CN102958532A - 使用结缔组织生长因子的药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及与使用结缔组织生长因子的血管发生相关的药物组合物；涉及用于促进血管发生的含有所述结缔组织生长因子的药物组合物，或用于抑制血管发生的含有选自以下的成分的药物组合物：可结合结缔组织生长因子的多肽、抗体和化合物。本发明中阐述的结缔组织生长因子蛋白的片段是结合FPRL1的位点，其可有效地诱导FPRL1特异性的ERK磷酸化，并且通过活化FPRL1来增加细胞内Ca2+浓度，并因而最终具有可有效地诱导血管发生的作用，因此所述结缔组织生长因子的片段可有利地用作促进血管发生的药物组合物，而可结合所述结缔组织生长因子蛋白的片段的多肽、抗体或化合物可有利地用作抑制血管发生的药物组合物。
Description
技术领域
本公开涉及血管发生相关的使用结缔组织生长因子的药物组合物，更具体地涉及用于促进血管发生的含有所述结缔组织生长因子的药物组合物，或用于抑制血管发生的含有选自可结合结缔组织生长因子的多肽、抗体和化合物中至少一种的药物组合物。
背景技术
血管发生是从现有的微血管形成新的毛细血管的过程，血管发生通常发生在胚胎发育、组织再生和创伤愈合、黄体（corpus luteum）发育期间，其中黄体发育是雌性生殖系统中的周期性变化，即使在这种情况下，血管发生也是严格地受到控制和进行的（Folkman J et al.,Int.Rev.Exp.Pathol.,16,pp207-248,1976）。
在成人中，血管内皮细胞生长非常慢，并且与其他类型细胞相比几乎不分裂。血管发生的过程通常由以下组成：通过血管发生促进剂的刺激引起蛋白酶对血管基底膜的分解，血管内皮细胞的迁移、增殖，以及由血管内皮细胞的分化形成管来重新构成血管以产生新的毛细血管。
存在由血管发生的自身调节失败和异常生长导致的疾病。在病理状态下发生的与血管发生相关的疾病包括血管瘤、血管纤维瘤、血管畸形和诸如动脉粥样硬化的心血管疾病、血管粘附、硬皮病，由血管发生导致的眼科疾病包括由于角膜移植造成的血管发生、新生血管性青光眼、糖尿病视网膜病、由血管发生导致的角膜疾病、黄斑变性、翼状胬肉、视网膜变性、晶状体后纤维增生、颗粒性结膜炎等。
慢性炎性疾病例如关节炎、皮肤病例如银屑病、毛细管扩张、化脓性肉芽肿、脂溢性皮炎、痤疮、阿尔茨海默病和肥胖也与血管发生相关，并且癌的生长和代谢必须依赖血管发生（D'Amato RJ et al.,Ophthalmology，102(9),pp1261-1262,1995;Arbiser JL,J.Am.Acad.Dermatol.,34(3),pp486-497,1996;O'Brien KD et al.Circulation,93(4),pp672-682,1996;Hanahan D et al.,Cell,86,pp353-364,1996）。
具体地，在癌中，血管发生对于癌细胞生长和代谢发挥着重要的功能。肿瘤是通过血管发生被供给生长所需的营养物和氧气，伸入肿瘤中的血管原性血管为癌细胞提供了进入血液循环系统从而允许癌细胞转移的途径（Folkm an and Tyler，Cancer Invasion and metastasis,Biologicmechanisms and Therapy(S.B.Day ed.)Raven press,New York,pp94-103,1977;Polverini PJ,Crit.Rev.Oral.Biol.Med.,6(3),pp230-247,1995）。
相反地，虽然血管的过量形成有时成为疾病恶化的主要原因，但是不形成血管也成为严重疾病的原因。血管发生是创伤愈合或组织再生的必要现象，例如，血管形成发育不良的胎盘是流产的重要原因，由于血管不形成造成的坏死、溃疡和缺血可以诱导组织或器官的异常功能或者成为死亡的原因。疾病例如动脉粥样硬化、心肌梗死和心绞痛也成为血液供应缓慢的原因。因此，需要开发一种治疗方法，其可以降低由血管不形成导致的低氧或低营养状态而造成的组织损伤，并且诱导或促进用于平滑组织再生的新血管形成。
具体实施方式
技术问题
发明人发现在血管发生中涉及一种炎性细胞因子——血管内皮生长因子-A（VEGF-A）和FPRL1（甲酰肽受体样1），结缔组织生长因子（CTGF）结合FPRL1以诱导血管发生，具体地发现CTGF中结合FPRL1的区域，证实了血管发生是通过该区域诱导的，并完成了本发明。
因此，本发明的一个实施方案提供了一种用于促进血管发生的药物组合物，其含有与CTGF中FPRL1结合区域对应的蛋白片段和/或编码该蛋白片段的基因；与CTGF中FPRL1结合区域对应的蛋白片段和/或编码该蛋白片段的基因用于促进血管发生和/或制备血管发生促进剂的用途；以及一种用于促进血管发生的方法，其包括将与CTGF中FPRL1结合区域对应的蛋白片段和/或编码该蛋白片段的基因给予需要促进血管发生的患者。
本发明的另一个实施方案提供了一种抑制血管发生的药物组合物，其含有与CTGF中FPRL1结合区域对应的蛋白片段和/或编码该蛋白片段的基因；与CTGF中FPRL1结合区域对应的蛋白片段和/或编码该蛋白片段的基因用于抑制血管发生和/或制备血管发生抑制剂的用途；并且/或者一种抑制血管发生的方法，其包括将与CTGF中FPRL1结合区域对应的蛋白片段和/或编码该蛋白片段的基因给予需要抑制血管发生的患者。
本发明的另一个实施方案提供了一种使用CTGF中FPRL1结合区域作为靶标来筛选血管发生抑制剂的方法。
技术方案
为解决所述问题，本发明的一个实施方案提供了一种用于促进血管发生的药物组合物，其含有结缔组织生长因子蛋白片段，所述片段包括SEQ ID NO.9的氨基酸序列中连续38个或更多个氨基酸，例如连续38-140个氨基酸（例如选自第103位到第242位氨基酸的区域）、连续38-100个氨基酸（例如选自第103位到第202位氨基酸的区域）或连续38-80个氨基酸（例如选自第163位到第242位氨基酸的区域），优选包括SEQ ID NO.5的氨基酸序列（WVCDEPKDQTVVGPALAAYRLEDTFGPDPTMIRANCLV）的连续38-39个氨基酸，所述SEQ ID NO.5为第164位到第201位氨基酸的区域；所述结缔组织生长因子蛋白片段用于促进血管发生和/或制备血管发生促进剂中的用途；以及一种用于促进血管发生的方法，其包括将所述结缔组织生长因子蛋白片段给予需要促进血管发生的患者。
另一个实施方案提供了一种用于促进血管发生的药物组合物，其含有编码结缔组织生长因子蛋白片段的基因，所述结缔组织生长因子蛋白片段包括SEQ ID NO.9氨基酸序列中连续38个或更多个氨基酸，例如连续38-140个氨基酸（例如选自第103位到第242位氨基酸的区域）、连续38-100个氨基酸（例如选自第103位到第202位氨基酸的区域）或连续38-80个氨基酸（例如选自第163位到第242位氨基酸的区域），优选包括SEQ ID NO.5氨基酸序列的连续38-39个氨基酸；编码结缔组织生长因子蛋白片段的基因用于促进血管发生和/或制备血管发生促进剂的用途；以及一种用于促进血管发生的方法，其包括将所述编码结缔组织生长因子蛋白片段的基因给予需要促进血管发生的患者。
所述用于促进血管发生的方法可以进一步包括，在所述给药前，确认需要促进血管发生的患者，其中所述需要促进血管发生的患者可以是这样的患者，即其需要预防或治疗心绞痛、动脉粥样硬化、中风、血管性痴呆、慢性溃疡或创伤。所述患者可以是哺乳动物，优选人。
另一个实施方案提供了一种抑制血管发生的药物组合物，其含有选自可结合结缔组织生长因子蛋白片段的多肽、抗体和化合物中的至少一种，所述结缔组织生长因子蛋白片段包括SEQ ID NO.9氨基酸序列中连续38个或更多个氨基酸，例如连续38-140个氨基酸（例如选自第103位到第202位氨基酸的区域）、连续38-100个氨基酸（例如选自第103位到第202位氨基酸的区域）或连续38-80个氨基酸（例如选自第163位到第242位氨基酸的区域），优选包括SEQ ID NO.5氨基酸序列的连续38-39个氨基酸；所述可结合结缔组织生长因子蛋白片段的多肽、抗体和化合物用于抑制血管发生和/或制备血管发生抑制剂的用途；以及一种抑制血管发生的方法，其包括将所述可结合结缔组织生长因子蛋白片段的多肽、抗体和化合物给予需要抑制血管发生的患者。
另一个实施方案提供了一种抑制血管发生的药物组合物，其含有结缔组织生长因子片段的表达抑制剂，所述结缔组织生长因子片段包括SEQ ID NO.9氨基酸序列中连续38个或更多个氨基酸作为其活性成分，例如连续38-140个氨基酸（例如选自第103位到第202位氨基酸的区域）、连续38-100个氨基酸（例如选自第103位到第202位氨基酸的区域）或连续38-80个氨基酸（例如选自第163位到第242位氨基酸的区域），优选包括SEQ ID NO.5氨基酸序列的连续38-39个氨基酸；所述结缔组织生长因子蛋白片段的表达抑制剂用于抑制血管发生和/或制备血管发生抑制剂的用途；以及一种抑制血管发生的方法，其包括将结缔组织生长因子蛋白片段的表达抑制剂给予需要抑制血管发生的患者。例如，所述表达抑制剂可以是选自反义核苷酸、短干扰RNA和短发夹RNA的至少一种，所述反义核苷酸、短干扰RNA和短发夹RNA互补性结合到编码所述SEQ ID NO.5氨基酸序列的基因的碱基序列（SEQ ID NO.7）或其mRNA，例如，由所述mRNA中连续15-30个、优选连续20-25个碱基组成的碱基序列。
所述抑制血管发生的方法还可以包括，在所述给药前，确认需要抑制血管发生的患者，其中所述需要抑制血管发生的患者可以是这样的患者，即其需要预防或治疗癌生长和转移、类风湿性关节炎、银屑病、糖尿病视网膜病、糖尿病肾病、高血压、子宫内膜异位、肥胖病、早产儿视网膜病、角膜炎症排斥、新生血管性青光眼、增殖性视网膜病、血友病性关节病、瘢痕疙瘩、伤口肉芽形成、血管粘附、骨关节炎、克罗恩病（Crohn’s disease）、再狭窄、动脉粥样硬化、肠粘连、溃疡、肝硬化、肾炎（neophritis）、恶性肾硬化、器官移植排斥、肾小球病、糖尿病或炎症。所述患者可以是哺乳动物，优选人。
另一个实施方案提供了用于筛选血管发生抑制剂的方法，其包括（a）用一种候选化合物处理包含有编码结缔组织生长因子蛋白片段的基因的细胞，所述结缔组织生长因子片段包括SEQ ID NO.9氨基酸序列中连续38个或更多个氨基酸，例如连续38-140个氨基酸（例如选自第103位到第202位氨基酸的区域）、连续38-100个氨基酸（例如选自第103位到第202位氨基酸的区域）或连续38-80个氨基酸（例如选自第163位到第242位氨基酸的区域），优选包括SEQ ID NO.5氨基酸序列的连续38-39个氨基酸；和（b）测量所述基因的表达程度，其中如果与没有用所述候选化合物处理的细胞相比，在用所述候选化合物处理的所述细胞中所述基因的表达程度降低，那么所述候选物质就被确定为血管发生抑制剂。
下文将详细阐述本发明。
所述用于促进血管发生的组合物含有结缔组织生长因子蛋白片段，所述结缔组织生长因子蛋白片段包括SEQ ID NO.9氨基酸序列中连续38个或更多个氨基酸，例如连续38-140个氨基酸（例如选自第103位到第242位氨基酸的区域）、连续38-100个氨基酸（例如选自第103位到第202位氨基酸的区域）或连续38-80个氨基酸（例如选自第163位到第242位氨基酸的区域），优选包括SEQ ID NO.5氨基酸序列的连续38-39个氨基酸。
所述结缔组织生长因子（CTGF）的全长氨基酸序列可以源自人（例如登录号CAG46559.1），并由SEQ ID NO.9表示。在血管发生中涉及一种炎性细胞因子——血管内皮生长因子-A（VEGF-A）和FPRL1（甲酰肽受体样1），所述结缔组织生长因子蛋白可以结合FPRL1以诱导血管发生。具体地，所述结缔组织生长因子具有诱导FPRL1特异性ERK磷酸化的活性（参见实验结果2），是一种其表达受VEGF-A诱导的蛋白（参见实验结果3），并且它结合FPRL1以诱导血管发生（参见实验结果11）。
具体地，其中所述结缔组织生长因子蛋白结合FPRL1的区域是结缔组织生长因子蛋白全长氨基酸序列SEQ ID NO.9中从第164位氨基酸到第201位氨基酸的区域，其可以由SEQ ID NO.5氨基酸序列表示（参见实验结果4）。
因此，所述结缔组织生长因子蛋白片段——其是本发明用于促进血管发生的药物组合物的活性成分——可以包括所述结缔组织生长因子蛋白的全长序列SEQ ID NO.9中连续38个或更多个氨基酸，例如连续38-140个氨基酸（例如选自第103位到第242位氨基酸的区域）、连续38-100个氨基酸（例如选自第103位到第202位氨基酸的区域）或连续38-80个氨基酸（例如选自第163位到第242位氨基酸的区域），优选连续38-39个氨基酸，其包括SEQ ID NO.5的氨基酸序列——SEQ ID NO.9中第164位氨基酸到第201位氨基酸的区域。所述结缔组织生长因子蛋白片段可以优选地由SEQ ID NO.6的氨基酸序列（EWVCDEPKDQTVVGPALAAYRLEDTFGPDPTMIRANCLV）表示，但不限于此。
所述结缔组织生长因子蛋白片段是FPRL1的结合区域（参见实验结果5），有效地诱导FPRL1特异性ERK磷酸化（参见实验结果6），活化FPRL1以增加细胞内Ca2+浓度（参见实验结果7），最后有效地诱导血管发生（参见实验结果9）。
本发明所述用于促进血管发生的药物组合物可以含有编码结缔组织生长因子蛋白的基因，所述结缔组织生长因子蛋白包括SEQ ID NO.9氨基酸序列中连续38个或更多个氨基酸，例如连续38-140个氨基酸（例如选自第103位到第242位氨基酸的区域）、连续38-100个氨基酸（例如选自从第103位到第202位氨基酸的区域）或连续38-80个氨基酸（例如选自第163位到第242位氨基酸的区域），优选包括SEQ ID NO.5氨基酸序列的连续38-39个氨基酸。优选地，所述基因可以编码SEQ IDNO.5的氨基酸序列——所述结缔组织生长因子蛋白全长氨基酸序列中第164位氨基酸到第201位氨基酸的区域，或者编码包括SEQ ID NO.5氨基酸序列的SEQ ID NO.6氨基酸序列，但不限于此。更优选地，所述基因可以由编码SEQ ID NO.5氨基酸序列的SEQ ID NO.7的碱基序列表示（164-TGG GTG TGT GAC GAG CCC AAG GAC CAA ACCGTG GTT GGG CCT GCC CTC GCG GCT TAC CGA CTG GAAGAC ACG TTT GGC CCA GAC CCA ACT ATG ATT AGA GCC AACTGC CTG GTC-201），并且它可以由编码SEQ ID NO.6氨基酸序列的SEQ ID NO.8的碱基序列表示（163-GAG TGG GTG TGT GAC GAGCCC AAG GAC CAA ACC GTG GTT GGG CCT GCC CTC GCGGCT TAC CGA CTG GAA GAC ACG TTT GGC CCA GAC CCA ACTATG ATT AGA GCC AAC TGC CTG GTC-201）。
所述基因可以被插入载体中，优选重组表达载体，但不限于此，其中所述重组表达载体可以包含所述基因以及包括可操作地连接的启动子等在内的表达调节基因。例如，所述重组表达载体可以是例如EcoRI-INSERT-Xba I in pAB-beeTM-FH载体（包括信号肽和flag标签），但不限于此。
具体地，所述载体被用于将DNA片段从一个细胞转移到另一个细胞的核酸分子，可以源自选自质粒、噬菌体、植物病毒和动物病毒的那些，但不限于此。
所述表达载体是指这样的重组DNA，其包含目标编码序列以及可操作地连接在具体宿主中的表达所述编码序列需要的适合核酸序列，并且通常，原核细胞中表达所需要的核酸序列可以包括启动子、操纵子（任选的）和核糖体结合区以及其他序列，而真核细胞使用启动子、增强子以及终止和多聚腺苷酸化信号，这在本领域中是已知的。
所述重组表达载体可以是包含可操作地连接的必需调节基因元件以便表达所述基因的基因构建体，其可以在适合的宿主细胞中产生目的蛋白——本发明所述的结缔组织生长因子片段。
术语“可操作地连接”意指核酸表达调节基因序列和编码目标蛋白的核酸序列有功能地连接以便执行通常的功能。例如，启动子与编码蛋白或RNA的核酸可以是可操作地连接的以影响编码序列的表达。所述与重组载体的可操作地连接可以使用本领域中公知的基因重组技术制备，位点特异性的DNA切割和连接可以使用本领域中广泛已知的酶等来执行。
适合的表达载体包括表达调节元件例如启动子、起始密码子、终止密码子、多聚腺苷酸化信号和增强子等，其可以根据目的以不同方式制备。当基因构建体被给予时所述起始密码子和终止密码子应该在个体中起作用，并且其应该与编码序列同框。
所述用于促进血管发生的药物组合物可以用于治疗由血管发生抑制导致的疾病或可以由促进血管发生治愈的疾病，但不限于此，例如，其可以用于治疗心绞痛、动脉粥样硬化、缺血性中风、血管性痴呆、慢性溃疡或创伤。因此，本发明的另一个实施方案提供一种用于预防和/或治疗心绞痛、动脉粥样硬化、缺血性中风、血管性痴呆、慢性溃疡或创伤的组合物，其包括所述用于促进血管发生的药物组合物作为活性成分。
同时，所述抑制血管发生的药物组合物含有选自可结合结缔组织生长因子蛋白片段的多肽、抗体和化合物中的至少一种，所述结缔组织生长因子蛋白片段包括SEQ ID NO.9氨基酸序列中连续38个或更多个氨基酸，例如连续38-140个氨基酸（例如选自第103位到第242位氨基酸的区域）、连续38-100个氨基酸（例如选自第103位到第202位氨基酸的区域）或连续38-80个氨基酸（例如选自从第163位到第242位氨基酸的区域），优选包括SEQ ID NO.5氨基酸序列的连续38-39个氨基酸。
如上所述，因为包括——结缔组织生长因子全长蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO.9中连续38个或更多个氨基酸，例如连续38-140个氨基酸（例如选自第103位到第242位氨基酸的区域）、连续38-100个氨基酸（例如选自第103位到第202位氨基酸的区域）或连续38-80个氨基酸（例如选自第163位到第242位氨基酸的区域），优选包括SEQ ID NO.5氨基酸序列的连续38-39个氨基酸——的结缔组织生长因子蛋白片段结合FPRL1以诱导血管发生，所以选自可结合所述结缔组织生长因子蛋白片段的多肽、抗体和化合物中的至少一种可以有效地抑制血管发生。
所述结缔组织生长因子片段可以包括所述结缔组织生长因子蛋白全长序列SEQ ID NO.9的氨基酸序列中连续38个或更多个氨基酸，例如连续38-140个氨基酸（例如选自第103位到第242位氨基酸的区域）、连续38-100个氨基酸（例如选自第103位到第202位氨基酸的区域）或连续38-80个氨基酸（例如选自第163位到第242位氨基酸的区域），优选包括SEQ ID NO.5氨基酸序列的连续38-39个氨基酸，所述SEQID NO.5为第164位到第201位的区域，更优选地，其可以由包括SEQID NO.5氨基酸序列的SEQ ID NO.6的氨基酸序列表示。
因为所述结缔组织生长因子蛋白片段包含结合FPRL1的区域，所以可结合所述结缔组织生长因子蛋白片段的多肽、抗体或化合物可以阻断所述结缔组织生长因子蛋白与FPRL1的结合以有效地抑制血管发生。
所述多肽、抗体或化合物没有具体限制，只要其可以结合所述结缔组织生长因子蛋白片段，但是优选地，其可以结合SEQ ID NO.6或SEQID NO.5氨基酸序列，并且其可以根据所述要结合的结缔组织生长因子蛋白片段的氨基酸序列容易地由本领域普通技术人员制备。
此外，抑制血管发生的药物组合物可以含有选自反义核苷酸、短干扰RNA和短发夹RNA的至少一种，所述反义核苷酸、短干扰RNA和短发夹RNA互补性结合到编码结缔组织生长因子蛋白片段的基因，或其mRNA，例如所述mRNA中由连续15-30优选连续20-25个碱基组成的碱基序列，所述结缔组织生长因子蛋白片段包括SEQ ID NO.9氨基酸序列中连续38个或更多个氨基酸，例如连续38-140个氨基酸（例如选自第103位到第242位氨基酸的区域）、连续38-100个氨基酸（例如选自第103位到第202位氨基酸的区域）或连续38-80个氨基酸（例如选自第163位到第242位氨基酸的区域），优选包括SEQ ID NO.5氨基酸序列的连续38-39个氨基酸。
所述siRNA包括正义RNA链和互补的反义RNA链，所述两条链通过标准沃森-克里克（Watson-Crick）碱基对相互作用互相退火，所述正义链包含与靶标mRNA中所述靶标序列相同的核酸序列。选择所述siRNA的靶标序列的技术记载于例如Tuschl T et al,"The siRNAUser Guide"revised Oct.11,2002中。
所述siRNA的正义和反义链可以包含两条互补的单链RNA分子，或者其可以包含其中两个互补部分形成碱基对并通过单链“发夹”区域共价键合的单个分子。后者被称为短发夹RNA（shRNA），其中所述shRNA为单链并在体内形成茎环结构。所述shRNA通常通过在体内由Pol III启动子转录互补DNA序列合成。Pol-III诱导的转录起始于明确限定的起始位点并终止于由4个或4个以上胸腺嘧啶核苷组成的线性（-TTTT-）的第二个残基处，以产生无poly(A)的转录物。Pol-III启动子可以在所有细胞中被活化，它可以表达shRNA。在转录后，所述shRNA的环被dicer酶切开，并且所述shRNA像siRNA一样与RISC（RNA诱导的沉默复合物）作用（参见，Tuschl,T.(2002),Cell110(5):563-74）。
所述siRNA可以使用本领域普通技术人员已知的许多技术获得。例如，siRNA可以使用本领域中已知方法化学合成或通过重组产生。优选地，所述siRNA可以使用以适合方法保护的核糖核苷亚磷酰胺和现有的DNA/RNA合成仪来化学合成。所述siRNA可以被合成为两个互补且分离的RNA分子或一个具有两个互补区域的RNA分子。或者，所述siRNA可以使用合适的启动子从重组DNA质粒表达。适合于从质粒表达所述siRNA的启动子可以包括例如，U6或H1RNA pol III启动子序列和巨细胞病毒启动子。所述重组质粒可以包括可诱导的或可控制的启动子以便在特定组织或特定细胞内环境中表达siRNA。
所述siRNA可以从重组质粒被表达为两个互补且分离的RNA分子或一个具有两个互补区域的RNA分子。对用于siRNA表达的适合质粒的选择、在质粒中插入核酸以表达siRNA的方法和将重组质粒转移到目标细胞的方法都在本发明所属领域的技术范围内。例如，参见[Tuschl,T.(2002),Nat.Biotechnol,20:446-448];[Brummelkamp TR et al.(2002),Science296:550-553];[Miyagishi M et al.(2002),Nat.Biotechnol.20:497-500];[Paddison PJ et al.(2002),Genes Dev.16:948-958;Lee NS et al.(2002),Nat.Biotechnol.20:500-505];和[PaulCP et al.(2002),Nat.Biotechnol.20:505-508]，以上文献都以引用的方式纳入本文。
例如，根据本发明的一个实施方案，可以使用具有靶标AAUUCACAUCGUGGUGGACAU（SEQ ID NO.10）的双链RNA分子（例如，正义链：UUCACAUCGUGGUGGACAUdTdT（SEQ ID NO.3）和反义链：AUGUCCACCACGAUGUGAAdTdT（SEQ ID NO.4））作为FPRL1的siRNA。
所述用于抑制血管发生的药物组合物可以用于预防和/或治疗血管发生相关的疾病。所述血管发生相关的疾病可以是选自以下的疾病或症状：癌生长和转移、类风湿性关节炎、银屑病、糖尿病视网膜病、糖尿病肾病、高血压、子宫内膜异位、肥胖病、早产儿视网膜病、角膜炎症排斥、新生血管性青光眼、增殖性视网膜病、血友病性关节病、瘢痕疙瘩、伤口肉芽形成、血管粘附、骨关节炎、克罗恩病、再狭窄、动脉粥样硬化、肠粘连、溃疡、肝硬化、肾炎、恶性肾硬化、器官移植排斥、肾小球病、糖尿病、炎症等。因此，本发明的一个实施方案提供一种用于预防或治疗选自以下的疾病或症状的组合物：癌生长和转移、类风湿性关节炎、银屑病、糖尿病视网膜病、糖尿病肾病、高血压、子宫内膜异位、肥胖病、早产儿视网膜病、角膜炎症排斥、新生血管性青光眼、增殖性视网膜病、血友病性关节病、瘢痕疙瘩、伤口肉芽形成、血管粘附、骨关节炎、克罗恩病、再狭窄、动脉粥样硬化、肠粘连、溃疡、肝硬化、肾炎、恶性肾硬化、器官移植排斥、肾小球病、糖尿病、炎症等，所述组合物含有所述用于抑制血管发生的药物组合物作为活性成分。
为了给予所述用于促进血管发生的药物组合物或用于抑制血管发生的药物组合物，除上述的活性成分外还可包括至少一种可药用载体。所述可药用载体可以是选自盐水溶液、无菌水、林格溶液（Ringer’ssolution）、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体及其混合物中的至少一种，并且如果必要的话，可以添加其他普通添加剂例如抗氧化剂、缓冲溶液、抑菌剂等。可以额外地添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂以配制成用于注射的剂型，例如水性溶液、悬液、乳剂等，丸剂、胶囊、颗粒或片剂，并且靶器官-特异性抗体或其他配体可以结合到所述载体以便特异地在靶器官上起作用。此外，优选地，可以根据疾病或成分通过本领域中适合的方法或使用Remington's Pharmaceutical Science(最新版),Mack PublishingCompany，Easton PA中公开的方法配制所述药物组合物。
本发明所述用于促进血管发生的药物组合物或用于抑制血管发生的药物组合物可以被制备用于口服给药、局部给药、肠胃外给药、静脉给药、肌内给药、皮下给药、眼内给药、经皮给药等。优选地，其可以以可注射形式使用。
因此，可以将可注射组合物与可药用介质混合以直接注射到要治疗的区域。本发明所述组合物可以包括冻干的组合物，所述冻干组合物一旦加入等渗无菌溶液、无菌水或适合的生理盐水后就能够构成可注射溶液。直接注射到患者的肿瘤中是有利的，因为治疗效力集中于受感染的组织。所使用的剂量可以通过多种参数控制，所述参数具体包括基因、载体、使用的给药途径、目的疾病或所需要的治疗期。并且，剂量范围可以根据体重、年龄、性别、健康状况、患者饮食、给药时间、给药途径、排泄率和疾病严重程度等变动。每日剂量可以为约0.0001-10mg/kg，优选0.001-1mg/kg，其可以优选地一天给药一次或分为几次。
同时，一种用于筛选血管发生抑制剂的方法包括
（a）用一种候选化合物处理包含有编码结缔组织生长因子蛋白片段的基因的细胞，所述结缔组织生长因子片段包括SEQ ID NO.9氨基酸序列中连续38个或更多个氨基酸，例如连续38-140个氨基酸（例如选自第103位到第202位氨基酸的区域）、连续38-100个氨基酸（例如选自第103位到第202位氨基酸的区域）或连续38-80个氨基酸（例如选自第163位到第242位氨基酸的区域），优选包括SEQ ID NO.5氨基酸序列的连续38-39个氨基酸；和
（b）测量所述基因的表达程度，
其中如果与没有用所述候选化合物处理的细胞相比，在用所述候选化合物处理的所述细胞中所述基因的表达程度减少，那么所述候选物质被确定为血管发生抑制剂。
在所述步骤（a）中，所述结缔组织生长因子蛋白片段可以由SEQ IDNO.5或SEQ ID NO.6的氨基酸序列表示。所述候选化合物可以是肽、蛋白质、非肽化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取物、植物提取物或动物提取物，但不限于此，并且其可以包括广泛已知的那些以及新物质。在所述步骤（a）中，所述细胞可以用包括所述基因的重组表达载体转化，所述转化方法为中本领域公知的。
在所述步骤（b）中，所述基因的表达程度可以优选地通过免疫萦光方法、酶联免疫吸附测定（ELISA）、蛋白印迹或RT-PCR测量，但不限于此。在使用抗体根据表达确定蛋白的量时，可以加入对靶蛋白特异性的并连接可检测标签的第二抗体，在加入所述第二抗体后，可以加入对所述第二抗体具有结合亲和力并连接可检测标签的第三抗体。作为所述第二或第三抗体的可检测标签，可以使用在培养时显色的酶和适合的显色底物。所述可检测部分可以包括可通过光谱的、酶的、光化学的、生物电的、免疫化学的、电的、光学的或化学的工具检测的组合物，例如，其可以包括萦光标记和染料、磁性标签、连接的酶、质谱标签、自旋标签、电子供体和受体，但不限于此。
如果，与未用所述候选化合物处理的对照相比，用所述候选化合物处理的细胞中所述基因表达程度减少，那么所述候选化合物可以被选作血管发生抑制剂。所述血管发生抑制剂可以用于预防或治疗选自以下的疾病或症状：类风湿性关节炎、银屑病、糖尿病视网膜病、糖尿病肾病、高血压、子宫内膜异位、肥胖病、癌症、早产儿视网膜病、角膜炎症排斥、新生血管性青光眼、增殖性视网膜病、血友病性关节病、瘢痕疙瘩、伤口肉芽形成、血管粘附、骨关节炎、克罗恩病、再狭窄、动脉粥样硬化、肠粘连、溃疡、肝硬化、肾炎、恶性肾硬化、器官移植排斥、肾小球病、糖尿病、炎症等，但不限于此。
使用本发明的筛选方法时，可以在短时间内选择所述机制中涉及的治疗剂，通过用于证明的实验，可以将有用的预防和/或治疗剂提供给需要预防和/或治疗由血管发生导致的疾病的患者。
本发明中发现的所述结缔组织生长因子蛋白片段，是FPRL1的结合区域，有效地诱导FPRL1特异性ERK磷酸化，活化FPRL1以增加细胞内Ca2+浓度，最后有效地诱导血管发生，因此，所述结缔组织生长因子蛋白片段可以用于促进血管发生的药物组合物，同时可结合所述结缔组织生长因子蛋白片段的多肽、抗体或化合物可以用于抑制血管发生的药物组合物。
附图说明
图1示出了免疫印迹法结果，其用于确认通过用VEGF-A处理获得的HUVEC条件培养基是否在FPRL1过表达的FPRL1/RBL细胞中诱导ERK磷酸化。
图2示出了实验结果，其用于确认条件培养基、VEGF-A和阳性对照（WKYMVm）只在FPRL1过表达的FPRL1/RBL细胞中诱导ERK磷酸化。
图3示出了以下结果，其用于确认通过用条件培养基的HPLC级分处理FPRL1/RBL细胞，ERK磷酸化是否发生。
图4示出了条件培养基的B12级分的MS/MS分析结果。
图5示出了根据VEGF-A的处理时间，分析以VEGF-A处理的HUVEC的细胞裂解物或条件培养基中CTGF表达程度的结果。
图6示出了根据VEGF-A的处理量，分析以VEGF-A处理的HUVEC的细胞裂解物或条件培养基中CTGF表达程度的结果。
图7示出了以下结果，其用于确认当给予VEGF-A受体的抗体时，CTGF表达显著减少。
图8的示意图显示了，测定CTGF中FPRL1的结合区域的方法。
图9示出了以下结果，其用于确认在FPRL1/RBL细胞中全长CTGF蛋白或其部分缺失的蛋白是否诱导ERK磷酸化。
图10示出了以下结果，其用于确认SEQ ID NO.6的CTGF接头（linker）多肽是否只与FPRL1/RBL细胞结合。
图11示出了以下结果，其用于确认SEQ ID NO.6的CTGF接头多肽诱导ERK磷酸化至与rhCTGF相似的水平，并且所述ERK磷酸化被FPRL1拮抗剂（WRW4）降低。
图12示出了以下结果，其用于确认在以SEQ ID NO.6的CTGF接头多肽处理的FPRL1/RBL细胞中Ca2+浓度是否增加。
图13示出了以下结果，其用于确认在HUVEC细胞中SEQ ID NO.6的CTGF接头多肽是否与FPRL1结合。
图14示出了以下结果，其用于确认如果以SEQ ID NO.6的CTGF接头多肽处理HUVEC，那么ERK磷酸化被有效地诱导。
图15示出了以下结果，其用于确认如果以SEQ ID NO.6的CTGF接头多肽处理HUVEC，那么细胞内Ca2+浓度以浓度依赖的方式增加。
图16示出了以下结果，其用于确认SEQ ID NO.6的CTGF接头多肽不会显著影响HUVEC的增殖。
图17示出了以下结果，其用于确认SEQ ID NO.6的CTGF接头多肽以浓度依赖的方式诱导HUVEC的迁移。
图18示出了以下结果，其用于确认SEQ ID NO.6的CTGF接头多肽以浓度依赖的方式诱导HUVEC的管形成。
图19示出了以下结果，其用于确认SEQ ID NO.6的CTGF接头多肽在体内以浓度依赖的方式诱导血管发生。
图20示出了根据孵育时间通过进行RT-PCR或流式细胞计量术确认在HUVEC细胞中VEGF-A是否诱导FPRL1表达的结果。
图21示出了根据处理量通过进行RT-PCR或流式细胞计量术确认在HUVEC细胞中VEGF-A是否诱导FPRL1表达的结果。
图22示出了以下实验结果，其用于确认由VEGF-A诱导的HUVEC的增殖没有被FPRL1拮抗剂（WRW4）显著降低。
图23示出了以下实验结果，其用于确认由VEGF-A诱导的HUVEC的迁移没有被FPRL1拮抗剂（WRW4）显著降低。
图24示出了以下实验结果，其用于确认由VEGF-A诱导的HUVEC的管形成没有被FPRL1拮抗剂（WRW4）显著降低。
图25示出了以下实验结果，其用于确认如果以FPRL1 siRNA处理HUVEC，那么FPRL1表达被抑制。
图26示出了以下实验结果，其用于确认如果以FPRL1 siRNA处理HUVEC，那么由VEGF-A诱导的细胞迁移被抑制。
图27示出了以下实验结果，其用于确认如果以FPRL1 siRNA处理HUVEC，那么由VEGF-A诱导的管形成被抑制。
图28示出了以下实验结果，其用于确认FPRL1拮抗剂（WRW4）通过VEGF-A抑制血管发生。
图29的示意图示出了通过由VEGF-A表达的CTGF和FPRL1的结合诱导的血管发生的机制。
实施例
下文中将参考以下实施例详细阐述本发明。
但是，这些实施例仅是为了解释本发明，本发明的范围不限于此。
在以下实施例中，所有数据以均值±标准差表示，通过Student's t检验进行统计对比，并且当p<0.05时认为是统计学上显著的。
<实验方法>
1.实验材料
磷酸化-ERK1/2（Thr202/Tyr204）和ERK1/2抗体购自Cell SignalingTechnology Inc.(Beverly，MA,USA)，人CTGF抗体和抗Flag的抗体分别购自Abcam(Cambridge,MA,USA)和Sigma Co.(St.Louis,MO,USA)。重组人CTGF购自BioVendor Laboratory Medicine Inc.(Brno,Czech Republic)。重组人VEGF-A165、抗VEGF-AmAb、抗VEGFR-1mAb和抗VEGFR-2mAb获自R&D Systems Inc.(Minneapolis,MN,USA)。
针对FPRL1的siRNA（正义链:UUCACAUCGUGGUGGACAUdTdT(SEQ ID NO.3)，反义链:AUGUCCACCACGAUGUGAAdTdT(SEQ ID NO.4)）和针对萤光素酶的siRNA（正义链:CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT(SEQ IDNO.11)，反义链:UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT(SEQ ID NO.12)）在Dharmacon Research,Inc.(Chicago,IL)合成。WKYMVm(SEQID NO.1)、WRWWWW(SEQ ID NO.2,WRW4)和生物素化的WKYMVm在A&PEP Inc(Seoul,Korea)合成，其纯度高于95%。包括人CTGF连接区域的氨基酸序列的接头多肽（EWVCDEPKDQTVVGPALAAYRLEDTFGPDPTMIRANCLV(SEQID NO.6)-NH2）在Anygen Co.Ltd.(Gwangjoo,Korea)合成，其纯度约为99.1%。
2.细胞培养
根据本领域中已知方法（Ferrero,E.etal.Transendothelialmigration leads to protection from starvation-induced apoptosis inCD34+CD14+circulating precursors:evidence for PECAM-1involvement through Akt/PKB activation.Blood101,186-193,2003）用胶原酶（Sigma,St.Louis,MO,USA）处理人脐静脉内皮细胞（HUVEC）以将其从脐带（ST.MARY'S Hospital,Seoul,Korea）分离。所述分离的HUVEC使用Medium199（含有20%（v/v）热灭活的胎牛血清和1%（w/v）的青霉素/链霉素）在以0.2%（w/v）明胶包被的培养皿中培养。
对于该实验，将每个细胞培养至亚汇合（subconfluence）状态，并使用3-5代（3to5passages）的细胞。表达FPRL1的大鼠嗜碱性细胞白血病（RBL）-2H3（FPRL1/RBL）细胞、表达FPR的RBL-2H3（FPR/RBL）细胞和RBL-2H3（载体/RBL）细胞（其中FPRL1或FPR受体不会过表达的细胞）（ATCC,Manassas,VA,USA）维持在含有高浓度葡萄糖的DMEM培养基（Sigma,St.Louis,MO,USA）中，其中加入1%的青霉素/链霉素、20%（v/v）热灭活的胎牛血清和G418（Geneticin）（500ug/ml）。所述细胞培养于37℃，5%CO2中。
3.条件培养基
条件培养基是用在不包括FBS的Medium199中培养的（3-5代）HUVEC获得的。所述条件培养基被离心以除去残留细胞，并储存在-80℃下待用。
4.蛋白质印迹分析
载体/RBL细胞、FPR/RBL细胞、FPRL1/RBL细胞和HUVEC被培养至汇合，并进入血清饥饿状态。所述被刺激的细胞（1×105细胞）用PBS洗涤两次，溶解于1ml上样缓冲液（50mM Tris-HCl,100mMNaCl,0.1%SDS,1%诺乃洗涤剂P-40（Nonidet P-40）,50mM NaF,1mM Na3VO4,1μg/ml抑酶肽（aprotinin）,1μg/ml胃酶抑素（pepstatin）,和1μg/ml亮肽酶素（leupeptin）），在95℃下加热30秒，用SDS-PAGE分离，然后转移到硝酸纤维素膜上。使用抗磷酸化-ERK（细胞外信号调节激酶）1/2（Thr202/Tyr204）的抗体（Cell Signaling Technology，Beverly，MA,USA）、抗ERK1/2的抗体（Cell Signaling Technology，Beverly，MA,USA）、抗CTGF的抗体（Abcam,Cambridge,MA,USA）、抗肌动蛋白的抗体（Sigma,St.Louis,MO,USA）或抗Flag的抗体（Sigma,St.Louis,MO,USA）进行免疫印迹，然后，用化学发光底物（AmershamPharmacia）使所述膜显影。
5.FPRL1（甲酰肽样受体1）活化蛋白的鉴定
从所述HUVEC中获得的条件培养基（CM）上样到HLB小柱（waters）中，使用反相（RP）C18柱分离。所述RP C18HPLC柱（218TP5215;2.1mm×150mm，Vydac）使用水/0.1%(w/v)TFA平衡。通过ACN/0.1%(w/v)TFA从0%(w/v)到100%(w/v)的浓度梯度，获得150ul级分。用胰蛋白酶处理所获得的活化的级分，并在37℃下培养过夜。
为获得所述活化的级分的MS和MS/MS数据，使用了由UltimateHPLC系统（LC Packings）和QSTAR PULSAR I hybrid Q-TOF MS/MS系统（Applied Biosytems/PE SCIEX）组成的并装备有nano-ESI源的nano-LC MS。所述QSTAR以8000-10000的分辨率在恒定质量下运行24小时。喷嘴电压为2300V，使用由Applied Biosystems Inc.(AB)提供的Analyst QS软件测量通过QSTAR检测的所有质量值。对于MS/MS分析，使用MASCOT搜索引擎（内部版本1.7（version,in-house））通过非冗余数据库分析共同的质量值谱以获得序列信息。所获得的MASCOT结果具有比通过随机匹配指出的更高的MOWSE值（p<0.05）。
6.质粒制造、转染和蛋白纯化
插入到含有Flag标签序列（在腱蛋白（chordin）信号肽后直到Ala41）的pCS2+表达载体中的非洲蟾蜍CTGF的全长和缺失变体由E.M.De Robertis（University of California，Los Angeles,CA）提供（在pCS2+中：EcoRI-腱蛋白信号肽-腱蛋白的20个N末端氨基酸-FLAG表位(DYKDDDDK)-Xho I-INSERT-Xba I）（Abreu,J.G.,Ketpura,N.I.,Reversade,B.& De Robertis,E.M.Connective-tissue growth factor(CTGF)modulates cell signalling by BMP and TGF-[beta].Nat Cell Biol4,599-604,2002）。所述缺失变体命名为CTGF/I-II-L、CTGF/II-L、CTGF/II、CTGF/L、CTGF/L-III-IV和CTGF/I-L-III-IV，其具体的缺失显示在图8（所缺失的部分用点线表示）。
根据制造商的说明书，通过使用lipofectamine（Invitrogen,Carlsbad,CA）瞬时转染HEK293T细胞（ATCC,Manassas,VA,USA）来获得带有所述flag标签的分泌蛋白。从HEK293T细胞中，使用抗Flag M2亲和凝胶柱将全长和缺失变体Flag-CTGF亲和纯化出来，并根据制造商的说明书洗脱Flag肽。所述蛋白的纯度使用Silver StainPlus试剂盒（Bio-Rad）通过银染测定。
7.生物素化和流式细胞计量术
为评估对应人CTGF连接区域的接头多肽的结合程度，根据制造商的说明书，使用EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation试剂盒（Pierce Chemical Co.，Rockford,IL,USA）标记接头多肽。所述接头多肽在含有9mM硫代-NHS-LC-生物素（Pierce Chemical Co.,Rockford,IL，USA）的PBS中在室温下培养1小时。在生物素化期间，将载体/RBL细胞、FPR/RBL细胞、FPRL1/RBL细胞或HUVEC用胰蛋白酶处理，收集，然后用兔血清在室温下处理30分钟。在所述生物素化的接头多肽在冰中培养30分钟后，将所述细胞以用冰预冷的PBS短暂洗涤，用抗人萦光素-5-异硫氰酸盐（FITC）轭合的链霉亲和素（Pierce Chemical Co.）培养，然后以用冰预冷的PBS洗涤，用1%甲醛溶液固定。然后，根据之前已知方法（He,R.,Sang,H.& Ye,R.D.Serum amyloid A induces IL-8secretion through a G protein-coupledreceptor，FPRL1/LXA4R.Blood101,1572-1581,2003）使用具有CellQuest和WinMDI2.9软件的FACS Caliber系统（BD Biosciences,San Jose,CA）分析所述细胞。
8.Ca
2+
的测量
FPRL1/RBL、载体/RBL或FPR/RBL细胞在含有0.03%(w/v)plutonic F-127（分子探针）的fluo-3-AM工作溶液中在37℃下培养1小时，以使fluo-3-AM的最终浓度变为20uM/L。在所述培养后，所述细胞中使用高功率Ar+激光时在488nm处出现fluo-3-AM荧光，用光电倍增管在530nm处测量了发射带。使用装备有尼康E-600Eclipse显微镜的共聚焦激光扫描系统（LSM510Meta;Carl Zeiss,Jena,Germany）检测了荧光信号。测量了在加入CTGF（F0）前和加入CTGF（F）后的荧光强度。细胞内Ca2+浓度[Ca2+]i的改变由F/F0比例指示。从每个细胞扫描50-120幅图像。
9.体外血管发生测定
对于增殖测定，将HUVEC以2×104个细胞/孔铺板培养在明胶包被的24孔培养皿中，并允许其贴附过夜。在血清耗尽后4小时，将所述细胞用多种促细胞分裂剂（CTGF接头多肽，CTGF）处理48小时。在获得最终培养物之前6小时，将[3H]-胸腺嘧啶核苷（1μCi，AmershamInternational）加入到每个孔。将所插入的[3H]-胸腺嘧啶核苷在0.2MNaOH和0.1%SDS溶液中在37℃下提取1小时。使用液体闪烁计数器（Beckmann Instruments）测量放射性，重复三次，所述结果由每分钟的均值±标准差表示。
按如下确认HUVEC的创伤迁移和管形成的活性。
具体地，用移液管末端对接种在60-mm培养皿上至汇合的HUVEC造成创伤，并用溶于其中加有1%血清和1mM胸腺嘧啶核苷的Medium199中的接头多肽（10-1~102nM）或重组CTGF（重组CTGF，rhCTGF；BioVendor R&D,NC,USA）（101或102nM）处理所述创伤细胞。在培养16小时后，计数迁移越过参考线的细胞数目以定量迁移程度，将所述细胞以50X放大倍数拍照。
同时，为分析管形成，将HUVEC与特定量的接头多肽、rhCTGF或VEGF-A165一起接种在之前聚合的基质胶（Matrigel,BD Biosciences）层上。培养18小时后，通过相差显微镜观察所述细胞的形状，以40x放大倍数拍照。通过使用image-Pro Plus v4.5（Media Cybernetics,SilverSpring,MD）测量从每个孔中随机选择的LPF（低功率区域）中的管长度5次，定量管形成的程度。
10.CAM（绒毛膜尿囊膜）的分析
体内CAM分析根据之前已知的方法进行（Lee,M.-S.et al.Angiogenic Activity of Pyruvic Acid in in Vivo and in Vitro AngiogenesisModels.Cancer Res61,3290-3293,2001）。
将受精卵在37℃下培养在设定为固定湿度的卵孵育器中。培养3天后，为从壳体脱下表达的CAM，用18号皮内针取出约2ml卵白蛋白。再培养6天后，将含有所述样品的thermanox盖玻片（Nunc）在空气中干燥，并涂敷在所述CAM表面以测试由接头多肽或rhCTGF引起的血管发生的活性。3天后，将1-2ml10%(w/v)Intralipose注射到绒毛膜尿囊中，并用显微镜观察。
11.针对FPRL1转录的siRNA的制备和转染
为使用siRNA抑制人FPRL1的转录，使用了FPRL1的siRNA（正义链:UUCACAUCGUGGUGGACAUdTdT（SEQ ID NO.3），反义链:AUGUCCACCACGAUGUGAAdTdT（SEQ ID NO.4））。作为所述siRNA序列的BLAST搜索结果，确认了与数据库中其他序列没有显著相似性。所述寡核苷酸显示了相似结果。HUVEC被用于siRNA转染。将所述细胞用终浓度为20nM的FPRL1 siRNA（SEQ ID NO.3和SEQID NO.4）转染，或用萤光素酶siRNA（SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12）转染作为对照。此时，根据制造商的说明书使用了lipofectamine试剂（Invitrogen Life Technologies）。将所述细胞用无血清培养基洗涤，然后用其中加有含20%（v/v）FBS的培养基的转染混合物培养4.5小时。在培养后24小时和48小时，收集所述细胞，通过RT-PCR分析确认FPRL1表达程度。
12.RT-PCR分析
使用市购的TRI试剂（Molecular Research Center）根据制造商的说明书从所述被转染的HUVEC分离所有RNA。使用3ug的每种无DNA的总RNA样品和oligo(dT)15以及Moloney鼠白血病病毒反转录酶（Promega,WI，USA）根据造商的说明书合成了第一链cDNA。然后，用含有1×PCR缓冲液、200uM dNTPs、10uM的每种特异性引物（sFPRL1:5'-GACCTTGGATTCTTGCTCTAGTC-3'（SEQ ID NO.13），asFPRL1:5'-GGATCAGTCTCTCTCGGAAGTC-3'（SEQ IDNO.14），sCTGF:5'-TTCCAGAGCAGCTGCAAGTACCA-3'（SEQID NO.15），asCTGF:5'-TTGTCATTGGTAACCCGGGTGGA-3'（SEQ ID NO.16））和1.25单位Taq DNA聚合酶（Perkin-Elmer）的50ul的反应溶液，扩增了相同量的cDNA。所述扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，用EtBr（溴化乙锭）染色并通过红外穿透（infraredpenetration）显影。
<实验结果>
1.用VEGF-A处理的HUVEC的条件培养基的ERK磷酸化诱导
活性
血管内皮生长因子A（VEGF-A）——一种炎性细胞因子——与G蛋白偶联受体FPRL1（甲酰肽样受体1）共享许多细胞功能，以控制血管发生。但是，VEGF-A和FPRL1怎样相互作用是未知的。
为确认这点，发明人在用VEGF-A处理的HUVEC中获得了条件培养基（CM），并用其以10ng/ml或50ng/ml的浓度处理FPRL1过表达的FPRL1/RBL细胞8小时。同时，作为阳性对照，用10nM FPRL1激动肽（agonistic peptide）WKYMVm(Trp-Lys-Tyr-Met-Val-D-Met,SEQ ID NO.1)处理所述细胞。
在所述处理后，用抗磷酸化erk（细胞外信号调节激酶）1/2的抗体和抗erk1/2的抗体（cell signaling technology，beverly，ma,usa）对转移到硝酸纤维素膜的细胞裂解物进行免疫印迹，然后，用化学发光底物（Amersham Pharmacia）使所述膜显影，结果在图1示出。
如图1所示，可以看到在用VEGF-A处理的HUVEC中获得的条件培养基以浓度依赖的方式增加了ERK磷酸化。
同时，将上述的载体/RBL、FPR/RBL或FPRL1/RBL细胞分别用上述条件培养基或VEGF-A以10ng/ml浓度处理8小时，并将阳性对照用10nM激动肽WKYMVm（SEQ ID NO.1）处理。然后，按如上所述进行免疫印迹，结果在图2示出。
如图2所示，可以看到仅在FPRL1过表达的FPRL1/RBL细胞中，条件培养基、VEGF-A和阳性对照都增加了ERK磷酸化。因此，可以看到由所述条件培养基诱导的ERK磷酸化是对FPRL1特异性的。
2.条件培养基中具有ERK磷酸化诱导活性的蛋白的鉴定
如<实验方法5>所述，将FPRL1/RBL细胞用40ug的所述条件培养基的HPLC级分处理5分钟，图3示出了确认ERK磷酸化是否按<实验结果1>中描述的发生的结果。
如图3所示，可以看到在FPRL1/RBL细胞中含有B12-C4的级分可诱导ERK磷酸化，作为检查B11-C4中每个级分的活性峰的结果，可以看到仅在B12、C3级分中观察到峰。
由所述结果，设想在FPRL1/RBL细胞中具有诱导ERK磷酸化活性的蛋白包含在B12中，对所述B12级分进行如<实验方法5>所述的MS/MS分析，结果在图4示出。
如图4所示，检测到与人结缔组织生长因子（CTGF）氨基酸序列对应的5个多肽序列（图4中下划线部分）。
因此，可以看到FPRL1/RBL细胞中具有诱导ERK磷酸化活性的蛋白是CTGF。
3.由VEGF-A引起的CTGF表达诱导
从所述<实验2>中，认为在由VEGF-A处理的HUVEC中分泌的所述条件培养基中，CTGF可以结合FPRL1以在FPRL1/RBL细胞中诱导ERK磷酸化。
为确认这点，按实验方法部分所述进行RT-PCR和蛋白质印迹分析。具体地，根据VEGF-A的处理时间和处理量分析了，用VEGF-A处理的HUVEC的细胞裂解物或条件培养基中的CTGF表达程度，其结果分别在图5和图6示出。
如图5所示，依照RT-PCR分析的结果，可以看到CTGF mRNA从用VEGF-A处理HUVEC半小时后起增加，依照蛋白质印迹分析的结果，可以看到在所述细胞裂解物中CTGF值从2小时后起增加，在所述条件培养基中CTGF值从4小时后起增加。
如图6所示，依照RT-PCR和蛋白质印迹分析结果，可以看到CTGF值以与所述VEGF-A的处理量成比例地增加。
同时，本发明人另外确认了VEGF-A受体是否涉及CTGF合成。具体地，将HUVEC用VEGF-A的中和抗体（R&D Systems,Minneapolis,MN,USA）、VEGF受体-1（VEGFR-1）（R&D Systems,Minneapolis,MN,USA）、VEGF受体-2（VEGFR-2）（R&D Systems,Minneapolis,MN,USA）和作为对照的IgG抗体以5ug/ml的浓度处理30分钟，然后将其用VEGF-A以20ng/ml的浓度处理。在2小时后，获得细胞裂解物，用抗人CTGF进行免疫印迹，结果在图7示出。
如图7所示，可以看到如果给予VEGF-A受体的抗体，CTGF表达显著减少。因此，可以看到VEGF-A的CTGF表达诱导是受受体偶联控制的。
4.CTGF的FPRL1结合位点的测定
为测定CTGF的FPRL1结合位点，根据<实验方法6>中描述的方法制备了如图8所示的其中插入编码全长CTGF蛋白或部分缺失的蛋白CTGF/I-II-L、CTGF/II-L、CTGF/II、CTGF/L、CTGF/L-III-IV和CTGF/I-L-III-IV的基因的质粒，并将其转染到HEK293T细胞（ATCC,Manassas,VA，USA），纯化了每种蛋白。
为确认所纯化的蛋白是否能在FPRL1/RBL细胞中诱导ERK磷酸化，按<实验结果1>所述进行免疫印迹，结果在图9示出。
如图9所示，可以看到除CTGF/II外的所有蛋白均可诱导ERK磷酸化。通过从所述结果中绘出除CTGF/II外的缺失蛋白的共同区域，可以看到全长CTGF蛋白的第164位到第201位（由粗体指示，SEQ IDNO.5）（MTAASMGPVRVAFVVLLALCSRPAVGQNCSGPCRCPDEPAPRCPAGVSLVLDGCGCCRVCAKQLGELCTERDPCDPHKGLFCDFGSPANRKIGVCTAKDGAPCIFGGTVYRSGESFQSSCKYQCTCLDGAVGCMPLCSMDVRLPSPDCPFPRRVKLPGKCCEEWVCDEPKDQTVVGPALAAYRLEDTFGPDPTMIRANCLVQTTEWSACSKTCGMGISTRVTNDNASCRLEKQSRLCMVRPCEADLEENIKKGKKCIRTPKISKPIKFELSGCTSMKTYRAKFCGVCTDGRCCTPHRTTTLPVEFKCPDGEVMKKNMMFIKTCACHYNCPGDNDIFESLYYRKMYGDMA）为FPRL1的CTGF结合位点。
5.CTGF接头多肽的FPRL1结合的确认
将10nM包含在<实验结果4>中确认的CTGF结合区域的接头多肽（SEQ ID NO.6,EWVCDEPKDQTVVGPALAAYRLEDTFGPDPTMIRANCLV，在SEQID NO.5的N末端多含有一个氨基酸(E)）被按照<实验方法7>所述生物素化，并将其与FPRL1/RBL、载体/RBL或FPR/RBL细胞培养，然后进行流式细胞计量术，结果在图10示出。
如图10所示，可以看到CTGF接头多肽仅结合FPRL1/RBL细胞。如图1所示，可以看到如果将FPRL1/RBL、载体/RBL或FPR/RBL细胞用10uM的FPRL1拮抗剂WRW4（SEQ ID NO.2）处理并培养30分钟，那么在FPR/RBL细胞中所述接头多肽结合被抑制。
因此，从所述结果可以看出CTGF接头多肽特异性地结合FPRL1，从而所述接头多肽可以通过FPRL1增加ERK磷酸化或Ca2+浓度。
6.CTGF接头多肽的ERK磷酸化促进作用
将CTGF接头多肽的ERK磷酸化诱导与重组人CTGF（rhCTGF）进行比较。具体地，将FPRL1/RBL细胞用CTGF接头多肽和rhCTGF以多种浓度处理5分钟，测量ERK磷酸化，结果在图11示出。
如图11所示，可以看到CTGF接头多肽与rhCTGF诱导ERK磷酸化至相似的水平。
并且，当将10nM的所述CTGF接头多肽或rhCTGF加入到FPRL1/RBL细胞时，加入或不加入10uM的WRW4，比较ERK磷酸化程度，结果在图11示出。
如图11所示，可以看到CTGF接头多肽（由LK表示）与rhCTGF（由CTGF表示）诱导ERK磷酸化至相似的水平，特别地，在加入FPRL1拮抗剂WRW4的情况下，ERK磷酸化被抑制。
7.由CTGF接头多肽引起的Ca
2+
浓度增加
因为FPRL1的活化增加细胞内Ca2+浓度，本发明人通过<实验方法8>确认了CTGF接头多肽是否活化FPRL1以最终增加细胞内Ca2+浓度，结果在图12示出。
如图12所示，作为用共聚焦显微镜检查的结果，Ca2+浓度仅在用CTGF接头多肽处理的FPRL1/RBL细胞中增加。此外，作为测量FPRL1/RBL细胞中Ca2+浓度的结果，可以看到Ca2+浓度增加依赖于所述CTGF接头多肽的浓度，并且所述CTGF接头多肽的活性比rhCTGF更有效，与阳性对照FPRL1激动剂WKYMVm（由Wm表示）相似。并且，可以看到如果给予10uM FPRL1拮抗剂WRW4，则由CTGF接头多肽引起的细胞内Ca2+浓度增加的程度减小。
从所述结果可以看到，CTGF通过所述接头区域直接结合到FPRL1，从而活化FPRL1。
8.HUVEC中CTGF接头多肽结合FPRL1并活化的确认
因为FPRL1在HUVEC中大量表达，因此确认了在用VEGF-A处理的HUVEC中是否分泌CTGF，从而检查了血管发生。
按<实验方法7>所述检查了在HUVEC中CTGF接头多肽是否结合到FPRL1，结果在图13示出。具体的，将HUVEC用10nM的所述CTGF接头多肽处理，并培养30分钟，然后按<实验方法7>所述进行流式细胞计量术。此时，将所述细胞用10uM的WRW4一起处理。
如图13所示，可以看到与不用所述CTGF接头多肽处理的HUVEC（仅用赋形剂（vehicle）处理）的情况相比，在将HUVEC用所述CTGF接头多肽处理的情况中，平均值向右移动。但是，在将其用FPRL1拮抗剂WRW4处理的情况中，没有观察到所述移动。
同时，将HUVEC用所述CTGF接头多肽或rhCTGF以多种浓度处理5分钟，获得细胞裂解物，然后用抗-磷酸化ERK1/2的抗体进行免疫印迹，结果在图14示出。
如图14所示，可以看到在将HUVEC用CTGF接头多肽处理的情况中，ERK磷酸化被有效地诱导，而如果用FPRL1拮抗剂WRW4（10uM）处理，则ERK磷酸化被抑制。
将HUVEC用所述CTGF接头多肽或rhCTGF以多种浓度处理1小时，确认了利用上述方法时细胞内Ca2+浓度是否增加，结果在图15示出。
如图15所示，可以看到虽然CTGF接头多肽以浓度依赖的方式增加细胞内Ca2+浓度，但是当用FPRL1拮抗剂WRW4（10uM）处理所述细胞时情况不是这样。
从所述结果可以看到在HUVEC中，CTGF通过所述接头区域特异性结合到FPRL1以活化HUVEC。
9.CTGF接头多肽的血管发生诱导效应
如果进行了血管发生，则内皮细胞会生长，现有的血管可根据生芽迁移，形成管（Carmeliet,P.& Jain,R.K.Angiogenesis in cancer andother diseases.Nature407,249-257,2000），因此，通过<实验方法9>确认了CTGF接头多肽是否诱导所述血管发生，结果在图16-18示出。
如图16所示，虽然CTGF接头多肽以浓度依赖的方式诱导HUVEC的增殖，但是程度在统计学上不显著。
如图17所示，可以看到所述CTGF接头多肽以浓度依赖的方式、比重组CTGF更有效地诱导HUVEC的迁移，此外，可以看到在将所述细胞用FPRL1拮抗剂WRW4（10uM）处理的情况中，没有诱导细胞迁移。
如图18所示，可以看到所述CTGF接头多肽比重组CTGF更有效地诱导HUVEC的管形成，此外，可以看到在将所述细胞用FPRL1拮抗剂WRW4（10uM）处理的情况中，没有诱导管形成。
从所述结果中，可以看到因为CTGF接头多肽比全长CTGF更有效地诱导细胞迁移和管形成而不是细胞增殖，所以其可以促进血管发生。
因此，基于所述结果，本发明人通过<实验方法10>确认了体内的血管发生活性，结果在图19示出。
如图19所示，可以看到CTGF接头多肽在体内也以浓度依赖的方式非常强烈地诱导血管发生，因此，形成了所谓的轮状血管（wheel-shaped blood vessel）。但是，可以看到在将所述细胞用FPRL1拮抗剂WRW4（10uM）处理的情况中，没有诱导血管形成。
因此，可以看到CTGF通过所述接头区域结合到FPRL1，从而在体外和体内均诱导血管发生。
10.VEGF-A的FPRL1表达促进效应
基于所述结果，认为CTGF/FPRL1组合可以在血管发生过程中介导VEGF-A的活性。
因此，确认了在HUVEC中VEGF-A是否诱导FPRL1表达。具体地，将HUVEC用20ng/ml的VEGF-A处理，并培养不同的时间，然后根据<实验方法12>进行RT-PCR，测量了FPRL1表达程度，结果在图20示出。根据<实验方法7>进行流式细胞计量术分析，结果在图20示出。
将HUVEC用不同浓度的VEGF-A处理，并培养，然后根据<实验方法12>进行RT-PCR，测量了FPRL1表达程度，结果在图21示出。根据<实验方法7>进行流式细胞计量术分析，结果在图21示出。
如图20和图21所示，可以看到VEGF-A以浓度依赖的方式诱导FPRL1的表达。
11.VEGF-A通过CTGF/FPRL1组合进行的血管发生诱导效应
另外确认了FPRL1拮抗剂WRW4是否抑制由VEGF-A诱导的血管发生。从而可以看到在由VEGF-A诱导的血管发生中涉及FPRL1活化。
首先，将20ng/ml的VEGF-A给予HUVEC，通过<实验方法9>确认了细胞增殖、细胞迁移或管形成的程度，结果在图22-24示出。此时，额外地加入FPRL1拮抗剂WRW4。
如图22所示，可以看到VEGF-A诱导HUVEC的增殖，但是FPRL1拮抗剂WRW4没有展示出统计学上显著的对由VEGF-A诱导的HUVEC增殖的抑制。
如图23所示，可以看到VEGF-A诱导HUVEC的迁移，在将所述细胞用FPRL1拮抗剂WRW4（10uM）处理的情况中，没有诱导细胞迁移。
如图24所示，可以看到VEGF-A诱导HUVEC的管形成，在将所述细胞用FPRL1拮抗剂WRW4（10uM）处理的情况中，没有诱导管形成。
同时，如<实验方法11>所述，使用FPRL1 siRNA抑制FPRL1表达，然后根据<实验方法12>进行RT-PCR以测量所述FPRL1表达程度，结果在图25示出。
如图25所示，可以看到将HUVEC用FPRL1 siRNA处理时，FPRL1表达被抑制，在用萤光素酶siRNA作为对照进行处理的情况中，FPRL1表达没有被抑制。
因此，确认了在将HUVEC用FPRL1 siRNA处理的情况中，由VEGF-A诱导的细胞迁移或管形成被抑制，结果在图26和27示出。
如图26和27所示，与将HUVEC用萤光素酶siRNA作为对照进行处理的情况相比，在将HUVEC用FPRL1 siRNA处理的情况中，由VEGF-A诱导的细胞迁移或管形成被抑制。
通过<实验方法10>确认了，在体内在将HUVEC用FPRL1拮抗剂（10ug/CAM）处理的情况中，VEGF-A（25ng/CAM）的血管发生活性被抑制，结果在图28示出。
如图28所示，可以看到FPRL1拮抗剂强烈地抑制由VEGF-A诱导的血管发生。
从所述结果中可以看到，FPRL1对于由VEGF-A诱导的血管发生是重要的因子，CTGF对于FPRL1的诱导活化是重要的因子。也就是说可以看到，FPRL1和由VEGF-A诱导的CTGF通过相互之间的结合促进内皮细胞迁移和管形成，藉此参与由VEGF-A诱导的血管发生。
Claims (38)
1.一种用于促进血管发生的含有结缔组织生长因子蛋白片段或编码该片段的基因作为活性成分的组合物，所述结缔组织生长因子蛋白片段由SEQ ID NO.9氨基酸序列中包含SEQ ID NO.5氨基酸序列的连续38个或更多个氨基酸组成。
2.根据权利要求1所述用于促进血管发生的组合物，其中所述结缔组织生长因子蛋白片段由SEQ ID NO.9氨基酸序列中包含SEQ IDNO.5氨基酸序列的连续38-39个氨基酸组成。
3.根据权利要求2所述用于促进血管发生的组合物，其中所述结缔组织生长因子蛋白片段由SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6的氨基酸序列表示。
4.根据权利要求1所述用于促进血管发生的组合物，其中所述基因具有由SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8表示的碱基序列。
5.根据权利要求1所述用于促进血管发生的组合物，其中所述基因被插入到载体中。
6.一种FPRL1（甲酰肽样受体1）的短干扰RNA（siRNA），其包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
7.一种用于促进血管发生的组合物，其包括权利要求6所述的siRNA作为其活性成分。
8.一种用于预防或治疗心绞痛、动脉粥样硬化、中风、血管性痴呆、慢性溃疡或创伤的组合物，其包括根据权利要求1-5和7任一项所述的用于促进血管发生的组合物。
9.一种用于抑制血管发生的组合物，其含有
选自可结合结缔组织生长因子蛋白片段的多肽、抗体和化合物中的至少一种，所述结缔组织生长因子蛋白片段由SEQ ID NO.9氨基酸序列中包含SEQ ID NO.5氨基酸序列的连续38个或更多个氨基酸组成；或
选自与编码所述结缔组织生长因子蛋白的基因的mRNA互补性结合的反义核苷酸、短干扰RNA（siRNA）和短发夹RNA的至少一种。
10.根据权利要求9所述用于抑制血管发生的组合物，其中所述结缔组织生长因子蛋白片段由SEQ ID NO.9氨基酸序列中包含SEQ IDNO.5氨基酸序列的连续38-39个氨基酸组成。
11.根据权利要求10所述用于抑制血管发生的组合物，其中所述结缔组织生长因子蛋白片段由SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6的氨基酸序列表示。
12.根据权利要求9所述用于抑制血管发生的组合物，其中所述编码所述结缔组织生长因子蛋白片段的基因具有SEQ ID NO.7或SEQID NO.8的碱基序列，并且所述反义核苷酸、短干扰RNA（siRNA）和短发夹RNA与由SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8的mRNA的连续15-30个碱基组成的碱基序列互补性结合。
13.一种用于预防或治疗癌生长和转移、类风湿性关节炎、银屑病、糖尿病视网膜病、糖尿病肾病、高血压、子宫内膜异位、肥胖病、早产儿视网膜病、角膜炎症排斥、新生血管性青光眼、增殖性视网膜病、血友病性关节病、瘢痕疙瘩、伤口肉芽形成、血管粘附、骨关节炎、克罗恩病、再狭窄、动脉粥样硬化、肠粘连、溃疡、肝硬化、肾炎、恶性肾硬化、器官移植排斥、肾小球病、糖尿病或炎症的组合物，其含有根据权利要求9-12任一项所述用于抑制血管发生的组合物作为活性成分。
14.一种用于筛选血管发生抑制剂的方法，其包括
（a）用候选化合物处理包含编码结缔组织生长因子蛋白片段的基因的细胞，所述结缔组织生长因子蛋白片段由SEQ ID NO.9氨基酸序列中包含SEQ ID NO.5氨基酸序列的连续38个或更多个氨基酸组成；
（b）测量所述基因的表达程度，
其中如果与没有用所述候选化合物处理的细胞相比，在用所述候选化合物处理的所述细胞中，所述基因的表达程度下降，那么所述候选化合物被确定为血管发生抑制剂。
15.根据权利要求14所述的筛选方法，其中在所述步骤（b）中，所述基因的表达程度是通过选自免疫荧光方法、酶联免疫吸附测定（ELISA）、蛋白质印迹和RT-PCR的方法测量的。
16.根据权利要求14所述的筛选方法，其中所述血管发生抑制剂是用于预防或治疗癌生长和转移、类风湿性关节炎、银屑病、糖尿病视网膜病、糖尿病肾病、高血压、子宫内膜异位、肥胖病、早产儿视网膜病、角膜移植排斥、青光眼、增殖性视网膜病、血友病性关节病、瘢痕疙瘩、伤口肉芽形成、血管粘附、骨关节炎、克罗恩病、再狭窄、动脉粥样硬化、肠粘连、溃疡、肝硬化、肾炎、恶性肾硬化、器官移植排斥、肾小球病、糖尿病或炎症。
17.结缔组织生长因子蛋白片段或编码该片段的基因用于促进血管发生的用途，所述结缔组织生长因子蛋白片段由SEQ ID NO.9氨基酸序列中包含SEQ ID NO.5氨基酸序列的连续38个或更多个氨基酸组成。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述结缔组织生长因子蛋白片段由SEQ ID NO.9氨基酸序列中包含SEQ ID NO.5氨基酸序列的连续38-39个氨基酸组成。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述结缔组织生长因子蛋白片段由SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6的氨基酸序列表示。
20.根据权利要求17的用途，其中所述基因具有由SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8表示的碱基序列。
21.根据权利要求17的用途，其中所述基因被插入到载体中。
22.根据权利要求17-21任一项的用途，其中所述血管发生促进剂用于预防或治疗心绞痛、动脉粥样硬化、中风、血管性痴呆、慢性溃疡或创伤。
23.选自可结合结缔组织生长因子蛋白片段的多肽、抗体和化合物中的至少一种，所述结缔组织生长因子蛋白片段由SEQ ID NO.9氨基酸序列中包含SEQ ID NO.5氨基酸序列的连续38个或更多个氨基酸组成；或
选自与编码所述结缔组织生长因子蛋白的基因的mRNA互补性结合的反义核苷酸、短干扰RNA（siRNA）和短发夹RNA的至少一种
用于制备血管发生抑制剂的用途。
24.根据权利要求23所述的用途，其中所述结缔组织生长因子蛋白片段由SEQ ID NO.9氨基酸序列中包含SEQ ID NO.5氨基酸序列的连续38-39个氨基酸组成。
25.根据权利要求23所述的用途，其中所述结缔组织生长因子蛋白片段由SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6的氨基酸序列表示。
26.根据权利要求24的用途，其中编码所述结缔组织生长因子蛋白片段的所述基因具有SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8的碱基序列，并且所述反义核苷酸、短干扰RNA（siRNA）和短发夹RNA与由SEQ IDNO.7或SEQ ID NO.8的mRNA的连续15-30个碱基组成的碱基序列互补性结合。
27.根据权利要求23-26任一项的用途，其中所述血管发生抑制剂用于预防或治疗癌生长和转移、类风湿性关节炎、银屑病、糖尿病视网膜病、糖尿病肾病、高血压、子宫内膜异位、肥胖病、早产儿视网膜病、角膜炎症排斥、新生血管性青光眼、增殖性视网膜病、血友病性关节病、瘢痕疙瘩、伤口肉芽形成、血管粘附、骨关节炎、克罗恩病、再狭窄、动脉粥样硬化、肠粘连、溃疡、肝硬化、肾炎、恶性肾硬化、器官移植排斥、肾小球病、糖尿病或炎症。
28.一种用于促进血管发生的方法，其包括将结缔组织生长因子蛋白片段或编码该片段的基因给予需要促进血管发生的患者，所述结缔组织生长因子蛋白片段由SEQ ID NO.9氨基酸序列中包含SEQ ID NO.5氨基酸序列的连续38个或更多个氨基酸组成。
29.根据权利要求28的方法，其中所述结缔组织生长因子蛋白片段由SEQ ID NO.9氨基酸序列中包含SEQ ID NO.5氨基酸序列的连续38-39个氨基酸组成。
30.根据权利要求29的用途，其中所述结缔组织生长因子蛋白片段由SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6的氨基酸序列表示。
31.根据权利要求28的方法，其中所述基因具有由SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8表示的碱基序列。
32.根据权利要求28的方法，其中所述基因被插入到载体中。
33.根据权利要求28的方法，其中所述需要促进血管发生的患者需要预防或治疗心绞痛、动脉粥样硬化、中风、血管性痴呆、慢性溃疡或创伤。
34.一种用于抑制血管发生的方法，其包括将以下给予需要抑制血管发生的患者：
选自可结合结缔组织生长因子蛋白片段的多肽、抗体和化合物中的至少一种，所述结缔组织生长因子蛋白片段由SEQ ID NO.9氨基酸序列中包含SEQ ID NO.5氨基酸序列的连续38个或更多个氨基酸组成；或
选自与编码所述结缔组织生长因子蛋白的基因的mRNA互补性结合的反义核苷酸、短干扰RNA（siRNA）和短发夹RNA的至少一种。
35.根据权利要求34的方法，其中所述结缔组织生长因子蛋白片段由SEQ ID NO.9氨基酸序列中包含SEQ ID NO.5氨基酸序列的连续38-39个氨基酸组成。
36.根据权利要求35的方法，其中所述结缔组织生长因子蛋白片段由SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6的氨基酸序列表示。
37.根据权利要求34的方法，其中所述编码所述结缔组织生长因子蛋白片段的基因具有SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8的碱基序列，并且所述反义核苷酸、短干扰RNA（siRNA）和短发夹RNA与由SEQ IDNO.7或SEQ ID NO.8的mRNA的连续15-30个碱基组成的碱基序列互补性结合。
38.根据权利要求34的方法，其中所述需要抑制血管发生的患者需要预防或治疗癌生长和转移、类风湿性关节炎、银屑病、糖尿病视网膜病、糖尿病肾病、高血压、子宫内膜异位、肥胖病、早产儿视网膜病、角膜炎症排斥、新生血管性青光眼、增殖性视网膜病、血友病性关节病、瘢痕疙瘩、伤口肉芽形成、血管粘附、骨关节炎、克罗恩病、再狭窄、动脉粥样硬化、肠粘连、溃疡、肝硬化、肾炎、恶性肾硬化、器官移植排斥、肾小球病、糖尿病或炎症。
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