CN110669143B - 一种短肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了属于生物医药领域的一种短肽及其应用。本发明中的短肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。SHH信号通路可以在缺血性脑中风中快速调控谷氨酸转运体GLT‑1活性，即通过降低细胞膜上谷氨酸转运体GLT‑1蛋白量使其活性降低。His‑2A‑TAT可以有效阻止SHH引起的谷氨酸转运体GLT‑1活性降低，从而在缺血性脑中风中起到神经保护作用。

Description

一种短肽及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种短肽及其应用。
背景技术
中风已经成为国人健康的头号杀手。但是目前为止，用于治疗缺血性脑中风的药物只有溶栓药物t-PA，但t-PA具有引发脑出血的隐患。缺血性脑中风早期损伤最强的因素是谷氨酸兴奋性毒作用，但是以谷氨酸受体为药物靶点的临床试验无一成功。除了谷氨酸受体外，谷氨酸转运体，尤其是表达于星形胶质细胞中的名为GLT-1的谷氨酸转运体在清除谷氨酸的过程中发挥最为重要的作用。已有研究显示，上调谷氨酸转运体GLT-1表达量可以降低缺血性脑损伤，但是缓慢调控谷氨酸转运体的表达量不足以在脑缺血早期产生神经保护作用。
虽然，谷氨酸转运体GLT-1活性调控在缺血性脑中风治疗中展示了一定的前景，但是目前没有在缺血性脑中风中发现可以快速调控谷氨酸转运体GLT-1活性的药物。现在已知内酰胺类抗生素可以在一周内上调谷氨酸转运体表达量，但这种慢性调控在治疗缺血性脑中风上很难实现临床转化，因为临床治疗缺血性脑中风的时间窗很短，通常只有几个小时。因此，寻找新的可以快速调控谷氨酸转运体GLT-1活性的药物是中风领域极为迫切的需要。
发明内容
为此，本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种短肽及其应用。
为此，本发明的首先提供了一种短肽(在本申请中称为His-2A-TAT)，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
本发明的还提供了：
上述短肽在抑制SHH信号通路中对GLT-1活性调控的应用。
上述短肽在制备预防或治疗SHH信号通路中谷氨酸转运体GLT-1活性降低所导致疾病的药物中的应用。
上述短肽在制备预防或治疗缺血过程中大脑海马区细胞膜上GLT-1表达量的降低所导致疾病的药物中的应用。
上述应用中，所述疾病为脑中风。
进一步的，所述脑中风为缺血性脑中风。
同时，本发明也提供了：
上述短肽在制备预防或治疗缺血性脑中风药物中的应用。
上述短肽在制备缺血、或缺氧过程中保护神经系统药物中的应用。
本发明还提供了：
一种治疗缺血性脑中风的药物，包括上述短肽。
本发明的短肽可以通过生物或化学合成的方法进行制备。
本发明具有以下优点及突出的技术效果：
本发明中，SHH信号通路可以在缺血性脑中风中快速调控谷氨酸转运体GLT-1活性，通过降低细胞膜上谷氨酸转运体GLT-1蛋白量使其活性降低。His-2A-TAT可以有效阻止SHH引起的谷氨酸转运体GLT-1活性降低，从而在缺血性脑中风中起到神经保护作用。
附图说明
图1为短肽His-SC-TAT和His-2A-TAT结构示意图。
图2为His-SC-TAT和His-2A-TAT进入星形胶质细胞的情况。
图3为His-SC-TAT和His-2A-TAT处理后GLT-1活性变化情况。
图4为His-SC-TAT和His-2A-TAT处理后SAG对于GLT-1在细胞膜上的表达量的影响。
图5为在小鼠单侧脑缺血模型中，SHH蛋白在缺血侧海马区的释放情况。
图6为体内实验His-SC-TAT和His-2A-TAT处理后GLT-1在细胞膜上的表达量变化情况。
图7为小鼠脑缺血体内实验流程图。
图8为脑缺血体内实验His-SC-TAT和His-2A-TAT处理后结果。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明中所使用的材料和装置，如无特殊说明，均为市售。
以下结合说明书附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。
实施例1 His-2A-TAT对于SHH信号通路引起的谷氨酸转运体GLT-1活性的作用
通过生物或化学方法制备短肽His-2A-TAT及His-SC-TAT，其氨基酸序列为：
His-2A-TAT:HHHHHHLAANGKSADCSVEEEPWKREKYGRKKRRQRRR；
His-SC-TAT:HHHHHHASSGAKWKEVPECDLRKANEEYGRKKRRQRRR。
结构如图1所示，His-SC-TAT作为His-2A-TAT的对照肽段以验证His-2A-TAT的功能。SC序列为2A序列的随机打乱排列。
首先用生理盐水将化学合成的His-2A-TAT及His-SC-TAT粉末溶解到1mM的浓度，在体外培养的大鼠星形胶质细胞中按比例加入His-2A-TAT或His-SC-TAT，总浓度为0.5μM和1μM，4小时后，用细胞裂解液裂解细胞，100摄氏度加热10分钟使蛋白变性，变性后的裂解液用western blot(蛋白免疫印迹)方法检测进入星形胶质细胞中的His-2A-TAT或His-SC-TAT。所用抗体为His抗体。如图2所示，0.5μM和1μM肽段孵育条件下，都可以检测到相应肽段的存在，作为对照，没有孵育肽段的星形胶质细胞中则没有信号，充分说明了His-SC-TAT或His-2A-TAT具有穿透细胞膜进入细胞内的能力。
利用全细胞膜片钳的方法，记录天冬氨酸(Aspartate,Asp)诱导的胶质细胞的谷氨酸转运体GLT-1的电流，内液配方：KNO3，140mM；EGTA，11mM；MgCl2，2.5mM；Na2ATP，2mM；HEPES，10mM；pH 7.3(KOH)。细胞外液(extracellular solution,ES)配方：NaCl，140mM；KCl，5mM；MgCl2，1mM；CaCl2，1mM；HEPES，10mM；D-Glucose，10mM；pH 7.4(NaOH)。根据其膜面积计算出细胞的电流密度，反映的是GLT-1在胶质细胞膜上的表达量，即膜上GLT-1蛋白活性。
实验分组为His-SC-TAT处理组和His-2A-TAT处理组(分别为：1μM，提前4小时孵育星形胶质细胞)，分别进行对照处理(DMSO,二甲基亚砜)和SHH信号通路的特异性激动剂(SAG)处理，通过GLT-1的电流密度，反映SHH信号通路对GLT-1的调节作用。从图3中可以看到，在His-SC-TAT处理组中，SAG可以在孵育30分钟时显著降低GLT-1的活性，而His-2A-TAT组中SAG的作用消失，从而保持了GLT-1的活性。
为了验证SHH信号通路是通过降低细胞膜上GLT-1蛋白表达量来降低GLT-1的活性，并且His-2A-TAT可以特异性抑制这一过程。进行以下实验，结果如图4所示：用1μM的His-SC-TAT或His-2A-TAT孵育星形胶质细胞4小时后加入3μM SAG或其溶剂对照DMSO(二甲亚砜)，0.5小时后，用生物素(不能穿透细胞膜，但是具有与蛋白质高度亲和的能力)孵育星形胶质细胞，0.5小时后裂解细胞，一部分裂解液直接加热变性用于检测细胞总体蛋白量，另一部分裂解液中加入亲和素(可以特异结合生物素)包被的磁珠，孵育1小时，再用磁铁将磁珠吸附，细胞膜蛋白也因此被收集，之后加热变性，用于检测细胞膜上蛋白量的变化。对照组中，SAG处理后细胞膜上GLT-1蛋白量显著降低，His-2A-TAT组中GLT-1细胞膜上蛋白量降低的现象则被抑制，在His-2A-TAT或His-SC-TAT组中，GLT-1总的蛋白量没有显著改变。说明SHH信号通路不影响总的GLT-1蛋白量，只改变了GLT-1细胞膜上蛋白量。
实施例2 His-2A-TAT抑制脑缺血过程中细胞膜上GLT-1蛋白量的降低
实施例1的结果在体外培养的细胞中证实了SHH信号通路可以快速调控GLT-1活性。在体缺血过程中是否有SHH信号通路的激活，为此通过手术在小鼠右侧颈动脉插入线拴至大脑中动脉，构建小鼠单侧脑缺血模型。在缺血后的不同时间点，取出小鼠缺血侧及位缺血侧的海马组织，将组织浸润于人工脑脊液30分钟，如果SHH蛋白被分泌到细胞外，在这样的条件下就会溶于人工脑脊液，之后，将这样的人工脑脊液用于ELISA(酶联免疫吸附测定)实验，结果如图5所示，SHH蛋白在缺血侧(ipsi，图中黑色线)海马区(Hip)的释放与未缺血侧(Contra，图中灰色线)相比有显著上升。提示SHH信号通路在缺血过程中有激活。
图5已经证实，在体脑缺血过程中SHH蛋白快速释放到细胞外，SHH信号通路的激活在在体过程中是否也会引起GLT-1蛋白在细胞膜上的表大量的降低，His-2A-TAT是否可以反转这种情况(如在体外培养的星形胶质细胞中的表现)。为此，设计了以下实验：
小鼠尾静脉按体重(10mg/kg)注射His-SC-TAT以及His-2A-TAT，1小时后进行如上所述单侧脑缺血造模，脑缺血1小时后，解剖取出小鼠大脑中海马区域，分离总体蛋白(total)，细胞质蛋白(cytosol)和细胞膜(membrane)蛋白结果如图6所示，发现His-SC-TAT组缺血侧(ipsi)海马区GLT-1在细胞膜上的表达量有显著降低，其在细胞质中则有显著堆积。而His-2A-TAT处理则可以完全反转GLT-1在缺血过程中的变化，这些结果充分说明，在体脑缺血过程中缺血侧(ipsi)细胞膜上的GLT-1蛋白表达量有显著降低，这些降低的GLT-1滞留于细胞质中，而用His-2A-TAT特异性抑制SHH对于GLT-1膜上表达量降低的作用可以反转缺血侧细胞膜上GLT-1蛋白表大量的降低，进而说明在体缺血过程中，SHH信号通路激活可以降低细胞膜上GLT-1蛋白表达量，His-2A-TAT可以反转这一现象说明His-2A-TAT可以特异性抑制在体情况下SHH通路激活对于GLT-1的调控作用。
实施例3小鼠脑缺血模型中His-2A-TAT药效评估
实验流程如图7所示，从斯贝福购买的C57小鼠，体重约为25g，随机分组，对照组(His-SC-TAT)10只，给药组(His-2A-TAT)9只，实验前1小时尾静脉按体重(10mg/kg)注射His-SC-TAT或者His-2A-TAT，进行如上所述单侧脑缺血造模，两个小时后拔出插入大脑中动脉的线拴，恢复大脑中动脉血流，实现复灌，一天后，取脑，切片，用TTC染液(一种常用的检测脑细胞活性状态的试剂)浸泡脑片至有红色出现。去掉TTC，加入PFA，4摄氏度固定，保存。
结果如图8所示，左侧为TTC染色典型图，未受缺血影响的脑区脑组织为红色，受缺血影响的脑区则为白色。右侧为His-SC-TAT及His-2A-TAT两种处理组中缺血损失的统计，可以看出，His-2A-TAT组中脑损伤的程度显著低于His-SC-TAT组，因此，His-2A-TAT在脑缺血过程中具有良好的脑保护作用。
上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种短肽及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
His His His His His His Leu Ala Ala Asn Gly Lys Ser Ala Asp Cys
1 5 10 15
Ser Val Glu Glu Glu Pro Trp Lys Arg Glu Lys Tyr Gly Arg Lys Lys
20 25 30
Arg Arg Gln Arg Arg Arg
35
<210> 2
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
His His His His His His Ala Ser Ser Gly Ala Lys Trp Lys Glu Val
1 5 10 15
Pro Glu Cys Asp Leu Arg Lys Ala Asn Glu Glu Tyr Gly Arg Lys Lys
20 25 30
Arg Arg Gln Arg Arg Arg
35

Claims (3)

1.一种短肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的短肽在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用。
3.一种治疗缺血性脑中风的药物，其特征在于，包括权利要求1所述的短肽。
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