至少8個月齡至高至12個月齡；或(iv)約3.2x1013 至約3.2x1014 GC，其中該患者為至少12個月齡。於某些具體實施例，該人類β-半乳糖苷酶編碼序列包含記載於SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：5之核苷酸序列，或與SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：5之任一者至少95%相同的序列，該序列編碼SEQ ID NO：4之胺基酸24至677的成熟β-半乳糖苷酶。於某些具體實施例，該經編碼的人類β-半乳糖苷酶具有選自下列之序列：(a)SEQ ID NO：4之約胺基酸1至677；及(b)合成的人類酶，包含融合至SEQ ID NO：4之約胺基酸24至677的異源引導子序列。於另外的具體實施例，該載體基因體亦包含5’反向末端重複(ITR)序列、衍生自人類泛素C(UbC)啟動子的調節元件、嵌合內含子、polyA訊號、及/或3’ITR序列。於某些具體實施例，該患者已被鑑定為具有第1型(嬰幼期)GM1或第2a型(嬰幼晚期)GM1。於某些具體實施例，該方案包含在遞送rAAV的至少前一天或當天，對該患者實施至少一種免疫抑制協同療法(immunosuppressive co-therapy)。該免疫抑制協同療法可包括一或多種皮質類固醇，可選擇地為口服去氫皮質醇(prednisolone)。於某些具體實施例，投予rAAV後，免疫抑制協同療法持續至少3至4週。於某些具體實施例，藉由延緩癲癇發作、降低癲癇發作頻率、血清及/或腦脊髓液中的β-半乳糖苷酶、以及藉由核磁共振造影(MRI)測量的腦組織的體積變化中的一種或多種而評估治療的療效。
於一態樣，於此提供一種包含重組AAV(rAAV)載體之組成物，該rAAV載體包含AAV衣殼及載體基因體，該載體基因體包含人類β-半乳糖苷酶編碼序列及引導其在標靶細胞中表現的表現控制序列，其中該rAAV載體被調配成用於腦大池內(ICM)注射至需要其之人類對象，以投予下列劑量：(i)約1.6x1013 至約1.6x1014 GC，其中該患者為約1個月至約4個月齡；(ii)約2.1x1013 至約2.1x1014 GC，其中該患者為至少4個月齡至低於8個月齡；(iii)約2.6x1013 至約2.6x1014 GC，其中該患者為至少8個月齡至高至12個月齡；或(iv)約3.2x1013 至約3.2x1014 GC，其中該患者為至少12個月齡。於某些具體實施例，該人類β-半乳糖苷酶編碼序列包含記載於SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：5之核苷酸序列，或與SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：5之任一者至少95%相同的序列，該序列編碼SEQ ID NO：4之胺基酸24至677的成熟β-半乳糖苷酶。於另外的具體實施例，該載體基因體亦包含5’反向末端重複(ITR)序列、衍生自人類泛素C(UbC)啟動子的調節元件、嵌合內含子、polyA訊號、及/或3’ITR序列。於某些具體實施例，該rAAV被調配成懸浮液以遞送每公克腦質量3.33x1010 GC至每公克腦質量3.33x1011 GC，可選擇地其中該投予的劑量的體積為約3.0mL至約5.0mL。於某些具體實施例，該rAAV係於具有pH為6至9之調配緩衝液中，可選擇地其中該pH為約7.2。於某些具體實施例，該組成物係用於協同療法之使用，該協同療法包含在遞送rAAV的至少前一天或當天投予至少一種免疫抑制劑至患者。該免疫抑制劑可為皮質類固醇，可選擇地為經口服遞送去氫皮質醇。
於一態樣，於此提供一種治療罹患GM1神經節苷脂症的患者之方法，該方法包含藉由腦大池內(ICM)注射而投予單劑之重組腺相關病毒(rAAV)至患者，其中該rAAV包含AAV衣殼及載體基因體，該載體基因體包含於引導其在標靶細胞中表現的調節序列的控制下編碼人類β-半乳糖苷酶的序列，且其中該單劑為該患者每公克估算腦質量1x1010 GC至3.4x1011 GC。於某些具體實施例，該患者在18個月齡或之前有GM1症狀的發作。於某些具體實施例，該患者在6個月齡或之前有GM1症狀的發作。於某些具體實施例，該患者在6至18個月齡有GM1症狀的發作。於某些具體實施例，該患者具有第1型(嬰幼期)GM1。於其它具體實施例，該患者具有第2a型(嬰幼晚期)GM1。於某些具體實施例，對象為至少4個月齡；4至36個月齡；4至24個月齡；6至36個月齡；6至24個月齡；12至36個月齡；或12至24個月齡。於某些具體實施例，該單劑為該患者之每公克估算腦質量3.3x1010 GC。於某些具體實施例，該單劑為2.1x1013 至2.5x1013 GC之rAAV或2.6x1013 至3.1x1013 GC之rAAV。於某些具體實施例，該單劑為3.2x1013 至4.5x1013 GC之rAAV。於某些具體實施例，該單劑為該患者之每公克估算腦質量1.11x1011 GC。於某些具體實施例，該單劑為6.8x1013 至8.6x1013 GC之rAAV；8.7x1013 至0.9x1014 GC之rAAV；或1.0x1014 至1.5x1014 GC之rAAV。於某些具體實施例，該患者為4至8個月齡，且該單劑為2.1x1013 GC之rAAV。於某些具體實施例，該患者為4至8個月齡，且該單劑為6.8x1013 GC之rAAV。於某些具體實施例，該患者為8至12個月齡，且該單劑為2.6x1013 GC之rAAV。於某些具體實施例，該患者為8至12個月齡，且該單劑為8.7x1013 GC之rAAV。於某些具體實施例，該患者為至少12個月齡，且該單劑為3.2x1013 GC之rAAV。於某些具體實施例，該患者為至少12個月齡，且該單劑為1.0x1014 GC之rAAV。於某些具體實施例，該方法進一步包含造血幹細胞移植之步驟。於某些具體實施例，該方法進一步包含投予類固醇至患者之步驟。該類固醇可為皮質類固醇。於某些具體實施例，該方法包含每日投予類固醇至少21日。於某些具體實施例，該方法包含每日投予類固醇30日。於某些具體實施例，該載體基因體包括編碼人類β-半乳糖苷酶之序列，該序列包含記載於SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：5之核苷酸序列，或與SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：5之任一者至少95%相同的序列，該序列編碼SEQ ID NO：4之胺基酸24至677的成熟β-半乳糖苷酶。人類β-半乳糖苷酶具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列或其功能性片段。於某些具體實施例，載體基因體具有選自下列之序列：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15。於某些具體實施例，其中該載體基因體具有與SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15至少95%相同的序列。於某些具體實施例，該載體基因體進一步包含5’反向末端重複(ITR)序列、衍生自人類泛素C(UbC)啟動子的調節元件、嵌合內含子、polyA訊號、及/或3’ITR序列。
於一態樣，於此提供一種為單位劑型之醫藥組成物，其在緩衝液中包含1x1013 GC至5x1014 之重組腺相關病毒(rAAV)載體，其中該rAAV包含AAV衣殼及載體基因體，該載體基因體包含於引導其在標靶細胞中表現的調節序列的控制下編碼人類β-半乳糖苷酶的序列。於某些具體實施例，該組成物被調配用於腦大池內(ICM)注射。於某些具體實施例，緩衝液包含磷酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、及泊洛沙姆(poloxamer)188。於另外的具體實施例，緩衝液包含1mM磷酸鈉、150mM氯化鈉、3mM氯化鉀、1.4mM氯化鈣、0.8mM氯化鎂、及0.001%泊洛沙姆188。於某些具體實施例，組成物包含2.1x1013 至2.5x1013 GC之rAAV；2.6x1013 至3.1x1013 GC之rAAV；3.2x1013 至4.5x1013 GC之rAAV；6.8x1013 至8.6x1013 GC之rAAV；8.7x1013 至0.9x1014 GC之rAAV；或1.0x1014 至1.5x1014 GC之rAAV。提供之醫藥組成物包括具有載體基因體之rAAV，該載體基因體具有編碼人類β-半乳糖苷酶之序列，該編碼人類β-半乳糖苷酶之序列包含記載於SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：5之核苷酸序列，或與SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：5之任一者至少95%相同的序列，該序列編碼SEQ ID NO：4之胺基酸24至677的成熟β-半乳糖苷酶。於某些具體實施例，人類β-半乳糖苷酶具有SEQ ID NO：4 之胺基酸序列或其功能性片段。於某些具體實施例，載體基因體具有選自SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15的序列。於某些具體實施例，載體基因體具有與SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15至少95%相同的序列。於某些具體實施例，該載體基因體包含5’反向末端重複(ITR)序列、衍生自人類泛素C(UbC)啟動子的調節元件、嵌合內含子、polyA訊號、及/或3’ITR序列。
由以下本發明之詳細說明，本發明之此等及其它態樣將為顯而易見。
本文提供用於治療GM1神經節苷脂症(GM1)之基於腺相關病毒(AAV)的組成物及方法。將有效量的重組AAV(rAAV)的基因體拷貝(GC)遞送至患者，該重組AAV具有AAVhu68衣殼並帶有載體基因體，該載體基因體具編碼人類β-半乳糖苷酶酶(rAAVhu68.GLB1)的正常GLB1 基因。理想地，此rAAVhu68.GLB1係以水性緩衝液調配。於某些具體實施例，懸浮液適合鞘內注射。於某些具體實施例，rAAVhu68.GLB1為AAVhu68.UbC.GLB1(亦稱為AAVhu68.UbC.hGLB1)，其中GLB1 基因(即，β-半乳糖苷酶(如本文所使用，亦稱為GLB1酶、β-gal、或半乳糖苷酶)編碼序列)係於調節序列的控制下，該調節序列包括衍生自人類泛素C(UbC)的啟動子。於某些具體實施例，經由腦大池內注射(ICM)注射遞送此組成物。
編碼演化枝F腺相關病毒的衣殼的核酸序列，在本文中稱為AAVhu68，被用於產生AAVhu68衣殼和攜帶載體基因體的重組AAV(rAAV)。如本文所使用，術語「載體基因體」係指被包裝於病毒衣殼(例如，AAV衣殼)中的核酸分子，且能夠被遞送至宿主細胞或患者中的細胞。於某些具體實施例，載體基因體為具有將載體基因體包裝到5'和3'末端的AAV衣殼中所必需的反向末端重複(ITR)序列以及在它們之間包含如本文所述的GLB1 基因的表現匣，該基因可操作地連接至指導其表現的序列。與AAVhu68有關的其它細節被提供於WO 2018/160582(其藉由引用整體併入本文)及此詳細說明中。本文所述rAAVhu68.GLB1非常適合用於將包含GLB1基因的載體基因體遞送至中樞神經系統(CNS)內的細胞，包括腦、海馬迴、運動皮質、小腦、及運動神經元。此等rAAVhu68.GLB1可用於標靶CNS及某些其它組織中的其它細胞及CNS外部的其它細胞。或者，AAVhu68衣殼可被另外的衣殼替換，該另外的衣殼亦適合遞送載體基因體至CNS，例如，AAVcy02、AAV8、AAVrh43、AAV9、AAVrh08、AAVrh10、AAVbb01、AAVhu37、AAVrh20、AAVrh39、AAV1、AAVhu48、AAVcy05、AAVhu11、AAVhu32、或AAVpi02。
I.GM1 及治療性 GLB1 基因 GM1神經節苷脂症(即，GM1)基於臨床表現型，可被分類成三種型式：(1)第1型或嬰幼期型，出生至6個月發病，到1-2歲為止快速地進展低張症、嚴重中樞神經系統(CNS)退化及死亡；(2)第2型嬰幼晚期或幼年型，7月齡至3歲發病，運動及認知發展遲滯，且較緩慢的進展；及(3)第3型成人或慢性的變型，晚發作(3–30年)，由於醣神經鞘脂質(glycosphingolipid)在尾核(caudate nucleus)中局部沉積而導致進行性錐體束外疾病(extrapyramidal disorder)(Brunetti-Pierri and Scaglia, 2008.GM1 gangliosidosis:Review of clinical, molecular, and therapeutic aspects,Molecular Genetics and Metabolism , 94:391-96)。具有6月齡之前症狀發作的嬰幼期GM1對象一致地表現出運動及認知損傷的快速和可預測的進展。大多數患者在生命的最初幾年內死亡(中位數存活為46個月，Jarnes Utz et al., 2017)。儘管有共同的潛在病理生理學，但成人(第3型)GM1表現型為變動的，疾病病程明顯較輕。大多數3型GM1型患者首先在兒童晚期出現神經系統症狀，成年後幾乎沒有進展。
各種型式的嚴重度與GLB1基因所編碼的β-半乳糖苷酶酶的殘留活性為逆相關(Brunetti-Pierri and Scaglia, 2008)。已於人類中鑑定出超過130種致病性GLB1 突變(Hoferet al. , 2010, Phenotype determining alleles in GM1 gangliosidosis patients bearing novelGLB1 mutations.Clinical Genetics .78(3):236-246；及Caciottiet al. , 2011, M1 gangliosidosis and Morquio B disease:An update on genetic alterations and clinical findings.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Molecular Basis of Disease. 1812(7):782-790.)。儘管已經對許多GLB1突變進行遺傳及生物化學分析，並與臨床表型相關(Gururajet al. , 2005, Magnetic Resonance Imaging Findings and Novel Mutations in GM1 Gangliosidosis.Journal of Child Neurology .20(1):57-60；Caciottiet al. , 2011；and Sperbet al. , 2013, Genotypic and phenotypic characterization of Brazilian patients with GM1 Gangliosidosis.Gene. 512(1):113-116)，許多GLB1 突變仍未被鑑定。廣義來說，患者的基因型會導致不同量的殘留的酶活性，但一般而言，殘留的酶活性越高，則表現型為越不嚴重(Ouet al. , 2018, SAAMP 2.0:An algorithm to predict genotype‐phenotype correlation of lysosomal storage diseases.Clinical Genetics .93(5):1008-1014.)。GM1的診斷藉由β-gal及神經胺酸酶的生化測定及/或藉由GLB1分子分析而被證實。然而，在預測受影響個體的臨床表現時，對於基因型-表現型相關性之使用有限制，因為殘留的酶活性本身無法預測由GLB1基因突變引起的疾病亞型(Hoferet al ., 2010, Caciottiet al ., 2011, Ouet al ., 2018)。該預測值最適合帶有兩個嚴重突變(即不顯示GLB1酶活性的突變)的個體，其通常呈現嚴重的早期發作表現型(Caciottiet al ., 2011, Sperbet al ., 2013)。儘管手足一致性的數據很少，但依據發病時間和主要的疾病表現方面，表明幼期GM1的手足的臨床病程相似(Gururajet al ., 2005)。
本文提供的基因治療載體，即，rAAV.GLB1(例如，rAAVhu68.GLB1、rAAVhu68.UbC.GLB1)、或含其之組成物，有用於治療與功能性β-半乳糖苷酶的正常水平缺乏相關的疾病。如本文所使用，基因治療載體指如本文所述之rAAV，其適合於治療患者中的使用。於某些具體實施例，本文提供的基因治療載體或組成物有用於治療第1型GM1。於某些具體實施例，本文提供的基因治療載體或組成物有用於治療第2型GM1。於某些具體實施例，本文提供的基因治療載體或組成物有用於治療第3型GM1。於某些具體實施例，本文提供的基因治療載體或組成物有用於治療第1型及第2型GM1。於某些具體實施例，本文提供的基因治療載體或組成物有用於治療GM1患者，其為18個月齡或以下。於某些具體實施例，本文提供的基因治療載體或組成物有用於治療第1型及第2型GM1。於某些具體實施例，本文提供的基因治療載體或組成物有用於治療GM1患者，其為36個月齡或以下。於某些具體實施例，本文提供的基因治療載體或組成物有用於治療不包括第3型的GM1。於某些具體實施例，本文提供的基因治療載體或組成物有用於治療與功能性β-半乳糖苷酶的正常水平缺乏相關的神經病況。於某些具體實施例，本文提供的基因治療載體或組成物有用於改善與GM1神經節苷脂症有關的症狀。於某些具體實施例，本文提供的基因治療載體或組成物有用於改善與GM1神經節苷脂症有關的神經症狀。
於某些具體實施例，患者具有嬰幼期神經節苷脂症且為18個月齡或以下。於某些具體實施例，接受rAAV.GLB1之患者為1至18個月齡。於某些具體實施例，接受rAAV.GLB1之患者為4至18個月齡。於某些具體實施例，嬰兒為4個月齡以下。於某些具體實施例，接受rAAV.GLB1之患者為約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、或約18個月齡。於某些具體實施例，患者為學步兒，例如，18個月齡至3歲。於某些具體實施例，接受rAAV.GLB1之患者為3歲至6歲、3歲至12歲、3歲至18歲、3歲至30歲。於某些具體實施例，患者為大於18歲。
於某些具體實施例，治療後觀察到與GM1神經節苷脂症有關的症狀之改善，例如，增加壽命(存活)；減少對餵食管的需求；減少癲癇發病、頻率、及長度、延遲癲癇發作；改善生活品質，例如，如以PedsQL測量；向神經認知功能衰退的進展減少及/或神經認知發育的改善，例如，改善適應行為、認知、語言(感受及表達溝通)、及運動功能(一般動作、精細動作)的發展或增進，如以貝萊嬰幼兒與學步兒發展量表，第3版(BSID-III)及文蘭適應行為量表(Vineland Adaptive Behavior Scales)，第2版(Vineland-II)測量；運動里程碑的成就年齡較早，而損失年齡則較晚；較早的成就年齡，較遲的運動里程碑年齡；延緩腦組織體積(大腦皮質和其他較小結構)和心室體積的增加、延緩腦結構(包括胼胝體(corpus callosum)、尾狀核(caudate)和殼核(putamen)以及小腦皮質)的大小減小、以及腦萎縮和體積變化的穩定；視丘和基底神經節中異常T1/T2訊號強度的延遲發展；CSF及血清中的β-gal酶活性增加；CSF GM1神經節甘脂濃度的減少；血清及/或尿硫酸角質素水平的減少、降低的己醣胺酶(hexosaminidase)活性；減少腦中的炎症反應；延遲的異常的肝臟及脾臟體積；延遲的異常的EEG及視覺誘發電位(VEP)；及/或吞嚥困難、步態功能、運動技能、語言及/或呼吸功能的改善。
於某些具體實施例，患者在注射rAAV.GLB1後接受一種協同療法，沒有本文所述的AAV治療，他們沒有資格接受協同療法。此種協同療法可包括酶替代療法(enzyme replacement therapy)、基質減量療法(substrate reduction therapy)(例如，與麥格司他(OGT 918，N-丁基-去氧野尻黴素(N-butyl-deoxynojirimycin))、tanganil(乙醯基-DL-白胺酸)治療、呼吸療法、餵食管使用、抗癲癇藥物)、或以骨髓或臍帶血的造血幹細胞移植(HSCT)。
可選擇地，免疫抑制協同療法可用於有需要的對象中。用於此種協同療法之免疫抑制劑包括，但未限於，糖皮質素、類固醇、抗代謝物、T-細胞抑制劑、巨環內酯(macrolide)(例如， 雷帕黴素(rapamycin)或rapalog)、及細胞生長抑制劑(cytostatic agent)，包括烷化劑、抗代謝物、細胞毒性抗生素、抗體、或對親免素(immunophilin)有活性的藥劑。免疫抑制劑可包括氮芥(nitrogen mustard)、亞硝脲(nitrosourea)、鉑化合物、胺甲喋呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azathioprine)、巰嘌呤(mercaptopurine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、放線菌素(dactinomycin)、蒽環類(anthracycline)、絲裂黴素C(mitomycin C)、博來黴素(bleomycin)、光輝黴素(mithramycin)、IL-受體-(CD25-)或CD3-導向的抗體、抗IL-2抗體、環孢素(ciclosporin)、他克莫司(tacrolimus)、西羅莫司(sirolimus)、IFN-β、IFN-γ、類鴉片(opioid)、或TNF-α(腫瘤壞死因子-α)結合劑。於某些具體實施例，免疫抑制療法可於rAAV.GLB1投予前或後的0、1、2、3、4、5、6、7或以上的日數開始。此種免疫抑制療法可涉及一、二或多種藥物的投予(例如， 糖皮質素、去氫皮質醇、嗎替麥考酚酯(mycophenolate mofetil)(MMF)及/或西羅莫司(即， 雷帕黴素))。能以相同劑量或調整的劑量向需要的患者/對象投予一次、兩次或多次此種免疫抑制藥。此種療法可涉及於相同日之二或多種藥物的共同投予(例如， 去氫皮質醇、嗎替麥考酚酯(MMF)及/或西羅莫司(即， 雷帕黴素))。於rAAV.GLB1投予後能以相同劑量或調整劑量繼續使用其中一種或多種藥物。根據需要，此種治療可持續約1週(7日)、約60日或更長時間。於某些具體實施例，選擇無他克莫司方案。
於某些具體實施例，如本文提供的「有效量」之rAAV.GLB1(例如，rAAV.GLB1、rAAV.UbC.GLB1)為達到與GM1神經節病相關的症狀減輕的量。於某些具體實施例，如本文提供的「有效量」之rAAV.GLB1係達到以下一個或多個終點的量：腦脊髓液(CSF)中β-gal藥效學及生物活性的增加、血清中β-gal藥效學及生物學活性增加、增加患者的平均壽命(生存期)、延緩GM1神經節苷脂症之疾病進展(藉由成就年齡、喪失年齡以及患者維持或獲得適合年齡的發展和運動里程碑的百分比來評估)、及基於下列一或多種的改變之神經認知發展的改進：年齡等效認知、一般動作、精細動作、嬰幼兒與學步兒發展的貝萊尺度的接受和表達溝通分數(BSID，例如，BSID第三版(BSID-III))、文蘭適應行為量表每一項的標準分數中的改變。對於較大的兒童和成年人，於一些具體實施例如本文提供的「有效量」之rAAV.GLB1可為改善吞嚥困難、步態功能、運動技能、語言及/或呼吸功能，文蘭適應行為量表第二版(Vineland-II)每一項的標準分數中的改變、降低癲癇發作的頻率及癲癇發作的年齡、提高24個月齡時餵食管獨立的可能性。世界衛生組織(WHO)提供適合年齡的發展和運動里程碑之例。參見，例如， Wijnhoven T.M.,et al. (2004).Assessment of gross motor development in the WHO Multicentre Growth Reference Study.Food Nutr Bull .25(1 Suppl):S37-45，以及下表。於某些具體實施例，如本文提供之「有效量」之rAAV.GLB1(諸如rAAVhu68、GLB1)為達成rAAV.GLB1對CSF和血清β-半乳糖苷活性、CSF GM1濃度以及血清和尿硫酸角質素的藥效作用的量；腦部MRI改變；監測肝臟和脾臟體積；監測EEG和視覺誘發電位(VEP)。
一般動作里程碑 多中心生長參考研究表現規範 (Multicenter Growth Reference Study Performance Criteria)
無支撐坐立 兒童直立坐著，頭部直立至少10秒鐘。兒童不使用手臂或手來平衡身體或支撐姿勢。
手膝爬行 兒童交替地前後移動手和膝蓋。腹部不接觸到支撐表面。有持續且連續的動作，至少連續三個。
輔助下站立 兒童雙腳以直立姿勢站立，以雙手托住一穩定物體(例如，家具)而不靠在上面。身體不碰到穩定的物體，且腿支撐著大部分體重。兒童如此在幫助下站立至少10秒鐘。
輔助下行走 兒童處於直立的姿勢，背部挺直。兒童用兩手之一隻手握住一穩定物體(例如，家具)向側邊或前方進行邁步。一隻腿向前移動，而另一隻腿支撐部分體重。兒童以此方式取得至少五步。
獨自站立 兒童以雙足(不是腳趾)直立姿勢站立，背部挺直。雙腿支撐兒童100%體重。沒有與人或物體的接觸。兒童獨自站立至少10秒鐘。
獨自行走 兒童在直立姿勢背部挺直下，至少要獨立走五步。一條腿向前移動，另一條腿支撐大部分體重。沒有與人或物體的接觸。
改編自(Wijnhoven et al., 2004, Assessment of gross motor development in the WHO Multicentre Growth Reference Study." Food Nutr Bull. 25(1 Suppl):S37-45)。縮寫：WHO，世界衛生組織。
本文描述的rAAV.GLB1、及包含其之組成物，含有GLB1 基因(即， β-gal編碼序列)，其編碼及表現人類β-半乳糖苷酶(其亦可稱為正常β-半乳糖苷酶)或其功能片段。GLB1酶催化β-半乳糖苷水解成單醣。人類β-半乳糖苷酶之胺基酸序列(2034 bp，677 aa，Genbank #AAA51819.1, EC3.2.1.23)於本文被再現為SEQ ID NO：4，其亦被認可為β-半乳糖苷酶，同功型1。參見，例如，UniProtKB-P16278(BGAL_HUMAN)。於某些具體實施例，GLB1酶可具有SEQ ID NO：4之胺基酸24至胺基酸677之序列(即，無訊號肽的成熟GLB1酶)。於某些具體實施例，GLB1酶可具有SEQ ID NO：4之胺基酸31至胺基酸677之序列(即，β-半乳糖苷酶，同功型3)。於某些具體實施例，GLB1酶為同功型2，具有SEQ ID NO：26的胺基酸序列。保留全長β-半乳糖苷酶功能的任何片段可由本文所述的GLB1基因編碼，並被稱為「功能片段」。例如，β-半乳糖苷酶之功能片段可具有全長β-半乳糖苷酶之至少約25%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或以上之活性(即， 正常GLB1酶，其可為具有SEQ ID NO：4之胺基酸24至胺基酸677的β-半乳糖苷酶，或三個同功型之任一者)。評估β-半乳糖苷酶活性的方法可於實施例以及出版物中發現。參見，例如，Radoslaw Kwapiszewski, Determination of Acid β-Galactosidase Activity:Methodology and Perspectives.Indian J Clin Biochem.2014 Jan；29(1):57-62。於某些具體實施例，功能片段為一經截短的β-半乳糖苷酶，其於全長β-半乳糖苷酶之N端及/或C端中缺少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或以上個胺基酸。於某些具體實施例，與全長β-半乳糖苷酶比較，功能片段含有約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或以上個保留型胺基酸取代。如本文所使用，保留型胺基酸取代為蛋白質中的胺基酸替換，其改變給定的胺基酸成具有相似生化性質(例如，電荷、疏水性及大小)的不同胺基酸。
於一具體實施例，GLB1 基因具有SEQ ID NO：5的序列。於某些具體實施例，GLB1 基因被工程化成具有SEQ ID NO：6的序列。於某些具體實施例，GLB1 基因被工程化成具有SEQ ID NO：7的序列。於某些具體實施例，GLB1 基因被工程化成具有SEQ ID NO：8的序列。於某些具體實施例，GLB1 基因被工程化成具有與SEQ ID NO：6至少95%至99.9%相同的序列。於某些具體實施例，GLB1基因被工程化成具有與SEQ ID NO：6至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或至少約99.9%相同的序列。於某些具體實施例，GLB1基因被工程化成具有與SEQ ID NO：7至少95%至99.9%相同的序列。於某些具體實施例，GLB1 基因被工程化成具有與SEQ ID NO：7至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或至少約99.9%相同的序列。於某些具體實施例，GLB1 基因被工程化成具有與SEQ ID NO：8至少95%至99.9%相同的序列。於某些具體實施例，GLB1 基因被工程化成具有與SEQ ID NO：8至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或至少約99.9%相同的序列。於另一具體實施例，經工程化序列編碼全長β-半乳糖苷酶或其功能片段。於又另一具體實施例，經工程化序列編碼SEQ ID NO：4之胺基酸24至胺基酸677或其功能性片段。於另一具體實施例，經工程化序列編碼SEQ ID NO：4之胺基酸序列或其功能性片段。
於某些具體實施例，GLB1基因編碼β-半乳糖苷酶，其包含訊號(引導子)肽及GLB1成熟蛋白質，SEQ ID NO：4之胺基酸24至677。引導子序列較佳為人類來源或人類引導子序列衍生物，且長度為約15至約28個胺基酸，較佳為約20至25個胺基酸、或約23個胺基酸。於某些具體實施例，訊號肽為天然訊號肽(SEQ ID NO：4之胺基酸1至23)。於某些具體實施例，GLB1酶於天然引導子序列(SEQ ID NO：4之胺基酸1-23)上包含外源的引導子序列。於另一具體實施例，引導子可來自人類IL2或變異的引導子。於另一具體實施例，人類serpinF1分泌訊號可用於作為引導子肽。
II.AAV hu68
AAVhu68(先前稱為AAV3G2)與另一演化支(clade)F病毒AAV9的區別為位於vp1之位置67及157的兩個經編碼的胺基酸，基於SEQ ID NO：2。相反地，另一演化支F AAV(AAV9、hu31、hu31)於位置67具有Ala且於位置157具有Ala。提供新穎AAVhu68衣殼及/或經工程化AAV衣殼，其基於SEQ ID NO：2之編號，於位置157具有纈胺酸(Val或V)且可選擇地，基於SEQ ID NO：2之編號，於位置67具有麩胺酸(Glu或E)。
如本文所使用，與AAV的群組有關的術語「演化支」係指在系統發生學上彼此相關的一群AAV，基於AAV vp1胺基酸序列比對而確定，如使用近鄰相接演算法(Neighbor-Joining algorithm)通過至少75%(至少1000次重複)的獨立運算值及泊松校正距離(Poisson correction distance)測量值不超過0.05。於文獻中已描述近鄰相接演算法。參見，例如， M. Nei and S. Kumar,Molecular Evolution and Phylogenetics (Oxford University Press, New York(2000)。可用於執行此演算法的電腦程式係可取得。例如，the MEGA v2.1程式執行修飾的Nei-Gojobori法。使用此等技術及電腦程式，及AAV vp1衣殼蛋白之序列，本項技術領域中具通常知識者可容易地確定所選擇的AAV係包含於本文鑑別的一個演化支中、另一個演化支中、或是於此等演化支之外。參見，例如， G Gao,et al, J Virol , 2004 Jun；78(10):6381-6388，其鑑別演化支A、B、C、D、E及F，並提供新穎AAV之核酸序列，GenBank登錄號AY530553至AY530629。亦參見WO 2005/033321。
於某些具體實施例，衣殼藉由一或多個下列各者而進一步被表徵。AAVhu68衣殼蛋白包含：由編碼SEQ ID NO：2之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現所產生之AAVhu68 vp1蛋白、由SEQ ID NO：1所產生的vp1蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：2之1至736之預測的胺基酸序列的SEQ ID NO：1至少70%相同的核酸序列所產生的vp1蛋白；由編碼SEQ ID NO：2之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現所產生之AAVhu68 vp2蛋白、由包含SEQ ID NO：1之至少核苷酸412至2211的序列所產生的vp2蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：2之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的SEQ ID NO：1之至少核苷酸412至2211至少70%相同的核酸序列所產生的vp2蛋白；及/或由編碼SEQ ID NO：2之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現所產生之AAVhu68 vp3蛋白、由包含SEQ ID NO：1之至少核苷酸607至2211的序列所產生的vp3蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：2之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的SEQ ID NO：1之至少核苷酸607至2211至少70%相同的核酸序列所產生的vp3蛋白。
AAVhu68 vp1、vp2及vp3蛋白一般表現為由編碼全長vp1胺基酸序列(胺基酸1至736)的相同核酸序列所編碼的選擇性剪接(alternative splice)突變體。可選擇地，單獨使用vp1編碼序列來表現vp1、vp2及vp3蛋白。或者，此序列可與一個或多個核酸序列共表現，該核酸序列編碼AAVhu68 vp3胺基酸序列(約aa 203至736)而不具有vp1-獨特區域(約aa 1至約aa137)及/或vp2-獨特區域(約aa 1至約aa 202)，或其互補股，對應的mRNA或tRNA(例如，轉錄自SEQ ID NO：1之約核苷酸(nt)607至約nt 2211的mRNA)、或與編碼SEQ ID NO：2之aa 203至736的SEQ ID NO：1至少70%至至少99%(例如， 至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%)相同的序列。另外或替代地，vp1-編碼及/或vp2-編碼序列可與核酸序列共表現，該核酸序列編碼不具有vp1-獨特區域(約aa 1至約137)的SEQ ID NO：2之AAVhu68 vp2胺基酸序列(約aa 138至736)、或其互補股、對應的mRNA或tRNA(例如，轉錄自SEQ ID NO：1之nt 412至2211的mRNA)，或與編碼SEQ ID NO：2之約aa 138至736的SEQ ID NO：1至少70%至至少99%(例如， 至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%)相同的序列。
如本文所述，rAAVhu68具有在生產系統中所生產的rAAVhu68衣殼，該衣殼表現自AAVhu68核酸序列，該核酸編碼SEQ ID NO：2之vp1胺基酸序列，及可選擇的額外核酸序列，例如，編碼不含vp1及/或vp2獨特區域的vp3蛋白。使用單個核酸序列vp1產生的結果產生的rAAVhu68產生vp1蛋白、vp2蛋白及vp3蛋白的異源群體。更特別地，AAVhu68衣殼含有vp1蛋白內、vp2蛋白內和vp3蛋白內的亞群，它們具有來自SEQ ID NO：2中預測的胺基酸殘基。此等亞群至少包括去醯胺的天冬醯胺酸(N或Asn)殘基。例如，天冬醯胺酸-甘胺酸對中的天冬醯胺酸被高度去醯胺。
於一具體實施例，AAVhu68 vp1核酸序列具有SEQ ID NO：1之序列，或與其互補的股，例如，對應的mRNA或tRNA。於某些具體實施例，vp2及/或vp3蛋白可被額外地或替代地從不同於vp1的核酸序列表現，例如，以改變所選擇的表現系統中vp蛋白的比例。於某些具體實施例，亦提供編碼不具有vp1-獨特區域(約aa 1至約aa 137)及/或vp2-獨特區域(約aa 1至約aa 202)的SEQ ID NO：2之AAVhu68 vp3胺基酸序列(約aa 203至736)之核酸序列、或與其互補的股，對應的mRNA或tRNA(SEQ ID NO：1之約nt 607至約nt 2211)。於某些具體實施例，亦提供編碼不具有vp1-獨特區域(約aa 1至約137)的SEQ ID NO：2之AAVhu68 vp2胺基酸序列(約aa 138至736)之核酸序列、或其互補股、對應的mRNA或tRNA(SEQ ID NO：1之nt 412至2211)。
然而，可選擇編碼SEQ ID NO：2之胺基酸序列的其它核酸序列用於生產rAAVhu68衣殼。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：1之核酸序列、或與編碼SEQ ID NO：2的SEQ ID NO：1至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%相同的序列。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：1之核酸序列、或與編碼SEQ ID NO:2之vp2衣殼蛋白(約aa 138至736)的SEQ ID NO：1之約nt 412至約nt 2211至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%相同的序列。於某些具體實施例，該核酸序列具有SEQ ID NO：1之約nt 607至約nt 2211的核酸序列、或與編碼SEQ ID NO：2之vp3衣殼蛋白(約aa 203至736)的SEQ ID NO：1之nt 607至約nt 2211至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%相同的序列。
設計編碼此AAVhu68衣殼的核酸序列(包括DNA(基因體或cDNA)或RNA(例如mRNA))係於本領域技術範圍內。於某些具體實施例，編碼AAVhu68 vp1衣殼蛋白之核酸序列係被提供於SEQ ID NO：1。亦參見，圖11A-11E。於其它具體實施例，可選擇與SEQ ID NO：1有70%至99.9%相同的核酸序列以表現AAVhu68衣殼蛋白。於某些其它具體實施例，該核酸序列為與SEQ ID NO：1至少約75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少97%相同、或至少99%至99.9%相同。可藉由各種方法設計在所選系統(即細胞類型)中表現用的此種可進行密碼子優化的核酸序列。可使用可於線上取得的方法(例如，GeneArt)、公開的方法或提供密碼子優化服務的公司(例如，DNA2.0(Menlo Park, CA))而進行該優化。描述一密碼子優化方法，例如， 描述於US國際專利公開案No. WO 2015/012924，藉由引用將其完整內容併入本文。亦參見，例如， US專利公開案No.2014/0032186及US專利公開案No. 2006/0136184。適合地，產物的開讀框(ORF)的整個長度被修飾。然而，於一些具體實施例，可改變ORF之僅一片段。藉由使用此等方法之一者，可將頻率應用於任何給定的多肽序列，並產生編碼該多肽的密碼子優化的編碼區域的核酸片段。許多選項可用於進行對密碼子的實際更改或用於合成如本文所述設計的密碼子優化編碼區域。可使用所屬技術領域中具通常知識者眾所周知的標準及常規分子生物學操作來進行此類修飾或合成。於一途徑，藉由標準方法合成各自的長度為80-90個核苷酸並跨越所需序列的長度之一系列互補的寡核苷酸對。合成此等寡核苷酸對，經過退火黏合(anneal)，它們形成80-90個鹼基對的雙股片段，其含有黏性末端，例如，對中的每個寡核苷酸被合成以延伸3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個鹼基，該鹼基超出與該對中另一個寡核苷酸互補的區域。每對寡核苷酸的單股末端被設計為與另一對寡核苷酸的單股末端退火黏合。允許寡核苷酸對退火黏合，然後使此等雙股片段中的大約五至六個經由黏性的單股末端一起退火黏合，然後它們一起連結並被選殖至標準細菌選殖載體，例如，可獲自Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif的TOPO® 載體。然後藉由標準方法定序此構築體。製備此等構築體中的數個，此等構築體由連接在一起的80至90個鹼基對片段的5至6個片段所組成，即由約500個鹼基對的片段所組成，如此使得整個所需序列在一系列質體構築體中表示。然後將此等質體的插入物以適當的限制酶切開，並連接在一起以形成最終構築體。然後將最終構築體選殖至標準細菌選殖載體，並定序。附加的方法對於所屬技術領域中具通常知識者為顯而易見的。此外，基因合成可容易地由市售獲得。
於某些具體實施例，AAVhu68衣殼係使用SEQ ID NO：1之核酸序列生產或使用至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%之序列生產，該序列編碼具修飾的SEQ ID NO：2之vp1胺基酸序列(例如， 去醯胺的胺基酸)，如本文所述。於某些具體實施例，vp1胺基酸序列再現於SEQ ID NO：2。
如本文所使用，當用於指vp衣殼蛋白，術語「異源(heterogenous)」或其任何語法變化，係指由不相同元件組成的群體，例如，具有具不同經修飾的胺基酸序列之vp1、vp2或vp3單體(蛋白質)。SEQ ID NO：2提供AAVhu68 vp1蛋白之經編碼的胺基酸序列。與vp1、vp2及vp3蛋白(亦稱為同功型)結合使用的術語「異源」係指衣殼內vp1、vp2及vp3蛋白的胺基酸序列的不同。AAV衣殼包含vp1蛋白內、vp2蛋白內及vp3蛋白內的亞群(subpopulation)，其具有由預測的胺基酸殘基的修飾。此等亞群至少包括某些去醯胺的天冬醯胺酸(N或Asn)殘基。例如，某些亞群於天冬醯胺酸-甘胺酸對包含至少一、二、三或四個高度去醯胺的天冬醯胺酸(N)位置及可選擇進一步包含其它去醯胺的胺基酸，其中該去醯胺化造成胺基酸改變及其它可選擇的修飾。
如本文所使用，vp蛋白之「亞群」係指一群vp蛋白，其具有至少一個共同的定義特徵，且由至少一組成員至少於參考組的所有成員所組成，除非另有指明。例如，vp1蛋白之「亞群」為組裝的AAV衣殼中的至少一個(1)vp1蛋白且少於所有vp1蛋白，除非另有指明。vp3蛋白的「亞群」可為組裝的AAV衣殼中的一(1)個vp3蛋白到少於所有vp3蛋白，除非另有指明。例如，vp1蛋白可為vp蛋白之亞群；vp2蛋白可為vp蛋白之一不同的亞群，及vp3為於組裝的AAV衣殼中的vp蛋白之又另一亞群。於另一例中，vp1、vp2及vp3蛋白可含有具有不同的修飾的亞群，例如，至少一、二、三或四個高度去醯胺的天冬醯胺酸，例如，於天冬醯胺酸-甘胺酸對。
除非另有規定，高度去醯胺的係指於參考的胺基酸位置上有至少45%去醯胺、至少50%去醯胺、至少60%去醯胺、至少65%去醯胺、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%、或多至約100%去醯胺，當與於參考胺基酸位置的預測的胺基酸序列比較(例如，至少80%之基於SEQ ID NO：2(AAVhu68)編號的胺基酸57之天冬醯胺酸)可去醯胺，基於全部vp1蛋白，可去醯胺，基於全部vp1、vp2及vp3蛋白)。此種百分比可使用2D膠體、質譜技術或其它適合的技術來確定。
不希望受理論束縛，咸信AAV衣殼中vp蛋白的至少高度去醯胺的殘基之去醯胺化本質上主要為非酶性質的，由衣殼蛋白中的將所選擇的天冬醯胺酸去醯胺化的官能團及在較小程度上麩醯胺殘基引起。大多數去醯胺化vp1蛋白的有效衣殼組裝指出此等事件發生於衣殼組裝後，或者各別單體(vp1、vp2或vp3)中的去醯胺化在結構上具有良好的耐受性，並且在很大程度上不會影響組裝動力。VP1-獨特(VP1-u)區域(〜aa 1-137)中的廣泛去醯胺化通常被認為位於細胞進入內部之前，暗示VP去醯胺化可能發生在衣殼組裝之前。N的去醯胺化可通過其C-末端殘基的骨架氮原子對Asn的側鏈醯胺基碳原子進行親核攻擊。咸信會形成一個中間物閉環的琥珀醯亞胺殘基。然後此琥珀醯亞胺殘基進行快速水解以產生最終產物天冬胺酸(Asp)或異天冬胺酸(IsoAsp)。因此，於某些具體實施例，天冬醯胺酸(N或Asn)的去醯胺化會導致Asp或IsoAsp，其可通過琥珀醯亞胺中間體相互轉化，例如，如下所示。
Figure 02_image001
如本文所提供，VP1、VP2或VP3中各去醯胺的N可獨立地為天冬胺酸(Asp)、異天冬胺酸(isoAsp)、天冬胺酸鹽、及/或Asp及isoAsp之互變共混物、或其組合。可存在α-及異天冬胺酸之任何適合的比率。例如，於某些具體實施例，比率可為由10：1至1：10的天冬胺酸對異天冬胺酸，約50：50天冬胺酸：異天冬胺酸，或約1：3的天冬胺酸：異天冬胺酸，或其它選擇的比率。
於某些具體實施例，一或多個麩醯胺(Q)可去醯胺為麩胺酸(Glu)，即，α-麩胺酸、γ-麩胺酸(Glu)、或α-及γ-麩胺酸之摻混，其可通過普通的戊二醯亞胺中間體相互轉化。可存在α-及γ-麩胺酸之任何適合的比率。例如，於某些具體實施例，比率可為由10：1至1：10之α 對γ，約50：50之α：γ、或約1：3之α ：γ、或其它選擇的比率。
Figure 02_image003
如此，rAAV包含vp1、vp2及/或vp3蛋白的rAAV+衣殼內具有去醯胺胺基酸的亞群，至少包括，包含至少一種高度去醯胺的天冬醯胺酸的至少一個亞群。此外，其它修飾可包括異構化，特別於選擇的天冬胺酸(D或Asp)殘基位置上。於另一些具體實施例，修飾可包括在Asp位置上的醯胺化。
於某些具體實施例，AAV衣殼含有具有至少4至至少約25個去醯胺的胺基酸殘基位置的vp1、vp2及vp3之亞群，當與vp蛋白之經編碼的胺基酸序列比較時，其至少1至10%為去醯胺。此等中的大多數可為N殘基。然而，Q殘基亦可去醯胺。
於某些具體實施例，rAAV具有具vp1、vp2及vp3蛋白之AAV衣殼，該蛋白質具有包含於實施例1所提供的表中所列位置的二、三、四或以上去醯胺殘基之組合的亞群，且藉由引用併入本文。於rAAV中去醯胺化可使用2D膠體電泳、及/或質譜分析(MS)、及/或蛋白質模擬(protein modelling)技術確定。線上層析可用Acclaim PepMap管柱及與具NanoFlex源的Q Exactive HF (Thermo Fisher Scientific)耦合的Thermo UltiMate 3000 RSLC系統(Thermo Fisher Scientific)而進行。MS數據係使用Q Exactive HF的依賴於數據的top-20方法所獲取，可從勘測掃描(200-2000 m/z)中動態選擇最豐富的尚未定序的前驅物離子。經由較高能量的碰撞解離片段進行定序，並以預測性自動增益控制確定目標值1e5離子，以4 m/z的窗口進行前驅物分離。以m/z 200時的解析度為120,000獲得勘測掃描。在m/z200時，HCD光譜的解析度可設置為30,000，最大離子注入時間為50 ms，歸一化碰撞能量為30。S-lens RF水平可以設置為50，以使達到胜肽自消化物中佔據的m/z區域之最佳透射率。可以從片段化選擇中排除具有單個、未分配或六個或更高電荷狀態的前驅物離子。BioPharma Finder 1.0軟體(Thermo Fischer Scientific)可用於分析所獲取的數據。對於胜肽圖譜(peptide mapping)，使用單輸入蛋白質FASTA數據庫進行搜索，其中胺甲醯甲基化設置為固定修飾；將氧化、去醯胺及磷酸化設置為可變修飾，質量精度為10ppm，高蛋白酶特異性，MS/MS光譜的信賴度為0.8。適合的蛋白酶之例可以包括例如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。去醯胺胜肽的質譜鑑定相對簡單，因去醯胺化增加完整分子的質量+0.984 Da(-OH及-NH2 基團之間的質量差)。特定胜肽的去醯胺化百分比由去醯胺胜肽的質量面積除以去醯胺和與天然胜肽的面積之和而確定。考慮到可能的去醯胺化位的數目，在不同位置去醯胺的同量異位物種(isobaric species)可能在一個峰中共遷移。因此，源自具有多個潛在去醯胺位點的胜肽的片段離子可用於定位或區分多個去醯胺位。於此等情形，觀察到的同位素圖譜內的相對強度可用於特異性確定不同的去醯胺胜肽異構物的相對豐度。此方法假定所有異構物的片段化效率相同，且在去醯胺化位點上是獨立的。本項技術領域中具通常知識者應理解，可使用此等說明性方法的多種變型。例如，適合的質譜儀可包括例如四極飛行時間質譜儀(QTOF)，諸如Waters Xevo或Agilent 6530或軌道儀器，諸如Orbitrap Fusion或Orbitrap Velos(Thermo Fisher)。適合的液相層析系統包括：例如，來自Waters或Agilent系統(1100或1200系列)之Acquity UPLC 系統。適合的資料分析軟體可包括，例如，MassLynx(Waters)、Pinpoint及 Pepfinder(Thermo Fischer Scientific)、Mascot(Matrix Science)、Peaks DB(Bioinformatics Solutions)。亦可描述其它技術，例如，描述於X. Jinet al , Hu Gene Therapy Methods, Vol. 28, No. 5, pp. 255-267,2017年6月16日在線發表。
除了去醯胺化之外，可發生其它修飾而不會導致一個胺基酸轉換為不同的胺基酸殘基。此種修飾可以包括乙醯化殘基、異構化、磷酸化或氧化。
去醯胺化的調節：於某些具體實施例，修飾AAV以改變天冬醯胺酸-甘胺酸對中的甘胺酸，以減少去醯胺化。於其它具體實施例，將天冬醯胺酸改變為不同的胺基酸，例如以較慢的速度去醯胺的麩醯胺；或缺少醯胺基的胺基酸(例如，含有醯胺基的麩醯胺及天冬醯胺酸)；及/或缺少胺基的胺基酸(例如含有胺基的離胺酸、精胺酸及組胺酸)。如本文所使用，缺少醯胺或胺側鏈的胺基酸係指例如，甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、胱胺酸、苯基丙胺酸、酪胺酸、或色胺酸、及/或脯胺酸。諸如所述的修飾可為於編碼的AAV胺基酸序列中發現的一、二或三個天冬醯胺酸-甘胺酸對中。於某些具體實施例，在所有四個天冬醯胺酸-甘胺酸對中沒有進行此種修飾。如此，用於減少具有較低去醯胺化率的AAV及/或工程化AAV變異體的去醯胺化的方法。另外，或替代地，可以將一種或多種其它醯胺胺基酸改變為非醯胺胺基酸以減少AAV的去醯胺化。於某些具體實施例，本文所述的突變體AAV衣殼含有精胺酸-甘胺酸對中的突變，使得甘胺酸改變為丙胺酸或絲胺酸。突變體AAV衣殼可含有一個、兩個或三個突變，其中參考AAV天然地包含四個NG對。於某些具體實施例，AAV衣殼可含有一個、兩個、三個或四個此種突變，其中參考AAV天然地包含五個NG對。於某些具體實施例，突變體AAV衣殼在NG對中僅包含單個突變。於某些具體實施例，突變體AAV衣殼含有兩個不同NG對中的突變。於某些具體實施例，突變體AAV衣殼含有兩個不同的NG對的突變，其位於AAV衣殼中結構上分開的位置。於某些具體實施例，該突變並未位於VP1-獨特區域。於某些具體實施例，突變之一者位於VP1-獨特區域。可選擇地，突變體AAV衣殼於NG對不含修飾，但含有突變以最小化或消除位於NG對之外的一個或多個天冬醯胺酸或麩醯胺中的去醯胺化。
於某些具體實施例，提供一種增加rAAV效力的方法，該方法包括工程化AAV衣殼，其消除了野生型AAV衣殼中的一個或多個NG。於某些具體實施例，「NG」之「G」的編碼序列被工程化成編碼另一胺基酸。於下列某些例，「S」或「A」被取代。然而，可選擇其它適合的胺基酸編碼序列。參見，實施例1之表，藉由引用被併入本文。
於AAVhu68衣殼蛋白，4個殘基(N57、N329、N452、N512)例行地顯示去醯胺＞70%的水平且於不同批次中多數情形＞90%。其它天冬醯胺酸殘基(N94、N253、N270、N304、N409、N477、及Q599)亦於各個批次中顯示出高達~20%的去醯胺化水平。最初使用胰蛋白酶消化物鑑定去醯胺化水平，並以胰凝乳蛋白酶消化物驗證。
AAVhu68衣殼含有vp1蛋白內、vp2蛋白內和vp3蛋白內的亞群，它們具有來自SEQ ID NO：2中預測的胺基酸殘基。此等亞群至少包括某些去醯胺的天冬醯胺酸(N或Asn)殘基。例如，某些亞群包含於SEQ ID NO：2中的天冬醯胺酸-甘胺酸中的對中的至少一個、二個、三個或四個高度去醯胺的天冬醯胺酸(N)位置，且可選擇地進一步包含其它去醯胺的胺基酸，其中該去醯胺造成胺基酸改變及其它選擇的修飾。SEQ ID NO：3提供經修飾的AAVhu68衣殼之胺基酸序列，說明可能具有一些百分比的去醯胺或其它方式修飾的胺基酸的位置。此等及其它修改的各種組合被描述於本文中。
於其它具體實施例，此方法涉及增加rAAV的產量，且因此在細胞裂解之前或不需要細胞裂解，增加存在於上清液中的rAAV的量。此方法涉及工程化AAV VP1衣殼基因以表現於位置67具有Glu、於位置157具有Val或兩者之衣殼蛋白，基於具有AAVhu68 vp1衣殼蛋白之胺基酸編號的排列。於其它具體實施例，此方法涉及工程化VP2衣殼基因以表現於位置157具有Val的衣殼蛋白。於另一些具體實施例，rAAV具有經修飾的衣殼，包含於位置67的Glu及於位置157的Val兩者的vp1及vp2衣殼蛋白。
如本文所使用，「AAV9衣殼」為自組裝的AAV衣殼，由多個AAV9 vp蛋白所組成。AAV9 vp蛋白一般被表現為選擇性剪接變異體，由SEQ ID NO：23之核酸序列所編碼或由與其至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%相同的序列所編碼，其編碼GenBank登錄號：AAS99264之vp1胺基酸序列。於某些具體實施例，「AAV9衣殼」包括具有99%與AAS99264相同或99%與SEQ ID NO：20相同的胺基酸序列。亦參見US7906111及WO 2005/033321。如本文所使用，「AAV9 變異體」包括彼等描述於例如，WO2016/049230、US 8,927,514、US 2015/0344911、及US 8,734,809。
已描述生產衣殼之方法、其編碼序列、及生產rAAV之方法。參見，例如， Gao, et al, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(10), 6081-6086(2003)及US 2013/0045186A1。
當指核酸或其片段時，術語「實質上同源」或「實質上相似」係指在與另一核酸(或其互補股)的適當核苷酸插入或刪除進行最佳比對時，於至少約95%至99%的比對序列中有核苷酸序列同一性。較佳地，該同源為全長序列、或其開讀框、或長度至少為15個核苷酸的其它適合的片段。本文描述適合的片段之例。
於核酸序列之上下文中，術語「序列同一性」、「百分比序列同一性」、或「百分比相同」係指兩個序列中當比對以獲得最大對應性時其為相同。序列同一性比較之長度冀望可為整個基因體之全長、基因編碼序列之全長、或至少約500至5000個核苷酸之片段。然而，較小片段中的同一性，亦可冀望為例如，至少約9個核苷酸，通常至少約20至24個核苷酸，至少約28至32個核苷酸，至少約36個或以上之核苷酸。相似地，可容易地確定在蛋白質之全長、或其片段上的胺基酸序列的「百分比序列同一性」。適合地，片段為至少約8個胺基酸長且可多至約700個胺基酸。本文描述適合的片段之例。
當指胺基酸或其片段時，術語「實質上同源」或「實質上相似」係指在與另一胺基酸(或其互補股)的適當胺基酸插入或刪除進行最佳比對時，於至少約95%至99%的比對序列中有胺基酸序列同一性。較佳地，該同源為全長序列、或其蛋白質，例如，cap蛋白、rep蛋白、或其片段，其為至少8個胺基酸，或更希望地，至少15個胺基酸長。本文描述適合的片段之例。
術語「高度保留」意指至少80%同一性，較佳至少90%同一性，更佳為超過97%同一性。藉由使用本項技術領域中具通常知識者已知的演算法及電腦程式，本項技術領域中具通常知識者可以容易地確定同一性。
一般而言，當提及兩個不同腺相關病毒之間的「同一性」、「同源性」、或「相似性」時，參照「比對」序列來確定「同一性」、「同源性」、或「相似性」。「比對」序列或「比對」係指多個核酸序列或蛋白質(胺基酸)序列，與參考序列相比，通常包含缺失或增加的鹼基或胺基酸的校正。在實施例中，使用公開的AAV9序列作為參考點進行AAV比對。 使用多種公開或市售的多序列比對程式中的任何一種進行比對。此種程式之例包括：「Clustal Omega」、「Clustal W」、「CAP Sequence Assembly」、「MAP」、及「MEME」，其可通過網際網路上的Web伺服器進行。此種程式之其它來源為本項技術領域中具通常知識者所知悉。或者，亦可使用Vector NTI應用程式。本領域中亦有許多可用於測量核苷酸序列同一性的算法，包括含於上述程式中的彼等者。作為另一例，可使用GCG版本6.1的程式FastaTM ，而比較多核苷酸序列。Fasta™提供查詢序列及檢索序列之間最佳重疊區域的比對及百分比序列同一性。例如，核酸序列之間的序列同一性百分比可使用Fasta™及其內定參數(字長為6，得分矩陣的NOPAM因子)而確定，如GCG版本6.1中所提供，其藉由引用併入本文。多序列比對程式亦可用於胺基酸序列，例如，「Clustal Omega」、「Clustal X」、「MAP」、「PIMA」、「MSA」、「BLOCKMAKER」、「MEME」、及「Match-Box」程式。一般而言，儘管本項技術領域中具通常知識者可依需要改變此等設定，但此等程式之任一者皆可於預設下使用。或者，本項技術領域中具通常知識者可利用另一種演算法或電腦程式，該演算法或電腦程式至少提供與所引用的演算法及程式所提供的同一性或比對水平。參見，例如， J. D. Thomson et al, Nucl.Acids.Res., “A comprehensive comparison of multiple sequence alignments”, 27(13):2682-2690(1999)。
III. rAAV 重組腺相關病毒(rAAV)已被描述為基因遞送的適合載具(vehicle)。通常，包含用於藉由rAAV遞送的轉基因(例如，GLB1 基因)之外源的表現匣替換來自天然AAV來源的功能性rep 基因及cap 基因，造成不具複製能力的載體。此等rep及cap功能在載體生產系統中以反式提供，但在最終的rAAV中不存在。
如上所指出者，提供具有AAV衣殼及載體基因體之rAAV，該載體基因體至少包含將載體基因體包裝到衣殼所需的AAV反向末端重複(ITRs)、GLB1 基因及引導其表現的調節序列。於某些具體實施例，AAV衣殼來自AAVhu68。本文中的實施例利用單股AAV載體基因體，但於某些具體實施例，可被利用於本發明中的rAAV含有自互補(self-complementary)(sc)AAV載體基因體。
必需的調節控制元件係以允許其在攝入rAAV的細胞中轉錄、轉譯及/或表現的方式而可操作地連接至基因(例如，GLB1 )。如本文所使用，「可操作地連接」的序列包括與有興趣的基因鄰接的表現控制序列及以反式或於一距離地作用而控制有興趣的基因之表現控制序列兩者。此種調節序列典型地包括，例如，一或多個之啟動子、增強子、內含子、polyA、自切割連結子(例如，弗林蛋白酶(furin)、弗林蛋白酶F2A(furin-F2A)、)。下列實施例利用CB7啟動子(例如， SEQ ID NO：10)、EF1a 啟動子(例如， SEQ ID NO：11)、或人類泛素C(UbC)啟動子(例如， SEQ ID NO：9)以表現GLB1 基因。然而，於某些具體實施例，可選擇其它啟動子、或另外的啟動子。
於某些具體實施例，除了GLB1 基因，可包括編碼另外的一種或以上之基因產物的非AAV序列。此種基因產物可為，例如，肽、多肽、蛋白質、功能性RNA分子(例如，miRNA、miRNA抑制劑)或其它感興趣的基因產物。有用的基因產物可包括miRNA。miRNA及其它小的干擾核酸經由目標RNA轉錄本裂解/降解或目標傳訊RNA(mRNA)的轉譯阻遏來調節基因表現。miRNAs被天然地表現，通常作為最終的19-25個非轉譯RNA產物。miRNA通過與目標mRNA的3’非轉譯區(UTR)進行序列特異性相互作用來展示其活性。此等內源性表現的miRNA形成髮夾前驅物，其隨後被加工成雙股miRNA(miRNA duplex)，並進一步加工成「成熟的」單股miRNA分子。此成熟的miRNA導引多蛋白複合體，miRISC，其基於其與成熟miRNA的互補性來鑑別目標mRNA的靶位，例如於3’UTR區域。
於某些具體實施例，載體基因體可被工程化以除了含有GBL1編碼序列外，含有一或多個有用於脫靶背根神經節的miR的以便改進安全性及/或減少副作用。此種drg脫靶序列可操作連結GLB1編碼序列因而最小化或防止於背根神經節中GLB1產物的表現。適合的脫靶序列被描述於PCT/US19/67872，2019年12月20日申請，標題為「Compositions for DRG-specific reduction of transgene expression」。
AAV載體基因體通常包含順式作用(cis-acting)的5′及3′反向末端重複(ITR)序列(參見，例如， B. J. Carter, in 「Handbook of Parvoviruses」, ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168(1990))。此ITR序列長度為約145鹼基對(bp)。較佳地，儘管允許對此等序列進行某種程度的輕微修飾，但是基本上在分子中使用了編碼ITR的整個序列。修飾此等ITR序列的能力係於本領域技術範圍內。(參見，例如， 文件如Sambrook et al, “Molecular Cloning.A Laboratory Manual”, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1989)；及K. Fisher et al., J. Virol., 70:520 532(1996))。本發明中所使用的此種分子之例為含有轉基因(transgene)的「順式作用」質體，其中5’及3’ AAV ITR序列位於所選擇的轉基因序列及有關的調節元件兩側。於一具體實施例，ITR來自不同於提供衣殼的AAV。於一具體實施例，ITR序列來自AAV2。已描述5’ITR的縮短版，稱為∆ITR，其中刪除了D序列(D-sequence)及末端分割位點(terminal resolution site)(trs )。於某些具體實施例，載體基因體包括130個鹼基對之縮短的AAV2 ITR，其中外部A元件被刪除。使用內部A元件作為模板，在載體DNA擴增過程中，縮短的ITR被還原為145個鹼基對的野生型長度。於其它具體實施例，使用全長AAV 5’及3’ITRs。然而，可選擇來自其它AAV來源的ITRs。於ITR之來源為來自AAV2且AAV衣殼來自另一AAV來源時，生成的載體可稱為假型(pseudotype)。然而，此等元件之其它型態可為適合的。
於某些具體實施例，另外的或可選擇的啟動子序列可被包括作為表現控制序列之部分(調節序列)，例如，位於選擇的5’ITR序列及編碼序列之間。組成型啟動子、可調節的啟動子(參見，例如， WO 2011/126808 及WO 2013/04943)、組織特異性啟動子(例如，神經元特異性啟動子或神經膠細胞特異性啟動子、或CNS特異性啟動子)、或對生理線索有反應的啟動子可用於本文所述的rAAV中。啟動子可選自不同來源，例如， 人類巨細胞病毒(CMV)立即早期增強子/啟動子、SV40早期增強子/啟動子、JC多瘤病毒啟動子、髓鞘質鹼性蛋白質(MBP)或神經膠原纖維酸性蛋白質(glial fibrillary acidic protein)(GFAP)啟動子、單純疱疹病毒(HSV-1)潛伏相關啟動子(latency associated promoter)(LAP)、勞氏肉瘤病毒(rouse sarcoma virus)(RSV)長末端重複(LTR)啟動子、神經元特異性啟動子(NSE)、血小板衍生生長因子(PDGF)啟動子、hSYN、黑色素濃縮激素(melanin-concentrating hormone)(MCH)啟動子、CBA、基質金屬蛋白啟動子(matrix metalloprotein啟動子)(MPP)、及雞β-肌動蛋白啟動子。其它適合的啟動子可包括CB7啟動子。除了啟動子，載體基因體可含有一或多個其它適當轉錄起始序列、轉錄終止序列、增強子序列、有效的RNA處理訊號諸如剪接(splicing)及多腺苷酸化(polyA)訊號；穩定細胞質的mRNA之序列，例如WPRE；增強轉譯效率之序列(即，Kozak共通序列)；增強蛋白質穩定性之序列；及當需要時，增強所編碼的產物之分泌的序列。適合的增強子之例為CMV增強子。其它適合的增強子包括彼等適合於所欲目標組織適應症者。於一具體實施例，調節序列包含一或多個表現增強子。於一具體實施例，調節序列含有二或多個表現增強子。此等增強子可相同或可彼此不同。例如，增強子可包括CMV立即早期增強子。此增強子能夠以位置彼此相鄰的兩個拷貝的方式存在。或者，增強子的雙重拷貝可被一個或多個序列分開。於再另一具體實施例，表現匣進一步包含內含子，例如雞β-肌動蛋白內含子。於某些具體實施例，內含子為嵌合內含子(CI)–由人類β-球蛋白剪接供體及免疫球蛋白G(IgG)剪接受體元件所組成的雜合內含子。其它適合的內含子包括本技術領域中已知者，例如，諸如WO 2011/126808所述者。適合的polyA序列之例包括例如，SV40、SV50、牛生長激素(bGH)、人類生長激素、及合成的polyA。可選擇地，可選擇一或多個序列以穩定mRNA。此種序列之例為經修飾的WPRE序列，其可為工程化的polyA序列的上游及編碼序列的下游(參見，例如，MA Zanta-Boussif,et al ,Gene Therapy (2009)16:605-619)。於某些具體實施例，不存在WPRE序列。
於某些具體實施例，構築載體基因體，其包含5’ AAV ITR-啟動子–可選擇的增強子–可選擇的內含子–GLB1 基因-polyA-3’ITR。於某些具體實施例，ITRs來自AAV2。於某些具體實施例，存有多於一個啟動子。於某些具體實施例，增強子存在於載體基因體。於某些具體實施例，存有多於一個增強子。於某些具體實施例，內含子存在於載體基因體。於某些具體實施例，存有增強子及內含子。於某些具體實施例，內含子為嵌合內含子(CI)–由人類β-球蛋白剪接供體及免疫球蛋白G(IgG)剪接受體元件所組成之雜合內含子。於某些具體實施例，polyA為SV40 poly A(即，衍生自猴病毒40(SV40)晚期基因之多腺苷酸化(PolyA)訊號)。於某些具體實施例，polyA為兔β-球蛋白(RBG)poly A。於某些具體實施例，載體基因體包含5’ AAV ITR–CB7啟動子–GLB1 基因–RBG poly A –3’ITR。於某些具體實施例，載體基因體包含5’ AAV ITR–EF1a啟動子–GLB1 基因–SV40 poly A–3’ITR。於某些具體實施例，載體基因體包含5’ AAV ITR–UbC啟動子–GLB1 基因–SV40 poly A–3’ITR。於某些具體實施例，GLB1 基因具有SEQ ID NO：5。於某些具體實施例，GLB1 基因具有SEQ ID NO：6。於某些具體實施例，GLB1 基因具有SEQ ID NO：7。於某些具體實施例，GLB1 基因具有SEQ ID NO：8。於某些具體實施例，載體基因體具有SEQ ID NO：12之序列或與其至少約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%至約99.9%相同的序列。於某些具體實施例，載體基因體具有SEQ ID NO：13之序列或與其至少約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%至約99.9%相同的序列。於某些具體實施例，載體基因體具有SEQ ID NO：14之序列或與其至少約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%至約99.9%相同的序列。於某些具體實施例，載體基因體具有SEQ ID NO：15之序列或與其至少約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%至約99.9%相同的序列。於某些具體實施例，載體基因體具有SEQ ID NO：16之序列或與其至少約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%至約99.9%相同的序列。
IV. rAAV 生產 於使用於生產AAV病毒載體(例如，重組(r)AAV)，載體基因體可被攜帶於任何適合的載體上，例如，質體，其被遞送至包裝的宿主細胞。有用於本發明之質體可經工程化而適合於原核細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等中之活體外複製及包裝。適合的轉染技術及包裝宿主細胞為本技術領域中具有通常知識者已知及/或可輕易設計。於圖12A-12B提供說明性的生產過程。
生產及單離適合作為載體使用之AAV之方法為本技術領域已知。一般參見例如，Grieger & Samulski, 2005, Adeno-associated virus as a gene therapy vector:Vector development, production and clinical applications,Adv.Biochem.Engin/Biotechnol. 99:119-145；Buninget al., 2008, Recent developments in adeno-associated virus vector technology,J. Gene Med. 10:717-733；及下列引述的參考文獻，其每一者藉由引用而完整併入本文。於將基因包裝到病毒體中，ITR為與包含該基因的核酸分子相同的構築體中順式中唯一需要的AAV組件。cap 和rep 基因可以反式來提供。
於一具體實施例，選擇的基因元件可藉由任何適合的方法而被遞送至AAV包裝細胞，包括轉染、電穿孔、微脂體遞送、膜融合技術、高速DNA塗布丸粒、病毒感染及原生質體(protoplast)融合。亦可製作穩定的AAV包裝細胞。用於製作此種構築體之方法為核酸操作領域中具有通常知識者所知悉且包括基因工程、重組工程、及合成技術。參見，例如， Molecular Cloning:A Laboratory Manual, ed. Green and Sambrook, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY(2012)。
術語「AAV中間體」或「AAV載體中間體」係指缺少包裝在其中的所欲基因體序列的組裝的rAAV衣殼。此等亦被稱為「空的」衣殼。此種衣殼可不含有表現匣的可檢測的基因體序列，或僅含有不足以達成基因產物(例如，β-gal)表現的部分包裝的基因體序列。此等空的衣殼沒有將感興趣的基因轉移至宿主細胞的功能。於某具體實施例中，如本文所述的rAAV.GLB1或組成物可為至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%無AAV中間體，即，含有少於20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%、或0.1% AAV中間體。
本文所述重組腺相關病毒(AAV)可使用已知技術生產。參見，例如， WO 2003/042397；WO 2005/033321、WO 2006/110689；US 7588772 B2。此種方法涉及培養宿主細胞，其含有編碼AAV衣殼蛋白的核酸序列；功能性rep 基因；至少由AAV反向末端重複(ITRs)及轉基因所組成的表現匣；及足夠的輔助功能以允許將表現匣包裝至AAV衣殼蛋白中。已描述生產衣殼之方法、其編碼序列、及生產rAAV病毒載體之方法。參見，例如， Gao,et al , Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(10), 6081-6086(2003)及US 2013/0045186A1。
於一具體實施例，提供有用於生產重組AAV(如rAAVhu68)之生產細胞培養。此種細胞培養含有於宿主細胞中表現AAV衣殼蛋白的核酸；適於包裝至AAV衣殼中的核酸分子，例如，載體基因體，其包含AAV ITR及GLB1基因，該GLB1基因可操作地連接至引導該基因於宿主細胞中表現的調控序列(例如，於需要的患者中的細胞)；及充足的AAV rep功能及腺病毒輔助功能，以允許將載體基因體包裝到重組AAV衣殼中。於一具體實施例，細胞培養係由哺乳動物細胞(例如，人類胚胎腎臟293細胞等)或昆蟲細胞(例如，草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9)細胞)組成。於某些具體實施例，桿狀病毒(baculovirus)提供將載體基因體包裝至重組AAVhu68衣殼所必須的輔助功能。
可選擇地，rep功能係由衣殼來源AAV(AAVhu68)以外的AAV提供。於某些具體實施例，至少部分rep功能來自AAVhu68。於另一具體實施例，rep蛋白為AAVhu68rep以外的異源的rep蛋白，例如但不限於，AAV1 rep蛋白、AAV2 rep蛋白、AAV3 rep蛋白、AAV4 rep蛋白、AAV5 rep蛋白、AAV6 rep蛋白、AAV7 rep蛋白、AAV8 rep蛋白；或rep 78、rep 68、rep 52、rep 40、rep68/78及rep40/52；或其片段；或其它來源。此等AAVhu68或突變體AAV衣殼序列之任一者可於引導其在宿主細胞中表現的外源調節控制序列的控制下。
於一具體實施例，於適合的細胞培養(例如，HEK 293或Sf9)或懸浮液中製備細胞。本文所述的基因療法載體的製備方法包括本領域眾所周知的方法，諸如生產用於生產基因療法載體的質體DNA、載體的生產、及載體的純化。於一些具體實施例，基因療法載體為rAAV且生產的質體為編碼AAV載體基因體的AAV順式質體，該AAV載體基因體包含感興趣的基因、含有AAV rep及cap基因的AAV反式質體、及腺病毒輔助質體。載體產生製程可包括諸如細胞培養之起始、細胞繼代、細胞接種、以質體DNA轉染細胞、轉染後培養基交換為無血清培養基、及含有載體的細胞及培養基的收取的方法步驟。所收取的含有載體的細胞和培養基在本文中稱為粗細胞收取物。於另一系統中，藉由以基於桿狀病毒的載體感染而將基因療法載體導入昆蟲細胞中。此等生產系統的綜述，一般參見例如，Zhanget al. , 2009, Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production,Human Gene Therapy 20:922-929，其各自之內容藉由引用而完整併入本文。製造及使用此等之方法及其它AAV生產系統亦描述於下列U.S.專利，其各自之內容藉由引用而完整併入本文：5,139,941；5,741,683；6,057,152；6,204,059；6,268,213；6,491,907；6,660,514；6,951,753；7,094,604；7,172,893；7,201,898；7,229,823；及7,439,065。
粗細胞收取物之後可經歷下列方法步驟，諸如rAAV收取物的濃縮、rAAV收取物的透析過濾、rAAV收取物的微流體化、rAAV收取物的核酸酶消化、微流體化中間體的過濾、藉由層析法的粗純化、藉由超速離心的粗純化、藉由切向流過濾的緩衝液交換、及/或調配及過濾以製備大量rAAV。
於高鹽濃度下進行兩步驟親和性層析純化，然後進行陰離子交換樹脂層析純化，用以純化rAAV藥物產物並移除空的衣殼。此等方法更詳細描述於WO 2017/160360、2016年12月9日申請的國際專利申請案No. PCT/US2016/065970，以及其優先權案2016年4月13日申請的US專利申請案No. 62/322,071及2015年12月11日申請的US專利申請案No. 62/226,357，標題為「Scalable Purification Method for AAV9」，其藉由引用而併入本文。
為計算空的(empty)及完整的(full)顆粒含量，將所選樣品(例如，在本文的實施例中，碘克沙醇(iodixanol)梯度純化的製劑，其中基因體拷貝(GC)的#=顆粒的#)的VP3帶(band)體積係對裝載的GC顆粒作圖。所生成的線性方程式(y=mx+c)用於計算測試物品峰的帶體積中的顆粒數量。然後將每20µL裝載的顆粒數(pt)乘以50，得到顆粒(pt)/mL。Pt/mL除以GC/mL得到顆粒對基因體拷貝的比率(pt/GC)。Pt/mL–GC/mL得到空的pt/mL。空的pt/mL除以pt/mL並x100得到空的顆粒的百分比。
通常，用於分析空的衣殼及具有包裝的載體基因體的rAAV顆粒的方法已為本領域所知。參見，例如， Grimmet al. ,Gene Therapy (1999)6:1322-1330；Sommeret al. , Molec.Ther.(2003)7:122-128。為了測試變性的衣殼，該方法包括對處理過的AAV備料(stock)進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，該電泳由能夠分離三種衣殼蛋白的任何凝膠組成，例如，在緩衝液中含有3-8%的Tris-乙酸鹽的梯度凝膠，然後運行凝膠直到分離樣品材料，然後將凝膠印漬到尼龍或硝化纖維素膜上，較佳為尼龍。然後將抗AAV衣殼抗體使用作為結合至變性的衣殼蛋白的一級抗體，較佳為抗AAV衣殼單株抗體，最佳為B1抗AAV-2單株抗體(Wobus et al.,J. Virol .(2000)74:9281-9293)。然後使用二級抗體，該二級抗體與一級抗體結合且含有用於檢測與一級抗體的結合的手段，更佳為含有與其共價結合的檢測分子的抗IgG抗體，最佳為與辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)共價連接的綿羊抗小鼠IgG抗體。使用檢測結合的方法，以半定量地確定一級抗體和二級抗體之間的結合，較佳為能夠檢測放射性同位素發射、電磁輻射或比色變化的檢測方法，最佳為化學發光檢測套組。例如，對於SDS-PAGE，可從管柱流份中取樣品，並於含有還原劑(例如DTT)的SDS-PAGE裝載緩衝液(loading buffer)中加熱，將衣殼蛋白於預鑄的梯度聚丙烯醯胺凝膠(例如Novex)進行解析。可根據製造商的說明使用SilverXpress(Invitrogen，CA)或其它適合的染色方法(即SYPRO ruby或考馬斯染色)進行銀染色。於一具體實施例，可藉由定量即時PCR(Q-PCR)測量管柱流份中的AAV載體基因體(vg)的濃度。稀釋樣品並以DNase I(或其它合適的核酸酶)消化以移除外源的DNA。核酸酶失活後，使用引子及對引子之間的DNA序列特異的TaqMan™螢光探針進一步稀釋及擴增樣品。在Applied Biosystems Prism 7700序列檢測系統上測量每個樣品達到定義的螢光水準所需的循環數(閾值循環，Ct)。使用含有與rAAV中含的序列相同的質體DNA，以於Q-PCR反應中生成標準曲線。從樣品獲得的循環閾值(Ct)數值係用於藉由將其標準化為質體標準曲線的Ct值來確定載體基因體力價(titer)。亦可使用基於數位PCR的終點分析。
於一態樣，使用優化的q-PCR方法，其利用廣效絲胺酸蛋白酶，例如蛋白酶K(如可由Qiagen購得)。更具體而言，優化的qPCR基因體力價分析除了於DNase I消化後，將樣品以蛋白酶K緩衝液稀釋並以蛋白酶K處理，然後進行熱失活之外，與標準分析相似。適合地，以與樣品量相等的量的蛋白酶K緩衝液稀釋樣品。蛋白酶K緩衝液可濃縮至2倍或更高。通常，蛋白酶K處理為約0.2mg/mL，但可於0.1mg/mL至約1mg/mL之間變化。該處理步驟通常於約55℃下進行約15分鐘，但可於較低溫度(例如約37℃至約50℃)下進行較長時間(例如約20分鐘至約30分鐘)；或者於較高的溫度(例如，高至約60°C)下進行較短的時間(例如，約5至10分鐘)。相似地，熱失活通常於約95℃下約15分鐘，但溫度可降低(例如約70至約90℃)且時間延長(例如約20分鐘至約30分鐘)。然後將樣品稀釋(例如1000倍)，並如標準分析中所述進行TaqMan分析。
另外或替代地，可使用液滴數位PCR(ddPCR)。例如，已描述一種藉由ddPCR確定單股及自互補的AAV載體基因體力價的方法。參見，例如， M. Locket al , Hum Gene Ther Methods.2014 Apr；25(2):115-25. doi:10.1089/hgtb.2013.131.Epub 2014 Feb 14。
簡而言之，用於從基因體缺陷的AAVhu68中間體中分離具有包裝的基因體序列的rAAVhu68顆粒的方法，涉及對包含重組AAVhu68病毒顆粒和AAVhu68衣殼中間體的懸浮液進行快速高效液相層析，其中將AAVhu68病毒顆粒與AAVhu68中間體結合至一種經平衡於pH約10.2的強陰離子交換樹脂，並經過鹽梯度而同時以約260奈米(nm)和約280nm的紫外線吸光度來監測洗提物。儘管對於rAAVhu68未到最佳，但pH可於約10.0至10.4的範圍內。於此方法中，從A260/A280之比達到反曲點時洗提的流份中收集AAVhu68完整的衣殼。於一例中，對於親和性層析步驟，可將經透析過濾的產物應用於有效捕捉AAV2/hu68血清型的Capture SelectTM Poros-AAV2/9親和性樹脂(Life Technologies)。於此等離子條件下，顯著百分比之殘留的細胞DNA及蛋白質流過管柱，而AAV顆粒被有效捕獲。
亦提供於本文者為一種生產載體(諸如質體)或用於生產載體基因體及/或rAAV.GLB1的宿主細胞，如本文所述。如本文所使用，帶有載體基因體的生產載體至宿主細胞以產生及/或包裝基因療法載體，如本文所述。
將rAAV.GLB1(例如，rAAVhu68.GLB1)懸浮於適當的生理學上相容的組成物(例如，緩衝食鹽水)。可將此組成物冷凍保存，隨後解凍，並可選擇地以適合的稀釋劑稀釋。或者，rAAV.GLB1可被製備成適合用於遞送至患者而無需通過冷凍及解凍步驟進行。
V. 組成物及用途 本文提供之組成物含有至少一種rAAV備料(例如，rAAVhu68備料或突變體rAAVhu68備料)及可選擇的載劑(carrier)、賦形劑及/或防腐劑。
如本文所使用，rAAV之「備料」係指一群rAAV。儘管由於去醯胺作用，其衣殼蛋白具有異質性，但是備料中的rAAV被期待共享相同的載體基因體。備料可包括具有衣殼之rAAV，該衣殼具有例如所選擇的AAV衣殼蛋白及所選擇的生產系統的特徵性的異質去醯胺樣式。可從單個生產系統生產此備料，亦可從生產系統的多個運行中合併備料。可以選擇各種生產系統，包括但不限於本文所述彼等。
特別是一種用於GM1神經節苷脂症之治療用的組成物。於一具體實施例，組成物適合投予具有GM1神經節苷脂症的患者或18個月齡或以下的具有嬰幼期神經節苷脂症的患者。於一具體實施例，組成物適合投予具有GM1神經節苷脂症的患者或36個月齡或以下的具有嬰幼期神經節苷脂症的患者。於一具體實施例，組成物適合投予至需要其之患者以改善GM1神經節苷脂症的症狀，或改善GM1神經節苷脂症的神經症狀。於一些具體實施例，組成物係用於製造治療GM1神經節苷脂症之醫藥。
如本文所使用，「載劑」包括任何及所有的溶劑、分散介質、媒液、包衣、稀釋劑、抗細菌及抗真菌劑、等滲及吸收延遲劑、緩衝液、載劑溶液、懸浮液、膠體等。此種用於醫藥活性物質的介質及藥劑的用途為本技術領域中所熟知。補充的活性成分亦可併入此組成物中。
於某些具體實施例，本文提供的組成物包含如本文所述的rAAV.GLB1及醫藥上可接受的載劑。用語「醫藥上可接受」係指當投予於宿主時不會產生過敏或類似的不良反應的分子實體及組成物。
於某些具體實施例，本文提供的組成物包含如本文所述的rAAV.GLB1及遞送媒液。遞送媒液諸如微脂體、奈米膠囊、微粒、微球、脂質顆粒、囊泡等可用於將本發明之組成物導入適當的宿主細胞中。特別是，可調配rAAV遞送的載體基因體用於遞送被包封於脂質粒子、微脂體、囊泡、奈米球或奈米顆粒等。
於一具體實施例，組成物包括適於遞送至對象/患者之最終調配物，例如，為緩衝至生理上可相容的pH和鹽濃度的水性液體懸浮液。可選擇地，調配物中存在一種或多種界面活性劑。於另一具體實施例，可將組成物作為濃縮物運輸，將其稀釋以投予至對象。於其它具體實施例，組成物可被凍乾並在投予時還原。
適合的界面活性劑或界面活性劑的組合可選自無毒的非離子界面活性劑。於一具體實施例，選擇終止於一級羥基的雙官能嵌段共聚物界面活性劑，例如，諸如Pluronic® F68 [BASF]，亦稱為泊洛沙姆188，其具有中性pH，平均分子量為8400。可選擇其它界面活性劑和其它泊洛沙姆，即由一個聚氧伸丙基(聚(環氧丙烷))之中央疏水鏈及兩側的兩個聚氧伸乙基(聚(環氧乙烷))之親水鏈所構成的非離子三嵌段共聚物、SOLUTOL HS 15(Macrogol-15 羥基硬脂酸酯)、LABRASOL(聚氧辛酸甘油酯(Polyoxy capryllic glyceride))、聚氧基10油基醚(polyoxy 10 oleyl ether)、TWEEN(聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯)、乙醇及聚乙二醇。於一具體實施例，調配物含有泊洛沙姆。此等共聚物通常以字母「P」(用於泊洛沙姆)跟三個數字命名：前兩個數字x100給出聚氧伸丙基核心的近似分子量，最後一個數字x10給出聚氧伸乙基含量百分比。於一具體實施例，選擇泊洛沙姆188。於一具體實施例，界面活性劑可於懸浮液中以高至約0.0005%至約0.001%(基於重量比，w/w%)的量存在。於另一具體實施例，界面活性劑可於懸浮液中以高至約0.0005%至約0.001%(基於體積比，v/v%)的量存在。於再另一具體實施例，界面活性劑可於懸浮液中以高至約0.0005%至約0.001%的量存在，其中n%指每100mL懸浮液中n公克。
以足夠的量投予rAAV.GLB1以轉染細胞並提供基因轉移及表現之足夠的水準，以提供治療益處，而沒有不適當的副作用，或具有醫學上可接受的生理作用，此可由醫學領域中具有通常知識者確定。習用及醫藥上可接受的投予途徑包括但不限於直接遞送至所欲器官(例如，腦、CSF、肝臟(可選擇地經由肝動脈)、肺臟、心臟、眼、腎臟)、口服、吸入、鼻內、鞘內、氣管內、動脈內、眼內、靜脈內、肌內、皮下、皮內、腦實質內(intraparenchymal)、腦室內、鞘內、ICM、腰椎穿刺及其它非經口途徑之投予。若需要，可合併投予途徑。
rAAV.GLB1的劑量主要取決於諸如所治療的病況、病患的年齡、體重、及健康狀況的因子，因此於病患間可能會變化。例如，rAAV.GLB1之治療上有效的人類劑量一般於範圍為約25至約1000微升至約100mL之溶液，每mL含有濃度為約1x109 至1x1016 載體基因體拷貝。於某些具體實施例，遞送體積約1mL至約15mL、或約2.5mL至約10mL、或約5mL懸浮液。於某些具體實施例，遞送體積約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、或約15mL懸浮液。
於一些具體實施例，以單劑投予此組成物。於一些具體實施例，以多劑投予此組成物。
於某些具體實施例，以本文所述體積投予劑量為每患者約8x1012 基因體拷貝(GC)之rAAV.GLB1至每患者約3x1014 GC之rAAV.GLB1。於某些具體實施例，以此體積投予劑量為每患者約2x1012 GC之rAAV.GLB1至每患者約3x1014 GC之rAAV.GLB1，或每患者約2x1013 GC之rAAV.GLB1至每患者約3x1014 GC之rAAV.GLB1，或每患者約8x1013 GC之rAAV.GLB1至每患者約3x1014 GC之rAAV.GLB1，或每患者約9x1013 GC之rAAV.GLB1，或總共約8.9x1012 至2.7x1014 GC。
於某些具體實施例，以本文所述體積投予劑量為每公克腦質量1x1010 GC之rAAV.GLB1(GC/g腦質量)至3.4x1011 GC/g腦質量。於某些具體實施例，以此體積投予劑量為3.4x1010 GC/g腦質量至3.4x1011 GC/g腦質量、或1.0x1011 GC/g腦質量至3.4x1011 GC/g腦質量、或約1.1x1011 GC/g腦質量、或約1.1x1010 GC/g腦質量至約3.3x1011 GC/g腦質量。於某些具體實施例，以此體積投予劑量為每公克腦質量約3.0x109 、約4.0x109 、約5.0x109 、約6.0x109 、約7.0x109 、約8.0x109 、約9.0x109 、約1.0x1010 、約1.1x1010 、約1.5x1010 、約2.0x1010 、約2.5x1010 、約3.0x1010 、約3.3x1010 、約3.5x1010 、約4.0x1010 、約4.5x1010 、 約5.0x1010 、約5.5x1010 、約6.0x1010 、約6.5x1010 、約7.0x1010 、約7.5x1010 、約8.0x1010 、約8.5x1010 、約9.0x1010 、約9.5x1010 、約1.0x1011 、約1.1x1011 、約1.5x1011 、約2.0x1011 、約2.5x1011 、約3.0x1011 、約3.3x1011 、約3.5x1011 、約4.0x1011 、約4.5x1011 、約5.0x1011 、約5.5x1011 、約6.0x1011 、約6.5x1011 、約7.0x1011 、約7.5x1011 、約8.0x1011 、約8.5x1011 、約9.0x1011 GC。於某些具體實施例，此劑量反映了GM1動物模型中顯示的最小有效劑量，並於用於人類患者根據每公克腦質量的基因體拷貝進行調整。於一具體實施例，用於人類患者的劑量係使用下表中列出的假定的腦質量計算。
對象年齡 假定的腦質量(g)
≥ 4至＜9個月 600
≥ 9至＜18個月 1000
≥ 18個月至＜3歲 1100
≥ 3歲 1300
年齡 ≥1 ~ ＜4個月 ≥4 ~ ＜8個月 ≥8 ~ ＜12個月 ≥12個月
平均人類腦重量(g) 488 610 780 960
低劑量3.33x1010 GC/g 1.6x1013 GC 2.1x1013 GC 2.6x1013 GC 3.2x1013 GC
高劑量1.11x1011 GC/g 5.4x1013 GC 6.8x1013 GC 8.7x1013 GC 1.0x1014 GC
最大可行劑量 3.33 x 1011 GC/g 1.6x1014 GC 2.1x1014 GC 2.6x1014 GC 3.2x1014 GC
調整劑量以平衡治療益處與任何副作用，且此種劑量可依據運用的rAAV.GLB1的治療應用而變化。可監測轉基因產物(例如，β-gal)表現的水平以確定劑量的頻率造成rAAV.GLB1，較佳rAAV含有袖珍基因(minigene)(例如，GLB1 基因)。可選擇地，使用本發明之組成物可將類似於用於治療目的描述的劑量方案用於免疫。
可以劑量單位來調配複製缺陷的病毒組成物，使含有複製缺陷的病毒(例如，rAAV.GLB1、rAAVhu68.GLB1、或rAAVhu68.UbC.GLB1)的量在範圍約1.0x109 GC至約1.0x1016 GC(對治療對象)，包括該範圍內的所有整數或分數量，且對人類患者較佳為1.0x1012 GC至1.0x1014 GC。於一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x109 、2x109 、3x109 、4x109 、5x109 、6x109 、7x109 、8x109 、或9x109 GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x1010 、2x1010 、3x1010 、4x1010 、5x1010 、6x1010 、7x1010 、8x1010 、或9x1010 GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x1011 、2x1011 、3x1011 、4x1011 、5x1011 、6x1011 、7x1011 、8x1011 、或9x1011 GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x1012 、2x1012 、3x1012 、4x1012 、5x1012 、6x1012 、7x1012 、8x1012 、或9x1012 GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x1013 、2x1013 、3x1013 、4x1013 、5x1013 、6x1013 、7x1013 、8x1013 、或9x1013 GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x1014 、2x1014 、3x1014 、4x1014 、5x1014 、6x1014 、7x1014 、8x1014 、或9x1014 GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x1015 、2x1015 、3x1015 、4x1015 、5x1015 、6x1015 、7x1015 、8x1015 、或9x1015 GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於一具體實施例，對於人類應用，劑量範圍可為每劑1x1010 至約1x1012 GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。
此等上述劑量能以各種體積的載劑、賦形劑或緩衝液調配物投予，範圍自約25至約1000微升，或更大體積，包括此範圍內所有數量，取決於欲治療區域的大小、使用的病毒力價、投予途徑、及該方法之所欲效果。於一具體實施例，載劑、賦形劑或緩衝液之體積為至少約25µL。於一具體實施例，體積為約50µL。於一具體實施例，體積為約75µL。於一具體實施例，體積為約100µL。於一具體實施例，體積為約125µL。於一具體實施例，體積為約150µL。於一具體實施例，體積為約175µL。於再另一具體實施例，體積為約200µL。於一具體實施例，體積為約225µL。於再另一具體實施例，體積為約250 µL。於再另一具體實施例，體積為約275µL。於再另一具體實施例，體積為約300µL。於再另一具體實施例，體積為約325µL。於一具體實施例，體積為約350µL。於一具體實施例，體積為約375µL。於一具體實施例，體積為約400µL。於一具體實施例，體積為約450µL。於一具體實施例，體積為約500µL。於一具體實施例，體積為約550µL。於一具體實施例，體積為約600µL。於一具體實施例，體積為約650µL。於一具體實施例，體積為約700µL。於另一具體實施例，體積為約700至1000µL。於一些具體實施例，體積為約1mL至10mL，於一些具體實施例，體積為少於15mL。
於某些具體實施例，劑量可為範圍約1x109 GC/g腦質量至約1x1012 GC/g腦質量。於某些具體實施例，劑量可為範圍約3x1010 GC/g腦質量至約3x1011 GC/g腦質量。於某些具體實施例，劑量可為範圍約5x1010 GC/g腦質量至約1.85x1011 GC/g腦質量。
於一具體實施例，病毒構築體能以至少約1x109 GC至約1x1015 、或約1x1011 至5x1013 GC之劑量被遞送。遞送此等劑量之適當體積及濃度可由本技術領域中具有通常知識者決定。例如，可選擇約1µL至150mL的體積，對於成年人選擇較大體積。典型地，對於新生兒，合適的體積為約0.5mL至約10mL，對於較大的嬰兒，可選擇約0.5mL至約15mL。對於學步兒，可選擇約0.5mL至約20mL的體積。對於兒童，可選擇至多約30mL的體積。對於前青少年及青少年，可選擇至多約50mL的體積。於另一些具體實施例，病患可接受鞘內投予，選擇約5mL至約15mL的體積，或約7.5mL至約10mL。可決定其它適合的體積及劑量。劑量可被調整以平衡治療益處與任何副作用，且此種劑量可依據運用的rAAV.GLB1的治療應用而變化。
根據已公開方法，可將上述rAAV.GLB1遞送至宿主細胞。可投予rAAV至人類或非人類的哺乳動物患者，其較佳懸浮於生理學上可相容的載劑。於某些具體實施例，為了投予至人類病患，將rAAV適合地懸浮於水性溶液，該水性溶液含有鹽水、界面活性劑、及生理上可相容的鹽或鹽之混合物。適合地，調整此調配物至生理上可接受的pH，例如，範圍為pH 6至9、或pH 6.0至7.5、或pH 6.2至7.7、或pH 6.5至7.5、或pH 7.0至7.7、或pH 7.2至7.8、或約7.0。於某些具體實施例，調整此調配物至pH約6.0、約6.1、約6.2、約6.3、約6.4、約6.5、約6.6、約6.7、約6.8、約6.9、約7.0、約7.1、約7.2、約7.3、約7.4、約7.5、約7.6、約7.7、或約7.8。於某些具體實施例，於鞘內遞送，可能冀望pH約7.28至約7.32、約6.0至約7.5、約6.2至約7.7、約7.5至7.8、約6.0、約6.1、約6.2、約6.3、約6.4、約6.5、約6.6、約6.7、約6.8、約6.9、約7.0、約7.1、約7.2、約7.3、約7.4、約7.5、約7.6、約7.7、或約7.8，可能冀望pH約6.8至約7.2。然而，可選擇最廣範圍及此等子範圍內的其它pH用於其它遞送途徑。
於另一具體實施例，組成物包括載劑、稀釋劑、賦形劑及/或佐劑。鑑於對所針對的適應症轉移病毒，本技術領域中具有通常知識者可容易地選擇適合的載劑。例如，一適合的載劑包括鹽水，其能以許多種緩衝溶液來調配(例如，磷酸鹽緩衝食鹽水)。其它示例性載劑包括無菌的鹽水、乳糖、蔗糖、磷酸鈣、明膠、聚葡萄醣、瓊脂、果膠、花生油、芝麻油、及水。緩衝液/載劑應包括防止rAAV黏附到輸液管上但不干擾rAAV活體內結合活性的成分。適合的界面活性劑或界面活性劑的組合可選自無毒的非離子界面活性劑。於一具體實施例，選擇終止於一級羥基的雙官能嵌段共聚物界面活性劑，例如，諸如泊洛沙姆188(一以商品名Pluronic® F68 [BASF]、 Lutrol® F68、Synperonic® F68、Kolliphor® P188為人所知)，其具有中性pH，具有8400之平均分子量。可選擇其它界面活性劑和其它泊洛沙姆，即由一個聚氧伸丙基(聚(環氧丙烷))之中央疏水鏈及兩側的兩個聚氧伸乙基(聚(環氧乙烷))之親水鏈所構成的非離子三嵌段共聚物、SOLUTOL HS 15(Macrogol-15 羥基硬脂酸酯)、LABRASOL(聚氧辛酸甘油酯(Polyoxy capryllic glyceride))、聚氧基-油基醚(polyoxy-oleyl ether)、TWEEN(聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯)、乙醇及聚乙二醇。於一具體實施例，調配物含有泊洛沙姆。此等共聚物通常以字母「P」(用於泊洛沙姆)跟三個數字命名：前兩個數字x100給出聚氧伸丙基核心的近似分子量，最後一個數字x10給出聚氧伸乙基含量百分比。於一具體實施例，選擇泊洛沙姆188。界面活性劑可於懸浮液中以高至約0.0005%至約0.001%之量存在。
於一例，調配物可含有例如，緩衝食鹽溶液，其包含於水中的氯化鈉、碳酸氫鈉、右旋糖、硫酸鎂(例如硫酸鎂・7H2 O)、氯化鉀、氯化鈣(例如氯化鈣・2H2 O)、磷酸氫二鈉及其等之混合物中的一或多種。適合地，對於鞘內遞送，容積滲透濃度(osmolarity)在與腦脊髓液相容的範圍內(例如，約275毫滲莫/升(mOsm/L)至約290mOsm/L)；參見，例如，emedicine.medscape.com/-article/2093316-overview。可選擇地，對於鞘內遞送，可使用市售稀釋劑作為懸浮劑，或與另一種懸浮劑及其它可選擇的賦形劑組合使用。參見，例如， Elliotts B®溶液[Lukare Medical]。各10mL之 Elliotts B溶液含有：氯化鈉，USP-73mg；碳酸氫鈉，USP-19mg；右旋糖，USP 8mg；硫酸鎂・7H2 O，USP  3mg；氯化鉀，USP-3mg；氯化鈣・2H2 O，USP-2mg；磷酸氫二鈉・7H2O，USP-2mg；注射用水，USP-qs 10mL。電解質之濃度：鈉(149mEq/公升)；碳酸氫根(22.6mEq/公升)；鉀(4.0mEq/公升)；氯根(132mEq/公升)；鈣(2.7mEq/公升)；硫酸根(2.4mEq/公升)；鎂(2.4mEq/公升)；磷酸根(1.5mEq/公升)。
成分的分子式和分子量為：
成分 分子式 分子量
氯化鈉 NaCl 58.44
碳酸氫鈉 NaHCO3 84.01
右旋糖 C6 H12 O6 180.16
硫酸鎂 • 7H2 O Mg2 SO4 • 7H2 O 246.48
氯化鉀 KCl 74.55
氯化鈣 • 2H2 O CaCl2 • 2H2 O 147.01
磷酸氫二鈉• 7H2 O Na2 HPO4 • 7H2 O 268.07
Elliotts B溶液之pH為6至7.5，容積滲透濃度為每公升288 mOsmol(計算值)。於某些具體實施例，鞘內最終調配物緩衝液(ITFFB)調配物緩衝液包含人工腦脊髓液，該人工腦脊髓液包含緩衝食鹽水及一種或多種之鈉、鈣、鎂、鉀或其混合物；及表面活性劑。於某些具體實施例，界面活性劑包含約0.0005%至約0.001%之懸浮液。於另一具體實施例，百分比(%)係基於重量(w)比(即w/w)計算。
於某些具體實施例，含有rAAVhu68.GLB1的組成物(例如，ITFFB調配物)係於pH範圍6.0至7.5、或6.2至7.7、或6.8至8、或7.2至7.8、或7.5至8。於某些具體實施例，最終調配物係於pH範圍約7、或7至7.4、或7.2。於某些具體實施例，於鞘內遞送，可冀望pH高於7.5，例如， 7.5至8、或7.8。
於某些具體實施例，pH約7被冀望用於鞘內遞送以及其它遞送途徑。
於某些具體實施例，調配物可含有不包含碳酸氫鈉的。此種調配物可含有於水中包含磷酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂及其混合物之一或多者的緩衝食鹽水溶液，諸如Harvard’s緩衝液。水溶液可進一步含有Kolliphor® P188，一種泊洛沙姆，其由BASF商業販售，之前以商標名Lutrol® F68出售。於某具體實施例中，水溶液可具有7.2之pH。於某具體實施例中，水溶液可具有約7之pH。
於另一具體實施例，調配物可含有緩衝食鹽水溶液，該緩衝食鹽水溶液包含1mM磷酸鈉(Na3 PO4 )、150mM氯化鈉(NaCl)、3mM氯化鉀(KCl)、1.4mM氯化鈣(CaCl2 )、0.8mM氯化鎂(MgCl2 )、及0.001%泊洛沙姆(例如， Kolliphor®)188。於某些具體實施例，調配物具有約7.2之pH。於某些具體實施例，調配物具有約7之pH。參見，例如，harvardapparatus.com/harvard-apparatus-perfusion-fluid.html。於某些具體實施例，Harvard’s緩衝液為較佳，因Harvard’s緩衝液觀察到較佳的pH穩定性。下表提供Harvard’s緩衝液及和Elliot’s B緩衝液之比較。
腦脊髓液(CSF)組成物
組分 單位 CSF Elliot’s B Harvard’s
Na+ mEq/L 117-137 149 150
K+ mEq/L 2.3-4.6 4.0 3.0
Mg+ mEq/L 2.2 2.4 0.8
Ca2+ mEq/L 2.2 2.7 1.4
Cl- mEq/L 113-127 132 155
HCO3 - mEq/L 22.9 22.6 0
Phos mg/dL 1.2-2.1 1.5 1.0
葡萄糖 mg/dL 45-80 80 -
Pluronic % - 0.001%(被添加) 0.001%(被添加)
容積滲透濃度 mOsm/L 295 288 290
pH 7.31 6.0-7.5* 偏移至9+ (8.2+w/o滴定) 7.2(被滴定至)
於某些具體實施例，調配緩衝液為具Pluronic F68的人工CSF。於其它具體實施例，調配緩衝液可含有一或多種之滲透增強劑。適合的滲透增強劑之例可包括，例如，甘露醇、甘膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、去氧膽酸鈉、水楊酸鈉、辛酸鈉、癸酸鈉、月桂硫酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂醚或EDTA。
可選擇地，除了rAAV及載劑之外，本發明之組成物可含有其它習用的醫藥成分，諸如防腐劑、或化學穩定劑。適合的示例性防腐劑包括氯丁醇、山梨酸鉀、山梨酸、二氧化硫、沒食子酸丙酯、對羥基苯甲酸酯(paraben)類、乙基香草醛、甘油、苯酚及對氯苯酚。適合的化學穩定劑包括明膠及白蛋白。
依據本發明之組成物可包含醫藥上可接受的載劑，如上定義。適合地，本文所述組成物包含有效量之一或多種AAV，懸浮於醫藥上適合的載劑及/或與適合的賦形劑混合而被設計用於經由注射、滲透泵、鞘內導管、或以另外的裝置或途徑遞送至對象。於一例中，組成物被調配用於鞘內遞送。於一具體實施例，組成物被調配用以經由腦大池內注射(ICM)投予。於一具體實施例，組成物被調配用以經由CT導引的枕骨下注射至腦大池。
如本文所使用，術語「鞘內遞送」或「鞘內投予」係指藥物經由注射至椎管的投予途徑，更具體而言為進入蜘蛛膜下腔以使其到達腦脊髓液(CSF)。鞘內遞送可包括腰椎穿刺、室內(包括腦室內(ICV))、枕骨下/腦池內、及/或C1-2穿刺。例如，可藉由腰椎穿刺方法導入物質以在整個蜘蛛膜下腔擴散。於另一例，可注射至腦大池。
如本文所使用，術語「腦池內遞送」或「腦池內投予」係指藥物直接進入腦大池小腦延髓之腦脊髓液中的投予途徑，更具體而言係經由枕骨下穿刺或藉由直接注射至腦大池或經由永久定位的管子。
於某些具體實施例，包含調配物緩衝液及如本文提供之rAAV.GLB1(例如，rAAVhu68.GLB1)的水性組成物被遞送至需要其之患者。於某些具體實施例，rAAV.GLB1具有AAV衣殼(例如，AAVhu68衣殼)及包含5’ AAV ITR-啟動子–可選擇的增強子–可選擇的內含子–GLB1基因–polyA–3’ITR的載體基因體。於某些具體實施例，ITRs來自AAV2。於某些具體實施例，存有多於一個啟動子。於某些具體實施例，增強子存在於載體基因體。於某些具體實施例，存有多於一個增強子。於某些具體實施例，內含子存在於載體基因體。於某些具體實施例，存有增強子及內含子。於某些具體實施例，polyA為SV40 poly A。於某些具體實施例，polyA為兔β-球蛋白(RBG)poly A。於某些具體實施例，載體基因體包含5’AAV ITR–CB7啟動子–GLB1基因–RBG poly A–3’ITR。於某些具體實施例，載體基因體包含5’ AAV ITR–EF1a啟動子–GLB1基因–SV40 poly A–3’ITR。於某些具體實施例，載體基因體包含5’ AAV ITR–UbC啟動子– GLB1基因–SV40 poly A–3’ITR。於某些具體實施例，GLB1基因具有SEQ ID NO：5。於某些具體實施例，GLB1基因具有SEQ ID NO：6。於某些具體實施例，GLB1基因具有SEQ ID NO：7。於某些具體實施例，GLB1基因具有SEQ ID NO：8。於某些具體實施例，載體基因體具有SEQ ID NO：12。於某些具體實施例，載體基因體具有SEQ ID NO：13。於某些具體實施例，載體基因體具有SEQ ID NO：14。於某些具體實施例，載體基因體具有SEQ ID NO：15。於某些具體實施例，載體基因體具有SEQ ID NO：16。
於某些具體實施例，最終調配物緩衝液調配物緩衝液包含人工腦脊髓液，該人工腦脊髓液包含緩衝食鹽水及一種或多種之鈉、鈣、鎂、鉀或其混合物；及表面活性劑。於某些具體實施例，界面活性劑為約0.0005%至約0.001%之懸浮液。於某些具體實施例，界面活性劑為Pluronic F68。於某些具體實施例，Pluronic F68的量為懸浮液之約0.0001%。於某些具體實施例，組成物係以pH範圍7.5至7.8用於鞘內遞送。於某些具體實施例，組成物係以pH範圍 6.2至7.7、或6.9至7.5、或約7用於鞘內遞送。於一具體實施例，百分比(%)係基於重量比或體積比計算。於另一具體實施例，百分比表示「最終體積每100毫升中的克數」。
於某些具體實施例，本文所述組成物之治療在動物及/或人類患者中具有最小至輕度的DRG感覺神經元的無症狀變性，對於感覺神經毒性及次臨床感覺神經元病變為良好耐受的。
於某具體實施例中，本文所述組成物於治療的對象/患者有用於改善功能的及臨床的結果。此種結果可於下列組成物投予後時間點測量：約30日、約60日、約90日、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、約12個月、約13個月、約14個月、約15個月、約16個月、約17個月、約18個月、約19個月、約20個月、約21個月、約22個月、約23個月、約24個月、約2.5年、約3年、約3.5年、約4年、約4.5年及然後每年一次直到約5年。測量頻率可為約每1個月、約每2個月、約每3個月、約每4個月、約每5個月、約每6個月、約每7個月、約每8個月、約每9個月、約每10個月、約每11個月、或約每12個月。
於某些具體實施例，與未治療對照比較，本文所述組成物於經治療的對象中顯示所測量的藥效學及臨床功效。
於某些具體實施例，可經由下列一或多種而評量藥效學功效、臨床功效、功能性結果、或臨床結果：(1)存活；(2)餵食管獨立性；(3)癲癇日記，例如，發病率、發作、頻率、長度、及癲癇類型；(4)生活品質(例如，通過PedsQL測量)；(5)神經認知和行為發展；(6)例如在血清或CSF中的β-gal酶表現或活性；以及(7)如本文所述的其它參數。貝萊嬰兒發展量表及文蘭量表可用於量化組成物對適應行為、認知、語言、運動功能及健康相關生活品質的發展及/或變化的影響。
於某些具體實施例，神經認知發展係基於下列一或多者：貝萊嬰兒發展量表之與年齡相等的認知的變化、一般動作、精細動作、感知及表達溝通分數；文蘭適應行為量表之每個領域的標準分數變化；及藉由兒童生活品質量表及兒童生活品質嬰兒量表(Pediatric Quality of Life Inventory-and the Pediatric Quality of Life Inventory Infant Scale(PedsQL and PedsQL-IS))中總分的變化之兒童的生活品質改變。
BSID(貝萊嬰兒發展量表：主要用於評估1至42個月大的嬰兒和幼兒的發育(Albers and Grieve, 2007, Test Review:Bayley, N.(2006).Bayley Scales of Infant and Toddler Development– Third Edition.San Antonio, TX:Harcourt Assessment.Journal of Psychoeducational Assessment.25(2):180-190)。它由一系列標準化的發展性遊戲任務組成，並藉由將成功完成的項目的原始分數轉換為量表分數和綜合分數，將這些分數與從同齡的典型發長兒童中獲得的規範進行比較，來得出發展商數(developmental quotient)。貝萊-III有3個主要子測試；認知量表，包括注意熟悉和不熟悉的物體、尋找跌落的物體、以及假裝遊戲(pretend play)等項目；語言量表，用於評估對語言的理解和表達(例如遵循指示及命名對象的能力)；以及一個用於測量一般動作和精細動作技能(例如，抓力、坐下、堆積木及爬樓梯)。最新版本為BSID-III。
文蘭：從五個方面評估從出生到成年(0-90歲)的適應行為：溝通、日常生活技能、社會化、運動技能、及適應不良行為。最新版本為文蘭III。從文蘭-II到文蘭-III的改良使更好地理解發育障礙的一些問題。
基於僅對嬰幼期GM1神經節苷脂症患者進行前瞻性研究的數據選擇BSID及文蘭(Brunetti-Pierri and Scaglia, 2008, GM1 gangliosidosis:Review of clinical, molecular, and therapeutic aspects.Molecular Genetics and Metabolism.94(4):391-396.)。BSID-III的與年齡相等的分數顯示認知和一般動作領域的測試量表均下降了28個月，而文蘭-II適應行為量表的分數仍可測量，儘管遠低於正常水平，到28個月齡時。儘管此等工具顯示了地板效應，但它們被證明是衡量這一嚴重受損族群發展變化的適合量表，此等量表的跨文化有效性使它們適合於國際研究。
PedsQL及PedsQL-IS：如嚴重的兒科疾病，疾病對家庭的負擔為顯著的。兒童生活品質量表™為一種經過驗證的工具，可評估兒童及其父母的生活品質(藉由父母代理報告)。其已在健康的兒童和青少年中得到驗證，並已用於多種兒科疾病(Iannaccone et al., 2009, The PedsQL in pediatric patients with Spinal Muscular Atrophy:feasibility, reliability, and validity of the Pediatric Quality of Life Inventory Generic Core Scales and Neuromuscular Module.Neuromuscular disorders :NMD .19(12):805-812；Absoud et al., 2011, Paediatric UK demyelinating disease longitudinal study(PUDDLS)."BMC Pediatrics.11(1):68；及Consolaro and Ravelli, 2016, Chapter 5-Assessment Tools in Juvenile Idiopathic Arthritis.Handbook of Systemic Autoimmune Diseases.R. Cimaz and T. Lehman, Elsevier.11:107-127)。因此，包含PedsQL以評估rAAV.GLB1對患者及其家人的生活品質的影響。其可應用於2歲及以上的孩子的父母，因此，隨著兒童年齡於5年追蹤期，可提供更多訊息。The Pediatric Quality of Life Inventory™ Infant Scale(Varni et al., 2011, "The PedsQL™ Infant Scales:feasibility, internal consistency reliability, and validity in healthy and ill infants."Quality of Life Research.20(1):45-55.)為經父母完成的經認證的模組化工具，被設計用於測量與健康相關的生活品質，專門針對1~24個月大的健康及患病嬰兒。
給定目標族群中疾病的嚴重度，對象可藉由入選已達成運動技能，發展並隨後喪失了其他運動里程碑，或者尚未顯示出運動里程碑發展的跡象。評估追蹤所有里程碑的達成年齡及喪失年齡。根據第I部分GM1和治療性GLB1 基因之本文提供的表中概述的WHO標準，為六個總里程碑定義運動里程碑達成。鑑於患有嬰幼期GM1神經節苷脂症的對象可在生命的幾個月內出現症狀，並且通常在4個月齡之前不會獲得第一個WHO運動里程碑(無支撐坐立)(中位數：5.9個月齡)，此終點可能缺乏評估治療益處程度的敏感性，尤其是在治療時出現明顯症狀的對象中。為了此原因，亦包括對可應用於嬰兒的適合年齡的發展里程碑的評估(Scharf et al., 2016, Developmental Milestones.Pediatr Rev. 37(1):25-37；quiz 38, 47.)。一缺點係該發布的工具旨在供臨床醫生和父母使用，並且在具有里程碑意義的典型年齡範圍內組織技能，而沒有參考正常範圍。然而，該數據對於總結相對於未治療的具嬰幼期GM1疾病的兒童或神經型兒童的典型獲取時間隨時間推移所保持、獲得或喪失的發展里程碑可能提供資訊。
隨著疾病的進展，兒童可能會發展出癲癇。癲癇活動的發作使我們能夠確定使用rAAV.GLB1進行治療是否可以預防或延遲該族群中癲癇發生或降低癲癇發作頻率。 要求父母保存癲癇發作日記，以追蹤癲癇的發生、頻率、長度及癲癇類型。
於某些具體實施例，藥效學功效、臨床功效、功能性結果、或臨床結果亦可包括疾病的CNS表現，例如，MRI隨時間測量的體積變化。所有神經節苷脂酶的嬰幼期表現型均顯示出一致的大頭畸形，並且顱內MRI體積迅速增加，同時腦組織體積(大腦皮質和其他較小的結構)和心室體積均增大。此外，隨著疾病的進展，包括胼胝體, 尾狀體及殼核的各種較小的腦的子結構以及小腦皮質通常會縮小(Regier et al., 2016s, and Nestrasil et al., 2018，如本文所引述)。以rAAV.GLB1治療具有萎縮和體積變化穩定的證據可減緩或停止CNS疾病表現的進展。基於報導的GM1和GM2神經節苷脂症患者視丘結構變化的證據，亦可包括視丘和基底神經節中T1/T2訊號強度的變化(正常/異常)(Kobayashi and Takashima, 1994, Thalamic hyperdensity on CT in infantile GM1-gangliosidosis.”Brain and Development.16(6):472-474)。於某些具體實施例，藥效學功效、臨床功效、功能性結果、或臨床結果可能包括藉由MRI測量的總腦容量、腦亞結構容量及側腦室容量的變化；及/或視丘和基底神經節活動中T1/T2訊號強度的變化。
替代地或另外地，藥效學功效、臨床功效、功能性結果、或臨床結果可包括生物標誌物，例如rAAV.GLB1之藥效學和生物活性，β-gal酶活性，其可在CSF和血清中被測量，CSF GM1濃度、血清和尿液硫酸角質素水平、己糖胺酶活性降低、以及腦部MRI，表現出嬰幼期GM1 神經節苷脂症的持續快速萎縮(Regier et al., 2016b，如本文所引述)。
於某些具體實施例，本文所述組成物有用於減緩疾病進行，例如，藉由達成的年齡、喪失的年齡和保持或獲得年齡適合的發展及動作里程碑的兒童百分比來評估(如世界衛生組織[WHO]基準所定義)。
於某些具體實施例，藥效學功效、臨床功效、功能性結果、或臨床結果可包括肝臟和脾臟體積；及/或EEG和視覺誘發電位(VEP)。
VI. 用於將藥物組成物遞送到腦脊髓液中的設備及方法
於一態樣，本文提供之rAAV或組成物可經由此段落所提供的方法及/或裝置及述於WO 2018/160582者進行鞘內投予，其藉由引用而併入本文。另一種合適的裝置描述於PCT/US20/14402，標題為Microcatheter for Therapeutic and/or Diagnostic Interventions in the Subarachnoid Space」，2020年1月31日申請，其藉由引用而併入本文。或者，可選擇其它裝置及方法。
於某些具體實施例，此方法包括：經由脊髓針將CT引導的枕骨下注射至病患的腦大池的步驟。如本文所使用，術語電腦斷層造影(CT)係指放射線攝影術，其中藉由電腦自沿軸線製成的一系列平面截面影像而構築身體結構的三維影像。
在治療當天，準備適當濃度的rAAV.GLB1。將含有適當容積(例如，3.6mL、4.6mL、或5.6mL)的rAAV.GLB1的注射器送入處置室。進行研究藥物投予時有下列人員在場：進行此處置的介入醫師；麻醉師及呼吸技術人員；護士及醫師助理；CT(或手術室)技術人員；現場研究協調員。在藥物投予之前，先進行腰椎穿刺以移除預定體積的CSF(例如，約5mL)，然後在鞘內(IT)注射碘化造影劑，以幫助可視化腦大池的相關解剖學結構。可於針頭插入之前或期間給予靜脈內(IV)造影劑，以替代鞘內造影劑。對於對象進行麻醉、插管，且置於處置台上。使用無菌技術將注射部位備妥並用布蓋好。在螢光鏡導引下，將脊椎針(例如，對象年齡3個月至18歲用之2”或3”25 G脊椎針)事先插入腦大池。可使用較大的導引針以輔助針頭放置。確認針頭放置後，將延伸套件連接到脊椎穿刺針上，並使其充滿CSF。在介入醫師的裁量下，可對延伸套件連接含造影劑的注射器，並少量注入以確認針頭在腦大池中的放置。藉由CT導引+/-照影劑注射而確認針頭放置後，將包含適當量之rAAV.GLB1注射器連接到延伸套件。緩慢地(例如，經過約1至2分鐘)注射注射器內含物，而在注射過程中未對注射器柱塞施加過大的力。注入總共3mL、4mL、或5mL之rAAV.GLB1；0.6mL之rAAV.GLB1殘留於設備中。將針頭、延長管及注射器緩慢地從對象身上取下，並放置在手術托盤上，以丟棄到適當的生物危害廢物容器中。檢查針插入部位是否有出血或CSF洩漏的跡象，並按照執行者的指示進行處理。如說明，使用紗布、手術膠帶及/或透明敷料(例如Tegaderm)對部位進行覆蓋。放置繃帶後，對象保持俯臥姿勢至少20分鐘。將對象從CT掃描儀中移出，以仰臥位放在擔架上。必須有足夠的人員在場，以確保運送及和定位過程中的對象安全。停止麻醉，並根據機構的麻醉後照護指南恢復該對象。若適合，將移除神經生理設備。在恢復期間約1小時內，擔架的頭部下降到約20-30度。根據機構指南，將對象運送到適合的麻醉後護理單位。
本文所述鞘內方法的其他或替代投予途徑包括例如全身、口服、靜脈內、腹膜內、皮下或肌內投予。
於一具體實施例，劑量可藉由腦質量而進行比例調整，腦質量提供CSF腔室大小的近似值。於另一具體實施例，劑量轉換係基於下述之腦質量：成年小鼠為0.4 g，少年恆河獼猴為90 g，4-18個月大的兒童為800 g。下表提供了鼠類MED研究、NHP毒理學研究以及等效的人類劑量的說明性劑量。
劑量 (GC/g腦質量) 小鼠(GC) NHP(GC) 人類(GC)
3.33×1011 1.30×1011 3.00×1013 2.70×1014
1.11×1011 4.40×1010 1.00×1013 8.90×1013
3.33×1010 1.30×1010 3.00×1012 2.70×1013
1.11×1010 4.40×109 - 8.90×1012
於某些具體實施例，以單一劑投予rAAV.GLB1至對象。於某些具體實施例，冀望為多劑(例如2劑)。例如，對於6個月以下的嬰兒，可能需要分開幾日、幾週或幾個月而遞送多劑。
於某些具體實施例，單劑之rAAV.GLB1為由約1x109 GC/g腦質量至約5x1011 GC/g腦質量。於某些具體實施例，單劑之rAAV.GLB1為由約1x109 GC/g腦質量至約3x1011 GC。於某些具體實施例，單劑之rAAV.GLB1為由約1x1010 GC/g腦質量至約3x1011 GC/g腦質量。於某些具體實施例，rAAV.GLB1之劑量為由1x1010 GC/腦質量至3.33x1011 GC/腦質量。於某些具體實施例，rAAV.GLB1之劑量為由1x1011 GC/腦質量至3.33x1011 GC/腦質量。於某些具體實施例，單劑之rAAV.GLB1為由1.11×1010 GC/g腦質量至3.33×1011 GC/g腦質量。
於某些具體實施例，單劑之rAAV.GLB1為由1x1010 GC/g腦質量至3.4x1011 GC/g腦質量。於某些具體實施例，單劑之rAAV.GLB1為由3.4x1010 GC/g腦質量至3.4x1011 GC/g腦質量。於某些具體實施例，單劑之rAAV.GLB1為由1.0x1011 GC/g腦質量至3.4x1011 GC/g腦質量。於某些具體實施例，單劑之rAAV.GLB1為約1.1x1011 GC/g腦質量。於某些具體實施例，單劑之rAAV.GLB1為至少1.11×1010 GC/g腦質量。於其它具體實施例，可選擇不同劑量。
於較佳具體實施例，對象為人類患者。於此情形，單劑之rAAV.GLB1為由約1x1012 GC至約3x1014 GC。於某些具體實施例，單劑之rAAV.GLB1為由9x1012 GC至3x1014 GC。於某些具體實施例，rAAV.GLB1之劑量為由5x1013 GC至3x1014 GC。於某些具體實施例，單劑之rAAV.GLB1為由8.90×1013 GC至2.70×1014 GC。於某些具體實施例，單劑之rAAV.GLB1為由每患者8x1012 基因體拷貝(GC)至每患者3x1014 GC。於某些具體實施例，單劑之rAAV.GLB1為由每患者2x1013 GC至每患者3x1014 GC。於某些具體實施例，單劑之rAAV.GLB1為由每患者8x1013 GC至每患者3x1014 GC。於某些具體實施例，單劑之rAAV.GLB1為由每患者約9x1013 GC。於某些具體實施例，單劑之rAAV.GLB1為至少8.90×1013 GC。於其它具體實施例，可選擇不同劑量。
可以劑量單位調配此組成物以含有AAV之量為範圍約1x109 基因體拷貝(GC)至約5x1014 GC(以治療對象平均體重70 kg)。於一些具體實施例，以劑量單位調配此組成物以含有AAV之量為範圍由1x109 基因體拷貝(GC)至5x1013 GC；由1x1010 基因體拷貝(GC)至5x1014 GC；由1x1011 GC至5x1014 GC；由1x1012 GC至5x1014 GC；由1x1013 GC至5x1014 GC；由8.9x1013 GC至5x1014 GC；或由8.9x1013 GC至2.7x1014 GC。於某些具體實施例，以劑量單位調配此組成物以含有AAV之量為至少1x1013 GC、2.7x1013 GC、或8.9x1013 GC。
於一具體實施例，進行脊椎穿刺(spinal tap)，其中去除約15mL(或更少)至約40mL的CSF，且其中將rAAV.GLB1與CSF混合及/或懸浮於相容的載劑中並遞送至對象。於一例，rAAV.GLB1濃度為由1x1010 基因體拷貝(GC)至5x1014 GC；由1x1011 GC至5x1014 GC；由1x1012 GC至5x1014 GC；由1x1013 GC至5x1014 GC；由8.9x1013 GC至5x1014 GC；或由8.9x1013 GC至2.7x1014 GC，但其它量諸如約1x109 GC、約5x109 GC、約1x1010 GC、約5x1010 GC、約1x1011 GC、約5x1011 GC、約1x1012 GC、約5x1012 GC、約1.0x1013 GC、約5x1013 GC、約1.0x1014 GC、或約5x1014 GC。於某些具體實施例，GC中的濃度顯示為每脊椎穿刺的GC。於某些具體實施例，GC中的濃度顯示為每脊椎穿刺每mL的GC。
可與本文提供的rAAV.GLB1組成物一起進行協同療法。諸如本申請案中較早描述的協同療法藉由引用併入本文。
一種此類協同療法可為免疫調節劑。用於此種協同療法之免疫抑制劑包括，但未限於，糖皮質素、類固醇、抗代謝物、T-細胞抑制劑、巨環內酯(例如，雷帕黴素或rapalog)、及細胞生長抑制劑，包括烷化劑、抗代謝物、細胞毒性抗生素、抗體、或對親免素有活性的藥劑。免疫抑制劑可包括氮芥、亞硝脲、鉑化合物、胺甲喋呤、硫唑嘌呤、巰嘌呤、氟尿嘧啶、放線菌素、蒽環類、絲裂黴素C、博來黴素、光輝黴素、IL-受體-(CD25-)或CD3-導向的抗體、抗IL-2抗體、環孢素、他克莫司、西羅莫司、IFN-β、IFN-γ、類鴉片、或TNF-α(腫瘤壞死因子-α)結合劑。於某些具體實施例，免疫抑制療法可於基因療法投予之前開始。此種療法可涉及於相同日之二或多種藥物的共同投予(例如，去氫皮質醇、嗎替麥考酚酯(MMF)及/或西羅莫司(即，雷帕黴素))。於基因療法實施後能以相同劑量或調整劑量繼續使用此等藥物之一種或多種。如需要時，此種療法可為約1週、約15日、約30日、約45日、60日、或更長。
例如，當在GM1中考慮營養時，放置胃造口管為適當。當呼吸功能惡化，提供氣管切開術或非侵入式呼吸支持。電動輪椅和其它設備可改善生活品質。
詞語「包含」(comprise、comprises、及comprising)被包括性地而不是排他性地解釋。詞語「由…組成」(consist、consisting)及其變體被排他性地而不是包括性地解釋。儘管說明書中的多個具體實施例使用「包含」語句來呈現，但在其它情況下，相關具體實施例亦意圖使用「由…組成」或「實質上由…組成」語句來解釋和描述。
術語「表現」在本文中以其最廣泛的含義使用，且包含RNA的產生或RNA及蛋白質的產生。關於RNA，術語「表現」或「轉譯」特別涉及肽或蛋白質的產生。表現可為一時的或可為穩定的。
如本文所使用，術語「NAb力價」係產生多少中和抗體(例如抗AAV Nab)的量度，其中和其靶向抗原決定位(例如AAV)的生理作用。抗AAV NAb力價可如下述測量，例如，Calcedo, R., et al., Worldwide Epidemiology of Neutralizing Antibodies to Adeno-Associated Viruses.Journal of Infectious Diseases, 2009.199(3):p. 381-390，其藉由引用而併入本文。
於一些具體實施例，AAV或組成物枝投予改善GM1神經節苷脂症之症狀，或GM1神經節苷脂症之改善的神經症狀。於一些具體實施例，治療之後，患者具有以下一項或多項：延長平均壽命、減少對餵食管的需求、減少癲癇發作及頻率、減少向神經認知能力下降的進展及/或改善神經認知發展。
如本文所使用，「表現匣」係指包含編碼序列、啟動子的核酸分子，且可包括其之其它調節序列。於某些具體實施例，載體基因體可含有二或以上個表現匣。於其它具體實施例，術語「轉基因」可與「表現匣」交替使用。通常，此類用於產生病毒載體的表現匣包含本文所述基因產物的編碼序列，其兩側是病毒基因體的包裝訊號及其它表現控制序列，諸如彼等本文所述者。
當使用於所提及之蛋白質或核酸時，術語「異源的」表示該蛋白質或核酸包含在自然界中彼此之間沒有相同關係的兩個或更多個序列或子序列。例如，核酸通常是重組產生的，具有二或多個來自無關基因的序列，其排列以產生新的功能性核酸。例如，於一具體實施例，該核酸具有來自一個基因的啟動子，其被安排以引導來自不同基因的編碼序列的表現。如此，參照編碼序列，該啟動子為異源的。
「複製缺陷的病毒」或「病毒載體」係指合成或人工病毒顆粒，其中含有感興趣的基因(例如，GLB1 )的表現匣被包裝於病毒衣殼(例如，AAV或波卡病毒(bocavirus))或套膜中，亦被包裝於該病毒衣殼或套膜中的任一病毒基因體序列為複製缺陷的；即，它們無法產生後代病毒顆粒，但保留感染標靶細胞的能力。於一具體實施例，病毒載體之基因體不包括編碼複製所需酶的基因(該基因體可被工程化為「無膽的(gutless)」-僅含有感興趣的基因，側邊為增幅和包裝人工基因體所需的訊號)，但可能在生產過程中提供此等基因。因此，由於除非存在複製所需的病毒的酶，否則後代病毒顆粒的複製和感染不會發生，而被認為可安全地用於基因療法。
如本文所使用，「有效量」係指rAAV組成物的量，其在標靶細胞中遞送及表現一定量之來自載體基因體的基因產物。可基於動物模式而不是人類患者來確定有效量。本文描述適當的鼠類或NHP模式之例。
應注意術語「一」(a、an)係指一或以上，例如，「一增強子」應理解為代表一或多個增強子。如此，術語「一」(a或an)、「一或以上」及「至少一種」於本文中可互換使用。
如上述，當使用於修飾一數值時，術語「約」意指±10%的變動，除非另有指明。
如上所述，術語「增加」、「降低」、「減少」、「改善」、「改進」、「延遲」、「較早」、「緩慢」、「停止」或其任何文法的變體、或表示變化的任何相似術語，意指與對應參考(例如，未經治療的對照、GM1患者或特定階段的GM1患者或健康對象或沒有GM1的健康人類的相應水平)比較為約5倍、約2倍、約1倍、約90%、約80%、約70%、約60%、約50%、約40%、約30%、約20%、約10%、約5% 的變動，除非另有指明。
如本文所使用，「患者」或「對象」係指哺乳類動物，包括人類、獸醫學或農場動物、家畜動物或寵物、及通常用於臨床研究的動物。於一具體實施例，此等方法及組成物的對象為人類。於某些具體實施例，該患者具有GM1。
除非於本說明書中另有定義，否則本文所用的技術及科學術語具有與本領域中具有通常知識者和參照公開文本所通常理解的相同含義，公開文本為本領域中具有通常知識者提供了本申請案中所使用之許多術語的一般指引。
[實施例] 下列實施例僅為說明性的且未意圖用於限制本發明。
實施例 1 ： AAVhu68+ 去醯胺化 分析AAVhu68的修飾。簡而言之，使用與此研究無關的載體基因體生產AAVhu68載體，各個均於293細胞中使用習用的三重轉染法而生產。有關此等技術的一般說明，參見例如Bell CL,et al ., The AAV9 receptor and its modification to improve in vivo lung gene transfer in mice.J Clin Invest .2011；121:2427–2435。簡而言之，例如編碼待包裝序列(表現自雞β-肌動蛋白啟動子的轉基因、來自猴病毒40(SV40)晚期基因的內含子和poly A)且兩側為AAV2反向末端重複序列的質體，係藉由HEK293細胞以編碼AAV2rep 基因和AAVhu68cap 基因的質體以及腺病毒輔助質體(pAdΔF6)之三重轉染而被包裝。可使用CsCl梯度離心而純化所生成的AAV病毒顆粒，濃縮並冷凍以備之後使用。
變性及烷基化：於100µg解凍的病毒製劑(蛋白質溶液)中，添加2µg之1M二硫蘇糖醇(DTT)及2µl之8M胍鹽酸鹽(GndHCl)，並在90℃下培養10分鐘。使溶液冷卻至室溫，然後添加5µl新鮮製備的1M碘乙醯胺(IAM)，並於黑暗中於室溫培養30分鐘。30分鐘後，藉由添加1µg之1M DTT終止烷基化反應。
消化：在變性的蛋白質溶液中，以將最終的GndHCl濃度稀釋至800mM的體積來添加20mM碳酸氫銨，pH 7.5-8。添加胰蛋白酶溶液以使胰蛋白酶與蛋白質的比率為1：20，並於37°C下培養隔夜。消化後，添加TFA至終濃度0.5%，以終止消化反應。
質譜分析：藉由UHPLC-MS/MS分析大約1微克之合併的消化混合物。LC係在UltiMate 3000 RSLCnano系統(Thermo Scientific)上進行。移動相A為具0.1%甲酸的MilliQ水。移動相B為具0.1%甲酸的乙腈。LC梯度係耗費15分鐘由4% B升至6% B，然後至10% B持續25分鐘(共40分鐘)，然後至30% B持續46分鐘(共86分鐘)。樣品直接裝載至管柱。管柱尺寸為75 cmx15 um I.D.並裝有2微米C18介質(Acclaim PepMap)。LC與四極Orbitrap質譜儀(Q-Exactive HF，Thermo Scientific)經由使用離子源的nanoflex電噴灑遊離而連接。將該管柱加熱至35℃，並施加2.2 kV的電噴灑電壓。質譜儀係按程序進行以自前20個離子獲取串聯式質譜。完整的MS解析為120,000，MS/MS解析為30,000。歸一化碰撞能量(Normalized collision energy)設為30，自動增益控制設為1e5，最大填充MS設為100ms，最大填充MS/MS設為50ms。
數據處理：質譜儀RAW數據文件係藉由BioPharma Finder 1.0(Thermo Scientific)分析。簡而言之，所有搜索皆要求10ppm的前驅物質量耐受性、5ppm的片段質量耐受性、胰蛋白酶裂解最多1個漏失裂解，半胱胺酸烷基化的固定修飾，甲硫胺酸/色胱酸氧化的可變修飾，天冬醯胺酸/麩醯胺酸去醯胺化、磷酸化、甲基化、及醯胺化。
於下表中，T係指胰蛋白酶，C係指胰凝乳蛋白酶。
修飾AAVhu68
酶 T T T T C C C C T T T   
% 覆蓋率 93.6 92 93.1 92.5 90.2 89.7 91.1 88.9 98.9 97 94.6 92.4
+去醯胺化(Deamid)
~N35                                    
N57+Deamid 87.6 95.5 89.3 88.2 90.5 96.3 86.4 84.8 100.0 100.0 99.0 92.7
N66+Deamid 4.7                                 
N94+Deamid 11.3 10.9 11.0 5.3 11.6 10.4 10.8 5.6 5.0 11.1 5.4 16.0
N113+Deamid       1.8                           
~N253+Deamid 17.7 22.0 21.1 15.0 17.0 22.6 20.5 15.6 4.2 5.5      
Q259+Deamid 35.2 25.6 21.0    35.4 26.3 20.9 9.2            
~N270+Deamid 16.4 25.1 23.2 16.6 15.9 24.9 23.5 16.1 0.2         
~N304+Deamid 2.6 2.9 2.8 1.3 2.5 2.8 2.9 1.3 16.6 10.3      
~N314+Deamid                         6.5         
N319+Deamid 0.3 2.8 2.8 0.2    2.9 2.8 0.2            
N329+Deamid 72.7 85.6 89.1 86.8 71.0 87.2 88.7 84.7 85.5 79.4 78.9 91.8
N336+Deamid    30.8 9.3 100.0    31.0 9.2 95.7            
~N409+Deamid 21.3 22.9 23.9 24.0 22.0 23.4 24.7 24.2            
N452+Deamid 98.8 99.7 99.2 100.0 98.9 97.3 98.1 95.2 98.2 68.7 67.4 49.4
N477+Deamid 4.4 4.3 4.3 2.6 4.5 4.4 4.3 2.6       0.8   
N512+Deamid 97.5 97.9 95.3 95.7 92.2 91.8 99.2 96.1 99.7 98.2 87.9 75.7
~N515+Deamid 8.2 21.0 16.0    8.3 21.0 16.5 0.0 2.5 3.0    15.1
~Q599+Deamid 4.0 15.4 10.1 13.6 4.0 15.5 10.0 13.8 15.8         
N628+Deamid 5.3    5.6    5.4 0.0 5.4 0.0            
N651+Deamid 0.9 1.6 1.6                0.5         
N663+Deamid 3.4    3.5 3.7 3.4 0.0 3.4 3.6            
N709+Deamid 0.6 0.8 20.2 0.6 0.6 0.8 19.8 0.6 0.3 1.3 0.1 0.2
N735                         25.0 42.7    21.7
+乙醯化(Ac)：
K332+Ac 100.0            
~K693+Ac 13.0 13.5            
~K666+Ac 93.8            
~K68+ Ac 59.2            
                                      
+異構化(Iso)：
D97+Iso 0.5 0.4 0.4 0.2 0.5    0.4 0.2            
D107+Iso    0.3    0.3    0.3                  
D384+Iso 0.8          0.9                     
                                      
+磷酸化(Phos)
S149+Phos 5.8 5.7 5.2 9.8 5.7 5.9 5.2 9.9            
~S499+ Phos          30.6                        
~T569+ Phos 0.9                                 
~S586+ Phos    3.6                              
                                      
+氧化
~W23+Oxi    4.7 5.5       4.8 5.5               
W247+Oxi 1.5 0.4 0.7    1.4                     
W247+Oxi至犬尿胺酸(kynurenine)    0.1          0.1                  
W306+Oxi 0.7 0.9 1.6 1.8 0.7 1.0 1.6 1.8            
W306+氧化至犬尿胺酸       0.3          0.3               
M404+Oxi 0.1    0.2    0.1    0.2               
M436+Oxi 4.9    10.2 23.0 4.8    10.2 22.6            
~M518+Oxi 29.9    1.5 10.6 29.9    1.5 10.5            
~M524+Oxi 18.8 31.6 52.7    18.4 31.1 52.5 14.2            
M559+Oxi 19.0 21.6 19.6 20.9 19.6 21.3 20.1 20.9            
~M605+Oxi 12.2 15.2       12.8 14.8                  
W619+Oxi 1.0    0.6 1.5 1.0    0.6 1.5            
W619+氧化       20.3                           
~M640+Oxi 23.5 64.2 24.6    22.4 21.1 25.6               
W695+Oxi 0.3    0.4 0.4 0.3    0.4 0.4            
                                      
+醯胺化
~D297+醯胺化 72.9 73.3            
於AAVhu68衣殼蛋白的情形，通常顯示4個殘基(N57、N329、N452、N512)去醯胺化水準＞70%，且於不同批次中多數情形＞90%。其它天冬醯胺酸殘基(N94、N253、N270、N304、N409、N477、及Q599)亦於各個批次中顯示出高達~20%的去醯胺化水平。最初使用胰蛋白酶消化物鑑定去醯胺化水平，並以胰凝乳蛋白酶消化物驗證。
因此，包含AAVhu68衣殼蛋白的AAV可包括衣殼蛋白之異源性族群，因為AAV可含有顯示不同去醯胺化水平的AAVhu68衣殼蛋白。具有各種去醯胺化水平的AAVhu68 vp1蛋白的異源性族群可為vp1蛋白(其由編碼SEQ ID NO：2之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現所產生)、由SEQ ID NO：1所產生的vp1蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：2之1至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：1至少70%相同的核酸序列所產生的vp1蛋白。具有各種去醯胺化水平的AAVhu68 vp2蛋白的異源性族群可為vp2蛋白(其由編碼SEQ ID NO：2之至少約胺基酸138至736預測的胺基酸序列的核酸序列的表現所產生)、由包含SEQ ID NO：1之至少核苷酸412至2211的序列所產生的vp2蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：2之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：1之至少核苷酸412至2211至少70%相同的核酸序列所產生的vp2蛋白。具有各種去醯胺化水平的AAVhu68 vp3蛋白的異源性族群可為vp3蛋白(其由編碼SEQ ID NO：2之至少約胺基酸203至736預測的胺基酸序列的核酸序列的表現所產生)、由包含SEQ ID NO：1之至少核苷酸607至2211的序列所產生的vp3蛋白、或由與編碼SEQ ID NO：2之至少約胺基酸203至736預測的胺基酸序列之SEQ ID NO：1之至少核苷酸607至2211至少70%相同的核酸序列所產生的vp3蛋白。
對成年恆河彌猴進行ICM投予的AAVhu68.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG(3.00x1013 GC)，並在28日後進行屍檢以評估載體轉導。在腦的廣泛區域觀察到AAVhu68之轉導(數據未顯示)。如此，AAVhu68衣殼提供CNS中交叉校正的可能性。
實施例 2 ：製造 - 組分及材料 由含有用以編碼由雞β肌動蛋白啟動子以巨細胞病毒增強子(CB7)[SEQ ID NO：10]、人類延長起始因子1α啟動子(EF1a)[SEQ ID NO：11]或人類泛素C啟動子(UbC)[SEQ ID NO：9](1229bp,  GenBank #D63791.1)]且兩側為AAV2反向末端重複序列所表現的人類GLB1的序列的順式質體構築載體。構築各種對人類GLB1[SEQ ID NO：4之aa序列]的編碼序列。野生型序列再現於SEQ ID NO：5。生產各種工程化GLB1編碼序列並被提供於SEQ ID NO：6、7、或8。
藉由黏附性HEK 293細胞的三重轉染，載體被包裝於AAV血清型hu68衣殼，並藉由碘克沙醇梯度離心純化，如先前於Lock, M.,et al. Rapid, Simple, and Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale.Human Gene Therapy 21, 1259-1271(2010)中所述。AAV血清型Hu68衣殼被描述於WO2018/160582，其藉由引用完整被併入本文。
更具體而言，AAVhu68.GLB1藉由將HEK293工作細胞庫(WCB)細胞以下列之三重質體轉染所產生：1)AAV順式載體基因體質體，2)稱為pAAV2/hu68.KanR的AAV反式質體，其編碼AAV2複製酶(rep)及AAVhu68衣殼(cap)，及3)稱為pAdΔF6.KanR的輔助腺病毒質體。
AAV順式載體基因體質體的序列元件的描述： •反向末端重複(ITR)：ITRs係源自AAV2的相同之反向互補序列(130bp, GenBank # NC001401)，位於載體基因體所有組件的兩側。當反式提供AAV和腺病毒輔助功能時，ITR序列功用既作為載體DNA複製的起始點，又作為載體基因體的包裝訊號。如此，ITR序列代表載體基因體複製及包裝所需的唯一順式序列。 •啟動子：源自人類泛素C(UbC)啟動子的調節元件：選擇此種普遍存在的啟動子(1229 bp, GenBank #D63791.1)以於任何CNS細胞類型中驅動轉基因表現。 •編碼序列：GLB1基因，基於最大人類密碼子使用，編碼β-半乳糖苷酶。GLB1酶催化從神經節苷脂(677 aa之2034 bp多核苷酸及終止密碼子，Genbank #AAA51819.1, EC3.2.1.23)水解β-連接的半乳糖。 •嵌合內含子(CI)–由人類β-球蛋白剪接供體及免疫球蛋白G(IgG)剪接受體元件所組成雜合內含子。 •SV40多腺苷酸化訊號(232bp)：SV40多腺苷酸化訊號順式促進基因mRNA之高效多腺苷酸化。此元件功能係如轉錄終止的訊號、在初期轉錄本的3’端的特定裂解事件及長多腺苷酸尾的添加。
AAVhu68反式質體：pAAV2/hu68.KanR AAV2/hu68反式質體pAAV2/hu68.KanR係於賓州大學的James M. Wilson博士的實驗室中被構築。AAV2/hu68反式質體編碼為AAV載體基因體的複製及包裝所需的四個野生型AAV2複製酶(Rep)蛋白。AAV2/hu68反式質體亦編碼三個WT AAVhu68病毒顆粒蛋白質衣殼(Cap)蛋白，其可組裝成AAV血清型hu68之病毒顆粒殼以收容AAV載體基因體。AAVhu68序列獲自人類心臟組織DNA。
為了產生pAAV2/hu68.KanR反式質體，將源自質體pAAV2/9n(其在衍生自pBluescript KS載體的質體骨架上編碼野生型AAV2 rep及AAV9 cap基因)的AAV9 cap基因移除並替換為AAVhu68 cap基因。胺苄青黴素(ampicillin)抗性(AmpR)基因亦以康黴素(kanamycin)抗性(KanR)基因替換，獲得pAAV2/hu68.KanR。將AAV p5啟動子(其通常驅動rep表現)由rep之5’端移至cap之3’端，留下經截短的rep之p5啟動子上游。此經截短的啟動子用於向下調節rep的表現，因此，使載體的產量最大化(圖1C)。質體的所有組成部分均已藉由直接定序驗證。
pAdDeltaF6(KanR)腺病毒輔助質體： 質體pAdDeltaF6(KanR)大小為15,774 bp。此質體含有對AAV複製為重要的腺病毒基因體的區域，即E2A、E4、及VA RNA(此腺病毒E1功能由HEK293細胞提供)，但不含有其它腺病毒複製或結構基因。此質體不含有對複製為至關重要的順式元件，如腺病毒反向末端重複序列，因此，預期不會產生感染性腺病毒。此質體源自Ad5(pBHG10，一種基於pBR322的質體)之E1、E3缺失分子殖株。將缺失導入至Ad5 DNA中以移除不必要之腺病毒基因的表現並將腺病毒DNA的數量從32 kb減少到12 kb。最後，將胺苄青黴素抗性基因替換為康黴素抗性基因以產生pAdeltaF6(KanR)。保留在此質體中的E2、E4及VAI腺病毒基因，以及存在於HEK293細胞中的E1，對於AAV載體生產都是必需的。
AAVhu68.GM1係藉由HEK293細胞之暫時轉染，隨後進行下游純化而製造。製造方法流程圖示於圖12A–12B。進入產品製備方法的主要試劑顯示在圖表的左側，方法中品質評估顯示在圖表的右側。亦提供每個生產及純化步驟的描述。
細胞培養及收穫：細胞培養及收穫製造方法包含四個主要製造步驟：細胞接種及擴增、暫時轉染、載體收穫及載體澄清(圖12A)。
細胞接種及擴增：將經完整特徵化的HEK293細胞系用於生產方法。
暫時轉染：生長約4日後(DMEM培養基+10% FBS)，將細胞培養基替換為新鮮的無血清DMEM培養基，並使用基於聚乙亞胺(PEI)的轉染方法以三種生產質體來轉染細胞。最初，製備的DNA/PEI混合物含有順式(載體基因體)質體、反式(rep及cap基因)質體、及輔助質體，與GMP級PEI(PEIPro HQ，PolyPlus Transfection SA)成比例。在小規模優化研究中，確定最適合AAV生產的該質體比例。充分混合後，將溶液在室溫下靜置多至25分鐘，然後添加到無血清培養基中以終止反應，最後添加到iCELLis生物反應器中。反應器受溫度和溶氧控制，並培養細胞5日。
載體收穫：使用拋棄式生物處理袋，藉由無菌方式將培養基從生物反應器中抽出，從PALL iCELLis生物反應器中收穫轉染的細胞和培養基。收穫後，添加去污劑、核酸內切酶及MgCl2 (核酸內切酶的輔助因子)以釋放載體並消化未包裝的DNA。在控制溫度的一次性混合器中將產品(於拋棄式生物處理袋中)於37°C培養2小時，以提供足夠的時間對轉染程序的結果之收穫物中殘存的細胞及質體DNA進行酶消化。執行此步驟以最小化最終載體藥物產物(DP)中的殘留DNA量。培養後，添加NaCl至終濃度為500mM，以幫助在過濾和下游切向流過濾(TFF)期間回收產物。
載體澄清：使用串聯連接的預濾器和深層過濾膠囊(1.2/0.22µm)作為無菌、封閉的管及袋組，其係藉由蠕動泵驅動，而自產物中去除細胞和細胞碎片。澄清確保保護下游過濾器及層析管柱免於結垢，而降低負荷菌(bioburden)的過濾確保於過濾器列的末端，去除在上游生產過程中可能引入的任何負荷菌，然後再進行下游純化。
純化方法：此純化方法包含四個主要製造步驟：藉由TFF的濃縮及緩衝液交換、親和性層析、陰離子交換層析、及藉由TFF的濃縮及緩衝液交換。於概述流程圖(圖12B)中描述此等方法步驟。面提供了每個製程的一般說明。
大規模切向流過濾：藉由使用定制的無菌、封閉式生物處理管、袋及膜組的TFF，達成經澄清的產物之體積減少(20倍)。TFF的原理係使溶液在平行於適當孔隙率(100 kDa)的膜的壓力下流動。壓差驅動較小尺寸的分子穿過膜並有效地進入廢物流，同時保留大於膜孔的分子。藉由使溶液再循環，平行流掃過膜表面，防止膜孔結垢及由於與膜結合而產物損失。藉由選擇適合的膜孔徑及表面積，可於保留並濃縮所欲分子的同時，快速減少液體樣品的體積。TFF應用中的透析過濾，涉及以與液體通過膜至廢物流之相同的速率對循環樣品中添加新鮮緩衝液。隨著透析過濾體積的增加，越來越多量的小分子自循環樣品被去除。此透析過濾造成澄清產物的適度純化，但亦達成與隨後的親和性管柱層析步驟相容的緩衝液交換。因此，利用100 kDa的PES膜進行濃縮，然後以最少四倍透析體積(diavolume)之由20 mM Tris pH 7.5和400 mM NaCl組成的緩衝液進行透析過濾。然後以1.2/0.22 µm深層過濾膠囊進一步澄清經透析過濾的產物，以移除任何沉澱的物質。
親和性層析：將經透析過濾後的產物應用於有效捕獲AAVhu68血清型的PorosTM Capture-SelectTM AAV 親和樹脂(Life Technologies)。於此等離子條件下，顯著百分比之殘留的細胞DNA及蛋白質流過管柱，而AAV顆粒被有效捕獲。施用後，以5倍體積的低鹽核酸內切酶溶液(250 U/mL核酸內切酶，20mM Tris pH 7.5，40mM NaCl，及1.5mM MgCl2 )處理管柱，以移除任何殘留的宿主細胞和質體核酸。洗滌管柱以移除其它進料雜質，然後進行低pH階段洗提(400mM NaCl，20mM檸檬酸鈉，pH 2.5)，其立即藉由收集至第1/10體積的中和緩衝液(200mM Bis-Tris丙烷，pH 10.2)中而被中和。
陰離子交換層析：為了達成進一步減少生產過程中的雜質，包括空的AAV顆粒，而將Poros-AAV洗提液合併者稀釋50倍(20mM Bis-Tris丙烷，0.001% Pluronic F-68，pH 10.2)以降低離子強度並使其與CIMultusTM QA monolith matrix(BIA Separations)結合。低鹽洗滌後，使用60倍管柱體積的NaCl線性鹽梯度(10-180 mM NaCl)洗提載體產物。此淺鹽梯度有效地將沒有載體基因體的衣殼顆粒(空的顆粒)從含有載體基因體的顆粒(完整的顆粒)中分離，而生成富含完整顆粒的製備物。收集完整的顆粒峰洗提物，中和，並於20mM Bis Tris Propane, 0.001% Pluronic F68, pH 10.2中稀釋20倍，重新施用於已於適當位置清理的相同管柱。重新施用10-180 mM NaCl鹽梯度，並收集適當的完整顆粒峰。評估峰面積並將其與先前的數據進行比較，以確定近似的載體產率。
藉由中空纖維切向流過濾之濃縮及緩衝液交換：使用TFF，將合併的陰離子交換中間體進行濃縮及緩衝液交換。於此步驟中，使用100kDa膜中空纖維TFF膜。於此步驟期間，使產物達到目標濃度，然後緩衝液交換至鞘內最終調配緩衝液(Intrathecal Final Formulation Buffer)(ITFFB，即，含0.001% Pluronic® F68的人工CSF)。產物經過無菌過濾(0.22µm)，儲存於無菌容器中，並於隔離區中於≤-60°C冷凍，直至釋放以進行最終填充。
最終填充：將冷凍的產物解凍、合併並使用最終調配緩衝液調整至目標濃度(稀釋或經由TFF濃縮步驟)。該產物最終通過0.22µm過濾器過濾，並被填充至帶有壓接密封塞的無菌West Pharmaceutical的Crystal Zenith(環狀烯烴聚合物)小瓶中，以待確定的填充量。個別將小瓶貼標籤。貼有標籤的小瓶儲存於≤-60°C。
實施例 3 開發表現人類β-gal的AAV載體並使用鼠類疾病模型評估將載體投予至CSF中對腦酶活性、胞溶體貯積損傷和神經系統症狀的影響。神經學評估改編自先前對GM1小鼠模型的研究[Ichinomya, S., et al.,  Brain Dev 2007；29:210-216.]。選擇此等評估以反映此模式之神經徵兆特徵。盲測檢查員評估了九個不同的參數：步態、前肢位置、後肢位置、軀幹位置、尾巴位置、迴避反應、翻身、垂直扶正反射、及降落傘反射。個別測試項目被分配以下四個分數之一：0(正常)、1(輕度異常)、2(中度異常)、及3(高度異常)。將每個參數的分數相加，以計算總分數。
A.材料及方法： 動物程序：所有動物程序均得到賓州大學委員會動物照護和使用機構的批准。GLB1剔除小鼠獲自RIKEN BioResource Research Center。在C57BL/6J背景上將小鼠維持為異型合子載體。於ICV注射，將載體在無菌磷酸鹽緩衝鹽水(Gibco)中稀釋至5µL的體積，然後使用定制的氣密注射器(Hamilton)和10毫米膠接的27號針頭在異氟烷麻醉的小鼠上徒手注射，以塑膠管連接到針座，以限制穿透深度為3毫米。在異氟烷麻醉的小鼠上進行頜下血液採集。將血液收集在血清分離管中，使其凝結，並藉由離心分離，然後等分並在≤-60°C冷凍。在屍檢時，用氯胺酮(ketamine)和甲苯噻嗪(xylazine)對小鼠進行鎮靜，並使用32-號連接到聚乙烯管通過枕下穿刺術收集CSF。以頸椎脫位術進行安樂死。立即將CSF、心臟、肺臟、肝臟和脾臟在乾冰上冷凍，並保存於≤-60°C。取出腦，收集額葉冠狀切片並冷凍以進行生化研究。剩餘的大腦用於組織學分析。
如實施例1及2中所述產生載體。
空：完整粒子比率：將載體樣品裝入具有12毫米光程長度的兩通道木炭芯組件(charcoal-epon centerpieces)的細胞中。將提供的稀釋緩衝液加載到每個槽的參考通道中。然後將經加載的槽放入AN-60Ti分析型轉子中，並裝載到裝有吸光度和RI檢測器的Beckman-Coulter ProteomeLab XL-I分析超速離心機中。在20°C完全平衡溫度後，轉子達到最終運行速度12,000rpm。約每3分鐘記錄一次於280nm掃描的吸光度，持續約5.5小時(每個樣品總共110次掃描)。使用c(s)法分析原始數據，並在分析程式SEDFIT中執行。繪製生成的大小分布及積分峰的圖表。與每個峰關聯的百分比值表示所有峰下總面積的峰面積分數，並基於在280nm處生成的原始數據；許多實驗室使用此等值來計算空：完整粒子比率。然而，因空的顆粒和完整顆粒在此波長下具有不同的消光係數，因此可相應地調整原始數據。消光係數調整前後的空的顆粒的比率和完整單體峰值兩者皆用於確定空：完整粒子比率。
具複製力之AAV分析：分析樣品中有無生產過程中可能潛伏生成之具複製力之AAV2/hu68(rcAAV)。基於細胞的成分係由接種的單層HEK293細胞(P1)、與測試樣品和野生型(WT)人類腺病毒5(Ad5)的稀釋液所組成。所測試產物的最大量為載體產物的1.00x1010 GC。由於腺病毒的存在，rcAAV在細胞培養中擴增。2日後，產生細胞溶胞產物，且Ad5被熱失活。然後將澄清的溶胞產物傳遞至第二輪細胞(P2)，以增強敏感性(同樣在Ad5存在下)。2日後，產生細胞溶胞產物，且Ad5被熱失活。然後將澄清的溶胞產物傳遞至第三輪細胞(P3)，以最大化敏感性(同樣在Ad5存在下)。2日後，裂解細胞以釋放DNA，然後對其進行qPCR以檢測AAVhu68帽序列。以Ad5依賴性方式擴增AAVhu68 cap序列表明rcAAV之存在。使用包含AAV2 rep和AAVhu68 cap基因的AAV2/hu68替代陽性對照能夠確定測定的檢出極限(0.1、1、10、及100IU)。使用rAAV的系列稀釋液(1.0×1010 、1.0x109 、1.0x108 、及1.0x107 GC)，可定量試驗樣品中存在的rcAAV的大約數量。
活體外效力：為了使ddPCRGC力價與基因表現相關，進行活體外相對效力生物測定。簡而言之，將細胞平鋪於96孔盤中，並於37℃/5% CO2 下培養隔夜。次日，將細胞以系列稀釋的AAV載體感染，並於37°C/5% CO2 下培養長達3天。收集細胞上清液並基於螢光基質之裂解分析β-gal活性。
總蛋白、衣殼蛋白、蛋白質純度、及衣殼蛋白比：首先使用二辛可寧酸(bicinchoninic acid)(BCA)分析，相對於牛血清白蛋白(BSA)蛋白質標準曲線，定量載體樣品的總蛋白量。藉由將等份樣品與套組中提供的Micro-BCA試劑混合而進行測定。相同的程序適用於BSA標準品的稀釋。將混合物在60℃下培養，並於562nm測量吸光度。使用4參數擬合(4‑parameter fit)，自已知濃度的標準吸光度生成標準曲線。根據4參數迴歸進行未知樣品的定量。為了提供rAAV純度的半定量測定，將樣品的基因體力價標準化，並於還原條件下藉由十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離5.00x109 GC。然後將SDS-PAGE凝膠以SYPRO Ruby染料染色。任何雜質帶均藉由光密度測定法定量。除了三種AAV特異性蛋白(VP1、VP2和VP3)之外，出現的染色帶被認為是蛋白質雜質。報告雜質帶的雜質質量百分比以及近似分子量。SDS-PAGE凝膠亦用於定量VP1、VP2和VP3蛋白並確定其比例。
酶活性分析：使用鋼珠均質器(TissueLyzer，Qiagen)在0.9%NaCl，pH 4.0中將組織均質化。3次冷凍解凍循環後，藉由離心將樣品澄清並藉由二辛可寧酸測定法(bicinchoninic acid分析(BCA))定量蛋白質含量。血清樣品直接用於酶測定。β-gal活性分析，將1µL樣品與99µL之0.5mM 4-甲基繖形酮基β-D-半乳哌喃糖苷(4-Methylumbelliferyl β-D-galactopyranoside)(Sigma M1633)之0.15M NaCl, 0.05% Triton-X100, 0.1M乙酸鈉，pH 3.58合併。將此反應溫育於37°C 30分鐘，然後藉由添加150µL之290mM甘胺酸、180mM檸檬酸鈉，pH 10.9而停止。將螢光與4MU的標準稀釋液進行比較。β-gal活性表示為每毫克蛋白質(組織)或每毫升血清或CSF之每小時釋放的nmol 4MU。HEX分析以與β-gal活性分析相同的方式進行，使用1 mM 4-甲基繖形酮基N-乙醯基-β-D-葡萄胺糖苷(Sigma M2133)作為基質，且組織裂解液的樣品體積為1µL，血清之樣品體積為2µL。
組織學：除了剔除小鼠模型，於屍檢後吾人亦進行組織學分析，比較經rAAV.hGLB1處理的GLB1-/-小鼠，與經媒液處理的GLB1-/-小鼠及GLB1+/-對照小鼠兩者。吾人評估藉由以菲利平(filipin)腦染色而胞溶體貯積損傷、結合GM1神經節苷脂的螢光分子、以及胞溶體相關膜蛋白1的免疫染色。菲利平染色顯示經媒液處理的GLB1-/-小鼠的皮質、海馬體和視丘之神經元中有明顯的GM1神經節苷脂蓄積，其於以rAAV.hGLB1處理的GLB1-/-小鼠中已正常化。免疫組織化學顯示溶劑處理的GLB1-/-小鼠中皮質及視丘中增加的胞溶體膜染色，其於經rAAV.hGLB1處理的GLB1-/-小鼠中減少，相似於GLB1+/-對照小鼠。將腦在4%多聚甲醛中固定過夜，在15%和30%蔗糖中平衡，然後在OCT包埋培養基中冷凍。冷凍切片以菲利平(Sigma, 10µg/mL)或抗GFAP或LAMP1之抗體染色。
抗β-gal抗體ELISA：將高結合力的聚苯乙烯ELISA平板每孔用100µL重組人β-gal(R＆D系統)以PBS中1µg /mL的濃度塗覆隔夜。將平板洗滌，並在室溫下用2%牛血清白蛋白的PBS溶液封閉2小時。將重複的孔以與在PBS中以1：1,000稀釋的血清樣品一起於室溫溫育1小時。將平板洗滌，與辣根過氧化物酶偶合的抗小鼠IgG多株抗體在封阻溶液中以1：5,000稀釋溫育1小時，並使用TMB基質顯影。
評價神經功能的治療效果
為了評估經rAAV.hGLB1處理的GLB1-/-小鼠的神經功能，根據製造商的說明，使用CatWalk XT步態分析系統(Noldus)(一種通常用於評估小鼠運動能力的分析系統)在連續兩日對四個月齡(rAAV.hGLB.1或媒液投予後三個月)進行步態分析。連續兩日對小鼠進行測試。在測試的每一日，對每隻動物至少進行了3次完整試驗。持續5秒以上的試驗或動物在停止或轉身之前沒有橫過器械整個長度的試驗被排除在分析之外。在測試的第二日，至少3次評估中為每隻動物定量平均步行速度及後足印記的長度。較慢的速度和加長的爪印表明運動性能受損。如下圖所示，與經媒液處理的GLB1-/- 小鼠相比，經rAAV.hGLB1處理的GLB1-/-小鼠的步行速度和足印長度顯著改善，且類似於GLB1+/- 對照小鼠。參見，例如，圖7C及7D。
生活中的評估包括監測生存、神經學檢查、步態分析以及評估血清轉基因表現(β-gal活性)。於投劑當日(第1日)對未經處理的GLB1 –/– 小鼠和正常GLB1 +/– 小鼠進行屍檢，以評估基線腦貯積損傷的嚴重性。於第150及300日將經媒液及載體處理的小鼠屍檢。
於第150日組中，除一隻經媒液處理的GLB1 –/– 小鼠外，所有小鼠均存活至計劃的屍檢(圖13)。載體投予後2日，此動物由於可能是由ICV注射程序引起的顱內出血而死亡。
於第300日組，在研究計劃終點之前，根據研究定義的安樂死標準對所有12隻經媒液處理的GLB1 –/– 小鼠實施安樂死。由於疾病的進展，小鼠表現出神經學症狀(即共濟失調、震顫及/或四肢無力)。經媒液處理的GLB1 –/– 小鼠的中位生存期為268日(範圍由185至283日)。在最低劑量組(4.4x109 GC)中，由於疾病進展而對5/12(41.7%)的動物實施安樂死，生存期為268-297日。治療後290日，由於疾病進展，對1.3x1010 GC劑量組中的單一隻動物(1/12 [8.3%])安樂死。所有接受載體劑量為4.4×1010 GC或1.3×1011 GC的動物均存活至研究終點。
步態分析評估在基線(第-7-0日)以及直到第240日的每60日，經媒液和載體處理的小鼠的步幅和後足印長。步態分析顯示經媒液處理的GLB1 –/– 小鼠進行性異常，而使用兩種最高載體劑量(1.3×1011 GC和4.4×1010 GC)處理的GLB1 –/– 小鼠在兩個步態參數上均表現出一致的改善。
在基線時，經媒液處理的GLB1–/–小鼠的平均步幅明顯短於正常GLB1 +/-對照，這種異常一直持續到第240日。在經rAAV.hGLB1處理的GLB1-/-小鼠中，步幅異常得到部分挽救，與所有劑量的經媒液處理的GLB1-/-小鼠相比，到60日時，其平均步幅均具有統計學上的顯著增加。然而，到第240日時，與經媒液處理的GLB1-/-小鼠相比，只有2個最高劑量組(1.3x1011 GC和4.4x1010 GC)保持明顯更長的平均步幅。
在第60日時，經媒液處理的GLB1–/–小鼠的後足印長度明顯長於正常GLB1+/-對照，這種異常一直持續到第240日。藉由在GLB1-/-小鼠中投予3種最高劑量(1.3x1011 GC、4.4x1010 GC、1.3x1010 GC)的rAAV.hGLB1可部分挽救後足印長異常，與第240日經媒液處理的GLB1-/-小鼠的後足印長相比，平均後足印長出現統計學上顯著的下降。
劑量範圍藥理學研究 進行藥理學研究以評估ICV投予rAAV.hGLB1後，GM1的GLB1基因剔除小鼠模型中的最小有效劑量或MED及β-gal表現水平。於此研究，以4個分別的劑量水平之rAAV.hGLB1以ICV-投予GLB1-/-小鼠。媒液以ICV投予GLB1-/-小鼠及異型合子GLB1小鼠、或HET小鼠。於此研究，rAAV.hGLB1之ICV投予導致腦和周圍器官中轉基因產物表現穩定、劑量依賴性增加、腦胞溶體貯積損傷的消退、神經表現型改善和GLB1-/-小鼠存活率提高。基於生存率、神經學檢查分數及腦貯積病變的統計學顯著改善，評估的最低劑量被認為是MED。
B.結果： 設計轉基因匣，該轉基因匣由雞β肌動蛋白啟動子與巨細胞病毒增強子(CB7)驅動的人類GLB1 cDNA、人類延長起始因子 1α啟動子(EF1a)或人類泛素C啟動子(UbC)所組成。每個匣被包裝在AAVhu68衣殼中，並藉由腦室內(ICV)注射至野生型小鼠而投予單一劑的1011 基因體拷貝(GC)。注射後2週，測量腦及CSF中的β-gal活性(圖2A-2B)。攜帶UbC啟動子的載體在腦及CSF中的β-gal活性均達到統計學上的顯著提高，其酶活性比未處理的野生型小鼠腦中的酶活性高2倍，而在CSF中的酶活性高10倍。因此選擇AAVhu68.UbC.hGLB1載體於進一步研究。
在GLB1-/- 小鼠模型中評估經優化的載體的功效。藉由新黴素(neomycin)抗性匣標靶的插入至GLB1基因之第6及/或第15外顯子，已發展出GM1神經節苷脂症之小鼠模型。Hahn, C.N.,et al. Generalized CNS disease and massive GM1-ganglioside accumulation in mice defective in lysosomal acid beta-galactosidase.Human molecular genetics 6, 205-211(1997)及Matsuda, J.,et al. Beta-galactosidase-deficient mouse as an animal model for GM1-gangliosidosis.Glycoconjugate journal 14, 729-736(1997)。與嬰幼期GM1神經節病患者相似，此等小鼠不表現功能性β-gal，且在腦中表現出GM1神經節苷脂的快速積累。腦GM1貯積在生命的最初幾週就已經很明顯，到3個月齡時，GLB1-/- 小鼠在大腦中的GM1積累程度與8個月齡的嬰幼期GM1患者相似(Hahn 1997，如上所引述)。GLB1-/- 小鼠的臨床表現型與嬰幼期GM1神經節苷脂症的模型最為相似，運動異常在4個月齡時出現，嚴重的神經系統症狀(例如共濟失調或麻痺)需要在10個月齡時出現安樂死(Hahn 1997;Matsuda 1997，如上所引述)。GLB1-/- 小鼠模型沒有表現出任何周圍器官受累，不像嬰幼期GM1患者經常會出現骨骼變形和肝脾腫大(Hahn 1997；Matsuda 1997，如上所引述)。因此，GLB1-/- 小鼠為嬰幼期GM1神經節苷脂症的神經學特徵的代表模型，但不是全身性疾病表現的代表模型。
在一個月齡時處理GLB1-/- 小鼠，並觀察到四個月齡時，它們通常會出現與腦部GM1水平相關的明顯步態異常，這與患有晚期疾病的嬰幼期GM1神經節苷脂症患者的相似(Matsuda 1997，如上所引述)。以AAVhu68.UbC.hGLB1的1.0x1011 基因體拷貝(GC)(n=15)或媒液(n=15)的單次ICV注射治療GLB1-/- 小鼠。以媒液處理的一組異型合子(GLB1+/- )小鼠(n=15)作為正常對照。在注射當日(第0日)和第10、28、60和90日收集血清。處理後90日，使用CatWalk XT步態分析系統(Noldus Information Technology，Wageningen，荷蘭)評估運動功能，然後對動物實施安樂死並收集組織進行組織學及生化分析。TCatWalk XT跟蹤小鼠在玻璃板上行走時的足跡。該系統量化每隻腳印的尺寸，並統計分析動物的速度和步態的其它特徵。為了進行此評估，在開始測試之前，先對Catwalk XT進行校準，並設置適合的走道寬度。將動物帶入房間，讓它們在黑暗中適應至少30分鐘，然後再運行Catwalk XT。一旦適應完成，選擇一隻動物並將其放置在走道的入口處。研究人員啟動採集軟體，並允許動物沿著走道行走。該動物的家籠被放置在走道的盡頭以作為鼓勵。當動物在指定的時限內成功走到走道的盡頭時，運行完成，否則重複運行。動物進行了三個試驗，最小持續時間為0.50秒，最大持續時間為5.00秒。認為試驗完成，需要進行三次成功的運行。若動物在10分鐘的測試後未能完成三次運行，則僅使用已完成的運行進行分析。由不知道動物ID和處理組評估人員進行分析。使用Catwalk XT軟體對運行進行自動分類，然後檢查足印的準確性和適當標籤。手動移除任何非足跡數據。該程式自動測量平均速度、步幅及後足印長度。計算並分析每組的左後足和右後足印長度的平均值。計算並分析每組足爪測得的步幅平均值。使用Prism 7.0(GraphPad軟體)進行分析。使用二因子變異數分析(ANOVA)，在每個時間點比較各組之間的神經學檢查分數及步態分析參數(步行速度及後足印長度)。使用對數秩檢定(log-rank test)(Mantel-Cox)比較各組間的生存曲線。對腦的LAMP1數據進行對數轉換，並使用單因子ANOVA分析然後Dunnett檢定進行比較。
一隻經AAV處理的小鼠於ICV注射過程中死亡。所有其它小鼠存活至90日研究終點。已顯示AAV遞送至CSF導致載體在周圍血液中分布並顯著地進行肝轉導。(Hinderer, C.,et al. Intrathecal gene therapy corrects CNS pathology in a feline model of mucopolysaccharidosis I. Molecular therapy :the journal of the American Society of Gene Therapy 22, 2018-2027(2014);Gray, S.J., Nagabhushan Kalburgi, S., McCown, T.J.& Jude Samulski, R. Global CNS gene delivery and evasion of anti-AAV-neutralizing antibodies by intrathecal AAV administration in non-human primates.Gene therapy 20, 450-459(2013)；Haurigot, V.,et al. Whole body correction of mucopolysaccharidosis IIIA by intracerebrospinal fluid gene therapy.The Journal of clinical investigation(2013)；Hinderer, C.,et al. Widespread gene transfer in the central nervous system of cynomolgus macaques following delivery of AAV9 into the cisterna magna.Molecular therapy.Methods & clinical development 1, 14051(2014)；Hordeaux, J.,et al. Toxicology Study of Intra-Cisterna Magna Adeno-Associated Virus 9 Expressing Human Alpha-L-Iduronidase in Rhesus Macaques.Molecular therapy.Methods & clinical development 10, 79-88(2018))。載體投予後10日，經AAVhu68.UbC.hGLB1處理的GLB1-/- 小鼠展現血清β-gal活性大於異型合子(GLB1+/- )對照(圖3A)。到第90日，在經AAVhu68.UbC.hGLB1處理的5/15小鼠中可檢測到抗人類β-gal的血清抗體。在整個研究中，除了兩隻小鼠外，所有鼠的血清β-gal活性持續升高，兩隻小鼠均產生抗人類β-gal的抗體(圖6)。包括心臟、肺臟、肝臟及脾臟的周圍器官亦表現出升高的β-gal活性(圖3B-3E)。一些開發出針對人類轉基因產物的抗體的動物在周圍器官中具有較低的β-gal活性。
屍檢時收集的CSF在經AAVhu68.UbC.hGLB1處理的GLB1-/- 小鼠中顯示β-gal活性超過異型合子對照CSF(圖4B)。經載體處理的小鼠的腦中的β-gal活性相似於異型合子對照β-gal活性(圖4A)。抗β-gal抗體似乎未影響腦或CSF β-gal水平。
使用生化和組織學分析評估腦異常的矯正。胞溶體酶經常在胞溶體貯積的調節中上調，此一發現已在GM1神經節苷脂症患者中得到證實(Van Hoof, F. & Hers, H.G.The abnormalities of lysosomal enzymes in mucopolysaccharidoses.European journal of biochemistry 7, 34-44(1968))。因此，在腦溶胞產物中測量胞溶體酶己糖胺酶(HEX)的活性。在經媒液處理的GLB1-/- 小鼠的腦樣本中，HEX活性升高，並且在經載體處理的動物中被標準化(圖5)。
為了評估胞溶體貯積病變的範圍，以菲利平(與GM1神經節苷脂結合的螢光分子)對胞溶體膜蛋白LAMP1進行了腦切片染色，並對胞溶體相關膜1(蛋白質LAMP1)進行免疫染色。菲利平亦與未酯化的膽固醇結合，儘管以前的研究已表明，菲利平染色主要反映GM1在GLB1-/- 小鼠中的積累(Arthur, J.R., Heinecke, K.A. & Seyfried, T.N.Filipin recognizes both GM1 and cholesterol in GM1 gangliosidosis mouse brain.Journal of lipid research 52, 1345-1351(2011))。菲利平染色顯示經媒液處理的GLB1-/-小鼠的皮質、海馬體和視丘之神經元中有明顯的GM1蓄積，該小鼠為經AAVhu68.UbC.hGLB1處理的小鼠(資料未顯示)。LAMP1免疫組織化學表明，GLB1-/- 小鼠的皮質和視丘的胞溶體膜染色增加，而在經載體處理的小鼠中則減少(資料未顯示)。藉由星狀細胞標記、膠質原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein)(GFAP)染色而評估神經膠瘤病。與經載體處理的對照相比，經載體處理的GLB1-/- 小鼠在視丘中顯示出明顯減少的星形膠質細胞增生(資料未顯示)。
為了評估經載體治療的GLB1-/- 小鼠的神經功能，在4個月齡時(載體或媒液投予後3個月)進行步態分析。先前注意到未經處理的GLB1-/- 小鼠在3~4個月齡時表現出臨床上明顯的步態異常。使用CatWalk系統對未經處理的GLB1-/- 小鼠和正常對照組進行的定量步態評估顯示出各種異常，包括較慢的自發行走速度、步幅差異以及步驟週期某些階段的持續時間(圖7C及7D)。由於GLB1-/- 小鼠的行走速度明顯變慢，大多數步態參數對速度的依賴性使得對許多這些明顯差異的解釋變得複雜(圖8A及8B)(Batka, R.J.,et al. The need for speed in rodent locomotion analyses.Anatomical record(Hoboken, N.J.:2007)297, 1839-1864(2014))。GLB1-/- 小鼠亦於後足的位置表現出一致的異常，其可藉由後足印長度的增加來衡量(圖7D)。發現此異常與步行速度無關，與先前的報告一致(Batka等人，如上文所引述)，使其成為評估GLB1-/- 小鼠中與速度無關的步態功能障礙的有用步態信號(圖8A及8B)。在連續兩日中使用同一組小鼠進行的測試顯示，在未經處理的GLB1-/- 小鼠中，較慢的自發行走速度和後足印長度增加為可重現的觀察結果(圖7A及7B)。經媒液處理的GLB1-/- 小鼠顯現相似於先前於未經處理的動物中鑑定的彼等步態異常(圖7A-7G)。於經載體處理的GLB1-/- 小鼠中標準化步行速度及足印長度(圖7A-7G)。
存活資料：圖13顯示研究中直到第300日的每個組的存活資料。由於具有神經學體徵、共濟失調、震顫及四肢無力的疾病進展，根據預定的研究終點，按照研究定義的安樂死標準對所有12隻經媒液處理的GLB1-/-小鼠實施安樂死。該組的中位存活期為268日。在最低劑量組中，由於疾病進展，對5/12隻動物實施安樂死。在第二低劑量組中，由於疾病進展，對1/12隻動物實施安樂死。兩個最高劑量組中的所有動物均存活至研究終點。
神經學檢查：到第240日，每60日以盲測法進行標準化的神經學檢查，並獲得平均總嚴重性分數。圖14C顯示每組在每個神經病學評定期間的平均總嚴重度分數。從第120日評估開始，投予媒液或最低劑量載體(4.4×109 GC)的Glb1–/– 小鼠表現出逐漸升高的總嚴重度分數，此表明神經學症狀的嚴重度正在增加。然而，投予最低劑量的Glb1–/– 小鼠的總嚴重度分數顯著低於經媒液處理的Glb1–/– 小鼠，此暗示該劑量(4.4×109 GC)部分挽救神經表現型。於第240日評估時，以下一個最高劑量(1.3x1010 GC)在7/12(58.3%)的動物中檢測到最小的異常，暗示神經表現型得到實質性挽救。在兩種最高的媒液劑量(1.3x1011 GC及4.4x1010 GC)下，神經學異常並不明顯，且此等組的總嚴重性分數在每個時間點均與正常的經媒液處理的Glb1+/– 對照相似，暗示完全挽救神經學表現型。
經媒液處理的GLB1 -/- 小鼠的結果顯示出逐漸更高的總嚴重性分數，表明從第120日開始評估的進行性神經學症狀。在最低劑量的rAAV.hGLB1時，藉由120日評估亦觀察到總嚴重度分數逐漸增加，儘管總嚴重度分數顯著低於同時間點經媒液處理的GLB1-/- 小鼠。於第二低的rAAV.hGLB1劑量下，在第240日評估時，在7/12隻動物中檢測到最小的異常。在rAAV.hGLB1的兩次最高劑量下，神經學異常並不明顯，且此等組的總嚴重性分數與正常經媒液處理的GLB1+/- 時間點相似。
組織學分析：亦進行組織學分析，比較於基線時、第150日及第300日經rAAV.hGLB1處理的GLB1-/-小鼠、經媒液處理的GLB1-/-小鼠及經媒液處理的GLB1 +/-對照小鼠的腦切片。將腦冷凍切片以抗胞溶體相關膜蛋白(LAMP1)(Abcam，Catalog#Ab4170)的抗體在4°C下染色隔夜。次日，洗滌載玻片，並與抗兔IgG TritC耦合的二級抗體在室溫下溫育1小時。洗滌載玻片並蓋上蓋玻片。使用VisioPharm影像分析軟體，將LAMP1染色定量為來自一個冠狀腦切片的整個腦皮層每個區域的陽性細胞。使用自動化程式在掃描的切片中對LAMP1陽性的皮質細胞(即表現出胞溶體膨脹的細胞)進行定量。對於由於疾病進展而未能在預定的300日屍檢時存活的動物，在安樂死時收集腦，並將數據作為第300日組的一部分呈現。與正常的未經處理的GLB1 +/-基線對照組相比，在第1日屍檢的未經處理的GLB1-/-基線小鼠腦中LAMP1陽性細胞的比例更高。在第150日及第300日，與經媒液處理的GLB1-/-對照相比，經rAAV.hGLB1處理的小鼠LAMP1陽性細胞的比例呈劑量依賴性降低。在rAAV.hGLB1的兩個最高劑量下，LAMP1陽性細胞的比例降低至與正常經媒液處理的GLB1 +/-對照相似的水平。
β-gal活性：在投予當日以及此後每60日直至第240日天，測量血清中的β-gal活性。屍檢時，測量腦及周圍器官(心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟)的β-gal活性。如圖9C所示，投予最大劑量的試驗hAAV.hGLB1(1.3x1011 GC)的GLB1-/- 小鼠血清中的平均β-gal活性約為正常經媒液處理的GLB1+/-對照的10倍。於第二最高劑量之試驗hAAV.hGLB1(4.4x1010 GC)，GLB1-/-小鼠的血清β-gal活性類似於正常媒液處理的GLB1+/-對照。其它所有rAAV.hGLB1劑量的GLB1-/- 小鼠血清β-gal活性相似於經媒液處理的GLB1-/- 對照者。
對於每種檢查的組織類型，兩組的平均β-gal活性水平在兩個時間點都相似(第150日及第300日)(圖17A-L)。於腦中，經載體處理的Glb1–/– 小鼠的β-gal活性呈劑量依賴性。所有劑量組的平均β-gal活性均高於經媒液處理的Glb1–/– 對照。然而，在兩個時間點，只有兩個最高劑量組(1.3x1011 GC和4.4x1010 GC)顯示出比正常經媒液處理的Glb1+/– 對照更高的平均β-gal活性。於投予載體後，一些周圍器官(例如，肝臟和脾臟)但不是全部(例如，肺臟和腎臟)表現出β-gal活性增加(圖17A-L)。特別注意，心臟在所有劑量下的β-gal活性均呈劑量依賴性增加，其平均水平高於經媒液處理的Glb1–/– 小鼠。然而，僅兩個最高劑量(1.3x1011 GC及4.4x1010 GC)在兩個時間點都將β-gal活性恢復至與正常經媒液處理的Glb1+/– 對照相似或更高的水平。
第300日存活至計劃的屍檢的組的所有動物的CSF中測量β-gal活性。由於沒有任何經媒液治療的Glb1+/-動物因疾病進展而存活到第300日，因此將經媒液處理的小鼠的β-gal活性水平與正常經媒液處理的Glb1+/-對照進行比較(圖16C)。第300日存活至計劃的屍檢的組的所有動物的CSF中測量β-gal活性。由於沒有任何經媒液治療的Glb1+/-動物因疾病進展而存活到第300日，因此將經媒液處理的小鼠的β-gal活性水平與正常經媒液處理的Glb1+/-對照進行比較(圖16C)。如圖16C所示，在評估的所有小鼠的CSF中均可檢測到β-gal活性。GLB1-/-小鼠投予兩個最高劑量的試驗rAAV.hGLB1(1.3x1011 GC和4.4x1010 GC)顯示出的CSF平均β-gal活性水平超過正常經媒液處理的GLB1+/-對照。儘管兩個最低劑量組(1.3x1010 GC和4.4x109 GC)中的β-gal活性與經媒液處理的Glb1+/-相似，但CSF中的β-gal活性通常是劑量依賴性的。在兩個最低劑量下具有相似的β-gal活性水平的原因可能與被給予最低載體劑量(4.4x109 GC)的動物的CSF樣品數量有關，此係受到該組高死亡率的限制；在該組中存活的動物可能比其它未存活的動物具有更高的β-gal表現。於所有組，β‑gal活性水平超過歷史對照經媒液處理的Glb1–/– 小鼠CSF的水平。
圖17A-L顯示屍檢後在腦、心臟及肝臟中的β-gal活性。於腦中，經rAAV.hGLB1處理的GLB1-/-小鼠中β-gal活性以劑量依賴方式增加。所有劑量組的平均β-gal活性均高於經媒液處理的GLB1-/-對照。然而，在兩個時間點，只有兩個最高劑量組顯示出比正常經媒液處理的GLB1+/-對照更高的平均β-gal活性。試驗rAAV.hGLB1投予後一些周圍器官中β-gal活性亦展現劑量依賴的增加。心臟在所有劑量下的β-gal活性均呈劑量依賴性增加，造成平均水平高於經媒液處理的GLB1-/-小鼠。然而，僅兩個最高劑量在兩個時間點都將β-gal活性恢復至與正常經媒液處理的GLB1+/-相似或更高的水平。試驗rAAV.hGLB1投予後肝臟中β-gal活性展現劑量依賴的增加。在除最低劑量外的所有劑量下，兩個時間點的平均β-gal活性水平均高於經媒液處理的GLB1-/-小鼠的水平，且與正常經媒液處理的GLB1 +/-對照的水平相似或更高。
C.討論： 此等結果表明，將rAAVhu68.hGLB1投予至CSF中可增加腦β-gal活性、減少神經元胞溶體貯積損傷，並防止神經性下降，基因轉移可預防及逆轉腦內GM1貯積。
此研究表明，當於此模型中已經存在明顯的腦貯積病變時，在4週齡時以AAV載體處理的Glb1-/-小鼠中不存在神經元貯積病變。此等結果表明基因轉移可能防止且逆轉GM1在腦中的貯積。具嬰幼期GM1神經節苷脂症患者為適合的AAV基因療法的人群，由於它們經常基於微妙的神經學發現進行診斷，此等發現出現在生命的最初6個月中，且在1到2年內不可避免地發生快速發展性退化之前。
實施例 4 ：動物模型 A.鑑定GLB1-/-小鼠模型中AAVhu68.UbC.GLB1的最小有效劑量(MED)
在GLB1-/- 小鼠模型中評估不同劑量的rAAVhu68.UbC.GLB1對CNS損傷和神經學症狀的影響。由盲測的檢閱者進行藉由血清酶活性、腦損傷的減輕、藉由自動步態分析(例如，經由CatWalk系統)測量的神經學症狀及標準化的神經學檢查(例如，姿勢、運動功能、感覺和反射的9點評估)，及存活來評估療效。亦進行安全性分析(包括血液收集及分析)。四週齡GLB1-/- 小鼠藉由ICV注射而接受rAAVhu68.UbC.GLB1之4劑(1.3×1011 GC、4.4×1010 GC、1.3×1010 GC或4.4×109 GC)之一者或媒液(每組n=24)。以媒液處理的異型合子的同一窩小鼠(n=24)作為正常對照。
每60日對每一組動物的一半進行血清β-gal酶活性、步態分析及神經學檢查，而在120日的觀察期內至少每30日測量一次體重。結果繪製為圖9A-9F，並簡要描述於下。
所有經處理的小鼠均看起來健康，表現出正常的體重增加。於觀察期內，各組之間的體重無顯著差異(圖9B)。
血清酶表現與實施例3中討論的研究一致。如圖9A所示，經媒液處裡的GLB1-/- 小鼠(其作為陰性對照)之β-gal酶活性保持在約10nmol/mL/小時左右，而陽性對照組(其為經媒液處理的GLB1+/- 小鼠)證實約100 nmol/mL/h酶活性。每隻小鼠以4.4x1010 GC的劑量以rAAVhu68.UbC.GLB1處理後，於第60日及第120日與陰性對照相比，β-gal酶的活性顯著增加。以每隻小鼠1.3x1011 GC的更高劑量的rAAVhu68.UbC.GLB1導致β-gal酶的活性高於第60日的陽性對照，並在第120日進一步升高。
GM1小鼠的步態表現型亦與實施例3中顯示的先前結果一致。獲得神經學檢查分數、後爪印長、後肢擺動時間及後肢步幅，並將結果繪製於圖9C-9F。對於所有四個標繪的參數，陰性對照和陽性對照之間存在顯著的統計差異，表明此等參數可作為評估功效的良好指標。與經媒液處理的GLB1-/- 小鼠比較，以4.4x1010 GC之rAAVhu68.UbC.GLB1處理的小鼠顯示後爪印長、後肢擺動時間及後肢步幅的顯著改善。1.3x1011 GC的更高劑量可增加後肢的擺動時間和更長的步幅，表示成功的矯正。與步態分析相比，神經學檢查更敏感。如圖9C所示，觀察到隨劑量增加神經學分數降低而顯示的劑量依賴性改善，而與陰性對照相比，以1.3×1010 GC的rAAVhu68.UbC.GLB1處理在總計分數中顯示出統計學意義。在低至每隻小鼠1.3x1010 GC的劑量下觀察到表現型校正的證據。
當所有未處理的動物皆被預期存活時，在至少另外150日之內，將繼續在該動物同齡組中收集相同組的參數。評估相對於未經處理的GLB1-/- 小鼠的存活率變化。
在上段中討論的前半的動物於處理後270日被犧牲。剩餘一半動物於處理後150日被犧牲。另外24隻小鼠用作基線屍檢對照。對於所有犧牲的動物，在經處理的動物和未經處理的動物之間進行組織學和生化學比較。屍檢後，將腦切成薄片並進行LAMP1染色以評估胞溶體貯積損傷，可使用自動成像系統對其進行定量。測量β-gal於腦、血清、及周圍器官中的活性。為了安全性分析，屍檢時採集血液以進行全血細胞計數和血清化學檢測，並由董事會認證的獸醫病理學家採集腦、脊髓、心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟及性腺以進行組織病理學評估。相對於經媒液處理的GLB1-/- 小鼠，可顯著減少腦貯積損傷的rAAVhu68.UbC.GLB1的最低劑量被選作最小有效劑量(MED)。
結果：在4週齡時，對GLB1-/-小鼠單次腦室內(ICV)投予rAAVhu68.UbC.GLB1的劑量範圍為4.40x109 基因體拷貝(GC)至1.30x1011 GC，結果確認與腦中測得的β-半乳糖苷酶活性增加有關。藉由自動步態分析及標準化的神經學檢查所測得的存活率、腦存儲的分辨率和神經功能，以劑量依賴性方式得到改善。經rAAVhu68.UbC.GLB1處理的小鼠的肝轉導和血清β-半乳糖苷酶活性顯著地超過異型合子對照(Glb +/-小鼠)。經rAAVhu68.UbC.GLB1處理可觀察到周圍器官的生化校正，此表明以單次ICV投予可治療中樞及周圍疾病的可能性。基於生存率、神經學檢查分數及腦貯積病變的統計學顯著改善，評估的最低劑量(4.4x109 GC)被認為是MED。
B.非人類靈長類動物(NHPs)的毒理學研究 選擇恆河獼猴進行毒理學研究係因為它們最能複製患者群體(4至18個月齡的嬰兒)的大小及CNS解剖結構，且可以使用臨床投予途徑(ROA)對其進行治療。選擇幼年動物為兒科試驗群的代表。於一具體實施例，幼年恆河獼猴為15至20個月齡。大小、解剖構造及ROA的相似性導致代表性的載體分布及轉導概貌，能夠準確評估毒性。此外，與囓齒動物模式相比，在NHP中進行更為嚴格的神經學評量，從而可更靈敏地偵測CNS毒性。
在幼年恆河獼猴中進行120日符合GLP的安全性研究，以研究ICM投予後AAVhu68.UbC.GLB1的毒理學。選擇120日的評估期，因為此給予分泌的轉基因產物足夠的時間以在ICM AAV投予後達到穩定的平線水平。研究設計摘述於下表。恆河獼猴接受三劑量水平之一者：總計3.0×1012 GC、總計1.0×1013 GC、或總計3.0×1013 GC(n=6/劑量)或媒液(n=4)。選擇劑量水平使其相等於彼等於MED研究中被評估者，當按腦質量比例調整(假設小鼠為0.4g，且恆河獼猴為90g)。進行基線神經學檢查、臨床病理學(具有差異的細胞計數、臨床化學、及凝血盤)、CSF化學、及CSF細胞學檢查。投予AAVhu68.UbC.GLB1或媒液後，每日監測動物的不適及異常行為的徵象。
在rAAVhu68.UbC.GLB1或媒液投予後30日，每週進行血液和CSF臨床病理學評量及神經學檢查，且之後每30日進行。於基線以及之後的每30日的時間點，藉由干擾素γ(IFN-γ)酶結合免疫斑點(ELISpot)分析而評量對AAVhu68的中和抗體及對AAVhu68及AAVhu68.UbC.GLB1轉基因產物反應的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。
恆河獼猴良好實驗室規範(GLP)毒理學研究(Rhesus macaque Good Laboratory Practice (GLP) Toxicology Study)
群命名 1 2 3 4
獼猴數 4 6 6 6
性別/年齡 M+F/幼年 M+F/幼年 M+F/幼年 M+F/幼年
試驗物 媒液 AAVhu68.UbC.GLB1 AAVhu68.UbC.GLB1 AAVhu68.UbC.GLB1
投予途徑 ICM ICM ICM ICM
載體劑量 (總共劑量) N/A 3.0×1012 GC 1.0×1013 GC 3.0×1013 GC
屍檢日 60(3) 120(3) 60(3) 120(3) 60(3) 120(3) 60(3) 120(3)
在投予rAAVhu68.UbC.GLB1或媒液任一者後，一半的動物在第60日被安樂死，另一半在第120日被安樂死。收穫組織用於全面的顯微組織病理學檢查。組織病理學檢查集中於中樞神經系統組織(腦、脊髓及背根神經節)及肝臟，因此等為ICM投予AAVhu68載體後轉導最嚴重的組織。此外，由脾臟及骨髓收穫淋巴細胞以評估於屍體剖檢時此等器官中是否有與衣殼和轉基因產物兩者發生反應的T細胞的存在。
藉由組織樣品的定量PCR，評估載體分布。在血清和CSF樣品中定量載體基因體。
結果： 於NHP中進行120日的符合GLP的良好實驗室實踐毒理學研究，以評估ICM投予後載體的安全性、耐受性及生物分布和排泄(脫落(shedding))槪貌。幼年雄性及雌性恆河獼猴接受單一ICM投予媒液或rAAV.hGLB1之三劑量水之一者。於投予後60或120日將來自每一同齡群的動物進行安樂死。
生命評估包括每日進行的臨床觀察、多次定期體檢、標準化的神經學監測、感覺神經傳導研究、或NCS、體重、血液和CSF的臨床病理、血清循環中和抗體的評估以及載體藥物動力學的評估及載體的排泄。
對動物進行屍檢，並收穫組織用於全面的組織病理學檢查、T細胞反應的測量及生物分布分析。
C.非臨床AAV研究中的感覺神經元毒性 評估AAV全身及鞘內(IT)投予的非臨床研究已一致地證明背根神經節(DRG)中感覺神經元的有效轉導，且於某些情形，涉及此等細胞的毒性的證據。鞘內投予可允許感覺神經元轉導，因為它們的中樞軸突暴露於CSF，或者rAAV可能直接到達細胞體，由於DRG暴露於脊髓CSF。非臨床研究的結果暗示rAAV.hGLB之ICM投予在年齡1至24個月之具有GM1神經節苷脂症的對象將增加中樞β-半乳糖苷酶水平並防止疾病進展。非臨床毒理學數據表明，臨床安全性監測應由彼等通常被利用於其它AAV基因療法的評估、以及周圍神經安全性監測所組成。
在rAAV.hGLB投予之前，對所有動物進行感覺神經傳導研究，之後每個月進行一次，以測量雙側正中神經感覺動作電位幅度及傳導速度。用氯胺酮(ketamine)/右美托咪定(dexmedetomidine)的組合使動物鎮靜。將經鎮靜動物放在帶有加熱袋的手術台上，使其側臥或背臥，以保持體溫。由於可能會干擾電信號採集，因此未使用電子加熱設備。
感覺神經傳導研究(NCS)使用NicoletEDX®系統(Natus Neurology)和Viking®分析軟體進行。簡而言之，將刺激探針放置在正中神經上，陰極最靠近記錄部位。將兩個針狀電極皮下插入到趾骨II的遠端指骨(參考電極)和近端指骨(記錄電極)的水平，而接地電極放置在刺激探針(陰極)的近端。使用WR50 Comfort Plus Probe兒科刺激器(Natus Neurology)。激發的反應被差異放大並顯示在監視器上。最初的採集刺激強度設置為0.0 mA，以便確認缺乏背景電信號。為了找到最佳的刺激位置，將刺激強度增加至10.0 mA，並在沿正中神經移動探針時產生一串刺激，直到找到最佳位置為止(由最大確定波形確定)。將探針保持在最佳位置，刺激強度以逐步的方式逐漸增加至10.0 mA，直到峰值幅度響應不再增加為止。記錄每個刺激反應並將其保存在軟體中。平均最多10次最大刺激反應，並報告正中神經。測量從記錄部位到刺激陰極的距離(cm)，並將其輸入軟體中。使用響應的開始潛伏期和距離(cm)計算傳導速度。報告傳導速度及感覺神經動作電位(SNAP)幅度的平均值兩者。對雙側正中神經進行測試。儀器生成的所有原始數據皆被保留作為研究文件的一部分。
對於SNAP振幅，動物間和動物內的變化為明顯的，儘管該值通常保持在基線測量範圍內(圖22A-22B)。一隻投予中間劑量的動物(動物17‑226 [1.0x1013 GC，第7組])和一隻投予高劑量的動物(動物17‑205 [3.0x1013 GC，第8組])顯示 rAAV.GLB投予後28天的雙側正中神經感覺振幅明顯減少，一直持續到屍檢時(圖22A-22B)。於此等動物中沒有異常的臨床發現，但此等發現確實與周圍神經的組織病理學發現相關。在SNAP顯著降低的動物中(動物17-226 [1.0x1013 GC，第7組]和動物17-205 [3.0x1013 GC，第8組])，無法確定發作潛伏期，因此排除傳導速度之測量。對於所有其它動物，在整個研究過程中未觀察到正中神經傳導速度的顯著變化(圖22A-22B)。
組織病理發現 A.藉由蘇木精和伊紅染色(Hematoxylin and Eosin Staining)或三色染色(Trichrome Staining)評估組織病理學。 蘇木精及伊紅染色：根據SOP 4019收集並標記所有組織和任何肉眼可見的病變。根據SOP 4003，將預先標記的匣中的樣品固定在10%中性緩衝液福爾馬林，改良的戴維森溶液(Davidson’s solution)(眼睛)或戴維森溶液(睾丸)中。將所有濕組織送至組織科學研究實驗室(Histo-Scientific Research Laboratories)進行組織處理、包埋、切片以及蘇木精及伊紅(H&E)染色。對於組織病理學評估，最初由主要研究病理學家對組織病理學玻片進行評估，其基於組織學評估、大體屍檢結果、相關臨床病理結果以及任何有助於解釋組織病理學發現的支持性數據而準備初步的病理報告。初步檢查完成後，病理報告草稿、玻片、及用於生成報告草稿的所有輔助材料都將提交給同行評審病理學家進行同行評審。由同行評審病理學家製作病理學同行評審備忘錄，並簽名及註明日期。備忘錄中包括的同行評審過程的材料、方法和進行的文件資料，以及同行評審病理學家與主要研究病理學家的病理報告的一般協議。調和基礎研究和同行評審病理學家之間的差異(若有差異的話)，且在同行評審完成後，準備最終報告。最終研究報告結合同行評審報告的意見，並由GTP的品質保證部門(QAU)進行品質保證審查。
對於三色染色： 根據研究病理學家的判斷，採用Masson的三色組織化學染色，以進一步評估通過H＆E染色確定的感興趣的發現(即，軸突周圍纖維化(periaxonal fibrosis))。左及右的近端正中神經的玻片使用Masson的三色染色套組(Polysciences, Inc.；目錄編號：25088-1)。為了組織病理學評估，使用光學顯微鏡檢查玻片，並由初級研究病理學家以盲測方式對玻片進行評分，使用與H＆E染色玻片相同的半定量評分系統。亦使用Aperio VERSA掃描系統(Leica Biosystems)對玻片進行數位掃描，並使用VIS圖像分析軟體進行定量(Visiopharm；Hoersholm, Denmark；Version 2019.07.0.6328)。
B.組織病理發現
與試驗物相關的發現主要在DRG、三叉神經節(TRG)、脊髓背根白質束、及周圍神經內觀察到。此等發現由DRG/TRG內的神經元變性及脊髓和周圍神經的背根白質束內的軸突變性(即，軸突病)。總體而言，所有GTP-203處理組均觀察到此等發現；然而，在兩個時間點，中間劑量(1.0x1013 GC)和高劑量(3.0x1013 GC)組的個別動物的發生率和嚴重性往往更高。其它與試驗物相關的發現通常除了注射部位骨骼肌和脂肪組織中的單核細胞浸潤之外還包括腦各個核和白質區的小膠質細胞增生灶。
於第60日和第120日的各個時間點，在所有劑量組中觀察到的與試驗品相關的組織病理學發現包括神經元細胞變性和DRG中單核細胞浸潤，此神經元細胞軸突集中突出到脊髓的背根白質束和外圍突出到周圍神經。在TRG中亦觀察到相似的發現。在第60日的時間點，與中間劑量(1.0x1013 GC，第3組，3/3動物)及高劑量(3.0x1013 GC，第4組，2/3動物)組(無至中度)相比，低劑量組(無或最小[3.0×1012 GC，第2組，1/3動物])中的DRG/TRG變性的發生率和嚴重度略低，表明劑量依賴性反應。在第120日的時間點，DRG/TRG變性的發生率和嚴重度於低劑量組(無至最小[3.0x1012 GC，第6組，2/3動物])最低且由中間劑量(無至輕度[1.0x1013 GC，第7組，3/3動物])至高劑量組(無至中度[3.0x1013 GC，第8組，3/3動物])增加，亦表明劑量依賴反應。跨時間點進行比較，rAAV.GLB1處理組之間DRG/TRG神經元變性的發生率和嚴重度相對相似，暗示無時間依賴性反應。缺乏時間依賴性反應暗示，從第60日到第120日的時間點，DRG/TRG神經元變性並沒有進一步發展。
DRG變性造成脊髓及周圍神經背根白質束的軸突病變，在顯微鏡下與軸突變性相符。在第60日的時間點，由於所有rAAV.hGLB1處理組的總發病率和嚴重度(無至輕度)相似，因此未觀察到背根白質束軸突性軸索病的劑量依賴性反應。在第120日的時間點，由於與中間劑量(1.0x1013 GC，第7組，3/3動物)及高劑量(3.0x1013 GC，第8組，3/3動物)組(最小至中度)相比，低劑量組(最小[3.0x1012 GC，第6組，2/3動物])中的背根白質束軸突性軸索病的發生率和嚴重度最低，觀察到劑量依賴性反應。在不同時間點進行比較，從第60日到第120日時間點，中間劑量組(1.0x1013 GC)和高劑量組(3.0x1013 GC)兩者背根白質束軸突病的嚴重度至較小程度，發生率增加，表明時間相關的響應和發現的進展。然而，此結論的一個重要警告為第120日的時間點，中間劑量組中的1/3動物(動物17-226 [1.0x1013 GC，第7組])和高劑量組中的1/3動物(動物17-205 [3.0x1013 GC，第8組])的嚴重度顯著高於兩組中的其它動物，這影響此等結果的解釋。相比之下，從第60日到第120日，低劑量組(3.0x1012 GC)的發生率和嚴重度降低，表明在該劑量下背根白質束軸突病沒有進展。關於在第60日時間點周圍神經軸突病，觀察到劑量依賴性反應，因為與高劑量組(最小至中度[3.0x1013 GC，第4組；20/24神經；3/3動物])中觀察到的嚴重度相比，低劑量(3.0x1012 GC，第2組；20/24神經；3/3動物)及中間劑量(1.0x1013 GC，第3組；22/24神經；3/3動物)組(最小至輕度)時嚴重度最低。在第120日的時間點，與低劑量(3.0x1012 GC，第6組；29/30神經；3/3動物)和經媒液處理(ITFFB，第5組，30/30神經；2/2隻動物)組(最小)觀察到的嚴重度相比，中間劑量(1.0x1013 GC，第7組；30/30神經；3/3動物)和高劑量(3.0x1013 GC，第8組；30/30神經；3/3動物)組(最小至明顯)的周圍神經軸突病的嚴重度較高，表示劑量依賴性反應。在第120日的時間點，經媒液處理的動物(ITFFB，第5組；30/30神經；3/3動物)表現出最小的軸突病，於周圍神經以及DRG軸突中觀察到。在第120日的時間點，在低劑量組(3.0×1012 GC，第6組)3/3動物及中間劑量組(1.0×1013 GC，第7組)1/3動物中，於此等經媒液處理的動物中觀察到的軸突病變程度可與大多數周圍神經和DRG軸突的程度相當。比較橫跨各個時間點的周圍神經軸突病，所有組的發病率和嚴重度從第60日到120日均增加，表明反應是時間依賴性的；然而，在中間劑量(1.0×1013 GC)時差異最大。
與第60日的時間點相比，第120日的時間點周圍神經發現的主要差異是存在軸突周圍纖維化(最小到明顯)，其僅在中間劑量組(1.0x1013 GC，第7組；2/3動物)及高劑量組(3.0x1013 GC，第8組；3/3動物)中觀察到。雖然在軸突周圍纖維化中觀察到劑量依賴性反應，但在中間劑量組(1.0x 1013 GC，第7組)觀察到最高的嚴重度。由於在第60日的時間點沒有特定的軸突周圍纖維化，觀察到時間依賴性反應。
為了進一步評估通過H＆E染色觀察到的周圍神經軸突纖維化，進行Masson的三色染色。此染色突顯周圍肌肉及其它組織的纖維結締組織。選擇左、右正中神經的近端部分進行三色染色，由於其較大的圓周，其可進行額外的再切。在第120日時對所有動物進行三色染色，因為在第60日時所有動物都沒有軸突周圍纖維化。藉由盲測評估者對三色染色進行半定量評分，證實中間劑量組(1.0×1013 GC，第7組；2/3動物)和高劑量組(3.0×1013 GC，第8組；3/3動物)存在劑量依賴性之軸突周圍纖維化。嚴重度範圍從中間劑量組(1.0x1013 GC，第7組；3/3動物)的無到明顯，從高劑量組(3.0x1013 GC；第8組；3/3動物)的最小到明顯。與基於H＆E的發現一致，最高嚴重度的軸突周圍纖維化(中度至明顯)發生在中間劑量的1/3動物(動物17-226；1.0×1013 GC，第7組)和高劑量的1/3動物(動物17‑205；3.0x1013 GC，第8組)，與在第28日至第120日觀察到的此等動物的SNAP幅度顯著降低有關。此外，使用VIS圖像分析軟體對三色染色進行定量分析顯示，對於中間劑量(1.0x1013 GC，第7組)和高劑量組(3.0x1013 GC，第8組)，神經組織體積呈劑量依賴性下降，組織切片中空白區域呈劑量依賴性增加，當與低劑量組(3.0x1012 GC，第6組)及經溶媒處理組(ITFFB，第5組)相比。此等發現表明中間劑量(1.0×1013 GC，第7組)和高劑量組(3.0×1013 GC，第8組)的軸突喪失。
在CNS中與其它試驗物相關的發現包括對投予高劑量的單隻動物(動物17-216 [3.0x1013 GC，第4組])在第60日出現輕度神經膠瘤病和腰椎脊髓腹角中的衛星細胞堆積。在兩個時間點，在所有經rAAV.hGLB1處理的組中，動物的腦中偶爾觀察到具有或不具有衛星細胞堆積的最小神經膠瘤病。在第60日的時間點，高劑量組(3.0x1013 GC，第4組；2/3動物)，特別是在動物17-213中，具有或不具有衛星細胞堆積的神經膠瘤病的發生率些微高於低劑量(3.0x1012 GC，第2組；1/3動物)及中間劑量(1.0x1013 GC，第3組；1/3動物)組。在第120日的時間點，在所有經rAAV.hGLB1處理組中偶發地觀察到極少的血管週浸潤及小的神經膠瘤病灶；然而，與第60日的時間點相比，在120日的時間點此等發現的發生率降低，暗示解決方案。
在所有組中，包括在第60日的時間點，經媒液處理的動物(ITFFB，第1組)，在ICM/CSF收集位的骨骼肌和脂肪組織內均觀察到局部注射部位的發現。然而，在第60日的時間點，浸潤液的組成發生變化，且在經rAAV.hGLB1處理的動物中，其嚴重度增加。第60日的經媒液處理組(ITFFB，第1組；1/2動物)中的浸潤主要由組織細胞(最小)組成，而經GTP-203處理的動物主要有淋巴細胞和漿細胞(最小至中等)，具有或不具有最小至中等肌纖維變化。高劑量組(3.0x1013 GC，第4組；1/3動物)僅在第60日見肌纖維變化，包括變性和萎縮。在第120日的時間點，所有經rAAV.hGLB1處理的動物在骨骼肌及/或脂肪組織內均表現出單核細胞浸潤，其範圍為從於低劑量(3.0x1012 GC，第6組；3/3動物)最小至於中間劑量(1.0x1013 GC，第7組；3/3動物)和高劑量(3.0x1013 GC，第8組；3/3動物)之最小至輕微，可能暗示劑量依賴性反應。與第60日時觀察到的嚴重度(肌纖維變化時為最小到中等)相比，第120日(最低至輕度)的注射部位發現的嚴重性降低，此表明消退並暗示時間依賴性反應。儘管此等發現可能由於最初注射而造成的，可能是重複的CSF收集所致，有可能是由於對試驗物的局部反應而產生的。
載體藥物動力學及排泄 ICM投予後，可在CSF和周圍血中檢測到rAAV.hGLB1載體DNA，CSF中的峰值濃度與劑量相關。在評估的第一時間點(第7日)後，CSF中rAAV.hGLB1的濃度迅速下降，除高劑量組中的一隻動物(動物17-212 [3.0x1013 GC，第8組])外，大多數動物在第60日皆無法檢測到，在屍檢第60日時，CSF中rAAV.hGLB1載體DNA濃度呈下降趨勢。血液中rAAV.hGLB1載體DNA濃度下降較慢，此可能歸因於周圍血細胞的轉導。
在第0日，在高劑量組的兩隻動物(動物17-197及17-205 [3.0x1013 GC，第8組])的CSF中檢測到rAAV.hGLB1載體DNA，但未在血液中檢測到。在第0日對rAAV.hGLB1呈陽性的CSF樣品進行重新測試以確認結果。在第0日的CSF中檢測到rAAV.hGLB1載體DNA可能是由於ICM施用過程中CSF樣品污染所致。在投予載體後第5日，在尿液和糞便中可檢測到rAAV.GLB1載體DNA。峰值水平通常與投予劑量成正比。投予載體後第60日，在所有動物的尿液和糞便中均未檢測到rAAV.hGLB1載體DNA。
轉基因表現的評估 於CSF及血液中測量人類β-gal活性。簡而言之，將1–10μL之CSF或血清任一者與99μL之反應混合物(0.5mM 4-甲基繖形酮基β-D-半乳哌喃糖苷[Sigma M1633]，0.15M NaCl，0.05% Triton-X100，及0.1M乙酸鈉，pH 3.58)混合於96孔盤黑色塑膠分析盤。將盤密封並在37℃下溫育30分鐘，藉由添加150μL終止溶液(290mM甘胺酸及180mM檸檬酸鈉，pH 10.9)來終止反應。測量在365nm激發時，在450nm的發射波長處測量來自反應產物的螢光。
由於正常NHP中內源性恆河獼猴β-gal酶的水平較高，因此無法評估主要器官中的轉基因產物表現(β-gal活性)。CSF及血清中存在較低水平的內源性恆河獼猴β-gal酶，而允許在第0、7、14、28、60、90和120日對CSF進行轉基因表現分析，而血清在基線和第14、28、60、90及120日進行。然而，應當注意的是，分析的性質限制NHPs之CSF和血清中轉基因產物活性的分析，其無法區分人類β-gal酶相對於內源性恆河獼猴β-gal酶。此限制敏感性，需要使用每隻動物的基線內源性β-gal活性水平進行分析(於圖23A–圖23D中以虛線表示)。轉基因產物在第14日後迅速喪失活性亦使分析變得複雜，此很可能係由於對人類轉基因產物的抗體反應所致(圖23A)。
儘管有此等警告，但於rAAV投予14日後，所有劑量組動物的CSF及血清中的β-gal活性均高於基線水平(圖23B)。於此CSF中，接受兩種較高劑量(1.0x1013 GC [1.1x1011 GC/g腦]或3.0x1013 GC[3.3x1011 GC/g腦])的動物的β-gal活性水平分別高於經媒液處理的對照組的水平約為2倍和4倍。此外，載體衣殼中預先存在的NAb不會影響於CSF中的表現，此支持無論NAb處於何種狀態，嬰幼期/嬰幼晚期GM1患者在目標器官系統(CNS)中實現治療活性的潛力。
在血清中，缺乏載體衣殼中預先存在的NAb的動物(在圖23B中用空心形狀表示)與經媒液處理的對照或對載體衣殼中預先存在的NAb呈陽性的動物相比，具有更高的β-gal酶活性(在圖23B中用實心形狀表示)。該結果暗示NAb陰性嬰幼期/嬰幼晚期GM1患者在周圍器官中具有治療活性的潛力。
生物分布：屍檢時，為生物分布收集組織，將組織放在於乾冰上有標籤的小瓶中，並在分析之前保存在≤–60°C。由經訓練的操作員從組織中提取DNA，並按照SOP 3001進行TaqMan qPCR反應。簡而言之，將組織機械均質化並以蛋白酶K消化。將樣品以RNAse A處理，並藉由在Buffer AL(Cat.#19075, QIAGEN)中於70°C溫育1小時來裂解細胞。萃取DNA，並在QIAGEN旋轉管柱上純化。稀釋至濃度≥90和≤110ng/μl後，使用載體及/或轉基因特異性引子重複進行qPCR反應。在同一研究的幼稚或陰性對照動物中，以已知濃度的DNA為背景，將訊號與線性化質體DNA的標準曲線進行比較。計算每微克DNA的基因體拷貝。利用其它對照來排除PCR反應中的交叉污染和樣品干擾。基於預定義的Ct值驗收準則對原始數據進行分析，並確定每次運行的定量極限。所有數據被包含於及/或附加到批次記錄表。
在第60日(圖24)和第120日(圖25)在腦、脊髓、DRG、肝臟及脾臟中檢測到高水平的載體基因體，此與先前對ICM AAV投予的研究一致。通常觀察到在CNS組織中檢測到的載體基因體的數量為劑量依賴性。在投予後60至120日之間，CNS組織中的載體基因體似乎穩定。在第120日，編入中間劑量組(1.0×1013 GC，第7組)的所有三隻動物均具有AAVhu68的基線NAb，此與載體向肝臟的分布極低有關。在來自兩個經媒液處理的對照動物(動物17-199[第1組]及17-204 [第5組])的一些樣品中檢測到載體基因體。對此等樣品進行兩次測試，以確認載體基因體的存在。
結論： 在所有評估劑量下，ICM投予rAAV.hGLB的耐受性均良好。rAAV.hGLB對臨床和行為體徵、體重或神經系統和身體檢查均未產生不利影響。與rAAV.hGLB投予相關的血液和CSF臨床病理沒有異常，除了某些動物中CSF白血球的短暫增加。
rAAV.hGLB投予導致TRG及DRG感覺神經元及其相關的中樞和周圍軸突無症狀退化。此等病變的嚴重度通常為最小至輕度。此等發現為劑量依賴性的，在中間劑量(1.0x1013 GC)和高劑量(3.0x1013 GC)組中有更嚴重病變的趨勢。
在第120日，感覺神經元細胞體的變性不如第60日嚴重。此結果表明此等病變並非進行性，儘管隨後的軸突變性和纖維化可能在幾個月內繼續發展。與此等發現一致，有兩隻動物在第120日屍檢時表現出最嚴重的軸突喪失和正中神經纖維化(動物17-226及17-205)，到第28日時其正中神經感覺動作電位振幅降低，隨後沒有進展。由於在所有劑量組中均存在無症狀的感覺神經元病變，因此未定義NOAEL。評估的最高劑量(3.0x1013 GC)被認為是MTD。以箭頭顯示出最嚴重的軸突喪失和纖維化且感覺神經動作電位降低的兩隻動物。(圖18A-18B、19A-19B)。圖20A–20B顯示研究中每個測量點的感覺正中神經傳導的變化，以感覺正中神經動作電位進行測量。
ICM投予rAAV.hGLB後14日，所有劑量組動物的CSF及血清中的轉基因表現(即，β-gal酶活性)均高於基線水平。於此CSF中，接受兩種較高劑量(1.0x1013 GC或3.0x1013 GC)的動物的β-gal活性水平分別高於經媒液處理的對照組的水平約為2倍和4倍。載體衣殼中預先存在的NAb不會影響於CSF中的表現，此支持無論NAb處於何種狀態，嬰幼期/嬰幼晚期GM1患者在目標器官系統(CNS)中實現治療活性的潛力。
ICM投予rAAV.hGLB導致載體在CSF中分布，並向腦、脊髓和DRG轉移高水平的基因。rAAV.hGLB在周圍血液和肝臟中亦達到顯著的濃度。
rAAV.hGLB DNA排泄之評估證實投予後5日尿液和糞便中可檢測到載體DNA，在60日內達到無法檢測的水平。
在大多數經rAAV.hGLB處理的動物的PBMC及/或組織淋巴細胞(肝臟、脾臟、骨髓)中可檢測到對載體衣殼及/或人類轉基因產物的T細胞反應。T細胞反應通常與任何異常的臨床或組織學發現無關。
在某些動物中可檢測到載體衣殼中於先存在的NAb，似乎不影響基因轉移至腦及脊髓，儘管預先存在的NAb與肝基因轉移明顯減少有關。
實施例 5 ： 1/2 階段開放標籤、多中心劑量遞增研究，以評估將單劑量 rAAVhu68.GLB1 送入患有嬰幼期 GM1 神經節苷脂症的兒科對象的腦大池 (ICM) 中的安全性和耐受性 選入年齡最高24個月且在最初18個月內出現症狀的GM1對象。這將包括患有第1型(嬰幼期)及第2a型(嬰幼晚期)GM1的對象。第1型(嬰幼期)對象在出生時可能會出現症狀。因此，治療應儘早開始以最大程度地發揮潛在的益處，且該研究包括至少一個月齡的對象。選擇年齡下限的另一考慮因素係確保可安全地執行ICM程序。提議的ICM程序包括術前腦部MRI和MR血管造影以及CT/CTA引導的ICM注射。在大於1個月齡的嬰兒中進行ICM投予並無對年齡的安全性問題。
ICM載體投予於CNS隔室中造成立即的載體分布。如此，依據腦質量縮放臨床劑量，其提供CNS隔室的大小的近似值。預期功效和毒性兩者與CNS載體暴露有關。劑量轉換將基於幼年-成年小鼠0.4g之腦質量、幼年及成年恆河獼猴90g的腦質量(Herndon 1998)以及0至30個月齡的人類嬰兒370g至1080g的腦質量(Dekaban, 1978)為基礎。下表顯示非臨床及等效的人類劑量。
非臨床研究劑量的比較
劑量 (GC/g腦質量) 幼年小鼠MED研究(GC) 幼年恆河獼猴毒理學研究(GC)
3.33x1011 1.30x1011 3.00x1013
1.11x1011 4.40x1010 1.00x1013
3.33x1010 1.30x1010 3.00x1012
1.11x1010 4.40x109 -
縮寫：GC，基因體拷貝；MED，最小有效劑量；NHP，非人類哺乳類動物。
考慮到腦的重量不同(例如，新生兒和2歲的對象之間大約有3倍的差異)，將使用滑動量表來確定於FIH研究中要投予至個體對象的藥物的含量(在基因拷貝[GC]中)，基於公布的至多24個月的嬰兒和兒童的平均大腦重量。以此方式，對象將被給予一定數量的藥物產品，該藥物產品在基因拷貝數/估計的腦重量中最接近意圖劑量。
年齡 1~4個月 ＞4~＜8個月 ≥8~12個月 ≥12個月
平均人類腦重量(g) 488 610 780 960
低劑量3.33x1010 GC/g 1.6x1013 GC 2.1x1013 GC 2.6x1013 GC 3.2x1013 GC
高劑量1.11x1011 GC/g 5.4x1013 GC 6.8x1013 GC 8.7x1013 GC 1.0x1014 GC
最大可行劑量3.33x1011 GC/g 1.6x1014 GC 2.1x1014 GC 2.6x1014 GC 3.2x1014 GC
遞送的投劑體積 3.0mL 4.0mL 5.0mL 5.0mL
1.劑量基礎：3.33e10GC/每公克腦 2.劑量基礎：1.11e11GC/每公克腦 GC：基因體拷貝
兒科投予套組
部分 描述
BD™脊髓針 25 G×2英寸BD™脊髓針，帶Quincke斜角，
25 G×3英寸BD™脊髓針，帶Quincke斜角，
Baxter T-連接器延伸套件 T-連接器延伸套件，帶有可伸縮的T型連接器，INTERLINK注射部位，Female Luer Lock Adapter，非DEHP， 約體積0.60mL，約長度6.7”(17cm)
備註：列出多根脊髓針作為兒科投予的選項，以解決解剖學差異。
成人投予套組
部分 描述
BD™脊髓針 22 G×5英寸BD™脊髓針，帶Quincke斜角，
18 G×3英寸BD™脊髓針，帶Quincke斜角導引器，用以投22G脊髓針，
Baxter T-連接器延伸套件 T-連接器延伸套件，帶有可伸縮的T型連接器，INTERLINK注射部位，Female Luer Lock Adapter，非DEHP， 約體積0.60mL，約長度6.7”(17cm)
此研究為AAVhu68.GLB1之1/2期、開放標籤、劑量遞增研究用於評估單劑量AAVhu68.GLB1遞送至具有GM1(第1型)嬰幼期型或嬰幼晚期(第2a型)的兒科對象之腦大池(ICM)以評估安全性、耐受性、及探索效力終點。此研究招募多達24名兒科對象，對象接受單劑ICM投予的AAVhu68.GLB1。
第1型(嬰幼期)GM1 ● 症狀發生前的GM1對象(≤6個月大，具有確定的突變且血清β-gal活性降低)通過產前篩檢或年齡較大的手足家族史確定，並具有相同基因型的GM1神經節苷脂症的確定診斷。手足必須在≤6個月齡時出現症狀。 ● 有症狀的GM1對象(證實突變且血清β-gal活性降低)必須具有≤6個月齡的發病醫學記錄文件，出現肌張力低下或任何與GM1神經節苷脂症相符的症狀，至少有70%的年齡在投劑時校正了預期的運動發展(BSID-III)。
第2型(嬰幼晚期)GM1 ● 具有＞6個月且≤18個月齡發作之有症狀的GM1對象，出現肌張力低下或任何記載的符合GM1神經節苷脂症之症狀者，其表現出達到進一步的發展里程碑的平穩期或延遲，且至少有70%的年齡校正後的預期運動發展(BSID-III)。
以對象之交錯、連續投劑而評估兩劑rAAVhu68.GLB1。rAAVhu68.GLB1劑量水平係基於鼠類MED研究和GLP NHP毒理學研究的數據確定，且由低劑量(被投予至同齡組1)和高劑量(被投予至同齡組2)所組成。高劑量係基於NHP毒理學研究中的最大耐受劑量(MTD)換算成等效的人類劑量。應用安全裕度，以使為人類對象選擇的高劑量為等效人類劑量的三分之一到一半。低劑量通常比選擇的高劑量少2-3倍，前提為該劑量超過動物研究中等效的按比例縮放的MED。此將確保兩個劑量水平皆具有賦予治療益處的潛力，同時應理解，若可忍受，則預期較高的劑量將為有利的。依次評估低劑量和高劑量，能確定所測試的兩種劑量的最大耐受劑量(MTD)。最後，擴展同齡組(同齡組3)接受rAAVhu68.GLB1的MTD。同時編入同齡組3(MTD)中的6名對象，而無需錯開投劑。同齡組3可能接受造血幹細胞移植(HSCT)及rAAVhu68.GLB1的合併治療。若可忍受，則預期較高的劑量將為有利的。
此研究的主要重點係評估rAAVhu68.GLB1的安全性及耐受性。ICM AAVhu68遞送的NHC研究表明，在某些動物中DRG感覺神經元無明顯或輕度無症狀變性，如此進行詳細檢查以評估感覺神經毒性，且在該試驗中採用感覺神經傳導研究來監測徵狀不顯著的(subclinical)感覺神經元病變。值得注意的是，感覺神經元功能喪失(由於潛在的背根神經節毒性)係藉由在30日、3個月、6個月、12個月、18個月、24個月及其後每年進行的感覺神經傳導研究而評估。鑑於在非臨床NHP研究中，AAV投予後2-4週內出現感覺神經元病變，因此在治療後3個月內進行更頻繁的評估將能夠評估人類的相似事件，從而使毒性動力學具有潛在的可變性。整個研究過程中的隨訪將允許評估人類中時間歷程為不同，或者在觀察到臨床後遺症的情況下，評估它們持續存在的時間，以及它們隨著時間的推移是否改善、保持穩定或惡化。
於此研究中亦評估藥效學和功效終點，並根據其在該人群中證明有意義的功能及臨床結果的潛力進行選擇。於30日、90日、6個月、12個月、18個月、24個月測量終點，然後每年進行一次，直至5年的隨訪期，但需要鎮靜及/或LP的除外。長期隨訪階段，測量頻率降低為每12個月一次。選擇此等時間點以促進全面評估rAAVhu68.GLB1的安全性和耐受性。考慮到未治療的嬰幼期GM1患者的疾病進展速度快，亦選擇早期時間點及6個月的間隔。此方法允許在隨訪期間對治療對象進行全面的藥效學和臨床療效評估，該隨訪期間存在未治療的比較數據，並且在此期間未治療的患者預期會顯示顯著下降。
次要和探索性功效終點包括生存率、餵食管獨立性、癲癇發作的發生率和頻率、藉由PedsQL進行測量的生活品質、及神經認知和行為發展。貝萊嬰兒發展量表及文蘭量表用於量化rAAVhu68.GLB1對適應行為、認知、語言、運動功能及健康相關生活品質的發展及變化的影響。每種措施皆用於GM1疾病族群或相關族群中使用，並基於父母和家人的意見進一步完善，以選擇對他們最有意義和最有影響力的措施。為了標準化評估，由經驗豐富的神經心理學家對參加試驗的地點進行各種規模管理的培訓。
給定目標族群中疾病的嚴重度，對象可藉由入選已達成運動技能，發展並隨後喪失了其他運動里程碑，或者尚未顯示出運動里程碑發展的跡象。評估追蹤所有里程碑的達成年齡及喪失年齡。基於WHO基準，為六個總里程碑定義運動里程碑成就。
鑑於患有嬰幼期GM1神經節苷脂症的對象於生命的數月間可發展出症狀，獲得第一WHO運動里程碑(無支撐坐立)通常不會在4個月齡之前出現(中位數：5.9個月齡)，此終點可能缺乏評估治療益處程度的敏感性，尤其是在治療時出現明顯症狀的對象中。為了此原因，亦包括對可應用於嬰兒的適合年齡的發展里程碑的評估(Scharf et al., 2016, Developmental Milestones.Pediatr Rev. 37(1):25-37；quiz 38, 47.)。此等數據對於總結相對於未治療的具嬰幼期GM1疾病的兒童或神經型兒童的典型獲取時間隨時間推移所保持、獲得或喪失的發展里程碑可能提供資訊。
隨著疾病的進展，兒童可能會發展出癲癇。癲癇活動的發作使我們能夠確定使用rAAVhu68.GLB1進行治療是否可以預防或延遲癲癇發作的發生或降低該族群的癲癇發作頻率。要求父母保存癲癇發作日記，以記錄癲癇的發生、頻率、時間和發作類型。此等條目將在每次訪問時與臨床醫生討論並解釋。
為了評估rAAVhu68.GLB1對CNS表現的影響，在MRI上隨時間測量體積變化。所有神經節苷脂酶的嬰幼期表現型均顯示出一致的大頭畸形，並且顱內MRI體積迅速增加，同時腦組織體積(大腦皮質和其他較小的結構)和心室體積均增大。此外，隨著疾病的進展，包括胼胝體、尾狀體及殼核的各種較小的腦的子結構以及小腦皮質通常會縮小(Regier et al., 2016，及Nestrasil et al., 2018，如本文所引述)。以rAAVhu68.GLB1治療具有萎縮和體積變化穩定的證據被預期減緩或停止CNS疾病表現的進展。基於報導的GM1和GM2神經節苷脂症患者視丘結構變化的證據，係基於視丘和基底神經節中T1/T2訊號強度的變化(正常/異常)(Kobayashi and Takashima, 1994, Thalamic hyperdensity on CT in infantile GM1-gangliosidosis.”Brain and Development.16(6):472-474)。
試驗用的生物標記包括β-gal酶(GLB1)活性(其可於CSD及血清中被測量)，及腦MRI(其顯示嬰幼期GM1神經節苷脂症持續、快速的萎縮)(Regieret al ., 2016b，如本文所引述)。自收集的樣本中檢測CSF和血清中的其它生物標記。
A.主要目標： ● 通過單劑投予至腦大池(ICM)後2年評估rAAVhu68.GLB1之安全性和耐受性。將評估副作用事件、神經學檢查、感覺神經傳導研究、總神經病變分數-照護(Neuropathy Score-Nurse)、血液學、血清化學、肝臟功能試驗、凝血(PT、aPTT、INR)、肌鈣蛋白-If、CSF抗AAVhu68 nAbs、載體脫落(vector shedding)、尿液分析、癲癇日記、身體檢查、生命徵象、ECG、腦MRI、及CSF細胞學及化學(細胞計數、蛋白質、葡萄糖)。 ● 通過單劑投予至腦大池後評估rAAVhu68.GLB1的效力。關鍵二次端點*將在2年和5年內進行評估： ● 文蘭適應行為量表，第2版 ● 其它二次端點*將在2年和5年內進行評估： ● 嬰幼兒與學步兒發展的貝萊尺度，第3版 ● WHO多中心生長參考研究動作 ● 發展里程碑評量 ● 哈默史密斯嬰兒神經發育檢查(Hammersmith Infant Neurodevelopment Examination) ● 臨床醫生和托育人員對嚴重性和變化的總體印象 ● 退出面談 *並無對於GM1神經節苷脂症符合目標(fit-for-purpose)臨床結果評量。因此，與這研究同時進行的是，發起人正在與標的專家合作，從臨床專家和父母/托育人員那裡收集數據，以製定一項成果測量策略，包括確定同齡組3的主要療效終點，並在需要時制定從上述量表得出的綜合終點計劃，修改現有的COA或開發以患者為中心的補充性GM1專用項目或量表。有關詳細資訊，請參見統計分析部分。
B.次要目標： ● 評估向腦大池遞送單劑後24個月內rAAVhu68.GLB1的藥效學和生物學活性。 評估：CSF生物標記：β-半乳糖苷酶活性、己醣胺酶活性、GM1神經節苷酯水平；血清生物標記：β-半乳糖苷酶活性、己醣胺酶活性；尿液生物標誌物：硫酸角質素水平；所有評估將在30日和5年的時間內進行。 ● 單劑投予至腦大池後評估於疾病進展上rAAVhu68.GLB1的效果。評估：MRI測量的總腦容量、腦子結構容量、心室容量及T1/T2訊號強度；通過側面脊柱X射線測量的骨骼異常；通過心臟超聲心動圖測量心肌病；通過腹部超音波測量肝脾腫大；通過連續腦電圖測量的腦功能和瀰漫性減慢變化；評估無機械通氣生存率；通過放置和使用餵食管來評估營養狀況；所有皆將在5年內評估。 評估將rAAVhu68.GLB1單劑投予於腦大池後對生活品質和醫療資源利用的影響。評估：生活品質：小兒生活質量量表/小兒生活質量量表-嬰兒量表；醫療保健資源利用：圖表檢查，包括住院日、急診室(ER)就診、加護病室(ICU)入院、手術、聽力及視力輔助的需求；所有此等皆將在5年內評估。
C.研究設計： rAAVhu68.GLB1的多中心、開放標籤、單臂劑量遞增研究(下表)。至多12名具有GM1神經節苷脂症的兒科對象入選2個劑量同齡組，並藉由ICM注射投予而接受單劑量的rAAVhu68.GLB1。安全性及耐受性通過2年評估，所有對象在rAAVhu68.GLB1投予後追蹤5年，以對安全性和耐受性、藥效學(轉基因表現的持久性)和臨床結果的持久性進行長期評估。
產品名： AAVhu68.UbC.GLB1
基因插入： 編碼β-半乳糖苷酶(beta-gal或β-gal)的人類GLB1 基因之人工型式
控制元件： 源自人類泛素C(UbC)啟動子的調節元件
其它元件： 嵌合內含子(CI)–由人類β-球蛋白剪接供體及免疫球蛋白G(IgG)剪接受體元件所組成的雜合內含子 源自猿病毒40(SV40)晚期基因的多腺苷酸化(PolyA)訊號A
AAV血清型： Hu68
將AAVhu68.UbC.GLB1冷凍(≤-60°C)以ITFFB(鞘內最終調配緩衝液)中的無菌溶液形式提供。根據對象的劑量水平和年齡段，在投予前可能需要在ITFFBD01(研究藥物稀釋劑)中稀釋AAVhu68.UbC.GLB1 DP。AAVhu68.UbC.GLB1 DP及ITFFBD01調配物由1 mM磷酸鈉、150 mM氯化鈉、3 mM氯化鉀、1.4 mM氯化鈣、0.8 mM氯化鎂、0.001%泊洛沙姆188, pH 7.2所構成。
在投予前-35日到-1日篩選潛在對象，以確定該研究的資格。多至24名具有第1型(嬰幼期)及第2a型(嬰幼晚期)GM1神經節苷脂症的兒科對象入選此研究。彼等符合納入/排除標準的對象在第1日早上或按照機構慣例入院。對象在第1日接受單次ICM劑量的rAAVhu68.GLB1，並在投予後留在醫院至少24小時以進行觀察。投予後第7、14和30日進行後續評估，第一年每60日評估一次，第二年每90日評估一次。通過評估不良事件(AE)和嚴重不良事件(SAE)、生命體徵、身體檢查、感覺神經傳導研究及實驗室評估(化學、血液學、凝血研究、CSF分析)來監測。亦評估AAV及轉基因產物的免疫原性。功效評估包括生存率、認知、動作及社交發展的測量、視覺功能和腦電圖的變化、肝臟和脾臟體積的變化、以及CSF、血清和尿液中的生物標記。
該研究由以下三個作為單次ICM注射投予的rAAVhu68.GLB1的同齡組所組成。 •同齡組1(低劑量)：編入三名符合條件的對象(對象#1至#3)，並給予低劑量的rAAVhu68.GLB1，在第一名對象和第二名對象之間有4週的安全觀察期。若無觀察到安全審查觸發因素(SRT)，則在對同齡組1的第三名對象進行rAAVhu68.GLB1投予後4週，由獨立的安全委員會評估所有可用的安全性數據。 •同齡組2(高劑量)：若決定進行，編入三名符合條件的對象(對象#4至#6)，並給予高劑量的rAAVhu68.GLB1，在第四名對象和第五名對象之間有4週的安全觀察期。若未觀察到SRTs，則獨立安全委員會會評估所有可用的安全性數據，包括來自同齡組1對象的安全數據，在同齡組2第三名對象接受rAAVhu68.GLB1後的4週。 •同齡組3(MTD)：在安全委員會提出積極建議之前，MTD最多編入6名其它對象，並對其進行單次ICM劑量的rAAVhu68.GLB1投予。在此同齡組中，對象之間的投予間隔不超過4週的安全觀察期，且在對該同齡組中前三名對象投劑後，需要安全委員會審查。
D.納入標準： 1.編入時≥1個月且＜24個月齡，具有第1型(發作≤6個月)或第2a型(發作＞6個月且≤18個月)。 a.第1型嬰幼期GM1 ●     i.症狀發生前的對象(≤6個月大，具有確定的突變且血清β-gal活性降低)通過產前篩檢或年齡較大的手足家族史確定，並具有相同基因型的GM1神經節苷脂症的確定診斷。手足必須在≤6個月齡時出現症狀。 或 ●     ii.有症狀的對象(證實突變且血清β-gal活性降低)必須具有≤6個月齡的發病醫學記錄文件，出現肌張力低下或任何與GM1神經節苷脂症相符的症狀，至少有70%的年齡在投劑時校正預期的運動發展(BSID-III)。 b.第2a型嬰幼晚期GM1： i.具有＞6個月且≤18個月齡發作之有症狀的GM1對象，出現肌張力低下或任何記載的符合GM1神經節苷脂症之症狀者，其表現出達到進一步的發展里程碑的平穩期或延遲，且至少有70%的年齡校正後的預期運動發展(BSID III)。 2.該對象對於GLB1基因缺失或突變為同型合子或複合異型合子，並且β-gal活性降低(≤白血球正常值的20%)的證明文件。
E.排除標準： 1.於研究人員的意見，任何歸因於GM1神經節苷脂症或任何其他狀況的臨床上重大的神經認知功能障礙，可能會使研究結果的解釋混亂。 2.若任何對象患有急性疾病，需要在編入後30日內住院，則使該對象編入之前，必須與發起人的醫療監護者討論病史。 3.輔助呼吸支持或需要氣管切開術的呼吸史。 4.難治性癲癇發作或不受控制的癲癇病定義為發生癲癇持續狀態發作，或在服用研究產品前30日內需要住院治療的癲癇發作。 5.ICM投予程序的任何禁忌，包括螢光鏡影像及麻醉的禁忌。 6.MRI或LP的任何禁忌。 7.先前的基因治療。 8.在投劑研究產品前48小時內使用麥格司他。 9.在投劑研究產品之前的5個半衰期內使用酶替代療法或其它研究療法。 10.於研究者的意見，任何條件(例如，任何疾病的病史、任何當前疾病的證據、身體檢查的任何發現或任何實驗室異常)都將使對象在手術過程中面臨過度的風險或干擾研究產品的評估或對象安全性或研究結果的解釋。此包括： a.  研究者認為臨床上異常的實驗值具有臨床意義。 b.  未能茁壯成長，定義為：在篩選/基線之前的3個月中體重下降20%(20/100) c.  免疫功能的潛在缺陷 d.  多種及嚴重威脅生命的感染的病史
F.投予途徑和程序 在第1日，將rAAVhu68.GLB1呈單劑量投予，經由CT引導的枕下注射到腦大池中。
於第1日，由與研究相關的研究藥局(Investigational Pharmacy)製備適當濃度的rAAVhu68.GLB1。將裝有5.6mL適當濃度的rAAVhu68.GLB1的注射器送入手術室。進行研究藥物投予時有下列人員在場：進行此處置的介入醫師；麻醉師及呼吸技術人員；護士及醫師助理；CT(或手術室)技術人員；現場研究協調員。
在藥物投予之前，先進行腰椎穿刺以移除預定體積的CSF，然後在鞘內(IT)注射碘化造影劑，以幫助可視化腦大池的相關解剖學結構。可於針頭插入之前或期間給予靜脈內(IV)造影劑，以作為鞘內造影劑之替代。介入者決定是否使用IV或IT對比。對對象進行麻醉、插管，且置於處置台上。使用無菌技術將注射部位備妥並用布蓋好。於螢光鏡引導下，將一根脊髓針(22-25 G)推入腦大池。可使用較大的導引針以輔助針頭放置。確認針頭放置後，將延伸套件連接到脊椎穿刺針上，並使其充滿CSF。在介入醫師的裁量下，可對延伸套件連接含造影劑的注射器，並少量注入以確認針頭在腦大池中的放置。藉由CT導引+/-照影劑注射而確認針頭放置後，將包含5.6mL之rAAVhu68.GLB1注射器連接到延伸套件。在1-2分鐘內緩慢注入注射器中的內容物，以遞送5.0mL的體積。將針頭從對象身上慢慢移除。
投予rAAVhu68.GLB1單劑至腦大池(ICM)於投予後5年內為安全且可耐受的。
rAAVhu68.GLB1之單劑投予至腦大池(ICM)中提高生存率、降低24個月齡時對餵食管依賴的可能性、及/或減少如下列評估的疾病進展：成就年齡、喪失年齡、及維持或獲得適合年齡的發展及動作里程碑的兒童百分比。
治療減緩神經認知功能的喪失。
為了預防潛在的免疫媒介的損傷，如肝毒性，對象將接受全身性皮質類固醇激素治療。從rAAVhu68.GLB1投予的前一日開始，將以每天1mg/kg體重的劑量與口服去氫皮質醇相當的全身性皮質類固醇投予約30日(或直到計劃的第1個月隨訪為止，以先到者為準)。在此訪視期間，應按照評估時間表進行臨床檢查及實驗室測試。對於無明顯發現的患者，研究人員應根據臨床判斷在接下來的21日內逐漸減少皮質類固醇的劑量，從第5週的每日0.75mg/kg劑量開始，第6週的每日0.5mg/kg劑量，然後在第7週每日0.25mg/kg的劑量。若患者對1mg/kg/日的治療方案沒有足夠的反應，則諮詢專家。若研究者認為對象出現臨床症狀或潛在的免疫媒介毒性反應的臨床/實驗室跡象，則可改變免疫抑制的劑量、類型及時間表，並應告知研究負責醫生。應遵守常規疫苗時間表和當地指引，包括在對象接受類固醇治療時調整疫苗時機的建議。
實施例 6 ： 1/2 階段開放標籤、多中心劑量遞增研究，以評估將單劑量 rAAVhu68.GLB1 送入患有嬰幼期 GM1 神經節苷脂症的兒科對象的腦大池 (ICM) 中的安全性和耐受性 選入年齡最高24個月且在最初18個月內出現症狀的GM1對象。這將包括患有第1型(嬰幼期)及第2a型(嬰幼晚期)GM1的對象。第1型(嬰幼期)對象在出生時可能會出現症狀。因此，治療應儘早開始以最大程度地發揮潛在的益處，且該研究包括至少一個月齡的對象。選擇年齡下限的另一考慮因素係確保可安全地執行ICM程序。提議的ICM程序包括術前腦部MRI和MR血管造影以及CT/CTA引導的ICM注射。在大於1個月齡的嬰兒中進行ICM投予並無對年齡的安全性問題。
ICM載體投予於CNS隔室中造成立即的載體分布。如此，臨床劑量係根據腦質量按比例確定，其提供CNS隔室的大小的近似值。預期功效和毒性兩者與CNS載體暴露有關。劑量轉換將基於幼年-成年小鼠0.4g之腦質量、幼年及成年恆河獼猴90g的腦質量(Herndon 1998)以及0至30個月齡的人類嬰兒370g至1080g的腦質量(Dekaban, 1978)為基礎。下表顯示非臨床及等效的人類劑量。
非臨床研究劑量的比較
劑量 (GC/g腦質量) 幼年小鼠MED研究(GC) 幼年恆河獼猴毒理學研究(GC)
3.33x1011 1.30x1011 3.00x1013
1.11x1011 4.40x1010 1.00x1013
3.33x1010 1.30x1010 3.00x1012
1.11x1010 4.40x109 -
縮寫：GC，基因體拷貝；MED，最小有效劑量；NHP，非人類哺乳類動物。
考慮到腦的重量不同(例如，新生兒和2歲的對象之間大約有3倍的差異)，將使用滑動量表來確定於FIH研究中要投予至個體對象的藥物的含量(在基因拷貝[GC]中)，基於公布的至多24個月的嬰兒和兒童的平均大腦重量。以此方式，對象將被給予一定數量的藥物產品，該藥物產品在基因拷貝數/估計的腦重量中最接近意圖劑量。
年齡 1~4個月 ＞4~＜8個月 ≥8~12個月 ≥12個月
平均人類腦重量(g) 488 610 780 960
低劑量3.33x1010 GC/g 1.6x1013 GC 2.1x1013 GC 2.6x1013 GC 3.2x1013 GC
高劑量1.11x1011 GC/g 5.4x1013 GC 6.8x1013 GC 8.7x1013 GC 1.0x1014 GC
最大可行劑量3.33x1011 GC/g 1.6x1014 GC 2.1x1014 GC 2.6x1014 GC 3.2x1014 GC
遞送的投劑體積 3.0mL 4.0mL 5.0mL 5.0mL
1.劑量基礎：3.33e10GC/每公克腦 2.劑量基礎：1.11e11GC/每公克腦 GC：基因體拷貝
兒科投予套組
部分 描述
BD™脊髓針 25 G×2英寸BD™脊髓針，帶Quincke斜角，
25 G×3英寸BD™脊髓針，帶Quincke斜角，
Baxter T-連接器延伸套件 T-連接器延伸套件，帶有可伸縮的T型連接器，INTERLINK注射部位，Female Luer Lock Adapter，非DEHP， 約體積0.60mL，約長度6.7”(17cm)
備注：列出多根脊髓針作為兒科投予的選項，以解決解剖學差異。
成人投予套組
部分 描述
BD™脊髓針 22 G×5英寸BD™脊髓針，帶Quincke斜角，
18 G×3英寸BD™脊髓針，帶Quincke斜角導引器，用以投22G脊髓針，
Baxter T-連接器延伸套件 T-連接器延伸套件，帶有可伸縮的T型連接器，INTERLINK注射部位，Female Luer Lock Adapter，非DEHP， 約體積0.60mL，約長度6.7”(17cm)
此研究為AAVhu68.GLB1之1/2期、開放標籤、劑量遞增研究用於評估單劑量AAVhu68.GLB1遞送至具有GM1(第1型)嬰幼期型或嬰幼晚期(第2a型)的兒科對象之腦大池(ICM)以評估安全性、耐受性、及探索效力終點。此研究招募多達28名兒科對象，對象接受單劑ICM投予的AAVhu68.GLB1。
納入標準：此研究將包括那些已證實具有GLB1突變(為GLB1基因缺失或突變的同型合子或複合異型合子)且具有降低的β-gal活性(≤白血球正常值的20%)的嬰幼兒，編入時≥4個月且＜24個月齡，具有第1型(嬰幼期)GM1，特徵為早發性(≤6個月)，預測快速進展；或具有第2a型(嬰幼晚期)GM1，特徵為晚發性表現(＞6且≤18個月)，預測較慢進展。
第1型(嬰幼期)GM1 ● 透過下列識別症狀發生前的對象：(a)確診為GM1且基因型相同且發病＜6個月齡的病史的年長手足的產前篩查或家族史；或(b)產前GM1疾病的跡象，例如子宮內生長遲緩，胎兒積水或胎盤空泡。 ● 有症狀的對象，病歷記錄≤6個月時症狀發作，伴有肌張力減退及/或發育延遲及/或與GM1一致的其它體徵(例如，肝脾腫大、骨骼發育不良、櫻桃紅色黃斑、心肌病、及粗糙的面部特徵)，且在過去一週內必須由現場檢查員確認/觀察到至少具有以下至少一項發展技能： -  顯示故意移動手臂和腿部的能力。 -  連續關注目標物體至少3秒鐘。 -  當直立靠著托育人員的胸部時，可以將頭從一側滾動到另一側(例如，若孩子將左耳放在托育人員的肩膀上，則他們可以在沒有幫助的情況下改用右耳躺在托育人員的肩膀上，或位置再調整)。 -  發出一種特定的情緒的聲音。 -  以喉音、咕嚕音或鼻音進行溝通。 -  固定凝視托育人員至少連續2秒鐘。
第2型(嬰幼晚期)GM1 ● 透過下列識別症狀發生前的對象：(a)確診為GM1且基因型相同且6至18個月齡發病的病史的年長手足的產前篩查或家族史； 或(b)產前GM1疾病的跡象，包括子宮內生長遲緩，胎兒積水或胎盤空泡。 ● 發病年齡＞6個月齡且≤18個月齡的有症狀的對象，患有肌張力低下及/或達到進一步的發展里程碑及/或其它任何與GM1相符的跡象(例如肝脾腫大、骨骼發育不良、櫻桃紅斑、心肌病、及面部特徵粗糙)，且必須滿足以下有症狀的嬰幼晚期GM1對象的年齡依賴性發展標準： -  小於12個月齡的有症狀的對象必須在過去一週內由現場檢查員確認/觀察後，具有下表中列出的適當年齡的總體動作、精細動作、語言/認知或社會發展里程碑之一。 -  大於12且小於24個月齡的有症狀的對象必須在過去一週內由現場檢查員確認/觀察到，對於其年齡50%(見下表)的兒童具有4個發展里程碑之至少2個。例如，16個月齡的小孩必須具有至少2個於8個月齡的小孩的2個發展里程碑。 以對象之交錯、連續投劑而評估兩劑rAAVhu68.GLB1。rAAVhu68.GLB1劑量水平係基於鼠類MED研究和GLP NHP毒理學研究的數據確定，且由低劑量(被投予至同齡組1及3)和高劑量(被投予至同齡組2及4)所組成。高劑量係基於NHP毒理學研究中的最大耐受劑量(MTD)換算成等效的人類劑量。應用安全裕度，以使為人類對象選擇的高劑量為等效人類劑量的三分之一到一半。低劑量通常比選擇的高劑量少2-3倍，前提為該劑量超過動物研究中等效的按比例縮放的MED。此將確保兩個劑量水平皆具有賦予治療益處的潛力，同時應理解，若可忍受，則預期較高的劑量將為有利的。依次評估低劑量和高劑量，能確定所測試的兩種劑量的最大耐受劑量(MTD)。
部分1
同齡組 患者 指定的干預
同齡組1 遲發性嬰幼期GM1神經節苷脂症(第2a型) rAAVhu68.GLB1劑量1：3.3x1010 GC/g* 單劑之rAAVhu68.GLB1，經由腦大池內
同齡組2 遲發性嬰幼期GM1神經節苷脂症(第2a型) rAAVhu68.GLB1劑量2：1.1x1011 GC/g*單劑之rAAVhu68.GLB1，經由腦大池內
同齡組3 早發性嬰幼期GM1神經節苷脂症(第1型) rAAVhu68.GLB1劑量1：3.3x1010 GC/g* 單劑之rAAVhu68.GLB1，經由腦大池內
同齡組4 早發性嬰幼期GM1神經節苷脂症 (第1型) rAAVhu68.GLB1劑量2：1.1x1011 GC/g*單劑之rAAVhu68.GLB1，經由腦大池內
*GC/g：每公克評估的腦重量的基因拷貝
最後，一個同齡組(同齡組5及6)接受單劑量的rAAVhu68.GLB1，以確認rAAVhu68.GLB1的安全性及效力。
部分2
同齡組 患者 指定的干預
同齡組5 遲發性嬰幼期GM1神經節苷脂症(第2a型) rAAVhu68.GLB1劑量之rAAVhu68.GLB1單劑量，經由腦大池內的劑量將在回顧部分1的數據後確定部分2中用於確認同齡組的劑量。
同齡組6 早發性嬰幼期GM1神經節苷脂症(第1型) rAAVhu68.GLB1之rAAVhu68.GLB1單劑量，經由腦大池內的劑量將在回顧同齡部分1的數據後確定部分2中用於確認同齡組的劑量。
此研究的主要重點係評估rAAVhu68.GLB1的安全性及耐受性。ICM AAVhu68遞送的NHC研究表明，在某些動物中DRG感覺神經元無明顯或輕度無症狀變性，如此進行詳細檢查以評估感覺神經毒性，且在該試驗中採用感覺神經傳導研究來監測徵狀不顯的(subclinical)感覺神經元病變。值得注意的是，感覺神經元功能喪失(由於潛在的背根神經節毒性)係藉由在30日、3個月、6個月、12個月、18個月、24個月及其後每年進行的感覺神經傳導研究而評估。鑑於在非臨床NHP研究中，AAV投予後2-4週內出現感覺神經元病變，因此在治療後3個月內進行更頻繁的評估將能夠評估人類的相似事件，從而使毒性動力學具有潛在的可變性。整個研究過程中的隨訪將允許評估人類中時間歷程為不同，或者在觀察到臨床後遺症的情況下，評估它們持續存在的時間，以及它們隨著時間的推移是否改善、保持穩定或惡化。
於此研究中亦評估藥效學和功效終點，並根據其在該人群中證明有意義的功能及臨床結果的潛力進行選擇。於30日、90日、6個月、12個月、18個月、24個月測量終點，然後每年進行一次，直至5年的隨訪期，但需要鎮靜及/或LP的除外。長期隨訪階段，測量頻率降低為每12個月一次。選擇此等時間點以促進全面評估rAAVhu68.GLB1的安全性和耐受性。考慮到未治療的嬰幼期GM1患者的疾病進展速度快，亦選擇早期時間點及6個月的間隔。此方法允許在隨訪期間對治療對象進行全面的藥效學和臨床療效評估，該隨訪期間存在未治療的比較數據，並且在此期間未治療的患者預期會顯示顯著下降。
次要和探索性功效終點包括生存率、餵食管獨立性、癲癇發作的發生率和頻率、藉由PedsQL進行測量的生活品質、及神經認知和行為發展。貝萊嬰兒發展量表及文蘭量表用於量化rAAVhu68.GLB1對適應行為、認知、語言、運動功能及健康相關生活品質的發展及變化的影響。每種措施皆用於GM1疾病族群或相關族群中使用，並基於父母和家人的意見進一步完善，以選擇對他們最有意義和最有影響力的措施。為了標準化評估，由經驗豐富的神經心理學家對參加試驗的地點進行各種規模管理的培訓。
給定目標族群中疾病的嚴重度，對象可藉由入選已達成運動技能，發展並隨後喪失了其他運動里程碑，或者尚未顯示出運動里程碑發展的跡象。評估追蹤所有里程碑的達成年齡及喪失年齡。基於WHO基準，為六個總里程碑定義運動里程碑成就。
鑑於患有嬰幼期GM1神經節苷脂症的對象於生命的數月間可發展出症狀，獲得第一WHO運動里程碑(無支撐坐立)通常不會在4個月齡之前出現(中位數：5.9個月齡)，此終點可能缺乏評估治療益處程度的敏感性，尤其是在治療時出現明顯症狀的對象中。為了此原因，亦包括對可應用於嬰兒的適合年齡的發展里程碑的評估(Scharfet al ., 2016, Developmental Milestones.Pediatr Rev. 37(1):25-37；quiz 38, 47.)。此等數據對於總結相對於未治療的具嬰幼期GM1疾病的兒童或神經型兒童的典型獲取時間隨時間推移所保持、獲得或喪失的發展里程碑可能提供資訊。
隨著疾病的進展，兒童可能會發展出癲癇。癲癇活動的發作使我們能夠確定使用rAAVhu68.GLB1進行治療是否可以預防或延遲癲癇發作的發生或降低該族群的癲癇發作頻率。要求父母保存癲癇發作日記，以記錄癲癇的發生、頻率、時間和發作類型。此等條目將在每次訪問時與臨床醫生討論並解釋。
為了評估rAAVhu68.GLB1對CNS表現的影響，在MRI上隨時間測量體積變化。所有神經節苷脂酶的嬰幼期表現型均顯示出一致的大頭畸形，並且顱內MRI體積迅速增加，同時腦組織體積(大腦皮質和其他較小的結構)和心室體積均增大。此外，隨著疾病的進展，包括胼胝體, 尾狀體及殼核的各種較小的腦的子結構以及小腦皮質通常會縮小(Regieret al ., 2016，及Nestrasilet al ., 2018，如本文所引述)。以rAAVhu68.GLB1治療具有萎縮和體積變化穩定的證據被預期減緩或停止CNS疾病表現的進展。基於報導的GM1和GM2神經節苷脂症患者視丘結構變化的證據，係基於視丘和基底神經節中T1/T2訊號強度的變化(正常/異常)(Kobayashi and Takashima, 1994, Thalamic hyperdensity on CT in infantile GM1-gangliosidosis.”Brain and Development.16(6):472-474)。
試驗用的生物標記包括β-gal酶(GLB1)活性(其可於CSD及血清中被測量)，及腦MRI(其顯示嬰幼期GM1神經節苷脂症持續、快速的萎縮)(Regieret al ., 2016b，如本文所引述)。自收集的樣本中檢測CSF和血清中的其它生物標記。
A.主要目標： •通過單劑投予至腦大池(ICM)後2年評估rAAVhu68.GLB1之安全性和耐受性。將評估副作用事件、神經學檢查、感覺神經傳導研究、總神經病變分數-照護、血液學、血清化學、肝臟功能試驗、凝血(PT、aPTT、INR)、肌鈣蛋白-If、CSF抗AAVhu68 nAbs、載體脫落、尿液分析、癲癇日記、身體檢查、生命徵象、ECG、腦MRI、及CSF細胞學及化學(細胞計數、蛋白質、葡萄糖)。 •通過單劑投予至腦大池後評估rAAVhu68.GLB1的效力。關鍵二次端點*將在2年和5年內進行評估： ● 文蘭適應行為量表，第2版 ● 其它二次端點*將在2年和5年內進行評估： ● 嬰幼兒與學步兒發展的貝萊尺度，第3版 ● WHO多中心生長參考研究動作 ● 發展里程碑評量 ● 哈默史密斯嬰兒神經發育檢查 ● 臨床醫生和托育人員對嚴重性和變化的總體印象 ● 退出面談 *並無對於GM1神經節苷脂症符合目標臨床結果評量。因此，與這研究同時進行的是，發起人正在與標的專家合作，從臨床專家和父母/托育人員那裡收集數據，以製定一項成果測量策略，包括確定同齡組3的主要療效終點，並在需要時制定從上述量表得出的綜合終點計劃，修改現有的COA或開發以患者為中心的補充性GM1專用項目或量表。有關詳細資訊，請參見統計分析部分。
B.次要目標： •評估向腦大池遞送單劑後24個月內rAAVhu68.GLB1的藥效學和生物學活性。評估：CSF生物標記：β-半乳糖苷酶活性、己醣胺酶活性、GM1 神經節苷酯水平；血清生物標記：β-半乳糖苷酶活性、己醣胺酶活性；尿液生物標誌物：硫酸角質素水平； 所有評估將在30日和5年的時間內進行。 •單劑投予至腦大池後評估於疾病進展上rAAVhu68.GLB1的效果。評估：MRI測量的總腦容量、腦子結構容量、心室容量及T1/T2訊號強度； 通過側面脊柱X射線測量的骨骼異常；通過心臟超聲心動圖測量心肌病；通過腹部超音波測量肝脾腫大；通過連續腦電圖測量的腦功能和瀰漫性減慢變化；評估無機械通氣生存率；通過放置和使用餵食管來評估營養狀況；所有皆將在5年內評估。 評估將rAAVhu68.GLB1單劑投予於腦大池後對生活品質和醫療資源利用的影響。評估：生活品質：小兒生活質量量表/小兒生活質量量表-嬰兒量表；醫療保健資源利用：圖表檢查，包括住院日、ER就診、ICU入院、手術、聽力及視力輔助的需求；所有此等皆將在5年內評估。
C.研究設計： rAAVhu68.GLB1的多中心、開放標籤、單臂劑量遞增研究(下表)。至多28名具有GM1神經節苷脂症的兒科對象入選4個劑量同齡組，並藉由ICM注射投予而接受單劑量的rAAVhu68.GLB1。安全性及耐受性通過2年評估，所有對象在rAAVhu68.GLB1投予後追蹤5年，以對安全性和耐受性、藥效學(轉基因表現的持久性)和臨床結果的持久性進行長期評估。
產品名： AAVhu68.UbC.GLB1
基因插入： 編碼β-半乳糖苷酶(beta-gal或β-gal)的人類GLB1 基因之人工型式
控制元件： 源自人類泛素C(UbC)啟動子的調節元件
其它元件： 嵌合內含子(CI)–由人類β-球蛋白剪接供體及免疫球蛋白G(IgG)剪接受體元件所組成的雜合內含子 源自猿病毒40(SV40)晚期基因的多腺苷酸化(PolyA)訊號A
AAV血清型： Hu68
將AAVhu68.UbC.GLB1冷凍(≤-60°C)以ITFFB(鞘內最終調配緩衝液)中的無菌溶液形式提供。根據對象的劑量水平和年齡段，在投予前可能需要在ITFFBD01(研究藥物稀釋劑)中稀釋AAVhu68.UbC.GLB1 DP。AAVhu68.UbC.GLB1 DP及ITFFBD01調配物由1 mM磷酸鈉、150 mM氯化鈉、3 mM氯化鉀、1.4 mM氯化鈣、0.8 mM氯化鎂、0.001%泊洛沙姆188, pH 7.2所構成。
在投予前-35日到-1日篩選潛在對象，以確定該研究的資格。多至28名具有第1型(嬰幼期)及第2a型(嬰幼晚期)GM1神經節苷脂症的兒科對象入選此研究。彼等符合納入/排除標準的對象在第1日早上或按照機構慣例入院。對象在第1日接受單次ICM劑量的rAAVhu68.GLB1，並在投予後留在醫院至少24小時以進行觀察。投予後第7、14和30日進行後續評估，第一年每60日評估一次，第二年每90日評估一次。通過評估不良事件(AE)和嚴重不良事件(SAE)、生命體徵、身體檢查、感覺神經傳導研究及實驗室評估(化學、血液學、凝血研究、CSF分析)來監測。亦評估AAV及轉基因產物的免疫原性。功效評估包括生存率、認知、動作及社交發展的測量、視覺功能和腦電圖的變化、肝臟和脾臟體積的變化、以及CSF、血清和尿液中的生物標記。
該研究由以下三個作為單次ICM注射投予的rAAVhu68.GLB1的同齡組所組成。
部分1(劑量遞增同齡組)
同齡組 患者 指定的干預
同齡組1 遲發性嬰幼期GM1神經節苷脂症(第2a型) rAAVhu68.GLB1劑量1：3.3x1010 GC/g* 單劑之rAAVhu68.GLB1，經由腦大池內
同齡組2 遲發性嬰幼期GM1神經節苷脂症(第2a型) rAAVhu68.GLB1劑量2：1.1x1011 GC/g*單劑之rAAVhu68.GLB1，經由腦大池內
同齡組3 早發性嬰幼期GM1神經節苷脂症(第1型) rAAVhu68.GLB1劑量1：3.3x1010 GC/g* 單劑之rAAVhu68.GLB1，經由腦大池內
同齡組4 早發性嬰幼期GM1神經節苷脂症(第1型) rAAVhu68.GLB1劑量2：1.1x1011 GC/g*單劑之rAAVhu68.GLB1，經由腦大池內
部分2(擴充同齡組)
同齡組5 遲發性嬰幼期GM1神經節苷脂症(第2a型) rAAVhu68.GLB1劑量之rAAVhu68.GLB1單劑量，經由腦大池內的劑量將在回顧同齡組1-4的數據後確定第2部分中用於確認同齡組的劑量。
同齡組6 早發性嬰幼期GM1神經節苷脂症(第1型) rAAVhu68.GLB1之rAAVhu68.GLB1單劑量，經由腦大池內的劑量將在回顧同齡組1-4的數據後確定第2部分中用於確認同齡組的劑量。
*GC/g：每公克評估的腦重量的基因拷貝
D.納入標準： 1.編入時≥4個月且＜36個月齡，具有第1型(發作≤6個月)或第2a型(發作＞6個月且≤18個月)。 a.第1型嬰幼期GM1 ●     i.症狀發生前的對象(≤6個月大，具有確定的突變且血清β-gal活性降低)通過產前篩檢或年齡較大的手足家族史確定，並具有相同基因型的GM1神經節苷脂症的確定診斷。手足必須在≤6個月齡時出現症狀。 或 ●     ii.有症狀的對象(證實突變且血清β-gal活性降低)必須具有≤6個月齡的發病醫學記錄文件，出現肌張力低下或任何與GM1神經節苷脂症相符的症狀，至少有70%的年齡在投劑時校正了預期的運動發展(BSID-III)。 b.第2a型嬰幼晚期GM1： i.具有＞6個月且≤18個月齡發作之有症狀的GM1對象，出現肌張力低下或任何記載的符合GM1神經節苷脂症之症狀者，其表現出達到進一步的發展里程碑的平穩期或延遲，且至少有70%的年齡校正後的預期運動發展(BSID III)。 2.該對象對於GLB1基因缺失或突變為同型合子或複合異型合子，並且β-gal活性降低(≤白血球正常值的20%)的證明文件。
E.排除標準： 1.於研究人員的意見，任何歸因於GM1神經節苷脂症或任何其他狀況的臨床上重大的神經認知功能障礙，可能會使研究結果的解釋混亂。 2.若任何對象患有急性疾病，需要在編入後30日內住院，則使該對象編入之前，必須與發起人的醫療監護者討論病史。 3.輔助呼吸支持或需要氣管切開術的呼吸史。 4.難治性癲癇發作或不受控制的癲癇病定義為發生癲癇持續狀態發作，或在服用研究產品前30日內需要住院治療的癲癇發作。 5.ICM投予程序的任何禁忌，包括螢光鏡影像及麻醉的禁忌。 6.MRI或LP的任何禁忌。 7.先前的基因治療。 8.在投劑研究產品前48小時內使用麥格司他。 9.在投劑研究產品之前的5個半衰期內使用酶替代療法或其它研究療法。 10.於研究者的意見，任何條件(例如，任何疾病的病史、任何當前疾病的證據、身體檢查的任何發現或任何實驗室異常)都將使對象在手術過程中面臨過度的風險或干擾研究產品的評估或對象安全性或研究結果的解釋。此包括： a. 研究者認為臨床上異常的實驗值具有臨床意義。 b. 未能茁壯成長，定義為：在篩選/基線之前的3個月中體重下降20%(20/100) c. 免疫功能的潛在缺陷 d. 多種及嚴重威脅生命的感染的病史
F.投予途徑和程序 在第1日，將rAAVhu68.GLB1呈單劑量投予，經由CT引導的枕下注射到腦大池中。
於第1日，由與研究相關的研究藥局(Investigational Pharmacy)製備適當濃度的rAAVhu68.GLB1。將裝有5.6mL適當濃度的rAAVhu68.GLB1的注射器送入手術室。進行研究藥物投予時有下列人員在場：進行此處置的介入醫師；麻醉師及呼吸技術人員；護士及醫師助理；CT(或手術室)技術人員；現場研究協調員。
在藥物投予之前，先進行腰椎穿刺以移除預定體積的CSF，然後在鞘內(IT)注射碘化造影劑，以幫助可視化腦大池的相關解剖學結構。可於針頭插入之前或期間給予靜脈內(IV)造影劑，以作為鞘內造影劑之替代。介入者決定是否使用IV或IT對比。對對象進行麻醉、插管，且置於處置台上。使用無菌技術將注射部位備妥並用布蓋好。於螢光鏡引導下，將一根脊髓針(22-25 G)推入腦大池。可使用較大的導引針以輔助針頭放置。確認針頭放置後，將延伸套件連接到脊椎穿刺針上，並使其充滿CSF。在介入醫師的裁量下，可對延伸套件連接含造影劑的注射器，並少量注入以確認針頭在腦大池中的放置。藉由CT導引+/-照影劑注射而確認針頭放置後，將包含5.6mL 之rAAVhu68.GLB1注射器連接到延伸套件。在1-2分鐘內緩慢注入注射器中的內容物，以遞送5.0mL的體積。將針頭從對象身上慢慢移除。
投予rAAVhu68.GLB1單劑至腦大池(ICM)於投予後5年內為安全且可耐受的。
rAAVhu68.GLB1之單劑投予至腦大池(ICM)中提高生存率、降低24個月齡時對餵食管依賴的可能性、及/或減少如下列評估的疾病進展：成就年齡、喪失年齡、及維持或獲得適合年齡的發展及動作里程碑的兒童百分比。
治療減緩神經認知功能的喪失。
為了預防潛在的免疫媒介的損傷，如肝毒性，對象將接受全身性皮質類固醇激素治療。從rAAVhu68.GLB1投予的前一日開始，將以每天1mg/kg體重的劑量與口服去氫皮質醇相當的全身性皮質類固醇投予約30日(或直到計劃的第1個月隨訪為止，以先到者為準)。在此訪視期間，應按照評估時間表進行臨床檢查及實驗室測試。於無明顯發現的患者，研究者應根據臨床判斷在接下來的21日內逐漸減少皮質類固醇的劑量，從第5週的每日0.75mg/kg劑量開始，第6週的每日0.5mg/kg劑量，然後第7週的每日0.25mg/kg 劑量，第8週的每隔一天0.25mg/kg的劑量。若患者對1mg/kg/日的治療方案沒有足夠的反應，則諮詢專家。若研究者認為對象出現臨床症狀或潛在的免疫媒介毒性反應的臨床/實驗室跡象，則可改變免疫抑制的劑量、類型及時間表，並應告知研究負責醫生。應遵守常規疫苗時間表和當地指引，包括在對象接受類固醇治療時調整疫苗時機的建議。
在本說明書中引用的所有文件皆以引用方式併入本文，如同標記為「21-9595PCT_ST25.txt」的序列表。亦藉由引用併入本文者為2020年8月7日提交的美國臨時專利申請案63/063,119、2020年4月8日提交的美國臨時專利申請案63/007,297及2020年2月2日提交的美國臨時專利申請案63/007,297。儘管已經參考特定具體實施例描述本發明，但應當理解，可於不脫離本發明的精神的情況下進行修改。此種修改意圖落入所附申請專利權利的範籌內。 (序列表非關鍵詞文字) 對於包含在數字識別號＜223＞下的非關鍵詞文字的序列，提供下列資訊。
SEQ ID NO：(包含非關鍵詞文字) 在＜223＞下的非關鍵詞文字
1 ＜223＞智人(Homo Sapiens)來源之AAVhu68 vp1衣殼 ＜220＞ ＜221＞ CDS ＜222＞(1)..(2211)
2 ＜223＞ 合成構築體
3 ＜223＞ 經修飾hu68vp1 ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(23)..(23) ＜223＞ Xaa可為W(Trp、色胺酸)、或經氧化的W。 ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(35)..(35) ＜223＞ Xaa可為Asn、或去醯胺成Asp、isoAsp、或Asp/isoAsp ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞ (57)..(57) ＜223＞ Xaa可為Asn、或去醯胺成Asp、isoAsp、或Asp/isoAsp    ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(66)..(66) ＜223＞ Xaa可為Asn、或去醯胺成Asp、isoAsp、或Asp/isoAsp ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(94)..(94) ＜223＞ Xaa可為Asn、或去醯胺成Asp、isoAsp、或Asp/isoAsp ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(97)..(97) ＜223＞ Xaa可為D(asp，天冬胺酸)、或經異構物化的D。 ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(107)..(107) ＜223＞ Xaa可為D(asp，天冬胺酸)、或經異構物化的D。 ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(113)..(113) ＜223＞ Xaa可為任何天然發生的胺基酸 ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(149)..(149) ＜223＞ Xaa可為S(Ser，絲胺酸)、或經磷酸化的S ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(149)..(149) ＜223＞ Xaa可為S(Ser，絲胺酸)、或經磷酸化的S ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(247)..(247) ＜223＞ Xaa可為W(Trp，色胺酸)、或經氧化的W(例如，犬尿胺酸)。 ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(253)..(253) ＜223＞ Xaa可為Asn、或去醯胺成Asp、isoAsp、或Asp/isoAsp ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(259)..(259) ＜223＞ Xaa表示Q、或Q去醯胺成麩胺酸       (α-麩胺酸)、γ-麩胺酸(Glu)、或α-及γ-麩胺酸之摻混物       ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(270)..(270) ＜223＞ Xaa可為Asn、或去醯胺成Asp、isoAsp、或Asp/isoAsp ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(297)..(297) ＜223＞ Xaa表示D(Asp，天冬胺酸)或醯胺化D至N(Asn，       天冬醯胺酸) ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(304)..(304) ＜223＞ Xaa可為Asn、或去醯胺成Asp、isoAsp、或Asp/isoAsp ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(306)..(306) ＜223＞ Xaa可為W(Trp，色胺酸)、或經氧化的W(例如，犬尿胺酸)。 ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(314)..(314) ＜223＞ Xaa可為Asn、或去醯胺成Asp、isoAsp、或Asp/isoAsp ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(319)..(319) ＜223＞ Xaa可為Asn、或去醯胺成Asp、isoAsp、或Asp/isoAsp ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(329)..(329) ＜223＞ Xaa可為Asn、或去醯胺成Asp、isoAsp、或Asp/isoAsp ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(332)..(332) ＜223＞ Xaa可為K(lys，離胺酸)、或經乙醯化的K ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(336)..(336) ＜223＞ Xaa可為Asn、或去醯胺成Asp、isoAsp、或Asp/isoAsp ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(384)..(384) ＜223＞ Xaa可為D(asp，天冬胺酸)、或經異構物化的D。 ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(404)..(404) ＜223＞ Xaa可為M(Met，甲硫胺酸)、或經氧化的M。 ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(409)..(409) ＜223＞ Xaa可為Asn、或去醯胺成Asp、isoAsp、或Asp/isoAsp ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(436)..(436) ＜223＞ Xaa可為M(Met，甲硫胺酸)、或經氧化的M。 ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(452)..(452) ＜223＞ Xaa可為Asn、或去醯胺成Asp、isoAsp、或Asp/isoAsp ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(477)..(477) ＜223＞ Xaa可為Asn、或去醯胺成Asp、isoAsp、或Asp/isoAsp ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(499)..(499) ＜223＞ Xaa可為S(Ser，絲胺酸)、或經磷酸化的S ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(512)..(512) ＜223＞ Xaa可為Asn、或去醯胺成Asp、isoAsp、或Asp/isoAsp ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(515)..(515) ＜223＞ Xaa可為Asn、或去醯胺成Asp、isoAsp、或Asp/isoAsp ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(518)..(518) ＜223＞ Xaa可為M(Met，甲硫胺酸)、或經氧化的M。 ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(524)..(524) ＜223＞ Xaa可為M(Met，甲硫胺酸)、或經氧化的M。 ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(559)..(559) ＜223＞ Xaa可為M(Met，甲硫胺酸)、或經氧化的M。 ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(569)..(569) ＜223＞ Xaa可為T(Thr，蘇胺酸)、或經磷酸化的T ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(586)..(586) ＜223＞ Xaa可為S(Ser，絲胺酸)、或經磷酸化的S ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(599)..(599) ＜223＞ Xaa表示Q、或Q去醯胺成麩胺酸       (α-麩胺酸)、γ-麩胺酸(Glu)、或α-及γ-麩胺酸之摻混物       ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(605)..(605) ＜223＞ Xaa可為M(Met，甲硫胺酸)、或經氧化的M。 ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(619)..(619) ＜223＞ Xaa可為W(Trp，色胺酸)、或經氧化的W(例如，犬尿胺酸)。 ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(628)..(628) ＜223＞ Xaa可為Asn、或去醯胺成Asp、isoAsp、或Asp/isoAsp ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(640)..(640) ＜223＞ Xaa可為M(Met，甲硫胺酸)、或經氧化的M。 ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(651)..(651) ＜223＞ Xaa可為Asn、或去醯胺成Asp、isoAsp、或Asp/isoAsp ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(663)..(663) ＜223＞ Xaa可為Asn、或去醯胺成Asp、isoAsp、或Asp/isoAsp ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(666)..(666) ＜223＞ Xaa可為K(lys，離胺酸)、或經乙醯化的K ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(689)..(689) ＜223＞ Xaa可為K(lys，離胺酸)、或經乙醯化的K ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(693)..(693) ＜223＞ Xaa可為K(lys，離胺酸)、或經乙醯化的K ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(695)..(695) ＜223＞ Xaa可為W(Trp、色胺酸)、或經氧化的W。 ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(709)..(709) ＜223＞ Xaa可為Asn、或去醯胺成Asp、isoAsp、或Asp/isoAsp ＜220＞ ＜221＞ MISC_FEATURE ＜222＞(735)..(735) ＜223＞ Xaa可為Asn、或去醯胺成Asp、isoAsp、或Asp/isoAsp
6 ＜223＞ 人類GLB1經工程化的編碼序列
7 ＜223＞ 人類GLB1經工程化的編碼序列 ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (6)..(6) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (9)..(9) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(15)..(15) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(18)..(18) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(21)..(21) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(27)..(27) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(30)..(30) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(33)..(33) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(36)..(36) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(39)..(39) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(42)..(42) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(45)..(45) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(48)..(48) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(51)..(51) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(54)..(54) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(57)..(57) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(60)..(60) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(63)..(63) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(66)..(66) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(69)..(69) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(72)..(72) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(75)..(75) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(81)..(81) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(84)..(84) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(90)..(90) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(111)..(111) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(114)..(114) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(120)..(120) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(126)..(126) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(135)..(135) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(141)..(141) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(147)..(147) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(156)..(156) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(159)..(159) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(162)..(162) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(174)..(174) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(177)..(177) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(180)..(180) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(183)..(183) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(186)..(186) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(204)..(204) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(207)..(207) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(210)..(210) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(225)..(225) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(228)..(228) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(231)..(231) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(237)..(237) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(246)..(246) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(252)..(252) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(255)..(255) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(273)..(273) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(279)..(279) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(282)..(282) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(297)..(297) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(312)..(312) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(324)..(324) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(327)..(327) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(330)..(330) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(333)..(333) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(342)..(342) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(345)..(345) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(348)..(348) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(351)..(351) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(354)..(354) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(360)..(360) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(363)..(363) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(366)..(366) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(369)..(369) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(372)..(372) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(384)..(384) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(399)..(399) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(402)..(402) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(405)..(405) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(408)..(408) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(411)..(411) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(417)..(417) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(420)..(420) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(432)..(432) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(438)..(438) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(441)..(441) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(444)..(444) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(447)..(447) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(450)..(450) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(456)..(456) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(465)..(465) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(468)..(468) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(471)..(471) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(474)..(474) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(486)..(486) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(489)..(489) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(492)..(492) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(495)..(495) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(498)..(498) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(501)..(501) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(513)..(513) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(516)..(516) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(519)..(519) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(531)..(531) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(534)..(534) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(537)..(537) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ 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misc_feature ＜222＞(1791)..(1791) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1797)..(1797) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1800)..(1800) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1803)..(1803) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1809)..(1809) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1812)..(1812) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1824)..(1824) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1830)..(1830) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1833)..(1833) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1836)..(1836) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1839)..(1839) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1845)..(1845) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1851)..(1851) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1854)..(1854) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1857)..(1857) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1863)..(1863) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1872)..(1872) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1875)..(1875) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1881)..(1881) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1884)..(1884) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1893)..(1893) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1899)..(1899) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1905)..(1905) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1908)..(1908) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1911)..(1911) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1917)..(1917) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1923)..(1923) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1926)..(1926) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1929)..(1929) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1935)..(1935) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1938)..(1938) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1941)..(1941) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1944)..(1944) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1947)..(1947) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1959)..(1959) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1962)..(1962) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1968)..(1968) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1971)..(1971) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1980)..(1980) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1983)..(1983) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1989)..(1989) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1992)..(1992) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1995)..(1995) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(1998)..(1998) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(2016)..(2016) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(2022)..(2022) ＜223＞ n為a、c、g、或t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞(2031)..(2031) ＜223＞ n為a、c、g、或t
8 ＜223＞ 人類GLB1經工程化的編碼序列
10 ＜223＞ 具巨細胞病毒增強子(CB7)之雞β肌動蛋白啟動子
11 ＜223＞ 人類延長起始因子1α啟動子(EF1a)
12 ＜223＞ UbC.GLB1.SV40載體基因體
13 ＜223＞ EF1a.GLB1.SV40載體基因體
14 ＜223＞ UbC.GLB1.SV40-2
15 ＜223＞ UbC.GLB1.SV40-3
16 ＜223＞ 載體基因體 CB7.CI.GLB1.RBG ＜220＞ ＜221＞ repeat_region ＜222＞(1)..(130) ＜223＞ 源自AAV2的5” ITR ＜220＞ ＜221＞ repeat_region ＜222＞(4232)..(4362) ＜223＞ 源自AAV2的5” ITR
17 ＜223＞ 雞β肌動蛋白內含子
18 ＜223＞ CB啟動子
19 ＜223＞ CMV立即早期啟動子
20 ＜223＞ 經編碼的AAV9 vp1胺基酸序列
21 ＜223＞經編碼的AAVhu31 vp1胺基酸序列
22 ＜223＞ 經編碼的AAVhu32 vp1胺基酸序列
23 ＜223＞ AAV9 vp1編碼序列
24 ＜223＞ AAVhu31 vp1編碼序列
25 ＜223＞ AAVhu32 vp1編碼序列
無。
圖1A提供一AAV載體基因體之示意圖，其顯示5’ITR、人類泛素C(UbC)啟動子、嵌合內含子、編碼人類β-半乳糖苷酶(β-gal)之GLB1 基因、SV40晚期polyA訊號、及3’ITR(即，「AAVhu68.Ubc.hGLB1co.SV40」)。 圖1B提供一含有由順式 質體攜帶的AAV載體基因體之順式質體(pAAV.UbC.hGLB1co.SV40.KanR)之示意圖。GLB1，β-半乳糖苷酶；ITR，反向末端重複；KanR，康黴素抗性；Ori，複製起點；PolyA，多腺苷酸化；及UbC，泛素C。 圖1C提供一包含編碼四個蛋白質之全長AAV2複製酶(AAV2 Rep)的編碼序列及AAVhu68 VP1衣殼基因(其編碼VP1、VP2及VP3蛋白)之反式質體之示意圖。AAV2，腺相關病毒血清型2；AAVhu68，腺相關病毒血清型hu68；Cap，衣殼；KanR，康黴素抗性；Ori，複製起點；及Rep，複製酶。 圖2A及2B分別說明以使用不同啟動子表現人類β-gal之rAAVhu68.GLB1處理的野生型小鼠之腦及腦脊髓液(CSF)中β-gal活性。以單次腦室內(ICV)注射由CB7、EF1a或UbC啟動子表現人類GLB1的rAAVhu68.GLB1而處理野生型小鼠(每組n=10)。未經處理的野生型小鼠(n=5)用作對照。rAAVhu68.GLB1投予後14日收集大腦(額葉皮層)及CSF，並使用螢光受質測量β-gal活性。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，克拉斯卡－瓦立斯檢定(Kruskal-Wallis test)，然後鄧恩檢定(Dunn’s test)。 圖3A-3E說明於GLB1剃除小鼠研究中血清及末梢器官β-gal活性。臨床前研究使用GM1的GLB1 基因剔除小鼠模型(攜帶在GLB1 基因中同型合子(homozygous)突變的小鼠，或GLB1-/-小鼠)進行。此研究比較經AAVhu68.UbC.hGLB1處理的GLB1-/-小鼠、經媒液(磷酸鹽緩衝液或PBS)處理的GLB1-/-小鼠、及異型合子(異型合子)GLB1 突變攜帶者的無病小鼠、或以媒液處理的GLB1+/-小鼠。於此研究中，所有小鼠均於一個月齡時處理，並觀察直到四個月齡時，這時GM1小鼠通常出現與大腦GM1神經節苷脂水平相關的明顯步態異常，該異常與患有晚期疾病的嬰幼期GM1患者相似。所有小鼠均經腦室內或ICV注射測試載體(在以下圖表中表示為AAV)或媒液進行處理。處理後90日，對所有動物實施安樂死並收集組織，稱為屍檢，以進行組織學及生化學分析。處理前後的各個時間點(第0、10、28、60及90日)測量血清β-gal活性。屍檢時評估腦、CSF及周圍器官中的β-gal活性。使用螢光基質分別在血清(圖3A)以及肺臟(圖3B)、肝臟(圖3C)、心臟(圖3D)及脾臟(圖3E)樣品中測量β-gal活性。PBS：磷酸鹽緩衝液(媒液)；AAV：腺相關病毒(AAVhu68.UbC.hGLB1)。*p＜0.05，**p＜0.01，克拉斯卡－瓦立斯檢定，然後鄧恩檢定。NS：不顯著。圖3A顯示，與經媒液處理的GLB1-/-小鼠相比，AAVhu68.UbC.hGLB1處理的GLB1-/-小鼠在治療後具有實質上較高的血清β-gal活性，且與經媒液處理的異型合子對照小鼠具有相似的β-gal活性。於以AAVhu68.UbC.hGLB1處理的所有小鼠處理後不久，以奈米莫耳/毫升/小時或nmol/ml/h測量的血清β-gal活性提升，並且除兩個AAVhu68.UbC.hGLB1處理的小鼠以外(兩者均表現出針對人類β-gal的抗體)，於所有小鼠，均在整個研究中持續存在。圖3B–3E顯示屍檢後在肺臟、肝臟、心臟及脾臟中的β-gal活性。於每個器官中，rAAV.hGLB1 GLB1-/-小鼠中的β-gal活性超過經媒液處理的GLB1-/-小鼠中的活性水平。此數據支持hGLB1為周圍器官提供矯正的β-gal酶活性的潛力，並暗示以rAAV.hGLB1載體的治療可解決在GM1患者中觀察到的CNS及周圍的現象。 圖4A-4B說明屍檢後腦以及CSF中的β-gal活性，單位為奈米莫耳/毫克/小時或nmol/mg/h。AAVhu68.UbC.hGLB1處理的小鼠的β-gal活性在腦及CSF中均超出經媒液處理的GLB1-/-小鼠。屍檢時收集腦(額葉皮層)及CSF，並使用螢光基質測量β-gal活性。PBS：磷酸鹽緩衝液(媒液)；AAV：腺相關病毒(AAVhu68.UbC.hGLB1)。*p＜0.05，**p＜0.01，克拉斯卡－瓦立斯檢定，然後鄧恩檢定。NS：不顯著。統計顯著性為重要的，且當於本文中使用時，以p值表示。p值係報告的結果為純粹偶然獲得的概率(例如，p值＜0.001意指觀察到的變化純粹係由於偶然導致的概率低於0.1%)。通常，小於0.05的p值被認為統計上顯著的。 圖5顯示經rAAVhu68.GLB1處理的GLB1-/-小鼠的腦中己糖胺酶(HEX)活性的降低。屍檢時收集腦(額葉皮層)，並使用螢光基質測量HEX活性。PBS：磷酸鹽緩衝液(媒液)；AAV：腺相關病毒(AAVhu68.UbC.hGLB1)。*p＜0.05，**p＜0.01，克拉斯卡－瓦立斯檢定，然後鄧恩檢定。NS：不顯著。屍檢後評估使用生化及組織學分析對腦部異常的矯正。胞溶體酶在胞溶體貯積症中經常被向上調節，且已於GM1患者中得到證實。因此，我們測量腦溶胞產物中胞溶體酶HEX的活性。該圖顯示，經rAAV.hGLB1處理的GLB1-/-小鼠中的HEX活性與GLB1+/-對照小鼠相比被標準化，而經媒液處理的GLB1-/-表現出升高的總HEX活性。 圖6顯示β-gal活性和抗β-gal抗體之間的相關性。屍檢時從經AAV處理的小鼠收集的血清樣品中測量β-gal活性和血清抗β-gal抗體。每個點代表一個別動物。 圖7A-7G顯示於經AAV處理的GLB1-/-小鼠中步態異常的校正。圖7A及7B顯示連續兩天使用CatWalk系統評估平均年齡為5個月的未處理的GLB1-/-小鼠(n=12)及GLB1+/-對照(n=22)。在至少3次試驗中，為每隻動物定量平均步行速度(圖7A)及後足印記的長度(圖7B)。**p＜0.01曼－懷特尼檢定(Mann Whitney test)。圖7C及7D顯示使用CatWalk系統，評估經媒液及AAV處理的GLB1-/- 小鼠(n=14)處理的四個月齡的GLB1+/- (n=15)或GLB1-/-( n=15)小鼠。在測試的第二天，在至少3次試驗中為每隻動物定量平均步行速度(圖7C)及後足印記的長度(圖7D)。*p＜0.05，**p＜0.01，克拉斯卡－瓦立斯檢定，然後鄧恩檢定。NS：不顯著。圖7E-G顯示經AAV處理的GLB1-/- 小鼠(圖7G)及經媒液處理的GLB1+/- (圖7E)及GLB1-/- (圖7F)對照之代表性後足印記。 圖8A及8B顯示步行速度和步態參數之間的相關性。使用CatWalk系統連續兩天評估GLB1+/- 對照(n=22)。記錄第二天在至少三項試驗中測得的步態參數。相關分析證實步行速度和步態參數(如步幅)之間為強相關性(斯皮爾曼(Spearman)r=0.7432，p＜0.001，圖8A)。相反地，後足印記長度與速度無關(Spearman r= -0.1239，p=0.423，圖8B)。 圖9A-9G提供通過ICV注射接受4劑rAAVhu68.UbC.GLB1(1.3×1011 GC、4.4×1010 GC、1.3×1010 GC或4.4×109 GC)中的一種或媒液的GLB1-/- 小鼠的後肢之β-gal活性(圖9A)、體重(圖9B)、神經學檢查分數(neuro exam score，圖9C)、後足印記長度(圖9D)和擺動時間(圖9E)及步幅(圖9F)。投予媒液(Het+媒液)的GLB1+/- 小鼠作為對照。更多細節提供於實施例4，A部分。圖9G顯示投予最高劑量的rAAV.GLB1的GLB1-/-小鼠血清中的平均β-gal活性約大於正常經媒液處理的GLB1+/-對照的10倍。在rAAV.hGLB1 次高劑量下，GLB1-/-小鼠的血清β-gal活性類似於正常經媒液處理的GLB1+/-對照。其它所有rAAV.hGLB1 劑量的GLB1-/-小鼠血清β-gal活性相似於經媒液處理的GLB1-/-對照。 圖10A-10B提供顯示AAVhu68(SEQ ID NO：2)(於對比中標記為hu.68.vp1)的vp1衣殼蛋白的胺基酸序列，與AAV9(SEQ ID NO：20)、AAVhu31(於對比中標記為hu.31，SEQ ID NO：21)及AAVhu32(於對比中標記為hu.32，SEQ ID NO：22)。與AAV9、AAVhu31和AAVhu32相比，發現兩個突變(A67E和A157V)在AAVhu68中為關鍵的，並於圖10A中被圈出。 圖11A-11E提供編碼AAVhu68的vp1衣殼蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：1)，與AAV9(SEQ ID NO：23)、AAVhu31(SEQ ID NO：24)及AAVhu32(SEQ ID NO：25)的比對。 圖12A提供用於生產rAAVhu68.GLB1原料藥的製造過程的說明性流程圖。AEX，陰離子交換；CRL，查爾斯河實驗室(Charles River Laboratories)；ddPCR，液滴數位聚合酶鏈反應(droplet digital PCR)；DMEM，達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco’s modified Eagle medium)；DNA，去氧核糖核酸；FFB，最終調配緩衝液；GC，基因體拷貝；HEK293，人類胚胎腎293細胞；ITFFB，鞘內最終調配緩衝液；PEI，聚乙亞胺；Ph. Eur.，歐洲藥典；SDS-PAGE，十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳；TFF，切向流過濾(tangential flow filtration)；USP，美國藥典；WCB，工作細胞庫。 圖12B提供用於生產rAAVhu68.GLB1藥品的製造過程的說明性流程圖。Ad5，腺病毒血清型5；AUC，分析型超速離心；BDS，主體原料藥(bulk drug substance)；BSA，牛血清白蛋白；CZ，Crystal Zenith；ddPCR，液滴數位聚合酶鏈反應；E1A，早期區域1A(early region 1A)(基因)；ELISA，酶連結免疫吸附分析法；FDP，最終藥品；GC，基因體拷貝；HEK293，人類胚胎腎293細胞；ITFFB，鞘內最終調配緩衝液；KanR，康黴素抗性(基因)；MS，質譜法；NGS，次世代定序；Ph.Eur.，歐洲藥典；qPCR，定量聚合酶鏈反應；SDS-PAGE，十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳；TCID50，50%組織培養物感染量；UPLC，超高效液相層析；USP，美國藥典。 圖13顯示於此研究中每個同齡組在第300日時的生存數據，於1.3x1011 GC、4.4x1010 GC、1.3x1010 GC、及4.4x109 GC之劑量，與KO之媒液對照及異型合子小鼠之媒液對照。 圖14A-14C顯示每個同齡組在每個神經病學評估期的平均總嚴重度分數。圖14A提供步幅(cm)。圖14B提供後足印記長度(cm)。圖14C提供神經學檢查的總分數。 圖15A-15C提供組織學分析結果，亦比較於基線時(圖15A，第1日，1月齡)、第150日(圖15B)及第300日(圖15C)經rAAV.hGLB1處理的GLB1-/-小鼠、經媒液處理的GLB1-/-小鼠及經媒液處理的GLB1+/-對照小鼠的腦切片。 圖16A提供血清β-gal活性(nmol/mL/h)且圖16B顯示在所有評估的小鼠的CSF中可檢測到β-gal活性。投予兩次最高劑量的被測試rAAV.hGLB1的GLB1-/-小鼠表現出的CSFβ-gal平均活性水平超過正常經媒液處理的GLB1+/-對照。CSF中的β-gal活性通常為劑量依賴性的，儘管於兩個最低劑量組中β-gal活性似乎相似。 圖17A-圖17L顯示評估試驗的經rAAV.hGLB1處理的GLB1-/-小鼠及經媒液處理的對照之β-gal活性的結果，腦(圖17A，第150日，及圖17B，第300日)、心臟(圖17C，第150日，及圖17D，第300日)、肝臟(圖17E，第150日，及圖17F，第300日)、脾臟(圖17G，第150日，及圖17H，第300日)、肺臟(圖17I，第150日，及圖17J，第300日)或腎臟(圖17K，第150日，及圖17L，第300日)。在評估的所有小鼠的腦脊髓液中均可檢測到β-gal。投予兩次最高劑量的試驗的rAAV.hGLB1的GLB1-/-小鼠表現出的CSFβ-gal平均活性水平超出正常經媒液處理的GLB1 +/-對照。CSF中的β-gal活性通常為劑量依賴性的，儘管在兩個最低劑量組中，β-gal活性似乎相似。 圖18A-18B顯示在第120日的背根神經節(DRG)和脊髓病變的嚴重度，藉由組織學分析和從0(無)至5(嚴重)的病變嚴重度評分來進行測量。箭頭指向顯示出最嚴重的軸突喪失和纖維化且感覺神經動作電位降低的兩隻動物。 圖19A-19B顯示第120日時的正中神經軸突病變和正中神經軸突周圍的纖維化，藉由組織學分析和從0(無)至5(嚴重)的病變嚴重度評分來測量。箭頭指向顯示出最嚴重的軸突喪失和纖維化且感覺神經動作電位降低的兩隻動物。 圖20A-20B顯示直至研究第120日的每個測量點的感覺正中神經傳導的變化，以感覺正中神經動作電位(微伏特(MV)為單位)進行測量。 圖21顯示ICM投予rAAV.GLB1後的示例性感覺神經動作電位。在BL和第28±3、90±4和120±4日來自接受單次ICM投予rAAV.GLB1，劑量為3.0x1012 GC(低劑量)、1.0x1013 GC(中間劑量)、或3.0x1013 GC(高劑量)(N=3/組)的幼年型NHPs的代表性SNAP波形。動物17-198(第6組)、17-222(第7組)及17-228(第8組)分別代表低劑量、中間劑量及高劑量組中所有動物的神經傳導數據，動物17-226(中間劑量，第7組)和17-205(高劑量；第8組)除外，其在第28±3日時SNAP振幅降低。縮寫：BL，基線；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；N，動物數；NHP，非人類靈長類動物；SNAP，感覺神經動作電位。 圖22A-22B顯示雙側正中神經感覺動作電位振幅(SNAP)和傳導速度的結果。幼年的NHPs接受單次ICM投予媒液(ITFFB；N=2/組)或rAAV.hGLB1試驗載體，以劑量3.0x1012 GC(低劑量)、1.0x1013 GC(中間劑量)、或3.0x1013 GC(高劑量)(N=3/組)。在BL和第28±3、60±3、90±4和120±4日進行感覺神經傳導測試。展示右及左正中神經的SNAP振幅及傳導速度。縮寫：BL，基線；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終調配緩衝液；N，動物數；NHP，非人類靈長類動物；SNAP，感覺神經動作電位。 圖23A-23D顯示經rAAV.hGLB1試驗載體或經媒液處理的NHPs之CSF及血清中人類β-半乳糖苷酶活性的結果。幼年的NHPs接受單次ICM投予媒液(ITFFB；N=2/組)或rAAV.GLB1，於劑量3.0x1012 GC(低劑量)、1.0x1013 GC(中間劑量)、或3.0x1013 GC(高劑量)(N=3/組)。在指定日收集CSF和血清，並分析人類β-gal活性。虛線表示基線內源性β-gal活性水平。圖23A為在設計日數的CSFβ-gal活性。圖23C及23D顯示第14日結果的放大圖：中空的形狀表示在處理時抗載體衣殼的血清循環Nab為陰性的動物。填滿的形狀表示在處理時抗載體衣殼的血清循環NAb為陽性的動物。縮寫：β-gal，β-半乳糖苷酶；BL，基線；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終調配緩衝液；N，動物數；NAb，中和抗體；NHP，非人類靈長類動物；SEM，平均值的標準誤差。 圖24提供ICM投予rAAV.hGLB1至NHPs後60日的載體生物分布。在單次ICM投予rAAV.hGLB1後60日，從幼年NHPs屍檢中收集指定的組織，以3.0x1012 GC(低劑量)、1.0x1013 GC(中間劑量)、或3.0x1013 GC(高劑量)(N=3/組)之劑量。亦自經媒液-(ITFFB-)處理的NHPs(N=2)收集組織作為對照。每個條形代表每μg之DNA檢測到的平均載體基因體。誤差槓代表SEM。LOD為50GC/μg DNA。縮寫：DNA，去氧核糖核酸；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終調配緩衝液；LOD，檢測極限；N，動物數；NHP，非人類靈長類動物；SEM，平均值的標準誤差。 圖25提供ICM投予rAAV.hGBL1至NHPs後120日的載體生物分布。在單次ICM投予rAAV.hGLB1後120日，從幼年NHPs屍檢中收集指定的組織，以3.0x1012 GC(低劑量)、1.0x1013 GC(中間劑量)、或3.0x1013 GC(高劑量)(N=3/組)之劑量。亦自經媒劑-(ITFFB-)處理的NHPs(N=2)收集組織作為對照。每個條形代表每μg之DNA檢測到的平均載體基因體。誤差槓代表SEM。LOD為50GC/μg DNA。縮寫：DNA，去氧核糖核酸；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終調配緩衝液；LOD，檢測極限；N，動物數；NHP，非人類靈長類動物；SEM，平均值的標準誤差。
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無。

Claims (73)

  1. 一種有用於人類患者中治療GM1神經節苷脂症之治療方案，其中該方案包含投予具有AAV衣殼及載體基因體之重組腺相關病毒(rAAV)載體，該載體基因體包含於引導其在標靶細胞中表現的調節序列的控制下編碼人類β-半乳糖苷酶的序列，該投予包含單劑之腦大池內(ICM)注射，該單劑包含： (i)約1.6x1013 至約1.6x1014 GC，其中該患者為約1個月至約4個月齡； (ii)約2.1x1013 至約2.1x1014 GC，其中該患者為至少4個月齡至低於8個月齡； (iii)約2.6x1013 至約2.6x1014 GC，其中該患者為至少8個月齡至高至12個月齡；或 (iv)約3.2x1013 至約3.2x1014 GC，其中該患者為至少12個月齡。
  2. 如請求項1之方案，其中該人類β-半乳糖苷酶編碼序列包含記載於SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：5之核苷酸序列，或與SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：5之任一者至少95%相同的序列，其編碼SEQ ID NO：4之胺基酸24至677的成熟β-半乳糖苷酶。
  3. 如請求項1或2之方案，其中該經編碼的人類β-半乳糖苷酶具有選自下列之序列： (a)SEQ ID NO：4之約胺基酸1至677；及 (b)合成的人類酶，包含融合至SEQ ID NO：4之約胺基酸24至677的異源引導子序列。
  4. 如請求項1至3中任一項之方案，其中該載體基因體進一步包含5’反向末端重複(ITR)序列、衍生自人類泛素C(UbC)啟動子的調節元件、嵌合內含子、polyA訊號、及/或3’ITR序列。
  5. 如請求項1至4中任一項之方案，其中該患者已被鑑定為具有第1型(嬰幼期)GM1或第2a型(嬰幼晚期)GM1。
  6. 如請求項1至5中任一項之方案，其進一步包含在遞送rAAV的至少前一天或當天，對該患者實施至少一種免疫抑制協同療法(immunosuppressive co-therapy)。
  7. 如請求項6之方案，其中該免疫抑制協同療法包括一或多種皮質類固醇。
  8. 如請求項6或7之方案，其中該免疫抑制協同療法包括口服去氫皮質醇(oral prednisolone)。
  9. 如請求項8之方案，其中該口服去氫皮質醇以約1mg/kg體重投予。
  10. 如請求項5至9中任一項之方案，其中投予rAAV後，實施該至少一種免疫抑制協同療法持續至少3至4週。
  11. 如請求項1至10中任一項之方案，其中藉由延緩癲癇發作、降低癲癇發作頻率、血清及/或腦脊髓液中的β-半乳糖苷酶、以及藉由核磁共振造影(MRI)測量的腦組織的體積變化中的一種或多種，而評估治療的療效。
  12. 一種包含重組AAV(rAAV)載體之組成物，該rAAV載體包含AAV衣殼及載體基因體，該載體基因體包含人類β-半乳糖苷酶編碼序列及引導其在標靶細胞中表現的表現控制序列，其中該rAAV載體被調配成用於腦大池內(ICM)注射至需要其之人類對象，以投予下列劑量： (i)約1.6x1013 至約1.6x1014 GC，其中該患者為約1個月至約4個月齡； (ii)約2.1x1013 至約2.1x1014 GC，其中該患者為至少4個月齡至低於8個月齡； (iii)約2.6x1013 至約2.6x1014 GC，其中該患者為至少8個月齡至高至12個月齡；或 (iv)約3.2x1013 至約3.2x1014 GC，其中該患者為至少12個月齡。
  13. 如請求項12之組成物，其中該人類β-半乳糖苷酶編碼序列包含記載於SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：5之核苷酸序列，或與SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：5之任一者至少95%相同的序列，其編碼SEQ ID NO：4之胺基酸24至677的成熟β-半乳糖苷酶。
  14. 如請求項12或13之組成物，其中該載體基因體進一步包含5’反向末端重複(ITR)序列、衍生自人類泛素C(UbC)啟動子的調節元件、嵌合內含子、polyA訊號、及/或3’ITR序列。
  15. 如請求項12至14中任一項之組成物，其中該rAAV被調配成懸浮液以遞送每公克腦質量3.33x1010 GC至每公克腦質量3.33x1011 GC，可選擇地其中該投予的劑量的體積為約3.0mL至約5.0mL。
  16. 如請求項12至15中任一項之組成物，其中該rAAV係於具有pH為6至9之調配緩衝液中，可選擇地其中該pH為約7.2。
  17. 如請求項12至16中任一項之組成物，其係用於協同療法之使用，該協同療法包含在遞送rAAV的至少前一天或當天投予至少一種免疫抑制劑至患者。
  18. 如請求項17之組成物，其中該免疫抑制劑為皮質類固醇，可選擇地為經口服遞送的去氫皮質醇。
  19. 一種治療罹患GM1神經節苷脂症的患者之方法，該方法包含藉由腦大池內(ICM)注射而投予單劑之重組腺相關病毒(rAAV)至患者， 其中該rAAV包含AAV衣殼及載體基因體，該載體基因體包含於引導其在標靶細胞中表現的調節序列的控制下編碼人類β-半乳糖苷酶的序列，且 其中該單劑為該患者每公克估算腦質量1x1010 GC至3.4x1011 GC。
  20. 如請求項19之方法，其中該患者在18個月齡或之前有GM1症狀的發作。
  21. 如請求項20之方法，其中該患者在6個月齡或之前有GM1症狀的發作。
  22. 如請求項20之方法，其中該患者在6至18個月齡有GM1症狀的發作。
  23. 如請求項19至21中任一項之方法，其中該患者具有第1型(嬰幼期)GM1。
  24. 如請求項19、20或22中任一項之方法，其中該患者具有第2a型(嬰幼晚期)GM1。
  25. 如請求項19至24中任一項之方法，其中該患者已被診斷具有第1型或第2a型GM1。
  26. 如請求項19至25中任一項之方法，其中該對象為至少4個月齡。
  27. 如請求項26之方法，其中該對象為4至36個月齡。
  28. 如請求項26之方法，其中該對象為4至24個月齡之人類患者。
  29. 如請求項26之方法，其中該患者為6至36個月齡之人類患者。
  30. 如請求項26之方法，其中該患者為6至24個月齡之人類患者。
  31. 如請求項26之方法，其中該患者為12至36個月齡之人類患者。
  32. 如請求項26之方法，其中該患者為12至24個月齡之人類患者。
  33. 如請求項19至32中任一項之方法，其中該單劑為該患者之每公克估算腦質量3.3x1010 GC。
  34. 如請求項33之方法，其中該單劑為2.1x1013 至2.5x1013 GC之rAAV。
  35. 如請求項33之方法，其中該單劑為2.6x1013 至3.1x1013 GC之rAAV。
  36. 如請求項33之方法，其中該單劑為3.2x1013 至4.5x1013 GC之rAAV。
  37. 如請求項19至32中任一項之方法，其中該單劑為該患者之每公克估算腦質量1.11x1011 GC。
  38. 如請求項37之方法，其中該單劑為6.8x1013 至8.6x1013 GC之rAAV。
  39. 如請求項37之方法，其中該單劑為8.7x1013 至0.9x1014 GC之rAAV。
  40. 如請求項37之方法，其中該單劑為1.0x1014 至1.5x1014 GC之rAAV。
  41. 如請求項19至25中任一項之方法，其中該患者為4至8個月齡，且該單劑為2.1x1013 GC之rAAV。
  42. 如請求項19至25中任一項之方法，其中該患者為4至8個月齡，且該單劑為6.8x1013 GC之rAAV。
  43. 如請求項19至25中任一項之方法，其中該患者為8至12個月齡，且該單劑為2.6x1013 GC之rAAV。
  44. 如請求項19至25中任一項之方法，其中該患者為8至12個月齡，且該單劑為8.7x1013 GC之rAAV。
  45. 如請求項19至25中任一項之方法，其中該患者為至少12個月齡，且該單劑為3.2x1013 GC之rAAV。
  46. 如請求項19至25中任一項之方法，其中該患者為至少12個月齡，且該單劑為1.0x1014 GC之rAAV。
  47. 如請求項19至46中任一項之方法，其進一步包含造血幹細胞移植之步驟。
  48. 如請求項19至47中任一項之方法，其進一步包含投予類固醇至患者之步驟。
  49. 如請求項48之方法，其中該類固醇為皮質類固醇。
  50. 如請求項48或49之方法，其中每日全身性投予該類固醇至少21日。
  51. 如請求項48或49之方法，其中每日全身性投予該類固醇至少30日。
  52. 如請求項19至51中任一項之方法，其中該編碼人類β-半乳糖苷酶之序列包含記載於SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：5之核苷酸序列，或與SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：5之任一者至少95%相同的序列，其編碼SEQ ID NO：4之胺基酸24至677的成熟β-半乳糖苷酶。
  53. 如請求項19至51中任一項之方法，其中該人類β-半乳糖苷酶具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列或其功能片段。
  54. 如請求項19至51中任一項之方法，其中該載體基因體具有選自SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15的序列 。
  55. 如請求項19至51中任一項之方法，其中該載體基因體具有與SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15至少95%相同的序列。
  56. 如請求項19至51中任一項之方法，其中該載體基因體進一步包含5’反向末端重複(ITR)序列、衍生自人類泛素C(UbC)啟動子的調節元件、嵌合內含子、polyA訊號、及/或3’ITR序列。
  57. 一種為單位劑型之醫藥組成物，其包含： 在緩衝液中1x1013 GC至5x1014 之重組腺相關病毒(rAAV)載體， 其中該rAAV包含AAV衣殼及載體基因體，該載體基因體包含於引導其在標靶細胞中表現的調節序列的控制下編碼人類β-半乳糖苷酶的序列。
  58. 如請求項57之醫藥組成物，其被調配用於腦大池內(ICM)注射。
  59. 如請求項58之醫藥組成物，其中該緩衝液包含磷酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、及泊洛沙姆(poloxamer)188。
  60. 如請求項57至59中任一項之醫藥組成物，其中該緩衝液包含1 mM磷酸鈉、150 mM氯化鈉、3 mM氯化鉀、1.4 mM氯化鈣、0.8 mM氯化鎂、及0.001%泊洛沙姆188。
  61. 如請求項57至60中任一項之醫藥組成物，其為液體形式。
  62. 如請求項61之醫藥組成物，其具有3.0mL、4.0mL或5.0mL之體積。
  63. 如請求項57至62中任一項之醫藥組成物，其包含2.1x1013 至2.5x1013 GC之rAAV。
  64. 如請求項57至62中任一項之醫藥組成物，其包含2.6x1013 至3.1x1013 GC之rAAV。
  65. 如請求項57至62中任一項之醫藥組成物，其包含3.2x1013 至4.5x1013 GC之rAAV。
  66. 如請求項57至62中任一項之醫藥組成物，其包含6.8x1013 至8.6x1013 GC之rAAV。
  67. 如請求項57至62中任一項之醫藥組成物，其包含8.7x1013 至0.9x1014 GC之rAAV。
  68. 如請求項57至62中任一項之醫藥組成物，其包含1.0x1014 至1.5x1014 GC之rAAV。
  69. 如請求項57至68中任一項之醫藥組成物，其中該編碼人類β-半乳糖苷酶之序列包含記載於SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：5之核苷酸序列，或與SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：5之任一者至少95%相同的序列，其編碼SEQ ID NO：4之胺基酸24至677的成熟β-半乳糖苷酶。
  70. 如請求項中57至68中任一項之醫藥組成物，其中該人類β-半乳糖苷酶具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列或其功能片段。
  71. 如請求項57至68中任一項之醫藥組成物，其中該載體基因體具有選自SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15的序列。
  72. 如請求項57至68中任一項之醫藥組成物，其中該載體基因體具有與SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15至少95%相同的序列。
  73. 如請求項57至68中任一項之醫藥組成物，其中該載體基因體進一步包含5’反向末端重複(ITR)序列、衍生自人類泛素C(UbC)啟動子的調節元件、嵌合內含子、polyA訊號、及/或3’ITR序列。
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