KR101522729B1 - 파골세포 융합의 새로운 바이오 마커인 piro - Google Patents

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Abstract

본 발명은 파골세포 융합의 새로운 바이오 마커인 PIRO(Progranulin induced receptor like gene during Osteoclastogenesis)에 관한 것으로, 구체적으로 골다공증을 유발하는 파골세포의 융합에 관여하는 인자로 PIRO를 새롭게 발굴함에 따라 이의 억제제를 유효성분으로 하여 골다공증을 예방하거나 치료하고, 이 PIRO를 유효성분으로 하여 파골세포의 융합을 유도하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 PIRO는 RANK 신호전달계에서 중요한 축을 이루고, 파골세포의 융합과 골흡수(bone resorption)의 후기 단계 인자로서 프로그래뉼린의 직접적인 유도유전자이므로, PIRO를 바이오마커로 사용하여 새로운 골다공증 예방 또는 치료제 개발, 또는 골다공증 진단, 치료 결과 또는 예후 평가에 유용하게 사용할 수 있으며, PIRO 억제제를 사용하면 골다공증을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

파골세포 융합의 새로운 바이오 마커인 PIRO{The PIRO as a new biomarker for osteoclast fusion}
본 발명은 파골세포 융합의 새로운 바이오 마커인 PIRO(Progranulin induced receptor like gene during Osteoclastogenesis)에 관한 것으로, 구체적으로 골다공증을 유발하는 파골세포의 융합에 관여하는 인자로 PIRO를 새롭게 발굴함에 따라 이의 억제제를 유효성분으로 하여 골다공증을 예방하거나 치료하고, 이 PIRO를 유효성분으로 하여 파골세포의 융합을 유도하는 조성물에 관한 것이다.
우리의 뼈는 조골세포(osteoblasts)와 파골세포(osteoclasts)의 분화와 양적인 균형, 및 미네랄의 축적으로 만들어진 견고한 골격(scaffold) 역할을 한다. 여성의 폐경 이후 에스트로젠의 양적 감소는 잘 알려진 것과 같이 파골세포의 분화를 촉진하여 골밀도의 감소를 가져와서 골다공증(osteoporosis)을 야기한다. 이런 기전은 생체내(in vivo) 및 시험관내(in vitro) 동물모델에서 재현이 잘 된다.
성숙된 파골세포는 각 세포의 핵이 세포융합에 의해 다핵체 세포로 변화하고 엑틴고리(actin ring)로 융합된 세포들이 묶인 형태로 기존의 뼈 조직을 파괴하여 골다공증을 유발한다. 파골세포의 전구체(progenitors) 세포는 골수성 세포 계열(myeloid cell lineage)에 속하여 골수세포에 M-CSF(macrophage-colony stimulating factor)를 처리하면 전구세포(preosteoclast) 및 대식세포(macrophages)로 분화하고, 파골세포 분화의 마스터 조절자(master regulator)인 RANK-리간드(RANKL)를 처리하면 수용체인 RANK에 결합하여 다양한 신호전달을 만들어서 세포안의 칼슘 오실레이터(oscillator)의 변화로 인한 Ca2+-의존 키나아제(Ca2+-dependent kinase)의 활성화를 통한 전사인자 NFAT-c1을 활성화하여 파골세포 분화에 필요한 여러 단백질 발현의 완성에 이르게 한다. 또한 TGF-β, IGF, IFN-γ, TNF-α 및 SemaD와 같이 조골세포 또는 파골세포에서 발현하여 파골세포의 분화의 양과 속도를 조절하는 cell-communication(coupling) factors들도 RANKL과 같이 작용하여 항상성과 병적상태에서 파골세포의 분화와 사멸을 조절한다.
프로그래뉼린(Progranulin)은 12개의 "시스테인 풍부 모티프(cysteine-rich motif)"로 구성된 7개 반의 그래뉼린(granulin, Grn) 도메인으로 구성된 88kD의 당 단백질이다. 인간 프로테옴 지도(the human proteome atlas)에서는 혈청 또는 혈장에서 80kD 당화 단백질(glycosylated protein)로 존재한다. 몇 개의 그룹에서 프로에피셀린(proepithelin) 및 PC 세포-유래 성장 인자 등으로 발견되어 불렸지만 HUGO의 정식 명칭은 "GRN"이다.
그래뉼린(granulin peptide)은 백혈구에서 분비되는 펩타이드로 처음 발견되었다(Bateman et.al., BBRC, 1990). 지금까지 그래뉼린의 기능에 대하여, 상처 치유 인자(wound-healing factor)로서 작용하는 것이 보고되었으며(Bateman et. al., Nature Medicine, 2003), 또한 신경 성장 인자(Neuronal growth factor)로서 작용하는 것이 보고되었다(Bateman et. al., BMC Neuroscience, 2009; 및 Van Damme et, al., JCB, 2008). 또한, 그래뉼린은 타우 부정적 계열의 전측두엽성치매(tau-negative familial FTD)의 원인 유전자(Baker & Cruts et. al., Nature, 2006)이고, 물질 대사 호르몬(Metabolic hormone)(Youn et. al., Diabetes, 2009)이며, 식욕 억제 호르몬(Kim et al., Endocrinology, 2011)이고, 인슐린 저항성 인자(Matsubara et. al., Cell Metabolism, 2012)라는 것이 보고되었다.
최근 본 발명자들은 실험을 통해 프로그래뉼린이 RANK-의존적인 세포 신호 인자(cell-communication factor)로 작용하고 LPS 같은 염증유발을 통한 골다공증에서 매개 인자로 작용하며, 인간의 경우 전립선암 환자, 골다공증 환자 및 침대에 오래 누워 있어서 골밀도가 떨어진 환자의 혈청에서 대조군에 비해 현저히 높은 농도로 존재하는 것을 확인함으로써, 프로그래뉼린이 파골세포 분화 인자(Osteoclast Differentiation Factor)이며, 골다공증 바이오마커 또는 전립선 암의 혈청 바이오마커인 것을 밝혔으며, 이를 통해 프로그래뉼린 억제제를 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물에 관해 특허출원한 바 있다.
이에, 본 발명자들은 프로그래뉼린 이외에 다른 새로운 골다공증 바이오마커를 발굴하고자 하였으며, 파골세포 분화과정에서 프로그래뉼린에 의해 발현 수준이 크게 상승(약 20배)하는 유전자(Progranulin-Induced Receptor-like molecule during Osteoclastogenesis, PIRO)를 발굴하였다. 사람과 쥐의 세포를 대상으로 한 생체내 및 생체외 실험을 통해 PIRO가 RANK 신호전달계에서 중요한 축을 이루고, 파골세포의 융합과 골흡수(bone resorption)의 후기 단계 인자로서 프로그래뉼린의 직접적인 유도유전자임을 확인하였으며, PIRO가 파골세포 융합 인자로써 골다공증 바이오마커인 것을 밝힘으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
Bateman et. al., Biochem Biophys Res Commun., 1990 Dec 31; 173(3): 1161-8. Bateman et. al., Nat Med., 2003 Feb; 9(2): 225-9. Bateman et. al., BMC Neurosci., 2009 Oct 27; 10: 130. Van Damme et, al., J Cell Biol., 2008 Apr 7; 181(1): 37-41. Youn et. al., Diabetes., 2009 Mar; 58(3): 627-36. Kim et al., Endocrinology., 2011 Dec; 152(12): 4672-82.
본 발명의 주된 목적은 PIRO를 골다공증에 대한 바이오마커로 사용하고, 파골세포 융합 인자로 사용하는 용도를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 갖고 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질의 억제제를 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[서열번호 1] PFSVF LAIFH VLKCV FLIFR DFQFS RHIPG PSVCI SHFSR FLVIS SFFKS
[서열번호 2] FSLXF SFLAI XHVLQ WTFLN FPPFS VFLAI FXVLK CVFLI FRDFQ XSRHI PGPSV CISHF XRFLV ISXFF KSSSX CFSFS MIFSF LAIFH VLQWT FLNXP PF
[서열번호 3] FXVVK WMFLI FHDFQ FS
(X = 모든 종류의 아미노산)
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 갖고 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질의 억제제를 유효성분으로 함유하는 파골세포(osteoclasts) 융합 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 피검 개체로부터 분리된 혈액, 혈장 또는 혈청으로부터 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 갖고 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질의 mRNA 또는 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
2) 상기 단백질의 mRNA 또는 상기 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 증가한 개체를 선별하는 단계;를 포함하는 골다공증 진단, 치료 결과 또는 예후 평가의 정보를 제공하기 위한 단백질 발현 수준의 측정 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 갖고 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질에 결합하는 항체, 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 상보적인 핵산, 및 상기 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 골다공증 진단, 치료 결과 또는 예후 평가용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 피검 조성물 또는 화합물을 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 갖고 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질 발현 세포주에 처리하는 단계;
2) 상기 세포주의 상기 단백질의 mRNA 또는 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
3) 상기 단백질의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검 조성물 또는 화합물을 선별하는 단계;를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 피검 조성물 또는 화합물을 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 갖고 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질 발현 세포주에 처리하는 단계;
2) 상기 세포주의 상기 단백질의 mRNA 또는 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
3) 상기 단백질의 mRNA 또는 상기 단백질의 발현 수준이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검 조성물 또는 화합물을 선별하는 단계;를 포함하는 파골세포 융합 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 갖고 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 파골세포 융합 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면 PIRO는 RANK 신호전달계에서 중요한 축을 이루고, 파골세포의 융합과 골흡수(bone resorption)의 후기 단계 인자로서 프로그래뉼린의 직접적인 유도유전자이므로, PIRO를 바이오마커로 사용하여 새로운 골다공증 예방 또는 치료제 개발, 또는 골다공증 진단, 치료 결과 또는 예후 평가에 유용하게 사용할 수 있으며, PIRO 억제제를 사용하면 골다공증을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 쥐 골수세포(mouse bone marrow cells, MBMC)(A), 인간 골수세포 (human bone marrow cells, HBMC)(B) 및 인간 백혈구(C)의 파골세포 분화를 유도하는 과정에서 프로그래뉼린(PGRN)의 처리에 따른 파골세포의 형성 정도를 분석한 결과이다.
도 2는 PGRN의 처리에 따른 F-actin 유도 및 actin-ring 형성 촉진과 골흡수(bone-resorption) 양상을 분석한 결과이다.
도 3은 조골세포 분화에서 PGRN의 효과를 분석한 결과이다.
도 4는 쥐 골수세포의 파골세포 분화를 유도하는 과정에서 내생성(endogenous) PGRN의 양상을 분석한 결과이다.
도 5는 쥐 골수세포의 PGRN을 낙다운하고 이에 따른 효과를 분석한 결과이다.
도 6은 쥐 골수세포의 파골세포 분화를 유도하는 과정에서 PGRN 낙다운에 따른 c-Fos, NFATc1, TRAP, OSCAR 및 PGRN의 발현 양상을 분석한 결과이다.
도 7은 LPS 처리 또는 OVX 생쥐 모델, 인간 골다공증환자 및 오랜 침대환자에서 serum PGRN 농도를 분석한 결과이다.
도 8은 쥐 골수세포의 파골세포 분화를 유도하는 과정에서 PGRN에 따른 유전자의 발현 양상을 분석한 결과이다.
도 9는 쥐 PIRO 단백질(mPIRO-1, GM10800)의 아미노산 서열과 생체막에서의 구조를 나타낸 것이다.
도 10은 인간 PIRO 유전자의 cDNA 서열과 PIRO 단백질의 아미노산 서열 및 생체막에서의 구조를 나타낸 것이다.
도 11은 쥐의 PIRO 유전자군과 인간 PIRO 유전자의 phylogeny tree 및 아미노산 서열의 alignment 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 쥐 골수세포와 인간 골수세포의 파골세포 분화를 유도하는 과정에서 PGRN 낙다운에 따른 PIRO의 발현 양상을 분석한 결과이다.
도 13은 쥐 골수세포의 파골세포 분화를 유도하는 과정에서 PIRO 낙다운에 따른 MNC 형성을 분석한 결과이다.
도 14는 인간 골수세포의 파골세포 분화를 유도하는 과정에서 PIRO 낙다운에 따른 MNC 형성을 분석한 결과이다.
도 15는 본 발명에서 예측된 RANKL/RANK axis에서 PGRN과 PIRO의 기능을 나타내는 모식도이다.
이하, 본 발명은 상세하게 설명한다.
본 발명에서는 파골세포의 분화 호르몬(hormone)이며 골다공증의 중요한 바이오마커인 프로그래뉼린(Progranulin, PGRN)에 의해 발현 수준이 상승(약 20배)하는 PIRO 유전자 및 단백질을 발굴하였으며, 이 PIRO가 파골세포의 융합과 골흡수(bone resorption)의 매우 중요한 인자임을 밝혔다. 이에 따라 PIRO를 억제하면 파골세포의 융합과 골흡수를 억제할 수 있고, 골다공증의 예방 또는 치료가 가능하게 되며, PIRO의 발현 수준을 확인함으로써 골다공증 진단, 치료 결과 또는 예후를 평가할 수 있고, PIRO를 억제하는지의 여부를 조사함으로써 골다공증 예방 또는 치료제, 및 파골세포 융합 억제제를 스크리닝할 수 있으며, PIRO를 유효성분으로 하여 파골세포의 융합을 유도할 수 있는 것이다.
본 발명은 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 갖고 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질의 억제제를 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단백질의 억제제를 유효성분으로 함유하는 파골세포 융합 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명에서 상기 단백질은 PIRO 단백질이라 하며, PIRO 단백질을 암호화하는 유전자는 PIRO 유전자라 한다.
PIRO 단백질은 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하나 이에 한정되지는 않으며, 서열번호 4 또는 5에서 하나 또는 몇 개의 아미노산이 첨가, 결실 또는 치환된 서열로 구성될 수 있다.
PIRO 유전자는 서열번호 6 또는 7의 염기서열로 구성되는 것이 바람직하나 이에 한정되지는 않으며, 서열번호 6 또는 7에서 하나 또는 몇 개의 염기가 첨가, 결실 또는 치환된 서열로 구성될 수 있다.
상기 억제제는 발현 또는 활성 억제제일 수 있다. 구체적으로, PIRO 단백질의 발현 억제제는 PIRO 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 및 RNAi[작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA) 및 마이크로 RNA(miRNA)]로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하며, PIRO 단백질의 활성 억제제는 PIRO 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 실시예에서 사용한 쥐 PIRO(mPIRO-1)의 siRNA인 siPIRO2와 인간 PIRO(hPIRO)의 siRNA인 si-hPIRO2도 여기에 포함된다.
이를 구체적으로 살펴보면 하기와 같다.
1) RNAi
RNA 간섭(RNAi)은 PIRO 유전자에 대응하는 두 가닥 사슬 RNA(dsRNA)를 세포 또는 유기체에 도입함으로써 대응하는 mRNA의 분해가 일어나는 전사 후 유전자 사일런싱 메카니즘(post-transcriptional gene silencing mechanism)이다. 상기 RNAi 효과에 의해 유전자 발현이 복귀되기 전에 다중 세포 분열이 지속되므로 RNAi는 RNA 레벨에서 목표로 하는 낙아웃(knockout) 또는 '낙다운(knockdown)'을 만드는 매우 강력한 방법이다(Elbashir et al. Nature May 24;411(6836):494-8, 2001). 유전자 사일런싱에서의 RNAi 기술은 표준 분자 생물학 방법을 이용한다. 불활성화시킬 표적 유전자의 서열에 대응하는 dsRNA는 표준 방법, 예를 들면 T7 RNA 중합효소를 이용한 주형 DNA의 양 가닥 동시 전사에 의해 생성할 수 있다. RNAi에 사용되는 dsRNA의 생성 키트는 상업적으로 판매되는 제품을 사용할 수 있다. dsRNA 또는 dsRNA를 제조하도록 처리된 플라스미드의 트랜스펙션 방법은 공지의 기술이다.
2) 안티센스 핵산 서열
PIRO를 코딩하는 핵산에 대해 안티센스인 핵산 분자를 저해제로 사용할 수 있다. '안티센스' 핵산은 PIRO를 코딩하는 '센스' 핵산에 상보적인, 예를 들면 두 가닥 사슬 cDNA 분자의 코딩 가닥에 상보적이거나 mRNA 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 따라서 안티센스 핵산은 센스 핵산과 수소 결합을 형성할 수 있다. 상기 안티센스 핵산은 전체 PIRO 코딩가닥 또는 단지 그들의 일부(예: 코딩영역)에 상보적일 수 있다. 상기 안티센스 핵산 분자는 PIRO mRNA의 전체 코딩 영역에 상보적일 수 있으나, PIRO mRNA의 코딩 또는 비코딩 영역의 단지 일부(예: 번역 개시부)에만 안티센스인 올리고뉴클레오티드가 더 바람직하다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 예를 들면 약 5 내지 50 뉴클레오티드의 길이일 수 있다. 안티센스 핵산은 공지의 방법을 이용한 화합 합성 및 효소 결합 반응을 이용하여 구성할 수 있다.
3) 펩티드 미메틱스(Peptide Mimetics)
PIRO 폴리펩티드의 단백질 결합 도메인을 억제한 미메틱스(예, 펩티드 또는 비펩티드성 약제)를 제작하여 원래의 PIRO 폴리펩타이드가 VHL에 결합하는 것을 억제할 수 있다.
상기 조성물은 PIRO 억제제에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있다.
상기 조성물은 전체 조성물 100 중량부 대비 PIRO 억제제를 0.1 중량부 내지 90 중량부로 함유할 수 있다.
상기 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
상기 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
상기 조성물의 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하나 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
상기 조성물은 실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 피검 개체로부터 분리된 혈액, 혈장 또는 혈청으로부터 PIRO의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
2) PIRO의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 증가한 개체를 선별하는 단계;를 포함하는 골다공증 진단, 치료 결과 또는 예후 평가의 정보를 제공하기 위한 단백질 발현 수준의 측정 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, PIRO의 mRNA 발현 수준은 RT-PCR, 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quentitative or semi-Quentitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 리얼 타임 RT-PCR(Quentitative or semi-Quentitative real-time RT-PCR), 노던 블롯(northern blot), 및 DNA 또는 RNA 칩(chip)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정할 수 있다.
상기 방법에 있어서, PIRO의 단백질 발현 수준은 조직면역염색법, 효소면역분석법(ELISA) 및 웨스턴 블롯(Western Blot)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 PIRO 단백질에 결합하는 항체, PIRO 유전자에 상보적인 핵산, 및 PIRO 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 골다공증 진단, 치료 결과 또는 예후 평가용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 피검 조성물 또는 화합물을 PIRO 단백질 발현 세포주에 처리하는 단계;
2) 상기 세포주의 PIRO의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
3) PIRO의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검 조성물 또는 화합물을 선별하는 단계;를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료제, 또는 파골세포 융합 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, PIRO의 mRNA 발현 수준은 RT-PCR, 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quentitative or semi-Quentitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 리얼 타임 RT-PCR(Quentitative or semi-Quentitative real-time RT-PCR), 노던 블롯(northern blot), 및 DNA 또는 RNA 칩(chip)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정할 수 있다.
상기 방법에 있어서, PIRO의 단백질 발현 수준은 조직면역염색법, 효소면역분석법(ELISA) 및 웨스턴 블롯(Western Blot)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 PIRO 단백질을 유효성분으로 함유하는 파골세포 융합 유도용 조성물을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 새로운 파골세포 분화 호르몬인 프로그래뉼린(Progranulin, PGRN)
1-1. 쥐 골수세포(mouse bone marrow cells, MBMC)(도 1의 A), 인간 골수세포 (human bone marrow cells, HBMC)(도 1의 B) 및 인간 백혈구(도 1의 C)를 분리하여 M-CSF(macrophage-colony stimulating factor)와 RANK(receptor activator of NFκB) 리간드(RANKL)를 처리하고 파골세포로 분화시키면서 여기에 재조합 인간 또는 생쥐 PGRN을 처리하여 파골세포의 형성을 관찰하였다.
도 1에서와 같이 모든 세포종류에서 PGRN은 강력한 파골세포 분화능이 있는 호르몬으로 확인되었다. 또한, 도 1의 A에서와 같이 PGRN의 파골세포 분화능은 RANKL에 의존적(dependent)이며, PGRN 농도의 증가에 따라 TRAP+ mutinucleated osteoclasts(MNCs)가 증가하는 것으로 나타났다.
1-2. PGRN의 파골세포 기능인 골흡수(bone resorption)능 측정을 위해 hydroxyl apatite와 dentin을 사용하였다. 도 2에서와 같이 PGRN은 파골세포 actin ring 조성을 위한 F-actin의 발현을 뚜렷이 촉진하였고, Pit 생성을 증가시켰다. 즉 골흡수가 PGRN의 처리 농도에 의존적으로 현저하게 증가하였다.
1-3. Alkaline phosphatase(ALP) 측정과 Alizarin res staining으로 PGRN이 조골세포(osteoblasts)에 미치는 영향을 확인한 결과, 도 3에서와 같이 PGRN은 조골세포의 분화에 영향을 미치지 않았다.
1-4. 소결
PGRN은 생쥐 및 인간 파골세포의 강력한 분화 호르몬이고, 파골세포의 골흡수능을 향상시키나 조골세포 분화에는 관여하지 않는 것으로 나타났다.
실시예 2. RANK 신호전달의 중요한 축을 이루는 프로그래뉼린
2-1. 지금까지의 결과는 외부에서 재조합 PGRN의 형태로 넣어주었을 때 PGRN이 파골세포 분화 및 성숙에 관여한다는 것을 보여준다.
RANK 신호전달에서 내생(endogenous) PGRN의 영향을 알아보기 위해 쥐 골수세포(MBMC)에 M-CSF와 RANKL을 처리하여 파골세포로 분화시키고, 이때 배양상층액(culture supernatant)과 총 RNA에서 PGRN을 측정하였다.
도 4에서와 같이 RANKL 처리 후 48시간부터 PGRN의 발현이 유도되는 것으로 나타났다.
2-2. PGRN의 생성이 RANK 신호전달의 중요한 요소임을 직접 증명하기 위해 shRNA를 이용한 유전자 낙다운(knock-down, KD) 실험을 실시하였다. 이때 사용한 mouse PGRN shRNA 서열은 표 1과 같다.
도 5에서와 같이, 대조군(control)과 비교 시 sh-PGRN3가 가장 강한 낙다운 효과를 보였다. PGRN mRNA와 배양상층액의 PGRN 발현을 감소시켰고, 동시에 multinucleated osteoclasts(MNC) 생성도 현저하게 감소시켰다.
2-3. shPGRN3로 PGRN 유전자를 낙다운시켰을 때 파골세포 분화와 관련된 유전자의 발현 양상을 조사하였다.
도 6에서와 같이, 파골세포 분화 관련 유전자인 c-Fos(12시간 유도), NFATc1(48시간 유도), TRAP(48시간 유도), OSCAR(48시간 유도) 및 PGRN(48시간 유도)의 mRNA가 shPGRN3 처리로 현저하게 감소하였다.
2-4. 소결
PGRN은 RANK 신호전달에서 하나의 구성요소(component)이고, MNCs 형성에 결정적인 역할을 하며, 파골세포 분화에 관여하는 c-Fos, NFATc1, TRAP 및 OSCAR의 발현에 영향을 미친다.
실시예 3. 골다공증 생쥐 모델과 사람에서 혈중 PGRN의 농도변화
3-1. 강력한 염증 인자인 LPS를 복강으로 투여하여 골다공증을 유발한 후(LPS-induced osteoporosis model) serum PGRN을 측정하였다.
도 7의 A에서와 같이 LPS 처리에 의한 골다공증 유발로 PGRN의 발현이 증가하였다.
3-2. 난소제거 후 골다공증 유발한 생쥐(ovariectomized model, OVX model)에서 serum PGRN을 측정하였다.
도 7의 B에서와 같이 난소제거에 의한 골다공증 유발로 PGRN의 발현이 증가하였다.
3-3. 골다공증 환자와 오랫동안 누워 침대 생활을 한 환자의 serum PGRN을 측정하였다.
도 7의 C에서와 같이 정상인과 비교할 때 PGRN의 발현이 유의하게 높았다.
3-4. 소결
PGRN은 골다골증의 중요한 바이오마커이다.
실시예 4. PIRO( P rogranulin- I nduced Receptor- l ike molecule during O steoclastogenesis) 유전자 발굴
4-1. RNA-염기서열 분석을 통한 genome-wide expression profiling
MCSF + RANLK 또는 MCSF + RANKL + PGRN을 각각 처리하고 60시간 후에 총 RNA를 분리한 다음, poly(A+) RNA를 재정제하여 Illumina hi-seq 2500 platform으로 deep sequencing하여 gene ontology를 만들었다.
총 23,000 여 transcriptome 분석에서 상위조절(upregulated)된 54개의 유전자와 하향조절(downregulated)된 108개의 유전자를 발견하였다. 이중에서 GM10800이라는 쥐의 유전자는 20여배가 증가되었고(도 8의 A), real time PCR에서도 72시간 후 PGRN 처리 시 20배 증가하였다(도 8의 B). 파골세포 마커인 TRAP은 PGRN에 관계없이 유도되었으므로 PIRO는 RANK 신호전달 72시간에 유도되는 후기 인자(later factor)임을 알 수 있다. 동시에 RANKL 단독으로도 PIRO의 발현이 5배 정도 높게 유도되는 것으로 보아 RANKL에 의해 내생적으로 PGRN의 발현이 유도되고 이것이 작용하였을 가능성을 나타냈다. GM10800을 Progranulin-Induced Receptor-like molecule during Osteoclastogenesis(PIRO)라고 명명하고, 이후에 쥐의 PIRO가 26개의 유전자 패밀리(family)로 구성되어 있어서 가장 먼저 발견된 유전자라는 뜻에서 mPIRO-1으로 최종 명명하였다.
4-2. mPIRO-1의 염기서열 및 아미노산 서열을 분석한 결과, 5개의 transmembrane(TM) domain을 갖는 수용체 단백질인 것으로 나타났다. mPIRO-1 단백질은 24번째 아미노산(P)부터 98번째 아미노산(F)까지와 99번째 아미노산(P)부터 179번째 아미노산(F)까지의 두 개의 PIRO domain으로 구성되어 있었다(도 9).
4-3. 인간의 PIRO 유전자(hPIRO) 발굴
mPIRO-1의 아미노산 서열을 이용한 NCBI blastp 검색을 수행하여 부분적인 인간 PIRO 단백질의 아미노산 서열을 얻었고, human highthrouhput genome sequence(HTGS) 데이터베이스 및 EST 데이터베이스 써치, 및 human bone marrow cells-deduced 파골세포 RNA에서 부분적인 RT-PCR을 통하여 sanger sequencing을 사용하여 불확실한 유전자 서열 확인을 통해 full length cDNA 서열을 얻었다. hPIRO 단백질은 1번째 아미노산(M)부터 78번째 아미노산(F), 79번째 아미노산(M)부터 186번째 아미노산(S), 187번째 아미노산(M)부터 269번째 아미노산(W)까지 3개의 PIRO domain을 갖고 있었다(도 10).
4-4. 쥐의 PIRO 유전자군과 인간 PIRO(hPIRO)와의 계통발생적 비교
쥐의 PIRO 유전자들은 염색체 2, 9, 12 등에 26개로 산재해 있으며, 여기에는 variants와 non-coding RNA가 포함된다. mPIRO-1은 염색체 2번에 존재하며 hPIRO는 염색체 18번에 존재한다. mPIRO-1과 hPIRO가 가장 유사하였다(도 11).
실시예 5. PGRN에 의한 mPIRO-1과 hPIRO의 영향
MBMC에 M-CSF와 RANKL을 처리하여 파골세포로 분화한 후 그리고 shPGRN3로 낙다운시킨 후 날짜별로 총 RNA를 분리하여 real time PCR로 PIRO의 mRNA를 측정하였다.
또한, HBMC에 M-CSF + RANKL 또는 M-CSF + RANKL + PGRN을 처리한 후 총 RNA를 분리하여 real time PCR로 hPIRO의 mRNA를 측정하였다.
도 12에서와 같이, mPIRO-1과 hPIRO의 발현이 PGRN에 의해 유도되는 것으로 나타났다.
실시예 6. mPIRO-1 낙다운에 따른 MNC 형성의 영향
MBMC에 M-CSF를 처리하여 대식세포로 분화한 후 mPIRO-1 siRNA를 처리하고, 24시간 후 배양액을 교체하고 RANKL을 처리하여 파골세포 분화를 유도한 다음, mPIRO-1의 mRNA를 real time PCR로 측정하고 TRAP+ MNC를 측정하였다.
도 13에서와 같이 siPIRO2가 RANKL에 의한 MNC 형성을 거의 억제하였고, 따라서 mPIRO-1은 파골세포의 융합에 결정적인 역할을 하는 것으로 나타났다.
실시예 7. hPIRO 낙다운에 따른 파골세포 융합의 영향
HBMC를 파골세포로 분화하고 hPIRO의 siRNA와 대조군 siRNA를 처리하여 MNC 형성을 관찰하였다.
도 14에서와 같이 si-hPIRO2가 MNC 형성을 상당히 억제하였고, 이에 따라 PIRO는 인간의 파골세포 융합에도 관여하는 것으로 나타났다.
본 발명의 실시예에 사용된 프라이머, shRNA 및 siRNA의 서열은 다음과 같다.
Primer sequences for Real-time RT-PCR
mPGRN Forward: 5′-TTC ACA CAC GAT GCG TTT CA-3′ (서열번호 8)
Reverse: 5′-AGG GCA CAC AGA AAA AG-3′ (서열번호 9)
mPIRO Forward: 5′-CCT TTT TCA GTT TTC CTC GCC-3′(서열번호 10)
Reverse: 5′-TGC ACA CTG AAG GAC CTG GAA-3′(서열번호 11)
mc-Fos Forward: 5′-GGT GAA GAC CGT GTC AGG AG-3′ (서열번호 12)
Reverse: 5′-TAT TCC GTT CCC TTC GGA TT-3′ (서열번호 13)
mNFATc1 Forward: 5′-GAG TAC ACC TTC CAG CAC CTT-3′(서열번호 14)
Reverse: 5′-TAT GAT GTC GGG GAA AGA GA-3′ (서열번호 15)
mTRAP Forward: 5′-TCA TGG GTG GTG CTG CT-3′ (서열번호 16)
Reverse: 5′-GCC CAC AGC CAC AAA TCT-3′ (서열번호 17)
mOSCAR Forward: 5′-GGA ATG GTC CTC ATC TGC TT-3′ (서열번호 18)
Reverse: 5′-GGA ATG GTC CTC ATC TGC TT-3′ (서열번호 19)
mGAPDH Forward: 5′-TCA AGA AGG TGG TGA AGC AG-3′ (서열번호 20)
Reverse: 5′-AGT GGG AGT TGC TGT TGA AGT-3′(서열번호 21)
hPGRN Forward: 5′-TCC CCC TAA CCA AAT TCT CC-3′ (서열번호 22)
Reverse: 5′-GGG ATG GCA GCT TGT AAT GT-3′ (서열번호 23)
hPIRO Forward: 5′-cct ttt tca gtt ttc ctc gcc-3′(서열번호 24)
Reverse: 5′-tgc aca ctg aag gac ctg gaa-3′(서열번호 25)
hGAPDH Forward: 5′-TCA AGA AGG TGG TGA AGC AG-3′ (서열번호 26)
Reverse: 5′-GGT GGA GGA GTG GGT GTC-3′ (서열번호 27)
siRNA sequences (Duplex)
mPIRO-siRNA 1 Sense: 5′-CUC CAU AUU CCA GGU CCU U(dTdT)-3′(서열번호 28)
Antisense: 5′-AAG GAC CUG GAA UAU GGA G(dTdT)-3′(서열번호 29)
mPIRO-siRNA 2 Sense: 5′-CGU CCU AAA GUG UGU AUU U(dTdT)-3′(서열번호 30)
Antisense: 5′-AAA UAC ACA CUU UAG GAC G(dTdT)-3′(서열번호 31)
mPIRO-siRNA 3 Sense: 5′-CGU CCU AAA GUG UGU AUU U(dTdT)-3′(서열번호 32)
Antisense: 5′-AAA UAC ACA CUU UAG GAC G(dTdT)-3′(서열번호 33)
hPIRO-siRNA1 Sense: 5′-CAC UUA UGA GUG AGA ACA U(dTdT)-3′(서열번호 34)
Antisense: 5′-AUG UUC UCA CUC AUA AGU G(dTdT)-3′(서열번호 35)
hPIRO-siRNA2 Sense: 5′-CUC CAU UUU UCA AGU CUC A(dTdT)-3′(서열번호 36)
Antisense: 5′-UGA GAC UUG AAA AAU GAC G(dTdT)-3′(서열번호 37)
hPIRO-siRNA3 Sense: 5′-CUG UCU UCU UGC CAU AUU U(dTdT)-3′(서열번호 38)
Antisense: 5′-AAA UAU GGC AAG ACA G(dTdT)-3′ (서열번호 39)
shRNA sequences (Vector: pMLP-GFP)
mPGRN-shRNA 1 5′-AAAGGAGGTGAAGTGCGACATA TAGTGAAGCCACAGATGTA
TATGTCGCACTTCACCTCCTTC-3′(서열번호 40)
mPGRN-shRNA 2 5′-ATGACCTGATCCAGAGTAAGTA TAGTGAAGCCACAGATGTA
TACTTACTCTGGATCAGGTCAC-3′(서열번호 41)
mPGRN-shRNA 3 5′-AGAGAAGGGCATTTCTGCCATA TAGTGAAGCCACAGATGTA
TATGGCAGAAATGCCCTTCTCC-3′(서열번호 42)
hPGRN-shRNA 1 5′-ATGCCCTGATGGTTCTACCTGA TAGTGAAGCCACAGATGTA
TCAGGTAGAACCATCAGGGCAC-3′(서열번호 43)
hPGRN-shRNA 2 5′-AAAGGACACTTCTGCCATGATA TAGTGAAGCCACAGATGTA
TATCATGGCAGAAGTGTCCTTC-3′(서열번호 44)
hPGRN-shRNA 3 5′-ACAACGTGAAGGCTCGATCCTA TAGTGAAGCCACAGATGTA
TAGGATCGAGCCTTCACGTTGC-3′(서열번호 45)
hPGRN-shRNA 4 5′-ACCCAGGGCTACACGTGTGTAA TAGTGAAGCCACAGATGTA
TTACACACGTGTAGCCCTGGGG-3′(서열번호 46)
상기 실시예의 결과를 종합하면 다음과 같다.
첫째, PGRN과 PIRO는 RANK 신호전달의 중요한 축을 이룬다.
둘째, RANK 신호전달은 PGRN의 발현(48시간) 및 PIRO의 발현(72시간)을 순차적으로 조절한다.
셋째, PIRO는 파골세포 융합과 골흡수의 아주 중요한 후기 인자(late-stage factor)로서 PGRN에 의해 직접적으로 유도되는 유전자이다.
상기와 같은 연구결과를 바탕으로 도 15에서와 같은 RANKL/RANK axis에서 PGRN과 PIRO의 기능이 예상된다.
이에 따르면, RANKL이 RANK에 결합한 후 NFATc1의 활성화 신호전달에서 PGRN을 생성하는 두 가지 경로(pathway)가 예상된다. 경로 I은 autocrine manner로 분화과정의 파골세포 자체에서 PGRN이 생성되어 PGRN 수용체를 통해 PIRO 유전자를 발현하는 것이고, 경로 II는 RANK 신호전달에 의해서 골수에 존재하는 다른 세포, 예를 들어 조골세포(osteoblasts), stromal cells 및 mesenchymal stem cell에 작용하여 그들 세포에서 PGRN이 발현되고 paracrine manner로 분화 중인 파골세포의 PGRN 수용체를 통한 신호전달이 PIRO 유전자를 발현시켜 multinucleated osteoclasts 생성과 골흡수에 관여하는 것이다.
<110> OsteoNeuroGen <120> The PIRO as a new biomarker for osteoclast fusion <130> PA140310-C01 <160> 46 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 50 <212> PRT <213> Mus musculus and Homo sapiens <400> 1 Pro Phe Ser Val Phe Leu Ala Ile Phe His Val Leu Lys Cys Val Phe 1 5 10 15 Leu Ile Phe Arg Asp Phe Gln Phe Ser Arg His Ile Pro Gly Pro Ser 20 25 30 Val Cys Ile Ser His Phe Ser Arg Phe Leu Val Ile Ser Ser Phe Phe 35 40 45 Lys Ser 50 <210> 2 <211> 102 <212> PRT <213> Mus musculus and Homo sapiens <400> 2 Phe Ser Leu Xaa Phe Ser Phe Leu Ala Ile Xaa His Val Leu Gln Trp 1 5 10 15 Thr Phe Leu Asn Phe Pro Pro Phe Ser Val Phe Leu Ala Ile Phe Xaa 20 25 30 Val Leu Lys Cys Val Phe Leu Ile Phe Arg Asp Phe Gln Xaa Ser Arg 35 40 45 His Ile Pro Gly Pro Ser Val Cys Ile Ser His Phe Xaa Arg Phe Leu 50 55 60 Val Ile Ser Xaa Phe Phe Lys Ser Ser Ser Xaa Cys Phe Ser Phe Ser 65 70 75 80 Met Ile Phe Ser Phe Leu Ala Ile Phe His Val Leu Gln Trp Thr Phe 85 90 95 Leu Asn Xaa Pro Pro Phe 100 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus and Homo sapiens <400> 3 Phe Xaa Val Val Lys Trp Met Phe Leu Ile Phe His Asp Phe Gln Phe 1 5 10 15 Ser <210> 4 <211> 220 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Phe Leu Ile Phe His Asp Phe Gln Phe Ser Cys His Ile Ser Arg 1 5 10 15 Pro Thr Val Asp Ile Ser Lys Pro Pro Phe Ser Val Phe Leu Ala Ile 20 25 30 Phe His Val Leu Lys Cys Val Phe Leu Ile Phe Arg Asp Phe Gln Phe 35 40 45 Ser Arg His Ile Pro Gly Pro Ser Val Cys Ile Ser His Phe Ser Arg 50 55 60 Phe Leu Val Ile Ser Ser Phe Phe Lys Ser Gln Val Asp Phe Ser Leu 65 70 75 80 Ile Phe Ser Phe Leu Ala Ile Leu His Val Leu Gln Trp Thr Phe Leu 85 90 95 Asn Phe Pro Pro Phe Ser Val Phe Leu Ala Ile Phe His Val Leu Lys 100 105 110 Cys Val Phe Leu Ile Phe Arg Asp Phe Gln Val Ser Arg His Ile Pro 115 120 125 Gly Pro Ser Val Cys Ile Ser His Phe Ser Arg Phe Leu Val Ile Ser 130 135 140 Ser Phe Phe Lys Ser Ser Ser Arg Cys Phe Ser Phe Ser Met Ile Phe 145 150 155 160 Ser Phe Leu Ala Ile Phe His Val Leu Gln Trp Thr Phe Leu Asn Ile 165 170 175 Pro Pro Phe Phe Ser Pro Tyr Ser Arg Ser Phe Ser Val His Phe Ser 180 185 190 Phe Phe Thr Tyr Phe Ser Asp Phe Val Ile Phe Gln Val Val Lys Trp 195 200 205 Met Phe Leu Ile Phe His Asp Phe Gln Phe Ser Phe 210 215 220 <210> 5 <211> 274 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Ile Phe Ser Phe Leu Ala Ile Phe His Val Leu Gln Trp Thr Phe 1 5 10 15 Leu Asn Phe Pro Pro Phe Ser Val Phe Leu Ala Ile Phe His Val Leu 20 25 30 Lys Cys Val Phe Leu Ile Phe Arg Asp Phe Gln Phe Ser Arg His Ile 35 40 45 Pro Gly Pro Ser Val Cys Ile Ser His Phe Ser Arg Phe Leu Val Ile 50 55 60 Ser Ser Phe Phe Lys Ser Ser Ser Gly Cys Phe Ser Phe Ser Met Ile 65 70 75 80 Phe Ser Phe Leu Ala Ile Phe His Val Leu Gln Trp Thr Phe Leu Asn 85 90 95 Phe Pro Pro Phe Ser Val Phe Leu Ala Ile Phe Pro Val Leu Lys Cys 100 105 110 Val Phe Leu Ile Phe Arg Asp Phe Gln Phe Ser Arg His Ile Pro Gly 115 120 125 Pro Ser Val Cys Ile Ser His Phe Lys Arg Phe Leu Val Ile Ser Thr 130 135 140 Phe Phe Lys Ser Ser Ser Gly Cys Phe Ser Phe Ser Met Ile Phe Ser 145 150 155 160 Phe Leu Ala Ile Phe His Val Leu Gln Trp Thr Phe Leu Asn Phe Pro 165 170 175 Pro Phe Ser Val Phe Leu Ala Ile Phe His Val Leu Lys Cys Val Phe 180 185 190 Leu Ile Phe Arg Asn Phe Gln Phe Ser Arg His Ile Pro Gly Pro Ser 195 200 205 Val Cys Ile Ser His Phe Ser Arg Phe Leu Val Ile Ser Ser Phe Phe 210 215 220 Lys Val Val Lys Trp Met Phe Leu Ile Phe His Asp Phe Gln Phe Ser 225 230 235 240 Cys His Ile Pro Arg Pro Thr Val Asp Ile Cys Lys Phe Ser Thr Phe 245 250 255 Phe Ser Phe Pro Arg His Ile Ser Arg Pro Lys Val Cys Ile Ser His 260 265 270 Phe Pro <210> 6 <211> 660 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 atgtttctca ttttccatga ttttcagttt tcttgccata tttcacgtcc tacagtggac 60 atttctaaac cacctttttc agttttcctc gccatatttc acgtcctaaa gtgtgtattt 120 ctcattttcc gtgattttca gttttctcgc catattccag gtccttcagt gtgcatttct 180 catttttcac gttttttagt gatttcgtca tttttcaaga gtcaagtgga tttttctttg 240 attttcagtt ttcttgccat actccacgtc ctacagtgga catttctaaa ttttccacct 300 ttttcagttt tcctcgccat atttcacgtc 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mOSCAR forward primer sequences for Real-time RT-PCR <400> 18 ggaatggtcc tcatctgctt 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mOSCAR reverse primer sequences for Real-time RT-PCR <400> 19 ggaatggtcc tcatctgctt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mGAPDH forward primer sequences for Real-time RT-PCR <400> 20 tcaagaaggt ggtgaagcag 20 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mGAPDH reverse primer sequences for Real-time RT-PCR <400> 21 agtgggagtt gctgttgaag t 21 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPGRN forward primer sequences for Real-time RT-PCR <400> 22 tccccctaac caaattctcc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPGRN reverse primer sequences for Real-time RT-PCR <400> 23 gggatggcag cttgtaatgt 20 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPIRO forward primer sequences for Real-time RT-PCR <400> 24 cctttttcag ttttcctcgc 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aaauacacac uuuaggacg 19 <210> 32 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mPIRO-siRNA 3 sense sequences(Duplex) <400> 32 cguccuaaag uguguauuu 19 <210> 33 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mPIRO-siRNA 3 antisense sequences(Duplex) <400> 33 aaauacacac uuuaggacg 19 <210> 34 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPIRO-siRNA 1 sense sequences(Duplex) <400> 34 cacuuaugag ugagaacau 19 <210> 35 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPIRO-siRNA 1 antisense sequences(Duplex) <400> 35 auguucucac ucauaagug 19 <210> 36 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPIRO-siRNA 2 sense sequences(Duplex) <400> 36 cuccauuuuu caagucuca 19 <210> 37 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPIRO-siRNA 2 antisense sequences(Duplex) <400> 37 ugagacuuga aaaaugacg 19 <210> 38 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPIRO-siRNA 3 sense sequences(Duplex) <400> 38 cugucuucuu gccauauuu 19 <210> 39 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPIRO-siRNA 3 antisense sequences(Duplex) <400> 39 aaauauggca agacag 16 <210> 40 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mPGRN-shRNA 1 sequences(vector : pMLP-GFP) <400> 40 aaaggaggtg aagtgcgaca tatagtgaag ccacagatgt atatgtcgca cttcacctcc 60 ttc 63 <210> 41 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mPGRN-shRNA 2 sequences(vector : pMLP-GFP) <400> 41 atgacctgat ccagagtaag tatagtgaag ccacagatgt atacttactc tggatcaggt 60 cac 63 <210> 42 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mPGRN-shRNA 3 sequences(vector : pMLP-GFP) <400> 42 agagaagggc atttctgcca tatagtgaag ccacagatgt atatggcaga aatgcccttc 60 tcc 63 <210> 43 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPGRN-shRNA 1 sequences(vector : pMLP-GFP) <400> 43 atgccctgat ggttctacct gatagtgaag ccacagatgt atcaggtaga accatcaggg 60 cac 63 <210> 44 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPGRN-shRNA 2 sequences(vector : pMLP-GFP) <400> 44 aaaggacact tctgccatga tatagtgaag ccacagatgt atatcatggc agaagtgtcc 60 ttc 63 <210> 45 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPGRN-shRNA 3 sequences(vector : pMLP-GFP) <400> 45 acaacgtgaa ggctcgatcc tatagtgaag ccacagatgt ataggatcga gccttcacgt 60 tgc 63 <210> 46 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPGRN-shRNA 4 sequences(vector : pMLP-GFP) <400> 46 acccagggct acacgtgtgt aatagtgaag ccacagatgt attacacacg tgtagccctg 60 ggg 63

Claims (12)

  1. 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하여 상기 유전자의 발현을 저해하는 안티센스뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)를 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 유전자는 서열번호 6 또는 7의 염기 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하여 상기 유전자의 발현을 저해하는 안티센스뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)를 유효성분으로 함유하는 파골세포(osteoclasts) 융합 억제용 약학적 조성물.
  6. 1) 피검 개체로부터 분리된 혈액, 혈장 또는 혈청으로부터 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 mRNA 또는 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    2) 상기 단백질의 mRNA 또는 상기 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 증가한 개체를 선별하는 단계;를 포함하는 골다공증 진단, 치료 결과 또는 예후 평가의 정보를 제공하기 위한 단백질 발현 수준의 측정 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 단백질의 mRNA 발현 수준은 RT-PCR, 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(quantitative or semi-quantitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 리얼 타임 RT-PCR(quantitative or semi-quantitative real-time RT-PCR), 노던 블롯(northern blot), 및 DNA 또는 RNA 칩(chip)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정하는 것을 특징으로 하는 골다공증 진단, 치료 결과 또는 예후 평가의 정보를 제공하기 위한 단백질 발현 수준의 측정 방법.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 단백질의 발현 수준은 조직면역염색법, 효소면역분석법(ELISA) 및 웨스턴 블롯으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정하는 것을 특징으로 하는 골다공증 진단, 치료 결과 또는 예후 평가의 정보를 제공하기 위한 단백질 발현 수준의 측정 방법.
  9. 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자에 상보적인 핵산, 및 상기 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 골다공증 진단, 치료 결과 또는 예후 평가용 키트.
  10. 1) 피검 조성물 또는 화합물을 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열을 갖는 단백질 발현 세포주에 처리하는 단계;
    2) 상기 세포주의 상기 단백질의 mRNA 또는 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    3) 상기 단백질의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검 조성물 또는 화합물을 선별하는 단계;를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
  11. 1) 피검 조성물 또는 화합물을 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열을 갖는 단백질 발현 세포주에 처리하는 단계;
    2) 상기 세포주의 상기 단백질의 mRNA 또는 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    3) 상기 단백질의 mRNA 또는 상기 단백질의 발현 수준이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검 조성물 또는 화합물을 선별하는 단계;를 포함하는 파골세포 융합 억제제의 스크리닝 방법.
  12. 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 파골세포 융합 유도용 조성물.
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