KR101229821B1 - 그래뉼린-에피테린 전구체 유전자의 발현을 억제하는 안티센스 및 이를 함유하는 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 그래뉼린-에피테린-전구체(GEP) 유전자에 대한 안티센스 핵산 및 이를 이용하여 GEP에 의하여 야기되는 질환을 유전적으로 치료하기 위한 조성물에 관한 것으로, 안티센스 핵산을 활용하여 GEP에 의하여 유도되는 질환, 예를 들어 간세포암의 진행을 억제, 치료할 수 있다.

Description

그래뉼린-에피테린 전구체 유전자의 발현을 억제하는 안티센스 및 이를 함유하는 약제학적 조성물{Anti-Sense Nucleic Acid of Inhibiting Expression of Granulin-Epithelin-Precursor Gene and Pharmaceutical Composition Containing Thereof}

본 발명은 유전자의 발현을 억제하는 핵산에 관한 것으로, 보다 상세하게는 그래뉼린-에피테린-전구체의 발현을 억제하는 안티센스로서의 핵산, 이들이 삽입된 벡터 및 이들을 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

간세포암(hepatocellular carcinoma, HCC)은 대표적인 간종양의 일종으로서, 주요한 사망 원인의 하나이다. 간세포암은 주로 B형 간염(hepatitis B), C형 간염(hepatitis C), 아플라톡신(aflatoxin), 알코올 중독 등에 의하여 야기되는 것으로 알려져 있다. 특히 B형 간염 바이러스나 C형 간염 바이러스에 지속적으로 감염되는 경우에, 인체의 면역 시스템이 간세포를 지속적으로 공격하여 간경변(cirrhosis)을 야기하고, 이에 따라 간세포암이 발병한다.

한편, 그래뉼린-에피테린-전구체(Granulin-Epithelin-precursor, GEP)는, 프로그래뉼린(progranulin), 아크로그라닌(acrogranin), PC-세포 유래 성장인자(PC-cell-derived growth factor), 프로에피테린(proepithelin) 등으로도 불리는, 세포 외부로 유리되는 당단백질의 일종으로서, 세포 주기 진행과 세포 성장을 촉진시키는 성장 인자(growth factor)로 알려져 있다. 그래뉼린-에피테린-전구체(이하, GEP)는 593개의 아미노산으로 구성된 당단백질로서, 이를 발현하는 mRNA는 상피 세포, 조혈 세포에서 많이 발현된다. 특히, GEP는 인간 염색체 17q21.32의 유전자 로커스를 갖는 간세포암(hepatocellular carcinoma, HCC)에서 과다 발현되는 유전자의 하나로서, 도 1에서는 GEP 유전자 및 발현 형태를 개략적으로 도시하고 있다.

도 1에 도시한 것과 같이, 인간을 포함하는 포유동물의 GEP 유전자는 N-말단을 코딩하는 엑손(N), C-말단을 코딩하는 엑손(C) 및 N-말단/C-말단을 코딩하는 엑손(C-N)을 포함하는 12개의 엑손으로 구성되어 있으며, 10번째의 엑손(X)이 발현되지 않는 경우에, N-말단이 grnC이고 C-말단이 grnD인 하이브리드 grn/epi 도메인을 형성하기도 한다. 특히, 다른 그래뉼린과 마찬가지로 다이설파이드 결합을 이루고 있는 총 12개의 시스테인(cysteine)이 함유되어 있는 시스테닐 모티프(cystenyl motif) 또는 그래뉼린/에피테린 모듈(Granulin/Epithelin module, GEM)이 7.5회 tandem 반복된다(Bateman A, Bennett H.P. 1998. Granulins: the structure and function of an emerging family of growth factors" J. Endocrinology, 158, 145-51, 비특허문헌 1). 발현된 GEP는 대략 68 ~ 88 kDa 분비 단백질로서 많은 부분에서 당화(glycosilation)되어 있다.

포유동물 세포에서 GEP의 세포 내 신호 전달(signal transduction)과 관련해서, GEP는 세포외에서 조절되는 인산전이효소 신호 전달 경로에서는 shc 및 p44/42 미토젠 활성화 단백질 인산전이효소(p44/42 MAPK)의 인산화를 촉진할 뿐만 아니라, 포스파티딜 이토시톨-3 인산전이효소(PI-3K), 단백질 인산전이효소인 B/AKT를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 기작을 통해서, GEP는 사이클린B(cyclin B) 및 사이클린D(cyclinD)의 발현을 증가시켜 체세포 분열이나 상처 후의 세포 증식을 통한 상처 치유, 초기 배발생 및 뇌의 분화를 조절하는 것은 물론이고 염증 사이토카인인 종양괴사인자-α(TNF-α)의 억제 물질로서의 염증 반응 및 인터류킨 8(IL-8)과 같은 사이토카인의 분비를 촉진하여 면역 반응에 관여할 뿐만 아니라, 치매와 같은 신경퇴화 질환을 야기하며, 특히 유방암, 난소암, 전립선암과 같은 선암, 양, 난소암 및 전립선암과 같은 다양한 암세포주에서 과다 발현된다(Andrew Bateman and Hugh P. J. Bennett. 2009. The Granulin gene family: from cancer to dementia". BioEssays, 31, 1245-1254, 비특허문헌 2).

특히, 간세포암(HCC)과 관련된 최근의 연구에 따르면, 간암세포에서의 GEP RNA 농도나 단백질의 발현 정도는 정상세포에서의 GEP RNA 농도나 단백질의 발현 수준에 비하여 상당히 높으며, GEP 단백질이 상승-조절(up-regulation)이 간세포암과 밀접한 관련이 있으며(Siu Tim Chenung et al., 2004. Granulin-Epithelin Precursor Overexpression Promotes Growth and Invasion of Hepatocellular Carcinoma. Clinical Cancer Research. 10, 7629-36, 비특허문헌 3), 특히 항-GEP 단일클론항체(A23)는 혈청 내에서 GEP의 발현을 감소시키며 농도 의존적인 형태로 종양의 성장을 억제하며, 이 항-GEP 단일클론항체는 p44/42 MAPK) 및 Akt 경로를 통한 종양 세포의 증식을 감소시키는 등의 방법으로 Hep3B 간암 세포와 같은 간세포암의 성장을 억제하기 때문에 GEP가 간세포암의 치료를 위한 표적이 될 수 있다고 설명하고 있다(Jenny C. Ho et al., 2008. Granulin-Epithelin Precursor as a Therapeutic Target for Hepatocellular Carcinoma. Hepatology 47(5), 1524-32, 비특허문헌 4).

또한, HpeG2 세포에서 GEP가 과다발현 되는 경우 종양 억제 인자인 p53의 발현이 증가하는 반면, GEP 단백질의 발현이 억제되면 p53의 발현이 감소하는 등 GEP와 p53은 간세포암에서 서로 연관성이 있는 것으로 확인되었다(Siu Tim Cheung et al., 2006. GEP associates with wild-type p53 in hepatocellular carcinoma. Oncology Reports, 15, 1507-1511, 비특허문헌 5).

아울러, GEP와 관련해서 일부 특허문헌도 공개되었는데, 예를 들어, 대한민국등록특허 제10-0896328호(특허문헌 1)에서는 프로그래뉼린에 특이적인 항체를 사용하여 혈중 프로그래뉼린의 농도를 측정하는 방법으로 비만, 당뇨병, 심혈관질환과 같은 대사성 질환을 치료하기 위한 마커 검출용 조성물 및 이를 포함하는 대사성 질환 진단용 키트를 제시하고 있다.

이처럼, 다양한 생물학적 반응이나 현상을 조절하여 많은 질병을 야기하는 것으로 알려진 GEP에 대한 연구는 더욱 진행될 필요가 있다. 특히, 간세포암은 물론이고 다양한 형태의 암을 야기하는 GEP의 발현을 억제하는 방법으로, 이들 질환을 치료하기 위한 방법을 개발할 필요성이 있다.

1. 대한민국등록특허 10-0896328호 (공고일 2009. 5. 7)

1. Bateman A, Bennett H.P. 1998. Granulins: the structure and function of an emerging family of growth factors" J. Endocrinology, 158, 145-51. 2. Andrew Bateman and Hugh P. J. Bennett. 2009. The Granulin gene family: from cancer to dementia". BioEssays, 31, 1245-1254. 3. Siu Tim Chenung et al., 2004. Granulin-Epithelin Precursor Overexpression Promotes Growth and Invasion of Hepatocellular Carcinoma. Clinical Cancer Research. 10, 7629-36. 4. Jenny C. Ho et al., 2008. Granulin-Epithelin Precursor as a Therapeutic Target for Hepatocellular Carcinoma. Hepatology 47(5), 1524-32. 5. Siu Tim Cheung et al., 2006. GEP associates with wild-type p53 in hepatocellular carcinoma. Oncology Reports, 15, 1507-1511.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 다양한 생물학적 반응에 관여하는 그래뉼린-에피테린 전구체(GEP)의 발현을 억제할 수 있도록, GEP의 mRNA의 특정 서열과 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산, 예를 들어 짧은-간섭 RNA(siRNA) 또는 짧은-헤어핀 RNA(shRNA)를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전술한 안티센스 핵산이 발현 가능하게 삽입되어 있는 벡터 또는 유전자 전달체를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전술한 안티센스 핵산 또는 이 안티센스 핵산이 삽입되어 있는 벡터나 유전자 전달체를 숙주 세포에 도입시켜 GEP의 발현을 억제하는 세포 및 그 제조 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 안티센스 핵산 또는 벡터나 유전자 전달체를 유효 성분으로 함유하는 GEP 발현 억제를 위한 약제학적 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 후술하는 발명의 상세한 설명 및 청구의 범위를 통해서 더욱 분명해질 것이다.

본 발명은 그래뉼린-에피테린-전구체(GEP)의 발현을 억제할 수 있도록 제조되는 안티센스 핵산 및 이를 활용하는 방법에 관한 것이다.

즉, 본 발명의 일 관점에 따르면, ⅰ) 서열번호 3 내지 서열번호 4로 구성되는 군에서 적어도 하나 선택되는 염기 서열을 가지는 짧은-간섭 RNA(short-interfering RNA, siRNA), 또는 ⅱ) 서열번호 3 내지 서열번호 4에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열의 5' 말단 쪽 또는 3'말단 쪽으로 연결되는 링커 서열을 통하여 서열번호 3 내지 서열번호 4의 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드(상보적 올리고뉴클레오티드)가 상기 짧은-간섭 RNA와 연결되어 있는 짧은-헤어핀 RNA(short-hairpin RNA, shRNA)로 구성되는, 그래뉼린-에피테린-전구체(Granulin-Epithelin precursor, GEP)의 발현을 억제하는 안티센스 핵산을 제공한다.

이때, 상기 짧은-헤어핀 RNA는, 상기 짧은-간섭 RNA의 일 끝단으로 연결되는 1-20개의 올리고뉴클레오티드(제 1 보조 올리고뉴클레오티드)와, 상기 상보적 올리고뉴클레오티드의 일 끝단으로 연결되며 상기 제 1 보조 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드(제 2 보조 올리고뉴클레오티드)를 더욱 가질 수 있다.

구체적으로, 상기 짧은-헤어핀 RNA는 서열번호 6 내지 서열번호 10으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열로 구성될 수 있다.

한편, 본 발명의 다른 관점에 따르면 전술한 안티섹스 핵산이 삽입되어 있는 재조합 벡터를 제공한다.

이때, 재조합 벡터는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터일 수 있으며, 일례로 바이러스 벡터로는 바큘로 바이러스, SV40 바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 아데노- 부속 바이러스, 레트로바이러스, 계두 바이러스, 가성광견병 바이러스 유래의 바이러스 벡터일 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 관점에 따르면 전술한 안티센스 핵산, 또는 재조합 벡터를 유효 성분으로 함유하는, 그래뉼린-에피테린-전구체(Granulin-Epithelin precursor, GEP) 유래의 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다. 이때, 상기 조성물은 간암의 질환을 치료하기 위한 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 관점에 따르면 포유동물 유래의 숙주 세포에 전술한 안티센스 핵산 또는 재조합 벡터를 도입한, 그래뉼린-에피테린-전구체(Granulin-Epithelin precursor, GEP)의 발현이 억제된 세포의 제조 방법을 제공한다. 숙주 세포는 분리되거나 배양된 것일 수 있으며, 간암 세포일 수 있다.

본 발명에서는 특히 간세포암과 같은 간질환은 물론이고 다양한 질환의 원인 인자인 그래뉼린-에피테린 전구체(GEP)의 발현을 억제할 수 있도록 제안된 안티센스 핵산으로서의 siRNA 및 shRNA를 제작하였다.

이들 안티센스 핵산을 직접 GEP가 야기하는 질환을 가지고 있는 적절한 숙주 세포에 직접 주입시키거나 또는 안티센스 핵산이 삽입된 재조합 벡터를 숙주 세포에 주입하는 등의 유전자 전달 시스템을 통해서 GEP가 야기하는 질환을 억제할 수 있다.

즉, 전술한 안티센스 핵산 및 이 안티센스 핵산이 삽입된 벡터를 유효 성분으로 함유하고 적절한 담체 등을 포함하는 약제학적 조성물의 형태로 응용함으로써 GEP의 과다 발현에 의해 야기되는 질환, 예를 들어 치매와 같은 신경퇴화 질환은 물론, 특히 간암, 간세포암, 유방암, 난소암, 전립선암과 같은 선암, 양, 난소암 및 전립선암과 같은 암 질환을 치료할 수 있다.

도 1은 그래뉼린-에피테린-전구체(GEP)의 엑손과 인트론을 포함하는 유전자 및 그로부터 발현되는 단백질과 특징적인 아미노산 서열을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따라 클로닝이 확인된 GEP의 염기 서열을 표시한 것으로, 번역이 시작되는 부위와 전사 종결 부위를 박스 형태로 표시되어 있으며, 도 2b는 GEP를 발현시키기 위하여 사용된 플라스미드 벡터의 개략적인 개열-지도를 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 GEP가 발현된 상태를 도시한 것으로, 도 3a는 웨스턴 블롯팅을 수행한 뒤의 사진이고, 도 3b는 ELISA 분석에 따른 측정 결과를 도시한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 확인된 짧은-간섭 RNA가 결합되는 GEP mRNA의 구조를 개략적으로 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 3개의 siRNA를 사용하여 GEP의 발현이 억제되는 정도를 측정한 것으로, 도 5a는 시간 경과에 따른 GEP 발현 억제 정도를 측정한 그래프이고, 도 5b는 siRNA의 농도 변화에 따른 GEP의 발현 억제 정도를 측정한 그래프이다. 도 5a에서 GEP-siRNA106은 상업적으로 판매되는 짧은-간섭 RNA(AC AAG CCU UGA AGA GAG A, 서열번호 11, Bioneer 사)로서 본 발명에 따른 안티센스 핵산과의 비교를 위해 사용한 것이고, GFP는 green fluorescent protein을 발현시키는 유전자가 삽입된 플라스미드를 transfection한 것으로 transfection 효율 확인 및 negative control로 사용한 것이며, pcDNA-GEP는 안티센스 핵산이 추가되지 않은 상태에서의 GEP의 발현 정도를 측정한 것이다.
도 6은 본 발명의 다른 실시예에 따라 링커 서열 및 추가 상보적인 서열을 통하여 변형된 안티센스 핵산인 shRNA를 사용하여 GEP의 발현이 억제되는 정도를 측정한 것으로, 도 6a는 시간 경과에 따른 GEP의 발현 억제 정도를 측정한 그래프, 도 6b는 shRNA의 농도 변화에 따른 GEP의 발현 억제 정도를 측정한 그래프로서, GFP는 green fluorescent protein을 발현시키는 유전자가 삽입된 플라스미드를 transfection한 것으로 transfection 효율 확인 및 negative control로 사용한 것이며, pcDNA-GEP는 안티센스 핵산이 추가되지 않은 상태에서의 GEP의 발현 정도를 측정한 것이다.
도 7은 본 발명의 다른 실시예에 따라 변형된 shRNA가 cell 내에 존재하는 GEP의 mRNA level을 감소시키는 지의 여부를 알아보기 위하여 Hep3B cell을 대상으로 실시간-PCR을 통한 결과를 측정한 그래프이다.
도 8은 liver cancer의 성장인자로 작용하는 GEP를 표적으로 RNAi 효과가 GEP에 대한 발현을 억제하는지를 알아보기 위해서 liver cancer cell에 대한 growth 억제 정도를 측정한 그래프이다.
도 9는 in vivo에서 본 발명에 따른 안티센스 핵산에 의한 종양 감소 정도를 측정한 것으로, 도 9a는 마우스에 본 발명에 따라 합성된 shRNA를 주입한 뒤에 종양의 억제 정도를 측정한 그래프이고, 도 9b 및 도 9c는 negative control로서 luciferase-억제 shRNA를 사용한 결과를 비교하여 측정한 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 Hep3B 간암 세포주의 세포 주기(cell cycle)에 따른 세포 수 측정 결과를 도시한 것으로, 상단 좌측(Luciferase-shRNA)은 luciferase 활성 억제 shRNA로 처리한 간암 세포주의 세포 주기에 따른 세포 수 측정 결과, 상단 우측(pcDNA-GEP)은 안티센스 핵산으로 처리하지 않은 간암 세포주의 세포 주기에 따른 세포 수 측정 결과, 하단 좌측(GEP-shRNA)은 본 발명에 따른 안티센스 핵산으로 처리한 간암 세포주의 세포 주기에 따른 세포 수 측정 결과를 나타낸 그래프이고, 하단 우측은 그 결과를 표 형태로 표시한 것이다.

본 발명자들은, 전술한 문제점을 인식하고, 그래뉼린-에피테린-전구체(GEP)의 과다 발현에 의하여 야기되는 질환, 예를 들어 각종 종양이나 간암과 같은 질환을 억제하기 위한 방법을 연구한 끝에, GEP의 mRNA와 상보적으로 교잡할 수 있는 안티센스 핵산을 적절한 숙주 세포 내로 주입(transfection)시키는 방법으로 GEP의 과도 발현으로 야기되는 간 질환을 방지, 치료할 수 있다는 점에 기초하여, 본 발명을 완성하였다. 이하에서는 본 발명에 대해서 첨부하는 도면을 참조하면서 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 공지된 그래뉼린-에피테린-전구체(GEP)의 유전자 서열(서열번호 1)에 기초하여, GEP의 발현 정도를 우선 측정하였다. 도 2a에 도시된 GEP의 유전자 서열(서열번호 1)과 도 2b에 도시된 발현 벡터를 사용하여 GEP를 클로닝한 뒤, 발현 정도를 확인하였다(도 3a 및 도 3b). 이어서, GEP의 mRNA의 특정 서열과 상보적으로 결합하여 그 활성을 억제할 수 있는 안티센스 핵산으로서의 3 종류의 짧은 간섭 RNA(short-interfering RNA, siRNA, 서열번호 2 내지 서열번호 4)을 찾아냈다.

본 발명에 따라 확인된 서열번호 2 내지 서열번호 4의 siRNA가 공격하는 GEP mRNA의 2차 구조를 분석한 결과, 이들 안티센스 핵산의 표적 부위는 스템-루프(stem-loop) 구조가 형성되어 있어 자유에너지가 상당히 높을 것으로 예상되었으며, GEP의 표적부위에 대해서 본 발명에 따른 안티센스 핵산을 통한 RNAi에 의한 접근이 용이할 것으로 예상되었다(도 4).

이어서, 본 발명자들은 확인된 서열번호 2 내지 서열번호 4의 siRNA로서의 안티센스 핵산을 대상으로 표적 유전자인 GEP의 발현 정도가 억제되는지의 여부를 확인하였다. 이들 짧은-간섭 RNA로서의 서열번호 2 내지 서열번호 4의 안티센스 핵산(GEP-siRNA1, GEP-siRNA2, GEP-siRNA3)에 의한 GEP의 발현은 의미 있게 억제되었으며(도 5a 참조), 특히 사용된 siRNA의 농도에 의존하여 GEP의 발현이 억제되었음을 확인하였다(도 5b 참조).

아울러, 본 발명자들은 siRNA의 형태로 transfection 되는 경우에 생체내에서의 불안전성을 고려하여 이들 siRNA를 변형하여 shRNA의 형태로 변형한 상태에서, shRNA 형태의 안티센스 핵산이 GEP의 발현을 억제하는지를 알아보았다. 그 결과 전술한 siRNA와 마찬가지로 shRNA 역시 GEP의 발현을 억제하였고(도 6a 참조), 마찬가지로 농도에 의존하여 GEP의 발현이 억제되었음을 확인하였다(도 6b 참조).

아울러, 본 발명에서 사용된 안티센스 핵산은 간암세포주인 Hep3B 세포에 주입한 결과 GEP의 mRNA 수준을 4배 감소시킬 뿐만 아니라(도 7), 암세포의 성장 역시 크게 억제한다는 점을 확인할 수 있었다(도 8).

뿐만 아니라, 마우스에 간암세포주를 주입하여 종양을 형성한 뒤에, 본 발명에 따른 안티센스 핵산을 주입한 결과 종양의 크기가 크게 감소한다는 점 또한 확인하였다(도 9a 내지 도 9c 참조). 특히, 본 발명에서 확인한 바에 따르면, 본 발명에 따라 합성된 GEP 안티센스 핵산으로 처리한 간암 세포의 경우, 세포 사이클을 특정 주기(S기 및 G2/M기)로 정지시켜(cell cycle arrest), 세포의 성장을 억제하는 것을 확인하였다(도 10 참조).

1. 안티센스 핵산

따라서 본 발명의 기본적인 출발점은, GEP의 과다 발현에 따른 질환을 치료 또는 방지하기 위한 목적에서 GEP의 mRNA의 특정 부위와 잡종 결합할 수 있는 안티센스 핵산, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA를 설계한 것이다. 이렇게 설계된 안티센스 핵산을 세포 내에 직접 주입하거나 또는 재조합 벡터의 형태로 주입하여 GEP 발현을 억제하는 RNA 간섭을 통해, GEP 과다 발현에 따른 질환, 치매와 같은 신경퇴화 질환 및 간암, 간세포암, 유방암, 난소암, 전립선암과 같은 선암, 양, 난소암 및 전립선암과 같은 다양한 암 질환을 치료하는데 있다.

RNA 간섭(RNA interference, RNAi)이란, 간단히 말하면 특정 단백질을 발현하는 mRNA에 상보적으로 교잡(hybridization)하는 핵산, 즉 안티센스 핵산에 의해 특정 단백질로의 번역이 억제됨으로써, 결과적으로 특정 단백질의 발현이 일어나지 않는 현상을 일컫는다. RNA 간섭에 관여하는 RNA에는 마이크로 RNA(microRNA, miRNA)와 짧은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)가 있는데, miRNA가 표적 mRNA의 3' 비전사영역(3' UTR)에 상보적으로 결합하는 반면, siRNA는 표적 mRNA의 단백질 코딩 영역의 특정 부위와 교잡(hybridization)하여 표적 mRNA에 기인하는 단백질의 발현을 억제한다. RNAi는 특히 바이러스와 트랜스포존과 같은 기생 유전자에 대한 세포의 면역 반응 및 유전자 발현의 조절과 밀접한 관련이 있다.

RNAi와 관련된 RNA 중에서 특히 짧은 간섭 RNA(siRNA)는 다양한 진핵생물에서 확인되었으며, '전사후 유전자 사일런싱(post-transcripiton gene silencing)'으로도 알려져 있다 (Andrew J. Hamilton, David C. Baulcombe (1999). "A Species of Small Antisense RNA in Posttranscriptional Gene Silencing in Plants", Science 286(5441): 950-52; Sayda M. Elbashir, Jens Harborth, Winfried Lendeckel, Abdullah Yalcin, Klaus Weber & Thomas Tuschl (2001). "Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells". Nature 411 (6836): 494-98). siRNA의 개략적인 메커니즘은 다음과 같다. 우선 외부에서 유도되거나 내부에서 생성된 이중 가닥 RNA(dsRNA)가 ribonuclease 활성을 가지는 Dicer라는 효소에 의해서 절단되어 대략 20개 ~ 30개 정도의 뉴클레오티드로 구성된 짧은 단편으로 변환된다.

이렇게 해서 형성된 짧은 단편의 RNA를 '짧은 간섭 RNA(short interfering RNA, siRNA)라고 부르는데, 이중 가닥 형태의 siRNA 단편은 각각의 가닥으로 분리되고 그 중 한 가닥의 RNA(guide strand)가 RNA-induced silencing complex(RISC)로 결합한다. RISC와 결합된 siRNA가 mRNA의 상보적 서열과 염기쌍을 이루면, RISC의 촉매 성분으로서 endonuclease 활성을 갖는 argonatue 단백질이 siRNA와 상보적으로 결합된 표적 mRNA 가닥을 절단하는 것으로 알려져 있다.

이러한 RNA 간섭을 이용해서, 특정 유전자에 상보적인 서열을 갖는 이중 가닥 RNA를 합성한 뒤 세포로 유입시켜 특정 유전자의 발현을 억제하는 'gene knock down'에 활용한다거나, 특히 합성된 siRNA를 벡터에 삽입한 뒤 숙주 세포에 주입하거나 또는 직접 siRNA를 주입하는 방법으로 특정 질병과 관련이 있는 유전자의 발현을 억제하는 유전자 치료 등에 활용될 수 있다.

하지만, 단일 가닥 형태로 제공되는 siRNA는 안정성이 낮기 때문에 생체내에서 단시간에 분해되어 표적 유전자의 발현 억제 효과에 한계가 많다. 이러한 한계를 극복하기 위해서 siRNA를 변형하여 짧은 헤어핀 RNA(short sequence RNA, shRNA)로 변형하는 방법이 사용된다.

최근의 연구 결과에 따르면 대략 25개 정도의 뉴클레오티드의 짧은 RNA를 포유동물 세포에 도입하여 포유동물 세포에서도 RNAi를 유도할 수 있고, 화학적으로 합성된 siRNA와 shRNA를 발현하는 벡터가 시험관 내(in vitro) 및 생체내(in vivo)에서 RNAi를 유도한다고 알려져 있다.

따라서 본 명세서에서 '안티센스(anti-sense)'라는 용어는, 직접 또는 세포로 직접 유입된 다른 핵산의 발현을 통하여 세포로 유입되어, 단백질을 코딩하는 세포 내의 mRNA의 일정 부분과 특이적으로 교잡하여 단백질로의 번역을 차단하여 표적 단백질의 발현을 억제하는 핵산을 의미한다.

한편, 본 명세서에서 '짧은-간섭 RNA(siRNA)'라는 용어는, 표적 mRNA의 특정 염기 서열과 상보적인 염기 서열을 갖는 RNA를 의미한다. 한편, '짧은-헤어핀 RNA(short/small hairpin RNA, shRNA)란, 이러한 짧은-간섭 RNA에 선택적으로 충분한 길이의 링커 서열(linker sequence)을 통하여, 필요에 따라서는 벡터를 통하여 세포 내로 트랜스펙션(transfection)될 수 있도록 변형된 RNA를 의미한다. 이러한 의미에서 '안티센스 핵산'이란 짧은-간섭 RNA, 짧은-헤어핀 RNA를 포함하는 것으로 이해된다.

이런 의미에서 본 발명에 따른 siRNA 말단 구조는 표적유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활 (blunt) 말단 혹은 점착 (cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 ' 말단이 돌출한 구조 및/또는 5' 말단이 돌출한 구조일 수 있다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않으며, 예를 들어 1 내지 8개의 염기, 바람직하게는 2개 내지 6개의 염기일 수 있다.

또한, 본 발명의 안티센스 핵산은 표적 유전자로 사용된 GEP의 발현 억제 효과(RNAi)를 유지할 수 있는 범위에서, 예컨대 전술한 siRNA의 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA (예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA 분자 또는 인공의 RNA 분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, siRNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템-루프형(stem-loop) 구조를 갖는 shRNA 형태를 가지도록 변경될 수 있다. 이때, 스템 부분이 염기쌍을 이루는데 지장이 없다면, 링커의 길이는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 1-20개, 바람직하게는 3-10개 정도의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 하기 표 1에서는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 가지는 그래뉼린-에피테린-전구체(GEP)의 mRNA에 상보적으로 결합하여 그 활성을 억제할 수 있는, 본 발명에 따른 안티센스 핵산의 일예를 대표적으로 나타낸다.

그래뉼린-에피테린-전구체에 대한 안티센스 핵산

명명	서열 (5'->3')	비고
GEP-siRNA1	GGACACUUCUGCCAUGAUA (서열번호 2)	표적 위치 1578
GEP-siRNA2	GAGAGAUGUCCCCUGUGAU (서열번호 3)	표적 위치 1091
GEP-siRNA3	UCUAAGGCCUUCCCUGUCA (서열번호 4)	표적 위치 1934
GEP-shRNA_A	GGACACUUCUGCCAUGAUAUCUCUCUAUCAUGGCAGAAGUGUCC (서열번호 5)	링커(UCUCUC) 전후 서열이 stem 구조를 이루어 이중 결합 가능
GEP-shRNA_B	GAGAGAUGUCCCCUGUGAUUCUCUCAUCACAGGGGACAUCUCUC (서열번호 6)
GEP-shRNA-C	UCUAAGGCCUUCCCUGUCAUCUCUCUGACAGGGAAGGCCUUAGA (서열번호 7)
GEP-shRNA	GGACACUUCUGCCAUGAUA ACCAGAUCUCUCUCUGGU UAUCAUGGCAGAAGUGUCC (서열번호 8)	링커 전후에 이중 결합이 가능한 보조 서열(ACCAGA/UCUGGU)이 삽입되어 안정적인 이중 결합 가능
GEP-shRNA2	GAGAGAUGUCCCCUGUGAUACCAGAUCUCUCUCUGGU AUCACAGGGGACAUCUCUC (서열번호 9)
GEP-shRNA3	UCUAAGGCCUUCCCUGUCAACCAGAUCUCUCUCUGGU UGACAGGGAAGGCCUUAGA (서열번호 10)

표 1에서 대표적으로 설명한 것과 같이, 본 발명의 안티센스 핵산은 19개의 염기를 갖는 서열번호 2 내지 서열번호 4의 짧은 간섭 RNA(siRNA)와, 이 짧은 간섭 RNA가 이중 결합을 형성할 수 있도록 링커 서열을 통하여 연결되는, 예를 들어 서열번호 5 내지 서열번호 10의 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)일 수 있다. shRNA를 형성하기 위한 링커 서열은 이른바 'loop'구조를 형성하기 위한 것이면 표 1에서 예시한 것에 한정되지 않는다. 따라서 본 발명에 따른 shRNA는 다른 적절한 링커 서열에 의해 생체내에서의 안정성이 향상된 shRNA로 변형될 수 있다.

특히, 표 1에서는 siRNA의 3' 말단에 연결되는 링커 서열을 통하여 siRNA 서열과 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드(상보적 올리고뉴클레오티드)가 결합된 shRNA를 설명하였으나, 반대로 siRNA의 5' 말단에 연결되는 링커 서열을 통하여 siRNA 서열과 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드가 결합된 shRNA도 가능하다.

아울러, 표 1의 서열번호 8 내지 서열번호 10에서 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 siRNA와 링커 서열 사이 또는 링커가 연결되지 않은 siRNA의 타단 쪽으로 예를 들어 1-10개, 바람직하게는 1-6개 정도의 염기(ACCAGA, 제 1 보조 올리고뉴클레오티드)를 추가하고, 이에 대응하여, siRNA와 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드와 링커 서열 사이 또는 링커가 연결되지 않은 상보적 올리고뉴클레오티드의 타단 쪽으로 전술한 제 1 보조 뉴클레오티드와 상보적으로 결합할 수 있는 염기(UCUGGU, 제 2 보조 올리고뉴클레오티드)를 추가한 shRNA도 본 발명에 따른 안티센스 핵산에 포섭될 수 있다.

이때, 본 발명의 안티센스 핵산으로서 전술한 서열번호 2 내지 4의 siRNA 또는 서열번호 5 내지 서열번호 10의 shRNA는 물론이고 이들의 생물학적 활성을 저하시키지 않는 변이를 가지는 기능적 등가물로서의 하나 이상의 염기가 치환, 삽입, 결실 및 이들의 조합을 갖는 변이체를 포함한다. 예를 들어, 이러한 변이체는 서열번호 2 내지 서열번호 4의 siRNA와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가질 수 있다. 이러한 상동성은 당업계에 널리 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예를 들어 Align 또는 BLAST 알고리즘 을 이용하여 뉴클레오티드의 서열을 표적 뉴클레오티드의 대응되는 부분과 비교하는 방법으로 쉽게 결정할 수 있다.

본 발명에 따른 안티센스 핵산의 제조 방법은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어 siRNA는 직접 화학적으로 합성하거나(Sui G et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:5515-5520, 2002), 시험관 내(in vitro) 전사를 이용하여 합성하거나(Brummelkamp TR et al., Science 296:550-553, 2002), 시험관 내(in vitro) 전사에 의해 합성된 긴 이중-가닥 RNA를 효소를 이용하여 절단하는 방법(Paul CP et al.,Nature Biotechnology 20:505-508, 2002), siRNA 발현 플라스미드나 바이러스성 벡터의 세포내 전달을 통한 발현법 (Lee NS et al., Nature Biotechnology 20:500-505, 2002) 및 PCR(polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트(cassette)의 세포 내 전달을 통한 발현법(Castanotto D et al., RNA 8:1454-1460, 2002) 등을 들 수 있다. siRNA를 제조하는 방법의 결정은 실험의 목적 및 표적 유전자 산물의 세포 생물학적 기능에 따라 달라질 수 있다.

2. 재조합 벡터 및 유전자 전달체

본 발명과 관련해서 전술한 안티센스 핵산을 직접 숙주 세포 내로 트랜스펙션(transfection)할 수도 있지만, 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터를 활용할 수 있다. 예를 들어 본 발명에 따른 siRNA 또는 적절한 링커 서열에 의하여 변형된 shRNA와 같은 안티센스 핵산이 적절한 벡터 내에 클로닝(cloning)될 수 있도록 삽입될 수 있다. 이러한 의미에서 본 발명에 따른 안티센스 핵산을 포함하는 재조합 벡터로서는 염색체, 에피솜 및 유도된 바이러스와 같은 수많은 발현 시스템이 사용될 수 있다. 보다 구체적으로 사용할 수 있는 재조합 벡터로는 세균성 플라스미드, 트랜스포존(transposon), 효모 에피솜, 삽입 인자, 효모 염색체 인자, 바큘로 바이러스와 같은 바이러스, SV40과 같은 유두종바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 아데노- 부속 바이러스, 레트로바이러스, 계두 바이러스, 가성광견병 바이러스로부터 유래한 것이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 재조합 벡터는 또한 코스미드 또는 파지미드 유도체일 수 있다.

만약, 벡터를 사용하는 경우에는 전사를 진행할 수 있는 강력한 프로모터(promoter)를 사용할 수 있으며, 원핵세포를 숙주로 하는 경우라면 벡터는 펩타이드로의 번역을 개시하기 위하여 리보솜 결합 위치(RBC) 및 전사/번역 종결 서열을 포함할 수 있다. 원핵세포를 대상으로 제작되는 벡터에 포함될 수 있는 프로모터로는 tac 프로모터, lac 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터 등 일반적으로 공지된 임의의 프로모터를 사용할 수 있다. 이와 같은 플라스미드 벡터로서는 shRNA을 cloning 하기 위해서 일반적으로 사용되는 플라스미드 벡터, 예를 들어, pSC101, pBR322, pUC19, pET-22, pcDNA 3.1, pGSH1-GFP 등을 사용할 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

반면, 진핵세포를 숙주로 하는 경우라면 포유동물 세포에서 유래된 프로모터(메탈로티아닌 프로모터) 라든가 포유동물 바이러스에서 유래된 프로모터를 사용할 수 있다. 다시 말하면, 본 발명의 벡터로서 바이러스를 사용하고자 하는 경우, 서열번호 2 내지 서열번호 4의 siRNA 또는 적절한 링커를 통하여 변형된 안티센스 핵산, 예를 들어 서열번호 5 내지 서열번호 10의 shRNA와 같은 안티센스 핵산이 백시니아(vaccinia) 또는 플로폭스(flowpox)와 같이 약독화된 바이러스는 물론이고 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(Adeno-assocated virus) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 무독성 탄저병 독소 벡터 등에 삽입된다. 이때, 예를 들어 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터 SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 HSV의 사 프로모터가 사용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다.

즉, 본 발명과 관련해서 서열번호 2 내지 서열번호 4 또는 적절한 링커 서열에 의하여 변형된 안티센스 핵산인 서열번호 5 내지 서열번호 10의 안티센스 핵산 분자를 숙주 세포 내로 전달시키기 위해 사용되는 벡터는 일종의 유전자 전달체로서, 목적하는 핵산 분자는 발현 조절 부위에 작동가능하게 연결된다. '작동가능하게 연결된(operably linked)'란, 목적하는 핵산의 발현 조절 부위(프로모터, 시그널 서열, 인핸서, 전사조절인자 결합 위치)와 다른 핵산 사이의 기능적인 결합을 의미한다.

따라서 본 발명에 따르면, 전술한 siRNA를 포함하는 안티센스 핵산을 숙주 세포 내로 도입할 수 있는 임의의 유전자 전달체를 포함하는데, 이 유전자 전달체는 예를 들어 naked 재조합 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터 또는 naked 재조합 핵산 또는 플라스미드를 내포하는 리포좀 또는 니오좀의 형태로 제작될 수 있으며, 바람직하게는 벡터의 형태이거나 naked 핵산의 형태이다.

한편, 본 발명에 따른 상술한 벡터를 안정적으로 발현시키기 위해서 당업계에서 통상적으로 사용되는 숙주 세포를 활용할 수 있다. 예를 들어 E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 츄린겐시스(Bacillus Thuringiensis, BT), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 진핵 세포로서의 숙주 세포에는 사카로미세 세레비시아(Saccharomyce cerevisiae)와 같은 yeast 세포, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다. 이 숙주 세포는 서열번호 2 내지 서열번호 4 또는 적절한 링커에 의해 변형된 안티센스 핵산을 합성할 수 있는 분리된 세포이거나 배양된 세포일 수 있다. 이 숙주 세포는 생식 세포이거나 체세포일 수 있으며, 줄기 세포 또는 분화된 세포일 수 있으며, 일례로 포유동물의 눈에서 유래된 세포일 수 있다.

한편, 본 발명에 따라 서열번호 2 내지 서열번호 4 및 적절한 링커 서열에 의하여 변형된 안티센스 핵산(예를 들어 서열번호 5 내지 서열번호 10)을 숙주 세포 내로 운반 또는 전달하기 위해서는 이미 공지된 다양한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어 서열번호 2 내지 서열번호 10의 안티센스 핵산을 naked 재조합 DNA의 형태로 직접 또는 플라스미드 벡터나 바이러스 벡터 등을 통해서 숙주 세포 내부로 운반하기 위해서는 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법 등을 통하여 핵산 분자를 세포내로 유입시킬 수 있다. 뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 기법으로서 또한 양이온성 리포좀을 사용하는 것을 고려해 볼 수 있다(Felgner, P.L. et al., Proc Natl Acad Sci USA 84：7413-7417 (1987)). . 상업적으로 구입할 수 있는 양이온성 지질 제제에는 Tfx 50 (Promega 사) 또는 Lipofectamin 2000 (Life Technologies 사) 등이 있다.

예를 들어 본 발명에 따른 벡터를 원핵세포인 숙주 세포 내부로 운반하기 위해서, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580 (1983)), 전기천공법(Dower,W.J. et al. Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145 (1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 반면, 숙주 세포가 진핵세포인 경우라면 칼슘포스페이트 침전법(Graham, F. L. & van der Eb, A. J. Virology 52: 456-467 (1973)), 전기 천공법(Neueumann, E., M. Schaefer-Ridder, Y. Wang, and P. H. Hofschneider, EMBO (Eur. Mol. Biol. Organ.) J. 1:841-845 (1982)), DEAE-덱스트란 처리법(GOPAL, T. V., Mol. Cell. Biol. 5: 1188-1190 (1985)), 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등의 방법을 사용할 수 있다.

3. 약학적 응용

본 발명의 다른 관점에 따르면 예를 들어 서열번호 2 내지 서열번호 4의 siRNA 또는 생체내에서의 안정성을 고려하여 적절한 링커 서열에 의하여 변형된 shRNA, 예를 들어 서열번호 5 내지 서열번호 10의 안티센스 핵산이 삽입된 유전자 전달체를 유효 성분으로 함유하는 약제학적 조성물을 또한 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 서열번호 2 내지 4의 안티센스 핵산 또는 적절한 링커 서열에 의하여 변형된 안티센스 핵산을 갖는 유전자 전달체 외에, 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다.

즉, 약학적 조성물로서 생명체에 투여하는 경우에는 서열번호 2 내지 서열번호 4 또는 적절한 링커 서열에 의하여 변형된 안티센스 핵산, 예를 들어 서열번호 5 내지 서열번호 10의 안티센스 핵산을 숙주 세포에 직접 투여하거나 이들 안티센스 핵산이 삽입된 재조합 벡터의 형태인 유전자 전달체로서 투여될 수 있다. 이때 재조합 벡터로는 전술한 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터가 사용된다. 이때, 본 발명에 따른 안티센스 핵산은 1 ~ 1000 pmol/㎖, 바람직하게는 30 ~ 500 pmol/㎖, 보다 바람직하게는 50 ~ 300 pmol/㎖의 농도로 약제학적 조성물에 포함될 수 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 '유효 농도'또는 '유효한 양'이란, 전술한 안티센스 핵산을 통하여 원하는 효과, 예를 들면 서열번호 2 내지 서열번호 4의 siRNA 및/또는 서열번호 5 내지 서열번호 10의 shRNA와 같은 안티센스 핵산이 주입(transfection)되지 않은 상태의 표적 유전자의 정상적인 발현 수준에 비하여 표적 유전자의 발현이 감소될 수 있는 충분한 양을 의미한다.

본 명세서에서 '약제학적으로 허용 가능한 담체'라는 용어는 당업계에서 알려진 다양한 담체를 의미한다. 통상적으로 사용되는 약제학적 담체를 채택하는 운반 시스템이 사용될 수 있다. 유입되는 약품 운반 시스템으로는 용액, 서스펜션, 겔, 마이크로스피어, 고분자 물질로서, 용해도-변성 물질(에탄올, 프로필렌글리콜, 수크로오스), 폴리머(폴리카프릴락톤, PLGA) 등을 포함한다.

결국, 본 발명의 다른 관점에 따르면 전술한 서열번호 2 내지 서열번호 4 또는 적절한 링커에 의해 변형된 안티센스 핵산 또는 이 안티센스 핵산이 삽입된 재조합 벡터 형태로서의 유전자 전달체를 유효 성분으로 포함하고, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 PEP의 과다 발현에 따른 질환을 치료, 예방할 수 있는 약제학적 조성물을 제공한다. 다시 말하면 이 약제학적 조성물은 유전자 치료의 하나로서 고려될 수 있다.

본 발명에 따라 약제학적 조성물에 함유되는 약제학적으로 허용되는 담체는 통상적으로 사용되는 물질을 사용할 수 있으며, 예를 들어 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 특히, 핵산 분자의 유전자 전달체로 사용되는 경우 주입되는 핵산 분자가 표적-세포로 도입되는 효율을 증가시킬 수 있는 리포좀, 바람직하게는 양이온성 리포좀을 담체로 사용할 수 있다.

약제학적으로 허용되는 부형제는 기술분야에 알려져 있으며 약학적 활성 물질의 투여를 용이하게 해주는 비교적 불활성인 물질이다. 예컨대, 부형제는 형상이나 점도를 부여할 수 있고 또는 희석제 역할도 할 수 있다. 적절한 부형제로는 안정화제, 보습제, 및 유화제, 오스몰 농도를 변화시킬 수 있는 염류, 캡슐화제제, 완충액, 피부침투 촉진제를 들 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

이때, 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액(suspension) 또는 유화액(emulsion) 형태는 물론이고, 엑스제, 분말제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

만약, 본 발명의 약제학적 조성물로 서열번호 2 내지 서열번호 4의 안티센스 핵산을 직접 숙주 세포에 트랜스펙션시키거나 또는 전술한 재조합 벡터의 형태로 트랜스펙션 시키는 경우에는 종래 알려진 제제 방법으로 제제화한 약품의 형태로 직접 투여할 수 있다. 이 때, 약제학적 조성물에는 전술한 안티센스 핵산 또는 재조합 벡터 외에도 살균수, 생리식염수, 인산완충액 및 배양액과 같은 담체 등을 적절하게 포함할 수 있다. 그 외 필요에 따라 완충액, 현탁액, 저장액, 계면 활성제 등을 포함할 수 있다. 이때, 안티센스 핵산 또는 재조합 벡터의 형태, 즉 유전자 전달체로서의 약제학적 조성물로 투여하는 경우 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 투여 시간, 투여 경로, 반응성 등과 같은 요인들에 의해 조정될 수 있으며 단일 투여 방법에 의하거나 여러 분 투여될 수 있다. 본 발명의 안티센스 핵산은 예를 들어 1 ~ 1000 pmole의 농도로 투여될 수 있으며, 며칠마다 1회 ~ 몇 개월마다 1회 투여될 수 있다. 통상의 기술자라면 적절한 투여량이나 투여 회수를 적절하게 선택할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 그래뉼린-에피테린-전구체(GEP)의 발현을 억제함으로써, GEP의 과다 발현에 의해 야기되는 질환, 암, 예컨대 간암과 같은 질병을 치료할 수 있다. 이 약제학적 조성물은 GEP의 과다 발현에 따른 질환을 치료하기 위한 치료제, 예컨대 항암제일 수 있다. 이 약제학적 조성물은 인간은 물론이고 생쥐, 쥐, 토끼, 개, 양, 염소, 돼지, 소, 말 등을 포함하는 포유류, 특히 상업적으로 중요한 동물 또는 가축 동물에 적용될 수 있다. GEP의 과다 발현에 따른 질환으로써 간세포암을 들 수 있지만, 본 발명이 꼭 이러한 질병에 한정되지는 않는다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물에는 항염증 물질, 진통제 등과 같은 다른 치료제를 함유할 수 있다.

따라서 본 발명의 다른 관점에서는 GEP의 과다 발현에 따른 질환을 가지는 숙주 세포에 전술한 안티센스 핵산을 직접 또는 안티센스 핵산이 포함된 재조합 벡터를 도입하는 방법으로 GEP의 과다 발현이 억제될 수 있는 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 이 숙주 세포는 서열번호 2 내지 서열번호 4 또는 적절한 링커에 의해 변형된 안티센스 핵산을 합성할 수 있는 분리된 세포이거나 배양된 세포일 수 있다. 이 숙주 세포는 생식 세포이거나 체세포일 수 있으며, 줄기 세포 또는 분화된 세포일 수 있으며, 일례로 포유동물의 눈에서 유래된 세포일 수 있다.

이하, 예시적인 실시예를 통해서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 결코 아니다.

실시예 1 : GEP cloning 및 발현 확인

(1) FC tagging된 GEP 유전자 Cloning

GEP를 mammalian cell에서 발현시켜, GEP 특이적인 siRNA/shRNA의 효능을 확인하기 위하여 FC가 tagged 된 GEP을 cloning 하였다. GEP에 tagging된 FC를 활용하여 실제 발현되는 GEP의 양을 ELISA로 손쉽게 측정 할 수 있을 것으로 생각되었다. 우선, 도 2a에 표시된 GEP 유전자의 염기 서열(서열번호 1)을 토대로, 도 2b에 도시되어 있는 pcDNA 3.1 vector 내의 플라스미드로 제한효소 Hind Ⅲ와 XhoⅠ을 사용하였고, secretion signal sequence, Human IgG FC sequence, GEP의 full gene을 삽입하였다. 이하, 설명의 편의를 위해서 FC/GEP가 삽입된 플라스미드를 pcDNA-GEP라고 설명하기로 한다.

GEP 유전자를 증폭하기 위해서 PCR을 수행하였다. template로 사용된 서열번호 1의 GEP를 증폭시키기 위하여 제한 효소가 인식하는 서열이 포함된 정방향 프라이머(gctcgaagcttgaccatgctctagtaaat; 서열번호 12)와 역방향 프라이머(cctgcactcgagtcatttacccgggga; 서열번호 13)를 사용하였다.

PCR 반응을 위하여, 10 X pfu buffer 5 ㎕, dNTP 1 ㎕, template 1 ㎕, 정방향 프라이머 1 ㎕, 역방향 프라이머 1 ㎕, pfu polymerase 1 ㎕, DW 40 ㎕이며 이것들을 잘 mix한 후 PCR를 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 2분을 먼저 수행한 후에 95 ℃에서 20초, 55 ℃에서 40초, 72 ℃에서 30초의 순서로 30 cycle을 한 뒤, 그 이후 72 ℃에서 5분간 enzyme inactivation을 하였다.

Enzyme cutting은 HindⅢ와 XhoⅠ을 이용하였다. 조성은 pcDNA3.1(+) vector 20 ㎕와 PCR 결과 산물 20 ㎕에 HindⅢ와 XhoⅠ을 각각 1 ㎕, 10 X NEB buffer 5 ㎕, D.W 23 ㎕를 mix하여 pcDNA3.1(+) vector는 37℃에서 3시간 동안 반응시켰으며, PCR 결과 산물은 37℃에서 5시간 동안 반응 시켰다.

Ligation을 위해 위의 enzyme 반응 결과 산물 중 vector : insert의 비가 1 : 3이 되도록 pcDNA3.1(+) 7 ㎕, insert(GEP, 서열번호 1) 7 ㎕, RBC rapid ligation Kit buffer A와 B 각각을 2 ㎕, T4 DNA ligase 1 ㎕를 mix하여 22℃에서 overnight 합성하였다. Ligation이 완료된 plasmid를 E. coli에 transformation 시키기 위하여competent DH5α 50 ㎕에 Ligation한 반응산물 20 ㎕를 mix 한 후 ice에서 20분간 반응시키고, 그 이후 42 ℃에서 45초 동안 heat shock을 준 후 다시 ice에서 20분 동안 반응시켰다. 그 이후 ampicillin이 첨가된 LB plate에 seeding하여 37 ℃에서 overnight 배양하였다. 배양 종료 후 plate에 자란 colony들을 ampicillin이 첨가된 LB broth media에 single colony를 접종하여 37℃에서 overnight 배양하였다. RBC사의 HiYield plasmid mini kit을 이용하여 plasmid를 추출하였다. 추출이 완료된 plasmid는 sequencing을 통해 원하는 유전자가 vector에 삽입되었는지 확인하였다.

(2) GEP 발현 확인

위에서 cloning된 GEP의 mammalian cell 내에서의 발현을 확인하기 위하여, 일반적으로 GEP가 발현되지 않는다고 알려진 CHO cell에 lipofectamine 2000을 이용하여 cloning한 pcDNA-GEP 2 ㎍을 transfection 하였다. Transfection 하고 24시간 후에 M-per buffer를 이용하여 cell 내의 protein을 추출하여 western blot을 수행하였다. Western blot은 8% SDS-gel에서 전기영동을 하였고, acrogranin이라는 antibody를 이용하였다. 도 3a에 도시한 것과 같이 CHO cell에 transfection 된 GEP-Human IgG FC가 98.5 kDa의 크기로 발현된 것을 확인하였다.

(2) ELISA 분석

GEP의 발현을 확인한 다른 방법은 Human IgG(FC) ELISA kit를 이용하였다. 이는 본 발명에서 GEP에 human IgG FC를 tagging하였기 때문에, GEP가 발현되면 IgG FC를 탐지함으로써 발현되는 GEP의 양을 측정할 수 있기 때문이다. 이를 위해서 Human IgG를 detection 하는 ELISA kit를 이용하였다. Human IgG ELISA Core Kit (KOMA BIOTECH)를 사용하여 ELISA 분석을 수행하였다. Na₂CO₃ 0.53 g, NaHCO₃ 0.42 g, D.W. 100 ㎖, pH 9.6의 coating buffer를 사용하였으며, 정제된 Goat anti-human IgG와 전술한 coating buffer를 1:1000의 비율로 affinity를 확인하였으며 희석된 Coating 항체 100 ㎕를 각각의 well에 coating하였다. Hep3B cell에 pcDNA-GEP 2 ㎍을 lipofectamine 2000을 이용하여 transfection하였다. Transfection하고 난 후 6, 12, 18, 24, 27, 30, 33, 48, 72시간에 cell의 media를 sampling하여 ELISA를 수행하였다. 본 실시예에 따른 측정 결과가 도 3b에 도시되어 있는데, 24시간 이후에 GEP이 발현이 지속적으로 증가하고 있음을 확인하였다.

실시예 2 : GEP 발현 억제를 위한 안티센스 핵산 규명

GEP에 대한 siRNA 서열은 문헌(Hui sun Lee et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 384: 431-35 (2009))에 기재된 방법에 따라 CAPSID 프로그램을 이용하여 검색하였다. CAPSID program으로 GEP에 대한 siRNA의 3개의 후보 부분을 찾았고 이에 대한 각각의 siRNA를 합성하였다. 설명의 편의를 위해서 이들 3개의 siRNA를 각각 GEP-siRNA1(GGACACUUCUGCCAUGAUA, 서열번호 2), GEP-siRNA2(GAGAGAUGUCCCCUGUGAU, 서열번호 3), GEP-siRNA3(UCUAAGGCCUUCCCUGUCA, 서열번호 4)로 표시하기로 한다. 이어서, 확인된 3개의 안티센스 핵산이 표적으로 하는 GEP mRNA의 2차 구조를 CAPSID program을 사용하여 분석하였다.

그 결과가 도 4에 표시되어 있다. 도 4에서 1이 GEP-siRNA1의 표적 부위, 2가 GEP-siRNA2의 표적 부위, 3이 GEP-siRNA3의 표적 부위에 대한 2차 구조이다. 도시된 것과 같이 본 발명에 따라 확인된 siRNA의 표적 부위에 루프(loop) 구조가 내재되어 있어 자유 에너지가 높을 것으로 예상되며, 본 발명에 따른 안티센스 핵산에 의한 RNAi가 용이하게 일어날 수 있을 것으로 기대되었다. 특히, GEP-siRNA1의 표적 위치는 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루는 생물학적 활성 부위일 가능성이 높아 RNAi 효과가 잘 나타나 GEP 발현 knock-down 효과가 잘 일어날 것으로 기대되었다.

실시예 3 : 안티센스 핵산으로서 siRNA의 효과

위 실시예 2에서 확인된 3개의 GEP-siRNA의 효과를 확인하기 위해서 Hep3B cell을 사용하여 GEP의 발현 억제 정도를 확인하였다. Hep3B cell에 pcDNA-GEP 2 ㎍과 GEP-siRNA1/GEP-siRNA2/GEP-siRNA3 각 100 pmol/㎖을 각각 co-transfection 하고 난 후, 24, 48, 72시간에 cell의 media를 sampling하여 Human IgG(FC) ELISA kit를 이용하여 pcDNA-GEP의 양을 detection하였다. GEP-siRNA1, GEP-siRNA2, GEP-siRNA3 모두 GEP의 발현을 억제하였으며, 특히 GEP-siRNA1이 GEP의 발현을 억제하는데 가장 큰 효과를 나타내는 것을 확인하였다. GEP-siRNA1는 72시간 후에 GEP를 transfection한 것보다 GEP의 level을 38배나 감소시켰다(도 5a).

계속해서, GEP-siRNA 농도에 따른 GEP specific siRNA의 효능을 확인하기 위해서 Hep3B cell에 pcDNA-GEP 2 ㎍과 GEP-siRNA1의 양을 10, 50, 100, 200 pmol/㎖로 다른 농도로 co-transfection 하고 난 후 24, 48, 72시간에 cell의 media를 sampling하여 Human IgG(FC) ELISA kit를 이용하여 pcDNA-GEP의 양을 detection하였다. 사용된 siRNA의 농도에 비례하여 GEP의 발현이 억제된 것을 확인하였다(도 5b).

실시예 4 : shRNA 형태의 GEP 발현 억제

siRNA의 불안정성을 보안하기 위해 GEP-siRNA1의 sequence를 이용하여 shRNA를 합성하였다. 이를 위해서 pENTR™ H1/TO(3869 bp) 벡터에 서열번호 8과 같이 링커 서열과 안정성을 향상시키기 위한 보조 올리고뉴클레오티드(이하, GEP-shRNA)를 삽입하였다. 합성된 GEP-shRNA가 GEP-siRNA와 동일한 효과를 보이는지를 확인하기 위해서, 위 실시예 3과 동일하게 Hep3B cell에 pcDNA-GEP 2 ㎍과 GEP-shRNA1 2 ㎍을 co-transfection하고, 24, 48, 72시간 후에 cell의 media를 sampling하여 human IgG(FC) ELISA kit를 이용하여 GEP의 발현 정도를 측정하였다. 실시예 3에서 확인한 siRNA와 마찬가지로, 본 실시예에 따라 합성된 shRNA 역시 GEP의 발현을 억제하는 것을 확인하였다(도 6a).

이어서, GEP-shRNA의 농도에 따른 GEP의 발현 억제 정도를 확인하기 위해서, 실시예 3과 마찬가지로 Hep3B cell에 pcDNA-GEP 2 ㎍과 GEP-shRNA의 양을 0.1, 0.5. 1.0. 2.0 ㎍으로 다르게 하여 co-transfection 한 후, 24, 48, 72시간 경과 후의 cell의 media를 sampling하여 Human IgG(FC) ELISA kit를 이용하여 pcDNA-GEP의 발현 정도를 측정하였다. shRNA 역시 농도 의존적인 형태로 GEP의 발현을 억제한다는 점을 확인하였다 (도 6b).

실시예 5 : GEP-shRNA의 endogenous한 GEP 억제 효과

실시예 4에서 합성한 GEP-shRNA가 endogenous하게 cell 내에 존재하는 GEP mRNA의 level을 감소시키는지를 확인하기 위해서 GEP를 지속적으로 발현시키는 Hep3B cell에 GEP-shRNA를 transfection하여 실시간 PCR을 통해 GEP mRNA의 level을 확인하였다.

Hep3B cell 내에 실시예 4에서 합성한 GEP-shRNA 2 ㎍을 transfecton한 cell과 GFP를 transfection cell 에서 TRI sol LS reagent method를 이용하여 RNA를 추출하였다. 우선, 6-well plate에서 한 well 당 TRI sol LS reagent 500 ㎕ 넣은 후 tapping 한 후 상온에서 5분간 반응시킨 후, chloroform 135 ㎕를 넣고 15초 동안 vortexing 후, 상온에서 10분간 반응시켰다. 그 후 12000g, 4℃, 15분 동안 centrifuge하고 투명한 상층액을 새로운 tube에 옮긴 후 isopropyl alcohol 333 ㎕를 넣고 veotexing 후, 상온에 10분간 반응시켰다. 그 후 다시 한 번 12000g, 4℃, 10분 동안 centrifuge하고 상층액을 버리고 pellet을 DEPC 처리되어있는 D.W를 이용하여 만든 70% 에탄올 400ul로 washing 한 후에 7500g, 4 ℃, 5분간 centrifuge한 후에 상층액을 제거하고 pellet을 건조 시킨 후 DEPC가 처리된 D.W 20ul로 RNA를 suspension시켰다.

RNA를 cDNA로 합성하기 위에서 cell 내에서 추출한 RNA 5 ㎕에 oligoDT primer 1 ㎕, DTT 2 ㎕, D.W 4 ㎕를 섞은 후 PCR 기계에서 70℃ 5min 간 반응시킨 후 RT&GO enzyme 8ul를 투여 후 42℃ 1시간 동안 반응시킨다. 그 이후 enzyme inactivation을 위해 70 ℃에서 15분 동안 반응시켰다.

합성된 cDNA를 이용하여 real-time PCR을 수행하기 위하여 합성된 cDNA 1 ㎕, GEP 정방향 프라이머(tccacgtgctgtgttatggt, 서열번호 14)/역방향 프라이머(ctgccctgttagtcctctgg, 서열번호 15) 각각 1 ㎕, D.W 9.5 ㎕, SYBR 12.5 ㎕를 잘 섞어서 실시예 1과 동일한 절차에서 실시간 PCR을 수행하였다. 측정 결과가 도 7에 표시되어 있는데, 본 발명에 따른 GEP-shRNA를 transfection한 것이 GEP의 mRNA level을 4배 감소시키는 결과를 확인하였다.

실시예 6 : shRNA의 liver cancer cell growth 억제 효과

GEP는 liver cancer의 growth factor로 작용하므로 GEP에 대한 발현을 억제하기 위해 GEP-shRNA를 liver cancer cell line에 transfection하여 cell의 cell의 growth를 확인하는 실험을 수행하였다. 이를 위해서 다음과 같은 세 종류의 세포군을 사용하였다. 간암 세포주인 Hep3B cell을 이용하여 GEP가 계속해서 발현되도록 만든 1) GEP expressed stable cell line, 2) 일반적인 Hep3B cell에 transfection control로 GFP를 transfection한 군, 3) 실험군으로 Hep3B cell에 GEP-shRNA를 transfection한 후, 1, 3, 5일에 남아 있는 cell을 triphan blue로 염색하고 Haemacytometer를 이용하여 counting하여 세포 성장을 비교하였다.

본 실시예에 따른 세포 성장 억제 효과 측정 결과가 도 8에 표시되어 있다. 3일째부터 GEP stable cell line에서 가장 빠르게 세포 성장이 일어나는 것을 관찰하였으며, transfection control로 GFP를 사용한 세포군과 아무런 처리를 하지 않은 Mock Hep3B 세포군에서 그 다음으로 세포 성장이 일어났으며, GEP-shRNA를 transfection한 cell은 growth가 느리다는 것을 확인하였다(도 8). 이러한 결과는, 본 발명에 따른 안티센스 핵산이 liver cancer의 성장을 억제할 수 있다는 것을 의미한다.

실시예 7 : in vivo에서 GEP-shRNA의 tumor volume 감소

Balb/c 유래의 nude mice의 대퇴부에 1 × 10⁷ Hep3B cell을 피하주사(subcutaneous injection)하여 10일 후에 tumor 형성을 확인한 상태에서 본 발명에 다른 안티센스 핵산에 의한 tumor volume 감소 정도를 측정하였다.

tumor가 형성된 마우스를 대상으로 위에서 합성된 GEP-shRNA 30 ㎍을 intratumoral injection 한 뒤, 50 mV의 전압으로 8회 electroporation의 전기충격을 주었다. injection 한 후 매일 tumor의 size를 측정하였다(도 7a). 아울러, GEP-shRNA와 NC로서 Luciferase-shRNA(제롤루션사 제공)를 비교하였다. 본 실시예에 따른 측정 결과가 도 9a 내지 도 9c에 도시되어 있다.

도 9a 내지 도 9b에 도시된 것과 같이, 본 발명에 따른 안티센스 핵산의 하나인 GEP-shRNA를 injection한 mice의 tumor growth는 Luciferase-shRNA를 injection한 mice의 tumor보다 growth가 감소되는 것을 확인하였다. 특히, 도 9c에 도시된 것과 같이, negative control과 상대적인 tumor volume을 비교한 결과 GEP-shRNA injection 후 8일째에 2 배 이상의 사이즈 차이가 생긴다는 것을 확인하였으며 31일까지 지속적으로 관찰한 후 최종적인 tumor size는 더 차이가 생기는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따라 합성된, GEP 특이적인 안티센스 핵산은 GEP에 의하여 야기되는 간암의 성장을 억제할 수 있는 물질로 활용될 수 있을 것으로 판단되었다.

실시예 8 : GEP-shRNA의 간암 세포 cell cycle arrest 확인

본 실시예에서는 본 발명에 따라 합성된 안티센스 핵산(GEP-shRNA)이 간암 세포주의 세포 주기에 영향을 미치는지의 여부를 확인하였다. 간암의 성장인자로 알려진 GEP의 knockdown이 간암세포의 cell cycle과의 관계를 확인하기 위해서 propidium iodide(PI) staining을 하여 FACS로 분석하였다.

Hep3B cell에 pcDNA-GEP, GEP-shRNA, Luciferase-shRNA를 각 2 ㎍씩 lipofectamin2000을 이용하여 transfection하고 5일 후에 sampling을 하였다. cell의 배양액을 걷어내고 PBS로 2번 washing한 후 trypsin 200 ㎕ 처리한 후 cell을 harvest 한 후 ep-tube에 넣었다. 그 후에 4000 rpm에서 2 분 동안 centrifuge 한 후 상층액을 버리고 PBS로 washing 하고 다시 4000 rpm에서 2 분 동안 centrifuge 한 후 상층액을 버렸다. 그 후 70% 에탄올 200 ㎕를 cell에 넣고 pipettng을 한 후 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 후에 4000 rpm에서 2 분 동안 centrifuge 한 후 상층액을 버리고 PBS로 70% 에탄올을 washing하고 4000 rpm에서 2 분 동안 centrifuge 한 후 상층액을 버렸다. 그 다음 PI stainign solution 500 ㎕를 cell에 treat한 후에 호일로 빛을 차단하고 15분간 반응시키고, FACS를 통해서 분석하였다.

본 실시예에 따른 결과가 도 10에 표시되어 있다. Negative control로 사용한 Luciferase-shRNA를 transfection한 cell과 비교하였을 때 pcDNA-GEP를 transfection한 cell에서는 G0/G1기가 늘어나고 M기가 줄어든 반면에 GEP-shRNA를 transfection한 cell에서는 G0/G1기가 줄어들고 S기와 G2/M기가 늘어나는 것을 확인 하였다. 따라서 GEP-shRNA를 통한 GEP의 knockdown이 cell cycle을 arrest를 일으키는 것을 확인하였다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 기초하여 본 발명을 설명하였으나, 본 발명이 전술한 실시예로 한정되는 것은 아니다. 오히려, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 전술한 실시예에 기초하여 본 발명에 대한 다양한 변형과 변경을 용이하게 생각해 낼 수 있을 것이다. 하지만, 그와 같은 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 사실은, 후술하는 청구의 범위를 통해서 분명해질 것이다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Anti-Sense Nucleic Acid of Inhibiting Expression of Granulin-Epitherin-Precursor Gene and Pharmaceutical Composition Containing Thereof <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2111 <212> DNA <213> Grnauline-Epitherin-Precursor <400> 1 caggcagacc atgtggaccc tggtgagctg ggtggcctta acagcagggc tggtggctgg 60 aacgcggtgc ccagatggtc agttctgccc tgtggcctgc tgcctggacc ccggaggagc 120 cagctacagc tgctgccgtc cccttctgga caaatggccc acaacactga gcaggcatct 180 gggtggcccc tgccaggttg atgcccactg ctctgccggc cactcctgca tctttaccgt 240 ctcagggact tccagttgct gccccttccc agaggccgtg gcatgcgggg atggccatca 300 ctgctgccca cggggcttcc actgcagtgc agacgggcga tcctgcttcc aaagatcagg 360 taacaactcc gtgggtgcca tccagtgccc tgatagtcag ttcgaatgcc cggacttctc 420 cacgtgctgt gttatggtcg atggctcctg ggggtgctgc cccatgcccc aggcttcctg 480 ctgtgaagac agggtgcact gctgtccgca cggtgccttc tgcgacctgg ttcacacccg 540 ctgcatcaca cccacgggca cccaccccct ggcaaagaag ctccctgccc agaggactaa 600 cagggcagtg gccttgtcca gctcggtcat gtgtccggac gcacggtccc ggtgccctga 660 tggttctacc tgctgtgagc tgcccagtgg gaagtatggc tgctgcccaa tgcccaacgc 720 cacctgctgc tccgatcacc tgcactgctg cccccaagac actgtgtgtg acctgatcca 780 gagtaagtgc ctctccaagg agaacgctac cacggacctc ctcactaagc tgcctgcgca 840 cacagtgggg gatgtgaaat gtgacatgga ggtgagctgc ccagatggct atacctgctg 900 ccgtctacag tcgggggcct ggggctgctg cccttttacc caggctgtgt gctgtgagga 960 ccacatacac tgctgtcccg cggggtttac gtgtgacacg cagaagggta cctgtgaaca 1020 ggggccccac caggtgccct ggatggagaa ggccccagct cacctcagcc tgccagaccc 1080 acaagccttg aagagagatg tcccctgtga taatgtcagc agctgtccct cctccgatac 1140 ctgctgccaa ctcacgtctg gggagtgggg ctgctgtcca atcccagagg ctgtctgctg 1200 ctcggaccac cagcactgct gcccccaggg ctacacgtgt gtagctgagg ggcagtgtca 1260 gcgaggaagc gagatcgtgg ctggactgga gaagatgcct gcccgccggg cttccttatc 1320 ccaccccaga gacatcggct gtgaccagca caccagctgc ccggtggggc agacctgctg 1380 cccgagcctg ggtgggagct gggcctgctg ccagttgccc catgctgtgt gctgcgagga 1440 tcgccagcac tgctgcccgg ctggctacac ctgcaacgtg aaggctcgat cctgcgagaa 1500 ggaagtggtc tctgcccagc ctgccacctt cctggcccgt agccctcacg tgggtgtgaa 1560 ggacgtggag tgtggggaag gacacttctg ccatgataac cagacctgct gccgagacaa 1620 ccgacagggc tgggcctgct gtccctaccg ccagggcgtc tgttgtgctg atcggcgcca 1680 ctgctgtcct gctggcttcc gctgcgcagc caggggtacc aagtgtttgc gcagggaggc 1740 cccgcgctgg gacgcccctt tgagggaccc agccttgaga cagctgctgt gagggacagt 1800 actgaagact ctgcagccct cgggacccca ctcggagggt gccctctgct caggcctccc 1860 tagcacctcc ccctaaccaa attctccctg gaccccattc tgagctcccc atcaccatgg 1920 gaggtggggc ctcaatctaa ggccttccct gtcagaaggg ggttgtggca aaagccacat 1980 tacaagctgc catcccctcc ccgtttcagt ggaccctgtg gccaggtgct tttccctatc 2040 cacaggggtg tttgtgtgtg tgcgcgtgtg cgtttcaata aagtttgtac actttcaaaa 2100 aaaaaaaaaa a 2111 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA to granulin-epithelin-precursor <400> 2 ggacacuucu gccaugaua 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA to granulin-epithelin-precursor <400> 3 gagagauguc cccugugau 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA to granulin-epithelin-precursor <400> 4 ucuaaggccu ucccuguca 19 <210> 5 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA to granulin-epithelin-precursor <400> 5 ggacacuucu gccaugauau cucucuauca uggcagaagu gucc 44 <210> 6 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA to granulin-epithelin-precursor <400> 6 gagagauguc cccugugauu cucucaucac aggggacauc ucuc 44 <210> 7 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA to granulin-epithelin-precursor <400> 7 ucuaaggccu ucccugucau cucucugaca gggaaggccu uaga 44 <210> 8 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA to granulin-epithelin-precursor <400> 8 ggacacuucu gccaugauaa ccagaucucu cucugguuau cauggcagaa gugucc 56 <210> 9 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA to granulin-epithelin-precursor <400> 9 gagagauguc cccugugaua ccagaucucu cucugguauc acaggggaca ucucuc 56 <210> 10 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA to granulin-epithelin-precursor <400> 10 ucuaaggccu ucccugucaa ccagaucucu cucugguuga cagggaaggc cuuaga 56 <210> 11 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA106578 commercial siRNA <400> 11 cacaagccuu gaagagaga 19 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying granulin-epithelin-precursor <400> 12 gctcgaagct tgaccatgct actagtaaat 30 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying granulin-epithelin-precursor <400> 13 cctgcactcg agtcatttac ccgggga 27 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Real-time PCR Forward primer for amplifying GEP cDNA <400> 14 tccacgtgct gtgttatggt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Real-time PCR Reverse priemr for amplifying GEP cDNA <400> 15 ctgccctgtt agtcctctgg 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Real-time PCR for amplifying 18s rRNA <400> 16 aactttcgat ggtagtcgcc g 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Real-time PCR Reverse primer for amplifying 18s rRNA <400> 17 ggatgtggta gccgtttctc a 21

Claims (10)

1. ⅰ) 서열번호 3 내지 서열번호 4로 구성되는 군에서 적어도 하나 선택되는 염기 서열을 가지는 짧은-간섭 RNA(short-interfering RNA, siRNA), 또는
   ⅱ) 서열번호 3 내지 서열번호 4에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열의 5' 말단 쪽 또는 3'말단 쪽으로 연결되는 링커 서열을 통하여 서열번호 3 내지 서열번호 4의 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드(상보적 올리고뉴클레오티드)가 상기 짧은-간섭 RNA와 연결되어 있는 짧은-헤어핀 RNA(short-hairpin RNA, shRNA)로 구성되는,
   그래뉼린-에피테린-전구체(Granulin-Epithelin precursor, GEP)의 발현을 억제하는 안티센스 핵산.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 짧은-헤어핀 RNA는, 상기 짧은-간섭 RNA의 일 끝단으로 연결되는 1-20개의 올리고뉴클레오티드(제 1 보조 올리고뉴클레오티드)와, 상기 상보적 올리고뉴클레오티드의 일 끝단으로 연결되며 상기 제 1 보조 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드(제 2 보조 올리고뉴클레오티드)를 더욱 가지는 안티센스 핵산.
   
3. 제 1항에 있어서,
   상기 짧은-헤어핀 RNA는 서열번호 6 내지 서열번호 10으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 구성되는 안티센스 핵산.
   
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나의 항에 기재된 안티섹스 핵산이 삽입되어 있는 재조합 벡터.
   
5. 제 4항에 있어서,
   상기 재조합 벡터는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
   
6. 제 5항에 있어서,
   상기 바이러스 벡터는 바큘로 바이러스, SV40 바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 아데노- 부속 바이러스, 레트로바이러스, 계두 바이러스, 가성광견병 바이러스 유래의 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
   
7. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나의 항에 기재되어 있는 안티센스 핵산을 유효 성분으로 함유하는 간암을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
   
8. 제 4항에 기재되어 있는 재조합 벡터를 유효 성분으로 함유하는 간암을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
   
9. 삭제
10. 삭제

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