KR101249041B1 - 결합조직 성장인자를 이용한 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 결합조직 성장인자를 이용한 혈관신생 관련 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 결합조직 성장인자를 함유하는 혈관신생 촉진 또는 결합조직 성장인자에 결합하는 폴리펩타이드, 항체 및 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 함유하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 밝혀 낸 결합조직 성장인자 단백질의 단편은 FPRL1과 결합하는 부위로, FPRL1에 특이적인 ERK 인산화를 효과적으로 유도하며, FPRL1를 활성화하여 세포 내 Ca2 + 농도를 상승시켜, 최종적으로 혈관 생성을 효과적으로 유도하는 활성이 있으며, 이에 따라 결합조직 성장인자 단백질의 단편은 혈관신생 촉진용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있으며, 반면, 상기 결합조직 성장인자 단백질의 단편과 결합하는 폴리펩타이드, 항체 또는 화합물은 혈관신생 억제용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

결합조직 성장인자를 이용한 약학적 조성물{Pharmaceutical composition using connective-tissue growth factor}
본 발명은 결합조직 성장인자를 이용한 혈관신생 관련 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 결합조직 성장인자를 함유하는 혈관신생 촉진 또는 결합조직 성장인자에 결합하는 폴리펩타이드, 항체, 및 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 함유하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.
혈관신생(angiogenesis)이란 기존의 미세혈관으로부터 새로운 모세혈관이 형성되는 과정으로서, 혈관신생이 정상적으로 일어나는 경우는 배아 발생(embryonic development), 조직재생 및 상처치료, 주기적인 여성의 생식기 계통의 변화인 황체가 발달될 때이며 이러한 경우에도 엄격히 조절되어 진행된다(Folkman J et al., Int. Rev. Exp. Pathol., 16, pp207-248, 1976).
성인의 경우 혈관내피세포는 매우 느리게 자라며, 다른 종류의 세포에 비하여 상대적으로 잘 분열하지 않는다. 혈관신생이 일어나는 과정은 일반적으로 혈관신생 촉진인자의 자극에 의하여 프로테아제로 인한 혈관 기저막의 분해, 혈관 내피세포의 이동, 증식 및 혈관 내피세포 분화에 의한 관강의 형성으로 혈관이 재구성되어 새로운 모세혈관이 생성되는 것으로 이루어진다.
혈관신생이 자율적으로 조절되지 못하고 병적으로 성장함으로써 야기되는 질환들이 있다. 병리학적 상태에서 나타나는 혈관신생에 관련된 질환으로는 혈관종, 혈관섬유종, 혈관기형 및 심혈관 질환인 동맥경화, 혈관유착, 부종성 경화증이 있고, 혈관신생에 의한 안과 질환으로는 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 당뇨병성 망막증, 신생혈관에 의한 각막 질환, 반점의 변성, 익상편, 망막 변성, 후수정체 섬유 증식증, 과립성 결막염 등이 있다.
관절염과 같은 만성 염증성 질환, 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염, 여드름과 같은 피부과질환, 알츠하이머 및 비만도 혈관신생과 관련이 있으며, 암의 성장과 전이는 반드시 혈관신생에 의존한다(D'Amato RJ et al., Ophthalmology, 102(9), pp1261-1262, 1995; Arbiser JL, J. Am. Acad. Dermatol., 34(3), pp486-497, 1996; O'Brien KD et al. Circulation, 93(4), pp672-682, 1996; Hanahan D et al., Cell, 86, pp353-364, 1996).
특히 암의 경우 혈관신생은 암세포의 성장과 전이에 중요한 역할을 한다. 종양은 신생혈관을 통하여 성장과 증식에 필요한 영양과 산소를 공급받으며, 또한 종양까지 침투한 신생 혈관들은 전이하는 암세포가 혈액순환계로 들어가는 기회를 줌으로써 암세포가 전이되도록 한다(Folkman and Tyler, Cancer Invasion and metastasis, Biologic mechanisms and Therapy(S.B. Day ed.) Raven press, New York, pp94-103, 1977; Polverini PJ, Crit. Rev. Oral. Biol. Med., 6(3), pp230-247, 1995).
반면, 과다한 혈관 형성은 질병 악화의 주원인이 되기도 하지만, 혈관의 미형성 또한 심각한 질병의 원인이 되고 있다. 혈관신생은 상처 치유나 조직 재생에 필수적인 현상이라 할 수 있는데, 예를 들어 혈관 형성이 미발달된 태반은 유산의 중요한 원인이 되며, 혈관의 미형성으로 인한 괴사, 궤양 및 허혈의 경우 조직이나 기관의 기능 이상을 유발하거나, 사망의 원인이 될 수 있다. 또한, 동맥경화증, 심근경색 및 협심증과 같은 질병도 원활하지 못한 혈액 공급이 원인이 되고 있다. 따라서, 혈관의 미형성으로 인한 저산소 상태 또는 저영양 상태의 유발로 인한 조직 손상을 감소시키고, 원활한 조직 재생을 위해 새로운 혈관 형성을 유도하거나 촉진시키고자 하는 치료법 개발이 필요하다.
이에 본 발명자들은 염증성 사이토카인의 일종인 혈관내피세포 성장인자-A(vascular endothelial growth factor-A, VEGF-A)와 FPRL1(formyl peptide receptor-like 1)가 관여하는 혈관 신생에 있어서, 결합조직 성장인자(connective tissue growth factor, CTGF)가 FPRL1과 결합함으로써 혈관 신생이 유도되며 특히 CTGF가 FPRL1과 결합하는 부위를 밝히고 상기 부위를 통하여 혈관 신생이 유도됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 일례는 CTGF 내의 FPRL1와의 결합 부위에 해당하는 단백질 단편 및/또는 이를 암호화하는 유전자를 함유하는 혈관신생 촉진용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또 다른 예는 CTGF 내의 FPRL1와의 결합 부위에 해당하는 단백질 단편 및/또는 이를 암호화하는 유전자의 억제제를 함유하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또 다른 예는 CTGF 내의 FPRL1와의 결합 부위를 사용하여 혈관신생 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 위하여, 본 발명의 일례는 서열번호 9의 아미노산 서열 내의, 164번째 아미노산부터 201번째 아미노산까지의 부위인 서열번호 5(WVCDEPKDQTVVGPALAAYRLEDTFGPDPTMIRANCLV)의 아미노산 서열을 포함하는 연속하는38개 이상, 예컨대, 연속하는 38개 내지 140개(예컨대, 103번째부터 242번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 연속하는 38개 내지 100개(예컨대, 103번째부터 202번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 또는 연속하는 38개 내지 80개 (예컨대, 163번째부터 242번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 바람직하게는 연속하는 38개 내지 39개 아미노산을 포함하는 결합조직 성장인자 단백질의 단편을 함유하는, 혈관신생 촉진용 약학적 조성물을 제공한다.
다른 예는 서열번호 9의 아미노산 서열 중에서, 서열번호 5의 아미노산서열을 포함하는 연속하는 38개 이상, 예컨대, 연속하는 38개 내지 140개(예컨대, 103번째부터 242번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 연속하는 38개 내지 100개(예컨대, 103번째부터 202번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 또는 연속하는 38개 내지 80개 (예컨대, 163번째부터 242번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 바람직하게는 연속하는 38개 내지 39개 아미노산을 포함하는 결합조직 성장인자 단백질의 단편을 암호화하는 유전자를 함유하는 혈관신생 촉진용 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 예는 서열번호 9의 아미노산 서열 중에서, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 연속하는 38개 이상, 예컨대, 연속하는 38개 내지 140개(예컨대, 103번째부터 242번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 연속하는 38개 내지 100개(예컨대, 103번째부터 202번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 또는 연속하는 38개 내지 80개 (예컨대, 163번째부터 242번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 바람직하게는 연속하는 38개 내지 39개 아미노산을 포함하는 결합조직 성장인자 단백질의 단편에 결합하는, 폴리펩타이드, 항체 및 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 함유하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 예는 서열번호 9의 아미노산 서열 중에서, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 연속하는 38개 이상, 예컨대, 연속하는 38개 내지 140개(예컨대, 103번째부터 242번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 연속하는 38개 내지 100개(예컨대, 103번째부터 202번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 또는 연속하는 38개 내지 80개 (예컨대, 163번째부터 242번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 바람직하게는 연속하는 38개 내지 39개 아미노산을 포함하는 결합조직 성장인자 단백질의 단편의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물을 제공한다. 예컨대, 상기 발현 억제제는 서열번호 5의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자의 염기서열(서열번호 7) 또는 그 mRNA, 예컨대, 상기 mRNA 중 연속하는 15 내지 30개, 바람직하게는 연속하는 20 내지 25개 염기로 이루어진 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
또 다른 예는 (a) 서열번호 9의 아미노산 서열 중에서, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 연속하는 38개 이상, 예컨대, 연속하는 38개 내지 140개(예컨대, 103번째부터 242번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 연속하는 38개 내지 100개(예컨대, 103번째부터 202번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 또는 연속하는 38개 내지 80개 (예컨대, 163번째부터 242번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 바람직하게는 연속하는 38개 내지 39개 아미노산을 포함하는 결합조직 성장인자 단백질의 단편을 암호화하는 유전자를 포함하는 세포에 후보 화합물을 처리하는 단계, 및 (b) 상기 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계를 포함하고, 상기 후보 화합물을 처리한 세포에서의 상기 유전자의 발현 정도가 후보 물질을 처리하지 않은 세포와 비교하여 감소한 경우, 상기 후보 화합물을 혈관신생 억제제로 결정하는 것을 특징으로 하는, 혈관신생 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 혈관신생 촉진용 조성물은 서열번호 9의 아미노산 서열 중에서, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 연속하는 38개 이상, 예컨대, 연속하는 38개 내지 140개(예컨대, 103번째부터 242번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 연속하는 38개 내지 100개(예컨대, 103번째부터 202번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 또는 연속하는 38개 내지 80개 (예컨대, 163번째부터 242번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 바람직하게는 연속하는 38개 내지 39개 아미노산을 포함하는 결합조직 성장인자 단백질의 단편을 함유하는 것을 특징으로 한다.
상기 결합조직 성장인자 단백질(connective tissue growth factor, CTGF)의 전장 아미노산 서열은 인간 유래의 것(예컨대, accession no. CAG46559.1)일 수 있고, 서열번호 9로 표시될 수 있다. 종래 염증성 사이토카인의 일종인 혈관내피세포 성장인자-A(vascular endothelial growth factor-A, VEGF-A)와 FPRL1(formyl peptide receptor-like 1)가 관여하는 혈관 신생에서 상기 결합조직 성장인자 단백질이 FPRL1과 결합함으로써 혈관 신생이 유도될 수 있다. 구체적으로 상기 결합조직 성장인자는 FPRL1에 특이적인 ERK 인산화를 유도하는 활성이 있으며(실험결과 2 참조), VEGF-A에 의해 발현이 유도되는 단백질로써(실험결과 3 참조), FPRL1과 결합함으로써 혈관 신생이 유도된다(실험결과 11 참조).
특히 상기 결합조직 성장인자 단백질이 FPRL1과 결합하는 부위는 결합조직 성장인자 단백질의 전장 아미노산 서열인 서열번호 9의 164번째 아미노산부터 201 번째 아미노산까지의 부위로, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시될 수 있다(실험결과 4 참조).
따라서 본 발명의 혈관신생 촉진용 약학적 조성물의 유효성분인 결합조직 성장인자 단백질의 단편은 상기 결합조직 성장인자 단백질의 전장 서열인 서열번호 9의 아미노산 서열 중에서, 상기 서열번호 9의 164번째 아미노산부터 201 번째 아미노산까지의 부위인 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 연속하는 38개 이상, 예컨대, 연속하는 38개 내지 140개(예컨대, 103번째부터 242번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 연속하는 38개 내지 100개(예컨대, 103번째부터 202번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 또는 연속하는 38개 내지 80개 (예컨대, 163번째부터 242번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 바람직하게는 연속하는 38개 내지 39개 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 상기 결합조직 성장인자 단백질의 단편은 이에 한정되지 않지만 보다 바람직하게는 서열번호 6의 아미노산 서열(EWVCDEPKDQTVVGPALAAYRLEDTFGPDPTMIRANCLV)로 표시된 것일 수 있다.
상기 결합조직 성장인자 단백질의 단편은 FPRL1과 결합하는 부위로(실험결과 5 참조), FPRL1에 특이적인 ERK 인산화를 효과적으로 유도하며(실험결과 6 참조), FPRL1를 활성화하여 세포 내 Ca2 + 농도를 상승시켜(실험결과 7 참조), 최종적으로 혈관 생성을 효과적으로 유도하는 활성이 있다(실험결과 9 참조).
또한 본 발명의 혈관신생 촉진용 약학적 조성물은 서열번호 9의 아미노산 서열 중에서, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, 연속하는 38개 이상, 예컨대, 연속하는 38개 내지 140개(예컨대, 103번째부터 242번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 연속하는 38개 내지 100개(예컨대, 103번째부터 202번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 또는 연속하는 38개 내지 80개 (예컨대, 163번째부터 242번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 바람직하게는 연속하는 38개 내지 39개 아미노산을 포함하는 결합조직 성장인자 단백질의 단편을 암호화하는 유전자를 함유하는 것일 수 있다. 상기 유전자는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 결합조직 성장인자 단백질의 전장 아미노산 서열에서 164 내지 201 번째 부위인 서열번호 5의 아미노산 서열을 암호화하는 것이거나 상기 서열번호 5의 아미노산 서열이 포함된 서열번호 6의 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있다. 상기 유전자는 보다 바람직하게는 상기 서열번호 5의 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 7의 염기서열 (164-TGG GTG TGT GAC GAG CCC AAG GAC CAA ACC GTG GTT GGG CCT GCC CTC GCG GCT TAC CGA CTG GAA GAC ACG TTT GGC CCA GAC CCA ACT ATG ATT AGA GCC AAC TGC CTG GTC-201)로 표시될 수 있으며 상기 서열번호 6의 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 8로 표시되는 염기 서열 (163-GAG TGG GTG TGT GAC GAG CCC AAG GAC CAA ACC GTG GTT GGG CCT GCC CTC GCG GCT TAC CGA CTG GAA GAC ACG TTT GGC CCA GAC CCA ACT ATG ATT AGA GCC AAC TGC CTG GTC-201)일 수 있다.
상기 유전자는 이에 한정되지 않지만 벡터, 바람직하게는 재조합 발현 벡터에 삽입된 것일 수 있으며, 상기 재조합 발현 벡터는 상기 유전자 및 이와 작동 가능하게 연결된 프로모터 등의 발현 조절 인자를 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 재조합 발현 벡터는 예컨대, EcoR I-INSERT-Xba I in pAB-beeTM-FH vector (including signal peptide & flag tag)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로 상기 벡터는 하나의 세포로부터 또 다른 세포로 DNA 절편을 전달하는 핵산 분자에 대해 사용되는 것으로 이에 한정되지 않지만 플라스미드, 박테리오파아지 및 식물 또는 동물 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 것에서 유래될 수 있다.
상기 발현 벡터는 목적하는 암호화 서열 및 특정 숙주 유기체에서 작동적으로 연결된 암호화 서열의 발현에 필요한 적합한 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA를 언급하며 원핵세포에서의 발현에 필요한 핵산 서열은 일반적으로, 다른 서열과 함께, 프로모터, 오퍼레이터 (임의), 및 리보좀 결합 부위를 포함할 수 있으며 진핵세포는 프로모터, 인핸서, 및 종결 및 폴리아데닐화 시그널을 이용하는 것일 수 있으며 이에 대한 사항은 당업계에 공지되어 있다.
상기 재조합 발현 벡터는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질, 본 발명에서는 결합조직 성장인자의 단편을 제조할 수 있는 상기 유전자가 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 구조체일 수 있다.
상기 작동가능하게 연결된 (operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 암호화하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 암호화서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
적합한 발현벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 등을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 암호화 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다.
상기 혈관신생 촉진용 약학적 조성물은 이에 한정되지 않지만 혈관 신생이 억제되어 발생하는 질환, 또는 혈관 신생이 촉진됨으로써 치유될 수 있는 질환의 치료용으로 사용될 수 있으며, 예컨대, 협심증, 동맥경화, 허혈성 뇌졸중, 뇌혈관성 치매, 만성궤양, 또는 창상 치료용으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 예는 상기 혈관신생 촉진용 약학적 조성물을 유효성분으로 포함하는 협심증, 동맥경화, 허혈성 뇌졸중, 뇌혈관성 치매, 만성궤양, 또는 창상의 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공한다.
한편, 본 발명의 혈관신생 억제용 약학적 조성물은 서열번호 9의 아미노산 서열 중에서, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 연속하는 38개 이상, 예컨대, 연속하는 38개 내지 140개(예컨대, 103번째부터 242번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 연속하는 38개 내지 100개(예컨대, 103번째부터 202번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 또는 연속하는 38개 내지 80개 (예컨대, 163번째부터 242번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 바람직하게는 연속하는 38개 내지 39개 아미노산을 포함하는 결합조직 성장인자 단백질의 단편에 결합하는, 폴리펩타이드, 항체, 및 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 함유하는 것을 특징으로 한다.
상기 기재한 바와 같이, 결합조직 성장인자의 전장 단백질의 아미노산 서열인 서열번호 9에서, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 연속하는 38개 이상, 예컨대, 연속하는 38개 내지 140개(예컨대, 103번째부터 242번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 연속하는 38개 내지 100개(예컨대, 103번째부터 202번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 또는 연속하는 38개 내지 80개 (예컨대, 163번째부터 242번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 바람직하게는 연속하는 38개 내지 39개 아미노산을 포함하는 결합조직 성장인자 단백질의 단편은 FPRL1과 결합함으로써 혈관 신생을 유도하는 활성이 있으므로, 상기 결합조직 성장인자 단백질의 단편에 결합하는 폴리펩타이드, 항체 및 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것은 혈관신생을 효과적으로 억제하는 활성이 있다.
상기 결합조직 성장인자 단백질의 단편은 상기 결합조직 성장인자 단백질의 전장 서열인 서열번호 9의 아미노산 서열 중에서, 164 내지 201 번째 부위인 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 연속하는 38개 이상, 예컨대, 연속하는 38개 내지 140개(예컨대, 103번째부터 242번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 연속하는 38개 내지 100개(예컨대, 103번째부터 202번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 또는 연속하는 38개 내지 80개 (예컨대, 163번째부터 242번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 바람직하게는 연속하는 38개 내지 39개 아미노산을 포함하는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 서열번호 5의 아미노산 서열이 포함된 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시된 것일 수 있다.
상기 결합조직 성장인자 단백질의 단편이 FPRL1과 결합하는 부위를 포함하므로, 상기 결합조직 성장인자 단백질의 단편에 결합하는 폴리펩타이드, 항체 또는 화합물은 상기 결합조직 성장인자 단백질이 FPRL1과 결합하는 것을 차단하여 혈관 신생을 효과적으로 억제할 수 있다.
상기 폴리펩타이드, 항체 또는 화합물은 상기 결합조직 성장인자 단백질의 단편에 결합하는 것이라면 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 서열번호 6, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열과 결합하는 것일 수 있으며, 결합 대상인 결합조직 성장인자 단백질의 단편의 아미노산 서열에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다.
또한 본 발명의 혈관신생 억제용 약학적 조성물은 서열번호 9의 아미노산 서열 중에서, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 연속하는 38개 이상, 예컨대, 연속하는 38개 내지 140개(예컨대, 103번째부터 242번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 연속하는 38개 내지 100개(예컨대, 103번째부터 202번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 또는 연속하는 38개 내지 80개 (예컨대, 163번째부터 242번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 바람직하게는 연속하는 38개 내지 39개 아미노산을 포함하는 결합조직 성장인자 단백질의 단편을 암호화하는 유전자 또는 그의 mRNA, 예컨대, 상기 mRNA 중 연속하는 15 내지 30개, 바람직하게는 연속하는 20 내지 25개 염기로 이루어진 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 것을 함유하는 것을 특징으로 한다.
상기 siRNA는 센스 RNA 가닥과 상보적인 안티센스 RNA 가닥을 포함하고, 이들 두 가닥은 표준 왓슨-크릭 염기쌍 상호작용에 의해서 서로 결합(annealing)하며, 상기 센스가닥은 표적 mRNA 내의 표적서열에 동일한 핵산서열을 포함한다. siRNA의 표적서열을 선택할 수 있는 기술은 예를 들면 문헌 (Tuschl T 등, "The siRNA User Guide" revised Oct. 11, 2002)에 기술되어 있다.
상기 siRNA의 센스 및 안티센스 가닥은 두 개의 상보적이고 단일쇄(single-stranded)의 RNA 분자를 포함하거나, 두 개의 상보적 부분이 염기쌍을 형성하고 단일쇄의 "머리핀(hairpin)" 영역에 의해서 공유결합된 단일 분자를 포함할 수 있다. 상기 후자의 경우를 shRNA(short hairpin RNA)라고 부르며, 상기shRNA는 single strand로 in vivo상에서 stem-loop 구조를 이루고 있다. 상기 shRNA는 일반적으로 in vivo상에서 Pol III promoter에부터 상보적인 DNA sequence의 전사에 의해 합성된다. Pol-III로 유도된 전사는 well-defined start site에서 시작되어 4개 이상의 thymidine으로 이루고 있는 선상(-TTTT-)의 second residue에서 종결되어 non-poly(A) transcript 생성한다. Pol III promoter는 모든 세포에서 활성되며 shRNA의 발현이 가능하다. 전사 후 shRNA는 Dicer에 의해 loop가 절단되고 siRNA처럼 RISC(RNA-induced silencing complex)와 작용하게 된다 (참조, Tuschl, T. (2002), Cell 110(5): 563­74).
상기 siRNA는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 알려진 많은 기술을 이용하여 획득될 수 있다. 예를 들면, siRNA는 본 발명이 속하는 분야에서 알려진 방법을 이용하여 화학적으로 합성되거나 재조합 방법에 의해서 생산될 수 있다. 바람직하게는, 상기 siRNA는 적절히 보호된 리보뉴클레오시드 포스포라미디트(ribonucleoside phosphoramidites)와 종래의 DNA/RNA 합성기를 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. siRNA는 상보적이고 분리된 두개의 RNA 분자 또는 두 개의 상보적인 영역을 가지는 하나의 RNA 분자로서 합성될 수 있다. 다른 방법으로서, siRNA는 또한 적절한 프로모터를 이용하여 재조합 DNA 플라스미드로 부터 발현될 수 있다. 플라스미드로부터 상기 siRNA를 발현시키는 데 적절한 프로모터는 예를 들면 U6 또는 H1 RNA pol Ⅲ 프로모터 서열 및 거대세포바이러스 프로모터를 포함한다. 또한, 상기 재조합 플라스미드는 특정 조직 또는 특정 세포내 환경에서 siRNA를 발현시키기 위해서 유도성 또는 조절가능한 프로모터를 포함할 수 있다.
상기 siRNA는 재조합 플라스미드로부터 상보적이고 분리된 두 개의 RNA 분자 또는 두개의 상보적인 영역을 가지는 하나의 RNA 분자로서 발현될 수 있다. 본 발명의 siRNA를 발현시키는 데 적절한 플라스미드의 선택, siRNA를 발현시키기 위한 핵산서열을 플라스미드 내로 삽입하는 방법, 및 재조합 플라스미드를 목적하는 세포로 전달하는 방법은 본 발명이 속하는 분야의 기술 범위 내에 있다. 예를 들면, 문헌 [Tuschl, T. (2002), Nat. Biotechnol, 20: 446-448]; [Brummelkamp TR 등 (2002), Science 296: 550- 553]; [Miyagishi M 등 (2002), Nat. Biotechnol . 20: 497-500]; [Paddison PJ 등 (2002), Genes Dev . 16: 948-958; Lee NS 등 (2002), Nat. Biotechnol . 20: 500-505]; 및 [Paul CP 등 (2002), Nat. Biotechnol . 20: 505-508]을 참고하면 되고, 상기 문헌은 본 발명에서 참고문헌으로 기재되어 있다.
예컨대, 본 발명의 일 구현예에서는 FPRL1의 siRNA로서 타겟 부위를AAUUCACAUCGUGGUGGACAU(서열번호 10)로 하는 이중가닥 RNA 분자 (예컨대, Sense: UUCACAUCGUGGUGGACAUdTdT (서열번호 3) 및 Anti-sense: AUGUCCACCACGAUGUGAAdTdT (서열번호 4))를 사용할 수 있다.
본 발명의 혈관신생 억제용 약학적 조성물은 혈관신생과 관련된 질병의 예방및/또는 치료에 사용될 수 있다. 상기 혈관신생과 관련된 질병은 예컨대 암의 성장 및 전이, 류마티스 관절염, 건선, 당뇨병성 막망증, 당뇨병성 신장병, 고혈압, 자궁내막증, 지방증, 미숙아 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 증식성 망막증, 혈우병성 관절, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 골관절염, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 악성 신경화증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 염증 등으로 이루어진 군에서 선택된 질환 또는 증상일 수 있다. 따라서, 본 발명의 일례는 상기 혈관신생 억제용 약학적 조성물을 유효성분으로 함유하는, 암의 성장 및 전이, 류마티스 관절염, 건선, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신장병, 고혈압, 자궁내막증, 지방증, 미숙아 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 증식성 망막증, 혈우병성 관절, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 골관절염, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 악성 신경화증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 염증등으로 이루어진 군에서 선택된 질환 또는 증상의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명의 혈관신생 촉진용 약학적 조성물 또는 혈관신생 억제용 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 혈관신생 촉진용 약학적 조성물 또는 혈관신생 억제용 약학적 조성물은, 경구, 국소, 비경구, 비 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 안 내, 경피 등의 투여를 목적으로 제조될 수 있다. 바람직하게는, 주사 가능한 형태로 사용될 수 있다.
이에 따라서 특히 처리될 영역으로는 직접적인 주입을 위하여 주사 가능한 조성물을 위한 임의의 약학적으로 허용되는 매개체와 혼합될 수 있다. 본 발명의 조성물은 특히 등장 멸균 용액 또는 멸균수 또는 적절한 생리 식염수의 첨가에 따라 주사 가능한 용액의 조성을 가능케 하는 동결건조 조성물을 포함할 수 있다. 환자의 종양으로의 직접적인 주입은 치료 효율을 감염된 조직에 집중시키도록 하므로 유리하다. 사용되는 투여량은 다양한 파라미터, 특히 유전자, 벡터, 사용되는 투여 방식, 문제시되는 질병 또는 대안적으로 요구되는 치료기간에 의해 조절될 수 있다. 또한, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 약 0.0001 내지 10 mg/kg이고, 바람직하게는 0.001 내지 1 mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.
한편 본 발명의 혈관신생 억제제의 스크리닝 방법은
(a) 서열번호 9의 아미노산 서열 중에서, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 연속하는 38개 이상, 예컨대, 연속하는 38개 내지 140개(예컨대, 103번째부터 242번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 연속하는 38개 내지 100개(예컨대, 103번째부터 202번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 또는 연속하는 38개 내지 80개 (예컨대, 163번째부터 242번째 아미노산까지의 부위 중에서 선택), 바람직하게는 연속하는 38개 내지 39개 아미노산을 포함하는 결합조직 성장인자 단백질의 단편을 암호화하는 유전자를 포함하는 세포에 후보 화합물을 처리하는 단계, 및
(b) 상기 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계
를 포함하고,
상기 후보 화합물을 처리한 세포에서의 상기 유전자의 발현 정도가 후보 물질을 처리하지 않은 세포와 비교하여 감소한 경우, 상기 후보 화합물을 혈관신생 억제제로 결정하는 것을 특징으로 한다.
상기 (a) 단계에서 결합조직 성장인자 단백질의 단편은 예컨대, 서열번호 5또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시될 수 있다. 상기 후보 화합물은 이에 한정되지 않지만 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출물, 식물 추출물, 또는 동물 조직 추출물 일 수 있으며, 신규한 물질뿐 아니라 널리 알려진 것일 수도 있다. 상기 (a) 단계에서의 세포는 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 세포일 수 있으며, 이러한 형질 전환 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
상기 (b) 단계에서 유전자의 발현 정도는 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 RT-PCR로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 유전자의 발현 정도는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 상기 발현에 따른 단백질의 양을 확인하는 방법으로서 항체를 이용하는 경우에는, 표적 단백질에 특이적이고 검출 가능한 표지에 연결된 제2항체를 첨가할 수 있으며, 검출은 또한 제2항체를 첨가한 후, 제2항체에 대한 결합 친화도를 가지며, 검출 가능한 표지에 연결된 제3항체를 첨가할 수도 있다. 제 2항체 또는 제3항체에 검출될 수 있는 표지는 적절한 발색성 기질과 배양시 발색을 나타내는 효소가 사용될 수 있다. 검출 가능한 부분은 분광학적, 효소적, 광화학적, 생화학적, 생체전자공학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단으로 검출가능한 조성물을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 형광 마커 및 염료, 자성 표지, 연결된 효소, 질량 분광 태그, 스핀 표지, 전자 전달 공여자 및 수용자 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 후보 화합물을 처리한 세포에서의 상기 유전자의 발현 정도가 후보 화합물을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 경우, 상기 후보 화합물은 혈관 신생 억제제로서 선별될 수 있다. 상기 혈관신생 억제제는 류마티스 관절염, 건선, 당뇨병성 막망증, 당뇨병성 신장병, 고혈압, 자궁내막증, 지방증, 암, 미숙아 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 증식성 망막증, 혈우병성 관절, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 골관절염, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 악성 신경화증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 염증 등으로 이루어진 군에서 선택된 질환의 예방 또는 치료에 사용되는 것일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 본 발명의 스크리닝 방법을 이용하는 경우, 빠른 시간에 상기 메카니즘에 관여하는 치료제를 선별하고, 이를 입증하는 실험을 통하여 혈관 신생으로 인한 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 유용한 예방제 및/또는 치료제를 제공할 수 있다.
본 발명에서 밝혀 낸 결합조직 성장인자 단백질의 단편은 FPRL1과 결합하는 부위로, FPRL1에 특이적인 ERK 인산화를 효과적으로 유도하며, FPRL1를 활성화하여 세포 내 Ca2+ 농도를 상승시켜, 최종적으로 혈관 생성을 효과적으로 유도하는 활성이 있으며, 이에 따라 결합조직 성장인자 단백질의 단편은 혈관신생 촉진용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있으며, 반면, 상기 결합조직 성장인자 단백질의 단편과 결합하는 폴리펩타이드, 항체 또는 화합물은 혈관신생 억제용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 VEGF-A가 처리된 HUVECs의 조건 배지에서 ERK 인산화 유도되는지 여부를 확인하기 위하여 면역블랏을 수행한 결과이다. 활성
도 2는 조건 배지, VEGF-A 및 양성 대조군(WKYMVm)이 FPRL1을 과발현하는 FPRL1/RBL 세포에서만 ERK 인산화가 유도됨을 확인한 실험결과이다.
도 3은 조건 배지의 HPLC 분획물을 FPRL1/RBL 세포에 처리하여 ERK 인산화 여부를 확인한 결과이다.
도 4는 조건배지의 B12 분획물에 대해 MS/MS 분석을 실시한 결과이다.
도 5는 VEGF-A가 처리된 HUVECs에서 세포 용해물 또는 조건 배지에서 CTGF의 발현 정도를 VEGF-A의 처리시간에 따라 분석한 결과이다.
도 6은 VEGF-A가 처리된 HUVECs에서 세포 용해물 또는 조건 배지에서 CTGF의 발현 정도를 VEGF-A의 처리량에 따라 분석한 결과이다.
도 7은 VEGF-A 수용체에 대한 항체를 투여한 경우 CTGF가 발현이 현저히 감소함을 확인한 결과이다.
도 8은 FPRL1에 대한 CTGF 결합 부위를 결정하기 위한 방법을 나타낸 개략도이다.
도 9는 전장 CTGF 단백질 또는 이의 일부 결실 단백들이 FPRL1/RBL 세포에서 ERK 인산화를 유도하는지 여부를 확인한 결과이다.
도 10은 서열번호 6의 CTGF 링커 폴리펩타이드가 FPRL1/RBL 세포에만 결합하는지 여부를 확인한 결과이다.
도 11은 서열번호 6의 CTGF 링커 폴리펩타이드가 rhCTGF에 비하여 농도 의존적으로 ERK 인산화를 보다 효과적으로 유도함을 확인한 결과이다.
도 12는 서열번호 6의 CTGF 링커 폴리펩타이드가 처리된 FPRL1/RBL 세포에서 Ca2+ 농도가 상승하는지 여부를 확인한 결과이다.
도 13은 HUVECs 세포에서 서열번호 6의 CTGF 링커 폴리펩타이드가 FPRL1에 결합하는지 여부를 확인한 결과이다.
도 14는 서열번호 6의 CTGF 링커 폴리펩타이드를 HUVECs에 처리한 경우 ERK 인산화가 효과적으로 유도됨을 확인한 결과이다.
도 15는 서열번호 6의 CTGF 링커 폴리펩타이드를 HUVECs에 처리한 경우 농도 의존적으로 세포 내 Ca2 + 농도를 증가함을 확인한 결과이다.
도 16은 서열번호 6의 CTGF 링커 폴리펩타이드가 농도 의존적으로 HUVECs 증식을 유도함을 확인한 결과이다.
도 17은 서열번호 6의 CTGF 링커 폴리펩타이드가 농도 의존적으로 HUVECs 이동을 유도함을 확인한 결과이다.
도 18은 서열번호 6의 CTGF 링커 폴리펩타이드가 농도 의존적으로 HUVECs의 관 구조 형성을 유도함을 확인한 결과이다.
도 19는 서열번호 6의 CTGF 링커 폴리펩타이드가 in vivo에서 농도 의존적으로 혈관 생성을 유도함을 확인한 결과이다.
도 20은 VEGF-A가 HUVECs 세포에서 FPRL1 발현을 유도하는지 여부를 배양 시간에 따라 RT-PCR 또는 유세포 분석을 수행하여 확인한 결과이다.
도 21은 VEGF-A가 HUVECs 세포에서 FPRL1 발현을 유도하는지 여부를 처리량에 따라 RT-PCR 또는 유세포 분석을 수행하여 확인한 결과이다.
도 22는 VEGF-A가 HUVECs 증식을 유도함을 확인한 실험결과이다.
도 23은 VEGF-A가 HUVECs 이동을 유도함을 확인한 실험결과이다.
도 24는 VEGF-A가 HUVECs의 관 형태의 구조 형성을 유도함을 확인한 실험결과이다.
도 25는 FPRL1 siRNA를 HUVECs에 처리한 결과 FPRL1 발현이 억제됨을 확인한 결과이다.
도 26은 FPRL1 siRNA를 HUVECs에 처리한 경우 세포 이동이 억제됨을 확인한 결과이다.
도 27은 FPRL1 siRNA를 HUVECs에 처리한 경우 관 형태의 구조 형성이 억제됨을 확인한 결과이다.
도 28은 FPRL1 길항제(WRW4)가 VEGF-A에 의한 혈관 생성을 억제함을 확인한 결과이다.
도 29는 CTGF에 의한 혈관 신생 기작을 나타낸 모식도이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
하기 실시예에서 모든 데이터는 평균±표준편자로 표현하였으며, Student's t test를 통하여 통계 비교하고 p < 0.05인 경우 통계적으로 유의한 것으로 고려하였다.
<실험방법>
1. 실험재료
Phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) 및 ERK1/2 항체를 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA)사에서 구입하고 Human CTGF 항체 및 anti-Flag 항체를 각각 Abcam (Cambridge, MA, USA) 및 Sigma (St. Louis, MO, USA)사에서 구입하였다. 재조합 human CTGF를 BioVendor Laboratory Medicine Inc. (Brno, Czech Republic)사에서 구입하였다. 재조합 human VEGF-A165, anti-VEGF-A mAb, anti-VEGFR-1 mAb, 및 anti-VEGFR-2 mAb는 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)사에서 입수하였다.
FPRL1 에 대한 siRNA (sense:UUCACAUCGUGGUGGACAUdTdT (서열번호 3), anti-sense:AUGUCCACCACGAUGUGAAdTdT(서열번호 4)) 및 luciferase에 대한 siRNA(sense: CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT (서열번호 11), anti-sense: UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT(서열번호 12))를 Dharmacon Research, Inc. (Chicago, IL)사에서 합성하였다. 또한 WKYMVm(서열번호 1), WRWWWW(서열번호 2, WRW4), 및 biotinylated WKYMVm은 A&PEP Inc (Seoul, Korea)에서 합성하였으며, 순도가 95%를 초과하였다. human CTGF 링크 부위의 아미노산 서열이 포함된 링커 폴리펩타이드(EWVCDEPKDQTVVGPALAAYRLEDTFGPDPTMIRANCLV(서열번호 6)-NH2)는 Anygen Co. Ltd. (Gwangjoo, Korea)에서 합성하였으며, 순도가 99.1% 정도였다.
2. 세포배양
인간의 제대 정맥 내피세포(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)를 종래 공지된 방법(Ferrero, E. et al . Transendothelial migration leads to protection from starvation-induced apoptosis in CD34+CD14+ circulating precursors: evidence for PECAM-1 involvement through Akt/PKB activation. Blood 101, 186-193, 2003)에 따라 콜라겐 분해효소 (collagenase)(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 처리하여 제대(umbilical cord)(ST. MARY'S Hospital, Seoul, Korea)에서 분리하였다. 상기 분리된 HUVECs를 Medium 199 (Sigma, St. Louis, MO, USA)(1%(w/v) 페니실린/스트렙토마이신 및 20%(v/v)의 열로 비활성화된 우태아혈청이 함유됨)를 사용하여 0.2%(w/v) 젤라틴이 코팅된 디쉬(dish)에서 배양하였다.
본 실험을 위하여, 각 세포는 포화(subconfluence) 상태에 이르도록 배양하고 3 계대(passages) 내지 5 계대인 것을 사용하였다. FPRL1를 발현하는 rat basophil leukemia (RBL)-2H3 (FPRL1/RBL) 세포, FPR를 발현하는 RBL-2H3 (FPR/RBL) 세포, 및 RBL-2H3 (vector/RBL) 세포 (FPRL1 또는 FPR receptor가 overexpression 되지 않은 세포)(이상, ATCC, Manassas, VA, USA)를 1% 페니실린/스트렙토마이신, 20% (v/v)의 열로 비활성화된 우태아혈청 및 G418 (Geneticin)(500 ug/ml)가 추가된 고 농도의 포도당이 포함된 DMEM 배지(Sigma, St. Louis, MO, USA)에 유지시켰다. 상기 세포를 37℃에서 5% CO2 , 에서 배양하였다.
3. 조건 배지( Conditioned medium )
우태아혈청(FBS)이 포함되지 않은 Medium 199에서 배양된 HUVECs(4 계대 내지 7 계대)에서 조건 배지(Conditioned Media)를 수득하였다. 상기 조건 배지를 원심 분리하여 잔존 세포를 제거하고 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
4. 웨스턴 블랏 분석( Western blot analysis )
Vector/RBL 세포, FPR/RBL 세포, FPRL1/RBL 세포, 및 HUVECs를 포화가 될 때까지 배양하고 혈청을 고갈(serum-starved)시켰다. 상기 자극된 세포(1X105 cells) 를 PBS로 2번 수세하고 샘플 버퍼(50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% Nonidet P-40, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml 아프로티닌, 1 μg/ml 펩스타딘, 및 1 μg/ml 류펩틴(leupeptin)) 1 ml에 녹이고, 95℃에서 30초간 가열한 후 SDS-PAGE로 분리한 다음, 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. Anti-phospho-ERK(extracellular signal regulated kinase)1/2 (Thr202/Tyr204)(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), anti-ERK1/2 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), anti-CTGF (Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-Actin (Sigma, St. Louis, MO, USA), 또는 anti-Flag (Sigma, St. Louis, MO, USA) 항체로 면역 블랏을 수행한 후, 상기 막을 화학 발광(chemiluminescence substrate, Amersham Pharmacia) 기질로 시각화하였다.
5. FPRL1 ( formyl peptide receptor - like 1) 활성화 단백질의 동정
HUVEC에서 수득한 조건 배지(CM)를 HLB 카트리지(waters)에 로딩하고 역상 컬럼(reverse phase (RP) C18 column)를 사용하여 분리하였다. RP C18 HPLC 컬럼(218 TP5215; 2.1 mm x 150 mm, Vydac)을 water/0.1%(w/v) TFA로 균일화(equilibrated)하였다. ACN/0.1%(w/v) TFA를 0%(w/v) 에서 100%(w/v)까지 농도 구배를 두어 150 ul의 분획물을 수득하였다. 상기 얻어진 활성 분획물에 트립신을 처리하고 37℃에서 밤새 배양하였다.
상기 활성 분획물의 MS 및 MS/MS data를 수득하기 위하여 nano-ESI source가 준비된 Ultimate HPLC 시시스템 (LC Packings) 및 a QSTAR PULSAR I hybrid Q-TOF MS/MS 시스템 (Applied Biosytems/PE SCIEX)으로 구성된 nano-LC MS를 사용하였다. 상기 QSTAR를 24시간 동안 일정한 질량으로 8000 내지 10000 해상도에서 작동시켰다. 스프레이 팁(spray tip)을 전압을 2300 V로 설정하고, QSTAR에 의해 감지된 모든 질량 수치는 Applied Biosystems (AB)사에서 제공된 Analyst QS 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. MS/MS 분석을 위해, 질량 수치 스펙트라(common mass values spectra)를 MASCOT search engine(version 1.7, in-house)을 사용하여 non-redundant 데이터베이스를 통해 분석하여 서열 정보를 수득하였다. 상기와 같이 수득한 MASCOT 결과는 random match에 의해 지시된 것보다 높은 MOWSE 수치를 가지도록 하였다. (p < 0.05).
6. 플라스미드 제조, 형질감염 및 단백질 정제
Ala41까지의 코딘 신호 펩타이드(chordin signal peptide)이후에 Flag-tag 서열이 포함된 pCS2+ 발현 벡터에 삽입된 제노푸스(Xenopus) CTGF의 전장 및 결실 변이체를 E. M. De Robertis (University of California, Los Angeles, CA)로 부터 제공받았다 (EcoRI-Chordin signal peptide-20 N.terminal AAs of chordin-FLAG epitope (DYKDDDDK)-Xho I-INSERT-Xba I in pCS2 + ) (Abreu, J.G., Ketpura, N.I., Reversade, B. & De Robertis, E.M. Connective-tissue growth factor (CTGF) modulates cell signalling by BMP and TGF-[beta]. Nat Cell Biol 4, 599-604, 2002). 상기 결실 변이체는 CTGF/I-II-L, CTGF/II-L, CTGF/II, CTGF/L, CTGF/L-III-IV, 및 CTGF/I-L-III-IV로 명명하였으며, 그 구체적인 결실 내용은 도 8에 나타내었다 (결실된 부위는 점선으로 표시함).
상기 Flag-tag된 분비 단백질은 제조사의 지시에 따라 리포펙타민(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 HEK 293T 세포 (ATCC, Manassas, VA, USA)를 핵산 전달 감염(transient transfection)시킴으로써 수득하였다. HEK293T 세포로부터 전장 및 결실 변이체 Flag-CTGF를 anti-Flag M2 affinity 겔 컬럼을 사용하여 친화 정제하고, 제조사의 지시에 따라 Flag 펩타이드를 용리하였다. 상기 단백질의 순도는 Silver Stain Plus 키트 (Bio-Rad)를 이용하여 은 염색을 통해 결정하였다.
7. 비오틴화 및 유세포 분석
human CTGF의 링크 부위와 대응하여 링커 폴리펩타이드의 결합 정도를 평가하기 위하여, 제조사의 지시에 따라 EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation 키트 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA)를 사용하여 링커 폴리펩타이드를 표지하였다. 링커 폴리펩타이드는 상온에서 1시간 동안 PBS에 9 mM sulfo-NHS-LC-biotin (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA)과 함께 배양하였다. 비오틴화하는 동안, vector/RBL cells, FPR/RBL cells, FPRL1/RBL cells, 또는 HUVECs를 트립신 처리하고 수집한 다음 상온에서 30분 동안 토끼 혈청을 처리하였다. 얼음에서 30분 동안 비오틴화한 링커 폴리펩타이드를 배양한 후, 상기 세포들을 ice-cold PBS로 얼음에서 짧게 수세하고, antihuman fluoroscein-5-isothiocyanate (FITC)-conjugated 스트렙타비딘 (Pierce Chemical Co.)으로 배양한 다음, ice-cold PBS로 수세하고 1% 포름알데히드 용액으로 고정했다. 이후, 종래 알려진 방법에 따라 CellQuest 및 WinMDI 2.9 소프트웨어로 FACS Caliber 시스템 (BD Biosciences, San Jose, CA)을 사용하여 분석하였다. (He, R., Sang, H. & Ye, R.D. Serum amyloid A induces IL-8 secretion through a G protein-coupled receptor, FPRL1/LXA4R. Blood 101, 1572-1581, 2003)
8. Ca 2 + 측정
FPRL1/RBL, vector/RBL 또는 FPR/RBL 세포를 37℃에서 1시간 동안 0.03%(w/v) plutonic F-127이 함유된 fluo-3-AM working solution (Molecular Probes)에서 배양하였다. 이 때 fluo-3-AM의 최종 농도는 20 uM/L가 되도록 하였다. 상기 배양 후, 세포에서 fluo-3-AM 형광이 high-power Ar+ 레이저로 488 nm에서 발하였으며, 방출 밴드를 photomultiplier로 530 nm에서 측정하였다. 형광 신호를 Nikon E-600 Eclipse microscope가 갖춰진 공초점 현미경(confocal laser scanning system, LSM 510 Meta; Carl Zeiss, Jena, Germany)을 사용하여 감지하였다. 형광 강도는 CTGF 추가 전(F0) 및 추가 후(F) 둘 다 특정하였다. 세포 내의 Ca2 + 농도 [Ca2+]i의 변화는 F/F0 비율로 표현하였다. 각 세포로부터 50 내지 120개의 이미지를 스캔하였다.
9. 혈관 생성 분석( in vitro angiogenesis assay )
증식도 분석(proliferation assay)을 위해, HUVECs를 겔라틴으로 코팅된 24-웰 배양 디쉬에 2 x 104 세포/웰로 평판 배양하여 밤새 접착되도록 하였다. 혈청이 고갈된 4시간 후에, 상기 세포에 다양한 미토겐(CTGF 링커 폴리펩타이드, CTGF)을 48시간 동안 처리하였다. [3H]-thymidine (1 μCi, Amersham International)을 배양 마지막 6시간 전에 각 웰에 첨가하였다. 삽입된 [3H]-thymidine을 37℃에서 1시간 동안 0.2 M NaOH 및 0.1% SDS 용액에서 추출하였다. 액체 섬광 계수기(liquid scintillation counter, Beckmann Instruments)를 이용하여 방사능을 측정하고 그 결과를 3번 반복하여 분 당 평균±표준편차로 표현하였다.
HUVECs의 상처 이동(wounding migration) 및 튜브 형성 활성을 하기와 같이 확인하였다.
구체적으로 60-mm 배양 디쉬 상에 포화 상태(confluence)로 접종된 HUVECs를 피펫 끝으로 상처를 입히고, 1% 혈청과 1 mM thymidine이 추가된 Medium 199에서 이에 링커 폴리펩타이드 (10-1 ~ 102 nM) 또는 재조합 CTGF (recombinant human CTGF, rhCTGF; BioVendor R&D, NC, USA)(101 또는102 nM)을 처리하였다. 16시간 배양한 후, 참조 선(reference line)을 넘어서 이동한 세포를 세어 이동 정도를 정량화하고 상기 세포를 50배로 확대하여 촬영하였다.
한편 튜브 형성 분석을 위해, 종전 중합된 Matrigel(BD Biosciences) 층에 HUVECs를 일정 양의 링커 폴리펩타이드, rhCTGF 또는 VEGF-A165와 함께 접종하였다. 18시간 배양 후, 세포 형태를 위상차 현미경 (phase-contrast microscopy)를 통해 관찰하고 40배로 확대하여 촬영하였다. image-Pro Plus v4.5 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD)를 이용하여 각 웰에서 5번 무작위로 선택된 LPF(low-power fields)에서 튜브의 길이를 측정함으로써 튜브 형성 정도를 정량화하였다.
10. CAM ( chorioallantoic membrane ) 분석
in vivo에서의 CAM 분석은 종전 공지된 방법에 따라 수행하였다. (Lee, M.-S. et al . Angiogenic Activity of Pyruvic Acid in in Vivo and in Vitro Angiogenesis Models. Cancer Res 61, 3290-3293, 2001)
수정된 계란을 37℃에서 일정한 습도로 설정된 에그 브리더(egg breeder)에서 배양하였다. 배양 후 3일째에, 껍질에서 발현된 CAM을 떼어내기 위해 18-게이지 피하침으로 약 2 ml의 계란 알부민을 뽑아 내었다. 6일 동안 추가 배양한 후, 샘플이 담긴 thermanox coverslips (Nunc)을 공기 중에서 말리고, 이를 링커 폴리펩타이드 또는 rhCTGF에 의한 신생혈관 형성 활성을 시험하기 위해 CAM 표면에 적용하였다. 3일 후, 1-2 ml의 10%(w/v) 지방 유제 (Intralipose)를 융모요막(chorioallantois)에 주입하고 현미경으로 이를 관찰하였다.
11. FPRL1 전사에 대한 siRNA 의 제조 및 형질감염
siRNA를 이용하여 human FPRL1 전사를 억제하기 위해, FPRL1 에 대한 siRNA (sense:UUCACAUCGUGGUGGACAUdTdT (서열번호 3), anti-sense:AUGUCCACCACGAUGUGAAdTdT(서열번호 4))를 사용하였다. 상기 siRNA 서열을 BLAST search한 결과, 데이터베이스 상의 어떠한 다른 서열과도 유의적인 유사성이 없는 것을 확인하였다. 상기 올리고뉴클레오티드는 유사한 결과를 보였다. HUVECs를 siRNA 형질 감염 과정에 사용하였다. 상기 세포를 최종 농도 20 nM FPRL1 siRNA (서열번호 3 및 서열번호 4) 또는 대조군으로 luciferase siRNA (서열번호 11 및 서열번호 12)로 형질 감염하였다. 이때 제조사의 지시에 따라 Lipofectamine reagent (Invitrogen Life Technologies)을 사용하였다. 상기 세포를 무혈청 배지로 수세하고 20%(v/v) FBS를 함유한 배지가 추가된 형질 감염 혼합물로 4.5 시간 동안 배양하였다. 상기 세포를 배양한 지 24시간 및 48시간 후 수집하고 FPRL1 발현 정도를 RT-PCR 분석을 통해 확인하였다.
12. RT - PCR 분석
제조사의 지시에 따라 상업적으로 이용 가능한 TRI reagent (Molecular Research Center)를 이용하여 상기 형질 감염된 HUVECs에서 모든 RNA를 분리하였다. 3 ug의 각 DNA-free total RNA 시료 및 oligo(dT)15와 Moloney murine leukemia virus 역전사 효소 (Promega, WI, USA) 를 이용하여 제조사의 지시에 따라 first-strand cDNA를 합성하였다. 이후 1x PCR 버퍼, 200 uM dNTPs, 10 uM의 각 특이 프라이머 (sFPRL1: 5'-GACCTTGGATTCTTGCTCTAGTC-3'(서열번호 13), asFPRL1: 5'-GGATCAGTCTCTCTCGGAAGTC-3'(서열번호 14), sCTGF: 5'-TTCCAGAGCAGCTGCAAGTACCA-3'(서열번호 15), asCTGF: 5'-TTGTCATTGGTAACCCGGGTGGA-3'(서열번호 16)), 및 1.25 units Taq DNA 중합효소 (Perkin-Elmer)가 함유된 50 ul 반응용액으로 동량의 cDNA를 증폭하였다. 증폭 산물을 1.5% 아가로스 겔 상에서 전기 영동하고 EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 적외선 투시로 현상화하였다.
<실험결과>
1. VEGF -A가 처리된 HUVECs 의 조건 배지의 ERK 인산화 유도 활성
염증성 사이토카인의 일종인 혈관내피세포 성장인자-A(vascular endothelial growth factor-A, VEGF-A)는 혈관 신생(angiogenesis) 조절에 있어서, G-단백질 연결 수용체(G-protein-coupled receptor)인 FPRL1(formyl peptide receptor-like 1)과 많은 세포 기능을 공유한다. 그러나 VEGF-A와 FPRL1이 구체적으로 어떻게 상호 작용하는지 여부에 대해서는 알려진 바가 없다.
본 발명자들은 이를 확인하기 VEGF-A가 처리된 인간의 제대 정맥 내피세포(HUVEC)에서 조건 배지(CM)을 수득하고 이를 FPRL1-과발현되는 세포인 FPRL1/RBL에 10ng/ml 또는 50ng/ml로 8시간 동안 처리하였다. 이때 양성 대조군으로 FPRL1의 작용 펩타이드(agonistic peptide)인 WKYMVm(Trp-Lys-Tyr-Met-Val-D-Met, 서열번호 1)을 10 nM로 처리하였다.
상기 처리 후, anti-phospho ERK(extracellular signal regulated kinase)1/2 및 anti-ERK1/2 항체 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)로 니트로셀룰로오즈 막에 옮겨진 세포 용해물에 대하여 면역 블랏을 수행한 후, 상기 막을 화학 발광(chemiluminescence substrate, Amersham Pharmacia) 기질로 시각화한 결과를 도 1에 기재하였다.
상기 도 1에 기재한 바와 같이, VEGF-A가 처리된 HUVECs에서 수득한 조건 배지는 농도 의존적으로 ERK 인산화를 증가시킴을 알 수 있다.
한편 상기 조건 배지 또는 VEGF-A를 상기 기재한 vector/RBL, FPR/RBL, 또는 FPRL1/RBL 세포에 10 ng/ml로 8시간 동안 각각 처리하고 또한 양성 대조군으로 작용 펩타이드(agonistic peptide)인 WKYMVm(서열번호 1)을 10 nM 처리하였다. 이후 상기와 같이 동일한 방법으로 면역블랏을 수행하고 그 결과를 도 2에 기재하였다.
상기 도 2에 기재한 바와 같이, 조건 배지, VEGF-A 및 양성 대조군은 모두 FPRL1을 과발현시키는 FPRL1/RBL 세포에서만 ERK 인산화를 증가시킴을 알 수 있다. 따라서 상기 조건 배지에 의한 ERK 인산화는 FPRL1에 특이적임을 알 수 있다.
2. 조건 배지에서 ERK 인산화 유도 활성이 있는 단백질의 동정
상기 <실험방법 5>에 기재한 바와 같이, 상기 조건 배지의 HPLC 분획물 40ug을 FPRL1/RBL 세포에 5분 처리하고 상기 <실험결과 1>과 같이 ERK 인산화 여부를 확인한 결과를 도 3에 기재하였다.
상기 도 3에 기재한 바와 같이, B12 내지 C4가 포함된 분획물이 FPRL1/RBL 세포에서 ERK 인산화를 유도함을 알 수 있으며 B11에서 C4까지의 각 분획물의 활성 피크를 조사한 결과, B12, C3 분획물에서만 피크가 관찰됨을 알 수 있다.
상기 결과로부터 FPRL1/RBL 세포에서 ERK 인산화를 유도할 수 있는 활성이 있는 단백질은 B12에 함유되어 있음을 가정하고, 상기 B12 분획물에 대해 상기 <실험방법 5>에 기재된 MS/MS 분석을 실시하고 그 결과를 도 4에 기재하였다.
상기 도 4에 기재한 바와 같이, 인간의 결합조직 성장인자(connective-tissue growth factor, CTGF)의 아미노산 서열과 일치하는 5개의 폴리펩타이드 서열(도 4에 밑줄 친 부분)이 검출되었다.
따라서 FPRL1/RBL 세포에서 ERK 인산화를 유도할 수 있는 활성이 있는 단백질은 CTGF임을 알 수 있다.
3. VEGF -A에 의한 CTGF 발현 유도
상기 <실험결과 2>를 통하여, 본 발명자들은 VEGF-A가 처리된 HUVECs에서 분비한 조건 배지에서 CTGF가 FPRL1과 결합하여 FPRL1/RBL 세포에서 ERK 인산화를 유도할 수 있는 활성이 있을 것으로 생각하였다.
이를 확인하기 위하여 본 발명자들은 상기 실험방법에 기재한 RT-PCR 및 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다. 구체적으로 VEGF-A가 처리된 HUVECs에서 세포 용해물 또는 조건 배지에서 CTGF의 발현 정도를 VEGF-A의 처리시간에 따라 분석한 결과 또는 VEGF-A의 처리량에 따라 분석한 결과를 각각 도 5 및 도 6에 기재하였다.
상기 도 5에 기재한 바와 같이, RT-PCR 분석결과 VEGF-A를 HUVECs에 처리한지 0.5 시간이 경과한 때부터 CTGF mRNA가 증가함을 알 수 있으며, 웨스턴 블랏 분석결과 세포 용해물에서는 2시간 경과한 때부터 CTGF 수치가 증가하고 나아가 조건 배지에서는 4시간 경과한 때부터 CTGF 수치가 증가함을 알 수 있다.
또한 도 6에 기재한 바와 같이, RT-PCR 및 웨스턴 블랏 분석결과 VEGF-A 처리량에 비례하여 CTGF 수치가 증가함을 알 수 있다.
한편 본 발명자들은 VEGF-A 수용체가 CTGF 합성에 관여하는지 여부를 추가적으로 확인하였다. 구체적으로 VEGF-A (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), VEGF receptor-1 (VEGFR-1) (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), VEGF receptor-2 (VEGFR-2) (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)의 중화 항체, 그리도 대조군으로 IgG 항체를 HUVECs에 5 ug/ml로 30분 동안 처리하고 VEGF-A를 20 ng/ml를 처리하였다. 2시간 경과 후, 세포 용해물을 수득하여 항-human CTGF 항체로 면역 블랏을 수행하고 그 결과를 도 7에 기재하였다.
상기 도 7에 기재한 바와 같이, VEGF-A 수용체에 대한 항체를 투여한 경우 CTGF가 발현이 현저히 감소함을 알 수 있다. 따라서 상기 결과를 바탕으로 VEGF-A에 의한 CTGF 발현 유도는 수용체 커플링에 의하여 조절됨을 알 수 있다.
4. FPRL1 에 대한 CTGF 결합 부위결정
본 발명자들은 FPRL1에 대한 CTGF 결합 부위를 결정하기 위하여, 상기 <실험방법 6>에 기재한 방법으로 도 8에 기재한 바와 같이 전장 CTGF 단백질 또는 이의 일부 결실 단백질을 암호화하는 유전자가 CTGF/I-II-L, CTGF/II-L, CTGF/II, CTGF/L, CTGF/L-III-IV, 및 CTGF/I-L-III-IV가 삽입된 플라스미드를 제조하고, 이를 HEK 293T 세포 (ATCC, Manassas, VA, USA)에 형질감염하고 이를 통해 각 단백질을 정제하였다.
상기 정제된 단백질들이 FPRL1/RBL 세포에서 ERK 인산화를 유도하는 여부를 상기 <실험결과 1>과 같이 면역 블랏을 수행하고 그 결과를 도 9에 기재하였다.
상기 도 9에 기재한 바와 같이, CTGF/II를 제외하고는 모두 ERK 인산화를 유도함을 알 수 있다. 상기 결과를 바탕으로 CTGF/II를 제외한 결실 단백질의 공통 부위를 도출함으로써 전장 CTGF 단백질 (MTAASMGPVRVAFVVLLALCSRPAVGQNCSGPCRCPDEPAPRCPAGVSLVLDGCGCCRVCAKQLGELCTERDPCDPHKGLFCDFGSPANRKIGVCTAKDGAPCIFGGTVYRSGESFQSSCKYQCTCLDGAVGCMPLCSMDVRLPSPDCPFPRRVKLPGKCCEEWVCDEPKDQTVVGPALAAYRLEDTFGPDPTMIRANCLVQTTEWSACSKTCGMGISTRVTNDNASCRLEKQSRLCMVRPCEADLEENIKKGKKCIRTPKISKPIKFELSGCTSMKTYRAKFCGVCTDGRCCTPHRTTTLPVEFKCPDGEVMKKNMMFIKTCACHYNCPGDNDIFESLYYRKMYGDMA)의 164 내지 201 번째 부위(굵은 글씨로 표시, 서열번호 5)가 FPRL1에 대한 CTGF 결합 부위임을 알 수 있다.
5. CTGF 링커 폴리펩타이드의 FPRL1 의 결합 여부 확인
본 발명자들은 상기 <실험결과 4>에서 확인한 CTGF 결합 부위가 포함된 링커 폴리펩타이드(서열번호 6, EWVCDEPKDQTVVGPALAAYRLEDTFGPDPTMIRANCLV, 서열번호 5의 N 말단쪽의 아미노산 하나(E)를 추가로 포함) 10 nM을 <실험방법 7>과 같이 비오틴화하고 이를 FPRL1/RBL, vector/RBL 또는 FPR/RBL 세포와 함께 배양한 다음 유세포 분석을 실시하고 그 결과를 도 10에 기재하였다.
상기 도 10에 기재한 바와 같이, 상기 CTGF 링커 폴리펩타이드는 FPRL1/RBL 세포에만 결합하는 것을 알 수 있다. 또한 도 1에 기재한 바와 같이, FPRL1 길항제인 WRW4 (서열번호 2) 10 uM을 FPRL1/RBL, vector/RBL 또는 FPR/RBL 세포에 처리하고 30분 동안 배양한 경우, FPR/RBL 세포에서 상기 링커 폴리펩타이드 결합이 저해됨을 알 수 있다.
따라서 상기 결과를 바탕으로, CTGF 링커 폴리펩타이드가 FPRL1에 특이적으로 결합함을 알 수 있으며, 이를 통해 상기 링커 폴리펩타이드가 FPRL1에 의한 ERK의 인산화나 Ca2 + 농도를 상승시킬 수 있음을 알 수 있다.
6. CTGF 링커 폴리펩타이드에 의한 ERK 의 인산화 촉진
CTGF 링커 폴리펩타이드가 ERK 인산화를 효과적으로 유도하는지 여부를 재조합 CTGF (recombinant human CTGF, rhCTGF)와 비교하였다. 구체적으로 FPRL1/RBL 세포에 CTGF 링커 폴리펩타이드와 rhCTGF를 5분 동안 다양한 농도로 처리하고 ERK 인산화 여부를 측정하여 그 결과를 도 11에 기재하였다.
상기 도 11에 기재한 바와 같이, CTGF 링커 폴리펩타이드가 rhCTGF에 비하여 농도 의존적으로 ERK 인산화를 보다 효과적으로 유도함을 알 수 있다.
또한 상기 CTGF 링커 폴리펩타이드 또는 rhCTGF를 10 nM을 FPRL1/RBL 세포에 첨가할 때, WRW4 10 uM를 첨가하거나 첨가하지 않은 경우 ERK 인산화 정도를 비교하여 도 11에 기재하였다.
상기 도 11에 기재한 바와 같이, CTGF 링커 폴리펩타이드(LK로 표시)가 rhCTGF(CTGF로 표시)에 비하여 보다 효과적으로 ERK 인산화를 유도함을 알 수 있으며, 특히 FPRL1 길항제인 WRW4를 처리한 경우 ERK 인산화가 억제됨을 알 수 있다.
7. CTGF 링커 폴리펩타이드에 의한 Ca 2 + 농도 상승
FPRL1이 활성화되면 세포 내 Ca2 + 농도가 상승하므로 본 발명자들은 CTGF 링커 폴리펩타이드에 의하여 FPRL1이 활성화되고 최종적으로 세포 내 Ca2+ 농도가 상승하는지 여부를 <실험방법 8>을 통하여 확인하고 그 결과를 도 12에 기재하였다.
상기 도 12에 기재한 바와 같이, 공초점 현미경으로 조사한 결과 CTGF 링커 폴리펩타이드가 처리된 FPRL1/RBL 세포에서만 Ca2 + 농도가 상승함을 알 수 있다. 나아가 실제 FPRL1/RBL 세포 내 Ca2 + 농도를 측정한 결과, CTGF 링커 폴리펩타이드에 농도 의존적으로 증가함을 알 수 있으며, 이러한 활성은 rhCTGF 보다 효과적이고 양성 대조군인 FPRL1의 작용제인 WKYMVm(Wm로 표시)와 비슷함을 알 수 있다. 또한 FPRL1의 길항제인 WRW4 10 uM을 투여한 결과 CTGF 링커 폴리펩타이드에 의한 세포 내 Ca2 + 농도 증가 정도가 감소함을 알 수 있다.
상기 결과를 바탕으로 CTGF는 상기 링커 부위를 통해 FPRL1과 직접 결함하고 이를 통해 FPRL1을 활성화 시킴을 알 수 있다.
8. HUVECs 에서 CTGF 링커 폴리펩타이드의 FPRL1 결합 및 활성화 확인
본 발명자들은 인간의 제대 정맥 내피세포 (HUVECs)에서 FPRL1을 다량 발현하므로, VEGF-A가 처리된 HUVECs에서 CTGF를 분비하는지 여부를 확인하고 이를 통해 혈관 신생 여부를 조사하였다.
HUVECs 세포에서 상기 CTGF 링커 폴리펩타이드가 FPRL1에 결합하는지 여부를 상기 <실험방법 7>과 같이 조사하고 그 결과를 도 13에 기재하였다. 구체적으로 HUVECs 세포에 상기 CTGF 링커 폴리펩타이드를 10 nM로 처리하고 30분 동안 배양한 다음 상기 <실험방법 7>과 같이 유세포 분석을 실시하였다. 이때 WRW4 10 uM을 함께 처리하였다.
상기 도 13에 기재한 바와 같이, HUVECs에 상기 CTGF 링커 폴리펩타이드를 처리한 경우 처리하지 않은 경우(vehicle만을 처리한 경우)에 비하여 평균 수치가 오른쪽으로 이동함을 알 수 있다. 그러나 FPRL1 길항제인 WRW4를 처리한 경우 상기와 같은 이동은 관찰되지 않는다.
한편 상기 CTGF 링커 폴리펩타이드 또는 rhCTGF를 다양한 농도로 HUVECs에 5분 동안 처리하고 세포 용해물을 수득한 다음, 상기 기재한 바와 같이 항-phospho ERK1/2 항체로 면역블랏을 수행하여 그 결과를 도 14에 기재하였다.
상기 도 14에 기재한 바와 같이, CTGF 링커 폴리펩타이드를 HUVECs에 처리한 경우에도 ERK 인산화가 효과적으로 유도되며, FPRL1의 길항제인 WRW4 (10 uM)를 처리하면 ERK 인산화가 억제됨을 알 수 있다.
또한 상기 CTGF 링커 폴리펩타이드 또는 rhCTGF를 다양한 농도로 HUVECs에 1시간 동안 처리하고 상기 기재한 바와 같이 세포 내 Ca2 + 농도가 증가되는지 여부를 확인하여 그 결과를 도 15에 기재하였다.
상기 도 15에 기재한 바와 같이, CTGF 링커 폴리펩타이드는 농도 의존적으로 세포 내 Ca2 + 농도를 증가시키나 FPRL1의 길항제인 WRW4 (10 uM)를 처리한 경우 그렇지 않음을 알 수 있다.
상기 결과로부터 CTGF는 링커 부위를 통해 HUVECs에서도 FPRL1과 특이적으로 결합하여 이를 통해 HUVECs를 활성화 시킴을 알 수 있다.
9. CTGF 링커 폴리펩타이드의 혈관 생성 유도 효과
혈관 생성(angiogenesis)이 진행되면 내피 세포 증식, 기존 혈관의 발아에 따른 이동 및 관 형태의 구조가 형성되므로(Carmeliet, P. & Jain, R.K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature 407, 249-257, 2000), 본 발명자들은 CTGF 링커 폴리펩타이드가 상기와 같은 혈관 생성을 유도하는지 여부를 <실험방법 9>를 통하여 확인하고 그 결과를 도 16 내지 18에 기재하였다.
상기 도 16에 기재한 바와 같이, CTGF 링커 폴리펩타이드가 농도 의존적으로 HUVECs 증식을 재조합 CTGF 보다 효과적으로 유도하는 것을 알 수 있으며, 나아가 FPRL1의 길항제인 WRW4 (10 uM)을 처리한 경우 상기와 같은 증식을 유도하지 못함을 알 수 있다.
또한 상시 도 17에 기재한 바와 같이, CTGF 링커 폴리펩타이드는 농도 의존적으로 HUVECs 이동을 재조합 CTGF 보다 효과적으로 유도하는 것을 알 수 있으며, 나아가 FPRL1의 길항제인 WRW4 (10 uM)을 처리한 경우 상기와 같은 세포 이동을 유도하지 못함을 알 수 있다.
또한 상기 도 18에 기재한 바와 같이, CTGF 링커 폴리펩타이드는 HUVECs의 관 형태의 구조 형성을 재조합 CTGF 보다 효과적으로 유도함을 알 수 있으며, 나아가 FPRL1의 길항제인 WRW4 (10 uM)을 처리한 경우 상기와 같은 관 형태의 구조 형성을 유도하지 못함을 알 수 있다.
상기와 같은 결과를 통해, CTGF 링커 폴리펩타이드가 세포의 증식, 이동 및 관 형태의 구조를 전장 CTGF 보다 효과적으로 유도하므로, 혈관 생성을 촉진함을 알 수 있다.
이에 본 발명자들은 상기와 같은 결과를 바탕으로 in vivo에서 혈관 생성 활성이 있는지 여부를 <실험방법 10>을 통해 확인하고 그 결과를 도 19에 기재하였다.
상기 도 19에 기재한 바와 같이, CTGF 링커 폴리펩타이드는 in vivo에서도 농도 의존적으로 혈관 생성을 매우 강하게 유도함을 알 수 있으며, 그 결과로 소위 바퀴 모양의 형태의 혈관이 형성됨을 알 수 있다. 그러나 FPRL1의 길항제인 WRW4 (10 uM)을 처리한 경우 상기와 같은 혈관 형성이 유도되지 못함을 알 수 있다.
따라서 CTGF는 링커 부위를 통하여 FPRL1에 결합하고 이를 통하여 in vitro 및 in vivo에서 혈관 생성을 유도함을 알 수 있다.
10. VEGF -A의 FPRL1 발현 촉진 효과
본 발명자들은 상기와 같은 결과를 바탕으로, 혈관 생성과정에서 CTGF/FPRL1 결합체가 VEGF-A의 활성을 중재할 수 있다고 생각하였다.
이에 VEGF-A가 HUVECs 세포에서 FPRL1 발현을 유도하는지 여부를 확인하였다. 구체적으로 HUVECs에 20 ng/ml VEGF-A를 처리하고 다양한 시간 동안 배양한 다음, 상기 <실험방법 12>에 따라 RT-PCR를 수행하여 FPRL1 발현 정도를 측정하여 그 결과를 도 20에 기재하였다. 또한 <실험방법 7>에 따라 유세포 분석을 수행하고 그 결과를 도 20에 기재하였다.
또한 HUVECs에 다양한 농도로 VEGF-A를 처리하고 배양한 다음 상기 <실험방법 12>에 따라 RT-PCR를 수행하여 FPRL1 발현 정도를 측정하여 그 결과를 도 21에 기재하였다. 또한 <실험방법 7>에 따라 유세포 분석을 수행하고 그 결과를 도 21에 기재하였다.
상기 도 20 및 도 21에 기재한 바와 같이, VEGF-A가 HUVECs에서 농도 의존적으로 FPRL1 발현을 유도함을 알 수 있다.
11. VEGF -A의 CTGF / FPRL1 결합체를 통한 혈관 생성 유도 효과
본 발명자들은 FPRL1 길항제인 WRW4에 의하여 VEGF-A에 의한 혈관 생성이 억제되는지 여부를 추가적으로 확인하였다. 이를 통해 VEGF-A에 의한 혈관 생성은 FPRL1의 활성화에 기인한 것임을 알 수 있다.
먼저 HUVECs에 VEGF-A를 20 ng/ml로 투여하고 상기 <실험방법 9>를 통하여 세포 증식 정도, 세포 이동, 또는 관 형태의 구조 형성 여부를 확인하고 그 결과를 도 22 내지 도 24에 기재하였다. 이때 FPRL1 길항제인 WRW4를 추가적으로 첨가하였다.
상기 도 22에 기재한 바와 같이, VEGF-A가 HUVECs 증식을 유도하는 것을 알 수 있으며, 나아가 FPRL1의 길항제인 WRW4를 처리한 경우 상기와 같은 증식을 유도하지 못함을 알 수 있다.
또한 상시 도 23에 기재한 바와 같이, VEGF-A는 HUVECs 이동을 유도하는 것을 알 수 있으며, 나아가 FPRL1의 길항제인 WRW4 (10 uM)을 처리한 경우 상기와 같은 세포 이동을 유도하지 못함을 알 수 있다.
또한 상기 도 24에 기재한 바와 같이, VEGF-A는 HUVECs의 관 형태의 구조 형성을 유도함을 알 수 있으며, 나아가 FPRL1의 길항제인 WRW4 (10 uM)을 처리한 경우 상기와 같은 관 형태의 구조 형성을 유도하지 못함을 알 수 있다.
한편 상기 <실험방법 11>에 기재한 바와 같이, FPRL1 siRNA를 이용하여 FPRL1 발현을 억제하고 상기 <실험방법 12>에 따라 RT-PCR를 수행하여 FPRL1 발현 정도를 측정하여 그 결과를 도 25에 기재하였다.
상기 도 25에 기재한 바와 같이, FPRL1 siRNA를 HUVECs에 처리한 결과, FPRL1 발현이 억제됨을 알 수 있으며 대조군으로 Luciferase siRNA를 처리한 경우는 그렇지 않음을 알 수 있다.
이를 통해 상기 FPRL1 siRNA를 HUVECs에 처리한 경우, VEGF-A에 의한 세포 이동이나 관 형태의 구조 형성이 억제되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 26 및 도 27에 기재하였다.
상기 도 26 및 도 27에 기재한 바와 같이, 상기 FPRL1 siRNA를 HUVECs에 처리한 경우, 대조군인 Luciferase siRNA를 처리한 경우에 비하여 VEGF-A에 의한 세포 이동이나 관 형태의 구조 형성이 억제됨을 알 수 있다.
또한 in vivo에서 FPRL1 길항제(10 ug/CAM)를 처리한 경우 VEGF-A(25 ng/CAM)에 의한 혈관 생성 활성이 억제되는지 여부를 <실험방법 10>을 통해 확인하고 그 결과를 도 28에 기재하였다.
상기 도 28에 기재한 바와 같이, FPRL1 길항제는 VEGF-A에 의한 혈관 생성을 매우 억제함을 알 수 있다.
상기 결과를 통하여 FPRL1이 VEGF-A에 의한 혈관 생성에 중요한 인자임을 알 수 있으며, FPRL1이 활성화 되어야 VEGF-A에 의한 혈관 생성이 유도될 수 있음을 알 수 있다. 그리고 FPRL1이 활성화를 유도하기 위해서는 CTGF가 중요한 인자임을 알 수 있다.
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Pharmaceutical composition using connective-tissue growth factor <130> DPP-2010-1743-KR <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Agonistic peptide, wherein the 6th amino acid is D-Met <400> 1 Trp Lys Tyr Met Val Met 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FPRL1 antagonist <400> 2 Trp Arg Trp Trp Trp Trp 1 5 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand of FPRL1 siRNA, wherein 'dTdT' is attached to 3' end <400> 3 uucacaucgu gguggacau 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-sense strand of FPRL1 siRNA, wherein 'dTdT' is attached to 3' end <400> 4 auguccacca cgaugugaa 19 <210> 5 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of linker region of CTGF <400> 5 Trp Val Cys Asp Glu Pro Lys Asp Gln Thr Val Val Gly Pro Ala Leu 1 5 10 15 Ala Ala Tyr Arg Leu Glu Asp Thr Phe Gly Pro Asp Pro Thr Met Ile 20 25 30 Arg Ala Asn Cys Leu Val 35 <210> 6 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of linker polypeptide comprising the linker region of SEQ ID NO: 5 <400> 6 Glu Trp Val Cys Asp Glu Pro Lys Asp Gln Thr Val Val Gly Pro Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Tyr Arg Leu Glu Asp Thr Phe Gly Pro Asp Pro Thr Met 20 25 30 Ile Arg Ala Asn Cys Leu Val 35 <210> 7 <211> 114 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence for the linker region of SEQ ID NO: 5 <400> 7 tgggtgtgtg acgagcccaa ggaccaaacc gtggttgggc ctgccctcgc ggcttaccga 60 ctggaagaca cgtttggccc agacccaact atgattagag ccaactgcct ggtc 114 <210> 8 <211> 117 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence for the linker polypeptide of SEQ ID NO: 6 <400> 8 gagtgggtgt gtgacgagcc caaggaccaa accgtggttg ggcctgccct cgcggcttac 60 cgactggaag acacgtttgg cccagaccca actatgatta gagccaactg cctggtc 117 <210> 9 <211> 349 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of full-length CTGF <400> 9 Met Thr Ala Ala Ser Met Gly Pro Val Arg Val Ala Phe Val Val Leu 1 5 10 15 Leu Ala Leu Cys Ser Arg Pro Ala Val Gly Gln Asn Cys Ser Gly Pro 20 25 30 Cys Arg Cys Pro Asp Glu Pro Ala Pro Arg Cys Pro Ala Gly Val Ser 35 40 45 Leu Val Leu Asp Gly Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Lys Gln Leu 50 55 60 Gly Glu Leu Cys Thr Glu Arg Asp Pro Cys Asp Pro His Lys Gly Leu 65 70 75 80 Phe Cys Asp Phe Gly Ser Pro Ala Asn Arg Lys Ile Gly Val Cys Thr 85 90 95 Ala Lys Asp Gly Ala Pro Cys Ile Phe Gly Gly Thr Val Tyr Arg Ser 100 105 110 Gly Glu Ser Phe Gln Ser Ser Cys Lys Tyr Gln Cys Thr Cys Leu Asp 115 120 125 Gly Ala Val Gly Cys Met Pro Leu Cys Ser Met Asp Val Arg Leu Pro 130 135 140 Ser Pro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Val Lys Leu Pro Gly Lys Cys 145 150 155 160 Cys Glu Glu Trp Val Cys Asp Glu Pro Lys Asp Gln Thr Val Val Gly 165 170 175 Pro Ala Leu Ala Ala Tyr Arg Leu Glu Asp Thr Phe Gly Pro Asp Pro 180 185 190 Thr Met Ile Arg Ala Asn Cys Leu Val Gln Thr Thr Glu Trp Ser Ala 195 200 205 Cys Ser Lys Thr Cys Gly Met Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp 210 215 220 Asn Ala Ser Cys Arg Leu Glu Lys Gln Ser Arg Leu Cys Met Val Arg 225 230 235 240 Pro Cys Glu Ala Asp Leu Glu Glu Asn Ile Lys Lys Gly Lys Lys Cys 245 250 255 Ile Arg Thr Pro Lys Ile Ser Lys Pro Ile Lys Phe Glu Leu Ser Gly 260 265 270 Cys Thr Ser Met Lys Thr Tyr Arg Ala Lys Phe Cys Gly Val Cys Thr 275 280 285 Asp Gly Arg Cys Cys Thr Pro His Arg Thr Thr Thr Leu Pro Val Glu 290 295 300 Phe Lys Cys Pro Asp Gly Glu Val Met Lys Lys Asn Met Met Phe Ile 305 310 315 320 Lys Thr Cys Ala Cys His Tyr Asn Cys Pro Gly Asp Asn Asp Ile Phe 325 330 335 Glu Ser Leu Tyr Tyr Arg Lys Met Tyr Gly Asp Met Ala 340 345 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target mRNA sequence for FPRL1 siRNA <400> 10 aauucacauc gugguggaca u 21 <210> 11 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand of luciferase siRNA, wherein 'dTdT' is attached to 3' end <400> 11 cguacgcgga auacuucga 19 <210> 12 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-sense strand of luciferase siRNA, wherein 'dTdT' is attached to 3' end <400> 12 ucgaaguauu ccgcguacg 19 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sFPRL1 primer <400> 13 gaccttggat tcttgctcta gtc 23 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asFPRL1 primer <400> 14 ggatcagtct ctctcggaag tc 22 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sCTGF primer <400> 15 ttccagagca gctgcaagta cca 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asCTGF primer <400> 16 ttgtcattgg taacccgggt gga 23

Claims (16)

  1. 서열번호 9의 아미노산 서열 내의, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는연속하는 38개 이상의 아미노산으로 이루어진 결합조직 성장인자 단백질의 단편 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 함유하는, 혈관신생 촉진용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 결합조직 성장인자 단백질의 단편은 서열번호 9의 아미노산 서열 내의, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 연속하는 38개 내지 39개의 아미노산으로 이루어진 것인, 혈관신생 촉진용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 결합조직 성장인자 단백질의 단편은 서열번호 5 또는서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 것인 혈관신생 촉진용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 가지는 것인, 혈관신생 촉진용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 유전자는 벡터에 삽입된 것인 혈관신생 촉진용 조성물.
  6. 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 FPRL1((formyl peptide receptor-like 1))의 작은 간섭 RNA (siRNA).
  7. 제6항의 siRNA를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 촉진용 조성물.
  8. 서열번호 9의 아미노산 서열 내의, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 연속하는 38개 이상의 아미노산으로 이루어진 결합조직 성장인자 단백질의 단편; 또는 이를 암호화하는 유전자; 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 FPRL1((formyl peptide receptor-like 1))의 작은 간섭 RNA (siRNA)를 유효성분으로 포함하는 협심증, 동맥경화, 뇌졸중, 뇌혈관성 치매, 만성궤양, 또는 창상의 예방 또는 치료용 조성물.
  9. 서열번호 9의 아미노산 서열 내의, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 연속하는 38개 이상의 아미노산으로 이루어진 결합조직 성장인자 단백질의 단편에 결합하는 항체; 또는
    상기 결합조직 성장인자 단백질의 단편을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA, siRNA), 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상
    을 함유하는, 혈관신생 억제용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 결합조직 성장인자 단백질의 단편은 서열번호 9의 아미노산 서열 내의, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 연속하는 38개 내지 39개의 아미노산으로 이루어진 것인, 혈관신생 억제용 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 결합조직 성장인자 단백질의 단편은 서열번호 5 또는서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 것인, 혈관신생 억제용 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 상기 상기 결합조직 성장인자 단백질의 단편을 암호화하는 유전자는 서열번호 7 또는 서열번호 8의 염기서열을 가지는 것이고, 상기 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA, siRNA), 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)은 상기 서열번호 7 또는 서열번호 8에 대한 mRNA의 연속하는 15 내지 30개의 염기로 이루어진 염기서열에 상보적으로 결합하는 것인, 혈관신생 억제용 조성물.
  13. 서열번호 9의 아미노산 서열 내의, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 연속하는 38개 이상의 아미노산으로 이루어진 결합조직 성장인자 단백질의 단편에 결합하는 항체; 또는
    상기 결합조직 성장인자 단백질의 단편을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA, siRNA), 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는, 암의 성장 및 전이, 류마티스 관절염, 건선, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신장병, 고혈압, 자궁내막증, 지방증, 미숙아 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 증식성 망막증, 혈우병성 관절, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 골관절염, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 악성 신경화증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 또는 염증의 예방 또는 치료용 조성물.
  14. (a) 서열번호 9의 아미노산 서열 내의, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 연속하는 38개 이상의 아미노산으로 이루어진 결합조직 성장인자 단백질의 단편을 암호화하는 유전자를 포함하는 세포에 후보 화합물을 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계
    를 포함하고,
    상기 후보 화합물을 처리한 세포의 유전자의 발현 정도가 후보 화합물을 처리하지 않은 세포에 비해 감소한 경우, 상기 후보 화합물을 혈관신생 억제제로 결정하는 것을 특징으로 하는,
    혈관신생 억제제의 스크리닝 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 (b) 단계의 유전자의 발현 정도는 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블랏(Western Blotting) 및 RT-PCR로 이루어진 군에서 선택된 방법으로 측정하는 것인 스크리닝 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 혈관신생 억제제는 암의 성장 및 전이, 류마티스 관절염, 건선, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신장병, 고혈압, 자궁내막증, 지방증, 미숙아 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 증식성 망막증, 혈우병성 관절, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 골관절염, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 악성 신경화증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 또는 염증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것인, 스크리닝 방법.
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