ES2920428T3 - Constructos de administración derivados de toxinas para la administración oral - Google Patents

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Weijun Feng
Thomas Carl Hunter
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Abstract

La presente divulgación se relaciona con construcciones de entrega aisladas no naturales que comprenden una construcción de suministro derivada de toxinas bacterianas junto con una carga terapéutica biológicamente activa; en el que la construcción de entrega es capaz de administrar la carga biológicamente activa a través del transporte de transcitosis a través de una célula epitelial; y en el que la construcción de suministro no comprende un dominio de translocación derivado de toxinas bacterianas o un dominio catalítico (citotóxico) derivado de la toxina bacteriana. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Constructos de administración derivados de toxinas para la administración oral
REFERENCIA CRUZADA
Esta solicitud reivindica el beneficio de las Solicitudes Provisionales de Estados Unidos N° 62/640.168 presentada el 8 de marzo de 2018; 62/640.188 presentada el 8 de marzo de 2018; y 62/640.194 presentada el 8 de marzo.
LISTADO DE SECUENCIAS
La presente solicitud contiene un listado de secuencias en forma de una "copia en papel" (archivo PDF) y un archivo que contiene las secuencias a las que se hace referencia (SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 221) en forma legible por computadora (archivo de texto en formato ST25) que se presenta en el presente. El listado de secuencias se muestra usando un código estándar de tres letras para aminoácidos, como se define en 37 C.F.R. 1.822. Dicha copia ASCII, creada el 8 de marzo de 2019, se denomina 40566-711_601_SL.txt y tiene un tamaño de 350.816 bytes.
ANTECEDENTES
El epitelio intestinal ha frustrado los esfuerzos para administrar por vía oral productos biológicos de moléculas grandes porque las proteínas no pueden difundirse a través de la barrera o colarse a través de las uniones estrechas. Cuando son absorbidos por endocitosis, la única ruta que les queda, típicamente se degradan en los lisosomas en lugar de ser transportados al cuerpo. Esta incapacidad de absorberse fácilmente a través del epitelio intestinal continúa siendo un factor limitante en el desarrollo de formulaciones orales comercialmente viables de estos agentes. La solución más común es usar la administración sistémica, pero eso a menudo puede crear efectos secundarios considerables y reducir la comodidad del paciente que afecta negativamente al cumplimiento. Hsu et al. analiza la vacunación contra la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) usando repeticiones de GnRH conjugadas con el dominio de unión al receptor de la toxina. La WO 2015/171965 divulga moléculas de fusión derivadas de toxina cholix para la administración oral de cargas biológicamente activas.
SUMARIO
La presente invención proporciona un constructo de administración aislado que comprende: un portador, en donde el portador consiste de una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5; y una carga biológicamente activa acoplada al portador, en donde el constructo de administración aislado es capaz de transcitosar a través de una célula epitelial polarizada.
La invención también proporciona un constructo de administración aislado que comprende: un portador de cholix que tiene como máximo 265 aminoácidos, en donde el portador de cholix comprende un dominio I de una exotoxina de cholix, o una versión truncada y/o modificada de la misma, y una carga biológicamente activa acoplada al portador, en donde el portador de cholix es capaz de administrar la carga biológicamente activa a través de una célula epitelial polarizada mediante transcitosis.
La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un constructo de administración aislado de acuerdo con la invención para su uso en terapia.
La presente divulgación proporciona métodos y composición para el transporte y/o la administración de una molécula de carga a ciertas localizaciones dentro de una célula (por ejemplo, una localización supranuclear) o a través de una célula (por ejemplo, una célula epitelial), ya sea in vitro o in vivo (por ejemplo, en un roedor o un humano). Dicha carga puede dirigirse a un conjunto de localizaciones acoplándola a una molécula portadora. Tal molécula portadora puede interactuar con receptores únicos tanto en la superficie celular como intracelularmente para la administración dirigida de la carga. Varios de tales portadores, cargas y usos de los mismos se describen en la presente.
La divulgación proporciona un constructo de administración aislado que puede comprender: un portador derivado de un dominio I de una exotoxina y que carece de un dominio II, un dominio Ib y un dominio III de la exotoxina; acoplado a una carga heteróloga. El portador puede consistir esencialmente del dominio I de la exotoxina. El constructo de administración puede administrar la carga heteróloga de acuerdo con uno o más de los siguientes: a través de una célula epitelial a través de transcitosis; al lado basal de la célula epitelial; a una región supranuclear dentro de la célula epitelial; o al interior de la célula epitelial por endocitosis. En algunos aspectos, el portador está configurado para administrar una carga heteróloga al lado basal de una célula epitelial.
La divulgación proporciona un constructo de administración aislado que puede comprender: un portador quimérico que comprende un dominio de direccionamiento epitelial intracelular; acoplado a una carga heteróloga.
La divulgación proporciona un constructo de administración aislado que puede comprender: un portador quimérico que comprende un dominio de direccionamiento epitelial supranuclear; acoplado a la carga heteróloga.
La divulgación proporciona un constructo de administración aislado que puede comprender: un portador acoplado a una carga heteróloga, en donde el portador interactúa con uno o más de ribofilina 1, SEC24, CK-8, TMEM132, GRP75, ERGIC-53 o perlecán, y no muestra interacción con uno o más de una clatrina o GPR78, o una combinación de los mismos. La interacción puede ser una interacción selectiva. La interacción puede ser una interacción dependiente del pH. La interacción del portador con uno o más de ribofilina 1, SEC24, cK-8, TMEM132, GRP75, ERGIC-53 o perlecán puede producirse en una superficie de la célula epitelial, en el interior de una célula epitelial o en un combinación de los mismos. La administración de la carga heteróloga a través de la célula epitelial puede producirse in vitro desde la superficie apical de la célula epitelial hasta un compartimento basolateral. La administración de la carga heteróloga puede producirse in vitro desde la superficie apical de la célula epitelial al interior de la célula epitelial. La administración de la carga heteróloga puede producirse in vitro desde la superficie apical de la célula epitelial hasta la región supranuclear dentro de la célula epitelial. La interacción del portador con uno o más de ribofilina 1, SEC24, CK-8, TMEM132, GRP75, ERGIC-53 o perlecán, o la combinación de los mismos, puede producirse in vitro en la superficie apical de la célula epitelial, en el interior de la célula epitelial, o una combinación de los mismos. La célula epitelial puede ser una célula epitelial polarizada. La célula epitelial polarizada puede formar parte de una monocapa de células epiteliales polarizadas. La célula epitelial polarizada puede ser de un roedor o de un humano. La célula epitelial polarizada puede ser de un humano. La célula epitelial polarizada humana puede ser una célula epitelial intestinal polarizada humana. La célula epitelial intestinal polarizada humana puede ser una célula Caco-2. La administración de la carga heteróloga a través de la célula epitelial puede producirse in vivo desde el intestino de un sujeto hasta un compartimento basolateral de un sujeto. La administración de la carga heteróloga puede producirse in vivo desde el intestino de un sujeto al interior de la célula epitelial de un sujeto. La administración de la carga heteróloga puede producirse in vivo desde el intestino de un sujeto a la región supranuclear dentro de la célula epitelial de un sujeto. La interacción del portador con uno o más de ribofilina 1, SEC24, CK-8, TMEM132, GRP75, ERGIC-53 y perlecán, o la combinación de los mismos, puede producirse in vivo en la superficie apical de la célula epitelial de un sujeto, en el interior de la célula epitelial del sujeto, o una combinación de los mismos. El sujeto puede ser un roedor o un humano. El sujeto puede ser un humano y estar afectado por uno o más de los siguientes: enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, sepsis bacteriana, lupus eritematoso sistémico (SLE), pénfigo vulgar, miastenia grave, anemia hemolítica, púrpura trombocitopénica, enfermedad de Grave, enfermedad de Sjogren, dermatomiositis, enfermedad de Hashimoto, polimiositis, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple (MS), diabetes mellitus, artritis reumatoide, esclerodermia, linfomas no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemia linfocítica crónica, leucemia de células pilosas, leucemia linfoblástica aguda, mieloma múltiple, carcinomas de vejiga, riñón, ovario, cuello uterino, mama, pulmón, nasofaringe, melanoma maligno, NHL resistente a rituximab o leucemia, diabetes, obesidad, diabetes como consecuencia de la obesidad, hiperglucemia, dislipidemia, hipertrigliceridemia, síndrome X, resistencia a la insulina, tolerancia a la glucosa alterada (IGT), dislipidemia diabética, hiperlipidemia, deficiencia de la hormona del crecimiento (GHD), síndrome de Turner (TS), síndrome de Noonan, síndrome de Prader-Willi, deficiencia del gen que contiene homeobox (SHOX) de estatura corta, insuficiencia renal crónica o síndrome de intestino corto idiopático de baja estatura. La célula epitelial puede ser una célula epitelial polarizada. La célula epitelial polarizada puede ser una célula epitelial intestinal polarizada. El portador puede ser una molécula pequeña, un polipéptido, un aptámero o una combinación de los mismos. El portador puede ser una molécula pequeña. El portador puede ser un polipéptido. El polipéptido puede ser un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo. El portador puede ser un aptámero. El portador puede derivarse de una exotoxina. El portador puede derivarse de un dominio I de la exotoxina y carece de un dominio II, un dominio Ib y un dominio III de la exotoxina. El portador que puede derivarse de un dominio I de una exotoxina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del dominio I de la exotoxina, o por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma, en donde la exotoxina es una toxina de Cholix o una exotoxina A de Pseudomonas. En algunos aspectos, el portador comprende por lo menos 110 residuos de aminoácidos del dominio I de la exotoxina. En algunos aspectos, el portador comprende por lo menos 50 residuos de aminoácidos contiguos del dominio I de la exotoxina. El portador que carece del dominio II, el dominio Ib y el dominio III de la exotoxina puede comprender una porción del dominio II, el dominio Ib o el dominio III de la exotoxina, o una combinación de los mismos. La porción no puede comprender más del 70% de los residuos de aminoácidos del dominio II, el dominio Ib o el dominio III de la exotoxina. La exotoxina puede ser una toxina de Cholix. El portador puede comprender: una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5 o por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma, y no más de 347 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1. El portador puede comprender una deleción o mutación en uno o más de los residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5. El portador puede comprender: una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5 o por lo menos un 90% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma, y no más de 347 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1. El portador puede comprender: una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5 o por lo menos un 95% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma, y no más de 347 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1. El portador puede comprender: una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5 o por lo menos un 99% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma, y no más de 347 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1. El portador puede comprender: una secuencia de aminoácidos que tiene un 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5 o un 100% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma, y no más de 347 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1. El portador puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5 o un fragmento funcional de la misma. El portador puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7 o un fragmento funcional de la misma. El portador puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 9 o un fragmento funcional de la misma. El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, un fragmento funcional de las mismas, o cualquier combinación de las mismas. El portador puede comprender una estructura espacial en la que uno o más residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148 o la SEQ ID NO: 149 están muy cerca de uno o más residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 151, y uno o más residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148 o la SEQ ID NO: 149 están muy cerca de uno o más residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 152. El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 30 o la SEQ ID NO: 31 o la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11 o por lo menos 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. El portador puede comprender una deleción o mutación en uno o más de los residuos de aminoácidos 1-187 o 1-206 de la SEQ ID NO: 11 o 1-186 o 1-205 de la SEQ ID NO: 10. El portador puede comprender los residuos 1-187 de la SEQ ID NO: 30 o 1-186 de la SEQ ID NO: 31 y no más de 206 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1. El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de la SEQ ID NO: 10 - SEQ ID NO: 31 o por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. El portador puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 11 o un fragmento funcional de la misma. El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 106 o la SEQ ID NO: 107 o la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 30 o la SEQ ID NO: 31 o por lo menos 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. El portador puede comprender una deleción o mutación en uno o más de los residuos de aminoácidos 1-151 o 1-187 de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5. El portador puede carecer de uno o más de los residuos de aminoácidos 1­ 39 de la SEQ ID NO: 5 o de los residuos de aminoácidos 1-38 de la SEQ ID NO: 4. El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 69 o la SEQ ID NO: 70 o un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. El portador puede comprender los residuos 1-151 de la SEQ ID NO: 5 o los residuos 1-150 de la SEQ ID NO: 4 y no más de 187 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1 El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de la SEQ ID NO: 30 - SEQ ID NO: 107 o por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. El portador puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 30 o la SEQ ID NO: 31 o un fragmento funcional de la misma. El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 106 o la SEQ ID NO: 107 o la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 124 o la SEQ ID NO: 125 o por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. El portador puede comprender una deleción o mutación en uno o más de los residuos de aminoácidos 1-150 de la SEQ ID NO: 6 o en uno o más de los residuos de aminoácidos 1-151 de la SEQ ID NO: 7. El portador puede comprender los residuos 1-134 de la SEQ ID NO: 5 o los residuos 1-133 de la SEQ ID NO: 4 y no más de 151 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1. El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 106 - SEQ ID NO: 125 o por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. El portador puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 106 o la SEQ ID NO: 107 o un fragmento funcional de las mismas. El portador o constructo de administración aislado puede comprender por lo menos una, pero no más de 20 cadenas beta. La exotoxina puede ser una exotoxina A de Pseudomonas. El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 137 o por lo menos un 80% de identidad con un fragmento funcional de la misma. El portador puede comprender una deleción o mutación en uno o más de los residuos de aminoácidos 1-252 de la SEQ ID NO: 137. El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de 1-252 de la SEQ ID NO: 137 o por lo menos un 90% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de 1-252 de la SEQ ID NO: 137 o por lo menos un 95% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de 1-252 de la SEQ ID NO: 137 o por lo menos un 99% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 100% con la secuencia de aminoácidos 1-252 de la SEQ ID NO: 137 o una identidad de secuencia del 100% con un fragmento funcional de la misma. El portador puede comprender no más de 252 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 134. En algunos aspectos, el portador comprende los residuos 1-252 de la SEQ ID NO: 134. El portador puede comprender por lo menos un residuo de metionina N-terminal. El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 125, o un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. El constructo de administración puede formar un multímero. El multímero puede formarse por multimerización de la carga heteróloga. El multímero puede ser un heterómero o un homómero. El homómero puede ser un homodímero. El homodímero puede formarse por dimerización de la carga heteróloga.
El portador puede acoplarse químicamente o acoplarse recombinantemente a la carga heteróloga. El portador puede acoplarse covalentemente a la carga heteróloga. La carga heteróloga puede acoplarse al extremo C terminal del portador. La carga heteróloga puede acoplarse al extremo N terminal del portador. El portador puede acoplarse directamente a la carga heteróloga. El portador puede acoplarse indirectamente a la carga heteróloga. El portador puede acoplarse a la carga heteróloga a través de un espaciador. El espaciador puede comprender un espaciador de aminoácidos. El espaciador de aminoácidos puede tener entre 1 y 50 residuos de aminoácidos de longitud. El espaciador de aminoácidos puede comprender uno o más residuos de glicina y uno o más residuos de serina. El espaciador puede ser un espaciador escindible. El espaciador escindible puede comprender una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 174 - SEQ ID NO: 206. El espaciador puede ser un espaciador no escindible. El espaciador no escindible puede comprender una o más de las secuencias de aminoácidos GGGGS (SEQ ID NO: 207), GGGGS (SEQ ID NO: 208), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 209), GGGGSGGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 210), o GGGGSGGG (SEQ ID NO: 211). El espaciador no escindible puede comprender una o más de (GGGGS)x(SEQ ID NO: 212), en donde x = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. El espaciador no escindible puede comprender una o más de (GS)x(SEQ ID NO: 213), en donde x = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. El espaciador puede comprender uno o más fragmentos del dominio II, el dominio Ib o el dominio III de la exotoxina, o una combinación de los mismos. El espaciador puede comprender como máximo 80 residuos de aminoácidos del dominio II, 80 residuos de aminoácidos del dominio III o una combinación de los mismos. La carga heteróloga puede ser una macromolécula, una molécula pequeña, un polipéptido, un ácido nucleico, un ARNm, un ARNmi, un ARNhc, un ARNip, una molécula antisentido, un anticuerpo, un ADN, un plásmido, una vacuna, un polímero, una nanopartícula, o un material catalíticamente activo. La carga heteróloga puede ser una carga biológicamente activa. La carga biológicamente activa puede ser una citoquina, una hormona, un anticuerpo terapéutico, un fragmento funcional del mismo o cualquier combinación de los mismos. La citoquina puede ser IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL- 19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29 o IL-30. La citoquina puede tener la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 217 o la SEQ ID NO: 218. La hormona puede tener la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 215 o la SEQ ID NO: 216. El anticuerpo terapéutico puede ser un anticuerpo anti-TNFa. El anticuerpo anti-TNFa puede ser adalimumab o infliximab. La carga heteróloga puede ser un agente detectable. El agente detectable puede ser un fluoróforo, un agente de contraste, un agente de contraste de rayos X, un agente PET, una nanopartícula o un radioisótopo. El fluoróforo puede ser una proteína fluorescente roja (RFP). La RFP puede tener la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 220.
Un constructo de administración de la presente divulgación puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las s Eq ID NO: 155, SEQ ID NO: 156 o SEQ ID NO: 158 - SEQ ID NO: 165, o por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. Un constructo de administración de la presente divulgación puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156 o SEQ ID NO: 158 - SEQ ID NO: 165, o por lo menos un 90% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. Un constructo de administración de la presente divulgación puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las s Eq ID NO: 155, SEQ ID NO: 156 o SEQ ID NO: 158 - SEQ ID NO: 165, o por lo menos un 95% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. Un constructo de administración de la presente divulgación puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156 o SEQ ID NO: 158 - SEQ ID NO: 165, o por lo menos un 99% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. Un constructo de administración de la presente divulgación puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 100% con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156 o SEQ ID NO: 158 - SEQ ID NO: 165, o un 100% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas.
La presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende: un constructo de administración aislado como se describe en la presente; y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición puede formularse para administración oral, administración tópica, administración pulmonar, administración intranasal, administración bucal, administración sublingual o administración ocular. La composición puede formularse para administración oral. La composición puede formularse en una cápsula o comprimido.
La presente divulgación proporciona un método para administrar una carga heteróloga a través de una célula epitelial, el método puede comprender: aplicar un constructo de administración a la superficie apical de la célula epitelial; y administrar el constructo de administración al lado basal de la célula epitelial a una velocidad mayor de 10-6 cm/seg, en donde el constructo de administración comprende: un portador; acoplado a la carga heteróloga. En algunos aspectos, el método comprende además liberar el constructo de administración desde el lado basal de la célula epitelial después de la administración a través de la célula epitelial. En algunos aspectos, el portador está configurado para administrar una carga heteróloga al lado basal de una célula epitelial.
La presente divulgación proporciona un método para administrar una carga heteróloga al interior de una célula epitelial mediante endocitosis, el método puede comprender: aplicar un constructo de administración a la superficie apical de la célula epitelial; y administrar el constructo de administración al interior de la célula epitelial mediante endocitosis, en donde el constructo de administración comprende: un portador; acoplado a la carga heteróloga.
La presente divulgación proporciona un método para administrar una carga heteróloga a una región supranuclear dentro de una célula epitelial mediante endocitosis, el método puede comprender: aplicar un constructo de administración a la superficie apical de una célula epitelial; y administrar el constructo de administración a la región supranuclear dentro de la célula epitelial mediante endocitosis, en donde el constructo de administración comprende: un portador; acoplado a la carga heteróloga.
La presente divulgación proporciona un método para interactuar con ribofilina 1, SEC24, CK-8, TMEM132, GRP75, ERGIC-53 o perlecán, o una combinación de los mismos, el método puede comprender: aplicar un constructo de administración a la superficie apical de la célula epitelial; e interactuar el constructo de administración con la ribofilina 1, SEC24, CK-8, TMEM132, GRP75, ERGIC-53 o perlecán, o la combinación de los mismos, en donde el constructo de administración comprende: un portador; acoplado a una carga heteróloga. El portador puede interactuar con uno o más de ribofilina 1, SEC24, CK-8, TMEM132, GRP75, ERGIC-53 o perlecán, o la combinación de los mismos, y no muestra interacción con uno o más de una clatrina o GPR78, o una combinación de los mismos. La interacción puede ser una interacción selectiva o una interacción dependiente del pH, o una combinación de las mismas. La interacción del portador con uno o más de ribofilina 1, SEC24, CK-8, TMEM132, GRP75, ERGIC-53 o perlecán puede producirse en una superficie de una célula epitelial, en el interior de una célula epitelial, o una combinación de los mismos.
La presente divulgación proporciona un método para tratar una enfermedad en un sujeto con necesidad de ello, el método puede comprender administrar al sujeto un constructo de administración que comprende: un portador; acoplado a una carga heteróloga; en donde el constructo de administración es capaz de administrar la carga heteróloga al interior de una célula epitelial.
La presente divulgación proporciona una composición que comprende un constructo de administración que comprende: un portador derivado de un dominio I de una exotoxina y que carece de un dominio II, un dominio Ib y un dominio III de la exotoxina; acoplado a una carga heteróloga; para su uso en un método para tratar una enfermedad en un sujeto con necesidad de ello, el método puede comprender administrar al sujeto el constructo de administración que comprende: un portador derivado de un dominio I de una exotoxina y que carece de un dominio II, un dominio Ib y un dominio III de la exotoxina; acoplado a una carga heteróloga; en donde el constructo de administración es capaz de administrar la carga heteróloga mediante transcitosis a través de una célula epitelial.
La presente divulgación proporciona una composición que comprende un constructo de administración aislado que comprende: un portador derivado de un dominio I de una exotoxina y que carece de un dominio II, un dominio Ib y un dominio III de la exotoxina; acoplado a una carga heteróloga; para su uso en un método de diagnosticar una enfermedad en un sujeto con necesidad de ello, el método puede comprender administrar al sujeto el constructo de administración que comprende: un portador derivado de un dominio I de una exotoxina y que carece de un dominio II, un dominio Ib y un dominio III de la exotoxina; acoplado a una carga heteróloga; en donde el constructo de administración es capaz de administrar la carga heteróloga mediante transcitosis a través de una célula epitelial. La administración de la carga heteróloga a través de la célula epitelial puede producirse in vitro desde la superficie apical de la célula epitelial hasta un compartimento basolateral. La administración de la carga heteróloga puede producirse in vitro desde la superficie apical de la célula epitelial al interior de la célula epitelial. La administración de la carga heteróloga puede producirse in vitro desde la superficie apical de la célula epitelial hasta la región supranuclear dentro de la célula epitelial. La interacción del portador con uno o más de ribofilina 1, SEC24, CK-8, TMEM132, GRP75, ERGIC-53 o perlecán, o la combinación de los mismos, puede producirse in vitro en la superficie apical de la célula epitelial, en el interior de la célula epitelial, o una combinación de los mismos. La célula epitelial puede ser una célula epitelial polarizada. La célula epitelial polarizada puede ser parte de una monocapa de células epiteliales polarizadas. La célula epitelial polarizada puede ser de un roedor. La célula epitelial polarizada puede ser de un humano. La célula epitelial polarizada humana puede ser una célula epitelial intestinal polarizada humana. La célula epitelial intestinal polarizada humana puede ser una célula Caco-2. La administración de la carga heteróloga a través de la célula epitelial puede producirse in vivo desde el intestino de un sujeto hasta un compartimento basolateral del sujeto. La administración de la carga heteróloga puede producirse in vivo desde el intestino de un sujeto al interior de la célula epitelial del sujeto. La administración de la carga heteróloga puede producirse in vivo desde el intestino de un sujeto a la región supranuclear dentro de la célula epitelial del sujeto. La interacción del portador con uno o más de ribofilina 1, SEC24, Ck-8, TMEM132, GRP75, ERGiC-53 y perlecán, o la combinación de los mismos, puede producirse in vivo en la superficie apical de la célula epitelial de un sujeto, en el interior de la célula epitelial del sujeto, o una combinación de los mismos. El sujeto puede ser un roedor o un humano. La célula epitelial puede ser una célula epitelial polarizada. La célula epitelial polarizada puede ser una célula epitelial intestinal polarizada. El método puede comprender además la formulación del constructo de administración para la administración al sujeto. La formulación puede comprender uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. El constructo de administración puede formularse para administración oral, administración tópica, administración pulmonar, administración intranasal, administración bucal, administración sublingual o administración ocular. La composición puede formularse para administración oral. La enfermedad puede ser una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmune, un cáncer, una enfermedad metabólica, una enfermedad del hígado graso, o un trastorno de crecimiento por deficiencia de hormona de crecimiento. La enfermedad inflamatoria puede ser una enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis o sepsis bacteriana. La enfermedad inflamatoria intestinal puede ser enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis colágena, colitis linfocítica, colitis isquémica, colitis por derivación, síndrome de Behcet o colitis indeterminada. La enfermedad autoinmune puede ser lupus eritematoso sistémico (SLE), pénfigo vulgar, miastenia grave, anemia hemolítica, púrpura trombocitopénica, enfermedad de Graves, enfermedad de Sjogren, dermatomiositis, enfermedad de Hashimoto, polimiositis, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple (MS), diabetes mellitus, artritis reumatoide o esclerodermia. El cáncer puede ser un linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemia linfocítica crónica, leucemia de células pilosas, leucemia linfoblástica aguda, mieloma múltiple, carcinomas de vejiga, riñón, ovario, cuello uterino, mama, pulmón, nasofaringe, melanoma maligno, NHL resistente a rituximab, o leucemia. La enfermedad metabólica puede ser diabetes, obesidad, diabetes como consecuencia de la obesidad, hiperglucemia, dislipidemia, hipertrigliceridemia, síndrome X, resistencia a la insulina, tolerancia a la glucosa alterada (IGT), dislipidemia diabética o hiperlipidemia. El portador puede ser una molécula pequeña. El portador puede ser un polipéptido. El polipéptido puede ser un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo. El portador puede ser un aptámero. El portador puede derivarse de una exotoxina. El portador puede derivarse de un dominio I de la exotoxina y carece de un dominio II, un dominio Ib y un dominio III de la exotoxina. El portador puede derivarse de un dominio I de una exotoxina y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del dominio I de la exotoxina, o por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma, en donde la exotoxina es una toxina de Cholix o una exotoxina A de Pseudomonas. El portador puede comprender por lo menos 130 residuos de aminoácidos del dominio I de la exotoxina. El portador puede comprender por lo menos 150 residuos de aminoácidos contiguos del dominio I de la exotoxina. El portador que carece del dominio II y el dominio III de la exotoxina puede comprender una porción del dominio II o el dominio III de la exotoxina, o una combinación de los mismos. La porción comprende no más de 82 de los residuos de aminoácidos del dominio II o del dominio III de la exotoxina. La exotoxina puede ser una toxina de Cholix. El portador puede comprender: una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5 o por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas, y no más de 347 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1. El portador puede comprender una deleción o mutación en uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5. El portador puede comprender: una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5 o por lo menos un 90% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas, y no más de 347 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1. El portador puede comprender: una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5 o por lo menos un 95% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas, y no más de 347 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1. El portador puede comprender: una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5 o por lo menos un 99% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas, y no más de 347 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1. El portador puede comprender: una secuencia de aminoácidos que tiene un 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5 o un 100% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas, y no más de 347 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1. El portador puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5 o un fragmento funcional de las mismas. En algunos aspectos, el portador comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 7 o un fragmento funcional de las mismas. El portador puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 9 o un fragmento funcional de las mismas. El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, un fragmento funcional de las mismas, o cualquier combinación de los mismos. El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ Id NO: 30 o la SEQ ID NO: 31 o la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 11 o por lo menos 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. El portador puede comprender una deleción o mutación en uno o más de los residuos de aminoácidos 1-187 o 1-206 de la SEQ ID NO: 5 o uno o más de los residuos de aminoácidos 1-186 o 1­ 205 de la SEQ ID NO: 4. El portador puede comprender los residuos 1-187 de la SEQ ID NO: 5 o los residuos 1-186 de la SEQ ID NO: 4 y no más de 206 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1. El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 31 o por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. El portador puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 11 o un fragmento funcional de las mismas. El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 106 o la SEQ ID NO: 107 o la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 30 o la SEQ ID NO: 31 o por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. El portador puede comprender una deleción o mutación en uno o más de los residuos de aminoácidos 1-151 o 1-187 de la SEQ ID NO: 5 o en uno o más de los residuos de aminoácidos 1-150 o 1-186 de la SEQ ID NO: 4. El portador puede carecer de uno o más de los residuos de aminoácidos 1-39 de la SEQ ID NO: 5 o los residuos 1-38 de la SEQ ID NO: 4. El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 69 o la SEQ ID NO: 70 o un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. El portador puede comprender los residuos 1-151 de la SEQ ID NO: 5 o los residuos 1-150 de la SEQ ID NO: 4 y no más de 187 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1. El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las s Eq ID NO: 30 - SEQ ID NO: 107 o por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. El portador puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 30 o la SEQ ID NO: 31 o un fragmento funcional de las mismas. El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 124 o la SEQ ID NO: 125 o la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 106 o la SEQ ID NO: 107 o por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. El portador puede comprender una deleción o mutación en uno o más de los residuos de aminoácidos 1-151 de la SEQ ID NO: 5 o en uno o más de los residuos de aminoácidos 1-150 de la SEQ ID NO: 4. El portador puede comprender los residuos 1-134 de la SEQ ID NO: 5 o los residuos 1-133 de la SEQ ID NO: 4 y no más de 151 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1. El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 106 - SEQ ID NO: 125 o por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. El portador puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 106 o la SEQ ID NO: 107 o un fragmento funcional de las mismas. El portador puede comprender por lo menos una, pero no más de 20 cadenas beta. El portador puede comprender además por lo menos un residuo de metionina N-terminal. El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 125, o un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. El constructo de administración puede formar un multímero. El multímero puede formarse por multimerización de la carga heteróloga. El multímero puede ser un heterómero o un homómero. El homómero puede ser un homodímero. El homodímero puede formarse por dimerización de la carga heteróloga. El portador puede acoplarse químicamente o acoplarse recombinantemente a la carga heteróloga. El portador puede acoplarse covalentemente a la carga heteróloga. La carga heteróloga puede acoplarse al extremo C terminal del portador. La carga heteróloga puede acoplarse al extremo N terminal del portador. El portador puede acoplarse directamente a la carga heteróloga. El portador puede acoplarse indirectamente a la carga heteróloga. El portador puede acoplarse a la carga heteróloga a través de un espaciador. El espaciador puede comprender un espaciador de aminoácidos. El espaciador de aminoácidos puede comprender uno o más residuos de glicina y uno o más residuos de serina. El espaciador de aminoácidos puede tener entre 1 y 50 residuos de aminoácidos de longitud. El espaciador puede ser un espaciador escindible. El espaciador escindible puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 174 - SEQ ID NO: 206. El espaciador puede ser un espaciador no escindible. El espaciador no escindible puede comprender una o más de las secuencias de aminoácidos GGGGS (SEQ ID NO: 207), GGGGS (SEQ ID NO: 208), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 209), GGGGSGGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 210), o GGGGSGGG (SEQ ID NO: 211). El espaciador no escindible puede comprender uno o más de (GGGGS)x(SeQ ID NO: 212), en donde x = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. El espaciador no escindible puede comprender uno o más de (GS)x(SEQ ID NO: 213),en donde x = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. El espaciador puede comprender uno o más fragmentos del dominio II, un dominio Ib o el dominio III de la exotoxina, o una combinación de los mismos. El espaciador puede comprender como máximo 82 residuos de aminoácidos del dominio II, 82 residuos de aminoácidos del dominio III o una combinación de los mismos. La carga heteróloga puede ser una macromolécula, una molécula pequeña, un polipéptido, un ácido nucleico, un ARNm, un ARNmi, un ARNhc, un ARNip, una molécula antisentido, un anticuerpo, un ADN, un plásmido, una vacuna, un polímero y un nanopartícula, o un material catalíticamente activo. La carga heteróloga puede ser una carga biológicamente activa. La carga biológicamente activa puede ser una citoquina, una hormona, un anticuerpo terapéutico, un fragmento funcional del mismo o cualquier combinación de los mismos. La citoquina puede ser IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL- 19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29 o IL-30. La citoquina puede tener la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 217 o la SEQ ID NO: 218. La hormona puede tener la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 215 o la SEQ ID NO: 216. El anticuerpo terapéutico puede ser un anticuerpo anti-TNFa. El anticuerpo anti-TNFa puede ser adalimumab o infliximab. La carga heteróloga puede ser un agente detectable. El agente detectable puede ser un fluoróforo, un agente de contraste, un agente de contraste de rayos X, un agente PET, una nanopartícula o un radioisótopo. El fluoróforo puede ser una proteína fluorescente roja (RFP). La RFP puede tener la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 220.
La presente divulgación se refiere a constructos de administración novedosas que no se producen de manera natural que pueden comprender un portador quimérico derivado de una toxinas bacterianas acoplado a una carga biológicamente activa; en donde el portador quimérico se deriva de un dominio I pero no comprende un dominio II, un dominio Ib o un dominio III de la toxina bacteriana (por ejemplo, una exotoxina); y en donde el constructo de administración es capaz de administrar una carga heteróloga (por ejemplo, una biológicamente activa) a través del transporte portranscitosis a través de una célula epitelial (por ejemplo, una célula epitelial intestinal).
El portador puede derivarse de un dominio I de una exotoxina y es capaz de reconocer e interactuar con uno o más receptores en la superficie luminal (por ejemplo, apical) de las células epiteliales intestinales. El receptor puede ser selectivo o no selectivo. En algunos aspectos, el receptor con el que interactúa un portador es un receptor eliminador no selectivo o un receptor transmembrana 132 (TMEM132). La interacción de los constructos de administración con un receptor de la superficie celular que está presente en la membrana apical de una célula epitelial polarizada puede producirse con suficiente afinidad para permitir la endocitosis del constructo de administración. El portador del que está compuesto un constructo de administración de la presente divulgación puede unirse a receptor o receptores que se sabe que están presentes en la membrana apical de una célula epitelial por un experto en la técnica sin limitación. En varias realizaciones, el dominio de unión al receptor del constructo de administración puede unirse a una proteína 1 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP1) o al receptor de TMEM132.
Un constructo de administración como se describe en la presente puede ser capaz de administrar una carga heteróloga (por ejemplo, una biológicamente activa) a través de una célula epitelial desde el lado apical hasta un compartimento basolateral y/o la lámina propia. Un constructo de administración como se describe en la presente puede ser capaz de administrar una carga heteróloga (por ejemplo, una biológicamente activa) en una célula epitelial (por ejemplo, una célula epitelial intestinal polarizada), como una vesícula o compartimento intracelular o el citosol de la célula epitelial, permitiendo de este modo la acumulación de la carga heteróloga (por ejemplo, biológicamente activa) en la célula epitelial. El portador puede derivarse del dominio I de una exotoxina del portador de cholix (Cholix).
El portador puede ser un polipéptido derivado de Cholix y que tiene: como máximo 5 residuos de aminoácidos; como máximo 10 residuos de aminoácidos; como máximo 15 residuos de aminoácidos; como máximo 20 residuos de aminoácidos; como máximo 30 residuos de aminoácidos; como máximo 40 residuos de aminoácidos; como máximo 50 residuos de aminoácidos; como máximo 60 residuos de aminoácidos; como máximo 70 residuos de aminoácidos; como máximo 80 residuos de aminoácidos; como máximo 90 residuos de aminoácidos; como máximo 100 residuos de aminoácidos; como máximo 110 residuos de aminoácidos; como máximo 120 residuos de aminoácidos; como máximo 130 residuos de aminoácidos; como máximo 140 residuos de aminoácidos; como máximo 150 residuos de aminoácidos; como máximo 160 residuos de aminoácidos; como máximo 170 residuos de aminoácidos; como máximo 180 residuos de aminoácidos; como máximo 190 residuos de aminoácidos; como máximo 200 residuos de aminoácidos; como máximo 210 residuos de aminoácidos; como máximo 220 residuos de aminoácidos; como máximo 230 residuos de aminoácidos; como máximo 240 residuos de aminoácidos; como máximo 250 residuos de aminoácidos; como máximo 260 residuos de aminoácidos; y como máximo 265 residuos de aminoácidos.
El portador puede derivarse de un dominio I de una exotoxina Cholix y puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de una secuencia de aminoácidos que tiene más del 50% de homología con la SEQ ID NO: 4, que tiene más del 60% de homología con la SEQ ID NO: 4, que tiene más del 70% de homología con la SEQ ID NO: 4, que tiene más del 80% de homología con la SEQ ID NO: 4, que tiene más del 85% de homología con la SEQ ID NO: 4, que tiene más del 90% homología con la SEQ ID NO: 4, y que tiene más del 95% de homología con la SEQ ID NO: 4. En algunos casos, el constructo de administración se deriva de la exotoxina cholix (Cholix) y comprende el polipéptido del dominio de unión al receptor que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4. El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos con más del 90% de homología con la SEQ ID NO: 4. El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos con más del 95% de homología con la SEQ ID NO: 4. El portador puede comprender un polipéptido de dominio de unión al receptor en donde uno o más residuos amino de la SEQ ID NO: 4 están sustituidos con otro aminoácido. El portador puede comprender un polipéptido del dominio de unión al receptor que es una porción truncada de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4.
Un constructo de administración puede comprender un portador, en donde el portador que comprende uno o más residuos de aminoácidos de un dominio I de exotoxina (por ejemplo, un Cholix) se reemplaza por uno o más residuos de aminoácidos de un segundo dominio I de exotoxina (por ejemplo, dominio I de aPE), (también denominado en lo sucesivo portador híbrido o quimérico). El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos en donde uno o más residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 se reemplazan por uno o más residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 137. El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos en donde los residuos de aminoácidos 77-87 de la SEQ ID NO: 4 se reemplazan por residuos de aminoácidos de un segundo polipéptido del dominio de unión al receptor del portador bacteriano. El portador puede comprender una secuencia de aminoácidos en donde los residuos de aminoácidos 188-236 de la SEQ ID NO: 4 se reemplazan por residuos de aminoácidos de un segundo polipéptido del dominio de unión al receptor del portador bacteriano.
Un portador de la presente divulgación puede derivarse de un dominio I de una exotoxina y puede comprender además una porción de un dominio II, una porción de un dominio Ib y/o una porción de un dominio III de la misma u otra exotoxina. Por tanto, un portador puede comprender un dominio I de una exotoxina, o una versión truncada y/o modificada de la misma, y una o más porciones derivadas de un dominio II, dominio Ib y/o dominio III de la misma exotoxina o una diferente. El dominio II, o dominio II modificado, y el dominio III, o dominio III modificado, pueden derivarse de la misma toxina bacteriana. El dominio II, o dominio II modificado, y el dominio III, o dominio III modificado, pueden derivarse de un portador bacteriano seleccionado del grupo que consiste de portador de cholix (Cholix) y exotoxina A de Pseudomonas (PE), toxina botulínica, toxina diftérica, toxina de la tosferina, toxina del cólera, enterotoxina de E. coli termolábil, toxina shiga y toxina similar a shiga. La toxicidad del portador bacteriano (por ejemplo, Cholix o PE) puede no ser necesaria para el transporte a través de las capas epiteliales, como el epitelio intestinal. Por ejemplo, un constructo de administración como se describe en la presente puede comprender un portador acoplado a una carga heteróloga, y en donde el portador se deriva de un dominio I de Cholix (por ejemplo, que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125) y que además comprende porciones de un dominio II (por ejemplo, SEQ ID NO: 126 o SEQ ID NO: 138), un dominio Ib (por ejemplo, SeQ ID nO: 127 o SEQ ID NO: 139), y /o un dominio III (por ejemplo, SEQ ID NO: 128 o SEQ ID NO: 140) de una exotoxina (por ejemplo, Cholix y/o PE).
Un constructo de administración puede comprender un portador que tiene la secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4, un dominio de translocación que tiene la secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 126 y un dominio catalítico no tóxico que tiene la secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 128. Un constructo de administración puede comprender un polipéptido del dominio de unión al receptor que tiene la secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 136, un dominio de translocación que tiene la secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 137, y un dominio catalítico no tóxico que tiene la secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 139. El constructo de administración puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 146. En varias realizaciones, el constructo de administración comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 147.
Los constructos de administración de la presente divulgación pueden comprender un portador acoplado a una carga heteróloga. La carga heteróloga puede ser una carga biológicamente activa. La carga heteróloga puede ser un agente detectable. El portador puede acoplarse a una carga biológicamente activa para producir un constructo de administración que sea capaz de administrar la carga biológicamente activa a través del transporte por transcitosis a través de un epitelio intestinal. La carga biológicamente activa puede seleccionarse de, por ejemplo, una macromolécula, molécula pequeña, péptido, polipéptido, ácido nucleico, ARNm, ARNmi, ARNhc, ARNip, molécula antisentido, anticuerpo, a Dn , plásmido, vacuna, nanopartícula polimérica o material catalíticamente activo. La carga biológicamente activa puede ser una enzima seleccionada de hialuronidasa, estreptoquinasa, activador del plasminógeno tisular, uroquinasa o PGE-adenosina desaminasa. La carga biológicamente activa puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218 y SEQ ID NO: 219, o cualquier combinación de las mismas.
Los constructos de administración pueden comprender un portador acoplado directamente a una carga heteróloga (por ejemplo, una biológicamente activa). La carga heteróloga (por ejemplo, una biológicamente activa) puede acoplarse directamente al extremo C-terminal del constructo de administración. La carga heteróloga (por ejemplo, una biológicamente activa) puede acoplarse directamente al extremo N-terminal del constructo de administración.
Los constructos de administración pueden comprender un portador acoplado químicamente a una carga heteróloga (por ejemplo, una biológicamente activa). Los constructos de administración pueden comprender un portador acoplado recombinantemente a una carga heteróloga (por ejemplo, una biológicamente activa). Un constructo de administración de la presente divulgación puede producirse parcialmente de manera sintética (por ejemplo, mediante síntesis en fase sólida) o de manera recombinante (por ejemplo, expresada por bacterias (por ejemplo, E. coli) o en una célula de mamífero (por ejemplo, célula CHO)). Un constructo de administración de la presente divulgación puede producirse parcialmente sintética y parcialmente recombinante.
Los constructos de administración pueden comprender un constructo de administración acoplado a una carga biológicamente activa mediante un espaciador escindible. El espaciador puede ser escindido por una enzima que está presente en una membrana basolateral de una célula epitelial polarizada. El espaciador puede ser escindido por una enzima que está presente en el plasma. El espaciador escindible puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 174 - SEQ ID NO: 206. El espaciador escindible puede ser un espaciador que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser un sustrato conocido para la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV). El espaciador escindible comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 193. El espaciador puede ser escindible por una enzima que está presente en una membrana basal-lateral de una célula epitelial polarizada. El espaciador puede ser escindido por una enzima que está presente en el plasma de un sujeto.
Los espaciadores escindibles pueden comprender una secuencia peptídica (o un dominio similar), que sirve para inhibir, interferir o bloquear la capacidad de la carga biológicamente activa para unirse a los receptores en la superficie de las células epiteliales, pero en donde el constructo de administración retiene la capacidad de la carga para activar su receptor después de que el constructo de administración se haya transportado a través de la barrera epitelial y la carga se libere del constructo de administración y los componentes espaciadores del constructo. El espaciador escindible puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en, por ejemplo, SEQ ID NO: 194 -SEQ ID NO: 206.
La presente divulgación también se refiere a composiciones farmacéuticas que pueden comprender un nuevo constructo de administración de origen no natural de la presente divulgación y uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, formulados para administración oral, administración tópica, administración pulmonar, administración intranasal, administración bucal, administración sublingual o administración ocular.
La presente divulgación proporciona una composición farmacéutica de la divulgación para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad inflamatoria en un sujeto que puede comprender administrar la composición farmacéutica de la presente divulgación al sujeto. En varias realizaciones, la enfermedad inflamatoria se selecciona de una enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis o sepsis bacteriana. En varias realizaciones, la enfermedad inflamatoria intestinal es la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis colágena, colitis linfocítica, colitis isquémica, colitis por desviación, síndrome de Behcet o colitis indeterminada.
La presente divulgación proporciona una composición farmacéutica de la divulgación para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad autoinmune en un sujeto que puede comprender administrar la composición farmacéutica de la presente divulgación al sujeto. En varias realizaciones, la enfermedad autoinmune es lupus eritematoso sistémico (SLE), pénfigo vulgar, miastenia grave, anemia hemolítica, púrpura trombocitopénica, enfermedad de Grave, enfermedad de Sjogren, dermatomiositis, enfermedad de Hashimoto, polimiositis, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple (MS), diabetes mellitus, artritis reumatoide o esclerodermia.
La presente divulgación proporciona una composición farmacéutica de la divulgación para su uso en un método para tratar un cáncer en un sujeto que puede comprender administrar la composición farmacéutica de la presente divulgación al sujeto. En varias realizaciones, el cáncer a tratar incluye, pero no se limita a, linfomas no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemia linfocítica crónica, leucemia de células pilosas, leucemia linfoblástica aguda, mieloma múltiple, carcinomas de vejiga, riñón, ovario, cuello uterino, mama, pulmón, nasofaringe, melanoma maligno y NHL resistente a rituximab y leucemia.
La presente divulgación proporciona la composición farmacéutica de la divulgación para su uso en un método para tratar a un sujeto que tiene un trastorno metabólico, dicho método puede comprender administrar la composición farmacéutica de la presente divulgación en una cantidad suficiente para tratar dicho trastorno, en donde dicho trastorno metabólico es diabetes, obesidad, diabetes como consecuencia de la obesidad, hiperglucemia, dislipidemia, hipertrigliceridemia, síndrome X, resistencia a la insulina, tolerancia a la glucosa alterada (IGT), dislipidemia diabética o hiperlipidemia.
La presente divulgación proporciona la composición farmacéutica de la divulgación para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad del hígado graso (por ejemplo, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD); esteatohepatitis no alcohólica (NASH)), una enfermedad gastrointestinal o una enfermedad neurodegenerativa, dicho método comprendiendo administrar por vía oral la composición farmacéutica de la presente divulgación en una cantidad suficiente para tratar dicha enfermedad.
La presente divulgación proporciona la composición farmacéutica de la divulgación para su uso en un método para tratar a un sujeto que tiene un trastorno del crecimiento por deficiencia de GH, dicho método puede comprender administrar la composición farmacéutica de la presente divulgación en una cantidad suficiente para tratar dicho trastorno, en donde dicho trastorno es deficiencia de la hormona del crecimiento (GHD), síndrome de Turner (TS), síndrome de Noonan, síndrome de Prader-Willi, deficiencia del gen que contiene homeobox de baja estatura (SHOX), insuficiencia renal crónica y síndrome de intestino corto idiopático de baja estatura, deficiencia de GH debido a tumores pituitarios raros o su tratamiento, y enfermedad de desgaste muscular asociada con el VIH/SIDA.
Un constructo de administración puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con una cualquiera o más de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 133. Un constructo de administración puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con una cualquiera o más de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 133. Un constructo de administración puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 950% de identidad de secuencia con una cualquiera o más de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 133. Un constructo de administración puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 99% de identidad de secuencia con una cualquiera o más de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 133. El portador puede derivarse de un dominio I de Cholix y puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con una cualquiera o más de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125 y/o las SEQ ID NO: 148 - SEQ ID NO: 152. El portador puede derivarse de un dominio I de Cholix y puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con una cualquiera o más de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125 y/o las SEQ ID NO: 148 - SEQ ID NO: 152. El portador puede derivarse de un dominio I de Cholix y puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con una cualquiera o más de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125 y/o las SEQ ID nO: 148 - SEQ ID NO: 152. El portador puede derivarse de un dominio I de Cholix y puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 99% de identidad de secuencia con una cualquiera o más de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125 y/o las SEQ ID NO: 148 - SEQ ID NO: 152. Cualquiera de estos portadores puede combinarse con cualquier carga heteróloga descrita y divulgada en la presente, por ejemplo, aquellos que tienen por lo menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 214 -SEQ ID NO: 220. Cualquiera de estos portadores puede combinarse con cualquier carga heteróloga descrita y divulgada en la presente, por ejemplo, aquellos que tienen por lo menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 214 - SEQ ID NO: 220. Cualquiera de estos portadores puede combinarse con cualquier carga heteróloga descrita y divulgada en la presente, por ejemplo, aquellos que tienen por lo menos un 95% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 214 - SEQ ID NO: 220. Cualquiera de estos portadores puede combinarse con cualquier carga heteróloga descrita y divulgada en la presente, por ejemplo, aquellos que tienen por lo menos un 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 214 -SEQ ID NO: 220. Un constructo de administración descrito en la presente puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 153 - SEQ ID NO: 165. Un constructo de administración descrito en la presente puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 153 - SEQ ID NO: 165. Un constructo de administración descrito en la presente puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las sEq ID NO: 153 -SEQ ID NO: 165. Un constructo de administración descrito en la presente puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 153 - SEQ ID NO: 165. Un constructo puede ser capaz de endocitosis (por ejemplo, endocitosis apical). Un constructo puede ser capaz de transcitosis de apical a basal.
La presente divulgación proporciona constructos de administración aislados que pueden unirse a un receptor en la superficie luminal de las células epiteliales intestinales con suficiente afinidad para permitir la endocitosis; en donde el dominio es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos en donde uno o más residuos de aminoácidos de un polipéptido del dominio I de la toxina bacteriana se reemplazan por uno o más residuos de aminoácidos de un segundo polipéptido del dominio I de la toxina bacteriana (por ejemplo, una exotoxina). El dominio I de una primera exotoxina puede comprender un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos en donde uno o más residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 pueden reemplazarse por uno o más residuos de aminoácidos del polipéptido del dominio de unión al receptor de una segunda toxina bacteriana (por ejemplo, una exotoxina). El dominio de unión al receptor puede ser un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos en donde uno o más residuos de aminoácidos de la sEq ID NO: 4 se reemplazan por uno o más residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 137.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las características novedosas de la presente divulgación se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente divulgación con referencia a la siguiente descripción detallada que expone aspectos ilustrativos, en los que se utilizan los principios de la divulgación, y los dibujos acompañantes (también "Figura" y "FIG." en la presente), de los cuales:
La FIG. 1 y la FIG. 2 representan la detección microscópica de fluorescencia de los constructos 7-12 (preparados como se describe en el EJEMPLO 1 de la presente) observados 20 minutos después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata. La FIG. 1 representa (de arriba a abajo) la localización de los constructos 12, 11 y 10. La FIG. 2 representa (de arriba a abajo) los constructos 9, 8 y 7. De izquierda a derecha: imagen de fluorescencia, iluminación de campo oscuro, compuesto de imagen de fluorescencia e iluminación de campo oscuro (la flecha blanca N° 1 resalta la superficie apical y la flecha blanca N° 2 resalta la superficie basal).
La FIG. 1A muestra la localización (imagen de fluorescencia) del constructo 12 observada 20 minutos después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata.
La FIG. 1B muestra la localización (imagen de luz blanca) del constructo 12 observada 20 minutos después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata.
La FIG. 1C muestra la localización (imagen combinada, con DAPI) del constructo 12 observada 20 minutos después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata.
La FIG. 1D muestra la localización (imagen de fluorescencia) del constructo 11 observada 20 minutos después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata.
La FIG. 1E muestra la localización (imagen de luz blanca) del constructo 11 observada 20 minutos después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata.
La FIG. 1F muestra la localización (imagen combinada, con DAPI) del constructo 11 observada 20 minutos después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata.
La FIG. 1G muestra la localización (imagen de fluorescencia) del constructo 10 observada 20 minutos después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata.
La FIG. 1H muestra la localización (imagen de luz blanca) del constructo 10 observada 20 minutos después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata.
La FIG. 1I muestra la localización (imagen combinada, con DAPI) del constructo 10 observada 20 minutos después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata.
La FIG. 2A muestra la localización (imagen de fluorescencia) del constructo 9 observada 20 minutos después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata.
La FIG. 2B muestra la localización (imagen de luz blanca) del constructo 9 observada 20 minutos después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata.
La FIG. 2C muestra la localización (imagen combinada, con DAPI) del constructo 9 observada 20 min después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata.
La FIG. 2D muestra la localización (imagen de fluorescencia) del constructo 8 observada 20 minutos después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata.
La FIG. 2E muestra la localización (imagen de luz blanca) del constructo 8 observada 20 minutos después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata.
La FIG. 2F muestra la localización (imagen combinada, con DAPI) del constructo 8 observada 20 min después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata.
La FIG. 2G muestra la localización (imagen de fluorescencia) del constructo 7 observada 20 minutos después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata.
La FIG. 2H muestra la localización (imagen de luz blanca) del constructo 7 observada 20 minutos después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata.
La FIG. 2I muestra la localización (imagen combinada, con DAPI) del constructo 7 observada 20 minutos después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata.
La FIG. 3 representa la detección microscópica de fluorescencia del constructo 6 (preparado como se describe en el EJEMPLO 1 en la presente) observado 20 minutos después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata. De izquierda a derecha: imagen de fluorescencia, iluminación de campo oscuro, compuesto de imagen de fluorescencia e iluminación de campo oscuro (la flecha blanca N° 1 resalta la superficie apical y la flecha blanca N° 2 resalta la superficie basal).
La FIG. 3A representa la detección microscópica de fluorescencia del constructo 6 (anti-Cho, 1/500).
La FIG. 3B representa la detección de iluminación de campo oscuro del constructo 6 (anti-Cho, 1/500).
La FIG. 3B representa un compuesto de detección de imagen de fluorescencia y de iluminación de campo oscuro del constructo 6 (anti-Cho, 1/500).
La FIG. 3D representa la detección microscópica de fluorescencia del constructo 6 (anti-RPF, 1/50).
La FIG. 3E representa la detección de iluminación de campo oscuro del constructo 6 (anti-RPF, 1/50).
La FIG. 3F representa un compuesto de detección de imagen de fluorescencia y de iluminación de campo oscuro del constructo 6 (anti-RPF, 1/50).
La FIG. 4 y la FIG. 5 representan la detección microscópica de fluorescencia del constructo 13 (SEQ ID NO: 146, preparado como se describe en el EJEMPLO 5 en la presente) observada después de 1 min (FIG. 4) y20 min (FIG. 5) después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata.
La FIG. 4A muestra la detección microscópica de fluorescencia del constructo 13 después de 1 min.
La FIG. 4B muestra la
Figure imgf000014_0001
detección microscópica de fluorescencia del constructo 13 después de 1 min. La FIG. 4C muestra la
Figure imgf000014_0002
detección microscópica de fluorescencia del constructo 13 después de 1 min. La FIG. 4D muestra la detección microscópica de fluorescencia del constructo 13 después de 1 min. La FIG. 4E muestra la detección microscópica de fluorescencia del constructo 13 después de 1 min (la flecha
blanca N° 1 resalta la superficie apical y la flecha blanca N° 2 resalta la superficie basal).
La FIG. 5A muestra la detección microscópica de fluorescencia del constructo 13 después de 20 min.
La FIG. 5B muestra la detección microscópica de fluorescencia del constructo 13 después de 20 min.
La FIG. 5C muestra la detección microscópica de fluorescencia del constructo 13 después de 20 min.
La FIG. 5D muestra la detección microscópica de fluorescencia del constructo 13 después de 20 min.
La FIG. 5E muestra la detección microscópica de fluorescencia del constructo 13 después de 20 min (la flecha
blanca N° 1 resalta la superficie apical y la flecha blanca N° 2 resalta la superficie basal).
La FIG. 6 y la FIG. 7 representan la detección microscópica de fluorescencia del constructo 14 (SEQ ID NO: 147, preparada como se describe en el EJEMPLO 5 en la presente) observada después de 1 min (FIG. 6) y 20min
(FIG. 7) después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata (la flecha
blanca N° 1 resalta la superficie apical y la flecha blanca N° 2 resalta la superficie basal).
La FIG. 6A muestra la detección microscópica de fluorescencia del constructo 14 después de 1 min. La FIG. 6B muestra la detección microscópica de fluorescencia del constructo 14 después de 1 min. La FIG. 6C muestra la
Figure imgf000014_0003
detección microscópica de fluorescencia del constructo 14 después de 1 min. La FIG. 6D muestra la detección microscópica de fluorescencia del constructo 14 después de 1 min. La FIG. 6E muestra la detección microscópica de fluorescencia del constructo 14 después de 1 min (la flecha
blanca N° 1 resalta la superficie apical y la flecha blanca N° 2 resalta la superficie basal).
La FIG. 7A muestra la detección microscópica de fluorescencia del constructo 14 después de 20 min.
La FIG. 7B muestra la detección microscópica de fluorescencia del constructo 14 después de 20 min.
La FIG. 7C muestra la detección microscópica de fluorescencia del constructo 14 después de 20 min.
La FIG. 7D muestra la detección microscópica de fluorescencia del constructo 14 después de 20 min.
La FIG. 7E muestra la detección microscópica de fluorescencia del constructo 14 después de 20 min (la flecha
blanca N° 1 resalta la superficie apical y la flecha blanca N° 2 resalta la superficie basal).
La FIG. 8A representa la detección microscópica de fluorescencia del constructo que comprende una secuencia
de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 165 (M+Cholix39-186-(espaciador con SeQ ID NO: 210)-HGH) observada 5 min después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata (la
flecha blanca N° 1 resalta la superficie apical y la flecha blanca N° 2 resalta la superficie basal).
La FIG. 8B representa la detección microscópica de fluorescencia del constructo que comprende una secuencia
de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 165 (M+Cholix39-186-(espaciador con SeQ ID NO: 210)-HGH) observada 10 minutos después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata.
La FIG. 8C representa la detección microscópica de fluorescencia del constructo que comprende una secuencia
de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 165 (M+Cholix39-186-(espaciador con SeQ ID NO: 210)-HGH) observada 15 minutos después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata.
La FIG. 9A representa la detección microscópica de fluorescencia del constructo que comprende una secuencia
de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 160 (Cholix1-186-(espaciador con SEQ ID NO: 210)-HGH) observada
5 min después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata (la flecha blanca
N° 1 resalta la superficie apical y la flecha blanca N° 2 resalta la superficie basal).
La FIG. 9B representa la detección microscópica de fluorescencia del constructo que comprende una secuencia
de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 160 (Cholix1-187-(espaciador con SEQ ID NO: 210)-HGH) observada
10 minutos después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata.
La FIG. 9C representa la detección microscópica de fluorescencia del constructo que comprende una secuencia
de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 160 (Cholix1-187-(espaciador con SEQ ID NO: 210)-HGH) observada
15 minutos después de la inyección intraluminal usando un modelo de inyección intraluminal de rata (la flecha
blanca N° 2 resalta la superficie basal).
La FIG. 10 A muestra la transcitosis de Cholix no tóxica (ntChx) a través del epitelio intestinal polarizado humano
in vitro. la FIG. 10A representa la cantidad de Cholix no tóxico (ntChx, SEQ ID NO: 3) detectado en el compartimento basal por ELISA a las 2 h después de una aplicación apical de 2,5-200 mg/ml de ntChx (N=2;
media ± SE, flecha blanca N° 1 resalta la superficie apical y la flecha blanca N° 2 resalta la superficie basal).
La FIG. 10B representa un análisis de transferencia Western del contenido del compartimento basal 2 h después
de una aplicación apical de 2,5-200 mg/ml de ntChx que se concentraron aproximadamente 10 veces antes del análisis, lo que muestra que la ntChx que se transportó no se alteró significativamente (por ejemplo, se alteró químicamente) durante transporte.
La FIG. 10C representa las cantidades basales de ntChx detectadas durante un transcurso de tiempo de 2 h por ELISA. El gráfico muestra un retraso de ~20-25 min en cantidades detectables y velocidades de transporte comparables para aplicaciones apicales de 5-20 mg/ml a 37° C, y una reducción significativa en la velocidad de transporte a 4° C.
La FIG. 11 muestra que el transporte apical a basal de 5-20 mg/ml de ntChx (SEQ ID NO: 3), medido por ELISA, fue más eficiente con el compartimento apical a pH 7 en comparación con pH 5 (N=2; media ± SE).
La FIG. 12A representa la transcitosis de Cholix no tóxica (ntChx, SEQ ID NO: 3) in vivo después de 1 minuto después de la inyección intraluminal (ILI) en yeyuno de rata visualizado por microscopía de inmunofluorescencia.
Flecha abierta = dominio de enterocitos apical; flecha sólida = región perinuclear de la célula; línea discontinua = demarcación de la membrana basal de la célula epitelial; GC = célula caliciforme.
La FIG. 12B representa la transcitosis de Cholix no tóxica (ntChx, SEQ ID NO: 3) in vivo después de 5 minutos después de ILI en yeyuno de rata visualizado por microscopía de inmunofluorescencia. Flecha abierta = dominio de enterocitos apical; flecha sólida = región perinuclear de la célula; línea discontinua = demarcación de la membrana basal de la célula epitelial; GC = célula caliciforme.
La FIG. 12C representa la transcitosis de Cholix no tóxica (ntChx, SEQ ID NO: 3) in vivo después de 15 minutos después de ILI en yeyuno de rata visualizado por microscopía de inmunofluorescencia. La colocalización con clatrina muestra el área de la punta de las vellosidades. Flecha abierta = dominio de enterocitos apical; flecha sólida = región perinuclear de la célula; línea discontinua = demarcación de la membrana basal de la célula epitelial; GC = célula caliciforme.
La FIG. 13A muestra transcitosis de ntChx in vivo 15 minutos después de ILI de ntChx (SEQ ID NO: 3) en yeyuno de rata con tinción simultánea del antígeno endosomal temprano 1 (EEA1) (la flecha blanca N° 1 resalta la superficie apical y la flecha blanca N° 2 resalta la superficie basal). GC = célula caliciforme; l-p = lámina propia. La FIG. 13B muestra la transcitosis de ntChx in vivo 15 minutos después de ILI de ntChx (SEQ ID NO: 3) en yeyuno de rata con tinción simultánea de la proteína Rab 11a relacionada con Ras (la flecha blanca N° 1 resalta la superficie apical y la flecha blanca N° 2 resalta la superficie basal). superficie). GC = célula caliciforme; l-p = lámina propia.
La FIG. 13C muestra la transcitosis de ntChx in vivo 15 min después de ILI de ntChx (SEQ ID NO: 3) en yeyuno de rata con tinción simultánea de la proteína de red de trans-Golgi (TGN)-38.
La FIG. 13D muestra la transcitosis de ntChx in vivo 15 minutos después de ILI de ntChx (SEQ ID NO: 3) en yeyuno de rata con tinción simultánea de calnexina (la flecha blanca N° 1 resalta la superficie apical y la flecha blanca N° 2 resalta la superficie basal). GC = célula caliciforme; l-p = lámina propia.
La FIG. 13E muestra la transcitosis de ntChx in vivo 15 minutos después de ILI de ntChx (SEQ ID NO: 3) en yeyuno de rata con tinción simultánea de la proteína Rab 7 relacionada con Ras (la flecha blanca N° 1 resalta la superficie apical y la flecha blanca N° 2 resalta la superficie basal). GC = célula caliciforme; l-p = lámina propia. La FIG. 13F muestra la transcitosis de ntChx in vivo 15 min después de ILI de ntChx (SEQ ID NO: 3) en yeyuno de rata con tinción simultánea de proteína formiminotransferasa ciclodeaminasa de 58 kDa asociada a Golgi (FTCD). GC = célula caliciforme; l-p = lámina propia.
La FIG. 14A muestra pequeñas cantidades de RFP (control negativo) que llegan a las células dentro de la lámina propia (l-p) sin RFP detectable en el epitelio de las vellosidades (las flechas sólidas apuntan a la superficie apical del epitelio) a los 30 minutos después de ILI. Un anticuerpo policlonal contra RFP demuestra que pequeñas cantidades de RFP pueden llegar a las células dentro de la lámina propia (l-p) sin RFP detectable en el epitelio de las vellosidades; (las flechas sólidas apuntan a la superficie apical del epitelio) a los 30 min después de ILI. Flecha continua (N° 1) = membrana luminal (apical); flecha blanca N° 2 = membrana basal; GC = célula caliciforme; l-p = lámina propia.
La FIG. 14B muestra que un constructo que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 157 que comprende Cholix no tóxica (ntChx, SEQ ID NO: 3) de longitud completa genéticamente fusionado o conjugado con proteína fluorescente roja (RFP, SEQ ID NO: 220) es capaz de una transcitosis apical a basal eficiente. Flecha continua (N° 1) = membrana luminal (apical); flecha blanca N° 2 = membrana basal; GC = célula caliciforme; l-p = lámina propia. La Cholix no tóxica de longitud completa (ntChx, SEQ ID NO: 3) se unió genéticamente a la proteína roja fluorescente (RFP, SEQ ID NO: 220).
La FIG. 14C muestra que el dominio I de Cholix es suficiente para la transcitosis de apical a basal después de la inyección intraluminal (ILI) en yeyuno de rata in vivo. La FIG. 14C muestra que una Cholix truncada en la terminación del dominio I (residuo de aminoácidos 265 de la SEQ ID NO: 1, más un residuo de metionina N-terminal que da como resultado la SEQ ID NO: 5) y que está genéticamente fusionado con RFP (por ejemplo, teniendo de este modo una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 156) es capaz de una transcitosis de apical a basal eficiente, lo que sugiere que el dominio I de Cholix puede ser suficiente para la transcitosis de apical a basal después de la inyección intraluminal (ILI) en yeyuno de rata in vivo. Las flechas blancas sólidas N° 1 indican la superficie epitelial apical y la flecha blanca N° 2 resalta la superficie basal. El dominio I de Cholix (SEQ ID NO: 5) se unió genéticamente a la proteína roja fluorescente (RFP, SEQ ID NO: 220).
La FIG. 15 representa el transporte de apical a basal de la hormona del crecimiento humana (HGH, SEQ ID NO: 214) en comparación con quimeras del dominio I de Cholix y elementos truncados de este dominio (designados por aminoácidos) que se unieron conjuntamente genéticamente a HGH. La transferencia Western para HGH evaluó cualitativamente la capacidad de estas proteínas para someterse a transporte de apical a basal a través de monocapas polarizadas de células epiteliales primarias del intestino delgado humano in vitro después de 2 h. Las cantidades de materiales aplicados apicalmente fueron equivalentes en base molar para el contenido de HGH y las colecciones basales se concentraron ~10 veces antes del análisis.
La FIG. 15A muestra que el transporte de fondo de apical a basal de HGH sola en este modelo fue mínimo en comparación con el observado para el constructo de administración que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 164, que comprende un dominio I de Cholix (SEQ ID NO: 5), un espaciador (SEQ ID nO: 210), y HGH (SEQ ID NO: 214). Los truncamientos del dominio I de Cholix (SEQ ID NO: 5) en las posiciones 134, 151, 187 o en 40-187 de la SEQ ID NO: 5 fueron incapaces de facilitar el transporte de apical a basal de HGH unida conjuntamente.
La FIG. 15B muestra que los truncamientos del dominio I de Cholix (SEQ ID NO: 5) en las posiciones 206, 245 o 251 demostraron el transporte de apical a basal de HGH unida conjuntamente. Mientras que los truncamientos en las posiciones 245 y 251 dieron como resultado un transporte de apical a basal comparable al del constructo que comprende el portador con SEQ ID NO: 5, la quimera donde el dominio I de Cholix está truncado en la posición 206 mostró una mejora significativa del transporte de apical a basal.
La FIG. 16A muestra la evaluación del transporte de la quimera de la hormona del crecimiento humano (HGH) por truncamiento del dominio I de Cholix a través de monocapas de epitelio de yeyuno de rata in vivo 15 minutos después de la inyección intraluminal, como se demuestra mediante microscopía de inmunofluorescencia. La FIG.
16A muestra que el constructo Cholix-HGH con SEQ ID NO: 211 (comprende Cholix1-133 metionina N-terminal) no se introdujo en las células epiteliales, lo que sugiere que el fragmento de péptido funcional tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 148 puede ser necesario para la endocitosis.
La FIG. 16B muestra la evaluación del transporte de la quimera de la hormona del crecimiento humano (HGH) por truncamiento del dominio I de Cholix a través de monocapas de epitelio de yeyuno de rata in vivo 15 minutos después de la inyección intraluminal, como se demuestra mediante microscopía de inmunofluorescencia. La FIG.
16B muestra que el constructo Cholix-HGH con SEQ ID NO: 212 (comprende Cholix1-150 metionina N-terminal) se introdujo en las células epiteliales (a diferencia de la proteína con SEQ ID NO: 211) pero permaneció en grupos vesiculares apicales y basales y no entró en la lámina propia, lo que permitió la administración al interior de una célula epitelial (por ejemplo, un compartimento en el lado basal de la célula epitelial).
La FIG. 16C muestra la evaluación del transporte de la quimera de la hormona del crecimiento humano (HGH) por truncamiento del dominio I de Cholix a través de monocapas de epitelio de yeyuno de rata in vivo 15 minutos después de la inyección intraluminal, como se demuestra mediante microscopía de inmunofluorescencia. La FIG.
16C muestra que el constructo Cholix-HGH con SEQ ID NO: 213 (comprende Cholix1-186 metionina N-terminal) se introdujo en las células epiteliales, alcanzó los compartimentos apicales y basales y, significativamente, también una región supranuclear de la célula, permanecía aún dentro de la célula epitelial, lo que sugiere que el fragmento de péptido funcional que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 151 puede permitir el acceso y la administración a regiones supranucleares, pero no permite la liberación del constructo en un compartimento basolateral (por ejemplo, lámina propia).
La FIG. 16D muestra la evaluación del transporte de la quimera de la hormona del crecimiento humano (HGH) por truncamiento del dominio I de Cholix a través de monocapas de epitelio de yeyuno de rata in vivo 15 minutos después de la inyección intraluminal, como se demuestra mediante microscopía de inmunofluorescencia. La FIG.
16D muestra que el constructo Cholix-HGH con SEQ ID NO: 218 (comprende Cholix39-186 metionina N-terminal) se introdujo en las células epiteliales pero permaneció en el compartimento apical y no pareció alcanzar los compartimentos basales o supranucleares.
La FIG. 16E muestra la evaluación del transporte de la quimera de la hormona del crecimiento humano (HGH) por truncamiento del dominio I de Cholix a través de monocapas de epitelio de yeyuno de rata in vivo 15 minutos después de la inyección intraluminal, como se demuestra mediante microscopía de inmunofluorescencia. La FIG.
16E muestra que el constructo Cholix-HGH con SEQ ID NO: 161 (comprende Cholix1-205 metionina N-terminal) completó el proceso de transcitosis como lo indica la administración de la quimera a las células dentro de la lámina propia, lo que sugiere que el fragmento de péptido funcional que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 152 (por ejemplo, los residuos de aminoácidos 187-206 de la SEQ ID NO: 5) puede permitir la liberación del constructo del epitelio en un compartimento basolateral (por ejemplo, lámina propia). La FIG. 16F muestra la evaluación del transporte de la quimera de la hormona del crecimiento humano (HGH) por truncamiento del dominio I de Cholix a través de monocapas de epitelio de yeyuno de rata in vivo 15 minutos después de la inyección intraluminal, como se demuestra mediante microscopía de inmunofluorescencia. La FIG.
16F muestra que el constructo Cholix-HGH con SEQ ID NO: 164 (comprende Cholix1-265 metionina N-terminal, SEQ ID NO: 5) completó el proceso de transcitosis como se indica mediante la administración de la quimera a células dentro de la lámina propia similar al constructo Cholix-HGH con SEQ ID NO: 164.
La FIG. 17 muestra que los fragmentos de aminoácidos seleccionados del dominio I de Cholix logran una transcitosis de apical a basal in vitro e in vivo. Un marco polimérico que contenía secuencias peptídicas de aminoácidos de las posiciones 1-39, 134-151, 151-178 y 178-206 del dominio I de Cholix con SEQ iD NO: 5 en varias combinaciones se marcó con diferentes formas de puntos cuánticos (por ejemplo, sulfuro de cadmio, sulfuro de plomo, etc.).
La FIG. 17A muestra la transcitosis de varios constructos de Cholix (Chx) truncados a través del epitelio intestinal polarizado in vitro después de 2 h. La cantidad de material transportado se informa como el aumento de fluorescencia con respecto a la preparación de punto cuántico de polímero que carece de péptidos de Chx. (N=2; media ± SE).
La FIG. 17B muestra la transcitosis in vivo a los 15 min del constructo Cholix39-186-HGH (SEQ ID NO: 218) (la flecha blanca N° 1 resalta la superficie apical y la flecha blanca N° 2 resalta la superficie basal).
La FIG. 17C muestra la transcitosis in vivo a los 15 min del constructo (SEQ iD NO: 5)-(4N)-RFP marcado con puntos cuánticos (la flecha blanca N° 1 resalta la superficie apical y la flecha blanca N° 2 resalta la superficie basal).
La FIG. 18 muestra la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 221 de un dominio 1 de Cholix (incl. y metionina N-terminal) que tiene un espaciador con una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 210 unida a su extremo C-terminal. Este espaciador puede usarse para unir fracciones de carga (por ejemplo, agentes terapéuticos) al portador de Cholix para su transporte a través de las capas epiteliales (por ejemplo, el epitelio intestinal). Los fragmentos de aminoácidos resaltados pueden proporcionar ciertas funcionalidades en relación con la transcitosis a través de las capas epiteliales. Por ejemplo, el fragmento con los residuos de aminoácidos de las posiciones 134-151 de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5 puede promover la entrada apical de los constructos de Cholix en las células epiteliales. El fragmento resaltado con los residuos de aminoácidos 151-187 (por ejemplo, de la SEQ ID NO: 5) puede promover la clasificación endosomal temprana. El fragmento resaltado con los residuos de aminoácidos 187-206 (por ejemplo, de la SEQ ID NO: 5) puede promover la transcitosis de un constructo de Chx como se describe en la presente.
La FIG. 19 muestra sitios de glicosilación potenciales de los residuos de asparagina localizados en las posiciones N98, N154, N165 y N224 del dominio I de Cholix que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 221.
La FIG. 20 muestra una estructura 3D general del dominio I de Cholix (SEQ ID NO: 5) con fragmentos funcionales resaltados.
La FIG. 20A muestra una estructura 3D general del dominio I de Cholix (SEQ ID NO: 5) con el fragmento funcional resaltado que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148 (residuos 134-151 de la SEQ ID NO: 5).
La FIG. 20B muestra una estructura 3D general del dominio I de Cholix (SEQ ID NO: 5) con el fragmento funcional resaltado que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 149 (por ejemplo, residuos 151­ 187 de la SEQ ID NO: 5).
La FIG. 20C muestra una estructura 3D general del dominio I de Cholix (SEQ ID NO: 5) con el fragmento funcional resaltado que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 152 (por ejemplo, residuos 187­ 206 de la SEQ ID NO: 5).
La FIG. 21 ilustra un análisis de vía de tráfico para el constructo de administración derivado de Cholix que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 154 (el constructo de administración es M+Cholix386-GGGGSGGGGGSGGGGS (SeQ ID NO: 210)-IL-10, desde el extremo N- al extremo C-terminal). El constructo de administración que comprende el dominio de Cholix (SEQ ID NO: 5) y la hormona del crecimiento humano (HGH) como carga también podría usarse para mostrar resultados similares a los mostrados para el constructo que comprende M+Cholix386.
La FIG. 2lA muestra que el constructo de administración de M+Cholix386-IL-10 (SEQ ID NO: 154) se colocalizó fuertemente con el antígeno EEA1 en localizaciones celulares consistentes con el tráfico en los dominios tanto apical como basal de los enterocitos, lo que sugiere la presencia de constructos de administración derivados de Cholix en los primeros compartimentos del endosoma (la flecha blanca N° 1 resalta la superficie apical y la flecha blanca N° 2 resalta la superficie basal).
La FIG. 21B muestran que el constructo de administración de M+Cholix386-IL-10 (SEQ ID NO: 154) (arriba a la derecha) se colocaliza fuertemente con Rab7 (arriba a la izquierda) predominantemente en el compartimento apical de los enterocitos, pero solo con una coocalización limitada en las células dentro de la lámina propia, lo que sugiere la presencia de constructos de administración derivados de Cholix en los compartimentos del endosoma tardío (la parte inferior izquierda muestra una imagen de luz blanca y la parte inferior derecha muestra una tinción combinada con DAPI).
La FIG. 21C muestra que LAMP1 se identificó en vesículas grandes y específicas consistentes de lisosomas maduros que carecían de constructos de administración M+Cholix386-IL-10 (SEQ ID NO: 154) (flechas blancas). Sin embargo, M+Cholix386-IL-10 (SEQ ID NO: 154) también se colocaliza con el antígeno LAMP1 en localizaciones celulares distintas de las estructuras similares a los lisosomas, consistente con el tráfico de vesículas en los dominios apical y basal de los enterocitos, lo que sugiere la presencia de los constructos de administración derivados de Cholix en los compartimentos endosomales tardíos.
La FIG. 21D muestra que la quimera M+Cholix386-IL-10 (SEQ ID NO: 154) también colocalizó fuertemente con vesículas recubiertas de clatrina, particularmente en áreas adyacentes al núcleo y en el Rabl 1 predominantemente en el compartimento basal de los enterocitos así como en células seleccionadas dentro de la lámina propia.
La FIG. 21E muestra que el constructo de administración de M+Cholix386-IL-10 (SEQ ID NO: 154) colocaliza con el retículo endoplásmico como lo demuestra la calnexina en un patrón adyacente al núcleo en enterocitos y en una gran fracción de células en la lámina propia. El constructo de administración de M+Cholix386-IL-10 (SEQ ID NO: 154) se colocaliza fuertemente con el compartimento intermedio de Golgi del retículo endoplasmático (ERGIC) y el antígeno LAMN1 pareció redistribuirse en respuesta a la endocitosis y transcitosis del portador, como se muestra para 1 (FIG. 21F), 5 (FIG. 21G), 10 (FIG. 21H), y15 minutos después de la inyección (FIG. 21I).
La FIG. 21F muestra que el constructo de administración de M+Cholix386-IL-10 (SEQ ID NO: 154) se colocaliza fuertemente con el compartimento intermedio de Golgi del retículo endoplasmático (ERGIC) y el antígeno LAMN1 parecía redistribuirse en respuesta a la endocitosis y transcitosis del portador, como se muestra durante 1 minuto después de la inyección (la flecha blanca N° 1 resalta la superficie apical y la flecha blanca N° 2 resalta la superficie basal).
La FIG. 21G muestra la colocalización del constructo de administración de M+Cholix386-IL-10 (SEQ ID NO: 154) con el antígeno LAMN1 5 minutos después de la inyección (la flecha blanca N° 1 resalta la superficie apical y la flecha blanca N° 2 resalta la superficie basal).
La FIG. 21H muestra la colocalización del constructo de administración de M+Cholix386-IL-10 (SEQ ID NO: 154) con el antígeno LAMN1 10 minutos después de la inyección.
La FIG. 21I muestra la colocalización del constructo de administración de M+Cholix386-IL-10 (SEQ ID NO: 154) con el antígeno LAMN1 15 minutos después de la inyección.
La FIG. 21J muestra que el constructo de administración de M+Cholix386-IL-10 (SEQ ID NO: 154) no se colocaliza con los niveles bajos de gigantina presentes en los enterocitos. Algo de gigantina colocalizó con la quimera en un subconjunto de células presentes en la lámina propia, lo que sugiere que el portador derivado de Cholix no se localiza con el compartimento de Golgi (la flecha blanca N° 1 resalta la superficie apical y la flecha blanca N° 2 resalta la basal). superficie).
La FIG. 21K muestra que el antígeno 58K se localiza en los enterocitos en un sitio apical al núcleo y el constructo de administración de M+Cholix386-IL-10 (SEQ ID NO: 154) muestra cierta colocalización con este antígeno de una manera que sugiere un breve movimiento a través de este compartimento. No se observó antígeno 58K en células dentro de la lámina propia (la flecha blanca N° 1 resalta la superficie apical y la flecha blanca N° 2 resalta la superficie basal).
La FlG. 21L muestra que el constructo de administración de M+Cholix386-IL-10 (SEQ ID NO: 154) mostró cierto nivel de colocalización con el antígeno TGN38 (arriba a la derecha), que mostró una distribución celular que se restringió al lado apical de los núcleos en enterocitos y adyacente al núcleo en unas pocas células dentro de la lámina propia (luz blanca e imágenes combinadas que se muestran abajo a la izquierda y abajo a la derecha, respectivamente).
La FIG. 21M muestra que el constructo de administración de M+Cholix386-IL-10 (SEQ ID NO: 154) (la tinción se muestra en verde, arriba a la derecha) se colocaliza fuertemente con Rabl1 (arriba a la izquierda) predominantemente en el compartimento basal de los enterocitos y en células seleccionadas dentro de la lámina propia (luz blanca e imágenes combinadas que se muestran abajo a la izquierda y abajo a la derecha, respectivamente).
La FIG. 22 ilustra una ID SDS-PAGE que muestra que puede usarse un protocolo eficiente usando perlas magnéticas de tamaño nanométrico (25 nm o 100 nm de diámetro) decoradas con elementos portadores derivados de Cholix no tóxicos para la captura de proteínas específicas para analizar proteínas que interactúan con Cholix o portadores derivados del mismo.
La FIG. 23 ilustra que, después de múltiples lavados, las vesículas enriquecidas con perlas magnéticas pueden solubilizarse en tampón de lisis y los componentes proteicos presentes pueden separarse mediante 2-D SDS-PAGE para su análisis.
La FIG. 24 muestra que los patrones de estas proteínas pueden compararse con el contenido total de proteínas de las células y que la espectrometría de masas puede usarse para identificar elementos específicos asociados con estructuras vesiculares a las que acceden los constructos de administración derivados de Cholix.
La FIG. 25 muestra una comparación de los resultados de las repeticiones del protocolo descrito anteriormente usado para identificar un conjunto de candidatos de interacción. Luego, las proteínas que interactúan pueden examinarse en cuanto a su contenido en células Caco-2 y en el intestino delgado de rata. La interacción de Cholix con las proteínas candidatas identificadas puede confirmarse usando perlas magnéticas recubiertas de portador de Cholix y proteína candidata purificada.
La FIG. 26 muestra que la incubación de las perlas recubiertas con el portador de Cholix (que tiene el aminoácido expuesto en la SEQ ID NO: 154) con las proteínas puras y las transferencias Western o ELISA posteriores puede permitir la detección de la interacción de Cholix-proteína. Por ejemplo, esta figura muestra la interacción del portador de Cholix con el proteoglicano de sulfato de heparán (HSPG), la proteína 1 relacionada con Dickkopf (DKK1), la proteína 75 regulada por glucosa chaperona (GRP75) y la citoqueratina-8 (K8 o CK8). La FIG. 27 muestra la colocalización microscópica de proteínas candidatas y el constructo de administración derivado de Cholix en yeyuno de rata. Se mostró in vivo la colocalización de un constructo de administración que comprende una proteína portadora de Cholix acoplada a IL-10 (SEQ ID NO: 154, M+Cholix386-GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 210)-IL-10) con CK8.
La FIG. 27A muestra la colocalización después de tratar yeyuno de rata con una aplicación luminal de constructo de administración de M+Cholix386-IL-10 (SeQ ID NO: 154) durante 1 minuto (la flecha blanca N° 1 resalta la superficie apical y la flecha blanca N° 2 resalta la superficie basal).
La FIG. 27B muestra la colocalización después de tratar yeyuno de rata con una aplicación luminal de constructo de administración de M+Cholix386-IL-10 (sEq ID NO: 154) durante 5 minutos.
La FIG. 27C muestra la colocalización después de tratar yeyuno de rata con una aplicación luminal del constructo de administración de M+Cholix386-IL-10 (SEQ ID NO: 154) durante 10 minutos. Por tanto, se demostró que la colocalización en la región supranuclear aumenta con el tiempo.
La FIG. 28 muestra una comparación de los resultados obtenidos en un estudio IHC con el atlas humano para garantizar que la distribución del receptor sea consistente entre los estudios in vivo en ratas y el intestino humano. Aquí, se examinan dos de los receptores identificados por espectrometría de masas y verificados en yeyuno de rata.
La FIG. 28A muestra que la localización intestinal de GRP75 es consistente entre el intestino de rata y humano. La FIG. 28B muestra que la localización intestinal de HSPC es consistente entre el intestino de rata y humano. La FIG. 29 muestra los efectos del silenciamiento de HSPG por CRISPR sobre la función de transporte del constructo de administración (SEQ ID NO: 164) que comprende el dominio I de Cholix (SEQ ID NO: 5) acoplado a HGH (SEQ ID NO: 214) a través de un espaciador de poliglicina-serina (SEQ ID NO: 210) y HGH sola como control interno del transporte no selectivo. Las células se sembraron a 1,5 x 105 células/ml en transwelIs. El día 18, se midió la resistencia eléctrica transepitelial/transendotelial (TEER) y se añadió a las cámaras apicales PBS que contenía 20 ug/ml del constructo de administración. Después de 3 h, se recogieron y concentraron muestras basolaterales. La extensión del transporte de proteínas se analizó mediante transferencia Western usando anticuerpos anti-HGH. Los resultados mostrados en la FIG. 29 demuestran que la transcitosis y el transporte selectivo activo de las proteínas portadoras derivadas de Cholix dependen de HSPG, ya que el portador de Cholix mostró una función de transcitosis significativamente menor en las células HSPC-silenciadas en comparación con las células Caco-2 normales positivas para HSPG.
La FIG. 30 muestra los efectos del silenciamiento de K8, HSPC y GRP75 sobre la función de transcitosis de los constructos de administración derivados del dominio I de Cholix. Se usaron líneas celulares estables de células Caco-2 que carecían de la expresión de proteínas candidatas específicas como monocapas in vitro para verificar su requisito de transcitosis del portador usando mecanismos de transporte endógeno activos y selectivos. El transporte específico del constructo de administración que contiene HGH frente al transporte no selectivo de HGH sola se redujo en los silenciamientos de HSPG y GRP75, pero no en el silenciamiento de K8.
La FIG. 30A muestra los efectos de silenciamiento de K8.
La FIG. 30B muestra los efectos de silenciamiento de HSPC.
La FIG. 30C muestra los efectos de silenciamiento de GRP75.
La FIG. 30D muestra el experimento de control.
La FIG. 31 muestra las interacciones de unión de Biacore usadas para examinar la dependencia del pH de las interacciones del portador de Cholix-GRP75. Las proteínas portadoras de Cholix se unieron a perlas magnéticas usando la bioconjugación de biotina-estreptavidina y se incubaron con proteína GRP75 purificada en soluciones tampón con pH 5,5, 6,5 y 7,5, respectivamente. La mayor afinidad de unión se mostró a pH 6,5.
La FIG. 32 muestra un modelo de superficie ejemplar del dominio I de Cholix (SEQ ID NO: 5) que se usó para resaltar áreas seleccionadas de interés potencial en este proceso de transcitosis debido a su proyección desde la superficie de la proteína. Es interesante señalar que dos regiones de aminoácidos entre M1 y G40 son adyacentes a los aminoácidos D151-A187 y a 187-L206 expuestos en la superficie. Específicamente, L18-I26 (dominio X1) y T171-I176 (dominio X2) se coordinan para formar un bolsillo rodeado por varias cargas negativas. De manera similar, K187-H203 (dominio X3) se coordina con I32-E40 (dominio X4) para formar una estructura de cresta continua La FIG. 32A muestra la proximidad de los dominios X3 y X4.
La FIG. 32B muestra la proximidad de los dominios X1 y X2, así como X3 y X4.
La FIG. 32C muestra la proximidad de los dominios X1 y X2.
La FIG. 32D muestra la proximidad de los dominios X1 y X2, así como X3 y X4.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Introducción
La presente divulgación proporciona métodos y composiciones para el transporte y/o la administración de una molécula de carga a ciertas localizaciones dentro de una célula (por ejemplo, una localización supranuclear) o a través de una célula (por ejemplo, una célula epitelial), ya sea in vitro o in vivo. (por ejemplo, en un roedor o un humano). Dicha carga puede dirigir sea un conjunto de localizaciones acoplándola a una molécula portadora. Tal molécula portadora puede interactuar con receptores únicos tanto en la superficie celular como intracelularmente para la administración dirigida de la carga. Varios de tales portadores, cargas y usos de los mismos se describen en la presente.
A menos que se defina lo contrario en la presente, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente divulgación tendrán los significados que son comúnmente entienden por los expertos en la técnica. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos singulares incluirán plurales y los términos plurales incluirán el singular. Generalmente, las nomenclaturas usadas en conexión con, y técnicas de, cultivo de células y tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, genética, química de proteínas y ácidos nucleicos, e hibridación descritas en la presente son las comúnmente usadas y bien conocidas en la técnica. Los métodos y técnicas de la presente divulgación se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva a menos que se indique lo contrario. Ver, por ejemplo, Green y Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se realiza comúnmente en la técnica o como se describe en la presente. La nomenclatura usada en relación con, y los procedimientos de laboratorio y las técnicas de química analítica, química orgánica sintética y química farmacéutica y médica descritas en la presente, son los comúnmente usados y bien conocidos en la técnica. Se usan técnicas estándar para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y administración, y tratamiento de pacientes.
Como se describe en la presente, una secuencia de aminoácidos puede comprender una o más modificaciones de las secuencias de aminoácidos en el extremo N-terminal. Una secuencia de aminoácidos como se describe en la presente puede comprender una "caperuza N". En general, una caperuza N como se describe en la presente puede referirse a una modificación de un extremo N-terminal de un péptido o polipéptido en una variedad de maneras y, en particular, puede referirse a (i) la adición de una o más secuencias de aminoácidos u otras fracciones (por ejemplo, identificadores de afinidad, secuencias peptídicas que penetran en las células, etc.), y (ii) una modificación de uno o más residuos de aminoácidos dentro de los primeros 1-10 aminoácidos N-terminales de un péptido o polipéptido, en donde la modificación de aminoácidos es relativa a una secuencia de referencia o una secuencia de consenso (ver, por ejemplo, la comparación de los primeros 4 residuos de aminoácidos N-terminales de las secuencias polipeptídicas expuestas en las SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 como se describe en la presente). Una caperuza N puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 15 o 100 residuos de aminoácidos adicionales que están unidos (por ejemplo, acoplados químicamente) al extremo N terminal de una secuencia de aminoácidos, como una molécula portadora derivada de Cholix. Una caperuza N puede comprender además una o más variaciones en la secuencia de aminoácidos en el extremo N-terminal. Por ejemplo, un portador derivado del dominio I de Cholix puede comprender una caperuza N. La caperuza N puede comprender la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos N-terminales con otros residuos de aminoácidos. Una caperuza N puede comprender además un residuo de metionina N-terminal. Una o más de estas modificaciones pueden ser el resultado de producir la secuencia de aminoácidos del dominio I de Cholix en un sistema de producción bacteriano (por ejemplo, E. coli). Como ejemplo, el dominio I de Cholix puede comprender los residuos de aminoácidos 1-265 de la SEQ ID NO: 1, que se expone en la SEQ ID NO: 4. Un dominio de Cholix expresado por bacterias puede comprender una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5, que como la SEQ ID NO: 4 más residuos de metionina N-terminales, al que también puede hacerse referencia en la presente como M+Cholix1’265 o M+Cholix265.
Como se describe en la presente, el término "carece de un dominio" o "que carece de un dominio" se refiere de manera general a que no comprende un dominio completo, pero que opcionalmente comprende una porción o fragmento del mismo. Por ejemplo, un portador que se deriva de un dominio I de una exotoxina pero que carece de un dominio II, un dominio Ib y un dominio III de dicha exotoxina se refiere de manera general a un portador que no comprende las secuencias de aminoácidos completas de (por ejemplo, 100% de identidad de secuencia con) cualquiera de los dominios II, Ib y III, pero que puede comprender opcionalmente porciones o fragmentos del mismo. Por tanto, un portador derivado de un dominio Cholix y que carece de un dominio Ii de Cholix como se describe en la presente puede comprender un dominio I de Cholix que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5 y 50-80 residuos de aminoácidos adicionales del dominio II de Cholix (por ejemplo, aminoácidos 1-50 o 1-80 de la SEQ ID NO: 126), y/o 50-80 residuos de aminoácidos adicionales del dominio III de Cholix (por ejemplo, aminoácidos 1-50 o 1-80 de la SEQ ID NO: 128).
Como se describe en la presente, los términos "unido a", "acoplado a", "enlazado a", "conjugado a" y "fusionado a" pueden usarse indistintamente y generalmente significan que una primera molécula (por ejemplo, un polipéptido) está asociada con una segunda molécula (por ejemplo, un polipéptido, molécula pequeña, etc.). La asociación puede ser a través de un enlace químico, en donde el enlace químico puede ser covalente o no covalente. Un enlace químico covalente entre un primer polipéptido y un segundo polipéptido puede producirse acoplando sintéticamente el primer polipéptido al segundo polipéptido, o puede producirse mediante la fusión recombinante del primer polipéptido con el segundo polipéptido. Por tanto, una primera molécula (por ejemplo, un primer polipéptido) puede acoplarse químicamente (por ejemplo, sintéticamente) o recombinantemente a una segunda molécula (por ejemplo, un segundo polipéptido.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Además, los términos "toxina", "portador", "constructo de administración", "constructo quimérico", "proteína" y "polipéptido" pueden usarse indistintamente y en general se refieren a una molécula que puede acoplarse a una carga heteróloga. Generalmente, "constructos de administración" y "constructos quiméricos" son "péptidos", "polipéptidos" o "proteínas", que se describen en la presente como cadenas de aminoácidos cuyos carbonos alfa están enlazados a través de enlaces peptídicos. Por lo tanto, el aminoácido terminal en un extremo de la cadena (terminal amino) tiene un grupo amino libre, mientras que el aminoácido terminal en el otro extremo de la cadena (terminal carboxi) tiene un grupo carboxilo libre. Como se usa en la presente, el término "terminal amino" (abreviado extremo N-terminal) se refiere al grupo a-amino libre en un aminoácido en el terminal amino de un péptido o al grupo a-amino (grupo imino cuando participa en un enlace peptídico) de un aminoácido en cualquier otra localización dentro del péptido. De manera similar, el término "extremo terminal carboxi" se refiere al grupo carboxilo libre en el extremo terminal carboxi de un péptido o al grupo carboxilo de un aminoácido en cualquier otra localización dentro del péptido. Los péptidos también incluyen esencialmente cualquier poliaminoácido que incluye, pero no se limita a, miméticos de péptidos como aminoácidos unidos por un enlace éter en lugar de un enlace amida. En general, los péptidos, polipéptidos, y proteínas como se describen en la presente pueden producirse recombinantemente o sintetizarse químicamente (por ejemplo, usando síntesis en fase sólida), o una combinación de los mismos.
Como se divulga en la presente, el término "administración" se refiere de manera general a la presencia de una molécula (por ejemplo, una carga heteróloga) en una localización (por ejemplo, un compartimento intracelular o una región supranuclear) durante un cierto período de tiempo. El término "administración" puede referirse a la presencia de una molécula (por ejemplo, una carga heteróloga) en una localización (por ejemplo, un compartimento intracelular o una región supranuclear) durante un tiempo suficiente para provocar un determinado efecto biológico, como un interacción (por ejemplo, unión) con una proteína (por ejemplo, una enzima o un receptor) en esa localización. La administración de una molécula (por ejemplo, una carga heteróloga) a una localización (por ejemplo, un compartimento intracelular o una región supranuclear) puede referirse a la retención de la molécula en esa localización. La retención de una molécula en una determinada región o compartimento intracelular o extracelular puede ser durante una cierta cantidad de tiempo, por ejemplo, por lo menos 2 minutos, por lo menos 5 minutos, por lo menos 10 minutos, por lo menos 15 minutos, a los 30 minutos o por lo menos 60 minutos. La retención de una molécula puede depender de varios factores, como la localización donde se retiene la molécula y/o los tipos de interacciones moleculares que se producen entre la molécula (por ejemplo, un portador, un constructo de administración y/o una carga heteróloga). Por ejemplo, la administración de una carga heteróloga a un compartimento basolateral a través de transcitosis a través de una célula epitelial polarizada puede comprender retener la carga heteróloga en la localización basolateral durante un tiempo suficiente para provocar un efecto determinado, como un efecto terapéutico en el caso de una carga terapéutica y/o biológicamente activa.
Los polipéptidos de la divulgación incluyen polipéptidos que se han modificado de cualquier manera y por cualquier motivo, por ejemplo, para: (1) reducir la susceptibilidad a la proteolisis, (2) reducir la susceptibilidad a la oxidación, (3) alterar la afinidad de unión para formar complejos de proteínas, (4) alterar las afinidades de unión y (5) conferir o modificar otras propiedades fisicoquímicas o funcionales. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de aminoácidos simples o múltiples (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos conservadoras) en la secuencia natural (por ejemplo, en la porción del polipéptido fuera del dominio o dominios que forman contactos intermoleculares). Una "sustitución conservadora de aminoácidos" se refiere a la sustitución en un polipéptido de un aminoácido con un aminoácido funcionalmente similar.
1) Alanina (A), Serina (S) y Treonina (T)
2) Ácido aspártico (D) y ácido glutámico (E)
3) Asparagina (N) y Glutamina (Q)
4) Arginina (R) y Lisina (K)
5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M) y Valina (V)
6) Fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptófano (W)
Una "sustitución de aminoácidos no conservadora" se refiere a la sustitución de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Al realizar tales cambios, de acuerdo con varias realizaciones, puede considerarse el índice hidropático de aminoácidos. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en base de sus características de hidrofobicidad y carga. Son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5). En otras realizaciones, el portador de constructos de administración es un portador quimérico que comprende un péptido, polipéptido, molécula pequeña, aptámero, fragmentos de los mismos, o cualquier combinación de los mismos.
La importancia del índice hidropático de aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a una proteína se entiende en la técnica (ver, por ejemplo, Kyteetal., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131). Se sabe que ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropática similar y todavía conservan una actividad biológica similar. Al realizar cambios en base al índice hidropático, en varias realizaciones, se incluye la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ± 2. En varias realizaciones, se incluyen aquellos que están dentro de ± 1, y en varias realizaciones, se incluyen aquellos dentro de 0,5.
También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede realizarse de manera eficaz en base a la hidrofilicidad, en particular cuando la proteína o el péptido biológicamente funcional creado de este modo está destinado a su uso en aplicaciones inmunológicas, como se divulga en la presente. En varias realizaciones, la mayor hidrofilicidad media local de una proteína, determinada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína.
Se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a estos residuos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 /- 0,1); glutamato (+3,0 /- 0,1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 /- 0,1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) y triptófano (-3,4). Al realizar cambios en base a los valores de hidrofilicidad similares, en varias realizaciones, se incluye la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ± 2, en varias realizaciones, se incluyen aquellos que están dentro de ± 1, y en varias realizaciones, se incluyen aquellos dentro de 0,5.
Las sustituciones de aminoácidos ejemplares se exponen en la TABLA 1.
TABLA 1 - i i n min i m l r
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Un experto en la técnica podrá determinar variantes adecuadas de polipéptidos como se expone en la presente usando técnicas bien conocidas. Un experto en la técnica puede identificar áreas adecuadas de la molécula que pueden cambiarse sin destruir la actividad dirigiéndose a regiones que no se cree que sean importantes para la actividad. El experto en la técnica puede identificar residuos y porciones de las moléculas que se conservan entre polipéptidos similares. Las áreas de estos materiales que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura podrían someterse a sustituciones conservadoras de aminoácidos sin destruir la actividad biológica o sin afectar negativamente a la estructura del polipéptido.
Además, un experto en la técnica puede revisar los estudios de estructura-función identificando residuos en polipéptidos similares que son importantes para la actividad o la estructura. En vista de tal comparación, el experto en la técnica puede predecir la importancia de los residuos de aminoácidos en un polipéptido que corresponden a residuos de aminoácidos importantes para la actividad o estructura en polipéptidos similares. Un experto en la técnica puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para tales residuos de aminoácidos importantes previstos.
Un experto en la técnica también puede analizar la estructura tridimensional y la secuencia de aminoácidos con respecto a esa estructura en polipéptidos similares. En vista de tal información, un experto en la técnica puede predecir la alineación de los residuos de aminoácidos de un polipéptido con respecto a su estructura tridimensional. Un experto en la técnica puede elegir no realizar cambios radicales en los residuos de aminoácidos que se prevé que estén en la superficie del polipéptido, ya que tales residuos pueden estar implicados en interacciones importantes con otras moléculas. Además, un experto en la técnica puede generar variantes de prueba que contengan una única sustitución de aminoácidos en cada residuo de aminoácidos deseado. Luego, las variantes pueden seleccionarse usando ensayos de actividad conocidos por los expertos en la técnica. Tales variantes podrían usarse para recopilar información sobre variantes adecuadas. Por ejemplo, si se descubre que un cambio en un residuo de aminoácidos particular da como resultado una actividad destruida, indeseablemente reducida o inadecuada, pueden evitarse las variantes con tal cambio en la secuencia de aminoácidos. En otras palabras, en base a la información recopilada de tales experimentos rutinarios, un experto en la técnica puede determinar fácilmente los aminoácidos en los que se deben evitar sustituciones adicionales, ya sea solos o en combinación con otras mutaciones.
El término "fragmento de polipéptido" y "polipéptido truncado", como se usa en la presente, se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino-terminal y/o carboxi-terminal en comparación con una proteína de longitud completa correspondiente. En varias realizaciones, los fragmentos pueden tener, por ejemplo, por lo menos 5, por lo menos 10, por lo menos 25, por lo menos 50, por lo menos 100, por lo menos 150, por lo menos 200, por lo menos 250, por lo menos 300, por lo menos 350, por lo menos 400, por lo menos 450, por lo menos 500, por lo menos 600, por lo menos 700, por lo menos 800, por lo menos 900 o por lo menos 1000 aminoácidos de longitud. Los fragmentos también pueden tener, por ejemplo, como máximo 1000, como máximo 900, como máximo 800, como máximo 700, como máximo 600, como máximo 500, como máximo 450, como máximo 400, como máximo 350, como máximo 300, como máximo 250, como máximo 200, como máximo 150, como máximo 100, como máximo 50, como máximo 25, como máximo 10, o como máximo 5 aminoácidos de longitud. Un fragmento puede comprender además, en cualquiera o ambos de sus extremos, uno o más aminoácidos adicionales, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de una proteína de origen natural diferente (por ejemplo, un Fc o dominio de cremallera de leucina) o una secuencia de aminoácidos artificial (por ejemplo, una secuencia espaciadora artificial).
Los términos "variante polipeptídica" y "mutante polipeptídico", como se usan en la presente, se refieren a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o más residuos de aminoácidos se insertan, eliminan y/o sustituyen en la secuencia de aminoácidos con respecto a otra secuencia polipeptídica. El número de residuos de aminoácidos a insertar, eliminar o sustituir puede ser, por ejemplo, por lo menos 1, por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4, por lo menos 5, por lo menos 10, por lo menos 25, por lo menos 50, por lo menos 75, por lo menos 100, por lo menos 125, por lo menos 150, por lo menos 175, por lo menos 200, por lo menos 225, por lo menos 250, por lo menos 275, por lo menos 300, por lo menos 350, por lo menos 400, por lo menos por lo menos 450 o por lo menos 500 aminoácidos de longitud. Las variantes de la presente divulgación incluyen proteínas de fusión.
Un "derivado" de un polipéptido es un polipéptido que se ha modificado químicamente, por ejemplo, conjugación con otra fracción química como, por ejemplo, polietilenglicol, albúmina (por ejemplo, albúmina de suero humano), fosforilación y glicosilación.
El término "% de identidad de secuencia" se usa indistintamente en la presente con el término "% de identidad" y se refiere al nivel de identidad de secuencia de aminoácidos entre dos o más secuencias peptídicas o el nivel de identidad de secuencia de nucleótidos entre dos o más secuencias de nucleótidos, cuando se alinean usando un programa de alineamiento de secuencias. Por ejemplo, como se usa en la presente, 80% de identidad significa lo mismo que 80% de identidad de secuencia determinada por un algoritmo definido, y significa que una secuencia dada es por lo menos 80% idéntica a otra longitud de otra secuencia. En varias realizaciones, el % de identidad se selecciona de, por ejemplo, por lo menos el 60%, por lo menos el 65%, por lo menos el 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, o por lo menos el 99% o más de identidad de secuencia con una secuencia dada. El % de identidad está en el intervalo de, por ejemplo, de aproximadamente el 60% a aproximadamente el 70%, de aproximadamente el 70% a aproximadamente el 80%, de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 85%, de aproximadamente el 85% a aproximadamente el 90%, de aproximadamente el 90% a aproximadamente el 95%, de aproximadamente el 95% a aproximadamente el 99%.
El término "% de homología de secuencia" se usa indistintamente en la presente con el término "% de homología" y se refiere al nivel de homología de secuencias de aminoácidos entre dos o más secuencias de péptidos o el nivel de homología de secuencias de nucleótidos entre dos o más secuencias de nucleótidos, cuando se alinean usando un programa de alineamiento de secuencias. Por ejemplo, como se usa en la presente, 80% de homología significa lo mismo que 80% de homología de secuencia determinada por un algoritmo definido y, en consecuencia, un homólogo de una secuencia dada tiene más del 80% de homología de secuencia en una longitud de la secuencia dada. El % de homología se selecciona de, por ejemplo, por lo menos el 60%, por lo menos el 65%, por lo menos el 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, o por lo menos el 99% o más de homología de secuencia con una secuencia dada. En varias realizaciones, el % de homología está en el intervalo de, por ejemplo, de aproximadamente el 60% a aproximadamente el 70%, de aproximadamente el 70% a aproximadamente el 80%, de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 85%, de aproximadamente el 85% a aproximadamente el 90%, de aproximadamente el 90% a aproximadamente el 95%, de aproximadamente el 95% a aproximadamente el 99%.
Los programas informáticos ejemplares que pueden usarse para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el conjunto de programas BLAST, por ejemplo, BLASTN, BLASTX, TBLASTX, BLASTP y TBLASTN, disponibles públicamente en Internet en el sitio web de NCBI. Ver también Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10 (con referencia especial a la configuración predeterminada publicada, es decir, parámetros w=4, t=17) y Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402. Las búsquedas de secuencias se llevan a cabo típicamente usando el programa BLASTP cuando se evalúa una secuencia de aminoácidos determinada con respecto a secuencias de aminoácidos en GenBank Protein Sequences y otras bases de datos públicas. Se prefiere el programa BLASTX para buscar secuencias de ácidos nucleicos que se han traducido en todos los marcos de lectura frente a secuencias de aminoácidos en GenBank Protein Sequences y otras bases de datos públicas. Tanto BLASTP como BLASTX se ejecutan usando los parámetros predeterminados de una penalización de hueco abierto de 11,0 y una penalización de hueco extendido de 1,0, y utilizan la matriz BLOSUM-62. Ver identificación.
Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, por ejemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual se produciría por casualidad una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es, por ejemplo, como máximo 0,1, como máximo 0,01 o como máximo 0,001.
"Polinucleótido" se refiere a un polímero compuesto de unidades de nucleótidos. Los polinucleótidos incluyen ácidos nucleicos de origen natural como ácido desoxirribonucleico ("ADN") y ácido ribonucleico ("ARN"), así como análogos de ácidos nucleicos. Los análogos de ácidos nucleicos incluyen aquellos que incluyen bases de origen no natural, nucleótidos que participan en enlaces con otros nucleótidos distintos del enlace fosfodiéster de origen natural o que incluyen bases unidas a través de enlaces distintos de los enlaces fosfodiéster. Así, los análogos de nucleótidos incluyen, por ejemplo y sin limitación, fosforotioatos, fosforoditioatos, fosforotriésteres, fosforamidatos, boranofosfatos, metilfosfonatos, metilfosfonatos quirales, 2-O-metilribonucleótidos, ácidos nucleicos peptídicos (PNA) y similares. Tales polinucleótidos pueden sintetizarse, por ejemplo, usando un sintetizador de ADN automatizado. El término "ácido nucleico" se refiere típicamente a polinucleótidos grandes. El término "oligonucleótido" se refiere típicamente a polinucleótidos cortos, generalmente no mayores de aproximadamente 50 nucleótidos. Se entenderá que cuando una secuencia de nucleótidos está representada por una secuencia de ADN (es decir, A, T, G, C), esto también incluye una secuencia de ARN (es decir, A, U, G, C) en la que "U" reemplaza "T".
La notación convencional se usa en la presente para describir secuencias de polinucleótidos: el extremo izquierdo de una secuencia de polinucleótidos de cadena sencilla es el extremo 5'; la dirección hacia la izquierda de una secuencia de polinucleótidos de cadena doble se denomina dirección 5'. La dirección de la adición de nucleótidos de 5' a 3' a los transcritos de ARN naciente se denomina dirección de transcripción. La cadena de ADN que tiene la misma secuencia que un ARNm se denomina "cadena codificante"; las secuencias en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que un ARNm transcrito a partir de ese ADN y que están localizadas de 5' al extremo 5' del transcrito de ARN se denominan "secuencias en sentido ascendente"; secuencias en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que están localizadas de 3' al extremo 3' del transcrito de ARN codificante se denomina “secuencias en sentido descendente”.
"Complementario" se refiere a la compatibilidad topológica o el emparejamiento de las superficies que interactúan de dos polinucleótidos. Por tanto, las dos moléculas pueden describirse como complementarias y, además, las características de la superficie de contacto son complementarias entre sí. Un primer polinucleótido es complementario con un segundo polinucleótido si la secuencia de nucleótidos del primer polinucleótido es sustancialmente idéntica a la secuencia de nucleótidos de la pareja de unión del polinucleótido del segundo polinucleótido, o si el primer polinucleótido puede hibridar con el segundo polinucleótido en condiciones de hibridación rigurosas.
"Hibridar específicamente con" o "hibridación específica" o "hibridar selectivamente con", se refiere a la unión, duplicación o hibridación de una molécula de ácido nucleico preferentemente con una secuencia de nucleótidos particular en condiciones rigurosas cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja (por ejemplo, ADN o ARN celular total). El término "condiciones rigurosas" se refiere a las condiciones en las que una sonda hibridará preferentemente con su subsecuencia objetivo y, en menor medida, con otras secuencias, o no lo hará en absoluto. La "hibridación rigurosa" y las "condiciones de lavado de hibridación rigurosas" en el contexto de los experimentos de hibridación de ácidos nucleicos como las hibridaciones Southern y Northern dependen de la secuencia y son diferentes bajo diferentes parámetros ambientales Una guía exhaustiva para la hibridación de ácidos nucleicos puede encontrarse en Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I, capítulo 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, N.Y.; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 3.sup.rd ed., NY; y Ausubel et al., eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY.
En general, las condiciones de hibridación y lavado altamente rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5° C más bajas que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y un pH definidos) a la que el 50% de la secuencia objetivo hibrida en una sonda perfectamente emparejada. Se seleccionan condiciones muy rigurosas para que sean iguales a la Tm para una sonda particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de aproximadamente 100 residuos complementarios en un filtro en una transferencia Southern o Northern es formalina al 50% con 1 mg de heparina a 42° C, realizándose la hibridación durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado altamente rigurosas es NaCl 0,15 M a 72° C durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado rigurosas es un lavado 0,2 x SSC a 65° C durante 15 minutos. Ver Sambrook et al. para obtener una descripción del tampón SSC. Un lavado altamente riguroso puede estar precedido por un lavado de baja rigurosidad para eliminar la señal de la sonda de fondo. Un lavado de rigurosidad media ejemplar para un dúplex de, por ejemplo, más de aproximadamente 100 nucleótidos, es 1 x SSC a 45° C durante 15 minutos. Un ejemplo de lavado de baja rigurosidad para un dúplex de, por ejemplo, más de aproximadamente 100 nucleótidos, es de 4-6 x SSC a 40°C durante 15 minutos. En general, una relación señal/ruido de 2x (o mayor) que la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica la detección de una hibridación específica.
"Cebador" se refiere a un polinucleótido que es capaz de hibridar específicamente con una plantilla de polinucleótido designada y proporcionar un punto de inicio para la síntesis de un polinucleótido complementario. Tal síntesis se produce cuando el cebador polinucleotídico se coloca en condiciones en las que se induce la síntesis, es decir, en presencia de nucleótidos, una plantilla polinucleotídica complementaria y un agente para la polimerización como la ADN polimerasa. Un cebador es típicamente de cadena sencilla, pero puede ser de cadena doble. Los cebadores son típicamente ácidos desoxirribonucleicos, pero una amplia variedad de cebadores sintéticos y de origen natural son útiles para muchas aplicaciones. Un cebador es complementario a la plantilla con la que está diseñado para hibridar para servir como sitio para el inicio de la síntesis, pero no necesita reflejar la secuencia exacta de la plantilla. En tal caso, la hibridación específica del cebador con la plantilla depende de la rigurosidad de las condiciones de hibridación. Los cebadores pueden marcarse, por ejemplo, con fracciones cromogénicas, radiactivas o fluorescentes y usarse como fracciones detectables.
"Sonda", cuando se usa en referencia a un polinucleótido, se refiere a un polinucleótido que es capaz de hibridar específicamente con una secuencia designada de otro polinucleótido. Una sonda hibrida específicamente con un polinucleótido complementario objetivo, pero no es necesario que refleje la secuencia complementaria exacta de la plantilla. En tal caso, la hibridación específica de la sonda con el objetivo depende de la rigurosidad de las condiciones de hibridación. Las sondas pueden marcarse, por ejemplo, con fracciones cromogénicas, radiactivas o fluorescentes y usarse como fracciones detectables. En los casos en los que una sonda proporciona un punto de inicio para la síntesis de un polinucleótido complementario, una sonda también puede ser un cebador.
Un "vector" es un polinucleótido que puede usarse para introducir otros ácidos nucleicos enlazados a él en una célula. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a una molécula de ADN de cadena doble lineal o circular en la que pueden ligarse segmentos de ácidos nucleicos adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico (por ejemplo, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados con defectos de replicación), en donde pueden introducirse segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que comprenden un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episomales) se integran en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped, y de este modo se replican junto con el genoma del huésped. Un "vector de expresión" es un tipo de vector que puede dirigir la expresión de un polinucleótido elegido.
Una "secuencia reguladora" es un ácido nucleico que afecta a la expresión (por ejemplo, el nivel, la cadencia o la localización de la expresión) de un ácido nucleico al que está enlazado operativamente. La secuencia reguladora puede, por ejemplo, ejercer sus efectos directamente sobre el ácido nucleico regulado, o a través de la acción de una o más de otras moléculas (por ejemplo, polipéptidos que se unen a la secuencia reguladora y/o al ácido nucleico). Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Ejemplos adicionales de secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. y Baron et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06. Una secuencia de nucleótidos está 'enlazada operativamente' a una secuencia reguladora si la secuencia reguladora afecta a la expresión (por ejemplo, el nivel, la cadencia o la localización de la expresión) de la secuencia de nucleótidos.
Generalmente, una célula de la presente divulgación puede ser una célula eucariota o una célula procariota. Una célula puede ser una célula epitelial. Una célula epitelial puede ser una célula epitelial polarizada (por ejemplo, una célula Caco-2 o una célula de ovario de hámster chino (CHO)). Una célula puede ser una célula animal o una célula vegetal. Una célula animal puede incluir una célula de un invertebrado marino, un pez, insectos, anfibio, reptil o mamífero. Una célula de mamífero puede obtenerse de un primate, simio, equino, bovino, porcino, canino, felino o roedor. Un mamífero puede ser un primate, simio, perro, gato, conejo, hurón o similar. Un roedor puede ser un ratón, una rata, un hámster, un jerbo, un hámster, una chinchilla o un conejillo de indias. Una célula de pájaro puede ser de canario, periquito o loros. Una célula de reptil puede ser de tortuga, lagarto o serpiente. Una célula de pez puede ser de un pez tropical. Por ejemplo, la célula de pez puede ser de un pez cebra (por ejemplo, Danino rerio). Una célula de gusano puede ser de un nematodo (por ejemplo, C. elegans). Una célula de anfibio puede ser de una rana. Una célula de artrópodo puede ser de una tarántula o un cangrejo ermitaño.
Una célula de mamífero también puede incluir células obtenidas de un primate (por ejemplo, un primate humano o no humano). Una célula de mamífero puede incluir una célula sanguínea, una célula madre, una célula epitelial, una célula de tejido conectivo, una célula secretora de hormonas, una célula nerviosa, una célula del músculo esquelético o una célula del sistema inmunitario. En realizaciones preferidas, los métodos y composiciones de la presente divulgación se usan en combinación con una o más células sanguíneas de mamíferos.
Una "célula huésped" es una célula que puede usarse para expresar un polinucleótido de la divulgación. Una célula huésped puede ser una procariota, por ejemplo, E. coli, o puede ser una eucariota, por ejemplo, una eucariota unicelular (por ejemplo, una levadura u otro hongo), una célula vegetal (por ejemplo, una células vegetal de tabaco o de tomate), una célula animal (por ejemplo, una célula humana, una célula de mono, una célula de hámster, una célula de rata, una célula de ratón o una célula de insecto) o un hibridoma. Típicamente, una célula huésped es una célula cultivada que puede transformarse o transfectarse con una serie de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos, que luego pueden expresarse en la célula huésped. La frase "célula huésped recombinante" puede usarse para indicar una célula huésped que ha sido transformada o transfectada con una serie de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos a ser expresados. Una célula huésped también puede ser una célula que comprende una serie de ácidos nucleicos pero que no los expresa a un nivel deseado a menos que se introduzca una secuencia reguladora en la célula huésped de tal manera que se enlace operativamente con el ácido nucleico. Se entiende que el término célula huésped se refiere no sólo a la célula objeto particular sino también a la progenie o progenie potencial de dicha célula. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a, por ejemplo, mutación o influencia ambiental, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula original, pero todavía está incluida dentro del alcance del término como se usa en la presente.
El término "molécula aislada" (donde la molécula es, por ejemplo, un polipéptido como un portador o un constructo de administración, o un polinucleótido) es una molécula que en virtud de su origen o fuente de derivación (1) no está asociada con componentes naturalmente asociados que lo acompañan en su estado nativo, (2) está sustancialmente libre de otras moléculas de la misma especie (3) es expresado por una célula de una especie diferente, o (4) no se produce en la naturaleza. Por tanto, una molécula que se sintetice químicamente, o se exprese en un sistema celular diferente de la célula de la que se origina de manera natural, se "aislará" de sus componentes asociados de manera natural. Una molécula también puede quedar sustancialmente libre de componentes asociados de manera natural mediante aislamiento, usando técnicas de purificación bien conocidas en la técnica. La pureza u homogeneidad de las moléculas puede ensayarse mediante una serie de medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la pureza de una muestra de polipéptido puede ensayarse usando electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción del gel para visualizar el polipéptido usando técnicas bien conocidas en la técnica. Para ciertos propósitos, pueden proporcionarse técnicas de separación de mayor resolución usando HPLC u otros medios bien conocidos en la técnica para la purificación.
Como se divulga en la presente, los términos "transcitosis completa", "transcitosis eficiente" o "transcitosis" o "transporte" pueden usarse indistintamente y pueden referirse al transporte de constructos de administración derivados de toxinas a través de capas epiteliales como el epitelio intestinal. Estos términos pueden referirse a un transporte completo de estos constructos según se determina en el experimento respectivo usando varias técnicas para evaluar la eficiencia de la transcitosis, como la microscopía de fluorescencia.
Como se usa en la presente, los términos "que comprende" y "que tiene" pueden usarse indistintamente. Por ejemplo, los términos "un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1" y "un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1" pueden usarse indistintamente.
Una proteína o polipéptido es "sustancialmente puro", "sustancialmente homogéneo" o "sustancialmente purificado" cuando por lo menos aproximadamente del 60% al 75% de una muestra presenta una única especie de polipéptido. El polipéptido o proteína puede ser monomérico o multimérico. Una proteína o polipéptido sustancialmente puro comprenderá típicamente aproximadamente el 50%, 60%, 70%, 80% o 90% P/P de una muestra de proteína, más habitualmente aproximadamente el 95% y, por ejemplo, tendrá una pureza superior al 99%. La pureza u homogeneidad de la proteína puede indicarse mediante una serie de medios bien conocidos en la técnica, como la electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra de proteína, seguido de la visualización de una única banda polipeptídica tiñendo el gel con una tinción bien conocida en la técnica. Para ciertos propósitos, pueden proporcionar técnicas de resolución de mayor resolución usando HPLC u otros medios bien conocidos en la técnica para purificación.
Como se divulga en la presente, un "espaciador" se refiere a una molécula que se une a otras dos moléculas, ya sea covalentemente o a través de enlaces iónicos, de van der Waals o de hidrógeno, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que hibrida con una secuencia complementaria en el extremo 5' y a otra secuencia complementaria en el extremo 3', uniendo por tanto dos secuencias no complementarias. Un "espaciador escindible" se refiere a un espaciador que puede degradarse o cortarse de otro modo para separar los dos componentes conectados por el espaciador escindible. Los espaciadores escindibles generalmente son escindidos por enzimas, típicamente peptidasas, proteasas, nucleasas, lipasas y similares. Los espaciadores escindibles también pueden ser escindidos por desencadenantes ambientales, como, por ejemplo, actividades enzimáticas específicas, cambios de temperatura, pH, concentración de sal, etc. cuando hay tal cambio en el entorno después de la transcitosis de los constructos de administración a través de una membrana epitelial polarizada. Por tanto, una carga heteróloga (por ejemplo, una carga biológicamente activa) puede liberarse del portador de una manera dependiente del pH y/o dependiente de enzimas.
"Composición farmacéutica" se refiere a una composición adecuada para su uso farmacéutico en un animal. Una composición farmacéutica comprende una cantidad farmacológicamente eficaz de un agente activo y un portador farmacéuticamente aceptable. "Cantidad farmacológicamente eficaz" se refiere a la cantidad de un agente eficaz para producir el resultado farmacológico pretendido.
"Portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquiera de los portadores, vehículos, tampones y excipientes farmacéuticos estándar, como una solución salina tamponada con fosfato, una solución acuosa de dextrosa al 5% y emulsiones, como una emulsión de aceite/agua o agua/aceite, y varios tipos de agentes humectantes y/o adyuvantes. Los portadores y formulaciones farmacéuticas adecuadas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 21a ed. 2005, Mack Publishing Co, Easton. Una "sal farmacéuticamente aceptable" es una sal que puede formularse en un compuesto para su uso farmacéutico que incluye, por ejemplo, sales metálicas (sodio, potasio, magnesio, calcio, etc.) y sales de amoníaco o aminas orgánicas.
Los términos "tratar", "que trata" y "tratamiento" se refieren a un método para aliviar o anular un trastorno biológico y/o por lo menos uno de sus síntomas concomitantes. Como se usa en la presente, “aliviar” una enfermedad, trastorno o afección significa reducir la gravedad y/o la frecuencia de aparición de los síntomas de la enfermedad, trastorno o afección. Además, las referencias en la presente a "tratamiento" incluyen referencias a tratamientos curativos, paliativos y profilácticos.
Como se usa en la presente, el término "sujeto" se refiere generalmente a un humano o a otro animal. Un sujeto puede ser de cualquier edad, por ejemplo, un sujeto puede ser un bebé, un niño pequeño, un niño, un preadolescente, un adolescente, un adulto o un anciano.
Los intervalos pueden expresarse en la presente como desde "aproximadamente" un valor particular, y/o hasta "aproximadamente" otro valor particular. Cuando se expresa tal intervalo, otra realización incluye desde un valor particular y/o hasta el otro valor particular. De manera similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente "aproximadamente", se entenderá que el valor particular forma otra realización. Se entenderá además que los puntos finales de cada uno de los intervalos están en relación con el otro punto final, e independientemente del otro punto final. El término "aproximadamente" como se usa en la presente se refiere a un intervalo que es del 15% más o menos de un valor numérico establecido dentro del contexto del uso particular. Por ejemplo, aproximadamente 10 puede incluir un intervalo de 8,5 a 11,5.
Portadores
En la presente se contemplan varios portadores que consisten de polipéptidos que pueden usarse para administrar una carga a una localización a través de una célula epitelial polarizada mediante transcitosis.
Los ejemplos de un polipéptido contemplado en la presente incluyen cualquier polipéptido que se derive de un dominio I de una exotoxina y que carece de un dominio II, un dominio Ib y un dominio III de la exotoxina. Tales dominios I incluyen, pero no se limitan a, las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5. Los polipéptidos que se derivan de cualquiera de las secuencias anteriores incluyen aquellos que tienen una alta homología de secuencia con las secuencias anteriores (por ejemplo, más del 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad de secuencia como se define con más detalle en la presente). Los polipéptidos que se derivan de cualquiera de las secuencias anteriores incluyen aquellos que son fragmentos de los anteriores que funcionan para administrar una carga a una localización definida dentro de una célula o a través de una célula epitelial.
Los métodos y composiciones de la presente divulgación se basan en el sorprendente descubrimiento de los inventores de que un portador capaz de interactuar con uno o más receptores endógenos (por ejemplo, ribofilina 1, SEC24, CK-8, TMEM132, GRP75, ERGIC-53 y/o o perlecán) puede proporcionar una administración rápida y eficiente de la carga en y/o a través de una célula como una célula epitelial.
Los métodos y composiciones descritos en la presente permiten un transporte y/o administración rápidos y eficientes de moléculas de carga a través de células epiteliales y/o al interior (por ejemplo, a la vesícula o compartimento intracelular o al citosol) de células epiteliales (por ejemplo, células epiteliales intestinales polarizadas). La presente divulgación proporciona constructos (por ejemplo, constructos de administración aislados) que pueden comprender un portador acoplado a una carga heteróloga. Un portador, como se divulga en la presente, puede variar en tamaño y composición molecular, así como en otros parámetros fisicoquímicos, como el punto isoeléctrico, la carga neta molecular total, etc. En general, y como se describe adicionalmente en la presente, un portador puede ser una molécula pequeña, un polipéptido, un aptámero, un ácido nucleico, un fragmento y/o cualquier combinación de los mismos.
Los portadores son una forma no natural de exotoxina Cholix (Cholix) que comprende solo un dominio I (es decir, que carece de un dominio II (a veces denominado dominio de translocación), un dominio Ib y un dominio III (a veces denominado dominio citotóxico)) y pueden ser capaces de transportar y/o administrar una carga heteróloga (como moléculas biológicas, terapéuticas o de diagnóstico) a través de células epiteliales intactas (por ejemplo, células epiteliales intestinales polarizadas) y barreras de células epiteliales (por ejemplo, monocapas de células Caco-2 o el epitelio intestinal de un sujeto) a través de transcitosis y/o al interior de una célula epitelial (por ejemplo, a través de endocitosis apical y la clasificación y el tráfico endosomal posteriores).
La presente divulgación proporciona métodos y composiciones que comprenden un portador, en donde el portador está acoplado a una carga biológicamente activa y, como tal, puede administrar la carga biológicamente activa a o a través de las células epiteliales. El portador puede ser un polipéptido de Cholix, en donde el polipéptido puede derivarse de una exotoxina. Los polipéptidos portadores derivados de exotoxinas descritos en la presente pueden utilizar vías de tráfico endógenas, incluyendo los receptores endógenos y los complejos de receptores, para lograr la transcitosis de apical a basal y/o la captación en el interior de una célula, como una célula epitelial (por ejemplo, enterocitos). Los portadores de administración de la presente divulgación pueden acceder a un compartimento basolateral (por ejemplo, lámina propia) y/o al interior de una célula epitelial sin dañar la célula o la capa celular y sin alterarse, degradarse o modificarse (por ejemplo, alterarse o modificarse química o enzimáticamente). Los constructos portadores (por ejemplo, constructos de administración aislados) de la presente divulgación pueden utilizar además compartimentos intracelulares específicos durante la transcitosis y/o la administración intracelular para lograr la eficiencia de transporte descrita.
La presente divulgación proporciona métodos y composiciones que pueden comprender portadores que usan (o interactúan con) un conjunto de proteínas y receptores endógenos implicados en el proceso de transcitosis de apical a basal a través de células epiteliales, como células epiteliales intestinales polarizadas (por ejemplo, enterocitos), para mediar en la transcitosis de un portador acoplado a una carga desde una luz que bordea la superficie apical de una membrana mucosa hasta el lado basolateral de una membrana mucosa. Los constructos de administración divulgados en la presente pueden participar en interacciones con dichas proteínas y receptores para proporcionar transporte y administración eficientes de varias moléculas de carga a localizaciones dentro de una célula epitelial y/o a través de una célula epitelial hasta el lado basal de un epitelio (por ejemplo, un epitelio intestinal de un sujeto). Los constructos descritos en la presente, como los constructos de administración, puede comprender un portador acoplado a una carga heteróloga, en donde el portador y/o la carga heteróloga pueden interactuar con proteínas y/o receptores durante la administración intracelular (por ejemplo, a una región supranuclear o a un compartimento localizados el lado basal dentro de la célula epitelial) o durante la transcitosis (por ejemplo, transcitosis vesicular). El portador puede interactuar con una o más proteínas (por ejemplo, receptores o enzimas). Estas interacciones pueden ser dinámicas y/o dependientes del pH. Se señala que las interacciones descritas en la presente son solo ejemplos y no limitan los métodos y las composiciones de esta divulgación a otras interacciones (por ejemplo, con otras proteínas o receptores).
Las composiciones y los métodos divulgados en la presente proporcionan la administración y el transporte eficientes de varias moléculas de carga (por ejemplo, moléculas pequeñas así como macromoléculas) a través de las células epiteliales y/o hacia el interior de las células epiteliales. Los portadores descritos en la presente logran tal administración eficiente de la carga de una manera que no afecta a la barrera de células epiteliales ni la estructura de administración en sí. Por tanto, las propiedades funcionales de los constructos de administración (por ejemplo, las del portador así como las funciones de la carga) pueden conservarse durante el transporte, lo que permite una administración rápida y eficiente de dicha carga. Los portadores descritos actualmente utilizan rutas de tráfico endógenas para administrar moléculas de carga exógenas o endógenas a localizaciones específicas. Esas localizaciones pueden estar dentro de una célula epitelial y/o en compartimentos basolaterales fuera de células epiteliales en el lado basal, por ejemplo, la lámina propia.
Los portadores de la presente divulgación comprenden que pueden derivarse de una exotoxina. Las toxinas de proteínas bacterianas son bien conocidas en la técnica y se analizan en fuentes como Burns, D., et al., eds., BACTERIAL PROTEIN TOXINS, ASM Press, Herndon Va. (2003), Aktories, K. and Just, I., eds., BACTERIAL PROTEIN TOXINS (HANDBOOK OF EXPERIMENTAL PHARMACOLOGY), Springer-Verlag, Berlin, Alemania (2000), y Alouf, J. y Popoff, M., eds., THE COMPREHENSIVE SOURCEBOOK OF BACTERIAL PROTEIN TOXINS, Academic Press, Inc., San Diego, Calif (3a Ed., 2006).
Como se describe adicionalmente en la presente, una exotoxina puede comprender uno o más dominios. Como se divulga en la presente, una exotoxina puede ser Cholix o PE. Para Cholix, en la presente se usa la siguiente nomenclatura para describir sus varios dominios (extremo N a C-terminal) y se usa la variante funcional de Cholix que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 como secuencia de referencia: (i) dominio I (residuos de aminoácidos 1-265, SEQ ID NO: 4), (ii) dominio II (residuos de aminoácidos 266-386, SEQ ID NO: 126), (iii) dominio Ib (residuos de aminoácidos 387-425, SEQ ID NO: 127), y (iv) dominio III (residuos de aminoácidos 426-634, SEQ ID NO: 128). Para PE, en la presente se usa la siguiente nomenclatura para describir sus varios dominios (extremo N a C-terminal) y se usa la variante de PE funcional que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 135 como secuencia de referencia: (i) dominio I (residuos de aminoácidos 1-252, SEQ ID NO: 137), (ii) dominio II (residuos de aminoácidos 253-364, SEQ ID No: 138), (iii) dominio Ib (residuos de aminoácidos 365 -404, SEQ ID NO: 139) y (iv) dominio III (residuos de aminoácidos 405-613, SEQ ID NO: 140). Además, los intervalos de residuos de aminoácidos que definen estos dominios pueden ser flexibles y las variaciones de aproximadamente 5 a 10 residuos de aminoácidos aún pueden estar dentro del alcance de esta divulgación, por ejemplo, describir una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos de aminoácidos 5­ 265 o 5-270, o 1-260, o 5-260 de Cholix de longitud completa aún pueden entenderse como un dominio I de Cholix y demás. Como se divulga en la presente, los términos "dominio I" y "dominio de unión al receptor" de una exotoxina pueden usarse indistintamente. Como se divulga en la presente, los términos "dominio II" y "dominio de translocación" de una exotoxina pueden usarse indistintamente. Como se divulga en la presente, los términos "dominio III", "dominio catalítico" y "dominio citotóxico" de una exotoxina pueden usarse indistintamente.
La exotoxina A (PE) de Pseudomonas aeruginosa, portador de difteria (DT) de Corynebacterium diphtheria y Cholix de Vibrio cholera forman una familia de toxinas de proteínas bacterianas que actúan como ADP-ribosiltransferasas. Por tanto, el portador puede derivarse de una toxina Cholix.
Un polipéptido de Cholix como se describe en la presente puede volverse no tóxico mediante una o más sustituciones de aminoácidos. Un polipéptido o portador derivado de Cholix como se describe en la presente puede volverse no tóxico sustituyendo un residuo de ácido glutámico en la posición 581 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 con alanina, lo que da como resultado un constructo de Cholix que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3.
Como se describe adicionalmente en la presente, Cholix y PE están organizados en distintos dominios (I, II, Ib y III) que se indican en base a sus relaciones estructurales. El dominio I parece facilitar la internalización y la transcitosis de la exotoxina, mientras que los dominios II, Ib y III proporcionan otras funciones como, por ejemplo, actividad enzimática en el caso del dominio III que puede ADP-ribosilar el factor de elongación 2 para inducir la apoptosis celular mediante el bloqueo de la síntesis de proteínas. Anteriormente se desconocía qué componentes de las proteínas de PE y Cholix están implicadas en el proceso de transcitosis transepitelial.
Cholix es secretado por Vibrio cholera como una proteína de 70,7 kDa compuesta por tres dominios globulares prominentes (la, II y III) y un pequeño subdominio (Ib) que conecta los dominios II y III de manera similar a la estructura de PE (Jorgensen, R. et al., J Biol Chem 283(16): 10671-10678, 2008). El Cholix maduro comprende un género de variantes funcionales, en donde cada variante puede diferir en uno o más residuos de aminoácidos en comparación con otra variante. Sin embargo, todas las variantes de Cholix divulgadas en la presente y abarcadas en esta divulgación son variantes de Cholix funcionales. Como se usa en la presente, Cholix es una proteína de 634 residuos, y en la presente se incluyen específicamente dos variantes funcionales, que son aquellas que tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 1. Un ácido nucleico que codifica la proteína de Cholix madura como se usa en la presente se expone en la SEQ ID NO: 134.
La exotoxina A de Pseudomonas o "PE" es secretada por Pseudomonas aeruginosa como una proteína de 67 kDa compuesta por tres dominios globulares prominentes (la, II y III) y un pequeño subdominio (Ib) que conecta los dominios II y III (ver Allured et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83:13201324, 1986). La PE madura como se usa en la presente es una proteína de 613 residuos, cuya secuencia se expone en la SEQ ID NO: 134. Un ácido nucleico que codifica la PE madura como se usa en la presente se expone en la SEQ ID NO: 135.
La secuencia de aminoácidos de la toxina Cholix madura se expone en la SEQ ID NO: 1 y se usa como secuencia de referencia, a menos que se especifique lo contrario. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4 contiene los residuos de aminoácidos 1-265 de la secuencia de aminoácidos de la toxina Cholix madura expuesta en la SEQ ID NO: 1 y se define como dominio I de Cholix. Por tanto, el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4 también puede describirse como "Chx1-265" (o "Cholix1'265" o "Cholix265" o "Dominio I de Cholix"). Además de la secuencia de referencia de Cholix expuesta en la SEQ ID NO: 1, cualquier otra variante de exotoxina de Cholix, funcionalmente activa, está incluida en la presente divulgación, por ejemplo, aquellas que comprenden una secuencia de consenso que define la actividad funcional de las exotoxinas Cholix (ver, por ejemplo, Awasthi et al. Novel Cholix toxin variantes, ADP-ribosylating toxins in Vibrio Cholerae Non-O1/Non-0139 strains, and their patogenicity, Infection and Immunity, 81(2), p. 531-541 (2013)). Como ejemplo, el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 es una variante funcional de la SEQ ID NO: 1. Como tal, un dominio I derivado de esa secuencia de exotoxina Cholix, o una versión truncada de la misma, puede usarse como un portador para la administración rápida y eficiente de la carga. Usando la nomenclatura descrita en la presente con la secuencia de referencia siendo la SEQ ID NO: 1, un polipéptido del dominio I de la exotoxina Cholix con SEQ ID NO: 2 también puede describirse como los residuos de aminoácidos 1-4 de la SEQ ID NO: 2 Cholix5-265.
En otros casos, y como se describe en la presente, un primer portador y un segundo portador se producen en un sistema de expresión diferente (por ejemplo, un sistema de expresión bacteriano o de mamífero). Los sistemas de expresión bacterianos incluyen E. coli, y los sistemas de expresión de mamíferos incluyen células CHO, por ejemplo. Un polipéptido producido por bacterias puede comprender una caperuza N, en donde la caperuza N puede comprender una o más modificaciones en el extremo N-terminal del polipéptido. Una caperuza N puede comprender un residuo de metionina N-terminal. Los ejemplos de polipéptidos portadores derivados del dominio I de Cholix que pueden producirse por bacterias y que comprenden dicha metionina N-terminal incluyen aquellos que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 107 y SEQ ID NO: 125.
La presente divulgación contempla portadores aislados derivados de toxinas bacterianas y de origen no natural (por ejemplo, un derivado de una exotoxina) que pueden acoplarse a una carga (por ejemplo, un producto biológicamente activo); en donde el portador es capaz de administrar la carga (por ejemplo, un producto biológicamente activo) a través del transporte por transcitosis a través del epitelio intestinal. El portador puede derivarse de un dominio I de una exotoxina Cholix. Un portador que se deriva de un dominio I de una exotoxina puede carecer de un dominio II (por ejemplo, SEQ ID NO: 126 o SEQ ID NO: 138), un dominio Ib (por ejemplo, SEQ ID NO: 127 o SEQ ID NO: 139), o un dominio III (por ejemplo, SEQ ID NO: 128 o SEQ ID NO: 140) de una exotoxina.
Como se describe en la presente, un portador que "carece" de un dominio II, un dominio Ib y un dominio III de una exotoxina (por ejemplo, Cholix y/o PE) aún puede comprender una porción del dominio II, un dominio Ib o el dominio III de la exotoxina, o una combinación de los mismos. Por tanto, el término "ausente" como se hace referencia en la presente significa que un portador no comprende un dominio II completo, un dominio Ib completo o un dominio III completo. Un portador puede comprender no más del 70% de los residuos de aminoácidos de un dominio II, un dominio Ib o un dominio III de una exotoxina. Por ejemplo, un portador puede comprender un dominio I de Cholix (por ejemplo, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5) o una versión truncada del mismo, y además comprender los residuos de aminoácidos 1-82 del dominio II de Cholix (SEQ ID NO: 126). Un portador puede comprender no más del 60% de los residuos de aminoácidos de un dominio II, un dominio Ib, o un dominio III de una exotoxina. Un portador puede comprender no más del 50% de los residuos de aminoácidos de un dominio II, un dominio Ib o un dominio III de una exotoxina. Un portador puede comprender no más del 25% de los residuos de aminoácidos de un dominio II, un dominio Ib o un dominio III de una exotoxina. Un portador puede comprender no más del 10% de los residuos de aminoácidos de un dominio II, un dominio Ib o un dominio III de una exotoxina.
La presente divulgación contempla portadores aislados derivados de toxinas bacterianas y de origen no natural (por ejemplo, un derivado de una exotoxina) que pueden acoplarse a una carga (por ejemplo, un producto biológicamente activo); en donde el portador es capaz de administrar la carga (por ejemplo, un producto biológicamente activo) al interior de una célula epitelial, como una vesícula o compartimento intracelular o el citosol. Las regiones y/o compartimentos en el interior de una célula epitelial pueden incluir regiones y/o compartimentos en el lado apical del interior de una célula epitelial, regiones y/o compartimentos en el lado basal del interior de una célula epitelial, regiones supranucleares de una célula epitelial, o cualquier combinación de los mismos. La célula epitelial puede ser una célula epitelial intestinal polarizada. La célula epitelial intestinal polarizada puede ser parte de una monocapa de células epiteliales polarizadas (por ejemplo, que comprende células Caco-2) o puede ser parte de un epitelio intestinal de un sujeto (por ejemplo, un roedor o un humano).
Un portador puede derivarse de un portador bacteriano como una exotoxina Cholix y puede derivarse de un dominio I de dicha exotoxina y puede carecer de un dominio II (por ejemplo, SEQ ID NO: 126), un dominio Ib (por ejemplo, SEQ ID NO: 127), o un dominio III (por ejemplo, SEQ ID NO: 128) de una exotoxina (por ejemplo, Cholix). El portador puede comprender un dominio de unión al receptor o un fragmento de unión, que puede ser un dominio, una región o un fragmento dentro del dominio I derivado de la exotoxina, y que permite la unión del constructo de administración a uno o más receptores selectivos o no selectivos en la superficie luminal de una célula epitelial. Un receptor puede ser un receptor selectivo o un receptor no selectivo, como un receptor eliminador no selectivo en la superficie luminal de las células epiteliales intestinales. El uno o más receptores con los que un portador puede interactuar en la superficie de una célula epitelial y/o durante la endocitosis pueden incluir una proteína 1 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP1) o una proteína transmembrana 132 (TMEM132). Por tanto, el constructo de administración puede unirse a uno o más receptores de la superficie celular que pueden estar presentes en la membrana apical de una célula epitelial con suficiente afinidad para permitir la endocitosis. El constructo de administración puede unirse a cualquier receptor que se sepa que está presente en la membrana apical de una célula epitelial por un experto en la técnica sin limitación. El portador puede unirse a LRP1. El portador puede unirse a TMEM132. Alternativamente, el portador puede unirse a lRp1 y TMEM132.
Un portador puede derivarse de un dominio I de una exotoxina Cholix. Un portador como se describe en la presente se deriva de un dominio I de una exotoxina, en donde la exotoxina es Cholix. Por tanto, un portador como se describe en la presente puede comprender una secuencia de aminoácidos que se deriva de la del dominio I de Cholix (por ejemplo, SEQ iD NO: 4 o SeQ ID NO: 5). Un dominio I de Cholix (por ejemplo, SEQ ID NO: 4) puede comprender los aminoácidos 1-265 de la SEQ ID NO: 1 o puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5 (por ejemplo, cuando se produce en bacterias y comprende un residuo de metionina N-terminal) y puede describirse como un "dominio de unión al receptor" que funciona como un ligando para un receptor de la superficie celular y media la unión de Cholix y la endocitosis. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos con más del 50% de homología con cualquiera de las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos con más del 60% de homología con cualquiera de las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos con más del 70% de homología con cualquiera de las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos con más del 80% de homología con cualquiera de las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos con más del 90% de homología con cualquiera de las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos con más del 95% de homología con cualquiera de las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125. Como se describe en la presente, una sustitución de residuos de aminoácidos se identificará por referencia a la sustitución de aminoácidos particular en un residuo de aminoácidos específico. Por tanto, por ejemplo, el término "S30A" indica que el residuo "S" (serina, en el código estándar de una sola letra) en la posición 30 en la SEQ ID NO: 4 se ha sustituido por una "A" (alanina, en el código estándar de una sola letra), y el portador modificado se identificará como "CholixS30A". Un portador puede ser una versión truncada de una secuencia del dominio I de Cholix expuesta en la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5. Por tanto, un portador que comprende unaversión truncada de un dominio I de Cholix puede comprender un conjunto de secuencias de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 6 - SEQ ID NO: 125. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125, en donde uno o más residuos amino de tal secuencia se elimina. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125, en donde uno o más residuos de aminoácidos pueden sustituirse con otro aminoácido. Como se describe en la presente, un portador truncado puede identificarse por referencia a los residuos de aminoácidos que comprenden la toxina truncada, por ejemplo, un portador de Cholix truncado que consta de los residuos de aminoácidos 1-260 de la SEQ ID NO: 4 se identificará como Cholix260 y así sucesivamente, de acuerdo con la nomenclatura descrita en la presente.
En la TABLA 2 a continuación, se muestran secuencias ejemplares de nucleótidos y aminoácidos de los portadores como se describe en la presente.
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Un portador puede ser un polipéptido que se deriva de una exotoxina Cholix y que tiene: como máximo 5 residuos de aminoácidos; como máximo 10 residuos de aminoácidos; como máximo 15 residuos de aminoácidos; como máximo 20 residuos de aminoácidos; como máximo 30 residuos de aminoácidos; como máximo 40 residuos de aminoácidos; como máximo 50 residuos de aminoácidos; como máximo 60 residuos de aminoácidos; como máximo 70 residuos de aminoácidos; como máximo 80 residuos de aminoácidos; como máximo 90 residuos de aminoácidos; como máximo 100 residuos de aminoácidos; como máximo 110 residuos de aminoácidos; como máximo 120 residuos de aminoácidos; como máximo 130 residuos de aminoácidos; como máximo 140 residuos de aminoácidos; como máximo 150 residuos de aminoácidos; como máximo 160 residuos de aminoácidos; como máximo 170 residuos de aminoácidos; como máximo 180 residuos de aminoácidos; como máximo 190 residuos de aminoácidos; como máximo 200 residuos de aminoácidos; como máximo 210 residuos de aminoácidos; como máximo 220 residuos de aminoácidos; como máximo 230 residuos de aminoácidos; como máximo 240 residuos de aminoácidos; como máximo 250 residuos de aminoácidos; como máximo 260 residuos de aminoácidos; y como máximo 265 residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. El dominio de unión al receptor portador bacteriano puede ser un polipéptido derivado de Cholix y que tiene por lo menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más de homología de secuencia con la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5. El portador puede ser un polipéptido derivado de Cholix y que tiene como máximo un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de homología de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 133. Los residuos de aminoácidos pueden ser consecutivos. Los residuos de aminoácidos también son no consecutivos. Un portador puede derivar de un dominio I de una exotoxina Cholix. Un portador que se deriva de un dominio I de una exotoxina puede comprender un aminoácido que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125, o por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. Un portador que se deriva de un dominio I de una exotoxina puede comprender un aminoácido que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125, o por lo menos un 90% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. Un portador que se deriva de un dominio I de una exotoxina puede comprender un aminoácido que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125, o por lo menos un 95% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. Un portador que se deriva de un dominio I de una exotoxina puede comprender un aminoácido que tiene por lo menos un 99% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125, o por lo menos un 99% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. Un portador que se deriva de un dominio I de una exotoxina puede comprender un aminoácido que tiene una identidad de secuencia del 100% con cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en las s Eq ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125, o una identidad de secuencia del 100% con un fragmento funcional de las mismas.
Un portador puede sintetizarse artificialmente. Un portador puede ser un polipéptido sintetizado artificialmente que tiene por lo menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más de homología de secuencia de aminoácidos con un dominio I de Cholix (por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NO: 4 -SEQ ID NO: 125). Un portador puede ser un polipéptido sintético que tiene como máximo un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de homología de secuencia de aminoácidos con un dominio I de Cholix (por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125). El polipéptido del que puede estar compuesto un portador puede sintetizarse usando síntesis en fase sólida.
Un portador puede ser un polipéptido derivado de Cholix y que tiene como máximo un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de homología de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 4 -SEQ ID NO: 125. Ciertos fragmentos dentro de la secuencia de aminoácidos del portador pueden tener funciones específicas que pueden estar relacionadas con uno o más aspectos del proceso de transcitosis. Estas funciones pueden comprender cruzar una monocapa polarizada de células epiteliales primarias del intestino delgado humano o un epitelio intestinal intacto, permitir o promover la endocitosis en una célula epitelial, el transporte de apical a basal, la liberación del constructo de administración de la membrana basal en un compartimiento basolateral, la administración en una vesícula o compartimento intracelular o en el citosol de una célula epitelial, y/o la administración en una región supranuclear de una célula epitelial (por ejemplo, una célula epitelial intestinal polarizada).
Por tanto, la presente divulgación proporciona portadores que pueden tener varias funciones (por ejemplo, una o más de endocitosis, transcitosis, administración intracelular, etc.). Dicho portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5 o por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma, y no más de 347 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1. Dicho portador puede comprender una deleción o mutación en uno o más de los residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4 (por ejemplo, un dominio I de Cholix expresado en una célula de mamífero) o la SEQ ID NO: 5 (por ejemplo, un dominio I de Cholix expresado en una célula bacteriana). Dicho portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 o por lo menos un 90% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma, y no más de 347 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5 o por lo menos un 95% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma, y no más de 347 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5 o por lo menos un 99% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma, y no más de 347 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene un 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5 o un 100% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma, y no más de 347 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1. Un portador divulgado en la presente puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5 o un fragmento funcional de la misma. El portador puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 7 o un fragmento funcional de la misma. El portador puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 9 o un fragmento funcional de la misma.
Un portador funcional de la presente divulgación puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, un fragmento funcional de las mismas, o cualquier combinación de las mismas. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, un fragmento funcional de las mismas, o cualquier combinación de las mismas. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, un fragmento funcional de las mismas, o cualquier combinación de las mismas. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 99% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, un fragmento funcional de las mismas, o cualquier combinación de las mismas. Un portador puede comprender una estructura espacial en la que uno o más residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 148 o la SEQ ID NO: 149 están muy cerca de uno o más residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 151, y uno o más aminoácidos los residuos de ácido de la SEQ ID NO: 148 o la SEQ ID NO: 149 están muy cerca de uno o más residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 152.
Un portador de la presente divulgación puede ser capaz de administrar una carga a través de una célula epitelial (por ejemplo, una célula epitelial polarizada). Dicho portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 30 o la SEQ ID NO: 31 o la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 11 o por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 30 o la SEQ ID NO: 31 o la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 11 o por lo menos un 90% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 30 o la SEQ ID NO: 31 o la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 11 o por lo menos un 95% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 30 o la SEQ ID NO: 31 o la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 11 o por lo menos un 99% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. Un portador puede comprender además una deleción o mutación en uno o más de los residuos de aminoácidos 1-187 o 1-205 de la SEQ ID NO: 10 o 1-186 o 1-206 de la SEQ ID NO: 11. Un portador puede comprender los residuos 1-186 de la SEQ ID NO: 30 o 1-187 de la SEQ ID NO: 31 y no más de 206 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1.
Los métodos y las composiciones de la presente divulgación pueden comprender un portador que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 10 - SEQ ID NO: 31 o por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 10 - SEQ ID NO: 31 o por lo menos un 90% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. En algunos casos, el portador comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 10 - SEQ ID NO: 31 o por lo menos un 95% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 10 -SEQ ID NO: 31 o por lo menos un 99% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de las mismas. El portador puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 11 o un fragmento funcional de la misma.
Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 106 o la SEQ ID NO: 107 o con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 30 o la SEQ ID NO: 31 o por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. Dicho portador puede ser capaz de administrar la carga a una localización intracelular. Dicha localización intracelular puede ser una región supranuclear. Dicho portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: l06 o la SEQ ID NO: 107 o con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 30 o la SEQ ID NO: 31 o por lo menos un 90% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 106 o la SEQ ID NO: 107 o con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID nO: 30 o la SEQ ID NO: 31 o por lo menos un 95% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 106 o la SEQ ID NO: 107 o con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 30 o la SEQ ID NO: 31 o por lo menos un 99% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. Un portador puede comprender una deleción o mutación en uno o más de los residuos de aminoácidos 1-151 o 1-187 de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5.
Los métodos y composiciones de la presente divulgación proporcionan un portador que puede carecer de uno cualquiera o más de los residuos de aminoácidos 1-39 de la s Eq ID NO: 5 o los residuos de aminoácidos 1-38 de la SEQ ID NO: 4. Tal portador puede ser capaz de administrar carga a una localización intracelular a través de endocitosis. Tal localización puede ser una región o compartimento apical. Un portador puede carecer de todos los residuos de aminoácidos 1-39 de la SEQ ID NO: 5 o de los residuos de aminoácidos 1-38 de la SEQ ID NO: 4. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 70 o un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 70 o un 90% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la s Eq ID NO: 70 o un 95% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 70 o un 99% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. Un portador puede comprender los residuos 1-151 de la SEQ ID NO: 5 o los residuos 1-150 de la SEQ ID NO: 4 y no más de 187 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1.
Un portador de la presente divulgación puede comprender una versión truncada de un dominio I de Cholix. Por tanto, un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 30 - SEQ ID NO: 107 o por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. Tal portador puede ser capaz de administrar carga a una localización intracelular a través de endocitosis. Tal localización puede ser una región o compartimento apical y/o basal. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las s Eq ID NO: 30 - SEQ ID NO: 107 o por lo menos un 90% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 30 - SEQ ID NO: 107 o por lo menos un 95% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 30 - SEQ ID NO: 107 o por lo menos un 99% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. Un portador puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 30 o la SEQ ID NO: 31 o un fragmento funcional de la misma.
Un portador de la presente divulgación puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 106 o la SEQ ID NO: 107 o la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 124 o la SEQ ID NO: 125 o por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. Tal portador puede ser capaz de administrar carga a una localización intracelular a través de endocitosis. Tal localización puede ser una región o compartimento apical. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 106 o la SEQ ID NO: 107 o la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 124 o la SEQ ID NO: 125 o por lo menos un 90% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 106 o la SEQ ID NO: 107 o la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 124 o la SEQ ID NO: 125 o por lo menos un 95% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 106 o la SEQ ID NO: 107 o la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 124 o la SEQ ID NO: 125 o por lo menos un 99% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. Un portador puede comprender además una deleción o mutación en uno o más de los residuos de aminoácidos 1-151 de la SEQ ID NO: 6 o en uno o más de los residuos de aminoácidos 1-150 de la SEQ ID NO: 7. Un portador como se describe en la presente puede comprender los residuos 1-134 de la SEQ ID NO: 5 o los residuos 1-133 de la SEQ ID NO: 4 y no más de 151 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 106 - SEQ ID NO: 125 o por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 106 -SEQ ID NO: 125 o por lo menos un 90% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 106 - SEQ ID NO: 125 o por lo menos un 95% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 106 - SEQ ID NO: 125 o por lo menos un 99% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. Un portador puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 106 o la SEQ ID NO: 107 o un fragmento funcional de la misma.
Un portador de la presente divulgación puede derivarse de un dominio I de una exotoxina. La exotoxina puede ser Cholix. Un portador que se deriva de un dominio I de Cholix puede comprender por lo menos una, pero no más de 20 cadenas beta. Un portador que se deriva de un dominio I de Cholix puede comprender por lo menos una, pero no más de 15 cadenas beta. Un portador que se deriva de un dominio I de Cholix puede comprender entre 10 y 15 cadenas beta. Un portador que se deriva de un dominio I de Cholix puede comprender por lo menos una pero menos de 10 hélices a. Un portador que se deriva de un dominio I de Cholix puede comprender entre 1 y 5 hélices a.
Un portador de la presente divulgación puede comprender un fragmento de aminoácidos del dominio I de Cholix que puede permitir, promover y/o potenciar la entrada apical del portador derivado de Cholix en células epiteliales como células epiteliales intestinales polarizadas. Dicho fragmento puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 148 y puede promover y/o potenciar la entrada apical del portador derivado de Cholix en las células epiteliales en la superficie epitelial/luminal apical. Esto puede mejorar la función de administración y/o transporte del portador y aumentar la cantidad de moléculas de carga administradas y/o transportadas hacia y/o a través de una célula epitelial.
Un portador de la presente divulgación puede comprender un fragmento de aminoácidos del dominio I de Cholix que puede permitir, promover y/o potenciar la transcitosis de apical a basal de un portador derivado de Cholix como se describe en la presente. Tal fragmento de aminoácidos que permite, promueve y/o potencia la transcitosis de apical a basal del constructo de administración puede comprender una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 149 o la SEQ ID NO: 150. Esto puede potenciar la administración y/o la función de transporte del portador y aumentar la cantidad de moléculas de carga administradas y/o transportadas hacia y/o a través de una célula epitelial. Por ejemplo, un portador que comprende tal fragmento con la SEQ ID NO: 149 o la SEQ ID NO: 150 puede aumentar la cantidad de moléculas de carga administradas y/o transportadas a un compartimento basal. Esto puede potenciar aún más la liberación basal del portador.
Un portador de la presente divulgación puede comprender un fragmento de aminoácidos del dominio I de Cholix que puede permitir, promover y/o potenciar la clasificación endosomal temprana y/o tardía, permitiendo, promoviendo y/o potenciando de este modo el transporte del portador derivado de Cholix. a una región supranuclear dentro de una célula epitelial. Tal fragmento peptídico del dominio I de Cholix que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 151 y puede permitir, promover y/o potenciar la clasificación endosomal temprana de un constructo de administración derivado de Cholix como se describe en la presente. Las regiones supranucleares a las que puede apuntarse usando tal portador pueden incluir el retículo endoplasmático, el aparato de Golgi y/o los endosomas. Por tanto, un portador capaz de acceder a tal región puede proporcionar una administración eficiente de carga a tales regiones.
Un portador de la presente divulgación puede comprender un fragmento de aminoácidos del dominio I de Cholix que puede permitir, promover y/o potenciar la transcitosis completa del constructo de administración derivado de Cholix a través de una capa epitelial intacta, como el epitelio intestinal. Tal fragmento que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 152 puede permitir, promover y/o potenciar la transcitosis completa del constructo de administración derivado de Cholix permitiendo la liberación basal del portador y/o el constructo de administración desde la célula epitelial. La transcitosis completa del constructo de administración derivado de Cholix puede determinarse, por ejemplo, midiendo la presencia del constructo de administración en un compartimento basolateral o en la lámina propia. La capacidad de tales portadores para transportar carga a través de capas de células epiteliales intactas puede ser de gran importancia ya que permite la administración oral de fármacos que no podrían atravesar tales capas epiteliales por sí mismos.
Como se describe en la presente, la presente divulgación contempla el sorprendente descubrimiento de que un portador que se deriva de un dominio I de Cholix y que carece de un dominio II, un dominio Ib y un dominio III de Cholix, es suficiente para una transcitosis apical a basal rápida y eficiente (por ejemplo, y suficiente para un transporte de carga rápido y eficiente de apical a basal a través de transcitosis). Además, se muestra que ciertas porciones de la secuencia de aminoácidos del dominio I de Cholix pueden tener funciones específicas relacionadas con la transcitosis de apical a basal a través de una célula epitelial y/o la administración hacia el citosol o al interior de una célula epitelial. Un portador de la presente divulgación puede comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125. Un portador de la presente divulgación puede comprender uno o más de los fragmentos de péptidos de aminoácidos funcionales de un dominio I de Cholix expuesto en las SEQ ID NO: 148 - SEQ ID NO: 152. Un portador de la presente divulgación puede comprende un dominio I de Cholix con una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4 y/o la SEQ ID NO: 5.
La presente divulgación contempla además portadores que comprenden uno o más fragmentos funcionales de un dominio I de Cholix. Los fragmentos funcionales pueden estar en el mismo orden que en la secuencia de aminoácidos de Cholix madura, o los fragmentos funcionales pueden estar en un orden diferente sin afectar a la función o funciones de tales fragmentos funcionales. Por tanto, un portador puede comprender una o más de las secuencias de aminoácidos funcionales derivadas de un dominio I de Cholix y expuestas en las SEQ ID NO: 148 -SEQ ID NO: 152. Tales secuencias de aminoácidos pueden enlazarse entre sí para formar un polipéptido polimérico que comprende una pluralidad de fragmentos peptídicos derivados del dominio I de Cholix. Tal portador de la presente divulgación puede comprender una o más secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 148 -SEQ ID NO: 152, o cualquier combinación de las mismas, que forman un polipéptido polimérico capaz de transcitosis eficiente a través de capas epiteliales como el epitelio intestinal. Tal péptido polimérico puede comprender una pluralidad de fragmentos de aminoácidos derivados del dominio I de Cholix y dicho polipéptido polimérico puede usarse en lugar de y/o además de un polipéptido del dominio I de Cholix o una versión truncada del mismo. Tal péptido polimérico sintético de origen no natural puede poseer capacidades de transcitosis superiores o inferiores cuando se usa como un constructo de administración en comparación con el dominio I de Cholix o una versión truncada del mismo. La funcionalidad de tales polipéptidos sintéticos puede depender de varios factores como la estructura y geometría espacial, la estabilidad y/o la carga que puede acoplarse a dicho polipéptido.
Un portador de la presente divulgación no puede alterarse significativamente de manera química, estructural y/o conformacional durante el proceso de transcitosis a través de una célula epitelial. Por tanto, el portador derivado de la toxina Cholix como se divulga en la presente (incluyendo los péptidos poliméricos que comprenden una pluralidad de fragmentos de aminoácidos derivados de Cholix) puede usarse como un vehículo de administración eficaz para varias moléculas de carga (por ejemplo, moléculas de carga terapéuticas) como se describe en la presente. Un portador derivado de Cholix como se describe aquí no contiene los dominios II y III, sino que está unido a una o más fracciones de carga (por ejemplo, moléculas de carga terapéuticas) sin tener capacidades de transcitosis y/o transporte reducidas en comparación con la ntChx madura.
El transporte de un portador como se describe en la presente a través de una capa epitelial (por ejemplo, un epitelio intestinal) puede comprender múltiples pasos. El transporte de un constructo de administración (por ejemplo, un constructo de administración derivado de Cholix) puede comprender elementos del dominio I de Cholix que funcionan en un proceso de múltiples pasos. Por ejemplo, el transporte o la transcitosis pueden incluir endocitosis apical, tráfico vesicular que implica regiones apicales, basales y/o supranucleares de enterocitos, y liberación desde la membrana basal para alcanzar la lámina propia. Además, un constructo de administración derivado de Cholix como se describe en la presente puede utilizar un proceso de endocitosis de tipo mediado por receptor. La endocitosis mediada por receptor puede implicar una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con el aminoácido expuesto en la SEQ ID NO: 148 o un fragmento o derivado del mismo, que puede proporcionar acceso a un compartimento vesicular endosomal temprano en la porción apical de enterocitos, por ejemplo, a través de endocitosis. Una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con el aminoácido expuesto en la SEQ ID NO: 151 o un fragmento o derivado del mismo, puede permitir, promover o potenciar el movimiento de un constructo de administración derivado de Cholix a una región supranuclear consistente con un sitio de clasificación en la célula para eventos secretores. El movimiento de un constructo de administración que comprende un portador derivado de Cholix al compartimento basal de las células puede ser más eficaz cuando el portador comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con el aminoácido expuesto en la SEQ ID NO: 149 o la SEQ ID NO: 150, o un fragmento o derivado del mismo. Una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con el aminoácido expuesto en la SEQ ID NO: 149, un fragmento o derivado del mismo, puede proporcionar un mecanismo para la secreción desde la membrana basal que libera un constructo de administración intacto y funcional (por ejemplo, que incluye la fracción de carga) en un compartimiento basolateral o la lámina propia desde donde puede llegar a varias otras localizaciones (por ejemplo, células, tejidos u órganos) dentro de un organismo (por ejemplo, en un humano o en un roedor).
Además de dejar el portador inalterado o sin modificar durante la transcitosis, el transporte de un constructo de administración como se divulga en la presente a través de una barrera epitelial (por ejemplo, un epitelio intestinal intacto) generalmente no implica intoxicación o alteración de enterocitos. Por tanto, un constructo de administración como se divulga en la presente puede comprender un dominio I de Cholix, un fragmento o una versión truncada del mismo (por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NO: 6 - SEQ ID NO: 125), o un péptido polimérico que comprende una pluralidad de fragmentos de aminoácidos derivados de un dominio I de Cholix (por ejemplo, SEQ ID NO: 148 -SEQ ID NO: 152), y en donde los otros dominios (por ejemplo, dominios II, dominio Ib y III) pueden reemplazarse por varias otras fracciones, como espaciadores, cargas heterólogas (por ejemplo, carga terapéutica y/o biológicamente activa), moléculas pequeñas, ácidos nucleicos (por ejemplo, aptámeros o ARN interferente), o cualquier combinación de los mismos, como se describe adicionalmente en la presente.
Un portador de la presente divulgación puede usarse para administrar varias moléculas de carga en y/o a través de las células epiteliales de manera eficiente, por ejemplo, cuando comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125). Por tanto, un portador de la presente divulgación puede permitir una endocitosis eficiente en el sitio apical y el transporte al interior de una célula epitelial (por ejemplo, un enterocito y/o una célula epitelial intestinal polarizada) como una vesícula o compartimento intracelular o el citosol y /o una región supranuclear. Tal portador puede comprender una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 30 - SEQ ID NO: 125. Por tanto, los constructos de administración de moléculas de carga en células epiteliales puede comprender un dominio I de Cholix truncado o fragmento de un dominio I de Cholix que no comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 151, y/o la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 152, o cualquier combinación de las mismas.
Un portador de la presente divulgación puede comprender uno o más sitios de glicosilación potenciales. El uno o más sitios de glicosilación pueden estar localizados dentro de un dominio I de Cholix (por ejemplo, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5). Un portador como se describe en la presente puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5, en donde los residuos de asparagina N98, N154, N165, N224, o cualquier combinación de los mismos, pueden ser sitios potenciales de glicosilación. La variación o mutación de uno o más de estos residuos de aminoácidos que pueden actuar como sitios de glicosilación pueden afectar o reducir una función relacionada con la transcitosis de un constructo de administración. La TABLA 3 muestra fragmentos peptídicos funcionales ejemplares del dominio I de Cholix que se identificaron para proporcionar una o más funciones relacionadas con la transcitosis de apical a basal.
TABLA - Fr m n i f n i n l m l r riv l mini I Cholix
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Como se describe adicionalmente en la presente, un portador de la presente divulgación puede comprender uno o más fragmentos funcionales. Tales fragmentos funcionales pueden incluir los enumerados en la TABLA 3. Por tanto, un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con una o más de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 148 - SEQ ID NO: 152. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con una o más de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 148 - SEQ ID NO: 152. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con una o más de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 148 - SEQ ID NO: 152. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 99% de identidad de secuencia con una o más de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 148 - SEQ ID NO: 152. Un portador como se describe en la presente puede comprender por lo menos una de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 148 - SEQ ID NO: 152. Un portador como se describe en la presente puede comprender por lo menos dos de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 148 - SEQ ID NO: 152. Un portador como se describe en la presente puede comprender por lo menos tres de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 148 - SEQ ID NO: 152. Un portador como se describe en la presente puede comprender por lo menos cuatro de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 148 - SEQ ID NO: 152. Un portador como se describe en la presente puede comprender todas las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 148 - SEQ ID NO: 152. Por tanto, un portador como se describe en la presente puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5, o un fragmento funcional de la misma.
Como se divulga en la presente, el dominio I de la exotoxina PE (SEQ ID NO: 137) comprende los aminoácidos 1-252 de la SEQ ID NO: 135 y se ha descrito como un "dominio de unión al receptor" que funciona como un ligando para un receptor de la superficie celular y media la unión de PE a una célula.
Un portador de la presente divulgación capaz de administrar carga a través de las células epiteliales (por ejemplo, células epiteliales polarizadas) puede comprender un polipéptido del dominio de unión al receptor (por ejemplo, un dominio I o un derivado del mismo) en donde uno o más residuos de aminoácidos de un polipéptido del dominio de unión al receptor del portador bacteriano se reemplaza por uno o más residuos de aminoácidos de un segundo polipéptido del dominio de unión al receptor del portador bacteriano (también referido en los sucesivo como "un polipéptido del dominio de unión al receptor híbrido"). Por ejemplo, un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos en la que uno o más residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 se reemplazan por uno o más residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 137. Además, dicho portador puede comprender una secuencia de aminoácidos en la que los residuos de aminoácidos 77-87 de la SEQ ID NO: 4 (Cholix) se reemplazan por residuos de aminoácidos de un segundo polipéptido del dominio de unión al receptor del portador bacteriano (por ejemplo, un dominio II de PE). Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos en donde los residuos de aminoácidos 188-236 de la SEQ ID NO: 4 se reemplazan por residuos de aminoácidos de un segundo polipéptido del dominio de unión al receptor del portador bacteriano.
Un portador de la presente divulgación que se deriva de un dominio I de una exotoxina puede comprender además una porción de un dominio de translocación de exotoxina, o elementos del dominio de translocación modificados. Un dominio de translocación puede ser un dominio II de una exotoxina. Un portador de la presente divulgación que se deriva de un dominio I de una exotoxina puede comprender además una porción de un dominio catalítico no tóxico o elementos del dominio catalítico no tóxico modificados. Un dominio catalítico no tóxico puede ser un dominio III modificado de una exotoxina, por ejemplo, aquellos que comprenden una o más variaciones de aminoácidos y/o una deleción de uno o más residuos de aminoácidos que hacen que el dominio III no sea tóxico (por ejemplo, una sustitución de E581A (por ejemplo, SEQ ID NO: 3) o una deleción de AE581). Un dominio de translocación, o un dominio de translocación modificado, y un dominio catalítico no tóxico, o un dominio catalítico no tóxico modificado, puede derivarse de la misma toxina bacteriana. Alternativamente, un dominio de translocación, o un dominio de translocación modificado, y un dominio catalítico no tóxico, o un dominio catalítico no tóxico modificado pueden derivarse de un portador bacteriano seleccionado del grupo que consiste de portador de Cholix (Cholix) y exotoxina de Pseudomonas (PE), toxina botulínica, toxina diftérica, toxina pertussis, toxina del cólera, enterotoxina de E. coli termolábil, toxina shiga y toxina similar a shiga.
Como se describe en la presente, el dominio II de Cholix (SEQ ID NO: 126) comprende los aminoácidos 266-386 de la SEQ ID NO: 1). Un portador de la presente divulgación puede comprender un portador derivado de Cholix que comprende la secuencia de aminoácidos completa de la SEQ ID NO: 126, o puede comprender una porción o porciones de la SEQ ID NO: 126. Además, pueden realizarse sustituciones conservadoras o no conservadoras en la SEQ ID NO: 126. En la presente se describe un ensayo representativo que puede ser usado rutinariamente por un experto en la técnica para determinar si un dominio de transcitosis tiene actividad de transcitosis. Un portador puede comprender por lo menos el 1%, por lo menos el 5%, por lo menos el 10%, por lo menos el 20%, por lo menos el 30%, por lo menos el 40%, por lo menos el 50%, por lo menos el 60%, por lo menos el 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95% o por lo menos el 99% de los residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos completa de la SEQ ID NO: 126. Un portador de la presente divulgación puede comprender un dominio II de Cholix truncado, por ejemplo los identificados como Cholix425 (SEQ ID NO: 129), Cholix415 (SEQ ID NO: 130), Cholix397 (SEQ ID NO: 131), Cholix386 (SEQ ID NO: 132), Cholix291 (SEQ ID NO: 133), y Cholix265 (SEQ ID NO: 4).
Como se describe en la presente, un dominio II de PE (SEQ ID NO: 138) comprende los aminoácidos 253­ 364 de la SEQ ID NO: 135).
Un portador de la presente divulgación puede comprender un dominio de unión al receptor y un dominio de translocación (por ejemplo, un dominio II) o un dominio de translocación modificado (por ejemplo, un dominio II modificado), y puede comprender además un dominio catalítico no tóxico (por ejemplo, un dominio III) o un dominio catalítico no tóxico modificado (por ejemplo, un dominio III modificado). El dominio catalítico no tóxico, o el dominio catalítico no tóxico modificado puede derivarse de un portador bacteriano seleccionado del grupo que consiste de portador de Cholix (Cholix) y exotoxina de Pseudomonas (PE), toxina botulínica, toxina de la difteria, toxina de la tosferina, toxina del cólera, enterotoxina de E. coli termolábil, toxina shiga y toxina similar a shiga. El dominio de translocación, o el dominio de translocación modificado, y el dominio catalítico no tóxico, o el dominio catalítico no tóxico modificado, pueden derivar de la misma toxina bacteriana.
Como se describe en la presente, el dominio II de Cholix (SEQ ID NO: 128) comprende los aminoácidos 426-634 de la SEQ ID NO: 1 y se ha descrito como un dominio catalítico responsable de la citotoxicidad e incluye una secuencia de retención del retículo endoplásmico. El dominio III media la ribosilación de ADP del factor de elongación 2 ("EF2"), que inactiva la síntesis de proteínas. Un portador que "carece de actividad endógena de ribosilación de ADP" o un "Cholix desintoxicado" se refiere a cualquier portador derivado de Cholix descrito en la presente (incluyendo las variantes modificadas) que no comprende la secuencia de aminoácidos completa expuesta en la SEQ ID NO: 128 (por ejemplo, un porción de un dominio III). Dicho portador puede comprender una o más modificaciones dentro de la s Eq ID NO: 128 de una manera que detoxifica la molécula. Por ejemplo, la deleción del residuo de ácido glutámico (Glu) en la posición de aminoácido 156 de la SEQ ID NO: 128 desintoxica la molécula. En varias realizaciones, la porción de la SEQ ID NO: 128 distinta de la señal de retención de ER puede reemplazarse por otra secuencia de aminoácidos. Esta secuencia de aminoácidos puede ser en sí misma no inmunogénica, ligeramente inmunogénica o altamente inmunogénica. Es preferible usar un dominio de retención de ER altamente inmunogénico para provocar una respuesta inmunitaria humoral. Por ejemplo, el dominio III de Cholix es en sí mismo altamente inmunogénico y puede usarse en constructos de administración donde se desea una respuesta inmunitaria humoral robusta.
Como se describe en la presente, el dominio III de PE (SEQ ID NO: 140) comprende los aminoácidos 405­ 613 de la SEQ ID NO: 3) y se ha descrito como un dominio catalítico responsable de la citotoxicidad e incluye una secuencia de retención del retículo endoplásmico. El dominio III media la ribosilación de ADP del factor de elongación 2 ("EF2"), que inactiva la síntesis de proteínas. Un portador derivado de PE que "carece de actividad de ribosilación de ADP endógeno" o un "PE desintoxicado" se refiere a cualquier PE descrito en la presente (incluyendo variantes o derivados modificados) que no comprende la SEQ ID NO: 140 y/o que se ha modificado dentro de la SEQ ID NO: 140 de una manera que desintoxica la molécula. Por ejemplo, deleción del residuo de ácido glutámico (Glu) en la posición de aminoácido 149 de la SEQ ID NO: 140 desintoxica la molécula. La presente divulgación contempla portadores que pueden comprender un polipéptido del dominio de unión al receptor que tiene la secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5, un dominio de translocación que tiene la secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 126, y un dominio catalítico no tóxico que tiene la secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 128.
Además de los portadores que comprenden un dominio I y/o porciones de un dominio II y un dominio III de una exotoxina, la presente divulgación proporciona portadores que pueden comprender un dominio Ib de Cholix (SEQ ID NO: 127), o una porción del mismo. El dominio Ib de Cholix (SEQ ID NO: 127) consiste de los aminoácidos 387-425 de la SEQ ID NO: 1. Por tanto, un portador que se deriva de un dominio I de una exotoxina puede comprender además la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 127, o una secuencia modificada truncada en un residuo de aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 127. El dominio Ib de PE descrito en la presente (SEQ ID NO: 139) consiste de los aminoácidos 365-404 de la SEQ ID NO: 135.
Un portador de la presente divulgación puede comprender porciones de uno o más de un dominio II, un dominio Ib o un dominio III, donde esas porciones (por ejemplo, ciertas secuencias de aminoácidos de las mismas) pueden ser parte de un espaciador como se describe adicionalmente en la presente.
En general, un portador de la presente divulgación puede comprender un polipéptido, en donde el polipéptido puede comprender por lo menos 110 residuos de aminoácidos de un dominio I de la exotoxina. Un portador puede comprender por lo menos 120 residuos de aminoácidos de un dominio I de la exotoxina. Un portador puede comprender por lo menos 130 residuos de aminoácidos de un dominio I de la exotoxina. Un portador puede comprender por lo menos 140 residuos de aminoácidos de un dominio I de la exotoxina. Un portador puede comprender por lo menos 150 residuos de aminoácidos de un dominio I de la exotoxina. Un portador puede comprender por lo menos 50 residuos de aminoácidos contiguos del dominio I de la exotoxina. Un portador puede comprender por lo menos 60 residuos de aminoácidos contiguos del dominio I de la exotoxina. Un portador puede comprender por lo menos 75 residuos de aminoácidos contiguos del dominio I de la exotoxina. Un portador puede comprender por lo menos 100 residuos de aminoácidos contiguos del dominio I de la exotoxina. Un portador puede comprender por lo menos 150 residuos de aminoácidos contiguos del dominio I de la exotoxina.
Los métodos y composiciones de la presente divulgación contemplan portadores que pueden comprender una o más modificaciones en el extremo N-terminal. Tal modificación puede comprender por lo menos un residuo de metionina N-terminal. El por lo menos un residuo de metionina N-terminal puede ser parte de una caperuza N como se describe en la presente. Un portador que comprende una caperuza N puede comprender además una o más variaciones de aminoácidos en los primeros 5-10 residuos de aminoácidos en comparación con una secuencia de referencia. Por tanto, uno o más de los primeros residuos de aminoácidos N-terminales de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 pueden sustituirse con otros residuos de aminoácidos, siempre que no se altere la secuencia de consenso que puede definir un Cholix funcional. Además de tales variaciones de aminoácidos, un portador descrito en la presente que comprende una caperuza N puede comprender además un residuo de metionina N-terminal. Una caperuza N también puede comprender solo una adición de un residuo de metionina N-terminal. Los portadores ejemplares de la presente divulgación que comprenden tal caperuza N (por ejemplo, una metionina N-terminal adicional) se exponen en cualquiera de las SeQ ID No : 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 31, SeQ ID NO: 107, SeQ ID NO: 125. Como se describe en la presente, las variantes funcionales de dicho portador pueden comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 125, o un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma.
En general, y como se describe más detalladamente en la presente, una "Cholix" (a la que también se hace referencia en la presente como toxina Cholix o exotoxina Cholix) puede abarcar una variedad de variantes funcionales (por ejemplo, un género funcional), en donde las variantes funcionales pueden comprender una o más variaciones en su secuencia de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 1 como se divulga en la presente. Por tanto, en la presente divulgación, la toxina Cholix que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 se usa como secuencia de referencia cuando se hace referencia a la Cholix. Sin embargo, como se describe en la presente, la presente divulgación no se limita a la Cholix que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, sino que abarca todas las variantes de Cholix que se encuentran dentro del género funcional de Cholix.
Por ejemplo, un primer polipéptido del dominio I de Cholix (por ejemplo, un primer portador) puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4, y un segundo polipéptido del dominio I de Cholix (por ejemplo, un segundo portador) puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5, en donde tanto el primer polipéptido como el segundo polipéptido son capaces de llevar a cabo las mismas funciones, por ejemplo, transcitosis a través de una célula epitelial e interactuar con los mismos receptores, como la ribofilina 1, SEC24, Ck-8, TMEM132, GRP75, ERGIC-53, y/o perlecán. Como se describe en la presente, un primer portador y un segundo portador pueden producirse en el mismo sistema de expresión (por ejemplo, un sistema de expresión bacteriano como E. coli o un sistema de expresión de mamífero como una célula CHO). En otros casos, y como se describe en la presente, un primer portador y un segundo portador se producen en un sistema de expresión diferente (por ejemplo, un sistema de expresión bacteriano o de mamífero).
Un portador de la presente divulgación puede comprender propiedades que permiten interacciones con receptores endógenos y/o acceder a un sistema de transcitosis y transporte endógenos. Por tanto, un portador de la presente divulgación que se deriva del dominio I de Cholix y comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125 o SEQ iD NO: 148 - SEQ ID NO: 152 puede interactuar con uno o más receptores endógenos. Tales receptores endógenos pueden incluir TMEM132A, GPR75, ERGIC-53 y/o perlecán, y cualquier combinación de los mismos. Tales interacciones pueden proporcionar transcitosis (por ejemplo, de apical a basal) a través de una célula epitelial y/o transporte al interior de una célula epitelial. Estas interacciones permiten una administración rápida y eficiente. Estas interacciones proporcionan además mecanismos de transporte que pueden no alterar el portador de la célula que es administrada o transportada por un portador. Por ejemplo, los portadores descritos en la presente no muestran ninguna modificación química tras liberarse de la membrana basal de una célula epitelial, lo que sugiere que los portadores de la presente divulgación pueden aprovechar uno o más sistemas de transporte endógenos para administrar la carga en y/o a través de las células epiteliales. Los receptores con los que puede interactuar un portador y/o un constructo de administración que comprende un portador incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de ribofilina 1, SEC24, CK-8, TMEM132, GRP75, ERGIC-53 o perlecán, o cualquier combinación del mismo. Por ejemplo, la interacción de un portador y/o un constructo de administración que comprende un portador con ERGlC-53 (también denominado LAMN1) puede ser una parte integral del proceso de endocitosis y/o transcitosis ya que este receptor es la única proteína que interactúa que puede subvertir en su distribución celular después de la aplicación luminal de un portador. Además, y como se demuestra en la presente, ERGIC-53 (LAMN1) se ha implicado en una vía retrógrada indirecta desde el Golgi hasta el ER, lo que sugiere que esta puede ser una vía descrita como eficiente y rápida.
La presente divulgación proporciona métodos y composiciones que comprenden portadores que permiten el transporte y la administración rápidos y eficientes de la carga a través de células como células epiteliales. Un portador como se describe en la presente puede transportar carga a través de una célula epitelial con una velocidad de transporte de aproximadamente 10‘1° cm/s a aproximadamente 10‘2 cm/s. Un portador puede transportar carga a través de una célula epitelial con una velocidad de transporte de aproximadamente 10‘9 cm/s a aproximadamente 10' 3 cm/s. Un portador puede transportar carga a través de una célula epitelial con una velocidad de transporte de aproximadamente 10‘8 cm/s a aproximadamente 10‘4 cm/s. Un portador puede transportar carga a través de una célula epitelial con una velocidad de transporte de aproximadamente 10‘7cm/s a aproximadamente 10‘5 cm/s. Un portador puede transportar carga a través de una célula epitelial con una velocidad de transporte de aproximadamente 10‘6 cm/s. Un portador puede transportar carga a través de una célula epitelial con una velocidad de transporte de por lo menos 10‘8 cm/s. Un portador puede transportar carga a través de una célula epitelial con una velocidad de transporte de por lo menos 10‘7 cm/s. Un portador puede transportar carga a través de una célula epitelial con una velocidad de transporte de por lo menos 10‘6 cm/s. Un portador puede transportar carga a través de una célula epitelial con una velocidad de transporte de por lo menos 10‘5 cm/s. Un portador puede transportar carga a través de una célula epitelial con una velocidad de transporte de por lo menos 10‘4cm/s. Un portador puede transportar carga a través de una célula epitelial con una velocidad de transporte de por lo menos 10-3 cm/s. Un portador puede transportar carga a través de una célula epitelial con una velocidad de transporte de por lo menos 10‘ 2 cm/s.
Constructos de administración
Los métodos y composiciones de la presente divulgación proporcionan moléculas portadoras que transportan carga de manera rápida y eficaz al interior y/o a través de las células epiteliales. La administración y/o el transporte de la carga pueden lograrse acoplando la carga a un portador como se describe en la presente. A tal constructo puede hacerse referencia en la presente como "constructo de administración". Como se describe en la presente, la presente divulgación contempla portadores que pueden comprender una molécula pequeña, un polipéptido, un aptámero, un fragmento de los mismos o cualquier combinación de los mismos. Como se describe en la presente, un portador puede derivarse de una exotoxina. La exotoxina puede ser de Cholix o PE. Un portador puede acoplarse directa o indirectamente a la carga. Un portador puede estar acoplado covalentemente o no covalentemente a la carga. Por tanto, un constructo de administración puede comprender además un espaciador que enlaza el portador con la carga. El espaciador puede ser cualquier molécula que enlace el portador con la carga y puede comprender espaciadores oligoméricos o poliméricos (por ejemplo, polietilenglicol, etc.) y aminoácidos. Además, un constructo de administración que comprende un portador acoplado a una carga y, opcionalmente, un espaciador y/u otra fracción funcional, puede producirse sintética o recombinantemente (por ejemplo, en E. coli o una célula CHO).
Como se divulga en la presente, los términos "constructos de administración", "constructos de administración", "constructos de administración derivados de toxinas", "constructos quiméricas", "proteínas" y "proteínas de fusión" pueden usarse indistintamente y pueden referirse a constructos que comprenden por lo menos una dominio portador o de administración (por ejemplo, un portador derivado del dominio I de Cholix o PE, una molécula pequeña, un aptámero o cualquier combinación de los mismos) y por lo menos una molécula de carga heteróloga como una molécula de carga terapéutica. Al término "carga heteróloga" puede hacerse referencia como no relacionado con estas exotoxinas. Como se describe adicionalmente en la presente, la toxicidad (por ejemplo, intoxicación de enterocitos) del portador bacteriano (por ejemplo, Cholix o PE) puede no ser un requisito necesario para el transporte eficiente del portador a través de capas epiteliales intactas, como el epitelio intestinal. En cambio, se demuestra en la presente que un portador que se deriva de un dominio I (por ejemplo, una versión truncada de un dominio I) de una exotoxina como Cholix y Pe es suficiente para una transcitosis rápida y eficiente a través de células epiteliales (por ejemplo, células epiteliales polarizadas). células de un intestino).
En general, un constructo de administración (por ejemplo, un constructo de administración aislado) comprende un portador que proporciona una administración y/o transporte rápidos y eficientes de una carga a una cierta localización, en donde la localización puede ser un órgano, un tejido, una célula o un compartimento celular. La molécula de carga puede acoplarse directa o indirectamente al portador. La carga que se acopla al portador puede ser una carga heteróloga (por ejemplo, no derivada del propio portador). Por tanto, un constructo de administración descrito en la presente puede comprender un portador acoplado a una carga heteróloga. El portador puede comprender ciertas funciones que permiten el transporte rápido y eficiente de la carga a una localización, por ejemplo, una localización dentro de una célula epitelial o una localización o localizaciones dentro de un compartimento basolateral. Un portador contemplado en la presente puede derivarse de una exotoxina. La exotoxina puede ser Cholix. Un portador que se deriva de una Cholix puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, o por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. Se observa que una Cholix (también referida en la presente como toxina Cholix o exotoxina Cholix) puede abarcar una variedad de variantes funcionales (por ejemplo, un género funcional), en donde las variantes funcionales pueden comprender una o más variaciones en su secuencia de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 1 como se divulga en la presente. Por tanto, en la presente divulgación, la toxina Cholix que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 se usa como secuencia de referencia cuando se hace referencia a Cholix. Sin embargo, como se describe en la presente, la presente divulgación no se limita a la Cholix que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, sino que abarca todas las variantes de Cholix que caen dentro del género funcional de Cholix. Por ejemplo, un primer polipéptido del dominio I de Cholix (por ejemplo, un primer portador) puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4, y un segundo polipéptido del dominio I de Cholix (por ejemplo, un segundo portador) puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5, en donde tanto el primer polipéptido como el segundo polipéptido son capaces de llevar a cabo las mismas funciones, por ejemplo, transcitosis a través de una célula epitelial, e interactuar con los mismos receptores, como la ribofilina 1, SEC24 (también referido como componente del complejo de cubierta COPII), citoqueratina-8 (CK-8), proteína transmembrana 132 (TMEM132), proteína regulada por glucosa 75 (GRP75), compartimento intermedio 53 del retículo endoplásmico de Golgi (ERGIC-53, el número 53 puede referirse a su peso molecular de aproximadamente 53 kDa) y/o perlecán (también referido como proteína central de proteoglicano de sulfato de heparán específica de la membrana basal o HSPG). Como se describe en la presente, un primer portador y un segundo portador pueden producirse en el mismo sistema de expresión (por ejemplo, un sistema de expresión bacteriano como E. coli o un sistema de expresión de mamífero como una célula CHO). Como se describe en la presente, un primer portador y un segundo portador pueden producirse en un sistema de expresión diferente (por ejemplo, un sistema de expresión bacteriano o de mamífero).
De manera importante, los constructos de administración contemplados en la presente pueden proporcionar ventajas sobre las modalidades de administración convencionales. Tales ventajas pueden incluir, pero no se limitan a: a) ayuda en la producción del constructo de administración; b) ayuda en el replegamiento del constructo de quimera; c) ayuda en la formulación del constructo de administración; d) ayuda en la reducción de la sensibilidad de la carga a la destrucción proteolítica; e) mejora de la estabilidad del constructo de administración durante el almacenamiento; f) en realizaciones en las que los elementos portadores bacterianos del dominio I se acoplan a la carga heteróloga (por ejemplo, una biológicamente activa) sin un espaciador, o con un espaciador no escindible, los elementos portadores bacterianos del dominio I pueden funcionar para retener la quimera en localizaciones seleccionadas del cuerpo después de la transcitosis que da como resultado una mayor exposición de una carga biológicamente activa (o de diagnóstico) a células específicas para proporcionar una farmacodinámica mejorada; g) en realizaciones en las que los elementos portadores bacterianos del dominio I se acoplan a una carga heteróloga (por ejemplo, una biológicamente activa) con un espaciador que puede escindirse mediante una enzima presente en una membrana basolateral de una célula epitelial, o una enzima presente en el plasma del sujeto, dicha escisión permitirá que la carga heteróloga (por ejemplo, una biológicamente activa) se libere de la fracción del constructo poco después de la transcitosis a través de la membrana epitelial; h) la administración directa de la carga heteróloga al interior de una célula epitelial como una vesícula o compartimento intracelular o el citosol o una región supranuclear de una célula epitelial; i) la administración directa de la carga heteróloga (por ejemplo, una biológicamente activa) al espacio submucoso-GI y al sistema hepático-portal puede reducir la toxicidad sistémica observada cuando la carga se administra por vías parenterales, además de permitir el acceso a la biología objetivo submucosa al que sería difícil dirigirse a través de vías no orales o GI; j) usando mecanismos de administración y transporte endógenos, los constructos de administración divulgados en la presente no dañan la capa epitelial; k) una vez transportado a través del epitelio GI, el constructo de administración o la carga biológicamente activa mostrará una vida media en suero prolongada en comparación con la carga biológicamente activa en su estado no fusionado; l) la administración oral del constructo de administración puede administrar una concentración eficaz aumentada de la carga biológicamente activa administrada al hígado del sujeto que la observada en el plasma del sujeto; y m) la capacidad de administrar la carga biológicamente activa a un sujeto sin usar una aguja para perforar la piel del sujeto, mejorando por tanto la calidad de vida de dichos sujetos evitando el dolor o las posibles complicaciones asociadas con el mismo, además de una conveniencia y cumplimiento de paciente/proveedor de cuidados mejorados.
La presente divulgación proporciona métodos y composiciones para la administración y el transporte de moléculas de carga a través de una célula epitelial (por ejemplo, mediante transcitosis) y/o al interior de una célula epitelial. Los métodos y composiciones divulgados en la presente pueden comprender un constructo de administración, en donde el constructo de administración comprende un portador acoplado a una carga heteróloga (por ejemplo, a través de un espaciador). Los procesos de transporte y administración descritos en la presente que usan los portadores de la presente divulgación pueden comprender endocitosis en el lado apical de una célula epitelial. Dependiendo de si el portador está configurado para administrar la carga en o a través de una célula epitelial, los procesos de transporte pueden comprender la liberación del constructo de administración en el lado basal. Además, pueden estar implicados varios mecanismos en el transporte de carga a esas varias localizaciones. Por ejemplo, la administración de la carga a una vesícula o compartimento intracelular o al citosol de una célula epitelial puede comprender liberar un constructo de administración que comprende un portador acoplado a esa carga desde una vesícula a una vesícula o compartimento intracelular o al citosol. Como otro ejemplo, la transcitosis de un constructo de administración puede incluir transcitosis vesicular y, como tal, puede comprender encapsular el constructo de administración en una vesícula durante la transcitosis de tal manera que el constructo de administración puede estar en contacto o no con el citosol intracelular.
Los métodos y composiciones de la presente divulgación pueden comprender la administración de una carga en una cierta localización de tal manera que la carga permanezca en esa localización durante una cantidad de tiempo determinada. Por ejemplo, una molécula de carga puede retenerse en una localización intracelular o basolateral que se ha fijado como objetivo usando las composiciones descritas en la presente. La retención puede hacer que la molécula de carga provoque una determinada respuesta o efecto biológico (por ejemplo, un efecto terapéutico). Por tanto, la presente divulgación proporciona métodos y composiciones que permiten la administración de la carga en una localización dentro de una célula epitelial, de tal manera que el constructo de administración (y la carga) se retiene en esa localización durante un período de tiempo específico. Dicha retención puede modularse, por ejemplo, permitiendo que la carga se escinda del portador, o permitiendo que el portador se una reversible o irreversiblemente a cierta proteínas (por ejemplo, un receptor) que esté presente en esa localización.
Los constructos de administración de la presente divulgación pueden comprender un portador, en donde el portador puede configurarse para dirigirse a una cierta localización dentro o a través de una célula epitelial. Tal localización puede ser un órgano, un tejido, una célula o un compartimento celular. Al dirigirse a dichas localizaciones, los métodos y las composiciones descritos en la presente pueden usarse para varias aplicaciones, por ejemplo, aquellas que incluyen la administración de carga a través de una membrana epitelial intacta in vitro o in vivo.
Como se describe en la presente, un portador puede acoplarse a una carga heteróloga de cualquier manera descrita en la presente. Un constructo de administración comprende un portador que está acoplado a una carga heteróloga a través de un espaciador. El espaciador puede comprender cualquier fracción citada en la presente y puede comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 166 - s Eq ID NO: 213. El espaciador puede ser un espaciador escindible. El espaciador puede ser un espaciador no escindible. Un espaciador puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 210, o un fragmento o derivado de la misma.
En general, y como se describe en la presente, cualquier portador divulgado en la presente (por ejemplo, los enumerados en la TABLA 2 y la TABLA 3) puede combinarse con cualquiera de las moléculas de carga descritas en el presente (por ejemplo, las enumeradas en la TABLA 11 y la TABLA 12), y, opcionalmente, con cualquier espaciador descrito en la presente (por ejemplo, los enumerados en las TABLAS 7-10 y los que tienen una secuencia de aminoácidos expuesta en las s Eq ID NO: 207 - SEQ ID NO: 213) para formar un constructo de administración. Por tanto, un portador descrito en la presente puede derivarse de una exotoxina. Un portador puede derivarse de un dominio I de una exotoxina. La exotoxina puede ser Cholix. Un constructo de administración contemplado en la presente puede comprender un portador derivado de Cholix, en donde el portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 125, acoplado a una carga heteróloga. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 125. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 125. Un portador puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 125.
A continuación, en la TABLA 4, se muestran constructos de administración ejemplares como se describen en la presente divulgación.
TABLA 4 - n i min i n r mini r i n m l r
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Los métodos y composiciones de la presente divulgación pueden comprender un constructo de administración que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 153 - SEQ ID NO: 165, o que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. Un constructo de administración puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 153 - SEQ ID NO: 165, o que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. Un constructo de administración puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 153 - SEQ ID NO: 165, o que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. Un constructo de administración puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 153 - SEQ ID NO: 165, o que tiene por lo menos un 99% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma. Un constructo de administración puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 100% con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 153 - SEQ ID NO: 165, o que tiene una identidad de secuencia del 100% con un fragmento funcional de la misma.
A continuación, en la TABLA 5, se muestran combinaciones ejemplares de varios portadores, espaciadores y cargas heterólogas que pueden formar un constructo de administración como se describe en la presente.
TABLA - n r mini r i n m l r
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Un constructo de administración de la presente divulgación puede interactuar con una o más proteínas, enzimas o receptores específicos durante el transporte y/o administración a través de una célula epitelial y/o en el interior de una célula epitelial (por ejemplo, una célula epitelial intestinal polarizada). El uno o más receptores pueden ser receptores endógenos. Por tanto, los constructos de administración de la presente divulgación pueden usar sistemas de receptores endógenos que proporcionan un transporte y administración de carga rápidos y eficientes a través de una célula epitelial o un epitelio intacto (por ejemplo, una monocapa de células Caco-2 y/o un epitelio intestinal intacto de un sujeto), y/o al interior de una célula epitelial de un epitelio. Los constructos de administración que comprenden un portador que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 30 - SEQ ID NO: 125 pueden permitir la administración y el transporte de una carga heteróloga (por ejemplo, una terapéutica o biológicamente activa) al interior de una célula epitelial, por ejemplo, al lado basal de una célula epitelial y/o una región supranuclear (por ejemplo, el retículo endoplasmático, el aparato de Golgi y/o un endosoma) de una célula epitelial. El interior de una célula epitelial puede ser una vesícula o compartimento intracelular o el citosol de la célula epitelial. Una carga (por ejemplo, una carga heteróloga) puede administrarse al lado basal de la célula epitelial (por ejemplo, una localización o compartimento en el lado basal). Una carga heteróloga puede administrarse a una región supranuclear de la célula epitelial. El transporte de un constructo de administración al interior de una célula epitelial puede comprender liberar el constructo de administración desde una vesícula que se formó durante la endocitosis del constructo de administración en la superficie apical de la célula epitelial. La administración y/o el transporte a una localización en el interior de una célula puede comprender retener el constructo de administración en una vesícula y/o liberar el constructo de administración desde esa vesícula, de tal manera que el constructo de administración pueda estar en contacto con el citosol de la célula epitelial (por ejemplo, el constructo puede estar en contacto o no con el citosol de la célula epitelial durante la transcitosis debido a la encapsulación en la vesícula). Por tanto, un portador que comprende una versión truncada del dominio I de Cholix puede liberarse de una vesícula, por ejemplo, aquellos que comprenden una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 30 - SEQ ID NO: 107, o un fragmento funcional o derivado de la misma.
Los constructos de administración de la presente divulgación que comprenden un portador que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 29, SeQ ID NO: 129 -SEQ ID NO: 133, o SEQ ID NO: 141 - SEQ ID NO: 145 puede permitir la administración y el transporte de una carga heteróloga (por ejemplo, una terapéutica o biológicamente activa) a través de una célula epitelial. El transporte a través de una célula epitelial (por ejemplo, una célula epitelial intestinal polarizada) puede producirse mediante transcitosis. El mecanismo de transcitosis utilizado por los constructos de administración descritos en la presente es un sistema de tráfico endógeno que incluye una variedad de receptores distintos con los que interactúa el constructo de administración. Un portador de un constructo de administración puede comprender los elementos estructurales que permiten estas interacciones con el receptor. Los receptores con los que puede interactuar un portador como se divulga en la presente incluyen ribofilina 1, SEC24, CK-8, TMEM132, GRP75, ERGIC-53 y perlecán, o cualquier combinación de los mismos. Un portador como se describe en la presente puede no interactuar o no interactuar significativamente con clatrina o GPR78, o una combinación de los mismos.
El uso de un sistema endógeno que incluye esos receptores puede tener varias ventajas sobre otros mecanismos de transporte. El uso de un sistema de transporte endógeno puede incluir las siguientes ventajas: (i) puede atravesarse una capa intacta de células epiteliales, como una monocapa o un epitelio in vivo, sin dañar o alterar las células o la estructura de la monocapa; (ii) puede lograrse una administración y un transporte rápidos y eficientes; (iii) la interacción de distintos dominios o regiones de un constructo derivado de exotoxina con receptores específicos permite la modulación de esta interacción de una manera que permite dirigirse específicamente a ciertas regiones o compartimentos dentro de una célula o dentro de un sujeto. Por ejemplo, la administración y el transporte (por ejemplo, de una carga heteróloga) al interior de una célula epitelial puede proporcionarse usando ciertas versiones truncadas de un dominio I de exotoxina, como las que tienen una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 30 - SEQ ID NO: 125, o fragmento funcional de la misma. La célula epitelial puede localizarse en el intestino de un sujeto (por ejemplo, un roedor o un humano). En varias realizaciones, la administración y el transporte (por ejemplo, de una carga heteróloga) a través de una capa epitelial mediante transcitosis (por ejemplo, mediante el uso de un sistema de transcitosis endógeno) puede proporcionarse mediante el uso de ciertas versiones truncadas o derivados de un dominio I de exotoxina, como los que tienen una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 129-SEQ ID NO: 133. La capacidad de los constructos de administración descritos en la presente para administrar rápida y eficientemente carga terapéuticamente activa y/o de diagnóstico a esas localizaciones permite nuevas opciones para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de varias enfermedades (por ejemplo, enfermedad inflamatoria, enfermedades autoinmunes, enfermedades por deficiencia de hormonas, obesidad y trastornos metabólicos, y cáncer).
Los constructos de administración de la presente divulgación, además de un portador, una carga y, opcionalmente, un espaciador, pueden comprender además una o más fracciones funcionales. Una fracción funcional puede ser un agente detectable, un identificador de afinidad (por ejemplo, un grupo funcional en el que se puede hacer clic, como una azida), un código de barras (por ejemplo, un código de barras de ácidos nucleicos), agentes de penetración celular u otras fracciones funcionales que modulan el perfil farmacocinético (PK) y/o farmacodinámico (PD) del constructo de administración. Un constructo de administración puede comprender un agente de penetración celular. El agente de penetración celular puede ser un péptido. El agente de penetración celular puede comprender policationes, ácidos poliorgánicos, polímeros de liberación endosomal, poli(ácido 2-propilacrílico), poli(ácido 2-etilacrílico), péptido Tat, parche Arg, un péptido anudado, CysTAT, S19-TAT, R8 (SEQ ID NO: 73), pAntp, Pas-TAT, Pas-R8 (SEQ ID NO: 76), Pas-FHV, Pas-pAntP, F2R4 (SEQ ID NO: 79), B55, aurina, IMT-P8, BR2, OMOTAG1, OMOTAG2, pVEC, SynB3, DPV1047, C105Y, Transpotan, MTS, hLF, PFVYLI (SEQ ID NO: 93), maurocalcina, imperatoxina, hadrucalina, hemicalcina, opicalcina-1, opicalcina-2, midkin(62-104), MCoTI-II o una clorotoxina. Un agente de penetración celular puede acoplarse a un constructo de administración como se describe en la presente a través del extremo N- o C-terminal. Un agente de penetración celular puede proporcionar acceso a una variedad de tipos de células. Un agente de penetración celular puede proporcionar una funcionalidad adicional, por ejemplo, para la administración de carga terapéutica, una vez que el constructo de administración ha cruzado una capa epitelial (por ejemplo, un epitelio de un sujeto).
Los métodos y composiciones de la presente divulgación contemplan constructos de administración que pueden formar un multímero. Puede formarse en solución un multímero que comprende múltiples constructos de administración. Puede formarse un multímero por multimerización del portador y/o la carga heteróloga. El multímero puede ser un heterómero o un homómero. El homómero puede ser un homodímero. El homodímero puede formarse por dimerización de la carga heteróloga. Por ejemplo, un constructo de administración que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 217 puede formar un dímero. La dimerización de tal constructo de administración puede deberse a la dimerización de la carga, por ejemplo, IL-10 (por ejemplo, SEQ ID NO: 217) en este caso.
Sitio de inserción para la unión de la carga heteróloga
Los métodos y composiciones de la presente divulgación pueden comprender un constructo de administración que comprende un portador acoplado a una carga, como una carga heteróloga. Una carga heteróloga (por ejemplo, una biológicamente activa) puede unirse al portador (por ejemplo, una molécula pequeña, un polipéptido, un aptámero o un ácido nucleico) mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica sin limitación. La carga heteróloga puede introducirse en cualquier parte del portador que no altere la actividad de endocitosis y/o transcitosis del portador.
La presente divulgación proporciona constructos de administración que comprenden un portador polipeptídico. Por tanto, una carga heteróloga puede acoplarse directamente al extremo N-terminal o al extremo C-terminal de dicho portador polipeptídico (por ejemplo, un dominio I o una versión truncada del mismo, por ejemplo, SEQ ID NO: 4 - s Eq ID NO: 125). Una carga heteróloga puede acoplarse al portador a través de una cadena lateral de un aminoácido del dominio de unión al receptor del portador. Una carga heteróloga puede acoplarse al portador con un espaciador escindible de tal manera que la escisión en el espaciador o espaciadores escindibles separen la carga heteróloga del resto del constructo de administración. Una carga heteróloga también puede ser un polipéptido que comprende un péptido líder corto que permanece unido al polipéptido después de la escisión del espaciador escindible. Por ejemplo, la carga heteróloga puede comprender un péptido líder corto de más de 1 aminoácido, de más de 5 aminoácidos, de más de 10 aminoácidos, de más de 15 aminoácidos, de más de 20 aminoácidos, de más de 25 aminoácidos, de más de 30 aminoácidos ácidos, de más de 50 aminoácidos, o de más de 100 aminoácidos. Una carga biológica activa puede comprender un péptido líder corto de menos de 100 aminoácidos, menos de 50 aminoácidos, menos de 30 aminoácidos, menos de 25 aminoácidos, menos de 20 aminoácidos, menos de 15 aminoácidos, menos de 10 aminoácidos, o menos de 5 aminoácidos. Una carga biológica activa puede comprender un péptido líder corto de entre 1 y 100 aminoácidos, entre 5 y 10 aminoácidos, entre 10 y 50 aminoácidos o entre 20 y 80 aminoácidos.
Como se describe en la presente, la presente divulgación proporciona métodos y composiciones que comprenden un portador que se deriva de un dominio I de una exotoxina, en donde la exotoxina puede ser Cholix. En Cholix nativa (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2) el giro del dominio Ib no es esencial para ninguna actividad conocida de la toxina, incluyendo la unión celular, translocación, retención de ER o actividad de ribosilación de ADP. Por consiguiente, el dominio Ib puede eliminarse por completo o modificarse para que contenga una carga heteróloga, por ejemplo, una carga biológicamente activa. Por tanto, la carga heteróloga (por ejemplo, carga biológicamente activa) puede insertarse en Cholix. Una carga heteróloga (por ejemplo, carga biológicamente activa), por ejemplo, puede insertarse en un dominio Ib de portador derivado de Cholix entre las cisteínas en las posiciones 395 y 402 que no están reticuladas. Esto puede lograrse reduciendo el enlace disulfuro entre las cisteínas, eliminando una o ambas cisteínas por completo del dominio Ib, mutando una o ambas cisteínas a otros residuos, por ejemplo, serina, o mediante otras técnicas similares. Alternativamente, la carga biológicamente activa puede insertarse en el giro del dominio Ib entre las cisteínas en las posiciones 395 y 402. En tales realizaciones, el enlace disulfuro entre las cisteínas puede usarse para restringir el dominio de carga biológicamente activa.
Los métodos y composiciones descritos en la presente pueden comprender constructos de administración que se producen de tal manera que una carga heteróloga se exprese junto con un portador (y, opcionalmente, un espaciador) como una proteína de fusión (por ejemplo, el constructo de administración). En tales casos, la carga heteróloga puede insertarse en el constructo de administración mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica sin limitación. Por ejemplo, los aminoácidos correspondientes a la carga heteróloga pueden insertarse directamente en el dominio de unión al receptor, con o sin deleción de las secuencias de aminoácidos nativas. Alternativamente, una carga heteróloga puede no expresarse junto con un portador (y, opcionalmente, un espaciador) como una proteína de fusión, la carga heteróloga puede acoplarse al portador mediante cualquier método adecuado conocido por un experto en la técnica, sin limitación, incluyendo química de conjugación de péptidos y/o química de clic.
Espaciadores
Los métodos y composiciones de la presente divulgación pueden comprender constructos de administración que comprenden un portador acoplado a una carga (por ejemplo, una carga heteróloga), en donde el portador es capaz de administrar la carga heteróloga en y/o a través de una célula epitelial in vitro (por ejemplo, una monocapa de células epiteliales) o in vivo (por ejemplo, un epitelio intestinal de un sujeto). Dicho portador puede acoplarse a una carga de cualquier manera descrita en la presente. El portador puede acoplarse directa o indirectamente a la carga. El portador también puede acoplarse covalente o no covalentemente a la carga.
La presente divulgación proporciona constructos de administración que comprenden un portador acoplado a una carga heteróloga a través de un espaciador. Un espaciador puede comprender cualquier fracción citada en la presente. Un espaciador puede ser cualquier molécula que enlaza el portador con la carga y puede comprender espaciadores oligoméricos o poliméricos (por ejemplo, polietilenglicol, etc.), otros espaciadores de molécula pequeña (por ejemplo, los derivados de ácidos dicarbónicos como el ácido succínico, ácido aspártico, etc.) y aminoácidos (incluyendo secuencias peptídicas cortas, etc.). Por tanto, un "espaciador", como se describe en la presente, se refiere de manera general a una fracción química que puede unirse o acoplarse a una molécula de la presente divulgación. Un espaciador puede localizarse entre una primera molécula y una segunda molécula. Un espaciador puede conectar, unir, enlazar o acoplar una primera molécula (por ejemplo, un polipéptido, una molécula pequeña, un ácido nucleico, etc.) a una segunda molécula (por ejemplo, un polipéptido, molécula pequeña, ácido nucleico, etc.). Un espaciador puede reducir la impedancia estérica entre la primera molécula y la segunda molécula. Un espaciador puede ser una secuencia de aminoácidos acoplada al extremo C-terminal de un péptido o polipéptido. La secuencia de aminoácidos de un espaciador como se divulga en la presente puede tener una longitud de entre 1 y 100 residuos de aminoácidos. Un espaciador puede tener una longitud de entre 5 y 75 residuos de aminoácidos. Un espaciador puede tener una longitud de entre 5 y 50 residuos de aminoácidos. En algunos casos, un espaciador tiene una longitud de entre 5 y 25 residuos de aminoácidos. Un portador puede comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125 se acopla a un espaciador en su extremo C-terminal (y el espaciador puede acoplarse además a una carga heteróloga a través de su extremo C-terminal). El espaciador puede ser un espaciador de aminoácidos. El espaciador puede comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 166 - SEQ ID NO: 213. El espaciador puede comprender una porción de un dominio II, un dominio Ib o un dominio III de una exotoxina, o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, un constructo de administración como se describe en la presente puede comprender un portador que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125, acoplado a un espaciador, en donde el espaciador comprende los residuos de aminoácidos 1- 82 de la SEQ ID NO: 126.
La presente divulgación proporciona constructos de administración que comprenden uno o más espaciadores que se describen con más detalle en la presente. Un espaciador puede comprender una secuencia de aminoácidos. Un espaciador puede comprender como máximo 82 residuos de aminoácidos de cualquier SEQ ID NO: 126. Por tanto, un espaciador puede comprender los primeros 82 residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 126. Los residuos de aminoácidos del dominio II de Cholix pueden ser residuos de aminoácidos contiguos (por ejemplo, los residuos 1-82 de la SEQ ID NO: 126).
Otro espaciador que puede usarse en combinación con los métodos y composiciones descritos en la presente comprende los que comprenden una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO: 207 - SEQ ID NO: 211. Un espaciador comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 210, o un fragmento o derivado del mismo.
Los métodos y composiciones de la presente divulgación pueden comprender un espaciador que puede comprender una porción de un dominio II, un dominio Ib y/o un dominio III de una exotoxina. Por ejemplo, un portador que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125 puede acoplarse además (por ejemplo, a través del extremo C-terminal) a un espaciador, en donde el espaciador comprende de aproximadamente 80 a aproximadamente 90 residuos de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 126 - SEQ ID NO: 128 y/o las SEQ ID NO: 138 - SEQ ID NO: 140. Un espaciador puede comprender como máximo 85 residuos de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 126 - SEQ ID NO: 128 y/o las SEQ ID NO: 137 - SEQ ID NO: 139. Un espaciador puede comprender como máximo 82 residuos de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 126 - SEQ ID NO: 128 y/o las SEQ ID NO: 137 - SEQ ID NO: 139. Un espaciador puede comprender como máximo 80 residuos de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 126 -SEQ ID NO: 128 y/o las SEQ ID NO: 137 - SEQ ID NO: 139. Un espaciador puede comprender como máximo 50 residuos de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 126 - SEQ ID NO: 128 y/o las SeQ ID NO: 137 - SEQ ID NO: 139. Un espaciador puede comprender como máximo 25 residuos de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 126 - SEQ ID NO: 128 y/o las SEQ ID NO: 137 - SEQ ID NO: 139.
Un espaciador puede comprender como máximo 82 residuos de aminoácidos de cualquier SEQ ID NO: 126. Un espaciador puede comprender los primeros 82 residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 126. Los residuos de aminoácidos del dominio II de Cholix pueden ser residuos de aminoácidos contiguos (por ejemplo, los residuos 1-82 de la SEQ ID NO: 126).
Un espaciador de la presente divulgación puede ser un espaciador escindible. Un espaciador de la presente divulgación puede ser un espaciador no escindible.
Espaciadores escindibles
Los métodos y composiciones descritos actualmente permiten que una carga heteróloga (por ejemplo, una carga biológica o terapéuticamente activa) se administra a una localización dentro o a través de una célula epitelial, en donde la carga heteróloga puede acoplarse al portador formando un constructo de administración como se describe en la presente. Tal constructo de administración puede comprender además un espaciador que puede acoplarse indirectamente un portador a una carga (por ejemplo, una carga heteróloga). Un espaciador como se describe aquí puede ser un espaciador escindible. El número de espaciadores escindibles presentes en un constructo de administración depende, por lo menos en parte, de la localización de la carga heteróloga con respecto al constructo de administración y la naturaleza de la carga heteróloga. Cuando la carga heteróloga puede separarse del resto del constructo de administración con escisión en un único espaciador, los constructos de administración pueden comprender un único espaciador escindible. Además, cuando la carga heteróloga es, por ejemplo, un dímero u otro multímero, cada subunidad de la carga biológicamente activa puede separarse del resto del constructo de administración y/o de las otras subunidades de la carga biológicamente activa por escisión en el espaciador escindible.
Un espaciador escindible puede ser escindido por una enzima de escisión que está presente en o cerca de la membrana basolateral de una célula epitelial. Seleccionando el espaciador escindible paraque sea escindido por tales enzimas, la carga biológicamente activa puede liberarse del resto del constructo de administración después de la transcitosis a través de la membrana mucosa y liberarse de la célula epitelial a la matriz celular en el lado basolateral de la membrana. Además, podrían usarse enzimas de escisión que están presentes dentro de la célula epitelial, de tal manera que el espaciador escindible se escinda antes de la liberación del constructo de administración de la membrana basolateral, siempre que la enzima de escisión no escinda el constructo de administración antes de que el constructo de administración entre en la vía de tráfico en la célula epitelial polarizada que resulta en la liberación del constructo de administración y la carga biológicamente activa de la membrana basolateral de la célula.
Un portador de la presente divulgación puede ser escindido por una enzima. La enzima que está presente en una membrana basolateral de una célula epitelial polarizada puede seleccionarse de, por ejemplo, catepsina GI, quimotripsina I, elastasa I, subtilisina AI, subtilisina AII, trombina I o uroquinasa I. La TABLA 6 presenta estas enzimas junto con una secuencia de aminoácidos que es reconocida y escindida por la peptidasa particular.
TABLA 6 - Peptidasas presentes cerca de las membranas mucosas basolaterales o en los últimos aspectos de la vía de transcitosis
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Un espaciador escindible puede mostrar una mayor propensión a escindirse que el resto del constructo de administración. Como sabe un experto en la técnica, muchas secuencias peptídicas y polipeptídicas pueden ser escindidas por peptidasas y proteasas. El espaciador escindible puede seleccionarse de manera que se escinda preferentemente con respecto a otras secuencias de aminoácidos presentes en el constructo de administración durante la administración del constructo de administración. Un portador de un constructo de administración puede estar sustancialmente (por ejemplo, aproximadamente el 99%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 80% o aproximadamente el 75%) intacto después de la administración del constructo de administración al torrente sanguíneo del sujeto. Una carga de un constructo de administración puede estar sustancialmente (por ejemplo, aproximadamente el 99%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 80, o aproximadamente el 75%) intacta después de la administración del constructo de administración al torrente sanguíneo del sujeto. Un espaciador escindible puede escindirse sustancialmente (por ejemplo, aproximadamente el 99%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 80% o aproximadamente el 75%) después de la administración del constructo de administración al torrente sanguíneo del sujeto.
Puede usarse una enzima de escisión que se encuentra en el plasma del sujeto para escindir el espaciador escindible. Puede usarse cualquier enzima de escisión que un experto en la técnica sepa que está presente en el plasma del sujeto para escindir el espaciador escindible. Se prefieren menos los usos de tales enzimas para escindir los espaciadores escindibles que el uso de enzimas escindibles que se encuentran cerca de la membrana basolateral de una célula epitelial polarizada porque se cree que se producirá una escisión más eficaz cerca de la membrana basolateral. Sin embargo, si el experto en la técnica determina que la escisión mediada por una enzima plasmática es suficientemente eficaz para permitir la escisión de una fracción suficiente de los constructos de administración para evitar efectos adversos; pueden usarse tales enzimas de escisión de plasma para escindir los constructos de administración. Por consiguiente, el espaciador escindible puede escindirse con una enzima que se selecciona del grupo que consiste de caspasa-1, caspasa-3, proproteína convertasa 1, proproteína convertasa 2, proproteína convertasa 4, proproteína convertasa 4 PACE 4, prolil oligopeptidasa, enzima de escisión de endotelina, dipeptidil-peptidasa IV, peptidasa señal, neprilisina, renina y esterasa (ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 6.673.574). La TABLA 7 presenta estas enzimas junto con una secuencia o secuencias de aminoácidos reconocidas por la peptidasa particular. La peptidasa escinde un péptido que comprende estas secuencias en el lado N-terminal del aminoácido identificado con un asterisco.
TABLA 7 - P i l m i m l r
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continuación
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Por tanto, un espaciador escindible puede ser cualquier espaciador escindible conocido por un experto en la técnica que puede ser escindido por una enzima que está presente en la membrana basolateral de una célula epitelial. Un espaciador escindible puede comprender un péptido. Un espaciador escindible puede comprender un ácido nucleico, como ARN o ADN. Además, un espaciador escindible puede comprender un carbohidrato, como un disacárido o un trisacárido.
Alternativamente, un espaciador escindible puede ser cualquier espaciador escindible conocido por un experto en la técnica que puede ser escindido por una enzima que está presente en el plasma del sujeto al que se administra el constructo de administración. Dicho espaciador escindible puede comprender un péptido. Dicho espaciador escindible puede comprender un ácido nucleico, como ARN o ADN. Dicho espaciador escindible comprende un carbohidrato, como un disacárido o un trisacárido.
Un espaciador escindible puede seleccionarse o derivarse de la lista de ejemplos presentada en la TABLA 8.
TABLA - n i min i i r m l r
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Además, un espaciador escindible puede ser un espaciador que comprende una secuencia de aminoácidos que es un sustrato conocido para la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV). Por consiguiente, un espaciador escindible puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en, por ejemplo, GGGGSGGGENLYFQS (SEQ ID NO: 193).
Los constructos de administración novedosos de la presente divulgación pueden comprender una secuencia peptídica (o un dominio similar), que sirve para inhibir, interferir o bloquear la capacidad de la carga biológicamente activa para unirse a los receptores en la superficie de las células epiteliales. Por consiguiente, dependiendo de la carga biológica a administrar, la secuencia peptídica (o dominio similar) que sirve para inhibir, interferir o bloquear la capacidad de la carga biológicamente activa para unirse a su receptor en la superficie de las células epiteliales se dirigirá específicamente al receptor al que se une la carga biológicamente activa.
Varias cargas biológicamente activas pueden unirse a los gangliósidos GM-1 que se encuentran en las superficies de las células de mamíferos. Por consiguiente, un espaciador escindible de la presente divulgación puede comprender una secuencia peptídica, que sirve para inhibir, interferir o bloquear la capacidad de la carga biológicamente activa para unirse a GM-1 en la superficie de las células epiteliales. La Patente de Estados Unidos N° 8.877.161 enseña una serie de péptidos que interfieren con la unión de ligandos a GM-1. La TABLA 9 presenta varios ejemplos de secuencias peptídicas, que pueden incorporarse en su totalidad o en parte, en los espaciadores escindibles para su uso en la preparación de los constructos de administración de la presente divulgación.
TABLA - P i ni n M-1 m l r
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Un espaciador escindible usado en la preparación de los constructos de administración de la presente divulgación puede comprender la secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, las SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189 y SEQ ID NO: 190, o variantes o fragmentos de las mismas, como se muestra en la TABLA 10 a continuación.
TABLA 10 - E i r m l r n i n n i ni n M-1 escindible
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Espaciadores no escindibles
Un constructo de administración de la presente divulgación puede comprender un portador acoplado a una carga heteróloga (por ejemplo, una carga biológicamente activa), en donde la carga puede estar separada del portador por un espaciador que consiste de uno o más aminoácidos (por ejemplo, hasta 25 aminoácidos). El espaciador puede ser un espaciador peptídico o cualquier otra entidad molecular que pueda usarse para acoplarse para enlazar una primera y una segunda molécula. Generalmente, un espaciador no tendrá actividad biológica específica más que unir las proteínas o preservar alguna distancia mínima u otra relación espacial entre ellas. Sin embargo, los aminoácidos constituyentes del espaciador pueden seleccionarse para influir sobre alguna propiedad de la molécula, como el plegamiento, la carga neta o la hidrofobicidad.
El espaciador puede ser capaz de formar enlaces covalentes tanto con el constructo de administración como con la carga (por ejemplo, una biológicamente activa). Los espaciadores adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, espaciadores de carbono de cadena lineal o ramificada, espaciadores de carbono heterocíclico o espaciadores peptídicos. El o los espaciadores pueden unirse a los aminoácidos constituyentes del constructo de administración y/o la carga biológicamente activa a través de sus grupos laterales (por ejemplo, a través de un enlace disulfuro a la cisteína). Los espaciadores pueden unirse a los grupos amino y/o carboxilo de carbono alfa de los aminoácidos terminales del constructo de administración y/o la carga (por ejemplo, una biológicamente activa).
Puede usarse un espaciador bifuncional que tiene un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo en el portador bacteriano y otro grupo reactivo en la carga biológicamente activa para formar el conjugado deseado. Alternativamente, la derivatización puede implicar el tratamiento químico de la fracción de direccionamiento. Se conocen procedimientos para la generación de, por ejemplo, grupos sulfhidrilo libres en polipéptidos, como anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (Ver Patente de Estados Unidos N° 4.659.839).
Se conocen muchos procedimientos y moléculas espaciadoras para la unión de varios compuestos incluyendo quelatos de radionúclidos metálicos, toxinas y fármacos a proteínas como anticuerpos. Ver, por ejemplo, Solicitud de Patente Europea N° 188.256; Patentes de Estados Unidos N° 4.671.958, 4,659,839, 4.414.148, 4.699.784; 4.680.338; 4.569.789; y 4.589.071; y Borlinghaus et al. (1987) Cancer Res. 47: 4071-4075.
Una carga (por ejemplo, una carga biológicamente activa) para ser administrada a una localización (por ejemplo, una localización dentro de un sujeto como un humano) puede acoplarse al portador usando uno o más espaciadores peptídicos no escindibles que comprenden, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos GTGGS (SEQ ID NO: 207), GGGGS (SEQ ID NO: 208), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 209), GGGGSGGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 210), o GGGGSGGG (SEQ ID NO: 211), en donde el portador dirige dicha carga (por ejemplo, carga biológicamente activa) a células específicas, incluyendo pero no limitadas a, células del sistema inmunitario como macrófagos, células presentadoras de antígenos y células dendríticas (por ejemplo, tras transportar la carga a través de una célula epitelial). En general, un espaciador no escindible puede comprender una o más de (GGGGS)x(SEQ ID NO: 212), en donde x = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. Un espaciador no escindible puede comprender una o más de (GS)x(SEQ ID NO: 213), en donde x = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.
Producción de constructos de administración
Los constructos de administración de la presente divulgación pueden producirse usando una variedad de métodos. La selección de un método de producción puede depender de la estructura molecular del constructo de administración y/o sus componentes (por ejemplo, el portador, la carga y/o el espaciador). Por tanto, para algunos constructos de administración, los métodos sintéticos orgánicos pueden ser ventajosos para producir tal constructo de administración. Un constructo de administración de la presente divulgación puede ser un polipéptido. Tales polipéptidos pueden producirse, por ejemplo, usando metodología de ADN recombinante. En general, esto implica crear una secuencia de ADN que codifique el constructo de administración, colocar el ADN en un casete de expresión bajo el control de un promotor particular, expresar la molécula en un huésped, aislar la molécula expresada y, si se requiere, plegar la molécula en una forma conformacional activa.
El ADN que codifica los constructos de administración descritos en la presente puede prepararse mediante cualquier método adecuado incluyendo, por ejemplo, la clonación y la restricción de secuencias apropiadas o la síntesis química directa mediante métodos como el método del fosfotriéster de Narang et al. (1979) Met. Enzymol.
68: 90-99; el método del fosfodiéster de Brown et al. (1979) Met. Enzymol. 68: 109-151; el método de la dietilfosforamidita de Beaucage et al. (1981) Tetra. Lett., 22: 1859-1862); el método de soporte sólido de la Patente de Estados Unidos N° 4.458.066, y similares.
La síntesis química produce un oligonucleótido de cadena sencilla. Este puede convertirse en ADN de cadena doble mediante hibridación con una secuencia complementaria o mediante polimerización con una ADN polimerasa usando la cadena sencilla como plantilla. Un experto reconocería que aunque la síntesis química de ADN se limita a secuencias de aproximadamente 100 bases, pueden obtenerse secuencias más largas mediante la unión de secuencias más cortas.
Alternativamente, pueden clonarse las subsecuencias y pueden escindirse las subsecuencias apropiadas usando enzimas de restricción apropiadas. Luego, los fragmentos pueden ligarse para producir la secuencia de ADN deseada. Un ADN que codifica un constructo de administración de la presente divulgación puede clonarse usando métodos de amplificación de ADN como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Así, por ejemplo, el gen para la carga biológicamente activa se amplifica por PCR, usando un cebador de sentido que contiene el sitio de restricción para, por ejemplo, Ndel y un cebador antisentido que contiene el sitio de restricción para HindlIl. Esto puede producir un ácido nucleico que codifica la secuencia de la carga biológicamente activa y que tiene sitios de restricción terminales. Un constructo de administración que tiene sitios de restricción "complementarios" puede clonarse de manera similar y luego ligarse a la carga biológicamente activa y/o a un espaciador unido a la carga biológicamente activa. La ligadura de las secuencias de ácidos nucleicos y la inserción en un vector produce un vector que codifica la carga biológicamente activa unida al dominio de unión del receptor del portador bacteriano. En varias realizaciones, el ADN que codifica los constructos de administración de la presente divulgación se sintetiza artificialmente, por ejemplo, mediante síntesis de ADN en fase sólida.
Los métodos de producción descritos en la presente pueden usarse para producir los constructos de administración de la presente divulgación, o variantes (funcionales) de los mismos. Por ejemplo, una "Cholix" (también referida en la presente como toxina Cholix o exotoxina Cholix) puede abarcar una variedad de variantes funcionales (por ejemplo, un género funcional), en donde las variantes funcionales pueden comprender una o más variaciones en su secuencia de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 1 como se divulga en la presente. Por tanto, en la presente divulgación, la toxina Cholix que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 se usa como secuencia de referencia cuando se hace referencia a Cholix. Sin embargo, como se describe en la presente, la presente divulgación no se limita a la Cholix que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, sino que abarca todas las variantes de Cholix que se encuentran dentro del género funcional de Cholix. Por ejemplo, una variante de la exotoxina Cholix con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 puede ser una exotoxina Cholix cuya secuencia de aminoácidos se expone en la SEQ ID NO: 2, en donde ambas variantes son capaces de llevar a cabo la mismas funciones, por ejemplo, transcitosis a través de una célula epitelial, e interactúan con los mismos receptores, como ribofilina 1, SEC24, CK-8, TMEM132, GRP75, ERGIC-53 y/o perlecán.
Además, el método de producción de un polipéptido puede afectar, hasta cierto punto, a la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido (por ejemplo, debido a modificaciones postraduccionales). Por ejemplo, un primer portador y un segundo portador se producen en el mismo sistema de expresión (por ejemplo, un sistema de expresión bacteriano como E. coli o un sistema de expresión de mamífero como una célula CHO). En otros casos, y como se describe en la presente, un primer portador y un segundo portador se producen en un sistema de expresión diferente (por ejemplo, un sistema de expresión bacteriano o de mamífero). Los sistemas de expresión bacterianos incluyen E. coli, y los sistemas de expresión de mamíferos incluyen células CHO, por ejemplo. Un polipéptido producido por bacterias puede comprender una caperuza N, en donde la caperuza N puede comprender una modificación más en el extremo N-terminal del polipéptido. Una caperuza N puede comprender un residuo de metionina N-terminal. Los ejemplos de polipéptidos portadores derivados del dominio I de Cholix que pueden producirse por bacterias y que comprenden dicha metionina N-terminal incluyen aquellos que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID nO: 9, SeQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 107 y SEQ ID NO: 135.
Carga
La presente divulgación proporciona métodos y composiciones que permiten la administración rápida y eficiente de carga en y/o a través de células epiteliales (por ejemplo, células epiteliales polarizadas) in vitro (por ejemplo, una monocapa de células Caco-2) e in vivo (por ejemplo, una epitelio intestinal de un sujeto). Tal administración rápida y eficiente puede lograrse acoplando la carga (por ejemplo, una carga biológicamente activa) a un portador para formar un constructo de administración. Tales constructos de administración pueden modificarse para que se dirijan a ciertas localizaciones dentro de una célula epitelial o para transportar carga a través de una célula epitelial como una membrana epitelial intacta.
Las composiciones y métodos de la presente divulgación proporcionan un transporte y administración eficaces de varias moléculas de carga a diferentes localizaciones (por ejemplo, órganos, tejidos o células) de un sujeto (por ejemplo, un roedor o un humano). Los constructos de administración de la presente divulgación pueden permitir la administración en células epiteliales y/o la transcitosis rápida (por ejemplo, transcitosis vesicular) a través de una capa de células epiteliales como el epitelio intestinal de un sujeto. Los mecanismos de administración descritos actualmente permiten el transporte y la administración de varias moléculas de carga. Los constructos de administración descritos en la presente pueden acoplarse a por lo menos una, por lo menos dos, por lo menos tres, por lo menos cinco o por lo menos 10 moléculas de carga. La carga puede ser una carga heteróloga, por ejemplo, heteróloga para el portador. Por ejemplo, un constructo de administración descrito en la presente comprende un portador derivado del dominio I de Cholix (por ejemplo, aquellos que tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 125) acoplado a una carga heteróloga, en donde la carga heteróloga es una molécula de carga no derivada de Cholix (por ejemplo, no se deriva o no contiene fragmentos de un dominio I, II, Ib y III de toxina Cholix).
Una carga heteróloga puede ser una carga biológicamente activa. Una carga biológicamente activa puede incluir moléculas terapéuticas y/o de diagnóstico. Por tanto, los constructos de administración de la presente divulgación pueden usarse para administrar una carga biológicamente activa a un sujeto (por ejemplo, un roedor o un humano). Una "carga biológicamente activa" como se usa en la presente incluye, pero no se limita as: una macromolécula, una molécula pequeña, un péptido, un polipéptido, un ácido nucleico, un ARNm, un ARNmi, un ARNhc, un ARNip, una molécula antisentido, un anticuerpo, un ADN, un plásmido, una vacuna, un polímero nanopartícula o material catalíticamente activo.
Una carga biológicamente activa de la presente divulgación puede ser una macromolécula que puede realizar una actividad biológica deseable cuando se introduce en el torrente sanguíneo del sujeto. Por ejemplo, la carga biológicamente activa puede tener actividad de unión al receptor, actividad enzimática, actividad de mensajero (es decir, actuar como una hormona, citoquina, neurotransmisor u otra molécula de señalización), actividad luminiscente u otra actividad detectable, o actividad reguladora, o cualquier combinación de las mismas. Para ciertos propósitos de diagnóstico, una carga biológicamente activa puede conjugarse o puede ser en sí misma una fracción emisora de rayos gamma farmacéuticamente aceptable, incluyendo pero no limitado a, indio y tecnecio, partículas magnéticas, materiales radiopacos como el aire o el bario y compuestos fluorescentes.
Una carga heteróloga como se describe en la presente puede ser una carga biológicamente activa. Una carga biológicamente activa que forma parte de un constructo de administración puede ejercer sus efectos en compartimentos biológicos del sujeto distintos de la sangre del sujeto. Por ejemplo, en varias realizaciones, la carga biológicamente activa puede ejercer sus efectos en el sistema linfático. En otros casos, la carga biológicamente activa puede ejercer sus efectos en un órgano o tejido, como, por ejemplo, el hígado, el corazón, los pulmones, el páncreas, el riñón, el cerebro, la médula ósea, etc. del sujeto. Como tal, la carga biológicamente activa puede estar presente o no en la sangre, la linfa u otro fluido biológico en concentraciones detectables, pero aun así puede acumularse a concentraciones suficientes en su sitio de acción para ejercer un efecto biológico.
Una carga biológicamente activa puede ser una proteína que comprenda más de una subunidad polipeptídica. Por ejemplo, la proteína puede ser un dímero, un trímero o un multímero de orden superior. En varias realizaciones, dos o más subunidades de la proteína pueden conectarse con un enlace covalente como, por ejemplo, un enlace disulfuro. Las subunidades de la proteína pueden mantenerse unidas mediante interacciones no covalentes. Un experto en la técnica puede identificar rutinariamente tales proteínas y determinar si las subunidades están asociadas apropiadamente usando, por ejemplo, un inmunoensayo.
Una carga biológicamente activa para ser administrada a una cierta localización (por ejemplo, en un sujeto) puede seleccionarse de, por ejemplo, citoquinas y receptores de citoquinas como interleucina-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, factor inhibidor de linfoquinas, factor estimulante de colonias de macrófagos, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de células madre, factor de crecimiento tumoral-p, factor de necrosis tumoral, linfotoxina, Fas, factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, interferón-a, interferón-p , interferón-y, factores de crecimiento y hormonas proteicas como eritropoyetina, angiogenina, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento de queratinocitos, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento tumoral-a, trombopoyetina, factor estimulante de la tiroides, hormona liberadora de tiroides, neurotrofina, factor de crecimiento epidérmico, VEGF, factor neurotrófico ciliar, LDL, somatomedina, factor de crecimiento de insulina, factor de crecimiento similar a la insulina I y II, quimiocinas como ENA-78, ELC, GRO-a, GRO-p, GRO-y, HRG, LEF, IP-10, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MIP-1-a, MIP-1-p, MG, MDC, NT-3, NT-4, SCF, LIF, leptina, RANTES, linfotactina, eotaxina-1, eotaxina-2, TARC, TECK, WAP-1, w Ap-2, GCP-1, GCP- 2; receptores de quimioquinas a, por ejemplo, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7; y receptores de p-quimioquinas, por ejemplo, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7.
En la TABLA 11 se proporciona un listado ilustrativo, pero no limitativo, de cargas biológicamente activas adecuadas para su uso en los constructos y métodos de la presente invención.
TABLA 11 - r i l i m n iv m l r
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Una carga biológicamente activa como se describe en la presente puede ser una hormona. Tal hormona puede ser una hormona del crecimiento. La hormona puede ser una hormona de crecimiento humana que tiene, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 214.
Una carga biológicamente activa puede ser una molécula que afecta y/o interactúa con el metabolismo de un sujeto. Por tanto, una carga biológicamente activa como se describe en la presente puede ser un fármaco que se puede usar para prevenir, tratar y/o diagnosticar una enfermedad o afección metabólica. Por tanto, una carga biológicamente activa como se describe en la presente puede ser un péptido similar al glucagón (GLP). El GLP puede ser GLP-1 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la s Eq ID NO: 215. Una hormona que puede usarse en combinación con los métodos y composiciones descritos en la presente puede ser insulina (con el elemento de péptido c eliminado de la proteína madura), o un derivado de la misma. Un péptido de insulina puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 216.
Una carga biológicamente activa puede ser una interleucina. Específicamente, las interleucinas que pueden usarse con los métodos y composiciones descritos en la presente pueden incluir IL-10 e IL-22, que tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 217 y la SEQ ID NO: 218, respectivamente.
La carga biológicamente activa divulgada en la presente puede modular la orientación espacial de un constructo de administración. Por ejemplo, una molécula de carga puede inducir la multimerización de dos o más constructos de administración. Tales multímeros pueden ser homómeros o heterómeros. El multímero puede ser un homodímero. Por ejemplo, un constructo de administración que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 217 puede formar un dímero. Tal dimerización puede ser inducida por IL-10 (ya que IL-10 puede formar un dímero natural y promover de este modo la dimerización de un constructo de administración que comprende una IL-10 como carga).
Una carga biológicamente activa también puede comprender toxinas, como endotoxinas, enterotoxinas o exotoxinas. Por ejemplo, una carga biológicamente activa puede ser un polipéptido de ExtB (que formará un pentámero natural) que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 219.
Otros ejemplos de carga biológicamente activa que pueden administrarse de acuerdo con la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, compuestos antineoplásicos, como nitrosoureas, por ejemplo, carmustina, lomustina, semustina, estreptococina; metilhidrazinas, por ejemplo, procarbazina, dacarbazina; hormonas esteroides, por ejemplo, glucocorticoides, estrógenos, progestágenos, andrógenos, tetrahidrodesoxicaricosterona; compuestos inmunoactivos como inmunosupresores, por ejemplo, pirimetamina, trimetopterina, penicilamina, ciclosporina, azatioprina; e inmunoestimulantes, por ejemplo, levamisol, ditiocarbamato de dietilo, encefalinas, endorfinas; compuestos antimicrobianos como antibióticos, por ejemplo, p-lactama, penicilina, cefalosporinas, carbapenimas y monobactamas, inhibidores de p-lactamasa, aminoglucósidos, macrólidos, tetraciclinas, espectinomicina; antipalúdicos, amebicidas; antiprotazoarios; antifúngicos, por ejemplo, anfotericina p, antivirales, por ejemplo, aciclovir, idoxuridina, ribavirina, trifluridina, vidarbina, ganciclovir; parasiticidas; antihalminticos; radiofármacos; fármacos gastrointestinales; compuestos hematológicos; inmunoglobulinas; proteínas de coagulación de la sangre, por ejemplo, factor antihemofílico, complejo de factor IX; anticoagulantes, por ejemplo, dicumarol, heparina Na; inhibidores de fibrolisina, por ejemplo, ácido tranexámico; fármacos cardiovasculares; fármacos antiadrenérgicos periféricos; fármacos antihipertensivos de acción central, por ejemplo, metildopa, metildopa HCl; vasodilatadores directos antihipertensivos, por ejemplo, diazóxido, hidralazina HCl; fármacos que afectan al sistema reninaangiotensina; vasodilatadores periféricos, por ejemplo, fentolamina; fármacos antianginosos; glucósidos cardíacos; inodilatadores, por ejemplo, amrinona, milrinona, enoximona, fenoximona, imazodan, sulmazol; antiarrítmicos; bloqueadores de entrada de calcio; fármacos que afectan a los lípidos sanguíneos, por ejemplo, ranitidina, bosentan, rezulin; fármacos respiratorios; fármacos sipaticomiméticos, por ejemplo, albuterol, mesilato de bitolterol, dobutamina HCl, dopamina HCl, efedrina SO, epinefrina, fenfluramina HCl, isoproterenol HCl, metoxamina HCl, bitartrato de norepinefrina, fenilefrina HCl, ritodrina HCl; fármacos colinomiméticos, por ejemplo, acetilcolina Cl; anticolinesterasas, por ejemplo, edrofonio Cl; reactivadores de colinesterasa; fármacos bloqueantes adrenérgicos, por ejemplo, acebutolol HCl, atenolol, esmolol HCl, labetalol HCl, metoprolol, nadolol, mesilato de fentolamina, propanolol HCl; fármacos antimuscarínicos, por ejemplo, bromuro de metilo de anisotropina, SO4 de atropina, clinidio Br, glicopirrolato, ipratropio Br, escopolamina HBr; fármacos bloqueadores neuromusculares; fármacos despolarizantes, por ejemplo, besilato de atracurio, hexafluorenio Br, yoduro de metocurina, succinilcolina Cl, tubocurarina Cl, vecuronio Br; relajantes musculares de acción central, por ejemplo, baclofeno; neurotransmisores y agentes neurotransmisores, por ejemplo, acetilcolina, adenosina, trifosfato de adenosina; neurotransmisores de aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos excitadores, GABA, glicina; neurotransmisores de amina biogénica, por ejemplo, dopamina, epinefrina, histamina, norepinefrina, octopamina, serotonina, tiramina; neuropéptidos, óxido nítrico, toxinas del canal de K+; fármacos antiparkinsonianos, por ejemplo, amaltidina HCl, mesilato de benztropina, carbidopa; fármacos diuréticos, por ejemplo, diclorfenamida, metazolamida, bendroflumetiazida, politiazida; fármacos antimigrañosos, por ejemplo, mesilato de carboprost trometamina, maleato de metisergida.
Otros ejemplos más de carga biológicamente activa que pueden administrarse de acuerdo con la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, hormonas como hormonas pituitarias, por ejemplo, gonadotropina coriónica, cosintropina, menotropinas, somatotropina, iorticotropina, protirelina, tirotropina, vasopresina, lipresina; hormonas suprarrenales, por ejemplo, dipropionato de beclometasona, betametasona, dexarnetasona, triamcinolona; hormonas pancreáticas, por ejemplo, glucagón, insulina; hormona paratiroidea, por ejemplo, dihidroquisterol; hormonas tiroideas, por ejemplo, calcitonina etidronato disódico, levotiroxina Na, liotironina Na, liotrix, tiroglobulina, acetato de teriparatida; fármacos antitiroideos; hormonas estrogénicas; progestágenos y antagonistas; anticonceptivos hormonales; hormonas testiculares; hormonas gastrointestinales, por ejemplo, colecistoquinina, enteroglicano, galanina, polipéptido inhibidor gástrico, péptido liberador de gastrinas, gastrinas, pentagastrina, tetragastrina, motilina, péptido YY, secretina, péptido intestinal vasoactivo o sincalida.
Otros ejemplos más de carga biológicamente activa que pueden administrarse de acuerdo con la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, enzimas como hialuronidasa, estreptoquinasa, activador tisular del plasminógeno, uroquinasa, PGE-adenosina desaminasa; anestésicos intravenosos como droperidol, etomidato, citrato de fetanilo/droperidol, hexobarbital, ketamina HCl, metohexital Na, tiamilal Na, tiopental Na; antiepilépticos, por ejemplo, carbamazepina, clonazepam, divalproex Na, etosuximida, mefeniloína, parametadiona, feniloína, primidona. En varias realizaciones, la carga biológicamente activa es una enzima seleccionada de hialuronidasa, estreptoquinasa, activador tisular del plasminógeno, uroquinasa, PGE-adenosina desaminasa.
Una carga biológicamente activa como se describe en la presente también puede incluir un anticuerpo terapéutico y/o de diagnóstico, un fragmento de anticuerpo, un diacuerpo, un minicuerpo o un fragmento variable de cadena sencilla (por ejemplo, scFv) o una combinación de los mismos. Por ejemplo, una carga biológicamente activa como se describe en la presente puede ser un agente antifactor de necrosis tumoral alfa (anti-TNFa). Un agente anti-TNFa es un anticuerpo anti-TNFa o un fragmento funcional del mismo. Un anticuerpo Anti-TNFa puede ser adalimumab (Abbvie HUMIRA®, Drug Bank DB 00051) o infliximab (Centocor REMICADE®, Drug Bank Db 00065), o un fragmento funcional (por ejemplo, un fragmento de unión del mismo).
Otros ejemplos más de carga biológicamente activa que pueden administrarse de acuerdo con la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, agentes quimioterapéuticos, como quimioterapia o agentes antitumorales que son eficaces contra varios tipos de cánceres humanos, incluyendo leucemia, linfomas, carcinomas, sarcomas, mielomas, etc. como, por ejemplo, doxorrubicina, mitomicina, cisplatino, daunorrubicina, bleomicina, actinomicina Dy neocarzinostatina.
Otros ejemplos más de carga biológicamente activa que puede administrarse de acuerdo con la presente divulgación incluyen inhibidores de células T reguladoras (Tregs) como Tregs que expresan CD4, CD25 y Foxp3, y Tregs como Tr1, Th3, CD8+CD28-, células T restringidas Qa-1 y células Treg IL-17. Tales inhibidores de Treg se han estudiado y descrito ampliamente en la técnica (ver, por ejemplo, Casares et al, Journal of Immunology, 185(9): 5150-5159, 2010, y las referencias citadas en el mismo).
La TABLA 12 muestra secuencias de aminoácidos ejemplares de varias cargas heterólogas que pueden usarse en combinación con los métodos y composiciones divulgados en la presente. Por ejemplo, cualquiera de las moléculas de carga heterólogas que se muestran en la TABLA 12 a continuación puede combinarse con cualquier portador divulgado en la presente, por ejemplo, los portadores enumerados en la TABLA 2 y/o la TABLA 3 anteriores.
TABLA 12 - n i m l r min i r h r l
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Una molécula de carga de la presente divulgación puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 214 - SEQ ID NO: 220, por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma, y/o cualquier combinación de las mismas. Una molécula de carga de la presente divulgación puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 214 - SEQ ID NO: 220, por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma, y/o cualquier combinación de las mismas. Una molécula de carga de la presente divulgación puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 214 - SEQ ID NO: 220, por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma, y/o cualquier combinación de las mismas. Una molécula de carga de la presente divulgación puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 99% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 214 - SEQ ID NO: 220, por lo menos un 80% de identidad de secuencia con un fragmento funcional de la misma, y/o cualquier combinación de las mismas. Una molécula de carga de la presente divulgación puede comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 214 - SEQ ID NO: 220, un fragmento funcional de la misma y/o cualquier combinación de las mismas.
En general, una carga descrita y divulgada en la presente puede retenerse en una localización a la que se ha dirigido usando las composiciones descritas en la presente. La retención puede hacer que la molécula de carga provoque una determinada respuesta o efecto biológico (por ejemplo, un efecto terapéutico). La administración de una molécula (por ejemplo, una carga heteróloga) a una localización (por ejemplo, un compartimento intracelular o una región supranuclear) puede referirse a la retención de la molécula en esa localización. La retención de una molécula en una cierta región o compartimento intracelular o extracelular puede ser durante una cierta cantidad de tiempo, por ejemplo, por lo menos 2 minutos, por lo menos 5 minutos, por lo menos 10 minutos, por lo menos 15 minutos, a los 30 minutos o por lo menos 60 minutos. La retención de una molécula puede depender de varios factores, como la localización donde se retiene la molécula y/o los tipos de interacciones moleculares que se producen entre la molécula (por ejemplo, un portador, un constructo de administración y/o una carga heteróloga). Por ejemplo, la administración de una carga heteróloga a un compartimento basolateral a través de transcitosis a través de una célula epitelial polarizada puede comprender retener la carga heteróloga en la localización basolateral durante un tiempo suficiente para provocar un efecto determinado, como un efecto terapéutico en el caso de una carga terapéutica y/o biológicamente activa. Un constructo de administración puede configurarse para liberar una carga en una localización específica, por ejemplo, usando un espaciador dependiente del pH y/o dependiente de la enzima. Tras la liberación de una carga de un portador, la molécula de carga puede provocar un cierto efecto y/o respuesta. Por ejemplo, y en el caso de cargas biológica y/o terapéuticamente activas, dichas cargas pueden provocar sus efectos terapéuticos in vitro o in vivo tras la liberación del portador. Una carga también puede ser capaz de provocar una respuesta cuando todavía está unida al portador. Esto puede depender de la carga y/o el constructo de administración.
Una carga heteróloga puede ser un agente detectable, como una molécula fluorescente o una fracción radiactiva. Un agente detectable como se describe en la presente puede usarse para detectar la molécula a la que se acopla el agente detectable en varias localizaciones, por ejemplo, dentro de un sujeto o dentro de una célula. Un agente detectable también puede tener características y funciones adicionales, como propiedades terapéuticas o biológicas de otro tipo. Por ejemplo, un radionúclido acoplado a un portador como se describe en la presente puede permitir la detección del portador pero también puede tener propiedades terapéuticas, por ejemplo, como un radionúclido terapéutico. En general, un portador puede conjugarse, enlazarse o fusionarse con agentes detectables, como un fluoróforo, un tinte de infrarrojo cercano, un agente de contraste, una nanopartícula, una nanopartícula que contiene metal, un quelato de metal, un agente de contraste de rayos X, un agente de PET, un metal, un radioisótopo, un colorante, un quelante de radionucleidos u otro material adecuado que pueda usarse en imagenología.
Un constructo de administración puede comprender aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 agentes detectables. Los ejemplos no limitativos de radioisótopos que pueden usarse como agentes detectables incluyen emisores alfa, emisores beta, emisores de positrones y emisores gamma. El metal o radioisótopo puede seleccionarse del grupo que consiste de actinio, americio, bismuto, cadmio, cesio, cobalto, europio, gadolinio, iridio, plomo, lutecio, manganeso, paladio, polonio, radio, rutenio, samario, estroncio, tecnecio, talio e itrio. El metal puede ser actinio, bismuto, plomo, radio, estroncio, samario o itrio. El radioisótopo puede ser actinio-225 o plomo-212. Los colorantes del infrarrojo cercano que pueden usarse en combinación con los agentes de unión quiméricos descritos en la presente pueden no ser inactivados fácilmente por tejidos y fluidos biológicos. El fluoróforo puede ser un agente fluorescente que emite radiación electromagnética a una longitud de onda entre 650 nm y 4000 nm, tales emisiones sirviendo para detectar dicho agente. Los ejemplos no limitativos de colorantes fluorescentes que pueden usarse como molécula de conjugación en la presente divulgación incluyen DyLight-680, DyLight-750, VivoTag-750, DyLight-800, IRDye-800, VivoTag-680, Cy5.5 o indocianina verde (ICG). Los colorantes del infrarrojo cercano pueden incluir colorantes de cianina (por ejemplo, Cy7, Cy5.5 y Cy5). Los ejemplos no limitativos adicionales de colorantes fluorescentes para su uso como una molécula de conjugación en la presente divulgación pueden incluir naranja o amarillo de acradina, Alexa Fluors (por ejemplo, Alexa Fluor 790, 750, 700, 680, 660 y 647) y cualquier derivado de los mismos, 7-actinomicina D, ácido 8-anilinonaftaleno-1-sulfónico, colorante ATTO y cualquier derivado del mismo, tinción de auramina-rodamina y cualquier derivado de la misma, bensantrona, bimane, 9-10-bis(feniletinil)antraceno, 5,12-bis(feniletinil)nattaceno, bisbenzimida, brainbow, calceína, carbofluoresceína y cualquier derivado de la misma, 1-cloro-9,10-bis(feniletinil)antraceno y cualquier derivado del mismo, DAPI, DiOC6, DyLight Fluors y cualquier derivado de los mismos, epicocconona, bromuro de etidio, FlAsH-EDT2, colorante Fluo y cualquier derivado del mismo, FluoProbe y cualquier derivado del mismo, fluoresceína y cualquier derivado de la misma, Fura y cualquier derivado del mismo, GelGreen y cualquier derivado del mismo, GelRed y cualquier derivado del mismo, proteínas fluorescentes y cualquier derivado de las mismas, proteínas de isoforma m y cualquier derivado de las mismas como mCherry, colorante de hetametina y cualquier derivado de la misma, tinción de Hoeschst, iminocumarina, amarillo indio, indo-1 y cualquier derivado del mismo, laurdan, amarillo lucifer y cualquier derivado del mismo, luciferina y cualquier derivado de la misma, luciferasa y cualquier derivado de la misma, mercocianina y cualquier derivado de la misma, colorantes nilo y cualquier derivado de los mismos, perileno, floxina, ficocolorante y cualquier derivado del mismo, yoduro de propio, piranina, rodamina y cualquier derivado de los mismos, ribogreen, RoGFP, rubreno, estilbeno y cualquier derivado de los mismos, sulforhodamina y cualquier derivado de la misma, SYBR y cualquier derivado del mismo, sinapto-pHluorin, tetrafenil butadieno, tetrasodium tris, rojo Texas, amarillo Titan, TSQ, umbeliferona, violantrona, proteína fluorescente amarilla y YOYO-1. Otros colorantes fluorescentes adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, fluoresceína y colorantes de fluoresceína (por ejemplo, isotiocianina de fluoresceína o FITC, naftofluoresceína, 4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína, 6-carboxifluoresceína o FAM, etc.), carbocianina, merocianina, colorantes de estiril, colorantes de oxonol, ficoeritrina, eritrosina, eosina, colorantes de rodamina (por ejemplo, carboxitetrametil-rodamina o TAMRA, carboxirodamina 6G, carboxi-X-rodamina (ROX), lisamina rodamina B, rodamina 6G, verde de rodamina, rojo de rodamina, tetrametilrodamina (TMR), etc.), colorantes de cumarina y cumarina (por ejemplo, metoxicumarina, dialquilaminocumarina, hidroxicumarina, aminometilcumarina (AMCA), etc.), colorantes verdes de Oregón (por ejemplo, verde de Oregón 488, verde de Oregón 500, verde de Oregón 514, etc. .), rojo Texas, rojo-X Texas, ROJO s PeCTRUM, VERDE SPECTRUM, colorantes de cianina (por ejemplo, CY-3, Cy-5, CY-3.5, CY-5.5, etc.), colorantes ALEXA FLUOR (por ejemplo, ALEXA FLUOR 350, ALEXA FLUOR 488, ALEXA FLUOR 532, ALEXA FLUOR 546, ALEXA FLUOR 568, ALEXA FLUOR 594, ALEXA FLUOR 633, ALEXA FLUOR 660, ALEXA FLUOR 680, etc.), colorantes BODIPY (por ejemplo, BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY TMR, BODIPY TR, BODIPY 530/550, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, etc.), IRDyes (por ejemplo, IRD40, IRD 700, IRD 800, etc.), y similares. Los agentes detectables adecuados adicionales se describen en el PCT/US14/56177. Los ejemplos no limitativos de radioisótopos incluyen emisores alfa, emisores beta, emisores de positrones y emisores gamma. El metal o radioisótopo puede seleccionarse del grupo que consiste de actinio, americio, bismuto, cadmio, cesio, cobalto, europio, gadolinio, iridio, plomo, lutecio, manganeso, paladio, polonio, radio, rutenio, samario, estroncio, tecnecio, talio e itrio. El metal puede ser actinio, bismuto, plomo, radio, estroncio, samario o itrio. El radioisótopo puede ser actinio-225 o plomo-212. Además, pueden usarse los siguientes radionúclidos para diagnóstico y/o terapia: carbono (por ejemplo, 11C o 14C), nitrógeno (por ejemplo, 13N), flúor (por ejemplo, 18F), galio (por ejemplo, 67Ga o 68Ga), cobre (por ejemplo, 64Cu o 67Cu), circonio (por ejemplo, 89Zr), lutecio (por ejemplo, 177Lu).
Un constructo de administración como se divulga en la presente puede conjugarse, acoplarse o fusionarse con un radiosensibilizador o fotosensibilizador. Los ejemplos de radiosensibilizadores pueden incluir, pero no se limitan a: ABT-263, ABT-199, WEHI-539, paclitaxel, carboplatino, cisplatino, oxaliplatino, gemcitabina, etanidazol, misonidazol, tirapazamina y derivados de bases de ácidos nucleicos (por ejemplo, purinas o pirimidinas halogenadas, como la 5-fluorodesoxiuridina). Los ejemplos de fotosensibilizadores pueden incluir, pero no se limitan a: moléculas o perlas fluorescentes que generan calor cuando se iluminan, nanopartículas, porfirinas y derivados de porfirinas (por ejemplo, clorinas, bacterioclorinas, isobacterioclorinas, ftalocianinas y naftalocianinas), metaloporfirinas, metaloftalocianinas, angelicinas, colorantes de calcogenapirrilio, clorofilas, cumarinas, flavinas y compuestos relacionados como aloxazina y riboflavina, fullerenos, feofórbidos, pirofeofórbidos, cianinas (por ejemplo, merocianina 540), feofitinas, safirinas, texafirinas, purpurinas, porficenos, fenotiazinios, derivados de azul de metileno, naftalimidas, derivados del azul del Nilo, quinonas, perilenoquinonas (por ejemplo, hipericinas, hipocrelinas y cercosporinas), psoralenos, quinonas, retinoides, rodaminas, tiofenos, verdines, colorantes de xanteno (por ejemplo, eosinas, eritrosinas, rosa de bengala), formas diméricas y oligoméricas de porfirinas y profármacos como el ácido 5-aminolevulínico. Ventajosamente, este enfoque puede permitir un direccionamiento altamente específico de células enfermas (por ejemplo, células cancerosas) usando tanto un agente terapéutico (por ejemplo, un fármaco) como energía electromagnética (por ejemplo, radiación o luz) concurrentemente. Las proteínas de la presente divulgación puede conjugarse, acoplarse, fusionarse, o acoplarse covalentemente o no covalentemente con el agente, por ejemplo, directamente o mediante un espaciador.
Un radionúclido puede unirse a un portador o constructo de administración como se describe en la presente utilizando un quelante. Las fracciones quelantes ejemplares pueden incluir ácido 2,2',2"-(3-(4-(3-(1-(4-(1,2,4,5-tetrazin-3-il)fenil)-1-oxo-5,8,11,14,17,20,23-heptaoxa-2-azapentacosan-25-il)tioureido)bencil)-1,4,7-triazonano-2,5,8-triil)triacético; ácido 2,2',2"-(3-(4-(3-(1-(4-(1,2,4,5-tetrazin-3-il)fenil)-1-oxo-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-undecaoxa-2- azaheptatriacontan-37-il)tioureido)bencil)-1,4,7-triazonano-2,5,8-triil)triacético; ácido 2,2'-(7-(4-(3-(1-(4-(1,2,4,5-tetrazin-3-il)fenil)-1-oxo-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-undecaoxa-2-azaheptatriacontan-37-il)tioureido)bencil)-1.4.7- triazonano-1,4-diil)diacético; ácido 2,2',2"-(3-(4-(3-(1-(4-(1,2,4,5-tetrazin-3-il)fenil)-3,7-dioxo-11,14,17,20,23,26,29-heptaoxa-2,8-diazahentriacontan-31-il)tioureido)bencil)-1,4,7-triazonano-2,5,8-triil)triacético; ácido 2,2',2"-(3-(4-(3-(1-(4-(1,2,4,5-tetrazin-3-il)fenil)-3,7-dioxo-11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-undecaoxa-2,8-diazatritetracontan-43-il)tioureido)bencil)-1,4,7-triazonano-2,5,8-triil)triacético; ácido 2,2',2"-(3-(4-(3-(25,28-dioxo-28-((6-(6-(piridin-2-il)-1,2,4,5-tetrazin-3-il)piridin-3-il)amino)-3,6,9,12,15,18,21-heptaoxa-24-zaoctacosil)tioureido)bencil)-1.4.7- triazonano-2,5,8-triil)triacético; 2,2',2"-(3-(4-(3-(37,40-dioxo-40-((6-(6-(piridin-2-il)-1,2,4,5-tetrazina -3-il)piridin-3-il)amino)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-undecaoxa-36-azatetracontil)tioureido)bencil)-1,4 ácido,7-triazonano-2,5,8-triil)triacético; ácido 2,2',2"-(3-(4-(1-(4-(6-metil-1,2,4,5-tetrazina)-3-il)fenil)-3-oxo-6,9,12,15,18,21,24-heptaoxa-2-azaheptacosan-27-amido)bencil)-1,4,7-triazonano-2,5,8-triil)triacético; ácido 2,2,2"-(2-(4-(1-(4-(6-metil-1,2,4,5-tetrazin-3-il)fenoxi)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-undecaoxahexatriacontan-36-amido)bencil)-1,4,7-triazonano-1,4,7-triil)triacético; ácido 2,2',2"-(3-(4-(3-(5-amino-6-((4-(6-metil-1,2,4,5-tetrazin-3-il)bencil)amino)-6-oxohexil)tioureido)bencil)-1,4,7-triazono-2,5,8-triil)triacético; ácido 2,2'-(7-(4-(3-(5-amino-6-((4-6-metil-1,2,4,5-tetrazin-3- il)bencil)amino)-6-oxohexil)tioureido)bencil)-1,4,7-triazono-1,4-diil)diacético; ácido 2,2',2"-(3-(4-(3-(5-amino-6-((5-amino-6-((4-(6-metil-1,2,4,5-tetrazina-3-il)bencil)amino)-6-oxohexil)amino)-6-oxohexil)tioureido)bencil)-1,4,7-triazonano-2,5,8-triil)triacético y ácido 2,2',2"-(3-(4-(3-(5-amino-6-((5-amino-6-((5-amino-6-((4-(6-metil-1 ,2,4,5-tetrazin-3-il)bencil)amino)-6-oxohexil)amino)-6-oxohexil)amino)-6-oxohexil)tioureido)bencil)-1,4,7-triazonano-2 ,5,8-triil)triacético.
Usos
La presente divulgación proporciona métodos y composiciones para el transporte y/o la administración de una molécula de carga a ciertas localizaciones dentro de una célula (por ejemplo, una localización supranuclear) o a través de una célula (por ejemplo, una célula epitelial), ya sea in vitro o in vivo. (por ejemplo, en un roedor o un humano). Dicha carga puede dirigirse a un conjunto de localizaciones acoplándola a una molécula portadora. Tal molécula portadora puede interactuar con receptores únicos tanto en la superficie celular como intracelularmente para la administración dirigida de la carga. Varios de tales portadores, cargas y usos de los mismos se describen en la presente.
En la presente se contemplan constructos de administración que pueden usarse para administrar una carga a una localización dentro de una célula (por ejemplo, una célula epitelial) o a través de una célula (por ejemplo, una célula epitelial). Tales portadores pueden ser una molécula pequeña, un polipéptido, un aptámero, un anticuerpo, un ácido nucleico, un fragmento de cualquiera de los anteriores, o una combinación de cualquiera de los anteriores. Los constructos de administración descritos en la presente pueden usarse para varias aplicaciones, que incluyen pero no se limitan a, aplicaciones terapéuticas, preventivas y/o de diagnóstico. Tales aplicaciones terapéuticas, preventivas y/o diagnósticas pueden proporcionarse si, por ejemplo, las moléculas de carga terapéuticamente activas se acoplan a los portadores descritos en la presente que permiten la administración dirigida a varias localizaciones (por ejemplo, en un sujeto como un humano).
Composiciones farmacéuticas y métodos de administración
Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se refieren a composiciones para la administración a un sujeto humano. Las composiciones farmacéuticas comprenden los constructos de administración de origen no natural enumerados en la presente, solos o en combinación. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender moléculas adicionales capaces de alterar las características de los constructos de administración de origen no natural, por ejemplo, estabilizando, modulando y/o activando su función. La composición puede, por ejemplo, estar en forma sólida o líquida y puede estar, entre otros, en forma de (a) polvos, (a) comprimidos, (a) soluciones o (a) aerosoles. La composición farmacéutica de la presente divulgación puede, opcional y adicionalmente, comprender un portador farmacéuticamente aceptable. "Portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un relleno, diluyente, material de encapsulación y cualquiera de los portadores, tampones y excipientes farmacéuticos estándar, sólido, semisólido o líquido no tóxico como una solución salina tamponada con fosfato, una solución acuosa al 5% de dextrosa, y emulsiones, como una emulsión de aceite/agua o agua/aceite, y varios tipos de agentes humectantes y/o adyuvantes.
Las composiciones farmacéuticas generalmente se formulan apropiadamente para el uso inmediato previsto para el constructo de administración. Por ejemplo, si el constructo de administración no se va a administrar inmediatamente, el constructo de administración puede formularse en una composición adecuada para el almacenamiento. Una de tales composiciones es una preparación liofilizada del constructo de administración junto con un estabilizante adecuado. Alternativamente, la composición de constructo de administración puede formularse para almacenamiento en una solución con uno o más estabilizantes adecuados. Puede usarse cualquier estabilizante conocido por un experto en la técnica sin limitación. Por ejemplo, los estabilizantes adecuados para las preparaciones liofilizadas incluyen, pero no se limitan a, azúcares, sales, surfactantes, proteínas, agentes caotrópicos, lípidos y aminoácidos. Los estabilizantes adecuados para preparaciones líquidas incluyen, pero no se limitan a, azúcares, sales, surfactantes, proteínas, agentes caotrópicos, lípidos y aminoácidos. Los estabilizantes específicos que pueden usarse en las composiciones incluyen, pero no se limitan a, trehalosa, albúmina sérica, fosfatidilcolina, lecitina y arginina. Otros compuestos, composiciones y métodos para estabilizar una preparación líquida o liofilizada de los constructos de administración pueden encontrarse, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 6.573.237, 6.525.102, 6.391.296, 6.255.284, 6.133.229, 6.007.791, 5.997.856, y 5.917.021.
Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se formulan para administración oral. Las composiciones farmacéuticas formuladas para administración oral aprovechan la capacidad de la toxina bacteriana para mediar en la transcitosis a través del epitelio gastrointestinal (GI) y/o la administración al interior de una célula del epitelio GI (por ejemplo, intestino). Se anticipa que la administración oral de estas composiciones farmacéuticas dará como resultado la absorción del constructo de administración a través de células epiteliales polarizadas de la mucosa digestiva, por ejemplo, la mucosa intestinal, seguido de la liberación de la carga biológicamente activa en el lado basolateral de la membrana mucosa. En varias realizaciones, la célula epitelial se selecciona del grupo que consiste de células epiteliales nasales, células epiteliales orales, células epiteliales intestinales, células epiteliales rectales, células epiteliales vaginales y células epiteliales pulmonares. Las composiciones farmacéuticas de la divulgación pueden incluir la adición de un potenciador de la transcitosis para facilitar la transferencia de la proteína de fusión a través del epitelio GI. Tales potenciadores son conocidos en la técnica. Ver Xia et al., (2000) J. Pharmacol. Experiment. Therap., 295:594-600; y Xia et al. (2001) Pharmaceutical Res., 18(2):191-195.
Sin querer estar limitados por ninguna teoría, se supone que una vez que se transportan a través del epitelio GI, los constructos de administración de la divulgación mostrarán una vida media prolongada en el suero, es decir, la carga biológicamente activa de los constructos de administración mostrará una vida media prolongada en el suero en comparación con la carga biológicamente activa en su estado no fusionado. Como tales, las formulaciones orales de las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se preparan de tal manera que sean adecuadas para el transporte al epitelio GI y la protección del constructo de administración en el estómago. Tales formulaciones pueden incluir componentes portadores y dispersantes y pueden estar en cualquier forma adecuada, incluyendo aerosoles (para administración oral o pulmonar), jarabes, elixires, comprimidos, incluyendo comprimidos masticables, cápsulas duras o blandas, trociscos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas u oleosas, emulsiones, granulados de obleas o sedimentos y polvos dispersables. En varias realizaciones, las composiciones farmacéuticas se emplean en formas de dosificación sólidas, por ejemplo, comprimidos, cápsulas o similares, adecuadas para la administración oral simple de dosificaciones precisas.
La formulación oral puede comprender un constructo de administración y uno o más compuestos que pueden proteger el constructo de administración mientras está en el estómago. Por ejemplo, el compuesto protector debería ser capaz de prevenir la hidrólisis ácida y/o enzimática del constructo de administración. En varias realizaciones, la formulación oral comprende un constructo de administración y uno o más compuestos que pueden facilitar el tránsito del constructo desde el estómago al intestino delgado. El uno o más compuestos que pueden proteger el constructo de administración de la degradación en el estómago también pueden facilitar el tránsito del constructo desde el estómago al intestino delgado. Por ejemplo, la inclusión de bicarbonato de sodio puede ser útil para facilitar el movimiento rápido de los materiales administrados por vía intragástrica desde el estómago hasta el duodeno, como se describe en Mrsny y col., Vaccine 17:1425-1433, 1999. Otros métodos para formular composiciones de tal manera que los constructos de administración puedan atravesar el estómago y ponerse en contacto con las membranas epiteliales polarizadas en el intestino delgado incluyen, pero no se limitan a, tecnologías de recubrimiento entérico como se describe en DeYoung, Int J Pancreatol, 5 Suppl: 31- 6, 1989 y los métodos proporcionados en las Patentes de Estados Unidos N° 6.613.332, 6.174.529, 6.086.918, 5.922.680, y 5.807.832.
Las composiciones farmacéuticas destinadas al uso oral pueden prepararse de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y tales composiciones pueden contener uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste de agentes edulcorantes para proporcionar una preparación farmacéuticamente elegante y apetecible. Por ejemplo, para preparar comprimidos administrables por vía oral, el constructo de administración se mezcla con por lo menos un excipiente farmacéutico y la formulación sólida se comprime para formar una comprimido de acuerdo con métodos conocidos, para la administración al tracto gastrointestinal. La composición del comprimido se formula típicamente con aditivos, por ejemplo, un portador de sacárido o celulosa, un aglutinante como pasta de almidón o metilcelulosa, un relleno, un disgregante, u otros aditivos típicamente usados habitualmente en la fabricación de preparaciones médicas. Para preparar cápsulas administrables por vía oral, la DHEA se mezcla con por lo menos un excipiente farmacéutico y la formulación sólida se coloca en un recipiente capsular adecuado para la administración al tracto gastrointestinal. Las composiciones que comprenden constructos de administración pueden prepararse como se describe de manera general en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton Pa. 18042) en el Capítulo 89.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse como comprimidos administrables por vía oral que contienen constructos de administración mezclados con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos, que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Estos excipientes pueden ser diluyentes inertes, como carbonato cálcico, carbonato sódico, lactosa, fosfato cálcico o fosfato sódico; agentes de granulación y disgregación, por ejemplo, almidón de maíz, gelatina o acacia, y agentes lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Los comprimidos pueden estar sin recubrir o pueden recubrirse con técnicas conocidas para retrasar la disgregación y la absorción en el tracto gastrointestinal y, por lo tanto, proporcionar una acción sostenida durante un período de tiempo más prolongado. Por ejemplo, puede emplearse un material retardador de tiempo como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo solo o con una cera.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse como cápsulas de gelatina dura en donde el constructo de administración se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato cálcico, fosfato cálcico o caolín, o como cápsulas de gelatina blanda en donde el constructo de administración se mezcla con un medio acuoso u oleoso, por ejemplo, aceite de maní, aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.
Las suspensiones acuosas pueden contener un constructo de administración en la mezcla con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Tales excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato sódico, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma arábiga; los agentes dispersantes o humectantes pueden ser un fosfátido natural, por ejemplo, lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo, estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo, heptadeciletiloxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol como monooleato de polioxietilen sorbitol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo monooleato de polioxietilen sorbitán. Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservantes, por ejemplo, phidroxibenzoato de etilo o n-propilo, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes aromatizantes y uno o más agentes edulcorantes como sacarosa o sacarina.
Las suspensiones oleosas pueden formularse suspendiendo el constructo de administración en un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de maní, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, o en un aceite mineral como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo, cera de abejas, parafina dura o alcohol cetílico. Pueden añadirse agentes edulcorantes, como los expuestos anteriormente, y agentes aromatizantes para proporcionar una preparación oral apetecible. Estas composiciones pueden conservarse mediante la adición de un antioxidante como el ácido ascórbico.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de oliva o aceite de maní, o un aceite mineral, por ejemplo, goma arábiga o goma tragacanto, fosfátidos de origen natural, por ejemplo, lecitina de soja, y ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de sorbitán, y productos de condensación de los mismos ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo, monooleato de polioxietilensorbitán. Las emulsiones también pueden contener agentes edulcorantes y aromatizantes.
La composición farmacéutica puede estar en forma de comprimido o cápsula, y el comprimido o cápsula puede recubrirse o encapsularse para proteger una carga terapéutica o biológicamente activa de la acción enzimática en el estómago y para asegurar que haya suficiente carga biológicamente activa para que sea absorbida por el sujeto para producir una respuesta eficaz. Tales métodos de recubrimiento o encapsulación incluyen, por ejemplo, encapsulación en nanopartículas compuestas de polímeros con una estructura principal hidrófoba y ramificaciones hidrófilas como portadores de fármacos, encapsulación en micropartículas, inserción en liposomas en emulsiones, y conjugación con otras moléculas. En algunos casos, la cápsula o comprimido libera el constructo de administración de manera dependiente del pH. Las cápsulas o comprimidos usados para administrar un constructo de administración como se describe en la presente pueden comprender uno o más recubrimientos entéricos.
Los ejemplos de nanopartículas incluyen nanopartículas mucoadhesivas recubiertas con quitosano y Carbopol (Takeuchi et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 47(1):39-54, 2001) y nanopartículas que contienen poliésteres combinados cargados, poli(2-sulfobutil-vinil alcohol) y poli(ácido D,L-láctico-co-glicólico) (Jung et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 50(1): 147-160, 2000).
Pueden usarse comprimidos encapsulados o recubiertos que liberan una carga biológicamente activa capa por capa, liberando de este modo la carga biológicamente activa durante un marco temporal predeterminado mientras se mueve a lo largo del tracto gastrointestinal. Además, los comprimidos que comprenden la carga biológicamente activa pueden colocarse dentro de un comprimido más grande, protegiendo de este modo el comprimido interno de las condiciones ambientales y de procesamiento, como la temperatura, los agentes químicos (por ejemplo, solventes), el pH y la humedad. El comprimido exterior y los recubrimientos sirven además para proteger la carga biológicamente activa en el entorno gástrico.
Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden formularse para administración oral usando microesferas de poliéster, microesferas de zeína, microesferas de proteinoides, microesferas de policianoacrilato y sistemas basados en lípidos (ver, por ejemplo, DiBase y Morrel, Oral Delivery of Microencapsulated Proteins, en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 255-288 (Plenum Press 1997)).
Los agentes activos de superficie o surfactantes promueven la absorción de polipéptidos a través de la membrana o el revestimiento de la mucosa. Los agentes activos de superficie o surfactantes útiles incluyen ácidos grasos y sales de los mismos, sales biliares, fosfolípidos o un sacárido de alquilo. Los ejemplos de ácidos grasos y sales de los mismos incluyen sales de sodio, potasio y lisina de caprilato (Ce), caprato (C10), laurato (C12) y miristato (C14). Los ejemplos de sales biliares incluyen ácido cólico, ácido quenodesoxicólico, ácido glucocólico, ácido taurocólico, ácido glucoquenodesoxicólico, ácido tauroquenodesoxicólico, ácido desoxicólico, ácido glucodesoxicólico, ácido taurodesoxicólico, ácido litocólico y ácido ursodesoxicólico. Los ejemplos de fosfolípidos incluyen fosfolípidos de cadena sencilla, como lisofosfatidilcolina, lisofosfatidilglicerol, lisofosfatidiletanolamina, lisofosfatidilinositol y lisofosfatidilserina; o fosfolípidos de cadena doble, como diacilfosfatidilcolinas, diacilfosfatidilgliceroles, diacilfosfatidiletanolaminas, diacilfosfatidilinositoles y diacilfosfatidilserinas. Los ejemplos de sacáridos de alquilo incluyen glucósidos de alquilo o maltósidos de alquilo, como glucósido de decilo y maltósido de dodecilo.
La presente divulgación se refiere a métodos y composiciones que permiten administrar por vía oral las composiciones farmacéuticas de la divulgación. Sin pretender estar limitados por ninguna teoría o mecanismo de acción en particular, se cree que la administración oral de los constructos de administración da como resultado la absorción del constructo de administración a través de células epiteliales polarizadas de la mucosa digestiva, por ejemplo, la mucosa intestinal, seguido de la escisión del constructo de administración y la liberación de la carga biológicamente activa en el lado basolateral de la membrana mucosa. Por tanto, cuando la carga biológicamente activa ejerce una actividad biológica en el hígado, como, por ejemplo, actividades mediadas por la unión de IL-10 a su receptor afín, se cree que la carga biológicamente activa ejerce un efecto superior al esperado en base a las concentraciones en plasma observadas en el sujeto, es decir, la administración oral del constructo de administración puede administrar una concentración eficaz más alta de la carga biológicamente activa administrada al hígado del sujeto de la que se observa en el plasma del sujeto.
La presente divulgación se refiere a métodos de administración oral de las composiciones farmacéuticas de la divulgación. Tales métodos pueden incluir, pero no se limitan a, pasos de administrar oralmente las composiciones por parte del paciente o un cuidador. Tales pasos de administración pueden incluir la administración en intervalos como una o dos veces al día dependiendo del constructo de administración, la enfermedad o el estado del paciente o el paciente individual. Tales métodos también incluyen la administración de varias dosificaciones del constructo de administración individual. Por ejemplo, la dosificación inicial de una composición farmacéutica puede estar en un nivel más alto para inducir un efecto deseado, como la reducción de los niveles de glucosa en sangre. Luego, las dosificaciones posteriores pueden disminuirse una vez que se logra el efecto deseado. Tales cambios o modificaciones en los protocolos de administración pueden realizarse por el médico tratante o el personal sanitario.
Estas composiciones farmacéuticas pueden administrarse al sujeto en una dosis adecuada. El régimen de dosificación puede ser determinado por el médico tratante en base a factores clínicos específicos. Como es bien sabido en las técnicas médicas, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto particular que se va a administrar, el sexo, el momento y la vía de administración, la salud general y otros fármacos que se estén administrando al mismo tiempo. La cantidad terapéuticamente eficaz para una situación dada se determinará fácilmente mediante experimentación rutinaria y está dentro de las capacidades y el juicio del practicante clínico o médico ordinario. El experto en la técnica sabe que la cantidad eficaz de una composición farmacéutica administrada a un individuo dependerá, entre otras cosas, de la naturaleza de la carga biológicamente activa. La duración del tratamiento necesaria para observar los cambios y el intervalo posterior al tratamiento para que se produzcan las respuestas variaran dependiendo del efecto deseado. Las cantidades particulares pueden determinarse mediante pruebas convencionales, que son bien conocidas por el experto en la técnica.
La cantidad de carga biológicamente activa es una cantidad eficaz para lograr el propósito del agente activo particular. La cantidad en la composición típicamente es una cantidad farmacológica, biológica, terapéutica o químicamente eficaz. Sin embargo, la cantidad puede ser menor que una cantidad farmacológica, biológica, terapéutica o químicamente eficaz cuando la composición se usa en una forma de unidad de dosificación, como una cápsula, un comprimido o un líquido, porque la forma de unidad de dosificación puede contener una multiplicidad de composiciones de portador/agente biológica o químicamente activo o puede contener una cantidad dividida farmacológica, biológica, terapéutica o químicamente eficaz. Las cantidades eficaces totales pueden administrarse en unidades acumulativas que contienen, en total, cantidades farmacológica, biológica, terapéutica o químicamente activas de carga biológicamente activa.
Como se usa en la presente, se pretende que los términos "coadministración", "coadministrado" y "en combinación con", en referencia a los constructos de administración de la divulgación y uno o más agentes terapéuticos distintos, signifiquen, y se refieran e incluyan lo siguiente: la administración simultánea de dicha combinación de constructos de administración de la divulgación y agentes terapéuticos a un paciente con necesidad de tratamiento, cuando tales componentes se formulan juntos en una sola forma de dosificación que libera dichos componentes sustancialmente al mismo tiempo a dicho paciente; administración sustancialmente simultánea de tal combinación de constructos de administración de la divulgación y agentes terapéuticos a un paciente con necesidad de tratamiento, cuando tales componentes se formulan por separado en formas de dosificación separadas que dicho paciente toma sustancialmente al mismo tiempo, después de lo cual dichos componentes se liberan sustancialmente al mismo tiempo a dicho paciente; administración secuencial de dicha combinación de constructos de administración de la divulgación y agentes terapéuticos a un paciente con necesidad de tratamiento, cuando dichos componentes se formulan por separado en formas de dosificación separadas que dicho paciente toma en momentos consecutivos con un intervalo de tiempo significativo entre cada administración, después de lo cual dichos componentes se liberan en momentos sustancialmente diferentes a dicho paciente; y la administración secuencial de dicha combinación de constructos de administración de la divulgación y agentes terapéuticos a un paciente con necesidad de tratamiento, cuando tales componentes se formulan juntos en una única forma de dosificación que libera dichos componentes de una manera controlada tras lo cual se liberan de manera concurrente, consecutiva y/o superpuesta en el mismo momento y/o en momentos diferentes a dicho paciente, en donde cada parte se administra por la misma vía o por una diferente.
Una terapia de combinación puede comprender la administración de la composición del constructo de administración aislado y la composición del segundo agente simultáneamente, ya sea en la misma composición farmacéutica o en composiciones farmacéuticas separadas. En varias realizaciones, la composición de constructo de administración aislado y la composición del segundo agente se administran secuencialmente, es decir, la composición de constructo de administración aislado se administra antes o después de la administración de la composición del segundo agente.
Una administración de la composición de constructo de administración aislado y la composición del segundo agente pueden ser concurrentes, es decir, el período de administración de la composición de constructo de administración aislado y la composición del segundo agente se superponen entre sí.
Una administración de la composición del constructo de administración aislado y la composición del segundo agente puede ser no concurrente. Por ejemplo, en varias realizaciones, la administración de la composición del constructo de administración aislado finaliza antes de que se administre la composición del segundo agente. La composición del segundo agente de administración puede terminarse antes de que se administre la composición del constructo de administración aislado.
Usos terapéuticos
Las composiciones farmacéuticas formuladas para administración oral pueden usarse para tratar ciertas clases de enfermedades o condiciones médicas que son particularmente susceptibles de formulación y administración oral. Tales clases de enfermedades o condiciones incluyen, por ejemplo, enfermedades o infecciones virales, cáncer, una enfermedad metabólica, obesidad, enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias, alergia, enfermedad de injerto contra huésped, infección microbiana sistémica, anemia, enfermedad cardiovascular, psicosis, enfermedades genéticas, enfermedades neurodegenerativas, trastornos de las células hematopoyéticas, enfermedades del sistema endocrino o de los sistemas reproductivos, enfermedades gastrointestinales. En muchas enfermedades crónicas, las formulaciones orales de los constructos de administración de la divulgación son particularmente útiles porque permiten el cuidado y la terapia del paciente a largo plazo a través de la administración oral en el hogar sin depender de tratamientos inyectables o protocolos de fármacos.
Una composición farmacéutica de la presente divulgación puede comprender cualquiera de los constructos de administración descritos en la presente, que incluye cualquier combinación de portador, carga y/o espaciador descrito en la presente. Específicamente, los constructos de administración descritos en la presente permiten la administración oral, que puede ser seguida por el transporte del constructo de administración a través o dentro de una célula de un epitelio de un sujeto. Un constructo de administración que ha sido transportado a través de tal capa epitelial puede alcanzar posteriormente varias partes y/u órganos y/o tejidos dentro del sujeto. Un constructo de administración, y en varios casos la carga que comprende un constructo de administración, puede provocar un efecto al llegar a un compartimento submucosal. Por ejemplo, una carga biológicamente activa puede ser una carga capaz de provocar una respuesta inmunitaria, y por tanto un constructo de administración puede presentar dicha carga a la célula inmunitaria una vez que haya llegado a un compartimento submucosal.
La presente divulgación se refiere a métodos para el tratamiento, profilaxis y/o prevención de una enfermedad inflamatoria en un sujeto, que comprende administrar una composición farmacéutica de la presente divulgación al sujeto. Las "enfermedades inflamatorias" incluyen todas las enfermedades asociadas con inflamación aguda o crónica. La inflamación aguda es la respuesta inicial del organismo a los estímulos nocivos y resulta de un movimiento aumentado de plasma y leucocitos (como, por ejemplo, granulocitos) desde la sangre hacia los tejidos lesionados. Una serie de eventos bioquímicos propagan y maduran la respuesta inflamatoria, implicando al sistema vascular local, el sistema inmunitario y varias células dentro del tejido lesionado. A la inflamación prolongada se hace referencia como inflamación crónica, lo que lleva a un cambio progresivo en el tipo de células presentes en el sitio de la inflamación y se caracteriza por la destrucción y curación simultáneas del tejido del proceso inflamatorio. Las enfermedades inflamatorias pueden estar provocadas, por ejemplo, por quemaduras, irritantes químicos, congelación, toxinas, infección por patógenos, lesiones físicas, reacciones inmunitarias debidas a hipersensibilidad, radiación ionizante o cuerpos extraños, como por ejemplo astillas, suciedad y desechos. Los ejemplos de enfermedades inflamatorias son bien conocidos en la técnica.
Una enfermedad inflamatoria puede seleccionarse del grupo que consiste de enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis y sepsis bacteriana. El término "enfermedad inflamatoria intestinal", como se usa en la presente, se refiere a un grupo de afecciones inflamatorias del colon y del intestino delgado que incluyen, por ejemplo, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, la colitis colágena, la colitis linfocítica, la colitis isquémica, la colitis por derivación, el síndrome de Behcet y la colitis indeterminada. Los constructos de administración que pueden usarse para prevenir y/o tratar dicha enfermedad inflamatoria incluyen aquellas que comprenden la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 154 y/o la SEQ ID NO: 155.
La "enfermedad de Crohn", de acuerdo con la presente divulgación, es una enfermedad inflamatoria intestinal de células T auxiliares Tipo 1 (Th1), que tiene un patrón de respuesta inmunitaria que incluye una producción aumentada de interleucina-12, factor de necrosis tumoral (TNF) e interferón-y (Romagnani. Inflamm Bowel Dis 1999; 5:285-94), y que puede tener un impacto devastador sobre el estilo de vida de un paciente que la padece. Los síntomas comunes de la enfermedad de Crohn incluyen diarrea, calambres, dolor abdominal, fiebre e incluso sangrado rectal. La enfermedad de Crohn y las complicaciones asociadas con ella a menudo hacen que el paciente necesite cirugía, a menudo más de una vez. No hay una cura conocida para la enfermedad de Crohn, y las opciones de tratamiento eficaces a largo plazo son limitadas. Los objetivos del tratamiento son controlar la inflamación, corregir las deficiencias nutricionales y aliviar síntomas como el dolor abdominal, la diarrea y el sangrado rectal. Aunque el tratamiento puede ayudar a controlar la enfermedad disminuyendo la cantidad de veces que una persona experimenta una recurrencia, no existe una cura. El tratamiento puede incluir fármacos, suplementos nutricionales, cirugía o una combinación de estas opciones. Los tratamientos comunes que pueden administrarse para el tratamiento incluyen fármacos antiinflamatorios, que incluyen sulfasalazina, cortisona o esteroides, incluyendo la prednisona, supresores del sistema inmunitario, como 6-mercaptopurina o azatioprina, y antibióticos.
“Psoriasis”, de acuerdo con la presente divulgación, es una enfermedad que afecta a la piel y las articulaciones. Comúnmente provoca la aparición de parches escamosos rojos en la piel. Los parches escamosos provocados por la psoriasis, llamados placas psoriásicas, son áreas de inflamación y producción excesiva de piel. La piel se acumula rápidamente en estos sitios y adquiere una apariencia blanca plateada. Las placas se producen frecuentemente en la piel de los codos y las rodillas, pero pueden afectar a cualquier área, incluyendo el cuero cabelludo y los genitales. Se supone que la psoriasis es inmunomediada y no es contagiosa. El trastorno es una afección crónica recurrente, que varía en gravedad desde parches localizados menores hasta la cobertura total del cuerpo. Las uñas de las manos y los pies se ven afectadas con frecuencia (distrofia de las uñas psoriásica), y puede verse como un hallazgo aislado. La psoriasis también puede provocar inflamación de las articulaciones, lo que se conoce como artritis psoriásica. Del diez al quince por ciento de las personas con psoriasis tienen artritis psoriásica.
El término "sepsis bacteriana", como se usa en la presente, se refiere a afecciones potencialmente mortales resultantes de la circulación de bacterias en el torrente sanguíneo. La sepsis da como resultado una producción sistémica generalizada de citoquinas proinflamatorias que da como resultado daño tisular y, en última instancia, shock séptico debido a la falla de la microcirculación.
La presente divulgación se refiere a métodos para el tratamiento, profilaxis y/o prevención de una enfermedad autoinmune en un sujeto, que comprende administrar una composición farmacéutica de la presente divulgación al sujeto. Una enfermedad autoinmune, en lo que se refiere a la presente divulgación, es una enfermedad o trastorno que surge de y se dirige contra los propios tejidos de un individuo o un cosegregado o manifestación de la misma o condición resultante de la misma. En varias realizaciones la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste de lupus eritematoso sistémico (SLE), pénfigo vulgar, miastenia grave, anemia hemolítica, púrpura trombocitopénica, enfermedad de Grave, enfermedad de Sjogren, dermatomiositis, enfermedad de Hashimoto, polimiositis, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple (MS), diabetes mellitus, artritis reumatoide, y esclerodermia. Los constructos de administración ejemplares que pueden usarse para tratar esas enfermedades pueden incluir aquellas que comprenden cualquier portador expuesto en las SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125 acoplado a, por ejemplo, un anticuerpo anti-TNFa, o un fragmento de unión funcional del mismo.
"Artritis reumatoide", de acuerdo con la presente divulgación, es un trastorno autoinmune que hace que el sistema inmunitario del cuerpo ataque las articulaciones de los huesos (Muller B et al., Springer Semin. Immunopatol., 20:181-96, 1998). La artritis reumatoide es un trastorno inflamatorio sistémico crónico que puede afectar a muchos tejidos y órganos, pero ataca principalmente a las articulaciones sinoviales. El proceso produce una respuesta inflamatoria de la sinovial (sinovitis) secundaria a hiperplasia de las células sinoviales, exceso de líquido sinovial y desarrollo de pannus en la sinovial. La patología del proceso de la enfermedad a menudo lleva a la destrucción del cartílago articular y la anquilosis de las articulaciones. La artritis reumatoide también puede producir inflamación difusa en los pulmones, el pericardio, la pleura y la esclerótica, y también lesiones nodulares, más comunes en el tejido subcutáneo debajo de la piel.
La presente divulgación se refiere a métodos y composiciones para el tratamiento, profilaxis y/o prevención de un cáncer en un sujeto, que comprende administrar una composición farmacéutica de la presente divulgación al sujeto. Los cánceres a tratar incluyen, pero no se limitan a, linfomas no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemia linfocítica crónica, leucemia de células pilosas, leucemia linfoblástica aguda, mieloma múltiple, carcinomas de páncreas, colon, intestino gástrico, próstata, vejiga, riñón ovario, cuello uterino, mama, pulmón, nasofaringe, melanoma maligno y NHL resistente a rituximab y leucemia.
La cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica de la presente divulgación se administrará en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos. Tales agentes terapéuticos pueden aceptarse en la técnica como un tratamiento estándar para un estado de enfermedad particular como se describe en la presente, como una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmune o un cáncer. Los ejemplos de agentes terapéuticos contemplados incluyen, pero no se limitan a, citoquinas, factores de crecimiento, esteroides, NSAID, DMARD, agentes antiinflamatorios, quimioterapéuticos, radioterapéuticos u otros agentes activos y auxiliares.
La presente divulgación se refiere a métodos para el tratamiento, profilaxis y/o prevención de un trastorno metabólico en un sujeto, que comprende administrar una composición farmacéutica de la presente divulgación al sujeto. En varias realizaciones, el trastorno metabólico se selecciona del grupo que consiste de: diabetes, obesidad, diabetes como consecuencia de la obesidad, hiperglucemia, dislipidemia, hipertrigliceridemia, síndrome X, resistencia a la insulina, tolerancia a la glucosa alterada (IGT), dislipidemia diabética e hiperlipidemia.
La presente divulgación se refiere a métodos para el tratamiento, profilaxis y/o prevención de una enfermedad del hígado graso (por ejemplo, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD); esteatohepatitis no alcohólica (NASH)), una enfermedad gastrointestinal o una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto, que comprende administrar una composición farmacéutica de la presente divulgación al sujeto.
La presente divulgación se refiere a métodos y composiciones para el tratamiento, profilaxis y/o prevención de un trastorno del crecimiento por deficiencia de GH en un sujeto, dicho método comprendiendo administrar una composición farmacéutica de la presente divulgación al sujeto. En varias realizaciones, el trastorno se selecciona del grupo que consiste de: deficiencia de la hormona del crecimiento (GHD), síndrome de Turner (TS), síndrome de Noonan, síndrome de Prader-Willi, deficiencia del gen que contiene homeobox de baja estatura (SHOX), insuficiencia renal crónica, y baja estatura idiopática, síndrome de intestino corto, deficiencia de GH debida a tumores hipofisarios raros o su tratamiento, y enfermedad de desgaste muscular asociada con el VIH/SIDA.
Un sujeto de la presente divulgación puede ser un humano o un roedor. El sujeto puede ser un humano. Un sujeto puede verse afectado por uno o más de los siguientes: enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, sepsis bacteriana, lupus eritematoso sistémico (SLE), pénfigo vulgar, miastenia grave, anemia hemolítica, púrpura trombocitopénica, enfermedad de Grave, enfermedad de Sjogren, dermatomiositis, enfermedad de Hashimoto. polimiositis, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple (MS), diabetes mellitus, artritis reumatoide, esclerodermia, linfomas no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemia linfocítica crónica, leucemia de células pilosas, leucemia linfoblástica aguda, mieloma múltiple, carcinomas de vejiga, riñón, ovario, cuello uterino, mama, pulmón, nasofaringe, melanoma maligno, NHL resistente a rituximab o leucemia, diabetes, obesidad, diabetes como consecuencia de la obesidad, hiperglucemia, dislipidemia, hipertrigliceridemia, síndrome X, resistencia a la insulina, tolerancia a la glucosa alterada (IGT), dislipidemia diabética, hiperlipidemia, deficiencia de la hormona del crecimiento (GHD), síndrome de Turner (TS), síndrome de Noonan, síndrome de Prader-Willi, deficiencia del gen que contiene homeobox de baja estatura (SHOX), insuficiencia renal crónica o síndrome de intestino corto idiopático de baja estatura.
Los métodos y composiciones descritos en la presente también pueden usarse para diagnosticar enfermedades o afecciones. El diagnóstico de una enfermedad o afección puede incluir modalidades de diagnóstico invasivas y no invasivas. Específicamente, las composiciones descritas en la presente pueden usarse para el diagnóstico no invasivo de una enfermedad, por ejemplo, midiendo la expresión de un determinado marcador (por ejemplo, un biomarcador) o antígeno. Tales diagnósticos pueden realizarse acoplando una carga a un portador, en donde la carga puede tener una afinidad de unión por un determinado marcador (por ejemplo, una biomolécula representativa cuya presencia o concentración en un determinado órgano, tejido o célula es representativa de una determinada enfermedad o afección). Los diagnósticos que se describen en la presente pueden comprender además monitorizar una respuesta a un tratamiento (por ejemplo, el tratamiento de un sujeto). Por ejemplo, si la respuesta a un tratamiento se correlaciona con una reducción de un determinado marcador (por ejemplo, un biomarcador), los constructos de administración de la presente divulgación pueden usarse para medir dicho marcador en una determinada localización (por ejemplo, una determinada población de células inmunitarias en un compartimento submucosal). Además de los diagnósticos no invasivos, los métodos y composiciones descritos en la presente pueden usarse para proporcionar información biológica y/o terapéuticamente relevante, por ejemplo, después de que se haya tomado una muestra de biopsia de un sujeto, que puede estar seguida por inmunohistoquímica, por ejemplo, la detección de acumulación de constructos de administración en un determinado tejido, etc.
El diagnóstico no invasivo puede comprender imagenología molecular y/o nuclear. Por ejemplo, un constructo de administración puede comprender una carga que está marcada con un compuesto fluorescente y/o radiactivo de tal manera que la localización y/o la concentración de dicho constructo de administración pueda determinarse en un sujeto después de la administración. Puede usarse cualquier fracción con aplicabilidad diagnóstica como se describe aquí para proporcionar agentes diagnósticos y/o teranósticos (terapéuticos y de diagnóstico).
Polinucleótidos que codifican constructos de administración
Los métodos y composiciones de la presente divulgación proporcionan polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica constructos de administración de origen no natural y/o polipéptidos de constructos de administración híbridos. Estos polinucleótidos son útiles, por ejemplo, para elaborar constructos de administración y/o polipéptidos de constructos de administración híbridos. La divulgación proporciona un sistema de expresión que comprende una secuencia de polinucleótidos recombinante que codifica un dominio de unión al receptor del portador bacteriano y un sitio de inserción de poliespaciador para una secuencia polinucleotídica que codifica una carga biológicamente activa. El sitio de inserción del poliespaciador puede estar en cualquier parte de la secuencia de polinucleótidos siempre que la inserción del poliespaciador no altere el constructo de administración de la toxina bacteriana. El sistema de expresión puede comprender una secuencia de polinucleótidos que codifica un espaciador escindible de tal manera que la escisión en el espaciador escindible separe una carga biológicamente activa codificada por un ácido nucleico insertado en el sitio de inserción del poliespaciador de la fracción del constructo de administración codificada. Por tanto, en realizaciones en las que el sitio de inserción del poliespaciador está en un extremo del constructo codificado, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un espaciador escindible entre el sitio de inserción del poliespaciador y el resto del polinucleótido. En realizaciones en las que el sitio de inserción del poliespaciador no está al final del constructo codificado, el sitio de inserción del poliespaciador puede estar flanqueado por secuencias de nucleótidos que codifican cada una un espaciador escindible.
Varios métodos in vitro que pueden usarse para preparar un polinucleótido que codifica un constructo de administración útil en los constructos de administración de la divulgación incluyen, pero no se limitan a, transcripción inversa, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), el sistema de amplificación basado en la transcripción (TAS), el sistema de replicación de secuencias autosostenido (3SR) y el sistema de amplificación de replicasa QP (QB). Puede usarse cualquier técnica conocida por un experto en la técnica que sea útil en la construcción de ácidos nucleicos recombinantes. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica la proteína o una porción de la misma puede aislarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa de ADNc usando cebadores basados en la secuencia de ADN de un constructo de administración o un nucleótido que codifica el dominio de unión al receptor.
La orientación para el uso de estas metodologías de clonación y amplificación in vitro se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 4.683.195; Mullis et al., 1987, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.
51:263; and Erlich, ed., 1989, PCR Technology, Stockton Press, NY. Los polinucleótidos que codifican un constructo de administración, o una parte del mismo, también pueden aislarse mediante la detección genómica de bibliotecas de ADNc usando sondas seleccionadas de las secuencias del polinucleótido deseado en condiciones de hibridación rigurosas, moderadamente rigurosas o muy rigurosas.
Además, los polinucleótidos también pueden codificar una secuencia secretora en el extremo terminal amino del constructo de administración codificado. Tales constructos son útiles para producir los constructos de administración en células de mamífero, ya que simplifican el aislamiento del constructo de administración y/o de los polipéptidos del constructo de administración híbrido.
Además, los polinucleótidos de la divulgación también abarcan versiones derivadas de polinucleótidos que codifican un constructo de administración. Tales derivados pueden prepararse mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica sin limitación. Por ejemplo, los derivados pueden fabricarse mediante mutagénesis específica del sitio, incluyendo la sustitución, inserción o eliminación de uno, dos, tres, cinco, diez o más nucleótidos, de los polinucleótidos que codifican el constructo de administración. Alternativamente, los derivados pueden elaborarse mediante mutagénesis aleatoria. Un método para mutagenizar aleatoriamente un ácido nucleico comprende amplificar el ácido nucleico en una reacción de PCR en presencia de MnCh 0,1 mM. y concentraciones desequilibradas de nucleótidos. Estas condiciones aumentan la tasa de incorporación imprecisa de la polimerasa usada en la reacción de PCR y dan como resultado una mutagénesis aleatoria del ácido nucleico amplificado.
Por consiguiente, la divulgación proporciona un polinucleótido que puede codificar uno o más constructos de administración. Un constructo de administración comprende un portador bacteriano y una carga biológicamente activa para ser administrada a un sujeto; y, opcionalmente, un espaciador no escindible o escindible. La escisión en el espaciador escindible puede separar la carga biológicamente activa del resto del constructo de administración. El espaciador escindible puede ser escindido por una enzima que está presente en una membrana basolateral de una célula epitelial polarizada del sujeto o en el plasma del sujeto.
El polinucleótido puede hibridarse en condiciones de hibridación rigurosas con cualquier polinucleótido de esta divulgación. El polinucleótido puede hibridarse en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que codifica cualquier constructo de administración de la divulgación.
La divulgación proporciona vectores de expresión para expresar los constructos de administración y/o polipéptidos de constructos de administración híbridos. En general, los vectores de expresión son moléculas de polinucleótidos recombinantes que comprenden secuencias de control de la expresión enlazadas operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido. Los vectores de expresión pueden adaptarse fácilmente para funcionar en procariotas o eucariotas mediante la inclusión de promotores, secuencias de replicación, marcadores seleccionables, etc. apropiados para dar como resultado una transcripción y traducción o ARNm estables. Las técnicas para la construcción de vectores de expresión y la expresión de genes en células que comprenden los vectores de expresión son bien conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning--A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., and Ausubel et al., eds., Edición actual, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY.
Los promotores útiles para su uso en vectores de expresión incluyen, entre otros, un promotor de metalotioneína, un promotor tardío principal de adenovirus constitutivo, un promotor de MMTV inducible por dexametasona, un promotor de SV40, un promotor de MRP pol III, un promotor de MPSV constitutivo, un promotor cd CMV inducible por tetraciclina (como el promotor de CMV temprano-inmediato humano) y un promotor de CMV constitutivo.
Los vectores de expresión deben contener señales de expresión y replicación compatibles con la célula en la que se expresan los constructos de administración. Los vectores de expresión útiles para expresar constructos de administración incluyen vectores virales como retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados, vectores plasmídicos, cósmidos y similares. Se prefieren los vectores virales y plasmídicos para transfectar los vectores de expresión en células de mamífero. Por ejemplo, el vector de expresión pcDNA1 (Invitrogen, San Diego, CA), en el que la secuencia de control de la expresión comprende el promotor CMV, proporciona buenas tasas de transfección y expresión en tales células.
Los vectores de expresión pueden introducirse en la célula para la expresión de los constructos de administración mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica sin limitación. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, la captación directa de la molécula por una célula de la solución; captación facilitada a través de lipofección usando, por ejemplo, liposomas o inmunoliposomas; transfección mediada por partículas; etc. Ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 5.272.065; Goeddel et al., eds, 1990, Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc., CA; Krieger, 1990, Gene Transfer and Expression--A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning--A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; y Ausubel et al., eds., Edición actual, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY.
Los vectores de expresión también pueden contener una fracción de purificación que simplifica el aislamiento de los polipéptidos del constructo de administración y/o del constructo de administración híbrido. Por ejemplo, puede incorporarse una fracción de polihistidina de, por ejemplo, seis residuos de histidina en el extremo terminal amino de la proteína. La fracción de polihistidina permite el aislamiento conveniente de la proteína en un solo paso mediante cromatografía de quelato de níquel. En varias realizaciones, la fracción de purificación puede escindirse del resto del constructo de administración después de la purificación. En otras realizaciones, la fracción no interfiere con la función de los dominios funcionales del constructo de administración y, por lo tanto, no es necesario escindirla.
La presente divulgación proporciona una célula que puede comprender un vector de expresión para la expresión de los constructos de administración y/o los polipéptidos del constructo de administración híbrido, o porciones de los mismos. La célula puede seleccionarse por su capacidad para expresar altas concentraciones del constructo de administración para facilitar la purificación de la proteína. En varias realizaciones, la célula es una célula procariótica, por ejemplo, E. coli. Como se describe en los ejemplos, los constructos de administración se pliegan correctamente y comprenden los enlaces disulfuro apropiados cuando se expresan en E. coli. La célula es una célula eucariota. Las células eucariotas útiles incluyen células de levadura y de mamífero. Puede usarse cualquier célula de mamífero conocida por un experto en la técnica que sea ser útil para expresar un polipéptido recombinante, sin limitación, para expresar los constructos de administración. Por ejemplo, para expresar los constructos de administración pueden usarse células de ovario de hámster chino (ChO). Los constructos de administración y/o los polipéptidos de constructos de administración híbridos de la divulgación pueden producirse mediante recombinación, como se describe a continuación. Sin embargo, los constructos de administración también pueden producirse mediante síntesis química usando métodos conocidos por los expertos en la técnica.
Los constructos de administración de la presente divulgación pueden producirse usando una variedad de métodos. La selección de un método de producción puede depender de la estructura molecular del constructo de administración y/o sus componentes (por ejemplo, el portador, la carga y/o el espaciador). Por tanto, para algunos constructos de administración, los métodos sintéticos orgánicos pueden ser ventajosos para producir tal constructo de administración. Un constructo de administración de la presente divulgación puede ser un polipéptido. Tales polipéptidos pueden producirse, por ejemplo, usando metodología de ADN recombinante. En general, esto implica crear una secuencia de ADN que codifique el constructo de administración, colocar el ADN en un casete de expresión bajo el control de un promotor particular, expresar la molécula en un huésped, aislar la molécula expresada y, si es necesario, plegar la molécula en una forma conformacional activa.
El ADN que codifica los constructos de administración descritos en la presente puede prepararse mediante cualquier método adecuado incluyendo, por ejemplo, la clonación y la restricción de secuencias apropiadas o la síntesis química directa mediante métodos como el método del fosfotriéster de Narang et al. (1979) Meth. Enzymol.
68: 90-99; el método del fosfodiéster de Brown et al. (1979) Met. Enzymol. 68: 109-151; el método de la dietilfosforamidita de Beaucage et al. (1981) Tetra. Lett., 22: 1859-1862); el método de soporte sólido de la Patente de Estados Unidos N° 4.458.066, y similares.
La síntesis química produce un oligonucleótido de cadena sencilla. Esto puede convertirse en ADN de cadena doble por hibridación con una secuencia complementaria o por polimerización con una ADN polimerasa usando la cadena sencilla como plantilla. Un experto reconocería que aunque la síntesis química de ADN se limita a secuencias de aproximadamente 100 bases, pueden obtenerse secuencias más largas mediante la unión de secuencias más cortas.
Alternativamente, pueden clonarse las subsecuencias y las subsecuencias apropiadas pueden escindirse usando enzimas de restricción apropiadas. Luego, los fragmentos pueden ligarse para producir la secuencia de ADN deseada. Un ADN que codifica un constructo de administración de la presente divulgación puede clonarse usando métodos de amplificación de ADN como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Así, por ejemplo, el gen para la carga biológicamente activa se amplifica por PCR, usando un cebador de sentido que contiene el sitio de restricción para, por ejemplo, NdeI y un cebador antisentido que contiene el sitio de restricción para HindIII. Esto puede producir un ácido nucleico que codifica la secuencia de carga biológicamente activa y que tiene sitios de restricción terminales. Un constructo de administración que tiene sitios de restricción "complementarios" pueden clonarse de manera similar y luego ligarse a la carga biológicamente activa y/o a un espaciador unido a la carga biológicamente activa. La ligadura de las secuencias de ácidos nucleicos y la inserción en un vector produce un vector que codifica la carga biológicamente activa unida al dominio de unión al receptor del portador bacteriano. En varias realizaciones, el ADN que codifica los constructos de administración de la presente divulgación se sintetizan artificialmente, por ejemplo, mediante síntesis de ADN en fase sólida.
Los métodos de producción descritos en la presente pueden usarse para producir los constructos de administración de la presente divulgación, o variantes (funcionales) de los mismos. Por ejemplo, una "Cholix" (también referida en la presente como toxina Cholix o exotoxina Cholix) puede abarcar una variedad de variantes funcionales (por ejemplo, un género funcional), en donde las variantes funcionales pueden comprender una o más variaciones en su secuencia de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 1 como se divulga en la presente. Por tanto, en la presente divulgación, la toxina Cholix que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 se usa como secuencia de referencia cuando se hace referencia a Cholix. Sin embargo, como se describe en la presente, la presente divulgación no se limita a la Cholix que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, sino que abarca todas las variantes de Cholix que se encuentran dentro del género funcional de Cholix. Por ejemplo, una variante de la exotoxina Cholix con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 puede ser una exotoxina Cholix cuya secuencia de aminoácidos se expone en la SEQ ID NO: 2, en donde ambas variantes son capaces de llevar a cabo la mismas funciones, por ejemplo, transcitosis a través de una célula epitelial, e interactúan con los mismos receptores, como ribofilina 1, SEC24, CK-8, TMEM132, GRP75, ERGIC-53 y/o perlecán.
Además, el método de producción de un polipéptido puede afectar, hasta cierto punto, a la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido (por ejemplo, debido a modificaciones postraduccionales). Por ejemplo, un primer portador y un segundo portador se producen en el mismo sistema de expresión (por ejemplo, un sistema de expresión bacteriano como E. coli o un sistema de expresión de mamífero como una célula CHO). En otros casos, y como se describe en la presente, un primer portador y un segundo portador se producen en un sistema de expresión diferente (por ejemplo, un sistema de expresión bacteriano o de mamífero). Los sistemas de expresión bacterianos incluyen E. coli, y los sistemas de expresión de mamíferos incluyen células CHO, por ejemplo. Un polipéptido producido por bacterias puede comprender una caperuza N, en donde la caperuza N puede comprender una modificación más en el extremo N-terminal del polipéptido. Una caperuza N puede comprender un residuo de metionina N-terminal. Los ejemplos de polipéptidos de portadores derivados del dominio I de Cholix que pueden producirse por bacterias y que comprenden dicha metionina N-terminal incluyen aquellos que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID nO: 9, SeQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 107 y SEQ ID NO: 135.
Métodos experimentales
Pruebas de transcitosis. La función de transcitosis de los constructos de administración aislados puede probarse en función de la capacidad del constructo de administración para pasar a través de una membrana epitelial. Como la transcitosis requiere primero la unión a la célula epitelial, estos ensayos también pueden usarse para evaluar la función del constructo de administración del constructo de administración.
La actividad de transcitosis del constructo de administración puede probarse mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica, sin limitación. En varias realizaciones, la actividad de transcitosis puede probarse evaluando la capacidad de un constructo de administración para introducirse en una célula no polarizada a la que se une. En el caso del portador derivado de Cholix, y sin pretender estar limitado por ninguna teoría o mecanismo de acción en particular, se describe en la presente que la función de transcitosis que permite que un constructo de administración pase a través de una célula epitelial polarizada y la función de introducirse en células epiteliales no polarizadas reside en el mismo dominio, es decir, el dominio descrito en la presente como dominio I. Por tanto, la capacidad del constructo de administración para introducirse en la célula puede evaluarse, por ejemplo, detectando la presencia física del constructo en el interior de la célula. Por ejemplo, el constructo de administración puede marcarse, por ejemplo, con un marcador fluorescente, y el constructo de administración puede exponerse a la célula. Luego, las células pueden lavarse, eliminando cualquier constructo de administración que no se haya introducido en la célula, y se determina la cantidad de marcador restante. La detección del marcador en esta tracción indica que el constructo de administración se ha introducido en la célula.
La capacidad de transcitosis del constructo de administración puede probarse evaluando la capacidad del constructo de administración para pasar a través de una célula epitelial polarizada. Por ejemplo, el constructo de administración puede marcarse, por ejemplo, con un marcador fluorescente (por ejemplo, RFP) y ponerse en contacto con las membranas apicales de una capa de células epiteliales. La fluorescencia detectada en el lado basolateral de la membrana formada por las células epiteliales indica que el dominio de transcitosis funciona apropiadamente.
La transcitosis in vivo puede probarse usando ratas Wistar macho. Las ratas Wistar macho pueden alojarse de 3 a 5 por jaula con un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h y pueden pesar entre 225 y 275 g (aproximadamente de 6 a 8 semanas de edad) cuando se colocan en estudio. Los experimentos pueden realizarse durante la fase de luz usando un protocolo de no recuperación que usa anestesia continua con isoflurano. Puede realizarse una incisión abdominal de 4-5 cm en la línea media que expone las regiones del yeyuno medio. Pueden prepararse soluciones madre a 3,86 x 10-5 M de artículos de prueba en solución salina tamponada con fosfato (PBS), con 50 pl (por rata de 250 g) administrados mediante inyección intraluminal (ILI) usando una aguja de calibre 29. El mesenterio del lugar de la inyección puede marcarse luego con un marcador permanente. A la finalización del estudio, una región de 3-5 mm que capturó el segmento de intestino marcado puede aislarse y procesarse para evaluación microscópica. Los experimentos in vivo se realizan de acuerdo con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) del Reino Unido de 1986, la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas de 1986 (86/609/EEC) y los procedimientos de revisión ética de la Universidad de Bath.
Prueba de escisión del espaciador escindible. La función del espaciador escindible puede probarse generalmente en un ensayo de escisión. Puede usarse cualquier ensayo de escisión adecuado conocido por un experto en la técnica, sin limitación, para probar los espaciadores escindibles. Pueden usarse tanto ensayos basados en células como libres de células para probar la capacidad de una enzima para escindir los espaciadores escindibles.
Un ensayo libre de células ejemplar para probar la escisión de espaciadores escindibles comprende preparar extractos de células epiteliales polarizadas y exponer un constructo de administración marcado que lleva un espaciador escindible a la fracción del extracto que corresponde a las enzimas asociadas a la membrana. En tales ensayos, el marcador puede unirse a la carga biológicamente activa que se administrará o a la fracción del constructo de administración. Entre estas enzimas se encuentran las enzimas de escisión que se encuentran cerca de la membrana basolateral de una célula epitelial polarizada, como se ha descrito anteriormente. La escisión puede detectarse, por ejemplo, uniendo el constructo de administración, por ejemplo, con un anticuerpo y lavando las moléculas no unidas. Si el marcador se une a la carga biológicamente activa que se administrará, entonces debe observarse poco o ningún marcador en la molécula unida a los anticuerpos. Alternativamente, el agente de unión usado en el ensayo puede ser específico para la carga biológicamente activa y el resto del constructo puede estar marcado. En cualquier caso, puede evaluarse la escisión.
La escisión también puede probarse usando ensayos basados en células que prueban la escisión por células epiteliales polarizadas ensambladas en membranas semipermeables. Por ejemplo, un constructo de administración marcado, o una parte de un constructo de administración que comprende el espaciador escindible, puede ponerse en contacto con el lado apical o basolateral de una monocapa de células epiteliales adecuadas como, por ejemplo, células Caco-2, en condiciones que permiten la escisión del espaciador. La escisión puede detectarse detectando la presencia o ausencia del marcador usando un reactivo que se une específicamente al constructo de administración, o porción del mismo. Por ejemplo, puede usarse un anticuerpo específico para el constructo de administración para unir un constructo de administración que comprende un marcador distal al espaciador escindible con respecto a la porción del constructo de administración unida por el anticuerpo. Luego, puede evaluarse la escisión detectando la presencia del marcador en las moléculas unidas al anticuerpo. Si se ha producido escisión, debe observarse poco o ningún marcador en las moléculas unidas al anticuerpo. Al realizar tales experimentos, pueden identificarse las enzimas que se escinden preferiblemente en la membrana basolateral en lugar de la membrana apical y, además, puede confirmarse la capacidad de dichas enzimas para escindir el espaciador escindible en un constructo de administración.
Además, la escisión también puede probarse usando un ensayo informador de fluorescencia como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 6.759.207. Brevemente, en tales ensayos, el informador de fluorescencia se pone en contacto con el lado basolateral de una monocapa de células epiteliales adecuadas en condiciones que permiten que la enzima de escisión escinda el informador. La escisión del informador cambia la estructura del informador de fluorescencia, cambiándolo de una configuración no fluorescente a una configuración fluorescente. La cantidad de fluorescencia observada indica la actividad de la enzima de escición presente en la membrana basolateral.
Además, la escisión también puede probarse usando una sonda molecular inactivada intramolecularmente, como las descritas en la Patente de Estados Unidos N° 6.592.847. Tales sondas comprenden generalmente una fracción fluorescente que emite fotones cuando se excita con luz de longitud de onda apropiada y una fracción inactivadora que absorbe tales fotones cuando está muy cerca de la fracción fluorescente. La escisión de la sonda separa la fracción inactivadora de la fracción fluorescente, de tal manera que puede detectarse la fluorescencia, lo que indica que se ha producido la escisión. Por tanto, tales sondas pueden usarse para identificar y evaluar la escisión por enzimas de escisión particulares poniendo en contacto el lado basolateral de una monocapa de células epiteliales adecuadas con la sonda en condiciones que permitan que la enzima de escisión escinda la sonda. La cantidad de fluorescencia observada indica la actividad de la enzima de escisión que se está probando.
Estudios en Vivo. Las ratas Wistar macho, alojadas en grupos de 3-5 por jaula con un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h, pesaban 225-275 g (aproximadamente 6-8 semanas de edad) cuando se colocaron en estudio después de una noche en ayunas. Todos los experimentos se realizaron durante la fase de luz y se llevaron a cabo usando un protocolo de no recuperación que usó anestesia continua con isoflurano. Se realizó una incisión abdominal de 4-5 cm en la línea media para exponer el intestino delgado (desde el yeyuno medio hasta las regiones del íleon proximal). Se inyectaron por vía intraluminal soluciones madre equimolares de quimeras de truncamiento de exotoxina A (PE)-RPF o Cholix-RFP preparadas en solución salina tamponada con fosfato usando una aguja hipodérmica de calibre 29 en un volumen de 200 pl/kg (o ~50 pl por 250 g rata). El mesenterio adyacente de cada sitio de inyección intraluminal se marcó con un bolígrafo de tinta permanente. A intervalos de tiempo seleccionados, el animal fue sacrificado y se aisló una región de 3-5 mm que capturaba el segmento de intestino marcado. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) del Reino Unido de 1986, la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas de 1986 (86/609/EEC) y los procedimientos de revisión ética de la Universidad de Bath.
Microscopía. Los tejidos aislados se enjuagaron brevemente en PBS enfriado con hielo y luego se fijaron con paraformaldehído al 4% en hielo antes de marcarlos con anticuerpos primarios contra la exotoxina A (PE), Cholix o RFP. Se evaluó la distribución tisular de un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia que reconocía estos anticuerpos primarios usando un microscopio de fluorescencia Zeiss LSM 510. Se usó DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) como tinción nuclear.
Inmunohistoquímica. Rehidratar portaobjetos de tejido en concentraciones decrecientes de etanol. Los portaobjetos se sumergen en histoclear (x2), etanol al 100%, etanol al 90%, etanol al 80%, etanol al 70% y PBS durante 5 minutos cada uno. Los portaobjetos se hierven en citrato de sodio 10 mM (pH 6) durante 10 minutos. Retirar del fuego y dejar enfriar durante 20 minutos. Secar el portaobjetos y añadir un borde de cera alrededor de cada sección de tejido con un lápiz hidrofóbico ImmEdge. Lavar las secciones de tejido pipeteando PBS directamente sobre el tejido. Realizar lavados de 3 x 5 minutos. Permeabilizar el tejido pipeteando Triton x-100 al 0,2% en PBS en las secciones. Incubar a temperatura ambiente durante 45 minutos. Lavar 3 x 5 minutos con PBS. Bloquear las secciones de tejido pipeteando BSA al 2% y suero de burro al 2% en Triton x-100 al 0,1% en PBS en las secciones. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente. Retirar la solución de bloqueo y añadir los anticuerpos primarios. Diluir los anticuerpos a la concentración requerida en Triton x-100 al 0,05% y BSA al 1% en PBS. Incubar durante la noche a 4° C. Lavar 3 x 5 minutos con PBS. Incubar con anticuerpos secundarios. Diluir los anticuerpos a la concentración requerida en Triton x-100 al 0,05% y BSA al 1% en PBS. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente. Lavar 3 x 5 minutos con PBS. Incubar con DAPI 200 nM a temperatura ambiente durante 45 minutos. Lavar 3 x 5 minutos con PBS. Deshidratar las secciones de tejido sumergiéndolas en etanol al 70%, etanol al 100%, histoclear y etanol al 100% durante 5 minutos cada una. Colocar una gota de medio de montaje fluorshield en cada sección de tejido y cubrir con un cubreobjetos de vidrio. Aplicar presión suavemente sobre el cubreobjetos para eliminar las burbujas de aire. Permitir que los medios de montaje se sequen durante 4 horas. Guardar los portaobjetos a 4° C y obtener imágenes usando un microscopio fluorescente confocal.
Evaluación de las proteínas que interactúan con el dominio I de Cholix. Para identificar a los compañeros que interactúan con Cholix y/o PE (por ejemplo, receptores, enzimas, etc.) y establecer los compartimentos vesiculares donde interactúan con las exotoxinas Cholix o PE (por ejemplo, un dominio I de esas exotoxinas o una versión truncada del mismo), puede realizarse una serie de desplegables para identificar posibles socios de interacción que pueden ser seguidos por asociaciones in silico usando resonancia de plasmones superficiales, estudios de transcitosis in vitro que usan células epiteliales intestinales humanas Caco-2 polarizadas donde puede lograrse el silenciamiento genético de objetivos específicos, y estudios de transcitosis in vivo donde los elementos de Cholix y los receptores específicos pueden colocalizarse en estructuras vesiculares establecidas. Sin querer estar limitados por ninguna teoría, se supone que un proceso de transcitosis puede implicar elementos que normalmente están restringidos dentro de elementos vesiculares específicos de células epiteliales intestinales polarizadas pero que pueden ser reclutados o "secuestrados" por, por ejemplo, el dominio I de Cholix o versiones truncadas del mismo. para dejar el endosoma tardío y evitar la degradación lisosomal después de la endocitosis mediada por receptor apical.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos simplemente ilustran la divulgación y no se pretende que limiten la divulgación de ninguna manera.
EJEMPLO 1
Preparación de constructos de administración derivados de Cholix y PE
Este ejemplo describe la preparación ejemplar de constructos de administración que comprenden portadores de Cholix truncados (truncamiento en los dominios II y/o Ib) y portadores de PE truncados (truncamiento en los dominios II y/o Ib) unidos a cargas heterólogas. En este ejemplo, se prepararon varios constructos de administración de origen no natural como una única secuencia de aminoácidos y que comprendían una secuencia portadora de Cholix modificada y/o una secuencia portadora de PE modificada, una secuencia espaciadora peptídica de poliglicina-serina y una carga heteróloga.
Se prepararon y usaron los siguientes portadores de Cholix y/o PE modificados para preparar los constructos 1-12: 1) un portador de Cholix modificado truncado en el residuo de aminoácidos 425 de la SEQ ID NO: 1 (Cholix425, SEQ ID NO: 129); 2) un portador de Cholix modificado truncado en el residuo de aminoácidos 415 de la s Eq ID NO: 1 (Cholix415, SEQ ID NO: 130); 3) un portador de Cholix modificado truncado en el residuo de aminoácidos 397 de la SEQ ID NO: 1 (Cholix397, SEQ ID NO: 131); 4) un portador de Cholix modificado truncado en el residuo de aminoácidos 386 de la s Eq ID NO: 1 (Cholix386, SeQ ID NO: 132); 5) un portador de Cholix modificado truncado en el residuo de aminoácidos 291 de la SEQ ID NO: 1 (Cholix291, SeQ ID NO: 133); 6) un portador de Cholix modificado truncado en el residuo de aminoácidos 265 de la SEQ ID NO: 1 (Cholix265, SEQ ID NO: 4); 7) un portador de PE modificado truncado en el residuo de aminoácidos 404 de la SEQ ID NO: 3 (PE404, SEQ ID nO: 140); 8) un portador de PE modificado truncado en el residuo de aminoácidos 395 de la SEQ ID NO: 3 (PE395, SEQ ID NO: 141); 9) un portador de PE modificado truncado en el residuo de aminoácidos 375 de la SEQ ID NO: 3 (PE375, SEQ ID NO: 142); 10) un portador de PE modificado truncado en el residuo de aminoácidos 364 de la SEQ ID NO: 3 (PE364, SEQ ID NO: 143); 11) un portador de PE modificado truncado en el residuo de aminoácidos 277 de la SEQ ID NO: 3 (PE277, SEQ ID NO: 144); y 12) un portador de PE modificado truncado en el residuo de aminoácidos 252 de la SeQ ID NO: 3 (PE252, SEQ ID NO: 145). En cada Constructo 1-12, se usó el espaciador peptídico de poliglicina-serina GTGGS (SEQ ID NO: 201) para unir conjuntamente la proteína fluorescente roja (RFP, SEQ ID NO: 220) en el extremo C-terminal de cada toxina modificada. La RFP emuló la presencia de una carga biológicamente activa.
Los genes optimizados con codones se obtuvieron de una fuente comercial y se clonaron en el vector de expresión pET26(+) que se usó para transformar células de E. coli del componente b L21(DE3) usando el protocolo sugerido por el fabricante. Los clones se seleccionaron usando placas de kanamicina/agar que se incubaron durante la noche a 37° C. La expresión de proteínas en cultivos fermentados de clones seleccionados se consiguió mediante inducción con IPTG 1 mM. Las bacterias sedimentadas se lisaron para recoger cuerpos de inclusión que se lavaron extensamente en Tris 50 mM, EDTA 20 mM, Triton X-100 al 2,5%, NaCl 0,5 M, pH 8 antes de la solubilización facilitada por sonicación en Tris 100 mM, pH 8, guanidina HCl 7 M. Después de la centrifugación para sedimentar los materiales insolubles y la adición de ditiotreitol, las proteínas del sobrenadante se volvieron a plegar usando un tampón de mezcla que contenía Tris 100 mM, pH 8, L-arginina 0,5 M, urea 1 M, EDTA 2 mM, glutatión oxidado 1 mM (recién preparado) y glutatión reducido 1 mM (recién preparado) que se dializó a 4° C frente a Tris 25 mM, pH 8, urea 0,1 M y EDTA 1 mM. Después de una filtración de 0,45 pm, las proteínas deseadas se purificaron usando intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaño. Las muestras finales de proteína se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se almacenaron a -80° C.
EJEMPLO 2
Experimentos in vivo que evalúan las funciones de administración de moléculas portadoras derivadas de exotoxinas
Este ejemplo describe un estudio in vivo ejemplar para evaluar las funciones de tráfico y administración epiteliales de las moléculas portadoras derivadas de exotoxinas descritas en la presente.
Los estudios in vivo usaron ratas Wistar adultas macho de 7-8 semanas de edad con un peso medio de aproximadamente 250 g. Cuando fue necesario, los experimentos se realizaron usando un protocolo de no recuperación. En general, las ratas se anestesiaron con isoflurano inhalado y se sacrificaron, cuando fue necesario, con CO2 inhalado. Los experimentos se iniciaron haciendo una incisión abdominal de unos 4 cm de largo para acceder a la región del yeyuno medio del intestino delgado. Al hacer la incisión, se inyectaron aproximadamente 50 pl de una solución preparada que contenía el constructo de administración o los constructos de administración múltiple a una concentración de aproximadamente 1-1,5 mg/ml en la luz intestinal de un área sin alimentos a través de una aguja de calibre 27 usando una jeringuilla de 1 ml. El mesenterio adyacente al sitio de la inyección se marcó con un marcador y el intestino se devolvió a la cavidad abdominal, y la incisión se cerró con pinzas. En puntos temporales específicos, se recuperó el intestino inyectado, se aisló quirúrgicamente y se lavó con una solución isotónica de PBS.
Las muestras extirpadas y lavadas se fijaron (paraformaldehído al 4% en PBS) durante la noche a 4° C antes de la deshidratación a través de series graduadas de soluciones de etanol/agua e incubación durante la noche en cloroformo. Los tejidos deshidratados se sumergieron en cera, se seccionaron y se montaron en portaobjetos de polilisina y se procesaron para la recuperación de antígenos usando citrato de sodio. Posteriormente, las secciones se permeabilizaron con Triton-X100 al 0,2% en PBS antes de lavarlas tres veces en PBS y bloquear con BSA al 2% + suero al 2% del animal. Se generaron los anticuerpos secundarios. Los anticuerpos primarios se diluyeron en BSA al 1%, Triton-X100 al 0,1% en PBS y se incubaron durante la noche a 4° C en aire humidificado. Los anticuerpos secundarios fluorescentes se diluyeron en BSA al 1%, Triton-X100 al 0,1% en PBS y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente antes del procesamiento para microscopía confocal. En ocasiones, se recogió una sección de intestino de aproximadamente 1 cm en el sitio de la inyección para estudios bioquímicos.
EJEMPLO 3
Evaluación de proteínas marcadoras específicas para interacciones con constructos de administración derivados de Cholix durante la transcitosis y la administración intracelular
Este ejemplo muestra una lista ejemplar de proteínas o marcadores para compartimentos celulares específicos que se analizaron usando tinción inmunohistoquímica (IHC) y microscopía confocal de inmunofluorescencia y al evaluar los constructos de administración de la presente divulgación.
La siguiente TABLA 13 muestra marcadores proteicos específicos del compartimento celular ejemplares usados en la presente. Por ejemplo, los constructos de administración derivados de Cholix que comprenden una IL-10 como carga heteróloga se siguieron durante experimentos usando un anticuerpo monoclonal (mAb) contra IL-10 y/o un anticuerpo policlonal (pAb) producido contra el portador de Cholix (por ejemplo, un dominio truncado I).
TABLA 1 - M r r r ín ífi l m r im n l l r
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EJEMPLO 4
Administración transepitelial in vivo de portadores derivados de Cholix y PE truncados dentro del Dominio II o Dominio Ib
Este ejemplo describe el transporte transepitelial de constructos de administración que comprenden portadores de Cholix truncados (por ejemplo, truncamiento en los dominios II y/o Ib) y portadores de PE truncados (por ejemplo, truncamiento en el dominio II y/o Ib) unidos conjuntamente a cargas biológicamente activas a través del epitelio intestinal polarizado (por ejemplo, a través de transcitosis de apical a basolateral).
Usando las formas monoméricas aisladas purificadas de los varios constructos de administración preparados como se describe en el EJEMPLO 1, se realizaron una serie de estudios de transporte in vivos usando el modelo de inyección intraluminal de rata (ver la sección de métodos adicionales a continuación). En este análisis, una rata se mantiene bajo anestesia con isoflurano durante la duración de este estudio de no recuperación. Durante este tiempo, el intestino delgado se expone después de una incisión abdominal en la línea media y se selecciona una región del yeyuno medio, identificándose el mesenterio adyacente con un rotulador indeleble. En la localización, se usó un volumen de inyección de 50 j l para administrar ~5 |jg de los Constructos 7-12. La proteína de prueba se disolvió en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se inyectó usando una aguja de calibre 28. Después de la inyección intraluminal, el segmento de intestino delgado se devolvió a la cavidad abdominal y se recuperó en los períodos de tiempo establecidos.
Una vez recuperado, el segmento de tejido expuesto a los constructos 7-12 se enjuagó con PBS, se fijó ligeramente en paraformaldehído y se preparó para microscopía de fluorescencia (ver la sección de métodos adicional a continuación) donde el constructo de administración se detectó usando un policlonal contra PE o Cholix que fue reconocido usando un anticuerpo secundario marcado con un colorante rojo fluorescente. La presencia o ausencia de transporte para los Constructos 7-12 se representa en la FIG. 1 (Constructos 12 (FIG.1A-FIG. 1C), 11 (FIG.1D-FIG. 1F) y 10 (FIG.1G-FIG. 1I)) y FIG. 2 (Constructos 9 (FIG.2A-FIG. 2C)), 8 (FIG.2D-FIG. 2F) y 7 (FIG.2G-FIG. 2I)).
La captación de cada uno de los constructos 7-12 en una población limitada de células dentro de la lámina propia fue consistente con la observada previamente para PE de longitud completa. El descubrimiento de que se produjo un transporte transepitelial eficiente de PE a través del epitelio intestinal polarizado incluso para el constructo 12 (PE252 -RFP, por ejemplo, aminoácido con SEQ ID NO: 137 acoplado al aminoácido con SEQ ID NO: 220) fue sorprendente y notable., lo que sugiere que no solo puede lograrse el transporte transepitelial a través de células epiteliales intestinales polarizadas, sino también la orientación a células específicas dentro del compartimento submucoso por los elementos que se encuentran dentro del dominio I (SEQ ID NO: 137) de PE.
En base a los sorprendentes descubrimientos usando los constructos de PE 7-12, se evaluó el Constructo 6 (Cholix265-RFP), que comprende solo el dominio I de Cholix (SEQ ID NO: 4). La evaluación de inmunofluorescencia del transporte de Cholix265-RFP (por ejemplo, aminoácido de la SEQ ID NO: 4 o 5 acoplado a la SEQ ID NO: 220) a través del intestino delgado de rata in vivo produjo un resultado similar al observado con el constructo de PE 12. La evaluación usando un anticuerpo tanto para el componente de Cholix como de RFP se usó para demostrar que ambos elementos de la quimera estaban siendo transportados (ver, por ejemplo, FIG. 3). El patrón de tinción observado para estos dos anticuerpos fue similar, mostrando que ambos elementos se movieron a través del epitelio y terminaron en la misma población de células dentro de la lámina propia. Estos datos sugieren que el dominio I (SEQ ID NO: 4) de Cholix puede ser suficiente para transportar un cargamento de proteína (26,9 kDa) y administrarlo a una población celular seleccionada (FIG. 3A-FIG. 3F).
EJEMPLO 5
Transporte a través del yeyuno de rata de constructos quiméricos de Cholix-PE
En este ejemplo, se prepararon constructos de administración que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas en la s Eq ID NO: 146 (Constructo 13) y SEQ ID NO: 146 (Constructo 14) y se evaluaron como se ha descrito anteriormente en el EJEMPLO 2. Los constructos de Cholix-PE quiméricos de este ejemplo comprenden dominios mixtos I, II, Ib y III de la exotoxina Cholix o la exotoxina PE como se describe en la presente.
El constructo portador quimérico 13 (SEQ ID NO: 146) comprende un dominio I de Cholix derivado de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 (residuos de aminoácidos 1-265 de la SEQ ID NO: 2), un dominio de translocación PE II derivado de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 138, un dominio Ib de PE derivado de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 139, y un dominio III catalítico de PE no tóxico derivado de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 140. El constructo de portador quimérico 14 (SEQ ID NO: 147) comprende un dominio I de PE derivado de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 137, un dominio II de translocación de portador de Cholix derivado de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 126, un dominio Ib de portador de Cholix derivado de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 127, y un dominio catalítico III de portador de Cholix no tóxico derivado de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 128.
Como se muestra en la FIG. 4 (después de 1 minuto, FIG.4A-FIG. 4E) y FIG. 5 (después de 20 minutos, 5A-FIG. 5E) para el constructo 13 y la FiG. 6 (después de 1 minuto, 6A-FIG. 6E) y la FIG. 7 (después de 20 minutos, 7A-FIG. 7E) para el constructo 14, los constructos de portador quimérico son capaces de transportarse a través del yeyuno de rata y las células objetivo en la lámina propia in vivo. Por tanto, se demuestra en la presente que también los constructos de administración quiméricos que comprenden porciones o dominios de dos o más exotoxinas diferentes (por ejemplo, Cholix y PE) pueden administrar eficazmente la carga en y a través de las células epiteliales. EJEMPLO 6
Producción y primeros estudios de transporte in vivo de constructos de administración del dominio I de Cholix truncado
Este ejemplo demuestra la función de transcitosis de los polipéptidos portadores derivados de Cholix truncados en donde, de manera importante, el truncamiento se produjo en varias localizaciones dentro del dominio I de la exotoxina de Cholix.
Se usó el espaciador peptídico de poliglicina-serina no escindible GGGGGSGGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 210) para acoplar la hormona del crecimiento humano (HGH) (SEQ ID NO: 214) al extremo C-terminal de varios polipéptidos portadores de Cholix modificados para preparar los siguientes constructos de administración para la evaluación de acuerdo con el procedimiento de producción de proteínas descrito en el EJEMPLO 1 anterior (en este producido por bacterias): 1) SEQ ID NO: 160, que comprende un portador de Cholix modificado truncado en el residuo de aminoácidos 187 de la SEQ ID NO: 5; 2) SEQ ID NO: 159, que comprende un portador de Cholix modificado truncado en el residuo de aminoácidos 151 de la SEQ ID NO: 5; 3) SEQ ID NO: 158, que comprende un portador de Cholix modificado truncado en el residuo de aminoácidos 134 de la SEQ ID NO: 5; 4) SEQ ID NO: 161, que comprende un portador de Cholix modificado truncado en el residuo de aminoácidos 206 de la SEQ ID NO: 5; 5) SEQ ID NO: 162, que comprende un portador de Cholix modificado truncado en el residuo de aminoácidos 245 de la SEQ ID NO: 5; 6) SEQ ID NO: 163, que comprende un portador de Cholix modificado truncado en el residuo de aminoácidos 251 de la SEQ ID NO: 5; y 8) SEQ ID NO: 165, que comprende un portador de Cholix modificado que comprende los residuos de aminoácidos 40-187 de la SEQ ID NO: 5.
Para analizar las proteínas de fusión producidas, se inyectaron constructos en la luz del intestino delgado de ratas y se recogió el sitio de inyección 5, 10 o 15 minutos después de la inyección. El tejido se fijó y se seccionó, luego se tiñó con anticuerpos anti-Cholix y anti-HGH. Se usaron anticuerpos secundarios fluorescentes para visualizar la localización de la proteína usando microscopía confocal. como se muestra en la FIG. 8A-FIG. 8C,el constructo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 165 se visualizó en las células epiteliales y se limitó a un área cerca de la membrana en el lado apical de las células a los 5, 10 y 15 minutos. No hubo un movimiento significativo de la proteína a través de las células alejándose de este compartimento y no apareció ninguna proteína en la lámina propia. Esto sugiere que el portador polipeptídico con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 165 es suficiente para la captación en las células epiteliales, por ejemplo, a través de su sitio de unión al receptor y/o a través de interacciones con TMEM132 y/o LRP1, pero carece de la parte de la secuencia para la transcitosis, lo que resulta en la acumulación en las células epiteliales. En comparación, los constructos que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 161 - SEQ ID NO: 164 demostraron que se movían rápidamente a través de las células epiteliales después de la captación y el transporte fuera de las células hacia la lámina propia. como se muestra en la FIG. 9, el constructo derivado de Cholix con la SEQ ID NO: 160 también se visualizó en el compartimento apical de las células epiteliales a los 5 minutos. A los 10 y 15 minutos, pequeñas cantidades de la proteína se movieron hacia el lado basal de la célula, pero no aparecieron en la lámina propia.
Esto sugiere que el extremo N-terminal puede estar implicado en la ruta de transporte pero no es suficiente para completar la transcitosis a través de la célula. Los sorprendentes descubrimietos representados en la FIG. 8A-FIG. 8C y la FIG. 9 representan un método potencial para administrar específicamente una carga unida a estos truncamientos a las células epiteliales, ya que son absorbidos por las células pero no pueden transportarse y, por lo tanto, acumularse en el interior.
EJEMPLO 7
Transcitosis apical a basal in vitro de constructos de Cholix de longitud completa no tóxicos
Este ejemplo demuestra la transcitosis de apical a basolateral de un Cholix no tóxico modificado (ntChx) a través de células epiteliales intestinales polarizadas in vitro.
En este ejemplo, el constructo de Cholix se volvió no tóxico mediante una variación de un aminoácido de un residuo de ácido glutámico específico (sustituido con alanina) dentro del bolsillo enzimático para la ribosilación de ADP, lo que dio como resultado la sustitución E581Ay un polipéptido con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3 (ntChx).
Se midió el transporte a 37° C de Cholix E581A no tóxico (ntChx) a través de láminas confluentes (área de superficie de filtro de 0,6 cm2) de epitelio intestinal humano primario in vitro, con concentraciones de 2,5-200 pg/ml aplicadas a la superficie apical y se midió la cantidad de ntChx en el compartimento basal después de 2 h por ELISA (FiG. 10 A). El intervalo de concentración probado demostró una permeabilidad aparente para concentraciones apicales de ntChx de 2,5 a 20 pg/ml que fue aproximadamente 2 veces mayor que para concentraciones apicales superiores a 20 pg/ml, aunque todas las concentraciones demostraron eficiencias significativas para el transporte de esta proteína de ~70 kDa. La ruptura en las tasas de permeabilidad puede ser consistente con un mecanismo de transporte mediado por receptor que se saturó a -20 pg/ml para los sistemas de superficie de área de filtro de 0,6 cm2del epitelio intestinal humano primario utilizados para este estudio in vitro. Es importante destacar que la ntChx transportada no pareció modificarse significativamente (por ejemplo, modificarse químicamente) en su tamaño aparente cuando se evaluó mediante análisis de transferencia Western (FIG. 10B).
Un curso de tiempo que evaluó la transcitosis de ntChx a concentraciones de 5, 10 y 20 |jg/ml demostró que la transcitosis de ntChx comenzó a alcanzar una linealidad después de una fase de retardo de aproximadamente 20-25 minutos (FIG. 10C). Usando estos valores de transporte, se calculó que la permeabilidad para ntChx a 37° C a través del epitelio intestinal humano primario in vitro era de ~1,92 x 10-5 cm/seg. Esta tasa de permeabilidad se redujo cuando se realizó el mismo protocolo de transporte in vitro a 4° C (FIG. 10C). Se puede suponer que, con las cantidades de ntChx aplicadas apicalmente, la concentración apical de ntChx comienza a agotarse después de ~90 min en este modelo in vitro. Juntos, estos datos sugieren que ntChx se transporta a través de un proceso de transcitosis mediado por receptores, altamente eficiente y que requiere energía. Dicho proceso puede depender de la cantidad de ntChx capaz de interactuar con los receptores de la superficie apical (por ejemplo, la proteína 1 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP1)) implicada en la endocitosis que da como resultado el acceso a una vía de transcitosis que permanece privilegiada frente a un catabolismo significativo.
El pH de la superficie de la membrana apical del epitelio del intestino delgado puede estar entre 5 y 7 (17). Se observó que la transcitosis a través del epitelio intestinal humano primario in vitro analizada para 20 jg/ml y examinada después de 120 min era aproximadamente el doble de eficiente cuando el medio apical tenía un pH de 7 en comparación con un pH de 5, mientras que el pH basal de 7 o 5 no parecía tener efecto (FIG. 11).
Sin querer estar limitados por ninguna teoría, se asumió que la mayor variabilidad observada para los resultados donde se probó el pH apical de 5 en el transporte de ntChx puede deberse a los esfuerzos del epitelio para neutralizar este compartimento apical durante el curso del estudio que puede estar produciéndose justo en la membrana plasmática apical en estrecha proximidad al sitio de endocitosis del receptor de ntChx. En resumen, estos datos sugieren que la ntChx, como se divulga en la presente, puede ser capaz de transportarse de manera eficiente, constante y continua a través del epitelio intestinal humano a través de un proceso mediado por receptores que no puede dar como resultado una modificación significativa del tamaño de la proteína transportada.
EJEMPLO 8
Análisis de la vía de transcitosis de constructos de Cholix no tóxicos de longitud completa
Este ejemplo demuestra la transcitosis de apical a basolateral de ntChx (SEQ ID NO: 3) a través de células epiteliales intestinales polarizadas in vivo, examinando la capacidad de ntChx para transportar a través de un epitelio intestinal in vivo mediante inyección intraluminal directa (ILI) en yeyuno de rata.
Las imágenes microscópicas inmunofluorescentes mostraron que la ntChx, identificada usando un antisuero policlonal anti-Cholix, se introducía rápidamente en las células epiteliales y se transportaba a través de estas células epiteliales en estructuras de tipo vesicular que implicaban colocalizaciones de clatherina, y el proceso de transcitosis se completaba en minutos (FIG. 12A-FIG. 12C). Los cambios dependientes del tiempo en la localización de estructuras similares a vesículas positivas para ntChx demostraron su distribución dentro de compartimentos localizados por encima y por debajo del núcleo del enterocito, así como dentro de una población seleccionada de células dentro de la lámina propia. La transcitosis de ntChx parecía producirse también a través de células caliciformes. En este experimento no se observó transporte de ntChx entre células epiteliales adyacentes, la llamada ruta paracelular.
ILI de ntChx en yeyuno de rata parecía restringir la exposición a los segmentos superiores y la punta de las vellosidades intestinales.
EJEMPLO 9
La transcitosis de constructos de Cholix no tóxicos implica compartimentos vesiculares específicos Este ejemplo demuestra la transcitosis de apical a basolateral de ntChx (SEQ ID NO: 3) que implica el acceso a compartimentos vesiculares específicos (por ejemplo, FIG. 13A-FIG. 13F).
La transcitosis de ntChx puede implicar procesos de endocitosis mediados por receptores y el tráfico vesicular posterior que evita el destino típico de los ligandos internalizados por esta ruta de degradación lisosomal. Varios patógenos intracelulares obligados y facilitadores son capaces de subvertir las vías secretoras y endocíticas de las células huésped que restringen su exposición al lisosomal a través de proteínas efectoras capaces de manipular los procesos de las células huésped. Este ejemplo examinó vesículas que contenían ntChx que experimentaban transcitosis para determinar la identidad de las proteínas asociadas que pueden definir los elementos de tráfico y los compartimentos celulares que pueden estar implicados en la transcitosis de Chx y variantes de Chx como se divulga en la presente.
Tras la captación en la membrana plasmática apical, se observó que las vesículas positivas para ntChx se colocalizaban con la proteína Rab 5 relacionada con Ras y el antígeno endosomal temprano 1 (EEA1) (FIG. 13A), demostrando las características del endosoma temprano/endosoma de clasificación (Ee/SE), lo que sugiere que esta exotoxina puede introducirse en las células epiteliales intestinales a través de una endocitosis mediada por receptores. También se observaron poblaciones de vesículas positivas para EEA1 en el compartimento basal de los enterocitos, pero estas se asociaron menos fuertemente con la presencia de ntChx. FIG. 13A). La proteína Rab 11a relacionada con Ras, que se sabe que está asociada con el reciclaje de endosomas, se observó en los compartimentos apical y basal de los enterocitos, pero la colocalización de Rab 11a con vesículas que contienen ntChx se observó predominantemente en el compartimento basal (FIG. 13B). Además, puede considerarse que la red trans-Golgi (TGN) funciona como una estación de clasificación de vías secretoras, que dirige las proteínas recién sintetizadas a diferentes compartimentos celulares, identificándose TGN-38 como indicativo. Sorprendentemente, no se observó que ntChx se colocalizara con TGN-38 en enterocitos en este experimento, pero se colocalizó después de la transcitosis en células no polarizadas con la lámina propia (FIG. 13C). La calnexina es una chaperona de lectina localizada en el retículo endoplásmico (ER) que puede participar en la regulación de la concentración de Ca2+ citosólico libre. Durante la transcitosis, se descubrió que ntChx puede colocalizarse con calnexina principalmente en el compartimento apical de los enterocitos pero con distribuciones que incluyen el compartimento basal (FIG. 13D). Además, se observó que la proteína Rab 7 relacionada con Ras, un marcador de endosomas tardíos y vesículas que se transportan a los lisosomas, se colocalizó en las porciones apical y basal de los enterocitos con ntChx (FIG. 13E). Se observó que LAMP1 (proteína de membrana asociada a lisosomas 1), distribuida tanto en los endosomas tardíos como en los lisosomas, se colocaliza de manera similar con ntChx en las porciones apical y basal de los enterocitos, pero no parece colocalizarse con estructuras vesiculares más grandes que eran consistentes en tamaño y número con estructuras lisosomales (FIG. 13F).
La aplicación apical de ntChx-NP dio como resultado un proceso de transcitosis consistente con el observado para ntChx sola y sin colocalización con estructuras positivas para LAMP1 (FIG. 13F). Una vez atravesada la capa de células epiteliales intestinales, se observaron ntChx-NPs en estructuras positivas para LAMP1 dentro de las células presentes dentro de la lámina propia (FIG. 13C).
EJEMPLO 10
Comparación de la función de transcitosis de la exotoxina de Cholix de longitud completa no tóxica frente a dominio I de Cholix soloe
Este ejemplo demuestra el transporte in vivo de proteínas portadoras truncadas del dominio I de Cholix (por ejemplo, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 4) como se describe en el EJEMPLO 6 en comparación con Cholix de longitud completa no tóxico como se describe en el EJEMPLO 7.
La transcitosis de ntChx (SEQ ID NO: 3) in vitro se monitorizó mediante transferencia Western y microscopía de inmunofluorescencia usando un anticuerpo policlonal generado contra la proteína de longitud completa. Para probar si este anticuerpo policlonal puede proporcionar una cobertura equivalente en todas las regiones de ntChx con el propósito de detectar formas truncadas de la exotoxina, se investigó la capacidad de una forma truncada de Cholix para transportar una carga de proteínas que podría usarse para evaluar la equivalencia de transcitosis.
Se prepararon quimeras genéticas de proteína de longitud completa (ntChx) y una versión de la proteína compuesta solo por el dominio I, que comprendía la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ NO: 5, y se usó su extremo C-terminal para conjugar la proteína roja fluorescente (RFP, SEQ ID NO: 220) a través de su extremo N-terminal, dando como resultado el constructo que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 157). Se usó RFP solo, que tenía un peso molecular de 25,9 kDa (225 residuos de aminoácidos) como control de transcitosis.
Los datos muestran que el grado de transcitosis de RFP solo fue mínimo en comparación con ntChx-RFP y el dominio I de Cholix (M+Cholix1’265 o los residuos 1-266 de la SEQ ID NO: 5) - RFP (SEQ ID NO: 156) cuando se examinó 30 min después de ILI en yeyuno de rata in vivo (FIG. 14A). Los patrones de transcitosis epiteliales fueron similares y la extensión de RFP detectable en la lámina propia también fue comparable para tanto ntChx-RFP (FIG.
14B) como el dominio I de Cholix-RFP (FIG. 14C) (las flechas en estas figuras ilustran el lado apical del epitelio). Estos resultados sugieren que los elementos de Cholix implicados en la transcitosis residen dentro del dominio I y que este dominio puede ser suficiente para transportar una carga de proteína que reemplaza los dominios II y III de Cholix a través del epitelio intestinal.
EJEMPLO 11
Transcitosis in vitro y función de administración intracelular de proteínas portadoras del dominio I de Cholix truncado
Este ejemplo demuestra la transcitosis apical-basolateral in vitro y las funciones de administración intracelular de varias proteínas portadoras del dominio I de Cholix truncado conjugadas con la hormona de crecimiento humano a través de un espaciador como se ha descrito anteriormente en el EJEMPLO 6.
Para explorar más a fondo la función de los elementos dentro del dominio I de Cholix implicados en la transcitosis, se prepararon como constructos genéticos una serie de quimeras que contenían una proteína farmacéuticamente relevante, la hormona del crecimiento humano (HGH, SEQ ID NO: 214). Cada secuencia truncada del dominio I de Cholix (SEQ ID NO: 5, expresada bacterianamente) se conjugó a través del extremo C-terminal al extremo N-terminal de HGH a través de una secuencia espaciadora G4SG4SG4S (SEQ ID NO: 210), que dio como resultado las quimeras que tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163 y SEQ ID NO: 164. En el caso del truncamiento K187 del dominio I de Cholix con la SEQ ID NO: 5, los primeros 39 aminoácidos también se eliminaron para producir el fragmento E40-K187 del dominio I de Cholix (SEQ ID NO: 5) para producir el constructo con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 165 (TABLA 14).
TABLA 14 - n r mini r i n mini I h lix r n r H H
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Los experimentos que investigaban las capacidades de transporte de estas quimeras a través de monocapas epiteliales intestinales humanas in vitro demostraron que los constructos de administración con las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 158, SeQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160 y SEQ ID NO: 165 no transportaron, a diferencia de la SEQ ID NO: 161, como se muestra en FIG. 15A. A pesar de su peso molecular mucho más bajo, la HGH sola se transportó en menor medida en comparación con la SEQ ID NO: 164 (Figura 15A, parte derecha que muestra la presencia en el compartimento basal). La transcitosis de la SEQ ID NO: 161 y la SEQ ID NO: 162 fue comparable a la de la SEQ ID NO: 164 en el punto temporal de evaluación de 2 h en este modelo in vitro de intestino delgado humano (FIG. 15B). Sorprendentemente, el constructo de administración con el aminoácido expuesto en la SEQ ID NO: 161 fue superior en su capacidad de transporte en comparación con la SEQ ID NO: 164 como lo demuestra la señal relativa más alta de la SEQ ID NO: 161 en comparación con la SEQ ID NO: 164.
Estos resultados sugieren que el dominio I de Cholix es suficiente para el transporte de apical a basal, y que puede funcionar como un elemento de transcitosis para administrar varias cargas heterólogas a través de las células epiteliales, en donde la carga heteróloga puede reemplazar los dominios II, Ib y III de la exotoxina Cholix. Además, se ha demostrado que los elementos dentro de los primeros 206 residuos de aminoácidos de la proteína Cholix expresada por bacterias (por ejemplo, SEQ ID NO: 5 o, alternativamente, los primeros 205 residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4) pueden ser suficientes para la función de transcitosis y, por lo tanto, puede usarse como un portador eficiente para varias cargas heterólogas. Sorprendentemente, los resultados sugieren que la eficiencia de transcitosis de estos primeros 206 aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 puede incluso ser mayor que la del dominio I completo (por ejemplo, SEQ ID NO: 5) o la de la exotoxina Cholix madura de longitud completa (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2). Por tanto, los constructos de dominio I truncado de Cholix divulgados en la presente pueden usarse para transportar de manera eficiente moléculas de carga heterólogas como agentes terapéuticos y/o de diagnóstico a través de una capa de células epiteliales (por ejemplo, el epitelio intestinal) que permiten la administración oral de agentes terapéuticos y/o de diagnóstico (por ejemplo, polipéptidos o proteínas más grandes como anticuerpos) que se administran de otro modo a través de vías de administración parenteral (por ejemplo, por vía intravenosa o por vía subcutánea). Además, estos resultados muestran que las versiones truncadas del dominio I de Cholix pueden usarse para administrar varias cargas heterólogas en células epiteliales usando los constructos de administración que se describen en la presente.
EJEMPLO 12
Transcitosis in vivo y función de administración intracelular de proteínas portadoras del dominio I de Cholix truncado
Este ejemplo demuestra el transporte in vivo de quimeras de proteínas truncadas de un dominio I de Cholix (por ejemplo, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5) a través de células epiteliales intestinales para el administración de carga heteróloga (en este ejemplo: hormona de crecimiento humana).
Las quimeras de truncamiento seleccionadas, como se ha mostrado anteriormente en la TABLA 14 del EJEMPLO 11, se examinaron para determinar su capacidad de transcitosis in vivo después de ILI en yeyuno de rata. La notación que indica la longitud y el residuo en el que se produjo el truncamiento de los portadores del dominio I de Cholix truncados es con respecto a la SEQ ID NO: 5.
Los datos obtenidos en estos estudios muestran que mientras M+Cholix1-133-(SEQ ID NO: 10)-HGH (SEQ ID NO: 158) no se introdujo en el epitelio de rata durante 15 min (FIG. 16A), M+Cholix1-150-(SEQ ID NO: 10)-HGH (SEQ ID NO: 159) experimentó endocitosis, pero no completó la transcitosis como lo demuestra la falta de esta quimera en la lámina propia (FIG. 16B). El constructo con SEQ ID NO: 159 se retuvo en un grupo vesicular restringido a compartimentos cerca de las membranas plasmáticas apicales y basales de los enterocitos (FIG. 16B). El mutante de truncamiento M+Cholix1-186-(SEQ ID NO: 10)-HGH (SEQ ID No : 160) dio como resultado resultados similares a los observados para el constructo con la SEQ ID NO: 159 con una diferencia de que el constructo con la SEQ ID NO: 159 con una diferencia de que el constructo con la SEQ ID NO: 160 pareció acceder a un compartimento vesicular supranuclear al que no accedió el constructo con la SEQ ID NO: 159 (FIG. 16C). Además, la eliminación de los primeros 39 aminoácidos del dominio I de Cholix con SEQ ID NO: 5 (que dio como resultado el constructo M+Cholix39-186-(SEQ ID NO: 210)-HGH, SEQ ID NO: 165) dio como resultado una proteína que podría experimentar endocitosis, pero no migró del compartimento vesicular apical al compartimento vesicular basal del enterocito 15 minutos después de ILI (FIG. 16D).
Estos resultados sugieren que los elementos del dominio I de Cholix (SEQ ID NO: 5) entre E134 y D151 son esenciales para la endocitosis apical, que los elementos dentro de los primeros 39 aminoácidos del dominio I de Cholix pueden ser críticos para el tráfico desde el grupo vesicular apical hasta el grupo vesicular basal, y que los elementos entre K187 y K206 pueden ser críticos para la secreción de Cholix desde la superficie basolateral de los enterocitos. Por tanto, estos resultados demuestran que el dominio I de Cholix y la versión truncada del mismo, por ejemplo, aquellos que comprenden los primeros 206 residuos de aminoácidos del dominio I de Cholix (SEQ ID NO: 5), pueden administrar de manera eficiente varias cargas a través de las células epiteliales (por ejemplo, a través de células epiteliales intestinales polarizadas de un sujeto). Además, estos resultados muestran que las versiones truncadas del dominio I de Cholix pueden usarse para administrar varias cargas heterólogas a células epiteliales usando los constructos de administración como se describe en la presente.
EJEMPLO 13
Evaluación de fragmentos de péptidos funcionales del dominio I de Cholix
Este ejemplo demuestra la recapitulación de la transcitosis del dominio I de Cholix (SEQ ID NO: 5) usando elementos funcionales, por ejemplo, fragmentos de péptidos funcionales, del dominio I de Cholix para generar un polipéptido sintético que es capaz de administración en células epiteliales y/o a través de una capa de células epiteliales (por ejemplo, una monocapa de células epiteliales y/o un epitelio intestinal de un sujeto) in vitro (FIG. 17A) e in vivo (FIG. 17B). Además, la FIG. 18, por ejemplo, representa algunas secuencias de aminoácidos funcionales dentro del dominio I de Cholix como fragmentos de secuencia coloreados. Además, la FIG. 20 ilustra estructuras 3D generales del dominio I de Cholix con los fragmentos funcionales resaltados SEQ ID NO: 148 (FIG. 20A), SEQ ID NO: 151 (FIG. 20B), y SEQ ID NO: 152 (FIG. 20C). Todos los residuos de aminoácidos y sus posiciones se muestran con respecto a la secuencia del dominio I de Cholix expresada en bacterias expuesta en la SEQ ID NO: 5.
Con ese fin, se usaron experimentos de transcitosis usando péptidos específicos derivados de porciones del dominio I de Cholix (SEQ ID NO: 5) que se identificaron como críticos para la endocitosis apical para modelar los varios pasos y aspectos como el tráfico intracelular y la secreción de la membrana basal de transcitosis de ntChx de longitud completa, los fragmentos de péptidos ejemplares del dominio de Cholix se muestran a continuación en la TABLA 15 (incluyendo la masa molecular y el punto isoeléctrico (pI)).
TABLA 15 - Dominios peptídicos funcionales ejemplares identificados dentro de la secuencia de min i l mini I h lix E ID N :
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continuación
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Por ejemplo, el péptido 134ELDQQRNIIEVPKLYSID151 (SEQ ID NO: 148) fue el elemento que difería entre M+Cholix1-150-HGH (secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 159) y M+Cholix1-133-HGH (secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 158), una quimera que podría experimentar endocitosis y otra que no podría. Otro péptido de interés está dentro de los primeros 39 aminoácidos (1MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLD39, SEQ ID NO: 149), que faltaba en el contructo de M+Cholix39-186 (SEQ ID NO: 165) que carecía de la capacidad de tráfico desde la parte apical de la célula epitelial al dominio basal después de la endocitosis. El péptido que proporcionó la diferencia entre M+Cholix1-150-(SEQ ID NO: 210)-HGH y M+Cholix1-186-(SEQ ID NO: 210)-HGH fue 151DLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK187 (SEQ ID nO: 151); M+Cholix1-150-(SEQ ID nO: 210)-HGH mostró la capacidad de acceder a un área supranuclear de la célula a la que no accedió M+Cholix1-150-(SEQ ID NO: 210)-HGH. Finalmente, M+Cholix1-265-(SEQ ID NO: 210)-HGH fue secretada desde la superficie basal de las células epiteliales intestinales mientras que M+Cholix1'186-(SEQ ID NO: 210)-HGH no lo era; 187KAAQKEGSRHKRWAHWHTGLAL206 (SEQ ID NO: 152) es el péptido que describe la diferencia en las secuencias de estas dos quimeras (ver, por ejemplo, FIG. 17A).
Se marcó una estructura de polímero que contenía secuencias peptídicas de aminoácidos de las posiciones 1-39, 134-151, 151-178 y 178-206 del dominio I de Cholix con la s Eq ID NO: 5 en varias combinaciones con diferentes formas de puntos cuánticos.
Los datos in vitro muestran que algunas secuencias peptídicas seleccionadas de los elementos peptídicos del dominio I de Cholix son suficientes para lograr la transcitosis de apical a basal in vitro e in vivo (FIG. 17). Por ejemplo, la transcitosis a través del epitelio intestinal polarizado se midió in vitro después de 2 h como se muestra en la FIG. 17A. La cantidad de material transportado se informa como el aumento de fluorescencia con respecto a la preparación de punto cuántico de polímero que carece de péptidos Chx. (N=2; media ± S.E) (FIG. 17A). Posteriormente, se realizó transcitosis in vivo a los 15 min de preparaciones de puntos cuánticos de polímero marcadas con puntos cuánticos (FIG. 17B y FIG. 17C).
Los datos muestran que varias variantes de la secuencia de Cholix, como se divulga en la presente, retienen una endocitosis eficiente después de la captación desde la luz, pero carecen de la capacidad para completar la transcitosis, siendo útiles para dirigirse a estructuras vesiculares apicales o apicales y basales. A partir de los datos presentados, parece que Cholix utiliza un proceso de endocitosis de tipo mediado por receptor que implica a los aminoácidos 134-151, que proporciona acceso a un compartimento vesicular endosomal temprano en la parte apical de los enterocitos (por ejemplo, células epiteliales intestinales). Los aminoácidos 151-187 del dominio I de la exotoxina Cholix (por ejemplo, SEQ ID NO: 5) como se describe en la presente parecen permitir su movimiento a un compartimento supranuclear consistente con un sitio de clasificación en la célula para eventos secretores y, por tanto, también permiten la administración de varios cargas a esas localizaciones. El movimiento hacia el compartimento basal de las células se vuelve más eficiente con la presencia de los aminoácidos 1-40. Finalmente, los aminoácidos 187-206 proporcionan un mecanismo para la secreción desde la membrana basal que libera la proteína completa e intacta en la lámina propia donde podría proporcionar concentraciones terapéuticamente eficaces de moléculas de carga terapéuticas (por ejemplo, interleucinas), presentar antígenos a las células inmunitarias y/o permitir que la carga se absorba en la circulación sistémica para su administración a otros órganos/tejidos objetivo en un sujeto.
EJEMPLO 14
La colocalización de los constructos de administración del dominio I de Cholix con varias proteínas marcadoras demuestra el tráfico usando compartimentos distintos
Este ejemplo demuestra que los constructos de administración derivados del dominio I de Cholix utilizan distintos compartimentos para el tráfico hacia y a través de (por ejemplo, mediante transcitosis) células epiteliales usando varias proteínas marcadoras (ver, por ejemplo, el EJEMPLO 3) que indican que los constructos de portadores derivados de Cholix utilizan vías de tráfico específicas y endógenas. El estudio descrito en este ejemplo se realizó usando el constructo de administración derivado de Cholix que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 154 (que comprende el portador M+Cholix386 acoplado a IL-10 a través del espaciador con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 210, M = metionina N-terminal).
Antígeno EEA1. La FIG. 21A muestra que los constructos de administración de Cholix-IL-10 (SEQ ID NO: 154) se colocalizaron fuertemente con el antígeno EEA1 en localizaciones celulares consistentes con el tráfico en los dominios tanto apical como basal de los enterocitos, lo que sugiere la presencia de constructos de administración derivados de Cholix en los primeros compartimentos del endosoma.
Rab7. Además, se demostró que los constructos de administración de Cholix-IL-10 (SEQ ID NO: 154, arriba a la derecha) se colocalizan fuertemente con Rab7 (arriba a la izquierda) predominantemente en el compartimento apical de los enterocitos, pero solo con una colocalización limitada en las células dentro de la lámina propia, lo que sugiere la presencia de constructos de administración derivados de Cholix en los compartimentos del endosoma tardío (FIG. 21B, la parte inferior izquierda muestra una imagen de luz blanca y la parte inferior derecha muestra una tinción combinada con DAPI).
LAMP1. LAMP1 se identificó en vesículas grandes y específicas consistentes de lisosomas maduros que carecían de constructos de administración de Cholix-IL-10 (SEQ ID NO: 154, flechas blancas). Sin embargo, la quimera Cholix-IL-10 también se colocaliza con el antígeno LAMP1 en localizaciones celulares distintas de las estructuras similares a los lisosomas, lo que es consistente con el tráfico de vesículas en los dominios tanto apical como basal de los enterocitos, lo que sugiere la presencia de constructos de administración derivados de Cholix en compartimentos lisosomales (FIG. 21C).
Clatrina. Luego, la quimera Cholix-IL-10 (SEQ ID NO: 154) también colocalizó fuertemente con vesículas recubiertas de clatrina, particularmente en áreas adyacentes al núcleo y con Rab 1 predominantemente en el compartimento basal de enterocitos así como en células seleccionadas dentro de la lámina propia (FIG. 21D).
Calnexina. La quimera Cholix-IL-10 (SEQ ID NO: 154) colocalizada con el retículo endoplásmico como lo demuestra la calnexina en un patrón adyacente al núcleo en los enterocitos y en una gran fracción de células en la lámina propia (FIG. 21E).
Compartimento intermedio del retículo endoplasmático de Golgi. La quimera Cholix-IL-10 (SEQ ID NO: 154) se colocaliza fuertemente con el compartimento intermedio del retículo endoplasmático de Golgi (ERGIC) y el antígeno LAMN1 pareció redistribuirse en respuesta a la endocitosis y transcitosis del portador, como se muestra para 1 (FIG. 21F), 5 (FIG. 21G), 10 (FIG. 21H), y15 minutos después de la inyección (FiG. 211). Se demostró que la transcitosis del constructo de administración trafica consistentemente en grandes cantidades a través de los enterocitos. Los compartimentos específicos que se colocalizaron fuertemente con esta transcitosis incluyeron endosomas tempranos y endosomas tardíos. El portador derivado de Cholix parecía estar asociado con vesículas recubiertas de clatrina en las cercanías de la red ER-Golgi organizada adyacente a los núcleos de enterocitos. Se observó la colocalización del portador derivado de Cholix con el ER y ERGIC, también descrito como LMAN1 (lectina, unión a manosa 1), pero limitado en su asociación con elementos de la red cis-Golgi, Golgi y trans-Golgi. El portador derivado de Cholix se colocalizó con endosomas reciclados cerca de la superficie basal de los enterocitos de una manera que podría coordinarse con la redistribución de ERGIC. ERGIC-53 también puede funcionar como un receptor de carga intracelular implicado en el transporte anterógrado de un número limitado de ligandos de glicoproteínas en la vía exocítica temprana y es usado por una serie de virus de ARN como parte de su estrategia de exocitosis. Los estudios de unión basados en ELISA demostraron que Cholix y los constructos de administración derivados de Cholix pueden asociarse con ERGIC-53 a pH 7,4, pero esta interacción es significativamente más fuerte a pH 5,5. Los estudios de SPR respaldaron aún más esta interacción dependiente del pH (FIG. 31).
Gigantina. La quimera Cholix-IL-10 (SEQ ID NO: 154) no se colocalizo con los niveles bajos de gigantina presentes en los enterocitos (FIG. 21J). Algo de la gigantina se colocalizó con la quimera en un subconjunto de células presentes en la lámina propia, lo que sugiere que el portador derivado de Cholix no se localiza con el compartimento de Golgi.
Antígeno 58K. El antígeno 58K se localizó en enterocitos en un sitio apical al núcleo y la quimera Cholix-IL10 muestra cierta colocalización con este antígeno de una manera que sugiere un breve movimiento a través de este compartimento. No se observó antígeno 58K en células dentro de la lámina propia (FIG. 21k).
Antígeno TGN38. La quimera Cholix-IL-10 (SEQ ID NO: 154) mostró cierto nivel de colocalización con el antígeno TGN38 (arriba a la derecha), que mostró una distribución celular restringida al lado apical de los núcleos en los enterocitos y adyacente al núcleo en unas pocas células dentro de la lámina propia (FIG. 21L, luz blanca e imágenes combinadas que se muestran abajo a la izquierda y abajo a la derecha, respectivamente).
Rab 1. La quimera Cholix-IL-10 (SEQ ID NO: 154, arriba a la derecha) se colocalizó fuertemente con Rab 1 (arriba a la izquierda) predominantemente en el compartimento basal de los enterocitos y en células seleccionadas dentro de la lámina propia (FIG. 21M, luz blanca e imágenes combinadas que se muestran abajo a la izquierda y abajo a la derecha, respectivamente).
Estos datos demuestran que los constructos de administración derivados de Cholix de la presente divulgación interactúan con varias proteínas y receptores endógenos para aprovechar un sistema de transporte endógeno para la administración eficiente de carga a través y/o dentro de células epiteliales (por ejemplo, células epiteliales intestinales polarizadas).
EJEMPLO 15
Protocolo general para evaluar los receptores que interactúan con la exotoxina Cholix
En base a los resultados mostrados anteriormente en el EJEMPLO 14, este ejemplo demuestra un protocolo para la evaluación de los receptores que interactúan con Cholix y varia información adicional con respecto a esas interacciones. En este estudio se usaron varios constructos de administración derivados de Cholix, incluyendo los que tienen una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 154 (M+Cholix386-GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 210) -IL-10) y un constructo que comprende el dominio I de Cholix expuesto en la SEQ ID NO: 5 acoplado a IL-10 (SEQ ID NO: 217) o HGH (SEQ ID NO: 153) a través del espaciador GGGGGSGGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 210), por ejemplo, SEQ ID NO: 164. En primer lugar, se identificó un conjunto limitado de proteínas candidatas como receptores de proteínas portadoras a través de estudios de análisis de captura de perlas y espectrometría de masas. Luego, se evaluaron in vitro las interacciones del portador de Cholix con estas proteínas candidatas (por ejemplo, usando monocapas de células Caco-2) e in vivo (por ejemplo, en el yeyuno de rata).
En general, se decoraron perlas magnéticas de tamaño nanométrico (25 nm o 100 nm de diámetro) con los elementos portadores no tóxicos de la proteína Cholix usando un método de interacción basado en biotina o polihistidina (por ejemplo, usando ID SDS-PAGE, descrita en, por ejemplo, FIG. 22). Se permitió que estas perlas decoradas se transportaran a través de monocapas polarizadas in vitro de las líneas celulares de cáncer de colon humano Caco2 durante períodos de tiempo establecidos antes de la alteración celular suave y la captura de vesículas que contenían estas perlas magnéticas.
Después de múltiples lavados, estas vesículas enriquecidas con perlas magnéticas se solubilizaron en tampón de lisis y los componentes proteicos presentes se separaron mediante 2-D SDS-PAGE (FIG. 23). El patrón de estas proteínas se comparó con el contenido total de proteínas de estas células y se usó espectrometría de masas para identificar elementos específicos asociados con estructuras vesiculares a las que se accede mediante el constructo de administración derivado de Cholix (FIG. 24).
Se usó la comparación de los resultados de las repeticiones de este protocolo para identificar un conjunto limitado de candidatos más prometedores que luego se examinaron para determinar su contenido en células Caco-2 y en intestino delgado de rata (FIG. 25). Posteriormente, se confirmó la interacción de Cholix con las proteínas candidatas identificadas usando perlas magnéticas recubiertas de portador de Cholix y proteína candidata purificada. La incubación de las perlas recubiertas con el portador de Cholix con las proteínas puras y las transferencias Western o ELISA posteriores permitieron la detección de la interacción Cholix-proteína como se muestra a modo de ejemplo en la FIG. 26. Esta figura muestra la interacción del portador de Cholix con el proteoglicano de sulfato de heparán (HSPG), la proteína 1 relacionada con Dickkopf (DKK1), la proteína 75 regulada por glucosa chaperona (GRP75) y la citoqueratina-8 (K8 o CK8).
La colocalización microscópica de proteínas candidatas y el constructo de administración derivado de Cholix se evaluó en yeyuno de rata in vivo. Aquí, se mostró in vivo la colocalización de un constructo de administración que comprende una proteína portadora de Cholix acoplada a IL-10 (SEQ ID NO: 154, M+Cholix386-GGGGSGGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 210) -IL-10) con CK8 después de tratar yeyuno de rata con una aplicación luminal del constructo que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 154 durante 1 minuto (FIG.
27A), 5 minutos (FIG. 27B), y10 minutos (FIG. 27C). La colocalización en una región supranuclear aumentó con el tiempo. Aunque se observó transcitosis del constructo de administración en la mayoría de las células epiteliales, interactuó con solo una población discreta de células dentro de la lámina propia.
Para garantizar que la distribución del receptor fuera consistente entre los estudios in vivo de ratas y el intestino humano, la información se comparó con los estudios IHC descritos en el atlas humano. Aquí, se examinaron dos de los receptores identificados por espectrometría de masas y se verificaron en yeyuno de rata. La FIG. 28A y la FIG. 28B muestran que la localización intestinal de GRP75 y HSPc es consistente entre el intestino de rata y el humano.
Se usó silenciamiento en células Caco-2 usando tecnología de ARN-hc para establecer líneas celulares estables que se usaron para validar la participación de estas proteínas objetivo en la transcitosis de apical a basal de la proteína portadora Cholix. Luego se repitieron estos estudios usando yeyuno de rata in vivo para comparar con los descubrimiento in vitro de células Caco-2.
Aquí, se evaluó el transporte del constructo de administración derivado del dominio I de Cholix en células Caco-2 estables de HSPC silenciadas por CRISPR. La FIG. 29 muestra los efectos del silenciamiento de HSPG por CRISPR sobre la función de transporte del constructo de administración (SEQ ID NO: 164) que comprende el dominio I de Cholix acoplado a HGH y HGH sola como control interno del transporte no selectivo. Las células se sembraron a 1,5 x 105 células/ml en transwelIs. El día 18, se midió la resistencia eléctrica transepitelial/transendotelial (TEER) y se añadió PBS que contenía 20 ug/ml del portador con la SEQ ID NO: 164 a las cámaras apicales. Después de 3 h, se recogieron y concentraron muestras basolaterales. El grado del transporte de proteínas se analizó mediante transferencia Western usando anticuerpos anti-HGH. Los resultados mostrados en la FIG. 29 demuestran que la transcitosis y el transporte selectivo activo de las proteínas portadoras derivadas de Cholix dependen de HSPG, ya que el portador de Cholix mostró una función de transcitosis significativamente menor en las células HSPC silenciadas en comparación con las células Caco-2 normales positivas para HSPG.
Se realizaron estudios similares para las proteínas candidatas adicionales K8 (FIG. 30A), HSPC (FIG. 30B), y GRP75 (FIG. 30C, ejecución de control mostrada en la FIG. 30D). Se usaron líneas celulares estables de células Caco-2 que carecían de la expresión de proteínas candidatas específicas como monocapas in vitro para verificar su requerimiento de transcitosis del portador usando mecanismos de transporte endógeno activos y selectivos. El transporte específico del constructo de administración SEQ ID NO: 164 frente al transporte no selectivo de HGH sola se redujo en los silenciamientos de HSPG y GRP75, pero no en el silenciamiento de K8. Esto sugiere que se requieren HSPG y GRP75 para el transporte activo y la transcitosis de las proteínas portadoras derivadas de Cholix, y que K8 puede no ser necesario para el transporte activo a través de una célula epitelial.
Los estudios de ILI en yeyuno de rata demostraron que GRP75 se distribuía en enterocitos en distintas poblaciones vesiculares apicales y basales; SEQ ID NO: 164 colocalizada con GRP75 en vesículas dentro del tercio apical de los enterocitos no inmediatamente adyacentes a la membrana plasmática apical (Fig. 3D). El constructo que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 164 se observó en este compartimento apical positivo para GPR75 se produjo en el plazo de 5 min de la aplicación luminal y era consistente con un compartimento endosomal temprano. En momentos posteriores, se observó una porción de vesículas positivas para GPR75 observadas cerca de la membrana basal que contenían los constructos con la SEQ ID NO:. TMEM132A es muy similar a la proteína de unión a GRP78 de rata. Sin querer estar limitados por ninguna teoría, se asumió que las similitudes entre GRP78 y GRP75 pueden proporcionar una razón para las interacciones de TMEM132A con GRP75 y el potencial para su colocalización en el momento de la endocitosis de Cholix.
Estos datos demuestran que, de hecho, el transporte y la administración de la carga y el portador derivados de Cholix es un proceso activo y selectivo que implica distintos receptores. Esto puede ser útil para la administración dirigida y moléculas terapéuticas y/o de diagnóstico a través y/o al interior de células epiteliales (por ejemplo, células epiteliales intestinales) para el tratamiento y diagnóstico de enfermedades como se describe en la presente.
EJEMPLO 16
Evaluación de la dependencia del pH de la interacción portador de Cholix-GRP75
Este ejemplo demuestra la evaluación de la dependencia del pH de una proteína portadora derivada de Cholix (por ejemplo, SEQ ID NO: 4) y uno de sus receptores que interactúan durante la transcitosis activa, GRP75.
Para este estudio, se usaron las interacciones de unión de Biacore para examinar la dependencia del pH de las interacciones entre el portador de Cholix-GRP75. Las proteínas portadoras de Cholix se unieron a perlas magnéticas usando la bioconjugación biotina-estreptavidina y se incubaron con proteína GRP75 purificada en soluciones tampón con pH 5,5, 6,5 y 7,5, respectivamente (FIG. 31).
Las afinidades de unión a esos tres niveles de pH estaban generalmente en el intervalo nanomolar bajo, sin embargo, se midió una afinidad de unión significativamente más alta (aproximadamente 20 veces mayor) del portador de Cholix a GRP75 a pH 6,5, lo que indica la dependencia del pH de esta interacción.
EJEMPLO 17
Evaluación del tipo y la localización de los compañeros de interacción del dominio I de Cholix
En este ejemplo, se examinó el tipo de proteínas y sus localizaciones compartimentales en las células epiteliales usando un constructo de administración derivada del dominio I de Cholix (SEQ ID NO: 5) que demostró poseer una función de transcitosis igual, si no mayor, que la de la exotoxina de Cholix de longitud completa (SEQ ID NO: 1). Todos los residuos de aminoácidos y sus posiciones se muestran con respecto a la secuencia del dominio I de Cholix expresada en bacterias expuesta en la SEQ ID NO: 5.
Los compañeros de interacción para el dominio I de Cholix que termina en K266 de la SEQ ID NO: 5, el portador de Cholix expresado por bacterias comprende una metionina N-terminal) se capturaron usando una perla magnética y el procedimiento de aislamiento seguido por separación por electroforesis en gel 2D y se identificaron usando espectrometría de masas como se ha descrito anteriormente en el EJEMPLO 15. Es importante destacar que, en este ejemplo, también se prepararon varias formas truncadas de la exotoxina Cholix de longitud completa para examinar varios aspectos de estas interacciones: truncamientos en los aminoácidos E134, D151, K187, L206, K245 o Q251 o L206 unidos al extremo N-terminal de la hormona del crecimiento humano (HGH) a través de una secuencia G4SG4SG4S con este espaciador de glicina-serina identificado previamente para construir quimeras genéticas. En el caso del truncamiento de K187, también eliminamos los primeros 39 aminoácidos para producir el fragmento E40-K187 del dominio I de Chx con la SEQ ID NO: 5. Como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, en el EJEMPLO 10, el constructo con SEQ ID NO: 158 no pudo lograr la entrada apical en las células epiteliales intestinales, el constructo con SEQ ID NO: 159 y SEQ ID NO: 160 experimentó endocitosis para alcanzar las reservas vesiculares tanto apicales como basales dentro de los enterocitos, pero no logró acceder a la lámina propia,y el constructo con SEQ ID NO: 165 experimentó endocitosis pero no pudo migrar desde el compartimiento vesicular apical al basal del enterocito y, finalmente, el constructo con SEQ ID NO: 164 completa eficiente y rápidamente la transcitosis. Por tanto, se evaluaron los primeros 206 aminoácidos del dominio I de Cholix en busca de elementos que pudieran participar en los eventos que dieron como resultado la transcitosis de apical a basal.
EJEMPLO 18
Evaluación de la endocitosis apical de constructos de administración derivados del dominio I de Cholix
Primero, se evaluó la proteína transmembrana 123A (TMEM132A). TMEM132A es una proteína transmembrana de un solo paso que contiene cohesina y tres dominios de inmunoglobulina en tándem, conectando así el medio extracelular con el citoesqueleto intracelular. Se han demostrado que las interacciones entre TMEM132A y la serina/treonina-proteína fosfatasa 1 (PP1) proporcionan un mecanismo para regular eventos citoesqueléticos intracelulares a través de un motivo de interacción RVxF.
Se descubrió que el dominio I de Cholix (SEQ ID NO: 5, expresado en bacterias) enriqueció el aislamiento de TMEM132A junto con las subunidades catalíticas y reguladoras del complejo PP1. Los estudios basados en ELISA mostraron que el dominio I de Cholix con s Eq ID NO: 5 interactuaba con el dominio extracelular de TMEM132A; los estudios de SPR mostraron que esta interacción se produce a pH 7,5 y menos a pH 5,5. Los estudios de silenciamiento en células Caco-2, para generar células Caco-2TMEM132A-, mostraron que la reducción de TMEM132A redujo drásticamente el transporte de transcitosis del dominio I de Cholix con SEQ ID NO: 5.
Los estudios de inyección intraluminal (ILI) realizados en yeyuno de rata dieron como resultado la colocalización del constructo de administración de dominio I de Cholix-HGH (SEQ ID NO: 164) con TMEM132A que estaba restringida a la membrana plasmática apical de los enterocitos. Un curso temporal que examinó la transcitosis de la SEQ ID NO: 164 sugirió que TMEM132A permaneció en o adyacente a la membrana plasmática apical y no se redistribuyó significativamente a otras regiones de estas células epiteliales polarizadas. Aunque el constructo con SEQ ID NO: 158 no se introdujo significativamente en los enterocitos después de la aplicación apical, el constructo con SEQ ID NO: 159 sí se introdujo, lo que sugiere que un dominio de Chx crítico para la entrada en la célula apical residía con los 17 aminoácidos que discriminaban dónde dos constructos portadores. Una vez internalizado, el pH interno de un endosoma temprano o reciclado puede caer desde la neutralidad hasta ~6.0. El examen de las interacciones entre el constructo que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 164 y TMEM132A demostró que estas se produjeron en un grado mucho mayor a pH 7,4 en comparación con pH 5,5, de acuerdo con la teoría de que la liberación de un receptor de internalización, en este caso TMEM132A, podría verse facilitado por la disminución del pH de la vesícula que podría producirse después de la captación apical de Chx.
Los estudios que examinaron la distribución de clatrina en enterocitos de rata no mostraron colocalizaciones con el constructo que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 164 en la superficie apical, lo que sugiere que la entrada de Chx puede no implicar la captación mediada por clatrina. Sorprendentemente, la distribución celular de TMEM132A después de la aplicación del constructo que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 164 permaneció en la superficie apical, pero se encontró con más frecuencia en las vesículas apicales después de la distribución del constructo con la SEQ ID NO: 159, lo que sugiere que la falta de otros elementos dentro del dominio I de Cholix (SEQ ID NO: 5) era necesaria para el traspaso a un receptor (o receptores) requerido para el siguiente paso en su tráfico. Estos resultados sugieren que Chx puede acoplarse a TMEM132A en la superficie luminal y que estas interacciones están implicadas en el proceso de endocitosis inicial de la luz intestinal y que se requieren interacciones posteriores dentro de los endosomas tempranos para que continúe el proceso de transcitosis.
La citoqueratina 8 (CK-8) fue una de varias proteínas de esta familia identificadas en la selección inicial como un posible compañero de interacción con Chx; CK-8 se había identificado previamente como un receptor de superficie celular para la toxina Pet secretada por E. coli enteroagregativa. Los estudios de unión basados en ELISA mostraron que c K-8 interactúa con TMEM132A y también con Chx. La distribución de CK-8 en enterocitos de rata estaba restringida a la superficie apical y a dominios discretos en los compartimentos apical y basal. Un curso temporal que examina la transcitosis del constructo que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 164 sugirió que la distribución celular de CK-8 no cambió drásticamente después de la aplicación de M+Cholix1'265-HGH (SEQ ID NO: 164) apical y que se observaron algunas colocalizaciones en el compartimento apical de los enterocitos. El silenciamiento de CK-8 se realizó en células Caco-2 (Caco-2CK8‘) y se evaluó con su impacto sobre la transcitosis del constructo que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 164. El silenciamiento de CK-8, como se ha mostrado adicionalmente con anterioridad en el EJEMPLO 15, no afectó al transporte del constructo que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 164, lo que demuestra la capacidad de este modelo in vitro para determinar la función selectiva de los compañeros de interacción en el proceso de transcitosis de Chx. Estos estudios señalan que las proteínas identificadas en los desplegables de Chx que se colocalizan con los compartimentos celulares visitados por el constructo que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 164 pueden no ser esenciales para la transcitosis.
EJEMPLO 19
Clasificación endosomal temprana de constructos de administración derivados del dominio I de Cholix Este ejemplo demuestra que distintas proteínas como GRP75 están implicadas en la clasificación endosomal temprana de Cholix y constructos de administración derivados de Cholix (por ejemplo, aquellas que tienen una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO: 158 - SEQ ID NO: 165).
Se demostró que la transcitosis del constructo de administración trafica consistentemente en grandes cantidades a través de los enterocitos. Los compartimentos específicos que se colocalizaron fuertemente con esta transcitosis incluyeron endosomas tempranos y endosomas tardíos. El portador derivado de Cholix parecía estar asociado con vesículas recubiertas de clatrina en las cercanías de la red ER-Golgi organizada adyacente a los núcleos de enterocitos. Se observó la colocalización del portador derivado de Cholix con el ER y ERGIC, también descrito como LMAN1 (lectina, unión a manosa 1), pero limitado en su asociación con elementos de la red cis-Golgi, Golgi y trans-Golgi. El portador derivado de Cholix que tiene la SEQ ID NO: 164 se colocalizó con endosomas de reciclaje cerca de la superficie basal de los enterocitos de una manera que podría coordinarse con la redistribución de ERGIC. ERGIC-53 también puede funcionar como un receptor de carga intracelular implicado en el transporte anterógrado de un número limitado de ligandos de glicoproteínas en la vía exocítica temprana y es usado por una serie de virus de ARN como parte de su estrategia de exocitosis. Los estudios de unión basados en ELISA demostraron que el constructo que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 164 puede asociarse con ERGIC-53 a pH 7,4, pero esta interacción es significativamente más fuerte a pH 5,5. Los estudios SPR respaldaron aún más esta interacción dependiente del pH.
La distribución observada de GPR75 en los compartimentos vesiculares apical y basal de los enterocitos no sugirió un papel para un mecanismo de enrutamiento vectorizado eficiente del constructo que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 164 de un compartimento vesicular apical a uno basal; más bien, GPR75 podría desempeñar un papel en los grupos vesiculares locales en cada localización. Además, no observamos ninguna distribución subvertida de GPR75 como se ha observado para las acciones de otras proteínas efectoras bacterianas. Por tanto, conjeturamos que las interacciones de Chx con GPR75 pueden proporcionar alguna otra función que enrutar vesículas desde un compartimento endosomal apical a un compartimento de endosoma basal y planteamos la hipótesis de que las interacciones de GPR75 podrían funcionar para minimizar el enrutamiento de esta proteína efectora bacteriana de vesículas a lisosomas en ambas localizaciones.
Estudios adicionales con TMEM132A demostraron una mayor afinidad de interacción con el constructo que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 164 a pH neutro en comparación con un pH ácido, lo que sugiere que una vez internalizado, el constructo que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 164 podría encontrar otro receptor para el tráfico mientras el receptor de internalización volvía a la superficie apical de la célula. En esta hipótesis, el receptor de tráfico tendría una mayor afinidad de interacción por Chx a un pH ácido con respecto a la neutralidad. De hecho, el examen de las interacciones de GPR75 con el constructo que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 164 demostró una mayor afinidad entre estas dos moléculas a pH 5,5 en comparación con pH 7,4.
Estos datos demuestran que los constructos de administración derivados de Cholix descritos en la presente acceden de manera eficiente a los enterocitos (por ejemplo, células epiteliales intestinales polarizadas) e interactúan con las proteínas implicadas en la clasificación endosomal temprana, lo que permite que estos constructos eviten las vías de degradación intracelular que dan como resultado la administración y el transporte de portador y carga intactos, por ejemplo, a través de la célula epitelial mediante transcitosis y/o hacia el interior a través de endocitosis. EJEMPLO 20
Clasificación intracelular de constructos de administración derivados del dominio I de Cholix
Este ejemplo demuestra que los constructos de administración derivados del dominio I de Cholix interactúan con distintas proteínas como ERGIC-53 durante la clasificación intracelular.
La introducción luminal de los constructos de administración con SEQ ID NO: 164 en el modelo ILI de rata proporcionó datos para respaldar ERGIC-53 como un elemento subvertido por los constructos de Cholix de la presente divulgación para lograr una transcitosis eficiente. Antes y, en ocasiones, inmediatamente después de la aplicación apical del constructo que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 164, se observó ERGIC-53 en poblaciones discretas en enterocitos que se enfocaba cerca de la superficie apical del núcleo celular, una localización donde ERGIC está constantemente localizado. En el plazo de pocos minutos desde la aplicación luminal del constructo que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 164, se observó que ERGIC-53 se movía a áreas dentro de los enterocitos adyacentes a la membrana plasmática apical y a un dominio basal. Por tanto, la transcitosis del portador de Cholix y la redistribución de ERGIC-53 al área basal de los enterocitos era coincidente.
Como ERGIC-53 está implicado en la exportación de glicoproteínas desde el RE, se examinó la distribución celular de una proteína residente en el RE, riboforina 1 (subunidad 1 de glicosiltransferasa de proteína doliquildifosfooligosacáridoe) que media los eventos de N-glicosilación. De manera importante, la riboforina 1 se observó en un desplegable usando GRP75. La transcitosis del constructo que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 164 se observó después de su ILI en el yeyuno de rata que no afectó a la distribución intracelular de la riboforina 1, lo que demuestra que se co-ocaliza en un grado limitado en el compartimento vesicular apical donde la riboforina 1 estuvo presente durante todo el transcurso de tiempo durante el cual ERGIC-53 se subvirtió al compartimento basal. Además, ERGIC-53 interactúa con una constelación de proteínas, incluyendo SEC24, en su función de receptor de carga soluble. Notablemente, un desplegable con GRP75 como cebo identificado como SEC24. De manera similar, la aplicación apical del constructo que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 164 no indujo una alteración importante de la organización del compartimento intracelular.
El ERGIC participa en la clasificación de moléculas solubles destinadas a la secreción desde la célula y el ERGIC-53 experimenta un proceso de clasificación por concentración que implica a la proteína de cubierta COPII. Como tanto COPI como COPII están implicados en el tráfico de vesículas en la interfaz ER-Golgi, se investigó el potencial de estas proteínas de cubierta para colocalizarse con el constructo que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 164 durante el proceso de transcitosis. Los enterocitos de rata demostraron una distribución de COPI debajo de la membrana plasmática apical y en un sitio supranuclear consistente con el aparato de Golgi, una distribución que también se observó después de la aplicación apical del constructo con la SEQ ID NO: 158 que no se introdujo en estas células y el constructo con SEQ ID NO: 165 que experimentó endocitosis pero permaneció en un compartimento vesicular apical. De manera similar a lo observado para tejidos no tratados o los expuestos al constructo con la SEQ ID NO: 158, la distribución de ERGIC-53 (LMAN1) en enterocitos expuestos a una aplicación apical del constructo con la SEQ ID NO:159 o el constructo con la SEQ ID NO: 165 permaneció principalmente en el compartimento vesicular apical, con muy poca distribución del compartimento vesicular basal en enterocitos (Fig. 5). El movimiento de ERGIC-53 (LMAN1) a un compartimento vesicular basal se observó esporádicamente en enterocitos después de la aplicación apical del constructo con la SEQ ID NO: 159, y este movimiento fue mucho más consistente en los enterocitos tratados apicalmente con el constructo con la SEQ ID NO: 160 o el constructo con la SEQ ID NO: 164. La distribución de COPi en enterocitos tratados apicalmente con el constructo con la SEQ ID NO: 160 ahora era más evidente en la región supranuclear de la célula pero ahora estaba enfocada a la superficie apical y compartimento vesicular apical donde se colocalizó en cierta medida con ERGIC-53 (LMAN1).
La aplicación apical del constructo con la SEQ ID NO: 159 o el constructo con la SEQ ID NO: 165 dio como resultado la colocalización de HGH con COPI debajo de la membrana apical y en un sitio supranuclear, observándose eventos de colocalización limitados en la región de la agrupación vesicular apical de los enterocitos. El tratamiento apical con el constructo con la SEQ ID NO: 160 dio como resultado una colocalización extensa de HGH con COPI debajo de la membrana apical y algunas colocalizaciones dentro del compartimento vesicular apical, y menos eventos de colocalización en la región supranuclear.
Estos datos demuestran que los constructos de administración derivados de Cholix, como los que tienen secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159 y SEQ ID NO: 165, pueden usarse para administrar varias moléculas de carga a los compartimentos intracelulares de una célula epitelial. Esto puede ser particularmente útil para la administración dirigida de moléculas terapéuticas y/o biológicamente activas capaces de provocar un efecto terapéutico y/o biológico en esas localizaciones.
EJEMPLO 21
Secreción basal de constructos de administración derivados del dominio I de Cholix
Este ejemplo demuestra un mecanismo que puede aprovecharse para lograr una liberación basal eficiente de constructos de administración derivados de Cholix, lo que permite un transporte eficiente de la carga a través de las capas epiteliales (por ejemplo, un epitelio intestinal).
La proteína proteoglicana de sulfato de heparán específica de la membrana basal (HSPG, HSPG2 o perlecán), un componente integral de las membranas basales que soportan el epitelio cilíndrico simple del intestino, se identificó en estudios de captura iniciales (ver, por ejemplo, FIG. 29, FIG. 30). El perlecán está modulado por la tirosina fosfatasa (PTPN6) e interactúa con la proteína 1 que contiene el dominio del factor A de von Willebrand (VWA1), las cuales también se enriquecieron en capturas desplegables usando el constructo con SEQ ID NO: 164.
El silenciamiento estable de perlecán en células Caco-2 (Caco-2HSPG2-) cultivadas en un formato polarizado redujo significativamente la capacidad del constructo con SEQ ID NO: 164 para completar la transcitosis in vitro. Los estudios de unión basados en ELISA demostraron que Chx puede asociarse con perlecán. Los estudios SPR mostraron que Chx interactúa con perlecán a pH 5,5 pero no a pH 7,4.
En enterocitos de animales no tratados después de la exposición apical con el constructo con la SEQ ID NO: 158, se observó inmunomarcado positivo para perlecán en vesículas que se distribuyeron en los compartimentos apical, supranuclear y basal; la distribución de ERGIC-53 (LAMN1) estaba restringida a una localización entre los compartimentos apical y supranuclear (Fig. 9D). La aplicación apical del constructo con la SEQ ID NO: 164 dio como resultado una reducción del marcado de perlecán relativo observado en el compartimento supranuclear y una colocalización con ERGIC-53 (LAMN1) en los compartimentos apical y basal, con un área por debajo de la membrana plasmática luminal positiva para ERGIC-53 (LAMN1) pero no para perlecán. El ERGIC-53 (LAMN1) presente en el área por debajo de la membrana plasmática luminal fue positivo para el constructo con SEQ ID NO: 164, pero sin perlecán. Las vesículas positivas para HGH también fueron positivas para ERGIC-53 (LAMN1) o perlecán o ambos en grados variables en los compartimentos apical y basal. La sorprendente colocalización del constructo con SEQ ID NO: 164, ERGIC-53 (LAMN1) y perlecán en estos compartimentos sugiere que Cholix podría transitar hacia el lado basal de la célula con ERGIC-53 (LAMN1) y/o perlecán (y/o posiblemente otros elementos que interactúan) donde puede liberarse a través de un proceso de exocitosis.
En particular, la ruta de transcitosis de Chx descrita en la presente sugiere que las proteínas portadoras derivadas de Cholix acopladas a una carga heteróloga (no derivada de Cholix) no dan como resultado una desorganización celular, fuera de la subversión de ERGIC-53 (LAMN1), lo que indica que los mecanismos de administración de carga (por ejemplo, terapéutica) descritos en la presente no afectan a la capa epitelial o a la propia célula. Por tanto, la administración de carga altamente eficiente sin dañar el epitelio del propio constructo de administración puede ser una característica importante de los constructos y métodos de administración descritos en la presente. Puede permitir la administración de varias moléculas de carga terapéuticas y/o de diagnóstico u otras de una manera no invasiva, permitiendo potencialmente estándares de seguridad y eficacia terapéutica.
Estos datos demuestran que proteínas específicas (por ejemplo, ERGIC-53, ribofilina 1, SEC24, CK-8, TMEM132A, GPR75 y perlecán) están implicadas en el tráfico de un constructo de administración derivado del dominio I de Cholix a través de una célula epitelial y permiten su liberación de la membrana basal. La identidad de los distintos compañeros de interacción y las dependencias del pH de estas interacciones pueden ser particularmente útiles para las aplicaciones terapéuticas, ya que la vía de tráfico descrita en la presente permite la administración de portadores derivados del dominio I de Cholix acoplados a varias moléculas de carga para llegar al compartimento basolateral (por ejemplo, lámina propia) mediante el uso de vías de tráfico endógenas. Sin embargo, y como se demuestra en el EJEMPLO 11 anterior, los elementos funcionales específicos del dominio I de Cholix (y PE) permiten la administración de carga heteróloga a localizaciones distintas dentro y/o a través del epitelio.
Por lo tanto, las vías multirreceptoras y multicompartimentales descritas en la presente usadas por los constructos de administración derivados de Cholix para lograr la transcitosis de manera eficiente pueden proporcionar una hoja de ruta potencial para la administración oral de moléculas terapéuticas (por ejemplo, proteínas terapéuticas como anticuerpos terapéuticos) que pueden acoplarse a un portador de dominio I de Cholix o un portador derivado del mismo.
EJEMPLO 22
Los fragmentos de péptidos funcionales del dominio I de Cholix se localizan en la superficie de la proteína Este ejemplo muestra que porciones de los elementos de la secuencia funcional del dominio I de Cholix que se describen en la presente para promover la transcitosis y el tráfico de apical a basal están localizados en la superficie de la proteína del dominio I de la exotoxina de Cholix.
Los análisis de la estructura de la proteína demostraron que los elementos funcionales necesarios para la endocitosis apical, el tráfico de apical a basal y la liberación basal están próximos entre sí en la superficie de la proteína del dominio I de Cholix.
Se usó un modelo de superficie del dominio I de Cholix expresado por bacterias (SEQ ID NO: 5) para resaltar áreas seleccionadas de interés potencial en este proceso de transcitosis debido a su proyección desde la superficie de la proteína (FIG. 32). Cabe señalar que dos regiones de aminoácidos entre M1 y G40 son adyacentes a los aminoácidos expuestos en la superficie D151-A187 y A187-L206. Específicamente, L18-I26 (dominio X1) y t 171-I176 (dominio X2) se coordinan para formar un bolsillo rodeado por varias cargas negativas. De manera similar, k187-H203 (dominio X3) se coordina con I32-E40 (dominio X4) para formar una estructura de cresta continua (FIG. 32A-FIG.
32D).
Estos datos muestran que las porciones de la secuencia de aminoácidos del dominio I de Cholix que están distantes entre sí en términos de posición de aminoácidos dentro de la secuencia pueden, de hecho, estar muy próximas entre sí en una configuración 3D de la proteína del dominio I de Cholix.. Estos datos sugieren que la estructura 3D y la morfología de la superficie del dominio I de Cholix permiten la interacción con los receptores y los elementos del receptor necesarios para la endocitosis eficaz y/o el transporte de la célula epitelial. Esto puede ser útil para diseñar agentes terapéuticos administrables por vía oral que comprendan tales moléculas portadoras derivadas del dominio I de Cholix para proporcionar dosis terapéuticamente eficaces en los compartimentos basolaterales, la lámina propia, etc. para provocar efectos terapéuticos.
Todos los artículos y métodos divulgados y reivindicados en la presente pueden elaborarse y ejecutarse sin experimentación indebida a la luz de la presente divulgación. Todas las patentes, solicitudes de patentes y publicaciones mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas de los niveles de conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece la divulgación. La divulgación descrita ilustrativamente en la presente puede ponerse en práctica adecuadamente en ausencia de cualquier elemento no divulgado específicamente en la presente.
Listados de secuencias
SEQ ID NO: 1 es una secuencia de 634 aminoácidos de la toxina Cholix de Vibrio cholerae madura. SEQ ID NO: 2 es una secuencia de 634 aminoácidos de la toxina Cholix de Vibrio cholerae madura. SEQ ID NO: 3 es una variante no tóxica (nt) de la toxina Cholix de V. cholera madura.
SEQ ID NO: 4 es un dominio I de una toxina Cholix.
SEQ ID NO: 5 es un dominio I de una toxina Cholix que comprende un residuo de metionina N-terminal (por ejemplo, debido a la expresión bacteriana).
SEQ ID NO: 6 - SEQ ID NO: 125 son versiones truncadas del dominio I de Cholix.
SEQ ID NO: 126 es una secuencia de aminoácidos del dominio de translocación del portador de Cholix de V. cholera (dominio II).
SEQ ID NO: 127 es una secuencia de aminoácidos del dominio Ib del portador de Cholix de V. cholera.
SEQ ID NO: 128 es una secuencia de aminoácidos del dominio catalítico del portador de Cholix de V. cholera (dominio III).
SEQ ID NO: 129 es la secuencia de aminoácidos de Cholix1'425.
SEQ ID NO: 130 es la secuencia de aminoácidos de Cholix1-415.
SEQ ID NO: 131 es la secuencia de aminoácidos de Cholix1-397.
SEQ ID NO: 132 es la secuencia de aminoácidos de Cholix1-386.
SEQ ID NO: 133 es la secuencia de aminoácidos de Cholix1-291.
SEQ ID NO: 134 es una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la toxina Cholix de Vibrio cholerae madura expuesta en la SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 135 es una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de 613 aminoácidos de la exotoxina A (PE) de Pseudomonas madura.
SEQ ID NO: 136 es una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la exotoxina A (PE) madura de Pseudomonas expuesta en la SEQ ID NO: 135.
SEQ ID NO: 137 es una secuencia de aminoácidos del dominio de unión al receptor de exotoxina A (PE) de Pseudomonas (Dominio I).
SEQ ID NO: 138 es una secuencia de aminoácidos del dominio de translocación (Dominio II) de la exotoxina A (PE) de Pseudomonas.
SEQ ID NO: 139 es una secuencia de aminoácidos del Dominio Ib de exotoxina A (PE) de Pseudomonas.
SEQ ID NO: 140 es una secuencia de aminoácidos del dominio catalítico (Dominio III) de la exotoxina A (PE) de Pseudomonas.
SEQ ID NO: 141 es la secuencia de aminoácidos de p e1-404.
SEQ ID NO: 142 es la secuencia de aminoácidos de p e1-395.
SEQ ID NO: 143 es la secuencia de aminoácidos de PE1-375.
SEQ ID NO: 144 es la secuencia de aminoácidos de PE1-364.
SEQ ID NO: 145 es la secuencia de aminoácidos de PE1-277.
SEQ ID NO: 146 es la secuencia de aminoácidos de un constructo de administración híbrido.
SEQ ID NO: 147 es la secuencia de aminoácidos de un constructo de administración híbrido.
SEQ ID NO: 148 es la secuencia de aminoácidos de una secuencia peptídica funcional derivada del dominio I de Cholix (por ejemplo, para endocitosis).
SEQ ID NO: 149 es la secuencia de aminoácidos de una secuencia peptídica funcional derivada del dominio I de Cholix (por ejemplo, para el transporte de apical a basal).
SEQ ID NO: 150 es la secuencia de aminoácidos de una secuencia peptídica funcional derivada del dominio I de Cholix (por ejemplo, para el transporte de apical a basal).
SEQ ID NO: 151 es la secuencia de aminoácidos de una secuencia peptídica funcional derivada del dominio I de Cholix (por ejemplo, para la localización supranuclear).
SEQ ID NO: 152 es la secuencia de aminoácidos de una secuencia peptídica funcional derivada del dominio I de Cholix (por ejemplo, para liberación basal).
SEQ ID NO: 153 es la secuencia de aminoácidos de un constructo de administración derivado de Cholix que comprende hormona de crecimiento humana (HGH).
SEQ ID NO: 154 es la secuencia de aminoácidos de un constructo de administración derivado de Cholix que comprende interleucina-10 (IL-10).

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un constructo de administración aislado que comprende: un portador, en donde el portador consiste de una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5; y una carga biológicamente activa acoplada al portador, en donde el constructo de administración aislado es capaz de transcitosar a través de una célula epitelial polarizada.
2. El constructo de administración aislado de la reivindicación 1, en donde el portador consiste de una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5.
3. El constructo de administración aislado de la reivindicación 1, en donde el portador consiste de una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5.
4. El constructo de administración aislado de la reivindicación 1, en donde el portador consiste de una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5.
5. El constructo de administración aislado de la reivindicación 1, en donde el portador consiste de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5.
6. Un constructo de administración aislado que comprende:
un portador de Cholix que tiene como máximo 265 aminoácidos, en donde el portador de Cholix comprende un dominio I de una exotoxina cholix, o una versión truncada y/o modificada del mismo, y
una carga biológicamente activa acoplada al portador,
en donde el portador de Cholix es capaz de administrar la carga biológicamente activa a través de una célula epitelial polarizada mediante transcitosis.
7. El constructo de administración aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde:
(a) el portador consiste del dominio I de una toxina cholix; y/o
(b) la carga biológicamente activa se acopla al portador a través de un espaciador, opcionalmente en donde el espaciador comprende GGGGGSGGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 210).
8. El constructo de administración aislado de cualquier reivindicación anterior, en donde
(a) el portador está configurado para administrar la carga biológicamente activa al lado basal de la célula epitelial; y/o
(b) el portador interactúa con uno o más de ribofilina 1, SEC24, CK-8, TMEM132, GRP75, ERGIC-53 o perlecán, y no muestra interacción con uno o más de clatrina o GPR78, o una combinación de los mismos, en donde opcionalmente la interacción es una interacción selectiva o la interacción es una interacción dependiente del pH.
9. El constructo de administración aislado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:
(a) la administración de la carga heteróloga a través de una célula epitelial se produce in vitro desde la superficie apical de la célula epitelial hasta un compartimento basolateral; y/o
(b) la célula epitelial polarizada es de un humano.
10. El constructo de administración aislado de la reivindicación 9, en donde la célula epitelial polarizada humana es una célula epitelial intestinal polarizada humana, opcionalmente en donde la célula epitelial intestinal polarizada humana es una célula Caco-2.
11. El constructo de administración aislado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la carga biológicamente activa:
(a) es una macromolécula, molécula pequeña, péptido, polipéptido, ácido nucleico, ARNm, ARNmi, ARNhc, ARNip, molécula antisentido, anticuerpo, ADN, plásmido, vacuna, nanopartícula polimérica o material catalíticamente activo; y/o
es una (b) hormona, una citoquina, un anticuerpo terapéutico, un fragmento funcional de los mismos o cualquier combinación de los mismos.
12. Una composición farmacéutica que comprende un constructo de administración aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para su uso en terapia.
13. La composición para su uso de cuerdo con la reivindicación 12, en donde:
(a) el sujeto a tratar es un humano; y/o
(b) la composición está formulada para administración oral, administración tópica, administración pulmonar, administración intranasal, administración bucal, administración sublingual o administración ocular.
14. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 12 y la reivindicación 13, en donde la composición es para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmune, un cáncer, una enfermedad metabólica, una enfermedad del hígado graso o un trastorno del crecimiento por deficiencia de la hormona del crecimiento, opcionalmente en donde la enfermedad inflamatoria es una enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis o sepsis bacteriana.
15. La composición para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 12-14, en donde:
(a) la enfermedad inflamatoria intestinal es enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis colágena, colitis linfocítica, colitis isquémica, colitis por derivación, síndrome de Behcet o colitis indeterminada; o
(b) la enfermedad autoinmune es lupus eritematoso sistémico (SLE), pénfigo vulgar, miastenia grave, anemia hemolítica, púrpura trombocitopénica, enfermedad de Grave, enfermedad de Sjogren, dermatomiositis, enfermedad de Hashimoto, polimiositis, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple (MS), diabetes mellitus, artritis reumatoide o esclerodermia; o
(c) el cáncer es un linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemia linfocítica crónica, leucemia de células pilosas, leucemia linfoblástica aguda, mieloma múltiple, carcinomas de vejiga, riñón, ovario, cuello uterino, mama, pulmón, nasofaringe, melanoma maligno, NHL resistente a rituximab, o leucemia; o
(d) la enfermedad metabólica es diabetes, obesidad, diabetes como consecuencia de la obesidad, hiperglucemia, dislipidemia, hipertrigliceridemia, síndrome X, resistencia a la insulina, tolerancia alterada a la glucosa (IGT), dislipidemia diabética o hiperlipidemia.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL282986B2 (en) * 2018-11-07 2024-01-01 Applied Molecular Transport Inc Colics-derivative carriers for oral administration of heterologous cargo
MX2022001975A (es) 2019-08-16 2022-03-11 Applied Molecular Transport Inc Composiciones, formulaciones y produccion y purificacion de interleucinas.
WO2022240407A1 (en) * 2021-05-12 2022-11-17 Applied Molecular Transport Inc. Delivery constructs derived from bacterial toxins and uses thereof
WO2024078828A1 (en) * 2022-10-13 2024-04-18 Se Therapeutics Cytotoxic necrotizing factors as exogenous carriers in mammalian cells

Family Cites Families (108)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
FR2504010B1 (fr) 1981-04-15 1985-10-25 Sanofi Sa Medicaments anticancereux contenant la chaine a de la ricine associee a un anticorps antimelanome et procede pour leur preparation
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
EP0092227B1 (en) 1982-04-19 1988-07-27 Nissan Motor Co., Ltd. Method for controlling reduction ratio of continuously variable transmission with acceleration compensation
US5272065A (en) 1983-10-20 1993-12-21 Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA
US6022950A (en) 1984-06-07 2000-02-08 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
US5668255A (en) 1984-06-07 1997-09-16 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
US4542225A (en) 1984-08-29 1985-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
US4659839A (en) 1984-10-10 1987-04-21 Mallinckrodt, Inc. Coupling agents for radiolabeled antibody fragments
DE3680924D1 (de) 1985-01-14 1991-09-26 Neorx Corp Metall-radionuklid markiertes protein fuer diagnose und therapie.
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4680338A (en) 1985-10-17 1987-07-14 Immunomedics, Inc. Bifunctional linker
US4699784A (en) 1986-02-25 1987-10-13 Center For Molecular Medicine & Immunology Tumoricidal methotrexate-antibody conjugate
US6051405A (en) 1986-09-24 2000-04-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Constructs encoding recombinant antibody-toxin fusion proteins
US4892827A (en) 1986-09-24 1990-01-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects
US5807832A (en) 1987-06-09 1998-09-15 Biotech Australia Pty Limited Oral delivery of biologically active substances bound to vitamin B12
US5997856A (en) 1988-10-05 1999-12-07 Chiron Corporation Method and compositions for solubilization and stabilization of polypeptides, especially proteins
AU646673B2 (en) 1990-05-11 1994-03-03 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Improved pseudomonas exotoxins of low animal toxicity and high cytocidal activity
US5328984A (en) 1991-03-04 1994-07-12 The United States As Represented By The Department Of Health & Human Services Recombinant chimeric proteins deliverable across cellular membranes into cytosol of target cells
GB9112553D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Wellcome Found Fusion proteins
AU664561B2 (en) 1991-06-21 1995-11-23 University Of Cincinnati, The Orally administrable therapeutic proteins and method of making
US6613332B1 (en) 1991-06-21 2003-09-02 The University Of Cincinnati Oral administration of therapeutic proteins
CA2077277A1 (en) 1991-09-09 1993-03-10 John J. Donnelly Cellular immunity vaccines from bacterial toxin-antigen conjugates
CA2136724A1 (en) 1992-06-18 1993-12-23 Ira H. Pastan Recombinant pseudomonas exotoxin with increased activity
US20020034727A1 (en) 1992-11-02 2002-03-21 Genentech, Inc. Compaction assay for assessment of respiratory disease therapy
US5488034A (en) 1993-02-02 1996-01-30 Xoma Corporation Pharmaceutical composition comprising BPI proteins
GB9320782D0 (en) 1993-10-08 1993-12-01 Univ Leeds Innovations Ltd Stabilising of proteins on solution
GB9420355D0 (en) 1994-10-10 1994-11-23 Univ Nottingham Preparation of protein microspheres, films and coatings
US5656730A (en) 1995-04-07 1997-08-12 Enzon, Inc. Stabilized monomeric protein compositions
US5811409A (en) 1995-06-05 1998-09-22 Synsorb Biotech, Inc. Treatment of cholera
US5912014A (en) 1996-03-15 1999-06-15 Unigene Laboratories, Inc. Oral salmon calcitonin pharmaceutical products
US5922680A (en) 1996-10-23 1999-07-13 Ferring, B.V. Stabilized composition for oral administration of peptides
US6086900A (en) 1997-03-26 2000-07-11 Board Of Regents, The University Of Texas Systems Methods and compositions for using membrane-penetrating proteins to carry materials across cell membranes
DE69836024T2 (de) 1997-07-11 2007-09-27 The United States Government As Represented By The Department Of Health And Human Services Pseudomonas exotoxin a-ähnliche chimerische immunogene zum auslösen einer sekretorischen iga-vermittelten immunantwort
EP1000163B1 (en) 1997-07-11 2005-10-19 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Pseudomonas exotoxin a-like chimeric immunogens
US20030054012A1 (en) 2000-05-12 2003-03-20 Fitzgerald David J. Pseudomonas exotoxin a-like chimeric immunogens for eliciting a secretory iga-mediated immune response
US7314632B1 (en) 1997-07-11 2008-01-01 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pseudomonas exotoxin A-like chimeric immunogens
NZ335005A (en) 1997-08-01 2000-12-22 Toray Industries Method for stabilizing cytokine using a compound arabic acid or the like
US6342611B1 (en) 1997-10-10 2002-01-29 Cytovia, Inc. Fluorogenic or fluorescent reporter molecules and their applications for whole-cell fluorescence screening assays for capsases and other enzymes and the use thereof
US6251392B1 (en) 1997-10-20 2001-06-26 Epicyte Pharmaceuticals, Inc. Epithelial cell targeting agent
US6592847B1 (en) 1998-05-14 2003-07-15 The General Hospital Corporation Intramolecularly-quenched near infrared flourescent probes
US8790897B2 (en) 1998-08-25 2014-07-29 Syntaxin Ltd. Treatment of mucus hypersecretion
US20040071736A1 (en) 1998-08-25 2004-04-15 Health Protection Agency Methods and compounds for the treatment of mucus hypersecretion
US6565856B1 (en) 1998-12-08 2003-05-20 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
BR0014486A (pt) 1999-10-04 2002-09-17 Chiron Corp Composições farmacêuticas contendo polipeptìdeo lìquido estabilizado
US6838553B1 (en) 1999-10-05 2005-01-04 Academia Sinica Peptide repeat immunogens
WO2001030392A2 (en) 1999-10-22 2001-05-03 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Delivery of proteins across polar epithelial cell layers
KR20040045391A (ko) 2000-11-27 2004-06-01 파우더젝트 백신, 인코포레이티드 핵산 어쥬번트
US6673574B2 (en) 2000-11-30 2004-01-06 Unigene Laboratories Inc. Oral delivery of peptides using enzyme-cleavable membrane translocators
DK1379550T3 (da) 2000-12-21 2009-07-06 Us Gov Health & Human Serv Et kimært protein omfattende non-toxisk pseudomonas exotoxin A og en type IV pilin sekvenser
US6573237B2 (en) 2001-03-16 2003-06-03 Eli Lilly And Company Protein formulations
US7595054B2 (en) 2003-06-09 2009-09-29 Healthbanks Biotech Co., Ltd. Fusion antigen used as vaccine
US8206950B2 (en) 2003-06-09 2012-06-26 Animal Technology Institute Taiwan Fusion antigen used as vaccine and method of making them
US7335361B2 (en) 2003-06-09 2008-02-26 Animal Technology Institute Taiwan Fusion antigen used as vaccine
EP1522585A1 (en) 2003-10-09 2005-04-13 Plant Research International B.V. Chimeric carrier molecules for the production of mucosal vaccines
US20080317761A1 (en) 2004-04-28 2008-12-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Peptide-Mediated Protein Transduction Into Cells of the Hematopoietic Lineage
AU2005265163B2 (en) 2004-06-18 2009-10-01 Ambrx, Inc. Novel antigen-binding polypeptides and their uses
TWI293957B (en) 2004-07-21 2008-03-01 Healthbanks Biotech Co Ltd A superantigen fusion protein and the use thereof
JP4474264B2 (ja) 2004-08-20 2010-06-02 生寶生物科技股▲ふん▼有限公司 子宮頸癌抑制の融合蛋白
WO2006135428A2 (en) 2004-10-04 2006-12-21 Trinity Biosystems, Inc. Methods and compositions for inducing an immune response against multiple antigens
US20090285771A1 (en) 2004-10-04 2009-11-19 Trinity Biosystems, Inc. Methods and compositions for needleless delivery of macromolecules
AU2005294436A1 (en) 2004-10-04 2006-04-20 Trinity Biosystems, Inc. Methods and compositions for immunizing against Pseudomonas infection
WO2006109303A2 (en) 2005-04-11 2006-10-19 Yeda Research And Development Co.Ltd. Chimeric proteins comprising yersinia yop, their preparation and pharmaceutical compositions containing them
EP1885393A4 (en) 2005-05-18 2011-03-02 Childrens Hosp & Res Ct Oak METHODS AND COMPOSITIONS FOR IMMUNIZATION AGAINST CHLAMYDIA INFECTIONS
AU2006275865B2 (en) 2005-07-29 2012-06-28 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY OF HEALTH AND HUMAN SERVICES NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH Mutated Pseudomonas exotoxins with reduced antigenicity
EP1749833A1 (en) 2005-08-05 2007-02-07 Healthbanks Biotech Co., Ltd. Super-antigens derived from the SARS coronavirus E2 spike protein
EP1757615B1 (en) 2005-08-24 2011-08-24 Healthbanks Biotech Co., Ltd. Fusion protein for inhibiting cervical cancer
CA2621577C (en) 2005-09-06 2013-12-24 Oramed Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for oral administration of proteins
WO2007067597A2 (en) 2005-12-05 2007-06-14 Trinity Biosystems, Inc. Methods and compositions for needleless delivery of binding partners
US7666991B2 (en) 2005-12-05 2010-02-23 Trinity Biosystems, Inc. Compositions for needleless delivery of antibodies
WO2007109110A2 (en) 2006-03-16 2007-09-27 Trinity Biosystems, Inc. Methods for increasing the size of animals using needleless delivery constructs
US7465455B2 (en) 2006-07-05 2008-12-16 Healthbanks Biotech Co., Ltd. Fusion protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus as PRRS vaccine
ES2384524T3 (es) 2006-07-29 2012-07-06 Healthbanks Biotech Co., Ltd. Proteína de fusión del virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino como vacuna contra el SRRP
US20090092660A1 (en) 2006-08-09 2009-04-09 Trinity Biosystems, Inc. Methods and compositions for needleless delivery of particles
WO2008147526A1 (en) 2007-05-23 2008-12-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Targeted carriers for intracellular drug delivery
JP2010533181A (ja) * 2007-07-13 2010-10-21 アボツト・バイオテクノロジー・リミテツド ＴＮＦα阻害剤の肺投与のための方法及び組成物
US8524241B2 (en) 2007-07-20 2013-09-03 The General Hospital Corporation Fusion proteins comprising a fragment of Vibrio cholerae exotoxin A
WO2009026328A2 (en) 2007-08-21 2009-02-26 Immune Disease Institute, Inc. Methods of delivery of agents to leukocytes and endothelial cells
US20090203884A1 (en) 2008-01-31 2009-08-13 Healthbanks Biotech Co., Ltd. Chimeric hiv fusion proteins as vaccines
EP2268313A2 (en) 2008-03-17 2011-01-05 Universitätsklinikum Münster Yopm as delivery vehicle for cargo molecules and as biological therapeutic for immunomodulation of inflammatory reactions
WO2009149281A1 (en) 2008-06-04 2009-12-10 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Immunotoxins and uses thereof
EP2350132A4 (en) 2008-10-21 2013-05-29 Internat Vaccine Inst THE A1 GROUP OF THE A SUB-UNIT OF CHOLERATOXIN AS ADJUVANS FOR MUCOSAL AND SYSTEMIC VACCINES
WO2011009624A1 (en) 2009-07-22 2011-01-27 Cenix Bioscience Gmbh Delivery system and conjugates for compound delivery via naturally occurring intracellular transport routes
US9090691B2 (en) * 2010-09-15 2015-07-28 Applied Molecular Transport Llc Systems and methods of delivery of bioactive agents using bacterial toxin-derived transport sequences
US11246915B2 (en) 2010-09-15 2022-02-15 Applied Molecular Transport Inc. Cholix toxin-derived fusion molecules for oral delivery of biologically active cargo
US20140065172A1 (en) 2011-01-26 2014-03-06 Cenix Bioscience Gmbh Delivery system and conjugates for compound delivery via naturally occurring intracellular transport routes
WO2012110596A1 (en) 2011-02-16 2012-08-23 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Fusion protein for the treatment of immunologic or allergic reactions
CA2840617C (en) 2011-06-29 2020-03-24 Rani Therapeutics, Llc Therapeutic agent preparations for delivery into a lumen of the intestinal tract using a swallowable drug delivery device
US8877161B2 (en) 2011-10-19 2014-11-04 Georgia Regents Research Institute, Inc. GM1-like peptides and uses thereof
UA113192C2 (xx) 2011-12-06 2016-12-26 Імуногенна композиція проти цирковірусу свиней типу 2 (pcv2)
WO2014089036A1 (en) 2012-12-05 2014-06-12 Thevax Genetics Vaccine Co., Ltd. Fusion proteins for use as immunogenic enhancers for inducing antigen-specific t cell responses
KR102514910B1 (ko) 2014-01-27 2023-03-29 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션. 폴리펩티드를 전달하는 mhc 클래스 i 항원결정기
CN103864938A (zh) 2014-03-24 2014-06-18 北京博翱泰生物技术有限公司 靶特异性双突变体融合蛋白质及其制备工艺
CN106470707A (zh) * 2014-05-07 2017-03-01 应用分子运输有限责任公司 用于口服递送生物活性货物的cholix毒素衍生的融合分子
KR102041032B1 (ko) 2015-06-01 2019-11-27 레버 제네틱스 컴퍼니 리미티드 돼지 생식기 호흡기 증후군 및 돼지 써코바이러스 연관 질환에 대한 백신 조성물
EP3192805A1 (en) 2016-01-15 2017-07-19 Humanitas Mirasole S.p.A. Inhibitors of t cell activation or stimulation and uses thereof
CN117530943A (zh) 2016-10-06 2024-02-09 奥巴斯治疗股份有限公司 用于施用依氟鸟氨酸的制剂
US10400013B2 (en) 2016-10-26 2019-09-03 Chao-Wei Liao Fusion polypeptide for immuno-enhancement and method for enhancing stimulation of immune response using the same
US20210008208A1 (en) 2016-12-07 2021-01-14 Molecular Templates, Inc. Shiga toxin a subunit effector polypeptides, shiga toxin effector scaffolds, and cell-targeting molecules for site-specific conjugation
WO2019036382A1 (en) 2017-08-15 2019-02-21 Progenity Inc. INFLAMMATORY DISEASE TREATMENT INVOLVING AN INGREDIENT DEVICE FOR RELEASING AN IMMUNOMODULATOR
SG11202004861UA (en) 2017-11-29 2020-06-29 Agency Science Tech & Res Chimeric molecule for targeting c-myc in cells
WO2019133647A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 Thevax Genetics Vaccine Co., Ltd. Combination of a fusion protein vaccine with anti-ox40 antibody for use in eliciting antigen-specific immune responses
WO2019173787A1 (en) * 2018-03-08 2019-09-12 Applied Molecular Transport Inc. Toxin-derived delivery constructs for oral delivery
US20200140511A1 (en) 2018-11-07 2020-05-07 Applied Molecular Transport Inc. Delivery constructs for transcytosis and related methods
IL282986B2 (en) 2018-11-07 2024-01-01 Applied Molecular Transport Inc Colics-derivative carriers for oral administration of heterologous cargo
WO2020097394A1 (en) 2018-11-07 2020-05-14 Applied Molecular Transport Inc. Delivery constructs for transcytosis and related methods
MX2022001975A (es) 2019-08-16 2022-03-11 Applied Molecular Transport Inc Composiciones, formulaciones y produccion y purificacion de interleucinas.
US20210100887A1 (en) 2019-10-04 2021-04-08 Reber Genetics Co., Ltd. Recombinant fusion protein and immunogenic composition

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