KR100637925B1 - 테트라사이클린 유도성 ｓｉＲＮＡ 발현 레트로바이러스벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 테트라사이클린 유도성 siRNA 발현 레트로바이러스 벡터에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 생쥐 돌연변이체 TBP 유전자와 TATA 박스 돌연변이체 U6 프로모터를 이용하여 테트라사이클린 유도성 siRNA 발현 레트로바이러스 벡터를 제조함으로써 레트로바이러스에 패키징될 수 있어 세포 내 도입이 용이하고 지속적으로 독시사이클린 의존적인 RNAi를 유도할 수 있을 뿐만 아니라 게놈 내 다른 유전자의 발현에 영향을 주지 않으면서 표적 RNAi의 유도가 가능하도록 개선된, 테트라사이클린 유도성 siRNA 발현 레트로바이러스 벡터에 관한 것이다.

siRNA, 생쥐 돌연변이체 TBP, U6 프로모터, TATA 박스

Description

테트라사이클린 유도성 ｓｉＲＮＡ 발현 레트로바이러스 벡터{A retroviral vector system for expressing tetracyclin-inducible siRNA}

도 1은 본 발명의 pTEA 벡터의 모식도이다.

도 2는 본 발명의 pTEA 벡터를 제조하는 방법에 관한 모식도이다.

도 3은 본 발명의 siRNA 유도 발현 벡터 시스템의 작동 원리에 관한 모식도이다.

도 4는 pTEA-EGFPi 벡터를 293T 세포에 일시적으로 형질도입하여 EGFP 단백질의 발현 억제 여부를 확인한 그래프이다.

도 5a 내지 도 5c는 pSuper-rtTA-hyg를 안정적으로 삽입한 K562 세포주에 siRNA 벡터를 일시적으로 형질도입 시켜서 EGFP 및 STAT3 단백질의 발현 억제를 웨스턴 블랏으로 확인한 그래프 및 사진이다.

도 6a 및 도 6b는 rtTA 발현 K562 세포주에 STAT3에 대한 siRNA 벡터를 안정적으로 형질도입한 세포주에서 STAT3의 단백질 발현이 독시사이클린 의존적으로 억제됨을 확인한 사진이다.

본 발명은 테트라사이클린 유도성 siRNA 발현 레트로바이러스 벡터에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 생쥐 돌연변이체 TBP 유전자와 TATA 박스 돌연변이체 U6 프로모터를 이용하여 테트라사이클린 유도성 siRNA 발현 레트로바이러스 벡터를 제조함으로써 레트로바이러스에 패키징될 수 있어 세포 내 도입이 용이하고 지속적으로 독시사이클린 의존적인 RNAi를 유도할 수 있을 뿐만 아니라 게놈 내 다른 유전자의 발현에 영향을 주지 않으면서 표적 RNAi의 유도가 가능하도록 개선된, 테트라사이클린 유도성 siRNA 발현 레트로바이러스 벡터에 관한 것이다.

RNA 간섭(RNA interference, RNAi)은 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA와 이에 대한 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA로 구성되는 이중나선 RNA(double strand RNA, dsRNA)를 세포 등에 도입하여 표적 유전자 mRNA의 분해를 유도함으로써 단백질의 발현을 억제할 수 있는 현상이다. RNAi를 이용한 유전자 녹-다운 방법은 간편하고 유전자의 발현 억제 효과가 우수하기 때문에, 종래의 형질전환 녹아웃 생쥐 모델의 제조에 따른 유전자의 기능 분석을 대체할 수 있는 방법으로 각광받고 있다. 또한, 유전자 치료(gene therapy)의 한 방편으로도 상당한 관심을 모으고 있다.

RNAi 현상은 1998 년에 선충(C. elegans)에서 최초 보고되었다[Tavernarakis N, Wang SL, Dorovkov M, Ryazanov A, Driscoll M. 2000, Nat Genet. 24: 180-3]. 그 후에 RNAi 현상은 선충은 물론 곤충, 식물, 균류 등의 다양한 생물종에 보존되 어 있는 것으로 밝혀졌으며 생물에 공통적으로 포함되어 있는 핵산 차원에서의 방어 시스템임이 밝혀졌다. 이들 생물에서는 외부로부터 특정 dsRNA를 도입할 경우 표적 유전자 발현 억제가 확인되었으며, 특정 유전자가 녹-다운된 개체를 생산하는 방법으로도 이용되고 있다.

한편, 포유동물 세포에서는 외부로부터 유입된 dsRNA에 의해 면역계가 활성화되는 현상이 보고되어 왔으며, 실제 특정 유전자의 dsRNA를 외부로부터 도입하더라도 표적 유전자의 녹다운 현상이 관찰되지 않았다. 그러나 최근에 21 ∼ 22 뉴클레오티드의 dsRNA 끝에 2 ∼ 3 뉴클레오티드의 단일나선 RNA을 갖는 짧은 머리핀 모양의 자루-고리 구조의 RNA(short hairpin RNA, shRNA 또는 short interference RNA, siRNA)가 포유동물 세포에서 RNAi 현상을 유도할 수 있음이 알려지고 있어[Elbashir SM et al. 2001, Nature 411: 494-498; Caplen NJ et al. 2001 Proc. Natl. Acad. Sci USA 98: 9742-9747], 의료 분야에서도 크게 기대하고 있다[Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R. 2002. Science, 296: 550-553].

초기 siRNA를 이용한 실험들에서는 주로 화학적으로 합성한 합성 RNA를 이용하였다. 그러나 위와 같은 방식의 RNA 합성은 비용이 많이 소모되고 siRNA 효과가 짧은 기간 동안만 지속된다는 단점을 가지고 있었다. 이를 극복하기 위해 벡터 시스템을 이용하여 siRNA를 안정적으로 발현시킬 수 있는 "DNA 벡터-기초된 siRNA 발현 시스템"이 출현하게 되었다[Sui G, Soohoo C, Affar el B, Gay F, Shi Y, Forrester WC, Shi Y. 2002, Proc Natl Acad Sci USA 99: 5515-20].

H1 또는 U6 프로모터 등의 RNA 중합효소 Ⅲ 프로모터를 이용하는 "siRNA 발 현 벡터 시스템"은 RNA 합성이 아니라 DNA 올리고머 합성 방법을 이용하기 때문에 비용이 저렴하고, 센스 및 안티센스 올리고머에 의해 머리핀 모양의 자루-고리 형태의 siRNA가 발현된다. 그러나 이러한 siRNA 발현 벡터 시스템은 발생이나 분화, 생존 또는 세포주기 조절 등에 관여하는 표적 유전자들의 발현 억제를 목적으로 이용될 경우 녹아웃 생쥐를 이용한 연구에서와 마찬가지로 세포의 치사 또는 분화가 유도됨으로써 유전자의 기능을 연구할 수 없는 한계가 있었다.

siRNA 발현 벡터 시스템의 이러한 한계를 극복하기 위하여 원하는 시간과 장소에 따라 발현을 조절할 수 있는 더 진보된 시스템, 즉 "유도성 siRNA 발현 시스템"에 대한 연구가 계속되었다. 현재까지 개발된 유도성 발현 시스템으로는 테트라사이클린 유도성 시스템[Van de Wetering et al. 2003. EMBO rep. 4: 609-615, Wiznerowicz M, Trono D. 2003. J Virol. 77: 8957-8961], 엑디손 유도성 시스템[Gupta S, Schoer RA, Egan JE, Hannon GJ, Mittal V. 2004, Proc Natl Acad Sci. USA 101: 1927-32] 및 Cre-loxP 시스템[Kasim V, Miyagishi M, Taira K. 2003. Nuecleic Acids Res. 3: 255-256]이 있다.

이 중에서 테트라사이클린 유도성 시스템이 보편적으로 이용되고 있으며, 이에는 크게 테트라사이클린의 존재 하에서만 표적유전자의 발현이 억제되는 tet-리프레서 시스템과 테트라사이클린의 존재 하에서면 표적 유전자의 발현이 일어나는 tet-엑티베이터 시스템의 두 가지가 존재 한다[Gossen, M., Bonin, A. L., Freundlieb, S. & Bujard, H. 1994. Curr. Opin. Biotechnol. 5: 516-520]. 보통 세포 배양에 이용되는 소의 혈청에는 미량의 테트라사이클린이 존재하고 있어 tet-리프레서 시스템이 더 효율적이라고 알려지고 있다[Gossen, M., Bonin, A. & Bujard, H. 1993. Trends Biochem. Sci. 18: 471-475).

테트라사이클린 유도성 시스템을 이용한 RNAi 발현 벡터는 현재까지 두 종류가 상품화되어 있다. 이 중 하나는 변형이 없는 순수한(naive) tet-리프레서를 발현하는 벡터와 U6 프로모터 또는 H1 프로모터의 TATA 박스와 전사 개시부 사이에 tet-오퍼레이터 서열을 삽입한 siRNA 발현 벡터로 구성되어 있다[Van de Wetering et al. 2003. EMBO rep. 4: 609-615]. 이 벡터는 현재 레트로바이러스 벡터로 발전하여 pSuperior(올리고엔진, USA)라는 이름으로 판매되고 있다. 또 다른 하나는 KREB 도메인을 가진 변형된 tet-리프레서를 발현하는 벡터와 H1 프로모터 상단부에 tet-오퍼레이터가 삽입된 렌티바이러스 벡터로 구성되어 있다. [Wiznerowicz M, Trono D. 2003. J Virol. 77: 8957-8961].

렌티바이러스는 줄기세포를 포함하여 레트로바이러스에 의해 감염이 잘 되지 않는 세포에도 표적 유전자 및 siRNA를 잘 전달할 수 있음이 알려지고 있다. 특히 KREB 도메인은 유전자 발현 조절에 중요한 염색체 리모델링 복합체와 상호작용을 통하여 tet-리프레서가 하나의 tet-오퍼레이터에 결합할 경우 3 kb 이내에 존재하는 모든 프로모터의 개폐를 조절할 수 있다는 장점을 지니고 있다[Witzgall, R., O'Leary, E., Leaf, A., Onaldi, D. & Bonventre, J. V. 1994. Proc Natl Acad Sci USA 91: 4514-4518). 그럼에도 불구하고 이러한 테트라사이클린 유도 발현 시스템에서는 테트라사이클린 존재 유무에 상관없이 표적 유전자가 어느 정도 발현되는 "누수현상(leaky)"이 나타나고 있으며, 게놈 내에는 RNAi 발현 벡터의 프로모터 에 존재하는 tet-오퍼레이터 외에도 이와 유사한 서열이 산재되어 있어 발현 유도 효율이 저하될 수 있다는 단점이 있었다.

대한민국 공개특허 제 2004-72643 호에서는 Lox P를 이용한 siRNA 발현 시스템 및 이를 이용한 기능유전자 녹다운 세포 등의 생산방법을 개시하고 있는데, 이는 단순한 일회성의 siRNA 발현만 가능하였고 다른 게놈 내의 유전자 발현에 영향을 줄 수 있어서 개선이 필요하였다.

이에 본 발명자는 이러한 종래의 문제점을 해결하기 위하여 연구, 노력한 결과, 생쥐 돌연변이체 TBP 유전자와 TATA 박스 돌연변이체 U6 프로모터를 도입한 siRNA 발현 레트로바이러스 벡터를 제조하면 일회성이 아닌 지속적인 독시사이클린 의존성 RNAi를 유도할 수 있을 뿐만 아니라 게놈 내 다른 유전자의 발현에 영향을 주지 않으면서 RNAi 현상을 효율적으로 유도할 수 있음을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 생쥐 돌연변이체 TBP 유전자와 TATA 박스 돌연변이체 U6 프로모터를 도입한 테트라사이클린 유도성 siRNA 발현 레트로바이러스 벡터를 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 생쥐 돌연변이체 TBP(mut-TBP) 유전자 및 TATA 박스 돌연변이체 U6 프로모터(mut-U6)를 포함하는 siRNA 유전자의 발현을 위한 pTEA 벡터를 그 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 생쥐 돌연변이체 TBP 유전자와 TATA 박스 돌연변이체 U6 프로모터를 이용하여 테트라사이클린 유도성 siRNA 발현 레트로바이러스 벡터를 제조함으로써 레트로바이러스에 패키징될 수 있어 세포 내 도입이 용이하고 지속적으로 독시사이클린 의존적인 RNAi를 유도할 수 있을 뿐만 아니라 게놈 내 다른 유전자의 발현에 영향을 주지 않으면서 표적 RNAi의 유도가 가능하도록 개선된, 테트라사이클린 유도성 siRNA 발현 레트로바이러스 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서는 레트로바이러스 벡터를 기반으로 생쥐 돌연변이체 TBP 유전자와 TATA 박스 돌연변이체 U6 프로모터를 도입한 siRNA 발현 벡터 pTEA를 도 1과 같이 제조하였다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 pTEA는 테트라사이클린에 의해 발현되는 생쥐 돌연변이체 TATA 박스 결합 단백질(TATA box Binding Protein)(mut-TBP) 유전자, 표적 RNAi 유전자를 삽입할 수 있는 자리(Apa I 및 EcoR I 제한효소 자리를 갖는 764 bp의 스터퍼 뉴클레오티드), 돌연변이체 TATA 박스를 지닌 U6 프로모터(mut-U6) 및 퓨로마이신 저항성 유전자 등을 포함하여 구성된다. 프로모터 및 종결 시그널이 결합된 mut-TBP 유전자(TRE-TBPDR2-SV40 poly A)의 염기서열은 서열목록 1, 스터퍼 뉴클레오티드의 염기서열은 서열목록 2, 및 mut U6 프로모터의 염기서열은 서열목록 3과 같다. 또한, 이들을 모두 포함하는 pTEA 벡터의 염기서열은 서열목록 4와 같다.

임의 크기의 siRNA 발현 유전자를 삽입할 수 있는 자리인 스터퍼 시퀀스를 포함한 pTEA 벡터를 대장균에 도입하여 이를 KCTC 유전자 은행에 2005 년 2 월 11 일 기탁하였다(기탁번호 KCTC 10776BP, 대장균STBL2/pTEA-stuffer).

pTEA 벡터의 제조 과정을 설명하면 다음의 도 2와 같다.

돌연변이체 TATA 박스 결합 도메인을 지니고 있는 pDR2_PII-EX와 이 염기서열에 결합할 수 있는 mut-TBP(TBPDR2)을 지닌 pTRE-TBP_DR2[Meissner W, Rothfels H, Schafer B, Seifart K. 2001. Nucleic Acids Res. 29: 1672-82]로부터 벡터의 제조에 필요한 부분들을 클로닝 하였다. mut-TBP를 발현하는 pTRE-TBP_DR2 벡터에서 tet 프로모터 부분부터 폴리 A 시그널 부분까지의 DNA 절편을 Xho I 및 Hind Ⅲ를 이용하여 절단하고 분리한 다음, 제한효소 Xho I 및 Hind Ⅲ로 절단된 pSuper-retro(Oligoengine, USA) 벡터와 T4 DNA 리가아제를 이용한 서브클로닝을 통해 pSuper-TRE-mutTBP 벡터를 제조하였다. 또한 pDR2_PII-EX를 EcoR I 및 BamH I으로 잘라 TATA 박스 돌연변이체 도메인을 가지는 mut-U6 PSE(proximal sequence element) DNA 절편을 얻어 pGEM3 벡터로 옮겼으며, PCR로 클로닝한 U6 프로모터의 DSE(distal sequence element) DNA 절편을 이 벡터의 PSE 상단부에 삽입함으로써 mut-U6 프로모터를 가지는 벡터를 제조하였다.

pTEA(pSuper-mutU6-mutTBP) 벡터를 제조하기 위해 pSuper-TRE-mutTBP를 EcoR I 및 Hind Ⅲ로 절단한 후 Kenow 단편을 이용하여 블런팅 시켜 H1 프로모터 부위를 제거한 후, 한 쌍의 프라이머군(DSE 부위의 정방향 프라이머와 Apa I과 EcoR I 제한효소 자리를 가지는 돌연변이 TATA 박스 도메인 부위의 역방향 프라이머를 이용 하여 pGEM3에 클로닝된 전장의 TATA 박스 돌연변이체 U6 프로모터를 PCR 클로닝하여 삽입하였다. 향후 siRNA를 용이하게 서브클로닝하기 위하여 pTEA (pSuper-mutU6-mutTBP) 벡터를 Apa I과 EcoR I으로 절단한 후 pcDNA3-tetO 벡터의 Apa I과 EcoR I 스터퍼(stuffer) 서열 단편(750 bp)을 삽입하여 pTEA 벡터를 최종적으로 제조하였다.

본 발명의 siRNA 유도 발현 벡터 시스템의 작동 원리는 도 3과 같다.

표적 유전자의 siRNA DNA를 포함하는 pTEA 벡터를 제조하고 바이러스 패키징 세포(예 : 293T/G/GP 및 PT67)를 통해 레트로바이러스를 생산한 후, rtTA를 발현하는 레트로바이러스(예 : pSuper-rtTA-Hygro)와 함께 표적 세포에 감염시켜 퓨로마이신과 하이그로마이신을 배지에 첨가하여 두 바이러스가 동시에 감염된 세포를 선별하거나, rtTA를 발현하는 벡터(예 : pUHD 172-1)가 표적세포 염색체에 안정하게 삽입된 표적 세포에 감염시켜 퓨로마이신을 배지에 첨가하여 선별하게 된다.

발현된 rtTA 단백질은 테트라사이클린의 유도체인 독시사이클린이 배지에 첨가되지 않은 상태에서 pTEA의 테트라사이클린 반응 부위(tetracycline responsive element, TRE)에 결합하지 못하므로 mut-TBP 단백질의 발현은 억제되어 siRNA는 생성되지 않는다. 그러나 독시사이클린이 존재할 경우 독시사이클린과 결합된 rtTA는 TRE에 결합하게 되어 mTBP 단백질이 합성되고 합성된 mTBP는 mut-U6 프로모터에 결합함으로써 표적 유전자의 siRNA가 과량 발현하게 된다.

또한, 본 발명의 벡터를 이용하면 siRNA의 발현을 인위적으로 억제할 수 있다. 이는 다음 실시예에서 볼 수 있는 바와 같이, EGFP(enhanced green fluorescence protein) 및 STAT3 유전자에 대한 siRNA 발현 벡터를 제조함으로써 세포 외부로부터 도입된 리포터 유전자에 대한 발현과 세포 내에서 발현하고 있는 단백질의 발현을 효율적으로 억제함을 확인할 수 있다. pTEA-EGFPi 벡터를 pEGFP-N1(Clontech) 및 rtTA 단백질 발현 벡터 (pUHD172-1)와 함께 293T 세포에 일시적으로 형질도입 하여 독시사이클린의 존재 하에서만 EGFP의 발현이 억제됨을 확인하였다(도 4). 또한 rtTA를 안정적으로 발현하는 K562-rtTA 세포주(도 5a)에 pTEA-EGFPi를 pEGFP-N1벡터와 일시적으로 형질도입 하여 독시사이클린 존재 하에서만 mut-TBP 단백질의 발현이 유도되고 EGFP의 발현이 억제됨을 웨스턴 블랏으로 확인하였다(도 5b). 이어서 본 발명에서 제조한 pTEA 벡터가 레트로바이러스를 효율적으로 만드는지와 세포 내 유전자의 발현도 억제시킬 수 있는지 확인하였다(도 5c). 레트로바이러스 패키징 세포인 293T/G/GP 및 PT67(Clontech, USA) 세포주에 다양한 농도의 pTEA-STAT3i 벡터를 CaPO₄ 침전법으로 형질도입 하여 레트로 바이러스를 얻었다. 이렇게 얻은 pTEA-STAT3i 레트로바이러스를 rtTA를 안정적으로 발현하는 K562-rtTA 세포주에 감염시켰다(도 5a). 36 시간 후 웨스턴 블랏을 이용하여 세포 내 STAT3 단백질의 발현 정도를 분석한 결과 독시사이클린의 존재 하에서만 도입한 pTEA-STAT3i 벡터의 농도 의존적으로 STAT3 단백질이 감소함을 확인하였다(도 5c).

마지막으로 염색체 내로 안정하게 삽입된 pTEA 벡터의 siRNA가 효율적으로 독시사이클린 의존적으로 발현하여 표적 유전자 발현을 억제할 수 있음을 확인하였 다(도 6a 및 도 6b). 상기 도 5c에서와 동일한 방법으로 pTEA-STAT3i 레트로바이러스 벡터를 rtTA를 안정적으로 발현하는 K562 rtTA 세포주(도 5a)에 감염시킨 후 이 세포들을 일주일 동안 퓨로마이신 존재 하에서 배양함으로써 pTEA-STAT3i를 안정적으로 염색체에 지니고 있는 클론들을 선별하였다. 이 세포들을 독시사이클린의 존재 혹은 부재 하에서 배양한 후 웨스턴 블랏 방법으로 STAT3 단백질의 발현을 분석한 결과, 일부 클론에서 독시사이클린 존재 및 처리 시간 의존적으로 STAT3 단백질의 발현이 억제됨을 확인하였다(도 6a 및 도 6b). 따라서 pTEA 벡터는 염색체로의 삽입 위치에 따라 siRNA가 발현되지 않을 수 있음을 확인하였고, 발현이 유도될 경우 효율적으로 특정 유전자의 녹다운 효과를 분석할 수 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하겠는바, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : pTEA 벡터의 제조

(1) 생쥐 돌연변이체 TBP(TATA box Binding Protein) 유전자의 서브클로닝

pSuper-Retro를 제한효소 Xho I과 Hind Ⅲ로 절단한 후 0.8% 아가로스 겔에서 100 V로 전기영동 하였다. 상기 아가로스 겔 상에서 전개되어 분리된 pSuper-Retro 주형 DNA를 자외선 하에서 면도날을 이용하여 오려낸 후 겔 추출 키트(Qiagen, USA)를 이용하여 정제하였다. pTRE-TBP_DR2 벡터를 Xho I과 Hind Ⅲ를 이용하여 제한효소 반응을 수행한 후 상기와 동일한 방법으로 TBP_DR2 DNA 조 각을 준비하였다. Xho I 및 Hind Ⅲ 제한효소로 잘린 pSuper-Retro 주형과 TBP_DR2 DNA 조각은 T4 리가아제를 이용하여 16 ℃에서 8 시간 이상 반응하여 연결한 후 대장균에 형질전환 하였다.

형질 전환은 하나한의 방법[Hanahan O., 1983. J. Mol. Biol., 166: 557-580]을 변형하여 실시하였다. 즉, 상기의 연결(ligation) 반응액 5 ㎕를 50 mM CaCl₂로 전 처리한 대장균 숙주세포(XL1-blue MRF' 균주) 100 ㎕에 섞어 4 ℃에서 30 분간 반응시킨 후, 42 ℃에서 90 초간 열처리하고 LB 배양액 1 ml을 첨가하여 37 ℃에서 60 분간 배양하였다. 이 형질전환체를 원심분리(12,000 rpm, 20 초)하여 100 ㎕ LB에 재 현탁한 후, 암피실린(50 ㎍/ml)이 포함된 아가 플레이트에 도말하고 37 ℃에서 12 ∼ 16 시간 배양하였다. 성장한 콜로니들을 이쑤시개로 취하여 2 ml LB 배양액에 접종한 후 37 ℃에서 밤새 배양하였다.

플라스미드 DNA는 1.5 ml의 배양액을 취하여 알칼리 용해 방법에 의해 추출하였으며, 여러 가지 제한효소 반응을 통해 플라스미드를 절단한 후 나온 DNA 단편을 전기영동법으로 분석하여 서브클로닝된 벡터 클론만을 선별하였다. 제조한 벡터의 DNA 염기서열 분석은 3 ㎍의 DNA와 서열 결정 키트(sequenase version 2.0, USB, 미국)를 사용하여 생거 등의 디데옥시 체인 터미네이션(dideoxy chain termination) 방법(Sanger, F., S. Nicklen and A. R. Coulson, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74: 5463-5467)에 의해 수행하였다. 반응한 각각은 요소 (Urea)가 포함된 6 % PAGE에서 60 W, 400 mA, 600 V로 전기 영동한 후, X-선 필름 (Fuji, Japan)에 24 시간 정도 노출시키고 현상하여 서열을 확인하였다. 앞으로 기술할 각 단계에서 제한 효소 반응, DNA 정제, 연결 반응 및 형질전환 후 서브클로닝된 벡터를 얻는 방법은 상기와 동일하다.

(2) TATA 박스 돌연변이체 U6 프로모터(mut-U6)의 제조

다음으로 RNAi 발현을 제어하는데 필요한 TATA 박스 돌연변이체 U6 프로모터 (mut-U6)를 제조하기 위하여 pDR2-PⅢ-Ex를 EcoR I 및 BamH I으로 절단하여 U6 프로모터의 PSE(proximal sequence element)와 TATA 박스 돌연변이체 절편부위를 취하여 pGEM3 벡터에 서브클로닝 하였다(pGEM-PSE-mutTATA). U6 프로모터의 DSE (distal sequence element) DNA 절편은 프라이머쌍(U6 DSE 1F 5'-GGA TCC GAC GCC GCC AT-3'; U6 DSE 1R 5'-TTT TGT GCT GTT TTT TAA AAT AAT A-3')을 이용하여 PCR 방법으로 pSilencer 1.0 벡터로부터 증폭하여 획득하였다.

PCR 반응은 94 ℃(30 초), 62 ℃(30 초), 72 ℃(1 분)으로 28 회 수행하였고, 5% PAGE에 전기영동 하여 PCR 산물을 확인하였다. 이를 EcoR I으로 절단하고 Klenow 반응으로 블런팅을 수행한 pGEM-PSE-mutTATA 벡터에 T4 DNA 리가아제를 이용하여 서브클로닝 하였다(pGEM-mutU6). mut-U6 프로모터 뒤쪽에 siRNA의 도입을 위한 제한효소 자리를 마련하기 위하여 TATA 박스 뒤쪽 부분에 Apa I과 EcoR I 제한효소 자리를 가진 PCR 역방향 프라이머(5'-GAA TTC GGG CCC AAC TGA TCT TCA GCA-3')를 제조하였다. 이를 U6 DSE 1F 프라이머와 함께 PCR 방법으로 pGEM-mutU6 벡터로부터 증폭하여 전장의 mut-U6 프로모터 절편을 얻었다. 이 DNA 절 편을 EcoR I 및 Hind Ⅲ 절단과 Klenow 반응으로 블런팅을 수행한 pSuper-TRE-TBPDR2-polyA 벡터에 서브클로닝하여 pTEA(pSuper-mutU6- mutTBP)라 명명하였다. 마지막으로 표적 유전자의 siRNA를 인코딩하는 DNA 절편을 용이하게 클로닝하기 위하여 pcDNA3-tetO 벡터로부터 750 bp의 Apa I과 EcoR I 스터퍼(stuffer) 절편을 잘라내어 Apa I/EcoR I으로 절단한 pTEA 벡터에 서브클로닝하여, 최종의 pTEA 벡터를 완성하였다.

이상의 단계에서 사용된 각 반응 용액의 조성을 나타내면 다음 표 1과 같다.

반응	성분 및 함량
제한효소반응	DNA(0.4 ug/㎕) 10 ㎕
	제한효소(10U/㎕)0.4 ㎕
	10 X 버퍼 2 ㎕
	증류수 7.6 ㎕
연결반응	10X 연결버퍼 1㎕
	T4 DNA 리가아제 0.2 ㎕
	주형DNA(0.2ug/㎕) 1 ㎕
	삽입할 DNA(0.2ug/㎕) 3 ㎕
	증류수 4.8 ㎕
Klenow 반응	DNA (0.4 ug/㎕) 10 ㎕
	10X 에코폴 버퍼 2 ㎕
	2.5 mM dNTPs 2 ㎕
	Klenow 효소(10 U/㎕) 0.4 ㎕
	증류수 5.6 ㎕
PCR 반응	템플레이트 (10 pg/㎕) 1 ㎕
	Taq 폴리머레이즈(5 U/ 1㎕) 0.5 ㎕
	10X PCR 버퍼 5 ㎕
	2.5 mM dNTPs 1 ㎕
	프라이머 혼합액(10 pmol/1㎕) 2 ㎕
	증류수 40.5 ㎕

실시예 2 : pTEA 벡터에 서브클로닝 한 EGFPi의 발현 효율 확인

(1) pTEA-EGFPi 벡터의 제조

상기 실시예 1에서 만든 pTEA 벡터가 효율적으로 RNAi 현상을 나타내는지 확인하기 위하여 pTEA-EGFPi 벡터를 제조하였다. EGFP 유전자 염기서열 상에서 RNAi 부위(5'-GCA AGC TGA CCC TGA AGT TCAT-3')를 선정하였으며[Chalk AM, Washlestedt C, and Sonnhammer LL. 2004. Riochem. Biophys. Res. Commun. 319: 264-274], EcoR I 제한효소 염기서열 일부(AATT), 정방향 siRNA 염기서열, 중간 염기서열(9nt, TTCAAGAGA), 역방향 siRNA 염기서열 및 Apa I 제한효소 염기서열 일부 (GGCC)가 차례대로 연결되도록 구상하여 상보적인 두 가닥의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다(Bioneer, Korea).

서로 상보적인 두 가닥의 올리고뉴클레오티드는 1 ug/㎕가 되도록 증류수에 희석한 후 각각 2 ㎕ 씩 취하여 46 ㎕의 결합 완충용액(30 mM HEPES pH 7.4, 100 mM K-아세테이트, 2 mM Mg-아세테이트)과 섞어 주었다. 이를 90 ℃에서 3 분간 반응시킨 후 상온까지 천천히 식혀주어 이중나선 DNA가 형성되도록 유도하고, 이 DNA(8 ng)를 EcoR I 및 Apa I 제한효소로 선형화한 pTEA 벡터(100 ng)에 서브클로닝하여 pTEA-EGFPi 벡터를 제조 하였다.

(2) pTEA-EGFPi 벡터의 EGFP 발현 억제 확인

제조한 pTEA-EGFPi 벡터가 EGFP의 발현을 독시사이클린 의존적으로 억제하는지를 확인하기 위해 pEGFP-N1 벡터 및 rtTA 단백질을 발현하는 pUHD 172-1 벡터와 함께 293T 세포에 일시적으로 형질도입 하였다(도 4 참고). EGFPi 자체의 발현 억제능의 대조군으로는 pTEA에 사용된 것과 동일한 EGFPi를 pSilencer(Ambion, USA) 벡터에 서브클로닝한 pSilencer-EGFPi를 이용하였다. rtTA 단백질에 의해 pTEA-EGFPi가 작동되는지 알아보고자 세포 배양 시 독시사이클린을 처리한 그룹도 분석하였다.

형질도입 하루 전 5 × 10⁴ 개의 293T 세포를 300 ㎕의 배양액(DMEM, 10% FBS)이 들어있는 24 웰 플레이트에 계대배양 하였으며, 이펙턴스(Qiagen, USA)를 이용하여 각각의 DNA들을 형질도입 하였다. 각 벡터의 DNA(총 0.4 ∼ 1.0 ㎍의 DNA)를 2.4 ㎕의 인헨서 용액과 섞고 EC 완충용액으로 60 ㎕로 부피를 맞춘 다음 상온에서 2 ∼ 5 분간 반응시켰다. 여기에 5 ㎕의 이펙턴스 용액을 넣어 잘 섞어준 다음 상온에서 5 ∼ 10 분간 더 반응시켜 300 ㎕의 배양액과 함께 세포에 뿌려주었다. 반응이 끝난 후 37 ℃에서 5% CO₂ 조건으로 이틀간 배양하였다.

EGFP 발현 벡터를 세포에 도입하면 형광을 내는 EGFP 단백질이 만들어지므로, 각 실험군 별로 EGFP를 발현하는 세포를 형광 현미경 하에서 계수하여 EGFP 발현율을 측정하였다. 도 4에서 보는 바와 같이, pEGFP-N1 벡터만 형질 도입한 경우에는 EGFP 단백질의 약 18 %가 발현되었고, pEGFP-N1 벡터와 pSilencer-EGFPi를 함께 형질 도입한 경우 EGFP 발현 세포는 3 % 정도로 감소하였다. 이는 본 실험에 사용한 EGFPi 서열에 의해 EGFP 단백질의 발현이 효율적으로 억제됨을 시사하는 것이다.

마찬가지로 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 독시사이클린이 존재하지 않는 경우 pTEA-EGFPi 벡터에 의해서는 rtTA의 존재 여부에 상관없이 EGFP 단백질의 발현을 억제하지 못하였다. 그러나 독시사이클린이 존재하는 경우에는 EGFP 발현 세포는 12 %로 감소하였다. 따라서 pTEA-EGFPi 벡터는 독시사이클린과 rtTA 단백질에 의존적으로 EGFP 단백질 발현을 억제하지만, 이 발현억제 효과는 pSilencer-EGFPi 벡터에 비해 낮음을 알 수 있었다. 이는 pUHD 172-1 벡터와 pTEA-EGFPi 벡터가 pEGFP-N1와 함께 하나의 세포에 동시에 들어갈 확률이 pSilencer-EGFPi 벡터 하나만 들어가는 경우보다 낮기 때문인 것으로 생각된다.

실시예 3 : K562 세포에서 pTEA 발현 벡터의 발현 억제 확인

상기 실시예 2에서의 pTEA 벡터의 발현 억제 효율이 낮은 원인을 확인하기 위하여 RNAi가 삽입된 두 pTEA 벡터(pTEA-EGFPi 및 pTEA-STAT3i)를 패키지 셀에 형질 도입하여 레트로바이러스를 얻은 후 rtTA를 발현하는 pUHD 172-1 벡터가 염색체에 안정하게 삽입된 K562세포에 감염시켜 분석하였다. STAT3i는 세포 내에서 이미 발현하고 있는 단백질의 발현을 조절할 수 있는지를 확인하기 위하여 선정하였다. pTEA-STAT3i 벡터는 pTEA-EGFPi 벡터 제조와 동일한 방법으로 제조하였으며 STAT3 RNAi 서열은 5'-CTT CAG ACC CGT CAA CAA A-3' 이었다.

우선 pUHD 172-1 벡터가 염색체에 안정하게 삽입된 K562 세포주를 제조하기 위하여 pUHD 172-1 벡터와 pCMV-hygro 벡터를 함께 형질 도입한 후 하이그로마이신 (200 ug/ml)으로 2 주간 처리하여 저항성을 나타내는 세포들의 클론들을 선별하였다. 이 클론들에 pTRE-Luc 벡터를 pTRL-TK-Luc 벡터를 형질 도입한 후 독시사이클린의 유무에 따라 발현하는 루시퍼레이즈 활성을 듀얼 루시퍼레이즈 분석 키트(dual luciferase assay kit, Promega, USA)를 이용하여 루미노미터로 측정하였으며, 독시사이클린 의존적으로 가장 높은 활성을 나타내는 클론(즉 독시사이클린 의존적으로 rtTA 단백질을 발현하는 세포)을 선별하였다. 선별된 세포주에서는 독시사이클린 유무에 따른 루시퍼레이즈 활성이 350 배 정도의 차이를 나타내었다(도 5a).

이어서 rtTA를 안정하게 발현하는 K562 세포에 pTEA RNAi 발현벡터를 레트로바이러스를 매개로 감염시키는 실험을 수행하였다. 다양한 농도의 pTEA-EGFPi 및 pTEA-STAT3i 벡터(2.5 ∼ 10 ㎍)를 레트로바이러스 패키지(packaging) 세포인 293T/G/GP 및 PT67(Clontech, USA) 세포주에 CaPO₄ 방법으로 형질 도입하여 레트로바이러스를 얻었다. CaPO₄ 방법을 이용한 형질 도입을 보다 자세히 설명하면 다음과 같다. 형질 도입하기 전 날에 5 × 10⁶ 개의 패키지 세포주를 6 ml의 배양액(DMEM, 10% FBS)에 희석한 후 100 mm 접시를 이용하여 계대배양 하였다. 형질도입 1 ∼ 2 시간 전에 25 μM의 클로로퀸을 처리하였으며, 20 ㎍의 벡터 DNA를 50 ㎕의 2 M CaCl₂와 섞은 후 최종 400 ㎕가 되도록 준비하였다. 준비된 DNA/CaCl₂ 용액을 400 ㎕의 2 X HBS(50 mM HEPES pH 7.1, 280 mM NaCl, 2.82 mM Na₂HPO₄)에 거품이 생길 정도로 흔들면서 한 방울씩 떨어뜨려 섞어 주었다. 상온에서 30 분 정도 반응시킨 후 100 mm 접시에 한 방울씩 골고루 뿌려 형질도입 하였다. 다음날 배양액을 교체해 주고, 48 시간 뒤에 배양액을 회수하여 4 ∼ 8 ㎍/ml의 폴리부렌(polybrene)과 섞어 K562-rtTA 세포주(2 × 10⁶)에 감염시켰다.

외부에서 도입된 EGFP의 발현 억제현상을 관찰하는 경우에는 레트로바이러스로 감염시킨 4 시간 후, 5 ㎍의 pEGFP-N1(Clontech, USA)을 K562 rtTA 세포주에 형질도입 하였으며, 이 때부터 48 시간 동안 독시사이클린을 첨가하였다. 각 실험군에서 발현하는 mut-TBP 및 EGFP 단백질의 양을 측정하기 위해 세포에 내재하는 β-튜블린을 대조군으로 하여 웨스턴 블랏으로 조사하였다(도 5b).

mut-TBP의 발현은 이 단백질 서열 앞에 His 펩티드가 태그 되어 있으므로 항-His 항체를 이용하였으며, β-튜블린과 EGFP의 발현은 각각 항-β-튜블린 및 항-GFP 항체들(Clontech, USA)을 이용하여 확인하였다. 수거한 세포를 lysis 완충용액에 섞은 다음 2X SDS(sodium dodecyl sulfate) 로딩 다이(dye)와 섞어 3 ∼ 5 분간 끓인 후 8% SDS-PAGE에서 전기영동 하였다. 이어서 세미-드라이 트랜스블랏(Bio-rad)을 이용하여 15 V 에서 1 시간 동안 니트로-셀룰로오스 멤브레인으로 옮긴 후 5% 비-지방 건조 밀크를 이용하여 1 시간 동안 블록킹 하였다. 1 차 항체는 PBS에 1% 비-지방 건조 밀크와 0.1% tween 20을 넣은 용액(PBS-T)에 1/1000로 희석하여 상온에서 1 시간 동안 반응시켰으며, HRP(horse-radish peroxidase)가 붙은 2 차 항체는 PBS-T 완충 용액으로 10 분씩 2 번 수세한 후 1/2000로 희석하여 상온에서 1 시간 동안 반응하여 수행하였다. ECL 키트(Amersham, USA)를 이용하여 3 ∼ 10 분 동안 X-레이 필름에 감광시킨 후 결과를 관찰하였다.

도 5b에서 볼 수 있는 것처럼, pTEA-EGFPi 벡터에 서브클로닝된 mut-TBP 유전자의 단백질은 독시사이클린 존재 하에서만 발현하고 있으며, EGFP 단백질은 패키징 세포에 형질도입된 pTEA-EGFPi 벡터의 양에 반비례하여 감소한다. 따라서 본 발명에서 제조한 pTEA 벡터는 효율적으로 RNAi를 발현할 뿐만 아니라 레트로바이러스로 패키징 되어 숙주세포를 감염시키는데 있어 매우 용이하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 pTEA 벡터를 이용할 경우 세포 내에서 지속적으로 발현하고 있는 STAT3 유전자의 발현도 효율적으로 억제시킬 수 있는지 확인하기 위하여 상기에서 기술한 pTEA-STAT3i 레트로바이러스를 상기의 pTEA-EGFPi의 경우와 동일한 방법으로 K562-rtTA 세포주에 감염시킨 후 독시사이클린을 첨가하여 48 시간 동안 배양한 후 내재적으로 발현하는 STAT3 단백질의 양을 항-STAT3 항체(Santa Cruz, USA)를 이용하여 분석하였다. 이 경우 역시 pTEA-STAT3i 벡터의 농도에 반비례하여 독시사이클린 의존적으로 세포에 내재하는 STAT3 단백질의 발현을 억제함을 알 수 있다(도 5c). 따라서 본 발명에서 개발한 pTEA 벡터는 독시사이클린의 유무에 따라 외부에서 넣거나 혹은 세포 내에 내재하는 유전자의 발현을 효율적으로 억제할 수 있을 뿐만 아니라 효율적으로 세포를 감염시킬 수 있는 레트로바이러스로 패키징 될 수 있음을 알 수 있다.

실시예 4 : K562 rtTA 세포주의 염색체에 안정적으로 삽입된 pTEA-STAT3i가 독시사이클린 의존적으로 STAT3 단백질의 발현 억제 확인

K562 rtTA 세포주의 염색체에 안정적으로 삽입된 pTEA-STAT3i 가 독시사이클린 의존적으로 STAT3 단백질의 발현을 억제할 수 있는지 분석하였다. 상기 도 5c의 실험에서와 마찬가지로 pTEA-STAT3i 레트로바이러스를 K562-rtTA 세포주에 감염시킨 후 1 ㎍/ml의 퓨로마이신을 배양액에 1 주일간 처리하여 살아남은 세포들의 클론들을 선별하였다. 선별된 클론들 중 3 세포주를 무작위적으로 선택하여 독시사이클린 처리 유무에 따른 STAT3 단백질의 발현을 웨스턴 블랏 방법을 이용하여 분석하였다.

분석 결과 3 가지 세포주 중 하나의 세포주(#2)에서 독시사이클린 의존적으로 STAT3 단백질의 발현이 감소됨을 확인할 수 있었다(도 6a). 이는 레트로바이러스가 염색체에 삽입되는 부위의 염색질 상태에 따라 삽입된 유전자가 발현되지 않을 수 있음을 시사한다. 본 실시예에서는 3 가지 세포주 중 하나(33 % 확률)에서 pTEA 벡터가 작동하므로 매우 효율이 높다고 판단된다. 또한 #2 세포주를 대상으로 독시사이클린 처리 시간을 72 시간까지 연장할 경우 웨스턴 블랏으로 감지하지 못할 정도로 STAT3 단백질의 발현을 억제하였다(도 6b). 따라서 본 발명에서 개발한 pTEA 벡터는 레트로바이러스로 패키징 되며, 염색체에 안정적으로 삽입된 상태에서도 지속적으로 독시사이클린 의존적으로 RNAi 효과를 나타냄을 알 수 있다.

상술한 바와 같이 본 발명의 테트라사이클린 유도성 siRNA 발현 레트로바이러스 벡터는 생쥐 돌연변이체 TBP 유전자와 TATA 박스 돌연변이체 U6 프로모터를 이용하여 테트라사이클린 유도성 siRNA 발현 레트로바이러스 벡터를 제조함으로써 레트로바이러스에 패키징될 수 있어 세포 내 도입이 용이하고 일시적이 아니라 지속적으로 독시사이클린 의존적인 RNAi를 유도할 수 있다. 또한, 테트라사이클 린의 존재 하에서 tet-엑티베이터가 생성되고 상기 tet-엑티베이터가 mut-TBP를 발현하는 프로모터의 tet-오퍼레이터에 결합함으로써 mut-TBP가 생성되고 이것이 mut-U6 프로모터에 결합하는 방식을 이용함으로써 기존의 방식보다 RNAi를 보다 효율적으로 유도할 수 있다.

그리고 TATA 박스에 RNA 중합효소 복합체 형성을 결정하는 mut-TBP를 표적으로 하므로 mut-TBP가 누수성 발현을 보이더라도 게놈 내 유전자의 조절 부위에 존재하는 정상적인 TATA 박스에 전혀 영향을 주지 않고 세포의 비특이적인 활성화가 발생되지 않는다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (3)

1. 슈퍼 레트로 벡터(pSuper Retro)로부터 유래되어 생쥐 돌연변이체 TATA 박스 바인딩 프로테인 유전자 및 TATA 박스 돌연변이체 U6 프로모터를 포함하고, 서열번호 4와 도 1의 개열지도로 표시되는 siRNA 유전자의 발현을 위한 재조합 벡터.
2. 청구항 1의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 대장균[KCTC 10776BP].
3. 청구항 1의 재조합 벡터 시스템 내,

   테트라사이클린의 존재 하에서 tet-엑티베이터가 생성되는 단계, 상기 tet-엑티베이터가 생쥐 돌연변이체 TATA 박스 바인딩 프로테인을 발현하는 프로모터의 tet-오퍼레이터에 결합하여 생쥐 돌연변이체 TATA 박스 바인딩 프로테인을 생성시키는 단계, 및 상기 생쥐 돌연변이체 TATA 박스 바인딩 프로테인이 TATA 박스 돌연변이체 U6 프로모터에 결합하여 표적 유전자의 SiRNA 유전자가 발현하게 되어 표적유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 RNAi의 유도 방법.

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