CN1759182A - 调节基因的组合物和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通过控制或调节编码siRNA的多核苷酸构建物或其它所需外源核酸或蛋白质的表达来调制或调节真核基因表达的组合物和方法。可将这类构建物或该系统的其它元件转染到感兴趣的细胞中并表达该siRNA，从而可通过给予该细胞一种化合物(如小分子物质或药物)控制该siRNA的靶基因表达。在本发明的某些实施方案中，可利用慢病毒来产生条件性敲减的动物。

Description

调节基因的组合物和系统
发明背景
本申请要求2002年11月22日提交的美国专利申请第60/428,347号和2003年6月4日提交的美国专利申请第60/475,715号的优先权，此二专利申请的内容纳入本文作参考。
发明领域
本发明涉及分子生物学、基因调控、基因治疗和转基因生物领域。更具体说，本发明涉及通过外部的RNA干扰系统来调控基因表达的方法。
相关技术说明
RNA干扰(RNAi)是RNA多核苷酸通过内源性细胞加工特异性阻抑其序列对应于该RNA的基因表达的一种现象(Brummelkamp等，2002；Gevroe和Silver，2002；Barton和Medzhitov，2002；Xia等，reviewed in Sharp，2001)。该现象广泛传播并看来是进化上保守的(Barton和Medzhitov，2002；Sui等，2002)。许多研究现已证明RNAi存在于许多生物中是一种天然发生的细胞活动(Sharp，2001)。
所述RNAi通路还不完全了解。然而在许多系统中，小的干扰性RNA分子(siRNA)看来在体内是通过RNA酶III内切核酸酶消化而产生的。这种消化吸收产生了长约21-23个核苷酸(碱基)的分子，虽然分子的大小可大至30个碱基。然后这些相对较短的RNA介导了对应的RNA信使和转录物降解(Sui等，2002；Sharp，2001)。理论上称为RNA-诱导的沉默复合体(RISC)的RNAi核酸酶复合体，可通过碱基配对相互反应帮助小的dsRNA识别互补的mRNA。siRNA与其底物反应后，mRNA靶向RISC中也许是通过RISC中存在的酶而被降解(Montgomery等，1998)。这些通路认为是生物体用来阻抑病毒感染、转座子跳跃和类似现象和调控内源基因表达的(Hutvagner等，2001；Sharp，2001；Waterhouse等，2001；Zamore，2000)。
虽然dsRNA阻抑基因表达的完全机制尚不清楚，但研究经验表明RNAi在大多数生物中是有效和重要的。
RNAi的普遍存在促进了将这种天然的基因调控系统开发转变为操纵基因表达工具的方法和组合物。利用RNAi操纵基因表达的一个最吸引人方面包括它的靶特异性。RNAi对介导该现象的RNA多核苷酸序列是特异的。因此可将设计的与能阻抑其表达的基因(靶基因)序列充分对应的RNA多核苷酸序列导入细胞中。存在此设计恰当的RNA时，激活了RNAi通路，导致对靶基因的阻抑或调节。
然而，利用RNAi作为工具来操纵基因表达需要在细胞中导入siRNA或表达。目前在细胞中导入siRNA调节靶基因表达的方法包括将siRNA(或前体RNA)直接注射或灌注入细胞、用游离载体(如质粒、腺病毒等)转染细胞和将表达siRNA的表达盒永久性导入细胞基因组内。
直接给予哺乳动物细胞siRNA或前体RNA的一个主要障碍是内源性抗病毒反应，该反应能识别长30个核苷酸(nt)以上的RNA聚核苷酸，并在它们能有效诱导表达的RNAi调节前降解它们。Elbashir等(2001)描述了以下发现，即长21个碱基的双链RNA能有效逃避这种抗病毒反应，因而可用于特异性调节哺乳动物细胞中的基因表达。
关于抗病毒反应的另一种方法是将siRNA表达盒加入载体中，然后转染入细胞来转录适当的诱导RNA类别的RNAi(见Sui等，2002；Xia等，2002；Barton和Medzhitov，2002)。可用的载体包括质粒(Brummelkamp等，2002；Sui等，2002)和病毒衍生的载体(见例如Xia等，2002；Barton和Medzhitov，2002；Devroe和Silver，2002)。已证明这些目前已知的系统在特异性调节外源和内源性基因时是有效的(见例如Sui等，2002；Xia等，2002)。病毒载体的另一优点是它们能使sIRNA表达构建物稳定整合到细胞基因组中，得以产生特定基因受特异性阻抑的细胞系。另外，某些病毒载体可用于体内转化细胞，从而可直接操纵体内和整个生物的基因表达。
就稳定转染细胞和生物表达特定siRNA构建物而言，一个挑战是避免这些构建物提供的siRNA产物异源组成型表达引起的细胞或生物毒性或活力降低。Tiscornia等(2003)证明了可用慢病毒载体组成型表达整合在各种哺乳动物系统中的siRNA。此研究得以产生能降低特异性基因表达的细胞系，和产生靶基因产物表达减少的敲减(knockdown)小鼠。然而如上所述，siRNA组成型表达的主要障碍在于发育早期时其频繁发生会导致早期死亡。这就取消了发育期的基因表达操纵而进入生物的成年期。因此，该领域需要通过载体携带的siRNA来调节和控制基因表达的系统，而载体中该siRNA分子本身的表达可受到控制。
siRNA的受控胞内转录有许多应用，包括例如，为研究治疗目的，使细胞产生胞内或分泌性内源基因产物，如蛋白质受到控制；产生“条件性敲减”的转基因动物，如产生人类疾病(如糖尿病、免疫缺陷病等)的临床前动物模型；或作为治疗研究的细胞/器官来源，以及用于农业食品工业中和植物中的类似目的；作为siRNA临床应用，如抗病毒治疗和遗传方法的安全装置，目的是控制例如，激素分泌过多所致的疾病。
发明概述
本发明涉及含有通过控制siRNA的表达来控制基因表达的有用的系统的组合物和方法。本发明提供外部可调控的系统，通过控制RNA干扰来操纵内源或外源基因的调节。该外部可调控系统可通过(改变)条件和组织特异性方式和/或定位方式调节。
在具体实施方案中，本发明包括一种外部施加的试剂，如药物或一种或多种其它化合物，来调节编码siRNA的核苷酸序列的表达。
在具体实施方案中，本发明涉及一种多核苷酸构建物。其含有编码操作性连接于一外部可调控启动子的siRNA的区域，该构建物也可定义为一种载体。载体的非限制性例子包括：慢病毒载体、逆转录病毒载体、MLV载体、AAV载体、质粒载体或腺病毒载体。外部可调控启动子可以是一种阻抑型启动子，从而可通过外部施加的试剂下调编码siRNA的表达。可通过外部施加药物下调编码siRNA的表达。
在具体实施方案中，该阻抑型启动子受Tet阻抑物的调节，和/或定义为还含有至少一个tet0序列。该阻抑型启动子可受lacI阻抑物的调节，或该阻抑型启动子可来自：ANB1、HEM13、ERG11、OLE1、GAL1、GAL10、ADH2或TETR基因。
在具体实施方案中，外部可调控的启动子是一种诱导型启动子，从而可通过外部施加的试剂上调编码siRNA的表达。诱导型启动子可受Cu2+、Zn2+、四环素、四环素类似物、蜕皮激素、糖皮质激素、三苯氧胺或lac操纵子诱导物的诱导。该启动子可受蜕皮激素、糖皮质激素或三苯氧胺的诱导。在具体实施方案中，该诱导型启动子是噬菌体诱导型启动子、营养物诱导型启动子、温度诱导型启动子、辐射诱导型启动子、金属诱导型启动子、激素诱导型启动子、类固醇诱导型启动子、或它们的组合。辐射诱导型启动子的例子包括fos启动子、jun启动子或erg启动子。
可用于本发明考虑范围的基因表达调节系统，包括可利用孕酮、雌激素和/或蜕皮激素的调节系统。
在一个优选的实施方案中，该系统包括：
(a)一多核苷酸构建物，其含有操作性连接于至少一个编码siRNA的多核苷酸的聚合酶III依赖型启动子；
(b)一多核苷酸，其编码含有DNA结合域和转录阻抑结构域的药物诱导型阻抑融合蛋白质；和
(c)一可结合的多核苷酸，其可被(b)所述融合蛋白的结合域结合并定位，从而转录阻抑结构域可发挥作用而阻抑(a)所述多核苷酸构建物的转录；
(d)一个或多个含有(a)、(b)和(c)所述构建物的载体；和
(e)一种化合物，可将其施加于细胞以控制上述融合蛋白的表达，或控制所述融合蛋白通过其结合域与所述可结合的多核苷酸序列结合。
在具体实施方案中，编码所述融合蛋白的多核苷酸与一诱导型启动子操作性相连。在其它和优选的实施方案中，该启动子是一种组成型启动子。在一具体实施方案中，该组成型启动子是EF-1α启动子。在其它实施方案中，该启动子是组织特异性启动子。
本发明的各种多核苷酸和多核苷酸序列可以是一种多核苷酸分子或其一部分，或它们可位于或组成在不同的多核苷酸分子中。不同的多核苷酸和多核苷酸序列，如果位于同一分子中，它们可以是相互毗连、毗邻、靠近或接近。这些序列的排列使得能转录性调节siRNA编码的多核苷酸，该领域普通技术人员不难构想这种排列。此外，本发明的实施例公开了相关序列的具体空间排列。
在本发明具体实施方案中，通过采用含多核苷酸和多肽组分二者的特殊系统产生对表达的控制。在前核和真核细胞中，对DNA上特定位点具有亲和力的多肽能调节基因的转录性表达。通过与基因中特定位点DNA的相互反应，某些称为阻抑物的多肽，例如可使该DNA不能接近RNA聚合酶而阻止了转录。
已广泛地特征分析了DNA结合蛋白质，以确定这些多肽是否确实能接触DNA分子，关于阻抑的那些实施例是否通过直接结合机制与其相互反应而影响基因表达。这些多肽的某些非限制性例子包括那些含有结构性基序：α-螺旋-转角-α-螺旋(H-T-H)的多肽。这些蛋白质可作为二聚体或三聚体与具有大致对称回文序列的特定操纵子序列中的DNA结合。在B-形DNA的主要沟槽二位点中和附近各单体的二个毗邻α-螺旋发生接触，是DNA与这些蛋白质之间介面中的主要特征。能以这种方式结合的蛋白质在H-T-H区中具有序列相似性，但在其它区域中相似程度不同。这组蛋白包括，例如噬菌体温度阻抑型蛋白和Cro蛋白，细菌代谢阻抑蛋白如GalR、LacI、LexA和TrpR，细菌激活剂蛋白CAP和激活剂/抑制剂双功能蛋白AraC，细菌转座子和质粒TetR蛋白，酵母菌交配型调节蛋白MATal和MATα2和真核同源框(homeobox)蛋白。
其它阻抑物与H-T-H结合蛋白序列同源很少或无，没有H-T-H结合基序。观察到此组的某些蛋白质，如沙门伤寒菌噬菌体P22Mnt蛋白质(VERS87a)和大肠杆菌TyrR阻抑蛋白(DEFE86)中，能与含有大致对称回文序列的操纵子相结合。此组的其它蛋白能结合部分对称(沙门伤寒菌噬菌体P22Arc蛋白VERS87b；大肠杆菌Fur蛋白DEL087；质粒R6K pi蛋白质FILU85)或非对称性(噬菌体Mu阻抑物KRAU86)的操纵子序列。
本领域技术人员知道，与野生型相比，本发明所用的阻抑物和/或DNA结合域可包含突变，只要该突变不会有害地影响这些组分的各自功能，本发明的方法和组合物中可采用这些突变的组分。
在其它具体实施方案中，上述(e)的化合物可调节该融合蛋白的表达。7在其它具体实施方案中，(e)所述化合物通过该融合蛋白的结合域，可调节该融合蛋白与可结合性多核苷酸序列的结合。在具体的优选实施方案中，该融合蛋白的结合域可结合的多核苷酸序列是四环素操纵子(tet0)序列，(b)所述该融合蛋白含有融合于人Kox-1的典型KRAB阻抑结构域(tTR-KRAB)的四环素阻抑物(tTR)的DNA结合域，(c)的底物是强力霉素。在一具体实施方案中，KRAB不是来自Kox-1而是来自另一个含锌指蛋白的KRAB结构域。因此，在一实施方案中，采用人Kox-1蛋白的KRAB阻抑结构域作为转录阻抑物(Theisen等，1990；Margolin等，1994；Pengue等，1994；Witzgall等，1994)。在另一实施方案中，采用一种KRAB协同阻抑物KAP-1，其中KRAB(Friedman等，1996)用作同一融合蛋白的一部分或分别提供。或者，KAP-1可单独与锌指蛋白一起应用。
在本发明的内容中，考虑能介导上述元件(a)、(b)和(c)输送和整合到靶细胞、组织或生物基因组中的任何载体都属于本发明范围。在具体实施方案中，(b)所述载体是：慢病毒载体、MLV载体、AAV载体、质粒载体或腺病毒(Adv或Ad)载体。在具体实施方案中，(b)所述载体是慢病毒载体。在实施方案中，(b)所述载体是慢病毒载体，其它实施方案包括其中含有(b)所述融合蛋白的结合域可结合的多核苷酸序列，和操作性连接有编码siRNA多核苷酸序列的启动子的载体，编码siRNA的多核苷酸序列包含在该慢病毒3’-长末端重复序列的U3区中。
该系统的其它实施方案中，编码该融合蛋白的多核苷酸包含在与含(a)所述构建物的载体不同的第二种载体中。在具体实施方案中，该第二种含有该融合蛋白编码多核苷酸的载体是：慢病毒载体、MLV载体、AAV载体、质粒载体或腺病毒(Adv或Ad)载体。在优选实施方案中，含有该融合蛋白编码多核苷酸的第二载体是慢病毒载体。
在具体实施方案中，(a)(i)所述聚合酶III-依赖型启动子是U6或H1启动子。在具体实施方案中，(a)(i)所述聚合酶III-依赖型启动子是U6启动子。
在具体优选实施方案中，(a)所述多核苷酸编码的siRNA形成一种茎环结构或发夹(即个sihRNA)。
然而，特别考虑本发明中除子条件性表达(转录或转录/翻译)siRNA分子(敲除分子)外，可采用本文所述方法和组合物来表达任何其它外源性核酸序列(“感兴趣的序列”)。因此，可用任何其它感兴趣序列来实施本文所述有关siRNA的任何实施方案。
另外，认为本发明覆盖了本文所述各多核苷酸或多核苷酸序列，或与其它多核苷酸或多核苷酸序列的组合。因此，在某些实施方案中，本发明包括本发明系统中所述的任何载体。例如，本发明包括的载体或表达构建物含有编码药物可调控(如药物诱导型)的阻抑事例蛋白，该蛋白含有DNA结合域和转录阻抑结构域，和/或相同或不同的载体或表达构建物含有该融合蛋白结合域可结合及定位的多核苷酸，从而该转录阻抑结构域可发挥作用而阻抑感兴趣基因的表达。在具体实施方案中，该融合蛋白含有融合于人Kox-1的KRAB阻抑结构域(tTR-KRAB)的四环素阻抑物(tTR)的DNA结合域，其可结合tet0序列。该tet0序列可位于相同或不同的表达构建物或载体上。
因此，在某些实施方案中，本发明还涉及操作性连接于一示范性Ttr-KRAB-反应启动子的多核苷酸。通常该Ttr-KRAB-反应启动子含有一个操作性连接于至少一个tet操纵子(tet0)序列的最小启动子。例如，可按照Saeger和Heinemann主编的《Protein-Nucleic Acid Interaction》(Macmillan，London，1989，第10卷，143-162页)一书中Hillen & Wissmann著的“Topics in Molecular和Structural Biollogy”中的方法获得该tet0序列，此文内容纳入本文作参考。可用于实施本发明的其它tet0序列也可从Genbank和/或Waters，S.H等(1983)Nucl Acid Res.11：6089-6105；Hillen，W和Schollmeier，K.(1983)Nucl Acid Res.11：525-539；Stuber，D和Bujard，H.(1981)Proc Natl AAcad Sci USA 78：167-171；Unger，B等(1984)NuclAcid Res.12：7693-7703；和Tovar，K等(1988)Mol Gen Genet.215：76-80中所述方法获得，这些文献的内容全部纳入本文作参考。在某些实施方案中，可采用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的tet操纵子序列的拷贝，采用更多数目的这种序列能增加调节的范围。
除了该示范性Ttr-KRAB-融合蛋白可作为外部药物诱导型阻抑融合蛋白外，可利用其它含有不同结合域和转录阻抑结构域的融合蛋白。在本发明的实施方案中，利用DNA结合域作为药物诱导型可调控的融合蛋白的一部分，该DNA结合域可包含，例如四环素阻抑物(tTR)的DNA结合域，或GAL4或LexA的此种结构域的序列。
在本发明的实施方案中，利用一种阻抑结构域作为外部药物诱导型调节器性融合蛋白的一部分，该阻抑结构域是Kruppel-相关盒结构域(KRAB)。然而，其它阻抑结构域包括EDR或SID转录阻抑结构域。可作为转录阻抑物的其它优选的转录因子和转录因子结构域包括，例如：MAD(见Sommer等，1998；Gupta等，1998；Queva等，1998；Larsson等，1997；Laherty等，1997；和Cultraro等，1997)；FKHR(forkheadin ehapdosarcoma gene；Ginsberg等，1998；Epstein等，1998)；EGR-1(早期生长反应基因产物-1；Yan等，1998；和Liu等，1998)；ets2阻抑因子阻抑结构域(EDR；Sgouras等，1995)；和MADsmSIN3相互作用结构域(SID；Ayer等，1996)。
其它实施方案中，可采用上述任何系统和构建物产生细胞和转基因动物。可以条件性方式控制这些转基因动物来显示敲减的表型。
在本发明的某些实施方案中，可用本领域技术人员熟知的方法将本发明的核酸导入哺乳动物细胞中。因此，在某些实施方案中，该哺乳动物细胞含有：(a)第一多核苷酸序列，其含有操作性连接于至少一个编码siRNA的核酸区段的聚合酶III-依赖型启动子；(b)编码一条件性阻抑融合蛋白的第二多核苷酸序列，该融合蛋白含有DNA结合域和转录阻抑结构域；和(c)上述(b)中的融合蛋白结合域可结合并定位的第三多核苷酸序列，这样，此转录阻抑结构域可发挥作用而阻抑(a)所述核酸区段的转录。在具体实施方案中，该条件性阻抑融合蛋白是药物诱导型蛋白。此外，在其它实施方案中，所述细胞除(a)、(b)和/或(c)以外，还含有：(d)第四多核苷酸序列，该序列可被切除从而阻止聚合酶III-依赖启动子的转录；和/或(e)第五多核苷酸序列，该序列在一可调控启动子的控制下。此酶和可切除序列将在以下进一步详述。
在本发明的实施方案中，所述哺乳动物细胞含有某些核酸构建物。本发明的一方面，上述融合蛋白结合域可结合的第三多核苷酸序列是四环互操纵子(tet0)序列，(b)所述的融合蛋白含有融合于人Kox-1的KRAB阻抑结构域的四环素阻抑物(tTR-KRAB)的DNA结合域，因而该融合蛋白受强力霉素的控制。该系统也可用于执行除任何siRNA分子外的任何感兴趣基因的条件性表达。
考虑本发明所用的哺乳动物细胞包括未分化细胞，如卵母细胞或受精的卵母细胞。可采用本领域技术人员已知的技术，用这些细胞来产生转基因动物。因此在某些实施方案中，本发明包括其细胞为本文所述哺乳动物细胞的能显示靶基因条件性敲减的转基因动物。特别考虑可创立与本文所述非限制性示范性Ttr-KRAB系统一起应用的奠基细胞系或动物。因此，本发明包括能表达Ttr-KRAB或任何条件性敲减/表达系统(能条件性表达感兴趣的敲减分子或其它基因或蛋白质)的细胞和转基因动物。在实施方案中，转基因动物的一个或多个细胞含有编码条件性阻抑融合蛋白的多取核苷酸序列，该融合蛋白含有四环素阻抑物的DNA结合域和转录阻抑结构域及人Kox-1的KRAB阻抑结构域(tTR-KRAB)。
tTR-KRAB或其它可调节系统的表达可以是条件性的、可诱导的、组织特异性的或局部可利用的(如施加于局部)。可利用奠基细胞或细胞系，来导入含有在转录融合蛋白调节元件(效应器多核苷酸)如tTR-KRAB控制下的感兴趣序列的核酸序列。或者可用本领域技术人员已知的方法，包括使奠基转基因动物与效应器转基因动物(其细胞含有效应器多核苷酸)交配，或将效应器多核苷酸导入奠基转基因动物的转基因细胞中，利用奠基转基因动物来创立同时含有敲减/表达构建物和该效应器多核苷酸的动物。
在其它实施方案中，本发明的转基因动物具有：(a)第一多核苷酸序列，其含有操作性连接于至少一个编码siRNA的核酸区段的聚合酶III-依赖型启动子；(b)编码一条件性阻抑融合蛋白的第二多核苷酸序列，该融合蛋白含有DNA结合域和转录阻抑结构域；和(c)上述(b)中的融合蛋白结合域可结合并定位的第三多核苷酸序列，这样，此转录阻抑结构域可发挥作用而阻抑(a)所述核酸区段的转录。此外，在本发明的某些实施方案中，可利用能控制siRNA转录的聚合酶III-启动子的tTR-KRAB所介导的阻抑，来创立条件性敲减动物。可利用上述构建物来转染或感染性细胞、干细胞、或任何其它可用于创立转基因动物的未分化细胞。
本发明其它方面涉及一种系统，该系统中存在的可切除核酸片段的酶通过切除介导，进而控制RNA干扰。特别考虑也可以执行所述的关于条件性敲减某基因的实施方案，和其它调节方法来敲减某基因，包括利用组织特异性启动子和/或利用Cre重组酶。因此，除用某可调控的阻抑融合蛋白控制调节转基因的表达(如siRNA的表达)水平外，本发明可利用该系统的一种以上调节水平，如用外部药物调节控制该可调控的阻抑融合蛋白质。
因此在本发明的某些实施方案中，存在一种可调节靶细胞中siRNA表达的系统，所述靶细胞含有可受调节(即可调节)的含有表达盒的表达构建物，所述表达盒含编码siRNA的核酸区段。可将该核酸区段置于启动子控制下，编码该siRNA的区段和该启动子之间有一可切除片段，在该启动子可能影响该siRNA转录前需要切除。适当的酶可利用该片段所含切除位点来切除该片段，因此，该片段是“可切除片段”此外，在某些实施方案中，称为“转录调节物”的其活性可受调节的转录因子(“可调节的转录调节物”)，可调节此启动子。该可调节的转录调节物是此系统的另一组分，可用编码它的多核苷酸在系统中提供。本发明的诸组分包括各种核酸分子，包括区段、片段、盒和构建物。这些核酸分子可以是RNA或DNA。然而，外部因子可调节任何或所有这些分子。
这些核酸分子可至少、最多、或包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、77、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、或1000个连续核苷酸可碱基对。在某些实施方案中，表达构建物是病毒载体，虽然可以是非病毒载体如质粒。病毒载体可以是一种整合型病毒，如逆转录病毒可腺伴随病毒。在某些实施方案中，该表达构建物是逆转录病毒，特别是慢病毒。
术语“siRNA表达构建物”指能表达siRNA分子的核酸分子。术语“可调节的siRNA表达构建物”指与给定细胞类型中或所有细胞中的组成型表达相反，siRNA的表达可受到调节。术语“表达构建物”理解为包括该构建物是载体。术语“表达盒”理解为指一种核酸区域，其包括被表达的核酸和参与其表达的控制区，包括但不限于启动子和增强子。
术语“可调控的启动子区域”指可调控某启动子区域以修饰或改变该启动子的表达。表达的修饰可以是正面或负面。表达的负修饰指该启动子的表达可能被消除、减弱、限制或局限。表达的正修饰指该启动子的表达可能增加、增强或放大。“启动子区”指能控制和调节远端或毗邻基因、cDNA或其它编码区转录速度的核酸区域。
在本发明的某些实施方案中，核酸分子包含一种或多种作为标记的肽的编码序列。该标记可用于监测可测试核酸或其一部分是否已整合入另一核酸、是否转染或导入了细胞或生物体，或被切除。考虑本发明的核酸分子、系统和生物可含有1、2、3、4、5或更多种标记多肽，或编码标记多肽的核酸。如上所述，可利用不同的标记多肽来监测不同事情。
除siRNA编码核酸区段外，本发明涉及含有一个或多个能修饰或调节转录的区段或元件的启动子。调节可以是正面或负面调节。负调节指阻抑、降低或消除启动子的转录。同样，正调节：指促进、增强或诱导含上述元件或区段的启动子的转录。在本发明某些实施方案中，所述启动子含有的元件可阻抑或诱导该启动子的转录功能。在本发明一具体方面，能在转录水平或蛋白水平起调节作用的转录调节物可识别该元件。在具体实施方案中，该元件是tet操纵子，其能结合含识别该元件的DNA结合域的转录阻抑物。在本发明其它实施方案中，该启动子是聚合酶III-依赖型启动子，即其转录功能需要聚合酶III。
在某些实施方案中，启动子可控制空间和/或时间性表达。因此考虑本发明所用启动子是组织特异性或发育特异性(只在特定发育阶段或时期启动转录)启动子，而在其它实施方案中，启动子是诱导型或组成型启动子。
本发明的多肽可外源性表达。这些多肽可以是天然产生的、野生型、多态性或突变产生的。在本发明具体实施方案中，多肽是融合或嵌合蛋白。嵌合蛋白是含有二种或多种多肽一起或无联系部分的多肽。多肽的无联系部分指含有可认为是相同功能或活性的氨基酸区域。融合蛋是嵌合蛋白的一种，此蛋白中第一多肽或其一部分端对端连接于第二多肽或其一部分。在本发明具体实施方案中，有一种嵌合蛋白是可调控的转录调节物。某些情况下该可调控的转录调节物是一种融合蛋白，其DNA结合域来自一种多肽，其转录阻抑或激活结构域来自另一多肽，该可调控的转录调节物，例如可通过结合某药物而受到负面调节或修饰。在其它实施方案中，该可调控的转录调节物可受到四环素或四环素类似物，如强力霉素的负调节。
“四环素类似物”是与四环素(Tc)密切相关能结合tet阻抑物，其Ka值至少为106M-1的许多化合物的任何一种。优选四环素类似物的结合亲和力约为109M-1或更高如109M-1。四环素类似物的例子包括但不限于在R.K.Blackwood等编辑的《实验性药物手册78》(Handbook of Experimental Pharmacology 78)(Springer Verlag，Berlin-New York，1985)中Hlavka和Boothe著的“四环素”；L.A.Mitscher“四环素抗生素的化学”，Medicinal Research 9，Dekker，New York，1978；NoyeeDevelopment Corporation，“四环素制备工艺”Chemical Process Reviews ParkRidge，N.J.，第2卷，1969；R.C.Evans，“四环素的技术学”，Biolchemical ReferenceSeries 1，Quadrangle Press，New York，1986；和H.F.Dowling，“四环素”，Antibioltics Monographs，no.3，Medical Encyclopedia，New York，1955；中所述的那些，这些文献各自的内容全纳入本文作参考。四环素类似物的非限制性例子包括：无水四环素、强力霉素、氯代四环素、环氧四环素等。与Tc相比，某些Tc类似物，如无水四环素和环氧四环素的抗生素活性降低。本领域知道本发明所用的四环素或四环素类似物的浓度，或可用标准方法测定。在具体实施方案中，所用强力霉素的浓度高于约10ng/ml(Gossen等，1995)。
  术语“转录调节物”指具有能直接或间接影响转录活性的多肽或蛋白质，这些活性包括但不限于：核酸结合活性、转录激活活性和/或转录阻抑活性。另外，转录调节物在本发明某些实施方案中可以是“可调节的”，意指，可以调节，即阻抑、消除、降低、增强、活化或改变其活性。调控也可以是暂时性或范围有限的。考虑到这种转录调节物的活性可受到，例如，一种或多种以下转录；翻译；mRNA半衰期；蛋白的半衰期；翻译后修饰；定位、核酸或多肽的结合特异性、分解速率或亲和力；和/或转录活性等变化的调节或修饰。负调节或修饰指降低或消除活性，而正调节或修饰指点提高或诱导活性。例如，转录掏物的负调节可导致减少存在的阻抑作用。
可调节转录调节物的表达。将其表达置于可调节启动子，如组织特异性或诱导型启动子的控制下。术语“可诱导的”指只在对特异性刺激的反应中可被激活的活性，与“组成型”活性相反。在本文的启动子中，术语“可诱导的”指只能在某些条件下促进转录的启动子，不象组成型启动子。诱导型启动子可理解为在允许的条件下才表达。术语“组织特异性”指只在特定组织中才存在活性，与普遍存在的启动子相反。
在本发明的某些实施方案中，只是在或部分由于启动子与待转录的核酸区段之间存在物理屏障或障碍才实现这种调节。在某些情况下这种屏障或障碍，例如通过切除形成或构成此屏障或障碍全部或部分的核酸区域才能去除。因此，在某些实施方案中，在启动子与可转录核酸序列之间安置一可切除片段。更具体说，该片段可防止siRNA编码核酸区域受该可调节启动子区的控制。一旦被切断，该siRNA编码区段就被置于该可调节启动子区的控制下。“可切除片段”指由于一种或多种酶反应，如涉及Cre的重组酶的酶作用，可被生理去除的核酸区。本发明的一具体方面，该可切除片段至少二个侧接的loxP位点，使该片段可被Cre重组酶切除。本领域技术人员熟知此loxP位点序列功能是作为Cre重组酶的识别位点。切除/重组系统的另一个例子是可用于本发明的众所周知的flt/frt系统。
此外，该系统另一种水平的调节可能是酶或多肽表达的调节，这些酶或多肽控制着在启动子控制下的感兴趣核酸序列，即siRNA编码核酸序列。换句话说，这些酶或多肽是条件性使用的。术语“条件性使用”指所述酶或多肽只在特定条件下可利用。，在某些实施方案中，Cre重组酶-编码的多核苷酸受组织特异性或诱导型启动子的控制。然而，本领域技术人员知道，其它方法也可控制表达。
本发明其它实施方案包括含有但不限于上述核酸的载体或细胞。特别考虑可将本发明的核酸包含在一表达构建物或载体中。然后可将该表达构建物或载体导入细胞中。在某些情况下，所述细胞含有i)包括siRNA编码核酸片段和可调控启动子区的表达盒，ii)编码可调控转录调节物的多核苷酸。在其它实施方案中，所述细胞可含有可条件性利用的Cre酶，此酶能催化切断位于siRNA编码核酸片段一可调控启动子区之间的可切除片段。具体考虑所述细胞是前核细胞或真核细胞、某些情况下是哺乳动物细胞，如狗、猫、牛、羊、猪、马、鼠类、兔类或猪细胞。人是本发明方法和组合物应用特别要考虑的生物。另外，所述细胞可以是分化细胞，在某些情况下，是未分化细胞，如卵子细胞、受孕卵子细胞或精子细胞。可采用未分化细胞来建立含有本发明可调控系统的动物。
本发明另一方面涉及含有编码可诱导能阻抑整合入宿主细胞中本发明至少一种siRNA表达的诱导型阻抑物的DNA分子的真核宿主细胞；和/或含有其siRNA操作性连接于一内部可调控启动子(如能对该诱导型阻抑物反应，不论直接或间接反应，的启动子)的DNA分子的真核宿主细胞。例如，该诱导型阻抑物可直接影响此启动子附近的序列，从而再影响此启动子本身的活性。宿主细胞可以是哺乳细胞(如人的细胞)。或者，宿主细胞可以是酵母菌、真菌或昆虫细胞(如可将诱导型阻抑物或siRNA编码DNA整合到昆虫细胞中的杆状病毒基因内)。同源重组的优选宿主细胞类型是胚胎干细胞，可用它来产生非人动物携带体，例如整合入动物染色体中预定位置的tTR-KRAB-编码序列。宿主细胞也可含有操作性连接于一典型tTR-KRAB反应性转录启动子的siRNA。可将该操作性连接于一典型tTR-KRAB反应性启动子的siRNA整合入宿主细胞的DNA中，随机(如导入外源基因)或预定(同源重组时使内源基因靶向)的位置。可将连接于tTR-KRAB反应性启动子的基因导入宿主细胞中，与编码siRNA的DNA分开，或者，可利用本发明的“一次命中”靶向载体将tTR-KRAB编码序列和tTR-KRAB反应性启动子整合入宿主细胞DNA中的预定位置。可使宿主细胞与四环素或四环素类似物接触，来阻抑操作性连接于tTR-KRAB反应性启动子的siRNA在本发明宿主细胞中的表达。
因此，本发明还涉及含编码sIRNA分子的可调节表达盒与编码可调控转录调节物的多核苷酸的转基因动物。在具体实施方案中，本发明包括能显示以组织特异性方式条件性敲除靶基因的转基因动物，该动物的细胞含有：i)在一可调控启动子区控制下的siRNA编码核酸区段，其中此siRNA对应于靶基因；ii)编码可调控转录调节物的多核苷酸；和iii)可条件性利用的Cre重组酶。然而，特别考虑可以除外本发明的组织特异性方面，或可以除外Cre重组酶水平的控制。因此，在某些实施方案中，动物不含有受组织特异性控制的核酸和/或Cre重组酶及或可切除片段。短语“靶基因的可条件性敲除”指某靶基因的表达可以条件方式消除或基本消除。本发明的其它方面包括本发明转基因动物的妊娠、及所产生的转基因动物的性细胞和其它转基因细胞。
本发明的其它方法包括采用上述试剂创立或产生能显示条件性敲除靶基因的转基因动物的方法。为此，可将具有条件性调节siRNA表达的第一种转基因动物与其性别不同的第二种动物交配
此外，也可以条件或组织特异性方式调节这类动物(的基因表达)，方法包括a)获得具有在组织特异性启动子调控下的Cre重组酶编码多核苷酸的第一种转基因动物；b)获得具有i)在一可调控启动子区控制下的siRNA编码核酸区段，其中该sIRNA对应于靶基因；和ii)编码该可调控多肽调节物的多核苷酸的第二种转基因动物；和c)使性别相反的第一种和第二种动物交配。在某些实施方案中，获得第二种转基因动物可通过：d)用i)可调控的siRNA表达构建物，其含有siRNA编码核酸区段和可调控启动子区(该区段与启动子区之间有一可切除片段)；和ii)该可调控siRNA表达构建物的可调节多肽调节物的编码多核苷酸，来转染未分化的哺乳动物细胞；e)如果细胞是单倍体基因组则使其受精；和f)将产生的胚胎移植到雌性动物中由该雌性动物产生第二种转基因动物。在某些情况下，未分化细胞是未受精的卵母细胞、受精的卵母细胞、胚胎干细胞、桑椹胚或胚泡中的细胞。此外，所用方法也可能涉及培养细胞然后转染和/或移植。另外，这类方法可能涉及与本发明转基因动物交配。
本发明在某些方面涉及调节细胞中某基因的表达，例如通过制备或提供编码操作性连接于一外部可控制启动子的siRNA，其中siRNA由能下调此基因表达的构建物所编码，然后部通过该外部可调控启动子从外部调节编码的siRNA表达。该外部可调控启动子可以是阻抑型启动子，从而可通过外部施加的试剂，如外部施加的药物下调该编码的siRNA的表达。在具体实施方案中，该阻抑型启动子含有至少一个tet0序列；另外，该方法也可包括提供编码能阻抑siRNA表达的诱导型阻抑物的多核苷酸的步骤。在本发明的一具体方面，编码该阻抑物的多核苷酸也定义为药物诱导型阻抑融合蛋白，其含有DNA结合域和转录阻抑结构域，其中该融会蛋白的结合域可结合该多核苷酸构建物，因此该转录阻抑结构域可发挥阻抑siRNA转录的作用。
在本发明的具体实施方案中，有一种研究基因产物在细胞中的功能的方法，该方法通过向细胞提供：i)含操作性连接于一外部可调控启动子的siRNA编码区的多核苷酸构建物，其中该约建物编码的siRNA可下调编码该基因产物的基因表达；和ii)编码能阻抑此siRNA表达的诱导型阻抑物的多核苷酸；和iii)通过该外部可调控启动子从外部调节编码的siRNA的表达。该外部可调控启动子可以是阻抑型启动子，从而可通过外部施加的试剂，如外部施加的药物下调该编码的siRNA的表达。本文所述的方法和组合物可用于治疗目的，如控制细胞被免疫系统识别的能力。要这样做，可通过下调移植抗原，如MHC I抗原，例如通过下调β2微球蛋白，来降低成本或阻抑免疫系统对细胞的识别，合细胞更顺从细胞移植。在本发明一个方面，下调β2微球蛋白可导致包含它的整个复合体下调。
特别考虑到本发明的方法和装置的实施方案可采用本发明的其它方法和装置。
在权利要求中所用的术语“或”指“和/或”，除非标明指另外或其它相互排斥的东西，虽然公布了支持物，但此定义仅指其它和“和/或”。
本申请书中，术语“约”用于表示一个值，和采用的装置或方法测定此值得到的标准差。
按照专利法，词语“一个”当在本发明权利要求书和说明书中与词“包含”一起用时指一个或多个。
附图简述
以下组成本发明一部分的附图进一步显示了本发明的某些方面内容。通过参考一个或多个这些附图，结合本文提供的具体实施方案的详细描述可更佳地了解本发明》
图1可调节siRNA合成的慢病毒载体。
图2强力霉素通过Tet-KRAB介导的对siRNA产生的阻抑诱导性调节了GFP的表达。GFP表达平均值表示在垂直轴上。水平轴的8段显示各构建物被转染入表达GFP的对照(Co)细胞中。Co(对照)段没有被构建物转染但经受了处理。各段中的4个短划显示各构建物的GFP表达：对照处理(Co：四组中各组的第一个短划)；WPXL-KEAB处理，表示细胞用WPXL-KRAB共转染(四个中的第二个短划)；强力霉素处理(DOX；四个中的第三短划)；和WPXL-KRAB+DOX，包括用WOXK-KRAB共转染细胞和用强力霉素处理细胞。
图3A-3B用于以dox-诱导型siRNA条件性阻抑基因的慢病毒的系统。(图3A)所用的慢病毒载体质粒的模式图。将含(LV-H)或不含(pLV-TH)上游tet0序列的H1启动子、H1-siRNA(LV-His)和tet0-H1-siRNA(LV-THis)盒克隆到pWPXL的3’U3区域内。所有载体都含有在EF-1α启动子转录控制下的内部标记cDNA。(图3B)siRNA慢病毒载体的双拷贝设计。逆转录时，利用其3’同源序列作为模板，合成5’LTR的U3区，导致先前已整合入转导细胞基因组中的siRNA盒成双。图3中的构建一般见图1中所述。
图4A-4B dox-可控制转录阻抑物的作用模型。(图4A)缺少dox时，tTR-KRAB结合于tet0并阻抑Hi-介导的siRNA转录，而使细胞靶基因正常表达(“打开”)。(图4B)在存在dox时，tTR-KRAB不能结合tet0，因此产生siRNA从而下调它们的靶基因(“关闭”)。siRNA载体中含有的内部标记提供了一种“反向”监视系统，因为存在dox它“打开”，缺少dox时它“关闭”。
图5A-5B用dox-诱导型的siRNA调节GFP表达。(图5A)以组成型(LVHsi)或调节(LV-THis)方式，用对照慢病毒载体(LVTH)或用产生GFP-特异性siRNA的载体，转导携带表达EF-1α启动子GFP(Hela-GFP)的单拷贝慢病毒载体，如表明的有或没有LV-tTR-KRAB。截短形式的神经生长因子受体(ΔNGFR)作用是siRNA载体中的内部报导物。这类似于图2中提供的资料。(图5B)条件性表达内部标记基因。在存在或不存在dox时培养用LV-This/GFP和LV-tTR-KRAB双重转导的Hela-GFP细胞，然后用NGFR特异性单克降抗体Ab作FACS分析。
图6用dox或诱导的siRNA调节内源基因。左：如材料和方法中所述下调用所示慢病毒载体感染的p53.MCF-7细胞。用抗p53、GFP或肌动蛋白(作对照)的单克降抗体作Western印迹分析。右：下调核纤层蛋白A/C。用核纤层蛋白特异性siRNA载体和抗体在Hela细胞中进行同一实验。
图7A-7B dox-诱导的RNA干扰的动力学和剂量反应。(图7A)如材料和方法中所述，用LV-This/p53和LV-tTR-KRAB共转导MCF-7细胞。5天后加入浓度5μg/ml的dox。收获细胞立即进行dox处理(泳道“0”)然后在标明时间点处理；wt，非转导细胞。(图7B)如图1转导后5天，将细胞置于含以下浓度dox(μg/ml)的培养液中：0(泳道1)、0.0005(泳道2)、0.001(泳道3)、0.002(泳道4)、0.004(泳道5)、0.008(泳道6)、0.016(泳道7)、0.063(泳道8)、0.25(泳道9)、1(泳道10)、5(泳道11)；wt，非转导细胞。再5天后进行全细胞提取物的Western印迹分析。
图8H1启动子的Cre-介导的激活。将从表达Cre的转基因小鼠靶组织中取回的受精卵母细胞，用tet-siRNA慢病毒载体(及LV-tTR-KRAB)转导。去除靶组织中的LoxP-侧接的EF-1α-MARKER盒，得以条件性产生siRNA。
图9Cre介导的切除后H1启动子的序列。将LoxP序列插入到近前端序列元件(PSE)和转录起始位点之间的H1启动子中，取代wt序列(wt远端保守)。修饰(*)LoxP序列(核心元件)以容纳TATA盒。插入GFP-特异性发夹序列作为例子。
图10A-10B目前的系统分析突变基因表型的应用。目前系统的特性可相互排除野生型细胞基因或其突变型的条件性表达。(图10A)在缺少药物时，突变体表达和siRNA合成受到阻抑(野生型打开)。(图10B)存在药物时，由于siRNA的作用wt基因表达式下调，突变型转录。
图11药物-可控制的转基因作用和药物-可控制的敲减的阐述性示范实施方案。
发明详述
本发明提供一种条件性阻抑哺乳动物细胞基因(表达)的系统。本发明涉及应用药物-可诱导的RNA干扰来开发基因敲减动物，任选地可通过慢病毒载体介导。本发明提出可用药物可诱导的RNA干扰作用，来产生其基因功能可受外部调节的敲减动物。
慢病毒介导的转基因作用提供了创立基因修饰生物的有效和省时的工具(Lois等，2002)。也可利用慢病毒载体输送的RNA干扰作用，使转基因小鼠中的基因沉默(Rubinson等，2003)。此输送模式的遍在性提示其非常广泛的用途，因为慢病毒载体可转导包括干细胞的广泛靶细胞，可用于产生若干种类的转基因动物。
本发明技术采用以下系统：四环素反式阻抑子(tTR-KRAB)介导的聚合酶III活性的药物诱导型调节；和慢病毒介导的转基因作用。本文所述系统明显优于目前采用的条件性敲减法。首先，与传统的Cre-loxP介导敲除法相比，缩短了产生转基因动物的时间(省钱、省力、省时)。第二，提供了所产生敲减小鼠的可逆表型。第三，在发育或成年过程中靶基因可关闭好几次(Cre介导的切除导致不可逆表型)。第四，能从小鼠以外的不同种动物产生条件性敲减动物。
I.RNA干扰
本发明提供的siRNA能在细胞中存在靶基因并不稳定表达时，调节，特别是减弱靶基因的表达。表达的调节器可部分或完全阻抑基因的功能，甚至在对主要靶基因的反应中上调其它次级靶基因或增强这些基因的表达。基因表达的减弱包括基因功能、转录加工或转录物的翻译部分或完全受到阻抑或阻抑。RNA干扰的含意是，基因表达的调节通过蛋白质与RNA(具体包括可作为“向导”RNA的小dsRNA)的复合物发生。siRNA之所以有效认为是它的核苷酸序列充分对应于靶基因核苷酸序列的至少一部分。虽然本发明不受其作用机制假说的限制，但更偏向认为siRNA中的核苷酸序列基本上相同于靶基因序列的至少一部分。
靶基因一般指含有编码基因产物如多肽区域的多核苷酸，或对该多肽的表达极为重要的具有调节、复制、转录或翻译、或其它加工作用的多核苷酸区，或含有多肽编码区和操作性连接的调节表达区二者的多核苷酸。本文中操作性连接指相对于多矛核苷酸序列，启动子被置于正确发挥功能的位置和/或朝向，从而能控制该序列的起始和/或表达。
靶基因可以在是染色体内(基因组)或染色体外。可以是细胞内源的功可以是外来基因(转基因)。可将外来基因整合到宿主基因组中，或可存在于染色体外遗传性结构如质粒或粘粒上。靶基因也可衍生自能感染生物或细胞的病原体，如病毒、细菌、真菌或原虫。靶基因可以是病毒或不能诱导干扰素应答的前病毒基因，如逆转录病毒基因。靶基因可以是蛋白质编码基因或非蛋白质编码基因，如编码核糖体RNA、剪接体RNA、tRNA等的基因。
可靶向细胞中任何待表达的基因。靶基因宜为参与对疾病有重要意义的细胞活动或与之相关的，或用于研究目的特别感兴趣的基因。因此，例如以下是可用于本发明方法调节或减弱靶基因表达的可能的靶基因分类：发育中的基因(如粘附分子、细胞周期蛋白抑制剂、Wnt家族成员、Pax家族成员、Winged螺旋家族成员、Hox家族成员、细胞因子/淋巴因子和它们的受体、生长和分化因子和它们的受体、神经递质和它们的受体)；癌基因(如ABLI、BLC1、BCL6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS1、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3和YES)；肿瘤阻抑基因(如APC、BRCA1、BRCA2、MADH4、MCC、NF1、NF2、RB1、TP53和WT1)；和酶(如ACP脱饱和酶和hycroxylases、ADP-葡萄糖pyrophorylases、ATP酶、醇脱氢酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、过氧化氢酶、纤维素酶、环氧化酶、脱羧酶、糊精酶、酯酶、DNA和RNA聚合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、GTP酶、半纤维素酶、整合酶、转化酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂酶、脂氧合酶、溶菌酶、果胶酯酶、过氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶和肽酶、支链淀粉酶、逆转录酶、拓扑异构酶、木聚糖酶)。
siRNA的核苷酸序列由其靶基因的核苷酸序列确定。siRNA含有与靶基因至少一部分基本相同的核苷酸序列。优选，siRNA所含有核苷酸序列与靶基因的至少一部分完全相同。当然，当RNA序列DNA序列作比较时“相同的”RNA序列含有的是枋糖核苷酸，而DNA序列含的是脱氧核糖核苷酸，另外，RNA序列通常含尿嘧啶的位置在DNA序列中含的是胸腺嘧啶。
siRNA含双链结构(如发夹结构或sihRNA)，其序列“基本上相同于”靶基因的至少一部分。‘相同’如本领域所知，是一种或多种多核苷酸(或多肽)序列之间通过序列比较所确定的关系。在专业上，相同性也指两多核苷酸序列之间通过核苷酸编号的匹配所确定的序列相关的程度。相同性不难计算。见例如Computational MolecularBiollogy，1988，Biolcomputing：informatics和Genome Projects，1993；和WO99/32619，WO 01/68836，WO 00/44914和WO 01/36646中所述的方法，它们的内容纳入本文作参考。已有测定二核苷酸序列之间相同性的许多方法，此术语是本领域熟知的。通常设计的测定相同性的方法要产生最大程度的核苷酸序列匹配，也常驻机构用计算机程序实施。相关领域技术坐吃山空不难获得这类程序。例如GCG程序包(Devereux等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等，1998)和CLUSTAL(Higgins等，1992；Thompson等，1994)。
本领域技术人员懂得可比较不同长度的二多核苷酸的较长片段的全长。或者，比较较小的区域。通常比较同样长度的序列以最终估计它们在实施本发明中的用途。优选用作siRNA的和靶基因的至少15个连续核苷酸的dsRNA之间序列100％相同，虽然具有70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高相同性的dsRNA也可用于本发明。与靶基因至少一部分基本相同的siRNA也可以是dsRNA，其中二条互补链之一(就自身互补RNA而言，其二条自身互补部分之一)或与靶基因所述部分的序列相同，或相对而言于靶基因该部分核苷酸序列含有一个或多个插入、缺失或单点突变。因此，siRNA技术具有能耐受序列变异(预计可能因基因突变、菌株多态性或进化多样性所致)的性能。
II.siRNA构建物的受控表达
siRNA表达构建物(或任何其它感兴趣的序列)的受控表达可通过许多该领域技术人员已知的系统实现。如本发明文中所述，启动子操纵了多核苷酸转录的起始。这类多核苷酸可含有编码siRNA的序列。能发动转录的诱导型启动子是至少能对诱导物的存在或作用部分起反应的启动子，所述诱导物可以是其作用能诱导该启动子发动转录的一种化合物或蛋白质。
A.启动子
术语“启动子”本文用于指能调节某编码区，如基因表达的任何序列。例如，启动子可以是组成型、诱导型、阻抑型或组织特异性启动子。“启动子”是一种控制序列，能控制某多核苷酸序列区域的转录启动和速度。它可含有可调控的蛋白质和分子，如RNA聚合酶或其它转录因子可结合的遗传元件。短语“操作性相连接”指启动子相对于某核酸序列以正确的功能位置和/或朝向控制着该序列的转录启动和/或表达。启动子可以和或不和“增强子”一起使用，增强子指参与核酸序列转录活动的顺式作用调节序列。
启动子可以是与某基因或序列天然相连接，可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游5’端的非编码序列获得。这种启动子可称为“内源性启动子”。类似的，增强子可以攻玉天然与某核酸序列相连接，位于该序列的下游或上游。或者，可通过将编码的核酸区段置于重组或异源启动子(指在其天然环境下通常不与该核酸序列相连接)的控制下来获得某些好处。重组或异源性增强子也指在其天然环境中不与该核酸序列相连接有增强子。这类启动子或增强子可启动子或增强子、分离自任何其它前核、病毒或真核细胞的启动子功增强子、“天然”不存在的启动子功增强子、即含有不同转录调控区的不同元件的，和/或能改变表达的突变的启动子功增强子。除用合成法产生启动子和增强子的核酸序列外，可采用重组克隆和/或核酸扩增技术，包括PCRTM与本文所述组合物来产生这类序列(见美国专利4,683,202和5,928,906，各纳入本文作参考)。此外，考虑也可采用能指导所述序列在非细胞核细胞器，如线粒体、叶绿体等内转录和/或表达的控制序列。
在具体实施方案中，本发明所用的启动子是一种外部可控制的启动子，可定义为Pol I、Poi II或Poi III启动子之任何一种(条件型、组织特异型、可调控型、组成型等)，它们通过条件性阻抑融合蛋白的结合域操作性连接于至少一个多核苷酸序列，所述阻抑融合蛋白含有DNA结合域和转录阻抑结构域，二结构域的位置使转录阻抑结构域能阻抑siRNA或cDNA或基因的转录。
诱导型启动子的特征是：当存在诱导物，或受诱导物影响，或与其接触时，与不存在诱导物，或不受其影响，或其不接触此启动子时，诱导型启动子可导致额外的转录活性。诱导物可以是内源性的，或一般是外源性的化合物或蛋白质，给予此化合物或蛋白质能激活对该诱导型启动子的诱导。诱导物，即化合物或蛋白质的前身，其自身可以是处在诱导型或阻抑性启动子控制下的某多核苷酸的转录或表达产物。诱导型启动子的例子包括但不限于：四环素、金属硫蛋白、蜕皮激素、哺乳动物病毒(台腺病毒晚期启动子；和小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列(MMTV-LTR))和其它类固醇反应性启动子雷帕霉素反应性启动子等。
本发明的诱导型启动子能在真核宿主生物中发挥功能。优选的实施方案包括哺乳动物诱导型启动子，但也可采用设计能在真核宿主中发挥功能的其它生物的诱导型启动子及合成的启动子。本发明诱导型启动子的重要功能特征是它们接触外部施加的物质，如环境诱导因子时而被最大诱导。合适的环境诱导因子包括接触热、各种类固醇类化合物、二价阳离子(包括Cu2+和Zn2+)、半乳糖、四环素、IPTG)异丙基β-D硫代半乳糖苷)，及其它天然产生的和合成的诱导因子和无缘无故的诱导物。重要的是要注意本发明某些模式中，该环境诱导信号可能对应于去除上列任何一种因子，不论其是否在非诱导状态中不断施加。真核启动子的诱导型可通过本发明方法所包括的二种机制获得。适合的诱导型启动子依赖于转录激活剂，进而依赖于环境诱导因子。另外，诱导型启动子可被其本身受环境诱导因子灭活的转录阻抑物所阻抑。因此，因此诱导型启动子，可以是受能正面激活转录活化剂的环境因子诱导的启动子，或是受负面调节转录阻抑物的环境因子所阻抑的启动子。
本发明的诱导型启动子包括受潜伏的转录激活剂(其受环境诱导因子的诱导)作用控制的启动子。优选例子包括酵母菌基因CUP1、CRS5和SOD1的铜诱导型启动子它们受酵母菌ACE1转录激活剂的铜依赖型激活(见Strain和Culotta，1996；Hottiger等，1994；Lapinska等，1993；和Gralla等，1991)。或者，可用酵母菌基因CTT1(编码胞质过氧化氢酶T)的铜诱导型启动子，其功能不依赖于ACE1转录激活剂(Lapinska等，1993)。有效诱导这些基因的铜的浓度应适当低，可被大多数细胞体系，如酵母菌和果蝇细胞所耐受。或者，本发明可采用兵其它天然产生的诱导型启动子包括：类固醇诱导型基因的启动子(见Oligino等，1998，Gene Ther.5：491-6)；酵母菌的半乳糖诱导型启动子(见Johnston，1987，Microbioll Rev.51：458-76；Ruzzi等，1987，Mol Cell Bioll.7：991-7)；和各种热激基因启动子。许多真核转录激活剂已显示在广大范围的真核宿主细胞中具有功能，例如，在酵母菌中鉴定到的诱导型启动子也适合用于哺乳动物宿主细胞。例如，已根据可诱导的含GAL-4结合位点的哺乳动物启动子的GAL-4雌激素受体融合蛋白，开发了哺乳动物细胞的独特合成性转录诱导系统(Braselmann等，1993，Proc Natl AAcad Sci USA.90：1657-61)。这些和其它对转录激活剂起反应要依赖于特定诱导因子的诱导型启动子，适合用于本发明。
本发明的诱导型启动子还包括可受阻抑物阻抑的启动子，所述阻抑物可因环境诱导因子的作用而被灭活。例子包括可在转录上阻抑经工程改造掺入了适当的阻抑物-结合操纵子序列的真核启动子。用于本发明的优选的阻抑物对生理上良性诱导因子的灭活作用很敏感。因此，当利用lac阻抑物蛋白来控制经工程改造含有lac0操纵子序列的真核启动子的表达时，用IPTG处理宿主细胞会引起lac阻抑物从该经工程改造的启动子上脱离下来，从而发生转录。类似的，当采用tet阻抑物来控制经工程改造含有tet0操纵子序列的真核启动子的表达时，用四环素处理宿主细胞将引起tet阻抑物从该经工程改造的启动子上脱离下来，从而发生转录。
一种或多种生理条件，如pH的变化、温度、辐射、渗透压、盐浓度、细胞表面结合和一种或多种外源因子或内源因子的浓度都诱导型启动子。外源性因子包括氨基酸和氨基酸类似物、糖和多糖、核酸、转录激活剂和阻抑物、细胞因子、毒素、石油化合物、含金属的化合物、盐、离子、酶底物类似物和它们的组合。在具体实施方案中，诱导型启动子在对环境条件的变化，如化学物质、金属、辐射或营养物浓度的变化，或pH的变化的反应中，被激活或受到阻抑。
诱导型启动子可以是噬菌体诱导型启动子、营养物诱导型启动子、温度诱导型启动子、辐射诱导型启动子、金属诱导型启动子、激素诱导型启动子、类固醇诱导型启动子和/或它们的杂交物和组合。在某些实施方案中，特别是癌症基因治疗中，所用的启动子是离子射线诱导型启动子，通过接触离子射线，如UV或X-线，诱导了位于癌细胞中的基因表达。射线诱导型启动子包括非限制性例子的fos启动子、c-jun启动子、或Egr-1启动子的至少一个CArG结构域。诱导型启动子的例子包括：一些基因如细胞色素P450基因、热激蛋白基因、金属硫蛋白基因、激素诱导型基因的启动子，如雌激素启动子等。
诱导型启动子可以是Zn2+金属硫蛋白启动子、金属硫蛋白-1启动子、人金属硫蛋白IIA启动子、lac启动子、小鼠乳腺瘤病毒早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒LTR启动子、丙糖脱氢酶启动子、单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子、猿病毒40早期启动子或逆转录病毒骨髓增殖性肉瘤病毒启动子。
诱导型启动子的例子包括：哺乳动物probasin启动子、乳白蛋白启动子、GRP78启动子、或细菌四环素诱导型启动子。其它例子包括：热激蛋白、类固醇激素、重金属、佛波酯、腺病毒EIA元件、干扰素和血清诱导型启动子。
用于体内的诱导型启动子包括那些对生物相容性物质，如在给定动物组织中常遇到的那些物质起反应的启动子。一个例子是人PAI-1启动子，它是肿瘤坏死难因子可诱导的。其它合适的例子有细胞色素P450基因启动子，各种毒素和其它因子如热激蛋白基因可诱导的启动子、各种应激诱导型启动子、激素可诱导基因，如雌激素基因启动子等。
显然，重要的是采用能有效指导所述DNA区段在选择用于表达的细胞、细胞器和生物中表达的启动子和/或增强子。分子生物学领域技术人员一般知道蛋白质表达所用的启动子、增强子和细胞类型。例如见Sambrook等(1989)，其内容纳入本文作参考。所用启动子可以是组成部分性、组织特异性、诱导型，和/或在适当条件下用来指导引入的DNA区段高水平表达，如有利于大规模生产重组蛋白质和/或肽。启动子可以是异源的或内源的。在某些实施方案中，本发明所用启动子是组织特异性启动子。
本发明考虑的启动子包括条件性启动子。条件性启动子是一种只在某种条件下才有活性的启动子。例如，当存在一种特定物质，如化学化合物时该启动子失活或受阻抑。当所述物质不再存在时，该启动子的转录被激活或去阻抑。条件性启动子的例子包括受甲硫氨酸调节的启动子Met23，调节作用以甲硫氨酸浓度为函数(Kerjan P等，1986)，或受半乳糖调节的启动子GAL1或GAL10，调节作用以半乳糖浓度为函数(Johnston和Davis，1984)，但不限于此。
在优选实施方案中，本发明的方法和组合物中采用外部刺激可调控的启动子。外部刺激可调控启动子的例子包括，例如，PL启动子、PR启动子、Pre启动子、Prm启动子、P’R启动子、T7晚期启动子、trp启动子、tac启动子、lac启动子、gal启动子、ara启动子或recA启动子。在具体实施方案中，本发明中采用这些启动子中的操纵子序列。
表1列出了本发明用于调节基因表达的元件/启动子。此表不想详尽描述参与启动表达的所有可能的元件，而只是示范性的。
                                     表1启动子和/或增强子
  启动子/增强子   参考文献
  免疫球蛋白重链   Banerji等，1983；Gilles等，1983；grosschedl等，1985；Atchinson等，1986，1987；Imler等，1987；Weinberger等，1984；Kiledjian等，1988；Porton等，1990
  免疫球蛋白轻链   Queen等，1983；Picard等，1984
  T-细胞受体   Luria等，1987；Winoto等，1989；Redondo等，1990
  HLA DQα和/或DQβ   Sullivan等，1987
  β-干扰素   Goodbourn等，1986；Fujita等，1987；Goodbourn等，1988
  白介素-2   Greene等，1989
  白介素-2受体   Greene等，1989；Lin等，1990
  MHC II类5   Koch等，1989
  MHC II类HLA-Dra   Sherman等，1989
  β-肌动蛋白   Kawamoto等，1988；Ng等，1989
  肌苷激酶(MCK)   Jaynes等，1988；Horlick等，1989；Johnson等，1989
  前白蛋白(甲状腺素运载蛋白)   Costa等，1988
  弹性蛋白酶I   Omitz等，1987
  金属硫蛋白(MTII)   Karin等，1987；Culotta等，1989
  胶原酶   Pinkert等，1987；Angel等，1987
  白蛋白   Pinkert等，1987；Tronche等，1989，1990
  α-铁蛋白   Godbout等，1988；Campere等，1989
  t-珠蛋白   Bodine等，1987；Perez-Stable等，1990
  β-珠蛋白   Trudel等，1987
  c-fos   Cohen等，1987
  c-HA-ras   Triesman，1986；Deschamps等，1985
  胰岛素   Edlund等，1985
  神经细胞粘附分子(NCAM)   Hirsh等，1990
  α1-Antitrypain   Latimer等，1990
  H2B(TH2B)组蛋白   Hwahg等，1990
  小鼠和/或I型胶原   Ripe等，1989
  葡萄糖调节蛋白(GRP9和GRP78)   Chang等，1989
  大鼠生长激素   Larsen等，1986
  人血清淀粉A(SAA)   Edbrooke等，1989
  肌钙蛋白质I(TNI)   Yutzey等，1989
  血小板衍生生长因子(PDGF)   Pech等，1989
  杜兴肌肉营养不良   Klamut等，1990
  SV40   Banerji等，1981；Moteau等，1981；Sleigh等，1985；Firak等，1986；Herr等，1986；Imbra等，1986；Kadesch等，1986；Wang等，1986；Ondek等，1987；Kuhl等，1987；Schaffner等，1988
  多瘤(病毒)   Swartzendruber等，1975；Vasseur等，1980；Katinka等，1980，1981；Tyndell等，1981；D和olo等，1983；de Villiers等，1984；Hen等，1986；Satake等，1988；Campbell等，1988
  逆转录病毒   Kriegler等，1982，1983；Levinson等，1982；Kriegler等，1983，1984a，b，1988；Bosze等，1986；Miksicek等，1986；Celander等，1987；Thiesen等，1988；Celander等，1988；Chol等，1988；Reisman等，1989
  乳头瘤病毒   Campo等，1983；Lusky等，1983；Sp和idos和Wilkie，1983；Spalholz等，1985；Lusky等，1986Cripe等，1987；Gloss等，1987；Hirochika等，1987；Stephens等，1987；
  乙肝病毒   Bulla等，1986；Jameel等，1986；Shaul等，1987；Sp和au等，1988；Vannice等，1988
  人免疫缺陷病毒   Muesing等，1987；Hauber等，1988；Jakobovits等，1988；Feng等，1988；Takebe等，1988；Rosen等，1988；Berkhout等，1989；Laspia等，1989；Sharp等，1989；Braddock等，1989
  巨细胞病毒(CMV)   Weber等，1984；Bosgart等，1985；Foecking等，1986
  Gibbon Ape白血病病毒   Holbrook等，1989；Quinn等，1989
表2提供了可诱导元件的例子，它们是在对特定刺激反应时可被激活的核苷酸序列区域。此表不想详尽描述参与启动表达的所有可能的元件，而只是示范性的。
                                         表2可诱导元件
  元件   诱导物  参考文献
  MT II   佛波酯重金属  Palmiter等，1982；Haslinger等，1985；Searle等，1985；Stuart等，1985；Imagawa等，1987；Karin等，1987；Angel等，1987b；等，1983；McNeall等，1989
  MMTV(小鼠乳头瘤病毒)   糖皮质激素  Huang等，1981；Lee等，1981；Majors等，1983；Ch和ler等，1983；Lee等，1984；Ponta等，1985；Sakai等，1988
  β-干扰素   Poly(rI)xPoly(rc)  Tavernier等，1983
  腺病毒5E2   EIA  Imperiale等，1984
  胶原酶   佛波酯(TPA)  Angel等，1987a
  溶基质素   佛波酯(TPA)  Angek等，1987b
  SV40   佛波酯(TPA)  Angel等，1987b
  小鼠MX基因   干扰素，新城堡病病毒  Hug等，1988
  GRP78基因   A23187  Resender等，1988
  α-2-巨球蛋白   IL-6  Kunz等，1989
  波形蛋白   血清  Rittling等，1989
  MHC I型基因H-2κb   干扰素  Blanar等，1989
  HSP70   EIA，SV40大T抗原  Taylor等，1989，1990a，1990b；
  增殖蛋白   佛波酯-TPA  Mordacq等，1989
  肿瘤坏死因子   PMA  Hensel等，1989
  甲状腺刺激激素α基因   甲状腺激素  Chatterjee等，1989
阻抑型启动子是一种能对阻抑物的存在或作用至少部分起反应的启动子，所述阻抑物是作用为阻抑启动子，从而可降低、阻抑或阻抑在该启动子影响下的多核苷酸转录的化合物或蛋白质。阻抑型启动子的特征是，在阻抑物存在、影响下，或接触时，可导致转录活动水平比该阻抑物不存在时，或不受其影响不接触时降低。阻抑物可以是内源性的，或通常是外源性给予的具有阻抑该阻抑型启动子活性的化合物或蛋白质。阻抑物，即化合物或蛋白质，原先自身可能是在诱导型启动子或阻抑型启动子控制下的多核苷酸转录或表达的产物。
在具体实施方案中，编码条件性阻抑融合蛋白的多聚核苷酯分子，和/或编码siRNA的多核苷酸也含有一操作性相连的启动子。该启动子可以是可诱导型启动子或组成型启动子，在某些实施方案中，这类启动子的例子包括Boshart等(1985)所述的巨细胞病毒启动子IE、遍在性表达型启动子如HSV-Tk(McKnight等，1984)和β-肌动蛋白启动子(如Ng等，1985所述的人β-肌动蛋白启动子)、及能与控制区联合使转基因整合位点独立表达的启动子(Grosveld等1987)、及组织特异性启动子如白蛋白启动子(肝脏特异性，Pinkert等，1987)、淋巴样特异性启动子Calame和Eaton，1988)、具体是T-细胞(Winoto和Baitimore，1989)和免疫球蛋白(Banerji等，1983；Queen和Balimore，1983)启动子、神经元特异性启动子(如神经纤丝启动子Byrne和Ruddle，1989)、胰腺行异性启动子(Edlund等，1985)或乳腺特异性启动子(牛奶乳清启动子，美国专利4,873,316和欧洲专利申请出版物264,166)及受发育调节的启动子，如小鼠hox启动子(Kessel和Cruss，Science.249：374-379，1990)或甲胎蛋白启动子(Campes和Tilghman，Genes Dev.3：537-546，1989)，以上各文献内容纳入本文作参考。优选在各自细胞类型中启动子是组成型的。
组织特异性启动子或元件的鉴定及特征分析其活性的试验是该领域技术人员熟知的。这类区域的例子包括人LIMK2基因(Nomoto等，1999)、促生长素阻抑素受体2基因(Kraus等，1998)、小鼠附睾视黄酸结合基因(Lareyre等，1999)、人CD4(Zhao-Emonet等，1998)小鼠α-2(XI)胶原(Lareyre等，1999)、DIA多巴胺受体基因(Lee等，1997)、胰岛素样生长因子II(Wu等，1997)、人血小板内皮细胞粘附分子-1(Almendro等，1996)和SM22α启动子。在某些实施方案中将采用组织特异性启动子和/或可调控元件。可用于本发明表达载体中的这类组织特异性启动子的其它例子，包括：大肠上皮细胞特异性的肝脂肪酸结合(FAB)蛋白基因、对胰细胞特异性的胰岛素基因、transphyretin、α1-抗胰蛋白酶、纤溶酶原激活物抑制剂1型(PA-1)、肝细胞特异性的载脂蛋白AI和LDL受体基因、少突胶质细胞特异性的髓鞘碱性蛋白(MBP)基因、胶质细胞特异性的胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)基因、特异性靶向眼睛的视蛋白和神经细胞特异性的神经元特异性烯醇化酶(NSE)基因的启动子。
本发明某些方面，利用组织特异性控制，来控制靶序列的表达水平，如控制siRNA的表达水平，或调节其它组分，如能直接或间接调节转基因(siRNA)表达的酶的表达水平。其与条件性阻抑融合蛋白的表达水平相反。然而，在其它实施方案中，条件性阻抑融合蛋白的表达是组织特异性的，而非siRNA或酶的组织特异性表达。
还考虑本发明可采用dectin-1和dectin-2启动子可在本发明中联用的其它病毒启动子、细胞启动子/增强子和诱导型启动子/增强子列于表1和表2中。此外，启动子/增强子联合(如Eukaryotic Promoter Data Base EPDB)也可用来驱动编码多糖加工酶、蛋白质折叠辅助蛋白、选择性标记蛋白或感兴趣的异源蛋白的结构基因的表达。或者，在本发明中可采用用于基因治疗，如癌基因治疗的组织特异性启动子(表3和表4)。
                   表3：基因治疗的候选组织特异性启动子
 组织特异性启动子   启动子在其中具有活性的癌症   启动子在其中具有活性的正常细胞
 癌胚抗原(CEA)*   大部分结直肠癌、50％肺癌、40-50％胃癌、大多数胰腺癌、许多乳腺癌   结肠粘膜、胃粘膜、肺上皮、外分泌汗腺、睾丸细胞
 前列腺特异性抗原(PSA)   大多数前列腺癌   前列腺上皮
 血管活性肠肽(VIP)   大多数非小细胞肺癌   神经元、淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸性白细胞
 表面活性蛋白A(SP-A)   许多肺腺癌细胞   II型肺克拉拉细胞
 人achaete-scute同源物(hASH)   大多数小细胞肺癌   肺内的神经内分泌细胞
 粘液素-1(MUC1)**   大多数腺癌(起源于任何组织)   乳腺和呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道的腺上皮细胞
 甲胎蛋白   大多数肝细胞癌、可能有许多睾丸细胞癌   肝细胞(在某些情况下)、睾丸
 白蛋白   大多数肝细胞癌   肝细胞
 酪氨酸酶   大多数黑色素瘤   黑色素细胞、星形细胞、雪旺细胞、某些神经元
 酪氨酸结合蛋白(TRP)   大多数黑色素瘤   黑色素细胞、星形细胞、雪旺
  细胞、某些神经元
 角蛋白14  可能许多鳞状细胞癌(如头颈癌   角质形成细胞
 EBV LD-2  许多头颈鳞状细胞癌   上消化道角质形成细胞
 胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)  许多工作星形细胞瘤   星形细胞
 髓鞘碱性蛋白(MBP)  可能许多睾丸癌   少突胶质细胞
 睾丸特异性血管紧张素转化酶(睾丸特异性ACE)  可能许多睾丸癌   精原细胞
 骨钙蛋白  可能许多骨肉瘤   成骨细胞
表4：用于组织特异性基因的候选启动子
  启动子   启动子在其中具有活性的癌症   启动子在其中具有活性的正常细胞
  E2F-调节启动子   几乎所有的癌症   增殖性细胞
  HLA-G   许多结直肠癌、许多黑色素瘤、可能许多其它癌   淋巴细胞、单核细胞、精母细胞、滋养层细胞
  FasL   大多数黑色素瘤、许多胰腺癌、大多数星状细胞瘤、可能许多其它癌   活化白细胞、神经元、内皮细胞、角质形成细胞、免疫特许组织中的细胞、肺、卵巢、肝和前列腺中的某些细胞
  MYC-调节的启动子   大多数肺癌(小细胞和非小细胞性)大多数结直肠癌   增殖性细胞(只是某些类型)、乳腺上皮细胞(包括非增殖性)
  MAGE-1   许多黟以素瘤、某些非上细胞肺癌、某些乳腺癌   睾丸
  VEGF   70％的各种癌(在许多癌中组成部分性过度表达)   新生血管部位的细胞(但不象肿瘤，其表达是暂时性的，强度差，非组成型)
  BFGF   假设许多不同癌症，因为局部缺血诱导了bFGF的表达   局部缺血部位的细胞(但不象肿瘤，其表达是暂时性的，强度差，
  非组成型)
  COX-2   大多数结直肠癌，许多肺癌，可能许多其它癌   炎症部位的细胞
  IL-10   大多数结直肠癌、许多肺癌、许多头颈鳞状细胞癌，可能许多工作其它癌   白细胞
  GRP78/Bip   假设许多不同癌症，因为肿瘤特异性状况血诱导了GRP7S的表达   局部缺血部位的细胞
  Egr-1的CarG元件   为离子化、射线所诱导，可想象放射引起的大多数肿瘤   暴露于离子射线的细胞、白细胞
B.起动信号和内部核糖体结合位点
有效翻译编码序列还需要特异性起始信号。这些信号包括ATG起始密码子或毗邻序列。可能需要提供外源性翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域技术人员能容易地确定和提供必须的信号。众所周知起始密码子必须位于所城编码序列的读框内以确保完整翻释插入物。外源性翻译控制信号和起始密参天子可以是天然的可合成的。包含适当的转录增强元件可提高表达效率。
在本发明某些实施方案中，利用内部核糖体进入位点(IRES)元件来产生多基因或多顺反子信使。IRES元件能绕过5’-甲基化加帽依赖型翻译的核糖体扫描模式，并开始在内部位点翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。细小病毒家族二成员(脊灰和脑心肌炎病毒)的IRES元件已有描述(Pelletier和Sonenberg，1988)，以及哺乳动物信使的IRES(Macejak和Sarmow，1991)。可将IRES元件连接于异源性开放读框。可一起转录多个开放读框，每个由IRES隔开，产生多顺反子信使。借助该IRES元件，各个开放读框均可接近核糖体进行有效翻译。利用一个启动子/增强子转录一个信使，可有效表达多个基因(见美国专利5,925,565和5,935,819，纳入本文作参考)。
C.多克隆位点
载体可含有多个克隆位点(MCS)，它们位于含有多个限制性酶切位点的核酸区域中，每个酶切位点都可用于标准重组技术来消化此载体(见Carbonelli等，1999和Cocea，1997，二者内容纳入本文作参考)。“限制性酶消化”指用只能在某核酸分子特定位点发挥作用的酶催化性切除该核酸分子。可从商业上获得许多这样的酶。本领域技术人员都知道这种酶的用途。通常采用能在MCS中切除的限制性酶使载体线性化或片段化，以能将外源序列连接入该载体。“连接”指在可以是或不是相互毗连的二个核酸片段之间形成磷酯键的过程。涉及限制性酶和连接反应的技术是重组技术领域技术人员熟知的。
D.剪接位点
大多数转录的真核RNA分子将经历RNA剪接从最初转录物中除去内含子。含基因组真核序列的载体可能需要供体和/或受体剪接位点才能确保转录物的正确加工用于蛋白质表达(见Ch和ler等，1997，其内容纳入本文作参考)。
E.末端信号
本发明的载体或构建物一般含有至少一个末端信号。“末端信号”或“终止子”组成了RNA聚合酶转录DNA序列为RNA时的特定终止位点。因此，在某些实施方案中，考虑设置中止RNA转录物产生的终止信号。终止子是体内必须的，以达到所需的信使水平。
在真核系统中，终止子区域还包括特异性DNA序列，其可定点切除新生转录物以暴露出聚腺苷酸化位点。这给予了专门的内源性聚合酶信号使其在该转录物的3’端添加大约200A的残基(聚A)。经昆尾修饰的RNA分子看来更稳定，能更有效翻译。因此，其它涉及真核细胞的实施方案中，优选终止子含有RNA切除信号，更优选访终止子信号能开启信使的聚腺苷酸化。终止子和/或聚腺苷酸化位点元件的作用，可能是提高信使水平和/或最大程度减少从表达盒子到其它序列的读取。
考虑可用于本发明的终止子包括本文所述或本领域技术普通人员已知的转录终止子，包括但不限于，例如基因的末端序列，如牛生长激素终止子或病毒末端序列如SV40终止子。在某些实施方案中，末端信号可以缺少可转录或可翻译序列，如由于序列截短而致。
F.聚腺苷酸化信号
具体的真核细胞表达通常包括聚腺苷酸化信号对转录物适当聚腺苷酸化的作用。不认为聚腺苷酸化信号的性质是成功实施本发明的关键，和/或可采用任何这种序列。优选的实施方案包括：SV40聚腺苷酸信号和/或牛生长激素聚腺苷酸信号，方便的和/或在各种靶细胞中已知功能良好的。聚腺苷酸化可提高转录物的稳定性，或可促进胞质质转运。
G.复制起点
为了增殖宿主细胞中的载体，此载体中可含一处或多处复制起始位点(常称为“ori”)，它是起动复制的特异性核酸序列。或者，如果宿主细胞是酵母菌，可采用自动复制序列(ARS)。
H.可选择的和可筛选的标记
在本发明的某些实施方案中，可在表达载体中加入一标记而在体外或体内鉴定含本发明多核苷酸的构建物。这类标记可赋予细胞一种可被鉴定的变化，使得易于鉴定含该表达载体的细胞。通常，可选择性标记是能赋予某可选择性能的标记。阳性可选择标记是存在该标记时可选到其存在的标记，而阴性可标记是其存在防碍其选择的标记。阳性可选择标记的例子是药物抗性标记。
通常在载体中包付诸东流可选择标记有助于克隆和转化子的鉴定，例如能赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、零霉素和组氨醇抗性的基因是有用的可选择性标记。除了能赋予可区分转化子的表型的标记外，也考虑其它类型的标记包括可筛选的标记，如GFP，依靠比色法进行分析。或者，可利用可筛选的酶，如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员知道怎样使用免疫标记物，可能要与FACS分析相结合。认为所用的标记不重要，只要它能与编码基因产生的核酸同时表达。可自动控制和可筛选的标记的其它例子是该领域技术人员熟知的。
例如，Mermad等在美国专利6,340,741中公开了在生物学和医学研发，及生物动技术和体细胞基因治疗中广泛应用的靶基因在真核系统中的受控表达。利用异源性或人造(嵌合性)转录因子对外源加入的药物诱导物(其作用是bona fide配体)的反应，实现了基因表达的调节。通常这些转录因子能识别靶基因启动子中的同源调节元件，该配体能调节转录因子与DNA的相互反应，或DNA-结合因子与转录活化结构域的相互反应。
给予或去除该配体会导致靶基因转录或活化的开关处于开或关状态。几种小分子已显示能介导组织培养细胞和/或转基因动物模型中基因表达的调节。这些小分子包括FK1012和雷帕霉素免疫阻抑药物(Spencer等，1993；Magari等，1997)、孕酮拮抗剂米非司酮(RU486)(Wang，1994；Wang等，1997)、四环素抗生素衍生物(Gossen和Bu jard，1992；Gossen等，1995；Kistner等，1996)和昆虫类固醇激素蜕皮激素(No等，1996)。所有这些文献纳入本文作参考)。
作为其它例子，Yao在美国专利6,444,871中公布了已开发的与四环素抗性(tet)操纵子子的前核元件，其中tet阻抑蛋白与已知能调节哺乳动物细胞转录的多肽融合在一起。通过给tet操纵子序列定位后将该融合蛋白导入特定位点。例如，将tet阻抑子融合于反式激活蛋白(VP16)而靶向位于某选出的基因上游的tet操纵子序列(Gussen等，1992；Kim等，1995；Hennoghausen等，1995)。此融合蛋白的tet阻抑子部分与该操纵子结合从而将VP16激活蛋白靶向需要诱导转录的特定位点。另一种方法是使tet阻抑子与KRAB阻抑结构域融合，将此蛋白靶向某基因上游数百个碱基对的操纵子。利用此系统，已发现该嵌合蛋白，而不是单单tet阻抑子，能产生对CMV-调节的基因表达10-15倍的阻抑(Deuschle等，1995)。
I.调节元件和系统
在基因调节及其修饰的一些例子中，需要导入进化上相隔很远物种的调节元件，如大肠杆菌到高等真核细胞，预计调制这种调节环境的的效应器对真核细胞生理将是椭性的，结果不会在真核细胞中引起不希望的多效性作用。例如大肠杆菌的Lac阻抑子(LacR)/操纵子/诱导物系统在真核细胞中具有功能，已被用来调节基因表达，通过三种不同方式：(1)将Lac操纵子置于启动子的恰当位点防止转录启动(Hu和Davidson，1987；Brown等，1987；Figge等，1988；Fuerst等，1989；Deuschle等，1989)；(2)用LacR/操纵子复合物阻断RNA聚合酶的转录延伸(Deuschle等，1990)；(3)启动子活化对LacR与单纯疱疹病毒(HSV)毒粒蛋白16(VP16)的活化结构域之间的融合起反应(Labow等，1990；Baim等，1991)。
在一个版本的Lac系统中，lac操纵子-连接序列受LacR-VP16融合蛋白的组成型激活而表达，在存在异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)时表达关闭(Labow等，1990，同上)。在另一版本此系统中，采用在存在IPTG时能与lac操纵子结合的lacR-VP16变体，可通过提高细胞温度而增强(Baim等，1990，同上)。因此，在本发明的某些实施方案中采用了Lac系统的组分。例如，可将lac操纵子操作性连接于siRNA-编码多核苷酸，可从外部用，例如，含lac阻抑子的IPTG可诱导融合蛋白控制其表达。
还发现大肠杆菌四环素抗性系统的组分在真核细胞中具有功能，已被用来调节基因表达。例如在植物细胞中表达能在缺少呈环素时结合tet操纵子序列并阻抑基因转录的Tet阻抑子(TetR)，其表达浓度足够高能阻抑含tet操纵子序列的启动子的转录(Gatz，C等，1992，Plant J.2：397-404)。在本发明的某些实施方案中，类似地采用了这种阻抑子系统。
本发明中也可利用温度诱导型基因调节系统，如含有融合蛋白形式的冷诱导反式激活蛋白的示范性TIGR系统，其含有融合于VP16反式激活蛋白的热激反应调节子rheA(Weber等，2003a)。能对该融合温感器反应的启动子含有操作性连接于最小启动子，如人巨细胞病毒立即早期启动子最汪版本的rheO元件。在37℃允许温度时，该冷诱导反式激活蛋白，反式激活了示范性rheO-CMVmin启动子，得以表达靶基因。41℃时，该冷诱导反式激活蛋白不再反式激活rheO启动子。
本发明所用的其它实施方案包括大肠杆菌的红霉素抗性调节子，其含有对大环内酯抗生素，如红霉素、克拉霉索和罗红霉素起反应的阻抑(Eoff)和或诱导(Eon)系统(Weber等，2002)。Eoff系统利用红霉素依赖型反式激活蛋白，其中提供大环内酯抗生素来阻抑转基因的表达。在Eon系统中，阻抑子与操纵子结合导致转基因表达的阻抑。而存在大环内酯蛤诱导了基因表达。
Fussenegger等(2000)描述了采用天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的链阳性菌素抗性操纵子编码的Pip(原始霉素诱导的蛋白质)阻抑子的阻抑和可诱导系统，此系统可对链阳性菌素类抗生素(如原始霉素、威里霉素和喹奴普丁)反应。例如，可将Pip DNA-结合域与VP16的反式激活结构域，或与KRAB沉默结构域相融合。如以上所述，原始霉素存在或不存在都能以各自方式调节该PipON和PipOFF。
转基因表达系统的另一例子是利用密度感受系统(指颗粒性前核分子通讯系统，其具有可扩散性信号分子可防止阻抑子与操纵子位点结合，导致靶调节子脱阻抑)。例如，Weber等(2003b)采用含有天蓝色链霉菌的密度感受受体与反式激活结构域结合的融合蛋白，来调节各自具有的该融合蛋可结合的操纵子的嵌合性启动子。用无毒性的丁酰内酯，如SCB1和MP133来细调表达。
在具体实施方案中，本发明采用功能上彼此相容的多重多基因治疗性基因表达系统(见例如，Kramer等，2003)。例如，在Weber等(2002)中，采用大环内酯反应性红霉素抗性调节子系统，结合链阳性菌素(PIP)调节的和四环素调节的表达系统。
在本发明一具体实施方案中，用Pol II启动子调节转基因(如示范性的siRMA)的表达(见例如，Shinagawa和Ishii，2003)。如在Shinagawa和Ishii(2003)的示范性系统中，产生的长dsRNA没有5’-帽结构和3’-聚(A)尾，阻碍了此长dsRNA输出到胞质中，从而阻碍了干扰素反应的诱导。虽然在此系统中，转录后加工受到在RNA起始位点(为去除5’-加帽)和MAZ位点(为Pol II停顿)下游处加入顺式作用锤头核酶的调节，但这样做的任何方法都属于本发明的范围。
III.转染：将siRNA表达系统导入细胞或生物体中
转染是将核酸导入受体真核细胞中，然后将该核酸序列整合入染色体DNA中。有效的转染需要载体，它能促进外源性核酸导入所需的细胞中，可提供染色体整合机制，和适当表达这些核酸编码的性状或蛋白质。设计和构建细胞转染用的有效、可靠和安全的载体是本领域熟知的。本发明申请书中，能介导元件(a)、(b)和(c)输送和基因组整合到靶细胞、组织或生物体内的任何载体都认为属于本发明的范围。
许多类型的病毒构成了载体的基础。所用的病毒常衍生自病原性种类的病毒，它们具有需要的性能和转染细胞的能力。然而，不是所有的病毒者能成功转染处在细胞周期所有阶段的所有类型细胞。因此在开发病毒载体时，常需修饰病毒基因组以提高它们导入外源性基因构建物(转基因)或其它核酸的能力和效果。同时，可导入修饰以减少或消除它们引起疾病的能力。因此，本发明可采用病毒，如逆转录病毒、痘苗病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)、腺伴随病毒(AAV)(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；；Hermonat和Muzycska，1984)和疱疹病毒衍生的病毒载体。它们能赋予各种哺乳动物细胞几种吸引人的特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1998；Horwich等，1990)也可采用衍生自病毒，如痘苗病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)、仙台病毒、巨细胞病毒和单纯疱疹病毒的其它病毒载体。
本领域所知的逆转录病毒载体可用于输送siRNA表达构建物。见例如，Devroe和Silver(2002)(其内容纳入本文作参考)证明逆转录病毒是输送siRNA表达盒到哺乳动物细胞中的有效载体Barton和Medzhitov(2002)证明用逆转录病毒导入siRNA表达构建物导致原代细胞中基因的稳定性失活。
慢病毒是逆转录病毒的一个亚组，由于其整合前复合体的亲核性质可通过核孔输入其活性形式，而能感染非分裂细胞。
A.慢病毒载体
慢病毒属包括牛慢病毒族、马慢病毒族、猫慢病毒族、羊慢病毒族和灵长类慢病毒族。用于基因治疗的慢病毒载体的开发综述见Klimatcheva等(1999)。适合于基因治疗的慢病毒载体的设计和用法见例如美其名曰国专利6,531,123、6,207,455和6,165,782中所述(各专利内容纳入本文作参考)。慢病毒的例子包括但不限于：HIV-1、HIV-2、HIV-1/HIV-2假型、HIV-1/SIV、FIV、猫关节炎脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫务病毒和牛免疫缺陷病毒。优选HIV-1。
慢病毒载体可赋予基因疗法很大优点。长期表达需要将它们稳定地整合入靶细胞的染色体中。另外，它们不会转移病毒基因从而避免了产生可能被细胞毒T-细胞摧毁的转导细胞问题。此外，它们具有相对较优大的克隆容量，因而有临床适用性。慢病毒与其它逆转录病毒相反，能转导非分裂怀细胞。这对于组织，如造血系统、脑、肝、肺和肌肉的基因治疗非常重要。例如，衍生自HIV-1的载体可在体内或先体外后体内将转基因输送、整合到细胞，如神经元、肝细胞和肌细胞中并稳定表达(Blomer等，1997；Kafri等，1997；Naldini等，1996a；1996b)。
慢病毒基因组和原病毒DNA具有3个逆转录病毒中所见的基因：gag、pol和env，它们侧国接有2个长末端重复(LTR)序列。Gag基因编码内部结构(基质、包衣和核衣壳)蛋白：pol基因编码RNA指导的DNA聚合酶(逆转录酶)、蛋白酶和整合酶；env基因编码病毒包膜糖蛋白。5’和3’LTR的作用是启动转录和病毒粒子RNA的聚腺苷酸化。LTR含病毒复制必须的所有其它顺式作用序列。慢病毒含有的其它基因包括vif、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx。
毗连5’LTR的序列是基因组逆转录(tRNA引物结合位点)和病毒RNA有效包裹入颗粒(Psi位点)中所必须的序列。如果从病毒基因组中减去包裹(或逆转录病毒RNA包装入感染性毒粒中)必须的该序列，此顺式作用缺陷将阻止基因组RNA的包裹。然而，产生的突变体仍能指导所有毒粒蛋白的合成。
慢病毒载体是本领域熟知的，见Naldini等，(1996a和1996b)；Zufferey等(1997)；dULL等，(1998)；美国专利6,013,516和5,994,136，它们的内容均纳入本文作参考。通常，这些载体是质粒或病毒，结构中携带有掺入外源性核酸、选择和将该核酸转移到宿主细胞中所必须的序列。
相应的，在体外和体内，人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)衍生的慢病毒转基因的有效输送、整合入非有丝分裂细胞中并长时间表达(Naldini等，1996a；Naldini等，1996b；Blomer等，1997)。
逆转录病毒基因组中，也含有所有的必须顺式作用元件的一个RNA分子，携带了所有的编码序列。通过将编码基各种组分的序列分配成为尽可能性多的独立单元，以最大程度提高再创立复制活性重组体(RCR)所需的交换数，从而达到了载体产生系统的生物安全性。在宿主生产细胞，如293人胚肾细胞中共表达毒粒包装元件和载体基因组产生了慢病毒载体颗粒。就HIV-1载体而言其毒粒的核心和酶组分来自HIV-1，而包膜蛋白衍生自异源病毒，最常用VSV病毒，因为其G蛋白稳定性高和嗜性广。HIV的基因组复杂，全套基因编码致病所必须的毒力因子，但可分散转移病毒基因，这大大有助于开发临床上可接受的载体系统。
多功能减毒包装系统现在通常只包含HIV-1九个基因中的三个：gag，编码毒粒的主要结构蛋白；pol，负责编码逆转录病毒的特异性酶，和rev，编码gag和pol有效表达所需的翻译后调节子(Dull等，1998)。由于这种包装系统缺失太多，亲代病毒不可能重建，因为其基因组的约60％完全被去除。在一种版本的HIV包装系统中，从4个分离的DNA单元产生了Gag/Pol、Rev、VSV G和载体。另外，载体和辅助序列之间的重叠减少到59个核苷酸使得发生同源重组的机会减至最低程度。
基于HIV 1型(HIV-1)的载体颗粒可通过在所谓生产细胞质如293T人胚肾细胞中共表达毒粒馐元件和载体基因组而产生。可用一些质粒瞬时转染这些细胞。常用3-4种质粒，但数目可更多，取决于慢病毒组分破开进入不同单元的程度。通常，一种质粒编码HIV-1衍生毒粒的核心和酶组分。此质粒称为包装质粒。另一质粒编码包膜蛋白，最常是水疱口炎病毒的G蛋白(VSV G)，因为它稳定性高，嗜性广。此质粒可称为包膜表达质粒。还有一质粒编码待转运给靶细胞的基因组，即载体本身，称为转运质粒。通过此技术可产生每毫升数百万转导单位(TU/ml)滴度的重组病毒和及变体。超离心后可获得大约109TU/ml的浓缩贮存液。
载体本身只是一种转移给靶细胞的遗传物质。它通常含转基因盒，侧接有其包裹、逆转录、核输入和整合所需的顺式作用元件。如先前对致癌逆转录病毒所做的工作，制备的慢病毒载体是“自身灭活的”，一旦转移到靶细胞中，它们即会喪失转录病毒长末端重复序列(LTR)的能力(Zufferey等，1998)。此种修饰进一步降低成本了出现复制活性重组体的危险，和避免了启动子干扰相关的问题。这些载体或它们的组分，称为SIN载体或含SIN的载体。进一步详述此SIN设计见Zufferey等，1998和美国专利5,994,136，其内容纳入本文作参考。
B.转录后调节元件
在某些实施方案，特别是涉及本发明具有合理活性的启动子的慢病毒构建物实施方案中，可能需要增强转基因的表达。
一类翻译后调节元件(PRE)是位于表达盒子中能刺激基因表达的内含子。然而，在慢病毒生命周期中可能剪去内含子。因此，如果内含子用作PRE，可能必须将它们安置在相对于载体基因组转录的相反朝向。
在病毒生命周期中不依赖于剪接活动的翻译后调节元件，优点是不会被除去。一些例子是单纯疱疹病毒的翻译后加工元件、乙肝病毒的翻译后加工元件(HPRE)和美洲旱赖肝炎病毒的翻译后加工元件(WPRE)。其中最优选WPRE，因为它含一个在HPRE中没有的额外顺式作用元件(Donello等，1998)。将此调节元件定位于载体包括在该转基因的RNA转录物中，但在该转基因翻译单元终止密码子的下游。如本发明和Zufferey等，1999所证明的那样，WPRE元件是刺激和增强慢病毒载体中所需转基因表达的有用工具。
WPRE的特征鉴定和描述见美国专利6,136,597，其内容纳入本文作参考。如上所述，WPRE是一种RNA输出元件，能介导RNA从细胞核中有效地转运到胞质中。它通过插入的顺式作用核酸序列能增强转基因的表达，因而可将该元件和转基因包付诸东流在一个转录物内。以有义方向存在的WPRE显示能提高转基因表达7-10倍。逆转录病毒输送cDNA形式的序列，而不是含完整内含子的基因，因为在导致形成逆转录病毒颗粒的一系列活动中，内含子通常被剪掉。内含子介导了原始转录物与剪接机制的相互反应。因为剪接机制对RNA的加工而促进了它的胞质输出，由于剪接和转运机制之间的偶联，常驻机构不能充分表达cDNA。因此，在载体中加入WPRE可导致转基因表达增加。
在细胞核中导入外源核酸需要将该核酸通过核膜输入到核中。慢病毒所用的活性核输入系统，形成了它们在非分裂细胞中有效复制能力的基础。这训活性输入系统依靠一系列复杂的活动，包括特异性调制逆转录。具体说，在HIV-1中，位于pol基因中的中央多聚嘌呤片段(cPPT)引起下游plus链的合成，同时也引起3’多聚嘌呤片段(PPT)的plus链合成。该短的DNA分子的链转移后，上游plus链的合成将启动并进行下去直到到达基因组的中心。在中央末端序列(cTS)处，HIV-1逆转录酶被排斥(从其模板上释放出来)，以链置换方式发挥功能(Charneau等，1994)。纯结果是在基因组中央形成长99个核苷酸的具有稳定下垂物的双链DNA分子。这种中央“下垂物”有助于核输入(Zennou等，2000)。
IV.转基因小鼠和其它转基因动物
产生转基因小鼠所用的方法是该领域技术人员熟知的。例如，可采用题为“Manipulating the Mouse Embryo”1986，一书中的手工方法。例子见Leder和Stewart美国专利4,736,866中产生转基因小鼠的方法。其它例子包括以下纳入本文作参考的专利：美国专利6,025,539，涉及IL-5转基因小鼠；美国专利6,023,010，缺失成熟淋巴细胞类型的非人转基因动物；美国专利6,018,098，皮肤光衰老的体内和体外模型；美国专利6,018,097，表达人胰岛素的转基因小鼠；美国专利6,008,434，生长分化因子-11转基因小鼠；美国专利5,994,618，生长分化因子-8转基因小鼠；美国专利5,986,171，检查脊灰病毒神经毒性的方法；美国专利5,981,830，具有被破坏的hepsin基因的敲除小鼠和它们的子代；美国专利5,981,829，DELTA.Nur77转基因小鼠；美国专利5,936,138，编码能促进HIV感染的突变体L3T4蛋白的基因，和表达此蛋白的转基因小鼠；美国专利5,912,411，四环素可诱导转录激活蛋白的转基因小鼠；美国专利5,894,078，表达C-100app的转基因小鼠(各专利内容纳入本文作参考)。
本领域众所周知，在受精卵的核中，或在最终形成受精卵核部分的任何核遗传物质中，安置或插入外源遗传物质，可进行受精卵的遗传转化(产生胚胎和成熟的生物)。受精卵和此受精卵所产生的生物的基因型将包括该外源遗传物质的基因型。此外，含有外源遗传物质的受精卵将产生该外遗传物质的表型表达。
该外源遗传物质的基因型表达在该受精卵分裂的细胞上。然而，该表型的表达，如产生蛋白产物或外源遗传物质的产物，或受精卵或生物天然表型的变化，将发生在该受精卵或生物体发育中该具体外源遗传物质被激活的时间点。表型表达的变化，包括表型表达的增加或减少，或表型启动和/或控制的改变，包括加入新的启动子和/或控制子，或补充加强了该表型的现有癖动子和/或控制子。
美其名曰国专利4,873,191中公开并详细描述了各种类型的基因转化，其内容纳入本文作参考。生物的遗传转化可用于分化期体内基因表达的分析，和采用基因疗法或用非人转基因哺乳动物作为人类疾病的模型系统来消灭或减少遗传性疾病。此模型系统可用于测试推测的药物在人体中的潜在治疗价值。
可将外源性遗传物质置于成熟卵的核内。所述卵宜为受精卵或处在(通过孤雌生殖)活化期。加入外源性遗传物质后，再加入能形成受精卵的一组互补性单倍染色体(如精子细胞或极体)。通过将受精卵植入假孕雌性动物使其发育成生物。分析所产生的生物外源性遗传物质整合情况。如果确定有正常整合，该生物可用于据认为与某特定遗传疾病相关的基因的体内表达分析。
进行了利用这类转基因动物研究多种不同类型遗传疾病的尝试。见例如WO89/06689和WO 89/06693关于阿尔茨海默病的研究，其内容纳入本文作参考。
不同发育期限的胚胎靶细胞可用于导入转基因。根据胚胎靶细胞的发育阶段采用不同的方法。显微注射的最好靶子是受精卵。雄性小鼠的前核当其大小达到约20微米直径时，能容纳1-2皮升DNA溶液的生殖性注射。利用受精卵作为基因转移的靶主要优点是，在大多数情况下注射的DNA在第一次切除前可掺入宿主基因中(Brinster等，1985)。结果，所有的非人转基因动物将携带该掺入的转基因。这一般也反映在该转基因能有效地优越性给该奠基动物的是后代，因为50％胚细胞含有此转基因。受精卵的显微注射是掺入转基因的优选方法。
也可利用逆转录病毒感染将转基因导入非人动物。可在体外将发育的非胚胎培养到胚泡期。此期间的卵裂球可作为逆转录病毒感染的靶子(Jaenich，1976)。用酶处理去除透明带可获得对裂球的有效感染(Hogan等，1986)。用于导入转基因的病毒载体系统一般是携带转基因的复制缺陷型逆转录病毒，Jahner等，(1985)；Van derPutten等，(1985)。在单层能产生病毒的细胞上培养该裂球可容易有效地获得转染(Van der Putten，同上；Stewart等，1987)。或者，可在晚期进行感染。将病毒或病毒感染细胞注射入该裂球中(Jahner，1982)。大多数奠基动物是转基因镶嵌动物，因为转基因工程的掺入只发生在一亚组细胞中，形成了非人转基因动物。另外，奠基动物在基因组的不同部位可能含有各种逆转录病毒的转基因插入物，通过会分离到后代中。此外，也可通过逆转录病毒宫内感染妊娠中期的胚胎，将转基因导入胚细胞系中，虽然效率低(Jahner，1982)。
用于导入转基因的第三种靶细胞是胚胎干细胞(ES)。ES细胞可获自体外培养的植入前胚胎并与胚胎融合(Evans等，1981；Bradley等，1984；Gossler等，1986；到Robertson等，1986)。通过DNA转染功通过逆转录病毒介导的转导，可有效地将转基因导入ES细胞中。这样转化的细胞可与非人动物的胚泡组合。ES细胞然后定居在胚胎并归并入所产生的嵌合动物的胚系中。综述风Jaenisch，(1988)。
如本文所用，“转基因”是一种通过人的干预，如上述方法，引入到非人动物种系中的DNA序列。
因此，在本发明的一具体方面，非人哺乳动物所具有的示范性转基因含有编码操作性连接于本发明KRAB阻抑结构域的四环素可调控或四环素类似物可调控的DNA结合域的多核苷酸序列，或该示范性转基因编码的siRNA操作性连接于启动子和上述融合基因产物可结合的序列。含有二种转基因(即编码四环素可调控或四环素类似物可调控融合蛋白的转基因，和含有连接有对该融合蛋白起反应的启动子的转基因)的双重转基因动物也包括在本发明中。一实施方案中，该转基因动物园是小鼠。在其它实施方案中，该转基因动物是奶牛、山羊、绵羊或猪。可通过在受精卵母细胞中导入编码上述示范性转基因的DNA分子，然后将该受精卵植入假孕养母中，使受精卵母细胞发育成非人转基因动物，而产生非人转基因动物。可通过二种转基因动物的适当交配产生双重转基因动物。可通过给予本发明双重转基因动物四环素或四环素类似物，来阻抑连接含有一启动子的siRNA(能对调节该启动子的四环素或四环素类似物可诱导融合蛋白起反应)的表达。
本发明另一具体方面涉及含有编码本发明四环素或四环素类似物融合蛋白转基因的非人转基因动物，其中，所述转基因通过同源重组整合入该动物细胞染色体中的预定位置(也称为同源重组动物)。该同源重组动物也可含有第二种编码操作性连接于对四环素或四环素类似物可诱导融合蛋白能起反应的siRNA的转基因。此第二种转基因被随机导入染色体中，或在染色体预定位置导入(如同源重组)。
可通过在胚胎干细胞群中导入本发明的靶向载体，产生在该动物细胞染色体DNA的预定位置贪大求含有整合的tTR-KRAB编码序列的本发明非人转基因动物，所用条件适合在编码tTR-KRAB的DNA与细胞染色体DNA之间发生同源重组，选出其染色体DNA预定位置整合了编码tTR-KRAB的DNA的胚胎干细胞，将该胚胎干细胞植入胚泡，再将该胚泡植入假孕养母中使该胚泡发育成非人转基因动物，从而产生该非人转基因动物。
A.条件性转基因动物
本发明还考虑条件性转基因或敲减动物，例如用重组方法产生这些动物。噬菌体P1Cre重组酶和酵母菌质粒的flp重组酶是位点特异性DNA重组酶的二个非限制性例子，它们能在特定的靶位点(Cre重组酶在loxP位点，flp重组酶在frt位点)切除DNA并催化该DNA与第二切除位点连接。已报导了许多合适的其它位点特异性重组酶，它们的基因可用于本发明的方法中。这类重组酶包括噬菌体λ(含或不含Xis)的Int重组酶(Weisberg等，1983，纳入本文作参考)、Tpnl和β-内酰胺酶转座子(Mercier等，1990)、Tn3解离酶(Flanagan和Fennewald，1989；Stark等，1989)、酵母菌重组酶(Matsuzaki等，1990)、枯草芽胞杆菌SpoIVC重组酶(Sato等，1990)、Flp重组酶(Schwartz和Sadowski，1989；Parsons等，1990；Golic和Lindquist，1989；Amin等，1990)、Hin重组酶(Glasgow等，1989)、免疫球蛋白重组酶(Malynn等，1988)和Cin重组酶(Haffer和Bickle，1988；Hubner等，1989)，所有均纳入本文作参考。这类系统在(Echols，1990；de Villartay，1988；Craig，1988；Poyart-Salmeron等，1989；Hunger-Bertling等，1990；Cregg和Madden，1989)中有所报告，所有这些文献内容纳入本文作参考。
本发明中特别令人感兴趣的是Cre重组酶。将Cre纯化至均一，并已广泛特征鉴定了它与lox P位点的反应(Abremski和Hess，1984，纳入本文参考文献)。Cre蛋白的分子量为35,000，可购自New Engl和Nuclear/DuPont。已克隆并表达了Cre基因(其编码Cre蛋白)(Abremski等，1983，纳入本文参考文献)。Cre蛋白可介导存在于相同或不同DNA分子中的二个lox P序列之间的重组(Sternberg等，1981)。因为lox P位点的内部间隔序列不对称，这二个lox P位点可能在方向上显示彼此相关(Hoess和Abremski，1984)。因此当同一DNA分子上的二位点以直接重复方向存在时，Cre将切除二位点之间的DNA(Abremski等，1983)。然而，如果二位点彼此相反，重组后它们之间的DNA不会被切断而是相颠倒。这样，具有二个顺方向lox P位点的环形DNA分子将会重组产生二个较小的环，而具有二个反向lox P位点的环形分子则简单地颠倒了二个lox P位点侧接的DNA序列。此外，当分开的DNA分子上存在靶序列时，重组酶的作用可导致远离靶位点区域的相互交换。
重组酶在特征鉴定敲除动物模型中的基因功能上有重要应用。当用本文所述构建物来破坏鲎凝血因子蛋白酶样基因时，在鲎凝血因子蛋白酶样基因翻译起始点下游(3’)插入阳性选择标记可产生融合转录物。该融合转录物可能导致某种水平的蛋白质表达后果不知。这提示阳性选择标记基因的插入可影响附近基因的表达。这种影响使测定敲除后基因的功能变得困难，因为不可能分辨某给定表型是否与某基因的灭活或附近基因的转录相关连。通过利用重组酶的活性解决了这二个潜在问题。当阳性选择标记侧接有同样取向的重组酶位点时，加入相应的重组酶将导致去除该阳性选择标记。以这种方式避免了阳性选择标记或融合转录物表达所引起的作用。
B.转基因敲减小鼠
在某些方面，本发明考虑建立能显示条件性敲减靶基因的转基因动物的方法，敲减靶基因可以组织特异性方式进行，虽然不需要这样。某基因的“敲减”可通过干扰突变基因转录为有害蛋白来实现。将此技术应用来创造其遗传的RNAi能使靶基因表达降低或沉默的转基因小鼠，从而产生稳定的“基因敲减”。
为使RNAi适应小鼠基因功能的研究，采用基因工程法创立了小鼠胚胎干细胞，此干细胞中RNAi被靶向到一特定基因(Carmell等，2003)。其根据是先前通过RNAi使感兴趣的基因沉默的研究，该研究采用工程改造的编码对应于该感兴趣基因的短发夹RNA分子有效实现了这种沉默(Carmell等，2003)。将这种干细胞注入胚胎中产生嵌合动物。这些嵌合性小鼠代交配，产生的后代体内每一个细胞都含有经基因工程程改造的RNAi诱导基因。
通过检查转基因小鼠的组织观察到，整个生物体内(如肝、心、脾)感兴趣基因的表达显著减少。基因表达的这种减少称为“基因敲减(knockdown)”，以和传统的涉及染色体中某DNA区段“基因敲除”，或完全缺失的方法相区别。
此RNAi为基础的基因敲减策略一个优点是，可修饰该策略使特定组织中的基因沉默，可设计使其在动物发育或成年期间任何时候打开或关闭。
V.治疗性应用
本发明可广泛用于各种需要能够调节基因表达水平的情况，如以迅速、有效和可控制方式打开或关闭基因表达，而不引起多效作用或细胞毒性。本发明具体可用于人的基因治疗目的，治疗遗传或获得性疾病。基因治疗的一般方法包括：将一种或多种核酸分子导入细胞，在该细胞中产生导入的遗传物质所编码的一种或多种产物，以恢复或改变功能活性。基因治疗方法的综述见：Anderson等，1992；Miller等，1992；Friedmann等，1989；和Cournoyer等，1990。然而，目前的基因治疗载体通常使用能对内源性转录因子起反应的组成型调节元件。这些载体系统没有能力调节患者的基因表达水平。相反，本发明的调节系统可提供情报此种能力。
为基因治疗目的采用本发明的系统，应至少将一种DNA分子导入需要基因治疗的患者(如患有遗传或获得性疾病的患病)的细胞中以修饰该细胞。被修饰的细胞包括：1)编码本发明可诱导调节子的核酸，其形式适合在宿主细胞中表达该可诱导调节子；和2)操作性连接有诱导型调节子-反应性启动子(如至少一个tet操纵子序列，任选的和最小启动子)的siRNA(如为了治疗目的)。可采用编码本发明调节系统诸组分的一个DNA分子，或者，可采用编码各个组分的不同DNA分子。可在活体外修饰患者的细胞后再导入该患者，或可采用在细胞中导入核酸的常规技术直接修饰体内的细胞。患者中存在Tc或Tc类似物时能刺激文艺患者细胞中感兴趣siRNA的表达，而患者中不存在Tc或Tc类似物时阻抑基表达。在某些实施方案中，基因表达水平不同取决于采用那种Tc类似物作为诱导物。此外，可根据个体的医疗需要调节siRNA的表达，这可能在该个体的一生中有变化。因此，本发明的调节系统赋予了比组成型调节系统更好的优点，可使基因表达水平的调节依据治疗情况的需要而定。
为治疗遗传性或获得性疾病患者细胞中要敲减或敲除的特别感兴趣基因，包括编码不良基因产物，如异常蛋白质的那些基因。非限制性特定疾病的例子包括甲状腺机能亢进(这是一种与甲状腺素分泌过多缺陷有关的疾病)和阿尔茨海默综合征。
基因治疗的应用特别感兴趣的在于癌症治疗，包括例如ABL1、BLC1、BCL6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3和YES等癌基因。本领域技术人员懂得，用本发明的方法和组合物治疗癌症可与其它其它形式癌症相结合，如手术、化疗、放疗、基因治疗、免疫治疗等。治疗的癌症类型包括非限制性例子有：胶质肉瘤、乳腺癌、肺癌、脑癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、子宫癌、膀胱癌、脾脏癌、头颈癌和骨癌。
本发明可用于开发治疗目的的自身或同种异体细胞系。例如，在细胞和/或器官移植中利用本发明作特别感兴趣的基因治疗。在示范性实施方案中，下调移植抗原(如通过siRNA下调β-2-微球蛋白表达)使同种异体移植细胞尽可能免遭患者免疫系统的排斥。就副作用(移植细胞不受控制的复制)而言，本发明可关闭RNAi。
可用于本发明的细胞类型包括：造血干细胞、成肌细胞、肝细胞、淋巴细胞、气道上皮细胞、皮肤上皮细胞、胰岛、多巴胺能神经元、角质形成细胞等。用于基因治疗的其它细胞类型、基因和方法的进一步说明见例如：Wilson等，(1988)；Armentano等，(1990)；Wolff等，(1990)；Chowdhury等，(1991)；Ferry等，(1991)；Wilson等，(1992)；Quqntin等，(1992)；Dai等，(1992)；van Beusechem等，(1992)；Rosenfeld等，(1992)；Kay等，(1992)；Cristiano等，(1993)；Hwu等，(1993)；Herz和Gerard，(1993)。
在本发明的具体实施方案中，治疗任何疾病的方法易于用siRNA治疗。在具体实施方案中，该方法包括制备含有编码操作性连接有外部可调控启动子的siRNA的多核苷酸构建物，其中该构建物编码的siRNA可治疗疾病，并通过外部可调控的启动子从外部调节该siRNA的表达。
所述疾病可以是，例如过度增殖性疾病，如癌症，具体的癌症例子包括胶质肉瘤、乳腺癌、肺癌、脑癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、子宫癌、膀胱癌、脾脏癌、头颈癌和骨癌。
在其它实施方案中，所述疾病涉及与至少一种激素过度分泌相关的过度分泌缺陷病。具体例子包括：甲状腺素分泌过多(如格雷夫斯病)、糖皮质激素分泌过多(如库欣综合征)、生长激素分泌过多(如巨人症或肢端肥大症)、胰岛素分泌过多、盐皮质激素分泌过多(如醛固酮过多症)、雄激素分泌过多(如雌性雄激素综合征)、雌激素分泌过多(如女子乳腺和/或卵巢癌发病升高和男子女性乳房)、或肾上腺素和/或去甲肾上腺素分泌过多。上前分泌过多缺陷的治疗可包括剧烈的治疗措施，如切除肾上腺。本发明的优点是通过本文所述的方法和组合物的特异性调节能够精细治疗分泌过多。
细胞免疫识别的控制
为治疗器官疾病和器官衰竭。在医学上采用同种异体或非自身组织移植变得越发重要。然而，利用同种异体移植物受到受者对移植组织频繁排斥的限制，因为供者与受者之间存在抗原性差异。
同种族各成员之间的抗原差异称为“同种抗原”。同种异体组织移植排斥时涉及的同种抗原称为“组织相容性抗原”。术语“主要组织相容性抗原”和“主要组织相容性复合物”(MHC)指基因的一种密切相连区域的产物。这些MHC基因产物位于细胞表面，是成功进行同种异体移植的重要障碍。
本领域技术人员知道，免疫防御机制的关键是T细胞。发现T细胞在对一种或数种与它们天然宿主的特异性移植抗原相关的抗原反应中受到限制。在体外，一种单倍型宿主的T细胞能对不同单倍型宿主移植抗原的相关抗原起反应。T细胞的受体库看来比B细胞免疫球蛋白库狭窄。此外，T细胞受体看来不能直接结合抗原，需要与抗原表位和移植抗原一起结合。本领域知道免疫移植抗原含有主要组织相容性复合物的成分。
移植抗原可分成二类：I类和II类，I类抗原比较遍布在宿主细胞上，而II类相对限制于淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞。不同的T细胞可被一类或加一类移植抗原所激活。人类中，活化T细胞的性质随与其互补的移植抗原类型而不同。
在效果上，看来一个T细胞克隆只识别与特异性等位移植抗原相结合的一种特异性抗原。然而，当将T细胞、抗原和抗原提呈细胞一起培养时，抗原序列的变异会影响反应的性质。根据变化的性质，可遇到三种可能性，即无变化，刺激增强和刺激减弱。
回顾以上所述，主要感兴趣的是能够调节体内外的免疫应答，能够激活或灭活特定的免疫应答。以这种方式，可调节对某事物的天然应答，即通过活化特定淋巴细胞来增强保护性应答，或灭活特定淋巴细胞来降低或防止免疫应答。
在优选实施例中，下调移植抗原可掩盖该移植物的免疫原性。在具体实施方案中，本发明提供控制细胞被免疫系统识别能力的方法和组合物。这样，本发明可提供至少一种可移植但不会引起免疫应答危险的细胞。在本发明一具体方面，产生的一种或多种细胞其MHC以可控制的方式已被敲减。如果细胞的MHC被敲减，在某些实施方案中，该细胞上的至少主要的MHC抗原基本上都缺少。因此，该细胞缺少组织相容性抗原使其不能补识别为外源性抗原。
本领域技术人员懂得，利用本发明的可调控性能，台去除外部施加的药物即废弃外部施加的药物，再从外部施加药物，加入更多的外加药物等等，可用来结束这种需要。因此能够掩盖细胞避开使移植不易进行的免疫应答是本发明的优点，利用本发明的可逆方式也是特别有益的。
在本发明的具体实施方案中，在调节基因产物时使全部或基本上全部的MHC I类复合物缺失，可控制免疫系统识别的能力。例子包括β2-微球蛋白复合体中的β2-微球蛋白分子，和/或功能类似β2-微球蛋白的分子。
在具体实施方案中，扩本发明方法下调I类或II类，或二者移植抗原。在加一具体实施方案中，下调NHC I移植抗原，如β2-微球蛋白。移植抗原的其它例子包括HLA，其中包括HLA-C、HLA-G和HLA-DQ；H-Y；P35B；Kdm4和Kdm5、TL、P198、P91A；H-2Kb等。
本文中可用于本发明的细胞包括，例如干细胞(如胚胎干细胞)、胰岛细胞、肝细胞、多巴胺能神经元、角质形成细胞或它们的混合物。在本发明的具体实施方案中，用本发明的方法，如敲减移植抗原如β2-微球蛋白来修饰干细胞，如胚胎干细胞。修饰干细胞然后分化。在另一具体实施方案中，在分化之前或之后修饰干细胞，或移植。
VI.人类疾病的动物模型
可单独或联用本发明的方法和组合物来刺激或阻抑动物特定基因的表达，或模拟人类疾病的病理机制，从而创立人类疾病的动物模型。例如在宿主动物中，参与疾病的感兴趣基因可能是本文所述siRNA的靶子。在示范性实施方案中，一种动物可与第二种动物交配，该第二种动物携带有一种或多种能调节siRNA表达的诱导型融合蛋白的转基因，以创立含有四环素或四环素类似物调节的融合蛋白基因和表达受其影响的siRNA二者的后代动物。可利用四环素或四环素类似物调节的融合蛋白下调该siRNA靶的基因的表达，以研究基因表达与疾病之间的关系。此方法优于同源重组基因“敲除”所产生的疾病动物模型，因为本所述示范性实施方案的tet-调节系统，能控制感兴趣基因的表达水平，又能在基因表达时下调或上调其水平。
VIII.实施例
以下实施例显示了了本发明的优选实施方案。本领域技术人员理解这些实施例中公开的技术代表了发明人公开的技术，按照这些技术能很好实施本发明，因此认为此技术构成了实施本发明的优选模式。然而，本领域技术人员应知道，凭借此公开的内容，可在具体实施中做出许多修改而仍能获得类似结果，但这些修改不脱离本发明的思路和范围。
                             实施例1
强力霉素通过tKRAB介导阻抑siRNA产生而诱导GFP表达的调节
在该系统的这个例子中，将元件(a)、(b)和(c)掺入慢病毒载体中。反式阻抑子(tTR-KRAB)由融合到人Kox-1的KRAB阻抑结构域的四环素阻抑子tTR的DNA结合域构成。tTR-KRAB的表达受组成型EF-1α启动子的控制。将tet0(四环素操纵子)序列、U6或H1启动子、sihRNA插入慢病毒载体3’长末端重复序列的U3区。在靶细胞中，此元件由于逆转录调制存在于整合的原病毒二端LTR中，从而复制了该3’LTR的U3区(图1)。
没有强力霉素时，tTR-KRAB结合tet0并阻断sihRNA合成，使sihRNA靶基因(例如感兴趣的基因))得以表达。存在强力霉素时，tTR-KRAB从tet0中释放出来，产生sihRNA，靶基因的表达受到阻抑。
图2提供的数据(类似于图5C所示)说明利用上述系统可调节GFP标记蛋白的表达。用携带有tet0和GFP-特异性sihRNA(pNGFP-siGFP/tet0，或pNGFR-siGFP/tet0inv，或pNGFR-siGFPinv/tet0，或pNGFR-siGFPinv/tet0inv)的慢病毒载体，和携带有在EF-1α启动子转录控制下的tTR-KRAB cDNA(pWPXL-KRAB)的慢病毒，共转导组成型表达的GFP(Hela-GFP)。在存在强力霉素时，GFP的表达受到显著阻抑，反映了tTR-KRAB从tet0中释放和GFP-特异性shRNA的合成。相反，在没有强力霉素时，tTR-KRAB与tet0结合导致阻抑sihRNA的合成，而使GFP得以表达。此资料证明，本发明的系统可用于有效和特异性调节内源或外源基因。这里用的GFP报道基因相当于内源基因，因为它已整合到细胞染色体中。另外，已知内源基因控制病毒载体通过siRNA的表达是有效的(如Devroe和Silver，2002)。
                          实施例2
                        材料和方法
以下用于实施3的材料和方法，可用于实施本文所述的本发明这施方案。
载体构建物采用标准的克隆方案构建载体。pSUPER和pSUPER-p53如前所述构建(Brummelkamp等，2002)。将pSUPFR的H1启动子插入pWPXL的3’LTR中构建pLV-H。为构建pLVTH，从pUHD 13-3切下tet0盒克隆入H1启动子上游的pLV-H中。
最后，用切取自pSUPER-siRNA的H1-siRNA盒替代pLV-H和pLV-TH中的H1启动子盒，分别产生pLY-H/siRNA和pLV-TH/siRNA。将编码tTR-KRAB的序列克隆入pWPXL替代的GFP标记(pLV-tTR-KRAB)，或利用脑心肌炎病毒的5’内部核糖体进入位点(IRES)，作为双顺反子单元也编码dsRed。
细胞培养和用慢病毒转导将293T、Hela和MCF-7细胞系培养在添加了10％胎牛血清的DEME中。按标准方案用瞬时转染的293T细胞产生所有的重组慢病毒(Zufferey等，1997)。简而言之用20微克质粒载体、15微克pCMV-ΔR8.91和5微克pMD2G-VSVG，以磷酸钙沉淀法反转染亚铺平的293T细胞。16小时后更换培养液，24小时后收获重组慢病毒。
为了分析GFP的调节，采用含有单拷贝WPXLGFP原病毒的Hela细胞克隆(Hela-GFP)。为转导，将Hela-GFP、MCF-7或Hela细胞接种在24孔板中(20×104细胞/孔)，16小时后，加入含重组慢病毒的培养液。培养16小时后，洗涤细胞分成二份，一半转导细胞中加入最终浓度5μg/ml的强力霉素。5天后收获细胞用FACS分析。
Western印迹分析  在含有蛋白酶抑制剂(Sigma)的RIPA裂解缓冲液(25mM TrispH7.5，1％Triton X-100，0.5％脱氧胆酸钠，5mM EDTA，150mM NaCl)中制备细胞提取液。在4-20％梯度PAGE-SDS凝胶上分离蛋白质样品(10μg)，电泳转移到聚偏氟乙烯膜上，接触抗p53(Santa Cruz Bioltechnology)、核纤层蛋白A/C(Santa CruzBioltechnology)、GFP(Clontech)和肌动蛋白(Calbiolchem)抗体。检测采用偶联有辣根过氧化物酶的抗体(Amersham)和增强的化学发光抗体(EFL；Amersham)。
FACS分析收获的Hela-GFP细胞用携带ΔNGFP cDNA的慢病毒载体转导，与标记了藻红NGFR-PE)的抗人NGFP特异性单克隆抗体(Becton Dickinson Pharmingen)一起培育，洗涤二次，用FACSscan(Becton Dickinson)分析氯荧光(GFP)和红色荧光(NGFP-PE)。用LV-THsi/p53或LV-This/核纤层蛋白和Plv-tTR-KRAB-Red共转导MCF-7和Hela细胞，在存在或不存在dox下培养，收获并用FACSscan分析氯荧光(GFP)和红色荧光(NGFP-PE)。
免疫荧光用LV-This/p53或LV-THsi/核纤层蛋白和Plv-tTR-KRAB-Red共转导MCF-7和Hela细胞，在存在或不存在dox下培养5天，用醛固定(10分钟/-20℃)，用PBS/1％BSA封闭，抗p53(Santa Cruz Bioltechnology)或抗核纤层蛋白A/C(SantaCruz Bioltechnology)抗体染色，第二抗体为偶联有Alexa633(Molecular Probe)的抗体作分析。用三色共焦显微镜(LSM 510 Carl Zeiss)拍照，用Zeiss软件分析。
                         实施例3
                        结果和讨论
此研究利用四环素可调控杂交蛋白，tTR-KRAB的优良特性，此蛋白质中大肠杆菌Tn10的四环素阻抑子(tTR)融合于人Kox1的KRAB结构域(Deuschle等1996；Gossen和Bujard，1992)。KRAB是见于许多锌指蛋白中的大约长75个氨基酸的转录阻抑调制物，可以取向不依赖型方式阻抑距其结合位点远达3kb的pol II-和polIII-介导的转录，推测是触发形成了异质染色体(Bellefroid等，1991；Deuschle等，1995；Margolin等，1994；Moosmann等，1997；Senatore等，1999)。当KRAB连接于tTR的DNA结合域时，可调节整合的与tet操纵子(tet0)序列(6)并列的启动子的转录。在没有强力霉素(dox)时，tTR-KRAB与tet0特异性结合，阻抑附近启动子的活性。相反，存在强力霉素时，tTR-KRA脱离与tet0的螯合，使基因工程能够表达(Deuschle等，1995)。
采用HIV-1衍生的慢病毒载体(LV)作为输送载体，因为它可提供能应用于广泛类型靶细胞的系统，即先体外后体内(细胞系、原代细胞如干细胞、受精卵母细胞、胚泡)或体内(如脑、肝)(Jacque等，2002；Miyoshi等，1999；Naldini等，1996a；1996b；Pfeifer等，2002；Qin等，2003；Rubinson等，2003；Tiscornia等，2003)；并且，由于tet0连接的转录单元只在整合入基因组中时才受tTR-KRAB的阻抑。从作为双顺反子转录物(其也可产生dsRed标记)一部分的遍在活性EF-1-α启动子表达tTR-KRAB式Cdna(图3A，LV-tTR-KRAB)。将tetO-H1启动子-siRNA盒插入自身灭活慢病毒载体3’长末端重复序列(LTR)的U3区中，构建成可调控的siRNA(图3A，LV-THsi)。逆转录中，载体RNA 3’U3区作为合成其5’DNA同源物的模板，因而在整合的原病毒中复制该tet0-H1-siNA盒(图3)。选择这种双拷贝构型可获得较高速率的siRNA合成。如Brummelkamp等，2002所述设计了含编码siRNA发夹前体的序列。对照载体携带有组成型活性的Hi-siRNA盒(LV-Hsi)，或H1或tet0-H1转录元件，无下游siRNA编码序列(分别为H1和tet0-H1)。所有的siRNA和对照载体也含内部EF1-α启动子下游的编码标记的基因。预测用LV-THsi和LVtTR-KRAB共同转导的细胞在保持无dox时，由于tTR-KRAB介导的对siRNA合成的阻抑，通常表达siRNA靶向的基因。相反，加入强力霉素将减轻其阻抑，从而下调靶基因(图4B)。该内部标记基因的表达也受条件性tTR-KRAB的阻抑，因此提供了一种内部监控装置。5C说明在慢病院载体中聚合酶III-介导的tTR-KRAB转录阻抑不依赖于tet0元件或聚合酶III启动子(HI)彼此的取向及与慢病毒的取向。
在第一系列实验中，研究了该系统调节稳定表达此荧光分的Hela细胞中的GFP产生(5A)。采用感染复数10的载体以确保良好的(共)转导率。用空LV-TH载体转导的Hela-GFP细胞在各自培养条件下保持了GFP强阳性。相反，用组成型活化LV-His/GFP载体转导的细胞表明出该标记的强烈下调。用可调控的LV-THsi/GFP载体转导的细胞，只存在tTR-KRAB和缺少dox时观察到GFP表达(图5A)。相应的，缺少强力霉素时，tTR-KRAB阻抑了该载体的ΔNGFP内部报告基因的表达(图5B)。如预期那样，tTR-KRAB介导的对siRNA产物的阻抑效果，不论tet0以有义或反义取向插入H1启动子上游或下游时相等。
其次，测试了该系统能否调节真正的内源性基因。选择p53和核纤层蛋白作为靶子，因为先前已鉴定和周全特征分析了siRNA能高效靶向这些基因(Brummelkamp等，2002；Elbashr等，2001)。采用MCF-7乳癌细胞作为p53下调研究的底物(图6，左)。用LV-tTR-KRAB和LV-THsi/p53共转导的细胞，在缺少dox培养时产生了野生型水平的p53，表明siRNA的合成全部阻抑(下图泳道7)。tTR-KRAB介导了这种阻抑，因为在仅用LV-THsi/p53转导的细胞中未测到p53，不论dox是否存在培养液中(上图，泳道7和8)。相反，加入强力霉素到该双重转导的细胞中，导致p53产生速率下调，如在含有组成型活化的LV-THsi/p53载体的细胞中观察到的那样强(比较下图泳道8和二图的泳道5与6)。用相应的siRNA慢病毒载体转导的Hela细胞中核纤层蛋白获得类似结果(图6)。值得注意的是，二种设置中，强力霉素诱导的siRNA产物，不论用Western印迹(图6)、FACS或共焦显微镜观察，都阻抑了p53或核纤层蛋白靶基因的表达，这与慢病毒载体内部GFP标记的阻抑相关。
综合在一起，这些结果表明，tTR-KRAB调节的、慢病毒载体介导的siRNA输送能以高效和无遗漏地可调控性阻抑细胞的基因表达。为完成此系统的特征鉴定，确定了其动力学和剂量反应性(7)。选择p53作为这种分析研究靶子是因为此蛋白的半衰期限相对较短为12小时左右。在用LV-THsi/p53和LV-tTR-KRAB载体双重转导的MCF-7细胞中，p53的稳定状态水平面早至培养液中加入5μg/ml dox后12小时就开始下降，36小时内用Western印迹法已测不到(图7A)。这提示RNA干扰在24小时不到时完全有效，意味着dox介导的tTR-KRAB螯合快速地分离，从而使整合的H1启动子高速产生siRNA产物。剂量反应分析进一步揭示对强力霉素控制极其敏感，同时点出基因阻抑的某些调节可能性。的确dox低浓度0.004μg/ml时已显示p53下调，而仅在0.25μg/ml剂量即达到了全部阻抑(图7B)。此实验中所用的抗p53siRNA抗体很有效，用较低特异性的siRNA时，更大范围的dox浓度可调节基因敲减的程度。
                           实施例4
                   条件性基因敲减动物(Ckd)
本发明涉及应用慢病毒载体介导的和药物诱导的RNA干扰来开发基因敲减动物。提供的技术包括以下系统：四环素反式阻抑子(tTR-KRAB)介导的聚合酶III活性的药物诱导型调节；和慢病毒介导的转基因。主要策略包括：(1)用tet0-siRNA和tTR-KRAB慢病毒载体共转导受精卵母细胞(通过卵黄周围注射)，然后将其转移到代孕母体子宫内；(2)用tet0-siRNA和tTR-KRAB慢病毒载体共转导受精卵母细胞(去除卵黄带后)，使其在体个成熟为胚泡转移到代孕母体子宫内：(3)用tet0-siRNA和tTR-KRAB慢病毒载体共转导桑椹胚或胚泡，使其成熟和/或转移到代孕母体子宫内；和(4)用tet0-siRNA和tTR-KRAB慢病毒载体共转导胚胎干细胞(ES)然后将其注射入胚泡转移到代孕母体子宫内。
由于高效和没有嵌合现象，第一代方法是本发明优选的。在发育或成年的任何时期可通过给予强力霉素诱导基因敲减。
                            实施例5
            利用转基因tTR-KRAB小鼠产生条件性敲减小鼠
实施例4中所述的策略也可应用于产生tTR-KRAB转基因动物，然后可利用此动物以tet-可调控siRNA载体进一步转基因。
因此，为了促进cKD小鼠的产生，创立了表达tTR-KRAB的转基因小鼠。用LV-tTR-KRAB-deRed慢病毒载体转导受精卵母细胞(通过卵黄周围注射)，然后转移到代孕母体子宫壶腹部。此法不需要共转导这样大量的运作表型，因为分离自tTR-KRAB小鼠的受精卵母细胞或胚泡可用上述(实施例4)方法以tet0-siRNA慢病毒载体转导。然而，可从tTR-KRAB小鼠分离ES细胞或任何其它类型细胞并用tet0-siRNA载体转导，以分析在条件性基因下调后的表型。
                          实施例6
               组织特异性可条件性敲减的动物
也可扩大本发明来获得以组织特异性方式的可条件性基因敲减。此情况为分析具体细胞类型的敲减表型，或基因敲减对生物整体是否有致死作用是特别需要的。将侧接loxP位点的填充片段(floxed)插入可调控H1聚合酶III启动子中防止下游shRNA的合成(图8和9)。转基因小鼠的产生，例如可通过转导从表达在组织特异性启动子转录控制下的Cre重组酶转基因小鼠挽回的受精卵母细胞(通过卵黄周围注射)，然后将其植入代孕母体中。由于Cre和填充片段被去除，从而激活了H1启动子，使条件性shRNA合成限于该特定组织。在某些特定情况时可采用条件性Cre(如与三苯氧氨可诱导核定位信号偶联)。也可利用标记基因作为填充片段来监测组织特异性切除的效率。
                            实施例7
               调节组织特异性敲减小鼠中的靶基因
本发明研究了对条件性基因敲减小鼠(其基因敲减是组织特异性的)中的基因调节。因此，例如，采用携带编码在组织特异性启动子转录控制下感兴趣基因的cDNA的tet0慢病毒载体(如LV-TH)，来转导获自tTR-KRAB小鼠的受精卵母细胞。给予药物以组织特异性方式调节双重转基因小鼠中的靶基因。
                            实施例8
            用tTR-KRAB小鼠进行组织特异性条件性基因表达
本发明还可延伸至动物中的条件性基因置换。其中在慢病毒载体中导入靶基因的突变型(图10)。该突变型因在其DNA序列中插入了沉默突变而能抵抗RNA干扰。此系统的此种特异性调制导致以下情景：缺少强力霉素时，siRNA的的合成及突变基因的表达受到tTR-KRAB的阻抑。相反，存在此药物时通过RNAi和突变等到位基因的表达导致敲减野生型基因的表达。因此，可通过条件性阻抑野生型等位基因可分析野生型背景中的隐性突变表型。
                             实施例9
     体外和体内通过tTR-KRAB的强力霉素诱导型调节外源基因表达
此实施例是关于本文已有描述的tTR-KRAB的产生，条件性转基因动物的产生，组织特异条件性转基因动物的产生，和例如通过调节外源基因的表达进行原位条件性表达。
本领域技术人员知道，本文所述方法和组合物可用于治疗目的，如基因治疗，来阻抑至少一种细胞的免疫识别，以治疗癌症等)及提供研究基因功能的有用方法。在具体实施方案中，这可通过该系统和本文所述的其各自方法对外源基因表达进行调节而实现，。
通过开发能组成型表达tTR-KRAB的转基因小鼠，可大大促进本文所述的策略。可采用常规方法(如ES细胞的原核注射或转染)或慢病毒介导的转基因，产生tTR-KRAB小鼠。例如，该tTR-KRAB小鼠可作为一种“通用平台”来条件性表达感兴趣的基因。本发明因此采用tet0慢病毒载体(如pLVTH)来输送编码感兴趣基因的cDNA到tTR-KRAB小鼠中。此转基因的表达将受到位于该载体上游的启动子特性的控制，并受加入的外部药物控制(如至少一种药物)。利用tTR-KRAB小鼠将确保对每一个转导细胞中感兴趣基因的调节。
在另一实验中，采用携带有编码感兴趣基因cDNA的tet0慢病毒载体(如LV-TH)来转导获自tTR-KRAB小鼠的受精卵母细胞，然后将其植入代孕期母体中。给予药物进行研究双重转基因小鼠中靶基因的调节。
感兴趣基因的表达可以是(a)完全性的(如果是组成型启动子表达该转基因，基本上包括该小鼠的每一个细胞)；(b)组织特异性的(如果由组织特异性启动子表达该转基因)；(c)局部性的(如局部注射到特定器官或器官某区域中，给予含药物可调控转基因盒的载体)。以于(a)和(b)，可利用tTR-KRAB小鼠作基础，通过输送含有位于组成型或组织特异性启动子下游的感兴趣基因表达盒，来产生双重转基因小鼠(利用常规或慢病毒载体介导的转基因)。本发明方法优于现有方法的一个主要改进是，得以药物可调控组织特异性表达转基因。
图11涉及药物可调控转基因的代表性实施方式，其中提供了含示范性TR-KRAB的小鼠，和编码感兴趣基因的多核苷酸(示为基因X，虽然该多核苷酸本身可能不是基因)，例如，将受遍在性启动子控制的(左上图)，或受组织特异性启动子控制的(右上图)多核苷酸导入TR-KRAB小鼠，进行外部药物可调控的敲减感兴趣的基因(表达)。
                              实施例10
               体外通过tTR-KRAB介导的对siRNA产生的阻抑
                   强力霉素诱导型调节细胞的基因表达
此实施例是关于采用本发明的方法和组合物产生本文所述的tTR-KRAB细胞系和产生条件性siRNA文库。
本发明可用来开发能够高通量研究，例如基因功能、药物试验(例如分析在缺少细胞基因时药物的功能)等的siRNA文库。通过开发组成型表达tTR-KRAB或类似的转基因的细胞系，可能极有利于下述策略。可用本文所述的慢病毒载体(如pLV-tTR-KRAB)或其它载体产生tTR-KRAB细胞系。可将该tTR-KRAB细胞系作为“通用平台”来条件性表达细胞的基因。因而本发是采用tet0慢病毒载体(如pLVTH)来输送siRNA(或siRNA文库)到tTR-KRAB细胞中。然后给予药物下调细胞的基因(表达)。采用至少一种tTR-KRAB细胞系来保证基本上每一个被转导细胞中感兴趣基因受到调节。利用条件性文库能定时、短期下调基因表达，从而避免可能的致死作用。另外，阻抑此可能的致死作用将扩增和增殖所选择的细胞，用于进一步研究。
因此，产生基因敲减的细胞系可用于，例如，治疗目的(如基因治疗)、药物筛选和研究基因功能。临床应用siRNA的安全装置也具有本发明这种和类似实施方式的优点。
在本发明一具体实施方案中，可用此法和组合物来开发用作治疗的自身或同种异体细胞系。如下调移植抗原(如一实施例中，通过RNAi下调β2-微球蛋白的表达)将得以移植同种异体细胞(如非限制性的胰岛细胞、肝细胞、多巴胺能神经元、角质形成细胞等)，同时最大程度减少被患者免疫系统排拆的危险。本发明能在发生不良反应时(如植入细胞不受控制的复制)关闭RNAi。
                          实施例11
            体内通过tTR-KRAB介导的对siRNA产生的阻抑
                强力霉素诱导型调节细胞的基因表达
此实施例是关于体内产生示范性tTR-KRAB小鼠，产生条件性敲减转基因小鼠，产生组织特异条件性敲减LFN ADLD小鼠，产生条件性siRNA文库，和产生含有tTR-KRAB的ES细胞系(ES-tTR-KRAB)。
图11涉及药物可调控敲减的代表性实施方式，其中提供了含示范性TR-KRAB的小鼠，和编码siRNA的多核苷酸，例如，将受遍在性Pol III启动子控制的(左下图)，或受组织特异性Pol III启动子控制的(右下图)多核苷酸导入TR-KRAB小鼠，进行外部药物可调控的敲减其表达。
在某些实施方案中，本发明采用tet0慢病毒载体(如pLVTH)输送siRNA靶向的感兴趣细胞基因到tTR-KRAB小鼠中。然后给予药物使siRNA合成并下调基本上每一个被转导细胞中该感兴趣细胞基因的表达。
如实施例10条件性阻抑外源基因所述，条件性下调细胞基因可以是完全性的、组织特异性的或局部性的。能够通过给予药物来激活RNAi可避免基因敲减可能引起的致死作用而得以研究发育晚期或成年期的基因功能。然而，该条件性RNAi得以分析基因敲减的直接作用，最大程度减少基因功能长期丧失可能发生的继发作用或代尝。此系统可用于产生模拟人类遗传缺陷的动物模型。
条件性RNAi允许产生体内的siRNA文库。可通过慢病毒载体(如pLVTH)输送siRNA文库来转导分离自tTR-KRAB小鼠的受精卵母细胞。或者，可通过慢病毒载体(如pLVTH)输送siRNA文库来转导ES-tTR-KRAB细胞。该条件性系统能预防RNAi可能的早期致死作用，得以从而得以研究细胞基因敲减对发育或成年的影响。此外，阻抑基因功能丧失的潜在致死作用得以植入、扩增和增殖该小鼠ES细胞文库存(或选择有克隆)用于进一步研究。
                      * * * * * * * * *
凭借本文所公开的内容，无须过多实验即可制备本文所述和权利要求所述的所有组合物和/或方法。虽然本发明的组合物和方法已在优选实施例中作了描述，但是本领域技术人员懂得，可对本文所述的组合物和/或方法及其各步顺序做出各种变化，这不脱离本发明的概念、思路和范围。更具体说，显然某些相关的化学或生理性药物可替代本文所述的药物而能匹敌相同或相似的结果。本领域技术人员懂得，所有这些相似的替代和修饰都应认为属于本发明所附权利要求书中所确定的思路、范围和概念之内。
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Claims (84)

1.一种多核苷酸构建物，其特征在于，该构建物含有编码操作性连接于一外部可调控启动子的siRNA的区域。
2.如权利要求1所述的构建物，其也被称为载体。
3.如权利要求2所述的构建物，其中，所述载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体、MLV载体、AAV载体、质粒载体或腺病毒载体。
4.如权利要求1所述的构建物，其中，所述外部可调控的启动子是阻抑型启动子，从而可通过外部施加的制剂来下调编码的siRNA的表达。
5.如权利要求4所述的构建物，其中，可通过外部施加的药物来下调编码的siRNA的表达。
6.如权利要求1所述的构建物，其中，所述阻抑型启动子受Tet阻抑子的调节。
7.如权利要求1所述的构建物，其中，所述所述阻抑型启动子还含有至少一个tet0序列。
8.如权利要求1所述的构建物，其中，所述阻抑型启动子受lacI阻抑子的调节。
9.如权利要求1所述的构建物，其中，所述阻抑型启动子来自ANB 1、HEM 13、ERG 11、OLE 1、GAL 1、GAL 10、ADH2或TETR的基因。
10.如权利要求1所述的构建物，其中，所述外部可调控的启动子是诱导型启动子，从而可通过外部施加的制剂上调编码的siRNA的表达。
11.如权利要求10所述的构建物，其中，所述诱导型启动子可被Cu+2、Zn2+、四环素、四环素类似物、蜕皮激素、糖皮质激素、三苯氧胺或lac操纵子诱导物所诱导。
12.如权利要求11所述的构建物，其中，所述启动子可被蜕皮激素、糖皮质激素或三苯氧胺诱导。
13.如权利要求10所述的构建物，其中，所述诱导型启动子是噬菌体诱导型启动子、营养物诱导型启动子、温度诱导型启动子、辐射诱导型启动子、金属诱导型启动子、激素诱导型启动子、类固醇诱导型启动子、抗生素诱导型启动子，或它们的组合。
14.如权利要求13所述的构建物，其中，所述辐射诱导型启动子是fos启动子、jun启动子或erg启动子。
15.一种控制基因表达的系统，其特征在于，该系统含有：
(a)一个或多个如权利要求1所述的多核苷酸构建物；
(b)可给予细胞来直接或间接控制siRNA表达的化合物或制剂。
16.如权利要求15所述的系统，其还含有：
a)可调控的siRNA-表达构建物，其包含可能处在一可调控启动子区控制下的siRNA编码核酸区段；和
b)编码该可调控siRNA-表达构建物可调控的多肽调节子的多核苷酸。
17.如权利要求15所述的系统，其中，在所述区段和可调控启动子区之间有一可切除片段。
18.如权利要求17所述的系统，其中，能切除所述可切除片段的物质的表达处于一组织特异性启动子的控制之下。
19.如权利要求16所述的系统，其中，所述可调控的siRNA-表达构建物是一种整合型病毒载体。
20.如权利要求18所述的系统，其中，所述整合型病毒载体是慢病毒、逆转录病毒或腺伴随病毒。
21.如权利要求19所述的系统，其中，所述整合型病毒载体是慢病毒。
22.如权利要求16所述的系统，其中，所述可调控的siRNA-表达构建物含有可用于整合测定的标记。
23.如权利要求16所述的系统，其中，所述可调控启动子区含有负调节此启动子转录的核酸区段。
24.如权利要求16所述的系统，其中，所述负调节此启动子转录的核酸区段是tet操纵基因。
25.如权利要求22所述的系统，其中，所述可调控的多肽调节子能结合该tet操纵基因。
26.如权利要求18所述的系统，其中，所述组织特异性启动子是：肝脂肪酸结合(FAB)蛋白基因启动子、胰岛素基因启动子、transphyretin启动子、α1-抗胰蛋白酶启动子、纤溶酶原激活物抑制剂1型(PAI-1)启动子、载脂蛋白AI启动子、LDL受体基因启动子、髓鞘碱性蛋白(MBP)基因启动子、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)基因启动子、视蛋白启动子、LCK启动子、CD4启动子、角蛋白启动子、肌球蛋白启动子、或神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子。
27.如权利要求16所述的系统，其中，所述多核苷酸在组成型启动子的控制之下。
28.如权利要求16所述的系统，其中，所述多核苷酸包含在病毒载体中。
29.如权利要求27所述的系统，其中，所述病毒载体是整合型病毒载体。
30.如权利要求28所述的系统，其中，所述整合型病毒载体是慢病毒、逆转录病毒或腺伴随病毒。
31.如权利要求16所述的系统，其还包含：
(a)一多核苷酸构建物，其含有操作性连接于至少一个编码siRNA的多核苷酸的启动子；
(b)一编码能阻抑所述至少一个siRNA表达的诱导型阻抑子的多核苷酸；
(c)一个或多个含有(a)和(b)所述构建物的载体；和
(d)可将其施加于细胞以控制所述融合蛋白表达的化合物或试剂。
32.如权利要求31所述的系统，其还包含：
(a)一多核苷酸构建物，其含有操作性连接于至少一个编码siRNA的多核苷酸的聚合酶III依赖型启动子；
(b)一多核苷酸，其编码含有DNA结合域和转录阻抑结构域的药物诱导型阻抑融合蛋白质；和
(c)一可结合的多核苷酸，其可被(b)所述融合蛋白的结合域结合并定位，从而转录阻抑结构域可发挥作用而阻抑(a)所述多核苷酸构建物的转录；
(d)一个或多个含有(a)、(b)和(c)所述构建物的载体；和
(e)一种化合物，可将其施加于细胞以控制所述融合蛋白的表达，或控制所述融合蛋白通过其结合域与所述可结合的多核苷酸序列结合。
33.如权利要32所述的系统，其中，所述多核苷酸编码操作性连接一诱导型启动子的融合蛋白。
34.如权利要求32所述的系统，其中，所述启动子是组成型启动子。
35.如权利要求32所述的系统，其中，所述可被融合蛋白结合域结合的多核苷酸序列是四环素操纵基因(tet0)序列，(ii)所述融合蛋白包含融合于人Kox-1的KRAB阻抑结构域(tTR-KRAB)的四环素阻抑子(tTR)的DNA结合域，且(c)的底物是强力霉素。
36.如权利要求32所述的系统，其中，(b)所述载体是慢病毒载体、MLV载体、AAV载体、质粒载体或腺病毒(Adv或Ad)载体。
37.如权利要求35所述的系统，其中，所述可被(b)所述融合蛋白结合域结合的多核苷酸序列、操作性连接于编码siRNA的多核苷酸序列的启动子和编码siRNA的多核苷酸序列都包含在慢病毒载3’长末端重复序列的U3区域中。
38.如权利要求32所述的系统，其中，所述编码融合蛋白的多核苷酸包含在第二个、与含(a)所述构建物分开的载体中。
39.如权利要求38所述的系统，其中，所述含编码融合蛋白的多核苷酸的第二个载体是慢病毒载体、MLV载体、AAV载体、质粒载体或腺病毒(Adv或Ad)载体。
40.如权利要求15所述的系统，其中，所述多核苷酸编码的siRNA形成茎环结构或发夹。
41.一种含有权利要求1所述多核苷酸构建物的哺乳动物细胞。
42.如权利要求41所述的哺乳动物细胞，其特征在于，该细胞还含有：
(a)第一多核苷酸序列，其含有操作性连接于至少一个编码siRNA的核酸区段的启动子；
(b)第二多核苷酸序列，其编码含有DNA结合域和转录阻抑结构域的条件性阻抑融合蛋白；和
(c)第三多核苷酸序列，其可被(b)所述融合蛋白的结合域结合并定位，从而转录阻抑结构域可发挥作用以阻抑(a)所述核酸区段的转录。
43.如权利要求41所述的哺乳动物细胞，其中，所述条件性阻抑融合蛋白是药物诱导型蛋白。
44.如权利要求42所述的哺乳动物细胞，其还包含：
(d)第四多核苷酸序列，其中所述第四多核苷酸序列是可切除的，并能阻止聚合酶III依赖型启动子的转录；和
(e)第五多核苷酸序列，其编码的酶能切除所述第四多核苷酸序列，其中所述第五多核苷酸序列处在一可调控的启动子控制之下。
45.如权利要求44所述的哺乳动物细胞，其中，可被融合蛋白结合域结合的第三多核苷酸序列是四环素操纵基因(test0)序列，(b)所述融合蛋白包含融合于人Kox-1的KRAB阻抑结构域(tTR-KRAB)的四环素阻抑子(tTR)的DNA结合域，且所述融合蛋白处于强力霉素控制之下。
46.如权利要求41所述的哺乳动物细胞，其中，所述细胞是未分化的细胞。
47.如权利要求41所述的哺乳动物细胞，其中，所述细胞是卵母细胞或受精的卵母细胞。
48.一种含有权利要求41-47中任一项所述的一种或多种细胞的转基因动物。
49.一种产生能够显示靶基因条件性敲减的转基因动物的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)在性细胞或未分化胚细胞中导入含权利要求1所述的多核苷酸的表达构建物；
(b)如果上述细胞是性细胞使其受精产生胚胎；和
(c)将该胚胎植入雌性动物，在该雌性动物中产生转基因动物。
50.如权利要求49所述的方法，其中，所述性细胞或未分化的胚细胞是未受精的卵母细胞、受精的卵母细胞、胚胎干细胞、桑椹胚或胚泡中的细胞。
51.如权利要求49所述的方法，该方法还包括在导入所述表达构建物和/或移植前培养所述细胞。
52.一种调节细胞中基因表达的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(a)制备如权利要求1所述的多核苷酸构建物，其中，所述构建物编码的siRNA能下调所述基因的表达；
(b)通过外部可调控的启动子从外部调节编码siRNA的表达。
53.如权利要求52所述的方法，其中，所述外部可调控启动子是一种阻抑型启动子，从而可通过外部施加的制剂下调编码的siRNA的表达。
54.如权利要求53所述的方法，其中，可通过外部施加的药物下调编码的siRNA的表达。
55.如权利要求53所述的方法，其中，所述阻抑型启动子含有至少一个tet0序列。
56.如权利要求52所述的方法，其中，所述方法还包括提供编码能阻抑siRNA表达的诱导型阻抑子的多核苷酸的步骤。
57.如权利要求56所述的方法，其中，所述编码阻抑子的多核苷酸还被定义为一种药物可调控的阻抑融合蛋白，其含有DNA结合域和转录阻抑结构域，其中该融合蛋白的结合域能结合所述多核苷酸构建物，从而使转录阻抑结构域发挥作用以阻抑siRNA的转录。
58.如权利要求52所述的方法，其中，所述能调节siRNA表达的启动子是组成型启动子。
59.如权利要求52所述的方法，其中，所述能调节siRNA表达的启动子是组织特异性启动子。
60.如权利要求52所述的方法，其中，所述细胞还被定义为细胞系中的细胞。
61.如权利要求59所述的方法，其中，所述方法还包括向所述细胞提供某药物的步骤，以测试在缺少所述基因编码的基因产物时该药物的功能。
62.如权利要求52所述的方法，其中，所述细胞包含在动物体内。
63.如权利要求56所述的方法，其中，所述编码siRNA的多核苷酸构建物可给予所述动物的某区域，在该区域内动物含有编码阻抑子的所述多核苷酸。
64.如权利要求63所述的方法，其中，所述给药是注射给药。
65.如权利要求63所述的方法，其中，所述动物的区域是在某器官内。
66.如权利要求62所述的方法，其中，所述动物是人类患者。
67.如权利要求66所述的方法，其中，所述基因是癌基因。
68.如权利要求67所述的方法，其中，所述癌基因是：ABLI、BLC1、BCL6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS1、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3或YES。
69.如权利要求52所述的方法，其中，所述从外部调节编码的siRNA的表达包括给予患者影响上调或下调所述表达的试剂。
70.如权利要求69所述的方法，其中，所述试剂是抗生素、辐射、类固醇、激素、金属、二价阳离子、营养物或温度。
71.如权利要求70所述的方法，其中，所述辐射是离子辐射。
72.一种控制细胞被免疫系统识别的能力的方法，其特征在于，该方法包括：
(a)获得一种细胞，其含有：
(i)如权利要求1所述的多核苷酸构建物，其中，所述构建物编码的siRNA能下调编码某移植抗原的多核苷酸的表达；和
(ii)编码能阻抑所述siRNA表达的诱导型阻抑子的多核苷酸；和
(b)通过外部可调控的启动子从外部调节编码的siRNA的表达。
73.如权利要求72所述的方法，其中，所述细胞在动物体内。
74.如权利要求72所述的方法，其中，所述移植抗原是MHC I类抗原。
75.如权利要求72所述的方法，其中，所述移植抗原是：β2-微球蛋白、HLA、H-Y、P35B、Kdm4、Kdm5、TL、P198、P91A或H-2Kb。
76.如权利要求75所述的方法，其中，所述HLA抗原是：HLA-C、HLA-G或HLA-DQ。
77.如权利要求74所述的方法，其中，所述细胞是：胰岛细胞、干细胞、肝细胞、多巴胺能神经元或角质形成细胞。
78.一种可用siRNA治疗的疾病症状的治疗方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(a)制备如权利要求1所述的多核苷酸构建物，其中，所述构建物编码的siRNA可治疗该疾病症状；
(b)通过所述外部可调控的启动子从外部调节所述siRNA的表达。
79.如权利要求78所述的方法，其中，所述疾病是过度增殖性疾病。
80.如权利要求79所述的方法，其中，所述过度增殖性疾病是癌症。
81.如权利要求80所述的方法，其中，所述癌症是：胶质肉瘤、乳腺癌、肺癌、脑癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、子宫癌、膀胱癌、脾脏癌、头颈癌或骨癌。
82.如权利要求78所述的方法，其中，所述疾病是甲状腺功能亢进症。
83.如权利要求78所述的方法，其中，所述疾病与分泌过多缺陷相关。
84.如权利要求83所述的方法，其中，所述分泌过多缺陷包括激素分泌过多缺陷。
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