CN106470707A - 用于口服递送生物活性货物的cholix毒素衍生的融合分子 - Google Patents

用于口服递送生物活性货物的cholix毒素衍生的融合分子 Download PDF

Info

Publication number
CN106470707A
CN106470707A CN201580036678.8A CN201580036678A CN106470707A CN 106470707 A CN106470707 A CN 106470707A CN 201580036678 A CN201580036678 A CN 201580036678A CN 106470707 A CN106470707 A CN 106470707A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
fusion molecule
cholix
biological activity
experimenter
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201580036678.8A
Other languages
English (en)
Inventor
兰德尔·J·米斯尼
塔希尔·玛穆德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Applied Molecular Transport Inc
Original Assignee
Applied Molecular Transport Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Applied Molecular Transport Inc filed Critical Applied Molecular Transport Inc
Priority to CN202311263281.5A priority Critical patent/CN117298254A/zh
Publication of CN106470707A publication Critical patent/CN106470707A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/45—Transferases (2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A61K38/166—Streptokinase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2066—IL-10
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/26—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/27—Growth hormone [GH] (Somatotropin)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/49—Urokinase; Tissue plasminogen activator
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/50—Hydrolases (3) acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5), e.g. asparaginase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/51—Lyases (4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5428—IL-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/02—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C12Y204/02036—NAD(+)--diphthamide ADP-ribosyltransferase (2.4.2.36)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21068—Tissue plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21073—Serine endopeptidases (3.4.21) u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/04—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amidines (3.5.4)
    • C12Y305/04004—Adenosine deaminase (3.5.4.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/02—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on polysaccharides (4.2.2)
    • C12Y402/02001—Hyaluronate lyase (4.2.2.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification

Abstract

本公开内容涉及药物组合物，所述药物组合物包含非天然存在的融合分子和一种或更多种药学上可接受的载体，所述药物组合物被配制用于口服递送至受试者，并且被设计为提供用于治疗，例如，炎性疾病、自身免疫性疾病、癌症、代谢紊乱和生长缺乏紊乱的改进的、有效的疗法。

Description

用于口服递送生物活性货物的CHOLIX毒素衍生的融合分子
相关专利申请
本申请要求于2014年5月7日提交的美国临时申请第61/990,054号的权益，该申请通过引用以其整体并入本文。
技术领域
生物活性多肽(指包含氨基酸残基的聚合物；通常也定义为蛋白或肽)的口服递送是制药产业的长期目标。遗憾地，胃肠(GI)道的许多物理、生理和生物屏障被设计为抑制蛋白和肽的摄取，直到它们可被充分降解以通过氨基酸和二肽或三肽转运蛋白吸收；和/或在腔表面处的内体摄取之后将蛋白和肽经细胞内运输至破坏性溶酶体区室。因此，以相似于用例如小分子可实现的方式从肠摄取多肽的可行性受到限制，且低口服生物可利用度仍然是大部分多肽和蛋白的问题。
尽管来自评价用于治疗疾病诸如癌症、炎性疾病、免疫疾病、生长缺乏紊乱等等的多种生物活性多肽的临床研究已存在一些有希望的结果，并且几种基于DNA的疗法已被FDA批准用于此类用途，这些治疗剂通常未能真正达到其最佳潜力，因为由于固有限制诸如阻碍递送最佳治疗有效剂量的短的生物半衰期和/或在治疗有效剂量下观察到的有害的副作用和毒性，通常存在最低限度或不足的总体效力。此外，许多此类疗法要求多个给药方案，需要静脉内或通过频繁的皮下注射连续施用，这对患者和护理者是繁重的。
针对评价有希望的生物活性多肽的未来临床研究可极大地受益于可用来向人类受试者口服施用此类多肽的新方法和/或药物组合物。
发明的公开内容
本公开内容涉及药物组合物，所述药物组合物包含新颖的、非天然存在的融合分子和一种或更多种药学上可接受的载体，所述药物组合物被配制用于口服递送，并且被设计为提供用于治疗例如炎性疾病和/或自身免疫性疾病和/或癌症的改进的、有效的疗法。
本公开内容部分地基于本发明人的独特洞察：包括包含与生物活性货物(cargo)偶联的修饰的Cholix毒素的融合分子的药物组合物的口服递送除了其他方面以外可提供以下优势：a)在其中修饰的Cholix毒素与生物活性货物不用接头或用不可裂解接头偶联的实施方案中，修饰的Cholix毒素被其在例如还表达针对生物活性货物的受体的免疫细胞的表面上的一种或更多种受体的锚定效应，可允许生物活性货物在靶向的细胞的表面上的更大的暴露并通过结合Cholix受体和生物活性货物受体两者提供协同效应；b)在其中修饰的Cholix毒素与生物活性货物用存在于上皮细胞的基底外侧膜处的酶或存在于受试者的血浆中的酶可裂解的接头偶联的实施方案中，此类裂解将允许生物活性货物在跨上皮膜的转胞吞之后很快从融合分子的剩余部分释放；c)生物活性货物至粘膜下层-GI空间(submucosal-GI space)和肝门静脉系的直接递送可降低当通过肠胃外途径施用货物时观察到的全身毒性，以及使得能够接近经由非口服或GI途径难以靶向的粘膜下层靶生物学；d)在跨GI上皮转运后，本公开内容的融合分子将表现出在血清中延长的半衰期，即，与在其非融合状态中的生物活性货物相比，融合分子的生物活性货物将表现出延长的血清半衰期；e)融合分子的口服施用可将递送的生物活性货物以比在受试者的血浆中观察到的更高的有效浓度递送至受试者的肝脏；以及f)将生物活性货物递送至受试者而不使用针刺穿受试者的皮肤的能力，因此除了改进的患者/护理者的便利和依从性以外，通过避免与其相关的疼痛或潜在的并发症改进此类受试者的生活质量。
因此，在一个方面，本公开内容涉及药物组合物，所述药物组合物包含非天然存在的融合分子和一种或更多种药学上可接受的载体，所述药物组合物被配制用于口服递送，其中融合分子包含与待递送至受试者的生物活性货物偶联的修饰的Cholix毒素，其中Cholix毒素是无毒的。
在一个方面，本公开内容涉及药物组合物，所述药物组合物包含非天然存在的融合分子和一种或更多种药学上可接受的载体，所述药物组合物被配制用于口服递送，其中融合分子包含与待递送至受试者的生物活性货物偶联的修饰的Cholix毒素，其中Cholix毒素是无毒的，且其中融合分子具有活化生物活性货物的受体的能力、或使催化活性物质(catalytically-active material)的催化过程成为可能的能力。
在多种实施方案中，药物组合物的融合分子包含在Cholix毒素结构域II内的氨基酸残基处截短的修饰的Cholix毒素。在多种实施方案中，融合分子包含具有以下中列出的氨基酸序列的截短的Cholix毒素：例如，SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ IDNO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQID NO：39、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：41。
在多种实施方案中，药物组合物的融合分子包含在Cholix毒素结构域Ib内的氨基酸残基处截短的修饰的Cholix毒素。在多种实施方案中，融合分子包含具有以下中列出的氨基酸序列的截短的Cholix毒素：例如，SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：80。
在多种实施方案中，药物组合物的融合分子包含修饰的Cholix毒素，其中结构域III已被截短或突变。在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：81中列出的氨基酸序列的突变的Cholix毒素，其中SEQ ID NO：1的氨基酸残基E581已被缺失(本文命名为“Cholix ΔE581”)。
在多种实施方案中，药物组合物的融合分子包含修饰的Cholix毒素，其中结构域Ia已被突变。
在多种实施方案中，生物活性货物选自例如，大分子、小分子、肽、多肽、核酸、mRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义分子、抗体、DNA、质粒、疫苗、聚合物纳米颗粒或催化活性物质。
在多种实施方案中，生物活性货物为选自以下的酶：透明质酸酶、链激酶、组织纤溶酶原激活物、尿激酶或PGE-腺苷脱氨酶。
在多种实施方案中，生物活性货物是为选自以下的GI道中的炎症调节因子的多肽：例如，白细胞介素-10、白细胞介素-19、白细胞介素-20、白细胞介素-22、白细胞介素-24或白细胞介素-26。在多种实施方案中，生物活性多肽为具有SEQ ID NO：82中列出的氨基酸序列的白细胞介素-10。在多种实施方案中，生物活性多肽为具有SEQ ID NO：83中列出的氨基酸序列的白细胞介素-19。在多种实施方案中，生物活性多肽为具有SEQ ID NO：84中列出的氨基酸序列的白细胞介素-20。在多种实施方案中，生物活性多肽为具有SEQ ID NO：85中列出的氨基酸序列的白细胞介素-22。在多种实施方案中，生物活性多肽为具有SEQ ID NO：86中列出的氨基酸序列的白细胞介素-24。在多种实施方案中，生物活性多肽为具有SEQ IDNO：87中列出的氨基酸序列的白细胞介素-26。在多种实施方案中，生物活性货物为是小分子的GI道中的炎症调节因子。在多种实施方案中，生物活性货物为是反义分子或siRNA分子的GI道中的炎症调节因子。
在多种实施方案中，生物活性货物为是以下的TNFSF抑制剂：抗体或其片段、或包含抗体或其片段的人工构建体、或被设计为模拟抗体或其片段与其抗原的结合的人工构建体。在多种实施方案中，生物活性货物为是可溶性TNFSF受体融合蛋白的TNFSF抑制剂。在多种实施方案中，生物活性货物为是小分子的TNFSF抑制剂。在多种实施方案中，生物活性货物为是反义分子或siRNA分子的TNFSF抑制剂。
在多种实施方案中，生物活性货物为包含SEQ ID NO：88中列出的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：89中列出的轻链可变区氨基酸序列的抗体。在多种实施方案中，生物活性货物为包含SEQ ID NO：90中列出的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：91中列出的轻链可变区氨基酸序列的抗体。在多种实施方案中，生物活性货物为包含SEQ ID NO：92中列出的氨基酸序列的可溶性TNFSF受体融合蛋白二聚体。
在一个方面，本公开内容涉及药物组合物，所述药物组合物包含新颖的、非天然存在的融合分子和一种或更多种药学上可接受的载体，所述药物组合物被配制用于口服递送，并且被设计为提供用于治疗代谢紊乱例如1型糖尿病和2型糖尿病的改进的、有效的疗法。生物活性多肽(指包含氨基酸残基的聚合物；通常也定义为蛋白或肽)的口服递送是制药产业的长期目标。遗憾地，胃肠(GI)道的许多物理、生理和生物屏障被设计为抑制蛋白和肽的摄取，直到它们可被充分降解以通过氨基酸和二肽或三肽转运蛋白吸收；和/或在腔表面处的内体摄取之后将蛋白和肽经细胞内运输至破坏性溶酶体区室。因此，以相似于用例如小分子可实现的方式从肠摄取多肽的可行性受到限制，且低口服生物可利用度仍然是大部分多肽和蛋白的问题。
在多种实施方案中，本公开内容涉及药物组合物，所述药物组合物包含非天然存在的融合分子和一种或更多种药学上可接受的载体，所述药物组合物被配制用于口服递送，其中融合分子包含与待递送至受试者的降葡萄糖剂(glucose-lowering agent)偶联的修饰的Cholix毒素。
在多种实施方案中，本公开内容部分地基于，包括包含与降葡萄糖剂偶联的修饰的Cholix毒素的融合分子的药物组合物的口服递送除了其他方面以外可提供以下优势：a)在其中修饰的Cholix毒素与降葡萄糖剂不用接头偶联的实施方案中，修饰的Cholix毒素被其在还表达针对降葡萄糖剂的受体的细胞的表面上的一种或更多种受体的锚定效应，可允许降葡萄糖剂在靶向的细胞的表面上的更大的暴露；b)在其中修饰的Cholix毒素与降葡萄糖剂用存在于上皮细胞的基底外侧膜处的酶或存在于受试者的血浆中的酶可裂解的接头偶联的实施方案中，此类裂解将允许降葡萄糖剂在跨上皮膜的转胞吞之后很快从融合分子的剩余部分释放；c)降葡萄糖剂至粘膜下层-GI空间和肝门静脉系的直接递送可降低当通过肠胃外途径施用降葡萄糖剂时观察到的全身毒性，以及使得能够接近经由非口服或GI途径难以靶向的粘膜下层靶生物学；d)降葡萄糖剂至粘膜下层GI空间和肝门静脉系的直接递送可提供改进的给药方案，包括更低频率的胰岛素注射；以及e)将降葡萄糖剂递送至受试者而不使用针刺穿受试者的皮肤的能力因此通过避免与其相关的疼痛或潜在的并发症改进此类受试者的生活质量。
在多种实施方案中，降葡萄糖剂选自例如，大分子、小分子、肽、多肽、核酸、mRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义分子、抗体、DNA、质粒、疫苗、聚合物纳米颗粒或催化活性物质。在多种实施方案中，降葡萄糖剂为肠降血糖素或肠降血糖素模拟物。在多种实施方案中，降葡萄糖剂为GLP-1。在多种实施方案中，降葡萄糖剂为GLP-1激动剂。在多种实施方案中，降葡萄糖剂为exendin。在多种实施方案中，降葡萄糖剂为葡萄糖抑制蛋白受体(GIPR)激动剂。
在多种实施方案中，降葡萄糖剂为是肽的GLP-1激动剂。在多种实施方案中，降葡萄糖剂为是小分子的GLP-1激动剂。在多种实施方案中，降葡萄糖剂为是反义分子或siRNA分子的GLP-1激动剂。在多种实施方案中，降葡萄糖剂为是以下的GLP-1激动剂：抗体或其片段、或包含抗体或其片段的人工构建体、或被设计为模拟抗体或其片段与其抗原的结合的人工构建体。
在多种实施方案中，生物活性货物为是包含SEQ ID NO：93中列出的氨基酸序列的GLP-1激动剂肽的降葡萄糖剂。在多种实施方案中，生物活性货物为是包含SEQ ID NO：94中列出的氨基酸序列的GLP-1激动剂肽的降葡萄糖剂。
在一个方面，本公开内容涉及药物组合物，所述药物组合物包含新颖的、非天然存在的融合分子和一种或更多种药学上可接受的载体，所述药物组合物被配制用于口服递送，并且被设计为提供用于治疗生长激素缺乏以及相似的紊乱的改进的、有效的疗法。
在多种实施方案中，本公开内容涉及药物组合物，所述药物组合物包含非天然存在的融合分子和一种或更多种药学上可接受的载体，所述药物组合物被配制用于口服递送，其中融合分子包含与待递送至受试者的生长激素(GH)偶联的修饰的Cholix毒素。
在多种实施方案中，本公开内容部分地基于本发明人的独特洞察：包括包含与生长激素偶联的修饰的Cholix毒素的融合分子的药物组合物的口服递送除了其他方面以外可提供以下优势：a)在其中修饰的Cholix毒素与生长激素用被存在于上皮细胞的基底外侧膜处的酶或存在于受试者的血浆中的酶可裂解的接头偶联的实施方案中，此类裂解将允许生长激素在跨上皮膜的转胞吞之后很快从融合分子的剩余部分释放；b)生长激素至粘膜下层-GI空间和肝门静脉系的直接递送可降低当通过肠胃外途径施用生长激素时观察到的全身毒性，以及使得能够接近经由非口服或GI途径难以靶向的粘膜下层靶生物学(例如，相对于经由皮下(sc)注射的全身递送提供更有效的IGF-1诱导)；c)生长激素至粘膜下层-GI空间和肝门静脉系的直接递送可提供改进的给药方案；d)口服递送将实现生长激素对肝脏的短暂脉冲，其与在生长中的儿童中观察到的血清水平更一致，且该脉冲谱不能通过sc注射实现；以及e)将生长激素递送至受试者而不使用针刺穿受试者的皮肤的能力，因此除了改进的患者/护理者的便利和依从性以外，通过避免与其相关的疼痛或潜在的并发症改进此类受试者的生活质量。
在多种实施方案中，生长激素选自例如，大分子、小分子、肽、多肽、核酸、mRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义分子、抗体、DNA、质粒、疫苗、聚合物纳米颗粒或催化活性物质。在多种实施方案中，生长激素为人类生长激素(或其变体)、生长激素2或生长激素释放激素。在多种实施方案中，生长激素为包含SEQ ID NO：95中列出的氨基酸序列的人类生长激素(促生长素(somatotropin))。
在多种实施方案中，融合分子包含与生物活性货物直接偶联的修饰的Cholix毒素。在多种实施方案中，生物活性货物与Cholix毒素的C-末端直接偶联。
在多种实施方案中，融合分子包含与生物活性货物化学偶联的修饰的Cholix毒素。
在多种实施方案中，融合分子包含通过不可裂解的接头与生物活性货物偶联的Cholix毒素。在多种实施方案中，不可裂解的接头包含以下的氨基酸序列：例如，SEQ IDNO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98或SEQ ID NO：99。
在多种实施方案中，融合分子包含通过可裂解的接头与生物活性货物偶联的Cholix毒素。在多种实施方案中，接头是存在于受试者的极化上皮细胞的基底外侧膜处的酶可裂解的。在多种实施方案中，接头是存在于所述受试者的血浆中的酶可裂解的。在多种实施方案中，可裂解的接头包含以下的氨基酸序列：例如，SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ IDNO：107、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：117、SEQ IDNO：118、SEQ ID NO：119或SEQ ID NO：120。
在多种实施方案中，融合分子包含通过可裂解的接头与生物活性货物偶联的Cholix毒素，其中可裂解的接头包含已知是烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶底物的氨基酸序列。在多种实施方案中，可裂解的接头包含，例如，SEQ ID NO：121的氨基酸序列。
在多种实施方案中，融合分子包含SEQ ID NO：122中列出的氨基酸序列。(这为Cholix415-TEV-IL-10)
在多种实施方案中，融合分子包含SEQ ID NO：123中列出的氨基酸序列。(这为Cholix415-(G4S)3-IL-10)
在另一个方面，本公开内容提供了一种治疗受试者中的炎性疾病的方法，所述方法包括将本公开内容的药物组合物口服施用至受试者。在多种实施方案中，炎性疾病选自炎性肠病、银屑病或细菌性脓毒症。在多种实施方案中，炎性肠病为克罗恩病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、转移性结肠炎、白塞氏综合征(Behcet′s syndrome)或不确定性结肠炎(indeterminate colitis)。
在另一个方面，本公开内容提供了一种治疗受试者中的自身免疫性疾病的方法，所述方法包括将本公开内容的药物组合物口服施用至受试者。在多种实施方案中，自身免疫性疾病为系统性红斑狼疮(SLE)、寻常天疱疮、重症肌无力、溶血性贫血、血小板减少性紫癜、格雷夫斯病(Grave′s disease)、干燥综合征(Sjogren′s disease)、皮肌炎、桥本氏病(Hashimoto′s disease)、多发性肌炎、炎性肠病、多发性硬化(MS)、糖尿病、类风湿性关节炎或硬皮病。
在另一个方面，本公开内容提供了一种治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括将本公开内容的药物组合物口服施用至受试者。在多种实施方案中，待治疗的癌症包括，但不限于，非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐受性NHL和白血病。
在另一个方面，本公开内容提供了一种治疗患有代谢紊乱的受试者的方法，所述方法包括以足以治疗所述紊乱的量口服施用本公开内容的融合分子，其中所述代谢紊乱为糖尿病、肥胖、作为肥胖结果的糖尿病、高血糖症、血脂异常、高甘油三酯血症、X综合征、胰岛素抵抗、葡萄糖耐量受损(impaired glucose tolerance)(IGT)、糖尿病血脂异常或高脂血症。
在另一个方面，本公开内容提供了一种治疗患有脂肪性肝病(例如，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)；非酒精性脂肪性肝炎(NASH))、胃肠道疾病或神经退行性疾病的受试者的方法，所述方法包括以足以治疗所述疾病的量口服施用本公开内容的融合分子。
在另一个方面，本公开内容提供了一种治疗患有GH缺乏性生长紊乱的受试者的方法，所述方法包括以足以治疗所述紊乱的量口服施用本公开内容的融合分子，其中所述紊乱为生长激素缺乏(GHD)、特纳综合征(Turner syndrome)(TS)、Noonan综合征、Prader-Willi综合征、包含身材矮小同源盒基因(short stature homeobox-containing gene)(SHOX)的缺乏、慢性肾功能不全和特发性身材矮小短肠综合征(idiopathic shortstature short bowel syndrome)、由罕见垂体肿瘤或其治疗引起的GH缺乏，以及与HIV/AIDS相关的肌肉消耗性疾病。
在另一个方面，本公开内容涉及本发明的非天然存在的融合分子在制备用于治疗、预防和/或防止有相应需要的受试者中的炎性疾病的药物中的用途。
在另一个方面，本公开内容涉及本发明的非天然存在的融合分子在制备用于治疗、预防和/或防止有相应需要的受试者中的自身免疫性疾病的药物中的用途。
在另一个方面，本公开内容涉及本发明的非天然存在的融合分子在制备用于治疗、预防和/或防止有相应需要的受试者中的癌症的药物中的用途。
在另一个方面，本公开内容涉及本发明的非天然存在的融合分子在制备用于治疗、预防和/或防止有相应需要的受试者中的代谢紊乱的药物中的用途。
在另一个方面，本公开内容涉及本发明的非天然存在的融合分子在制备用于治疗、预防和/或防止有相应需要的受试者中的脂肪性肝病的药物中的用途。
在另一个方面，本公开内容涉及本发明的非天然存在的融合分子在制备用于治疗、预防和/或防止有相应需要的受试者中的GH缺乏性生长紊乱的药物中的用途。
在其他方面，本公开内容提供了多核苷酸，所述多核苷酸编码本公开内容的非天然存在的修饰的Cholix毒素-生物活性货物融合分子；载体，所述载体包含编码本公开内容的非天然存在的修饰的Cholix毒素-生物活性货物融合分子的多核苷酸；任选地，可操作地连接至由用载体转化的宿主细胞识别的控制序列；宿主细胞，所述宿主细胞包括包含编码本公开内容的非天然存在的修饰的Cholix毒素-生物活性货物融合分子的多核苷酸的载体；一种用于产生本公开内容的非天然存在的修饰的Cholix毒素-生物活性货物融合分子的方法，所述方法包括培养包括包含编码本公开内容的非天然存在的修饰的Cholix毒素-生物活性货物融合分子的多核苷酸的载体的宿主细胞，使得所述多核苷酸被表达；以及任选地，从宿主细胞培养基中回收非天然存在的修饰的Cholix毒素-生物活性货物融合分子。
附图简述
图1描绘了本文评价的两种示例性Cholix毒素-IL-10融合分子的遗传构建。人类IL-10单体序列的N-末端使用稳定的不可裂解的接头序列((G4S)3)或为烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶的已知底物的接头序列被遗传地附连至修饰的Cholix毒素的C-末端(Cholix415)。每种构建体还包含N-末端甲硫氨酸(M)。
图2为在将由IL-10二聚化驱动的重折叠之后的示例性“二聚体Cholix毒素-IL-10”融合分子的带状图表示。Cholix毒素(SEQ ID NO：1)的前415个氨基酸通过16个氨基酸的接头(未示出)连接，以与人类IL-10序列连接。设想IL-10二聚化导致显示的紫色Cholix415/蓝色hIL-10和橙色Cholix415/绿色组织化。
图3为诱导和从包含体表达后的Cholix415-TEV-IL-10(被描述为“C”)和Cholix415-(G4S)3-IL-10(被描述为“N”)的考马斯染色的SDS PAGE。表达的融合分子显示～66kDa的预期分子大小，该分子大小与分别为66380.78和65958.25道尔顿的计算质量相当。示出了 Plus2预染MW标准。
图4为描绘使用以在两种浓度的本公开内容的示例性Cholix毒素-IL-10融合分子处理的小鼠巨噬细胞来源的J774.2细胞系的流式细胞术测定的结果的柱状图。在处理后48小时测量％增殖。值代表n＝4±标准偏差。数据显示，“二聚体Cholix415-(G4S)3-IL-10”融合分子显示出生物活性的IL-10。
图5为描绘其中测试二聚体Cholix415-(G4S)3-IL-10融合分子在体外对Caco-2细胞单层的屏障特性的效应的测定的结果的线图。将荧光素标记的70kDa右旋糖酐(dextran)和不同浓度的二聚体Cholix415-(G4S)3-IL-10融合分子添加至这些单层的顶面，并通过代替收集150μL体积(collecting 150μL volumes with replacement)随时间监测在基底区室中检测到的荧光的累积量。将累积基础右旋糖酐水平(pmol)对时间作图。每条线代表在0min、15min、30min、45min、60min、90min、120min、180min和240min测量的基础荧光值的平均值(n＝4)。
图6为描绘其中测试二聚体Cholix415-(G4S)3-IL-10融合分子在体外对Caco-2细胞单层的屏障特性的效应的测定的结果的线图。将荧光素标记的70kDa右旋糖酐和不同浓度的二聚体Cholix415-(G4S)3-IL-10融合分子添加至这些单层的顶面，并随时间监测在基底区室中检测到的荧光的累积量。
图7A和7B为描绘评价二聚体Cholix415-(G4S)3-IL-10融合分子跨Caco-2细胞单层移动的能力的ELISA测定的结果的线图。在图例中指示的多种浓度的顶部添加后，随时间监测二聚体Cholix415-(G4S)3-IL-10融合分子到达基底区室的累积量。每条线代表在0min、15min、30min、45min、60min、90min、120min、180min和240min测量的基础IL-10水平的平均值(n＝4)。在7A＝8000fmol IL-10扩展的和7B＝1000fmol IL-10的范围将转运的累积的IL-10对时间作图。
进行本发明的模式
除非本文另有定义，与本公开内容关联使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。通常，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学及杂交关联使用的命名法和其技术是本领域常用的和熟知的那些。除非另有指示，本公开内容的方法和技术通常根据本领域熟知的常规方法，并且如在整个本说明书中引用和讨论的多种一般和更具体的参考文献中描述的进行。参见，例如，Sambrook等Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)和Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Associates(1992)，以及Harlow和Lane Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)，其通过引用并入本文。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书，如本领域通常完成或如本文描述的进行。与本文描述的分析化学、合成有机化学以及药用和药物化学(medicinal and pharmaceutical chemistry)关联使用的命名法以及其实验室程序和技术是本领域常用的和熟知的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送以及患者的治疗。
定义
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。在多种实施方案中，“肽”、“多肽”和“蛋白”为其α碳通过肽键连接的氨基酸链。因此，在链一端(氨基末端)的末端氨基酸具有自由的氨基基团，而在链的另一端(羧基末端)的末端氨基酸具有自由的羧基基团。如本文使用的，术语“氨基末端”(缩写为N-末端)指在肽的氨基末端处的氨基酸上的自由的α-氨基基团，或在肽内的任何其他位置处的氨基酸的α-氨基基团(当参与肽键时为亚氨基基团)。相似地，术语“羧基末端”指在肽的羧基末端上的自由的羧基基团或在肽内任何其他位置处的氨基酸的羧基基团。肽还基本上包括任何聚氨基酸，包括，但不限于，肽模拟物，诸如通过醚而不是酰胺键连接的氨基酸。
本公开内容的多肽包括以任何方式和由于以下任何原因进行修饰的多肽：例如，(1)降低对蛋白水解的易感性，(2)降低氧化敏感性，(3)改变形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，以及(5)赋予或修改其他物理化学或功能特性。例如，单个或多个氨基酸取代(例如，保守性氨基酸取代)可在天然存在的序列(例如，在形成分子间接触的一个或更多个结构域外部的多肽部分中)中进行。“保守性氨基酸取代”指在多肽中用功能相似的氨基酸取代氨基酸。以下六组各包含对彼此为保守性取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)
2)天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)
3)天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)
4)精氨酸(R)和赖氨酸(K)
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)
“非保守性氨基酸取代”指将这些类别之一的成员取代为来自另一类别的成员。在进行此类改变时，根据多种实施方案，可以考虑氨基酸的亲水指数(hydropathic index)。基于氨基酸的疏水性和电荷特性，每个氨基酸已被指定亲水指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
亲水氨基酸指数在对蛋白赋予交互生物功能中的重要性在本领域中是理解的(参见，例如，Kyte等，1982，J.Mol.Biol.157：105-131)。已知，某些氨基酸可被具有相似亲水指数或评分的其他氨基酸取代且仍保持相似的生物活性。在基于亲水指数进行改变时，在多种实施方案中，包括亲水指数在±2内的氨基酸的取代。在多种实施中，包括在±1内的那些，且在多种实例中，包括在±0.5内的那些。
本领域还理解，可基于亲水性有效地进行相似氨基酸的取代，特别是当凭借其产生的生物功能蛋白或肽意图用于如本文公开的免疫学实施方案中时。在多种实施方案中，蛋白的最大局部平均亲水性(如由其相邻氨基酸的亲水性决定的)与其免疫原性和抗原性，即，与蛋白的生物学特性相关。
这些氨基酸残基已被指定了以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+-.1)；谷氨酸(+3.0.+-.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于相似亲水性值进行改变时，在多种实施方案中，包括亲水性值在±2内的氨基酸的取代，在多种实施方案中，包括在±1内的那些，且在多种实施方案中，包括在±0.5内的那些。
示例性氨基酸取代列于表1中。
表1
氨基酸取代
本领域技术人员将能够使用熟知的技术确定如本文陈述的多肽的适合的变体。在多种实施方案中，本领域技术人员可通过靶向被认为对于活性不重要的区来鉴定可被改变而不破坏活性的分子的适合区域。在其他实施方案中，技术人员可鉴定在相似多肽间是保守的分子的残基和部分。在另外的实施方案中，甚至对生物活性或对结构可能重要的区域可经历保守性氨基酸取代，而不破坏生物活性或不会不利地影响多肽结构。
另外，本领域技术人员可回顾鉴定相似多肽中对活性或结构重要的残基的结构-功能研究。鉴于此类比较，本领域技术人员可预测多肽中对应于相似多肽中对活性或结构重要的氨基酸残基的氨基酸残基的重要性。本领域技术人员可选择对此类预测的重要氨基酸残基进行化学上相似的氨基酸取代。
本领域技术人员还可分析与相似多肽中的该结构相关的三维结构和氨基酸序列。鉴于此类信息，本领域技术人员可预测多肽关于其三维结构的氨基酸残基的比对。在多种实施方案中，本领域技术人员可选择对预测在多肽表面上的氨基酸残基不进行根本改变，因为此类残基可能参与与其他分子的重要相互作用。另外，本领域技术人员可产生包含在每个期望的氨基酸残基处的单个氨基酸取代的测试变体。然后变体可使用本领域技术人员已知的活性测定来筛选。此类变体可用来收集关于适合变体的信息。例如，如果人们发现，对特定氨基酸残基的改变导致被破坏的、不期望的降低的或不适合的活性，可避免具有此类改变的变体。换言之，基于从此类常规实验收集的信息，本领域技术人员可容易地确定应该避免在此处单独地或与其他突变组合的进一步取代的氨基酸。
如本文使用的术语“多肽片段”和“截短的多肽”指与对应的全长蛋白相比具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽。在多种实施方案中，片段的长度可以是例如，至少5个、至少10个、至少25个、至少50个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个或至少1000个氨基酸。在多种实施方案中，片段的长度还可以是例如，至多1000个、至多900个、至多800个、至多700个、至多600个、至多500个、至多450个、至多400个、至多350个、至多300个、至多250个、至多200个、至多150个、至多100个、至多50个、至多25个、至多10个或至多5个氨基酸。片段还可在其末端的任一个或两个处包含一个或更多个另外的氨基酸，例如，来自不同的天然存在的蛋白的氨基酸序列(例如，Fc或亮氨酸拉链结构域)或人工氨基酸序列(例如，人工接头序列)。
如本文使用的术语“多肽变体”和“多肽突变体”指包含这样的氨基酸序列的多肽，其中相对于另一多肽序列，一个或更多个氨基酸残基被插入到该氨基酸序列、从该氨基酸序列缺失和/或取代到该氨基酸序列。在多种实施方案中，待插入、缺失或取代的氨基酸残基的数目可以是例如，至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少25个、至少50个、至少75个、至少100个、至少125个、至少150个、至少175个、至少200个、至少225个、至少250个、至少275个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个或至少500个氨基酸。本公开内容的变体包括融合蛋白。
多肽的“衍生物”为已被化学修饰，例如，与另一化学部分诸如，例如，聚乙二醇、白蛋白(例如，人类血清白蛋白)缀合、磷酸化和糖基化的多肽。
术语“％序列同一性”在本文中与术语“％同一性”可互换使用，并且指当使用序列比对程序比对时两个或更多个肽序列之间的氨基酸序列同一性的水平或两个或更多个核苷酸序列之间的核苷酸序列同一性的水平。例如，如本文使用的，80％同一性与通过定义的算法确定的80％序列同一性具有相同含义，并且意指，给定序列与另一序列的另一长度至少80％相同。在多种实施方案中，％同一性选自，例如，与给定序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％或更大的序列同一性。在多种实施方案中，％同一性在以下的范围内：例如，约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％、或约95％至约99％。
术语“％序列同源性”在本文中与术语“％同源性”可互换使用，并且指当使用序列比对程序比对时两个或更多个肽序列之间的氨基酸序列同源性的水平或两个或更多个核苷酸序列之间的核苷酸序列同源性的水平。例如，如本文使用的，80％同源性与通过定义的算法确定的80％序列同源性具有相同含义，并且因此给定序列的同系物跨给定序列的长度具有大于80％的序列同源性。在多种实施方案中，％同源性选自，例如，与给定序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％或更大的序列同源性。在多种实施方案中，％同源性在以下的范围内：例如，约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％、或约95％至约99％。
可用来确定两个序列之间的同一性的示例性计算机程序包括，但不限于，BLAST程序套件，例如，BLASTN、BLASTX和TBLASTX、BLASTP和TBLASTN，其可在因特网上在NCBI网站公开获得。还参见，Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215：403-10(特别参考已公布的缺省设置，即，参数w＝4、t＝17)以及Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402。当相对于GenBank蛋白序列和其他公共数据库中的氨基酸序列评价给定氨基酸序列时，通常使用BLASTP程序进行序列搜索。BLASTX程序优选用于针对氨基酸序列在GenBank蛋白序列和其他公共数据库中搜索在所有阅读框中已被翻译的核酸序列。BLASTP和BLASTX两者使用开放空位罚分为11.0和延伸空位罚分为1.0的缺省参数来运行，并利用BLOSUM-62矩阵。参见同前。
除了计算序列同一性百分比以外，BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计分析(参见，例如，Karlin & Altschul，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA，90：5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似性的一个量度是最小总和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸序列或氨基酸序列之间将偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率为，例如，至多0.1、至多0.01或至多0.001，则认为核酸与参考序列相似。
“多核苷酸”指包含核苷酸单元的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，诸如脱氧核糖核酸(″DNA″)和核糖核酸(″RNA″)以及核酸类似物。核酸类似物包括包含非天然存在的碱基的那些，参与与其他核苷酸的除了天然存在的磷酸二酯键以外的连接的核苷酸，或包含通过除了磷酸二酯键以外的连接附连的碱基的核苷酸。因此，核苷酸类似物包括，例如，且不限于，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯(phosphorotriester)、氨基磷酸酯、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)等。此类多核苷酸可，例如，使用自动化DNA合成仪合成。术语“核酸”通常指大的多核苷酸。术语“寡核苷酸”通常指短的多核苷酸，通常不大于约50个核苷酸。应当理解，当核苷酸序列由DNA序列(即，A、T、G、C)代表时，这还包括其中“U”代替″T″的RNA序列(即，A、U、G、C)。
本文使用常规符号描述多核苷酸序列：单链多核苷酸序列的左手端为5′-末端；双链多核苷酸序列的左手方向被称为5′-方向。核苷酸向新生RNA转录物的5′至3′添加的方向被称为转录方向。具有与mRNA相同序列的DNA链被称为“编码链”；在具有与从该DNA转录的mRNA相同的序列的DNA链上且位于RNA转录物的5′-末端的5′的序列被称为“上游序列”；在具有与RNA相同的序列的DNA链上并且在编码RNA转录物的3′-末端的3′的序列被称为“下游序列”。
“互补”指两个多核苷酸的相互作用表面的拓扑相容性或匹配在一起。因此，两个分子可被描述为互补的，且此外，接触表面特性为彼此互补。如果第一多核苷酸的核苷酸序列与第二多核苷酸的多核苷酸结合配偶体的核苷酸序列基本上相同，或如果第一多核苷酸可与第二多核苷酸在严格杂交条件下杂交，则第一多核苷酸与第二多核苷酸互补。
“与...特异性杂交”或“特异性杂交”或“与...选择性杂交”指当该序列存在于复杂混合物(例如，总细胞)DNA或RNA中时，核酸分子优先与特定核苷酸序列在严格条件下的结合、双链体化或杂交。术语“严格条件”指在其下探针将优先与其靶子序列杂交，并且在较小程度上与其它序列杂交或根本不与其他序列杂交的条件。在核酸杂交实验诸如DNA杂交和RNA杂交的背景下，“严格杂交”和“严格杂交洗涤条件”为序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。关于核酸杂交的广泛指导可在以下中发现：Tijssen，1993，LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with NucleicAcid Probes，部分I，第2章，″Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assays″，Elsevier，N.Y.；Sambrook等，2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，3.sup.rded.，NY；以及Ausubel等，编著，现行版，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，NY。
通常，选择比在定义的离子强度和pH下特定序列的热解链温度(Tm)低约5℃的高度严格的杂交和洗涤条件。Tm为在其下50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在定义的离子强度和pH下)。选择等于特定探针的Tm的非常严格的条件。用于在DNA印迹或RNA印迹中的滤器上具有多于约100个互补残基的互补核酸的杂交的严格杂交条件的实例为在42℃，50％福尔马林与1mg肝素，杂交被进行过夜。高度严格的洗涤条件的实例为在72℃下，0.15M NaCl，持续约15分钟。严格洗涤条件的实例为在65℃下，0.2x SSC洗涤，持续15分钟。参见Sambrook等对于SSC缓冲液的描述。高严格洗涤之前可进行低严格洗涤以去除背景探针信号。对于，例如，多于约100个核苷酸的双链体的示例性中度严格洗涤为在45℃下，1xSSC，持续15分钟。对于，例如，多于约100个核苷酸的双链体的示例性低严格洗涤为在40℃下，4-6x SSC，持续15分钟。通常，比起在特定杂交测定中对于不相关探针观察到的2倍(或更高)的信噪比指示检测到特异性杂交。
“引物”指能够与指定的多核苷酸模板特异性杂交并提供用于合成互补多核苷酸的起始点的多核苷酸。当多核苷酸引物被置于在其下诱导合成的条件下，即，在核苷酸、互补多核苷酸模板和用于聚合的试剂诸如DNA聚合酶的存在下时，此类合成发生。引物通常为单链的，但可以为双链的。引物通常为脱氧核糖核酸，但多种合成和天然存在的引物可用于许多应用。引物与模板互补，其被设计为与模板杂交以用作合成起始的位点，但不需要反映模板的精确序列。在此类情况下，引物与模板的特异性杂交取决于杂交条件的严格度。引物可用例如，显色的、放射性的或荧光的部分标记并用作可检测的部分。
当提及多核苷酸使用时，“探针”指能够与另一多核苷酸的指定序列特异性杂交的多核苷酸。探针与靶互补多核苷酸特异性杂交，但不需要反映模板的精确互补序列。在此类情况下，探针与靶的特异性杂交取决于杂交条件的严格度。探针可用例如，显色的、放射性的或荧光的部分标记并用作可检测的部分。在其中探针提供用于合成互补多核苷酸的起始点的情况下，探针也可以为引物。
“载体”为可用来将与它连接的另一核酸引入到细胞中的多核苷酸。一种类型的载体为“质粒”，其指可将另外的核酸区段连接到其中的线性或环状双链DNA分子。另一种类型的载体为病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其中另外的DNA区段可被引入到病毒基因组中。某些载体能够在引入了它们的宿主细胞中自主复制(例如，包含细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入到宿主细胞后被整合进宿主细胞的基因组中，并且从而与宿主基因组一起复制。“表达载体”为可指导选择的多核苷酸的表达的一种类型的载体。
“调节序列”为影响与它可操作地连接的核酸的表达(例如，表达的水平、时机或位置)的核酸。调节序列可，例如，直接对调节的核酸发挥其效应，或通过一种或更多种其他分子(例如，结合调节序列和/或核酸的多肽)的作用发挥其效应。调节序列的实例包括启动子、增强子及其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。调节序列的另外的实例在以下中描述：例如，Goeddel，1990，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.以及Baron等，1995，Nucleic Acids Res.23：3605-06。如果调节序列影响核苷酸序列的表达(例如，表达的水平、时机或位置)，则核苷酸序列与调节序列“可操作地连接”。
“宿主细胞”为可用来表达本公开内容的多核苷酸的细胞。宿主细胞可以为原核生物，例如，大肠杆菌(E.coli)，或宿主细胞可以为真核生物，例如，单细胞真核生物(例如，酵母或其他真菌)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如，人类细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。通常，宿主细胞为可用编码多肽的核酸转化或转染的培养细胞，所述核酸然后可在宿主细胞中被表达。短语“重组宿主细胞”可用来表示已用待表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞还可以为包含核酸但不以期望的水平表达该核酸的细胞，除非调节序列被引入到宿主细胞，使得调节序列变成与该核酸可操作地连接。应当理解，术语宿主细胞不仅指特定的受试者细胞，而且指此类细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可由于，例如，突变或环境影响而在随后世代中发生，此类后代实际上可能与亲本细胞不相同，但仍被包括在如本文使用的该术语的范围内。
术语“分离的分子”(其中分子为，例如，多肽或多核苷酸)为这样的分子，该分子凭借其起源或衍生来源(1)与在它天然状态中伴随它的、天然缔合的组分不缔合，(2)基本上不含来自相同物种的其他分子，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)不存在于自然界中。因此，化学合成的或在与它天然起源的细胞不同的细胞系统中表达的分子将与它天然缔合的组分“分离”。还可使用本领域熟知的纯化技术通过分离使分子基本上不含天然缔合的组分。分子纯度或同质性可通过本领域熟知的许多方法来测定。例如，使用本领域熟知的技术，多肽样品的纯度可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶染色以显现多肽来测定。为了某些目的，更高的分辨率可通过使用HPLC或本领域熟知的用于纯化的其他方法来提供。
当至少约60％至75％的样品表现出单一种类的多肽时，蛋白或多肽为“基本上纯的”、“基本上同质的”或“基本上纯化的”。多肽或蛋白可以为单体的或多聚体的。基本上纯的多肽或蛋白将通常构成蛋白样品的约50％、60％、70％、80％或90％W/W，更通常约95％，且例如，将超过99％的纯的。蛋白纯度或同质性可通过本领域熟知的许多方法来指示，所述方法诸如蛋白样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后在用本领域熟知的着色剂染色凝胶之后显现单一多肽条带。为了某些目的，更高的分辨率可通过使用HPLC或本领域熟知的用于纯化的其他方法来提供。
“接头”指共价地或通过离子、范德华力或氢键连接两个其他分子的分子，例如在5′末端处与一个互补序列杂交并在3′末端处与另一个互补序列杂交，从而连接两个非互补序列的核酸分子。“可裂解的接头”指可被降解或以其他方式切断以分离通过该可裂解的接头连接的两个组分的接头。可裂解的接头通常被酶，通常为肽酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶等裂解。融合分子跨极化上皮膜转胞吞后，可裂解的接头也可被环境因素，诸如，例如，特异性酶活性，温度、pH、盐浓度等等的变化裂解(当环境中存在此类变化时)。
“药物组合物”指适合于在动物中药物使用的组合物。药物组合物包含药理学有效量的活性剂和药学上可接受的载体。“药理学有效量”指有效产生预期药理学结果的试剂的量。
“药学上可接受的载体”指任何标准的药物载体、媒介物、缓冲液和赋形剂，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、5％右旋糖水性溶液，以及乳液，诸如油/水或水/油乳液，以及各种类型的润湿剂和/或佐剂。适合的药物载体和制剂在Remington′s Pharmaceutical Sciences，第21版2005，Mack Publishing Co，Easton中描述。“药学上可接受的盐”为可被配制成用于药物用途的化合物的盐，包括，例如，金属盐(钠、钾、镁、钙等等)以及氨或有机胺的盐。
术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指减轻或消除生物紊乱和/或其伴随症状中的至少一种的方法。如本文使用的，“减轻”疾病、紊乱或状况意指降低疾病、紊乱或状况的症状的严重程度和/或发生频率。此外，本文中对“治疗”的提及包括对治愈性治疗、姑息性治疗(palliative treatment)和预防性治疗的提及。
修饰的Cholix毒素多肽
如本文使用的成熟Cholix毒素(Jorgensen，R.等，J Biol Chem 283(16)：10671-10678(2008))为70.7kD、634个残基的蛋白，其序列示于SEQ ID NO：1中：
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK(SEQ ID NO：1)
在多种实施方案中，Cholix毒素具有与SEQ ID NO：1的序列共享，例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％的观察到的同源性的氨基酸序列。
编码成熟Cholix毒素的示例性核酸示于SEQ ID NO：2中：
ATGGTCGAAGAAGCTTTAAACATCTTTGATGAATGCCGTTCGCCATGTTCGTTGACCCCGGAACCGGGTAAGCCGATTCAATCAAAACTGTCTATCCCTAGTGATGTTGTTCTGGATGAAGGTGTTCTGTATTACTCGATGACGATTAATGATGAGCAGAATGATATTAAGGATGAGGACAAAGGCGAGTCCATTATCACTATTGGTGAATTTGCCACAGTACGCGCGACTAGACATTATGTTAATCAAGATGCGCCTTTTGGTGTCATCCATTTAGATATTACGACAGAAAATGGTACAAAAACGTACTCTTATAACCGCAAAGAGGGTGAATTTGCAATCAATTGGTTAGTGCCTATTGGTGAAGATTCTCCTGCAAGCATCAAAATCTCCGTTGATGAGCTCGATCAGCAACGCAATATCATCGAGGTGCCTAAACTGTATAGTATTGATCTCGATAACCAAACGTTAGAGCAGTGGAAAACCCAAGGTAATGTTTCTTTTTCGGTAACGCGTCCTGAACATAATATCGCTATCTCTTGGCCAAGCGTGAGTTACAAAGCAGCGCAGAAAGAGGGTTCACGCCATAAGCGTTGGGCTCATTGGCATACAGGCTTAGCACTGTGTTGGCTTGTGCCAATGGATGCTATCTATAACTATATCACCCAGCAAAATTGTACTTTAGGGGATAATTGGTTTGGTGGCTCTTATGAGACTGTTGCAGGCACTCCGAAGGTGATTACGGTTAAGCAAGGGATTGAACAAAAGCCAGTTGAGCAGCGCATCCATTTCTCCAAGGGGAATGCGATGAGCGCACTTGCTGCTCATCGCGTCTGTGGTGTGCCATTAGAAACTTTGGCGCGCAGTCGCAAACCTCGTGATCTGACGGATGATTTATCATGTGCCTATCAAGCGCAGAATATCGTGAGTTTATTTGTCGCGACGCGTATCCTGTTCTCTCATCTGGATAGCGTATTTACTCTGAATCTTGACGAACAAGAACCAGAGGTGGCTGAACGTCTAAGTGATCTTCGCCGTATCAATGAAAATAACCCGGGCATGGTTACACAGGTTTTAACCGTTGCTCGTCAGATCTATAACGATTATGTCACTCACCATCCGGGCTTAACTCCTGAGCAAACCAGTGCGGGTGCACAAGCTGCCGATATCCTCTCTTTATTTTGCCCAGATGCTGATAAGTCTTGTGTGGCTTCAAACAACGATCAAGCCAATATCAACATCGAGTCTCGTTCTGGCCGTTCATATTTGCCTGAAAACCGTGCGGTAATCACCCCTCAAGGCGTCACAAATTGGACTTACCAGGAACTCGAAGCAACACATCAAGCTCTGACTCGTGAGGGTTATGTGTTCGTGGGTTACCATGGTACGAATCATGTCGCTGCGCAAACCATCGTGAATCGCATTGCCCCTGTTCCGCGCGGCAACAACACTGAAAACGAGGAAAAGTGGGGCGGGTTATATGTTGCAACTCACGCTGAAGTTGCCCATGGTTATGCTCGCATCAAAGAAGGGACAGGGGAGTATGGCCTTCCGACCCGTGCTGAGCGCGACGCTCGTGGGGTAATGCTGCGCGTGTATATCCCTCGTGCTTCATTAGAACGTTTTTATCGCACGAATACACCTTTGGAAAATGCTGAGGAGCATATCACGCAAGTGATTGGTCATTCTTTGCCATTACGCAATGAAGCATTTACTGGTCCAGAAAGTGCGGGCGGGGAAGACGAAACTGTCATTGGCTGGGATATGGCGATTCATGCAGTTGCGATCCCTTCGACTATCCCAGGGAACGCTTACGAAGAATTGGCGATTGATGAGGAGGCTGTTGCAAAAGAGCAATCGATTAGCACAAAACCACCTTATAAAGAGCGCAAAGATGAACTTAAG(SEQ ID NO：2)
在多种实施方案中，Cholix毒素包含与SEQ ID NO：2的序列共享，例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％的观察到的同源性的核酸序列。
在多种实施方案中，用于制备融合分子的修饰的Cholix毒素为截短的Cholix毒素，其中融合分子具有活化生物活性货物的受体的能力。如本文描述的截短的Cholix毒素将通过提及构成截短的Cholix毒素的氨基酸残基来标识，例如，由SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-386组成的截短的Cholix毒素将被标识为Cholix386。
在多种实施方案中，用于制备融合分子的修饰的Cholix毒素为突变的Cholix毒素。如本文描述的，其中突变牵涉氨基酸残基缺失的突变的Cholix毒素将通过提及被缺失的氨基酸残基来鉴定，例如，其中SEQ ID NO：1的氨基酸E581已被缺失的突变的Cholix毒素，将被标识为“CholixΔE581”。其中突变牵涉氨基酸残基取代的突变的Cholix毒素将通过提及在特定氨基酸残基处的特定氨基酸取代来标识。因此，例如，术语“S30A”指示，在SEQID NO：1中的位置30处的“S”(以标准单字母代码的丝氨酸)残基已被“A”(以标准单字母代码的丙氨酸)取代，即使该残基出现在截短的Cholix毒素中，且修饰的毒素将被标识为“CholixS30A”。
Cholix毒素结构域Ia(SEQ ID NO：1的氨基酸1-265)为作为细胞表面受体的配体起作用的“受体结合结构域”并介导融合分子与细胞的结合，例如，结构域Ia将以允许融合分子的胞吞的足够的亲和力结合存在于上皮细胞的顶膜上的细胞表面受体。结构域Ia可与本领域技术人员已知的存在于上皮细胞的顶膜上的任何受体结合，且不限于此。例如，受体结合结构域可结合α2-MR。只要基本上不消除介导融合分子与细胞的结合的能力，可对结构域Ia的氨基酸序列进行保守性或非保守性取代。在多种实施方案中，融合分子包括包含突变的结构域Ia的Cholix毒素。
在多种实施方案中，结构域Ia包含抗原呈递细胞(APC)受体结合结构域。在多种实施方案中，APC受体结合结构域为Cholix结构域Ia的细胞识别结构域或足以与APC上的细胞表面受体结合的Cholix结构域Ia的一部分。
在多种实施方案中，APC受体结合结构域结合被鉴定为存在于树突细胞或其他APC上的受体。APC上的细胞表面受体的实例可包括，但不限于，DEC-205(CD205)、CD207、CD209、CD11a、CD11b、CD11c、CD36、CD14、CD50、CD54、CD58、CD68、CD80、CD83、CD86、CD102、CD3、CD14、CD19、Clec9a、CMFR-44、dectin-1、dectin-2、FLT3、HLA-DR、LOX-1、MHC II、BDCA-1、DC-SIGN、Toll-样受体(TLR)-2、-3、-4、和-7，以及α2-巨球蛋白受体(“α2-MR”)。在多种实施方案中，APC受体结合结构域为α2-MR。
Cholix毒素结构域II(SEQ ID NO：1的氨基酸266-386)为介导从与粘膜的顶面毗邻的腔至粘膜的基底外侧的转胞吞的“转胞吞结构域”。如在本文中提及的，“转胞吞”指融合分子通过极化上皮细胞的运输。此类运输允许从极化上皮细胞的基底外侧膜释放生物活性货物。本公开内容的融合分子可包括包含结构域II的整个氨基酸序列的修饰的Cholix毒素，或者可包含结构域II的部分，只要转胞吞活性基本上不被消除。此外，只要转胞吞活性基本上不被消除，可对转胞吞结构域的氨基酸序列进行保守性或非保守性取代。本文描述了本领域技术人员常规地可用来确定转胞吞结构域是否具有转胞吞活性的代表性测定。如本文使用的，只要与包含结构域II的整个氨基酸序列的修饰的Cholix毒素相比，活性为，例如，至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％，转胞吞活性基本上未被消除。
在多种实施方案中，非天然存在的融合分子包含在Cholix毒素结构域II内的氨基酸残基处截短的修饰的Cholix毒素，其中融合分子具有活化生物活性货物的受体的能力。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix386(SEQ ID NO：3)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix385(SEQ ID NO：4)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix384(SEQ ID NO：5)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix383(SEQ ID NO：6)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix382(SEQ ID NO：7)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix381(SEQ ID NO：8)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix380(SEQ ID NO：9)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix379(SEQ ID NO：10)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix378(SEQ ID NO：11)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix377(SEQ ID NO：12)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix376(SEQ ID NO：13)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix375(SEQ IDNO：14)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix374(SEQ ID NO：15)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix373(SEQ ID NO：16)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix372(SEQ ID NO：17)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix371(SEQ IDNO：18)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix370(SEQ ID NO：19)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix369(SEQ ID NO：20)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix368(SEQ ID NO：21)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix367(SEQ IDNO：22)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix366(SEQ ID NO：23)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix365(SEQ ID NO：24)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix364(SEQ ID NO：25)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix363(SEQ IDNO：26)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix362(SEQ ID NO：27)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix361(SEQ ID NO：28)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix360(SEQ ID NO：29)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix359(SEQ IDNO：30)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix358(SEQ ID NO：31)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix357(SEQ ID NO：32)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix356(SEQ ID NO：33)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix355(SEQ IDNO：34)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix354(SEQ ID NO：35)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix353(SEQ ID NO：36)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix352(SEQ ID NO：37)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix351(SEQ IDNO：38)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix350(SEQ ID NO：39)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix349(SEQ ID NO：40)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix348(SEQ ID NO：41)。
Cholix毒素结构域Ib(SEQ ID NO：1的氨基酸387-425)对于Cholix的任何已知的活性，包括细胞结合、易位、ER滞留或ADP核糖基化活性不是必不可少的。在多种实施方案中，非天然存在的融合分子包含在Cholix毒素结构域Ib内的氨基酸残基处截短的修饰的Cholix毒素，其中融合分子具有活化生物活性货物的受体的能力。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix415(SEQ ID NO：42)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix424(SEQ ID NO：43)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix423(SEQ ID NO：44)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix422(SEQ ID NO：45)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix421(SEQ ID NO：46)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix420(SEQ ID NO：47)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix419(SEQ IDNO：48)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix418(SEQ ID NO：49)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix417(SEQ ID NO：50)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix416(SEQ ID NO：51)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix415(SEQ IDNO：52)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix414(SEQ ID NO：53)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix413(SEQ ID NO：54)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix412(SEQ ID NO：55)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix411(SEQ IDNO：56)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix410(SEQ ID NO：57)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix409(SEQ ID NO：58)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix408(SEQ ID NO：59)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix407(SEQ IDNO：60)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix406(SEQ ID NO：61)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix405(SEQ ID NO：62)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix404(SEQ ID NO：63)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix403(SEQ IDNO：64)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix402(SEQ ID NO：65)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix401(SEQ ID NO：66)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix400(SEQ ID NO：67)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix399(SEQ IDNO：68)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix398(SEQ ID NO：69)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix397(SEQ ID NO：70)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix396(SEQ ID NO：71)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix395(SEQ IDNO：72)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix394(SEQ ID NO：73)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix393(SEQ ID NO：74)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix392(SEQ ID NO：75)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix391(SEQ IDNO：76)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix390(SEQ ID NO：77)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix389(SEQ ID NO：78)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix388(SEQ ID NO：79)。在一个实施方案中，截短的Cholix毒素为Cholix387(SEQ IDNO：80)。
Cholix毒素结构域III(SEQ ID NO：1的氨基酸426-634)负责细胞毒性并且包括内质网滞留序列。结构域III介导延伸因子2(″EF2″)的ADP核糖基化，其使蛋白合成失活。“缺乏内源性ADP核糖基化活性”的Cholix或“解毒Cholix”指不包含Cholix结构域III或其已在结构域III内以使分子解毒的方式被修饰的本文描述的任何Cholix(包括修饰的变体)。例如，缺失SEQ ID NO：1的氨基酸位置581处的谷氨酸(Glu)残基使分子解毒。该解毒的Cholix被称为“CholixΔE581”。在多种实施方案中，Cholix结构域III的除了ER滞留信号以外的部分可被另一氨基酸序列代替。该氨基酸序列本身可以为非免疫原性的、轻微免疫原性的或高度免疫原性的。高度免疫原性的ER滞留结构域优选用于引发体液免疫应答。例如，Cholix结构域III本身为高度免疫原性的，并且可用于其中期望稳健的体液免疫应答的融合分子中。
如本文使用的，“解毒的Cholix序列”可以为全长序列或全长序列的一个或更多个部分。通常，解毒的Cholix序列具有一个或更多个结构域或具有解毒的Cholix的某些生物活性的结构域的部分，诸如细胞识别结构域、易位结构域或内质网滞留结构域。例如，解毒的Cholix序列可仅包含结构域II和解毒的结构域III。在另一实例中，解毒的Cholix序列可仅包含结构域Ia、结构域II和解毒的结构域III。在另一实例中，解毒的Cholix序列可包含结构域Ia、Ib、II和解毒的结构域III的所有。因此，解毒的Cholix序列可以为天然Cholix的连续序列，或解毒的Cholix序列可以为包含缺乏ADP核糖基化活性的天然Cholix的非连续子序列的序列。在本公开内容的一个实施方案中，非天然存在的融合分子包含具有SEQ IDNO：81中列出的氨基酸序列的突变的修饰的Cholix毒素，本文命名为Cholix毒素ΔE581。
生物活性货物
除了修饰的Cholix毒素多肽以外，本公开内容的融合分子还包含用于递送至受试者的生物活性货物。如本文使用的“生物活性货物”包括，但不限于：大分子、小分子、肽、多肽、核酸、mRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义分子、抗体、DNA、质粒、疫苗、聚合物纳米颗粒或催化活性物质。
在多种实施方案中，生物活性货物为当被引入至受试者的血流时可进行期望的生物活性的大分子。例如，生物活性货物可具有受体结合活性、酶活性、信使活性(即，充当激素、细胞因子、神经递质或其他信号传导分子)、发光或其他可检测的活性或调节活性、或其任何组合。在某些诊断实施方案中，生物活性货物可与药学上可接受的γ-发射部分缀合或本身可以为药学上可接受的γ-发射部分，所述药学上可接受的γ-发射部分包括但不限于，铟和锝、磁性颗粒、不透射线物质诸如空气或钡以及荧光化合物。
在多种实施方案中，融合分子的生物活性货物可在除了受试者的血液以外的受试者的生物区室中发挥其效应。例如，在多种实施方案中，生物活性货物可在淋巴系统中发挥其效应。在其他实施方案中，生物活性货物可在器官或组织中发挥其效应，所述器官或组织诸如，例如，受试者的肝脏、心脏、肺、胰腺、肾、脑、骨髓等等。在此类实施方案中，生物活性货物可以以可检测的浓度或者可以不以可检测的浓度存在于血液、淋巴或其他生物流体中，仍可在其作用位点以足够的浓度累积以发挥生物效应。
在多种实施方案中，生物活性货物为包含多于一个多肽亚基的蛋白。例如，蛋白可以为二聚体、三聚体或更高级多聚体。在多种实施方案中，蛋白的两个或更多个亚基可以共价键，诸如，例如，二硫键连接。在其他实施方案中，蛋白的亚基可以非共价相互作用保持在一起。本领域技术人员可常规地鉴定此类蛋白，并使用，例如，免疫测定确定亚基是否适当地缔合。
在多种实施方案中，待递送的生物活性货物选自，例如，细胞因子和细胞因子受体诸如白细胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、淋巴因子抑制因子、巨噬细胞集落刺激因子、血小板来源的生长因子、干细胞因子、肿瘤生长因子-β、肿瘤坏死因子、淋巴毒素、Fas、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、生长因子及蛋白激素诸如红细胞生成素、血管生成素、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、角质形成细胞生长因子、神经生长因子、肿瘤生长因子-α、血小板生成素、甲状腺刺激因子、甲状腺释放激素、神经营养因子、表皮生长因子、VEGF、睫状神经营养因子、LDL、生长调节素、胰岛素生长因子、胰岛素样生长因子I和II、趋化因子，诸如ENA-78、ELC、GRO-α、GRO-β、GRO-γ、HRG、LEF、IP-10、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MIP-1-α、MIP-1-β、MG、MDC、NT-3、NT-4、SCF、LIF、瘦蛋白(leptin)、RANTES、淋巴细胞趋化因子、嗜酸性粒细胞趋化因子-1(eotaxin-1)、嗜酸性粒细胞趋化因子-2、TARC、TECK、WAP-1、WAP-2、GCP-1、GCP-2；α-趋化因子受体，例如，CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7；以及β-趋化因子受体，例如，CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7。
可根据本公开内容递送的生物活性货物的其他实例包括但不限于，抗肿瘤化合物，诸如亚硝基脲类，例如，卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链脲佐菌素(streptozotocin)；甲基肼类，例如，甲基苄肼、达卡巴嗪；固醇类激素类，例如，糖皮质激素类、雌激素类、黄体激素类(progestin)、雄激素类、四氢脱氧皮质酮(tetrahydrodesoxycaricosterone)；免疫活性化合物，诸如免疫抑制剂，例如，乙胺嘧啶、甲氧苄氨嘧啶(trimethopterin)、青霉胺、环孢霉素、硫唑嘌呤(azathioprine)；以及免疫刺激剂，例如，左旋咪唑、二乙基二硫代氨基甲酸酯、脑啡肽类、内啡肽类；抗微生物化合物，诸如抗生素类，例如β-内酰胺、青霉素、头孢菌素类、碳青霉烯类(carbapenims)以及单酰胺菌素(monobactams)、β-内酰胺酶抑制剂、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、壮观霉素；抗疟药、杀阿米巴药；抗原生动物药(antiprotazoals)；抗真菌剂，例如，两性霉素β；抗病毒药，例如，阿昔洛韦、碘苷、利巴韦林、曲氟尿苷、阿糖腺苷(vidarbines)、更昔洛韦；杀寄生虫药；抗蠕虫药(antihalmintics)；放射治疗剂；胃肠药；血液化合物；免疫球蛋白类；凝血蛋白，例如，抗血友病因子、因子IX复合物；抗凝血剂，例如，双香豆素、肝素Na；溶纤维药抑制剂(fibrolysininhibitor)，例如，氨甲环酸；心血管药物；外周抗肾上腺能药物；中枢作用性抗高血压药，例如，甲基多巴、盐酸甲基多巴；抗高血压性直接血管舒张药(antihypertensive directvasodilator)，例如，二氮嗪、盐酸肼苯哒嗪(hydralazine HCI)；影响肾素-血管紧张素系统的药物；外周血管舒张药，例如，酚妥拉明；抗心绞痛药；强心苷类；变力扩血管药(inodilator)，例如，氨力农、米力农、依诺昔酮、非诺唑酮、伊马唑旦、硫马唑；抗心律失常药；钙进入阻滞剂；影响血脂的药物，例如，雷尼替丁、波生坦、曲格列酮；呼吸系统药物；拟交感神经药(sypathomimetic drugs)，例如，沙丁胺醇、甲磺酸比托特罗、盐酸多巴酚丁胺(dobutamine HCl)、盐酸多巴胺(dopamine HCl)、麻黄碱(ephedrine So)、肾上腺素、盐酸芬氟拉明(fenfluramine HCl)、盐酸异丙肾上腺素(isoproterenol HCl)、盐酸甲氧明(methoxamine HCl)、重酒石酸去甲肾上腺素、盐酸去氧肾上腺素(phenylephrine HCl)、盐酸利托君(ritodrine HCl)；拟胆碱药，例如，氯化乙酰胆碱(acetylcholine Cl)；抗胆碱酯酶，例如，氯化滕喜龙(edrophonium Cl)；胆碱酯酶再激活剂；肾上腺素能阻断剂，例如，盐酸醋丁洛尔(acebutolol HCl)、阿替洛尔、盐酸艾司洛尔(esmolol HCl)、盐酸拉贝洛尔(labetalol HCl)、美托洛尔、纳多洛尔、甲磺酸酚妥拉明、盐酸心得安(propanolol HCl)；抗毒蕈碱药物，例如，甲溴辛托品、硫酸阿托品(atropine SO4)、溴可利啶(clinidium Br)、格隆溴铵、异丙托溴铵(ipratropium Br)、氢溴酸莨菪碱(scopolamine HBr)；神经肌肉阻断药；去极化药物，例如，苯磺酸阿曲库铵、己芴溴铵(hexafluorenium Br)、碘二甲箭毒、氯化琥珀胆碱(succinylcholine Cl)、氯化筒箭毒碱(tubocurarine Cl)、维库溴铵(vecuronium Br)；中枢作用肌肉松弛剂，例如，巴氯芬；神经递质和神经递质药，例如，乙酰胆碱、腺苷、三磷酸腺苷；氨基酸神经递质类，例如，兴奋性氨基酸类、GABA、甘氨酸；生物胺神经递质类，例如，多巴胺、肾上腺素、组胺、去甲肾上腺素、真蛸胺、5-羟色胺、酪胺；神经肽类、一氧化氮、K+通道毒素；抗帕金森病药物，例如，盐酸金刚烷胺(amaltidine HCl)、甲磺酸苯扎托品、卡比多巴；利尿药，例如，双氯非那胺、醋甲唑胺、苄氟噻嗪、泊利噻嗪；抗偏头痛药，例如，甲磺酸卡前列素氨丁三醇(carboprost tromethamine mesylate)、马来酸美西麦角。
可根据本公开内容递送的生物活性货物的仍其他实例包括，但不限于，激素诸如垂体激素，例如，绒毛膜促性腺激素、二十四肽促皮质素(cosyntropin)、促生育素、促生长素、促肾上腺皮质激素、普罗瑞林、促甲状腺激素、血管加压素、赖氨酸加压素(lypressin)；肾上腺激素，例如，二丙酸倍氯米松、倍他米松、地塞米松、曲安西龙；胰腺激素，例如，胰高血糖素、胰岛素；甲状旁腺激素，例如，二氢松香甾醇(dihydrochysterol)；甲状腺激素，例如，降钙素依替膦酸二钠(calcitonin etidronate disodium)、左甲状腺素钠、碘塞罗宁钠(liothyronine Na)、复方甲状腺素(liotrix)、甲状腺球蛋白、乙酸特立帕肽(teriparatide acetate)；抗甲状腺药物；雌激素类(estrogenic hormones)；黄体激素类和拮抗剂类；激素类避孕药；睾丸激素；胃肠激素，例如，缩胆囊素、enteroglycan、甘丙肽(galanin)、抑胃肽、表皮生长因子-尿抑激素、肠抑胃肽、促胃液素释放肽、胃泌素、五肽胃泌素、四肽胃泌素、胃动素、肽YY、促胰液素、血管活性肠肽或辛卡利特。
可根据本公开内容递送的生物活性货物的仍其他实例包括，但不限于，酶，例如，透明质酸酶、链激酶、组织纤溶酶原激活物、尿激酶、PGE-腺苷脱氨酶；静脉麻醉药(intravenous anesthetics)诸如氟哌利多、依托咪酯、枸橼酸芬太尼(fentanylcitrate)/氟哌利多、环己巴比妥、盐酸氯胺酮(ketamine HCl)、美索比妥钠(methohexitalNa)、硫戊巴比妥钠(thiamylal Na)、硫喷妥钠(thiopental Na)；抗癫痫药，例如，卡马西平、氯硝西泮、双丙戊酸钠(divalproex Na)、乙琥胺、美芬妥因(mephenyltoin)、帕腊二酮(paramethadione)、苯妥英(phenyltoin)、扑米酮。在多种实施方案中，生物活性货物为选自以下的酶：透明质酸酶、链激酶、组织纤溶酶原激活物、尿激酶、PGE-腺苷脱氨酶。
可根据本公开内容递送的生物活性货物的又其他实例包括，但不限于，化疗药物，诸如对多种类型的人类癌症有效的化学疗法或抗肿瘤剂，所述癌症包括白血病、淋巴瘤、癌、肉瘤、骨髓瘤等等，所述化学疗法或抗肿瘤剂诸如，例如，多柔比星、丝裂霉素、顺铂、柔红霉素、博来霉素、放线菌素D和新制癌菌素。
炎症调节因子(白细胞介素-10及相关细胞因子)
白细胞介素-10(IL-10)为由许多细胞群产生的重要的免疫调节细胞因子，且其主要生物学功能表现为限制和终止炎症反应，并调节几种免疫细胞的分化和增殖，所述几种免疫细胞诸如T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、抗原呈递细胞、肥大细胞和粒细胞。更近的数据显示，IL-10还介导免疫刺激特性，其有助于消除具有有限炎症的感染性和非感染性颗粒；Asadullah等，Pharmacol Rev，55：241-269，2003。此外，许多研究显示了IL-10在炎症、恶性和自身免疫性疾病中的主要影响，并且发现在某些肿瘤诸如黑素瘤、基底细胞和鳞状细胞癌和几种淋巴瘤中IL-10过表达；同前。已经发现了与IL-10结构相关的五种新的人类分子：IL-19(Gallagher等，Genes Immun.，1：442-450，2000)；IL-20(Blumberg等，Cell，104：9-19，2001)、IL-22(Dumoutier等，Genes Immun.，1：488-494，2000)、IL-24(Jiang等，Oncogene，11：2477-2486，1995)和IL-26(Knappe等，J.Virol.，74：3881-3887，2000)且数据显示，免疫细胞为新的IL-10家族成员的主要来源；Wolk等，J.Immunol.，168：5397-5402，2002。
尽管在实验模型中在几种炎性疾病的过程中存在来自IL-10递送的一些有希望的结果，评价IL-10作为治疗炎症和/或免疫紊乱的治疗剂的几种临床研究仍然有些令人失望，其中许多数据冲突；Asadullah等，Asadullah等，Pharmacol Rev，55：241-269，2003。总的来说，数据显示，IL-10是安全的并且通常是良好耐受的，然而，在用标准剂量全身施用之后，肠内的最终局部IL-10浓度太低，仅导致边际效力。同前。不幸地，足够增加剂量的能力由于副作用(例如，贫血、头痛)而受到限制，并且存在更高剂量的全身施用的IL-10在某些适应症，例如，克罗恩病中可能是有害的而不是有益的忧虑；Herfarth等，Gut，50(2)：146-147，2002。
在多种实施方案中，生物活性货物为已被确定为GI道中的选自以下的炎症调节因子的多肽：例如，白细胞介素-10、白细胞介素-19、白细胞介素-20、白细胞介素-22、白细胞介素-24、或白细胞介素-26。
白细胞介素-10(IL-10)首先被鉴定为2型辅助T细胞的产物，且后来显示由包括B细胞和巨噬细胞的其他细胞类型产生(Moore等，Annu Rev Immunol，19：683-765，2001)。它还抑制由1型辅助T细胞产生的几种细胞因子，诸如γ-干扰素、IL-2和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的合成(Fiorentino等，J Immunol，146：3444-3451，1991)。IL-10抑制细胞介导的免疫应答调节因子和抑制抗原呈递细胞依赖性T细胞应答的能力证明IL-10具有免疫抑制特性。该细胞因子还抑制单核细胞/巨噬细胞产生其他细胞因子诸如IL-1、IL-6、IL-8、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、和TNF-α。
IL-10蛋白形成功能性二聚体，其在破坏连接它的两个单体亚基的非共价相互作用后变成生物学上失活的。N-末端不表现为直接参与IL-10受体活化。因此，在本公开内容的一个方面，融合分子经由使用可裂解的接头通过IL-10蛋白的N-末端与修饰的Cholix毒素的C-末端的缀合来构建。此类构建可由于IL-10相互作用而导致溶液二聚体。
在多种实施方案中，生物活性货物为具有SEQ ID NO：82中列出的氨基酸序列的人类白细胞介素-10或其片段或变体：
MHSSALLCCLVLLTGVRASPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN(SEQ ID NO：82)
在多种实施方案中，生物活性货物包含与SEQ ID NO：82的序列共享，例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％的观察到的同源性的氨基酸序列。
IL-19为属于IL-10细胞因子亚家族的细胞因子。发现该细胞因子优先在单核细胞中表达。它可结合IL-20受体复合物并导致信号转导因子和转录激活因子3(STAT3)的活化(Yamamoto-Furusho JK，等Hum Immunol，72(11)：1029-32，2011)。在多种实施方案中，生物活性货物为具有SEQ ID NO：83中列出的氨基酸序列的人类白细胞介素-19或其片段或变体：
MKLQCVSLWLLGTILILCSVDNHGLRRCLISTDMHHIEESFQEIKRAIQAKDTFPNVTILSTLETLQIIKPLDVCCVTKNLLAFYVDRVFKDHQEPNPKILRKISSIANSFLYMQKTLRQCQEQRQCHCRQEATNATRVIHDNYDQLEVHAAAIKSLGELDVFLAWINKNHEVMSSA(SEQ ID NO：83)
在多种实施方案中，生物活性货物包含与SEQ ID NO：83的序列共享，例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％的观察到的同源性的氨基酸序列。
IL-20为与白细胞介素10(IL-10)结构相关的细胞因子。该细胞因子已显示在角质形成细胞中通过信号转导因子和转录激活因子3(STAT3)转导其信号。发现该细胞因子的特异性受体在皮肤中表达并在银屑病皮肤中显著上调，表明该蛋白在表皮功能和银屑病中起作用(Yamamoto-Furusho JK，等Immunol Lett，149(1-2)：50-32013)。在多种实施方案中，生物活性货物为具有SEQ ID NO：84中列出的氨基酸序列的人类白细胞介素-20或其片段或变体：
MKASSLAFSLLSAAFYLLWTPSTGLKTLNLGSCVIATNLQEIRNGFSEIRGSVQAKDGNIDIRILRRTESLQDTKPANRCCLLRHLLRLYLDRVFKNYQTPDHYTLRKISSLANSFLTIKKDLRLCHAHMTCHCGEEAMKKYSQILSHFEKLEPQAAVVKALGELDILLQWMEETE(SEQ ID NO：84)
在多种实施方案中，生物活性货物包含与SEQ ID NO：84的序列共享，例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％的观察到的同源性的氨基酸序列。
IL-22为与白细胞介素10(IL-10)结构相关的细胞因子。分泌IL-22的CD4(+)T(Th22)细胞和IL-22参与自身免疫性疾病的发病机理，并且可能在NMO和MS的发病机理中起重要作用(Xu等，J Neuroimmunol.，Aug 15；261(1-2)：87-91，2013)。在多种实施方案中，生物活性货物为具有SEQ ID NO：85中列出的氨基酸序列的人类白细胞介素-22或其片段或变体：
MAALQKSVSSFLMGTLATSCLLLLALLVQGGAAAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI(SEQ ID NO：85)
在多种实施方案中，生物活性货物包含与SEQ ID NO：85的序列共享，例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％的观察到的同源性的氨基酸序列。
IL-24为与白细胞介素10(IL-10)结构相关的细胞因子，其可在多种癌细胞中选择性诱导细胞凋亡。该基因的过表达导致几种与诱导凋亡相关的GADD家族基因的表达升高。发现促分裂原活化蛋白激酶14(MAPK7/P38)和热休克27kDa蛋白1(HSPB2/HSP27)的磷酸化由该基因在黑素瘤细胞中诱导，但不在正常永生黑素细胞中诱导(Lin BW，等，J KoreanMed Sci，28(6)：833-9，2013)。在多种实施方案中，生物活性货物为具有SEQ ID NO：86中列出的氨基酸序列的人类白细胞介素-24或其片段或其变体：
MNFQQRLQSLWTLASRPFCPPLLATASQMQMVVLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL(SEQ ID NO：86)
在多种实施方案中，生物活性货物包含与SEQ ID NO：86的序列共享，例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％的观察到的同源性的氨基酸序列。
IL-26通过其在松鼠猴疱疹病毒转化的T细胞(herpesvirus saimiri-transformed T cells)中的特异性过表达来鉴定。编码的蛋白为IL-10细胞因子家族的成员。它为分泌性蛋白，并可作为同型二聚体起作用。这种蛋白被认为有助于由松鼠猴疱疹病毒(herpesvirus saimiri)感染之后的T细胞的转化表型(Corvaisier M，等PLoS Biol，10(9)：e1001395，2012)。在多种实施方案中，生物活性货物为具有SEQ ID NO：87中列出的氨基酸序列的人类白细胞介素-26或其片段或其变体：
MLVNFILRCGLLLVTLSLAlAKHKQSSFTKSCYPRGTLSQAVDALYIKAAWLKATIPEDRIKNIRLLKKKTKKQFMKNCQFQEQLLSFFMEDVFGQLQLQGCKKIRFVEDFHSLRQKLSHCISCASSAREMKSITRMKRIFYRIGNKGIYKAISELDILLSWIKKLLESSQ(SEQ ID NO：87)
在多种实施方案中，生物活性货物包含与SEQ ID NO：87的序列共享，例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％的观察到的同源性的氨基酸序列。
重要地，缺乏可裂解的接头的非天然存在的融合分子可以是有利的，因为修饰的Cholix毒素被在，例如，还表达IL-10受体(但以相当低的量)的免疫细胞的表面处的其一种或更多种受体的锚定效应可允许IL-10在靶向的细胞表面处的更大暴露，并且经由Cholix与其受体的结合和IL-10与IL-10R的结合而提供协同效应。
肿瘤坏死因子超家族
肿瘤坏死因子为与对应的受体超家族(下文称为“TNFSFR”)相互作用的快速增长的细胞因子超家族(下文称为“TNFSF”)。自从约25年前发现肿瘤坏死因子-α(“TNF-αα”)以来，TNFSF已增长为由超过20个成员组成的相关蛋白的大家族，其通过超过30种受体发信号(参见，例如，由Iqbal S.Grewal编著的“Therapeutic Targets of the TNFSuperfamily”，Landes Bioscience/Springer Science+Business Media，LLC dualimprint/Springer series：Advances in Experimental Medicine and Biology，2009)。TNFSF的成员具有广泛的组织分布，并且TNFSF配体-受体相互作用参与许多生物过程，范围为从造血作用至多效性细胞应答，包括活化、增殖、分化和凋亡。TNFSF配体-受体相互作用还已牵涉到肿瘤发生、移植排斥、脓毒性休克、病毒复制、骨吸收和自身免疫中。特定的应答取决于发信号的受体、细胞类型和由细胞接收的并发信号。
因为许多TNFSF成员在肿瘤细胞上表达，正在开发基于抗体的疗法来靶向这些分子，并且一些目前正在经历临床试验(例如，TNF-α用于人类在治疗肉瘤和黑素瘤中使用)(Eggermont等，Lancet Oncol，4：429-437，2003；Lans等，Clin Cancer Res，7：784-790，2001)。另外，许多这些分子也被开发作为用于抗体-药物缀合物的靶(例如，CD30和CD70)或开发用于放射免疫疗法的靶(例如，BLyS受体TACI和BR3)(Buchsbaum等，J Nucl Med，44：434-436，2003)。
相似地，因为许多TNFSF成员牵涉到先天性免疫应答和适应性免疫应答两者，诸如针对病原体的防御、炎症反应和自身免疫中，正在开发靶向许多TNFSF受体和配体以用于治疗自身免疫性疾病和其他炎性疾病的方法。实际上，已经开发了包括人源化/人类单克隆抗体(例如，英夫利昔单抗(infliximab)或阿达木单抗(adalimumab))或IgG和可溶性TNFSF受体的重组融合蛋白(例如，依那西普)的许多生物TNF阻断疗法(下文称为“TNF抑制剂”)，并且现在正用于人类以抑制与克罗恩病和类风湿性关节炎相关的炎症(Mitoma等，Arthritis Rheum，58：1248-1257，2008；Shealy等，Handb Exp Pharmacol，181：101-129，2008)。因此，包括，但不限于，肠和肺粘膜的局部递送此类试剂的潜力，将提供效力和安全性的另外的益处。
尽管这些多种TNF抑制剂已被批准用于人类疗法并且正被成功地用于人类患者，但仍存在与这些TNF抑制剂相关的许多毒性，例如，肝脏毒性、血栓栓塞并发症和增加的发展结核病和淋巴瘤的风险(Gardam等，Lancet Infect Dis，3：148-155，2003)。此外，尽管有效地停止疾病的进展，但这些试剂非常昂贵，通常静脉内或皮下施用，并且不治愈疾病。需要继续检查TNFSF成员的信号转导以开发用于组织特异性干预的方法，这可允许靶向疗法具有更少的副作用。
在多种实施方案中，生物活性货物为是分离的抗体或抗体片段的TNF抑制剂。可用在本发明的构建体和方法中的分离的抗体和抗体片段包括，但不限于，单克隆Ab(mAb)、多克隆Ab、Ab片段(例如，Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fc等等)、嵌合Ab、微型-Ab或结构域Ab(dAb)、双重特异性Ab(dual specific Ab)、双特异性Ab(bispecific Ab)、异源缀合Ab(heteroconjugate Ab)、单链Ab(SCA)、单链可变区片段(ScFv)、包含Ab部分或多个Ab部分的融合蛋白、人源化Ab、完全人类Ab、以及包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白(Ig)分子的任何其他修饰的构型。
抗-TNF-α抗体。FDA批准的抗-TNF-α抗体阿达木单抗(AbbvieDrugBank DB 00051)已被用来治疗人类。在本发明的多种实施方案中，生物活性货物为人类抗体或抗原结合片段或其抗原结合或免疫功能性免疫球蛋白片段，该人类抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：88中列出的重链可变区序列：
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVERGFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC(SEQ IDNO：88)
和SEQ ID NO：89中列出的轻链可变区序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：89)
在多种实施方案中，本发明提供了抗体，所述抗体包含重链和轻链，其中重链包含重链可变区，并且其中重链可变区包含与如SEQ ID NO：88中列出的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％同一性的序列；且其中轻链包含轻链可变区，并且其中轻链可变区包含与如SEQ ID NO：89中列出的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％同一性的序列；其中抗体与人类TNF-α特异性结合。
FDA批准的抗-TNF-α抗体英夫利昔单抗(Centocor DrugBank DB00065)已被用来治疗人类。在本发明的多种实施方案中，生物活性货物为人类抗体或抗原结合片段或其抗原结合或免疫功能性免疫球蛋白片段，该人类抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：90中列出的重链可变区序列：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAIISFDGSNKSSADSVKGRFTUSRRNSKNALFLQMNSLRAEDTAVFYCARDRGVSAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：90)
和SEQ ID NO：91中列出的轻链可变区序列：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTRFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIL(SEQ ID NO：91)
在多种实施方案中，本发明提供了抗体，所述抗体包含重链和轻链，其中重链包含重链可变区，并且其中重链可变区包含与如SEQ ID NO：90中列出的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％同一性的序列；且其中轻链包含轻链可变区，并且其中轻链可变区包含与如SEQ ID NO：91中列出的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％同一性的序列；其中抗体与人类TNF-α特异性结合。
针对几种其他TNFSF配体或TNFSFR的抗体已在文献中描述，并且在治疗或预防多种炎性疾病、自身免疫性疾病和癌症中作为治疗候选物来评价。针对指定的TNFSF多肽或TNFSFR的抗体的核苷酸和氨基酸序列可容易地从公众可获得的数据库中获得。此类抗体以及另外的TNF抑制剂的综合述评在以下中提供：由Iqbal S.Grewal编著的“TherapeuticTargets of the TNF Superfamily”，Landes Bioscience/Springer Science+BusinessMedia，LLC dual imprint/Springer series：Advances in Experimental Medicine andBiology，2009，出于教导此类TNF抑制剂的目的，其通过引用以其整体特此并入。
在多种实施方案中，生物活性货物为包含可溶性受体或可溶性共配体的TNFSF抑制剂。术语“可溶性受体”、“可溶性细胞因子受体”(SCR)和“免疫粘附素”可互换使用，指包含受体(例如，TNFSF成员的受体)的细胞外结构域和Ig序列的可溶性嵌合分子，其保留受体的结合特异性并能够结合TNFSF成员。在多种实施方案中，TNFSFSCR包含来自能够结合TNFSF成员的TNFSF成员细胞外结构域的TNFSFR氨基酸序列(或其部分)(在一些实施方案中，基本上保留了TNFSFR的结合特异性的氨基酸序列)和Ig序列的融合物。已知存在两种不同类型的TNFSFR：I型TNFSFR(TNFSFRI)和II型TNFSFR(TNFSFRII)。在多种实施方案中，TNFSF受体为人类TNFSF受体序列，并且融合物具有Ig恒定结构域序列。在其他实施方案中，Ig恒定结构域序列为Ig重链恒定结构域序列。在其他实施方案中，两种TNF受体-Ig重链融合物的缔合(例如，经由通过一个或更多个二硫键的共价连接)导致同二聚体Ig样结构。
可用于本发明中的商购可得的可溶性受体的实例为(依那西普)。由重组人类TNFR-p75-Fc二聚体融合蛋白组成，该重组人类TNFR-p75-Fc二聚体融合蛋白由与人IgG1的Fc部分连接的人75千道尔顿(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的细胞外配体结合部分组成。依那西普的Fc组分包含CH2结构域、CH3结构域和铰链区，但不包含IgG1的CH1结构域。依那西普通过重组DNA技术在中国仓鼠卵巢(CHO)哺乳动物细胞表达系统中产生。它由934个氨基酸组成。通过编码人类TNFR-p75的可溶性部分与IgG的Fc部分的DNA制备产物。在本发明的多种实施方案中，生物活性货物为TNF抑制剂，其为包含SEQ IDNO：92中列出的序列的二聚体融合蛋白或其片段或变体：
LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：92)
在多种实施方案中，生物活性货物包含与SEQ ID NO：92的序列共享至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％的观察到的同源性的氨基酸序列。
在表2中提供了适合的TNFSF配体和TNFSFR的说明性、但非限制性列表，其中TNF抑制剂将来源于TNFSF配体和TNFSFR并用作本发明的构建体和方法中的生物活性货物。
表2
降葡萄糖剂
在多种实施方案中，生物活性货物为降葡萄糖剂。在多种实施方案中，降葡萄糖剂为包含以下的肽：约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约11个、约12个、约13个、约14个、约15个、约16个、约17个、约18个、约19个、约20个、约25个、约30个、约35个、约40个、约45个、约50个、约55个、约60个、约65个、约70个、约75个、约80个、约85个、约90个、约95个、约100个、约150个、约200个、约250个、约300个、约400个、约500个、约600个、约700个、约800个、约900或约1000个氨基酸。
在表3中提供了待用作本公开内容的融合分子中的降葡萄糖剂、或者预期用作降葡萄糖剂的降葡萄糖剂可来源于其的适合的葡萄糖代谢相关蛋白的说明性、但非限制列表。
表3
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)，是通过胰高血糖素前体前胰高血糖素原的组织特异性翻译后加工在肠L-细胞中合成的前胰高血糖素肠降血糖素家族的成员，是牵涉到控制食欲和饱腹感中的有效的降葡萄糖剂。GLP-1通过广泛分布于组织，包括脑、胰腺、肠、肺、胃和肾中的GLP-1受体(GLP-1R)起作用。GLP-1的效应表现为促胰岛素和胰岛素模拟物(insulinomimetic)两者，这取决于环境葡萄糖浓度。由于它们增加来自胰腺的胰岛素分泌、增加α细胞和β细胞两者中的胰岛素敏感度、并降低来自胰腺的胰高血糖素分泌的能力，GLP-1及其类似物作为糖尿病的治疗策略引起了相当大的关注。
几个临床试验已研究了添加GLP-1激动剂结合正在进行的胰岛素疗法，并且已批准几种GLP-1激动剂用于治疗T2D，几种GLP-1激动剂包括，例如，艾塞那肽(商标名Amylin/Astrazeneca)；利拉鲁肽(商标名Novo Nordisk A/S)；利西拉来(lixisenatide)(商标名Sanofi)；阿必鲁泰(albiglutide)(商标名GlaxoSmithKline)；度拉糖肽(dulaglutide)(商标名EliLilly)。尽管被证明是有效的，与临床使用GLP-1激动剂相关的主要缺点是短的生物半衰期，需要静脉内或通过频繁的皮下注射连续施用，且迄今批准的所有GLP-1药物被基于皮下施用每天两次或每周一次。此外，存在与这些GLP-1激动剂的使用相关的安全性忧虑，即，胰腺炎和胰腺瘤形成、低血糖症和肾损伤。其他报道的副作用包括胃肠紊乱，诸如消化不良、食欲降低、恶心、呕吐、腹痛、腹泻、头晕、头痛和感觉紧张。因此，继续进行涉及制备更持久的天然GLP-1类似物的深入研究，以及持续释放和其他相关技术的开发，以降低T2D患者的注射频率。
在多种实施方案中，生物活性货物为具有SEQ ID NO：93中列出的氨基酸序列的GLP-1激动剂或其片段或变体：
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：93)
在多种实施方案中，生物活性货物包含与SEQ ID NO：93的序列共享，例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％的观察到的同源性的氨基酸序列。
在多种实施方案中，生物活性货物为具有SEQ ID NO：94中列出的氨基酸序列的GLP-1激动剂或其片段或变体：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEEFIIAWLVKGRG(SEQ ID NO：94)
在多种实施方案中，生物活性货物包含与SEQ ID NO：94的序列共享，例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％的观察到的同源性的氨基酸序列。
人类生长激素
生长激素(GH)(也称为生长激素(somatropin)或促生长素(somatotropin))是人体中的主要激素，并由内分泌系统合成和分泌。这种激素控制基本功能，如：在身体的多种器官中的细胞的生长和复制。GH的一些基本功能包括：控制肌肉生长、改进骨矿化和强度、降低脂肪沉积和维持良好的能量水平。生长激素的产生和分泌由生长激素释放激素(GHRH)控制，生长激素释放激素(GHRH)由下丘脑分泌。GHRH刺激垂体腺(pituitary gland)产生GH，GH被直接释放到血流中。GH转而刺激肝脏产生胰岛素样生长因子(IGF-1)，其刺激软骨细胞(chondrocytes)(软骨细胞(cartilaginous cells))的增殖、促进成肌细胞的分化并增强蛋白质合成，这转而有助于其他肌肉和组织细胞的生长。
在美国，合成产生的人类生长激素(HGH)已用于儿科群体中以治疗由于生长激素缺乏(GHD)的身材矮小、特纳综合征(TS)、Noonan综合征、Prader-Willi综合征、包含身材矮小同源盒基因(SHOX)的缺乏、慢性肾功能不全、特发性身材矮小和小于胎龄的儿童(children small for gestational age)。在成人中，HGH已用来治疗短肠综合征，由于罕见的垂体肿瘤或它们的治疗的GH缺乏，以及与HIV/AIDS相关的肌肉消耗性疾病，短肠综合征是其中由于严重的肠道疾病或手术切除大部分小肠而导致营养物没有被适当地吸收的状况。
生长激素缺乏(GHD)为一种罕见紊乱，其包括一组不同的病理学，其以来自垂体前腺(anterior pituitary gland)(位于负责产生几种激素的脑基底的小腺体)的生长激素(GH)的分泌不足为特征。GHD可单独发生或与其他垂体激素缺乏组合发生。GHD可以是从出生存在的(先天性)或作为创伤、浸润、肿瘤或放射疗法的结果获得的。存在未知原因的第三类(特发性)。儿童发病的GHD可以是全部三种：先天性、获得性或特发性。它导致生长迟缓、身材矮小和成熟延迟，反映为与儿童的实际年龄(chronological age)不相符的肢体骨骼的延长的延迟。成人发病的GHD最常获自垂体肿瘤或脑创伤，但也可能是特发性的。其以多种可变症状为特征，包括降低的能量水平、改变的身体组成、骨质疏松(降低的骨矿物质密度)、降低的肌肉强度、脂质异常诸如增加的LDL或胆固醇水平、胰岛素抵抗和受损的心脏功能。估计成人GHD每年影响10万分之1的人，而当考虑儿童发病的GHD患者时，其发病率为每10万人群中约2例。约15％-20％的病例代表儿童GHD转化为成年GHD(Stochholm K等，Eur JEndocrinol.，155：61-71，2006)。
特纳(或Ullrich-Turner)综合征(TS)为染色体异常，其以缺乏整个X染色体或该染色体内的缺失为特征并影响雌性发育。特纳综合征最常见的特征为身材矮小，大约5岁时变得明显。在全世界，这种状况发生在约2,500分之1的新生女婴中，但它在未存活到期限的怀孕(流产和死胎)中更常见。作为染色体状况，不存在特纳综合征的治愈。
重组DNA来源的人类生长激素是唯一被批准专门用于治疗GHD和TS的药物。截至2005年，在美国多种重组人类生长激素(也称为注射用生长激素(somatropin)[rDNA起源])是可用的，(且它们的制造商)包括(Genentech)、(Lilly)、(Pfizer)、(Novo)和(MerckSerono)。在2006年，美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)(FDA)批准了免为(Sandoz)的rHGH版本。持续释放形式的人类生长激素，NUTROPIN(Genentech/Alkermes)于1999年被FDA批准，允许较少的注射(每2或4周而不是每天)；然而，由于财务原因，该产品在2004年被Genentech/Alkermes停产。另外的批准的重组HGH产品包括用于短肠综合征的(EMD Serono)、(Teva)和(Merck Serono)。
尽管被证明是用于管理生长紊乱诸如GHD的最有效、自发的和可信的治疗选择，这些可注射的rHGH具有一些显著的限制，包括，例如，1)与长期使用和高剂量相关的并发症，其是严重和不可逆的，且包括，例如，发展糖尿病、心血管紊乱和结肠癌的可能性。其他常见的副作用包括：关节疼痛、全身性水肿、严重头痛、低血糖症、腕关节疼痛(腕管综合征)、血液中增加的LDL水平，增加发展动脉粥样硬化的可能性等等；2)HGH注射并非作为非处方药(over the counter)可得的，然而，由于僵硬的FDA规范，黑市销售猖獗。没有医学处方的HGH注射的采购被认为是非法的，并且可依法惩罚、监禁和罚款；以及3)治疗的费用过高。取决于制药公司，用于一个月治疗的HGH注射的费用范围通常在800至3000美元之间。最后，使用rHGH的常规方法通常牵涉多剂量方案，其中经由皮下注射施用HGH。与此类方法相关的不便、痛苦和社会污名可以是相当大的。用这些高度侵入性和重复性疗法来治疗由于生长激素缺乏(GHD)的身材矮小、特纳综合征(TS)和相关紊乱的儿科群体的管理可以是特别困难的。
全长人类HGH由191个氨基酸组成。使用分子生物学技术产生的HGH可具有与天然存在的HGH相同的氨基酸序列。可选地，使用的HGH可以是相对于天然激素包含一个或更多个氨基酸序列变异的HGH类似物。这些氨基酸变异可提供增强的生物活性或一些其他生物学或逻辑优势(logistical advantages)。在多种实施方案中，重组HGH包含Genbank登录号P01241中列出的氨基酸序列。HGH氨基酸序列(不含P01241的26aa信号序列)示于SEQ IDNO：95中：
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQ ID NO：95)
本公开内容的HGH指来自具有SEQ ID NO：95的序列的任何来源的HGH，包括从任何来源产生或化学合成，例如使用固相合成化学合成的分离的、纯化的和/或重组的HGH。本文还包括天然HGH的保守性氨基酸取代。例如，可进行保守性氨基酸改变，其中尽管它们改变蛋白或肽的一级序列，但通常不改变其功能。保守性氨基酸取代通常包括在以下组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在多种实施方案中，HGH具有与SEQ IDNO：95的序列共享，例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％的观察到的同源性的氨基酸序列。
在多种实施方案中，预期用于本公开内容的融合分子中的HGH包括已经在本领域中广泛描述的人类生长激素变体和突变体(参见，例如美国专利第8,637,646号(Wells等)及其中引用的参考文献，以及第US 20110130331号(Guyon等)，出于提供此类生长激素变体和突变体的具体目的，各自通过引用整体并入本文)。
在多种实施方案中，预期用于本公开内容的融合分子中的HGH包括，例如，(Genentech)、(Lilly)、(Pfizer)、(Novo)、(Merck Serono)、(Sandoz)、(EMD Serono)、(Teva)和(MerckSerono)。
在表4中提供了待用作本公开内容的融合分子中的生长激素、或者预期用作生长激素的生长激素可来源于其的适合的生长激素蛋白的说明性、但非限制列表。
表4
生长激素相关蛋白 RefSeq(NCBI/Uniprot)
促生长素 P01241
合成的人类生长激素 AAA72260.1
合成的人类生长激素部分 CAA01435
合成的人类生长激素部分 CAA00380
人类生长激素2 P01242
促生长素释放素 P01286.1
食欲调节激素 Q9UBU3
瘦蛋白 P41159
生长激素受体蛋白
生长激素受体 P10912
生长激素释放激素受体 Q02643
生长激素促分泌素受体 Q92847
生长激素释放激素受体形式a P78470
生长激素受体 E9PCN7
用于附连生物活性货物的插入位点
融合分子的生物活性货物可通过本领域技术人员已知的任何方法附连至融合分子的剩余部分，且不限于此。可将生物活性货物引入到融合分子的、不破坏修饰的Cholix毒素的细胞结合或转胞吞活性的任何部分。在多种实施方案中，生物活性货物与修饰的Cholix毒素的N-末端或C-末端直接偶联。在多种实施方案中，生物活性货物可与修饰的Cholix毒素的氨基酸的侧链连接。在多种实施方案中，生物活性货物与修饰的Cholix用不可裂解的肽接头偶联。在多种实施方案中，生物活性货物与修饰的Cholix毒素用可裂解的接头偶联，使得在一个或更多个可裂解的接头处的裂解将生物活性货物与融合分子的剩余部分分离。在多种实施方案中，生物活性货物为还可包含在裂解可裂解的接头后保持与多肽附连的短前导肽的多肽。例如，生物活性货物可包含以下的短前导肽：大于1个氨基酸、大于5个氨基酸、大于10个氨基酸、大于15个氨基酸、大于20个氨基酸、大于25个氨基酸、大于30个氨基酸、大于50个氨基酸、或大于100个氨基酸。在一些情况下，生物活性货物可包含以下的短前导肽：少于100个氨基酸、少于50个氨基酸、少于30个氨基酸、少于25个氨基酸、少于20个氨基酸、少于15个氨基酸、少于10个氨基酸、或少于5个氨基酸。在一些情况下，生物活性货物可包含以下的短前导肽：介于1-100个氨基酸之间、介于5-10个氨基酸之间、介于10-50个氨基酸之间、或介于20-80个氨基酸之间。在天然Cholix毒素中，结构域Ib环跨越氨基酸387至425，并且在结构上以位置395和402处的两个半胱氨酸之间的二硫键为特征。Cholix毒素的该结构域Ib部分，对于Cholix毒素的任何已知的活性，包括细胞结合、易位、ER滞留或ADP核糖基化活性不是必不可少的。因此，结构域Ib可被完全缺失或被修饰以包含生物活性货物。因此，在多种实施方案中，生物活性货物可被插入到Cholix毒素结构域Ib中。如果需要，可将生物活性货物插入到在未交联的位置395和402处的半胱氨酸之间的Cholix毒素结构域Ib中。这可通过以下来实现：通过还原半胱氨酸之间的二硫键，通过从Ib结构域中完全缺失一个或两个半胱氨酸，通过将一个或两个半胱氨酸突变为其他残基，例如，丝氨酸，或通过其他类似技术。可选地，可将生物活性货物插入到在位置395和402处的半胱氨酸之间的结构域Ib环中。在此类实施方案中，在半胱氨酸之间的二硫键可用来约束生物活性货物结构域。
在其中生物活性货物与融合分子的另一部分一起作为融合蛋白表达的实施方案中，生物活性货物可通过本领域技术人员已知的任何方法插入到融合分子中，且不限于此。例如，对应于生物活性货物的氨基酸可直接被插入到融合分子中，并带有或没有天然氨基酸序列的缺失。在多种实施方案中，Cholix毒素的Ib结构域的全部或部分可被缺失并被生物活性货物代替。在多种实施方案中，Ib环的半胱氨酸残基被缺失，使得生物活性货物保持不受约束。在其他实施方案中，Ib环的半胱氨酸残基以二硫键连接并约束生物活性货物。
在其中生物活性货物不与融合分子的剩余部分一起作为融合蛋白表达的实施方案中，生物活性货物可与融合分子的剩余部分通过本领域技术人员已知的任何适合的方法连接，且不限于此。更具体地，以上描述的用于将受体结合结构域与分子的剩余部分连接的示例性方法同样适用于将生物活性货物与分子的剩余部分连接。
融合蛋白的产生
在多种实施方案中，非天然存在的融合分子使用重组DNA方法合成。通常，这包括创造编码融合分子的DNA序列，将DNA放置在特定启动子控制下的表达盒中，在宿主中表达该分子，分离表达的分子，并且如果需要，使分子复性。
编码本文描述的融合分子(例如Cholix415-IL-10)的DNA可通过任何适合的方法制备，包括，例如，克隆和限制适当的序列或通过以下方法直接化学合成：诸如Narang等(1979)Meth.Enzymol.68：90-99的磷酸三酯方法；Brown等(1979)Meth.Enzymol.68：109-151的磷酸二酯方法；Beaucage等(1981)Tetra.Lett.，22：1859-1862)的二乙基亚磷酰胺方法；美国专利第4,458,066号的固体支持方法等。
化学合成产生单链寡核苷酸。这可通过与互补序列杂交或通过使用单链作为模板用DNA聚合酶聚合而被转化为双链DNA。本领域技术人员将认识到，尽管化学合成的DNA被限制为约100个碱基的序列，较长序列可通过较短序列的连接获得。
可选地，可克隆子序列，并使用适当的限制性内切酶裂解适当的子序列。然后可连接片段以产生期望的DNA序列。
在多种实施方案中，编码本公开内容的融合分子的DNA可使用DNA扩增方法诸如聚合酶链式反应(PCR)克隆。因此，例如，使用包含，例如，NdeI的限制性位点的有义引物和包含HindIII限制性位点的反义引物，对IL-10的基因进行PCR扩增。这可产生编码成熟IL-10序列并具有末端限制性位点的核酸。具有“互补”限制性位点的修饰的Cholix毒素可相似地被克隆，并然后与IL-10和/或附连至IL-10的接头连接。连接核酸序列并插入到载体产生编码与修饰的Cholix毒素连接的IL-10的载体。
不可裂解的接头
在多种实施方案中，修饰的Cholix毒素和生物活性货物可通过由一个或更多个氨基酸(例如，多达至25个氨基酸)组成的肽间隔区分离。通常，除了连接蛋白或保持它们之间的一定最小距离或其他空间关系以外，间隔区将不具有特殊的生物活性。然而，在多种实施方案中，可选择间隔区的组成氨基酸以影响分子的一些特性，诸如折叠、净电荷或疏水性。
在多种实施方案中，接头能够与Cholix毒素和生物活性货物两者形成共价键。适合的接头是本领域技术人员熟知的，并包括，但不限于，直链或支链碳接头、杂环碳接头或肽接头。在多种实施方案中，一个或更多个接头可与Cholix毒素和/或生物活性货物的组成氨基酸通过它们的侧基(例如，通过二硫键与半胱氨酸)连接。在多种实施方案中，接头与Cholix毒素和/或生物活性货物的末端氨基酸的α碳氨基和/或羧基基团连接。
具有与Cholix毒素上的基团反应性的一个官能团和对生物活性货物上的基团反应性的另一个基团的双官能接头可用来形成期望的缀合物。可选地，衍生化可包括靶向部分的化学处理。用于在多肽，诸如，抗体或抗体片段上产生，例如，自由巯基的程序是已知的(参见美国专利第4,659,839号)。
用于将包括放射性核素金属螯合物、毒素和药物的多种化合物与蛋白诸如抗体附连的许多程序和接头分子是已知的。参见，例如，欧洲专利申请第188,256号；美国专利第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784号；第4,680,338号；第4,569,789号；和第4,589,071号；以及Borlinghaus等(1987)Cancer Res.47：4071-4075。
在多种实施方案中，待递送至受试者的生物活性货物与修饰的Cholix毒素使用包含以下的一种或更多种不可裂解的肽接头偶联：例如，氨基酸序列GGGGS(SEQ ID NO：96)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：97)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：98)、或GGGGSGGG(SEQ ID NO：99)，其中修饰的Cholix毒素将所述生物活性货物靶向特定细胞，包括但不限于，免疫系统细胞，诸如巨噬细胞、抗原呈递细胞和树突细胞。
可裂解的接头
在多种实施方案中，待递送至受试者的生物活性货物与修饰的Cholix毒素使用一种或更多种可裂解的接头偶联。存在于融合分子中的可裂解的接头的数目至少部分地取决于生物活性货物相对于修饰的Cholix毒素的位置和生物活性货物的性质。当生物活性货物可通过在单个接头处裂解而与融合分子的剩余部分分离时，融合分子可包含单个可裂解的接头。此外，当生物活性货物为，例如，二聚体或其他多聚体时，生物活性货物的每个亚基可通过在可裂解的接头处裂解而与融合分子的剩余部分和/或生物活性货物的其他亚基分离。
在多种实施方案中，可裂解的接头可通过存在于上皮细胞的基底外侧膜处或附近的裂解酶裂解。通过选择将被此类酶裂解的可裂解的接头，生物活性货物可在跨粘膜转胞吞，并从上皮细胞释放到膜的基底外侧上的细胞基质中后从融合分子的剩余部分释放。此外，可使用存在于上皮细胞内部的裂解酶，使得可裂解的接头在融合分子从基底外侧膜释放之前被裂解，只要裂解酶在融合分子进入极化上皮细胞中的导致融合分子和生物活性货物从细胞的基底外侧膜释放的运输途径之前不裂解融合分子。
在多种实施方案中，存在于极化上皮细胞的基底外侧膜的酶选自，例如，组织蛋白酶GI、胰凝乳蛋白酶I、弹性蛋白酶I、枯草杆菌蛋白酶AI、枯草杆菌蛋白酶AII、凝血酶I或尿激酶I。表5示出了这些酶连同被特定肽酶识别和裂解的氨基酸序列。
表5
基底外侧粘膜附近或转胞吞途径的稍后方面中存在的肽酶
在多种实施方案中，可裂解的接头表现出比递送构建体的剩余部分大的裂解倾向。如本领域技术人员知道的，许多肽和多肽序列可以被肽酶和蛋白酶裂解。在多种实施方案中，选择相对于在施用递送构建体期间存在于递送构建体中的其他氨基酸序列优先被裂解的可裂解的接头。在多种实施方案中，受体结合结构域在将递送构建体递送至受试者的血流后基本上(例如约99％、约95％、约90％、约85％、约80或约75％)是完整的。在多种实施方案中，易位结构域在将递送构建体递送至受试者的血流后基本上(例如约99％、约95％、约90％、约85％、约80或约75％)是完整的。在多种实施方案中，大分子在将递送构建体递送至受试者的血流后基本上(例如约99％、约95％、约90％、约85％、约80或约75％)是完整的。在多种实施方案中，可裂解的接头在将递送构建体递送至受试者的血流后基本上(例如约99％、约95％、约90％、约85％、约80或约75％)是裂解的。
在其他实施方案中，可裂解的接头被在受试者的血浆中发现的裂解酶裂解。本领域技术人员已知存在于受试者血浆中的任何裂解酶可用来裂解可裂解的接头。比起使用在极化上皮细胞的基底外侧膜附近发现的裂解酶，使用此类酶裂解可裂解的接头是不太优选的，因为认为更高效的裂解将在基底外侧膜附近发生。然而，如果本领域技术人员确定，由血浆酶介导的裂解足够有效以允许裂解足够比例的递送构建体以避免副作用，则此类血浆裂解酶可用来裂解递送构建体。因此，在多种实施方案中，可裂解的接头可用选自由以下组成的组的酶裂解：半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-3、蛋白质原转化酶1、蛋白质原转化酶2、蛋白质原转化酶4、蛋白质原转化酶4PACE 4、脯氨酰寡肽酶(prolyl oligopeptidase)、内皮肽裂解酶、二肽基肽酶IV、信号肽酶、脑啡肽酶(neprilysin)、肾素和酯酶(参见，例如，美国专利号第6,673,574号，通过引用以其整体并入本文)。表6显示了这些酶连同被特定肽酶识别的一个或更多个氨基酸序列。肽酶在用星号标识的氨基酸的N-末端侧裂解包含这些序列的肽。
表6
血浆肽酶
因此，在多种实施方案中，可裂解的接头可以是本领域技术人员已知被存在于上皮细胞的基底外侧膜的酶可裂解的任何可裂解的接头。在多种实施方案中，可裂解的接头包含肽。在其他实施方案中，可裂解的接头包含核酸，诸如RNA或DNA。在仍其他实施方案中，可裂解的接头包含碳水化合物，诸如二糖或三糖。
可选地，在多种实施方案中，可裂解的接头可以是本领域技术人员已知被存在于施用递送构建体的受试者的血浆中的酶可裂解的任何可裂解的接头。在多种实施方案中，可裂解的接头包含肽。在其他实施方案中，可裂解的接头包含核酸，诸如RNA或DNA。在仍其他实施方案中，可裂解的接头包含碳水化合物，诸如二糖或三糖。
在多种实施方案中，肽酶在基底-外侧(也称为基底外侧)表现出高得多的活性(例如，相对于顶侧的100％、200％或更多的活性增加)。因此，在多种实施方案中，可裂解的接头可被在膜的基底外侧上表现出比在膜的顶侧上的高50％的活性的酶裂解。在多种实施方案中，可裂解的接头可被在膜的基底外侧上表现出比在膜的顶侧上的高100％的活性的酶裂解。在多种实施方案中，可裂解的接头可被在膜的基底外侧上表现出比在膜的顶侧上的高200％的活性的酶裂解。在多种实施方案中，可裂解的接头可被在膜的基底外侧上表现出比在膜的顶侧上的高500％的活性的酶裂解。在多种实施方案中，可裂解的接头可被在膜的基底外侧上表现出比在膜的顶侧上的高1，000％的活性的酶裂解。
在多种实施方案中，融合分子包含具有选自以下的氨基酸序列的可裂解的接头：例如，SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106或SEQ ID NO：107，并且可被在极化上皮细胞的基底外侧上表现出比它在极化上皮细胞的顶侧上高的活性的酶来裂解和/或可被在血浆中表现出比它在极化上皮细胞的顶侧上高的活性的酶来裂解。
在多种实施方案中，可裂解的接头可以是在融合分子的环境变化后被裂解的可裂解的接头。例如，可裂解的接头可以是pH敏感的可裂解的接头，并且当融合分子从极化上皮细胞的基底外侧膜释放时可被所经历的pH的变化裂解。例如，肠腔为强碱性的，而血浆为基本上中性的。因此，可裂解的接头可以是在从碱性至中性pH转换后被裂解的部分。裂解可裂解的接头的融合分子的环境变化可以是本领域技术人员已知的当融合分子从极化上皮细胞的基底外侧膜释放时所经历的任何环境变化，且不限于此。
在多种实施方案中，可裂解的接头被在受试者的血浆中发现的裂解酶裂解。本领域技术人员已知存在于受试者血浆中的任何裂解酶可用来裂解可裂解的接头。因此，在多种实施方案中，可裂解的接头可用选自以下的酶裂解：例如，SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119或SEQ ID NO：120。
在多种实施方案中，可裂解的接头为包含为烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶的已知底物的氨基酸序列的接头。因此，在多种实施方案中，可裂解的接头包含例如，GGGGSGGGENLYFQS(SEQ ID NO：121)中列出的氨基酸序列。
货物与修饰的Cholix毒素的化学缀合
在多种实施方案中，待递送至受试者的生物活性货物与修饰的Cholix毒素化学缀合。化学缀合分子的方法是本领域技术人员熟知的。
缀合两种分子的程序根据试剂的化学结构而不同。多肽通常包含多种官能团；例如，羧酸(COOH)或自由胺(--NH2)基团，其可用于与另一肽上的或在将分子与其连接的接头上的适合的官能团反应。
可选地，抗体和/或生物活性货物可被衍生化以暴露或附连另外的反应性官能团。衍生化可包括附连许多接头分子中的任一个，诸如从Pierce Chemical Company，RockfordIll可得的那些。
在多种实施方案中，分离的修饰的Cholix毒素通过细菌发酵制备，并通过建立的方法纯化。纯化的修饰的Cholix毒素然后在其C-末端被修饰，以允许通过位于蛋白的C-末端附近的自由巯基直接化学偶联。C-末端修饰包括携带来自烟草蚀纹病毒(TEV)的高选择性蛋白酶的共有裂解序列的半胱氨酸约束环(cysteine-constrained loop)、第二半胱氨酸和六组氨酸(His6)标签。包括第二Cys以与最终用于偶联的Cys形成二硫桥。His6序列至蛋白的添加简化了纯化，并且TEV裂解序列提供了在轻度还原后选择性去除末端Cys残基的机制。在表达和分离ntCholix构建体后，TEV裂解和用0.1mM二硫苏糖醇轻度还原，允许生物活性货物经由基于马来酰亚胺的反应的直接化学偶联作为货物附连的一般机制。在TEV蛋白酶裂解、还原和通过马来酰亚胺与自由巯基的反应的货物偶联后，通过第二Ni2+柱层析步骤实现去除释放的C-末端序列。
在多种实施方案中，融合分子包含以修饰的Cholix毒素共价装饰的颗粒，并且其中生物活性货物被整合到颗粒中。在多种实施方案中，颗粒的直径可小于～150nm、小于～100nm或小于～50nm。
在多种实施方案中，融合分子包含与修饰的Cholix毒素非共价偶联的生物活性货物。该融合分子可转运，例如，非共价缔合的IL-10跨越上皮，诸如IL-10受体的表面元件(Josephson，K.，Logsdon，N.J.，Walter，M.R.，Immunity 15：35-46，2001，通过引用以其整体并入本文)。
药物组合物和递送方法
本公开内容的药物组合物涉及用于施用至人类受试者的组合物。药物组合物包含本文陈述的非天然存在的融合分子(单独地或组合地)。药物组合物可包含能够改变非天然存在的融合分子的特征，例如，稳定、调节和/或活化其功能的另外的分子。组合物可，例如，呈固体或液体形式，并且可呈一种或更多种粉末、一种或更多种片剂、一种或更多种溶液或一种或更多种气雾剂的形式，以及其他。本公开内容的药物组合物可任选地和另外地包含药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”指无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封物质及任何标准的药物载体、媒介物、缓冲液和赋形剂，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、5％右旋糖水性溶液，以及乳液，诸如油/水或水/油乳液，以及各种类型的润湿剂和/或佐剂。
药物组合物通常被适当配制用于融合分子预期的立即使用。例如，如果不立即施用融合分子，则可将融合分子配制在适于储存的组合物中。一种此类组合物为融合分子连同适合的稳定剂一起的冻干制剂。可选地，融合分子组合物可被配制，以用于与一种或更多种适合的稳定剂一起储存在溶液中。可使用本领域技术人员已知的任何此类稳定剂，且不限于此。例如，适合于冻干制剂的稳定剂包括，但不限于，糖、盐、表面活性剂、蛋白、离液剂、脂质和氨基酸。适合于液体制剂的稳定剂包括，但不限于，糖、盐、表面活性剂、蛋白、离液剂、脂质和氨基酸。可用于组合物中的具体稳定剂包括，但不限于，海藻糖、血清白蛋白、磷脂酰胆碱、卵磷脂和精氨酸。用于稳定融合分子的冻干制剂或液体制剂的其他化合物、组合物和方法可见于，例如，美国专利第6,573,237号、第6,525,102号、第6,391,296号、第6,255,284号、第6,133,229号、第6,007,791号、第5,997,856号及第5,917,021号。
在多种实施方案中，本公开内容的药物组合物被配制用于口服递送。配制用于口服施用的药物组合物利用修饰的Cholix毒素介导跨胃肠(GI)上皮转胞吞的能力。预期，口服施用这些药物组合物将导致通过消化性粘膜，例如，肠粘膜的极化上皮细胞吸收融合分子，随后在粘膜的基底外侧释放生物活性货物。在多种实施方案中，上皮细胞选自由以下组成的组：鼻上皮细胞、口腔上皮细胞、肠上皮细胞、直肠上皮细胞、阴道上皮细胞和肺上皮细胞。本公开内容的药物组合物可包括添加转胞吞增强剂以促进融合蛋白跨GI上皮的转移。此类增强剂是本领域熟知的。参见Xia等，(2000)J.Pharmacol.Experiment.Therap.，295：594-600；以及Xia等(2001)Pharmaceutical Res.，18(2)：191-195，每一个通过引用以其整体并入本文。
预期，在跨GI上皮转运后，本公开内容的融合分子将在血清中表现出延长的半衰期，即，与在其非融合状态的生物活性货物相比，融合分子的生物活性货物将表现出延长的血清半衰期。因此，制备本公开内容的药物组合物的口服制剂，使得它们适于转运至GI上皮并保护胃中的融合分子。此类制剂可包括载体和分散剂组分，并且可呈任何适合的形式，包括气雾剂(用于口服或肺部递送)、糖浆剂、酏剂、片剂，包括咀嚼片剂、硬胶囊或软胶囊、锭剂(troches)、锭剂(lozenges)、水性悬液或油性悬液、乳剂、扁囊剂或丸粒剂(pelletsgranulates)及可分散粉剂。在多种实施方案中，药物组合物以适于简单口服施用精确剂量的固体剂型使用，固体剂型例如，片剂、胶囊等。
在多种实施方案中，口服制剂包含融合分子及当融合分子在胃中时可保护融合分子的一种或更多种化合物。例如，保护性化合物应能够防止融合分子的酸水解和/或酶水解。在多种实施方案中，口服制剂包含融合分子及可促进构建体从胃转运至小肠的一种或更多种化合物。在多种实施方案中，可保护融合分子免受胃中降解的一种或更多种化合物还可促进构建体从胃转运至小肠。例如，碳酸氢钠的包含可用于促进胃内递送的物质从胃至十二指肠的快速移动，如在Mrsny等，Vaccine 17：1425-1433，1999中描述的。用于配制组合物使得融合分子可穿过胃并且接触小肠中的极化上皮膜的其他方法包括，但不限于，如在DeYoung，Int J Pancreatol，5Suppl：31-6，1989中描述的肠溶包衣技术，以及在美国专利第6,613,332号、第6,174,529号、第6,086,918号、第5,922,680号、及第5,807,832号中提供的方法，每一个通过引用以其整体并入本文。
预期用于口服使用的药物组合物可根据本领域已知的用于制备药物组合物的任何方法制备，并且此类组合物可包含选自由甜味剂组成的组的一种或更多种试剂，以提供药学上美观和可口的制剂。例如，为了制备可口服递送的片剂，将融合分子与至少一种药物赋形剂混合，并且根据已知方法将固体制剂压制以形成片剂，用于递送至胃肠道。片剂组合物通常与以下一起配制：添加剂，例如，糖或纤维素载体，粘合剂诸如淀粉糊或甲基纤维素，填充剂，崩解剂或通常在医疗制剂的制造中通常使用的其他添加剂。为了制备可口服递送的胶囊，将DHEA与至少一种药物赋形剂混合，并且将固体制剂置于适于递送至胃肠道的胶囊容器中。包含融合分子的组合物可如通常在Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版1990(Mack Publishing Co.Easton Pa.18042)在第89章中描述的来制备，其通过引用并入本文。
在多种实施方案中，将药物组合物配制为包含与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的融合分子的可口服递送片剂，所述赋形剂适于制造片剂。这些赋形剂可以是惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，例如，玉米淀粉、明胶或阿拉伯胶，以及润滑剂，例如，硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包被的，或者它们可用已知技术包被以延迟在胃肠道的崩解和吸收，并从而在较长时间内提供持续的作用。例如，可使用时间延迟物质，诸如单独的或与蜡一起的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
在多种实施方案中，将药物组合物配制为硬明胶胶囊或者为软明胶胶囊，在硬明胶胶囊中将融合分子与惰性固体稀释剂，例如，碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，在软明胶胶囊中将融合分子与水性介质或油介质，例如，花生油(arachis oil)、花生油(peanut oil)、液体石蜡或橄榄油混合。
在多种实施方案中，水性悬液可包含与适于制造水性悬液的赋形剂混合的融合分子。此类赋形剂为悬浮剂，例如，羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂，例如，卵磷脂或环氧烷烃与脂肪酸的缩合产物例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂族醇类的缩合产物例如十七基乙氧基鲸蜡醇(heptadecylethyloxycetanol)，或环氧乙烷与源自脂肪酸的部分酯类和己糖醇的缩合产物诸如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与源自脂肪酸的偏酯类和己糖醇酐的缩合产物例如聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯。水性悬液还可包含一种或更多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂、和一种或多种甜味剂诸如蔗糖或糖精。
在多种实施方案中，油性悬液可通过将融合分子悬浮于植物油，例如，花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油中或者在矿物油诸如液体石蜡中来配制。油性悬液可包含增稠剂，例如，蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可添加甜味剂诸如以上陈述的那些和调味剂，以提供可口的口服制剂。这些组合物可通过添加抗氧化剂诸如抗坏血酸来保存。
在多种实施方案中，药物组合物可呈水包油乳剂的形式。油相可以是植物油，例如，橄榄油或花生油，或矿物油，例如，阿拉伯树胶或黄蓍树胶，天然存在的磷脂，例如大豆卵磷脂，以及源自脂肪酸的酯或偏酯和己糖醇酐，例如失水山梨糖醇单油酸酯，以及相同的偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如，聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。乳剂还可包含甜味剂和调味剂。
在其中药物组合物呈片剂或胶囊形式的多种实施方案中，片剂或胶囊被包被或包封以保护生物活性货物免受胃中的酶作用并确保存在足够的生物活性货物被受试者吸收以产生有效的反应。此类包被或包封方法包括，例如，包封在包含作为药物载体的具有疏水主链和亲水支链的聚合物的纳米颗粒中，包封在微粒中，插入到以乳剂的脂质体中，以及与其他分子缀合。纳米颗粒的实例包括用壳聚糖和卡波姆包被的粘膜粘附性纳米颗粒(Takeuchi等，AdvDrug Deliv.Rev.47(1)：39-54，2001)及包含带电荷的组合聚酯、聚(2-磺丁基-乙烯醇)和聚(D，L-乳酸-羟基乙酸共聚物)(poly(D，L-lactic-co-glycolic acid))的纳米颗粒(Jung等，Eur.J.Pharm.Biopharm.50(1)：147-160，2000)。
可使用包封或包被的片剂，该片剂以逐层的方式释放生物活性货物，从而在沿着胃肠道移动的同时在预定的时间框架内释放生物活性货物。另外，包含生物活性货物的片剂可被放置在更大的片剂内，从而保护内片剂免受环境和加工条件，诸如温度、化学试剂(例如，溶剂)、pH和湿度的影响。外片剂和包衣还用于在胃环境中保护生物活性货物。
在多种实施方案中，药物组合物可被配制，以用于使用以下口服递送：聚酯微球、玉米醇溶蛋白微球、类蛋白微球、聚氰基丙烯酸酯微球和基于脂质的系统(参见，例如，DiBase和Morrel，Oral Delivery of Microencapsulated Proteins，in ProteinDelivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(编著)，第255-288页(Plenum Press1997))。
表面活性试剂或表面活性剂促进多肽穿过粘膜或内膜(lining)的吸收。有用的表面活性试剂或表面活性剂包括脂肪酸及其盐、胆盐、磷脂或烷基糖。脂肪酸及其盐的实例包括辛酸(C8)、癸酸(C10)、月桂酸(C12)和肉豆蔻酸(C14)的钠盐、钾盐和赖氨酸盐。胆盐的实例包括胆酸、鹅脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、石胆酸和熊脱氧胆酸。磷脂的实例包括单链磷脂，诸如溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine)、溶血磷脂酰甘油(lysophosphatidylglycerol)、溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphatidylethanolamine)、溶血磷脂酰肌醇(lysophosphatidylinositol)和溶血磷脂酰丝氨酸(lysophosphatidylserine)；或双链磷脂，诸如二酰基磷脂酰胆碱(diacylphosphatidvlcholines)、二酰基磷脂酰甘油(diacylphosphatidylglycerols)、二酰基磷脂酰乙醇胺(diacylphosphatidylethanolamines)、二酰基磷脂酰肌醇(diacylphosphatidylinositols)和二酰基磷脂酰丝氨酸(diacylphosphatidylserines)。烷基糖的实例包括烷基葡糖苷或烷基麦芽糖苷，诸如癸基葡糖苷和十二烷基麦芽糖苷。
在另一个方面，本公开内容涉及口服施用本公开内容的药物组合物的方法。不意图被任何特定的理论或作用机制束缚，认为，口服施用融合分子导致通过消化性粘膜，例如，肠粘膜的极化上皮细胞吸收融合分子，随后裂解融合分子，并在粘膜的基底外侧释放生物活性货物。因此，当生物活性货物在肝脏中发挥生物活性，诸如，例如，由IL-10结合其同源受体介导的活性时，认为生物活性货物发挥超出基于在受试者中观察到的血浆浓度将被期望的效应，即，口服施用融合分子可将比受试者的血浆中观察到的浓度更高的有效浓度的递送的生物活性货物递送至受试者的肝脏。
在另一个方面，本公开内容涉及口服施用本公开内容的药物组合物的方法。此类方法可包括，但不限于，由患者或护理者口服施用组合物的步骤。此类施用步骤可包括根据融合分子、疾病或患者状况或个体患者，以间隔诸如每天一次或两次施用。此类方法还包括施用多种剂量的单独的融合分子。例如，药物组合物的初始剂量可处于较高水平以诱导期望的效应，诸如降低血糖水平。在达到期望的效应后，随后可降低随后的剂量。对施用方案的这些改变或修改可由主治医师或健康照护工作者来完成。
这些药物组合物可以以适合的剂量施用至受试者。给药方案将由主治医师和临床因素确定。如医学领域熟知的，用于任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用的时间和途径、一般健康状况及同时施用的其他药物。对于给定情况的治疗有效量将通过常规实验容易地确定，并且在普通临床医师或医师的技能和判断之内。本领域技术人员知道，施用至个体的药物组合物的有效量将，除了其他以外，取决于生物活性货物的性质。观察到变化所需的治疗时间长度和治疗后发生响应的时间间隔根据期望的效应而变化。特定量可通过本领域技术人员熟知的常规测试来确定。
生物活性货物的量为有效实现特定活性剂的目的的量。组合物中的量通常为药理学、生物学、治疗或化学上的有效量。然而，当组合物以剂量单位形式，诸如胶囊、片剂或液体使用时，该量可小于药理学、生物学、治疗或化学上的有效量，因为剂量单位形式可包含许多载体/生物或化学活性剂组合物，或者可包含分开的药理学、生物学、治疗或化学上的有效量。总有效量然后可以以累积单位施用，所述累积单位总体上包含药理学、生物学、治疗或化学上的活性量的生物活性货物。
在多种实施方案中，施用至受试者的融合分子的量为至多0.001pg、至多1pg、至多2pg、至多3pg、至多4pg、至多5pg、至多10pg、至多50pg、至多100pg、至多1μg、至多2μg、至多3μg、至多4μg、至多5μg、至多10μg、至多50μg、至多100μg、至多1mg、至多2mg、至多3mg、至多4mg、至多5mg、至多10mg、至多50mg、至多100mg或至多1g。
在多种实施方案中，施用至受试者的融合分子的量为至少0.001pg、至少1pg、至少2pg、至少3pg、至少4pg、至少5pg、至少10pg、至少50pg、至少100pg、至少1μg、至少2μg、至少3μg、至少4μg、至少5μg、至少10μg、至少50μg、至少100μg、至少1mg、至少2mg、至少3mg、至少4mg、至少5mg、至少10mg、至少50mg、至少100mg或至少1g。
在多种实施方案中，施用至受试者的融合分子的量为从0.001pg至约1g、从1pg至10pg、从50pg至100pg、从1μg至5μg、从10μg至20μg、从10μg至500mg、从10μg至100mg、从10μg至1000μg、从10μg至250μg、从10μg至100μg、从10μg至50μg、从1mg至5mg、或从10mg至100mg。
被施用的包含融合分子的组合物的体积通常将取决于融合分子的浓度和组合物的制剂。在多种实施方案中，融合分子组合物的单位剂量为从0.001μl至1ml、从1μl至100μl、从50μl至500μl、从0.01ml至1ml、从1ml至100ml、从0.05ml至1ml。例如，融合分子组合物的单位剂量可以为约0.5ml。
在一些实施方案中，融合分子组合物的单位剂量为至多约0.001μl、至多1μl、至多10μl、至多50μl、至多200μl、至多0.01ml、至多0.05ml、至多0.1ml、至多0.2ml、至多0.5ml、或至多1ml。
在一些实施方案中，融合分子组合物的单位剂量为至少0.001μl、至少1μl、至少10μl、至少50μl、至少200μl、至少0.01ml、至少0.05ml、至少0.1ml、至少0.2ml、至少0.5ml、或至少1ml。
融合分子组合物可以制备为包含以下的剂型：在1个和50个剂量之间(例如，0.5ml至25ml)，更通常在1个和10个剂量之间(例如，0.5ml至5ml)。
本公开内容的融合分子组合物可以以一个剂量或多个剂量施用。剂量之后可以是一个或更多个剂量，间隔了约1至约6小时、约6至约12小时，约12至约24小时、约1天至约3天、约1天至约1周、约1周至约2周、约2周至约1个月、约4至约8周、约1至约3个月或约1至约6个月。
在多种实施方案中，包含融合分子的药物组合物可以(尽管不必)每天以有效量施用以改善症状。通常，总每日剂量可以以以下的量来施用：每天至少约0.001pg、至少约0.1mg、至少约1mg、至少约10mg、至少约50mg、至少约100mg、至少约150mg、至少约200mg、至少约250mg、至少约300mg、至少约350mg、至少约400mg、至少约450mg、至少约500mg、或每天至少约1000mg。例如，剂量可配制成用于以胶囊或片剂口服施用，使得4个胶囊或片剂，每个包含50mg融合分子。用于口服递送的胶囊或片剂可方便地包含多达至全部每日口服剂量，例如，每天200mg或更多。
在多种实施方案中，包含融合分子的药物组合物可以(尽管不必)每天以有效量施用以改善症状。通常，总每日剂量可以以以下的量来施用：每天至多50mg、每天至多100mg、每天至多150mg、每天至多200mg、每天至多250mg、每天至多300mg、每天至多350mg、每天至多400mg、每天至多450mg、每天至多500mg、或每天至多1000mg。
如本文使用的，提及本公开内容的融合分子与一种或更多种其他治疗剂时，术语“共施用(co-administration)”、“共施用(co-administered)”和“与...组合(incombination with)”旨在意指，并且的确指并包括以下：当此类组分被一起配制成在基本上同时将所述组分释放至所述患者的单一剂型时，将本公开内容的融合分子与一种或更多种治疗剂的此类组合同时施用至需要治疗的患者；当此类组分彼此分开配制成在基本上同时被所述患者服用的单独的剂型，届时所述组分基本上同时释放至所述患者时，将本公开内容的融合分子与一种或更多种治疗剂的此类组合基本上同时施用至需要治疗的患者；当此类组分彼此分开配制成以每次施用之间的显著的时间间隔被所述患者在连续时间服用的单独的剂型，届时所述组分在基本上不同的时间释放至所述患者时，将本公开内容的融合分子与一种或更多种治疗剂的此类组合依次施用至需要治疗的患者；以及，当此类组分一起配制成以受控方式释放所述组分的单一剂型，届时它们在相同和/或不同的时间以同时、连续和/或重叠的方式释放至所述患者，其中每个部分可通过相同或不同的途径施用时，将本公开内容的融合分子与一种或更多种治疗剂的此类组合依次施用至需要治疗的患者。
在多种实施方案中，包含融合分子的药物组合物可与第二组分共施用，其中第二组分为能够结合GM-1(单唾液酸四己糖基神经节苷脂)受体的激素、毒素或生物活性剂(Hakomori，Advances in Exp.Medicine and Biology，174：333-339，1984)。在多种实施方案中，第二组分为SV40病毒、多瘤病毒或毒素诸如霍乱毒素或来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A(PE)。
如本文使用的，术语“霍乱毒素”或“CT”指霍乱弧菌(Vibrio cholerae)细菌的同名毒力剂，其可引起急性、危及生命的大规模水样腹泻。CT为包含单个A亚基与B亚基五聚体构成的蛋白复合物，与在上皮细胞的顶面的细胞表面GM1神经节苷脂结构结合。CT由霍乱弧菌(V.cholera)在与携带称为CTXf或的溶源性噬菌体变体的霍乱弧菌强毒菌株的水平基因转移之后分泌。然而，最近的霍乱爆发显示，一些血清群(非O1、非O139)的菌株不表达CT，而是使用其他毒力因子。非O1、非O139环境和临床数据的详细分析显示存在与PE具有一些相似性的新推定的分泌外毒素。CT的序列是已知的并且已被描述(Mekalanos J.J.等Nature 306，551页(1983))。
如本文使用的，术语“来自铜绿假单胞菌的外毒素A”、“假单胞菌(Pseudomonas)外毒素A”或“PE”指由铜绿假单胞菌分泌的极其活性的单体蛋白(分子量为66kD)，该单体蛋白抑制真核细胞中的蛋白合成。PE的613-残基序列是本领域熟知的，并且例如，陈述于美国专利第5,602,095号中。结构域Ia(氨基酸1-252)介导细胞结合。结构域II(氨基酸253-364)负责易位到胞质溶胶中，且结构域III(氨基酸400-613)介导延伸因子2的ADP核糖基化。结构域Ib(氨基酸365-399)的功能仍尚未定义，尽管已知其大部分，氨基酸365-380可被缺失而不损失细胞毒性。参见Siegall等，J Biol Chem，264：14256-61(1989)。
PE的某些细胞毒性片段是本领域已知的，并且通常由片段的分子量提及，其为本领域技术人员指定PE片段的特定组成。例如，PE40为被研究和用作免疫毒素的毒性部分的第一片段之一。该术语指定截短形式的PE结构域Ia，即负责非特异性结合的结构域。参见，例如，Pai等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，88：3358-3362(1991)；以及Kondo等，J.Biol.Chem.，263：9470-9475(1988)。然而，消除非特异性结合也可通过突变结构域Ia的某些残基来实现。美国专利第5,512,658号，例如，公开了，其中存在结构域Ia但其中结构域Ia的位置57、246、247和249处的碱性残基被酸性残基(谷氨酸或“E”)代替的突变PE表现出极大减弱的非特异性细胞毒性。PE的这种突变形式有时被称为“PE4E”。
在多种实施方案中，组合疗法包括同时施用在同一药物组合物中或在单独的药物组合物中的分离的融合分子组合物和第二试剂组合物。在多种实施方案中，依次施用分离的融合分子组合物和第二试剂组合物，即，在施用第二试剂组合物之前或之后施用分离的融合分子组合物。
在多种实施方案中，分离的融合分子组合物和第二试剂组合物的施用是同时的，即，分离的融合分子组合物和第二试剂组合物的施用时间段彼此重叠。
在多种实施方案中，分离的融合分子组合物和第二试剂组合物的施用是非同时的。例如，在多种实施方案中，在施用第二试剂组合物之前终止分离的融合分子组合物的施用。在多种实施方案中，在施用分离的融合分子组合物之前终止施用第二试剂组合物。在多种实施方案中，本发明的融合分子的施用，无论是单独的或是与治疗剂组合的，可与餐食一起实现，例如，在餐前、在餐时或在餐后。
在一些实施方案中，本发明的融合分子的施用，无论是单独的或是与治疗剂组合的，可在餐前实现。在多种实施方案中，本发明的融合分子，无论是单独的或是与治疗剂组合的，可在餐前多于12小时、多于11小时、多于10小时、多于9小时、多于8小时、多于7小时、多于6小时、多于5小时、多于4小时、多于3小时、多于2小时、多于1小时、多于50分钟、多于40分钟、多于30分钟、多于20分钟、多于10分钟、多于5分钟、或多于1分钟被施用。在多种实施方案中，本发明的融合分子，无论是单独的或是与治疗剂组合的，可在餐前少于12小时、少于11小时、少于10小时、少于9小时、少于8小时、少于7小时、少于6小时、少于5小时、少于4小时、少于3小时、少于2小时、少于1小时、少于50分钟、少于40分钟、少于30分钟、少于20分钟、少于10分钟、少于5分钟、或少于1分钟被施用。在多种实施方案中，本发明的融合分子，无论是单独的或是与治疗剂组合的，可在餐前介于约1分钟至约10分钟之间、介于约5分钟至约30分钟之间、介于约20分钟至约60分钟之间、介于约1小时至约3小时之间、介于约2小时至约10小时之间、或介于约5小时至约12小时之间被施用。
在一些实施方案中，本发明的融合分子的施用，无论是单独的或是与治疗剂组合的，可在餐后实现。在多种实施方案中，本发明的融合分子，无论是单独的或是与治疗剂组合的，可在餐后多于12小时、多于11小时、多于10小时、多于9小时、多于8小时、多于7小时、多于6小时、多于5小时、多于4小时、多于3小时、多于2小时、多于1小时、多于50分钟、多于40分钟、多于30分钟、多于20分钟、多于10分钟、多于5分钟、或多于1分钟被施用。在一些实施方案中，本发明的融合分子，无论是单独的或是与治疗剂组合的，可在餐后少于12小时、少于11小时、少于10小时、少于9小时、少于8小时、少于7小时、少于6小时、少于5小时、少于4小时、少于3小时、少于2小时、少于1小时、少于50分钟、少于40分钟、少于30分钟、少于20分钟、少于10分钟、少于5分钟、或少于1分钟被施用。在多种实施方案中，本发明的融合分子，无论是单独的或是与治疗剂组合的，可在餐前少于12小时、少于11小时、少于10小时、少于9小时、少于8小时、少于7小时、少于6小时、少于5小时、少于4小时、少于3小时、少于2小时、少于1小时、少于50分钟、少于40分钟、少于30分钟、少于20分钟、少于10分钟、少于5分钟、或少于1分钟被施用。在多种实施方案中，本发明的融合分子，无论是单独的或是与治疗剂组合的，可在餐后介于约1分钟至约10分钟之间、介于约5分钟至约30分钟之间、介于约20分钟至约60分钟之间、介于约1小时至约3小时之间、介于约2小时至约10小时之间、或介于约5小时至约12小时之间被施用。
使用方法
在另一个方面，配制用于口服递送的药物组合物用来治疗特别顺从于口服制剂和递送的某些类别的疾病或医学状况。此类别的疾病或状况包括，例如，病毒性疾病或感染、癌症、代谢性疾病、肥胖、自身免疫性疾病、炎性疾病、过敏症、移植物抗宿主病(graft-vs-host disease)、全身性微生物感染、贫血、心血管疾病、精神病、遗传疾病、神经退行性疾病、造血细胞紊乱、内分泌系统或生殖系统的疾病、胃肠道疾病。在许多慢性疾病中，本公开内容的融合分子的口服制剂是特别有用的，因为它们允许长期的患者护理和经由家庭口服施用的疗法，而不依赖于可注射的治疗或药物方案。
在本公开内容的多种实施方案中，提供了包含本公开内容的融合分子的药物组合物，所述药物组合物用于在治疗和/或预防炎性疾病中使用。“炎性疾病”包括与急性或慢性炎症相关的所有疾病。急性炎症是身体对有害刺激的初始反应，并且由血浆和白细胞(诸如例如粒细胞)从血液到损伤组织的增加的移动引起。许多生物化学事件传播并使牵涉局部血管系统、免疫系统和损伤组织内的多种细胞的炎症反应成熟。长期的炎症被称为慢性炎症，其导致存在于炎症部位处的细胞类型的进行性变化，并且其特征在于来自炎症过程的组织的同时破坏和愈合。炎性疾病可由以下引起：例如，烧伤、化学刺激物、冻伤、毒素、病原体感染、物理损伤、由于超敏反应引起的免疫反应、电离辐射或异物，诸如例如，碎片(splinters)、污垢和碎屑(debris)。炎性疾病的实例是本领域熟知的。
在多种实施方案中，炎性疾病选自由以下组成的组：炎性肠病，银屑病和细菌性脓毒症。如本文使用的，术语“炎性肠病”指结肠和小肠的一组炎性状况，包括，例如，克罗恩病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、转移性结肠炎、白塞氏综合征和不确定性结肠炎。
根据本公开内容，“克罗恩病”为1型T辅助(Th 1)炎性肠病，其具有包括白细胞介素-12、肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素-γ的增加的产生的免疫应答模式(Romagnani.Inflamm Bowel Dis 1999；5：285-94)，并且其可以对罹患其的患者的生活方式具有破坏性影响。克罗恩病的常见症状包括腹泻、痉挛(cramping)、腹痛、发热、甚至直肠出血。克罗恩病和与其相关的并发症经常导致患者需要手术，通常不止一次。对克罗恩病没有已知的治愈方法，且长期、有效的治疗选项是有限的。治疗的目的是控制炎症，纠正营养缺乏，并缓解症状如腹痛、腹泻和直肠出血。尽管治疗可通过降低人经历复发的次数帮助控制疾病，但未治愈。治疗可包括药物、营养补充剂、手术或这些选项的组合。可施用用于治疗的常见治疗包括抗炎药物，包括柳氮磺胺吡啶、可的松或类固醇(包括泼尼松)、免疫系统抑制剂(诸如6-巯基嘌呤或硫唑嘌呤)和抗生素。
根据本公开内容，“银屑病”为影响皮肤和关节的疾病。它通常导致红色鳞状斑块出现在皮肤上。由银屑病引起的称为银屑病斑的鳞状斑块是炎症和过度皮肤产生的区域。皮肤在这些部位迅速累积，并呈现银白色的外观。斑块经常发生在肘和膝盖的皮肤上，但可影响任何区域，包括头皮和生殖器。银屑病被假定为免疫介导的，并且不具有传染性。该紊乱为慢性复发性状况，其在严重程度方面有差异，从轻微局部的斑块至全身覆盖。手指甲和脚趾甲经常受到影响(银屑病指甲营养不良)，并可被视为单独的发现(finding)。银屑病还可导致关节炎症，其被称为银屑病关节炎。10％至15％的患银屑病的人患有银屑病性关节炎。
如本文使用的术语“细菌性脓毒症”指由细菌在血流中循环引起的危及生命的状况。脓毒症导致促炎细胞因子的泛发的全身性产生，其导致组织损伤和最终由于微循环失败的脓毒性休克。
本公开内容的另一个方面涉及用于治疗、预防和/或防止自身免疫性疾病的方法，所述方法包括在药学上可接受的载体中将治疗有效量(作为单一疗法或在组合疗法方案中)的本文描述的融合分子施用至所述患者。
与本公开内容相关的自身免疫性疾病为起因于并针对个体的自身组织的疾病或紊乱或其共分离系或表现或由其产生的状况。在多种实施方案中，自身免疫性疾病选自由以下组成的组：系统性红斑狼疮(SLE)、寻常天疱疮、重症肌无力、溶血性贫血、血小板减少性紫癜、格雷夫斯病、干燥综合征、皮肌炎、桥本氏病、多发性肌炎、炎性肠病、多发性硬化(MS)、糖尿病、类风湿性关节炎及硬皮病。
根据本公开内容，“类风湿性关节炎”为导致身体的免疫系统攻击骨关节的自身免疫紊乱(Muller B等，Springer Semin Immunopathol.，20：181-96，1998)。类风湿性关节炎为可影响许多组织和器官，但主要是攻击滑膜关节的慢性、全身性炎症性紊乱。该过程产生滑膜的继发于滑膜细胞增生的炎性反应(滑膜炎)、过量的滑液，以及滑膜中血管翳的发展。该疾病过程的病理学通常导致关节软骨的破坏和关节的关节强直。类风湿性关节炎也可在肺、心包膜、胸膜和巩膜中产生弥漫性炎症，且还产生最常见于皮肤下的皮下组织的结节性损伤。
在本公开内容的多种实施方案中，提供了包含本公开内容的融合分子的药物组合物，所述药物组合物用于在治疗、预防和/或防止癌症中使用，所述使用包括在药学上可接受的载体中将治疗有效量(作为单一疗法或在组合疗法方案中)的本文描述的融合分子施用至所述患者。待治疗的癌症包括，但不限于，非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐受性NHL和白血病。
在多种实施方案中，治疗有效量的本文描述的融合分子将与一种或更多种其他治疗剂组合施用。此类治疗剂可在本领域中被公认作为用于如本文描述的特定疾病状态的标准治疗，本文描述的特定疾病状态诸如炎性疾病、自身免疫性疾病或癌症。设想的示例性治疗剂包括，但不限于，细胞因子、生长因子、类固醇、NSAID、DMARD、抗炎剂、化疗剂、放射治疗剂或其他活性剂和辅助剂。
在多种实施方案中，本公开内容提供了一种治疗患有代谢紊乱的受试者的方法，所述方法包括以足以治疗所述紊乱的量口服施用本公开内容的融合分子，其中所述代谢紊乱为糖尿病、肥胖、作为肥胖结果的糖尿病、高血糖症、血脂异常、高甘油三酯血症、X综合征、胰岛素抵抗、葡萄糖耐量受损(IGT)、糖尿病血脂异常或高脂血症。
在另一个方面，本公开内容提供了一种治疗患有脂肪性肝病(例如，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH))、胃肠道疾病或神经退行性疾病的受试者的方法，所述方法包括以足以治疗所述疾病的量口服施用本公开内容的融合分子。
在另一个方面，本公开内容涉及本公开内容的非天然存在的融合分子在制备用于治疗、预防和/或防止有相应需要的受试者中的GH缺乏性生长紊乱的药物中的用途。
在另一个方面，本公开内容提供了一种治疗患有GH缺乏性生长紊乱的受试者的方法，所述方法包括以足以治疗所述紊乱的量口服施用本公开内容的融合分子，其中所述紊乱为生长激素缺乏(GHD)、特纳综合征(TS)、Noonan综合征、Prader-Willi综合征、包含身材矮小同源盒基因(SHOX)的缺乏、慢性肾功能不全和特发性身材矮小短肠综合征、由罕见垂体肿瘤或其治疗引起的GH缺乏、以及与HIV/AIDS相关的肌肉消耗性疾病。
编码融合分子的多核苷酸
在另一个方面，本公开内容提供了多核苷酸，所述多核苷酸包含编码非天然存在的融合分子的核苷酸序列。这些多核苷酸可用于，例如，制备融合分子。在又另一个方面，本公开内容提供了表达系统，所述表达系统包含编码修饰的Cholix毒素的重组多核苷酸序列和用于编码生物活性货物的多核苷酸序列的多接头插入位点。只要多接头插入不破坏修饰的Cholix毒素的受体结合结构域或转胞吞结构域，多接头插入位点可在多核苷酸序列中的任何位置。在多种实施方案中，表达系统可包含编码可裂解的接头的多核苷酸序列，使得在可裂解的接头处的裂解将由插入到多接头插入位点的核酸编码的生物活性货物与编码的融合分子的剩余部分分开。因此，在其中多接头插入位点在编码的构建体的末端的实施方案中，多核苷酸包含编码在多接头插入位点和多核苷酸剩余部分之间的可裂解的接头的一种核苷酸序列。在其中多接头插入位点不在编码的构建体末端的实施方案中，多接头插入位点侧翼可为各自编码可裂解的接头的核苷酸序列。
可用来制备编码可用于本公开内容的融合分子中的修饰的Cholix毒素的多核苷酸的多种体外方法包括，但不限于，逆转录、聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)、自主序列复制系统(3SR)和QP复制酶扩增系统(QB)。可使用本领域技术人员已知可用于构建重组核酸的任何此类技术。例如，编码蛋白或其部分的多核苷酸可使用基于修饰的Cholix毒素的DNA序列或编码例如，受体结合结构域的核苷酸的引物通过cDNA的聚合酶链式反应来分离。
使用这些克隆和体外扩增方法的指导在以下中描述：例如，美国专利第4,683,195号；Mullis等，1987，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263；以及Erlich，编著，1989，PCR Technology，Stockton Press，NY。编码融合分子或其部分的多核苷酸还可通过用选自期望多核苷酸的序列的探针在严格、中度严格或高度严格的杂交条件下筛选基因组或cDNA文库来分离。
编码本公开内容的融合分子的核酸的构建可通过将编码生物活性货物的核酸的插入位点引入到构建体中来促进。在多种实施方案中，用于生物活性货物的插入位点可被引入在编码修饰的Cholix毒素的结构域Ib的半胱氨酸残基的核苷酸之间。在其他实施方案中，只要插入不破坏由核酸编码的功能结构域，插入位点可被引入编码构建体的核酸中的任何位置。在多种实施方案中，插入位点可在ER滞留结构域中。
此外，多核苷酸还可编码在编码的融合分子的氨基末端的分泌序列。此类构建体可用于在哺乳动物细胞中产生融合分子，因为它们简化了免疫原的分离。
此外，本公开内容的多核苷酸还包括编码融合分子的多核苷酸的衍生物形式。此类衍生物可通过本领域技术人员已知的任何方法制备，且不限于此。例如，衍生物可通过位点特异性诱变来制备，位点特异性诱变包括取代、插入或缺失编码融合分子的多核苷酸的一个、两个、三个、五个、十个或更多个核苷酸。可选地，衍生物可通过随机诱变制备。一种用于随机诱变核酸的方法包括在0.1mM MnCl2和不平衡的核苷酸浓度的存在下在PCR反应中扩增核酸。这些条件增加了PCR反应中使用的聚合酶的不准确性掺入率，并导致扩增的核酸的随机诱变。
因此，在多种实施方案中，本公开内容提供了编码融合分子的多核苷酸。融合分子包含修饰的Cholix毒素和待递送至受试者的生物活性货物；以及任选地，不可裂解或可裂解的接头。在可裂解的接头处的裂解可将生物活性货物与融合分子的剩余部分分离。可裂解的接头可被存在于受试者的极化上皮细胞的基底外侧膜处或受试者的血浆中的酶裂解。
在多种实施方案中，多核苷酸与本公开内容的任何多核苷酸在严格杂交条件下杂交。在另外的实施方案中，多核苷酸与编码本公开内容的任何融合分子的核酸在严格条件下杂交。
在仍另一个方面，本公开内容提供了用于表达融合分子的表达载体。通常，表达载体为包含与编码多肽的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列的重组多核苷酸分子。通过包括适合的启动子、复制序列，可选择标志等等，表达载体可容易地为了原核生物或真核生物中的功能改造，以产生稳定的转录和翻译或mRNA。用于表达载体的构建和包含表达载体的细胞中基因的表达的技术是本领域熟知的。参见，例如，Sambrook等，2001，MolecularCloning--A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，N.Y.，以及Ausubel等，编著，现行版，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，NY。
用于表达载体中的有用的启动子包括，但不限于，金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP pol III启动子，组成型MPSV启动子、四环素-诱导型CMV启动子(诸如人类立即早期CMV启动子)和组成型CMV启动子。
表达载体应该包含与在其中表达融合分子的细胞相容的表达和复制信号。可用于表达融合分子的表达载体包括病毒载体，诸如逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒、质粒载体、粘粒等。优选病毒和质粒载体用于将表达载体转染到哺乳动物细胞中。例如，其中表达控制序列包含CMV启动子的表达载体pcDNA1(Invitrogen，San Diego，Calif.)提供了向此类细胞的良好的转染和表达的比率。
可通过本领域技术人员已知的任何方法将表达载体引入到用于表达融合分子的细胞中，且不限于此。此类方法包括，但不限于，例如，由细胞从溶液直接摄取分子；通过使用，例如，脂质体或免疫脂质体的脂质转染(lipofection)促进摄取；颗粒介导的转染；等等。参见，例如，美国专利第5,272,065号；Goeddel等，编著，1990，Methods in Enzymology，185卷，Academic Press，Inc.，CA；Krieger，1990，Gene Transfer and Expression--ALaboratory Manual，Stockton Press，NY；Sambrook等，1989，Molecular Cloning--ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY；以及Ausubel等，编著，现行版，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and WileyInterscience，NY。
表达载体还可包含简化融合分子的分离的纯化部分。例如，可在蛋白的氨基末端处掺入，例如，6个组氨酸残基的聚组氨酸部分。聚组氨酸部分允许通过镍螯合物层析在单一步骤中方便地分离蛋白。在多种实施方案中，纯化部分可在纯化后从融合分子的剩余部分裂解。在其他实施方案中，该部分不干扰融合分子的功能结构域的功能，并因此不需要被裂解。
在又另一个方面，本公开内容提供了细胞，所述细胞包含用于表达融合分子或其部分的表达载体。选择其有表达高浓度的融合分子的能力的细胞，以促进蛋白的纯化。在多种实施方案中，细胞为原核细胞，例如，大肠杆菌。如实施例中描述的，当在大肠杆菌中表达时，融合分子被适当折叠并包含适当的二硫键。
在其他实施方案中，细胞为真核细胞。有用的真核细胞包括酵母细胞和哺乳动物细胞。本领域技术人员已知可用于表达重组多肽的任何哺乳动物细胞可用于表达融合分子，且不限于此。例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞可用来表达融合分子。
本公开内容的融合分子可通过重组产生，如下文描述的。然而，融合分子还可使用本领域技术人员已知的方法通过化学合成产生。
用于表达和纯化本公开内容的融合分子的方法在下文实施例中广泛描述。通常，方法依赖于将编码融合分子的表达载体引入至可由载体表达融合分子的细胞。然后可纯化融合分子，用于施用至受试者。
转胞吞测试
转胞吞结构域的功能可作为融合分子穿过上皮膜的能力的函数来测试。因为转胞吞首先要求结合细胞，这些测定还可用来评估细胞识别结构域的功能。
融合分子的转胞吞活性可通过本领域技术人员已知的任何方法测试，且不限于此。在多种实施方案中，转胞吞活性可通过评估融合分子进入它与之结合的非极化细胞的能力来测试。不意图被任何特定的理论或作用机制束缚，认为，允许转胞吞结构域穿过极化上皮细胞的相同特性也允许携带转胞吞结构域的分子进入非极化细胞。因此，融合分子进入细胞的能力可，例如，通过检测细胞内部构建体的物理存在来评估。例如，融合分子可用，例如，荧光标志来标记，并且将融合分子暴露于细胞。然后，可将细胞洗涤，去除尚未进入细胞的任何融合分子，并确定剩余的标记物的量。检测该构建体上的标记物指示，融合分子已进入细胞。
在其他实施方案中，融合分子的转胞吞能力可通过评估融合分子穿过极化上皮细胞的能力来测试。例如，融合分子可用，例如，荧光标志来标记，并与上皮细胞层的顶膜接触。在由上皮细胞形成的膜的基底外侧检测到的荧光指示，转胞吞结构域适当地起作用。
可裂解的接头裂解测试
可裂解的接头的功能通常可在裂解测定中测试。本领域技术人员已知的任何适合的裂解测定可用来测试可裂解的接头，且不限于此。基于细胞的和无细胞的测定两者可用来测试酶裂解可裂解的接头的能力。
用于测试可裂解的接头的裂解的示例性无细胞测定包括制备极化上皮细胞的提取物，并将携带可裂解的接头的标记的融合分子暴露于对应于膜缔合酶的提取物级分。在此类测定中，标记物可被附连至待递送的生物活性货物或融合分子的剩余部分。其中，这些酶为如以上描述的在极化上皮细胞的基底外侧膜附近发现的裂解酶。裂解可，例如，通过将融合分子与，例如，抗体结合并洗去未结合的分子来检测。如果标记物被附连至待递送的生物活性货物，则在与抗体结合的分子上应当观察到很少或没有标记物。可选地，在测定中使用的结合剂可以是对生物活性货物特异的，并且可标记构建体的剩余部分。在任一情况下，可评估裂解。
裂解还可使用基于细胞的测定来测试，所述测定测试被组装成膜的极化上皮细胞的裂解。例如，在允许裂解接头的条件下，可将包含可裂解的接头的标记的融合分子或融合分子的部分与适合的上皮细胞，诸如，例如，Coco-2细胞的单层的顶侧或基底外侧接触。裂解可通过使用特异性结合融合分子或其部分的试剂检测标记的存在或不存在来检测。例如，对融合分子特异性的抗体可用来结合包含相对于由抗体结合的融合分子部分的可裂解的接头远侧的标记物的融合分子。然后裂解可通过检测与抗体结合的分子上标记物的存在来评估。如果发生了裂解，在与抗体结合的分子上应该观察到很少或没有标记物。通过进行此类实验，可鉴定优先在基底外侧膜而不是顶膜上裂解的酶，并且此外，可确认此类酶裂解融合分子中的可裂解的接头的能力。
此外，裂解还可使用如美国专利第6,759,207号中描述的荧光报告物测定来测试。简言之，在此类测定中，在允许裂解酶裂解报告物的条件下，将荧光报告物与适合的上皮细胞的单层的基底外侧接触。对报告物的裂解改变荧光报告物的结构，将其从非荧光构型改变为荧光构型。观察到的荧光的量指示存在于基底外侧膜处的裂解酶的活性。
此外，裂解还可使用分子内猝灭的分子探针，诸如美国专利第6,592,847号中描述的那些来测试。此类探针通常包含当用适当波长的光激发时发射光子的荧光部分和当紧密接近荧光部分时吸收此类光子的猝灭物部分。探针的裂解将猝灭部分与荧光部分分离，使得可检测到荧光，从而指示已发生裂解。因此，通过在允许裂解酶裂解探针的条件下使适合的上皮细胞的单层的基底外侧与探针接触，此类探针可用来鉴定和评估由特定裂解酶的裂解。观察到的荧光的量指示被测试的裂解酶的活性。
示例性Cholix毒素-生物活性货物融合分子
本公开内容的实施方案包括，但不限于，表7中描述的融合分子。
表7
在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：80的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和具有SEQ ID NO：82的氨基酸序列的生物活性货物。
在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：70的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和具有SEQ ID NO：82的氨基酸序列的生物活性货物。
在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和具有SEQ ID NO：82的氨基酸序列的生物活性货物。
在多种实施方案中，融合分子包含SEQ ID NO：114中列出的氨基酸序列。
在多种实施方案中，融合分子包含SEQ ID NO：115中列出的氨基酸序列。
在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和为抗体的生物活性货物，所述抗体包含具有SEQ ID NO：88的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：89的氨基酸序列的轻链可变区。
在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和为抗体的生物活性货物，所述抗体包含具有SEQ ID NO：90的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：91的氨基酸序列的轻链可变区。
在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和具有SEQ ID NO：92的氨基酸序列的生物活性货物。
在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和具有SEQ ID NO：93的氨基酸序列的生物活性货物。
在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和具有SEQ ID NO：94的氨基酸序列的生物活性货物。
在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和具有SEQ ID NO：95的氨基酸序列的生物活性货物。
在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：80的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和为抗体的生物活性货物，所述抗体包含具有SEQ ID NO：88的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：89的氨基酸序列的轻链可变区。
在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：80的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和为抗体的生物活性货物，所述抗体包含具有SEQ ID NO：90的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：91的氨基酸序列的轻链可变区。
在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：80的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和具有SEQ ID NO：92的氨基酸序列的生物活性货物。
在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：80的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和具有SEQ ID NO：93的氨基酸序列的生物活性货物。
在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：80的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和具有SEQ ID NO：94的氨基酸序列的生物活性货物。在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：80的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和具有SEQ ID NO：95的氨基酸序列的生物活性货物。
在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：70的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和为抗体的生物活性货物，所述抗体包含具有SEQ ID NO：88的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：89的氨基酸序列的轻链可变区。
在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：70的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和为抗体的生物活性货物，所述抗体包含具有SEQ ID NO：90的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：91的氨基酸序列的轻链可变区。
在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：70的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和具有SEQ ID NO：92的氨基酸序列的生物活性货物。
在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：70的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和具有SEQ ID NO：93的氨基酸序列的生物活性货物。
在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：70的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和具有SEQ ID NO：94的氨基酸序列的生物活性货物。
在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：70的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和具有SEQ ID NO：95的氨基酸序列的生物活性货物。
在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和为抗体的生物活性货物，所述抗体包含具有SEQ ID NO：88的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：89的氨基酸序列的轻链可变区。
在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和为抗体的生物活性货物，所述抗体包含具有SEQ ID NO：90的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：91的氨基酸序列的轻链可变区。
在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和具有SEQ ID NO：92的氨基酸序列的生物活性货物。
在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和具有SEQ ID NO：93的氨基酸序列的生物活性货物。
在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和具有SEQ ID NO：94的氨基酸序列的生物活性货物。
在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的修饰的Cholix毒素和具有SEQ ID NO：95的氨基酸序列的生物活性货物。
以下实施例仅仅说明本公开内容，并且不意图以任何方式限制本公开内容。
实施例1
在本实施例中，大体描述了作为单一氨基酸序列以及包含修饰的Cholix毒素序列、可裂解的接头序列和生物活性货物的非天然存在的融合分子的制备。
用于递送多肽白细胞介素-10(SEQ ID NO：82)、白细胞介素-19(SEQ ID NO：83)、白细胞介素-20(SEQ ID NO：84)、白细胞介素-22(SEQ ID NO：85)、白细胞介素-24(SEQ IDNO：86)、或白细胞介素-26(SEQ ID NO：87)的7种示例性融合分子表达载体如下文一般性描述的来构建。首先，通过PCR扩增多肽基因，在PCR产物的两端掺入NdeI和EcoRI、PstI和PstI、AgeI和EcoRI、或PstI和EcoRI的限制性内切酶对的位点。在限制性内切酶消化之后，将PCR产物克隆到用于细胞表达的适当的质粒中，其用对应的限制性内切酶对来消化。所得的构建体包含修饰的Cholix毒素和相应的多肽，所述修饰的Cholix毒素包含由SEQ ID NO：1的氨基酸1-386组成的氨基酸序列(Cholix386)，并且还在多肽的N-末端用6-His基序加标签以促进纯化。最终的质粒通过限制性内切酶消化和DNA测序验证。
还制备了以下：非天然存在的融合分子，其包含Cholix415(SEQ ID NO：52)、具有SEQ ID NO：121中列出的氨基酸序列的可裂解的接头序列和为由SEQ ID NO：82的氨基酸残基20-178组成的IL-10多肽的生物活性货物(该融合分子被命名为“Cholix415-TEV-IL-10”，参见图1(SEQ ID NO：122))；和非天然存在的融合分子，其包含Cholix415(SEQ ID NO：52)、具有SEQ ID NO：98中列出的氨基酸序列的不可裂解的接头序列和为由SEQ ID NO：82的氨基酸残基20-178组成的IL-10多肽的生物活性货物(该融合分子被命名为“Cholix415-(G4S)3-IL-10”，参见图1(SEQ ID NO：123))。
包含不可裂解的接头或可裂解的接头的表达载体通过引入编码适当氨基酸序列的序列来构建。为此，合成编码与适当的限制性位点互补的序列和期望接头的氨基酸序列的寡核苷酸，然后连接到如以上描述制备的表达载体中的修饰的Cholix序列和多肽序列之间。
在多种实施方案中，如下表达融合分子：将大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞(Novagen，Madison，Wis.)在适当的质粒存在下使用标准热休克方法来转化，以产生融合分子表达细胞，将该融合分子表达细胞在包含氨苄青霉素的培养基上选择，并且分离并在具有抗生素的Luria-Bertani肉汤(Difco；Becton Dickinson，Franklin Lakes，N.J.)中生长，然后通过在OD 0.6添加1mM异丙基-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。在IPTG诱导后2小时，细胞通过以5,000rpm离心10min来收获。包含体在细胞裂解后来分离，且将蛋白溶解于包含100mM Tris-HCl(pH 8.0)、2mM EDTA、6M盐酸胍、和65mM二硫苏糖醇的缓冲液中。溶解的融合分子在0.1M Tris，pH＝7.4，500mM L-精氨酸、0.9mM GSSG、2mM EDTA的存在下重折叠。重折叠的蛋白通过Q sepharose离子交换和Superdex 200凝胶过滤层析(Amersham Biosciences，Inc.，Sweden)纯化。蛋白的纯度通过SDS-PAGE和分析型HPLC(Agilent，Inc.Palo Alto，Calif.)评估。
图2为在将由IL-10二聚化驱动的重折叠之后的示例性融合分子，例如，Cholix415-TEV-IL-10的带状图表示。设想IL-10二聚化导致显示的紫色Cholix415/蓝色hIL-10和橙色Cholix415/绿色组织化。
评价Cholix415-TEV-IL-10和Cholix415-(G4S)3-IL-10，以验证关于它们的期望的分子尺寸的适当折叠。在诱导后，从包含体收集表达的蛋白。包含体中的Cholix415-TEV-IL-10(在凝胶上被描绘为“C”)表达和Cholix415-(G4S)3-IL-10(在凝胶上被描绘为“N”)表达的程度显示出～66kDa的表观分子量，其与分别为66380.78和65958.25道尔顿的计算质量相当。参见图3。显示对于TEV接头(Cs)和非TEV接头(Ns)在包含体去除之后上清液培养基中缺乏这些蛋白，证明嵌合体诱导的程度和特异性。示出了 Plus2预染MW标准。
实施例2
本实施例描述了验证融合分子关于它们携带生物活性货物跨越完整上皮的能力的适当折叠的体外方法。
J774小鼠巨噬细胞细胞系可用作IL-10应答细胞系(O′Farrell AM，等，EMBO J，17(4)：1006-18，1998)。IL-10天然形成其最佳活性所需的二聚体。由大肠杆菌表达的Cholix415-(G4S)3-IL-10从包含体来收集，并使用二硫化物混洗交换缓冲系统(disulphideshuffle exchange buffer system)折叠。所得的物质通过离子交换和尺寸排阻层析纯化，这导致分离～130kDa的蛋白，即结合至两个Cholix415分子的IL-10二聚体的预期尺寸(下文称为“二聚体Cholix415-IL-10”融合分子)。基于SDS PAGE，制备物具有～85％-90％的蛋白纯度。将J774.2细胞系的培养物用在25nM和250nM浓度的二聚体Cholix415-IL-10融合分子处理48h。与未处理的匹配细胞相比，二聚体Cholix415-IL-10融合分子产生细胞数量的剂量依赖性降低，如通过活细胞/死细胞的流式细胞术评估的(参见图4)。值代表n＝4±标准偏差。
可选地，人们可在细胞单层的基底区室中共培养IL-10反应性细胞用于顶部至基底外侧转胞吞(Rubas W，等，Pharm Res.13(1)：23-6，1996)。
实施例3
在本实施例中，评价二聚体Cholix415-(G4S)3-IL-10融合分子其体外对Caco-2细胞单层的屏障特性的效应。(Rubas W，等，J Pharm Sci.，85(2)：165-9，1996)。Caco-2(ATCCHTB-37TM)细胞在以下完全培养基中在37℃在5％CO2中保持：补充有10％胎牛血清、2.5mM谷氨酰胺、100U青霉素/ml和100μg链霉素/ml的Dulbecco氏改良的Eagle培养基F12(DMEMF12)(Gibco BRL，Grand Island，N.Y.)。细胞每2至3天用该培养基(称为完全培养基)供应，且每5至7天传代一次。对于测定，将细胞接种到24孔或96孔板中并生长至汇合。
用于这些研究的已建立的Caco-2单层具有在～450-600Ω·cm2之间的跨上皮电阻(transepithelial electrical resistance)(TER)值(平均579Ω·cm2)，如使用chopstick电压计(Millipore)测量的。将荧光素标记的70kDa右旋糖酐和不同浓度(4.7nM、23.6nM和236nM)的二聚体Cholix415-(G4S)3-IL-10融合分子添加至这些单层的顶面，并通过代替收集150μL体积随时间监测在基底区室中检测到的荧光的累积量。如图5和6中描绘的，在滤器支撑物上不存在Caco-2细胞下，右旋糖酐从顶部区室快速移动到基底区室。与之相比，70kDa右旋糖酐跨越Caco-2单层转运的程度少得多，且多种二聚体Cholix415-IL-10融合分子未能对70kDa右旋糖酐跨越这些Caco-2单层转运的程度具有任何剂量依赖性效应，且与用未暴露于二聚体Cholix415-IL-10融合分子的Caco-2单层获得的结果没有显著不同。二聚体Cholix415-(G4S)3-IL-10融合分子不在体外明显影响Caco-2细胞单层的屏障特性。
实施例4
在本实施例中，进行ELISA测定以评价二聚体Cholix415-(G4S)3-IL-10融合分子跨越Caco-2细胞单层移动的能力。A549(ATCC CCL-185TM)、L929(ATCC CRL-2148TM)和Caco-2(ATCC HTB-37TM)细胞在以下完全培养基中在37℃在5％CO2中保持：补充有10％胎牛血清、2.5mM谷氨酰胺、100U青霉素/ml和100μg链霉素/ml的Dulbecco氏改良的Eagle培养基F12(DMEM F12)(Gibco BRL，Grand Island，N.Y.)。细胞每2至3天用该培养基(称为完全培养基)供应，且每5至7天传代一次。对于测定，将细胞接种到24孔或96孔板中并生长至汇合。
将Caco-2细胞在胶原包被的0.4-μm孔径聚碳酸酯膜transwell支撑物(Corning-Costar，Cambridge，MA)上生长为汇合单层，并在获得如使用chopstick电压计(Millipore)测量的＞250Ω·cm2的跨上皮电阻(TER)之后的18-25天来使用。二聚体Cholix415-(G4S)3-IL-10融合分子跨越这些单层的顶部至基底外侧(A→B)转运通过测量在37℃应用4.7nM、23.6nM和236nM4小时之后转运的蛋白的量来确定。TER测量和10kDa荧光右旋糖酐的程度(使用HPLC尺寸排阻方案测量的)用来在研究过程期间验证单层屏障特性。Cholix转运的程度通过在基于细胞的细胞毒性测定中滴定收集的培养基来确定。转运的二聚体Cholix415-(G4S)3-IL-10融合分子使用用于捕获的抗-IL-10抗体和用于检测的针对Cholix的多克隆血清通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来测量。如图7(A和B)中描绘的，二聚体Cholix415-(G4S)3-IL-10融合分子跨越Caco-2细胞单层移动。
实施例5
在本实施例中，描述了缺乏可裂解的序列的非天然存在的融合分子的制备。这些融合分子被设计为特异性靶向粘膜下层/GI空间，并限制生物活性货物对该空间的作用。
制备编码Cholix毒素的无毒突变体形式，即Cholix毒素ΔE581(SEQ ID NO：81)的质粒构建体。蛋白表达在用适当的质粒通过热休克(在42℃，1min)转化后使用大肠杆菌DH5α细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)来实现。在包含抗生素的培养基上选择的转化的细胞被分离，并在Luria-Bertani肉汤(Difco)中生长。蛋白表达通过添加1mM异丙基-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)来诱导。在IPTG诱导2小时后，细胞通过在4℃以5,000xg离心10min来收获。包含体在细胞裂解后来分离，且将蛋白溶解于6M盐酸胍和2mM EDTA(pH 8.0)加65mM二硫苏糖醇中。在重折叠和纯化后，将蛋白在-80℃在缺乏Ca2+和Mg2+的PBS(pH 7.4)中以～5ml/ml储存。基于尺寸排阻层析，确认在这些研究中使用的所有蛋白具有＞90％的纯度。
Cholix毒素ΔE581蛋白然后在其C-末端被修饰，以允许通过位于蛋白的C-末端附近的自由巯基残基直接化学偶联。C-末端修饰包括携带来自烟草蚀纹病毒(TEV)的高选择性蛋白酶的共有裂解序列的半胱氨酸约束环、第二半胱氨酸和六组氨酸(His6)标签。包括第二Cys以与最终用于偶联的Cys形成二硫桥。His6序列至蛋白的添加简化了纯化，并且TEV裂解序列提供了在温和还原后选择性去除末端Cys残基的机制。在表达和分离ntCholix构建体后，TEV裂解和用0.1mM二硫苏糖醇温和还原，允许生物活性货物经由基于马来酰亚胺的反应的直接化学偶联作为货物附连的一般机制。在TEV蛋白酶裂解、还原、和通过马来酰亚胺与自由巯基的反应的货物偶联后，通过第二Ni2+柱层析步骤实现去除自由的C-末端序列。
实施例6
Cholix毒素ΔE581-货物的跨上皮转运在体外使用Caco-2单层来评价。将Caco-2细胞(传代数25-35)生长至汇合单层，如在先描述的；Rubas，W.等，Pharm Res，10：113-118(1993)。简言之，将细胞在5％CO2和90％湿度的气氛中，在富含以下的DMEM/高生长培养基中在37℃下保持：2mM L-谷氨酰胺、10％胎牛血清和100单位的青霉素/链霉素。将细胞在75cm2烧瓶中以1∶3的分配比每周传代，并以63,000个细胞/cm2的密度接种在来自CorningCostar(Cambridge，MA)的预湿化和胶原包被的可渗透(0.4μm孔径)聚碳酸酯(TranswellTM)滤器支撑物上。每隔一天更换生长培养基。在接种后20-26天使用汇合单层，汇合单层通过使用伏-欧姆计(volt-ohm-meter)(World Precision Instruments，Sarasota，FL)确定获得的显著跨上皮电阻(TEER)。
跨上皮转运通量速率使用Caco-2细胞的极化单层在顶部(Ap)至基底外侧(Bl)和Bl至Ap方向体外测量，以分别描述粘膜至浆膜和浆膜至粘膜流事件。就在开始转运研究之前，测量每个滤器的跨上皮电阻(TEER)；读数＜200Ω·cm2的单层TEER被排除在研究以外。将Ap和Bl介质从被包含的单层去除，且这些表面用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次。然后，一组单层接受Ap(提供者)应用100μL包含以下的PBS：10μg Cholix毒素ΔE581-货物和10μgTRITC-右旋糖酐或10μg BSA-货物和10μg TRITC-右旋糖酐。接受者(B1)区室然后接受500μL PBS，以设置用于转运研究的T0。提供者和接受者区室两者在37℃孵育4小时之后被取样，以分别确定跨越单层转运的物质的量和在顶面滞留的量。
实施例7
本实施例描述了包含在C-末端与IL-10多肽直接融合的包含编码SEQ ID NO：1的氨基酸1-415的序列的修饰的Cholix毒素的融合分子(被称为“Cholix415-IL-10融合分子”)在大肠杆菌中的制备和表达。蛋白表达使用大肠杆菌DH5α细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)在用适当的质粒通过热休克(在42℃，1min)转化后来实现。在包含抗生素的培养基上选择的转化的细胞被分离，并在Luria-Bertani肉汤(Difco)中生长。蛋白表达通过添加1mM异丙基-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)来诱导。在IPTG诱导后2小时，细胞通过在4℃以5,000xg离心10min来收获。包含体在细胞裂解后来分离，且将蛋白溶解于6M盐酸胍和2mM EDTA(pH8.0)加65mM二硫苏糖醇中。在重折叠和纯化后，将蛋白在-80℃在缺乏Ca2+和Mg2+的PBS(pH7.4)中以～5ml/ml储存。基于尺寸排阻层析，确认在这些研究中使用的所有蛋白具有＞90％的纯度。
从Duke Scientific(Palo Alto，CA)获得包含具有468/508nm的激发/发射特性的共价整合的红色荧光染料并具有醛表面官能团(XPR-582)的聚苯乙烯珠(10nm直径)。将100μl XPR-582珠(以2％固体)与约2.5纳摩尔IL-10或Cholix415-IL-10融合分子在最终体积200μl中性(pH 7.0)磷酸盐缓冲盐水(PBS)中混合。在室温下温和摇动2小时之后，添加20μl在PBS中的2mg/ml牛血清白蛋白(BSA；Sigma，St.Louis，MO)的溶液。然后，制备物通过以下的3个循环来透析：用PBS稀释及使用来自Millipore(Bedford，MA)的100,000分子量临界值Microcon滤器装置浓缩。包被珠的最终制备物为1％固体。
实施例8
在本实施例中，包含以下的非天然存在的分离的融合分子如在实施例1中描述的来制备，并如以上实施例中描述的来评价以确认适当的折叠、适当的尺寸：SEQ ID NO：52的修饰的Cholix毒素序列(Cholix415)、可裂解的接头序列(SEQ ID NO：121)或不可裂解的接头(SEQ ID NO：98)及为TNFSF抑制剂的生物活性货物。
制备6种示例性融合分子表达载体(对于每个接头为3种)，以测试融合分子跨越上皮细胞顶部至底部转运选自以下的TNFSF抑制剂的能力：1)为抗体的TNF抑制剂，该抗体包含SEQ ID NO：88和89的重链可变区和轻链可变区序列；2)为抗体的TNF抑制剂，该抗体包含SEQ ID NO：90和91的重链可变区和轻链可变区序列；以及3)为二聚体的TNFSF抑制剂，该二聚体为可溶性人类TNFR-p75与包含SEQ ID NO：92的序列的IgG的Fc部分的二聚体。
实施例9
在本实施例中，包含以下的非天然存在的分离的融合分子如在实施例1中描述的来制备，并如以上实施例中描述的来评价以确认适当的折叠、适当的尺寸：SEQ ID NO：52的修饰的Cholix毒素序列(Cholix415)、可裂解的接头(SEQ ID NO：121)或不可裂解的接头(SEQ ID NO：98)及为降葡萄糖剂的生物活性货物。
制备4种示例性融合分子表达载体(对于每个接头为2种)，以测试融合分子跨越上皮细胞顶部至底部转运选自以下的降葡萄糖剂的能力：1)GLP-1激动剂，其包含SEQ ID NO：93的序列；以及2)GLP-1激动剂，其包含SEQ ID NO：94的序列。
实施例10
在本实施例中，包含以下的非天然存在的分离的融合分子如在实施例1中描述的来制备，并如以上实施例中描述的来评价以确认适当的折叠、适当的尺寸：SEQ ID NO：52的修饰的Cholix毒素序列(Cholix415)、可裂解的接头(SEQ ID NO：121)或不可裂解的接头(SEQ ID NO：98)及为人类生长激素的生物活性货物。
制备2种示例性融合分子表达载体(对于每个接头为1种)，以测试融合分子跨越上皮细胞顶部至底部转运人类生长激素的能力，所述人类生长激素包含SEQ ID NO：95的序列。
实施例11
本实施例描述了实施例1中制备的融合分子的代表性生物活性货物在组织中的组织学检测。在施用融合分子后，通过CO2窒息将动物安乐死并通过心脏穿刺放血。将具体组织(淋巴结、气管、脑、脾脏、肝脏、GI道)取出，短暂地在PBS中清洗以去除任何残余血液并在OCT中冷冻。将切片(5微米厚)置于载玻片上。将载玻片在丙酮中固定10min并用PBS清洗。将载玻片与3％过氧化物酶孵育5min。然后将载玻片用蛋白封闭另外5min。将各自生物活性货物的一抗以1∶100稀释在载玻片上孵育30min，随后进行PBS洗涤。然后将生物素标记的二抗孵育约15分钟，随后进行PBS洗涤。将链霉亲和素HRP标记物在载玻片上孵育15min，随后进行PBS洗涤。应用HRP发色团5min，随后在蒸馏水中清洗数次。最后，将载玻片用苏木精复染色1min，盖上盖玻片，并检查生物活性货物的存在。
本公开内容的融合分子提供了优于用于将大分子局部或全身递送至受试者的常规技术的若干优势。此类优点中最重要的是将生物活性货物递送至受试者而不使用针刺穿受试者的皮肤的能力。许多受试者需要重复的、定期给药大分子。例如，糖尿病患者必须每天数次注射胰岛素以控制血糖浓度。如果大分子的递送可在没有注射的情况下实现，则通过避免与其相关的疼痛或潜在并发症，此类受试者的生活质量将大大改进。
另外，生物活性货物与融合分子的剩余部分用被存在于上皮细胞的基底外侧膜处的酶裂解的接头的偶联，允许生物活性货物在跨越上皮膜的转胞吞之后不久从融合分子释出并从融合分子的剩余部分释放。此类释出降低了诱导针对生物活性货物的免疫应答的概率。它还允许生物活性货物与其靶相互作用而无融合分子的剩余部分。
另外，缺乏可裂解的接头的非天然存在的融合分子可以是有利的，因为修饰的Cholix毒素被其在，例如，还表达生物活性货物的受体(但以相当低的量)的免疫细胞的表面处的一种或更多种受体的锚定效应可允许生物活性货物在被靶向的细胞表面处的更大暴露，并且经由Cholix与其受体的结合，且，例如，IL-10与IL-10R的结合而提供协同效应。
此外，在跨越GI上皮细胞转运后，本公开内容的融合分子将在血清中表现出延长的半衰期，即，与在其非融合状态的生物活性货物相比，融合分子的生物活性货物将表现出延长的血清半衰期，并且融合分子的口服施用可将比在受试者的血浆中观察到的更高的有效浓度的递送的生物活性货物递送至受试者的肝脏。
此外，融合分子的实施方案可在重组系统中构建和表达。重组技术允许人们制备具有被设计用于引入任何适合的生物活性货物的插入位点的融合分子。此类插入位点允许本领域技术人员快速且容易地产生用于递送新的生物活性货物的融合分子，如果出现这么做的需要。
本文公开的和请求保护的所有物品和方法鉴于本公开内容均可被制备和执行而无过度实验。尽管本公开内容的物品和方法已以实施方案的方式被描述，但对本领域技术人员明显的是，变化形式可被应用到物品和方法而不偏离本公开内容的精神和范围。对于本领域技术人员明显的所有此类变化形式和等同物，无论现在存在或是未来开发的，被认为是在如由所附权利要求所限定的本公开内容的精神和范围之内。在本说明书中提到的所有专利、专利申请和出版物指示本公开内容所属领域的普通技术人员的水平。所有专利、专利申请和出版物出于所有目的通过引用以其整体并入本文，并且其程度如同每一个单独的出版物被具体和单独指明出于任何及所有目的通过引用以其整体并入的相同程度。本文说明性地描述的本公开内容可在本文未具体地公开的任何一个或更多个元素的不存在下被适合地实践。因此，例如，在本文的每种情况下，术语“包含(comprising)”，“基本上由...组成(consisting essentially of)”和“由...组成(consisting of)”中的任一个可被其他两个术语中的任一个代替。已使用的术语和表述被用作描述性的而非限制性的术语，并且在使用此类术语和表述时不意图排除所显示和所描述的特征的任何等同物或其部分，但认识到多种改变在请求保护的本公开内的范围内是可能的。因此，应该理解，尽管本公开内容已通过实施方案和任选的特征被具体地公开，但本领域技术人员可寻求本文公开的概念的改变和变化形式，并且认为此类改变和变化形式在如由所附的权利要求所限定的本公开内容的范围内。
序列表
所附序列表中列出的氨基酸序列使用如在37C.F.R.1.822中定义的用于氨基酸的标准三字母代码来示出。
SEQ ID NO：1为成熟霍乱弧菌(Vibrio cholera)Cholix毒素的634个氨基酸序列。
SEQ ID NO：2为编码成熟霍乱弧菌(V.cholera)Cholix毒素的634个氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO：3-80为衍生自SEQ ID NO：1中列出的成熟Cholix毒素序列的多种截短的Cholix毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO：81为突变的Cholix毒素的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：1的氨基酸残基E581已被缺失。
SEQ ID NO：82为人类白细胞介素-10(IL-10)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：83为人类白细胞介素-19(IL-19)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：84为人类白细胞介素-20(IL-20)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：85为人类白细胞介素-22(IL-22)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：86为人类白细胞介素-24(IL-24)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：87为人类白细胞介素-26(IL-26)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：88-抗-TNF-α抗体的重链可变区序列。
SEQ ID NO：89-抗-TNF-α抗体的轻链可变区序列。
SEQ ID NO：90-抗-TNF-α抗体的重链可变区序列。
SEQ ID NO：91-抗-TNF-α抗体的轻链可变区序列。
SEQ ID NO：92-人类TNFR-p75-Fc二聚体融合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：93-GLP-1激动剂肽氨基酸序列(艾塞那肽)。
SEQ IDNO：94-GLP-1激动剂肽氨基酸序列(利拉鲁肽)。
SEQIDNO：95-人类生长激素(促生长素)的氨基酸序列。
SEQIDNO：96-121为多种肽接头的氨基酸序列。
SEQIDNO：122为Cholix415-TEV-IL-10融合分子的氨基酸序列。
SEQIDNO：123为Cholix415-(G4S)3-IL-10融合分子的氨基酸序列。
序列表
SEQ ID NO：1-成熟霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK
SEQ ID NO：2-编码成熟霍乱弧菌Cholix毒素的核酸序列
ATGGTCGAAGAAGCTTTAAACATCTTTGATGAATGCCGTTCGCCATGTTCGTTGACCCCGGAACCGGGTAAGCCGATTCAATCAAAACTGTCTATCCCTAGTGATGTTGTTCTGGATGAAGGTGTTCTGTATTACTCGATGACGATTAATGATGAGCAGAATGATATTAAGGATGAGGACAAAGGCGAGTCCATTATCACTATTGGTGAATTTGCCACAGTACGCGCGACTAGACATTATGTTAATCAAGATGCGCCTTTTGGTGTCATCCATTTAGATATTACGACAGAAAATGGTACAAAAACGTACTCTTATAACCGCAAAGAGGGTGAATTTGCAATCAATTGGTTAGTGCCTATTGGTGAAGATTCTCCTGCAAGCATCAAAATCTCCGTTGATGAGCTCGATCAGCAACGCAATATCATCGAGGTGCCTAAACTGTATAGTATTGATCTCGATAACCAAACGTTAGAGCAGTGGAAAACCCAAGGTAATGTTTCTTTTTCGGTAACGCGTCCTGAACATAATATCGCTATCTCTTGGCCAAGCGTGAGTTACAAAGCAGCGCAGAAAGAGGGTTCACGCCATAAGCGTTGGGCTCATTGGCATACAGGCTTAGCACTGTGTTGGCTTGTGCCAATGGATGCTATCTATAACTATATCACCCAGCAAAATTGTACTTTAGGGGATAATTGGTTTGGTGGCTCTTATGAGACTGTTGCAGGCACTCCGAAGGTGATTACGGTTAAGCAAGGGATTGAACAAAAGCCAGTTGAGCAGCGCATCCATTTCTCCAAGGGGAATGCGATGAGCGCACTTGCTGCTCATCGCGTCTGTGGTGTGCCATTAGAAACTTTGGCGCGCAGTCGCAAACCTCGTGATCTGACGGATGATTTATCATGTGCCTATCAAGCGCAGAATATCGTGAGTTTATTTGTCGCGACGCGTATCCTGTTCTCTCATCTGGATAGCGTATTTACTCTGAATCTTGACGAACAAGAACCAGAGGTGGCTGAACGTCTAAGTGATCTTCGCCGTATCAATGAAAATAACCCGGGCATGGTTACACAGGTTTTAACCGTTGCTCGTCAGATCTATAACGATTATGTCACTCACCATCCGGGCTTAACTCCTGAGCAAACCAGTGCGGGTGCACAAGCTGCCGATATCCTCTCTTTATTTTGCCCAGATGCTGATAAGTCTTGTGTGGCTTCAAACAACGATCAAGCCAATATCAACATCGAGTCTCGTTCTGGCCGTTCATATTTGCCTGAAAACCGTGCGGTAATCACCCCTCAAGGCGTCACAAATTGGACTTACCAGGAACTCGAAGCAACACATCAAGCTCTGACTCGTGAGGGTTATGTGTTCGTGGGTTACCATGGTACGAATCATGTCGCTGCGCAAACCATCGTGAATCGCATTGCCCCTGTTCCGCGCGGCAACAACACTGAAAACGAGGAAAAGTGGGGCGGGTTATATGTTGCAACTCACGCTGAAGTTGCCCATGGTTATGCTCGCATCAAAGAAGGGACAGGGGAGTATGGCCTTCCGACCCGTGCTGAGCGCGACGCTCGTGGGGTAATGCTGCGCGTGTATATCCCTCGTGCTTCATTAGAACGTTTTTATCGCACGAATACACCTTTGGAAAATGCTGAGGAGCATATCACGCAAGTGATTGGTCATTCTTTGCCATTACGCAATGAAGCATTTACTGGTCCAGAAAGTGCGGGCGGGGAAGACGAAACTGTCATTGGCTGGGATATGGCGATTCATGCAGTTGCGATCCCTTCGACTATCCCAGGGAACGCTTACGAAGAATTGGCGATTGATGAGGAGGCTGTTGCAAAAGAGCAATCGATTAGCACAAAACCACCTTATAAAGAGCGCAAAGATGAACTTAAG
SEQ ID NO：3-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix386
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQA
SEQ ID NO：4-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix385
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQ
SEQ ID NO：5-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix384
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGA
SEQ ID NO：6-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix383
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAG
SEQ ID NO：7-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix382
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSA
SEQ ID NO：8-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix381
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTS
SEQ ID NO：9-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix380
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISVVPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQT
SEQ ID NO：10-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix379
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHVVHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNVVFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQ
SEQ ID NO：11-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列ChoIix378
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPE
SEQ ID NO：12-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Chohx377
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTP
SEQ ID NO：13-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix376
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLT
SEQ ID NO：14-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix375
VEDELNIFDECRSPCSLIPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNVVFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGL
SEQ ID NO：15-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix374
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQVVKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPG
SEQ ID NO：16-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix373
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHP
SEQ ID NO：17-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix372
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHH
SEQ IDNO：18-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix371
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQVVKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTH
SEQ ID NO：19-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix370
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVT
SEQ ID NO：20-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix369
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYV
SEQ ID NO：21-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix368
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHVVHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDY
SEQ ID NO：22-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix367
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYND
SEQ ID NO：23-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix366
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYN
SEQ ID NO：24-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix365
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIY
SEQ ID NO：25-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix364
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQI
SEQ ID NO：26-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix363
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISVVPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQ
SEQ ID NO：27-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix362
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVAR
SEQ ID NO：28-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix361
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVA
SEQ ID NO：29-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix360
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTV
SEQ ID NO：30-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix359
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLT
SEQ ID NO：31-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix358
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVL
SEQ ID NO：32-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix357
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISVVPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQV
SEQ ID NO：33-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix356
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQ
SEQ ID NO：34-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix355
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVT
SEQ ID NO：35-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix354
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMV
SEQ ID NO：36-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix353
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGM
SEQ ID NO：37-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix352
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQVVKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPG
SEQ ID NO：38-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix351
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNP
SEQ ID NO：39-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix350
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHVVHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENN
SEQ ID NO：40-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix349
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRVVAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINEN
SEQ ID NO：41-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix348
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINE
SEQ ID NO：42-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix425
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPEN
SEQ ID NO：43-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix424
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPE
SEQ ID NO：44-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix423
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLP
SEQ ID NO：45-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix422
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYL
SEQ ID NO：46-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix421
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRVVAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSY
SEQ ID NO：47-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix420
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRS
SEQ ID NO：48-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix419
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGR
SEQ ID NO：49-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix418
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQVVKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSG
SEQ ID NO：50-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix417
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQVVKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHVVHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRS
SEQ ID NO：51-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix416
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESR
SEQ ID NO：52-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix415
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIES
SEQ ID NO：53-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix414
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIE
SEQ ID NO：54-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix413
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINI
SEQ ID NO：55-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix412
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQVVKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANIN
SEQ ID NO：56-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix411
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANI
SEQ ID NO：57-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix410
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQAN
SEQ ID NO：58-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix409
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNVVFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQA
SEQ ID NO：59-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix408
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQ
SEQ ID NO：60-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix407
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNND
SEQ ID NO：61-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix406
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNN
SEQ ID NO：62-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix405
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHVVHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASN
SEQ ID NO：63-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix404
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVAS
SEQ ID NO：64-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix403
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVA
SEQ ID NO：65-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序，列Cholix402
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCV
SEQ ID NO：66-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix401
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSC
SEQ ID NO：67-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix400
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISVVPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKS
SEQ ID NO：68-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix399
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADK
SEQ ID NO：69-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix398
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDAD
SEQ ID NO：70-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix397
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDA
SEQ ID NO：71-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix396
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPD
SEQ ID NO：72-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix395
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQVVKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP
SEQ ID NO：73-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix394
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFC
SEQ ID NO：74-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix393
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNVVFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLF
SEQ ID NO：75-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix192
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQVVKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSL
SEQ ID NO：76-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix391
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILS
SEQ ID NO：77-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix390
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADIL
SEQ ID NO：78-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix389
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISVVPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADI
SEQ ID NO：79-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix388
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQVVKTQGNVSFSVTRPEHNIAISVVPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAAD
SEQ ID NO：80-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列Cholix387
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAlSWPSVSYKAAQKEGSRHKRVVAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAA
SEQ ID NO：81-修饰的霍乱弧菌Cholix毒素氨基酸序列CholixΔ581
VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDTVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK
SEQ ID NO：82-人美白细胞介素-10氨基酸序列
MHSSALLCCLVLLTGVRASPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN
SEQ ID NO：83-人类白细胞介素-19氨基酸序列
MKLQCVSLVVLLGTILILCSVDNHGLRRCLISTDMHHIEESFQEIKRAIQAKDTFPNVTILSTLETLQIIKPLDVCCVTKNLLAFYVDRVFKDHQEPNPKILRKISSIANSFLYMQKTLRQCQEQRQCHCRQEATNATRVIHDNYDQLEVHAAAIKSLGELDVFLAWINKNHEVMSSA
SEQ ID NO：84-人类白细胞介素-20氨基酸序列
MKASSLAFSLLSAAFYLLWTPSTGLKTLNLGSCVIATNLQEIRNGFSEIRGSVQAKDGNIDIRILRRTESLQDTKPANRCCLLRHLLRLYLDRVFKNYQTPDHYTLRKISSLANSFLTIKKDLRLCHAHMTCHCGEEAMKKYSQILSHFEKLEPQAAVVKALGELDILLQWMEETE
SEQ ID NO：85-人类白细胞介素-22氨基酸序列
MAALQKSVSSFLMGTLATSCLLLLALLVQGGAAAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
SEQ ID NO：86-人类白细胞介素-24氨基酸序列
MNFQQRLQSLWTLASRPFCPPLLATASQMQMVVLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGVVPQKLVVEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL
SEQ ID NO：87-人类白细胞介素-26氨基酸序列
MLVNFILRCGLLLVTLSLAIAKHKQSSFTKSCYPRGTLSQAVDALYIKAAWLKATIPEDRIKNIRLLKKKTKKQFMKNCQFQEQLLSFFMEDVFGQLQLQGCKKIRFVEDFHSLRQKLSHCISCASSAREMKSITRMKRIFYRIGNKGIYKAISELDILLSWIKKLLESSQ
SEQ ID NO：88-抗-TNF-α抗体的重链可变区序列
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVERGFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
SEQ ID NO：89-抗-TNF-α抗体的轻链可变区序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：90-抗-TNF-α抗体的重链可变区序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAIISFDGSNKSSADSVKGRFTYSRRNSKNALFLQMNSLRAEDTAVFYCARDRGVSAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：91-抗-TNF，α抗体的轻链可变区序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTRFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIL
SEQ ID NO：92-人类TNFR-p75-Fc二聚体融合蛋白的氨基酸序列
LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：93-GLP-1激动剂肽氨基酸序列(艾塞那肽)
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS
SEQ ID NO：94-GLP-1激动利肽氨基酸序列(利拉鲁肽)
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEEFIIAWLVKGRG
SEQ ID NO：95-人类生长激素(促生长素)的氨基酸序列
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLUQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
SEQ ID NO：96-肽接头的氨基酸序列
GGGGS
SEQ ID NO：97-肽接头的氨基酸序列
GGGGSGGGGS
SEQ ID NO：98-肽接头的氨基酸序列
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO：99-肽接头的氨基酸序列
GGGGSGGG
SEQ ID NO：100-肽接头的氨基酸序列
AAPF
SEQ ID NO：101-肽接头的氨基酸序列
GGF
SEQ ID NO：102-肽接头的氨基酸序列
AAPV
SEQ ID NO：103-肽接头的氨基酸序列
GGL
SEQ ID NO：104-肽接头的氨基酸序列
AAL
SEQ ID NO：105-肽接头的氨基酸序列
FVR
SEQ ID NO：106-肽接头的氨基酸序列
VGR
SEQ ID NO：107-肽接头的氨基酸序列
RKPR
SEQ ID NO：108-肽接头的氨基酸序列
Y V A D Xaa Xaa＝任何氨基酸
SEQ ID NO：109-肽接头的氨基酸序列
D Xaa Xaa D Xaa Xaa＝任何氨基酸
SEQ ID NO：110-肽接头的氨基酸序列
R(Xaa)nR Xaa Xaa＝任何氨基酸 n＝0、2、4或6
SEQ ID NO：111-肽接头的氨基酸序列
K(Xaa)nR Xaa Xaa＝任何氨基酸 n＝0、2、4或6
SEQ ID NO：112-肽接头的氨基酸序列
E R T K R Xaa Xaa＝任何氨基酸
SEQ ID NO：113-肽接头的氨基酸序列
R V R R Xaa Xaa＝任何氨基酸
SEQ ID NO：114-肽接头的氨基酸序列
癸酰基-R V R R Xaa Xaa＝任何氨基酸
SEQ ID NO：115-肽接头的氨基酸序列
P Xaa W V P Xaa Xaa＝任何氨基酸
SEQ ID NO：116-肽接头的氨基酸序列
W V A Xaa Xaa＝任何氨基酸
SEQ ID NO：117-肽接头的氨基酸序列
Xaa F Xaa Xaa Xaa＝任何氨基酸
SEQ ID NO：118-肽接头的氨基酸序列
Xaa Y Xaa Xaa Xaa＝任何氨基酸 n＝0、2、4或6
SEQ ID NO：119-肽接头的氨基酸序列
Xaa W Xaa Xaa Xaa＝任何氨基酸 n＝0、2、4或6
SEQ ID NO：120-肽接头的氨基酸序列
与(V、A或P)-Y-(S、P或A)组合的DRWIPFHLL
SEQ ID NO：121-肽接头的氨基酸序列
GGGGSGGGENLYFQS
SEQ ID NO：122-Cholix415-TEV-IL-10融合分子的氨基酸序列
MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPGDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVSQDAPFGVINLDITTENGTKTYSFNRKESEFAINWLVPIGEDSPASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYNAQQIVSLFLATRILFTHIDSIFTLNLDGQEPEVAERLDDLRRINENNPGMVIQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNSDQANINIESGGGGSGGGENLYFQSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN
SEQ ID NO：123-Cholix415-(G4S)3-IL-10融合分子的氨基酸序列
MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPGDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVSQDAPFGVINLDITTENGTKTYSFNRKESEFAINWLVPIGEDSPASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYNAQQIVSLFLATRILFTHIDSIFTLNLDGQEPEVAERLDDLRRINENNPGMVIQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNSDQANINIESGGGGSGGGGSGGGGSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN
序列表
<110> 应用分子运输有限责任公司
<120> 用于口服递送生物活性货物的CHOLIX毒素衍生的融合分子
<130> CACAM1.0002WO
<160> 123
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 634
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌(Vibreo cholera) - 成熟的Cholix毒素氨基酸序列
<400> 1
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys Val Ala Ser Asn Asn Asp Gln Ala Asn Ile Asn Ile Glu Ser Arg
405 410 415
Ser Gly Arg Ser Tyr Leu Pro Glu Asn Arg Ala Val Ile Thr Pro Gln
420 425 430
Gly Val Thr Asn Trp Thr Tyr Gln Glu Leu Glu Ala Thr His Gln Ala
435 440 445
Leu Thr Arg Glu Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Asn His
450 455 460
Val Ala Ala Gln Thr Ile Val Asn Arg Ile Ala Pro Val Pro Arg Gly
465 470 475 480
Asn Asn Thr Glu Asn Glu Glu Lys Trp Gly Gly Leu Tyr Val Ala Thr
485 490 495
His Ala Glu Val Ala His Gly Tyr Ala Arg Ile Lys Glu Gly Thr Gly
500 505 510
Glu Tyr Gly Leu Pro Thr Arg Ala Glu Arg Asp Ala Arg Gly Val Met
515 520 525
Leu Arg Val Tyr Ile Pro Arg Ala Ser Leu Glu Arg Phe Tyr Arg Thr
530 535 540
Asn Thr Pro Leu Glu Asn Ala Glu Glu His Ile Thr Gln Val Ile Gly
545 550 555 560
His Ser Leu Pro Leu Arg Asn Glu Ala Phe Thr Gly Pro Glu Ser Ala
565 570 575
Gly Gly Glu Asp Glu Thr Val Ile Gly Trp Asp Met Ala Ile His Ala
580 585 590
Val Ala Ile Pro Ser Thr Ile Pro Gly Asn Ala Tyr Glu Glu Leu Ala
595 600 605
Ile Asp Glu Glu Ala Val Ala Lys Glu Gln Ser Ile Ser Thr Lys Pro
610 615 620
Pro Tyr Lys Glu Arg Lys Asp Glu Leu Lys
625 630
<210> 2
<211> 1905
<212> DNA
<213> 霍乱弧菌 -编码成熟的Cholix毒素的核酸序列
<400> 2
atggtcgaag aagctttaaa catctttgat gaatgccgtt cgccatgttc gttgaccccg 60
gaaccgggta agccgattca atcaaaactg tctatcccta gtgatgttgt tctggatgaa 120
ggtgttctgt attactcgat gacgattaat gatgagcaga atgatattaa ggatgaggac 180
aaaggcgagt ccattatcac tattggtgaa tttgccacag tacgcgcgac tagacattat 240
gttaatcaag atgcgccttt tggtgtcatc catttagata ttacgacaga aaatggtaca 300
aaaacgtact cttataaccg caaagagggt gaatttgcaa tcaattggtt agtgcctatt 360
ggtgaagatt ctcctgcaag catcaaaatc tccgttgatg agctcgatca gcaacgcaat 420
atcatcgagg tgcctaaact gtatagtatt gatctcgata accaaacgtt agagcagtgg 480
aaaacccaag gtaatgtttc tttttcggta acgcgtcctg aacataatat cgctatctct 540
tggccaagcg tgagttacaa agcagcgcag aaagagggtt cacgccataa gcgttgggct 600
cattggcata caggcttagc actgtgttgg cttgtgccaa tggatgctat ctataactat 660
atcacccagc aaaattgtac tttaggggat aattggtttg gtggctctta tgagactgtt 720
gcaggcactc cgaaggtgat tacggttaag caagggattg aacaaaagcc agttgagcag 780
cgcatccatt tctccaaggg gaatgcgatg agcgcacttg ctgctcatcg cgtctgtggt 840
gtgccattag aaactttggc gcgcagtcgc aaacctcgtg atctgacgga tgatttatca 900
tgtgcctatc aagcgcagaa tatcgtgagt ttatttgtcg cgacgcgtat cctgttctct 960
catctggata gcgtatttac tctgaatctt gacgaacaag aaccagaggt ggctgaacgt 1020
ctaagtgatc ttcgccgtat caatgaaaat aacccgggca tggttacaca ggttttaacc 1080
gttgctcgtc agatctataa cgattatgtc actcaccatc cgggcttaac tcctgagcaa 1140
accagtgcgg gtgcacaagc tgccgatatc ctctctttat tttgcccaga tgctgataag 1200
tcttgtgtgg cttcaaacaa cgatcaagcc aatatcaaca tcgagtctcg ttctggccgt 1260
tcatatttgc ctgaaaaccg tgcggtaatc acccctcaag gcgtcacaaa ttggacttac 1320
caggaactcg aagcaacaca tcaagctctg actcgtgagg gttatgtgtt cgtgggttac 1380
catggtacga atcatgtcgc tgcgcaaacc atcgtgaatc gcattgcccc tgttccgcgc 1440
ggcaacaaca ctgaaaacga ggaaaagtgg ggcgggttat atgttgcaac tcacgctgaa 1500
gttgcccatg gttatgctcg catcaaagaa gggacagggg agtatggcct tccgacccgt 1560
gctgagcgcg acgctcgtgg ggtaatgctg cgcgtgtata tccctcgtgc ttcattagaa 1620
cgtttttatc gcacgaatac acctttggaa aatgctgagg agcatatcac gcaagtgatt 1680
ggtcattctt tgccattacg caatgaagca tttactggtc cagaaagtgc gggcggggaa 1740
gacgaaactg tcattggctg ggatatggcg attcatgcag ttgcgatccc ttcgactatc 1800
ccagggaacg cttacgaaga attggcgatt gatgaggagg ctgttgcaaa agagcaatcg 1860
attagcacaa aaccacctta taaagagcgc aaagatgaac ttaag 1905
<210> 3
<211> 386
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-386
<400> 3
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala
385
<210> 4
<211> 385
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-385
<400> 4
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln
385
<210> 5
<211> 384
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-384
<400> 5
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
<210> 6
<211> 383
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-383
<400> 6
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly
370 375 380
<210> 7
<211> 382
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-382
<400> 7
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala
370 375 380
<210> 8
<211> 381
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-381
<400> 8
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser
370 375 380
<210> 9
<211> 380
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-380
<400> 9
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr
370 375 380
<210> 10
<211> 379
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-379
<400> 10
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln
370 375
<210> 11
<211> 378
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-378
<400> 11
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu
370 375
<210> 12
<211> 377
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-377
<400> 12
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro
370 375
<210> 13
<211> 376
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-376
<400> 13
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr
370 375
<210> 14
<211> 375
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-375
<400> 14
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu
370 375
<210> 15
<211> 374
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-374
<400> 15
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly
370
<210> 16
<211> 373
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-373
<400> 16
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro
370
<210> 17
<211> 372
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-372
<400> 17
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His
370
<210> 18
<211> 371
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-371
<400> 18
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His
370
<210> 19
<211> 370
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-370
<400> 19
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr
370
<210> 20
<211> 369
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-369
<400> 20
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val
<210> 21
<211> 368
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-368
<400> 21
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
<210> 22
<211> 367
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-367
<400> 22
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp
355 360 365
<210> 23
<211> 366
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-366
<400> 23
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn
355 360 365
<210> 24
<211> 365
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-365
<400> 24
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr
355 360 365
<210> 25
<211> 364
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-364
<400> 25
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile
355 360
<210> 26
<211> 363
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-363
<400> 26
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln
355 360
<210> 27
<211> 362
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-362
<400> 27
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg
355 360
<210> 28
<211> 361
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-361
<400> 28
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala
355 360
<210> 29
<211> 360
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-360
<400> 29
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val
355 360
<210> 30
<211> 359
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-359
<400> 30
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr
355
<210> 31
<211> 358
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-358
<400> 31
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu
355
<210> 32
<211> 357
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-357
<400> 32
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val
355
<210> 33
<211> 356
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-356
<400> 33
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln
355
<210> 34
<211> 355
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-355
<400> 34
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr
355
<210> 35
<211> 354
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-354
<400> 35
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val
<210> 36
<211> 353
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-353
<400> 36
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met
<210> 37
<211> 352
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-352
<400> 37
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
<210> 38
<211> 351
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-351
<400> 38
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro
340 345 350
<210> 39
<211> 350
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-350
<400> 39
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn
340 345 350
<210> 40
<211> 349
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-349
<400> 40
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn
340 345
<210> 41
<211> 348
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-348
<400> 41
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu
340 345
<210> 42
<211> 425
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-425
<400> 42
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys Val Ala Ser Asn Asn Asp Gln Ala Asn Ile Asn Ile Glu Ser Arg
405 410 415
Ser Gly Arg Ser Tyr Leu Pro Glu Asn
420 425
<210> 43
<211> 424
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-424
<400> 43
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys Val Ala Ser Asn Asn Asp Gln Ala Asn Ile Asn Ile Glu Ser Arg
405 410 415
Ser Gly Arg Ser Tyr Leu Pro Glu
420
<210> 44
<211> 423
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-423
<400> 44
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys Val Ala Ser Asn Asn Asp Gln Ala Asn Ile Asn Ile Glu Ser Arg
405 410 415
Ser Gly Arg Ser Tyr Leu Pro
420
<210> 45
<211> 422
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-422
<400> 45
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys Val Ala Ser Asn Asn Asp Gln Ala Asn Ile Asn Ile Glu Ser Arg
405 410 415
Ser Gly Arg Ser Tyr Leu
420
<210> 46
<211> 421
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-421
<400> 46
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys Val Ala Ser Asn Asn Asp Gln Ala Asn Ile Asn Ile Glu Ser Arg
405 410 415
Ser Gly Arg Ser Tyr
420
<210> 47
<211> 420
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-420
<400> 47
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys Val Ala Ser Asn Asn Asp Gln Ala Asn Ile Asn Ile Glu Ser Arg
405 410 415
Ser Gly Arg Ser
420
<210> 48
<211> 419
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-419
<400> 48
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys Val Ala Ser Asn Asn Asp Gln Ala Asn Ile Asn Ile Glu Ser Arg
405 410 415
Ser Gly Arg
<210> 49
<211> 418
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-418
<400> 49
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys Val Ala Ser Asn Asn Asp Gln Ala Asn Ile Asn Ile Glu Ser Arg
405 410 415
Ser Gly
<210> 50
<211> 417
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-417
<400> 50
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys Val Ala Ser Asn Asn Asp Gln Ala Asn Ile Asn Ile Glu Ser Arg
405 410 415
Ser
<210> 51
<211> 416
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-416
<400> 51
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys Val Ala Ser Asn Asn Asp Gln Ala Asn Ile Asn Ile Glu Ser Arg
405 410 415
<210> 52
<211> 415
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-415
<400> 52
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys Val Ala Ser Asn Asn Asp Gln Ala Asn Ile Asn Ile Glu Ser
405 410 415
<210> 53
<211> 414
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-414
<400> 53
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys Val Ala Ser Asn Asn Asp Gln Ala Asn Ile Asn Ile Glu
405 410
<210> 54
<211> 413
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-413
<400> 54
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys Val Ala Ser Asn Asn Asp Gln Ala Asn Ile Asn Ile
405 410
<210> 55
<211> 412
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-412
<400> 55
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys Val Ala Ser Asn Asn Asp Gln Ala Asn Ile Asn
405 410
<210> 56
<211> 411
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-411
<400> 56
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys Val Ala Ser Asn Asn Asp Gln Ala Asn Ile
405 410
<210> 57
<211> 410
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-410
<400> 57
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys Val Ala Ser Asn Asn Asp Gln Ala Asn
405 410
<210> 58
<211> 409
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-409
<400> 58
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys Val Ala Ser Asn Asn Asp Gln Ala
405
<210> 59
<211> 408
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-408
<400> 59
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys Val Ala Ser Asn Asn Asp Gln
405
<210> 60
<211> 407
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-407
<400> 60
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys Val Ala Ser Asn Asn Asp
405
<210> 61
<211> 406
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-406
<400> 61
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys Val Ala Ser Asn Asn
405
<210> 62
<211> 405
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-405
<400> 62
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys Val Ala Ser Asn
405
<210> 63
<211> 404
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-404
<400> 63
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys Val Ala Ser
<210> 64
<211> 403
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-403
<400> 64
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys Val Ala
<210> 65
<211> 402
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-402
<400> 65
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys Val
<210> 66
<211> 401
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-401
<400> 66
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys
<210> 67
<211> 400
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-400
<400> 67
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
<210> 68
<211> 399
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-399
<400> 68
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys
385 390 395
<210> 69
<211> 398
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-398
<400> 69
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp
385 390 395
<210> 70
<211> 397
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-397
<400> 70
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala
385 390 395
<210> 71
<211> 396
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-396
<400> 71
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp
385 390 395
<210> 72
<211> 395
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-395
<400> 72
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro
385 390 395
<210> 73
<211> 394
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-394
<400> 73
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys
385 390
<210> 74
<211> 393
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-393
<400> 74
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe
385 390
<210> 75
<211> 392
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-392
<400> 75
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu
385 390
<210> 76
<211> 391
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-391
<400> 76
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser
385 390
<210> 77
<211> 390
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-390
<400> 77
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu
385 390
<210> 78
<211> 389
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-389
<400> 78
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile
385
<210> 79
<211> 388
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-388
<400> 79
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp
385
<210> 80
<211> 387
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌 Cholix毒素氨基酸残基1-387
<400> 80
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala
385
<210> 81
<211> 633
<212> PRT
<213> 在氨基酸残基581处缺失的霍乱弧菌成熟的Cholix毒素
<400> 81
Val Glu Asp Glu Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser
1 5 10 15
Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro
20 25 30
Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile
35 40 45
Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile
50 55 60
Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val
65 70 75 80
Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu
85 90 95
Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala
100 105 110
Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro
130 135 140
Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys
145 150 155 160
Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile
165 170 175
Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly
180 185 190
Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys
195 200 205
Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn
210 215 220
Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala
225 230 235 240
Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro
245 250 255
Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu
260 265 270
Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala
290 295 300
Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His
305 310 315 320
Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val
325 330 335
Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly
340 345 350
Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr
355 360 365
Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala
370 375 380
Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser
385 390 395 400
Cys Val Ala Ser Asn Asn Asp Gln Ala Asn Ile Asn Ile Glu Ser Arg
405 410 415
Ser Gly Arg Ser Tyr Leu Pro Glu Asn Arg Ala Val Ile Thr Pro Gln
420 425 430
Gly Val Thr Asn Trp Thr Tyr Gln Glu Leu Glu Ala Thr His Gln Ala
435 440 445
Leu Thr Arg Glu Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Asn His
450 455 460
Val Ala Ala Gln Thr Ile Val Asn Arg Ile Ala Pro Val Pro Arg Gly
465 470 475 480
Asn Asn Thr Glu Asn Glu Glu Lys Trp Gly Gly Leu Tyr Val Ala Thr
485 490 495
His Ala Glu Val Ala His Gly Tyr Ala Arg Ile Lys Glu Gly Thr Gly
500 505 510
Glu Tyr Gly Leu Pro Thr Arg Ala Glu Arg Asp Ala Arg Gly Val Met
515 520 525
Leu Arg Val Tyr Ile Pro Arg Ala Ser Leu Glu Arg Phe Tyr Arg Thr
530 535 540
Asn Thr Pro Leu Glu Asn Ala Glu Glu His Ile Thr Gln Val Ile Gly
545 550 555 560
His Ser Leu Pro Leu Arg Asn Glu Ala Phe Thr Gly Pro Glu Ser Ala
565 570 575
Gly Gly Glu Asp Thr Val Ile Gly Trp Asp Met Ala Ile His Ala Val
580 585 590
Ala Ile Pro Ser Thr Ile Pro Gly Asn Ala Tyr Glu Glu Leu Ala Ile
595 600 605
Asp Glu Glu Ala Val Ala Lys Glu Gln Ser Ile Ser Thr Lys Pro Pro
610 615 620
Tyr Lys Glu Arg Lys Asp Glu Leu Lys
625 630
<210> 82
<211> 178
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens) - 白细胞介素-10
<400> 82
Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val
1 5 10 15
Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His
20 25 30
Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe
35 40 45
Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu
50 55 60
Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys
65 70 75 80
Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro
85 90 95
Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu
100 105 110
Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg
115 120 125
Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn
130 135 140
Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu
145 150 155 160
Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile
165 170 175
Arg Asn
<210> 83
<211> 177
<212> PRT
<213> 智人 - 白细胞介素-19
<400> 83
Met Lys Leu Gln Cys Val Ser Leu Trp Leu Leu Gly Thr Ile Leu Ile
1 5 10 15
Leu Cys Ser Val Asp Asn His Gly Leu Arg Arg Cys Leu Ile Ser Thr
20 25 30
Asp Met His His Ile Glu Glu Ser Phe Gln Glu Ile Lys Arg Ala Ile
35 40 45
Gln Ala Lys Asp Thr Phe Pro Asn Val Thr Ile Leu Ser Thr Leu Glu
50 55 60
Thr Leu Gln Ile Ile Lys Pro Leu Asp Val Cys Cys Val Thr Lys Asn
65 70 75 80
Leu Leu Ala Phe Tyr Val Asp Arg Val Phe Lys Asp His Gln Glu Pro
85 90 95
Asn Pro Lys Ile Leu Arg Lys Ile Ser Ser Ile Ala Asn Ser Phe Leu
100 105 110
Tyr Met Gln Lys Thr Leu Arg Gln Cys Gln Glu Gln Arg Gln Cys His
115 120 125
Cys Arg Gln Glu Ala Thr Asn Ala Thr Arg Val Ile His Asp Asn Tyr
130 135 140
Asp Gln Leu Glu Val His Ala Ala Ala Ile Lys Ser Leu Gly Glu Leu
145 150 155 160
Asp Val Phe Leu Ala Trp Ile Asn Lys Asn His Glu Val Met Ser Ser
165 170 175
Ala
<210> 84
<211> 176
<212> PRT
<213> 智人 - 白细胞介素-20
<400> 84
Met Lys Ala Ser Ser Leu Ala Phe Ser Leu Leu Ser Ala Ala Phe Tyr
1 5 10 15
Leu Leu Trp Thr Pro Ser Thr Gly Leu Lys Thr Leu Asn Leu Gly Ser
20 25 30
Cys Val Ile Ala Thr Asn Leu Gln Glu Ile Arg Asn Gly Phe Ser Glu
35 40 45
Ile Arg Gly Ser Val Gln Ala Lys Asp Gly Asn Ile Asp Ile Arg Ile
50 55 60
Leu Arg Arg Thr Glu Ser Leu Gln Asp Thr Lys Pro Ala Asn Arg Cys
65 70 75 80
Cys Leu Leu Arg His Leu Leu Arg Leu Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys
85 90 95
Asn Tyr Gln Thr Pro Asp His Tyr Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu
100 105 110
Ala Asn Ser Phe Leu Thr Ile Lys Lys Asp Leu Arg Leu Cys His Ala
115 120 125
His Met Thr Cys His Cys Gly Glu Glu Ala Met Lys Lys Tyr Ser Gln
130 135 140
Ile Leu Ser His Phe Glu Lys Leu Glu Pro Gln Ala Ala Val Val Lys
145 150 155 160
Ala Leu Gly Glu Leu Asp Ile Leu Leu Gln Trp Met Glu Glu Thr Glu
165 170 175
<210> 85
<211> 179
<212> PRT
<213> 智人 - 白细胞介素-22
<400> 85
Met Ala Ala Leu Gln Lys Ser Val Ser Ser Phe Leu Met Gly Thr Leu
1 5 10 15
Ala Thr Ser Cys Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Val Gln Gly Gly Ala
20 25 30
Ala Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln
35 40 45
Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser
50 55 60
Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe
65 70 75 80
His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu
85 90 95
Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln
100 105 110
Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg
115 120 125
Leu Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn
130 135 140
Val Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu
145 150 155 160
Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn
165 170 175
Ala Cys Ile
<210> 86
<211> 207
<212> PRT
<213> 智人 - 白细胞介素-24
<400> 86
Met Asn Phe Gln Gln Arg Leu Gln Ser Leu Trp Thr Leu Ala Ser Arg
1 5 10 15
Pro Phe Cys Pro Pro Leu Leu Ala Thr Ala Ser Gln Met Gln Met Val
20 25 30
Val Leu Pro Cys Leu Gly Phe Thr Leu Leu Leu Trp Ser Gln Val Ser
35 40 45
Gly Ala Gln Gly Gln Glu Phe His Phe Gly Pro Cys Gln Val Lys Gly
50 55 60
Val Val Pro Gln Lys Leu Trp Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Asp Thr
65 70 75 80
Met Gln Ala Gln Asp Asn Ile Thr Ser Ala Arg Leu Leu Gln Gln Glu
85 90 95
Val Leu Gln Asn Val Ser Asp Ala Glu Ser Cys Tyr Leu Val His Thr
100 105 110
Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Lys Thr Val Phe Lys Asn Tyr His Asn Arg
115 120 125
Thr Val Glu Val Arg Thr Leu Lys Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn
130 135 140
Phe Val Leu Ile Val Ser Gln Leu Gln Pro Ser Gln Glu Asn Glu Met
145 150 155 160
Phe Ser Ile Arg Asp Ser Ala His Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg Arg
165 170 175
Ala Phe Lys Gln Leu Asp Val Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Leu Gly
180 185 190
Glu Val Asp Ile Leu Leu Thr Trp Met Gln Lys Phe Tyr Lys Leu
195 200 205
<210> 87
<211> 171
<212> PRT
<213> 智人 - 白细胞介素-26
<400> 87
Met Leu Val Asn Phe Ile Leu Arg Cys Gly Leu Leu Leu Val Thr Leu
1 5 10 15
Ser Leu Ala Ile Ala Lys His Lys Gln Ser Ser Phe Thr Lys Ser Cys
20 25 30
Tyr Pro Arg Gly Thr Leu Ser Gln Ala Val Asp Ala Leu Tyr Ile Lys
35 40 45
Ala Ala Trp Leu Lys Ala Thr Ile Pro Glu Asp Arg Ile Lys Asn Ile
50 55 60
Arg Leu Leu Lys Lys Lys Thr Lys Lys Gln Phe Met Lys Asn Cys Gln
65 70 75 80
Phe Gln Glu Gln Leu Leu Ser Phe Phe Met Glu Asp Val Phe Gly Gln
85 90 95
Leu Gln Leu Gln Gly Cys Lys Lys Ile Arg Phe Val Glu Asp Phe His
100 105 110
Ser Leu Arg Gln Lys Leu Ser His Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ser Ala
115 120 125
Arg Glu Met Lys Ser Ile Thr Arg Met Lys Arg Ile Phe Tyr Arg Ile
130 135 140
Gly Asn Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Ile Ser Glu Leu Asp Ile Leu Leu
145 150 155 160
Ser Trp Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser Ser Gln
165 170
<210> 88
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗-TNF-α抗体的重链可变区序列
<400> 88
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Arg Gly Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 89
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗-TNF-α抗体的轻链可变区序列
<400> 89
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 90
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗-TNF-α抗体的重链可变区序列
<400> 90
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asn Lys Ser Ser Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Tyr Ser Arg Arg Asn Ser Lys Asn Ala Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly Val Ser Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 91
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗-TNF-α抗体的轻链可变区序列
<400> 91
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Arg Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Leu
100 105
<210> 92
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人类TNFR-p75-Fc二聚体融合蛋白的氨基酸序列
<400> 92
Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser
1 5 10 15
Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys
20 25 30
Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr
35 40 45
Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu
50 55 60
Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser
65 70 75 80
Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys
85 90 95
Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys
100 105 110
Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala
115 120 125
Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro
130 135 140
Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His
145 150 155 160
Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala
165 170 175
Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val
180 185 190
His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr
195 200 205
Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly
210 215 220
Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Glu Pro Lys Ser Cys
225 230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys
465
<210> 93
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GLP-1激动剂肽氨基酸序列(艾塞那肽)
<400> 93
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 94
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GLP-1激动剂肽氨基酸序列(利拉鲁肽)
<400> 94
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Glu Phe Ile Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
Gly
<210> 95
<211> 191
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人类生长激素(促生长素)
<400> 95
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
1 5 10 15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
20 25 30
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro
35 40 45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
65 70 75 80
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
85 90 95
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
100 105 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
115 120 125
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser
130 135 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr
145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
165 170 175
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
180 185 190
<210> 96
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 96
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 97
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 97
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 98
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 98
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 99
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 99
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 100
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 100
Ala Ala Pro Phe
1
<210> 101
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 101
Gly Gly Phe
1
<210> 102
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 102
Ala Ala Pro Val
1
<210> 103
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 103
Gly Gly Leu
1
<210> 104
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 104
Ala Ala Leu
1
<210> 105
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 105
Phe Val Arg
1
<210> 106
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 106
Val Gly Arg
1
<210> 107
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 107
Arg Lys Pro Arg
1
<210> 108
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽 X = 任何氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 108
Tyr Val Ala Asp Xaa
1 5
<210> 109
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽 X = 任何氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 109
Asp Xaa Xaa Asp Xaa
1 5
<210> 110
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽 X = 任何氨基酸 N= 0、2、4或6
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 110
Arg Xaa Asn Arg Xaa
1 5
<210> 111
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽 X = 任何氨基酸 N = 0、2、4或6
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 111
Lys Xaa Asn Arg Xaa
1 5
<210> 112
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽 X = 任何氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 112
Glu Arg Thr Lys Arg Xaa
1 5
<210> 113
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽 X = 任何氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 113
Arg Val Arg Arg Xaa
1 5
<210> 114
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽 D = 癸酰基 X = 任何氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 114
Asp Arg Val Arg Arg Xaa
1 5
<210> 115
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽 X = 任何氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 115
Pro Xaa Trp Val Pro Xaa
1 5
<210> 116
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽 X = 任何氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 116
Trp Val Ala Xaa
1
<210> 117
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽 X = 任何氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 117
Xaa Phe Xaa Xaa
1
<210> 118
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽 X = 任何氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 118
Xaa Tyr Xaa Xaa
1
<210> 119
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽 X = 任何氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 119
Xaa Trp Xaa Xaa
1
<210> 120
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 120
Asp Arg Tyr Ile Pro Phe His Leu Leu Val Ala Pro Tyr Ser Pro Ala
1 5 10 15
<210> 121
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽
<400> 121
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser
1 5 10 15
<210> 122
<211> 590
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Cholix415-TEV-IL-10融合分子的氨基酸序列
<400> 122
Met Val Glu Glu Ala Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys
1 5 10 15
Ser Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile
20 25 30
Pro Gly Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr
35 40 45
Ile Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser
50 55 60
Ile Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr
65 70 75 80
Val Ser Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile Asn Leu Asp Ile Thr Thr
85 90 95
Glu Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Phe Asn Arg Lys Glu Ser Glu Phe
100 105 110
Ala Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile
115 120 125
Lys Ile Ser Ile Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val
130 135 140
Pro Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp
145 150 155 160
Lys Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn
165 170 175
Ile Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu
180 185 190
Gly Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu
195 200 205
Cys Trp Leu Val Pro Ile Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln
210 215 220
Asn Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val
225 230 235 240
Ala Gly Thr Pro Lys Ala Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys
245 250 255
Pro Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Lys Asn Ala Met Glu Ala
260 265 270
Leu Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg
275 280 285
Ser Arg Lys Pro Arg Asp Leu Pro Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Asn
290 295 300
Ala Gln Gln Ile Val Ser Leu Phe Leu Ala Thr Arg Ile Leu Phe Thr
305 310 315 320
His Ile Asp Ser Ile Phe Thr Leu Asn Leu Asp Gly Gln Glu Pro Glu
325 330 335
Val Ala Glu Arg Leu Asp Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro
340 345 350
Gly Met Val Ile Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp
355 360 365
Tyr Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly
370 375 380
Ala Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys
385 390 395 400
Ser Cys Val Ala Ser Asn Ser Asp Gln Ala Asn Ile Asn Ile Glu Ser
405 410 415
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Pro
420 425 430
Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn
435 440 445
Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys
450 455 460
Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu
465 470 475 480
Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser
485 490 495
Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn
500 505 510
Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu
515 520 525
Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys
530 535 540
Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys
545 550 555 560
Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe
565 570 575
Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
580 585 590
<210> 123
<211> 590
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Cholix415-(G4S)3-IL-10融合分子的氨基酸序列
<400> 123
Met Val Glu Glu Ala Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys
1 5 10 15
Ser Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile
20 25 30
Pro Gly Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr
35 40 45
Ile Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser
50 55 60
Ile Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr
65 70 75 80
Val Ser Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile Asn Leu Asp Ile Thr Thr
85 90 95
Glu Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Phe Asn Arg Lys Glu Ser Glu Phe
100 105 110
Ala Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile
115 120 125
Lys Ile Ser Ile Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val
130 135 140
Pro Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp
145 150 155 160
Lys Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn
165 170 175
Ile Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu
180 185 190
Gly Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu
195 200 205
Cys Trp Leu Val Pro Ile Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln
210 215 220
Asn Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val
225 230 235 240
Ala Gly Thr Pro Lys Ala Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys
245 250 255
Pro Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Lys Asn Ala Met Glu Ala
260 265 270
Leu Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg
275 280 285
Ser Arg Lys Pro Arg Asp Leu Pro Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Asn
290 295 300
Ala Gln Gln Ile Val Ser Leu Phe Leu Ala Thr Arg Ile Leu Phe Thr
305 310 315 320
His Ile Asp Ser Ile Phe Thr Leu Asn Leu Asp Gly Gln Glu Pro Glu
325 330 335
Val Ala Glu Arg Leu Asp Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro
340 345 350
Gly Met Val Ile Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp
355 360 365
Tyr Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly
370 375 380
Ala Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys
385 390 395 400
Ser Cys Val Ala Ser Asn Ser Asp Gln Ala Asn Ile Asn Ile Glu Ser
405 410 415
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro
420 425 430
Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn
435 440 445
Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys
450 455 460
Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu
465 470 475 480
Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser
485 490 495
Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn
500 505 510
Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu
515 520 525
Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys
530 535 540
Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys
545 550 555 560
Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe
565 570 575
Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
580 585 590

Claims (57)

1.一种药物组合物，所述药物组合物包含非天然存在的融合分子和一种或更多种药学上可接受的载体，所述药物组合物被配制用于口服递送至受试者，其中所述融合分子包含与生物活性货物偶联的修饰的Cholix毒素，其中所述Cholix毒素在Cholix毒素结构域Ib内的氨基酸残基处被截短，且其中所述融合分子具有活化所述生物活性货物的受体的能力、或使催化活性物质的催化过程成为可能的能力。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述截短的Cholix毒素包含以下中列出的氨基酸序列：SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:80。
3.一种药物组合物，所述药物组合物包含非天然存在的融合分子和一种或更多种药学上可接受的载体，所述药物组合物被配制用于口服递送至受试者，其中所述融合分子包含与生物活性货物偶联的修饰的Cholix毒素，其中所述Cholix毒素在Cholix毒素结构域II内非氨基酸残基Ala386的氨基酸残基处被截短，且其中所述融合分子具有活化所述生物活性货物的受体的能力、或使催化活性物质的催化过程成为可能的能力。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述截短的Cholix毒素包含以下中列出的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:41。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的药物组合物，其中所述生物活性货物为大分子、小分子、肽、多肽、核酸、mRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反义分子、抗体、DNA、质粒、疫苗、聚合物纳米颗粒或催化活性物质。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述生物活性货物为多肽。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述多肽为GI道中的炎症的调节因子。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述GI道中的炎症的调节因子为白细胞介素-10(SEQ ID NO:82)、白细胞介素-19(SEQ ID NO:83)、白细胞介素-20(SEQ ID NO:84)、白细胞介素-22(SEQ ID NO:85)、白细胞介素-24(SEQ ID NO:86)、或白细胞介素-26(SEQID NO:87)。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述GI道中的炎症的调节因子为白细胞介素-10(SEQ ID NO:82)。
10.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述生物活性货物为肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述TNF抑制剂为包含SEQ ID NO:88中列出的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:89中列出的轻链可变区氨基酸序列的抗体。
12.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述TNF抑制剂为包含SEQ ID NO:90中列出的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:91中列出的轻链可变区氨基酸序列的抗体。
13.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述TNFSF抑制剂为可溶性TNFSF受体融合蛋白。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述可溶性TNFSF受体融合蛋白包含SEQID NO:92中列出的氨基酸序列。
15.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述生物活性货物为降葡萄糖剂。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述降葡萄糖剂为GLP-1激动剂肽(SEQID NO:93)或GLP-1激动剂肽(SEQ ID NO:94)。
17.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述生物活性货物为生长激素。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述生长激素为人类生长激素(或其变体)、生长激素2或生长激素释放激素。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述人类生长激素包含SEQ ID NO:95中列出的氨基酸序列。
20.一种药物组合物，所述药物组合物包含非天然存在的融合分子和一种或更多种药学上可接受的载体，所述药物组合物被配制用于口服递送至受试者，其中所述融合分子包含与生物活性货物偶联的修饰的Cholix毒素，其中所述Cholix毒素在Cholix毒素结构域Ib内的氨基酸残基处被截短，且其中所述生物活性货物为选自以下的酶：透明质酸酶、链激酶、组织纤溶酶原激活物、尿激酶或PGE-腺苷脱氨酶。
21.一种药物组合物，所述药物组合物包含非天然存在的融合分子和一种或更多种药学上可接受的载体，所述药物组合物被配制用于口服递送至受试者，其中所述融合分子包含与生物活性货物偶联的修饰的Cholix毒素，其中所述Cholix毒素在Cholix毒素结构域II内的氨基酸残基处被截短，且其中所述生物活性货物为选自以下的酶：透明质酸酶、链激酶、组织纤溶酶原激活物、尿激酶或PGE-腺苷脱氨酶。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的药物组合物，其中所述修饰的Cholix毒素与所述生物活性货物直接偶联。
23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述生物活性货物与所述修饰的Cholix毒素的C-末端直接偶联。
24.根据权利要求1-22中任一项所述的药物组合物，其中所述修饰的Cholix毒素与所述生物活性货物化学偶联。
25.根据权利要求1-22中任一项所述的药物组合物，其中所述修饰的Cholix毒素与所述生物活性货物通过不可裂解的接头偶联，其中所述修饰的Cholix将所述货物靶向特定细胞，所述特定细胞包括免疫系统的细胞，诸如巨噬细胞、抗原呈递细胞和树突细胞。
26.根据权利要求25所述的药物组合物，其中所述不可裂解的接头包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98或SEQ ID NO:99。
27.根据权利要求1-22中任一项所述的药物组合物，其中所述修饰的Cholix毒素与所述生物活性货物通过可裂解的接头偶联。
28.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述接头是存在于受试者的极化上皮细胞的基底外侧膜处的酶可裂解的。
29.根据权利要求28所述的药物组合物，其中所述可裂解的接头包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ IDNO:105、SEQ ID NO:106或SEQ ID NO:107。
30.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述接头是存在于受试者血浆中的酶可裂解的。
31.根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述可裂解的接头包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ IDNO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119或SEQ ID NO:120。
32.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述接头是烟草蚀纹病毒的蛋白酶可裂解的。
33.根据权利要求32所述的药物组合物，其中所述可裂解的接头包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列。
34.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述融合分子包含SEQ ID NO:114中列出的氨基酸序列。
35.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述融合分子包含SEQ ID NO:115中列出的氨基酸序列。
36.一种治疗受试者中的炎性疾病的方法，所述方法包括将根据权利要求1-35中任一项所述的药物组合物口服施用至受试者。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述炎性疾病选自炎性肠病、银屑病或细菌性脓毒症。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述炎性肠病选自克罗恩病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、转移性结肠炎、白塞氏综合征或不确定性结肠炎。
39.一种治疗受试者中的自身免疫性疾病的方法，所述方法包括将根据权利要求1-35中任一项所述的药物组合物口服施用至受试者。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮(SLE)、寻常天疱疮、重症肌无力、溶血性贫血、血小板减少性紫癜、格雷夫斯病、干燥综合征、皮肌炎、桥本氏病、多发性肌炎、炎性肠病、多发性硬化(MS)、糖尿病、类风湿性关节炎或硬皮病。
41.一种治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括将根据权利要求1-35中任一项所述的药物组合物口服施用至受试者。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述癌症选自非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐受性NHL和白血病。
43.根据权利要求1-35中任一项所述的非天然存在的融合分子用于制备用于治疗、预防和/或防止有相应需要的受试者中的炎性疾病的药物的用途。
44.根据权利要求1-35中任一项所述的非天然存在的融合分子用于制备用于治疗、预防和/或防止有相应需要的受试者中的自身免疫性疾病的药物的用途。
45.根据权利要求1-35中任一项所述的非天然存在的融合分子用于制备用于治疗、预防和/或防止有相应需要的受试者中的癌症的药物的用途。
46.一种治疗受试者中的代谢紊乱的方法，所述方法包括将根据权利要求1-35中任一项所述的药物组合物口服施用至受试者。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述代谢紊乱选自糖尿病、肥胖、作为肥胖结果的糖尿病、高血糖症、血脂异常、高甘油三酯血症、X综合征、胰岛素抵抗、葡萄糖耐量受损(IGT)、糖尿病血脂异常或高脂血症。
48.一种治疗受试者中的脂肪性肝病的方法，所述方法包括将根据权利要求1-35中任一项所述的药物组合物口服施用至受试者。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述脂肪性肝病选自非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)；非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、胃肠道疾病或神经退行性疾病。
50.根据权利要求1-35中任一项所述的非天然存在的融合分子用于制备用于治疗、预防和/或防止有相应需要的受试者中的代谢紊乱的药物的用途。
51.根据权利要求1-35中任一项所述的非天然存在的融合分子用于制备用于治疗、预防和/或防止有相应需要的受试者中的脂肪性肝病的药物的用途。
52.一种治疗受试者中的生长激素(GH)缺乏性生长紊乱的方法，所述方法包括将根据权利要求1-35中任一项所述的药物组合物口服施用至受试者。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述GH缺乏性生长紊乱选自生长激素缺乏(GHD)、特纳综合征(TS)、Noonan综合征、Prader-Willi综合征、包含身材矮小同源盒基因(SHOX)缺乏、慢性肾功能不全和特发性身材矮小短肠综合征、由罕见垂体肿瘤或其治疗引起的GH缺乏、以及与HIV/AIDS相关的肌肉消耗性疾病。
54.根据权利要求1-35中任一项所述的非天然存在的融合分子用于制备用于治疗、预防和/或防止有相应需要的受试者中的GH缺乏性生长紊乱的药物的用途。
55.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1-35中任一项所述的融合分子。
56.一种载体，所述载体包含根据权利要求55所述的多核苷酸。
57.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含表达融合分子的载体，其中所述宿主细胞包含根据权利要求56所述的载体。
CN201580036678.8A 2014-05-07 2015-05-07 用于口服递送生物活性货物的cholix毒素衍生的融合分子 Pending CN106470707A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311263281.5A CN117298254A (zh) 2014-05-07 2015-05-07 用于口服递送生物活性货物的cholix毒素衍生的融合分子

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461990054P 2014-05-07 2014-05-07
US61/990,054 2014-05-07
PCT/US2015/029795 WO2015171965A2 (en) 2014-05-07 2015-05-07 Cholix toxin-derived fusion molecules for oral delivery of biologically active cargo

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311263281.5A Division CN117298254A (zh) 2014-05-07 2015-05-07 用于口服递送生物活性货物的cholix毒素衍生的融合分子

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106470707A true CN106470707A (zh) 2017-03-01

Family

ID=54393149

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580036678.8A Pending CN106470707A (zh) 2014-05-07 2015-05-07 用于口服递送生物活性货物的cholix毒素衍生的融合分子
CN202311263281.5A Pending CN117298254A (zh) 2014-05-07 2015-05-07 用于口服递送生物活性货物的cholix毒素衍生的融合分子

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311263281.5A Pending CN117298254A (zh) 2014-05-07 2015-05-07 用于口服递送生物活性货物的cholix毒素衍生的融合分子

Country Status (19)

Country Link
US (8) US10624955B2 (zh)
EP (2) EP3139965B1 (zh)
JP (2) JP6759188B2 (zh)
KR (2) KR102598038B1 (zh)
CN (2) CN106470707A (zh)
AU (2) AU2015255834B2 (zh)
BR (1) BR112016025866A2 (zh)
CA (1) CA2948346C (zh)
DK (1) DK3139965T3 (zh)
ES (1) ES2900328T3 (zh)
IL (2) IL285716B (zh)
MX (2) MX2016014548A (zh)
PH (2) PH12016502447B1 (zh)
PL (1) PL3139965T3 (zh)
PT (1) PT3139965T (zh)
RU (1) RU2723178C2 (zh)
SG (1) SG11201610183XA (zh)
SI (1) SI3139965T1 (zh)
WO (1) WO2015171965A2 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113347997A (zh) * 2018-11-07 2021-09-03 应用分子运输公司 用于经口递送异源有效载荷的Cholix衍生的携带体
CN114555058A (zh) * 2019-08-16 2022-05-27 应用分子转运公司 用于有效载荷递送的组合物和颗粒

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105541978B (zh) 2010-09-15 2019-12-13 兰德尔·J·米斯尼 使用细菌毒素衍生的转运序列递送生物活性剂的系统和方法
US11246915B2 (en) 2010-09-15 2022-02-15 Applied Molecular Transport Inc. Cholix toxin-derived fusion molecules for oral delivery of biologically active cargo
KR102598038B1 (ko) 2014-05-07 2023-11-07 어플라이드 몰레큘라 트랜스포트 인크. 생물학적 활성 화물의 경구 전달용 콜릭스 독소-유래 융합 분자
US11311628B2 (en) 2016-10-17 2022-04-26 Duke University Production of immunotoxin D2C7—(scdsFv)—PE38KDEL
CA3093386A1 (en) * 2018-03-08 2019-09-12 Applied Molecular Transport Inc. Toxin-derived delivery constructs for oral delivery
PL3762009T3 (pl) 2018-03-08 2022-09-12 Applied Molecular Transport Inc. Pochodzące z toksyny konstrukty dostarczające do dostarczania doustnego
PL3650037T3 (pl) * 2018-11-07 2022-06-06 Applied Molecular Transport Inc. Konstrukty dostarczające do transcytozy i powiązane z nimi sposoby
WO2021034727A1 (en) 2019-08-16 2021-02-25 Applied Molecular Transport Inc. Compositions, formulations, and interleukin production and purification
WO2023196532A1 (en) * 2022-04-08 2023-10-12 Applied Molecular Transport Inc. Chimeric il-10/carrier constructs for treatment of pouchitis and methods of use

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009014650A2 (en) * 2007-07-20 2009-01-29 The General Hospital Corporation Recombinant vibrio cholerae exotoxins
CN102227447A (zh) * 2008-10-02 2011-10-26 新兴产品开发西雅图有限公司 Cd86拮抗物多靶点结合蛋白
WO2012101235A1 (en) * 2011-01-26 2012-08-02 Cenix Bioscience Gmbh Delivery system and conjugates for compound delivery via naturally occurring intracellular transport routes
WO2012110596A1 (en) * 2011-02-16 2012-08-23 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Fusion protein for the treatment of immunologic or allergic reactions
CN103249401A (zh) * 2010-09-15 2013-08-14 兰德尔·J·米斯尼 使用细菌毒素衍生的转运序列递送生物活性剂的系统和方法

Family Cites Families (84)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1014372A (en) 1910-12-01 1912-01-09 Bush Mfg Company Hinge.
US1013068A (en) 1911-09-09 1911-12-26 Frederick F Mcintosh Single-trigger gun mechanism.
US2643653A (en) 1951-07-19 1953-06-30 Heidrich John Pill injector
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
FR2504010B1 (fr) 1981-04-15 1985-10-25 Sanofi Sa Medicaments anticancereux contenant la chaine a de la ricine associee a un anticorps antimelanome et procede pour leur preparation
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
DE3377484D1 (en) 1982-04-19 1988-09-01 Nissan Motor Method for controlling reduction ratio of continuously variable transmission with acceleration compensation
US5272065A (en) 1983-10-20 1993-12-21 Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA
US5668255A (en) 1984-06-07 1997-09-16 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
US6022950A (en) 1984-06-07 2000-02-08 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
US4542225A (en) 1984-08-29 1985-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
US4659839A (en) 1984-10-10 1987-04-21 Mallinckrodt, Inc. Coupling agents for radiolabeled antibody fragments
DE3680924D1 (de) 1985-01-14 1991-09-26 Neorx Corp Metall-radionuklid markiertes protein fuer diagnose und therapie.
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4680338A (en) 1985-10-17 1987-07-14 Immunomedics, Inc. Bifunctional linker
US4699784A (en) 1986-02-25 1987-10-13 Center For Molecular Medicine & Immunology Tumoricidal methotrexate-antibody conjugate
US6051405A (en) 1986-09-24 2000-04-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Constructs encoding recombinant antibody-toxin fusion proteins
US4892827A (en) 1986-09-24 1990-01-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects
US5807832A (en) 1987-06-09 1998-09-15 Biotech Australia Pty Limited Oral delivery of biologically active substances bound to vitamin B12
US5997856A (en) 1988-10-05 1999-12-07 Chiron Corporation Method and compositions for solubilization and stabilization of polypeptides, especially proteins
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
DK0531434T3 (da) 1990-05-11 2000-01-31 Us Health Forbedrede Pseudomonas-exotoksiner med lav dyretoksicitet og høj cytocidal aktivitet
GB9112553D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Wellcome Found Fusion proteins
ES2109362T3 (es) 1991-06-21 1998-01-16 Univ Cincinnati Unas proteinas administrables oralmente y metodo para hacerlas.
US6613332B1 (en) 1991-06-21 2003-09-02 The University Of Cincinnati Oral administration of therapeutic proteins
US5487994A (en) * 1992-04-03 1996-01-30 The Johns Hopkins University Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease
WO1993025690A1 (en) 1992-06-18 1993-12-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Recombinant pseudomonas exotoxin with increased activity
DE69428521T2 (de) 1993-02-02 2002-05-23 Xoma Technology Ltd Arzneizusammensetzungen enthaltend ein bakterizides permeabilität erhöhendes protein und ein tensid
GB9401787D0 (en) 1994-01-31 1994-03-23 Medeva Holdings Bv Vaccine compositions
GB9320782D0 (en) 1993-10-08 1993-12-01 Univ Leeds Innovations Ltd Stabilising of proteins on solution
GB9420355D0 (en) 1994-10-10 1994-11-23 Univ Nottingham Preparation of protein microspheres, films and coatings
US5656730A (en) 1995-04-07 1997-08-12 Enzon, Inc. Stabilized monomeric protein compositions
US5912014A (en) 1996-03-15 1999-06-15 Unigene Laboratories, Inc. Oral salmon calcitonin pharmaceutical products
US5922680A (en) 1996-10-23 1999-07-13 Ferring, B.V. Stabilized composition for oral administration of peptides
NZ335005A (en) 1997-08-01 2000-12-22 Toray Industries Method for stabilizing cytokine using a compound arabic acid or the like
US6342611B1 (en) 1997-10-10 2002-01-29 Cytovia, Inc. Fluorogenic or fluorescent reporter molecules and their applications for whole-cell fluorescence screening assays for capsases and other enzymes and the use thereof
US6251392B1 (en) 1997-10-20 2001-06-26 Epicyte Pharmaceuticals, Inc. Epithelial cell targeting agent
US6592847B1 (en) 1998-05-14 2003-07-15 The General Hospital Corporation Intramolecularly-quenched near infrared flourescent probes
US7053200B1 (en) 1999-06-01 2006-05-30 Baylor College Of Medicine Compositions and methods for the therapeutic use of an atonal-associated sequence for deafness, osteoarthritis, and abnormal cell proliferation
HUP0203133A3 (en) 1999-10-04 2005-07-28 Chiron Corp Emeryville Stabilized liquid polypeptide-containing pharmaceutical compositions
US20030186386A1 (en) 2000-02-11 2003-10-02 Hansen Christian Karsten Interleukin 10
ES2332261T3 (es) 2000-11-27 2010-02-01 Powderject Vaccines, Inc. Adyuvantes de acidos nucleicos.
US6673574B2 (en) 2000-11-30 2004-01-06 Unigene Laboratories Inc. Oral delivery of peptides using enzyme-cleavable membrane translocators
US6573237B2 (en) 2001-03-16 2003-06-03 Eli Lilly And Company Protein formulations
US20050074462A1 (en) 2001-05-23 2005-04-07 Duotol Ab Supression of allergic reactions by transdermal administration of allergens conjugated to cholera toxin or fragments thereof
JP4623625B2 (ja) 2003-07-24 2011-02-02 株式会社ＡＭＢｉＳ ヘテロ型５量体組換えワクチン
EP1522585A1 (en) 2003-10-09 2005-04-13 Plant Research International B.V. Chimeric carrier molecules for the production of mucosal vaccines
HUE026000T2 (en) * 2003-12-17 2016-04-28 Wyeth Llc Immunogenic peptide-bearing conjugates and methods for their preparation
US20080317761A1 (en) 2004-04-28 2008-12-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Peptide-Mediated Protein Transduction Into Cells of the Hematopoietic Lineage
US20050281885A1 (en) 2004-06-21 2005-12-22 Egilmez Nejat K Method for treating inflammatory bowel disease by oral administration of IL-10
WO2006135428A2 (en) 2004-10-04 2006-12-21 Trinity Biosystems, Inc. Methods and compositions for inducing an immune response against multiple antigens
AU2005296064A1 (en) 2004-10-04 2006-04-27 Trinity Biosystems, Inc. Methods and compositions for needleless delivery of macromolecules
US7998930B2 (en) 2004-11-04 2011-08-16 Hanall Biopharma Co., Ltd. Modified growth hormones
EP3006458B1 (en) 2005-07-29 2017-11-22 The Government of the United States of America, as represented by the Secretary of Health and Human Services Mutated pseudomonas exotoxins with reduced antigenicity
US20090148401A1 (en) 2005-12-05 2009-06-11 Trinity Biosystems, Inc. Methods and compositions for needleless delivery of binding partners
CA2647168A1 (en) 2006-03-16 2007-09-27 Trinity Biosystems, Inc. Methods for increasing the size of animals using needleless delivery constructs
WO2008011157A2 (en) 2006-07-20 2008-01-24 The General Hospital Corporation Methods, compositions, and kits for the selective activation of protoxins through combinatorial targeting
US20090092660A1 (en) 2006-08-09 2009-04-09 Trinity Biosystems, Inc. Methods and compositions for needleless delivery of particles
US20100196277A1 (en) 2006-10-09 2010-08-05 The University Of North Carolina At Chapel Hill Nanoparticle compositions for controlled delivery of nucleic acids
EP3351270A1 (en) 2007-05-23 2018-07-25 The Trustees of the University of Pennsylvania Targeted carriers for intracellular drug delivery
CN101361968B (zh) 2007-08-06 2011-08-03 健能隆医药技术（上海）有限公司 白介素-22在治疗脂肪肝中的应用
US20110177155A1 (en) 2007-08-21 2011-07-21 Immune Disease Institute, Inc. Methods of delivery of agents to leukocytes and endothelial cells
JP5670875B2 (ja) 2008-03-17 2015-02-18 ウニベルジテーツクリニクム ミュンスター カーゴ分子の送達ビヒクルおよび炎症反応を免疫調節するための生物学的治療剤としてのＹｏｐＭ
US20110250199A1 (en) * 2008-06-04 2011-10-13 The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Department.... Immunotoxins and uses thereof
US20120258104A1 (en) 2009-07-22 2012-10-11 Cenix Bioscience Gmbh Delivery System and Conjugates For Compound Delivery Via Naturally Occurring Intracellular Transport Routes
WO2011031441A1 (en) 2009-08-28 2011-03-17 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Therapy with a chimeric molecule and a pro-apoptotic agent
AU2012275112B2 (en) * 2011-06-29 2017-07-06 Rani Therapeutics, Llc Therapeutic agent preparations for delivery into a lumen of the intestinal tract using a swallowable drug delivery device
JP2016526014A (ja) 2013-04-24 2016-09-01 アルモ・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド インターロイキン−１０組成物及びその使用
CN112386680A (zh) 2013-11-07 2021-02-23 纪念斯隆–凯特林癌病中心 在胃肠道移植物抗宿主病的治疗中使用il-22的方法
CN104623637A (zh) 2013-11-07 2015-05-20 健能隆医药技术（上海）有限公司 Il-22二聚体在制备静脉注射药物中的应用
EP3099704B1 (en) 2014-01-27 2021-03-17 Molecular Templates, Inc. Mhc class i epitope delivering polypeptides
KR102598038B1 (ko) 2014-05-07 2023-11-07 어플라이드 몰레큘라 트랜스포트 인크. 생물학적 활성 화물의 경구 전달용 콜릭스 독소-유래 융합 분자
CN107106655A (zh) 2014-10-22 2017-08-29 阿尔莫生物科技股份有限公司 使用白细胞介素‑10治疗疾病和病症的方法
WO2016146833A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Biomarkers for nad(+)-diphthamide adp ribosyltransferase resistance
US20190255107A1 (en) 2015-10-09 2019-08-22 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Modulation of novel immune checkpoint targets
WO2017118985A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Yeda Research And Development Co. Ltd. Compositions and methods for treating malignant, autoimmune and inflammatory diseases
EP3192805A1 (en) 2016-01-15 2017-07-19 Humanitas Mirasole S.p.A. Inhibitors of t cell activation or stimulation and uses thereof
WO2017210684A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 New York University Methods and reagents for modulating macrophage phenotype
JP7084881B2 (ja) 2016-06-22 2022-06-15 アルカームス インコーポレーテッド Ｉｌ－１０の免疫刺激特性および抗炎症特性を調節するための組成物および方法
WO2018112264A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a chemokine/chemokine receptor inhibitor
US11523772B2 (en) 2016-12-14 2022-12-13 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunosuppressant
WO2018183931A1 (en) 2017-03-30 2018-10-04 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with il-10 or an il-10 agonist
CA3093386A1 (en) 2018-03-08 2019-09-12 Applied Molecular Transport Inc. Toxin-derived delivery constructs for oral delivery
JP2022512976A (ja) 2018-11-07 2022-02-07 アプライド モレキュラー トランスポート インコーポレイテッド 異種ペイロードの経口送達のためのコリックス由来担体

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009014650A2 (en) * 2007-07-20 2009-01-29 The General Hospital Corporation Recombinant vibrio cholerae exotoxins
CN102227447A (zh) * 2008-10-02 2011-10-26 新兴产品开发西雅图有限公司 Cd86拮抗物多靶点结合蛋白
CN103249401A (zh) * 2010-09-15 2013-08-14 兰德尔·J·米斯尼 使用细菌毒素衍生的转运序列递送生物活性剂的系统和方法
WO2012101235A1 (en) * 2011-01-26 2012-08-02 Cenix Bioscience Gmbh Delivery system and conjugates for compound delivery via naturally occurring intracellular transport routes
WO2012110596A1 (en) * 2011-02-16 2012-08-23 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Fusion protein for the treatment of immunologic or allergic reactions

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RENE´ JØRGENSEN ET AL.: ""Cholix Toxin, a Novel ADP-ribosylating Factor from Vibrio cholerae"", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
常雁红 等: "《生物化学》", 冶金工业出版社 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113347997A (zh) * 2018-11-07 2021-09-03 应用分子运输公司 用于经口递送异源有效载荷的Cholix衍生的携带体
CN114555058A (zh) * 2019-08-16 2022-05-27 应用分子转运公司 用于有效载荷递送的组合物和颗粒

Also Published As

Publication number Publication date
ES2900328T3 (es) 2022-03-16
CN117298254A (zh) 2023-12-29
PL3139965T3 (pl) 2022-01-31
JP6759188B2 (ja) 2020-09-23
JP7125453B2 (ja) 2022-08-24
PH12016502447A1 (en) 2017-03-06
MX2021010666A (es) 2021-10-13
MX2016014548A (es) 2017-06-27
CA2948346C (en) 2023-06-27
US10786556B2 (en) 2020-09-29
AU2015255834A1 (en) 2016-12-22
US20190117744A1 (en) 2019-04-25
RU2723178C2 (ru) 2020-06-09
IL285716B (en) 2022-09-01
EP3998077A1 (en) 2022-05-18
AU2015255834B2 (en) 2020-05-21
EP3139965A2 (en) 2017-03-15
BR112016025866A2 (pt) 2017-12-12
JP2021008468A (ja) 2021-01-28
WO2015171965A3 (en) 2016-03-17
EP3139965A4 (en) 2018-04-11
US20200030417A1 (en) 2020-01-30
EP3139965B1 (en) 2021-09-29
KR20170013893A (ko) 2017-02-07
RU2016147734A3 (zh) 2019-02-14
WO2015171965A2 (en) 2015-11-12
IL285716A (en) 2021-09-30
IL248768B (en) 2021-09-30
KR102598038B1 (ko) 2023-11-07
US20190117742A1 (en) 2019-04-25
SG11201610183XA (en) 2017-01-27
JP2017519039A (ja) 2017-07-13
KR20230154480A (ko) 2023-11-08
US10799565B2 (en) 2020-10-13
US10624957B2 (en) 2020-04-21
PH12016502447B1 (en) 2017-03-06
US20170151307A1 (en) 2017-06-01
US10130688B2 (en) 2018-11-20
US10786555B2 (en) 2020-09-29
PH12021551189A1 (en) 2022-02-21
PT3139965T (pt) 2021-12-27
DK3139965T3 (da) 2021-11-22
US20190105375A1 (en) 2019-04-11
US20170281736A1 (en) 2017-10-05
CA2948346A1 (en) 2015-11-12
US20190117743A1 (en) 2019-04-25
US20210205420A1 (en) 2021-07-08
IL248768A0 (en) 2017-01-31
US10624955B2 (en) 2020-04-21
AU2020207779A1 (en) 2020-08-06
SI3139965T1 (sl) 2022-01-31
RU2016147734A (ru) 2018-06-08
US10624956B2 (en) 2020-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106470707A (zh) 用于口服递送生物活性货物的cholix毒素衍生的融合分子
US10617741B2 (en) Compositions and methods for oral delivery of therapeutic cargo
US20220226445A1 (en) Cholix toxin-derived fusion molecules for oral delivery of biologically active cargo
US20240131118A1 (en) Cholix toxin-derived fusion molecules for oral delivery of biologically active cargo

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20211104

Address after: California, USA

Applicant after: Applied molecular transportation Co.

Address before: California, USA

Applicant before: APPLIED MOLECULAR TRANSPORT LLC