JP2013530934A - 結合組織成長因子を用いた薬学的組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明で明らかにした結合組織成長因子蛋白質の断片は、FPRL1と結合する部位で、FPRL1に特異的なERKリン酸化を効果的に誘導し、FPRL1を活性化して細胞内のCa2+濃度を上昇させ、最終的に血管生成を効果的に誘導する活性があり、これにより、結合組織成長因子蛋白質の断片は、血管新生促進用薬学的組成物に有用に使用でき、反面、前記結合組織成長因子蛋白質の断片と結合するポリペプチド、抗体または化合物は、血管新生抑制用薬学的組成物に有用に使用できる。
【選択図】図29
Description
特に、癌の場合、血管新生は癌細胞の成長と転移に重要な役割を果たす。腫瘍は、新生血管を通して成長と増殖に必要な栄養と酸素の供給を受け、また、腫瘍まで浸透した新生血管は移転する癌細胞が血液循環系に入る通路を提供することにより、癌細胞が転移するようにする(Folkman and Tyler,Cancer Invasion and metastasis,Biologic mechanisms and Therapy(S.B.Day ed.)Raven press,New York,pp94−103,1977;Polverini PJ,Crit.Rev.Oral.Biol.Med.,6(3),pp230−247,1995)。
本発明の血管新生促進用組成物は、配列番号9のアミノ酸配列の中において、配列番号5のアミノ酸配列を含む連続する38個以上、例えば、連続する38個〜140個(例えば、103番目から242番目のアミノ酸までの部位の中から選択)、連続する38個〜100個(例えば、103番目から202番目のアミノ酸までの部位の中から選択)、または連続する38個〜80個(例えば、163番目から242番目のアミノ酸までの部位の中から選択)、好ましくは、連続する38個〜39個のアミノ酸を含む結合組織成長因子蛋白質の断片を含有することを特徴とする。
したがって、本発明の血管新生促進用薬学的組成物の有効成分である結合組織成長因子蛋白質の断片は、前記結合組織成長因子蛋白質の全長配列である配列番号9のアミノ酸配列の中において、前記配列番号9の164番目のアミノ酸から201番目のアミノ酸までの部位である配列番号5のアミノ酸配列を含む連続する38個以上、例えば、連続する38個〜140個(例えば、103番目から242番目のアミノ酸までの部位の中から選択)、連続する38個〜100個(例えば、103番目から202番目のアミノ酸までの部位の中から選択)、または連続する38個〜80個(例えば、163番目から242番目のアミノ酸までの部位の中から選択)、好ましくは、連続する38個〜39個のアミノ酸を含むものであり得る。前記結合組織成長因子蛋白質の断片は、これに限定されないが、より好ましくは、配列番号6のアミノ酸配列(EWVCDEPKDQTVVGPALAAYRLEDTFGPDPTMIRANCLV)で表示されたものであり得る。
具体的には、前記ベクターは、1つの細胞から他の細胞にDNA切片を伝達する核酸分子に対して使用されるもので、これに限定されないが、プラスミド、バクテリオファージ、および植物または動物ウイルスからなる群より選択されたものに由来できる。
これにより、特に処理される領域には、直接的な注入のために、注射可能な組成物のための任意の薬学的に許容される媒介体と混合できる。本発明の組成物は、特に、等張滅菌溶液または滅菌水または適切な生理食塩水の添加によって注射可能な溶液の組成を可能にする凍結乾燥組成物を含むことができる。患者の腫瘍への直接的な注入は、治療効率を感染した組織に集中させるようにするため有利である。使用される投与量は、多様なパラメータ、特に、遺伝子、ベクター、使用される投与方式、問題視される疾病または代案的に要求される治療期間によって調節できる。また、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などによってその範囲が多様である。1日投与量は、約0.0001〜10mg/kgであり、好ましくは0.001〜1mg/kgであり、1日1回〜数回に分けて投与することが好ましい。
本発明で明らかにした結合組織成長因子蛋白質の断片は、FPRL1と結合する部位で、FPRL1に特異的なERKリン酸化を効果的に誘導し、FPRL1を活性化して細胞内のCa2+濃度を上昇させ、最終的に血管生成を効果的に誘導する活性があり、これにより、結合組織成長因子蛋白質の断片は、血管新生促進用薬学的組成物に有用に使用でき、反面、前記結合組織成長因子蛋白質の断片と結合するポリペプチド、抗体または化合物は、血管新生抑制用薬学的組成物に有用に使用できる。
但し、下記の実施例は、本発明を例示するものであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
下記の実施例において、全てのデータは、平均±標準偏差で表現し、Student’s t testにより統計比較し、p<0.05の場合、統計的に有意なものと考慮した。
1.実験材料
Phospho−ERK1/2(Thr202/Tyr204)およびERK1/2抗体をCell Signaling Technology(Beverly、MA、USA)社から購入し、Human CTGF抗体および抗フラッグ(anti−Flag)抗体をそれぞれAbcam(Cambridge、MA、USA)およびSigma(St.Louis、MO、USA)社から購入した。組み換えhuman CTGFをBioVendor Laboratory Medicine Inc.(Brno、Czech Republic)社から購入した。組み換えhuman VEGF−A165、anti−VEGF−A mAb、anti−VEGFR−1 mAb、およびanti−VEGFR−2 mAbはR&D Systems(Minneapolis、MN、USA)社から入手した。
FPRL1に対するsiRNA(sense:UUCACAUCGUGGUGGACAUdTdT(配列番号3)、anti−sense:AUGUCCACCACGAUGUGAAdTdT(配列番号4))およびルシフェラーゼ(luciferase)に対するsiRNA(sense:CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT(配列番号11)、anti−sense:UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT(配列番号12))をDharmacon Research,Inc.(Chicago、IL)社で合成した。また、WKYMVm(配列番号1)、WRWWWW(配列番号2、WRW4)、およびbiotinylated WKYMVmはA&PEP Inc(Seoul、Korea)で合成し、純度が95%を超えた。human CTGFリンク部位のアミノ酸配列が含まれているリンカーポリペプチド(EWVCDEPKDQTVVGPALAAYRLEDTFGPDPTMIRANCLV(配列番号6)−NH2)はAnygen Co.Ltd.(Gwangjoo、Korea)で合成し、純度が99.1%程度であった。
ヒトの臍帯静脈内皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells、HUVECs)を従来公知の方法(Ferrero,E.et al.Transendothelial migration leads to protection from starvation−induced apoptosis in CD34+CD14+ circulating precursors:evidence for PECAM−1 involvement through Akt/PKB activation.Blood101,186−193,2003)によってコラーゲン分解酵素(collagenase)(Sigma、St.Louis、MO、USA)を処理し、臍帯(umbilical cord)(ST.MARY’S Hospital、Seoul、Korea)から分離した。前記分離されたHUVECsを、Medium199(Sigma、St.Louis、MO、USA)(1%(w/v)ペニシリン/ストレプトマイシンおよび20%(v/v)の熱で非活性化されたウシ胎仔血清が含有されている)を用い、0.2%(w/v)ゼラチンがコーティングされたディッシュ(dish)で培養した。
本実験のために、各細胞は飽和(subconfluence)状態に達するように培養し、3継代(passages)〜5継代のものを使用した。FPRL1を発現するrat basophil leukemia(RBL)−2H3(FPRL1/RBL)細胞、FPRを発現するRBL−2H3(FPR/RBL)細胞、およびRBL−2H3(vector/RBL)細胞(FPRL1またはFPR receptorがoverexpressionしない細胞)(以上、ATCC、Manassas、VA、USA)を、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、20%(v/v)の熱で非活性化されたウシ胎仔血清およびG418(Geneticin)(500ug/ml)が追加された高濃度のブドウ糖が含まれているDMEM培地(Sigma、St.Louis、MO、USA)に維持させた。前記細胞を、37℃にて、5%CO2で培養した。
ウシ胎仔血清(FBS)が含まれていないMedium199で培養されたHUVECs(3継代〜5継代)から条件培地(Conditioned Media)を収得した。前記条件培地を遠心分離して残存細胞を除去し、使用時まで−80℃にて保管した。
Vector/RBL細胞、FPR/RBL細胞、FPRL1/RBL細胞、およびHUVECsを飽和するまで培養し、血清を枯渇(serum−starved)させた。前記刺激された細胞(1×105cells)をPBSで2回水洗し、サンプルバッファー(50mM Tris−HCl、100mM NaCl、0.1%SDS、1%Nonidet P−40、50mM NaF、1mM Na3 VO4、1μg/mlアプロチニン、1μg/mlペプスタチン、および1μg/mlロイペプチン(leupeptin))1mlに溶かし、95℃にて30秒間加熱した後、SDS−PAGEで分離してから、ニトロセルロース膜に移した。Anti−ホスホ−ERK(extracellular signal regulated kinase)1/2(Thr202/Tyr204)(Cell Signaling Technology、Beverly、MA、USA)、anti−ERK1/2(Cell Signaling Technology、Beverly、MA、USA)、anti−CTGF(Abcam、Cambridge、MA、USA)、anti−Actin(Sigma、St.Louis、MO、USA)、またはanti−Flag(Sigma、St.Louis、MO、USA)抗体で免疫ブロットを行った後、前記膜を化学発光(chemiluminescence substrate、Amersham Pharmacia)基質で視角化した。
HUVECから収得した条件培地(CM)をHLBカートリッジ(waters)にローディングし、逆相カラム(reverse phase(RP)C18column)を用いて分離した。RPC18HPLCカラム(218TP5215;2.1mm×150mm、Vydac)を、水(water)/0.1%(w/v)TFAで均一化(equilibrated)した。ACN/0.1%(w/v)TFAを、0%(w/v)から100%(w/v)まで濃度勾配をおいて150ulの分画物を収得した。前記得られた活成分画物にトリプシンを処理し、37℃にて一晩中培養した。
Ala41までのコーディン信号ペプチド(chordin signal peptide)以降に、フラッグタグ(Flag−tag)配列が含まれているpCS2+発現ベクターに挿入されたジェノパス(Xenopus)CTGFの全長および欠失変異体を、E.M.De Robertis(University of California、Los Angeles、CA)から提供された(EcoRI−Chordin signal peptide−20N.terminal AAs of chordin−FLAG epitope(DYKDDDDK)−Xho I−INSERT−Xba I in pCS2+)(Abreu,J.G.,Ketpura,N.I.,Reversade,B.&De Robertis,E.M.Connective−tissue growth factor(CTGF)modulates cell signaling by BMP and TGF−[beta].Nat Cell Biol4,599−604,2002)。前記欠失変異体は、CTGF/I−II−L、CTGF/II−L、CTGF/II、CTGF/L、CTGF/L−III−IV、およびCTGF/I−L−III−IVと命名し、その具体的な欠失内容は図8に示した(欠失した部位は点線で表示する)。
human CTGFのリンク部位に対応してリンカーポリペプチドの結合程度を評価するために、製造会社の指示に従って、EZ−リンクマイクロスルホ−NHS−LC−ビオチン化キット(Pierce Chemical Co.、Rockford、IL、USA)を用い、リンカーポリペプチドを標識した。リンカーポリペプチドは、常温にて1時間、PBSに9m Mスルホ−NHS−LC−ビオチン(Pierce Chemical Co.、Rockford、IL、USA)と共に培養した。ビオチン化する間、vector/RBL cells、FPR/RBL cells、FPRL1/RBL cells、またはHUVECsをトリプシン処理し、収集した後、常温にて30分間、ウサギ血清を処理した。氷で30分間ビオチン化したリンカーポリペプチドを培養した後、前記細胞をice−cold PBSに氷で短く水洗し、antihuman fluoroscein−5−isothiocyanate(FITC)−conjugatedストレプトアビジン(Pierce Chemical Co.)で培養した後、ice−cold PBSで水洗し、1%ホルムアルデヒド溶液で固定した。以降、従来知られた方法によってCellQuestおよびWinMDI2.9ソフトウェアでFACS Caliberシステム(BD Biosciences、San Jose、CA)を用いて分析した。(He,R.,Sang,H.&Ye,R.D.Serum amyloid A induces IL−8 secretion through a G protein−coupled receptor,FPRL1/LXA4R.Blood101,1572−1581,2003)
FPRL1/RBL、vector/RBLまたはFPR/RBL細胞を、37℃にて1時間、0.03%(w/v)plutonic F−127が含有されているfluo−3−AM working solution(Molecular Probes)で培養した。この時、fluo−3−AMの最終濃度は20uM/Lとなるようにした。前記培養後、細胞でfluo−3−AM蛍光がhigh−power Ar+レーザによって488nmで発し、放出バンドをphotomultiplierによって530nmで測定した。蛍光信号をニコンE−600エクリプス顕微鏡(Nikon E−600 Eclipse microscope)が備えられた共焦点顕微鏡(confocal laser scanning system、LSM510Meta;Carl Zeiss、Jena、Germany)を用いて感知した。蛍光強度は、CTGFの追加前(F0)および追加後(F)の両方とも特定した。細胞内のCa2+濃度[Ca2+]iの変化はF/F0比率で表現した。各細胞から50〜120個のイメージをスキャンした。
増殖度分析(proliferation assay)のために、HUVECsを、ゼラチンでコーティングされた24ウェル培養ディッシュに2×104細胞/ウェルで平板培養し、一晩中接着されるようにした。血清が枯渇した4時間後に、前記細胞に多様なマイトジェン(CTGFリンカーポリペプチド、CTGF)を48時間処理した。[3H]−チミジン(1μCi、Amersham International)を、培養最後の6時間前に各ウェルに添加した。挿入された[3H]−チミジンを、37℃にて1時間、0.2M NaOHおよび0.1%SDS溶液から抽出した。液体閃光計数器(liquid scintillation counter、Beckmann Instruments)を用いて放射能を測定し、その結果を3回繰り返して1分あたり平均±標準偏差で表現した。
HUVECsの傷移動(wounding migration)およびチューブ形成活性を下記のように確認した。
インビボでのCAM分析は、従来公知の方法によって行った(Lee,M.−S.et al.Angiogenic Activity of Pyruvic Acid in in vivo and in Vitro Angiogenesis Models.Cancer Res61,3290−3293,2001)。
受精した卵を、37℃にて一定の湿度に設定されたエッグブリーダー(egg breeder)で培養した。培養後3日目に、皮で発現したCAMを切り離すために、18ゲージの皮下針で約2mlの卵アルブミンを抽出した。6日間追加培養した後、サンプルの入ったthermanox coverslips(Nunc)を空気中で乾燥させ、これをリンカーポリペプチドまたはrhCTGFによる新生血管形成活性を試験するために、CAMの表面に適用した。3日後、1−2mlの10%(w/v)脂肪乳剤(Intralipose)を漿尿膜(chorioallantois)に注入し、顕微鏡でこれを観察した。
siRNAを用いてhuman FPRL1の転写を抑制するために、FPRL1に対するsiRNA(sense:UUCACAUCGUGGUGGACAUdTdT(配列番号3)、anti−sense:AUGUCCACCACGAUGUGAAdTdT(配列番号4))を使用した。前記siRNA配列をBLAST searchした結果、データベース上のいかなる他の配列とも有意な類似性がないことを確認した。前記オリゴヌクレオチドは、類似の結果を示した。HUVECsをsiRNA形質感染過程に使用した。前記細胞を最終濃度20nM FPRL1 siRNA(配列番号3および配列番号4)または対照群としてルシフェラーゼ(luciferase)siRNA(配列番号11および配列番号12)で形質感染した。この時、製造会社の指示に従って、リポフェクタミン試薬(Lipofectamine reagent、Invitrogen Life Technologies)を使用した。前記細胞を無血清培地で水洗し、20%(v/v)FBSを含有する培地が追加された形質感染混合物で4.5時間培養した。前記細胞を培養して24時間および48時間後に収集し、FPRL1の発現程度をRT−PCR分析によって確認した。
製造会社の指示に従って、商業的に利用可能なTRI試薬(Molecular Research Center)を用い、前記形質感染したHUVECsで全てのRNAを分離した。3ugの各DNA−free total RNA試料およびoligo(dT)15とMoloney murine leukemia virus逆転写酵素(Promega、WI、USA)を用い、製造会社の指示に従ってfirst−strand cDNAを合成した。以降、1xPCRバッファー、200uM dNTPs、10uMの各特異的プライマ−(sFPRL1:5’−GACCTTGGATTCTTGCTCTAGTC−3’(配列番号13)、asFPRL1:5’−GGATCAGTCTCTCTCGGAAGTC−3’(配列番号14)、sCTGF:5’−TTCCAGAGCAGCTGCAAGTACCA−3’(配列番号15)、asCTGF:5’−TTGTCATTGGTAACCCGGGTGGA−3’(配列番号16))、および1.25units Taq DNA重合酵素(Perkin−Elmer)が含有されている50ulの反応溶液で同量のcDNAを増幅した。増幅産物を1.5%アガロースゲル上で電気泳動し、EtBr(ethidium bromide)で染色して赤外線透視で現像化した。
1.VEGF−Aが処理されたHUVECsの条件培地によるERKリン酸化の誘導活性
炎症性サイトカインの一種である血管内皮細胞成長因子−A(vascular endothelial growth factor−A、VEGF−A)は、血管新生(angiogenesis)の調節において、G−蛋白質連結受容体(G−protein−coupled receptor)であるFPRL1(formyl peptide receptor−like1)と多くの細胞機能を共有する。しかし、VEGF−AとFPRL1が具体的にどのように相互作用するかについては知られていない。
前記図1に記載したように、VEGF−Aが処理されたHUVECsから収得した条件培地は、濃度依存的にERKリン酸化を増加させることが分かる。
前記図2に記載したように、条件培地、VEGF−Aおよび陽性対照群は、いずれもFPRL1を過発現させるFPRL1/RBL細胞でのみERKリン酸化を増加させることが分かる。したがって、前記条件培地によるERKリン酸化は、FPRL1に特異的であることが分かる。
前記<実験方法5>に記載したように、前記条件培地のHPLC分画物40ugをFPRL1/RBL細胞に5分処理し、前記<実験結果1>のようにERKリン酸化の有無を確認した結果を図3に記載した。
前記図3に記載したように、B12〜C4が含まれている分画物がFPRL1/RBL細胞でERKリン酸化を誘導することが分かり、B11からC4までの各分画物の活性ピークを調べた結果、B12、C3分画物でのみピークが観察されることが分かる。
前記図4に記載したように、ヒトの結合組織成長因子(connective−tissue growth factor、CTGF)のアミノ酸配列と一致する5個のポリペプチド配列(図4の下線部分)が検出された。
したがって、FPRL1/RBL細胞でERKリン酸化を誘導できる活性のある蛋白質は、CTGFであることが分かる。
前記<実験結果2>を通し、本発明者らは、VEGF−Aが処理されたHUVECsから分泌した条件培地でCTGFがFPRL1と結合し、FPRL1/RBL細胞でERKリン酸化を誘導できる活性があるものと考えた。
また、図6に記載したように、RT−PCRおよびウェスタンブロット分析結果、VEGF−Aの処理量に比例してCTGF数値が増加することが分かる。
前記図7に記載したように、VEGF−A受容体に対する抗体を投与した場合、CTGFの発現が顕著に減少することが分かる。したがって、前記結果に基づき、VEGF−AによるCTGFの発現誘導は、受容体カップリングによって調節されることが分かる。
本発明者らは、FPRL1に対するCTGF結合部位を決定するために、前記<実験方法6>に記載した方法で、図8に記載したように、全長CTGF蛋白質またはその一部の欠失蛋白質を暗号化する遺伝子が、CTGF/I−II−L、CTGF/II−L、CTGF/II、CTGF/L、CTGF/L−III−IV、およびCTGF/I−L−III−IVが挿入されたプラスミドを製造し、これをHEK293T細胞(ATCC、Manassas、VA、USA)に形質感染し、これによって各蛋白質を精製した。
前記精製された蛋白質がFPRL1/RBL細胞でERKリン酸化を誘導するか否かを、前記<実験結果1>のように免疫ブロットを行い、その結果を図9に記載した。
本発明者らは、前記<実験結果4>で確認したCTGF結合部位が含まれているリンカーポリペプチド(配列番号6、EWVCDEPKDQTVVGPALAAYRLEDTFGPDPTMIRANCLV、配列番号5のN末端側のアミノ酸1個(E)を追加的に含む)10nMを、<実験方法7>のようにビオチン化し、これをFPRL1/RBL、vector/RBLまたはFPR/RBL細胞と共に培養した後、フローサイトメトリー分析を実施し、その結果を図10に記載した。
したがって、前記結果に基づき、CTGFリンカーポリペプチドがFPRL1に特異的に結合することが分かり、これにより、前記リンカーポリペプチドがFPRL1によるERKのリン酸化やCa2+濃度を上昇できることが分かる。
CTGFリンカーポリペプチドがERKリン酸化を効果的に誘導するか否かを組み換えCTGF(recombinant human CTGF、rhCTGF)と比較した。具体的には、FPRL1/RBL細胞にCTGFリンカーポリペプチドとrhCTGFを5分間多様な濃度で処理してERKリン酸化の有無を測定し、その結果を図11に記載した。
前記図11に記載したように、CTGFリンカーポリペプチドがrhCTGFに似た水準でERKリン酸化を誘導することが分かる。
また、前記CTGFリンカーポリペプチドまたはrhCTGF10nMをFPRL1/RBL細胞に添加する時、WRW4を10uM添加するか添加しない場合、ERKリン酸化程度を比較して図11に記載した。
前記図11に記載したように、CTGFリンカーポリペプチド(LKと表示)は、rhCTGF(CTGFと表示)に似た水準でERKリン酸化を誘導することが分かり、特に、FPRL1拮抗剤のWRW4を処理した場合、ERKリン酸化が抑制されることが分かる。
FPRL1が活性化されると、細胞内のCa2+濃度が上昇するため、本発明者らは、CTGFリンカーポリペプチドによってFPRL1が活性化され、最終的に細胞内のCa2+濃度が上昇するか否かを<実験方法8>を通して確認し、その結果を図12に記載した。
前記結果に基づき、CTGFは、前記リンカー部位を通してFPRL1と直接結合し、これによってFPRL1を活性化させることが分かる。
本発明者らは、ヒトの臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)でFPRL1を多量発現するため、VEGF−Aが処理されたHUVECsからCTGFを分泌するか否かを確認し、これによって血管新生の有無を調べた。
前記図13に記載したように、HUVECsに前記CTGFリンカーポリペプチドを処理した場合、処理しなかった場合(vehicleのみを処理した場合)に比べて、平均数値が右側に移動することが分かる。しかし、FPRL1拮抗剤であるWRW4を処理した場合、このような移動は観察されなかった。
前記図14に記載したように、CTGFリンカーポリペプチドをHUVECsに処理した場合にも、ERKリン酸化が効果的に誘導され、FPRL1の拮抗剤のWRW4(10uM)を処理すると、ERKリン酸化が抑制されることが分かる。
前記図15に記載したように、CTGFリンカーポリペプチドは、濃度依存的に細胞内のCa2+濃度を増加させるが、FPRL1の拮抗剤であるWRW4(10uM)を処理した場合、そうでないことが分かる。
血管生成(angiogenesis)が進行すると、内皮細胞の増殖、既存血管の発芽に伴う移動および管形態の構造が形成されるため(Carmeliet,P.&Jain,R.K.Angiogenesis in cancer and other diseases.Nature407、249−257、2000)、本発明者らは、CTGFリンカーポリペプチドが前記のような血管生成を誘導するか否かを<実験方法9>を通して確認し、その結果を図16〜図18に記載した。
また、前記図17に記載したように、CTGFリンカーポリペプチドは、濃度依存的にHUVECsの移動を組み換えCTGFより効果的に誘導することが分かり、さらに、FPRL1の拮抗剤であるWRW4(10uM)を処理した場合、このような細胞の移動を誘導しないことが分かる。
なお、前記図18に記載したように、CTGFリンカーポリペプチドは、HUVECsの管形態構造の形成を組み換えCTGFより効果的に誘導することが分かり、さらに、FPRL1の拮抗剤であるWRW4(10uM)を処理した場合、このような管形態構造の形成を誘導しないことが分かる。
このような結果を通し、CTGFリンカーポリペプチドが細胞の増殖よりは移動および管形態の構造を全長CTGFより効果的に誘導するため、血管生成を促進することが分かる。
前記図19に記載したように、CTGFリンカーポリペプチドは、インビボでも濃度依存的に血管生成を非常に強く誘導することが分かり、その結果として、いわゆる車輪状形態の血管が形成されることが分かる。しかし、FPRL1の拮抗剤であるWRW4(10uM)を処理した場合、このような血管形成が誘導されないことが分かる。
したがって、CTGFは、リンカー部位を通してFPRL1に結合し、これによってin vitroおよびインビボで血管生成を誘導することが分かる。
本発明者らは、前記のような結果に基づき、血管生成過程でCTGF/FPRL1結合体がVEGF−Aの活性を仲裁できるものと考えた。
そこで、VEGF−AがHUVECs細胞でFPRL1の発現を誘導するか否かを確認した。具体的には、HUVECsに20ng/ml VEGF−Aを処理し、多様な時間培養した後、前記<実験方法12>によってRT−PCRを行ってFPRL1の発現程度を測定し、その結果を図20に記載した。また、<実験方法7>によってフローサイトメトリー分析を行い、その結果を図20に記載した。
さらに、HUVECsに多様な濃度でVEGF−Aを処理し、培養した後、前記<実験方法12>によってRT−PCRを行ってFPRL1の発現程度を測定し、その結果を図21に記載した。また、<実験方法7>によってフローサイトメトリー分析を行い、その結果を図21に記載した。
前記図20および図21に記載したように、VEGF−AがHUVECsで濃度依存的にFPRL1の発現を誘導することが分かる。
本発明者らは、FPRL1拮抗剤のWRW4によってVEGF−Aによる血管生成が抑制されるか否かを追加的に確認した。これにより、VEGF−Aによる血管形成にFPRL1の活性化が関与することが分かった。
まず、HUVECsにVEGF−Aを20ng/mlで投与し、前記<実験方法9>を通し、細胞の増殖程度、細胞の移動、または管形態構造の形成の有無を確認し、その結果を図22〜図24に記載した。この時、FPRL1拮抗剤であるWRW4を追加的に添加した。
前記図22に記載したように、VEGF−AがHUVECsの増殖を誘導することが分かるが、VEGF−AによるHUVECsの増殖にFPRL1の拮抗剤であるWRW4が統計学的な意味を有するほどの抑制能を示していなかった。
前記図25に記載したように、FPRL1 siRNAをHUVECsに処理した結果、FPRL1の発現が抑制されることが分かり、対照群としてルシフェラーゼ(Luciferase)siRNAを処理した場合は、そうでないことが分かる。
前記図26および図27に記載したように、前記FPRL1 siRNAをHUVECsに処理した場合、対照群のルシフェラーゼ(Luciferase)siRNAを処理した場合に比べて、VEGF−Aによる細胞の移動や管形態構造の形成が抑制されることが分かる。
前記図28に記載したように、FPRL1拮抗剤は、VEGF−Aによる血管生成を非常に抑制することが分かる。
Claims (38)
- 配列番号9のアミノ酸配列内の、配列番号5のアミノ酸配列を含む連続する38個以上のアミノ酸からなる結合組織成長因子蛋白質の断片またはこれを暗号化する遺伝子を有効成分として含有することを特徴とする、血管新生促進用組成物。
- 前記結合組織成長因子蛋白質の断片は、配列番号9のアミノ酸配列内の、配列番号5のアミノ酸配列を含む連続する38個〜39個のアミノ酸からなるものであることを特徴とする、請求項1に記載の血管新生促進用組成物。
- 前記結合組織成長因子蛋白質の断片は、配列番号5または配列番号6のアミノ酸配列で表示されるものであることを特徴とする、請求項2に記載の血管新生促進用組成物。
- 前記遺伝子は、配列番号7または配列番号8で表示される塩基配列を有するものであることを特徴とする、請求項1に記載の血管新生促進用組成物。
- 前記遺伝子は、ベクターに挿入されたものであることを特徴とする、請求項1に記載の血管新生促進用組成物。
- 配列番号3および配列番号4を含むFPRL1(formyl peptide receptor−like1)の小さい干渉RNA(siRNA)。
- 請求項6に記載のsiRNAを有効成分として含むことを特徴とする、血管新生促進用組成物。
- 請求項1〜5および請求項7のいずれか1項に記載の血管新生促進用組成物を有効成分として含むことを特徴とする、狭心症、動脈硬化、脳卒中、脳血管性痴呆、慢性潰瘍、または創傷の予防または治療用組成物。
- 配列番号9のアミノ酸配列内の、配列番号5のアミノ酸配列を含む連続する38個以上のアミノ酸からなる結合組織成長因子蛋白質の断片に結合するポリペプチド、抗体、および化合物からなる群より選択された1種以上;または
前記結合組織成長因子蛋白質の断片を暗号化する遺伝子のmRNAに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチド、小さい干渉RNA(short interfering RNA、siRNA)、および短いヘアピンRNA(short hairpin RNA)から構成された群より選択された1種以上を含有することを特徴とする、血管新生抑制用組成物。 - 前記結合組織成長因子蛋白質の断片は、配列番号9のアミノ酸配列内の、配列番号5のアミノ酸配列を含む連続する38個〜39個のアミノ酸からなるものであることを特徴とする、請求項9に記載の血管新生抑制用組成物。
- 前記結合組織成長因子蛋白質の断片は、配列番号5または配列番号6のアミノ酸配列で表示されるものであることを特徴とする、請求項10に記載の血管新生抑制用組成物。
- 前記結合組織成長因子蛋白質の断片を暗号化する遺伝子は、配列番号7または配列番号8の塩基配列を有するものであり、前記アンチセンスヌクレオチド、小さい干渉RNA(short interfering RNA、siRNA)、および短いヘアピンRNA(short hairpin RNA)は、前記配列番号7または配列番号8に対するmRNAの連続する15〜30個の塩基からなる塩基配列に相補的に結合するものであることを特徴とする、請求項9に記載の血管新生抑制用組成物。
- 請求項9〜12のいずれか1項に記載の血管新生抑制用組成物を有効成分として含有することを特徴とする、癌の成長および転移、リウマチ関節炎、乾癬、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎臓病、高血圧、子宮内膜症、脂肪症、未熟児網膜症、角膜移植拒否、新生血管緑内障、増殖性網膜症、血友病性関節、ケロイド、傷顆粒化、血管接着、骨関節炎、クローン病、再発狭窄症、アテローム性動脈硬化、腸管接着、潰瘍、肝硬病症、糸球体腎炎、悪性腎硬化症、器官移植拒否、腎糸球体病症、糖尿病、または炎症の予防または治療用組成物。
- (a)配列番号9のアミノ酸配列内の、配列番号5のアミノ酸配列を含む連続する38個以上のアミノ酸からなる結合組織成長因子蛋白質の断片を暗号化する遺伝子を含む細胞に候補化合物を処理するステップと、(b)前記遺伝子の発現程度を測定するステップとを含み、
前記候補化合物を処理した細胞の遺伝子の発現程度が候補化合物を処理していない細胞に比べて減少した場合、前記候補化合物を血管新生抑制剤として決定することを特徴とする、血管新生抑制剤のスクリーニング方法。 - 前記(b)ステップの遺伝子の発現程度は、免疫蛍光法、酵素免疫分析法(ELISA)、ウェスタンブロット(Western Blotting)およびRT−PCRからなる群より選択された方法で測定するものであることを特徴とする、請求項14に記載のスクリーニング方法。
- 前記血管新生抑制剤は、癌の成長および転移、リウマチ関節炎、乾癬、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎臓病、高血圧、子宮内膜症、脂肪症、未熟児網膜症、角膜移植拒否、新生血管緑内障、増殖性網膜症、血友病性関節、ケロイド、傷顆粒化、血管接着、骨関節炎、クローン病、再発狭窄症、アテローム性動脈硬化、腸管接着、潰瘍、肝硬病症、糸球体腎炎、悪性腎硬化症、器官移植拒否、腎糸球体病症、糖尿病、または炎症の予防または治療に使用するためのものであることを特徴とする、請求項14に記載のスクリーニング方法。
- 配列番号9のアミノ酸配列内の、配列番号5のアミノ酸配列を含む連続する38個以上のアミノ酸からなる結合組織成長因子蛋白質の断片またはこれを暗号化する遺伝子の血管新生促進のための用途。
- 前記結合組織成長因子蛋白質の断片は、配列番号9のアミノ酸配列内の、配列番号5のアミノ酸配列を含む連続する38個〜39個のアミノ酸からなるものであることを特徴とする、請求項17に記載の用途。
- 前記結合組織成長因子蛋白質の断片は、配列番号5または配列番号6のアミノ酸配列で表示されるものであることを特徴とする、請求項18に記載の用途。
- 前記遺伝子は、配列番号7または配列番号8で表示される塩基配列を有するものであることを特徴とする、請求項17に記載の用途。
- 前記遺伝子は、ベクターに挿入されたものであることを特徴とする、請求項17に記載の用途。
- 前記血管新生促進剤は、狭心症、動脈硬化、脳卒中、脳血管性痴呆、慢性潰瘍、または創傷の予防または治療に使用されるものであることを特徴とする、請求項17〜21のいずれか1項に記載の用途。
- 配列番号9のアミノ酸配列内の、配列番号5のアミノ酸配列を含む連続する38個以上のアミノ酸からなる結合組織成長因子蛋白質の断片に結合するポリペプチド、抗体、および化合物からなる群より選択された1種以上;または
前記結合組織成長因子蛋白質の断片を暗号化する遺伝子のmRNAに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチド、小さい干渉RNA(short interfering RNA、siRNA)、および短いヘアピンRNA(short hairpin RNA)から構成された群より選択された1種以上の血管新生抑制剤製造のための用途。 - 前記結合組織成長因子蛋白質の断片は、配列番号9のアミノ酸配列内の、配列番号5のアミノ酸配列を含む連続する38個〜39個のアミノ酸からなるものであることを特徴とする、請求項23に記載の用途。
- 前記結合組織成長因子蛋白質の断片は、配列番号5または配列番号6のアミノ酸配列で表示されるものであることを特徴とする、請求項23に記載の用途。
- 前記結合組織成長因子蛋白質の断片を暗号化する遺伝子は、配列番号7または配列番号8の塩基配列を有するものであり、前記アンチセンスヌクレオチド、小さい干渉RNA(short interfering RNA、siRNA)、および短いヘアピンRNA(short hairpin RNA)は、前記配列番号7または配列番号8に対するmRNAの連続する15〜30個の塩基からなる塩基配列に相補的に結合するものであることを特徴とする、請求項24に記載の用途。
- 前記血管新生抑制剤は、癌の成長および転移、リウマチ関節炎、乾癬、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎臓病、高血圧、子宮内膜症、脂肪症、未熟児網膜症、角膜移植拒否、新生血管緑内障、増殖性網膜症、血友病性関節、ケロイド、傷顆粒化、血管接着、骨関節炎、クローン病、再発狭窄症、アテローム性動脈硬化、腸管接着、潰瘍、肝硬病症、糸球体腎炎、悪性腎硬化症、器官移植拒否、腎糸球体病症、糖尿病、または炎症の予防または治療に使用されるものであることを特徴とする、請求項23〜26のいずれか1項に記載の用途。
- 配列番号9のアミノ酸配列内の、配列番号5のアミノ酸配列を含む連続する38個以上のアミノ酸からなる結合組織成長因子蛋白質の断片またはこれを暗号化する遺伝子を、血管新生の促進を必要とする患者に投与するステップを含むことを特徴とする、血管新生促進方法。
- 前記結合組織成長因子蛋白質の断片は、配列番号9のアミノ酸配列内の、配列番号5のアミノ酸配列を含む連続する38個〜39個のアミノ酸からなるものであることを特徴とする、請求項28に記載の方法。
- 前記結合組織成長因子蛋白質の断片は、配列番号5または配列番号6のアミノ酸配列で表示されるものであることを特徴とする、請求項29に記載の方法。
- 前記遺伝子は、配列番号7または配列番号8で表示される塩基配列を有するものであることを特徴とする、請求項28に記載の方法。
- 前記遺伝子は、ベクターに挿入されたものであることを特徴とする、請求項28に記載の方法。
- 血管新生の促進を必要とする患者は、狭心症、動脈硬化、脳卒中、脳血管性痴呆、慢性潰瘍、または創傷の予防または治療を必要とする患者であることを特徴とする、請求項28に記載の方法。
- 配列番号9のアミノ酸配列内の、配列番号5のアミノ酸配列を含む連続する38個以上のアミノ酸からなる結合組織成長因子蛋白質の断片に結合するポリペプチド、抗体、および化合物からなる群より選択された1種以上;または
前記結合組織成長因子蛋白質の断片を暗号化する遺伝子のmRNAに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチド、小さい干渉RNA(short interfering RNA、siRNA)、および短いヘアピンRNA(short hairpin RNA)から構成された群より選択された1種以上を、血管新生の抑制を必要とする患者に投与するステップを含むことを特徴とする、血管新生抑制方法。 - 前記結合組織成長因子蛋白質の断片は、配列番号9のアミノ酸配列内の、配列番号5のアミノ酸配列を含む連続する38個〜39個のアミノ酸からなるものであることを特徴とする、請求項34に記載の方法。
- 前記結合組織成長因子蛋白質の断片は、配列番号5または配列番号6のアミノ酸配列で表示されるものであることを特徴とする、請求項35に記載の方法。
- 前記結合組織成長因子蛋白質の断片を暗号化する遺伝子は、配列番号7または配列番号8の塩基配列を有するものであり、前記アンチセンスヌクレオチド、小さい干渉RNA(short interfering RNA、siRNA)、および短いヘアピンRNA(short hairpin RNA)は、前記配列番号7または配列番号8に対するmRNAの連続する15〜30個の塩基からなる塩基配列に相補的に結合するものであることを特徴とする、請求項34に記載の方法。
- 血管新生の抑制を必要とする患者は、癌の成長および転移、リウマチ関節炎、乾癬、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎臓病、高血圧、子宮内膜症、脂肪症、未熟児網膜症、角膜移植拒否、新生血管緑内障、増殖性網膜症、血友病性関節、ケロイド、傷顆粒化、血管接着、骨関節炎、クローン病、再発狭窄症、アテローム性動脈硬化、腸管接着、潰瘍、肝硬病症、糸球体腎炎、悪性腎硬化症、器官移植拒否、腎糸球体病症、糖尿病、または炎症の予防または治療を必要とする患者であることを特徴とする、請求項34に記載の方法。
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Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH11507332A (ja) * | 1995-06-02 | 1999-06-29 | ユニバーシティー オブ サウス フロリダ | 結合組織成長因子 |
WO2001015729A1 (en) * | 1999-08-27 | 2001-03-08 | Fibrogen, Inc. | Connective tissue growth factor receptor, its agonists and antagonists, and their therapeutic and diagnostic uses |
JP2002532084A (ja) * | 1998-12-14 | 2002-10-02 | ユニバーシティー オブ マイアミ | 結合組織成長因子(ctgf)断片とそれを用いた方法および使用 |
WO2003053340A2 (en) * | 2001-12-10 | 2003-07-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of connective tissue growth factor expression |
WO2007066823A1 (ja) * | 2005-12-07 | 2007-06-14 | Nosan Corporation | 結合組織増殖因子に対する抗体又はそれを含む組成物 |
JP2008525460A (ja) * | 2004-12-23 | 2008-07-17 | アルコン,インコーポレイテッド | 眼の障害を処置するためのCTGFのRNAi阻害 |
WO2010027831A1 (en) * | 2008-08-25 | 2010-03-11 | Excaliard Pharmaceuticals, Inc. | Method for reducing scarring during wound healing using antisense compounds directed to ctgf |
WO2010027830A2 (en) * | 2008-08-25 | 2010-03-11 | Excaliard Pharmaceuticals, Inc. | Methods for modulation of connective tissue growth factor expression by administering antisense oligonucleotides through a delivery system so as to reduce scarring from wound healing and threat fibrotic diseases |
WO2010042281A2 (en) * | 2008-08-25 | 2010-04-15 | Excaliard Pharmaceuticals | Antisense oligonucleotides directed against connective tissue growth factor and uses thereof |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5408040A (en) * | 1991-08-30 | 1995-04-18 | University Of South Florida | Connective tissue growth factor(CTGF) |
US20030215460A1 (en) * | 2002-05-07 | 2003-11-20 | Schall Thomas J. | Methods and compositions for inducing an immune response |
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CA2606778A1 (en) * | 2005-05-05 | 2006-11-16 | Fibrogen, Inc. | Vascular disease therapies |
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Patent Citations (9)
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JPH11507332A (ja) * | 1995-06-02 | 1999-06-29 | ユニバーシティー オブ サウス フロリダ | 結合組織成長因子 |
JP2002532084A (ja) * | 1998-12-14 | 2002-10-02 | ユニバーシティー オブ マイアミ | 結合組織成長因子(ctgf)断片とそれを用いた方法および使用 |
WO2001015729A1 (en) * | 1999-08-27 | 2001-03-08 | Fibrogen, Inc. | Connective tissue growth factor receptor, its agonists and antagonists, and their therapeutic and diagnostic uses |
WO2003053340A2 (en) * | 2001-12-10 | 2003-07-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of connective tissue growth factor expression |
JP2008525460A (ja) * | 2004-12-23 | 2008-07-17 | アルコン,インコーポレイテッド | 眼の障害を処置するためのCTGFのRNAi阻害 |
WO2007066823A1 (ja) * | 2005-12-07 | 2007-06-14 | Nosan Corporation | 結合組織増殖因子に対する抗体又はそれを含む組成物 |
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