JP5922095B2 - 薬理学的に誘導される導入遺伝子アブレーション系 - Google Patents

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Description

［発明の分野］
本発明は、薬理学的作用物質（ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｇｅｎｔ）、好ましくは経口製剤、例えば錠剤に反応して、永久的にもしくは一時的に、治療遺伝子産物を取り除くための内臓安全機序を備えて設計された複製欠損ウイルス組成物（１つもしくは複数）を用いる患者への治療用製品（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔ）の送達のために考案された遺伝子治療系に関する。
［発明の背景］
遺伝子治療は、疾病を処置するかもしくは治療する目的で宿主細胞への遺伝物質の導入を伴う。多数の疾病は、必須タンパク質の欠乏をもたらす「欠陥」遺伝子により引き起こされる。欠陥のある遺伝子発現を修正する１つの方法は、機能しない、すなわち「欠陥のある」、病原遺伝子を置換するためにゲノム内の非特異的な場所に正常な遺伝子（導入遺伝子）を挿入することである。遺伝子治療はまた、治療用製品が長期間にわたって発現され、反復投与の必要性をなくすように、様々な疾病を処置するために治療タンパク質もしくはＲＮＡの送達のためのプラットフォームとして用いることもできる。患者の標的細胞に導入遺伝子を送達するためにベクターと呼ばれる担体分子を使用しなければならず、最も一般的なベクターは、正常なヒト遺伝子を保有するように遺伝子操作されているウイルスである。ウイルスはそれらの遺伝子を封入しそして病因的にヒト細胞に送達する方法を生み出しており、従って、ウイルスゲノムは治療遺伝子を挿入するために操作することができる。
安定な導入遺伝子発現は、非分裂細胞へのアデノウイルスもしくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくベクターのインビボ送達後に、そしてまたレトロウイルスおよびレンチウイルスに基づくもののような、組込みおよび非組込みベクターでエクスビボで形質導入した幹細胞の移植によっても成し遂げることができる。ＡＡＶベクターは、とりわけ、ＡＡＶが非病原性であり、それが有害な免疫反応を引き起こさず、そしてＡＡＶ導入遺伝子発現が何年ももしくは動物モデルの生涯にわたって持続することが多いので遺伝子治療に用いられる（非特許文献１を参照）。ＡＡＶは、４．７ｋｂである一本鎖ＤＮＡゲノムの線状鎖をパッケージングする小型の非エンベロープヒトパルボウイルスである。ＡＡＶによる増殖感染は、ヘルパーウイルス、アデノウイルスもしくはヘルペスウイルスのいずれかの存在下でのみ起こる。ヘルパーウイルスの不在下で、ＡＡＶは高い頻度で宿主ゲノムの特定部位（１９ｑ １３−ｑｔｅｒ）に組込み、ＡＡＶを部位特異的組込みの能力があることが知られている唯一の哺乳類ＤＮＡウイルスにする。非特許文献２を参照。しかしながら、いかなるウイルス遺伝子も含有せずそして治療遺伝子のみを含有する組換えＡＡＶは、ゲノムに組込まない。代わりに、組換えウイルスゲノムは逆方向末端反復を介してその末端で融合して長期の遺伝子発現の主因であると予測される環状のエピソーム型を形成する（非特許文献１を参照）。
遺伝子治療の実質的に全ての前臨床および臨床応用は、構成的プロモーターから導入遺伝子を発現するベクターを使用しており、これはベクターゲノムが持続する限りそれが一定レベルで活性であることを意味する。しかしながら、遺伝子治療に適している多くの疾病は、導入遺伝子の発現を調節する必要があり得る。遺伝子発現を正に誘導するために興味のある遺伝子を薬剤誘導性の改変された転写因子の制御下に置くという一般的原理に基づくいくつかの系が記述されている（非特許文献３；非特許文献４）。様々な系は、２つの種類に分けることができる。第一において、テトラサイクリン、抗黄体ホルモンもしく
はエクジステロイドのような誘導物質によりアロステリックに調節されるＤＮＡ結合ドメインがトランス活性化ドメインに連結される。薬剤の添加（もしくはある場合には除去）によりＤＮＡ結合、従って転写活性化がもたらされる。第二において、アロステリック制御は、より一般的な誘導近接機序で置き換えられる。ＤＮＡ結合および活性化ドメインは、二量化の化学誘導物質もしくは「二量化剤（ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）」と呼ばれる、２価の小分子の添加により活性転写因子に再構成される別個のポリペプチドとして発現される。これらの系は導入遺伝子発現を誘導することを必要とする遺伝子治療系において有用であるが、それらは導入遺伝子発現をもはやそれが必要とされない場合にもしくは長期の薬剤投与に起因する毒性が結果として起きる場合に止めるかもしくは永久的に取り除くことができる必要性に応えていない。
Ｓｈｙａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２４（４）：５８３−５９３ Ｋｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，ＰＮＡＳ，８７：２２１１−２２１５ Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｒｎ Ｂｉｏｌ，１（２）：２１０−８ Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９８．９（５）：ｐ．４５１−６
［発明の要約］
本発明は、薬理学的作用物質、好ましくは経口製剤、例えば錠剤に反応して、永久的にもしくは一時的に、治療遺伝子産物を取り除くための内臓安全機序を備えて設計された複製欠損ウイルス組成物（１つもしくは複数）を用いる患者への治療用製品の送達用に考案された遺伝子治療系に関する。
本発明は、１つには、導入遺伝子を取り除くかもしくは導入遺伝子発現を負に調節するための、「ＰＩＴＡ」（薬理学的に誘導される導入遺伝子アブレーション（ａｂｌａｔｉｏｎ））と本明細書において呼ばれる、統合的方法の出願者等の開発に基づく。この方法において、治療用製品（ＲＮＡもしくはタンパク質）をコードする導入遺伝子を、それが患者において発現されるが薬理学的作用物質を投与することにより可逆的にもしくは不可逆的に停止させることができるように送達するために複製欠損ウイルスが用いられる。
本発明は、導入遺伝子の発現が薬理学的作用物質により正に調節される系に勝る多数の利点を提示する。そのような場合、レシピエントは、発現される導入遺伝子を必要とする期間、非常に長い可能性がありそしてそれ自体の毒性と関連し得る期間にわたって薬剤を服用しなければならない。
１つの態様において、本発明は、ウイルスゲノムが（ａ）転写を制御するプロモーターと機能的に結合した治療用製品をコードする第１の転写単位、該単位は少なくとも１つのアブレーション認識部位を含有する；および（ｂ）プロモーターと機能的に結合した少なくとも１つのアブレーション認識部位に特異的なアブレーターをコードする第２の転写単位、ここで、転写および／もしくはアブレーション活性は薬理学的作用物質、例えば二量化剤により制御されるを含有するように改変されているヒト患者における使用に適当な複製欠損ウイルス組成物を提供する。例えば、１つの適当な薬理学的作用物質はラパマイシンもしくはラパマイシンアナログであることができる。ウイルス組成物は、２つもしくはそれ以上の異なるウイルスストックを含有することができる。
１つの態様において、本発明は、ウイルスゲノムが（ａ）転写を制御するプロモーターと機能的に結合した治療用製品をコードする第１の転写単位、該第１の転写単位はアブレーション認識部位を含有する；およびプロモーターと機能的に結合したアブレーション認識部位に特異的なアブレーターをコードする第２の転写単位、ここで、転写および／もしくはアブレーション活性は薬理学的作用物質により制御されるを含んでなるヒト患者における使用に適当な複製欠損ウイルス組成物を提供する。第１の転写単位は、１つより多くのアブレーション認識部位を含有することができる。ゲノムが１つより多くのアブレーション認識部位を含んでなる場合、該１つより多くのアブレーション認識部位は第１のアブレーション認識部位および該第１のアブレーション認識部位と異なる第２のアブレーション認識部位を含んでなり、該ウイルスは第１のアブレーション認識部位に特異的な第１のアブレーターおよび第２の認識部位に特異的な第２のアブレーターをさらに含んでなる。
１つの態様において、転写、生物活性および／もしくはアブレーターのＤＮＡ結合特異性は調節可能な系により制御される。調節可能な系は、ｔｅｔ−オン／オフ系、ｔｅｔＲ−ＫＲＡＢ系、ミフェプリストン（ＲＵ４８６）調節可能な系、タモキシフェン依存的な調節可能な系、ラパマイシン調節可能な系もしくはエクジソンに基づく調節可能な系から選択することができる。
１つの態様において、アブレーターは、第１の転写単位中のアブレーション認識部位に結合しそしてＤＮＡを切除するかもしくは取り除くエンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、メガヌクレアーゼもしくはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼおよび第１の転写単位のＲＮＡ転写産物を取り除くか、もしくは第１の転写単位のＲＮＡ転写産物の翻訳を抑制する干渉ＲＮＡ、リボザイムもしくはアンチセンスよりなる群から選択される。１つの特定の態様において、アブレーターはＣｒｅであり、そしてアブレーション認識部位はｌｏｘＰであるか、もしくはアブレーターはＦＬＰであり、そしてアブレーション認識部位はＦＲＴである。
１つの態様において、アブレーターはキメラの改変されたエンドヌクレアーゼであり、ここで、ウイルス組成物は（ｉ）第１の薬理学的作用物質の結合ドメインに融合したエンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインを含んでなる第１の配列を含んでなり；そしてここで、ウイルス組成物は（ｉｉ）第１の薬理学的作用物質の結合ドメインに融合したエンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ切断ドメインをコードする第２の配列をさらに含んでなり、ここで、第１の配列（ｉ）および第２の配列（ｉｉ）は各々その発現を制御する少なくとも１つのプロモーターと機能的に結合している。キメラの改変されたエンドヌクレアーゼは、第２の転写単位中の単一の２シストロン性オープンリーディングフレーム内に含有することができ、該転写単位は（ｉ）と（ｉｉ）の間にリンカーをさらに含んでなる。場合により、配列（ｉｉ）は誘導性プロモーターを有する。別の態様において、キメラの改変されたエンドヌクレアーゼの融合相手／フラグメントは別個のオープンリーディングフレーム内に含有される。１つの態様において、第１の配列および第２の配列の各々は構成的プロモーターの制御下にあり、そしてアブレーターは第１の薬理学的作用物質により生物活性化される。
アブレーターのコーディング配列は、アブレーターコーディング配列の５’もしくは３’に位置する核局在化シグナルをさらに含んでなることができる。
１つの態様において、ＤＮＡ結合ドメインはジンクフィンガー、ヘリックス−ターン−ヘリックス、ＨＭＧ−ボックス、Ｓｔａｔタンパク質、Ｂ３、ヘリックス−ループ−ヘリックス、ウィングドヘリックス−ターン−ヘリックス、ロイシンジッパー、ウィングドヘリックス、ＰＯＵドメインおよびホメオドメインよりなる群から選択される。
さらに別の態様において、エンドヌクレアーゼはＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、イントロンエンドヌクレアーゼおよびセリンもしくはチロシンリコンビナーゼよりなる群から選択される。１つの特定の態様において、アブレーターはキメラのＦｏｋ１酵素である。
さらに別の態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物において、ウイルスゲノムは、アブレーターの誘導性プロモーターを調節する転写因子の二量化可能なドメインを各々コードする、第３および第４の転写単位をさらに含んでなり、ここで：（ｃ）第３の転写単位は、第１のプロモーターと機能的に結合した薬理学的作用物質の結合ドメインに融合した転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードし；そして（ｄ）第４の転写単位は、第２のプロモーターと機能的に結合した薬理学的作用物質の結合ドメインに融合した転写因子の活性化ドメインをコードする。（ｃ）の第１のプロモーターおよび（ｄ）の第２のプロモーターは、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターから独立して選択される。別の態様において、第１および第２のプロモーターは両方とも構成的プロモーターであり、そして薬理学的作用物質は転写因子のドメインを二量化する二量化剤である。なおさらなる態様において、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターの一方は誘導性プロモーターである。第３および第４の転写単位は、ＩＲＥＳもしくはフューリン−２Ａを含有する２シストロン性単位であることができる。
１つの態様において、薬理学的作用物質はラパマイシンもしくはラパログである。
１つの態様において、ウイルスはＡＡＶである。そのようなＡＡＶは、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびｒｈ１０の中から選択することができる。例えばアデノウイルス、単純ヘルペスウイルスなどを包含する、さらに他のウイルスを本発明のＤＮＡ構築物および複製欠損ウイルスを作製するために用いることができる。
１つの態様において、治療用製品は、ＨＩＶ感染性を中和する抗体もしくは抗体フラグメント、可溶性血管内皮成長因子受容体−ｌ（ｓＦｌｔ−ｌ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ヘムオキシゲナーゼ−ｌ（ＨＯ−１）または神経成長因子（ＮＧＦ）である。
複製欠損ウイルス組成物の１つの態様において、第１の転写単位および第２の転写単位は組成物中の異なるウイルスストック上にある。場合により、第１の転写単位および第２の転写単位は第１のウイルスストック中にあり、そして第２のウイルスストックは第２のアブレーター（１つもしくは複数）を含んでなる。
１つの態様において、組換えＤＮＡ構築物はウイルスゲノムのパッケージングシグナルが隣接する第１および第２の転写単位を含んでなり、ここで：（ａ）第１の転写単位は、転写を制御するプロモーターと機能的に結合した治療用製品をコードし、該第１の転写因子は少なくとも１つのアブレーション認識部位を含有し；そして（ｂ）第２の転写単位は、薬理学的作用物質に反応して転写を誘導するプロモーターと機能的に結合した少なくとも１つのアブレーション認識部位に特異的なアブレーターをコードする。転写単位に隣接するパッケージングシグナルは、ＡＡＶ ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）およびＡＡＶ ３’ＩＴＲであることができる。場合により、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ２、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９もしくはｒｈ１０ ＩＴＲであることができる。１つの態様において、第１の転写単位にはＡＡＶ ＩＴＲが隣接し、そして第２、第３および第４の転写単位にはＡＡＶ ＩＴＲが隣接する。場合により、転写単位は２つもしくはそれ以上のＤＮＡ構築物中に含有される。
１つの態様において、治療用製品はＨＩＶ感染性を中和する抗体もしくは抗体フラグメ
ント、可溶性血管内皮成長因子受容体−ｌ（ｓＦｌｔ−ｌ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ヘムオキシゲナーゼ−ｌ（ＨＯ−１）または神経成長因子（ＮＧＦ）である。
１つの態様において、治療用製品の転写を制御するプロモーターは構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、細胞特異的プロモーター、誘導性プロモーターもしくは生理学的刺激に反応するプロモーターである。
治療用製品がＶＥＧＦアンタゴニストである、本明細書に記載の通りの複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる、ヒト患者における加齢性黄斑変性症を処置するための方法が記述される。
治療用製品が第ＶＩＩＩ因子である、本明細書に記載の通りの複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる、ヒト患者における血友病Ａを処置するための方法が記述される。
治療用製品が第ＩＸ因子である、本明細書に記載の通りの複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる、ヒト患者における血友病Ｂを処置するための方法が記述される。
治療用製品がインシュリン様成長因子もしくは肝細胞成長因子である、本明細書に記載の通りの複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる、ヒト患者における鬱血性心不全を処置するための方法が記述される。
治療用製品が神経成長因子である、本明細書に記載の通りの複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる、ヒト患者における中枢神経系疾患を処置するための方法が記述される。
治療用製品がＨＩＶに対する中和抗体である、本明細書に記載の通りの複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる、ヒト患者におけるＨＩＶ感染を処置するための方法が記述される。
導入遺伝子産物の送達を制御することにおいて使用する複製欠損ウイルスが本明細書において提供される。該産物は、ＶＥＧＦアンタゴニスト、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、インシュリン様成長因子、肝細胞成長因子、神経成長因子およびＨＩＶに対する中和抗体よりなる群から選択することができる。
本明細書において提供した通りの複製欠損ウイルスもしくはＤＮＡ構築物を含んでなる遺伝子操作された細胞が提供される。遺伝子操作された細胞は、植物、細菌もしくは非ヒト哺乳類細胞から選択することができる。
（ａ）患者から得られる組織サンプルにおける治療用製品の発現を検出すること、および（ｂ）該患者における治療用製品の存在と関連する副作用を検出することを含んでなり、ここで、該患者における治療用製品の存在と関連する副作用の検出は、アブレーターの発現を誘導する薬理学的作用物質を投与する必要性を示す、治療用製品およびアブレーターを含有する本明細書に提供した通りの複製欠損ウイルスを受けた患者に治療用製品を取り除くために薬理学的作用物質をいつ投与するかを決定する方法が提供される。
該患者から得られる組織サンプルにおける治療用製品の存在と関連する毒性の生化学マーカーのレベルを検出することを含んでなり、ここで、毒性を表す該マーカーのレベルは
、アブレーターの発現を誘導する薬理学的作用物質を投与する必要性を示す、治療用製品およびアブレーターをコードする本明細書に記載の通りの複製欠損ウイルスを受けた患者に治療用製品を取り除くために薬理学的作用物質をいつ投与するかを決定する方法が提供される。
これらの方法は、アブレーターの発現を誘導する薬理学的作用物質での処置の後に患者からの組織サンプルにおける治療遺伝子産物をコードするＤＮＡ、そのＲＮＡ転写産物もしくはそのコードタンパク質の存在を決定することをさらに含んでなることができ、ここで、治療遺伝子産物をコードするＤＮＡ、そのＲＮＡ転写産物もしくはそのコードタンパク質の存在は、アブレーターの発現を誘導する薬理学的作用物質での反復処置の必要性を示す。
本発明はさらに、導入遺伝子産物の送達を制御することにおいて使用する本明細書に記載の通りの複製欠損ウイルスを提供する。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の通りの複製欠損ウイルスもしくはＤＮＡ構築物を含んでなる、遺伝子操作された細胞を提供する。そのような細胞は、植物、酵母、真菌、昆虫、細菌、非ヒト哺乳類細胞もしくはヒト細胞であることができる。
なおさらなる態様において、本発明は：（ａ）患者から得られる組織サンプルにおける治療用製品の発現を検出すること、および（ｂ）該患者における治療用製品の存在と関連する副作用を検出することを含んでなり、ここで、該患者における治療用製品の存在と関連する副作用の検出は、アブレーターの発現を誘導する薬理学的作用物質を投与する必要性を示す、治療用製品およびアブレーターをコードする本明細書に記載の通りの複製欠損ウイルスを受けた患者に治療用製品を取り除くために薬理学的作用物質をいつ投与するかを決定する方法を提供する。なおさらなる態様において、本発明は、該患者から得られる組織サンプルにおける治療用製品の存在と関連する毒性の生化学マーカーのレベルを検出することを含んでなり、ここで、毒性を表す該マーカーのレベルは、アブレーターの発現を誘導する薬理学的作用物質を投与する必要性を示す、治療用製品およびアブレーターをコードする本明細書に記載の通りの複製欠損ウイルスを受けた患者に治療用製品を取り除くために薬理学的作用物質をいつ投与するかを決定する方法を提供する。
本発明の他の態様および利点は、以下の本発明の詳細な記述から容易に明らかである。
本明細書において用いる場合、以下の用語は示される意味を有する：
「単位」は転写単位をさす。
「導入遺伝子単位」は、（１）導入遺伝子をコードするＤＮＡ配列；（２）導入遺伝子内に含有されるかもしくはそれに隣接するアブレーション認識部位（ＡＲＳ）；および（３）導入遺伝子の発現を調節するプロモーター配列を含んでなるＤＮＡをさす。
「アブレーション認識部位」もしくは「ＡＲＳ」は、（１）導入遺伝子単位から導入遺伝子を取り除くかもしくは切除するアブレーターにより認識されることができるか；または（ｂ）アブレーション認識ＲＮＡ配列（ＡＲＲＳ）をコードするＤＮＡ配列をさす。
「アブレーション認識ＲＮＡ配列」もしくは「ＡＲＲＳ」は、導入遺伝子の転写産物もしくはそのｍＲＮＡの翻訳を取り除くアブレーターにより認識されるＲＮＡ配列をさす。
「アブレーター」は、（ａ）導入遺伝子単位のＡＲＳを特異的に認識し／それに結合しそして導入遺伝子を切断するかもしくは切除する；または（ｂ）転写された導入遺伝子単
位のＡＲＲＳを特異的に認識し／それに結合しそしてｍＲＮＡ転写産物の翻訳を切断するかもしくは妨げる任意の遺伝子産物、例えば翻訳もしくは転写産物をさす。
「アブレーション単位」は、（１）アブレーターをコードするＤＮＡ配列；および（ｂ）該アブレーターの発現を制御するプロモーター配列を含んでなるＤＮＡをさす。
「二量化可能な転写因子（ＴＦ）ドメイン単位」は、（１）プロモーターにより制御される二量化剤結合ドメインに融合したＴＦのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質）をコードするＤＮＡ配列；および（２）プロモーターにより制御される二量化剤結合ドメインに融合したＴＦの活性化ドメイン（活性化ドメイン融合タンパク質）をコードするＤＮＡ配列をさす。１つの態様において、二量化可能なドメインの各単位は構成的プロモーターにより制御され、そして該単位はアブレーターのプロモーターの制御に利用される。あるいはまた、プロモーターの１つもしくはそれ以上は誘導性プロモーターであることができる。
「二量化可能な融合タンパク質単位」は、（１）二量化剤結合ドメインに融合したタンパク質もしくは酵素（例えばアブレーター）の単位、サブユニットもしくはフラグメントをコードする第１のＤＮＡ配列および（２）発現されそして必要に応じて活性化されると、結合して融合タンパク質を形成する、タンパク質もしくは酵素の単位、サブユニットもしくはフラグメントをコードする第２のＤＮＡ配列をさす。この「二量化可能な融合タンパク質単位」は、アブレーターのプロモーターを活性化するため、ＤＮＡ特異性を与えるため、結合ドメインと触媒ドメインを一緒にすることによりキメラのアブレーターを活性化するためもしくは所望の導入遺伝子を生成せしめるためを包含する様々な目的のために利用することができる。これらの単位（１）および（２）は、単一のプロモーターの制御下で適当なリンカー（例えば、ＩＲＥＳもしくは２Ａ自己切断タンパク質）により分離された単一のオープンリーディングフレーム中であることができ、または独立したプロモーターの制御下で別個のオープンリーディングフレーム中であることができる。以下の詳細な記述から、この融合タンパク質単位を使用する用途により（例えばアブレーターの発現のため）、構成的もしくは誘導性プロモーターの様々な組み合わせをこの単位の２つの成分において利用できることは明らかである。１つの態様において、二量化可能な融合タンパク質単位は、例えばジンクフィンガーモチーフ、ホメオドメインモチーフ、ＨＭＧ−ボックスドメイン、ＳＴＡＴタンパク質、Ｂ３、ヘリックス−ループ−ヘリックス、ウィングドヘリックス−ターン−ヘリックス、ロイシンジッパー、ヘリックス−ターン−ヘリックス、ウィングドヘリックス、ＰＯＵドメイン、リプレッサーのＤＮＡ結合ドメイン、癌遺伝子のＤＮＡ結合ドメインおよび＞６塩基対を認識する天然に存在する配列特異的ＤＮＡ結合ドメインが包含されるＤＮＡ結合ドメインを含有する。
「二量化剤」は、ＴＦドメイン融合タンパク質もしくは二量化可能な融合タンパク質のヘテロ二量化可能な結合ドメインに結合しそして融合タンパク質の二量化もしくはオリゴマー化を誘導することができる化合物もしくは他の部分をさす。典型的に、二量化剤は製薬学的組成物として患者に送達される。
「副作用」は、本発明の複製欠損ウイルス組成物の投与によって患者に送達された導入遺伝子産物の所望の治療効果に加えて患者において起こる望ましくない二次的影響をさす。
「複製欠損ウイルス」もしくは「ウイルスベクター」は、複製欠損ウイルス粒子、すなわち、標的細胞に感染することができるが子孫ウイルス粒子を生成することができない粒子にパッケージングされる興味のある遺伝子を含有する合成もしくは人工ゲノムをさす。ウイルスベクターの人工ゲノムは、複製するために必要とされる酵素をコードする遺伝子
を含まない（ゲノムは、人工ゲノムの増幅およびパッケージングに必要とされるシグナルが隣接する興味のある導入遺伝子のみを含有する、「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように改変することができる）。従って、子孫ウイルス粒子による複製および感染は、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下である場合を除いて起こることができないので、それは遺伝子治療における使用にとって安全であると考えられる。
「ウイルスストック」もしくは「複製欠損ウイルスのストック」は、同じ人工／合成ゲノム（言い換えれば、均質もしくはクローン集団）をパッケージングするウイルスベクターをさす。
結合ドメインに融合したエンドヌクレアーゼアブレーターの触媒ドメインをコードする配列および結合ドメインに融合したエンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインをコードする配列が共発現される場合に「キメラの改変されたアブレーター」もしくは「キメラ酵素」が提供される。キメラの改変された酵素は二量体であり、ＤＮＡ結合ドメインは例えばジンクフィンガーおよび他のホメオドメインモチーフ、ＨＭＧ−ボックスドメイン、ＳＴＡＴタンパク質、Ｂ３、ヘリックス−ループ−ヘリックス、ウィングドヘリックス−ターン−ヘリックス、ロイシンジッパー、ヘリックス−ターン−ヘリックス、ウィングドヘリックス、ＰＯＵドメイン、リプレッサーのＤＮＡ結合ドメイン、癌遺伝子のＤＮＡ結合ドメインおよび＞６塩基対を認識する天然に存在する配列特異的なＤＮＡ結合タンパク質の中から選択することができる。［１９９５年７月２５日に交付済みのＵＳ ５，４３６，１５０］。ヘテロ二量体が形成される場合、結合ドメインは、所望の酵素生物活性、ＤＮＡ結合特異性および／もしくはアブレーターの転写を提供するために二量化を誘導する薬理学的作用物質に特異的である。典型的に、二重のドメイン、すなわち、容易に分離できる触媒ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを有する酵素が選択される。１つの態様において、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼが選択される。１つの態様において、ＡＴＰ加水分解に依存しない、２つの機能ドメインを有するエンドヌクレアーゼに基づいてキメラエンドヌクレアーゼが設計される。有用なヌクレアーゼには、ＦｏｋＩのようなＩＩ型Ｓエンドヌクレアーゼ、もしくはＮａｅＩのようなエンドヌクレアーゼが包含される。別の適当なエンドヌクレアーゼは、例えばＩ−ＴｅｖＩのようなイントロンエンドヌクレアーゼの中から選択することができる。さらに他の適当なヌクレアーゼには、例えばインテグラーゼ（組込みを触媒する）、セリンリコンビナーゼ（組換えを触媒する）、チロシンリコンビナーゼ、インバーターゼ（例えばＧｉｎ）（反転を触媒する）、リゾルバーゼ（例えばＴｎ３）、および転位、分解（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）、挿入、欠失、分解もしくは交換を触媒するヌクレアーゼが包含される。しかしながら、他の適当なヌクレアーゼを選択することができる。
ｒＡＡＶ７生産性および培養培地への放出についてのトランスフェクション剤の比較。図１Ａ〜１Ｂ：６ウェルプレートにＨＥＫ２９３細胞を蒔き、そしてトランスフェクション試薬としてリン酸カルシウム（図１Ａ）もしくはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（図１Ｂ）を用いて３つのプラスミド（それぞれ、ベクターゲノム、ＡＡＶ２ ｒｅｐ／ＡＡＶ７ ｃａｐ遺伝子、およびアデノウイルスヘルパー機能を保有する）でトランスフェクションした。トランスフェクション後７２時間で細胞溶解物および産生培養培地に存在するＤＮアーゼ耐性ベクターゲノムコピー（ＧＣ）をｑＰＣＲにより定量した。図１Ｃおよび１Ｄ：ＨＥＫ２９３細胞を含有する１０層コーニングセルスタックにリン酸カルシウム（図１Ｃ）もしくはＰＥＩ（図１Ｄ）法の両方により三重トランスフェクションし、そして１２０時間後に培養上清および細胞中のベクターＧＣを決定した。 ５００ｍＭ塩の存在下もしくは不在下でのＰＥＩトランスフェクション後の異なる血清型の生産性および放出。１５ｃｍプレートのＨＥＫ２９３細胞にＰＥＩおよび示される５つの異なるＡＡＶキャプシド遺伝子の１つを含有するＤＮＡミックスを用いて三重トランスフェクションした。トランスフェクション後５日で、培養培地および細胞を０．５Ｍ塩にさらすかもしくはさらさずに採取し、そしてＤＮアーゼ耐性ベクターゲノムコピー（ＧＣ）を定量した。細胞当たり産生されるＧＣは、各棒の上に示される上清中に見出されるベクターのパーセンテージと共に表される。 濃縮した産生培養上清からのｒＡＡＶ７ベクターの大規模ヨージキサノール勾配に基づく精製。図３Ａ：セルスタック培養培地からのｒＡＡＶ７ベクターを濃縮し、ヨージキサノール勾配上で分離し、そしてチューブの底から画分を採取した（画分１）。ヨージキサノール密度は３４０ｎｍでモニターし、そして各画分のゲノムコピー数はｑＰＣＲにより得られた。図３Ｂ：各画分の１ｘ１０１０ＧＣをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、そしてシプロルビー染色を用いてタンパク質を可視化した。Ｖ＝検証ロット；Ｍ＝分子量マーカー。ＡＡＶキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３が示される。純粋なＡＡＶベクターピークは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の白色のボックスにより示される。 大規模ｒＡＡＶ製造ロットの純度。１ｘ１０１０ＧＣの大規模ＡＡＶ８およびＡＡＶ９ベクター調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにのせ、そしてシプロルビー染色によりタンパク質を可視化した。全てのタンパク質バンドを定量し、そしてキャプシド（総タンパク質に対して示されるＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質）のパーセント純度を計算し、そしてゲルの下に示した。大規模ロットの純度を小規模ＣｓＣｌ勾配精製したＡＡＶ９ベクターと比較した。 大規模ｒＡＡＶ８およびｒＡＡＶ９製造ロットにおける空：完全粒子比率の決定。大規模ｒＡＡＶ８およびｒＡＡＶ９ベクター調製物を酢酸ウラニルでネガティブ染色し、そして透過型電子顕微鏡で調べた。図５Ａはパイロットラン１である。図５Ｂはパイロットラン８である。図５Ｃはパイロットラン９である。図５Ｄはパイロットラン１０である。図５Ｅはパイロットラン１１である。図５Ｆはパイロットラン１２である。空粒子は電子密度の高い中心に基づいて識別され、そして矢印で示される。空：完全粒子の比率および空粒子のパーセンテージは、画像の下に示される。図５Ｇは、比較のために分析に含まれる小規模ＡＡＶ８ベクター調製物である。 インビトロにおけるｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ９およびｒＡＡＶ６ベクターの相対的形質導入。図６Ａ〜Ｆ：アデノウイルスの存在下で１ｘ１０４ＧＣ／細胞のＭＯＩで大規模および小規模工程の両方により製造したｒＡＡＶ−ｅＧＦＰベクターロットをＨＥＫ２９３細胞に三重反復で感染させた。ＰＩ４８時間でＧＦＰ導入遺伝子発現を撮影した。図６Ｇ：ｅＧＦＰ蛍光強度は、バックグラウンドレベルに対する明るさレベルおよびピクセルの積を決定することによりデジタル画像から直接定量した。 ｒＡＡＶ８およびｒＡＡＶ９大規模製造ロットの肝臓形質導入。図７Ａ〜７Ｆ：Ｃ５７ＢＬ／６マウスに小規模および大規模工程により製造した１ｘ１０１１ＧＣのｒＡＡＶ８−ｅＧＦＰおよびｒＡＡＶ９−ｅＧＦＰベクターをｉ．ｖ．注射した。図７ＡはＡＡＶ９のパイロットラン１であり、図７ＢはＡＡＶ９のパイロットラン９であり、そして図７ＣはＡＡＶ９のＣｓＣｌ（小規模）である。図７ＤはＡＡＶ８のパイロットラン１０である。図７ＥはＡＡＶ８のパイロットラン１２であり、そして図７ＦはＡＡＶ８のＣｓＣｌ（小規模）である。注射後９日でｅＧＦＰ蛍光を肝臓切片において比較した。図７Ｇ：ｅＧＦＰ蛍光強度は、バックグラウンドレベルに対する明るさレベルおよびピクセルの積を決定することによりデジタル画像から直接定量した。各棒は、２匹の動物からの肝臓サンプルの平均強度値を表す。 二量化可能な転写因子ドメイン単位およびアブレーション単位を含有するＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物。図８Ａは、二量化可能な転写因子ドメイン単位およびアブレーション単位を含んでなる、以下のＤＮＡ構築物の地図である：ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ＴＦ．ＦＲＢ−ＩＲＥＳ−１ｘＦＫＢＰ．Ｃｒｅ。図８Ｂは、プラスミドバックボーンに挿入された転写単位の絵である。様々なベクタードメインの記述は、本明細書における８．１節に見出すことができる。 二量化可能な転写因子ドメイン単位およびアブレーション単位を含有するＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物。図９Ａは、二量化可能な転写因子ドメイン単位およびアブレーション単位を含んでなる、以下のＤＮＡ構築物の地図である：ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ＴＦ．ＦＲＢ−Ｔ２Ａ−２ｘＦＫＢＰ．Ｃｒｅ。図９Ｂは、プラスミドバックボーンに挿入された転写単位の絵である。様々なベクタードメインの記述は、本明細書における８．１節に見出すことができる。 二量化可能な転写因子ドメイン単位およびアブレーション単位を含有するＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物。図１０Ａは、二量化可能な転写因子ドメイン単位およびアブレーション単位を含んでなる、以下のＤＮＡ構築物の地図である：ｐＡＡＶ．ＣＭＶ１７３．ＴＦ．ＦＲＢ−Ｔ２Ａ−３ｘＦＫＢＰ．Ｃｒｅ。図１０Ｂは、プラスミドバックボーンに挿入された転写単位の絵である。様々なベクタードメインの記述は、本明細書における８．１節に見出すことができる。 二量化可能な転写因子ドメイン単位およびアブレーション単位を含有するＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物。図１１Ａは、二量化可能な転写因子ドメイン単位およびアブレーション単位を含んでなる、以下のＤＮＡ構築物の地図である：ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ＴＦ．ＦＲＢ−Ｔ２Ａ−２ｘＦＫＢＰ．ＩＳｃｅ−Ｉ。図１１Ｂは、プラスミドバックボーンに挿入された転写単位の絵である。様々なベクタードメインの記述は、本明細書における８．１節に見出すことができる。 導入遺伝子単位を含有するＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物。図１２Ａは、導入遺伝子単位を含んでなる、以下のＤＮＡ構築物の地図である：ｐＥＮＮ．ＣＭＶ．ＰＬｌｏｘＰ．Ｌｕｃ．ＳＶ４０。図１２Ｂは、プラスミドバックボーンに挿入された転写単位の絵である。様々なベクタードメインの記述は、本明細書における８．２節に見出すことができる。 導入遺伝子単位を含有するＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物。図１３Ａは、導入遺伝子単位を含有する、以下のＤＮＡ構築物の地図である：ｐＥＮＮ．ＣＭＶ．ＰＩＳｃｅＩ．ＵＣ．ＳＶ４０。図１３Ｂは、プラスミドバックボーンに挿入された転写単位の絵である。様々なベクタードメインの記述は、本明細書における８．２節に見出すことができる。 二量化可能な転写因子ドメイン単位および導入遺伝子単位を含有するＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物。図１４は、導入遺伝子単位および二量化可能な転写因子ドメイン単位を含有するベクターの地図である。様々なベクタードメインの記述は、本明細書における８．１および８．２節に見出すことができる。 ラパマイシン処理後のルシフェラーゼのインビトロ誘導。図１５Ａは、ラパマイシンで処理されるかもしくはされないいずれかの４８時間後の示されるＤＮＡ構築物（ＤＮＡ構築物１〜６）でトランスフェクションした細胞における相対的ルシフェラーゼ活性を示す棒グラフである。図１５Ｂは、ラパマイシンで処理されるかもしくはされないいずれかの７２時間後の示されるＤＮＡ構築物（ＤＮＡ構築物１〜６）でトランスフェクションした細胞における相対的ルシフェラーゼ活性を示す棒グラフである。 二量化剤誘導系のインビボモデルにおいて、４グループのマウスは以下のＤＮＡ構築物を含有するＡＡＶベクターのＩＶ注射を受けた。図１６Ａは、ＡＡＶベクターによってグループ１マウスに送達された、ユビキタスな構成的ＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰ−ルシフェラーゼをコードするＤＮＡ構築物の略図である。図１６Ｂは、ＡＡＶベクターによってグループ２マウスに送達された、（１）ＣＭＶプロモーターにより導かれる二量化可能な転写因子ドメイン単位（ｐ６５活性化ドメインと融合したＦＲＢおよび３コピーのＦＫＢＰと融合したＤＮＡ結合ドメインＺＦＨＤ）；および（２）二量化したＴＦにより誘導されるプロモーターにより導かれるＧＦＰ−ルシフェラーゼを発現するＡＡＶベクターをコードするＤＮＡ構築物の略図である。図１６Ｃは、ＡＡＶベクターによってグループ３マウスに送達された、肝臓構成的プロモーターＴＢＧの制御下でＧＦＰ−ルシフェラーゼをコードするＤＮＡ構築物の略図である。図１６Ｄは、ＡＡＶベクターによってグループ４マウスに送達された、（１）ＴＢＧプロモーターにより導かれる二量化可能な転写因子ドメイン単位を発現するＡＡＶベクター；および（２）二量化したＴＦにより誘導されるプロモーターにより導かれるＧＦＰ−ルシフェラーゼを発現するＡＡＶベクターをコードするＤＮＡ構築物の略図である。 ルシフェラーゼの基質、ルシフェリンの注射後３０分での様々なＤＮＡ構築物を含有する３ｘ１０１１粒子のＡＡＶウイルスを受けた４グループのマウスの画像。図１７Ａは、ラパマイシン投与の前（「Ｐｒｅ」）および後（「Ｐｏｓｔ」）のグループ１マウスの様々な組織における、主に肺、肝臓および筋肉におけるルシフェラーゼ発現を示す。図１７Ｂは、ラパマイシン投与の前（「Ｐｒｅ」）および後（「Ｐｏｓｔ」）のグループ２マウスの主に肝臓および筋肉におけるルシフェラーゼ発現を示す。図１７Ｃは、ラパマイシン投与の後（「Ｐｏｓｔ」）の主に肝臓および筋肉におけるルシフェラーゼ発現を示し、そしてグループ３マウスにおけるラパマイシン投与の前（「Ｐｒｅ」）にルシフェラーゼ発現がないことを示す。図１７Ｄは、ルシフェラーゼ発現がラパマイシン投与の後（「Ｐｏｓｔ」）に肝臓に限定されることを示し、そしてラパマイシン投与の前（「Ｐｒｅ」）にルシフェラーゼ発現がないことを示す。 ルシフェラーゼの基質、ルシフェリンの注射後３０分での様々なＤＮＡ構築物を含有する１ｘ１０１１粒子のＡＡＶウイルスを受けた４グループのマウスの画像。図１８Ａは、ラパマイシン投与の前（「Ｐｒｅ」）および後（「Ｐｏｓｔ」）のグループ１マウスの様々な組織における、主に肺、肝臓および筋肉におけるルシフェラーゼ発現を示す。図１８Ｂは、ラパマイシン投与の前（「Ｐｒｅ」）および後（「Ｐｏｓｔ」）のグループ２マウスの主に肝臓および筋肉におけるルシフェラーゼ発現を示す。図１８Ｃは、ラパマイシン投与の後（「Ｐｏｓｔ」）の主に肝臓および筋肉におけるルシフェラーゼ発現を示し、そしてグループ３マウスにおいてラパマイシン投与の前（「Ｐｒｅ」）にルシフェラーゼ発現がないことを示す。図１８Ｄは、ルシフェラーゼ発現がラパマイシン投与の後（「Ｐｏｓｔ」）に肝臓に限定されることを示し、そしてラパマイシン投与の前（「Ｐｒｅ」）にルシフェラーゼ発現がないことを示す。 ＡＭＤを処置するためのＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物。図１９Ａは、可溶性ＶＥＧＦ受容体、ｓＦｌｔ−１をコードする導入遺伝子単位を含んでなるＤＮＡ構築物を示す。図１９Ｂは、ＩＲＥＳにより調節されるアバスチンＩｇＧ重鎖（アバスチンＨ）および軽鎖（アバスチンＬ）を含んでなる２シストロン性ＤＮＡ構築物を示す。図１９Ｃは、Ｔ２Ａ配列により分離されたアバスチンＩｇＧ重鎖（アバスチンＨ）および軽鎖（アバスチンＬ）を含んでなる２シストロン性ＤＮＡ構築物を示す。 肝臓代謝性疾患を処置するためのＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物。図２０Ａは、第ＩＸ因子を含んでなる導入遺伝子単位を含有する、血友病Ａおよび／もしくはＢを処置するためのＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物を示す。図２０Ｂは、ＨＣＶのＩＲＥＳを標的とするｓｈＲＮＡの送達のためのＤＮＡ構築物を示す。 心臓疾患を処置するためのＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物。図２１Ａは、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ１）を含んでなる導入遺伝子単位を含有する、鬱血性心不全を処置するためのＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物を示す。図２１Ｂは、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）を含んでなる導入遺伝子単位を含有する、鬱血性心不全を処置するためのＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物を示す。 ＣＮＳ疾患のためのＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物。図２２は、神経成長因子（ＮＧＦ）を含んでなる導入遺伝子単位を含有する、アルツハイマー病を処置するためのＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物を示す。 ＨＩＶ処置のためのＰＩＴＡ系。図２３は、ＨＩＶ抗体の重鎖および軽鎖を含んでなる導入遺伝子単位を含有するＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物ならびにアブレーション単位および二量化可能なＴＦドメイン単位を含有するＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物を示す。図２３はまた、導入遺伝子単位を含有するＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物から導入遺伝子（ＨＩＶ抗体の重鎖および軽鎖）を取り除くために、ラパマイシンアナログ（ラパログ）がアブレーター、ｃｒｅの発現を誘導できることも示す。 ＰＩＴＡ系の１つの態様の例示。図２４は、構成的プロモーターと機能的に結合している治療抗体をコードする導入遺伝子単位、転写因子誘導性プロモーターと機能的に結合しているエンドヌクレアーゼをコードするアブレーション単位、および各転写因子ドメイン融合配列が構成的プロモーターと機能的に結合している二量化可能なＴＦドメイン単位を示す。ラパマイシンもしくはラパログの投与の前に、治療抗体のそして２つの転写因子ドメイン融合タンパク質の基準発現がある。ラパマイシン投与の際に、二量化した転写因子はエンドヌクレアーゼの発現を誘導し、それは導入遺伝子単位中のエンドヌクレアーゼ認識ドメインを切断し、それにより導入遺伝子発現を取り除く。 ２５Ａ〜２５Ｂは、ＦｏｋＩのアブレーション部位を含む導入遺伝子を含有するＤＮＡプラスミドをＦｏｋＩ酵素をコードするプラスミドと標的細胞に共トランスフェクションした場合に野生型ＦｏｋＩが導入遺伝子の発現を効果的に取り除いたことを例示する棒グラフである。図２５Ａ、棒１は５０ｎｇのｐＣＭＶ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを表し、棒２は５０ｎｇのｐＣＭＶ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ＋２００ｎｇのｐＣＭＶ．ＦｏｋＩを表し、棒３は５０ｎｇのｐＣＭＶ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ＋トランスフェクションしたＦｏｋＩタンパク質を表し、棒４はトランスフェクションしたＦｏｋＩタンパク質のみを表し；棒５はトランスフェクションしていないコントロールを表す。図２５Ｂ、棒１は５０ｎｇのｐＣＭＶ．Ｌｕｃのみを表し、後の棒はｐＣＭＶ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅと共トランスフェクションした増加する濃度のＺＦＨＤ−ＦｏｋＩ発現プラスミド（６．２５、１２．５、２５、５０および１００ｎｇ）を表す。本研究は、実施例１１Ａに記述される。 図２６Ａ〜Ｂは、ジンクフィンガーホメオドメインによりＤＮＡ上の非コグネイト認識部位に繋留されるキメラの改変された酵素が導入遺伝子の発現を効果的に取り除くことを例示する棒グラフである。図２６Ａは、ｐＣＭＶ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅと共トランスフェクションした非繋留ＦｏｋＩをコードする発現プラスミドの増加する濃度（６．２５ｎｇ、１２．５ｎｇ、２５ｎｇ、５０ｎｇおよび１００ｎｇ）を比較する。第１の棒は、５０ｎｇのｐＣＭＶ．Ｌｕｃのみのポジティブコントロールを与える。図２６Ｂは、ｐＣＭＶ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅと共トランスフェクションしたジンクフィンガーホメオドメインとの融合によってＤＮＡに繋留されるＦｏｋＩをコードする発現プラスミドの増加する濃度（６．２５ｎｇ、１２．５ｎｇ、２５ｎｇ、５０ｎｇおよび１００ｎｇ）を比較する。第１の棒は、５０ｎｇのｐＣＭＶ．Ｌｕｃのみのコントロールを与える。本研究は、実施例１１Ｂに記述される。 図２７Ａ〜Ｂは、キメラＦｏｋＩのＤＮＡ結合特異性を様々な種類の異種ＤＮＡ結合ドメインとの融合により再現性良く改変できることおよび標的導入遺伝子のアブレーションを異種核局在化シグナル（ＮＬＳ）の付加によりさらに改善できることを例示する棒グラフである。図２７Ａは、ＨＴＨ融合によってＤＮＡに繋留されるＦｏｋＩをコードする発現プラスミドの増加する濃度（６．２５、１２．５、２５、５０および１００ｎｇ）とｐＣＭＶ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの共トランスフェクションの結果を例示する。第１の棒は、５０ｎｇのｐＣＭＶ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅのみを示すコントロールである。図２７Ｂは、そのＮ末端にＮＬＳをさらに有する、ＨＴＨ−ＦｏｋＩ融合をコードする発現プラスミドの増加する濃度（６．２５、１２．５、２５、５０および１００ｎｇ）とｐＣＭＶ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの共トランスフェクションの結果を例示する。第１の棒は、５０ｎｇのｐＣＭＶ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅのみを示すコントロールである。本研究は、実施例１１Ｃに記述される。
［発明の詳細な記述］
ＰＩＴＡ系において、１つもしくはそれ以上の複製欠損ウイルスが複製欠損ウイルス組成物において用いられ、ここで、ウイルスゲノム（１つもしくは複数）は：（ａ）転写を制御するプロモーターと機能的に結合した治療用製品をコードする第１の転写単位、該単位は少なくとも１つのアブレーション認識部位を含有する；および（ｂ）薬理学的作用物質に反応して転写を誘導するプロモーターと機能的に結合したアブレーション認識部位に特異的なアブレーター（もしくは融合タンパク質単位の一部としてそのフラグメント）をコードする第２の転写単位を含有するように改変されている。選択した結合ドメインのドメインを特異的に二量化する任意の薬理学的作用物質を用いることができる。１つの態様において、ラパマイシンおよび「ラパログ」と呼ばれるそのアナログを用いることができる。
第１の転写単位を含有するウイルスゲノムは、２つもしくはそれ以上の同じアブレーション認識部位または２つもしくはそれ以上の異なるアブレーション認識部位（すなわち、それらは他のアブレーション認識部位（１つもしくは複数）を認識するものと異なるアブレーターに特異的な部位である）を含有することができる。同じであろうと異なろうと、そのような２つもしくはそれ以上のアブレーション認識部位は相互にタンデムに位置することができ、またはもう一方に連続していない場所に位置することができる。さらに、アブレーション認識部位（１つもしくは複数）は、導入遺伝子のコーディング配列に対して任意の位置に、すなわち、導入遺伝子コーディング配列内、コーディング配列の５’（すぐ５’または１つもしくはそれ以上の塩基により分離されるいずれか、例えば、プロモーターの上流もしくは下流）もしくはコーディング配列の３’（例えばすぐ３’または１つもしくはそれ以上の塩基により分離されるいずれか、例えば、ポリＡ配列の上流）に位置することができる。
アブレーターは、（ａ）導入遺伝子単位のアブレーション認識部位（１つもしくは複数）（ＡＲＳ）を特異的に認識し／それに結合し、そして導入遺伝子を切断するかもしくは切除する；または（ｂ）転写された導入遺伝子のアブレーション認識ＲＮＡ配列（ＡＲＲＳ）を特異的に認識し／それに結合し、そしてｍＲＮＡ転写産物を切断するかもしくはその翻訳を妨げる任意の遺伝子産物、例えば翻訳もしくは転写産物である。本明細書に記載の通り、アブレーターは：第１の転写単位中のアブレーション認識部位に結合しそしてＤＮＡを切除するかもしくは取り除くエンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、メガヌクレアーゼもしくはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼおよび第１の転写単位のＲＮＡ転写産物を取り除くか、もしくは第１の転写単位のＲＮＡ転写産物の翻訳を抑制する干渉ＲＮＡ
、リボザイムもしくはアンチセンスよりなる群から選択することができる。１つの特定の態様において、アブレーターはＣｒｅであり（それはそのアブレーション認識部位としてｌｏｘＰを有する）、もしくはアブレーターはＦＬＰである（それはそのアブレーション認識部位としてＦＲＴを有する）。１つの態様において、ＡＴＰ加水分解に依存せずに働くエンドヌクレアーゼが選択される。そのようなアブレーターの例には、ＩＩ型Ｓエンドヌクレアーゼ（例えばＦｏｋＩ）、ＮａｅＩ、およびイントロンエンドヌクレアーゼ（例えばＩ−ＴｅｖＩのような）、インテグラーゼ（組込みを触媒する）、セリンリコンビナーゼ（組換えを触媒する）、チロシンリコンビナーゼ、インバーターゼ（例えばＧｉｎ）（反転を触媒する）、リゾルバーゼ（例えばＴｎ３）、および転位、分解、挿入、欠失、分解もしくは交換を触媒するヌクレアーゼを包含することができる。しかしながら、他の適当なヌクレアーゼを選択することができる。
治療導入遺伝子の永久的停止のためには、アブレーターは第１の転写単位中のアブレーション認識部位（１つもしくは複数）に結合しそして導入遺伝子を取り除くかもしくは切除するエンドヌクレアーゼであることができる。導入遺伝子の一時的停止が所望される場合、治療導入遺伝子のＲＮＡ転写産物中のアブレーション認識部位（１つもしくは複数）に結合しそして転写産物を取り除くかもしくはその翻訳を妨げるアブレーターが選択されるべきである。この場合、干渉ＲＮＡ、リボザイムもしくはアンチセンス系を用いることができる。治療導入遺伝子が癌、当業者に容易に明らかである様々な遺伝病を処置するために、もしくは宿主免疫反応を媒介するために投与される場合、該系は特に望ましい。
アブレーターの発現は、例えば誘導性プロモーターを包含する１つもしくはそれ以上の要素によりそして／または本明細書に記述されるようなホモダイマーもしくはヘテロダイマー融合タンパク質系を利用するキメラアブレーターの使用により制御することができる。ホモダイマー系の使用が選択される場合、アブレーターの発現は誘導性プロモーターにより制御される。ヘテロダイマー系の使用が選択される場合、アブレーターの発現は薬理学的作用物質の添加および場合によりヘテロダイマー系を形成する融合タンパク質の一方もしくは両方のさらなる誘導性プロモーターにより制御される。１つの態様において、ホモおよびヘテロ二量化可能なアブレーターは、転写因子調節物質で構築物に安全性のさらなる層を与えるために選択される。これらの系は、本明細書において後でより詳細に記述される。
アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）；アデノウイルス；ヘルペスウイルス；レンチウイルス；レトロウイルスなどが包含されるがこれらに限定されるものではない、遺伝子治療に適当な任意のウイルスを用いることができる。好ましい態様において、使用する複製欠損ウイルスはアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）である。ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９もしくはｒｈ１０は、ヒト患者における使用にとって特に魅力的である。パッケージングのためのＡＡＶゲノムのサイズ制限のために、転写単位を２つもしくはそれ以上のＡＡＶストックにおいて改変しそしてパッケージングすることができる。本発明のウイルス組成物として使用する１つのウイルスストックにおいて、もしくは本発明のウイルス組成物を形成する２つもしくはそれ以上のウイルスストックにおいてパッケージングしようと、処置に使用するウイルスゲノムは、治療導入遺伝子およびアブレーターをコードする第１および第２の転写単位をまとめて含有しなければならず；そして追加の転写単位をさらに含んでなることができる。例えば、第１の転写単位は１つのウイルスストックにおいてパッケージングし、そして第２、第３および第４の転写単位は第２のウイルスストックにおいてパッケージングすることができる。あるいはまた、第２の転写単位は１つのウイルスストックにおいてパッケージングし、そして第１、第３および第４の転写単位は第２のウイルスストックにおいてパッケージングすることができる。ＡＡＶゲノムをパッケージングすることにおけるサイズ制限のためにＡＡＶに有用であるが、本発明のウイルス組成物を製造するために他のウイルスを用いることができる。別の態様にお
いて、本発明のウイルス組成物は、それらが多数のウイルスを含有する場合、異なる複製欠損ウイルス（例えばＡＡＶおよびアデノウイルス）を含有することができる。
１つの態様において、本発明のウイルス組成物は、上記のような組み合わせにおいて、２つもしくはそれ以上の異なるＡＡＶ（もしくは別のウイルス）ストックを含有する。例えば、ウイルス組成物はアブレーター認識部位を有する治療遺伝子および第１のアブレーターを含んでなる第１のウイルスストックならびに追加のアブレーター（１つもしくは複数）を含む第２のウイルスストックを含有することができる。別のウイルス組成物は、治療遺伝子およびアブレーターのフラグメントを含んでなる第１のウイルスストックならびにアブレーターの別のフラグメントを含んでなる第２のウイルスストックを含有することができる。本発明のウイルス組成物における２つもしくはそれ以上のウイルスストックの様々な他の組み合わせは、本発明の系の成分の記述から明らかである。
ウイルスゲノム（１つもしくは複数）内のスペースを節約するために、２シストロン性転写単位を設計することができる。例えば、同じプロモーターにより調節することができる転写単位、例えば第３および第４の転写単位（および必要に応じて、治療導入遺伝子をコードする第１の転写単位）は、ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）もしくは２Ａペプチドを含有する２シストロン性単位として設計することができ、それは翻訳後事象において自己切断し（例えばフューリン−２Ａ）、そしてそれは導入遺伝子（もしくはアブレーターコーディング配列）が大きいか、マルチサブユニットからなるか、または２つの導入遺伝子を共送達するか、所望の導入遺伝子（１つもしくは複数）もしくはサブユニットを保有する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を共投与して単一のベクターゲノムを形成するようにインビボでそれらをコンカテマー化させる場合に単一のプロモーターからのメッセージにより異種遺伝子産物の共発現を可能にする。そのような態様において、第１のＡＡＶは単一の導入遺伝子を発現する発現カセットを保有することができ、そして第２のＡＡＶは宿主細胞における共発現のために異なる導入遺伝子を発現する発現カセットを保有することができる。しかしながら、選択した導入遺伝子は任意の生物活性産物もしくは他の産物、例えば研究にとって望ましい産物をコードすることができる。単一のプロモーターは、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）において、自己切断ペプチド（例えば２Ａペプチド、Ｔ２Ａ）もしくはプロテアーゼ認識部位（例えばフューリン）をコードする配列により相互に分離される２つもしくは３つの異種遺伝子（例えば第３および第４の転写単位、ならびに必要に応じて、治療導入遺伝子をコードする第１の転写単位）を含有するＲＮＡの発現を導くことができる。従って、ＯＲＦは、翻訳中（Ｔ２Ａの場合）もしくは後のいずれかに、個々のタンパク質に切断される単一のポリタンパク質をコードする。これらのＩＲＥＳおよびポリタンパク質系は、ＡＡＶパッケージングスペースを節約するために用いることができ、それらは同じプロモーターにより導くことができる成分の発現にのみ用いることができる。
本発明はまた、複製欠損ウイルス組成物の製造用の細胞系を設計するために使用するＤＮＡ構築物；複製欠損ウイルス組成物を作製しそして製造する方法；植物、細菌、哺乳類細胞などを包含する様々な細胞タイプおよび系における発現、ならびに動物処置（例えば家畜および他の哺乳類における）を包含する遺伝子導入のためにそしてヒト患者における遺伝子治療を包含するインビボもしくはエクスビボ治療のために複製欠損ウイルス組成物を使用する処置の方法にも関する。
５．１．導入遺伝子アブレーション系
本発明は、薬理学的作用物質、好ましくは経口製剤、例えば導入遺伝子もしくはその転写産物に特異的なアブレーターの発現を誘導する小分子を含有する錠剤に反応して、永久的にもしくは一時的に、治療遺伝子産物を取り除くための内臓安全機序を備えて設計された複製欠損ウイルス組成物を用いる導入遺伝子（治療用製品−タンパク質もしくはＲＮＡ
をコードする）の送達のために考案された薬理学的に誘導される導入遺伝子アブレーション（ＰＩＴＡ）系を提供する。しかしながら、薬理学的作用物質の他の送達経路を選択することができる。
ＰＩＴＡ系において、ウイルスゲノム（１つもしくは複数）が導入遺伝子単位（本明細書における５．１．１節に記述される）およびアブレーション単位（本明細書における５．１．２節に記述される）を含有するように改変されている１つもしくはそれ以上の複製欠損ウイルスが用いられる。特に、ウイルスゲノム（１つもしくは複数）が（ａ）転写を制御するプロモーターと機能的に結合した治療用製品をコードする第１の転写単位、該単位は少なくとも１つのアブレーション認識部位を含有する（導入遺伝子単位）；および（ｂ）薬理学的作用物質に反応して転写を誘導するプロモーターと機能的に結合したアブレーション認識部位に特異的なアブレーターをコードする第２の転写単位（アブレーション単位）を含有するように改変されている１つもしくはそれ以上の複製欠損ウイルスが用いられる。
１つの態様において、ＰＩＴＡ系は、複製欠損ウイルスのウイルスゲノム（１つもしくは複数）が二量化可能なドメイン単位（５．１．３節に記述される）を含有するようにさらに改変されるように設計される。１つの態様において、二量化可能なＴＦドメイン単位を送達することにより、標的細胞は、各々二量化剤結合ドメイン（５．１．３節に記述される）に融合した、２つの融合タンパク質：一方はアブレーターを制御する誘導性プロモーターに結合する転写因子のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含有し、そしてもう一方はアブレーターを制御する誘導性プロモーターを活性化する転写因子の転写活性化ドメイン（ＡＤ）を含有するを共発現するように改変される。両方の融合タンパク質に存在する二量化剤結合ドメインと同時に相互作用することができる薬理学的作用物質、すなわち「二量化剤」（５．１．４節に記述される）の添加は、調節されるプロモーターへのＡＤ融合タンパク質の動員をもたらし、アブレーターの転写を開始する。例えば、米国特許第５，８３４，２６６号および米国特許第７，１０９，３１７号に記述されるＡｒｉａｄ ＡＲＧＥＮＴＲ系を参照、これらの各々は引用することによりその全部が本明細書に組み込まれる。リガンドおよび適切な最小プロモーターの不在下では相互に親和性を有さない二量化剤結合ドメインを用いることにより、転写を二量化剤の添加に完全に依存的にする。
この目的のために、複製欠損ウイルスのウイルスゲノム（１つもしくは複数）は、各々第２の転写単位中のアブレーターの誘導性プロモーターを調節する転写因子の二量化可能なドメインをコードする、第３および第４の転写単位（二量化可能なＴＦドメイン単位）を含有するようにさらに改変することができ、ここで：（ｃ）第３の転写単位は、構成的プロモーターと機能的に結合した薬理学的作用物質の結合ドメインに融合した転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードし；そして（ｄ）第４の転写単位は、プロモーターと機能的に結合した薬理学的作用物質の結合ドメインに融合した転写因子の活性化ドメインをコードする。１つの態様において、二量化可能なＴＦドメインの各成分は構成的プロモーター下で発現される。別の態様において、二量化可能なＴＦドメイン単位の少なくとも１つの成分は誘導性プロモーター下で発現される。
ＰＩＴＡ系の１つの態様は図２４において例示され、それは構成的プロモーターと機能的に結合している治療抗体をコードする導入遺伝子単位、転写因子誘導性プロモーターと機能的に結合しているエンドヌクレアーゼをコードするアブレーション単位、および各転写因子ドメイン融合配列が構成的プロモーターと機能的に結合している、二量化可能なＴＦドメイン単位を示す。ラパマイシンもしくはラパログの投与の前に、治療抗体のそして２つの転写因子ドメイン融合タンパク質の基準発現がある。ラパマイシン投与の際に、二量化した転写因子はエンドヌクレアーゼの発現を誘導し、それは導入遺伝子単位中のエンドヌクレアーゼ認識ドメインを切断し、それによって導入遺伝子発現を取り除く。
１つの態様において、ＰＩＴＡ系において使用する複製欠損ウイルスはアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）（５．１．５節に記述される）である。ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９もしくはｒｈ１０は、ヒト患者における使用にとって特に魅力的である。パッケージングのためのＡＡＶゲノムのサイズ制限のために、転写単位を２つもしくはそれ以上のＡＡＶストックにおいて設計しそしてパッケージングすることができる。例えば、第１の転写単位は１つのＡＡＶストックにおいてパッケージングし、そして第２、第３および第４の転写単位は第２のＡＡＶストックにおいてパッケージングすることができる。あるいはまた、第２の転写単位は１つのＡＡＶストックにおいてパッケージングし、そして第１、第３および第４の転写単位は第２のＡＡＶストックにおいてパッケージングすることができる。
５．１．１．導入遺伝子単位
ＰＩＴＡ系において、ウイルスゲノム（１つもしくは複数）が導入遺伝子単位を含有するように改変されている１つもしくはそれ以上の複製欠損ウイルスが用いられる。本明細書において用いる場合、「導入遺伝子単位」という用語は、（１）導入遺伝子をコードするＤＮＡ配列；（２）導入遺伝子もしくはその発現制御要素内もしくはそれに隣接する（例えば、プロモーターの上流もしくは下流および／またはポリＡシグナルの上流）を包含する、導入遺伝子発現を妨げる位置に含まれる少なくとも１つのアブレーション認識部位（ＡＲＳ）；および（３）導入遺伝子の発現を調節するプロモーター配列を含んでなるＤＮＡをさす。導入遺伝子をコードするＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または例えば導入遺伝子の発現を高めることができる１つもしくはそれ以上のイントロンを含むｃＤＮＡであることができる。導入遺伝子の除去のために考案された系において、使用するＡＲＳは、導入遺伝子を取り除くかもしくは切除するアブレーター（５．１．２節に記述される）により認識されるもの、例えば、リコンビナーゼ（例えばＣｒｅ／ｌｏｘＰ系、ＦＬＰ／ＦＲＴ系）、メガヌクレアーゼ（例えばＩ−Ｓｃｅｌ系）、人工制限酵素系もしくは別の人工制限酵素系、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはヒドゲノムにまれにしか存在しない制限部位に特異的な制限酵素などが包含されるがこれらに限定されるものではないエンドヌクレアーゼ認識配列である。導入遺伝子の発現を抑制するために、ＡＲＳはアブレーション認識ＲＮＡ配列（ＡＲＲＳ）、すなわち、導入遺伝子の転写産物もしくはそのｍＲＮＡの翻訳を取り除くアブレーターにより認識されるＲＮＡ配列、例えばリボザイム認識配列、ＲＮＡｉ認識配列もしくはアンチセンス認識配列をコードすることができる。
本発明の導入遺伝子単位において設計することができる導入遺伝子の例には、ＨＩＶ感染性を中和する抗体もしくは抗体フラグメント、治療抗体、例えばＶＥＧＦ抗体、ＴＮＦ−α抗体（例えばインフリキシマブ、アダリムマブ）、ＥＧＦ−Ｒ抗体、バシリキシマブ、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ−ＣＬＬ、ダクリズマブ、エファリズマブ、オマリズマブ、パビリズマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ、アダリムマブ、もしくは前述の治療抗体のいずれかの抗体フラグメント；可溶性血管内皮成長因子受容体−ｌ（ｓＦｌｔ−ｌ）、可溶性ＴＮＦ−ａ受容体（例えばエタネルセプト）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、インシュリン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、肝細胞成長因子（ＲＧＦ）、ヘムオキシゲナーゼ−ｌ（ＲＯ−１）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ベータ−ＩＦＮ、ＩＬ−６、抗ＥＧＦＲ抗体、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮベータ−１ａ、抗ＣＤ２０抗体、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、抗細胞接着分子、ａ４−インテグリン抗体、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＤＣＣ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ガラニン、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）、ＴＮＦアンタゴニスト、ＩＬ−８ファミリーからのケモカイン、ＢＣｌ２、ＩＬ−１０、治療ｓｉＲＮＡ、治療ｕ６タンパク質、エンドスタチン、プラスミノーゲンもしくはそのフラグメント、Ｔ
ＩＭＰ３、ＶＥＧＦ−Ａ、ＲＩＦＩアルファ、ＰＥＤＦ、またはＩＬ−ｌ受容体アンタゴニストをコードする導入遺伝子が包含されるがこれらに限定されるものではない。
導入遺伝子は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターもしくは生理学的刺激により調節されるプロモーターの制御下であることができる。
治療用製品の発現を制御するために適当な構成的プロモーターの例には、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス（ＳＶ４０）の初期および後期プロモーター、Ｕ６プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ＥＦｌａプロモーター、ユビキチンプロモーター、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）プロモーター（Ｓｃｈａｒｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４６２６−４６３０（１９９１））、アデノシンデアミナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ピルビン酸キナーゼプロモーター、ホスホグリセロールムターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター（Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１０００６−１００１０（１９８９））、モロニー白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターならびに当業者に既知である他の構成的プロモーターが包含されるがこれらに限定されるものではない。
治療用製品の発現を制御するために適当な誘導性プロモーターには、外来性物質（例えば薬理学的作用物質）にもしくは生理学的刺激に応答するプロモーターが包含される。これらの応答配列には、ＨＩＦ−Ｉαおよびβに結合する低酸素応答配列（ＨＲＥ）、テトラサイクリン応答配列（Ｇｏｓｓｅｎ ＆ Ｂｕｊａｒｄ（１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５１により記述されるような）；エクジソン誘導性応答配列（Ｎｏ Ｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：３３４６−３３５１）、Ｍａｙｏ ｅｔ ａｌ．（１９８２，Ｃｅｌｌ ２９：９９−１０８）；Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）およびＳｅａｒｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１４８０−１４８９）により記述されるような金属イオン応答配列；Ｎｏｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ｅｄ．Ｎｏｕｅｒ，Ｌ．，ＣＲＣ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，ｐｐＩ６７−２２０，１９９１中）により記述されるような熱ショック応答配列；またはＬｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９４：２２８−２３２）；Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０３８−２０４２，１９８１）；Ｋｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３２９：７３４−７３６，１９８７）；およびＩｓｒａｅｌ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ（１９８９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：２５８９−２６０４）により記述されるようなホルモン応答配列ならびに当該技術分野において既知である他の誘導性プロモーターが包含されるがこれらに限定されるものではない。好ましくは、応答配列はエクジソン誘導性応答配列であり、より好ましくは応答配列はテトラサイクリン応答配列である。
本発明における使用に適当な組織特異的プロモーターの例には、表１に記載されるものおよび当該技術分野において既知である他の組織特異的プロモーターが包含されるがこれらに限定されるものではない。
Figure 0005922095
例えば、そして限定としてではなく、本発明の複製欠損ウイルス組成物はヒト患者における加速性黄斑変性症を処置するためにＶＥＧＦアンタゴニストを；ヒト患者における血友病Ａを処置するために第ＶＩＩＩ因子を；ヒト患者における血友病Ｂを処置するために第ＩＸ因子を；ヒト患者における鬱血性心不全を処置するためにインシュリン様成長因子（ＩＧＦ）もしくは肝細胞成長因子（ＨＧＦ）を；ヒト患者における中枢神経系疾患を処置するために神経成長因子（ＮＧＦ）を；またはヒト患者におけるＨＩＶ感染を処置するためにＨＩＶに対する中和抗体を送達するために用いることができる。
さらに他の有用な治療用製品には、インシュリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルホン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦαを包含するトランスフォーミング成長因子αスーパーファミリーのいずれか１つ、アクチビン、インヒビン、もしくは骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ１〜１５のいずれか、成長因子のヘレグリン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーのいずれか１つ、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３およびＮＴ−４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、セマフォリン／コラプシンのファミリーのいずれか１つ、ネトリン−１およびネトリン−２、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニック・ヘッジホッグおよびチロシンヒドロキシラーゼが包含されるがこれらに限定されるものではないホルモンならびに成長および分化因子が包含される。
他の有用な導入遺伝子産物には、サイトカインおよびリンホカイン、例えばトロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−１〜ＩＬ−２５（例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８を包含する）、単球走化性タンパク質、白血病抑制因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、βおよびγ、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ−３リガンドが包含されるがこれらに限定されるものではない免疫系を調節するタンパク質が包含される。免疫系により産生される遺伝子産物もまた本発明において有用である。これらには、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子、ならびに改変された免疫グロブリンおよびＭＨＣ分子が包含されるがこれらに限定されるものではない。有用な遺伝子産物にはまた補体調節タンパク質、例えば補体調節タンパク質、膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）、分解促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２およびＣＤ５９も包含される。
さらに他の有用な遺伝子産物には、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質および免疫系タンパク質の受容体のいずれか１つが包含される。本発明には、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）受容体およびスカベンジャー受容体が包含される、コレステロール調節および／もしくは脂質調節のための受容体が包含される。本発明にはまた、グルココルチコイド受容体およびエストロゲン受容体、ビタミンＤ受容体および他の核内受容体を包含するステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーのような遺伝子産物も包含される。さらに、有用な遺伝子産物には転写因子、例えばｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ−１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤおよびミオゲニン、ＥＴＳボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ−４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ−１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡボックス結合タンパク質、例えばＧＡＴＡ−３、ならびにウイングドヘリックスタンパク質のフォークヘッドファミリーが包含される。
他の有用な遺伝子産物には、カルバモイル合成酵素Ｉ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸合成酵素、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテート加水分解酵素、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ−１抗トリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、シスタチオニン（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｅ）ベータ・シンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル−ｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インシュリン、ベータ−グルコシダーゼ、ピルビン酸塩カルボキシラーゼ、肝臓ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ−タンパク質、Ｔ−タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）配列およびジストロフィン遺伝子産物［例えば、ミニ−もしくはミクロ−ジストロフィン］が包含される。さらに他の有用な遺伝子産物には、酵素の欠損活性に起因する様々な症状において有用である、酵素補充療法において有用であり得るような酵素が包含される。例えば、マンノース−６−リン酸塩を含有する酵素は、リソソーム蓄積症の治療において利用することができる（例えば、適当な遺伝子にはβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）をコードするものが包含される）。
５．１．２．アブレーション単位
ＰＩＴＡ系において使用する１つもしくはそれ以上の複製欠損ウイルスのウイルスゲノム（１つもしくは複数）は、本明細書に定義した通り、アブレーション単位もしくはアブ
レーターのコーディング配列をさらに含有するように改変される。
導入遺伝子発現の永久的停止のためには、アブレーターは、導入遺伝子単位のＡＲＳに結合しそして導入遺伝子を取り除くかもしくは切除する、リコンビナーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼもしくはヒトゲノムにまれにしか存在しない制限部位を有する任意の制限酵素が包含されるがこれらに限定されるものではないエンドヌクレアーゼであることができる。そのようなアブレーターの例には、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系（Ｇｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７，５９９５−６０００）；ＦＬＰ／ＦＲＴ系（Ｓｏｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２３，４３１−４６９）；哺乳類ゲノムにおけるまれな配列、特定の非対称の１８ｂｐ配列（Ｔ ＡＧＧＧＡＴ ＡＡＣＡＧＧＧＴ
ＡＡＴ（配列番号：２５））を認識しそして二本鎖切断をもたらすＩ−ＳｃｅＩのようなメガヌクレアーゼ（Ｊａｓｉｎ，Ｍ．，１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，１２，２２４−２２８）；および人工制限酵素（例えば、哺乳類ゲノムに特有のＡＲＳ配列を標的とするように改変することができるＤＮＡ切断ドメインにジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを融合させることにより作製したジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０５：５８０９−５８１４））が包含されるがこれらに限定されるものではない。１つの態様において、アブレーターはキメラ酵素であり、それはホモ二量体もしくはヘテロ二量体融合タンパク質に基づくことができる。
導入遺伝子の一時的停止が所望される場合、導入遺伝子単位のＲＮＡ転写産物のＡＲＲＳに結合しそして転写産物を取り除くかもしくはその翻訳を妨げるアブレーターが選択されるべきである。そのようなアブレーターの例には、ＡＲＲＳを認識する干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、リボスイッチのようなリボザイム（Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（３）：３３７−４３）、もしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドが包含されるがこれらに限定されるものではない。ＡＲＲＳを認識するＲＮＡｉ、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者に既知である任意の方法を用いて設計しそして構築することができる。この系は、癌を処置するためにもしくは宿主免疫反応を媒介するために治療導入遺伝子が投与される場合に特に望ましい。
１つの態様において、アブレーターの発現は、アブレーター遺伝子の転写に対して厳格な制御を与える誘導性プロモーター、例えば薬理学的作用物質、または薬理学的作用物質もしくは代わりの態様において生理学的刺激により活性化される転写因子により制御されなければならない。漏洩せずそして厳格に制御することができるプロモーター系が好ましい。アブレーターの発現を制御するために適当な誘導性プロモーターは、例えば、テトラサイクリン（ｔｅｔ）応答配列（Ｇｏｓｓｅｎ ＆ Ｂｕｊａｒｄ（１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５１）により記述されるような）；エクジソン誘導性応答配列（Ｎｏ Ｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：３３４６−３３５１）、Ｍａｙｏ ｅｔ ａｌ．（１９８２，Ｃｅｌｌ．２９：９９−１０８）；Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）およびＳｅａｒｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１４８０−１４８９）により記述されるような金属イオン応答配列；Ｎｏｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ｅｄ．Ｎｏｕｅｒ，Ｌ．，ＣＲＣ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，ｐｐｌ６７−２２０，１９９１中）により記述されるような熱ショック応答配列；もしくはＬｅｅ
ｅｔ ａｌ．（１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９４：２２８−２３２）；Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０３８−２０４２）；Ｋｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２９：７３４−７３６）；およびＩｓｒａｅｌ ＆ Ｋａｕｆｍａｎ（１９８９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．１７：２５８９−２６０４）により記述されるようなホルモン応答配列が包含されるがこれらに限定されるものではない応答配列および当該技術分野において既知である他の誘導性プロモーターである。そのようなプロモーターを用いて、例えば、ほんの数例を挙げればＴｅｔ−オン／オフ系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６−９；Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８９（１２）：５５４７−５１）；ＴｅｔＲ−ＫＲＡＢ系（Ｕｒｒｕｔｉａ Ｒ．，２００３，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．，４（１０）：２３１；Ｄｅｕｓｃｈｌｅ Ｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（４）：１９０７−１４）；ミフェプリストン（ＲＵ４８６）調節可能な系（Ｇｅｎｅｓｗｉｔｃｈ；Ｗａｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９１（１７）：８１８０−４；Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０２（３９）：１３７８９−９４）；ヒト化タモキシフェン依存的な調節可能な系（Ｒｏｓｃｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．６（５）：６５３−６３）；およびエクジソン依存的な調節可能な系（Ｒｈｅｏｓｗｉｔｃｈ；Ｋａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１：１１；Ｐａｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０（６）：１３０８−１５）により、アブレーターの発現を制御することができる。
キメラ酵素は、構成的もしくは誘導性プロモーターにより制御することができる。１つの態様において、系はキメラエンドヌクレアーゼを利用し、ここで、ヌクレアーゼは少なくとも２つのドメイン、すなわち、触媒ドメインおよび配列特異的ＤＮＡ結合ドメインを有し、これらの各々は別個に制御されるプロモーター下で発現され、そしてこれらは機能的に連結される。２つのドメインが同時に発現される場合、２つのドメインの産物はキメラエンドヌクレアーゼを形成する。典型的に、ＤＮＡ結合ドメインに連結されたドメインの各々を含有する別個の転写単位が提供される。そのようなＤＮＡ結合ドメインには、例えば、ジンクフィンガーモチーフ、ホメオドメインモチーフ、ＨＭＧ−ボックスドメイン、ＳＴＡＴタンパク質、Ｂ３、ヘリックス−ループ−ヘリックス、ウイングドヘリックス−ターン−ヘリックス、ロイシンジッパー、ヘリックス−ターン−ヘリックス、ウィングドヘリックス、ＰＯＵドメイン、リプレッサーのＤＮＡ結合ドメイン、癌遺伝子のＤＮＡ結合ドメインおよび＞６塩基対を認識する天然に存在する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質［１９９５年７月２５日に交付済みのＵＳ ５，４３６，１５０］が包含される。
１つの態様において、アブレーターの発現は、５．１．３節に記述される二量化可能な転写因子ドメインにより調節される誘導性プロモーターの制御下にある。そのような誘導性プロモーターの例には、ＧＡＬ４転写因子に応答するＧＡＬ４結合部位最小プロモーターが包含されるがこれに限定されるものではない。ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインもしくはトランス活性化ドメインはまた、エクジソン受容体（ＥｃＲ）のようなステロイド受容体に融合させることもできる。本明細書に記述されるようなさらに他の適当な誘導性プロモーターを選択することができる。
５．１．３．二量化可能な転写因子ドメイン単位
１つの態様において、ＰＩＴＡ系は、ヘテロ二量体融合タンパク質である二量化可能な単位を含有するために複製欠損ウイルスのウイルスゲノム（１つもしくは複数）がさらに改変されるように設計される。これらの単位は、本明細書において定義した通りの二量化可能なＴＦ単位もしくは別の二量化可能な融合タンパク質単位（例えば、キメラ酵素の一部）であることができる。そのような場合、二量化剤結合ドメインに結合しそしてＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質と活性化ドメイン融合タンパク質を二量化し（可逆的に架橋し）、二機能性転写因子を形成する二量化剤が用いられる（５．１．４節を参照）。例えば、米国公開第２００２／０１７３４７４号、米国公開第２００９１０１００５３５号、
米国特許第５，８３４，２６６号、米国特許第７，１０９，３１７号、米国特許第７，４８５，４４１号、米国特許第５，８３０，４６２号、米国特許第５，８６９，３３７号、米国特許第５，８７１，７５３号、米国特許第６，０１１，０１８号、米国特許第６，０４３，０８２号、米国特許第６，０４６，０４７号、米国特許第６，０６３，６２５号、米国特許第６，１４０，１２０号、米国特許第６，１６５，７８７号、米国特許第６，９７２，１９３号、米国特許第６，３２６，１６６号、米国特許第７，００８，７８０号、米国特許第６，１３３，４５６号、米国特許第６，１５０，５２７号、米国特許第６，５０６，３７９号、米国特許第６，２５８，８２３号、米国特許第６，６９３，１８９号、米国特許第６，１２７，５２１号、米国特許第６，１５０，１３７号、米国特許第６，４６４，９７４号、米国特許第６，５０９，１５２号、米国特許第６，０１５，７０９号、米国特許第６，１１７，６８０号、米国特許第６，４７９，６５３号、米国特許第６，１８７，７５７号、米国特許第６，６４９，５９５号、米国特許第６，９８４，６３５号、米国特許第７，０６７，５２６号、米国特許第７，１９６，１９２号、米国特許第６，４７６，２００号、米国特許第６，４９２，１０６号、ＷＯ ９４／１８３４７、ＷＯ ９６／２０９５１、ＷＯ ９６／０６０９７、ＷＯ ９７／３１８９８、ＷＯ ９６／４１８６５、ＷＯ ９８／０２４４１、ＷＯ ９５／３３０５２、ＷＯ ９９１１０５０８、ＷＯ ９９１１０５１０、ＷＯ ９９／３６５５３、ＷＯ ９９／４１２５８，ＷＯ ０１１１４３８７に記述されるＡｒｉａｄ ＡＲＧＥＮＴＴＭ系、ＡＲＧＥＮＴＴＭ調節転写レトロウイルスキット、バージョン２．０（９１０９１０２）およびＡＲＧＥＮＴＴＭ調節転写プラスミドキット、バージョン２．０（９１０９／０２）を参照、これらの各々は引用することによりその全部が本明細書に組み込まれる。
１つの態様において、二量化可能な単位を送達することにより、標的細胞は、各々二量化剤結合ドメインに融合した、使用する薬理学的作用物質により二量化される２つの融合タンパク質：一方はアブレーターを制御する誘導性プロモーターに結合する転写因子のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含有しそしてもう一方はアブレーターを制御する誘導性プロモーターを活性化する転写因子の転写活性化ドメイン（ＡＤ）を含有するを共発現するように改変される。２つの融合タンパク質の発現は構成的であるか、もしくはさらなる安全機能として誘導性であることができる。融合タンパク質の一方の発現に誘導性プロモーターが選択される場合、プロモーターは調節可能であるが、ウイルス組成物中の任意の他の誘導性もしくは調節可能なプロモーターと異なり得る。両方の融合タンパク質に存在する二量化剤結合ドメインと同時に相互作用することができる薬理学的作用物質、すなわち「二量化剤」（５．１．４節に記述される）の添加は、調節されるプロモーターへのＡＤ融合タンパク質の動員をもたらし、アブレーターの転写を開始する。リガンドおよび適切な最小プロモーターの不在下では相互に親和性を有さない二量化剤結合ドメインを使用することにより、転写を二量化剤の添加に完全に依存的にする。好適には、本発明の複製欠損ウイルス組成物は１つより多くの二量化可能なドメインを含有することができる。組成物中の様々な複製欠損ウイルスは異なるストックのものであることができ、それらは異なる転写単位（例えばインサイチューで二量化可能な単位を形成するための融合タンパク質）および／もしくは追加のアブレーターを提供する。
１つもしくはそれ以上の転写因子ドメインを含有する融合タンパク質は、本明細書に引用することによりそれらの全部が組み込まれるＷＯ ９４／１８３１７、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０８００８、Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ，上記およびＢｌａｕ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ １９９７ ９４：３０７６）に開示される。リガンド媒介遺伝子ノックアウトのためのそしてリガンド媒介遺伝子発現阻害もしくは遺伝子産物機能阻害のためのそのような融合タンパク質の設計および使用は、ＰＣＴ／ＵＳ９５／１０５９１に開示される。標的遺伝子の調節転写に関する態様において有用である新規ＤＮＡ結合ドメインおよびそれらが結合するＤＮＡ配列は、例えば、Ｐｏｍｅｒａｎｚ ｅｔ ａｌ，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：９３ ９６に開示される。これらの参考文献は、同様の融合タンパク
質をコードするＤＮＡ構築物、標的遺伝子構築物の設計、構築および使用、ならびに本発明の実行者にも有用であり得る他の態様に関する実質的な情報、指針および実施例を提供する。
好ましくは、ＤＮＡ結合ドメインおよびそれを含有する融合タンパク質は、他の多数であることが多い他のＤＮＡ配列の存在にもかかわらず選択したＤＮＡ配列への結合を検出することができる（インビトロにおいて測定した場合に直接的にもしくは間接的に）ように十分な選択性を有してその認識ＤＮＡ配列に結合する。好ましくは、選択したＤＮＡ配列へのＤＮＡ結合ドメインを含んでなる融合タンパク質の結合は、インビトロにおける結合研究によりもしくは任意の代わりのＤＮＡ配列と比較した場合に選択したＤＮＡ配列と関連する遺伝子の転写の相対的割合もしくはレベルを測定することにより測定した場合に、任意の１つの代わりのＤＮＡ配列への結合よりも少なくとも２桁、より好ましくは３桁そしてさらにより好ましくは４桁以上大きい。本発明の二量化可能な転写因子（ＴＦ）ドメイン単位は、当該技術分野において既知である任意の転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインをコードすることができる。そのような転写因子の例には、ＧＡＬ４、ＺＦＨＤ１、ＶＰＩ６およびＮＦ−ＫＢ（ｐ６５）が包含されるがこれらに限定されるものではない。
本発明の二量化可能な単位によりコードされる二量化剤結合ドメインは、米国公開第２００２／０１７３４７４号、米国公開第２００９１０１００５３５号、米国特許第５，８３４，２６６号、米国特許第７，１０９，３１７号、米国特許第７，４８５，４４１号、米国特許第５，８３０，４６２号、米国特許第５，８６９，３３７号、米国特許第５，８７１，７５３号、米国特許第６，０１１，０１８号、米国特許第６，０４３，０８２号、米国特許第６，０４６，０４７号、米国特許第６，０６３，６２５号、米国特許第６，１４０，１２０号、米国特許第６，１６５，７８７号、米国特許第６，９７２，１９３号、米国特許第６，３２６，１６６号、米国特許第７，００８，７８０号、米国特許第６，１３３，４５６号、米国特許第６，１５０，５２７号、米国特許第６，５０６，３７９号、米国特許第６，２５８，８２３号、米国特許第６，６９３，１８９号、米国特許第６，１２７，５２１号、米国特許第６，１５０，１３７号、米国特許第６，４６４，９７４号、米国特許第６，５０９，１５２号、米国特許第６，０１５，７０９号、米国特許第６，１１７，６８０号、米国特許第６，４７９，６５３号、米国特許第６，１８７，７５７号、米国特許第６，６４９，５９５号、米国特許第６，９８４，６３５号、米国特許第７，０６７，５２６号、米国特許第７，１９６，１９２号、米国特許第６，４７６，２００号、米国特許第６，４９２，１０６号、ＷＯ ９４１１８３４７、ＷＯ ９６／２０９５１、ＷＯ ９６／０６０９７、ＷＯ ９７／３１８９８、ＷＯ ９６／４１８６５、ＷＯ ９８／０２４４１、ＷＯ ９５／３３０５２、ＷＯ ９９／１０５０８、ＷＯ ９９１１０５１０、ＷＯ ９９／３６５５３、ＷＯ ９９／４１２５８、ＷＯ ０１１１４３８７に記述される任意の二量化剤結合ドメイン、ＡＲＧＥＮＴＴＭ調節転写レトロウイルスキット、バージョン２．０（９／０９／０２）およびＡＲＧＥＮＴＴＭ調節転写プラスミドキット、バージョン２．０（９／０９／０２）であることができ、これらの各々は引用することによりその全部が本明細書に組み込まれる。
ＰＩＴＡ系において用いることができる二量化剤結合ドメインは、イムノフィリンＦＫＢＰ（ＦＫ５０６結合タンパク質）である。ＦＫＢＰは、免疫抑制薬ＦＫ５０６およびラパマイシンの細胞内受容体として働く豊富な１２ｋＤａ細胞質タンパク質である。調節転写は、転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび転写因子の活性化ドメインに多コピーのＦＫＢＰを融合させ、続いてＦＫ１０１２（ＦＫ５０６のホモ二量体；Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．，ｅｔ
ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ，３８２（６５９４）：８２２−６）；もしくはＡＰ１５１０のようなより単純な合成アナログ（Ａｍａｒａ，Ｊ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４（２０）：１０６１８−２
３）の添加により成し遂げることができる。これらの系の効能は、内因性ＦＫＢＰとの相互作用を最小限に抑える故意の「バンプ（ｂｕｍｐｓ）」を有する、ＡＰ１８８９のような合成二量化剤を用いることにより改善することができる（Ｐｏｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９９９．３０６：ｐ．２６３−８１）。ヘテロ二量化に基づく改善された方法は、ＦＫ５０６およびラパマイシンがＦＫＢＰを第２の標的タンパク質と一緒にすることにより生来機能するという発見を利用する。これは、遺伝子発現を制御するために二量化剤として天然産物自体もしくはそのアナログを直接使用することを可能にする。
カルシニューリンホスファターゼに複合体形成したＦＫＢＰ−ＦＫ５０６の構造（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８２：５０７ ５２２，１９９５）が報告されている。カルシニューリンＡ（残基１２ ３９４）は、Ｇａｌ４に融合した３つのＦＫＢＰおよびＧａｌ４活性化ドメインにＣ末端で融合したマウスカルシニューリンＡの残基１２〜３９４を用いて酵母における３ハイブリッド系を使用して二量化剤結合ドメインとして有効であることが示された（Ｈｏ，１９９６ Ｎａｔｕｒｅ．３８２：８２２ ８２６）。ＦＫ５０６の添加は、これらの細胞におけるレポーター遺伝子の転写を活性化した。より小さい、より機能的なドメインである、ＣＡＢと呼ばれる「最小」カルシニューリンドメインは、二量化剤結合ドメインとして用いることができる。
本発明の二量化可能な融合タンパク質単位によりコードされるＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質および活性化ドメイン融合タンパク質は、１コピーもしくはそれ以上の１つもしくはそれ以上の異なる二量化剤結合ドメインを含有することができる。二量化剤結合ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインに対してＮ末端、Ｃ末端もしくは散在することができる。多コピーの二量化剤結合ドメインに関する態様は、通常は２、３もしくは４つのそのようなコピーを有する。融合タンパク質の様々なドメインは、場合により隣接するドメインの１つ由来であり得るかもしくは異種であり得る連結ペプチド領域により分離される。
本明細書において用いる場合、二量化剤結合ドメインのバリアントの文脈における「バリアント」という用語は、天然の二量化剤結合ドメインに対して欠失、挿入、置換もしくは他の改変を含有するが、二量化剤に結合するそれらの特異性を保持する二量化剤結合ドメインをさす。二量化剤結合ドメインのバリアントは、好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１アミノ酸残基以下の欠失、挿入、置換および／もしくは他の改変を有する。特定の態様において、二量化剤結合ドメインのバリアントは、１〜５アミノ酸が二量化剤結合ドメインのカルボキシおよび／もしくはアミノ末端から付加されるかもしくは除かれる（ここで、付加されるアミノ酸は天然の二量化剤結合ドメインに存在する隣接アミノ酸（１つもしくは複数）である）ことを除いて、上記に特定した通りの二量化剤結合ドメインの天然配列を有する。
ウイルスゲノム（１つもしくは複数）内のスペースを節約するために、２シストロン性転写単位を設計することができる。例えば、ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）を含有する２シストロン性単位として第３および第４の転写単位を設計することができ、それは単一プロモーターからのメッセージによる異種遺伝子産物の共発現を可能にする。あるいはまた、単一のプロモーターは、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）において、自己切断ペプチド（例えばＴ２Ａ）もしくはプロテアーゼ認識部位（例えばフューリン）をコードする配列により相互に分離される２つもしくは３つの異種遺伝子（例えば第３および第４の転写単位）を含有するＲＮＡの発現を導くことができる。従って、ＯＲＦは、翻訳中（Ｔ２Ａの場合）もしくは後のいずれかに、個々のタンパク質に切断される、単一のポリタンパク質をコードする。しかしながら、これらのＩＲＥＳおよびポリタンパク質系はＡＡＶパッケージングスペースを節約するために用いることができるが、それら
は同じプロモーターにより導くことができる成分の発現にのみ使用できることに留意すべきである。
以下の実施例において説明する通り、本発明の様々な成分には下記のものを包含することができる：
ＩＴＲ：ＡＡＶ血清型２の逆方向末端反復（１６８ｂｐ）。１つの態様において、ＡＡＶ２ ＩＴＲは偽型ＡＡＶ、すなわち、ＩＴＲが由来するＡＡＶのものと異なるＡＡＶからのキャプシドを有するＡＡＶを生成せしめるように選択される。
ＣＭＶ：エンハンサーを含む、完全なサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター。ＣＭＶ：エンハンサーを含まない、最小ＣＭＶプロモーター。１つの態様において，ヒトＣＭＶプロモーターおよび／もしくはエンハンサーが選択される。
ＦＲＢ−ＴＡ融合：二量化剤結合ドメインおよび転写因子の活性化ドメインの融合。ＦＲＢフラグメントは、細胞増殖および分裂を制御するホスホイノシチド３−キナーゼホモログ、ＦＲＡＰ（ｍＴＯＲ［ラパマイシンの哺乳類標的］としても知られている、ＦＫＢＰラパマイシン関連タンパク質）のアミノ酸２０２１〜２１１３に対応する。ＦＲＡＰ配列は、ある種の非免疫抑制性ラパマイシンアナログ（ラパログ）の使用を可能にするために単一の点突然変異Ｔｈｒ２０９８Ｌｅｕ（ＦＲＡＰＬ）を含む。ＦＲＡＰはラパマイシン（もしくはそのアナログ）およびＦＫＢＰに結合し、そして転写活性化因子としてヒトＮＦ−ＫＢ ｐ６５（１９０アミノ酸）の一部に融合される。
ＺＦＨＤ−ＦＫＢＰ融合：ＤＮＡ結合ドメインおよび１コピーの二量化剤結合ドメイン、２コピーの薬剤結合ドメイン（２ｘＦＫＢＰ）もしくは３（３ｘＦＫＢＰ）コピーの薬剤結合ドメインの融合。イムノフィリンＦＫＢＰ（ＦＫ５０６結合タンパク質）は、免疫抑制薬ＦＫ５０６およびラパマイシンの細胞内受容体として働く豊富な１２ｋＤａ細胞質タンパク質である。ＺＦＨＤは、ジンクフィンガー対およびホメオドメインからなるＤＮＡ結合ドメインである。別の代替物において、様々な他のコピー数の選択した薬剤結合ドメインを選択することができる。そのような融合タンパク質は、５’および／もしくは３’末端にヒトｃ−ＭｙｃからのＮ末端核局在化配列を含有することができる。
Ｚ８Ｉ：ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）遺伝子からの最小プロモーターが続くＺＦＨＤの８コピーの結合部位（Ｚ８）を含有する（配列番号：３２）。例えば、プロモーター、例えばＩＬ−２からの最小プロモーターもしくは別の選択したプロモーターが続くＺＦＨＤの１〜約２０コピーの結合部位を含有する、これのバリアントを用いることができる。
Ｃｒｅ：Ｃｒｅリコンビナーゼ。Ｃｒｅは、バクテリオファージＰ１から単離されたＩ型トポイソメラーゼである。Ｃｒｅは、２つのｌｏｘＰ部位の間のＤＮＡにおける部位特異的組換えを媒介し、欠失もしくは遺伝子変換をもたらす（１０２９ｂｐ、配列番号：３３）。
Ｉ−ＳｃｅＩ：メガヌクレアーゼの大きいクラスであるイントロンエンドヌクレアーゼもしくはホーミングエンドヌクレアーゼのメンバー（７０８ｂｐ、配列番号：３４）。それらは、細菌および植物において見出されるイントロンのような可動遺伝要素によりコードされる。Ｉ−ＳｃｅＩは、イントロンホーミング過程に関与する酵母エンドヌクレアーゼである。Ｉ−ＳｃｅＩは、哺乳類ゲノムにおけるまれな配列、特定の非対称の１８ｂｐ配列を認識し、そして二本鎖切断をもたらす。Ｊａｓｉｎ，Ｍ．（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，１２，２２４−２２８を参照。
ｈＧＨポリＡ：ヒトＧＨからの最小ポリアデニル化シグナル（配列番号：３５）。
ＩＲＥＳ：ＥＣＭＶ（脳心筋炎ウイルス）からの内部リボソーム侵入部位配列（配列番号：３６）。
５．１．４．二量化剤および薬理学的作用物質
本明細書において用いる場合、「二量化剤」という用語は、ＴＦドメイン融合タンパク質（５．１．３節に記述される）の二量化剤結合ドメインに結合しそして融合タンパク質の二量化を誘導することができる化合物である。インビトロにおいてアッセイした場合に、転写因子のドメインを二量化する任意の薬理学的作用物質を用いることができる。好ましくは、ラパマイシンおよび「ラパログ」と呼ばれるそのアナログを用いることができる。以下に記述する二量化剤のいずれかを用いることができる：米国公開第２００２／０１７３４７４号、米国公開第２００９／０１００５３５号、米国特許第５，８３４，２６６号、米国特許第７，１０９，３１７号、米国特許第７，４８５，４４１号、米国特許第５，８３０，４６２号、米国特許第５，８６９，３３７号、米国特許第５，８７１，７５３号、米国特許第６，０１１，０１８号、米国特許第６，０４３，０８２号、米国特許第６，０４６，０４７号、米国特許第６，０６３，６２５号、米国特許第６，１４０，１２０号、米国特許第６，１６５，７８７号、米国特許第６，９７２，１９３号、米国特許第６，３２６，１６６号、米国特許第７，００８，７８０号、米国特許第６，１３３，４５６号、米国特許第６，１５０，５２７号、米国特許第６，５０６，３７９号、米国特許第６，２５８，８２３号、米国特許第６，６９３，１８９号、米国特許第６，１２７，５２１号、米国特許第６，１５０，１３７号、米国特許第６，４６４，９７４号、米国特許第６，５０９，１５２号、米国特許第６，０１５，７０９号、米国特許第６，１１７，６８０号、米国特許第６，４７９，６５３号、米国特許第６，１８７，７５７号、米国特許第６，６４９，５９５号、米国特許第６，９８４，６３５号、米国特許第７，０６７，５２６号、米国特許第７，１９６，１９２号、米国特許第６，４７６，２００号、米国特許第６，４９２，１０６号、ＷＯ ９４１１８３４７、ＷＯ ９６／２０９５１、ＷＯ ９６／０６０９７、ＷＯ ９７／３１８９８、ＷＯ ９６／４１８６５、ＷＯ ９８／０２４４１、ＷＯ ９５／３３０５２、ＷＯ ９９／１０５０８、ＷＯ ９９／１０５１０、ＷＯ
９９／３６５５３、ＷＯ ９９／４１２５８、ＷＯ ０１１１４３８７、ＡＲＧＥＮＴＴＭ調節転写レトロウイルスキット、バージョン２．０（９１０９／０２）およびＡＲＧＥＮＴＴＭ調節転写プラスミドキット、バージョン２．０（９／０９／０２）、これらの各々は引用することによりその全部が本明細書に組み込まれる。
本発明において使用することができる二量化剤の例には、ラパマイシン、ＦＫ５０６、ＦＫＩ０１２（ＦＫ５０６のホモ二量体）、内因性ＦＫＢＰおよび／もしくはＦＲＡＰに対する親和性を減らすかもしくは除く「バンプ」を付加するために天然産物の化学修飾により容易に製造されるラパマイシンアナログ（「ラパログ」）が包含されるがこれらに限定されるものではない。ラパログの例には、例えば、内因性ＦＫＢＰとの相互作用を最小限に抑える故意の「バンプ」を有する、ＡＰ２６１１３（Ａｒｉａｄ）、ＡＰ１５１０（Ａｍａｒａ，Ｊ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４（２０）：１０６１８−２３）、ＡＰ２２６６０、ＡＰ２２５９４、ＡＰ２１３７０、ＡＰ２２５９４、ＡＰ２３０５４、ＡＰ１８５５、ＡＰ１８５６、ＡＰ１７０１、ＡＰ１８６１、ＡＰ１６９２およびＡＰ１８８９が包含されるがこれらに限定されるものではない。
二量化剤結合ドメインにもしくは他の内因性成分に結合することができる他の二量化剤は、ファージ提示およびペプチジル結合化合物を同定するための他の生物学的方法；合成多様性もしくは組み合わせ方法（例えば、Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３７（９）：１２３３−１２５１および３７（１０）：１３８５−１４
０１；ならびにＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ，１９９３，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：６９０９−６９１３を参照）ならびに通常のスクリーニングもしくは合成プログラムを包含する、様々な方法を用いて容易に同定することができる。興味のある二量化剤結合ドメインに結合することができる二量化剤は、アフィニティー精製の様々な方法によりまたはピン、ビーズ、チップなどのような固体担体上に固定した化合物へのタンパク質の結合に関するアッセイを包含する直接もしくは競合結合アッセイにより同定することができる。例えば、Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，上記を参照。
一般的に言えば、二量化剤は好ましくは約１０−６未満、より好ましくは約１０−７未満、さらにより好ましくは約１０−８未満、そしてある態様において約１０−９Ｍ未満のＫｄ値で、いずれかの順にもしくは同時に２つ（もしくはそれ以上）のタンパク質分子に結合することができる。二量化剤は好ましくは非タンパク質であり、そして約５ｋＤａ未満の分子量を有する。そのようにオリゴマー化されるタンパク質は、同じであるかもしくは異なることができる。
様々な二量化剤は疎水性であるか、もしくは親油基での適切な修飾によりそのようにすることができる。特に、連結部分を含有する二量化剤は、リンカー部分に約１２〜２４個の炭素原子の１つもしくはそれ以上の脂肪族側鎖を含むことにより親油性を高めるように改変することができる。
５．１．５．複製欠損ウイルス組成物を作製すること
アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）；アデノウイルス；アルファウイルス；ヘルペスウイルス；レトロウイルス（例えばレンチウイルス）；ワクシニアウイルスなどが包含されるがこれらに限定されるものではない、遺伝子導入（例えば遺伝子治療）に適当な任意のウイルスを、複製欠損ウイルスの１つもしくはそれ以上のストックに転写単位をパッケージングするために用いることができる。治療導入遺伝子単位、アブレーション単位、および場合により（しかし好ましくは）二量化可能な転写因子ドメイン単位を含有する複製欠損ウイルスを製造するために複製欠損ウイルスに外来遺伝子をパッケージングするための当該技術分野において周知である方法を用いることができる。例えば、Ｇｒａｙ ＆ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００８，“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．８：９１１−９２２；Ｍｕｒｐｈｙ ＆ Ｈｉｇｈ，２００８，“Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，”Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ １４０：４７９−４８７；Ｈｕ，２００８，“Ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ：総説，”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：５４−６５；Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００８，“Ｔｈｅ ｐｏｘｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ＭＶ Ａ ａｎｄ ＮＹＶ ＡＣ ａｓ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ，”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：９７−１２０を参照。
好ましい態様において、治療的使用のための複製欠損ウイルス組成物はＡＡＶを用いて作製される。遺伝子治療に適当なＡＡＶを作製しそして単離する方法は、当該技術分野において既知である。一般的には、例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ ＆ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，“Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９−１４５；Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，“Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ−ａｓ
ｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｊ．Ｇｅｎｅ
Ｍｅｄ．１０：７１７−７３３；および以下に引用する参考文献を参照、これらの各々は引用することによりその全部が本明細書に組み込まれる。
アデノ随伴ウイルス（ディペンドウイルス属、パルボウイルス科）は、ヒトおよび他の霊長類に感染する小型（約２０〜２６ｎｍ）の、非エンベロープ一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、現在、疾病を引き起こさないことが知られている。アデノ随伴ウイルスは、分裂および非分裂細胞の両方に感染することができる。機能性ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルスもしくはヘルペスウイルス）の不在下で、ＡＡＶは複製欠損性である。アデノ随伴ウイルスは、宿主細胞核中でエピソームコンカテマーを形成する。非分裂細胞において、これらのコンカテマーは宿主細胞の生涯にわたって損なわれないままである。分裂細胞において、エピソームＤＮＡは宿主細胞ＤＮＡと一緒に複製されないので、ＡＡＶ ＤＮＡは細胞分裂によって失われる。しかしながら、ＡＡＶ ＤＮＡはまた宿主ゲノムに低レベルで組込むこともできる。
ＡＡＶゲノムは、約４．７キロ塩基の長さである、プラスもしくマイナスセンスのいずれかのｓｓＤＮＡから成る。ＡＡＶのゲノムは、天然において存在する場合にＤＮＡ鎖の両末端の逆方向末端反復（ＩＴＲ）、および２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ｒｅｐおよびｃａｐを含んでなる。前者はＡＡＶ生活環に必要とされるＲｅｐタンパク質をコードする４つの重複する遺伝子からなり、そして後者は正二十面体対称のキャプシドを形成するように相互作用するキャプシドタンパク質（Ｃａｐ）：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする重複する配列を含有する。
ＩＴＲは各々１４５塩基であり、そして第２のＤＮＡ鎖のプライマーゼ非依存的合成を可能にするいわゆる「自己プライミング」に寄与するヘアピンを形成する。ＩＴＲはまた、宿主細胞ゲノムへの（例えばヒトにおける第１９染色体への）ＡＡＶ ＤＮＡ組込みおよびそれからのレスキューに、ならびにＡＡＶ ＤＮＡの効率の良いキャプシド封入およびＡＡＶ粒子の組立てにも必要とされるようである。
ビリオンに導入遺伝子をパッケージングするために、ＩＴＲは導入遺伝子と同じ構築物においてシスに必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子は、トランスに供給することができる。従って、ＤＮＡ構築物は、ＡＡＶ ＩＴＲが転写単位（すなわち、導入遺伝子単位、アブレーター単位、および二量化可能な転写因子単位）の１つもしくはそれ以上に隣接し、従って、増幅されそしてパッケージングされる領域を特定するように設計することができる（唯一の設計制約は、パッケージングされるＤＮＡのサイズの上限である）（約４．５ｋｂ）。スペースを節約するために使用することができるアデノ随伴ウイルス工学および設計選択は、以下に記述される。
複製欠損ウイルス組成物を作製する方法
導入遺伝子をパッケージングする組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の効率の良い製造のために多数の方法が確立されており、本発明の複製欠損ウイルス組成物を作製するためにこれらを使用するかもしくは適用することができる。１つの系において、ＩＴＲが隣接する導入遺伝子をコードする構築物ならびにｒｅｐおよびｃａｐをコードする構築物（１つもしくは複数）で産生細胞系を一過性トランスフェクションする。第２の系において、ＩＴＲが隣接する導入遺伝子をコードする構築物で、ｒｅｐおよびｃａｐを安定に供給するパッケージング細胞系を一過性トランスフェクションする。第３の系において、ＩＴＲが隣接する導入遺伝子およびｒｅｐ／ｃａｐを供給する安定な細胞系を使用する。これらの系を用いて複製可能なＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ）を生成する可能性を最小限に抑える１つの方法は、ｒｅｐ／ｃａｐカセットに隣接する領域および導入遺伝子に隣接するＩＴＲ間の相同性の領域を除くことによってである。しかしながら、これらの系の各々において、ＡＡＶビリ
オンはヘルパーアデノウイルスもしくはヘルペスウイルスの感染に応答して産生され、混入ウイルスからのｒＡＡＶの分離を必要とする。
最近になって、ＡＡＶを回収するためにヘルパーウイルスの感染を必要としない系が開発されており、必要とされるヘルパー機能（すなわち、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡおよびＥ４もしくはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２およびＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼ）もまた系によりトランスに供給される。これらのより新しい系において、ヘルパー機能は、必要とされるヘルパー機能をコードする構築物での細胞の一過性トランスフェクションにより供給することができ、もしくはその発現を転写もしくは転写後レベルで制御することができる、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定に含有するように細胞を改変することができる。さらに別の系において、ＩＴＲが隣接する導入遺伝子およびｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子は、バキュロウイルスに基づくベクターでの感染により昆虫細胞に導入される。これらの産生系に関する総説は、一般的に、例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ ＆ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５；およびＢｔｉｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２−９２９を参照、これらの各々の内容は、引用することによりその全部が本明細書に組み込まれる。これらおよび他のＡＡＶ産生系を作製しそして使用する方法はまた以下の米国特許にも記述され、その各々の内容は引用することによりその全部が本明細書に組み込まれる：５，１３９，９４１；５，７４１，６８３；６，０５７，１５２；６，２０４，０５９；６，２６８，２１３；６，４９１，９０７；６，６６０，５１４；６，９５１，７５３；７，０９４，６０４；７，１７２，８９３；７，２０１，８９８；７，２２９，８２３；および７，４３９，０６５。また、これらの系およびそのバリアントを用いてＡＡＶ生産をスケールアップする方法を記述する以下の段落も参照。
パッケージングのためのＡＡＶのサイズ制限のために（約４．５ｋｂの導入遺伝子を許容する）、記載の転写単位（すなわち、導入遺伝子単位、アブレーター単位および二量化可能な転写因子単位）は、２つもしくはそれ以上の複製欠損ＡＡＶストックに設計されそしてパッケージングされる必要があり得る。パッケージング容量を上回ることは、より多数の「空」ＡＡＶ粒子の生成につながり得るという証拠があるので、これは好ましい可能性がある。
あるいはまた、パッケージングに利用可能なスペースは、１つより多くの転写単位を単一の構築物に組み合わせ、そのようにして必要とされる調節配列スペースの量を減らすことにより節約することができる。例えば、単一のプロモーターは興味のある２つもしくは３つもしくはそれ以上の遺伝子をコードする単一のＲＮＡの発現を導くことができ、そして下流遺伝子の翻訳はＩＲＥＳ配列により導かれる。別の例において、単一のプロモーターは、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）において、自己切断ペプチド（例えばＴ２Ａ）もしくはプロテアーゼ認識部位（例えばフューリン）をコードする配列により相互に分離される興味のある２つもしくは３つもしくはそれ以上の遺伝子を含有するＲＮＡの発現を導くことができる。従って、ＯＲＦは、翻訳中（Ｔ２Ａの場合）もしくは後のいずれかに、個々のタンパク質（例えば導入遺伝子および二量化可能な転写因子のような）に切断される、単一のポリタンパク質をコードする。しかしながら、これらのＩＲＥＳおよびポリタンパク質系はＡＡＶパッケージングスペースを節約するために用いることができるが、それらは同じプロモーターにより導くことができる成分の発現にのみ使用できることに留意すべきである。
別の代替物において、ＡＡＶの導入遺伝子容量は、頭尾コンカテマーを形成するように
アニーリングすることができる２つのゲノムのＡＡＶ ＩＴＲを提供することにより増加することができる。一般に、宿主細胞へのＡＡＶの侵入の際に、導入遺伝子を含有する一本鎖ＤＮＡは宿主細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体により二本鎖ＤＮＡに転化され、その後にＩＴＲは核におけるコンカテマー形成を助ける。代替物して、ＡＡＶは自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶであるように改変することができ、それは宿主細胞への侵入の際にウイルスが第２鎖合成の段階を回避することを可能にし、より速いそして潜在的により高い（例えば、１００倍までの）導入遺伝子発現を有するｓｃＡＡＶウイルスを提供する。例えば、標的細胞への送達後にかみ合い、興味のある導入遺伝子単位をコードする二本鎖ＤＮＡを生成することができる、それぞれ導入遺伝子単位およびその相補物をコードする２つの連結された一本鎖ＤＮＡを含んでなるゲノムを有するようにＡＡＶを改変することができる。自己相補的ＡＡＶは、例えば米国特許第６，５９６，５３５号；第７，１２５，７１７号；および第７，４５６，６８３号に記述され、これらの各々は引用することによりその全部が本明細書に組み込まれる。
複製欠損ｒＡＡＶ中の転写単位（１つもしくは複数）は、本明細書に記述されるか、当該技術分野において既知であるか、もしくは発見されていない任意のＡＡＶキャプシドタンパク質（Ｃａｐ）でパッケージングすることができる。血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９もしくはｒｈ１０からのＣａｐは、ヒト患者において使用するｒＡＡＶを作製するために特に好ましい。好ましい態様において、ｒＡＡＶ Ｃａｐは血清型ＡＡＶ８に基づく。別の態様において、ｒＡＡＶ Ｃａｐは２つもしくは３つもしくはそれ以上のＡＡＶ血清型からのＣａｐに基づく。例えば、１つの態様において、ｒＡＡＶ ＣａｐはＡＡＶ６およびＡＡＶ９に基づく。
Ｃａｐタンパク質は、ＡＡＶウイルスの宿主指向性、細胞、組織もしくは臓器特異性、受容体使用、感染効率および免疫原性に影響を与えることが報告されている。例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ ＆ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５；Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８；およびこのサブセクションにおいて以下に引用される参考文献を参照；これらの全ては引用することによりそれらの全てが本明細書に組み込まれる。従って、ｒＡＡＶにおいて使用するＡＡＶ Ｃａｐは、例えば、処置する患者（例えば、ヒトもしくは非ヒト、患者の免疫学的状態、長期もしくは短期処置への患者の適合性など）もしくは特定の治療用途（例えば、特定の疾病もしくは疾患の処置、または特定の細胞、組織もしくは臓器への送達）の検討に基づいて選択することができる。
ある態様において、ｒＡＡＶ Ｃａｐは、例えば、特定の治療が標的とする、特定の細胞、組織もしくは臓器に効率良く形質導入するその能力によって選択される。ある態様において、ｒＡＡＶ Ｃａｐは、強固な内皮細胞関門、例えば血液−脳関門、血液−眼関門、血液−精巣関門、血液−卵巣関門、心臓の周りの内皮細胞関門もしくは血液−胎盤関門を乗り越えるその能力によって選択される。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型の組織特異性はキャプシドの血清型により決定され、そして異なるＡＡＶキャプシドに基づくウイルスベクターは異なる組織に感染するそれらの能力を考慮に入れて作製することができる。ＡＡＶ２は、骨格筋、中枢神経系のニューロン、血管平滑筋細胞に対して生来の指向性を示す。ＡＡＶ１は筋肉、関節炎の関節、膵島、心臓、血管内皮、中枢神経系（ＣＮＳ）および肝臓細胞に形質導入することにおいてＡＡＶ２より効率が良いと記述されており、一方、ＡＡＶ３は蝸牛内有毛細胞の形質導入に、ＡＡＶ４は脳に、ＡＡＶ５はＣＮＳ、肺、眼、関節炎の関節および肝臓細胞に、ＡＡＶ６は筋肉、心臓および気道上皮に、ＡＡＶ７は筋肉に、ＡＡＶ８は筋肉、膵臓、心臓および肝臓に、そしてＡＡＶ９は心臓によく適しているようである。例えば、Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８を参照。当該技術分野において既知であるＡＡＶの任意の血清型、例えば、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡ
Ｖ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７［ＷＯ ２００３／０４２３９７を参照］、ＡＡＶ８［例えば、米国特許７７９０４４９；米国特許７２８２１９９を参照］、ＡＡＶ９［ＷＯ ２００５／０３３３２１を参照］、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、改変されたＡＡＶ［例えば、ＷＯ ２００６／１１０６８９を参照］、もしくはまだ発見されていない、またはそれに基づく組換えＡＡＶをｒＡＡＶキャプシドの供給源として用いることができる。
様々な天然に存在するそして組換えのＡＡＶ、それらのコードする核酸、ＡＡＶ ＣａｐおよびＲｅｐタンパク質およびそれらの配列、ならびにそのようなＡＡＶを単離するかもしくは作製し、増殖させ、そして精製する方法、そして特に、ｒＡＡＶを製造することにおける使用に適当なそれらのキャプシドは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，２００４，“Ｃｌａｄｅｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｒｅ ｗｉｄｅｌｙ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅｓ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１−６３８８；米国特許第７，３１９，００２号；第７，０５６，５０２号；第７，２８２，１９９号；第７，１９８，９５１号；第７，２３５，３９３号；第６，１５６，３０３号；および第７，２２０，５７７号；米国特許出願公開第ＵＳ ２００３−０１３８７７２号；第ＵＳ ２００４−００５２７６４号；第ＵＳ ２００７−００３６７６０号；第ＵＳ ２００８−００７５７３７号；および第ＵＳ ２００８−００７５７４０号；ならびに国際特許出願公開第ＷＯ ２００３１０１４３６７号；第ＷＯ
２００１１０８３６９２号；第ＷＯ ２００３／０４２３９７号（ＡＡＶ７および様々なシミアンＡＡＶ）；第ＷＯ ２００３／０５２０５２号；第ＷＯ ２００５／０３３３２１号；第ＷＯ ２００６１１１０６８９号；第ＷＯ ２００８／０２７０８４号；および第ＷＯ ２００７／１２７２６４号に記述され；これらの各々は引用することによりその全部が本明細書に組み込まれる。
ある態様において、ｒＡＡＶにおいて使用するＡＡＶ Ｃａｐは、上記のＡＡＶ Ｃａｐもしくはそのコードする核酸の１つの突然変異誘発により（すなわち、挿入、欠失もしくは置換により）作製することができる。ある態様において、ＡＡＶ Ｃａｐは上記のＡＡＶ Ｃａｐの１つもしくはそれ以上に少なくとも７０％同一であり、７５％同一であり、８０％同一であり、８５％同一であり、９０％同一であり、９５％同一であり、９８％同一であり、または９９％もしくはそれ以上同一である。
ある態様において、ＡＡＶ Ｃａｐは、上記のＡＡＶ Ｃａｐの２つもしくは３つもしくは４つもしくはそれ以上からのドメインを含んでなるキメラである。ある態様において、ＡＡＶ Ｃａｐは２つもしくは３つの異なるＡＡＶもしくは組換えＡＡＶからのＶｐｌ、Ｖｐ２およびＶｐ３モノマーのモザイクである。ある態様において、ｒＡＡＶ組成物は上記のＣａｐの１つより多くを含んでなる。
ある態様において、ｒＡＡＶ組成物において使用するＡＡＶ Ｃａｐは、異種配列もしくは他の改変を含有するように設計される。例えば、選択的ターゲッティングもしくは免疫回避を与えるペプチドもしくはタンパク質配列をＣａｐタンパク質中に設計することができる。あるいはまたもしくはさらに、Ｃａｐは、ｒＡＡＶの表面がポリエチレングリコール化（ＰＥＧ化）されるように化学的に修飾することができ、それは免疫回避を容易にすることができる。Ｃａｐタンパク質はまた、例えばその生来の受容体結合を除くために、もしくは免疫原性エピトープをマスクするために突然変異させることもできる。
ＡＡＶの拡張性のある（ｓｃａｌａｂｌｅ）製造の方法
臨床応用において使用する好適に均質でありそして混入物質を含まないｒＡＡＶ組成物を作製するために適応することができる、ＡＡＶの拡張性のある（例えば商業的規模での製造のための）製造の方法もまた、当該技術分野において既知であり、そして以下に簡潔
に要約される。
アデノ随伴ウイルスは、引用することによりその全部が本明細書に組み込まれる、Ｔｈｏｍｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，“Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：７０７−７１４に記述される安定な産生細胞系を用いる方法のような、哺乳類細胞系に基づく方法を用いる規模で製造することができる。Ｔｈｏｒｐｅおよび同僚等により記述される方法において、ｒＡＡＶを作製するために必要な全ての成分、導入遺伝子構築物（ＩＴＲが隣接する導入遺伝子）ならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を安定に含有する産生細胞系が設計され、それらは生のアデノウイルス５型（Ａｄ５）のようなヘルパーウイルスの感染によりウイルスを作るように誘導される（当該技術分野において同様に周知である拡張性のある製造の方法）。産生細胞系は、（ｉ）パッケージングカセット（所望の血清型のｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびにそれらの発現に必要とされる調節要素）、（ｉｉ）ＩＴＲが隣接する導入遺伝子、（ｉｉｉ）哺乳類細胞用の選択マーカー、ならびに（ｉｖ）細菌におけるプラスミド増殖に必要な成分を含有する構築物（１つもしくは複数）で安定にトランスフェクションされる。安定な産生細胞系は、パッケージング構築物（１つもしくは複数）をトランスフェクションし、薬剤耐性細胞を選択しそしてヘルパーウイルスの存在下で組換えＡＡＶの産生を保証するためにレプリカ平板培養することにより得られ、それらを次に性能および品質についてスクリーニングする。いったん適切なクローンが選択されると、細胞系の増殖をスケールアップし、細胞にアデノウイルスヘルパーを感染させ、そして得られるｒＡＡＶを細胞から採取する。
Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．により記述される方法の代わりとして、パッケージング細胞系をＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子で安定にトランスフェクションし、そしてｒＡＡＶの産生が所望される場合に導入遺伝子構築物を別個に導入する。Ｔｈｏｒｐｅおよび同僚等は産生細胞系にＨｅＬａ細胞を使用するが、ヘルパーウイルスの感染を受けやすく、ｒｅｐ遺伝子の安定に組込まれたコピーを維持することができ、そして好ましくはバイオリアクターにおける増殖および産生用に懸濁状態で良く増殖することができる任意の細胞系（例えば、Ｖｅｒｏ、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３）をＴｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．に記述される方法に従って用いることができる。
前述の方法において、ｒＡＡＶはヘルパーウイルスとしてアデノウイルスを用いて産生される。これらの方法の改変として、ｒＡＡＶはアデノウイルスヘルパー機能を含有する１つもしくはそれ以上の構築物で安定にトランスフェクションした産生細胞を用いて作製することができ、アデノウイルスを細胞に感染させる必要を省く。バリエーションにおいて、アデノウイルスヘルパー機能の１つもしくはそれ以上はｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子と同じ構築物内に含有される。これらの方法において、アデノウイルスヘルパー機能の発現は、アデノウイルス関連細胞毒性を防ぐために転写もしくは転写後制御下に置くことができる。
安定な細胞系を作製する代わりとして、ＡＡＶはまた、引用することによりその全部が本明細書に組み込まれる、Ｗｒｉｇｈｔ，２００９，“Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：６９８−７０６により記述されるような、一過性トランスフェクション方法を用いる規模で産生することもできる。Ｗｒｉｇｈｔの方法は、（ｉ）ＩＴＲが隣接する興味のある導入遺伝子；（ｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子；ならびに（ｉｉｉ）ゲノム複製およびパッケージングを助けるために必要とされるヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス）遺伝子（あるいはまた、Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．
に記載の通りのヘルパーウイルス）を含有する構築物での細胞のトランスフェクションを伴う。あるいはまた、アデノウイルスヘルパー機能は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子と同じ構築物内に含有することができる。従って、ｒＡＡＶは、導入遺伝子およびｒｅｐ／ｃａｐ構築物の安定なトランスフェクションを保証する必要なしに産生される。これはＡＡＶを作製するための柔軟性のあるそして迅速な方法を提供し、従って、前臨床および初期臨床開発に理想的である。組換えＡＡＶは、当該技術分野において既知である一過性トランスフェクション方法を用いて構築物で哺乳類細胞系を一過性トランスフェクションすることにより作製することができる。例えば、大規模生産に最も適しているトランスフェクション方法には、リン酸カルシウムでのＤＮＡ共沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥ）のようなポリカチオンおよびカチオン性脂質の使用が包含される。
ヘルパーとしてのアデノウイルスの有効性はまた、例えばアデノウイルスおよびＡＡＶに基づくハイブリッドウイルス（「Ａｄ−ＡＡＶハイブリッド」）を用いて、大規模組換えＡＡＶ生産のための代替法を開発するためにも利用されている。この生産方法は、それがトランスフェクションを必要としないという利点を有し、ｒＡＡＶ生産に必要とされるのはアデノウイルスによるｒｅｐ／ｃａｐパッケージング細胞の感染だけである。この方法において、安定なｒｅｐ／ｃａｐ細胞系に機能性Ｅ１遺伝子を保有するヘルパーアデノウイルスをそして次にＡＡＶ導入遺伝子に加えてＩＴＲ配列がアデノウイルスＥ１領域に挿入される組換えＡｄ−ＡＡＶハイブリッドウイルスを感染させる。Ａｄ−ＡＡＶハイブリッドを作製する方法および組換えＡＡＶ生産におけるそれらの使用は、引用することによりその全部が本明細書に組み込まれる、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９に記述される。
別のバリエーションにおいて、ｒＡＡＶは、引用することによりその全部が本明細書に組み込まれる、Ｃｌｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，２００９，“Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｕｓｉｎｇ ａ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｅｎａｂｌｅｓ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：７９６−８０６に記述されるような、ＡＡＶおよび単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ）に基づくハイブリッドウイルス（「ＨＳＶ／ＡＡＶハイブリッド」）を用いて作製することができる。この方法は、ＡＡＶ生産用のヘルパーウイルスとしてＨＳＶを使用する可能性を進展させる（当該技術分野において周知であり、そしてまたＣｌｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．において概説される）。簡潔に言えば、ＨＳＶ／ＡＡＶハイブリッドはＨＳＶバックボーン内にＡＡＶ導入遺伝子構築物を含んでなる。これらのハイブリッドは、ｒｅｐ／ｃａｐおよびヘルペスウイルスヘルパー機能を供給する産生細胞に感染させるために用いることができ、もしくはヘルパー機能を供給する組換えＨＳＶとの共感染において用いることができ、興味のある導入遺伝子をキャプシド封入するｒＡＡＶの生成をもたらす。
別の方法において、ｒＡＡＶ組成物は、例えば、引用することによりその全部が本明細書に組み込まれる、Ｖｉｒａｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，“Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｆｏｓｔｅｒ ｃｅｌｌｓ：Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ−ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：８０７−８１７に記載の通り、昆虫細胞におけるＡＡＶ成分の組換えバキュロウイルス媒介発現を用いる規模で製造することができる。この系において、周知のバキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）系は、組換えＡＡＶを生産するように適応される。例えば、Ｖｉｒａｇ ｅｔ ａｌ．により記述される系は、（ｉ）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ（１つもしくは２つのＢＥＶにおけるいずれか）および（ｉｉ）導入遺伝子構築物を提供する２つ（
もしくは３つ）の異なるＢＥＶでのＳｆ９昆虫細胞の感染を含んでなる。あるいはまた、Ｓｆ９細胞は、ｒｅｐおよびｃａｐを発現するように安定に改変することができ、導入遺伝子構築物を含有する単一のＢＥＶのみでの感染後に組換えＡＡＶの生産を可能にする。ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の化学量論的生産を保証するために（これらのうち後者は効率の良いパッケージングに必要とされる）、ＢＥＶは遺伝子発現の転写前および転写後調節を可能にする特徴を含むように改変することができる。次に、Ｓｆ９細胞は導入遺伝子構築物をＡＡＶキャプシドにパッケージングし、そして得られるｒＡＡＶを培養上清からもしくは細胞を溶解することにより採取することができる。
前述の方法の各々は、ｒＡＡＶ組成物の拡張性のある製造を可能にする。商業的用途（診療所における使用を包含する）に適当なｒＡＡＶ組成物の製造方法はまた、混入細胞の除去の工程；ヘルパーウイルス（および内因性レトロウイルス様粒子のような任意の他の混入ウイルス）を除きそして不活性化する工程；任意のｒｃＡＡＶを除きそして不活性化する工程；空（導入遺伝子なしの）ＡＡＶ粒子の生産を最小限に抑え、定量しそして除く工程（例えば遠心分離により）；ｒＡＡＶを精製する工程（例えば、濾過またはサイズおよび／もしくは親和性に基づくクロマトグラフィーにより）；および純度および安全性についてｒＡＡＶ組成物を試験する工程も含んでならなければならない。これらの方法はまた前段落において引用される参考文献にも提供され、そしてこの目的のために本明細書に組み込まれる。
拡張性のあるｒＡＡＶ生産の前述の方法の１つの不都合な点は、ｒＡＡＶの多くが産生細胞を溶解することにより得られ、それはウイルスを得るためだけでなくそれを細胞混入物から単離するためにもかなりの努力を必要とすることである。これらの必要性を最小限に抑えるために、その内容が引用することによりその全部が本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ ２００７／１２７２６４号において提供されるような、細胞溶解を必要としないｒＡＡＶ生産の拡張性のある方法を用いることができる。以下の６節の実施例において、細胞培養上清からｒＡＡＶを得る新規の拡張性のある方法が提供され、それはまた、本明細書に記載の方法に従って使用するｒＡＡＶ組成物の製造に適用することもできる。
さらに別の態様において、本発明は、本発明のＤＮＡ構築物および／もしくはウイルス組成物の１つもしくはそれ以上を含有するヒトもしくは非ヒト細胞を提供する。そのような細胞は遺伝子操作することができ、そして例えば植物、細菌、非ヒト哺乳類もしくは哺乳類細胞を包含することができる。細胞タイプの選択は、本発明の制約ではない。
５．２．組成物
本発明は、ウイルスのゲノム（または組み合わせて使用する２つもしくはそれ以上の複製欠損ウイルスストックの集団ゲノム）が３．１．節において定義されそして上に記述される治療導入遺伝子単位およびアブレーター単位を含んでなり；そして二量化可能な融合タンパク質もしくはＴＦドメイン単位（１つもしくは複数）（二量化可能な単位（１つもしくは複数）と便宜上呼ばれる）をさらに含んでなることができる治療（インビボもしくはエクスビボ）における使用に適当な複製欠損ウイルス組成物を提供する。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルスもしくはレトロウイルスが包含されるがこれらに限定されるものではない、遺伝子治療に適当な任意のウイルスを本発明の組成物において用いることができる。好ましい態様において、組成物は本明細書の５．２．１節においてさらに詳細に記述される複製欠損ＡＡＶである。
本発明の組成物は、ウイルスのゲノム（１つもしくは複数）が導入遺伝子単位、アブレーション単位、および／もしくは二量化可能な単位を含んでなる治療（インビボもしくは
エクスビボ）に適当な複製欠損ウイルス（１つもしくは複数）を含んでなる。１つの態様において、本発明の組成物は、ウイルスのゲノムが導入遺伝子単位を含んでなる遺伝子治療に適当なウイルスを含んでなる。別の態様において、本発明の組成物は、ウイルスのゲノムがアブレーション単位を含んでなる遺伝子治療に適当なウイルスを含んでなる。別の態様において、本発明の組成物は、ウイルスのゲノムが二量化可能な単位を含んでなる遺伝子治療に適当なウイルスを含んでなる。別の態様において、本発明の組成物は、ウイルスのゲノムが導入遺伝子単位およびアブレーション単位を含んでなる遺伝子治療に適当なウイルスを含んでなる。別の態様において、本発明の組成物は、ウイルスのゲノムが導入遺伝子単位および二量化可能な単位を含んでなる遺伝子治療に適当なウイルスを含んでなる。別の態様において、本発明の組成物は、ウイルスのゲノムがアブレーション単位および二量化可能な単位を含んでなる遺伝子治療に適当なウイルスを含んでなる。別の態様において、本発明の組成物は、ウイルスのゲノムが導入遺伝子単位、アブレーション単位および二量化可能な単位を含んでなる遺伝子治療に適当なウイルスを含んでなる。
本発明はまた、本明細書に記載の１つもしくはそれ以上の転写単位を含んでなる組換えＤＮＡ構築物を含んでなる組成物も提供する。組換えＤＮＡ構築物を含んでなる組成物は、５．２．２節においてさらに詳細に記述される。
５．２．１．遺伝子治療用の複製欠損ウイルス組成物
本発明は、複製欠損ウイルスストック（１つもしくは複数）を含んでなる組成物および生理学的に許容しうる担体における複製欠損ウイルス（１つもしくは複数）の製剤を提供する。これらの製剤は、遺伝子導入および／もしくは遺伝子治療に用いることができる。組成物のウイルスゲノムは：（ａ）転写を制御するプロモーターと機能的に結合した治療用製品をコードする第１の転写単位、該単位は少なくとも１つのアブレーション認識部位を含有する（導入遺伝子単位）；および（ｂ）プロモーターと機能的に結合したアブレーション認識部位に特異的なアブレーターもしくはそのフラグメントをコードする第２の転写単位を含んでなる。１つの態様において、複製欠損ウイルスのウイルスゲノム。アブレーターは、本明細書の他の所に定義した通りである。
ＡＡＶストック
好ましい態様において、本発明の組成物の複製欠損ウイルスはＡＡＶ、好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９もしくはｒｈ１０である。１つの態様において、組成物のＡＡＶはＡＡＶ８である。大部分の場合におけるＡＡＶのパッケージング制限（約４．５ｋｂ）のために、製造しやすくするために、導入遺伝子単位、アブレーション単位および二量化可能な単位は２つもしくはそれ以上のウイルスベクター間に分割され、そして別個のＡＡＶストックにパッケージングされる。１つの態様において、複製欠損ウイルス組成物は１つのＡＡＶストックにパッケージングされる第１の転写単位（導入遺伝子単位）、ならびに第２のＡＡＶストックにパッケージングされる第２（アブレーター単位）、第３および第４の転写単位（二量化可能なＴＦドメイン単位）を含んでなる。別の態様において、複製欠損ウイルス組成物は１つのＡＡＶストックにパッケージングされる第２の転写単位（アブレーター単位）、ならびに第２のＡＡＶストックにパッケージングされる第１（導入遺伝子単位）、第３および第４の転写単位（二量化可能なＴＦドメイン単位）を含んでなる。別の態様において、全ての４つの単位を１つのＡＡＶストックにパッケージングすることができるが、これはパッケージングすることができるＤＮＡのサイズに制限を課す。例えば、１つのＡＡＶストックに全ての４つの単位をパッケージングするために、アブレーターとしてＣｒｅをそして二量化可能なＴＦドメインとしてＦＲＢ／ＦＫＢを使用する場合（以下の実施例において示されるように）、治療導入遺伝子をコードするＤＮＡのサイズは約９００塩基対未満の長さであるべきであり；これはサイトカインをコードするＤＮＡ、ＲＮＡｉ治療などに適応する。
パッケージングのためのＡＡＶゲノムのサイズ制限のために、転写単位は２つもしくはそれ以上のＡＡＶストックにおいて設計しそしてパッケージングすることができる。本発明のウイルス組成物として使用する１つのウイルスストックにおいて、もしくは本発明のウイルス組成物を形成する２つもしくはそれ以上のウイルスストックにおいてパッケージングしようと、処置に使用するウイルスゲノムは治療導入遺伝子およびアブレーターをコードする第１および第２の転写単位をまとめて含有しなければならず；そして追加の転写単位（例えば、二量化可能なＴＦドメインをコードする第３および第４の転写単位）をさらに含んでなることができる。例えば、第１の転写単位を１つのウイルスストックにパッケージングし、そして第２、第３および第４の転写単位を第２のウイルスストックにパッケージングすることができる。あるいはまた、第２の転写単位を１つのウイルスストックにパッケージングし、そして第１、第３および第４の転写単位を第２のウイルスストックにパッケージングすることができる。ＡＡＶゲノムをパッケージングすることにおけるサイズ制限のためにＡＡＶに有用であるが、本発明のウイルス組成物を製造するために他のウイルスを用いることができる。別の態様において、本発明のウイルス組成物は、それらが多数のウイルスを含有する場合、異なる複製欠損ウイルス（例えばＡＡＶおよびアデノウイルス）を含有することができる。
１つの態様において、本発明のウイルス組成物は、上記の通りのような組み合わせにおいて、２つもしくはそれ以上の異なるＡＡＶ（もしくは別のウイルス）ストックを含有する。例えば、ウイルス組成物は、アブレーター認識部位を有する治療遺伝子および第１のアブレーターを含んでなる第１のウイルスストックおよび追加のアブレーター（１つもしくは複数）を含む第２のウイルスストックを含有することができる。別のウイルス組成物は、治療遺伝子およびアブレーターのフラグメントを含んでなる第１のウイルスストックならびにアブレーターの別のフラグメントを含んでなる第２のウイルスストックを含有することができる。本発明のウイルス組成物における２つもしくはそれ以上のウイルスストックの様々な他の組み合わせは、本発明の系の成分の記述から明らかである。
ウイルス製剤
本発明の組成物は、獣医学的目的のための動物（例えば家畜（ウシ、ブタなど）、および他の非ヒト哺乳類患者への、ならびにヒト患者への送達用に調合することができる。複製欠損ウイルスは、遺伝子導入および遺伝子治療用途に使用する生理学的に許容しうる担体と調合することができる。ウイルスは複製欠損性であるので、製剤の投薬量はＰＦＵ（プラーク形成単位）として測定するかもしくは計算することができない。代わりに、ゲノムコピー（「ＧＣ」）の定量を製剤に含有される用量の尺度として使用することができる。
当該技術分野において既知である任意の方法を本発明の複製欠損ウイルス組成物のゲノムコピー（ＧＣ）数を決定するために用いることができる。ＡＡＶ ＧＣ数の滴定を行うための１つの方法は下記の通りであり：精製されたＡＡＶベクターサンプルを最初にＤＮアーゼで処理して製造工程からキャプシド封入されていないＡＡＶゲノムＤＮＡもしくは混入プラスミドＤＮＡを除く。ＤＮアーゼ耐性粒子を次に熱処理に供してキャプシドからゲノムを遊離させる。遊離したゲノムを次にウイルスゲノムの特定領域（通常はポリＡシグナル）を標的とするプライマー／プローブ組を用いてリアルタイムＰＣＲにより定量する。
また、複製欠損ウイルス組成物は、ヒト患者用に約１．０ｘ１０９ＧＣ〜約１．０ｘ１０１５ＧＣ（７０ｋｇの体重の平均患者を処置するため）、そして好ましくは１．０ｘ１０１２ＧＣ〜１．０ｘ１０１４ＧＣの範囲である複製欠損ウイルスの量を含有するように投与単位において調合することができる。好ましくは、製剤における複製欠損ウイルスの用量は１．０ｘ１０９ＧＣ、５．０Ｘ１０９ＧＣ、１．０Ｘ１０１０ＧＣ、５．０Ｘ１０
１０ＧＣ、１．０Ｘ１０１１ＧＣ、５．０Ｘ１０１１ＧＣ、１．０Ｘ１０１２ＧＣ、５．０Ｘ１０１２ＧＣもしくは１．０ｘ１０１３ＧＣ、５．０Ｘ１０１３ＧＣ、１．０Ｘ１０１４ＧＣ、５．０Ｘ１０１４ＧＣもしくは１．０ｘ１０１５ＧＣである。
複製欠損ウイルスは、１つもしくはそれ以上の生理学的に許容しる担体もしくは賦形剤を用いて常法において調合することができる。複製欠損ウイルスは注射による、例えばボーラス注射もしくは連続注入による非経口投与用に調合することができる。注射用製剤は、防腐剤を加えて、単位投与携帯物において、例えばアンプルにおいてもしくは複数回投与容器において提供することができる。複製欠損ウイルス組成物は、油性もしくは水性賦形剤における懸濁剤、液剤もしくは乳剤のような形態をとることができ、そして懸濁化剤、安定剤および／もしくは分散剤のような調合剤を含有することができる。複製欠損ウイルス製剤の液状製剤は、懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体もしくは水素化食用脂）；乳化剤（例えばレシチンもしくはアカシア）；非水性賦形剤（例えば扁桃油、油性エステル、エチルアルコールもしくは分別植物油）；および防腐剤（例えばメチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）のような製薬学的に許容しうる添加剤と一緒に常法により製造することができる。製剤はまた、バッファー塩を含有することもできる。あるいはまた、組成物は、使用前の適当な賦形剤、例えば発熱性物質除去滅菌水での構成用の粉末形態であることができる。
また包含されるのは、本発明の複製欠損ウイルスと組み合わせたもしくは混合したアジュバントの使用である。意図されるアジュバントには、無機塩アジュバントもしくは無機塩ゲルアジュバント、粒子アジュバント、微粒子アジュバント、粘膜アジュバントおよび免疫賦活アジュバントが包含されるがこれらに限定されるものではない。アジュバントは、本発明の複製欠損ウイルスとの混合物として患者に投与するか、もしくは本発明の複製欠損ウイルスと組み合わせて使用することができる。
５．２．２．治療目的に有用な複製欠損ウイルスベクターの製造のための組換えＤＮＡ構築物組成物
本発明は、増幅されそして複製欠損ウイルス粒子にパッケージングされる領域を特定するウイルスシグナルが隣接する導入遺伝子単位、アブレーション単位、および／もしくは１もしくは２つの二量化可能なドメイン単位を含んでなる組換えＤＮＡ構築物組成物を提供する。これらのＤＮＡ構築物は、複製欠損ウイルス組成物およびストックを作製するために用いることができる。
１つの態様において、組換えＤＮＡ構築物はウイルスゲノムのパッケージングシグナルが隣接する導入遺伝子単位を含んでなる。別の態様において、本発明の組成物はウイルスゲノムのパッケージングシグナルが隣接するアブレーション単位を含んでなる組換えＤＮＡ構築物を含んでなる。別の態様において、組換えＤＮＡ構築物はウイルスゲノムのパッケージングシグナルが隣接する二量化可能な単位を含んでなる。別の態様において、組換えＤＮＡ構築物はウイルスゲノムのパッケージングシグナルが隣接する導入遺伝子単位およびアブレーション単位を含んでなる。別の態様において、組換えＤＮＡ構築物はウイルスゲノムのパッケージングシグナルが隣接する導入遺伝子単位および二量化可能な単位を含んでなる。別の態様において、組換えＤＮＡ構築物はウイルスゲノムのパッケージングシグナルが隣接するアブレーション単位および二量化可能な単位を含んでなる。別の態様において、組換えＤＮＡ構築物は、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルが隣接する導入遺伝子単位、アブレーション単位および二量化可能な単位を含んでなる。
第１の転写単位は、転写を制御するプロモーターと機能的に結合した治療用製品をコードし、該単位は少なくとも１つのアブレーション認識部位を含有し（導入遺伝子単位）；そして（ｂ）第２の転写単位は、薬理学的作用物質に反応して転写を誘導するプロモータ
ーと機能的に結合したアブレーション認識部位に特異的なアブレーターもしくは結合ドメインに融合したそのフラグメントをコードする（アブレーション単位）。別の態様において、組換えＤＮＡ構築物は、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルが隣接する二量化可能なＴＦドメイン単位を含んでなる。
好ましい態様において、組換えＤＮＡ構築物組成物は、ウイルスパッケージングシグナル内にネスト化された（ｎｅｓｔｅｄ）二量化可能な単位をさらに含んでなる。１つの態様において、各単位は、第２の転写単位の誘導性プロモーターを調節する転写因子の二量化可能なドメインをコードし、ここで、（ｃ）第３の転写単位は、構成的プロモーターと機能的に結合した薬理学的作用物質の結合ドメインに融合した転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードし；そして（ｄ）第４の転写単位は、構成的プロモーターと機能的に結合した薬理学的作用物質の結合ドメインに融合した転写因子の活性化ドメインをコードする。別の態様において、（ｃ）もしくは（ｄ）の少なくとも一方は誘導性プロモーター下で発現される。特定の態様において、組換えＤＮＡ構築物組成物の第２の単位と機能的に結合しているプロモーターの転写を誘導する薬理学的作用物質は、インビトロで測定した場合に転写因子のドメインを二量化する二量化剤である。さらに別の特定の態様において、組換えＤＮＡ構築物組成物の第２の単位と機能的に結合しているプロモーターの転写を誘導する薬理学的作用物質はラパマイシンである。なおさらなる態様において、組換えＤＮＡ構築物は二量化可能な融合タンパク質単位を含んでなる。例えば、二量化可能な融合タンパク質単位は、（ａ）結合ドメインに融合した酵素の結合ドメインおよび（ｂ）結合ドメインに融合した酵素の触媒ドメインをコードすることができ、ここで、結合ドメインはＤＮＡ結合ドメインもしくは二量化剤の結合ドメインのいずれかである。
ウイルスゲノム（１つもしくは複数）内のスペースを節約するために、２シストロン性転写単位を設計することができる。例えば、第３および第４の転写単位はＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）を含有する２シストロン性単位として設計することができ、それは単一のプロモーターからのメッセージによる異種遺伝子産物の発現を可能にする。あるいはまた、単一のプロモーターは、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）において、自己切断ペプチド（例えばＴ２Ａ）もしくはプロテアーゼ認識部位（例えばフューリン）をコードする配列により相互に分離される２つもしくは３つの異種遺伝子（例えば第３および第４の転写単位）を含有するＲＮＡの発現を導くことができる。従って、ＯＲＦは、翻訳中（Ｔ２Ａの場合）もしくは後のいずれかに、個々のタンパク質に切断される単一のポリタンパク質をコードする。しかしながら、これらのＩＲＥＳおよびポリタンパク質系は、ＡＡＶパッケージングスぺースを節約するために用いることができるが、それらは同じプロモーターにより導くことができる成分の発現にのみ使用できることに留意すべきである。
特定の態様において、二量化可能な単位を含んでなる組換えＤＮＡ構築物組成物はＩＲＥＳを含んでなる。別の特定の態様において、第３および第４の転写単位（二量化可能なＴＦドメイン単位）を含んでなる組換えＤＮＡ構築物組成物はＩＲＥＳを含んでなる。別の特定の態様において、導入遺伝子単位を含んでなる組換えＤＮＡ構築物組成物はＩＲＥＳを含んでなる。別の特定の態様において、アブレーション単位を含んでなる組換えＤＮＡ構築物組成物はＩＲＥＳを含んでなる。別の特定の態様において、二量化可能な単位を含んでなる組換えＤＮＡ構築物組成物はＩＲＥＳを含んでなる。
特定の態様において、第３および第４の転写単位（二量化可能なＴＦドメイン単位）を含んでなる組換えＤＮＡ構築組成物はＴ２Ａ配列を含んでなる。別の特定の態様において、導入遺伝子単位を含んでなる組換えＤＮＡ構築物組成物はＴ２Ａ配列を含んでなる。別の特定の態様において、アブレーション単位を含んでなる組換えＤＮＡ構築物組成物はＴ２Ａ配列を含んでなる。別の特定の態様において、二量化可能なＴＦドメイン単位を含ん
でなる組換えＤＮＡ構築物組成物はＴ２Ａ配列を含んでなる。
１つの態様において、組換えＤＮＡ構築物組成物の第２の転写単位によりコードされるアブレーターは、第１の転写単位中のアブレーション認識部位に結合しそしてＤＮＡを切除するかもしくは取り除くエンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、メガヌクレアーゼもしくは人工ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼである。特定の態様において、アブレーターはｃｒｅであり、そしてアブレーション認識部位はＬｏｘＰであるか、もしくはアブレーターはＦＬＰであり、そしてアブレーション認識部位はＦＲＴである。別の態様において、組換えＤＮＡ構築物組成物の第２の転写単位によりコードされるアブレーターは、第１の転写単位のＲＮＡ転写産物を取り除くか、もしくは第１の転写単位のＲＮＡ転写産物の翻訳を抑制する干渉ＲＮＡ、リボザイムもしくはアンチセンスである。特定の態様において、アブレーターの転写はｔｅｔ−オン／オフ系、ｔｅｔＲ−ＫＲＡＢ系、ミフェプリストン（ＲＵ４８６）調節可能な系、タモキシフェン依存的な調節可能な系もしくはエクジソン依存的な調節可能な系により制御される。
組換えＤＮＡ構築物組成物は、複製欠損ウイルスベクターにおいて増幅されそしてパッケージングされることが所望される転写単位に隣接するパッケージングシグナルを含有する。特定の態様において、パッケージングシグナルはＡＡＶ ＩＴＲである。偽型ＡＡＶが産生される場合、ＩＴＲはキャプシドのＡＡＶ供給源と異なる供給源から選択される。例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶ９キャプシドなどとの使用のために選択することができる。
別の特定の態様において、ＡＡＶ ＩＴＲはキャプシドと同じ供給源、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ１０ ＩＴＲなどからであることができる。別の特定の態様において、組換えＤＮＡ構築物組成物はＡＡＶ ＩＴＲが隣接する第１の転写単位（導入遺伝子単位）、ならびにＡＡＶ ＩＴＲが隣接する第２（アブレーション単位）、ならびに任意の第３および第４の転写単位（二量化可能なＴＦドメイン単位）、および／もしくは二量化可能な融合タンパク質単位（１つもしくは複数）を含んでなる。さらに別の特定の態様において、組換えＤＮＡ構築物組成物は、ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する第２の転写単位（アブレーション単位）を含んでなり、そして第１（導入遺伝子単位）、第３および第４の転写単位（二量化可能なＴＦドメイン単位）にはＡＡＶ ＩＴＲが隣接する。好ましい態様において、ＰＩＴＡ系の転写単位は２つもしくはそれ以上の組換えＤＮＡ組成物に含有される。
特定の態様において、組換えＤＮＡ構築物は、以下の治療用製品のいずれか１つもしくはそれ以上をコードする導入遺伝子単位を含有する：ＨＩＶ感染性を中和する抗体もしくは抗体フラグメント、可溶性血管内皮成長因子受容体−ｌ（ｓＦｌｔ−ｌ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ヘムオキシゲナーゼ−ｌ（ＨＯ−１）または神経成長因子（ＮＧＦ）。特定の態様において、組換えＤＮＡ構築物は、治療遺伝子の転写を制御する以下のプロモーターのいずれか１つを含んでなる導入遺伝子単位を含有する：構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、細胞特異的プロモーター、誘導性プロモーターもしくは生理学的刺激に応答するプロモーター。
ＤＮＡ構築物は、複製欠損ウイルスストックを作製するために５．１．５節に記載の方法のいずれかにおいて用いることができる。
５．２．３．二量化剤の製薬学的組成物および製剤
本発明は、５．１．４節に記載の本発明の二量化剤を含んでなる製薬学的組成物を提供する。好ましい態様において、製薬学的組成物は製薬学的に許容しうる担体もしくは賦形
剤を含んでなる。場合により、これらの製薬学的組成物は、本明細書に記述されるような、獣医学的目的のために、例えば非ヒト哺乳類（例えば家畜）への送達のために適用される。
本発明の製薬学的組成物は、本発明の導入遺伝子単位の導入遺伝子を取り除くかもしくは切除するためにまたは導入遺伝子の転写産物を取り除くかもしくはその翻訳を抑制するために治療的に有効な用量で患者に投与することができる。治療的に有効な用量は、導入遺伝子の発現により引き起こされる症状、例えば毒性の改善をもたらすために、または導入遺伝子の発現の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％の抑制をもたらすために十分な製薬学的組成物の量をさす。
１つの態様において、約０．１〜５マイクログラム（μｇ）／キログラム（ｋｇ）の範囲である本発明の二量化剤を含んでなる製薬学的組成物の量が投与される。この目的のために、本発明の二量化剤を含んでなる製薬学的組成物は、７０ｋｇの体重の平均患者を処置するために約７ｍｇ〜約３５０ｍｇの範囲の用量において調合される。投与される本発明の二量化剤を含んでなる製薬学的組成物の量は：０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５もしくは５．０ｍｇ／ｋｇである。製剤中の二量化剤の用量は、７、８、９、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５もしくは７５０ｍｇである（７０ｋｇの体重の平均患者を処置するために）。これらの用量は、好ましくは経口投与される。これらの用量は１回もしくは繰り返して、例えば毎日、隔日、毎週、隔週もしくは毎月与えることができる。好ましくは、製薬学的組成物は約４〜６週の期間にわたって毎週１回与えられる。ある態様において、二量化剤を含んでなる製薬学的組成物は単回投与において、もしくは２回投与において、もしくは３回投与において、もしくは４回投与において、もしくは５回投与において、または６回投与もしくはそれ以上において患者に投与される。投薬間隔は、例えば、導入遺伝子の発現により引き起こされる症状、例えば毒性を改善するために、導入遺伝子の発現の抑制の必要がある医師の決定に基づいて決定することができる。例えば、ある態様において導入遺伝子アブレーションの必要性が緊急である場合、二量化剤を含んでなる製薬学的組成物の毎日投薬量を投与することができる。他の態様において、例えば導入遺伝子アブレーションの必要性がそれほど緊急でないかもしくは緊急でない場合、二量化剤を含んでなる製薬学的組成物の毎週投薬量を投与することができる。
本発明に従って使用する製薬学的組成物は、１つもしくはそれ以上の生理学的に許容しうる担体もしくは賦形剤を用いて常法において調合することができる。従って、二量化剤およびそれらの生理学的に許容しうる塩および溶媒和物は、吸入もしくは吹送（口もしくは鼻のいずれかを介した）による投与、経口、口腔、非経口、直腸もしくは経皮投与用に調合することができる。非侵襲的投与方法もまた意図される。
経口投与のために、製薬学的組成物は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えばラクトース、微結晶性セルロースもしくはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）；崩壊剤（例えばジャガイモ澱粉もしくは澱粉グリコール酸ナトリウム）；もしくは湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）のような製薬学的に許容しうる賦形剤と共に常法により製造される例えば錠剤もしくはカプセル剤の形態をとることができる。錠剤は、当該技術分野において周知である方法によりコーティングすることができる。経口投与用の液状製剤は、例えば、液剤、シロップ剤
もしくは懸濁剤の形態をとることができ、またはそれらは使用前の水もしくは他の適当な賦形剤での構成用の乾燥製品として提供することができる。そのような液状製剤は、懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体もしくは水素化食用脂）；乳化剤（例えばレシチンもしくはアカシア）；非水性賦形剤（例えば扁桃油、油性エステル、エチルアルコールもしくは分別植物油）；および防腐剤（例えばメチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）のような製薬学的に許容しうる添加剤と共に常法により製造することができる。製剤はまた、適切な場合にバッファー塩、香料、着色料および甘味料を含有することもできる。
経口投与用の製剤は、二量化剤の制御放出を与えるように好適に調合することができる。
口腔投与用に、組成物は常法において調合される錠剤もしくはトローチ剤の形態をとることができる。
吸入による投与用に、本発明に従って使用する二量化剤は、適当な推進剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素もしくは他の適当なガスを用いて、加圧パックもしくはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示の形態において都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は定量を送達するために弁を備えることにより決定することができる。吸入具もしくは吸入器において使用する例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、二量化剤およびラクトースもしくは澱粉のような適当な粉末ベースの粉末混合物を含有して調合することができる。
二量化剤は注射による、例えばボーラス注射もしくは連続注入による非経口投与用に調合することができる。注射用製剤は、防腐剤を加えて、単位投与形態物において、例えばアンプルにおいてもしくは複数回投与容器において提供することができる。組成物は油性もしくは水性賦形剤中の懸濁剤、液剤もしくは乳剤のような形態をとることができ、そして懸濁化剤、安定剤および／もしくは分散剤のような調合剤を含有することができる。あるいはまた、有効成分は、使用前の適当な賦形剤、例えば発熱物質除去滅菌水での構成用の粉末形態においてであることができる。
二量化剤はまた、例えば、ココアバターもしくは他のグリセリドのような通常の座薬ベースを含有する、座薬もしくは停留かん腸のような直腸組成物において調合することもできる。
前記の製剤に加えて、二量化剤はまたデポー製剤として調合することもできる。そのような長時間作用型製剤は埋め込みにより（例えば皮下にもしくは筋肉内に）もしくは筋肉内注射により投与することができる。従って、例えば、二量化剤は適当なポリマーもしくは疎水性材料（例えば許容しうる油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂と、あるいは難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として調合することができる。
組成物は、所望に応じて、有効成分を含有する１つもしくはそれ以上の単位投与形態物を含有することができるパックもしくはディスペンサー装置において提供することができる。パックは例えば金属もしくはプラスチックホイル、例えばブリスターパックを含んでなることができる。パックもしくはディスペンサー装置には、投与のための説明書を添付することができる。
また包含されるのは、本発明の二量化剤と組み合わせたもしくは混合したアジュバントの使用である。意図されるアジュバントには、無機塩アジュバントもしくは無機塩ゲルア
ジュバント、粒子アジュバント、微粒子アジュバント、粘膜アジュバントおよび免疫賦活アジュバントが包含されるがこれらに限定されるものではない。アジュバントは、本発明の二量化剤との混合物として患者に投与するか、もしくは本発明の二量化剤と組み合わせて使用することができる。
５．３．疾病および疾患の処置
本発明は、遺伝子治療に適している任意の疾病もしくは疾患を処置する方法を提供する。１つの態様において、「処置」もしくは「処置すること」は、疾病もしくは疾患、またはその少なくとも１つの認められる症状の改善をさす。別の態様において、「処置」もしくは「処置すること」は、必ずしも患者により認識されない、疾病もしくは疾患と関連する少なくとも１つの測定可能な物理的パラメーターの改善をさす。さらに別の態様において、「処置」もしくは「処置すること」は、物理的に、例えば認められる症状の安定化、生理的に、例えば物理的パラメーターの安定化のいずれか、もしくは両方で疾病もしくは疾患の進行を抑制することをさす。癌、免疫疾患および獣医学的症状を包含する他の症状もまた処置することができる。
５．３．１．標的疾病
本発明の方法により処置することができる疾病および疾患のタイプには、加齢性黄斑変性症；糖尿病性網膜症；感染症、例えばＨＩＶ、汎発性インフルエンザ、生物兵器のカテゴリー１および２病原体、もしくは任意の新たに発生するウイルス感染；自己免疫疾患；癌；多発性骨髄腫；糖尿病；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；Ｃ型肝炎；多発性硬化症；アルツハイマー病；パーキンソン病；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病；てんかん；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；関節炎症、関節炎；心筋梗塞（ＭＩ）；鬱血性心不全（ＣＨＦ）；血友病Ａ；または血友病Ｂが包含されるがこれらに限定されるものではない。
本発明の方法により処置するかもしくは防ぐことができる感染症は、ウイルス、細菌、真菌、原虫、蠕虫および寄生虫が包含されるがこれらに限定されるものではない感染性病原体により引き起こされる。本発明は、細胞内病原体により引き起こされる感染症を処置するかもしくは防ぐことに限定されない。多数の医学関連微生物が文献に詳細に記述されている、例えば、その全内容が本明細書に引用することにより本明細書に組み込まれる、Ｃ．Ｇ．Ａ Ｔｈｏｍａｓ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ Ｔｉｎｄａｌｌ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ １９８３を参照。
本発明の方法により処置するかもしくは防ぐことができる細菌感染もしくは疾病は、マイコバクテリア（例えば、マイコバクテリア・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリア・ボビス（Ｍ ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリア・アビウム（Ｍ ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリア・レプラ（Ｍ ｌｅｐｒａｅ）もしくはマイコバクテリア・アフリカヌム（Ｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ））、リケッチア、マイコプラズマ、クラミジアおよびレジオネラのような、その生活環において細胞内段階を有する細菌が包含されるがこれらに限定されるものではない細菌により引き起こされる。意図される細菌感染の他の例には、グラム陽性バシラス（例えば、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えばバシラス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、エリジペロトリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）種）、グラム陰性細菌（例えば、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ヘモフィルス（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、シュードモナ
ス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）およびエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）種）、スピロヘータ菌（ライム病を引き起こすボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）を包含するボレリア種）、嫌気性細菌（例えばアクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）およびクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種）、グラム陽性および陰性球菌、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、ニューモコッカス（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）種、スタヒロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種により引き起こされる感染が包含されるがこれらに限定されるものではない。感染性細菌の具体例には：ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、マイコバクテリア・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリア・アビウム（Ｍ ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリア・イントラセルラエ（Ｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリア・カンサイ（Ｍ ｋａｎｓａｉｉ）、マイコバクテリア・ゴルドナエ（Ｍ ｇｏｒｄｏｎａｅ）、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群ストレプトコッカス）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群ストレプトコッカス）、ストレプトコッカス・ビリダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ）、ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、バシラス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｒａｃｉｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、エリシペロトリックス・ルシオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、クロストリジウム・パーフューリンゲン（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバシラス・モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、トレポネーマ・パリジウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｉｕｍ）、トレポネーマ・ペルテヌエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）およびアクチノマイセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅ ｉｓｒａｅｌｌｉ）が包含されるがこれらに限定されるものではない。
ヒトおよび非ヒト脊椎動物の両方の感染性ウイルスには、レトロウイルス、ＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスが包含される。ヒトにおいて見出されているウイルスの例には：レトロウイルス科（例えばＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶもしくはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶとも呼ばれる）もしくはＨＩＶ−ＩＩＩのようなヒト免疫不全ウイルス）；およびＨＩＶ−ＬＰのような他の分離株；ピコルナウイルス科（例えばポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（例えば胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科
（例えばウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラウイルス科（例えばデングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えばコロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えばエボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えばパラインフルエンザウイルス、おたふくかぜウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えばインフルエンザウイルス）；ブンガウイルス科（例えばハンターンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えばレオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（大部分のアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；ポックスウイルス科（天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびイリドウイルス科（例えばアフリカブタ熱ウイルス）；ならびに未分類のウイルス（例えば海綿状脳症の病因病原体、デルタ肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライト（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ）であると考えられている）、非Ａ、非Ｂ肝炎の病原体（クラス１＝内部伝染；クラス２＝非経口的伝染（すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォークおよび関連ウイルス、ならびにアストロウイルス）が包含されるがこれらに限定されるものではない。
本発明の方法により処置するかもしくは防ぐことができる寄生虫症には、アメーバ症、マラリア、リーシュマニア、コクシジウム、ランブル鞭毛虫症、クリプトスポリジウム症、トキソプラズマ症およびトリパノソーマ症が包含されるがこれらに限定されるものではない。また包含されるのは、回虫症、十二指腸虫症、鞭虫症、糞線虫症、トキソカラ症、旋毛虫病、オンコセルカ症、フィラリアおよびディロフィラリア症のようなしかしこれらに限定されるものではない様々な蠕虫による感染である。また包含されるのは、住血吸虫症、肺吸虫症および肝吸虫症が包含されるがこれらに限定されるものではない様々な吸虫による感染である。これらの疾病を引き起こす寄生虫は、それらが細胞内もしくは細胞外であるかに基づいて分類することができる。「細胞内寄生虫」は、本明細書において用いる場合、その全生活環が細胞内である寄生虫である。ヒト細胞内寄生虫の例には、リーシュマニア種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐｐ．）、プラスモジウム種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、トキソプラズマ・ゴンジイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、バベシア種（Ｂａｂｅｓｉａ ｓｐｐ．）およびトリキネラ・スピラリス（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ）が包含される。「細胞外寄生虫」は、本明細書において用いる場合、その全生活環が細胞外である寄生虫である。ヒトに感染することができる細胞外寄生虫には、エンタモエバ・ヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、ジアルジア・ランブリア（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、エンテロシトゾオン・ビエネウシ（Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎ ｂｉｅｎｅｕｓｉ）、ネグレリア（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ）およびアカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）ならびに大部分の寄生蠕虫が包含される。寄生虫のさらに別の種類は、主に細胞外であるがそれらの生活環における重要な段階で偏性細胞内存在を有すると定義される。そのような寄生虫は、「偏性細胞内寄生虫」と本明細書において呼ばれる。これらの寄生虫はそれらの一生の大部分もしくはそれらの一生のほんの一部を細胞外環境において存在することができるが、それらは全てそれらの生活環において少なくとも１つの偏性細胞内段階を有する。寄生虫のこの後者のカテゴリーには、トリパノソーマ・ローデシエンス（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ）およびトリパノソーマ・ガンビエンス（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｇａｍｂｉｅｎｓｅ）、イソスポラ種（Ｉｓｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）、クリプトスポリジウム種（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ）、エイメリア種（Ｅｉｍｅｒｉａ ｓｐｐ．）、ネオスポラ種（Ｎｅｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）、サルコシスティス種（Ｓａ
ｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐｐ．）およびシストソーマ種（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｓｐｐ．）が包含される。
本発明の方法により処置するかもしくは防ぐことができる癌のタイプには、ヒト肉腫および癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉種、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛腫、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮性癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫；白血病、例えば、急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）；および真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症および重鎖病が包含されるがこれらに限定されるものではない。
５．３．２．ウイルスベクターの投薬量および投与の方法
本発明の複製欠損ウイルス組成物は、当該技術分野において既知である任意の方法および処方計画によりヒト患者に投与することができる。例えば、本発明の複製欠損ウイルス組成物は、様々な治療用途におけるＡＡＶベクターを使用する方法に関する以下の特許および特許出願：その各々が引用することによりその全部が組み込まれる、米国特許第７，２８２，１９９号；第７，１９８，９５１号；米国特許出願公開第ＵＳ ２００８−００７５７３７号；第ＵＳ ２００８−００７５７４０号；国際特許出願公開第ＷＯ ２００３／０２４５０２号；第ＷＯ ２００４／１０８９２２号；第ＷＯ ２００５１０３３３２１号に記載の任意の方法によりヒト患者に投与することができる。
１つの態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は、門静脈の腸間膜支流（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ ｔｒｉｂｕｔａｒｙ）の注射により肝臓を介して全身的に送達される。別の態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は、例えば大腿四頭筋もしくは二頭筋への筋肉内注射により筋肉を介して全身的に送達される。別の態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は、両側定位固定注射によりマイネルト基底核（ＮＢＭ）を含有する脳の基底前脳領域に送達される。別の態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は、両側被殻内および／もしくは黒質内注射によりＣＮＳに送達される。別の態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は、関節内注射により関節に送達される。別の態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は、冠動脈内注入により心臓に送達される。別の態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は、網膜下腔への注射により網膜に送達される。
別の態様において、複製欠損ウイルス組成物の量は、ヒト患者に約１．０ｘ１０８ゲノムコピー（ＧＣ）／キログラム（ｋｇ）〜約１．０ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇ、そして好ましくは１．０ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ〜１．０ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇの範囲である有効用量で投与される。好ましくは、投与される複製欠損ウイルス組成物の量は１．０ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、５．０ｘ１０８ＧＣ／ｋｇ、１．０ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、５．０ｘ１０９ＧＣ／ｋｇ、１．０ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、５．０ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇ、１．０ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ、５．０ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇもしくは１．０ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、５．０ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇ、１．０ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、５．０ｘ１０１３ＧＣ／ｋｇ、１．０ｘ１０１４ＧＣ／ｋｇである。
これらの用量は１回もしくは繰り返して、例えば毎日、隔日、毎週、隔週もしくは毎月
、または適当な導入遺伝子発現が患者において検出されるまで与えることができる。１つの態様において、複製欠損ウイルス組成物は約４〜６週の期間にわたって毎週１回与えられ、そして投与の方法もしくは部位は好ましくは各投与によって異なる。反復注射は、導入遺伝子発現の完全なアブレーションに必要とされる可能性が高い。１回もしくはそれ以上の注射の間隔の後に同じ部位を繰り返すことができる。また、分割注射を与えることもできる。従って、例えば、用量の半分をある部位に、そしてもう半分を同じ日に別の部位に与えることができる。
２つもしくはそれ以上のウイルスストックにパッケージングされる場合、複製欠損ウイルス組成物は同時にもしくは逐次投与することができる。２つもしくはそれ以上のウイルスストックが逐次送達される場合、後に送達されるウイルスストックは、最初のウイルスストックの投与の１、２、３もしくは４日後に送達することができる。好ましくは、２つのウイルスストックが逐次送達される場合、２番目に送達されるウイルスストックは最初のウイルスストックの送達の１もしくは２日後に送達される。
本発明の複製欠損ウイルス組成物のゲノムコピー（ＧＣ）数を決定するために当該技術分野において既知である任意の方法を用いることができる。ＡＡＶ ＧＣ数の滴定を行うための１つの方法は下記の通りである：精製されたＡＡＶベクターサンプルを最初にＤＮアーゼで処理して製造工程からキャプシド封入されていないＡＡＶゲノムＤＮＡもしくは混入プラスミドＤＮＡを除く。ＤＮアーゼ耐性粒子を次に熱処理に供してキャプシドからゲノムを遊離させる。遊離したゲノムを次にウイルスゲノムの特定領域（通常はポリＡシグナル）を標的とするプライマー／プローブ組を用いてリアルタイムＰＣＲにより定量する。
１つの態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は、約３．０ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇの用量で門静脈の腸間膜支流の注射により肝臓を介して全身的に送達される。別の態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は、約５．０ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇの用量で大腿四頭筋もしくは二頭筋のいずれかへの２０回までの筋肉内注射により筋肉を介して全身的に送達される。別の態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は、約５．０ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇの用量で両側定位固定注射によりマイネルト基底核（ＮＢＭ）を含有する脳の基底前脳領域に送達される。別の態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は、約１．０ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ〜約５．０ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇの範囲の用量で両側被殻内および／もしくは黒質内注射によりＣＮＳに送達される。別の態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は、炎症性関節炎の処置のために関節容量のｍＬ当たり約１．０ｘ１０１１ＧＣの用量で関節内注射により関節に送達される。別の態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は、約１．４ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ〜約３．０ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇの範囲の用量で冠動脈内注入注射により心臓に送達される。別の態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は、約１．５ｘ１０１０ＧＣ／ｋｇの用量で網膜下腔への注射により網膜に送達される。
表２は、特定の疾病を処置するために本発明のＰＩＴＡ系により特定の組織／臓器を介して送達することができる導入遺伝子の例を示す。
Figure 0005922095
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１つの態様において、ヒト患者における加齢性黄斑変性症を処置する方法は、治療用製品がＶＥＧＦアンタゴニストである、複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる。
別の態様において、ヒト患者における血友病Ａを処置する方法は、治療用製品が第ＶＩＩＩ因子もしくはそのバリアント、例えばヘテロ二量体の軽鎖および重鎖ならびにＢ欠失ドメイン；米国特許第６，２００，５６０号および米国特許第６，２２１，３４９号である、複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる。第ＶＩＩＩ因子遺伝子は２３５１アミノ酸をコードし、そしてタンパク質は、アミノ末端から終末カルボキシ末端へＡ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２と表される６つのドメインを有する［Ｗｏｏｄ
ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：３３０（１９８４）；Ｖｅｈａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：３３７（１９８４）；およびＴｏｏｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：３３７（１９８４）］。ヒト第ＶＩＩＩ因子は細胞内でプロセシングされてＡ１、Ａ２およびＢドメインを含有する重鎖ならびにＡ３、Ｃ１およびＣ２ドメインを含有する軽鎖を主に含んでなるヘテロ二量体をもたらす。一本鎖ポリペプチドおよびヘテロ二量体は両方とも、Ｂドメインを遊離しそしてＡ１およびＡ２ドメインからなる重鎖
をもたらす、Ａ２およびＢドメイン間のトロンビン切断により活性化されるまで、不活性前駆体として血漿中を循環する。Ｂドメインは、タンパク質の活性化された凝血促進型において欠失している。さらに、天然タンパク質において、Ｂドメインに隣接する２つのポリペプチド鎖（「ａ」および「ｂ」）は２価のカルシウム陽イオンに結合している。ある場合において、ミニ遺伝子は、１０アミノ酸のシグナル配列をコードする第ＶＩＩＩ因子重鎖の最初の５７塩基対、ならびにヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化配列を含んでなる。代わりの態様において、ミニ遺伝子はＡ１およびＡ２ドメイン、ならびにＢドメインのＮ末端から５アミノ酸、および／もしくはＢドメインのＣ末端の８５アミノ酸、ならびにＡ３、Ｃ１およびＣ２ドメインをさらに含んでなる。さらに他の態様において、第ＶＩＩＩ因子重鎖および軽鎖をコードする核酸は、Ｂドメインの１４アミノ酸をコードする４２の核酸により分離される単一のミニ遺伝子において提供される［米国特許第６，２００，５６０号］。第ＶＩＩＩ因子の天然に存在するおよび組換え型の例は、米国特許第５，５６３号、０４５号、米国特許第５，４５１，５２１号、米国特許第５，４２２，２６０号、米国特許第５，００４，８０３号、米国特許第４，７５７，００６号、米国特許第５，６６１，００８号、米国特許第５，７８９，２０３号、米国特許第５，６８１，７４６号、米国特許第５，５９５，８８６号、米国特許第５，０４５，４５５号、米国特許第５，６６８，１０８号、米国特許第５，６３３，１５０号、米国特許第５，６９３，４９９号、米国特許第５，５８７，３１０号、米国特許第５，１７１，８４４号、米国特許第５，１４９，６３７号、米国特許第５，１１２，９５０号、米国特許第４，８８６，８７６号；国際特許公開第ＷＯ ９４／１１５０３号、第ＷＯ ８７／０７１４４号、第ＷＯ ９２／１６５５７号、第ＷＯ ９１／０９１２２号、第ＷＯ ９７／０３１９５号、第ＷＯ ９６／２１０３５号および第ＷＯ ９１／０７４９０号；欧州特許出願第ＥＰ
０ ６７２ １３８号、第ＥＰ ０ ２７０ ６１８号、第ＥＰ ０ １８２ ４４８号、第ＥＰ ０ １６２ ０６７号、第ＥＰ ０ ７８６ ４７４号、第ＥＰ ０ ５３３ ８６２号、第ＥＰ ０ ５０６ ７５７号、第ＥＰ ０ ８７４ ０５７号、第ＥＰ
０ ７９５ ０２１号、第ＥＰ ０ ６７０ ３３２号、第ＥＰ ０ ５００ ７３４号、第ＥＰ ０ ２３２ １１２号および第ＥＰ ０ １６０ ４５７号；Ｓａｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ＸＸｔｈ Ｉｎｔ．Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ｆｅｄ．Ｏｆ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ（１９９２）ならびにＬｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３２：１９（１９９５）を包含する特許および科学文献に見出すことができる。
別の態様において、ヒト患者における血友病Ｂを処置する方法は、治療用製品が第ＩＸ因子である、複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる。
別の態様において、ヒト患者における鬱血性心不全を処置する方法は、治療用製品がインシュリン様成長因子もしくは肝細胞成長因子である、複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる。
別の態様において、ヒト患者における中枢神経系疾患を処置する方法は、治療用製品が神経成長因子である、複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる。
５．４．導入遺伝子発現および望ましくない副作用をモニタリングすること
５．４．１．導入遺伝子発現をモニタリングすること
本発明の複製欠損ウイルス組成物の投与後に、導入遺伝子発現を当業者に既知である任意の方法によりモニターすることができる。投与した導入遺伝子の発現は、例えば、該導入遺伝子によりコードされるタンパク質および／もしくはＲＮＡを定量することにより、容易に検出することができる。従って、タンパク質発現を検出しそして／もしくは可視化するための免疫測定法（例えば、ウェスタンブロット、免疫沈降続いてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、免疫細胞化学、切片への
免疫組織化学染色など）および／もしくは遺伝子をコードするｍＲＮＡをそれぞれ検出しそして／もしくは可視化することにより遺伝子発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチューハイブリダイゼーションなど）が包含されるがこれらに限定されるものではない当該技術分野において標準的な多数の方法を用いることができる。ウイルスゲノムおよび導入遺伝子由来のＲＮＡはまた、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により検出することもできる。そのようなアッセイは日常的であり、そして当該技術分野において既知である。免疫沈降プロトコルは、一般に、プロテインホスファターゼおよび／もしくはプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジウム酸ナトリウム）を補足したＲＩＰＡバッファー（１％ＮＰ−４０もしくはＴｒｉｔｏｎ ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２の０．０１Ｍリン酸ナトリウム、１％トラシロール）のような溶解バッファーに細胞の集団を溶解すること、興味のある抗体を細胞溶解物に加えること、４０℃で一定期間（例えば１〜４時間）インキュベーションすること、プロテインＡおよび／もしくはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解物に加えること、４０℃で約１時間もしくはそれ以上の間インキュベーションすること、ビーズを溶解バッファー中で洗浄することおよびビーズをＳＤＳ／サンプルバッファーに再懸濁することを含んでなる。特定の抗原を免疫沈降させる興味のある抗体の能力は、例えばウェスタンブロット分析により評価することができる。当業者は、抗原への抗体の結合を増加しそしてバックグラウンドを減らすために改変することができるパラメーターに関して精通している（例えば、セファロースビーズで細胞溶解物を事前にきれいにすること）。
ウェスタンブロット分析は、一般に、タンパク質サンプルを調製すること、ポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量により８％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）におけるタンパク質サンプルの電気泳動，ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦもしくはナイロンのような膜にタンパク質サンプルを移すこと、ブロッキング溶液（例えば、３％ＢＳＡもしくは無脂肪乳を有するＰＢＳ）中で膜をブロッキングすること、膜を洗浄バッファー（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）中で洗浄すること、ブロッキングバッファーに希釈した一次抗体（興味のある抗体）と膜をインキュベーションすること、膜を洗浄バッファー中で洗浄すること、ブロッキングバッファーに希釈した酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）もしくは放射性分子（例えば、３２ｐもしくは１２５Ｉ）に結合した二次抗体（これは一次抗体を認識する、例えば抗ヒト抗体）と膜をインキュベーションすること、膜を洗浄バッファー中で洗浄することおよび抗原の存在を検出することを含んでなる。当業者は、検出されるシグナルを増加するためにそしてバックグラウンドノイズを減らすために改変することができるパラメーターに関して精通している。
ＥＬＩＳＡは、一般に、抗原を準備すること、抗原で９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを被覆すること、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）のような検出可能な物質に結合した興味のある抗体をウェルに加えそして一定期間インキュベーションすること、および抗原の存在を検出することを含んでなる。ＥＬＩＳＡにおいて、興味のある抗体は検出可能な物質に結合される必要はなく；代わりに、検出可能な化合物に結合した二次抗体（これは興味のある抗体を認識する）をウェルに加えることができる。さらに、抗原でウェルを被覆する代わりに、抗体をウェルに被覆することができる。この場合、検出可能な物質に結合した二次抗体は、被覆したウェルに興味のある抗原を加えた後に加えることができる。当業者は、検出されるシグナルを増加するために改変することができるパラメーターおよび当該技術分野において既知であるＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関して精通している。
表現型もしくは生理的読み出しもまた、導入遺伝子の発現を評価するために用いること
ができる。例えば、疾病もしくはそれと関連する症状の重症度を改善する導入遺伝子産物の能力を評価することができる。さらに、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャンおよび中和抗体アッセイを行うことができる。
さらに、導入遺伝子産物の活性を当業者に周知である技術を利用して評価することができる。例えば、導入遺伝子産物の活性は、細胞二次メッセンジャー（例えば、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導を検出すること、タンパク質のリン酸化を検出すること、転写因子の活性化を検出すること、または細胞応答、例えば、細胞に基づくアッセイによって細胞分化もしくは細胞増殖もしくはアポトーシスを検出することにより決定することができる。細胞二次メッセンジャーもしくはタンパク質のリン酸化のレベルの改変は、例えば、当業者に周知でありそして本明細書に記述される免疫測定法により決定することができる。転写因子の活性化もしくは抑制は、例えば、電気泳動移動度シフトアッセイにより検出することができ、そして細胞増殖のような細胞応答は、例えば、トリパンブルー細胞計数、３Ｈ−チミジンの取り込みおよびフローサイトメトリーにより検出することができる。
５．４．２．望ましくない副作用／毒性をモニタリングすること
患者への本発明の複製欠損ウイルス組成物の投与後に、導入遺伝子を取り除くかもしくは切除するために、または導入遺伝子の転写産物を取り除くかもしくはその翻訳を妨げるために二量化剤（５．２．３節に記述される）を含んでなる製薬学的組成物を患者に投与するかどうかを決定するために望ましくない副作用および／もしくは毒性を当業者に既知である任意の方法によりモニターすることができる。
本発明は、（ａ）患者から得られる組織サンプルにおける治療用製品の発現を検出すること、および（ｂ）該患者における治療用製品の存在と関連する副作用を検出することを含んでなり、ここで、該患者における治療用製品の存在と関連する副作用の検出は、アブレーターの発現を誘導する薬理学的作用物質を投与する必要性を示す、治療用製品およびアブレーターをコードする複製欠損ウイルス組成物を受けた患者に治療用製品を取り除くための薬理学的作用物質をいつ投与するかを決定する方法を提供する。
本発明はまた、該患者から得られる組織サンプルにおける治療用製品の存在と関連する毒性の生化学マーカーのレベルを検出することを含んでなり、ここで、毒性を表す該マーカーのレベルはアブレーターの発現を誘導する薬理学的作用物質を投与する必要性を示す、治療用製品およびアブレーターをコードする複製欠損ウイルス組成物を受けた患者に治療用製品を取り除くための薬理学的作用物質をいつ投与するかを決定する方法も提供する。毒性の生化学マーカーは当該技術分野において既知であり、そして異常腎臓機能のマーカー（例えば、腎臓毒性に関する上昇した血液尿素窒素（ＢＵＮ）およびクレアチニン）；全身性炎症のマーカーとしての増加した赤血球沈降速度；骨髄毒性のマーカーとしての低い白血球数、血小板もしくは赤血球などのようなしかしこれらに限定されるものではない臨床病理学血清測定が包含される。肝臓毒性と関連する異常を検出するために肝臓機能検査（ｌｆｔ）を行うことができる。そのようなｌｆｔの例には、アルブミン、アラニントランスアミナーゼ、アルパラギン酸トランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼ、ビリルビンおよびガンマグルタミルトランスペプチダーゼの検査が包含される。
本発明は、アブレーターの発現を誘導する薬理学的作用物質での処置の後に患者からの組織サンプルにおける治療遺伝子産物をコードするＤＮＡ、そのＲＮＡ転写産物もしくはそのコードタンパク質の存在を決定する方法をさらに含んでなり、ここで、治療遺伝子産物をコードするＤＮＡ、そのＲＮＡ転写産物もしくはそのコードタンパク質の存在は、アブレーターの発現を誘導する薬理学的作用物質での反復処置の必要性を示す。
本発明の複製欠損ウイルス組成物を受けている患者においてモニターすることができる１つの望ましくない副作用は、分泌された導入遺伝子産物への抗体反応である。分泌された導入遺伝子産物へのそのような抗体反応は、抗体が分泌された導入遺伝子産物にもしくは導入遺伝子産物とエピトープを共有する自己抗原に結合する場合に起こる。導入遺伝子産物が抗体である場合、該反応は「抗イディオタイプ」反応と呼ばれる。可溶性抗原が血管コンパートメントにおいて抗体と結合すると、それらは様々な臓器の血管床において非特異的に捕捉される循環免疫複合体を形成し、血清病、血管炎、腎炎、血管炎を有する全身性エリテマトーデスもしくは糸球体腎炎のような、いわゆる免疫複合体病を引き起こし得る。
分泌された導入遺伝子産物への別のより全身性の望ましくない免疫反応において、導入遺伝子産物への抗体反応は１つもしくはそれ以上の自己抗原への交差免疫反応をもたらし、ほとんどあらゆる種類の自己免疫を引き起こす。自己免疫は、免疫系が自己としてそれ自身の構成要素を認識できないことであり、それはそれ自体の細胞および組織に対する免疫反応を可能にし、自己免疫疾患を引き起こす。本発明の導入遺伝子産物への自己免疫は、強直性脊椎炎、クローン病、特発性炎症性腸疾患、皮膚筋炎、Ｉ型糖尿病、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、抗ガングリオシド、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病、エリテマトーデス、混合性結合組織病、重症筋無力症、ナルコレプシー、尋常性天疱瘡、悪性貧血、乾癬、乾癬性関節炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、関節リウマチ、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」としても知られている）、潰瘍性大腸炎（２つのタイプの特発性炎症性腸疾患「ＩＢＤ」の１つ）、血管炎およびウェゲナー肉芽腫症が包含されるがこれらに限定されるものではない任意の自己免疫疾患を引き起こし得る。
免疫複合体病および自己免疫は、当該技術分野において既知である任意の方法により本発明の複製欠損ウイルス組成物で処置されている患者において検出しそして／もしくはモニターすることができる。例えば、免疫複合体病および／もしくは自己免疫を測定するために行うことができる方法は免疫複合体試験であり、その目的は血液中の循環免疫複合体を示すこと、免疫複合体病および／もしくは自己免疫疾患の重症度を評価すること、ならびに二量化剤の投与後の反応をモニターすることである。免疫複合体試験は、当業者に既知である任意の方法により行うことができる。特に、免疫複合体試験は、その各々が引用することによりその全部が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，１４１，９６５号、米国特許第４，２１０，６２２号、米国特許第４，２１０，６２２号、米国特許第４，３３１，６４９号、米国特許第４，５４４，６４０号、米国特許第４，７５３，８９３号および米国特許第５，８８８，８３４号に記載の方法のいずれか１つもしくはそれ以上を用いて行うことができる。
当該技術分野において既知である方法を用いる以下の自己免疫疾患のいずれか１つにより引き起こされるかもしくはそれと関連する症状の検出は、ヒト患者に投与した複製欠損ウイルス組成物によりコードされた分泌導入遺伝子産物により引き起こされる自己免疫もしくは免疫複合体病を検出するさらに別の方法である：強直性脊椎炎、クローン病、特発性炎症性腸疾患、皮膚筋炎、Ｉ型糖尿病、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、抗ガングリオシド、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病、エリテマトーデス、混合性結合組織病、重症筋無力症、ナルコレプシー、尋常性天疱瘡、悪性貧血、乾癬、乾癬性関節炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、関節リウマチ、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」としても知られている）、潰瘍性大腸炎（２つのタイプの特発性炎症性腸疾患「ＩＢＤ」の１つ）、血管炎およびウェゲナー肉芽腫症。
自己免疫および免疫複合体病に起因する共通疾患は、血管の炎症である血管炎である。
血管炎は、肥厚、弱化、狭窄および瘢痕化を包含する血管壁の変化を引き起こす。血管炎を診断するために用いることができる一般的な試験および方法には、赤血球沈降速度、Ｃ反応性タンパク質試験、完全血球算定および抗好中球細胞質抗体試験のような血液検査；タンパク質の増加した量を示すことができる尿検査；大動脈およびその支流のような、より大きい動脈が罹患しているかどうかを決定するためのＸ線、超音波、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）のような画像検査；血管のＸ線（血管造影図）；ならびに血管の一部の生検を行うことが包含されるがこれらに限定されるものではない。本発明の方法により処置した患者において認めることができる血管炎の一般的な兆候および症状には、熱、疲労、体重減少、筋肉および関節痛、食欲不振、およびしびれもしくは衰弱のような神経障害が包含されるがこれらに限定されるものではない。
本発明の複製欠損ウイルス組成物の投与が局所的導入遺伝子発現をもたらす場合、導入遺伝子を取り除くかもしくは切除するために、または導入遺伝子の転写産物を取り除くかもしくはその翻訳を抑制するために二量化剤（５．２．３節に記述される）を含んでなる製薬学的組成物を患者に投与するかどうかを決定するために局所的毒性を検出しそして／もしくはモニターすることができる。例えば、加齢性黄斑変性症の処置のためにＶＥＧＦ阻害剤をコードする導入遺伝子単位を含んでなる複製欠損ウイルス組成物を網膜に投与する場合、ＶＥＧＦは網膜において神経防護的である得ると考えられ、そしてそれを抑制することは神経節細胞の脱落のために視力を悪化させ得る。従って、そのような複製欠損ウイルス組成物の投与後に、視力を定期的にモニターすることができ、そして当該技術分野において既知である任意の方法、例えば網膜の非侵襲的画像診断により神経節細胞脱落を検出することができる。さらに、ＶＥＧＦ抑制はまた網膜において必要な微小血管系を枯渇させる可能性もあり、それはフルオレセイン血管造影もしくは当該技術分野において既知である任意の他の方法によりモニターすることができる。
一般に、患者に二量化剤（５．２．３節に記述される）を含んでなる製薬学的組成物を投与するかどうかを決定するために本発明の複製欠損ウイルスの投与後に患者において検出する／モニターすることができる副作用には、腸もしくは任意の臓器の出血、難聴、視力の喪失、腎不全、認知症、鬱病、糖尿病、下痢、嘔吐、勃起障害、熱、緑内障、脱毛、頭痛、高血圧症、心臓動悸、不眠症、乳酸アシドーシス、肝臓損傷、しみ、血栓症、持続勃起症、横紋筋融解症、発作、眠気、食欲増加、食欲減退、めまい、脳卒中、心不全もしくは心臓発作が包含されるがこれらに限定されるものではない。前述の症状もしくは任意の他の副作用を検出するために当該技術分野において一般に使用される任意の方法を用いることができる。
アブレーター治療；いったん本発明の方法により患者に送達された導入遺伝子産物が患者において望ましくない副作用を引き起こしていることが決定されると、二量化剤を含んでなる製薬学的組成物を本明細書の５．２．３節に記述される処方計画、投与の方法、もしくは用量のいずれかを用いて患者に投与することができる。
本発明は、本明細書に記述される特定の態様によって範囲が限定されるものではない。実際に、記述されるものに加えて本発明の様々な改変が、上記の記述および添付の図面から当業者に明らかになる。そのような改変は、添付の請求項の範囲内に入るものとする。
６．実施例１：スケールでの（ａｔ ｓｃａｌｅ）組換えＡＡＶベクターの製造
本実施例は、哺乳類細胞のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクションおよび濃縮した培養上清のヨージキサノール勾配遠心分離に基づく高収率の組換えＡＡＶ製造方法を記述する。新規の方法で製造されるＡＡＶベクターは、小規模の塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配精製ベクターと比較した場合にインビトロおよびインビボの両方において同等のもしくはより良い形質導入を示す。さらに、記述されるヨージキサノール勾配精製方法は空キャプシドから機能性ベクター粒子を効果的に分離する（前臨床研究中の毒性および望ましくない免疫反応を減らすための望ましい特性）。
６．１．導入
近年、臨床遺伝子治療用途のための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの使用は増えており、そして前臨床および臨床試験の両方において関連毒性がほとんどなくそして優れた全体的安全性プロフィールを有する動物モデルにおけるｒＡＡＶベクターからの長期導入遺伝子発現の実証によるところが大きい（Ｓｎｙｄｅｒ ａｎｄ Ｆｌｏｔｔｅ ２００２；Ｍｏｓｓ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｒｚｏｇ ２００６；Ｍａｇｕｉｒｅ ｅｔ ａｌ．２００８；Ｍｕｅｌｌｅｒ ａｎｄ Ｆｌｏｔｔｅ ２００８；Ｂｒａｎｔｌｙ ｅｔ ａｌ．２００９）。最も初期のＡＡＶ遺伝子治療研究は血清型２（「ＡＡＶ２」）ベクターで行われたが、より効率の良い遺伝子送達および異なる組織特異性を有する他のＡＡＶ血清型に基づくベクター系が現在ヒト試験中であり、そしてそれらの使用は増加すると思われる（Ｂｒａｎｔｌｙ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｎｅｉｎｈｕｉｓ ２００９）。
遺伝子治療薬の開発および最終的マーケティングの主要な要求は、十分な規模で遺伝子送達ベクターを製造できることである。過去において、この要求はｒＡＡＶベクターの成功した応用への障壁であったが、最近になって臨床用途のための大規模製造に適合するいくつかの革新的な製造系が開発されている。これらの新規の系は、ｒＡＡＶゲノムおよびトランスに作用するヘルパー機能を産生細胞に送達するためにアデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびバキュロウイルスハイブリッドを使用し、そして最近概説されている（Ｃｌｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｖｉｒａｇ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｚｈａｎｇ
ｅｔ ａｌ．２００９）。ｒＡＡＶハイブリッドウイルス感染による産生細胞系への必要とされる遺伝要素の導入の容易さは、効率の良いｒＡＡＶベクター製造および重要なことにはバイオリアクターへの方法のスケールアップを可能にする。これらの系は最終的な臨床候補ベクターに特に適しているが、各ベクターにハイブリッドウイルスを作る必要性のために、それらは導入遺伝子およびベクター血清型のいくつかの組み合わせを評価する必要があり得る初期開発および前臨床研究にはあまり適していない。
多くの前臨床のｒＡＡＶに基づく遺伝子治療研究がマウスにおいて行われているが、より大型の動物において得られる結果は実際の臨床結果をより予測すると考えられることが多い。大型動物研究はより高いｒＡＡＶベクター用量を必要とし、そしてこれらの要求を満たすために、時間のかかる中間体製造の必要のないスケールで様々な試験ベクターを迅速に製造することができる汎用的製造系が必要とされる。ＨＥＫ２９３細胞へのＡＡＶベクターゲノム、ＡＡＶキャプシド遺伝子およびトランスに作用するヘルパー遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡのリン酸カルシウム共沈殿による一過性トランスフェクション（「三重トランスフェクション」として知られている方法）は、研究所においてｒＡＡＶを製造するための長年にわたり標準的な方法であった（Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．１９９８；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．１９９８；Ｓａｌｖｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．１９９８；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．１９９８）。トランスフェクションに基づく方法は全てのｒＡＡＶ製造技術の中で依然として最も汎用的であり、そして異なるｒＡＡＶベクターの同時製造を可能にする。しかしながら、三重トランスフェクションは、懸濁培養系との適合性がないために大規模ｒＡＡＶ製造にとって理想的と一般に考えられていない。しかしながら、最近、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用するいくつかの有望な結果は、リットル当たり１〜３ｘ１０１３ベクター粒子の未精製収量を有する哺乳類細胞懸濁培養におけるｒＡＡＶ２ベクターの製造を示しており、これらは接着形態（培養皿上に単層として培養した細胞）トランスフェクション系からの収量に匹敵する（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｈｉｌｄｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．２
００７）。ＰＥＩに基づくトランスフェクションの利点は、通常のリン酸カルシウム媒介トランスフェクションで典型的に必要とされる培地交換の必要なしに無血清培地中でもそれを実施できることである（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．２００７）。これらの特徴は、より低価格ならびにプリオンおよび他の外来因子の存在のような動物由来の血清に関する懸念の除去になる。
ｒＡＡＶベクター製造のスケールアップのさらなる障害は、ベクターの下流処理中に生じる。小規模で、ｒＡＡＶベクター精製に使用する最も一般的な方法は、複数回の一晩の塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配遠心分離を伴う（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．１９９９）。この精製方法は標準的な実験室設備で容易に行うことができ、一般に高収量であり、そして注意深く行う場合に妥当な純度のベクターを生成せしめる。しかしながら、この技術の欠点は、第１に、ＣｓＣｌへの長期暴露がｒＡＡＶベクターの効能を落とすと報告されていること（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．１９９９；Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．２００１；Ｂｒｕｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．２００２）、そして第２に、勾配が細胞溶解物の限られたローディング容量を有し、それは今度はｒＡＡＶ精製スケールアップを制限し得ることである。代わりの勾配媒質、ヨージキサノールもまたｒＡＡＶベクターを精製するために用いられている（Ｈｅｒｍｅｎｓ ｅｔ ａｌ．１９９９；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．１９９９）。この等張媒質は最初は冠動脈造影中に使用する造影剤として開発され、そして低い関連毒性および相対不活性は安全性およびベクター効能の観点の両方からＣｓＣｌより勝っている（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．１９９９）。しかしながら、ヨージキサノールはｒＡＡＶ製造培養細胞溶解物のローディング容量、従ってｒＡＡＶ精製の拡張性が限られるという点においてＣｓＣｌと同じ欠点を共有する。これらの勾配特異的制約を克服するために、研究者等はスケールでＡＡＶを精製するためにイオン交換クロマトグラフィーそして最近では単一ドメイン重鎖抗体フラグメントを用いるアフィニティー精製に関心を寄せている（Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．２００１；Ｂｒｕｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．２００２；Ｋａｌｕｄｏｖ ｅｔ ａｌ．２００２；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．２００２；Ｄａｖｉｄｏｆｆ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．２００９）。これらの技術はＡＡＶ収量、拡張性および純度を高める。しかしながら、クロマトグラフィーに基づく技術を用いて完全に機能性のベクター粒子から一般に分離されない、空キャプシドのようなベクター関連不純物が残る。空および完全なベクター粒子のイオン交換に基づく分離を開発するためにＡＡＶ２ベクターを用いていくらかの進歩がなされているが（Ｑｕ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．２００９）、ＣｓＣｌ勾配遠心分離はｒＡＡＶベクター調製物から空粒子を除くための依然として最も良く特性化された方法である。
最近、ＡＡＶ２と対照的に、大部分の他のＡＡＶ血清型はリン酸カルシウムでトランスフェクションされた製造培養の培地中に主に放出され、そして細胞溶解物に保持されないことが認められた（Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ ｅｔ ａｌ．２０１０）。この分配は細胞溶解なしに起こるので、製造培養培地はｒＡＡＶベクターの比較的純粋な供給源であると、そしてより低レベルの細胞混入物はローディング容量および精製勾配の分離を改善し得ると結論付けられた。
本実施例に記述されるのは、ＰＥＩトランスフェクションおよび上清採取に基づく、大型動物研究に適当なスケーリングした（ｓｃａｌｅｄ）ｒＡＡＶ製造方法である。該方法は高収量であり、異なる血清型および導入遺伝子でのベクターの製造に汎用性があり、そして十分に簡単であるので最低限の専門的技術および設備で大部分の研究室において行うことができる。さらに、本実施例は空粒子からのゲノム含有ベクターの分離のためのヨージキサノール勾配の使用を示す。
６．２．材料および方法
６．２．１．細胞培養
後期継代ＨＥＫ２９３細胞培養物を１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ，Ｓｏｕｔｈ Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を加えたＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｉｎｃ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）中１５ｃｍプレート上で維持した。細胞を週に２回継代してそれらを指数増殖期において維持した。小規模トランスフェクションには、１ｘ１０６のＨＥＫ２９３細胞を６ウェルプレートのウェル当たりに蒔き、そして１．５ｘ１０７細胞を１５ｃｍディッシュに蒔いた。大規模製造には、トランスフェクションの４日前に１６枚のコンフルエントな１５ｃｍプレートからのＨＥＫ２９３細胞を１リットルのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳを含有する２つの１０層細胞スタック（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に分けた。トランスフェクションの前日に、２つの細胞スタックをトリプシン処理し、そして細胞を２００ｍＬの培地に再懸濁した。細胞塊を沈降させ、その後で６細胞スタックの各々に６．３ｘ１０８細胞を平板培養した。トランスフェクションの前に細胞を２４時間接着させた。細胞スタックのコンフルエンシーは、顕微鏡ステージ上に細胞スタックを収容するために位相差ハードウェアがそれから取り除かれているＤｉａｐｈｏｔ倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｃｏｒｐ．）を用いてモニターした。
６．２．２．プラスミド
全てのトランスフェクションに使用したプラスミドは下記の通りであった：
１）ＡＡＶ２ ＩＴＲが隣接するｅＧＦＰ発現カセットを含有する、シスプラスミドｐＥＮＮＡＡＶＣＭＶｅＧＦＰ．ＲＢＧ（「ＡＡＶシス」とも呼ばれる）；
２）ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子およびそれぞれＡＡＶ１、６、７、８からのキャプシドタンパク質遺伝子を含有する、トランスプラスミドｐＡＡＶ２／１、ｐＡＡＶ２／６、ｐＡＡＶ２／７、ｐＡＡＶ２／８およびｐＡＡＶ２／９（「ＡＡＶトランス」とも呼ばれる）；ならびに
３）アデノウイルスヘルパープラスミドｐＡｄΔＦ６。
１５〜５０ｍｇロットの＞９０％スーパーコイル状プラスミドを入手し（Ｐｕｒｅｓｙｎ Ｉｎｃ．，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）、そして全てのトランスフェクションに使用した。
６．２．３．リン酸カルシウムトランスフェクション
小規模リン酸カルシウムトランスフェクションは、前述の通り（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．２００２）ＡＡＶシス、ＡＡＶトランスおよびアデノウイルスヘルパープラスミドの三重トランスフェクションにより行った。簡潔に言えば、トランスフェクションの２時間前に６ウェルプレート中の８５〜９０％コンフルエントなＨＥＫ２９３単層上の培地をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳに変えた。２：１：１の比率のプラスミド（ウェル当たり１．７３μｇのアデノウイルスヘルパー／０．８６μｇのシス／０．８６μｇのトランス）をリン酸カルシウムで沈殿させ、そしてプレートに滴下して加えた。トランスフェクションを３７℃で２４時間インキュベーションし、この時点で培地をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳに再び変えた。培養物を感染後７２時間までさらにインキュベーションし、その後で細胞および培地を別個に採取した。細胞スタックの大規模トランスフェクションには、プラスミド比率を一定に保つが、全ての試薬量を６３０倍増加した。トランスフェクション混合物を１ＬのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳに直接加え、そしてこの混合物を用いて細胞スタック中の培地を置換した。培地をトランスフェクション後２４時間で変えた。細胞および培地を直接もしくは５００ｍＭのＮａＣｌの存在下で２時間さらにインキュベーションした後のいずれかでトランスフェクション後７２時間もしくは１２０時間後に採取した。細胞に存在するベクターを定量しなければならない場合、細胞をトリプシン処理により遊離させ、そして３回の凍結／融解サイクルにより溶解物を生成せしめた。
６．２．４．小規模ベクター調製
４０枚の１５ｃｍプレートをリン酸カルシウム法によりトランスフェクションし、そしてトランスフェクション後７２時間で３連続サイクルの凍結／融解（−８０℃／３７℃）で細胞溶解物を調製した。細胞溶解物を２回の塩化セシウム（ＣｓＣｌ）遠心分離で精製し、そしてウルトラ１５遠心濃縮器装置（Ａｍｉｃｏｎ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ）を用いて純粋な勾配画分を濃縮しそして脱塩した。
６．２．５．小規模ポリエチレンイミントランスフェクション
６ウェルプレート中のＨＥＫ２９３細胞のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に基づく三重トランスフェクションには、同じプラスミド量をリン酸カルシウムトランスフェクションについて記載の通り使用した。ＰＥＩ−ｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）を水中１ｍｇ／ｍＬで溶解し、そしてｐＨを７．１に調整した。トランスフェクションするＤＮＡのμｇ当たり２μｇのＰＥＩを使用した。ＰＥＩおよびＤＮＡを各々１００μＬの無血清ＤＭＥＭに加え、そして２つの溶液を合わせ、そしてボルテックスすることにより混合した。室温で１５分のインキュベーション後に、混合物を１．２ｍＬの無血清培地に加え、そしてウェル中の培地を置換するために使用した。さらなる培地交換は実施しなかった。１５ｃｍプレートには、プラスミド比率を一定に保つが、使用するプラスミドおよび他の試薬の量を１５倍増やした。
６．２．６．大規模ポリエチレンイミントランスフェクション
大規模なＰＥＩに基づくトランスフェクションをＨＥＫ２９３細胞の７５％コンフルエントな単層を含有する１０層細胞スタックにおいて行った。２：１：１の比率のプラスミド（細胞スタック当たり１０９２μｇのアデノウイルスヘルパー／５４６μｇのシス／５４６μｇのトランス）を使用した。ＰＥＩ−ｍａｘ：ＤＮＡ比を２：１（重量／重量）で維持した。各細胞スタックには、無血清ＤＭＥＭを含有する別個のチューブにプラスミド混物およびＰＥＩを各々加えた（５４ｍＬの総容量）。チューブをボルテックスすることにより混合し、そして室温で１５分間インキュベーションし、そしてその後で抗生物質を含有する１リットルの無血清ＤＭＥＭに混合物を加えた。スタック中の培養培地をデカンテーションし、ＤＭＥＭ／ＰＥＩ／ＤＮＡ混合物で置換し、そしてスタックを標準的な５％ＣＯ２、３７℃インキュベーター中でインキュベーションした。トランスフェクション後７２時間で、５００ｍＬの新しい無血清ＤＭＥＭを加え、そしてインキュベーションをトランスフェクション後１２０時間まで続けた。この時点で、ベンゾナーゼ（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）を２５ユニット／ｍＬの最終濃度まで培養上清に加え、そしてスタックを２時間再インキュベーションした。ＮａＣｌを５００ｍＭまで加え、そしてインキュベーションをさらに２時間再開し、その後で培養培地を採取した（この時点で、培養培地は「下流原料」と呼ばれた）。細胞関連ベクターを定量しなければならない場合、細胞をトリプシン処理により遊離させ、そして３回の連続凍結／融解サイクル（−８０℃／３７℃）により溶解物を生成せしめた。
６．２．７．下流処理
６つの細胞スタックからの１０リットルの原料培養培地を１０リットルのアレグロ培地バッグ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．，Ｆｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）中に０．５μｍＰｒｏｆｉｌｅ ＩＩデプス（ｄｅｐｔｈ）フィルター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．，Ｆｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）を通して清澄化した。清澄化した原料を次に特注の１／４”ＩＤチューブおよびポートを有するＮｏｖａｓｅｔ−ＬＳ ＬＶＨホルダー（ＴａｎｇｅｎＸ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．，Ｓｈｒｅｗｓｂｕｒｙ，ＭＡ）および１００ｋＤａ ＭＷＣＯ ＨｙＳｔｒｅａｍ膜を有する０．１ｍ２Ｓｉｕｓ−ＬＳ使い捨てＴＦＦスクリーンチャンネルカセット（ＴａｎｇｅｎＸ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．，Ｓｈｒｅｗｓｂｕｒｙ，ＭＡ）を用いて接線流濾過により濃縮した。１０〜１２ｐｓｉの膜間圧を工程を通して維持して８５ｍＬまでの１２５倍濃縮を製造業者の推奨
に従って行った。各ランの後にＴＦＦフィルターを捨て、そしてラン間で系を０．２Ｎ ＮａＯＨで洗浄した。濃縮原料を１０，５００ｘｇおよび１５℃で２０分間遠心分離により再清澄化し、そして上清を新しいチューブに注意深く取り除いた。６つのヨージキサノール段階勾配を下記の通りいくらかの改変を有してＺｏｌｔｕｋｉｎｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．１９９９）の方法に従って形成した：１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび２５ｍＭカリウムを含有するＰＢＳ中の次第に濃いヨージキサノール（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）溶液を４０ｍＬのクイックシール遠心管（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ
Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）中に連続して下に置いた。勾配の段階は４ｍＬの１５％、９ｍＬの２５％、９ｍＬの４０％そして５ｍＬの５４％ヨージキサノールであった。１４ｍＬの清澄化した原料を次に勾配上に重ね、そしてチューブを密封した。チューブを１８℃で７０Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）中３５０，０００ｘｇで７０分間遠心分離し、そしてチューブの底から約１ｃｍで水平に挿入した１８ゲージ針を通して勾配を分画した。画分をＵＶ透過９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に水で２０倍希釈し、そして吸光度を３４０ｎｍで測定した。ＯＤ３４０の読み取りにおけるスパイクは主要な混入タンパク質バンドの存在を示し、そしてこのスパイクより下の全ての画分を集めそしてプールした。全ての６つの勾配からのプールした画分を合わせ、１０容量の最終調合バッファー（ＰＢＳ／３５ｍＭ ＮａＣｌ）に対して限外濾過し、そして１００ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｈｙｓｔｒｅａｍスクリーンチャンネル膜を有する０．０１ｍ２使い捨てＳｉｕｓ ＴＦＦカセット（ＴａｎｇｅｎＸ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．，Ｓｈｒｅｗｓｂｕｒｙ，ＭＡ）およびＣｅｎｔｒａｍａｔｅ ＬＶカセットホルダー（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．，Ｆｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）を用いて製造業者の説明書に従って接線流濾過により約１０ｍＬまで４倍濃縮した。１０の膜間圧を工程を通して維持した。装置のホールドアップ容量を最短の白金硬化シリコーンチューブ（１．６６ｍｍの内径，Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ；Ｃｏｌｅ Ｐａｌｍｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
Ｃｏ．，Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ，ＩＬ）を用いて低く保った。さらに、表面へのベクターの結合を最小限に抑えるために全ての湿潤性部分を０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）で２時間前処理した。各ランの後にＴＦＦフィルターを捨て、そしてラン間で系を０．２Ｎ ＮａＯＨで洗浄した。限外濾過し、濃縮した生成物にグリセロールを最終５％まで加え、そして調製物を等分し、−８０℃で保存した。
６．２．８．ベクター特性化
導入遺伝子カセットにおいてコードされるポリアデニル化シグナルに対するプライマーおよびプローブを用いて、ＤＮアーゼＩ耐性ベクターゲノムをＴａｑＭａｎ ＰＣＲ増幅（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により滴定した。勾配画分および最終ベクターロットの純度をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）により評価し、そしてＳＹＰＲＯルビー染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）およびＵＶ励起を用いてＤＮＡを可視化した。染色したゲル上で可視の非ベクター不純物に対する純度をＧｅｎｅｔｏｏｌｓソフトウェア（Ｓｙｎｇｅｎｅ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を用いて決定した。ベクター調製物の空粒子含量をネガティブ染色および電子顕微鏡検査により評価した。銅グリッド（フォルムバー／薄カーボン膜で被覆した４００メッシュ；Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ）を１％アルシアンブルー（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ）で前処理し、そして５μｌのベクター調製物をのせた。次にグリッドを洗浄し、１％酢酸ウラニル（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ）で染色し、そしてＰｈｉｌｉｐｓ ＣＭ１００透過型電子顕微鏡を用いて観察した。
空：完全粒子比を電子顕微鏡写真の直接計数により決定した。
６．２．９．相対的ベクター効能評価
初期継代ＨＥＫ２９３細胞を９６ウェルプレートにおいて８０％のコンフルエンシーまで平板培養し、そして野生型アデノウイルス５型（ＭＯＩ：４００）の存在下で１０，０００のＭＯＩでＡＡＶベクターに感染させた。感染後４８時間で、ＧＦＰ蛍光画像をデジタル的に撮り、そして蛍光強度を前述の通り（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１０）ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ，１９９９７−２００６，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を用いて定量した。形質導入のインビボ分析のために、Ｃ５７ＢＬ６マウスに１ｘ１０１１ゲノムコピーのＡＡＶベクターをｉ．ｖ．注射した。動物を注射後９日で解剖し、肝臓を薄片にし、そして前述の通り（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１０）ＧＦＰ蛍光を撮像し、そして蛍光強度をＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量した。
６．３．ｒＡＡＶ製造用のトランスフェクション試薬の比較の結果
小規模でｒＡＡＶベクターを製造するための標準的な上流方法（全収量：約１〜２ｘ１０１３ゲノムコピー（ＧＣ））は、４０枚の１５ｃｍ組織培養プレート中のＨＥＫ２９３細胞のリン酸カルシウム媒介三重トランスフェクションに基づく。この方法は細胞ペレットおよび培養培地の両方において優れた力価で様々なＡＡＶ血清型のベクターを再現性良く生成するが（Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ ｅｔ ａｌ．２０１０）、それは技術的に面倒であり、動物血清の存在を必要とし、そして２回の培地交換を伴う。スケーリングしたｒＡＡＶ製造には、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のようなあまり複雑でなく、より強力なトランスフェクション剤が好都合であり得ると結論付けられた。リン酸カルシウムもしくはＰＥＩ媒介三重トランスフェクションのいずれかの後のｅＧＦＰ発現カセットを保有するｒＡＡＶ７ベクター（ｒＡＡＶ７−ｅＧＦＰ）の生産は、６ウェルプレートＨＥＫ２９３製造培養の細胞および培地の両方におけるＤＮアーゼ耐性ベクターゲノムのｑＰＣＲにより定量した（図１Ａ〜１Ｄ）。リン酸カルシウムでトランスフェクションした細胞におけるｅＧＦＰ導入遺伝子のより強い発現にもかかわらず、いずれのトランスフェクション方法でも、ｒＡＡＶ７−ｅＧＦＰ生産は同様なレベルで細胞および培養培地間で均等に分配することが見出された。これらの結果は、製造培養における導入遺伝子発現レベルがｒＡＡＶ製造収量の予測とならないこと、そしてｒＡＡＶ７−ｅＧＦＰはトランスフェクション技術にかかわらず同様なレベルで培養培地に放出されることを示す。
６．３．１．１．培養培地へのｒＡＡＶ放出への血清型および塩添加の影響
ＰＥＩ三重トランスフェクション後の培養培地へのｒＡＡＶ７−ｅＧＦＰの放出を立証し、すぐ次の目標は他のＡＡＶ血清型で同様な放出を示すことであった。さらに、目標は細胞と関連したままである４５％の検出可能なベクター（図１Ａ〜Ｄ）を培養培地に移動できるかどうかを見ることであった。標準的な７２時間とは対照的に、ＰＥＩトランスフェクション後１２０時間まで採取を延ばすことにより、培養培地中の全ベクターは倍になることが見出された（データは示されない）。この戦略を適応して、１５ｃｍプレートのＨＥＫ２９３細胞をＰＥＩを用いて三重トランスフェクションした。５つの異なるＡＡＶ血清型キャプシド遺伝子をコードするトランスプラスミドが様々なトランスフェクション混合物に含まれ、そして１２０時間のインキュベーション後に、即座にもしくは５００ｍＭ ＮａＣｌの添加後２時間のいずれかで培養培地および細胞を採取した。次に、細胞溶解物および培養培地中のキャプシド封入されたＡＡＶゲノムをｑＰＣＲにより定量した（図２）。試験した５つのＡＡＶ血清型の各々は、６１．５％〜８６．３％の間の総ＧＣ収率のレベルで塩添加なしに５日のインキュベーション後に上清に放出された。この結果は、トランスフェクション後の増加したインキュベーション時間が培養培地中のＡＡＶベク
ターのより高い力価をもたらすという初期開発ラン中の結果を裏付けた。塩を有する製造培養のインキュベーションは、おそらく細胞ストレスにより媒介される機序によって、上清へのＡＡＶ２の放出を引き起こすことが示されている（Ａｔｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００５）。ここで行われた高塩インキュベーションは、培養培地へのＡＡＶ６およびＡＡＶ９ベクターのさらに約２０％のＧＣ放出をもたらしたが、他の血清型ではほとんど変化を引き出さなかった。
６．３．１．２．ｒＡＡＶ７ベクター収量へのスケールアップの影響
本研究の目標は、大型動物前臨床研究を支援するために標準的な装置を用いて大部分の研究所において行うことができるスケーリングしたＡＡＶ製造系を開発することであった。従って、ＰＥＩに基づくトランスフェクションをスケールアップするためにＣｏｒｎｉｎｇ １０層細胞スタックを、このタイプの組織培養容器は標準的な研究室インキュベーターにより収容することができるので選択した。最初に、単一の１０層細胞スタックに単層が翌日に７５％コンフルエントになるように６．３ｘ１０８のＨＥＫ２９３細胞を蒔いた。トランスフェクションの前に底のＨＥＫ２９３単層のコンフルエンシーを評価するために、細胞スタックを収容できるように位相差ハードウェアを取り除くことにより標準的な研究室顕微鏡を適用した。１つの細胞スタックにＡＡＶ７−ｅＧＦＰベクターを製造するための関連プラスミドをリン酸カルシウムもしくはＰＥＩのいずれかを用いて三重トランスフェクションし（材料および方法を参照）、そして次に細胞および培地の両方におけるＤＮアーゼ耐性ベクターゲノムの定量の前に感染後１２０時間までインキュベーションした。ＰＥＩトランスフェクション細胞スタックからの細胞当たりの収量は、６ウェルおよび１５ｃｍプレートにおいて以前に得られたものと同様であった（図１Ａ〜Ｄ、図２）。本実験における培養培地からの総収量は、細胞スタック当たり２．２ｘ１０１３ＧＣであった。リン酸カルシウムトランスフェクションスタックは、プレートにおいて以前に認められたものより細胞当たりかなり低いベクター収量をもたらし、そしてこの影響は細胞スタックの中央領域へのＣＯ２の拡散の欠如に起因し得る。１０層細胞スタックトランスフェクション結果に基づき、ＰＥＩをスケーリングした方法のさらなる開発のためにトランスフェクション試薬として選択した。
６．３．１．３．ｒＡＡＶ７−ｅＧＦＰ製造培養培地の下流処理
スケーリングした製造方法を開発する目標は、任意のＡＡＶベクターを一般的方法により精製することができるように柔軟性を維持することであった。密度およびサイズに基づく混入物質からのベクターの分離は、多数のベクター血清型に適用することができる精製方法である。従って、培養培地中のｒＡＡＶベクターを、ヨージキサノール密度勾配上での精製を可能にするために十分に少ない容量まで接線流濾過（ＴＦＦ）により濃縮した。０．５μｍデプスフィルターを通した製造培養培地の事前清澄化を行って細胞残屑および剥離細胞を取り除きそしてＴＦＦ膜の目詰まりを防いだ。次に、工程を通して１０〜１２ｐｓｉの膜間圧を保ちながら、使い捨ての１００ｋＤａカットオフスクリーンチャンネルＴＦＦ膜を用いて１３０倍濃縮を行った。膜の使い捨てできることは、ラン間で汚れを除き（ｄｅ−ｆｏｕｌ）そして洗浄する必要を省き、従って、方法の再現性を増加させた。製造培養培地をヌクレアーゼ（ベンゾナーゼ）で処理して混入プラスミドおよび細胞ＤＮＡを分解し、そして処理中にそれ自体への（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．２００５）そして混入タンパク質へのベクターの凝集を最低限に抑えるために濃縮の前に５００ｍＭ塩を加えた。後で、これら２つの処理はヨージキサノール勾配からの回収を増加すると決定された（データは示されない）。フルスケールパイロットランの下流工程および性能の開発中に、濃縮工程のために任意の時点でベクターの有意な損失は認められなかった（以下の表３を参照）。
Figure 0005922095
ＡＡＶベクターのヨージキサノール勾配精製は詳細に記述されており（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．１９９９）、そしてここで使用する段階勾配はこの研究から適用される。勾配層の容量は、混入物質からのベクターのより良い分離を得るために改変した（材料および方法を参照）。１つの細胞スタックの製造培養培地からの濃縮ＡＡＶ７−ｅＧＦＰベクターを含有する１４ミリリットルのＴＦＦリテンテート（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を２７ｍＬのヨージキサノール段階勾配上にのせ、そして３５０，０００ｘｇで１時間遠心分離にかけた。次に、チューブの底から勾配を分画し、そして画分（２７５μｌ）をそれぞれｑＰＣＲ、３４０ｎｍでの光学密度（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９７）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてベクター含量、ヨージキサノール濃度およびベクター純度について分析した。１つのそのような勾配の代表的なプロフィールを図３に示す。減少するＯＤ３４０の読み取りにより示されるヨージキサノール濃度の直線勾配は、画分２２まで認められた。この時点の後、読み取りは増加し（図３Ａ）、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより（図３Ｂ）そして勾配に存在する薄いバンドの形態において裸眼により可視化される混入タンパク質のスパイクに対応した。ＯＤ３４０のスパイクはこの波長でのタンパク質およびヨージキサノールの重複する吸光度に起因すると思われ、そしてこの現象は混入タンパク質バンドの出現を検出する正確なそして再現性のある方法を提供した。
ベクターゲノムのピークは、混入する細胞タンパク質バンド（画分２３〜２８）の開始のすぐ下、１．３１ｇ／ｍＬ〜１．２３ｇ／ｍＬのＯＤ３４０推定ヨージキサノール濃度で画分１２〜２２の間の勾配の底３分の１に対して認められた（図３Ａ）。このピークは、混入する細胞タンパク質のないＡＡＶキャプシドタンパク質の存在により判断した場合に純粋なベクター粒子を含有する画分と一致した（図３Ｂ）。約５０％のベクターゲノムは混入するタンパク質と常に共に移動し、そして異なるヨージキサノール濃度、回転時間、塩濃度および洗剤を用いてそのように行う試みにもかかわらず分離することができなかった（データは示されない）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に各画分の等しいゲノムコピー（１０１０ＧＣ）をのせたことにもかかわらず、画分２６、２７および２８はより高いレベルのキャプシドタンパク質ＶＰ１、２および３を含有した（図３Ｂ）。この結果は、関連するもしくはパッケージングされたゲノムのない空キャプシドもしくはキャプシド集合中間体のいずれかのこれらの画分における存在を示唆した。ヨージキサノール勾配は、完全なおよび空のｒＡＡＶ粒子を分離することができると結論付けられる（以前に公式に示されていない結果）。
６．３．１．４．大規模パイロット製造ラン回収および収率
上記の開発研究は、ＰＥＩトランスフェクションおよびヨージキサノール勾配精製の組み合わせを用いて単一の細胞スタックから高い力価で純粋なｒＡＡＶ７ベクターを製造し得ることを示す。製造方法を特性化しそして再現性および他のＡＡＶ血清型への適用性を示すために、各々６細胞スタックを用いる、フルスケールパイロット製造ランを開始した。各ランの目標は、１０１４ＧＣを上回る最終精製ベクターを製造することであり；用いる最終方法を以下の表４に要約し、そして材料および方法において十分に詳述する。
Figure 0005922095
ｒＡＡＶ８−ｅＧＦＰおよびｒＡＡＶ９−ｅＧＦＰの各々３回のランをｒＡＡＶ６−ｅＧＦＰの２回のランと一緒に行った。工程中、サンプルを様々な段階で採取して下記の通り全体を通したベクター損失を評価した：１）ベンゾナーゼ／０．５Ｍ塩での培養培地の処理および清澄化の後に原料サンプルを採取し；２）ＴＦＦ濃縮の後にリテンテートサンプルを採取し；３）勾配採取および画分プールの後にヨージキサノール勾配画分サンプルを採取し；そして４）バッファー交換および第２のＴＦＦ工程による最終濃縮後に最終生成物サンプルを採取した。様々なランのこれらの段階の各々でのキャプシド封入されたベクターゲノムコピーの回収を表３に記載する。
原料中のｒＡＡＶ８およびｒＡＡＶ９ベクターの平均回収は９．０ｘ１０１４ＧＣであり、一方、ｒＡＡＶ６ベクターでは平均回収は６．７ｘ１０１３ＧＣであった。ｒＡＡＶ６ベクターの同様な低い収率は開発中のトランスフェクションにおいて見られ（図２）、そしてまた標準的な小規模ＡＡＶ製造工程においても常に認められる。
１０Ｌから８５ｍＬへの原料の１２５倍濃縮（表３：ＴＦＦＩリテンテート）は、損失が機械的故障のためであった１例を除いてベクターの損失をもたらさなかった。数例において、濃縮すると収率の明らかな増加があったが、これはｑＰＣＲ反応の阻害を克服するために必要であった、リテンテートの過剰希釈により引き起こされる誤差のためであった。開発ラン中の場合のように、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９ベクターでは原料の３５％〜５０％の間の回収でパイロットヨージキサノール精製ラン中にベクターの損失があった。より多くの損失が精製中にＡＡＶ６ベクターで見られた（原料の８０〜８５％）。最終濃縮およびバッファー交換は、おそらく出発材料のより低い力価そしてそれ故にＴＦＦ装置の表面に吸収されるベクターのより大きい割合のために、ＡＡＶ６ベクターでこれは最も顕著であったが、さらなる損失をもたらした。機械的損失が生じたランを除いて、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９ベクターの平均全工程収量は２．２ｘ１０１４ＧＣ（原料の約２６％）であった。
６．３．１．５．大規模製造ロットの特性化
パイロットランにおいて製造したベクターロットをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりキャプシドタンパク質純度についてそして電子顕微鏡検査により空粒子含量について特性化した。ｒＡＡＶ８およびｒＡＡＶ９大規模製造ロットの各々においてＡＡＶキャプシドタンパク質ＶＰ１、２および３に加えてほんの数本のマイナーバンドのみがＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により視覚化され、そして概算純度は１例を除いて９０％を上回った（図４）。これらの結果は、８５％を上回るベクター純度が日常的に得られる標準的な小規模工程と比べて遜色がなかった。大規模製造ロットの空粒子含量の概算は、電子顕微鏡写真上でネガティブ染色されたベクター粒子の直接観察により決定した（図５Ａ〜Ｇ）。空粒子は、ネガティブ染色を排除する完全な粒子と比較してキャプシドの電子密度の高い中心領域によりこれらの画像上で識別される。パイロット製造ロットの空粒子含量は０．４％〜５％の間であった。未精製調製物において、空：完全比率は３０：１と高い可能性があり（Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．２００３）、従って、これらの結果は、ヨージキサノール勾配が空および完全ｒＡＡＶ粒子を分離できるという結論を裏付ける。
任意のｒＡＡＶ製造ロットの必須の品質は、細胞において興味のある遺伝子を送達しそして発現するベクターの能力である。小規模工程により製造されるベクターに対するｒＡＡＶ８およびｒＡＡＶ９大規模製造ロットの効能は、インビトロにおいてｅＧＦＰ発現によりそしてＩＶ注射後のＣ５７ＢＬ／６マウス肝臓において評価した（それぞれ、図６Ａ〜Ｇおよび図７Ａ〜Ｇ）。インビトロおよびインビボ分析の両方により、新規製造方法により製造される全てのｒＡＡＶ８およびｒＡＡＶ９ベクターは、標準的な小規模方法により製造される同一のベクターと比較した場合に等しいかもしくはより高い効能（３．５倍まで）を示した。ｒＡＡＶ６ベクター収率は常に低かったが、それにもかかわらず大規模製造ロットは小規模で製造されるｒＡＡＶ６−ｅＧＦＰと比較して２倍の形質導入改善を示した。
６．４．説明
臨床遺伝子治療用のｒＡＡＶベクターの需要は拡大し続け、そして該分野における現在の進歩が加速するにつれて、後期臨床試験において使用する大量のベクターが必要とされ得る。並行して、研究者がヒトにおける臨床結果の改善予測のために大型動物データにますます依存するにつれて前臨床研究の複雑な要求を満たすベクターに対する拡大する需要は増すと思われる。後期臨床試験に入れるために十分な収率でｒＡＡＶベクターを製造するいくつかの新規方法は、産業および学術機関の両方において開発研究所から製造スイート（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｓｕｉｔｅｓ）に現在移っている（Ｃｌｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｖｉｒａｇ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００９）。しかしながら、これらの方法はハイブリッドウイルスおよびパッケージング細胞系のような中間体の時間のかかる構築を伴うことが多く、従って、導入遺伝子およびＡＡＶ
血清型のいくつかの組み合わせが厳密な時系列下で試験されなければならないことが多い前臨床環境に適していない。さらに、前臨床研究の大部分は、多数の大規模製造工程において使用される高度技術装置を利用できることが限定され得る学術機関において行われる。
前臨床研究グループのベクター要求を支援するために、標準的なＡＡＶ研究所において任意の所望のｒＡＡＶ生成物を迅速に作製する柔軟性および簡単さを保持しながら大型動物研究用に十分なベクターを生成するスケーリングした製造方法が開発された。本実施例に記述される製造方法はＰＥＩ三重トランスフェクションに基づき、これは異なるＡＡＶ血清型／導入遺伝子の組み合わせの迅速なそして容易な置換のような、トランスフェクションに基づく製造技術のいくつかの特有の性質の保持を可能にする。新規方法の顕著な特徴は、ベクターの大部分が産生細胞からよりむしろ培養培地から採取することができ、従って、細胞溶解物に存在する細胞混入物質の大部分が回避されることである。上流工程は非常に効率が良く、そして６細胞スタックの細胞当たり２ｘ１０５ＧＣまで、もしくはロット当たり１ｘ１０１５ＧＣをもたらす（図２；表３）。下流工程用のヨージキサノール勾配遠心分離の選択は、全ての血清型の一般的な精製方法の維持に役立つ。ヨージキサノールの等張で比較的不活性の性質は、ベクター効能（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．１９９９）および全体的な製品安全性を維持することに関して有益であると判明している。ヨージキサノール段階勾配に濃縮した製造培養培地を適用することにより、非常に純粋なそして強力なｒＡＡＶベクターが単一の１時間の遠心分離工程において許容しうる収率で得られた。全工程は迅速であり（合計７日、表４）、そして費用効率が高い。ＡＡＶ８およびＡＡＶ９ベクターの平均総収量は、２６％の全工程回収で、２．２ｘ１０１４ＧＣであった。
現在のフォーマットにおいて、細胞はトランスフェクションの前に１０％ウシ胎仔血清中で培養されるので製造方法は部分的に無血清である。しかしながら、２９３細胞用に市販されている動物性製品を含まない培地を用いて、安全規制に従って該方法を完全に無血清に適用することができる。同様に、全ての容器は密封されそして操作はバイオセイフティーキャビネット内で行われるので、該方法はｃＧＭＰ適合性である。従って、前臨床研究に対するその有用性に加えて、該方法はまたベクター要求が低い初期臨床試験における使用にも、そして低いベクター用量が予測される遺伝性網膜疾患の処置のようなある種の適応症にも適用できる。
上流工程の開発中に、様々な血清型のｒＡＡＶがリン酸カルシウムおよびＰＥＩでトランスフェクションした培養の両方において上清に放出され（図１Ａ〜Ｄ）、そして明らかな細胞病変なしに起こるようである。使用するトランスフェクション技術は培養培地に放出されるベクターの量に大して影響しなかったが、トランスフェクション後のインキュベーション期間を延ばすことにより放出の実質的な増加がもたらされた。さらに、トランスフェクション後に連日培地を採取しそして置換する場合、培養培地中のｒＡＡＶ７ベクターの回収は一定のままであった（データは示されない）。この結果は、工程へのかん流培養技術の導入が上流収量をなおさらに増加し得ることを示唆する。本実施例に報告される実験において、接着性ＨＥＫ２９３細胞培養は簡単便利という理由で使用されたが、懸濁培養中でのｒＡＡＶの製造におけるＰＥＩトランスフェクションの最近報告された使用を考慮すると（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｈｉｌｄｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．２００７）、この上流工程はまたバイオリアクターに適用することもできる。そのような方法の利点は、前臨床および臨床ベクター製造の両方に同じ上流工程を使用できることであり、これは規制の観点から望ましい。
大部分のＡＡＶ血清型を製造培養培地から効率よく採取できる本実施例における実証（図２；Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ ｅｔ ａｌ．２０１０）は、新規方法が大部分のＡＡＶベクターに広く適用可能であることを示す。しかしながら、いくつかのＡＡＶ血清型には、改変が必要とされる。例えば、ｒＡＡＶ２は細胞中にほとんど保持され（Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ ｅｔ ａｌ．２０１０）、そして培養培地へのこの血清型の放出は最適化される必要がある。ｒＡＡＶ６ベクターは、ＰＥＩ三重トランスフェクション後に細胞もしくは培養培地のいずれにおいても効率よく生産されず（図２；表１）、そして標準的なリン酸カルシウムトランスフェクションおよびＣｓＣｌ勾配精製により高い力価で再現性良く製造されなかった。
イオン交換、疎水性相互作用もしくはアフィニティーカラムクロマトグラフィーは、大量の培養培地からのＡＡＶベクターの捕獲のための最適な方法である。これらの方法は、各ＡＡＶ血清型に特異的に開発されなければならないことが多く、従って、前臨床ベクター製造には、多数の血清型に対応する一般的な精製方法がより良い解決策である。本実施例に記載のＴＦＦ濃縮／ヨージキサノール勾配法はｒＡＡＶ精製の一般的な下流方法であり、そしてここに提示する研究において、純粋なそして空粒子を比較的含まないベクターピークをもたらした（図４および図５Ａ〜Ｇ）。本実施例は、初めて、完全なｒＡＡＶ粒子から空のものを分離するヨージキサノール勾配精製方法の能力を公式に示している。
本実施例に記載の方法により製造されるｒＡＡＶ８およびｒＡＡＶ９ベクターの効能は、通常の小規模製造方法により製造される同一のベクターよりわずかに優れているとまではいかないとしても少なくとも同等であるとインビトロおよびインビボ形質導入アッセイの両方で本明細書において示された（図６Ａ〜Ｇおよび図７Ａ〜Ｇ）。
結論として、本実施例に提示される大規模ｒＡＡＶベクター製造方法は、前臨床試験に関与するＡＡＶ遺伝子治療研究所の要求に応じ、そして柔軟性のあるベクター製造の前臨床要求を包含する、これらの研究の大部分の要求を満たすと予測される。このＡＡＶ製造方法は、例えば試薬の簡単さ、工程速度およびベクター特異的不純物の除去の利点を保持しながら、臨床用途にｒＡＡＶベクターを供給するためにスケールアップする潜在能力を有する。
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７．実施例２：ＡＡＶベクターのセシウム精製
本実施例は、トランスフェクションした細胞ペレットからのＡＡＶベクターの塩化セシウム（ＣｓＣｌ）精製の新規方法を記述する。
１日目−ペレット処理およびＣｓＣｌ回転
１）溶解物調製
・−８０℃フリーザーから細胞を３７℃で１５分間融解する。
・４０プレートの細胞についてそして２０ｍＬの最終容量用に細胞ペレットを〜２０ｍＬの再懸濁バッファー１（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、２ｍＭ ＭｇＣｌ）に再懸濁し、そして氷上に置く。
・３回凍結／融解する（ドライアイスおよびエタノール浴／３７℃水浴）。
・調製物当たり１００μＬのベンゾナーゼ（２５０Ｕ／ｍＬ）を加え、そして穏やかに
逆さにし、サンプルを３７℃で２０分間インキュベーションし、５分毎にチューブを逆さにする。
・６ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌを加えて最終塩濃度を１Ｍにする。混合する。
・Ｓｏｒｖａｌ遠心分離機において４℃で８，０００ｒｐｍで１５分間回転させる。注記：Ｓｏｒｖａｌがきれいであることを確認する。遠心分離後に、さらに進める前に７０％でチューブを滅菌する。上清を新しいチューブに移す。
・Ｓｏｒｖａｌにおいて４℃で８，０００ｒｐｍで１５分間再び回転させる。注記：Ｓｏｒｖａｌがきれいであることを確認する。遠心分離後に、さらに進める前に７０％でチューブを滅菌する。
・１．８ｍＬの１０％ＯＧＰを０．５％の最終濃度になるように加え、そして反転により穏やかに混合する。
２）塩化セシウム段階勾配精製
・各調製用に、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ−２８チューブ（ウルトラクリアチューブを使用しない）において７．５ｍＬの１．５ｇ／ｍＬ ＣｓＣｌおよび１５ｍＬの１．３ｇ／ｍＬ ＣｓＣｌからなる２つの２リットル勾配を準備する。より密度が低いＣｓＣｌを最初にのせ、そして次により重いＣｓＣｌを底にのせる。
・１５ｍＬのサンプルを各勾配の最上部に加える。勾配を乱さないようにチューブの側面にサンプルをゆっくりと加える。チューブにロット＃を付ける。
・１５℃で２５，０００ｒｐｍで最低２０時間回転させる。
２日目−第１のＣｓＣｌ回転からＡＡＶバンドを集め、そして第２のＣｓＣｌ回転をセットする
１）ＣｓＣｌ回転からバンドを集める
・勾配を乱さないように注意して、バケットから遠心管（ＡおよびＢ）を注意深く取り出す。第１のチューブ（Ａ）をチューブホルダー上に固定する。
・２つの１／１６インチオス型ルアー（Ｆｉｓｈｅｒ ＮＣ９５０７０９０）を装着したあらかじめ滅菌した２ｆｔの長さのタイゴン−シリコーンチューブ（１．６ｍｍの内径；Ｆｉｓｈｅｒ ＮＣ９４２２０８０）を取り、そしてルアーに１８Ｇ １”針を挿入する。
・１８Ｇ １”針の１つをできるだけ底近くに直角にチューブに通し（ベベルを上に向けて）、そしてマスターフレックスポンプのイージーロードローラー中にチューブを固定する。速度を〜１ｍＬ／分まで穏やかに上げる。最初の４．５ｍＬを１５ｍＬファルコンチューブに集め、そして次に９６ウェルプレートに画分（２５０μＬ）を集め始める（チューブＡから）。４８画分を集める。
・２０％の漂白溶液を含有するビーカーに勾配の残りを流し、そして針／チューブアセンブリを廃棄する。
・２つの１／１６インチオス型ルアー（Ｆｉｓｈｅｒ ＮＣ９５０７０９０）を装着した別のあらかじめ滅菌した２ｆｔの長さのタイゴン−シリコーンチューブ（１．６ｍｍの内径；Ｆｉｓｈｅｒ ＮＣ９４２２０８０）を取り、そして第２のチューブから（チューブＢから）画分を集めるためにルアーに１８Ｇ １”針を挿入する。
・チューブＢについて全採取を繰り返す。使用後に針／チューブアセンブリを廃棄する。
２）屈折率（ＲＩ）を読み取る
・マルチチャンネルピペッターを用いて、（最初に９６ウェルプレートＡから集めた４８の）各画分の１０μＬを新しいプレートに移し（１〜４８とラベルを付ける）、そしてバイオセイフティーキャビネットに画分の残りを置いておく。
・各画分の５μＬを取り、そして屈折計を用いてＲＩを読み取る。ＡＡＶを含有する画分は、１．３７４０〜１．３６６０の屈折率を有するはずである。ＲＩを１．３６５０まで読み取り、そして次に１．３７４０〜１．３６６０の範囲のＲＩを有する画分をバイオセイフティーキャピネットにおいてプールする。（チューブ１および２に属する９６ウェ
ルプレートの両方をプールした後に全容量を測定する。さらに加えるいくらかのスペースがまだある場合、１．３７５のＲＩを有するウェルから加える。）
・第２の９６ウェルプレート（チューブＢから）にこの工程を繰り返す。
３）第２の勾配をのせる
・（チューブＡおよびＢからの）各勾配からの全プール容量は５〜６ｍＬのはずである。５０ｍＬファルコンチューブに２つの勾配採取をプールし、そしてＣｓＣｌの１．４１ｇ／ｍＬ溶液で容量を１３ｍＬにする。ピペットでよく混合する。
・１０ｍＬシリンジおよび１８Ｇ針を用いて、プールした第１の勾配採取を１３ｍＬの密封可能な遠心管に加える。溶液は、気泡なしにチューブの首上の線まで加えるべきである。
・ポータブルシーラー、金属チューブキャップおよびヒートシンクを用いてチューブを密封する。
・漏れを調べるためにチューブを押しつぶし、そして次に適切なバランスでＴｉ７０．１ローター中に置く。ローターキャップおよび蓋を挿入し、そして次に６０，０００ｒｐｍ、１５℃で２０時間回転させる。
３日目−第２のＣｓＣｌ回転からＡＡＶバンドを集め、そして脱塩する。
１）ＣｓＣｌ回転からバンドを集める
・勾配を乱さないように注意して、バケットから遠心管を注意深く取り出す。チューブをチューブホルダー上に固定する。この時点でチューブのほぼ中ほどにボトム照明（ｂｏｔｔｏｍ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）後に単一バンドが見えるはずである。
・２つの１／１６インチオス型ルアー（Ｆｉｓｈｅｒ ＮＣ９５０７０９０）を装着したあらかじめ滅菌した２ｆｔの長さのタイゴン−シリコーンチューブ（１．６ｍｍの内径；Ｆｉｓｈｅｒ ＮＣ９４２２０８０）を取り、そしてルアーに１８Ｇ １”針を挿入する。調製物当たり１つの長さのチューブを使用する。
・１８Ｇ １”針の１つをできるだけ底近くに直角にチューブに通し（ベベルを上に向けて）、そしてマスターフレックスポンプのイージーロードローラー中にチューブを固定する。第２の１８Ｇ針を最上部で再びチューブに通す。速度を〜１ｍＬ／分まで穏やかに上げ、そして次に９６ウェルプレートに画分（２５０μＬ）を集め始める。全勾配を集める（〜４５画分）。
２）屈折率（ＲＩ）を読み取る：
・マルチチャンネルピペッターを用いて、各画分の１０μＬを新しいプレートに移し、そしてバイオセイフティーキャビネット中に画分の残りを置いておく。
・各画分の５μＬを取り、そして屈折計を用いてＲＩを読み取る。ＡＡＶを含有する画分は、１．３７５０〜１．３６６０の屈折率を有するはずである。ＲＩを１．３６５０まで読み取り、そして次に１．３７５０〜１．３６６０の範囲のＲＩを有する画分をプールする。
３）脱塩：Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−Ｉ ５遠心濃縮器
この方法において、ベクターをＰＢＳで希釈し、そして１００ｋＤａ ＭＷＣＯフィルター装置を通して低速で回転させた。ＡＡＶ粒子の高分子量（〜５０００ｋＤａ）のために、ベクターは膜により保持され、そして塩は通過する。ベクターは膜上に蓄積することができ、従って、最終段階ですすぎが必要とされる。
・５０ｍＬのＰＢＳ＋３５ｍＭ ＮａＣｌを５０ｍＬチューブに等分する。
・上記の段階２からのプール画分をＰＢＳ＋３５ｍＭ ＮａＣｌで１５ｍＬの総容量に希釈する。穏やかに混合し、そしてＡｍｉｃｏｎフィルター装置に加える。
・卓上Ｓｏｒｖａｌｌ遠心機において２，０００〜４，０００ｒｐｍで２分間回転させる。ベクターが膜上に乾燥しないように常に液面をフィルター表面の最上部より上（〜１．８ｍＬ）に保つことは重要であるので、サンプルの流速を決定するために最初はより低速の回転を試みることが推奨される。目標は、リテンテートの容量を〜１．８ｍＬまで減らすことである。これを成し遂げるために追加の短い回転が必要とされ得る。容量が所望
のものより少なくなる場合、それをＰＢＳ＋３５ｍＭ ＮａＣｌで１．８ｍＬまで戻す。
・さらに１３．２ｍＬのＰＢＳ＋３５ｍＭ ＮａＣｌを加え、装置に残るリテンテートとピペットで混合し、そして上記の回転工程を繰り返す。あらかじめ等分した５０ｍＬのＰＢＳ＋３５ｍＭ ＮａＣｌが全て装置を通して回転して落とされるまでこの工程を続ける。
・全表面に対して繰り返しピペッティングすることにより最終リテンテート（〜１．８ｍＬ）で膜をすすぐ。１ｍＬおよび２００μＬのエッペンドルフチップを用いて適当な大きさの滅菌遠心管にリテンテートを回収する（２００μＬチップは１ｍＬのチップには届かない装置の底の最終リテンテート用である）。最低１００μＬのＰＢＳ＋３５ｍＭ ＮａＣｌを用いて膜を２回すすぎ、そしてそれを最終リテンテートと一緒にプールする。
・正確な容量を決定し、そしてグリセロールを５％まで加える。
・５ｘ２５μｌアリコート、保管用に１ｘ１００μＬ、そして残りを１０５μＬアリコートに等分する。
・−８０℃で即座に凍結させる。
ｒＡＡＶ精製において使用する試薬
・再懸濁バッファー１［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ ＭｇＣｌ］：５０ｍＬ ｌＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２ｍＬ／Ｍ ＭｇＣｌ２ ９４８ｍＬまでＭＱ水、フィルター滅菌。
・１．５ｇ／ｍＬ ＣｓＣｌ溶液：６７５ｇのＣｓＣｌを６５０ｍＬのＰＢＳに溶解し、そして最終容量を１０００ｍＬに調整する。密度を調べるために１ｍＬの溶液を秤量する。溶液をフィルター滅菌する。
・１．３ｇ／ｍＬ ＣｓＣｌ溶液：４０５ｇのＣｓＣｌを９０６ｍＬのＰＢＳに溶解し、そして１０００ｍＬに最終容量を調整する。密度を調べるために１ｍＬの溶液を秤量する。溶液をフィルター滅菌する。
・１０％（Ｗ／Ｖ）オクチル−ＰＤ−グルコピラノシド（ＯＧＰ）（Ｓｉｇｍａ，０８００１−１０Ｇ）：ｍｉｌｌｉＱ水で１０グラムを１００ｍＬにする。溶液をフィルター滅菌する。
・最終調合バッファー：ＰＢＳ＋３５ｍＭ ＮａＣｌ。１リットルの滅菌ＰＢＳに、７．０５ｍＬの滅菌５Ｍ ＮａＣｌを加える。
・滅菌グリセロール：１００ｍＬガラス瓶にグリセロールを等分する。液体サイクルで（ｏｎ ｌｉｑｕｉｄ ｃｙｃｌｅ）２０分間オートクレーブにかける。
８．実施例３：ＰＩＴＡ ＡＡＶベクターの製造用のＤＮＡ構築物
本発明は、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現を誘導する転写因子ドメインを二量化するために、ラパマイシンを用いるアブレーター発現の厳密な調節；および細胞におけるＣｒｅ認識部位（ｌｏｘＰ）を含有する導入遺伝子の成功した誘導性アブレーションを示す、実施例３〜５により例示される。アブレーターの発現の厳密な調節は、動物モデルにおいて示される。
下記のものはＤＮＡ構築物の例であり、ＤＮＡ構築物および本発明のＰＩＴＡ系に従って使用する複製欠損ＡＡＶベクターを作製するためのそれらの使用は、以下の実施例において説明される。
８．１．二量化可能な転写因子ドメイン単位およびアブレーション単位をコードする構築物
図８Ａ−Ｂ〜図１２Ｂは、二量化可能な転写因子ドメイン単位およびアブレーション単位をコードするＡＡＶベクターを作製するために使用することができる以下のＤＮＡ構築物の略図である：（１）ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ＴＦ．ＦＲＢ−ＩＲＥＳ−１ｘＦＫＢＰ．Ｃ
ｒｅ（図８Ａ−Ｂ）；（２）ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ＴＦ．ＦＲＢ−Ｔ２Ａ−２ｘＦＫＢＰ．Ｃｒｅ（図９Ａ−Ｂ）；（３）ｐＡＡＶ．ＣＭＶＩ７３．ＴＦ．ＦＲＢ−Ｔ２Ａ−３ｘＦＫＢＰ．Ｃｒｅ（図１０Ａ−Ｂ）；および（４）ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ＴＦ．ＦＲＢ−Ｔ２Ａ−２ｘＦＫＢＰ．ＩＳｃｅ−Ｉ（図１１Ａ−Ｂ）。
ＤＮＡ構築物に含まれる様々なドメインの記述は下記の通りである：
ＩＴＲ：ＡＡＶ血清型２の逆方向末端反復（１６８ｂｐ）。［配列番号：２６］
ＣＭＶ：エンハンサーを含む；全長サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター。［配列番号２７］
ＣＭＶ（１７３ｂｐ）：エンハンサーを含まない、最小ＣＭＶプロモーター。［配列番号：２８］
ＦＲＢ−ＴＡ融合：二量化剤結合ドメインおよび転写因子の活性化ドメインの融合（９００ｂｐ、配列番号：２９）。タンパク質は、配列番号：３０として本明細書において提供される。ＦＲＢフラグメントは、ＦＲＡＰ（ｍＴＯＲ［ラパマイシンの哺乳類標的］としても知られている、ＦＫＢＰラパマイシン関連タンパク質）、細胞増殖および分裂を制御するホスホイノシチド３−キナーゼホモログのアミノ酸２０２１〜２１１３に対応する。ＦＲＡＰ配列は、ある種の非免疫抑制性ラパマイシンアナログ（ラパログ）の使用を可能にするために単一の点突然変異Ｔｈｒ２０９８Ｌｅｕ（ＦＲＡＰＬ）を含む。ＦＲＡＰはラパマイシン（もしくはそのアナログ）およびＦＫＢＰに結合し、そして転写活性化因子としてヒトＮＦ−ＫＢ ｐ６５の一部（１９０アミノ酸）に融合している。
ＺＦＨＤ−ＦＫＢＰ融合：ＤＮＡ結合ドメインおよび１コピーの二量化剤結合ドメイン（１ｘＦＫＢＰ；７３２ｂｐ）、２コピーの薬剤結合ドメイン（２ｘＦＫＢＰ；１０５９ｂｐ）もしくは３（３ｘＦＫＢＰ；１３８９ｂｐ）コピーの薬剤結合ドメインの融合。イムノフィリンＦＫＢＰ（ＦＫ５０６−結合タンパク質）は、免疫抑制薬ＦＫ５０６およびラパマイシンの細胞内受容体として働く豊富な１２ｋＤａ細胞質タンパク質である。ＺＦＨＤは、ジンクフィンガー対およびホメオドメインからなるＤＮＡ結合ドメインである。両方の融合タンパク質は、５’末端にヒトｃ−ＭｙｃからのＮ末端核局在化配列を含有する。配列番号：４５を参照。
Ｔ２Ａ：自己切断ペプチド２Ａ（５４ｂｐ）（配列番号：３１）。
Ｚ８Ｉ：ヒトインターロイキン−２（ｌＬ−２）遺伝子からの最小プロモーターが続くＺＦＨＤの８コピーの結合部位（Ｚ８）（配列番号：３２）。例えば、プロモーター、例えばＩＬ−２からの最小プロモーターが続くＺＦＨＤの１〜約２０コピーの結合部位を含有する、このプロモーターのバリアントを使用することができる。
Ｃｒｅ：Ｃｒｅリコンビナーゼ。Ｃｒｅは、バクテリオファージＰ１から単離されたＩ型トポイソメラーゼである。Ｃｒｅは、２つのｌｏｘＰ部位間のＤＮＡにおける部位特異的組換えを媒介して欠失もしくは遺伝子変換をもたらす（１０２９ｂｐ、配列番号：３３）。
Ｉ−ＳｃｅＩ：メガヌクレアーゼの大きいクラスであるイントロンエンドヌレアーゼもしくはホーミングエンドヌクレアーゼのメンバー（７０８ｂｐ、配列番号：３４）。それらは、細菌および植物において見られるイントロンのような可動遺伝要素によりコードされる。Ｉ−ＳｃｅＩは、イントロンホーミング過程に関与する酵母エンドヌクレアーゼである。Ｉ−ＳｃｅＩは、哺乳類ゲノムにおけるまれな配列、特定の非対称の１８ｂｐ配列を認識し、そして二本鎖切断をもたらす。Ｊａｓｉｎ，Ｍ．（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，１２，２２４−２２８を参照。
ｈＧＨポリＡ：ヒトＧＨからの最小ポリアデニル化シグナル（配列番号：３５）。
ＩＲＥＳ：ＥＣＭＶ（脳心筋炎ウイルス）からの内部リボソーム侵入部位配列（配列番号：３６）。
８．２．導入遺伝子単位をコードする構築物
図１２Ａ−Ｂおよび図１３Ａ−Ｂは、ＣｒｅリコンビナーゼのｌｏｘＰ認識部位が隣接する導入遺伝子をコードするＡＡＶベクターを作製するための以下のＤＮＡ構築物の略図である：
（１）ｐＥＮＮ．ＣＭＶ．Ｐｌ．ｌｏｘＰ．Ｌｕｃ．ＳＶ４０（図１２Ａ−Ｂ）；および（２）ｐＥＮＮ．ＣＭＶ．Ｐｌ．ｓｃｅ．Ｌｕｃ．ＳＶ４０（図１３Ａ−Ｂ）。構築部の様々なドメインの記述は下記の通りである：
ＩＴＲ：ＡＡＶ血清型２の逆方向末端反復（配列番号：２６）。
ＣＭＶ：前初期遺伝子発現を調節するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびエンハンサー（８３２ｂｐ、配列番号：２７）。
ｌｏｘＰ：Ｃｒｅの認識配列。それは、方向性を与える８ｂｐ領域に隣接する２つの１３ｂｐ逆方向反復を含んでなる３４ｂｐ配列である（３４ｂｐ、配列番号：３７）。
Ｆｆルシフェラーゼ：ホタルルシフェラーゼ（１６５６ｂｐ、配列番号：３８）。
ＳＶ４０：後期ポリアデニル化シグナル（２３９ｂｐ、配列番号：３９）。
Ｉ−ＳｃｅＩ部位：ＳｃｅＩ認識部位（１８ｂｐ、配列番号：２５）。
８．３．導入遺伝子単位および二量化可能な転写因子ドメイン単位をコードする構築物
図１４は、導入遺伝子単位および二量化可能な転写因子ドメイン単位を含有するＡＡＶベクターを作製するためのＤＮＡ構築物の略図である。このプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、転写因子（ＴＦ）ドメイン単位、ＣＭＶプロモーター、ＦＲＢ（ＦＲＡＰ（ｍＴＯＲ［ラパマイシンの哺乳類標的］としても知られている、ＦＫＢＰラマパイシン関連タンパク質）、細胞増殖および分裂を制御するホスホイノシチド３−キナーゼホモログのアミノ酸２０２１〜２１１３）、Ｔ２Ａ自己切断ドメイン、ＦＫＢＰドメイン、およびヒト成長ホルモンポリＡ部位を含有するＡＡＶプラスミドバックボーン上に、ＣＭＶプロモーター、ｌｏｘＰ部位、インターフェロンアルファコーディング配列およびＳＶ４０ポリＡ部位を提供する。アブレーション単位（ｃｒｅ発現カセット）は、別個の構築物上に位置することができる。この戦略は、上流のＣＭＶプロモーターから導かれるｃｒｅの任意の潜在的なバックグラウンドレベル発現を最小限に抑えることができる。
９．実施例４：ＰＩＴＡ用のインビトロモデル
本実施例は、ＡＡＶベクター中に設計されたＤＮＡ要素（単位）が細胞における導入遺伝子の厳密に制御された誘導性アブレーションを成功裏に成し遂げることを示す。特に、本実施例は、導入遺伝子単位（ルシフェラーゼを発現しそしてｌｏｘｐ部位を含有する）、アブレーション単位（Ｃｒｅを発現する）および二量化可能な転写因子ドメイン単位を含有する構築物でトランスフェクションした細胞の二量化剤（ラパマイシン）処理の際にルシフェラーゼ導入遺伝子発現を取り除くことができることを示す。
ヒト胎児腎臓線維芽細胞２９３細胞を１２ウェルプレート上にまいた。本明細書の９．１節に記載の様々なＤＮＡ構築物での細胞のトランスフェクションは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎから購入したリポフェクトアミン２０００を用いて細胞密度が９０％のコンフルエンシーに到達した翌日に実施した。トランスフェクションの内部コントロールとして働くように高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードするベクターを各ウェルに全ＤＮＡの１０％で加えた。ＤＭＥＭに懸濁したＤＮＡをリポフェクトアミン２０００と混合してＤＮＡ−脂質複合体を形成し、そしてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより提供される説明書に従ってトランスフェクションのために２９３細胞に加えた。トランスフェクション後６時間で、ウェルの半分を５０ｎＭの最終濃度でラパマイシンで処理した。培養培地（１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ）を新しいラパマイシンと共に毎日置き換えた。トランスフェクション後４８および７２時間で、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、そして次にウェルからこすり取り、Ｐｒｏｍｅｇａから購入したルシフェラーゼアッセイキット中に供給される溶解バッファーに再懸濁した。細胞懸濁液をボルテックスにかけ、そして残屑を遠沈した。１０μＬの溶解物を１００μＬの基質と混合することによりルシフェラーゼ活性を決定し、そして秒当たりの発光を照度計から読み取った。
９．１．構築物
その大部分は８節、実施例３に記述される、以下の構築物を感染性の複製欠損ＡＡＶベクターを作製するために使用した：
１．ＣＭＶプロモーターを含有しそして導入遺伝子を含まない、コントロールとしてのｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＭＶ．ＲＢＧ
２．ｐＥＮＮ．ＣＭＶ．Ｐｌ．ｌｏｘＰ．Ｌｕｃ．ＳＶ４０（図１２Ａ−Ｂ）／ｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＭＶ．ＲＢＧ（ＣＭＶプロモーターそして導入遺伝子なし）
３．ｐＥＮＮ．ＣＭＶ．Ｐｌ．ｌｏｘＰ．Ｌｕｃ．ＳＶ４０（図１２Ａ−Ｂ／ｐＡＡＶ．ＴＦ．ＣＭＶ．ＦＲＢ−Ｔ２Ａ−２ｘＦＫＢＰ．Ｃｒｅ（図９Ａ−Ｂ）
４．ｐＥＮＮ．ＣＭＶ．Ｐｌ．ｌｏｘＰ．Ｌｕｃ．ＳＶ４０（図１２Ａ−Ｂ／ｐＡＡＶ．ＴＦ．ＣＭＶ．ＦＲＢ−ＩＲＥＳ−ＦＫＢＰ．Ｃｒｅ（図８Ａ−Ｂ）
５．ｐＥＮＮ．ＣＭＶ．Ｐｌ．ｌｏｘＰ．Ｌｕｃ．ＳＶ４０（図１２Ａ−Ｂ）／ｐＡＡＶ．ＣＭＶＩ７３．ＦＲＢ−Ｔ２Ａ−３ｘＦＫＢＰ．Ｃｒｅ（図１０Ａ−Ｂ）
６．構成的プロモーターからＣｒｅ遺伝子を発現する、ｐＥＮＮ．ＣＭＶ．ＰＩ．ｌｏｘＰ．Ｌｕｃ．ＳＶ４０（図１２Ａ−Ｂ）／ｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＭＶ．ＰＩ．Ｃｒｅ．ＲＢＧ
９．２．結果
４８時間での結果を図１５Ａに示し、そして７２時間での結果を図１５Ｂに示す。Ｃｒｅが構成的に発現されるコントロール（処置６）において、ルシフェラーゼ発現は、ｌｏｘＰ部位のないルシフェラーゼのコントロール発現（処置２、ルシフェラーゼ構築物でトランスフェクションした細胞）と比較してラパマイシンとは関係なく取り除かれた。対照的に、ルシフェラーゼ構築物に隣接するｌｏｘＰに加えてＰＩＴＡ系の制御下でｃｒｅを保有する構築物の１つを受けている細胞において（処置３、４および５）、レポーター遺伝子発現のレベルは二量化剤、ラパマイシンの不在下でコントロールに匹敵し、ほとんどもしくは全くｃｒｅ発現が誘導されないことを示す。しかしながら、ラパマイシンでの処理による誘導の際に、ＰＩＴＡ制御ｃｒｅ構築物を受けている細胞におけるレポーター遺伝子発現のレベルはコントロール（処置２）と比較して有意に減少しており、ｃｒｅ発現が活性化されたことを示す。これらの結果は、アブレーターの発現が二量化剤、ラパマイシンにより特異的に調節されることを裏付ける。
１０．実施例５：二量化剤誘導系のインビボモデル
本実施例は、本明細書に記載の二量化剤誘導系により調節される肝臓特異的プロモーターを用いる導入遺伝子発現の厳密な組織特異的制御を示す。これらのデータは、ＰＩＴＡ系におけるアブレーターの厳密な調節のモデルとして役立つ。
３匹のマウスの４グループは、それぞれ、３ｘ１０１０、１ｘ１０１１および３ｘ１０１１粒子のウイルスの用量で２シストロン性レポーター遺伝子（ＧＦＰ−ルシフェラーゼ）をコードするＡＡＶベクターのＩＶ注射を受けた：グループ１（Ｇ１、Ｇ２およびＧ３）は、ユビキタスな構成的ＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰルシフェラーゼを発現するＡＡＶベクターを受けた（ＤＮＡ構築物の略図は図１６Ａを参照）。グループ２（Ｇ４、Ｇ５およびＧ６）は、以下の２つのＡＡＶベクター：（１）ＣＭＶプロモーターにより導かれる二量化可能な転写因子ドメイン単位（ｐ６５活性化ドメインと融合したＦＲＢおよび３コピーのＦＫＢＰと融合したＤＮＡ結合ドメインＺＦＨＤ）を発現するＡＡＶベクター（図９Ｂに示されるＤＮＡ構築物）；および（２）二量化したＴＦにより誘導されるプロモーターにより導かれるＧＦＰ−ルシフェラーゼを発現するＡＡＶベクター（ＤＮＡ構築物の略図は図１９Ｃを参照）の共注射を受けた。グループ３（Ｇ７、Ｇ８およびＧ９）は、肝臓構成的プロモーター、ＴＢＧの制御下でＧＦＰ−ルシフェラーゼを発現するＡＡＶベクターを受けた（ＤＮＡ構築物の略図は図１６Ｃを参照）。グループ４（Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１２）は、以下の２つのＡＡＶベクター：（１）ＴＢＧプロモーターにより導かれる二量化可能な転写因子ドメイン単位（ｐ６５活性化ドメインと融合したＦＲＢおよび３コピーのＦＫＢＰと融合したＤＮＡ結合ドメインＺＦＨＤ）を発現するＡＡＶベクター；および（２）二量化したＴＦにより誘導されるプロモーターにより導かれるＧＦＰ−ルシフェラーゼを発現するＡＡＶベクター（ＤＮＡ構築物の略図は図１６Ｄを参照）の共注射を受けた。
ウイルス投与後約２週で、マウスに２ｍｇ／ｋｇの用量で二量化剤、ラパマイシンのＩＰ注射を与えた。翌日開始してルシフェラーゼ発現をＸｅｎｏｇｅｎ画像解析によりモニターした。ラパマイシン注射後約２４時間で、マウスにルシフェラーゼの基質、ルシフェリンをＩＰ注射し、次に造影のために麻酔をかけた。
３ｘ１０１１粒子のウイルスを受けたマウスは、ルシフェリン注射後３０分で画像を撮った（図１７Ａ−Ｄ）。ＧＦＰ−ルシフェラーゼを保有するベクターを受けたグループ１マウスでは、ＣＭＶプロモーターにより導かれる発現、ルシフェラーゼ発現は様々な組織において、そして主に肺、肝臓および筋肉において認められた（図１７Ａ参照）。対照的に、ルシフェラーゼ発現は、ＴＢＧプロモーターにより発現が制御されるルシフェラーゼベクターを受けたグループ３マウスにおいて肝臓に限定された（図１７Ｂ参照）。グループ２マウスにおいて、ルシフェラーゼ発現のレベルは、誘導前のレベルと比較して２ｌｏｇより多く上昇しており、そして発現は主に肝臓および筋肉においてである（図１７Ｃ参照）。グループ４マウスにおいて、誘導前と比較して、１００倍より多いルシフェラーゼ発現が誘導されそして肝臓に限定された（図１７Ｄ参照）。
１ｘ１０１１粒子のウイルスを受けたマウスは、高用量群のものと同様であるが、誘導の際により低いレベルの発現で、そして主に肝臓における結果を示す（図１８Ａ−Ｄを参照）。
結論：
１．二量化剤誘導系は、ベースラインに対して２ｌｏｇより多いルシフェラーゼ発現のピークレベルを有して強力であり、そして１週以内にベースライン近くまで戻る（示されない）。
２．肝臓は、ウイルスをＩＶで与えた場合に感染を受ける最も効率の良い組織である。
３．肝臓はまた、二量化剤誘導系が働くために重要である２つのウイルスで共形質導入される最も効率の良い組織でもある。
４．ＣＭＶプロモーターにより制御される転写因子発現を有するその二量化剤誘導系により調節されるルシフェラーゼ発現は、調節なしのＣＭＶプロモーター由来の発現よりマウ
ス肝臓において有意に高い。これは、誘導性プロモーターがＣＭＶプロモーターと比較していったんそれが活性化されると肝臓においてより強力なプロモーターであることを示した。
５．ルシフェラーゼ発現は、誘導性ＴＢＧプロモーター系を保有するベクターを受けているマウスにおいてラパマイシンによる誘導の際に肝臓において特異的に検出された。肝臓特異的な調節可能なベクターにより媒介されるルシフェラーゼ発現はラパマイシンによる誘導に完全に依存的であり、そしてルシフェラーゼ発現のピークレベルはＴＢＧプロモーターの制御下のものに匹敵する。本研究は、肝臓特異的な二量化剤誘導系のＡＡＶ媒介遺伝子送達により肝臓特異的遺伝子調節を行うことができることを裏付けた。
１１．実施例６：加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）治療のためのＰＩＴＡ
モノクローナル抗体の硝子体内投与は、患者の亜集団において疾病進行を遅らせそして視力を改善するためのＡＭＤの有効な治療であると判明している。しかしながら、この方法の重大な制約は、反復硝子体内注射の必要性である。遺伝子治療は長期補正を提供する可能性を有し、そして単回注射は治療効果を得るために十分なはずである。図１９Ａ〜Ｃは、抗ＶＥＧＦ抗体（アバスチン重鎖（アバスチンＨ）およびアバスチン軽鎖（アバスチンＬ）；図１９Ｂおよび１９Ｃ）もしくは可溶性ＶＥＧＦ受容体（ｓＦｌｔ−１；図１９Ａ）のようなＶＥＧＦアンタゴニストを含んでなる導入遺伝子単位を含有する、ＡＭＤを処置するためのＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物を示す。これらのＤＮＡ構築物を含んでなるベクターは、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で網膜下注射によって送達することができる。導入遺伝子発現のアブレーションは、長期抗ＶＥＧＦ治療の悪影響が認められる場合に経口二量化剤投与により行うことができる。
１２．実施例７：肝臓代謝疾患治療のためのＰＩＴＡ
ＰＩＴＡは、Ｃ型肝炎および血友病のような肝臓代謝疾患を処置するために潜在的に有用である。図２０Ａは、第ＩＸ因子を含んでなる導入遺伝子単位を含有する、血友病Ａおよび／もしくはＢを処置するためのＰＩＴＡ構築物を示す。第ＶＩＩＩ因子もまた、それぞれ血友病ＡおよびＢの処置のために送達することができる（それぞれ、血友病ＡおよびＢのために第ＶＩＩＩおよびＩＸ因子）。治療は、阻害剤形成が起こる場合に患者において取り除くことができる。図２０Ｂは、ＨＣＶのＩＲＥＳを標的とするｓｈＲＮＡの送達のためのＰＩＴＡ構築物を示す。この構築物を含んでなるベクターは、３ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇの用量で門静脈の腸間膜支流を介して注射することができる。ｓｈＲＮＡの発現は、ＲＮＡ干渉の非特異的毒性が生じるかもしくは治療がもはや必要とされない場合に取り除くことができる。
１３．実施例８：心臓疾患治療のためのＰＩＴＡ
ＰＩＴＡは、鬱血性心不全（ＣＨＦ）および心筋梗塞（ＭＩ）が包含されるがこれらに限定されるものではない心臓疾患用途に利用することができる。ＣＨＦの処置は、図２１Ａおよび２１Ｂに示される構築物を用いるインシュリン様成長因子（ＩＧＦ）もしくは肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の送達を含むことができる。心筋梗塞の処置には、ＭＩの初期段階における遺伝子の送達は、虚血の悪影響から心臓を保護することができるが、もはや必要とされない場合に治療のアブレーションを可能にする。この方法の治療遺伝子には、虚血性損傷の程度を限定するように働くことができるヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）が包含される。心臓へのベクター媒介遺伝子送達の送達方法には、経皮、血管内、筋肉内および心臓肺バイパス技術が包含される。ヒトには、最適なベクター媒介遺伝子送達プロトコルは冠状動脈もしくは前心静脈への逆行もしくは順行トランス冠状動脈送達を利用すると思われる。
１４．実施例９：中枢神経系（ＣＮＳ）疾患治療のためのＰＩＴＡ
中枢神経系におけるＰＩＴＡの適用の魅力的な候補には、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病および眼疾患の処置のための神経栄養因子が包含される。図２２は、神経成長因子（ＮＧＦ）を含んでなる導入遺伝子単位を含有する、アルツハイマー病を処置するためのＰＩＴＡ構築物を示す。ＮＧＦのＡＡＶベクター媒介遺伝子送達は、アルツハイマー病の処置のためにＣｅｒｅｇｅｎｅにより実施される第１相臨床試験において現在研究されている。ＮＧＦは、神経変性疾患の動物モデルにおいてコリン作動性細胞消失を減らすことにおいて有効であることが示されておりそしてＡＤ患者において記憶および認知能力の喪失を防ぐことにおいて有効であり得る、神経栄養因子である。該方法の送達方法は、マイネルト基底核（ＮＢＭ）を含有する脳の基底前脳領域を標的とする両側定位固定注射からなる。処置を止める必要をもたらす副作用の可能性のために、ＰＩＴＡを含むように構築物をさらに改変することが必要とされる。
てんかんの処置のための中枢神経系におけるＰＩＴＡの適用もまた、発作に関する問題がいったん解消されるようになると遺伝子発現を取り除く可能性のためにならびに薬剤治療に反応せずそして外科的に処置することが難しいてんかんの処置に利用可用な限られた代替法のために有用であり得る。これらの場合において、特に、治療遺伝子を発現するベクターの定位固定注射を伴う送達方法は、代わりの外科的処置よりはるかに低侵襲性である。遺伝子発現の候補には、ガラニン、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）およびグリア細胞系由来神経栄養因子、ＧＤＮＦを包含することができ、これらはてんかんの動物モデルにおいて治療効果を有することが示されている。他の適用には、アルツハイマー病に神経成長因子（ＮＧＦ）をそしてパーキンソン病に芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＤＣＣ）を送達することが包含される。
１５．実施例１０：ＨＩＶ治療のためのＰＩＴＡ
ＨＩＶに対する自然に誘導される中和抗体は、長期感染患者の血清において同定されている。ＡＡＶにより送達される中和抗体の効率の悪い誘導しかし十分なレベルをもたらしている、能動的ワクチン法の代わりとして、ＰＩＴＡは受動免疫治療用の抗ＨＩＶ中和抗体を送達するために有望な方法である。図２３を参照。構築物設計は、ＡＭＤ治療のためのアバスチン遺伝子送達と同様である（図１９Ｂおよび１９Ｃを参照）。肝臓特異的プロモーター（ＴＢＧ）により調節される抗体をコードする構築物を含んでなるベクターは、３ｘ１０１２ＧＣ／ｋｇの用量で肝臓に注射することができる。あるいはまた、抗体発現を導くユビキタスなＣＢ７プロモーターを保有する構築物を含んでなるベクターは、大腿四頭筋および二頭筋に２０回までの注射にわたって５ｘ１０１２ＧＣ／ｍＬの用量で筋肉内注射により送達することができる。治療は、それがもはや必要とされない場合にもしくは抗薬剤抗体の誘導のために毒性が生じる場合に取り除くことができる。
１６．実施例１１：
以下の実施例において記述するＤＮＡ構築物は、本発明の複製欠損ＡＡＶウイルスおよびウイルス組成物を製造するために用いることができる。
様々なエンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームはコドン最適化され、そしてＧｅｎｅＡｒｔによりデノボ合成された。アブレーター発現および標的プラスミドは、標準的な分子生物学クローニング技術を用いて作製した。トランスフェクションは、リポフェクトアミンＴＭ２０００トランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＨＥＫ２９３細胞において行った。全てのトランスフェクシ
ョンは、トランスフェクション試薬プロトコルにおいて定義した通りの最適なトランスフェクション条件を用いて行った。簡潔に言えば、２００〜２５０ｎｇのプラスミドＤＮＡ（トランスフェクションコントロールプラスミドを除く）をリポフェクトアミンと複合体形成させ、そして９６ウェルプレート中の細胞に加えた。ＤＮＡ量は、試験プラスミドと同じプロモーターを含有する関係のないプラスミドでの補完により全ての条件にわたって一定であった。トランスフェクション試薬プロトコル通りトランスフェクション複合体を細胞と４〜６時間インキュベーションし、その後でＦＢＳ補足培地を加えた。トランスフェクションした細胞を３７℃で２４〜７２時間インキュベーションした。インキュベーション後に、Ｂｉｏ Ｔｅｋ Ｃｌａｒｉｔｙプレートリーダー上でＰｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼ検出キットを製造業者の説明書に従って用いて細胞をレポーター遺伝子発現についてアッセイし、そしてウミシイタケルシフェラーゼをトランスフェクション効率を制御するために使用した。全てのサンプルは四重反復で行い、そして平均の標準誤差を計算した。
Ａ．野生型ＦｏｋＩの共発現は、ＦｏｋＩタンパク質の送達より効果的に導入遺伝子の発現を取り除く
ＦｏｋＩ酵素のアミノ酸配列は配列番号：１２に提供され、ここで、アミノ酸１〜３８７はＤＮＡ結合ドメインであり、アミノ酸３８７〜５８４は触媒ドメインである。コドン最適化したＦｏｋＩ配列は配列番号：１に提供される。
図２５は、野生型ＦｏｋＩがＨＥＫ２９３細胞への共トランスフェクション後にルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を効果的に取り除いたことを例示し（図２５Ａ棒２）、一方、ＦｏｋＩタンパク質を細胞に送達した場合には部分的なアブレーションのみが認められた（図２５Ａ、棒３）。
用量依存的実験において、ＦｏｋＩ発現ベクターはジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＨＤ）に融合したＦｏｋＩ触媒ドメインを含有した。９６３ｂｐであるこの構築物は配列番号：２１に提供され、そして塩基対１〜３６６ｂｐＺＦＨＤ、３６７〜３７２ｂｐリンカーおよび３７３〜９６３ｂｐＦｏｋＩ触媒ドメインからなる。得られる発現産物はアミノ酸１〜１２２（ＺＦＨＤ）を含んでなり、アミノ酸１２３〜１２４はリンカーであり、そしてアミノ酸１２５〜３２１はＦｏｋＩ触媒ドメインからである。図２５Ｂは、ＦｏｋＩの濃度を増加することによりＬｕｃレポーターの用量依存的アブレーションがもたらされたことを例示する。ルシフェラーゼは多数の天然のＦｏｋＩ部位を含有するので、この例示において導入遺伝子を含有する転写単位中にアブレーション部位を設計する必要はなかった。
これは、細胞への送達用の導入遺伝子を含有する転写単位中の特定のアブレーション部位に向けられるトランスフェクションしたＦｏｋＩ酵素を用いるＰＩＴＡ系の使用への裏付けを提供する。
Ｂ．ジンクフィンガー−ホメオドメインによりＤＮＡ上の非コグネイト認識部位に繋留されるキメラの改変されたＦｏｋＩはＬｕｃレポーター遺伝子の発現を効果的に取り除く
本実施例におけるプラスミド構築物は、ＦｏｋＩ触媒ドメイン（全長タンパク質のアミノ酸３８７〜５８４に対応する１９８アミノ酸（配列番号：１４））（非繋留ＦｏｋＩ）もしくは上記のＡ部分に記載の通りの９６３ｂｐのＺＦＨＤ−ＦｏｋＩ触媒ドメイン（繋留ＦｏｋＩ）のいずれかを含有する。最高濃度でさえ、ＤＮＡに繋留されないＦｏｋＩの触媒ドメインは、Ｌｕｃレポーター遺伝子の発現に効果を有さない（図２６Ａ）。ＺＦＨＤとの融合を介してＤＮＡに繋留されるキメラの改変されたＦｏｋＩは、増加する濃度のＺＦ−ＨＤ−ＦｏｋＩ発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクションした場合に用量依存的にルシフェラーゼレポーターの発現を効果的に取り除いた（図２６Ｂ）
。
これは、ＰＩＴＡ系および細胞への送達用の導入遺伝子を含有する転写単位中の特定のアブレーション部位に向けられるキメラ酵素により提供される追加の安全要素の使用を裏付ける。
Ｃ．キメラのＦｏｋＩのＤＮＡ結合特異性は異種ＤＮＡ結合ドメインの様々な種類との融合により再現性良く変えることができ、そして標的導入遺伝子のアブレーションは異種ＮＬＳの付加によりさらに改善することができる
本実施例は、ジンクフィンガーホメオドメイン（ＺＦＨＤ）がキメラの改変された酵素により媒介されるアブレーションの特異性を改変するために適当な唯一のドメインではないことを例示する。ＦｏｋＩは、ＨＴＨ ＤＮＡ結合ドメインをＦｏｋＩ触媒ドメインに融合した場合に用量依存的にルシフェラーゼレポーターの発現を効果的に取り除いた（図２７Ａ）。別個の実験において（図２７Ｂ）、ＨＴＨ−ＦｏｋＩの活性は、ＨＴＨ−ＦｏｋＩコーディング配列のＮ末端に異種ＮＬＳを付加することによりさらに改善された。
ＨＴＨ−ＦｏｋＩ触媒ドメイン（配列番号：５）は、Ｇｉｎ（セリンリコンビナーゼ）からの１〜１７１ｂｐＨＴＨ、リンカー（ｂｐ１７２〜１７７）およびコドンを最適化したＦｏｋＩ由来のＦｏｋＩ触媒ドメイン（１７８〜７６８ｂｐ）からなる。得られるキメラ酵素（配列番号：６）は、ＧｉｎからのＨＴＨのａａ１〜５７、リンカー（ａａ５８〜５９）およびＦｏｋＩ触媒ドメイン（アミノ酸６０〜２５６）を含有する。
図２７Ａ〜２７Ｂは、キメラのＦｏｋＩのＤＮＡ結合特異性を別の種類の異種ＤＮＡ結合ドメインとの融合により再現性良く変更できそして標的導入遺伝子のアブレーションが異種核局在化シグナル（ＮＬＳ）の付加によりさらに改善できることを例示する棒グラフである。図２７Ａは、ＨＴＨ融合によってＤＮＡに繋留されたＦｏｋＩをコードする発現プラスミドの増加する濃度とｐＣＭＶ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの共トランスフェクションの結果を例示する（６．２５、１２．５、２５、５０および１００ｎｇ）。最初の棒は、５０ｎｇのｐＣＭＶ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅのみを示すコントロールである。図２７Ｂ そのＮ末端にＮＬＳをさらに有する、ＨＴＨ−ＦｏｋＩ融合をコードする発現プラスミドの増加する濃度とｐＣＭＶ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ。
１７．実施例１２：
ここで例示されないが、他のキメラ酵素が本明細書に記載の技術を用いて作製されている：
ＳＶ４０ Ｔ−Ａｇの核局在化シグナル（１〜２４ｂｐ）およびＧｉｎ、セリンリコンビナーゼからのＨＴＨ（２５〜１９２ｂｐ）を含む、ＳＶ４０ Ｔ−Ａｇ ＮＬＳ−Ｇｉｎからのヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）（１９２ｂｐ、配列番号：７）を含有するＡＡＶプラスミド。得られる酵素（配列番号：８）において、アミノ酸１〜８はＳＶ４０ Ｔ−Ａｇ ＮＬＳからであり、そしてアミノ酸９〜６４はＧｉｎからのＨＴＨである；
ＳＶ４０ Ｔ−Ａｇ ＮＬＳ（ｂｐ１〜２４）、ＧｉｎからのＨＴＨ（ｂｐ２５〜１９２）、リンカー（ｂｐ１９３〜１９８）およびＦｏｋＩの触媒ドメイン（ｂｐ１９９〜７８９）含む、ＳＶ４０ Ｔ−Ａｇ ＮＬＳ−ＨＴＨ−ＦｏｋＩ触媒ドメイン（７８９ｂｐ、配列番号：９）を含有するＡＡＶプラスミド。得られるキメラ酵素（配列番号：１０）において、アミノ酸１〜８はＳＶ４０ Ｔ−Ａｇ ＮＬＳからであり、アミノ酸９〜６４はＧｉｎからのＨＴＨであり、アミノ酸６５〜６６はリンカー残基であり、そしてアミノ酸６７〜２６３はＦｏｋＩ触媒ドメインである。
ＳＶ４０ Ｔ−Ａｇ ＮＬＳ（ｂｐ１〜２４）、ジンクフィンガーホメオドメイン（ｂ
ｐ２５〜３８７）、リンカー（ｂｐ３８８〜３９３）およびＦｏｋＩ触媒ドメイン（ｂｐ３９４〜９８４）を含む、ＳＶ４０ Ｔ−Ａｇ ＮＬＳ−ＺＦＨＤ−ＦｏｋＩ触媒ドメイン（９８４ｂｐ）を含有するＡＡＶプラスミドを作製した（配列番号：２３）。得られるキメラ酵素（配列番号：２１、３２８ａａ）において、アミノ酸１〜８はＳＶ４０ Ｔ−Ａｇ ＮＬＳであり、アミノ酸９〜１２９はＺＦＨＤであり、アミノ酸１３０〜１３１はリンカー残基であり、そしてアミノ酸１３２〜１３８はＦｏｋＩ触媒ドメインである。
これらおよび他の構築物は、ウイルス組成物およびＰＩＴＡ系用に本発明の方法に従ってウイルスを製造するために用いることができる。
１８．実施例１３：ＨＩＶの処置における複製欠損ＡＡＶウイルス組成物の使用
本組成物は、ＨＩＶの処置における安全機序として潜在的に使用することができる。最近、エイズへの進行なしに数十年にわたってＨＩＶ＋状態を維持する個体、長期非進行者からの広範に中和する抗体が、いくつかの研究グループにより同定されている。
ＨＩＶに対する中和抗体（ＨＩＶ ＮＡｂ）の全てのコーディング領域が、ＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）の間に置かれる。構築物の全サイズが４．７ｋｂ未満（２つのＩＴＲを含む）である場合、それらはＡＡＶキャプシドにパッケージングされる。選択するＡＡＶ血清型キャプシドは、遺伝子発現のレベル、送達の方法および必要とされる注射部位からの生体内分布の程度によって決まる。さらに、ＨＩＶ ＮＡｂの発現に使用する構成的プロモーター（および潜在的に１つの小分子の場合における誘導系の部分）は、標的とする組織タイプによって決まる。潜在的臨床研究の以下の実施例において、選択するベクター血清型は、肝臓特異的プロモーターＴＢＧの利用を可能にする静脈内注射により投与されるＡＡＶ８である。
ＨＩＶ＋患者において、これらのＨＩＶ中和抗体の１つもしくはそれ以上を発現するＡＡＶベクターの投与は、１つもしくはそれ以上の広範ＨＩＶ ＮＡｂの長期の高レベル発現をもたらし、そしてウイルス量を減らし、ＨＩＶの獲得を潜在的に防ぐ。この場合、個体は５ｘ１０１２ゲノムコピー／各ベクターのキログラムの用量で２つのＡＡＶベクターの静脈内注射を受ける。２つのＡＡＶベクターに含まれるのは、構成的プロモーターの制御下のＨＩＶ中和抗体であり、ベクターの投与後に発現が迅速に起こることを可能にする。
Ａ．ヘテロ二量体および２つの小分子
ＨＩＶ ＮＡｂに対する潜在的毒性の最初の兆候の後、誘導系の成分、この場合、ＦＫＢＰに連結されたＤＮＡ結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼ酵素の触媒ドメインに連結されたＦＲＡＰＬの発現を誘導するために第１の小分子薬剤が投与される。これは、ＨＩＶ ＮＡｂに対するさらなる毒性が生じる場合に系を作用のために準備することを可能にする。毒性レベルが上昇し続ける場合、エンドヌクレアーゼ活性の開始は、活性酵素の形成およびＨＩＶ ＮＡｂ遺伝子発現のアブレーションをもたらす第２の小分子薬剤の投与により誘導される。
Ｂ．ヘテロ二量体および１つの小分子
また構成的発現の制御下であるのは、ラパマイシン誘導系の要素、ＦＫＢＰおよびＦＲＡＰＬである。ＡＡＶベクターの投与後に、患者は数年間にわたって一定の間隔で綿密にモニターされる。ＨＩＶ ＮＡｂに対する毒性が生じる場合、ラパマイシンもしくはラパログの送達が実行される。反復投与まで増やす可能性を有してまず最初に１ｍｇ／ｋｇのラパマイシン／ラパログのＩＶ投与が、ＨＩＶ抗体の発現を取り除くために与えられる。
毒性およびＨＩＶ抗体レベルは、ＨＩＶ ＮＡｂの発現が検出できないレベルに到達するまで綿密にモニターされる。従って、ＨＩＶ ＮＡｂの遺伝子発現のアブレーションは、克服できない毒性が生じる場合に遺伝子発現を取り除くための安全スイッチを提供する。
本明細書において引用される全ての公開、特許および特許出願、ならびに優先出願米国特許出願第６１／３１８，７５５号および配列表は、各個々の公開もしくは特許出願が引用することにより組み込まれると明確にそして個々に示されるように引用することによりそれらの全部が本明細書に組み込まれる。前述の発明は理解を明らかにする目的のために例示および実施例としていくらか詳細に記述されているが、添付の請求項の精神もしくは範囲から逸脱せずにある種の変更および改変をそれに行うことができることは本発明の教示を考慮すると当業者に容易に明らかである。

Claims (15)

  1. ヒト患者における使用するための複製欠損アデノ随伴ウイルス組成物であって、２種以上のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのストックを含んでなり、かつ、
    （ａ）治療用製品の転写を制御するプロモーターと機能的に結合した治療用製品をコードする第１の転写単位であって、キメラの改変されたヌクレアーゼアブレーターに特異的なアブレーション認識部位を含有する該第１の転写単位；および
    （ｂ）調節可能なプロモーターと機能的に結合したアブレーション認識部位に特異的なアブレーターをコードする少なくとも一つの第２の転写単位であって、該転写および／もしくはアブレーション活性が薬理学的作用物質により制御される該第２の転写単位
    を含んでなり、
    該アブレーターが第１の配列（ｉ）および第２の配列（ｉｉ）を有するキメラの改変されたヌクレアーゼであり、第１の配列におけるヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインが薬理学的作用物質の二量化可能な結合ドメインに融合しており、第２の配列におけるヌクレアーゼヌクレアーゼ切断ドメインが薬理学的作用物質の二量化可能な結合ドメインに融合しており、かつ、第１の配列（ｉ）及び第２の配列（ＩＩ）は各々プロモーターの発現を制御する少なくとも一つ該プロモーターと機能的に結合している、
    前記組成物。
  2. 請求項１に記載の複製欠損アデノ随伴ウイルス組成物であって、以下の任意の特徴：（ｉ）該第１の転写単位が１つより多くのアブレーション認識部位を含有すること、または
    （ｉｉ）該第１の転写単位を担持するＡＡＶベクターのストックが１つより多くのアブレーション認識部位を含んでなり、該１つより多くのアブレーション認識部位が第１のアブレーション認識部位および該第１のアブレーション認識部位と異なる第２のアブレーション認識部位を含んでなり、該組成物が第１のアブレーション認識部位に特異的な第１のアブレーターおよび第２の認識部位に特異的な第２のアブレーターをさらに含むこと、
    を有する、組成物。
  3. 調節可能なプロモーター系がｔｅｔ−オン／オフ系、ｔｅｔＲ−ＫＲＡＢ系、ミフェプリストン（ＲＵ４８６）調節可能な系、タモキシフェン依存的な調節可能な系、ラパマイシンで調節可能な系もしくはエクジソンに基づく調節可能な系から選択される請求項１に記載の複製欠損アデノ随伴ウイルス組成物。
  4. アブレーターが、第１の転写単位中のアブレーション認識部位に結合しそしてＤＮＡを切除するかもしくは取り除くエンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、メガヌクレアーゼもしくはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼよりなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の複製欠損アデノ随伴ウイルス組成物。
  5. アブレーターがＣｒｅリコンビナーゼであり、そしてアブレーション認識部位がｌｏｘＰであるか、またはアブレーターがＦＬＰリコンビナーゼであり、そしてアブレーション認識部位がＦＲＴである、請求項４に記載の複製欠損アデノ随伴ウイルス組成物。
  6. 請求項１に記載の複製欠損アデノ随伴ウイルス組成物であって、アブレーターがキメラの改変されたエンドヌクレアーゼであり、かつ、第１の配列（ｉ）および第２の配列（ｉｉ）が各々その発現を制御する少なくとも１つのプロモーターと機能的に結合している、組成物。
  7. 請求項６に記載の複製欠損アデノ随伴ウイルス組成物であって、以下の任意の特徴：
    （ａ）キメラの改変されたエンドヌクレアーゼがバイシストロン性の転写単位中の単一のバイシストロン性オープンリーディングフレーム内に含有され、該転写単位が（ｉ）と（ｉｉ）の間にリンカーをさらに含んでなること、または
    （ｂ）配列（ｉ）および／もしくは配列（ｉｉ）が誘導性プロモーターを有すること、または
    （ｃ）キメラの改変されたエンドヌクレアーゼが別個のオープンリーディングフレーム内に含有されていること、
    を有する、組成物。
  8. アブレーターのコーディング配列が、アブレーターコーディング配列の５’もしくは３’に位置する核局在化シグナルをさらに含んでなる、請求項１〜７のいずれかに記載の複製欠損アデノ随伴ウイルス組成物。
  9. 請求項１〜８のいずれかに記載の複製欠損アデノ随伴ウイルス組成物であって、以下の任意の特徴：
    （ｉ）ＤＮＡ結合ドメインがジンクフィンガー、ヘリックス−ターン−ヘリックス、ＨＭＧ−ボックス、Ｓｔａｔタンパク質、Ｂ３、ヘリックス−ループ−ヘリックス、ウィングドヘリックス−ターン−ヘリックス、ロイシンジッパー、ウィングドヘリックス、ＰＯＵドメインおよびホメオドメインよりなる群から選択されること、または
    （ｉｉ）エンドヌクレアーゼがＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、イントロンエンドヌクレアーゼ、およびセリンもしくはチロシンリコンビナーゼよりなる群から選択されること
    を有する、組成物。
  10. アブレーターがキメラのＦｏｋＩ酵素である、請求項６〜９の（ｉｉ）のいずれかに記載の複製欠損アデノ随伴ウイルス組成物。
  11. 第１の配列（ｉ）および第２の配列（ｉｉ）がＩＲＥＳもしくはフューリン−２Ａを含有するバイシストロン性単位であり、かつ、第１のプロモーターと第２のプロモーターが同一である、請求項１〜１０のいずれかに記載の複製欠損アデノ随伴ウイルス組成物。
  12. 請求項１〜１１のいずれかに記載の複製欠損アデノ随伴ウイルス組成物であって、以下の任意の特徴：
    （ｉ）薬理学的作用物質がラパマイシンもしくはラパログであること、または
    （ｉｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）がＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９もしくはｒｈ１０よりなる群から選択されること、または
    （ｉｉｉ）（ａ）の第１の転写単位および（ｂ）のアブレーター系が該組成物中の異なるＡＡＶベクターのストック上にあること、
    を有する、組成物。
  13. 請求項１〜１２のいずれかに記載の複製欠損アデノ随伴ウイルス組成物であって、第１のＡＡＶベクターのストックがＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列および第１の転写単位に隣接するＡＡＶ３’ＩＴＲ配列を含んでなる、組成物。
  14. 請求項１３に記載の複製欠損アデノ随伴ウイルス組成物であって、ＡＡＶ ＩＴＲｓがＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９もしくはｒｈ１０ＩＴＲｓから選択される、組成物。
  15. 請求項１〜１４のいずれかに記載の複製欠損アデノ随伴ウイルス組成物であって、治療用製品がＨＩＶ感染性を中和する抗体もしくは抗体フラグメント、可溶性血管内皮成長因子受容体−１（ｓＦｌｔ−１）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）または神経成長因子（ＮＧＦ）である、組成物。
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