CN101072584A - 用于无针输送大分子的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了向个体的血流中无针输送大分子的方法和组合物。一方面，本发明提供了输送结构，其包括受体结合区、穿胞运输(transcytosis)区域、向个体输送的大分子，以及可裂解的连接子。通常，该可裂解的连接子通过酶裂解，该酶在血浆中或极化上皮细胞的底侧膜处或附近的浓度要比在体内其它位置如极化上皮细胞的顶侧处要高。本发明的其它方面提供了编码本发明输送结构的核酸、含有本发明输送结构的试剂盒，表达本发明输送结构的细胞以及本发明输送结构的使用方法。
Description
本申请要求2004年10月4日提交的美国临时申请60/615,970、2005年5月24日提交的美国临时申请60/684,484、2005年9月19日提交的美国临时申请60/718,907的优先权，并且上述申请各自全部引入本文作为参考。
1.技术领域
本发明部分地涉及用于向个体无针输送大分子的方法和组合物。一方面，该方法和组合物涉及向个体施用含有待输送的大分子的输送结构，其中该大分子通过连接子连接到该结构的其它部分，该连接子在极化上皮细胞的底侧膜处可以被裂解。
2.背景技术
随着生物化学和分子生物学的发展，许多治疗性的大分子都得到识别和表征，例如，生长激素、红细胞生成素、胰岛素、IGF等。施用这些分子可以大大改善遭受多种疾病折磨的个体的生活质量。
不过，给予这些治疗性的大分子仍然存在问题。目前，通常通过注射给予大分子。这种注射需要穿透个体的皮肤和组织，因而伴随着疼痛。而且，穿透皮肤会破坏抗感染保护的一种有效的非特异性机制，从而可能导致潜在的严重感染。
已经有研究尝试向个体无针输送大分子。如国际专利公开WO01/30,392。在这些研究中，用输送载具通过极化上皮细胞向个体输送大分子。然而，这些改进都不包括可被在极化上皮细胞的底侧膜处的酶裂解的可裂解的连接子。如果不经过裂解，就会增加诱导对抗输送工具和/或待输送的大分子的免疫反应的可能性。而且，输送工具和大分子之间的空间位阻降低大分子的活性，从而降低治疗的功效。
因此，目前需要一种在不破坏个体的皮肤的情况下向个体的血流中无针输送大分子的方法和组合物。本发明在此公开了满足这种需求的方法和组合物。
3.发明内容
本发明的输送结构包括向个体输送的大分子，该大分子通过可裂解的连接子连接到该结构的其它部分。该连接子可以通过极化上皮细胞的底侧膜处的酶或环境因素裂解。
因此，在某些方面，本发明提供了输送结构，该结构包括受体结合区、穿胞运输区域、向个体输送的大分子，以及可裂解的连接子。可裂解的连接子的裂解可以将大分子与输送结构的其余部分分开。在某些实施方案中，可裂解的连接子可通过所述个体的极化上皮细胞的底侧膜处的酶裂解。在其它的实施方案中，该可裂解的连接子可以通过所述个体的血浆中的酶裂解。
在另一方面，本发明提供了一种编码输送结构的核酸，该输送结构包括受体结合区、穿胞运输区域、向个体输送的大分子、和可裂解的连接子。可裂解的连接子的裂解可以将大分子与输送结构的其余部分分开。在某些实施方案中，可裂解的连接子可通过所述个体的极化上皮细胞的底侧膜处的酶裂解。在其它的实施方案中，该可裂解的连接子可以通过所述个体的血浆中的酶裂解。
在其它实施方案中，编码输送结构的多核苷酸包括编码受体结合区的核酸序列、编码穿胞运输区域的核酸序列、编码可裂解的连接子的核酸序列和编码多连接子插入位点的核酸序列。多连接子插入位点可以相对于编码可裂解的连接子的核酸序列进行定向，使得可以裂解可裂解的连接子从而将由插入到多连接子位点的核酸编码的大分子与编码的输送结构的其它部分分开。在某些实施方案中，可裂解的连接子可通过所述个体的极化上皮细胞的底侧膜处的酶裂解。在其它的实施方案中，该可裂解的连接子可以通过所述个体的血浆中的酶裂解。
在另一方面，本发明提供了包含本发明的多核苷酸的表达载体。
在又一方面，本发明提供了包含本发明的表达载体的细胞。
在又一方面，本发明提供了包含本发明的输送结构的组合物。在某些实施方案中，该组合物是药物组合物。
在又一方面，本发明提供了一种向个体输送大分子的方法。该方法包括将该个体的极化上皮细胞的顶部表面与本发明的输送结构接触。该输送结构包括受体结合区、穿胞运输区域、可裂解的连接子和要输送的大分子。该穿胞运输区域可以穿过极化上皮细胞的底侧膜而进行大分子的穿胞运输。在某些实施方案中，可裂解的连接子可通过所述个体的极化上皮细胞的底侧膜处的酶裂解。在其它的实施方案中，该可裂解的连接子可以通过所述个体的血浆中的酶裂解。可裂解的连接子的裂解可以将所述大分子与输送结构的其它部分分离，并使该大分子脱离该结构的其它部分而输送到个体。
4.附图说明
图1A-1D是显微图片，显示了包括绿色荧光蛋白(GFP)的示例性输送结构粘附并穿越鼠气管上皮细胞(A-C组)，而单独的GFP并不粘附上皮细胞(D组)。
图2显示了向麻醉的小鼠鼻内给予100μg的nt-PE-GFP后，血清中nt-PE-GFP浓度随时间的变化。
图3显示的是示例性PE的氨基酸序列。
图4是Western印迹，通过人的肠上皮细胞单层显示了包含鼠生长激素(rGH)的示例性输送结构的裂解和输送。将该输送结构和所述上皮细胞单层的顶侧接触培养4小时。从培养后的膜(轨道1)的底侧分离的介质包含原始表观分子量的rGH，而该膜(轨道2)顶侧的介质包含完整的输送结构。轨道3和4分别显示了完整的输送结构2和重组rGH。
图5显示的是BALB/c小鼠的血清rGH浓度，该小鼠通过皮下(SC)注射30μg的非糖基化重组大鼠GH。各个小鼠血清以稀释比1∶10进行测试，记录rGH浓度的组平均值(n＝4只小鼠每时间点)。平均值的标准误差(SEM)由误差条(error bar)显示。
图6显示的是BALB/c小鼠的血清rGH浓度，小鼠口服100μg的输送结构2。各个小鼠血清以稀释比1∶10进行测试，记录rGH浓度的组平均值(n＝4只小鼠每时间点)。平均值的标准误差(SEM)由误差条(error bar)显示。
图7显示的曲线是皮下给予rGH和输送结构2的动力学对照。
图8显示的雌性BALB/c小鼠肝脏中的IGF-I-BP3 mRNA的表达水平，小鼠通过皮下注射了30μg的重组rGH或强饲口服了100μg的输送结构2。从肝脏中提取的总RNA，如上所述用IGF-I-BP3特异性引物进行定量的RT-PCT。将数值标准化为3-磷酸甘油醛酯脱氢酶(GAPDH)，并表示为对照的百分比。
图9显示的是雌性BALB/c小肝脏中的生长激素(GH)受体mRNA的表达水平，小鼠通过皮下注射了30μg rGH或强饲口服了100μg的输送结构2。从肝脏中提取的总RNA，用如上所述的GH特异性引物进行定量RT-PCT。数值标准化为3-磷酸甘油醛酯脱氢酶(GAPDH)，并表示为对照的百分比。
图10显示的是雌性BALB/c小鼠肝脏中类胰岛素生长因子I(IGF-I)mRNA的表达水平，小鼠通过皮下注射了30μg rGH或强饲口服了100μg的输送结构2。从肝脏中提取总RNA，用如上所述的IGF-I特异性引物进行定量RT-PCT。将数值标准化为3-磷酸甘油醛酯脱氢酶(GAPDH)，并表示为对照的百分比。
图11A和B用有误差条的图显示口服施用3μg、10μg或30μg的输送结构2(F2)或皮下施用3μg或10μg rGH的小鼠的血清抗-rGH IgG抗体(图11A中的稀释比为1∶25；图11B的稀释比为1∶200)，图11C和D表示来自单个动物的同样数据。
图12显示的是编码输送结构6(SEQ ID NO：34)，一种用于输送人生长激素(hGH)的示例性输送结构的核苷酸序列。
图13A和B显示的是编码输送结构6(SEQ ID NO：35)，一种用于输送hGH的示例性输送结构的氨基酸序列。
图14显示的是编码输送结构6(SEQ ID NO：36)，一种用于输送干扰素-α(IFN-α)的示例性输送结构的核苷酸序列。
图15A和B显示的是编码输送结构7(SEQ ID NO：37)，一种用于输送IFN-α的示例性输送结构的氨基酸序列。
图16显示的是BALB/c小鼠的6种血清IFN-α浓度，小鼠口服了100μg的输送结构8。单个小鼠血清以稀释比1∶10进行测试，记录IFN-α浓度的组平均值(n＝3只小鼠每个时间点)。
图17A和B显示的是编码输送结构8(SEQ ID NO：38)，一种用于输送胰岛素原的示例性输送结构的氨基酸序列。
图18A和B显示的是输送结构9(SEQ ID NO分别为39和40)，一种用于输送胰岛素的示例性输送结构的两条氨基酸链的氨基酸序列。二硫键在SEQ ID NO：40(如图18B所示)的位点7处的半胱氨酸和SEQ ID NO：39(如图18A所示)的位点381处的半胱氨酸之间、以及在SEQ ID NO：40的位置20处的半胱氨酸和SEQ ID NO：39的位置393处的半胱氨酸之间形成。
5.具体实施方式
5.1.定义
除非特别定义外，本发明的所有的技术和科学术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。在本发明中，下述术语具有所述的定义，除非另有说明。
“配体”是特异性结合靶分子的化合物。示例性配体包括但不限于抗体、细胞因子、基质、信号分子等。
“受体”是特异性结合配体的化合物。
当配体或受体在结合反应中作用时，配体或受体(如抗体)与另一分子“特异性结合”或“发生特异性免疫反应”，这表明在异源化合物分子样品中存在该分子。因此，在所设计的试验(如免疫测定)条件下，配体或受体优先结合样品中的特定化合物，而不以有意义的量结合其它化合物。例如，多核苷酸在杂交的条件下特异性结合含有互补序列的另一多核苷酸，抗体在免疫测定条件下特异性结合具有用于诱导该抗体的抗原决定簇的抗原。
“免疫测定”指的是检测在样品中的分析物的方法，包括将样品与特异性结合所述分析物的抗体接触，并检测该抗体和分析物之间的结合。多种免疫测定的形式可以用于选择与特定蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定通常用于选择与蛋白质发生特异性免疫反应的单克隆抗体。参见Harlow和Lane(1988)，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications，New York，其描述了用于测定特异性免疫反应活性的免疫测定方式和条件。在一个实例中，抗体特异性结合特定抗原，其结合亲和力(Km)约为10μM。
“连接子”指的是通过共价键、或离子、或范德华力或氢键与两个其它分子连接的分子，例如，在5’端与一个互补序列杂交且在3’端与另一互补序列杂交，从而连接两个非互补序列的核酸分子。“可裂解的连接子”指的是该连接子可以被降解，或以其它方式而使该可裂解的连接子所连接的两个组分分离。可裂解的连接子通常通过酶裂解，该酶一般为肽酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶等。可裂解的连接子也以通过环境因素裂解，如温度、pH、盐浓度的变化，等等。这种环境因素变化发生在输送结构穿过极化上皮细胞膜的穿胞运输之后。
“药物组合物”指的是适合动物使用的药用组合物。药物组合物含有药学有效量的活性试剂和药学上可接受的载体。“药学有效量”指的是试剂的量可以产生需要的药学效果。“药学上可接受的载体”指的是任何标准药物载体、媒介物、缓冲液和赋形剂，如磷酸盐缓冲液、5％的葡萄糖水溶液、以及乳化剂如油/水或水/油乳液、以及不同类型的润湿剂和/或助剂。MackPublishing Co.，Easton出版2005年出版的第21版Remington′s PharmaceuticalSciences中公开了合适的药物载体和剂型。“药学上可接受的盐”是指可以配制成药用化合物的盐，包括金属盐(钠、钾、镁、钙等)和氨盐或有机胺盐。
优选的药物载体取决于活性试剂所需要的给药方式。典型的给药的方式包括经肠(如口服、鼻、直肠或阴道)或不经肠(如皮下、肌肉、静脉或腹膜注射)，或者局部(如通过皮肤或粘膜给药)。
“有机小分子”指大小与药物中所用的那些有机分子相当的有机分子。该术语不包括有机生物多聚物(如蛋白质、核酸等等)。优选的有机小分子的大小最大为5000Da、2000Da或1000Da。
诊断、治疗或给药的“个体”指的是人或非人动物，包括哺乳动物或灵长类动物，优选为人。
“治疗”指的是预防性治疗或治疗性治疗。“预防性”治疗是指向没有表现出疾病的症状或仅表现出早期症状的个体给药，以降低疾病的发生风险为目的。“治疗性”治疗是指向表现出病理学症状的个体给药，以较少或消除这些症状为目的。
“假单胞菌外毒素A”或“PE”是绿脓杆菌分泌的67KD的蛋白质，该蛋白质由三种主要的球状区域(Ia、II和III)和一种连接区域II和III的小的次区域(Ib)组成。参见A.S.Allured等人1986年的Proc.Natl.Acad.Sci.83：1320-1324。不受任何特定机理或理论的约束，相信PE的区域Ia介导细胞结合，因为区域Ia特异性结合低密度脂蛋白受体相关蛋白质(″LRP″)，也称作α2-巨球蛋白受体(″α2-MR″)和CD-91。参见MZ.Kounnas等人1992年的J.Biol.Chem.267：12420-23。区域Ia包括氨基酸1-252。PE的区域II被认为在区域Ia与α2-MR结合后介导细胞内的穿胞运输。区域II包括氨基酸253-364。该区域的某些部分可能是假单胞菌分泌合成后的PE所必需的。参见Vouloux等人2000年的J Bacterol 182：4051-8。还不知晓区域Ib的功能，其包括氨基酸365-399。区域III介导PE的细胞毒性，其包含内质网驻留序列。相信PE细胞毒性是延长因子2的ADP核糖基化作用结果，该作用使蛋白质的合成失活。区域III包括PE的氨基酸400-613。从区域III中删除氨基酸E553(″ΔE553″)会消除EF2 ADP的核糖基化活性，并使PE解毒。具有突变ΔE553的PE在此称为″PEΔE553″。PE的基因改性形式在如美国专利5,602,095、5,512,658和5,458,878中有描述。本发明所述的假单胞菌外毒素也包括此定义范围内的PE的基因改性的形式、等位基因的形式和化学失活的形式。参见Vasil等人1986年的Infect.Immunol.52：538-48。而且，本发明所述的PE的不同区域可参考图3所示的PE序列。然而，只要该些区域保持功能活性，改性PE如基因改性或化学改性的PE的一个或多个区域，或这些区域的一部分也可以用于本发明的嵌合免疫原中。本领域的技术人员基于，例如与图3所举例的PE序列的同源性，可以很容易地确定改性PE的这些区域，并用例如如下所述检测方法检测其功能活性。
“多核苷酸”指的是由核苷单元构成的聚合物。多核苷酸包括天然形成的核酸序列，如脱氧核糖核酸(″DNA″)和核糖核酸(″RNA″)，以及核酸类似物。核酸类似物包括那些含有非天然形成的碱基、与其它核苷以天然形成的磷酸二酯键之外的键连接的核苷，或包含通过磷酸二酯键之外的键连接的碱基的核酸类似物。因此，核酸类似物包括，例如但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷三酯、氨基磷酸酯、硼代磷酸酯、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核酸、肽-核酸(PNA)等。这些多核苷酸可以是合成的，例如用自动DNA合成仪合成。术语“核酸”通常指的是长多核苷酸。术语“寡核苷酸”通常指的是短多核苷酸，通常不超过50个核苷。可以理解，当核苷酸序列用DNA序列(即A、T、G、C)表示时，其也包括RNA序列(A、U、G、C)，其中“U”替代“T”。
在此使用常规标记来描述多核苷酸序列：单链多核苷酸序列的左手端是5′端，双链多核苷酸序列的左手方向被称为5′方向。
在初始RNA转录中添加核苷的5′到3′的方向称为转录方向。和mRNA具有相同序列的DNA链称为“编码链”；位于RNA转录的5′到5′端、在与该DNA转录的mRNA序列相同的DNA链序列称为“上游序列”；位于编码RNA转录的3′到3′端、在与RNA序列相同的DNA链序列称为“下游序列”。
“互补的“指的是两个多核苷酸的拓扑相容性或其接触面一起配对。因此，该两个分子是互补的，而且，该接触面的特点是彼此互补。如果第一多核苷酸的核苷序列与第二多核苷酸的多核苷酸序列的结合配偶体的核苷序列基本相同，或者第一多核苷酸在严格的杂交条件下可以杂交第二多核苷酸，则第一多核苷酸和第二多核苷酸是互补的。因此，序列5′-TATAC-3′的多核苷酸和序列5′-GTATA-3′的多核苷酸是互补的。
此处用的术语“％一致”和术语“％序列一致”交替使用，其指的是用序列比对程序进行比对时，两个或多个肽序列之间的氨基酸序列的一致性水平或两个或多个核苷序列之间的核苷序列的一致性水平。例如，在本发明中，由限定的运算法则测定的80％一致与80％序列一致是同一含义，意即给定的序列和另一序列的另一长度至少80％是相同的。序列一致性的示例性水平包括但不限于与给定序列具有60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或更高的一致。
此处用的术语“％序列同源”和术语“％同源”交替使用，指的是用序列比对程序进行比对时，两个或多个肽序列之间的氨基酸序列的同源水平或两个或多个核苷序列之间的核苷序列的同源水平。例如，此处所用的由限定的运算法则测定的80％同源与80％序列同源是同一含义，意即给定序列在其长度上具有大于80％的序列同源性。序列同源性的示例水平包括但不限于与给定序列具有60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或更高的同源。
用于测定两个序列之间的一致性的计算机程序的实例包括但不限于BLAST程序，如公众可以从NCBI网站得到的BLASTN、BLASTX、TBLASTX、BLASTP和TBLASTN程序。请参见Altschul等人1990年的J MoIBiol.215：403-10(公开了默认设置的具体参数，即参数w＝4，t＝17)和Altschul等人1997年的Nucleic Acids Res.，25：3389-3402。当相对于GenBank ProteinSequences和其它公共数据库中的氨基酸序列评价给定氨基酸序列时，通常用BLASTP程序进行序列研究。BLASTX程序优选用于研究核酸序列，这些核酸序列已经对着GenBank Protein Sequences和其它公共数据库中的氨基酸序列转译成各种阅读框。BLASTP和BLASTX以默认的参数值(其中开放空位罚分为11.0，延长空位罚分为1.0)运行，并使用BLOSUM-62矩阵。
为了测定两个或多个序列之间的“％一致”，被选序列优选用例如MacVector6.5版的CLUSTAL-W程序进行比对，使用默认参数，包括开放空位罚分为10.0，延长空位罚分为0.1，以及BLOSUM 30相似矩阵。
“极性氨基酸”指的是具有在生理pH条件下不带电的侧链的亲水氨基酸，但其具有至少一个下述键，其中在两个原子之间共享的一对电子被其中一个原子更加紧密的保持。遗传编码的极性氨基酸包括Asn(N)、Gln(Q)、Ser(S)和Thr(T)。
“非极性氨基酸”指的是具有在生理pH条件下不带电的侧链的疏水氨基酸，其具有下述键，其中在两个原子之间共享的一对电子被每个原子同等地保持(即侧链是非极性的)。遗传编码的非极性氨基酸包括Ala(A)、Gly(G)、Ile(I)、Leu(L)、Met(M)和Val(V)。
根据Eisenberg等人1984年的J MoI.Biol.179：125-142中多数人同意的亲水性数值，“亲水氨基酸“指的是亲水性小于0的氨基酸。遗传编码的亲水性氨基酸包括Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q)、His(H)、Lys K)、Ser(S)和Thr(T)。
根据Eisenberg等人1984年的J MoI.Biol.179：125-142中多数人同意的亲水性数值，“疏水氨基酸“指的是亲水性大于0的氨基酸。遗传编码的憎水性氨基酸包括Ala(A)、Gly(G)、Ile(I)、Leu(L)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Trp(W)、Tyr(Y)和VaI(V)。
“酸性氨基酸“指的是具有侧链pK值小于7的亲水性氨基酸。由于氢离子的缺失，因此酸性氨基酸在生理pH条件下带负电荷。遗传编码的酸性氨基酸包括Asp(D)和Glu(E)。
“碱性氨基酸”指的是具有侧链pK值大于7的亲水性氨基酸。由于和氢离子的结合，因此碱性氨基酸在生理pH条件下带正电荷。遗传编码的碱性氨基酸包括Arg(R)、His(H)和Lys(K)。
“编码”是多核苷酸中的具体核苷序列，如基因、cDNA或mRNA的固有性质，以用作生物过程中的其它聚合物和大分子合成的模板，该其它聚合物或大分子具有限定的核苷序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列，以及由之产生的生物性能。因而，如果在细胞或其它生物系统中基因产生的mRNA的转录和翻译产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。这种基因或cDNA的编码链和非编码链都可以被认为编码蛋白质或编码该基因或cDNA的其它产物，其中编码链的核苷序列和mRNA序列相同，通常以序列表的形式提供，而非编码链用作转录的模板。除非特别声明，“编码氨基酸序列的核苷序列”包括彼此间所有的简并序列和编码同一氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷序列包括内含子。
“扩增”指的是将多核苷酸序列复制并因而使其扩增成大量多核苷酸序列的方法，例如，通过如反转录、聚合酶链反应、连接酶链反应等。
“引物”指的是能够特异性地与指定的多核苷酸模板杂交并能提供合成互补多核苷酸的起始位点的多核苷酸。当多核苷酸引物处于诱导合成的条件时，即在核苷、互补多核苷酸模板和聚合试剂如DNA聚合酶存在的情况时，就会发生这种合成。引物通常是单链的，但是也可以是双链的。引物通常是脱氧核糖核酸，但是大量不同的合成引物和天然引物可以用于多种用途。引物和设计来与其杂交的模板是互补的以用作合成的起始位点，但是不必是该模板准确序列。在这种情况下，引物与模板的特异性杂交取决于杂交条件的严格性。引物可以用如产色部分、放射活性部分的或荧光部分标记，并作为可检测部分。
当用于多核苷酸时，“探针”是指能和另一多核苷酸的指定序列发生特异性杂交的多核苷酸。探针与靶互补多核苷酸特异性杂交，但是不必是模板的准确的互补序列。在这种情况下，探针与靶的特异性杂交取决于杂交条件的严格性。探针可以用如产色部分、放射活性部分或荧光部分标记，并作为可检测部分。当探针提供互补多核苷酸合成的起始位点时，探针也可以是引物。
“特异性杂交”和“选择性地杂交”指的是在严格条件下，当核苷酸分子序列以复合的混合DNA和RNA(如全细胞)存在时，其优先地与特定核苷序列结合、双重结合(duplexing)和杂交。
术语“严格条件”指的是探针优先与其靶序列杂交，而很少或根本不与其它序列杂交的条件。在本文的核酸杂交试验如Southern和Northern杂交中，“严格杂交”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，在不同的环境参数下不同。核酸杂交的广泛指南可以参考1993年由纽约的Elsevier出版的Tijssen的Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes的第1部分第2章的“Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”；Sambrook等人2001年的第三版Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory；以及Ausubel等人编辑的、由纽约GreenePublishing Associates and Wiley Interscience出版的Current Edition，CurrentProtocols in Molecular Biology。
通常，对于具体的序列，在规定的离子强度和pH下选择的高度严格的杂交和洗涤条件为低于热熔点(Tm)约5℃。Tm是50％的靶序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在规定的离子强度和pH下)。对于具体的探针，所选高度严格的条件的温度等于Tm。
用于在Southern和Northern印迹中在过滤膜上杂交具有多于100个互补残基的互补核酸的严格杂交条件的一个实例是在42℃下，50％的福尔马林和1mg的肝磷脂经过一夜的杂交。高度严格的洗涤条件的实例是在72℃下用0.15M的NaCl洗涤约15分钟。严格洗涤条件的实例是在65℃下用0.2×SSC洗涤15分钟。参见Sambrook等人对SSC缓冲液的说明。高度严格的洗涤可以在低严格洗涤之后进行，从而除去背景探针信号。例如，二倍体，如超过约100个核苷的二倍体的中度严格的洗涤的实例是在45℃下用1×SSC洗涤15分钟。二倍体，如超过约100个核苷的二倍体的低严格的洗涤的实例是在40℃下用4-6×SSC洗涤15分钟。通常，在特定杂交试验中，观察到比不相关探针高2倍或更高的信号噪音比表明检测到了特异性杂交。
“多肽”指的是由氨基酸残基组成的聚合物，相关的天然发生的结构变体和通过肽键连接的其合成的非天然发生的类似物，相关的天然发生的结构变体和其合成的非天然发生的类似物组成的聚合物。合成的多肽可以，如用自动化的多肽合成仪合成。此处用常规符号来描述多肽序列，多肽序列的起点是氨基端，多肽的末端是羧基端。
术语“蛋白质”通常指的是大的多肽，例如，含有超过50个氨基酸的多肽。术语“蛋白质”也指含有多于一个多肽的二聚体、三聚体、多聚体。
“保守取代”指的是用功能类似的氨基酸取代多肽中的氨基酸。下述六组各自含有可相互取代的氨基酸：
丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)；
天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；
天冬酰胺(N)和谷酰胺(Q)；
精氨酸(R)和赖氨酸(K)；
异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)
苯基丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)
除非另有指明，在本发明中所用的术语“约”指数值上下浮动的范围不超过10％。例如，术语“约5μg/kg”的含义是4.5μg/kg到5.5μg/kg之间。再例如，“约1小时”指的是48分钟到72分钟之间。
5.2.输送结构
通常，本发明的输送结构是多肽，该多肽具有与PE的区域Ia和II相对应的结构域。这些结构域实现某些功能，包括但不限于细胞识别和转录，与PE的域的功能相对应。
除了与PE的功能区域相对应的分子部分外，本发明的输送结构还包括输送到个体的生物学区室中的大分子。该大分子可以导入到该输送结构的任何部分，而不会破坏细胞结合或穿胞运输活性。该大分子通过可裂解的连接子与输送结构的其它部分连接。
相应地，本发明的输送结构通常包括下述结构单元，每个单元赋予输送结构特定的功能：(1)“受体结合区”，其作为细胞表面受体的配体，介导该结构与细胞的结合；(2)“穿胞运输区域”，其介导从与粘膜顶部表面邻近的腔到粘膜底侧面的穿胞运输；(3)大分子；以及(4)将该大分子与该输送结构的其它部分连接的可裂解的连接子。
本发明的输送结构与常规的向个体局部或系统地输送大分子的技术相比具有若干优点。其中最重要的优点是不需要在个体的皮肤上用针穿孔就可以输送大分子。许多个体需要重复地施用大分子的常规剂量。例如，糖尿病人每天需要注射几次胰岛素以控制血糖浓度。如果大分子的输送无需注射就可完成，这将避免与注射相关的痛苦和潜在的并发症，从而提高了患者的生活质量。
而且，所述输送结构的许多实施方案可以在重组系统中构建和表达。重组使得可以构建具有插入位点的输送结构，该插入位点被设计成用于引入任何合适的大分子。这种插入位点可以使本领域的技术人员容易地快捷地获得输送新的大分子的输送结构，从而满足增加的需求。
此外，被极化上皮细胞的底侧膜处的酶裂解的连接子将大分子和输送结构其它部分连接，这可以使得该大分子在通过上皮细胞膜的穿胞运输后不久就可以从所述输送结构中脱离并从该输送结构的其它部分释放。这种脱离降低了诱导产生对抗该大分子的免疫反应的可能性。也可以使该大分子与靶发生反应而不被该输送结构其它部分干扰。
本发明输送结构的其它优点对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。
在某些实施方案中，本发明提供了输送结构，该输送结构包含受体结合区、穿胞运输区域、向个体输送的大分子，以及可裂解的连接子。可裂解的连接子的裂解将所述大分子与所述输送结构的其它部分分离。可裂解的连接子通过个体中极化上皮细胞底侧膜处的酶或个体血浆中的酶裂解。在某些实施方案中，极化上皮细胞底侧膜处的酶比极化上皮细胞顶侧的酶具有更高的活性。在某些实施方案中，个体血浆中的酶比极化上皮细胞顶侧的酶具有更高的活性
在某些实施方案中，所述输送结构还包含第二可裂解的连接子。在某些实施方案中，该第一和/或第二可裂解的连接子包含选自下述的氨基酸序列：Ala-Ala-Pro-Phe(SEQ ID NO.：4)、Gly-Gly-Phe(SEQ ID NO.：5)、Ala-Ala-Pro-Val(SEQ ID NO.：6)、Gly-Gly-Leu(SEQ ID NO.：7)、Ala-Ala-Leu(SEQ ID NO.：8)、Phe-Val-Arg(SEQ ID NO.：9)、Val-Gly-Arg(SEQ ID NO.：10)。在某些实施方案中，该第一和/或第二可裂解的连接子包含选自下述的氨基酸序列：Ala-Ala-Pro-Phe(SEQ ID NO.：4)、Gly-Gly-Phe(SEQ ID NO.：5)、Ala-Ala-Pro-Val(SEQ ID NO.：6)、Gly-Gly-Leu(SEQ ID NO.：7)、Ala-Ala-Leu(SEQ ID NO.：8)、Phe-Val-Arg(SEQ ID NO.：9)、Val-Gly-Arg(SEQ ID NO.：10)，并可被酶裂解，该酶在极化上皮细胞底侧膜处比在极化上皮细胞顶侧处具有更高的活性。在某些实施方案中，该第一和/或第二可裂解的连接子包括选自下述的氨基酸序列：Ala-Ala-Pro-Phe(SEQ ID NO.：4)、Gly-Gly-Phe(SEQ ID NO.：5)、Ala-Ala-Pro-Val(SEQ ID NO.：6)、Gly-Gly-Leu(SEQ ID NO.：7)、Ala-Ala-Leu(SEQ ID NO.：8)、Phe-Val-Arg(SEQ ID NO.：9)、Val-Gly-Arg(SEQ ID NO.：10)，并可被酶裂解，该酶在血浆中比在极化上皮细胞顶侧处具有更高的活性。
在某些实施方案中，存在于极化上皮细胞底侧膜处的酶选自组织蛋白酶GI、糜蛋白酶I、弹性蛋白酶I、枯草杆菌蛋白酶AI、枯草杆菌蛋白酶AII、凝血酶I和尿激酶I。
在某些实施方案中，所述受体结合区选自以下的受体结合区：假单胞菌外毒素A、霍乱毒素、肉毒杆菌毒素、白喉毒素、志贺毒素或类志贺毒素，单克隆抗体，多克隆抗体，单链抗体，TGFα，EGF，IGF-I，IGF-II，IGF-III，IL-1，IL-2，IL-3，IL-6，MIP-1a，MIP-1b，MCAF和IL-8。在某些实施方案中，该受体结合区于选自下述的细胞表面受体结合：α2-巨球蛋白受体、表皮生长因子受体、转铁蛋白受体、趋化因子受体、CD25、CD11B、CD11C、CD80、CD86、TNFα受体、TOLL受体、M-CSF受体、GM-CSF受体、清道夫受体和VEGF受体。在进一步的实施方案中，假单胞菌外毒素A的受体结合区为假单胞菌外毒素A的区域Ia。在更进一步的实施方案中，假单胞菌外毒素A的受体结合区具有SEQ ID NO.：1的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述穿胞运输区域选自假单胞菌外毒素A、肉毒杆菌毒素、白喉毒素、百日咳毒素、霍乱毒素、热敏性大肠杆菌(大肠杆菌)肠毒素、志贺毒素或类志贺毒素的穿胞运输区域。在进一步的实施方案中，该穿胞运输区域为假单胞菌外毒素A穿胞运输区域。在更进一步的实施方案中，所述假单胞菌外毒素A的受体结合区具有SEQ ID NO.：2的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述大分子选自核酸、肽、多肽、蛋白质和脂。在进一步的实施方案中，所述多肽选自多肽激素、细胞因子、趋化因子、生长因子和凝结因子。在进一步的实施方案中，该多肽选自IGF-I、IGF-II、IGF-III、EGF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8、IL-12、EPO、生长激素、因子VII、抗利尿激素、降血钙素、甲状旁腺激素、黄体激素释放因子、组织血纤维蛋白溶酶原活化剂、促肾上腺皮质激素(adrenocorticototropin)、脑啡肽和胰高血糖素样肽1。在更进一步的实施方案中，该多肽是人生长激素。在其它实施例中，所述蛋白质为人胰岛素。
在某些实施方案中，所述输送结构进一步包括第二大分子和第二可裂解的连接子，其中该第二大分子选自核酸、肽、多肽、蛋白质、脂和小的有机分子，其中该第二可裂解的连接子的裂解将所述第二大分子与所述输送结构的其它部分分离。在某些实施方案中，所述第一大分子为第一多肽，所述第二大分子为第二多肽。在某些实施方案中，该第一多肽和第二多肽连接形成多聚体。在某些实施方案中，该多聚体为二聚体、四聚体或八聚体。在进一步的实施方案中，该二聚体为抗体。
5.2.1.受体结合区
本发明的输送结构通常包括受体结合区。该受体结合区可以是本领域普通技术人员熟知的任何受体结合区，并不限于与上皮细胞的顶侧膜上的细胞表面受体结合。优选地，该受体结合区与细胞表面受体特异性结合。该受体结合区应与细胞表面受体以足够的亲和性结合，从而可以进行该输送结构的内吞作用。
在某些实施方案中，所述受体结合区包含肽、多肽、蛋白质、脂、糖类或小有机分子，或其组合。这些与上皮细胞的顶侧膜上的细胞表面受体结合的分子是本领域公知的。合适的肽或多肽包括但不限于：细菌毒素受体结合区，如PE、霍乱毒素、肉毒杆菌毒素、白喉毒素、志贺毒素或类志贺毒素等的受体结合区；抗体，包括单克隆抗体、多克隆抗体和单链抗体，或其衍生物；生长因子，如EGF、IGF-I、IGF-II、IGF-III等；细胞因子，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-6等；趋化因子，如MIP-1a、MIP-1b、MCAF、IL-8等；以及其它的配体，如CD4、免疫球蛋白超家族的细胞粘附分子、整联蛋白、IgA受体的特异性配体等。参见Pastan等人1992年的Annu.Rev.Biochem.61：331-54；以及美国专利5,668,255、5,696,237、5,863,745、5,965,406、6,022,950、6,051,405、6,251,392、6,440,419和6,488,926。本领域的技术人员可以根据所述受体结合区所结合的受体的表达方式选择合适的受体结合区。
受体结合区的合适配体包括但不限于：自身与细胞表面受体结合的脂类，如鞘氨醇-1-磷酸脂、溶血卵磷脂酸、溶血神经鞘氨脂、类维生素酸等；脂蛋白，如阿朴脂蛋白E、阿朴脂蛋白A等，以及糖脂质如脂多糖等；鞘糖脂，如N一脂酰鞘氨醇三己糖苷(globotriaosylceramide)和galabiosylceramide；等等。受体结合区的合适糖类包括但不限于单糖、二糖和包含如葡萄糖、果糖、半乳糖等单糖的多糖；以及糖蛋白如粘液素和选择素；等等。受体结合区的合适有机小分子包括但不限于：维生素，如维生素A、B1、B2、B3、B6、B9、B12、C、D、E和K；氨基酸；以及由上皮细胞顶侧的受体捕获和/或识别的其它小分子。美国专利5,807,832提供了这种小的有机分子受体结合区的实例，维生素B12。
在某些实施方案中，所述受体结合区可以与上皮细胞上的受体结合。在进一步的实施方案中，该受体结合区可以与上皮细胞顶侧膜处发现的受体结合。该受体结合区可以与位于上皮细胞的顶侧膜上的本领域的技术人员所公知但不受限制的任何受体结合。例如，该受体结合区可以与α2-MR、EGFR或IGFR结合。能与α2-MR结合的受体结合区的例子是PE的区域Ia。因此，在某些实施方案中，该受体结合区为PE的区域Ia。在其它的实施方案中，该受体结合区是可以与α2-MR结合的PE的区域Ia的一部分。能与EGFR结合的受体结合区的实例包括但不限于EGF和TGFα。能与IGFR结合的受体结合区包括但不限于IGF-I、IGF-II或IGF-III。因而，在某些实施方案中，该受体结合区为EGF、IGF-I、IGF-II或IGF-III。在其它的实施方案中，该受体结合区是可以与EGF或IGF受体结合的EGF、IGF-I、IGF-II或IGF-III的一部分。
在某些实施方案中，所述受体结合区与极化上皮细胞底侧膜处高度表达，但在抗原递呈细胞如树突细胞上不表达或低水平表达的受体结合。具有这种表达方式的受体结合区的实例包括但不限于TGFα、EGF、IGF-I、IGF-II和IGF-III。
在某些实施方案中，本发明的输送结构包括多个可以作为受体结合区发挥作用的区域。例如，除了另一个受体结合区外，该输送结构可以包含PE的区域Ia。
所述受体结合区可以以本领域技术人员所熟知但不受限制的用于连接这种分子的任何方法或方式连接到所述输送结构的其它部分上。在某些实施方案中，该受体结合区与该输送结构的其它部分一起表达成融合蛋白质。这种实施方案在该受体结合区和输送结构其它部分均由肽或多肽形成时特别有用。
在其它的实施方案中，所述受体结合区通过连接子与所述输送结构的其它部分连接。在另一些实施方案中，该受体结合区不通过连接子而与输送结构的其它部分连接。这两种实施方案在该受体结合区包含肽、多肽、蛋白质、脂类、糖类、核酸或有机小分子时是有用的。
在某些实施方案中，所述连接子可以在所述受体结合区和输送结构的其它部分之间形成共价键。在某些实施方案中，该共价键可以是肽键。在其它的实施方案中，该连接子可以通过一种或多种具有足够亲和性的非共价相互作用而将所述受体结合区与输送结构的其它部分连接。本领域的技术人员可以容易地识别可以用于本发明的具有足够亲合性的相互反应的连接子的输送结构。例如，可以将生物素连接到所述受体结合区，将链亲和素连接到所述分子的其它部分。在某些实施方案中，所述连接子可以直接将所述受体结合区与所述分子的其它部分连接。在其它的实施方案中，该连接子本身包括两个或多个结合的分子，从而将所述受体结合区连接到所述分子的其它部分。示例性连接子包括但不限于直链或支链的碳连接子、杂环碳连接子、取代的碳连接子、不饱和的碳连接子、芳香碳连接子、肽连接子等等。
在用连接子来连接所述受体结合区与输送结构的其它部分的实施方案中，该连接子可以用本领域技术人员熟知但不受限制的任何方法或方式连接到受体结合区和/或输送结构的其它部分上。例如，该连接子可以通过乙醚、酯、硫醚、硫酯、氨基化合物、酰亚胺、二硫化物、肽或其它合适部分连接到受体结合区和/或输送结构的其它部分上。本领域的普通技术人员可以根据所选择的受体结合区和连接子的物理化学属性来选择合适的连接子和连接连接子的方法。该连接子可以连接受体结合区或所述分子的其它部分上的任何合适的官能基团。例如，该连接子可以连接巯基(-S)、羧酸(COOH)或游离的氨基(-NH2)，这些官能基团可以与连接子上的合适官能团反应。在没有连接子时，这些官能基团也可用于将受体结合区直接连接到所述分子的其它部分。
而且，为了便于连接子和这些部分的连接，所述受体结合区和/或输送结构的其它部分可以被衍生化。例如，这种衍生化可以通过连接合适的衍生物完成，如从伊利诺斯州Rockford市的Pierce Chemical Company购得的衍生物。可选择地，衍生化可以涉及对受体结合区和/或输送结构的其它部分进行化学处理。例如，用高碘酸对糖类或糖蛋白受体结合区的糖部分进行的乙二醇裂解可以产生游离的乙醛基。这些游离的乙醛基可以和所述分子的其它部分上的肼基或自由氨基反应，从而连接该分子的这些部分。参考美国专利4,671,958。而且，熟练的技术人员可以在蛋白质上产生可用于获得二硫化物、硫酯、硫醚等连接子的反应活性基团。参考美国专利4,659,839。
在没有连接子的情况下，将连接子连接到受体结合区和/或输送结构的其它部分的任何方法也可用于将受体结合区与输送结构的其它部分的连接。在这些实施方案中，受体结合区通过适用于特定受体结合区的方法与输送结构的其它部分连接。因而，任何本领域公知但不受限制的适于将蛋白质、肽、多肽、核酸、糖类、脂类或小有机分子连接到输送结构的其它部分上的方法都可以用于将受体结合区连接到输送结构的其它部分。除了上述将连接子连接到受体结合区或输送结构其它部分的方法外，受体结合区可以按照如下美国专利所述与输送结构的其它部分连接：美国专利6,673,905、6,585,973、6,596,475、5,856,090、5,663,312、5,391,723、6,171,614、5,366,958和5,614,503。
在某些实施方案中，受体结合区可以是单克隆抗体。在其中的一些实施方案中，将嵌合的免疫原表达为融合蛋白质，该融合蛋白质包括免疫球蛋白的重链，该免疫球蛋白对该嵌合的免疫原所要结合的细胞上的受体特异。然后，该免疫球蛋白的轻链可以和该嵌合免疫原一起表达，从而形成轻链-重链的二聚物。在其它实施方案中，抗体可以独立地从嵌合免疫原的其它部分表达和组装，并化学地连接于其上。
5.2.2.穿胞运输区域
本发明的输送结构还包括穿胞运输区域。该穿胞运输区域可以是本领域技术人员公知的，影响已与上皮细胞顶侧膜的细胞表面受体结合的嵌合蛋白质的穿胞运输的任何穿胞运输区域。在某些实施方案中，穿胞运输区域是来自PE、白喉毒素、百日咳毒素、霍乱毒素、热敏性大肠杆菌肠毒素、志贺毒素或类志贺毒素的穿胞运输区域。例如，参考美国专利5,965,406和6,022,950。在优选的实施方案中，穿胞运输区域为PE的区域II。
尽管不是必要，但所述穿胞运输区域可以包括天然PE区域II的全部氨基酸序列，该天然PE区域II包含了PE的253-364位残基。例如，该穿胞运输区域可以包含含有PE区域II的280-344位残基的部分PE。位置339和343的氨基酸对于穿胞运输很重要。参考Siegall等人1991年的Biochemistry 30：7154-59。而且，只要穿胞运输的活性没有完全消除，穿胞运输区域的氨基酸序列可以进行保守取代或非保守取代。下文叙述了本领域技术人员常用的用于检测穿胞运输区域是否有穿胞运输活性的代表性试验。
不受任何特定理论或反应机理的约束，在所述输送结构与极化上皮细胞顶侧表面上的受体结合后，认为穿胞运输区域可以允许该输送结构穿过极化上皮细胞。这种穿过极化上皮细胞的输送此处称之为“穿胞运输”。这种输送使得该输送结构可以从极化上皮细胞基膜处释放。
5.2.3.输送大分子
本发明的输送结构也包括大分子。该大分子可以通过本领域技术人员公知但不受限制的方法连接到输送结构的其它部分上。在某些实施方案中，将大分子与输送结构的其它部分一起表达为融合蛋白质。在这种实施方案中，只要受体结合区、穿胞运输区域和大分子保持活性，该大分子就可以被插入或连接到所述输送结构的任何部分。该大分子通过可裂解的连接子或可裂解的连接子的组合与输送结构其它部分连接，如下所述。
在天然的PE中，Ib环(区域Ib)包括氨基酸365-399，其结构特征为在位置372和379处的两个半胱氨酸之间形成二硫键。PE的该部分对于PE的公知活性包括细胞结合、穿胞运输、ER保持或ADP核糖基化活性不是必需的。因此，区域Ib可以被完全删除，或者可以修饰为包含大分子。
因而，在某些实施方案中，该大分子可以插入到区域Ib中。如果可以，该大分子可以插入到区域Ib中，其中位置372和379处的半胱氨酸没有交联。这可以通过还原半胱氨酸之间的二硫键、通过从Ib区域完全删除半胱氨酸、通过使半胱氨酸突变成其它残基如丝氨酸、或者通过其它类似的技术来实现。可选择地，该大分子可以插入到位置372和379处的两个半胱氨酸之间的Ib环中。在这种实施方案中，所述半胱氨酸之间的二硫键可以根据需要用于约束大分子。不管怎样，在该大分子插入到PE的区域Ib或输送结构的其它部分中的实施方案中，该大分子的侧翼连接可裂解的连接子，从而可裂解的连接子的裂解可以将该大分子从输送结构的其它部分释放。
在其它的实施方案中，该大分子可以与输送结构的多肽部分的N-末端或C-末端连接。在这种实施方案中，所述的连接方法应该设计为避免干扰输送结构的其它功能，如受体结合或穿胞运输。在其它实施方案中，该大分子可以与输送结构的氨基酸侧链连接。该大分子通过可裂解的连接子与输送结构的其它部分连接，如下文所述。在这种实施方案中，要输送的大分子可以通过一或多个可裂解的连接子与输送结构的其它部分连接，从而使可裂解的连接子的裂解可以将大分子与输送结构的其它部分分离。需要注意的是，在某些实施方案中，在可裂解的连接子裂解后，除了相关大分子外，该相关大分子还包括仍与其连接的短的(1-20个氨基酸，优选为1-10个氨基酸，特别优选为1-5个氨基酸)前导肽。优选地，这种前导肽不会影响大分子的活性或免疫性能。
在大分子与输送结构的另一部分一起被表达为融合蛋白质的实施方案中，该大分子可以通过本领域技术人员公知但不受限制的任何方法插入到输送结构中。例如，可以将与所述大分子对应的氨基酸直接插入到输送结构中，天然氨基酸序列有或者没有被删除。在某些实施方案中，PE的所有或部分Ib区域可以删除或用大分子替换。在某些实施方案中，Ib环的半胱氨酸残基被删除，从而使大分子不受约束。在其它的实施方案中，Ib环的半胱氨酸残基通过二硫键连接，从而约束大分子。
所述大分子可以是需要引入到个体中的任何大分子。因而，该大分子可以是肽、多肽、蛋白质、核酸、糖类，脂类、糖蛋白类、合成的有机或无机化合物，或其组合。该大分子也可以是可检测的化合物，如辐射不可透过的化合物，包括空气、钡和磁性化合物。在某些实施方案中，该大分子可以是可溶于或不溶于水的。在某些实施方案中，该大分子可以是在引入到个体的血流中时可以执行所需的生物学活性的大分子。例如，该大分子可以有受体结合活性、酶活性、信使活性(即作为激素、细胞因子神经传递素，或其它信号分子)、发光或其它可检测的活性、或常规活性或其任何组合。例如，在诊断性实施方案中，该大分子自身是药学可接受的γ-辐射基团或与其结合，该γ-辐射基团包括但不限于铟、锝、磁性颗粒、辐射不可透过的物质如空气或钡、以及发光物质。
在其它的实施方案中，输送的大分子可以影响个体的生物学区室，而不影响个体的血液。例如，在某些实施方案中，大分子可以在淋巴系统中发挥作用。在其它实施方案中，大分子可以在器官、组织，如个体的肝、心脏、肺、胰腺、肾、脑、骨髓等中发挥作用。在这种实施方案中，大分子可以以可检测的浓度存在或不存在于血液、淋巴或其它生物学体液中，也可以在作用位点积累足够的浓度以产生生物学效果。
而且，所述大分子可以是包含多个多肽亚单位的蛋白质。例如，该蛋白质可以是二聚物、三聚物或更高级别的多聚物。在某些实施方案中，两个或多个蛋白质亚单位可以通过共价键如二硫键连接。在其它的实施方案中，蛋白质亚单位可以通过非共价键连接。本领域的技术人员可以常规地识别这些蛋白质，并测定该亚单位是否正确连接，例如用免疫测定法测定。示例性蛋白质包含多个可以用本发明的输送结构输送的多肽链，包括并不限于抗体、胰岛素、IGF I等。
因此，在某些实施方案中，所述大分子为肽、多肽或蛋白质。在某些实施方案中，大分子包括肽或含有约5、8、10、12、15、17、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、400、600、800或1000个氨基酸的多肽。在某些实施方案中，大分子是含有1、2、3、4、5、6、7、8或更多多肽的蛋白质。在某些实施方案中，所述肽、多肽或蛋白质是通常通过注射给予个体的分子。肽或多肽的实例包括但不限于IGF-I、IGF-II、IGF-III、EGF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8、IL-12、EPO、生长激素、凝结因子如因子VII、抗利尿激素、降血钙素、甲状旁腺激素、黄体生成激素释放因子、组织血浆酶原活化剂、促肾上腺皮质激素、脑啡肽、拟胰增血糖素肽1、冬酰胺酶等。在优选的实施方案中，所述大分子是胰岛素。在某些优选的实施方案中，所述多肽是生长激素。在更优选的实施方案中，所述多肽是人生长激素。在同等优选的实施方案中，所述多肽是IFN-α，更优选为IFNα-2b。在同等优选的实施方案中，所述多肽是胰岛素或胰岛素原。在其它实施方案中，所述多肽是绿色荧光蛋白质。所有这些大分子的序列对于本领域技术人员来说是已知的，这些大分子和输送结构的连接对于本领域技术人员来说也是已知的，如下文所述。
在某些实施方案中，所述大分子可以选择成不被上皮细胞基膜上的酶裂解。例如，在实施例中所述的试验可以用来常规地检测这种裂解酶是否能够裂解所要输送的大分子。如果能，就可以常规地改变该大分子以消除被裂解酶所识别的不需要的氨基酸序列。然后用本领域常用的方法测试该被改变的大分子，以确保该大分子仍具有活性。
根据本发明，可以被输送的大分子的其它实例包括但不限于：抗肿瘤化合物如亚硝基脲，如双氯乙基亚硝脲、环己亚硝脲、甲环亚硝脲、strepzotocin；甲基肼，如甲苄肼、甲氮咪胺；类固醇激素，如糖皮质激素、雌激素、黄体酮、雄性激素、四氢去氧皮质酮；免疫活性化合物如免疫抑制剂，如乙嘧啶、trimethopterin、青霉胺、环孢霉素、咪唑硫嘌呤；以及免疫刺激物，如左咪唑、二乙基二硫代氨基甲酸酯、脑啡肽、内啡肽；抗菌化合物如抗菌素，如β-内酰胺、青霉素、头孢菌素、carbapenims和单内酰环类、β-内酰胺酶抑制剂、氨基糖苷类抗生素、大环内酯、四环素、奇放线菌素；抗疟药，阿米巴剂；antiprotazoals；抗真菌剂，如两性霉素β；抗病毒素，如无环鸟苷、疱疹净、病毒唑、三氟尿苷、vidarbine、更昔洛韦；驱虫剂；antihalmintics；放射性药剂；胃肠药；血液学化合物；免疫球蛋白；血液凝结蛋白质，如抗血友病因子、因子IX络合剂；抗凝血剂，如血液凝结剂、肝磷脂Na；柔瘢药抑制剂，如止血环酸；心血管药物；辅助的抗肾上腺素药；中枢作用的高血压药，如甲基多巴、盐酸乙基多巴；直接血管扩张的抗高血压药，如氯甲苯噻嗪、盐酸肼苯哒嗪；作用血管紧张素系统的药物；外周血管扩张药物，如芬妥胺；抗心绞痛的药物；强心剂配糖；正性肌力扩血管药，如氨力农、米力农、依诺昔酮、芬诺昔酮、伊吗唑坦、硫马唑；抗节律紊乱药；钙内流阻断药；调血脂的药，如雷尼替丁、波生坦(bosentan)、rezulin；与呼吸有关的药；sypathomimetic药，如沙丁胺醇、比托特罗、盐酸多巴酚丁胺、盐酸多巴胺、麻黄碱素So、肾上腺素、盐酸氟苯丙胺、盐酸异丙肾上腺素、盐酸甲氧胺、酒石酸去甲肾上腺素、盐酸苯肾上腺素、盐酸羟苄羟麻黄碱；类胆碱药物，如氯化乙酰胆碱；抗胆碱脂酶，如氯化腾喜龙；胆碱脂酶激动剂；肾上腺素阻断药，如盐酸阿西布特诺、阿替洛尔、盐酸艾司洛尔、盐酸拉贝洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、甲磺酸芬妥胺、盐酸普萘洛尔；抗蕈毒碱药物，如甲溴辛托品、硫酸阿托品、clinidium Br、格隆溴胺、异丙托溴铵、氢溴酸车莨菪碱；神经肌肉阻断药；去极化药，如阿曲库胺、己芴溴铵、碘二甲箭毒、氯化琥珀胆碱、氯化筒箭毒碱、维库溴胺；中枢作用的肌肉松弛剂，如巴氯芬；神经传递素和神经传递素试剂，如乙酰胆碱、腺苷、三磷酸腺苷；氨基酸神经传递素，如刺激性氨基酸、GABA、氨基乙酸；生物胺神经递质，如多巴胺、肾上腺素、组胺、去甲肾上腺素、真蛸胺、5-羟色胺、酪胺；神经肽，氮氧化物，K+信道毒素；抗帕金森病的药物，如amaltidine HCl、甲磺酸苯托品、卡比多巴；利尿药，如二氯磺胺、甲醋唑胺、卞氟噻嗪、泊利噻嗪；抗偏头痛药，如甲磺酸氨丁三醇卡波前列素、二甲麦角新碱。
根据本发明，其它可以输送的大分子的实例还包括并不限于下述物质：激素如垂体激素，如人工绒毛膜促性腺激素、促皮质激素、促生育素、生长激素、iorticotropin、促甲状腺素释放素、促甲状腺素、抗利尿激素、赖氨加压素；肾上腺激素，如丙酸倍氯米松、倍他米松、地塞米松、去炎松；胰腺激素，如胰高血糖素、胰岛素；甲状旁腺激素，如dihydrochysterol；甲状腺激素，如降血钙素依替膦酸二钠、甲状腺氨酸钠、碘塞罗宁钠、liotrix、甲状腺球蛋白、醋酸特利加压素；抗甲状腺药剂；雌激素；黄体酮和拮抗剂；激素避孕药；睾丸激素；胃肠激素，如胆囊收缩素、enteroglycan、甘丙肽、胃抑制多肽、表皮生长因子-尿抑肠素、胃抑制多肽、胃泌激素-释放肽、胃肠激素、五肽促胃酸激素、四肽促胃酸激素、蠕动素、肽YY、分泌素、血管活性的的肠肽、辛卡利特。
根据本发明，其它可以输送的大分子的实例还包括并不限于下述物质：酶，如透明质酸酶、链激酶、组织血浆酶原激动剂、尿激酶、PGE-腺苷脱氨酶；静脉麻醉剂，如氟哌利多、依托咪酯、芬太尼柠檬酸酯/氟哌利多、海索比妥、盐酸克他命、美索比妥钠、硫戊比妥钠、戊硫代巴比妥钠；抗癫痫的药物，如卡巴咪嗪、clonazepam、双丙戊酸钠、乙琥胺、美芬妥英、甲乙双酮、苯妥英、普奈米东。
根据本发明，其它可以输送的大分子的实例还包括并不限于下述物质：肽和蛋白质如锚蛋白、抑制样蛋白、细菌膜蛋白、网格蛋白、连接蛋白、抗肌营养不良蛋白、内皮素受体、血影蛋白、选择素、细胞因子；趋化因子；生长因子、胰岛素、促红细胞生成素(EPO)、肿瘤坏死因子(TNF)、神经肽、神经肽Y、神经降压素、转化生长因子α、转化生长因子β、干扰素(IFN)；激素，生长抑制剂，如染料木黄酮、类固醇等；糖蛋白，如ABC转运蛋白、血小板糖蛋白、GPIb-IX络合剂、GPIIb-IIIa络合剂、玻连蛋白、血栓调节蛋白、CD4、CD55、CD58、CD59、CD44、与淋巴细胞功能相关的抗原、细胞间的粘附分子、血管细胞粘附分子、Thy-1、反向转运蛋白、CA-15-3抗原、纤连蛋白、层连蛋白、与髓磷脂相关的糖蛋白、GAP、GAP-43。
根据本发明，其它可以输送的大分子的实例还包括并不限于下述细胞因子和细胞因子受体：白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-1受体、IL-2受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-5受体、IL-6受体、IL-7受体、IL-8受体、1L-9受体、IL-10受体、IL-11受体、IL-12受体、IL-13受体、IL-14受体、IL-15受体、IL-16受体、IL-17受体、IL-18受体、淋巴因子抑制因子、巨噬细胞克隆刺激因子、血小板衍生的生长因子、干细胞因子、肿瘤生长因子β、肿瘤坏死因子、淋巴毒素、Fas、粒细胞克隆刺激因子、粒细胞巨噬细胞克隆刺激因子、干扰素α、干扰素β、干扰素γ。
根据本发明，其它可以输送的大分子的实例还包括并不限于下述物质：生长因子和蛋白质激素如促红细胞生成素、血管生成素、肝细胞生长因子、纤维原生长因子、角化细胞生长因子、神经生长因子、肿瘤生长因子α、血小板生成素、甲状腺刺激因子、甲状腺释放激素、神经营养生长因子、表皮生长因子、VEGF、绒毛神经营养因子、LDL、生长调节素、胰岛素生长因子、类胰岛素生长因子I和II；趋化因子，如ENA-78、ELC、GRO-α、GRO-β、GRO-γ、HRG、LIF、IP-10、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MIP-1α、MIP-1β、MIG、MDC、NT-3、NT-4、SCF、LIF、瘦素、RANTES、淋巴细胞趋化因子、eotaxin-1、eotaxin-2、TARC、TECK、WAP-1、WAP-2、GCP-1、GCP-2；α-趋向因子受体，如CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7；以及β-趋向因子受体，如CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7。
根据本发明，其它可以输送的大分子的实例还包括并不限于：化学治疗剂，如对各种人类癌症有效的化学治疗药或抗肿瘤试剂，该癌症包括白血病、淋巴瘤、上皮性恶性肿瘤、肉瘤、骨髓瘤等，化学治疗药或抗肿瘤试剂如阿霉素、丝裂霉素、顺铂、正定霉素、博来霉素、放射菌素D和新制癌菌素。
根据本发明，其它可以输送的大分子的实例还包括并不限于：抗体，如分化抗原CD-1到CD-166的反生簇(anti-cluster)和这些分子的配体或反受体；抗细胞因子抗体，如抗IL-1到抗IL-18及这些分子的受体；抗免疫受体抗体；抗T细胞受体的抗体，主要的组织相容性复合剂I和II，B细胞受体，选择素杀伤抑制剂受体，杀伤激动性受体，OX-4U，MadCAM-1，Gly-CAM1，整联蛋白，钙黏着蛋白，唾液酸粘附素，Fas，CTLA-4，Fcγ-受体，Fca-受体，Fcε-受体，Fcμ-受体，以及它们的配体；抗金属蛋白酶抗体，如胶原酶特异性抗体，MMP-1到MMP-8，TIMP-1，TIMP-2；抗细胞溶解/促炎分子，如穿孔素、补体组分、前列腺激素、氮氧化物、凝血氧烷；以及抗粘附分子，如癌胚抗原、层粘连蛋白、纤粘连蛋白。
根据本发明，其它可以输送的大分子的实例还包括并不限于：抗病毒试剂，如反向转录酶抑制剂和核苷类似物，如ddI、ddC、3TC、ddA、AZT；蛋白酶抑制剂，如沙奎那韦甲硫酸盐、ABT-538；以及RNA处理中的抑制剂，如病毒唑。
进一步地，可以通过本发明的输送结构输送的大分子的具体实例有：卡托普利、蒙诺、Pravachol、Avapro、Plavix、Cefzil、Duricef/头孢羟氨苄、Azactam、Videx、赛瑞特、马斯平、足叶乙甙、佳铂帝、顺氯氨铂、泰素、UFT、Buspar、Serzone、Stadol NS、Estrace、Glucophage(Bristol-Myers Squibb)；头孢克罗、罗拉碳头孢、地红霉素、百忧解、Darvon、培高利特、再普乐、优泌乐、尼扎地平、健泽、Evista(礼来制药公司)；Vasotec/Vaseretic、洛伐他汀、辛伐他汀、Prinivil/Prinizide、波依定、氯沙坦/海捷亚、Pepcid、Prilosec、泰能、重组单抗原乙型肝炎疫苗、水痘疫苗、Timoptic/XE、盐酸杜塞酰胺、波斯卡、福善美、心宁美、克滤满、保法止、Vioxx、顺尔宁、利扎曲坦、伊维菌素(Merck&Co.)、氟康唑、优立新、舒普深、希舒美、Trovan、ProcardiaXL、Cardura、络活喜、多非利特、凡地那、Zoloft、齐哌西酮、Glucotrol XL、仙特明、依来曲普坦、万艾可、屈洛昔芬、Aricept、Lipitor(Pfizer)；Vantin、地拉夫定甲磺酸酯、Vistide、Genotropin、优降糖/Glyn./Glyb.、法安明、TotalMedrol、Xanax/阿普唑仑、思尔明、酣乐欣/三唑仑、Freedox、Dostinex、瑞波西汀、普拉克索、Pharmorubicin、阿霉素、Camptosar、Remisar、狄波-普维拉、凯威捷、Detrusitol、Estring、黏弹剂、适利达、落健(Pharmacia&Upjohn)、诺衡、Accrupil、癫能停、康耐视、Neurontin、Loestrin、Dilzem、Fempatch、Estrostep、曲格列酮、立普妥、Omnicef、FemHRT、苏拉明和克林沙星(Warner Lambert)。
可以通过本发明的输送结构输送的大分子的其它实例可以在下述文献中找到：Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics，第9版，McGraw-Hill 1996。该文全部并入本发明，作为本发明的一部分。
在某些实施方案中，所述大分子在给药时可以是非活性或较低活性的形式，然后在个体体内被激活。例如，大分子可以是掩盖了活性位点的肽或多肽。除去掩盖部分后，该肽或多肽可以被激活。如果是肽或多肽掩盖剂，可以通过肽酶或蛋白酶除去。可选择地，该掩盖剂可以是通过个体体内酶除去的化学部分。在有限制的情况下需要激活大分子时，可以采用这种方法。例如，仅需在个体肝脏激活大分子时这种方法时有用的。在这些情况下，大分子可以选择包含掩盖部分，该掩盖部分可以通过肝脏中存在而在其它器官或组织中不存在的酶去除。制备和使用这种掩盖的大分子的方法和组合物可以在美国专利6,080,575、6,265,540和6,670,147中找到。
在这种实施方案的另一实例中，所述大分子可以是大分子原(pro-macromolecule)，其通过生物学活性，如通过在个体体内加工、呈递而被激发。例如，示例的大分子胰岛素原可以通过本发明的输送结构输送。大分子原输送后，可以通过合适的酶在体内激活。虽然认为，胰岛素原由在胰腺β-细胞分泌颗粒中浓度最高的酶(内蛋白酶PC2和PC3)加工，也认为这种酶在其它区室中的浓度足以将大分子原激活成完全活性的形式。而且，需要注意的是，许多大分子原，例如包括胰岛素原，也显示出与完整活性分子一样的活性。例如参考Desbuquois等人2003年的Endocrinology12：5308-5321。因此，即使不是所有的大分子原转化为完全活性形式，但在很多情况下，大分子原仍然在个体体内具有所需的生物活性。
5.2.4.可裂解的连接子
在本发明的输送结构中，给个体输送的大分子通过一个或多个可裂解的连接子与输送结构的其它部分连接。输送结构中存在的可裂解的连接子的数目至少部分地取决于所述大分子相对于该输送结构的其它部分的位置及该大分子的性质。当大分子插入到输送结构中时，该大分子可以通过可裂解的连接子侧翼连接，从而使两个连接子处的裂解可以分离出该大分子。侧翼连接的连接子可以彼此相同或不同。当大分子通过单个连接子的裂解而从输送结构的其它部分分离时，输送结构可以包含单个可裂解的连接子。而且，当大分子是例如二聚物或其它多聚物，该大分子的每个亚单位通过可裂解的连接子处的裂解可以从输送结构的其它部分和/或该大分子的其它亚单位分离。
通常，所述可裂解的连接子可以被存在于上皮细胞底侧膜处或附近的裂解酶裂解。通过选择被这些酶裂解的可裂解的连接子，大分子在穿过粘膜的穿胞运输后可以从输送结构的其它部分释放，并从上皮细胞释放入底侧膜的细胞基质中。而且，可以使用存在于上皮细胞内侧的裂解酶，从而使可裂解的连接子在输送结构从底侧膜释放之前就被裂解而使输送结构和大分子从细胞底侧膜处释放，只要该裂解酶在输送结构进入极化上皮细胞中的输送通道前不裂解该输送结构。
在某些实施方案中，所述裂解酶为肽酶。在其它实施方案中，裂解酶为RNAse。在其它实施方案中，裂解酶可以裂解糖类。优选的肽酶包括但不限于组织蛋白酶GI、胰凝乳蛋白酶I、弹性蛋白酶I、枯草杆菌蛋白酶AI、枯草杆菌蛋白酶AII、凝血酶I和尿激酶I。表1列出了这些酶及由特定肽酶裂解和识别的氨基酸序列。
表1
| 存在于底侧粘膜附近的肽酶 | |
| 肽酶 | 识别并裂解的氨基酸序列 |
| 组织蛋白酶GI | Ala-Ala-Pro-Phe(SEQ ID NO.：4) |
| 胰凝乳蛋白酶I | Gly-Gly-Phe(SEQ ID NO.：5) |
| 弹性蛋白酶I | Ala-Ala-Pro-Val(SEQ ID NO.：6) |
| 枯草杆菌蛋白酶AI | Gly-Gly-Leu(SEQ ID NO.：7) |
| 枯草杆菌蛋白酶AII | Ala-Ala-Leu(SEQ ID NO.：8) |
| 凝血酶I | Phe-Val-Arg(SEQ ID NO.：9) |
| 尿激酶I | Val-Gly-Arg(SEQ ID NO.：10) |
在某些实施方案中，所述输送结构可以包含多个可裂解的连接子，其中任一可裂解的连接子的裂解可以将需要输送的大分子从输送结构分离。在某些实施方案中，可裂解的连接子根据需要输送的肽、多肽或蛋白质大分子的序列进行选择，从而避免使用含有所输送的大分子中的序列的可裂解的连接子。例如，如果大分子含有AAL，可裂解的连接子就可以选择成被不识别该序列的酶裂解。
更进一步，可裂解的连接子优选显示出比输送结构的其它部分更容易裂解。本领域技术人员可以意识到，许多肽或多肽序列可以被肽酶或蛋白酶裂解。某些实施方案中，在施用输送结构期间，该可裂解的连接子被选择成相对于该输送结构中的其它氨基酸序列被优先裂解。在某些实施方案中，在输送结构输送到个体血流中后，所述受体结合区基本上(例如约99％、95％、90％、85％、80％、或约75％)是完整的。在某些实施方案中，在输送结构输送到个体血流中后，所述转运区域基本上(例如约99％、95％、90％、85％、80％、或约75％)是完整的。在某些实施方案中，在输送结构输送到个体血流中后，所述大分子基本上(例如约99％、95％、90％、85％、80％、或约75％)是完整的。在某些实施方案中，在输送结构输送到个体血流中后，可裂解的连接子基本上(例如约99％、95％、90％、85％、80％、或约75％)是完整的。
在其它实施例中，可裂解的连接子由个体血浆中的裂解酶裂解。本领域技术人员公知的存在于个体血浆中的酶可以用于裂解该可裂解的连接子。与使用极化上皮细胞底侧膜附近存在的裂解酶相比，用这种酶裂解可裂解的连接子不是优选的，因为相信在底侧膜附近的裂解效率要更高。不过，如果本领域技术人员检测到血浆酶介导的裂解效率足够输送结构发生足够比例的裂解而避免副效应，这种血浆裂解酶也可以用于裂解输送结构。因此，在某些实施方案中，可裂解的连接子用选自下述的酶进行裂解：Caspase-1、Caspase-3、蛋白质前体转化酶1、蛋白质前体转化酶2、蛋白质前体转化酶4、蛋白质前体转化酶4 PACE 4、脯氨酰寡肽酶、内皮素裂解酶、二肽-肽酶IV、信号肽酶、脑啡肽酶、血管紧张肽原酶和酯酶。参考美国专利6,673,574。表2列出了这些酶及由特定肽酶识别的氨基酸序列。这些肽酶裂解这些序列的肽，这些肽在N-末端氨基酸含有星号标记。
表2
| 血浆酶 | |
| 肽酶 | 识别并裂解的氨基酸序列 |
| Caspase-1 | Tyr-Val-Ala-Asp-Xaa*(SEQ ID NO.：11) |
| Caspase-3 | Asp-Xaa-Xaa-Asp-Xaa*(SEQ ID NO.：12) |
| 蛋白质前体转化酶1蛋白质前体转化酶2 | Arg-(Xaa)n-Arg-Xaa*；n＝0，2，4 or 6(SEQ ID NO.：13)Lys-(Xaa)n-Arg-Xaa*；n＝0，2，4，or 6(SEQ ID NO.：14) |
| 蛋白质前体转化酶4 | Glp-Arg-Thr-Lys-Arg-Xaa*(SEQ ID NO.：15) |
| 蛋白质前体转化酶4 PACE 4 | Arg-Val-Arg-Arg-Xaa*(SEQ ID NO.：16)Decanoyl-Arg-Val-Arg-Arg-Xaa*(SEQ ID NO.：17) |
| 脯氨酰寡肽酶、内皮素裂解酶与二肽-肽酶IV的组合 | Pro-Xaa*-Trp-Val-Pro-Xaa(SEQ ID NO.：18) |
| 信号肽酶 | Trp-Val*-Ala-Xaa(SEQ ID NO.：19) |
| 脑啡肽酶与二肽-肽酶IV的组合 | Xaa-Phe*-Xaa-Xaa(SEQ ID NO.：20)Xaa-Tyr*-Xaa-Xaa(SEQ ID NO.：21)Xaa-Trp*-Xaa-Xaa(SEQ ID NO.：22) |
| 血管紧张肽原酶与二肽-肽酶IV的组合 | Asp-Arg-Tyr-Ile-Pro-Phe-His-Leu*-Leu-(Val，Ala or Pro)-Tyr-(Ser，Pro，or Ala)(SEQ ID NO.：23) |
因此，在某些更优选的实施方案中，可裂解的连接子可以是本领域技术人员公知的任何可以被上皮细胞底侧膜处的酶裂解的可裂解的连接子。在某些实施方案中，可裂解的连接子包含肽。在其它的实施方案中，可裂解的连接子包含核酸，如RNA或DNA。在其它实施方案中，可裂解的连接子包含糖类，如二糖和三糖。在某些实施方案中，可裂解的连接子是含有选自以下氨基酸序列的肽：Ala-Ala-Pro-Phe(SEQ ID NO.：4)、Gly-Gly-Phe(SEQ ID NO.：5)、Ala-Ala-Pro-VaI(SEQ ID NO.：6)、Gly-Gly-Leu(SEQ IDNO.：7)、Ala-Ala-Leu(SEQ ID NO.：8)、Phe-Val-Arg(SEQ ID NO.：9)、Val-Gly-Arg(SEQ ID NO.：10)。
可选择地，在次优选的实施方案中，可裂解的连接子也可以是本领域技术人员公知的任何可以被施用输送结构的个体中的血浆酶裂解的可裂解的连接子。在某些实施方案中，可裂解的连接子包含肽。在其它的实施方案中，可裂解的连接子包含核酸，如RNA或DNA。在其它实施方案中，可裂解的连接子包含糖类，如二糖和三糖。在某些实施方案中，可裂解的连接子是含有氨基酸序列的肽，该氨基酸序列选自表2中所列出的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述输送结构包含多个可裂解的连接子。在某些实施方案中，任何可裂解的连接子的裂解将所输送的大分子从输送结构的其它部分上分离。在某些实施方案中，输送结构包含可被上皮细胞底侧膜处的酶裂解的可裂解的连接子和可被施用输送结构的个体中的血浆酶裂解的可裂解的连接子。
进一步地，下述表4和5列出了测试肽酶在极化上皮细胞顶侧膜和底侧膜处裂解底物的能力试验结果。这些酶识别的序列在本领域是公知的。因而，在某些实施方案中，所述输送结构含有表4和5所列出的酶所裂解的可裂解的连接子。优选的肽酶在膜的底侧处具有更高的活性。具体的优选肽酶在底侧处具有更高的活性(相对于顶侧高100％、200％和更多)。因此，在某些实施方案中，可裂解的连接子由在底侧膜处表现出的活性比顶侧膜处高50％的酶裂解。在某些实施方案中，可裂解的连接子由在底侧膜处表现出的活性比顶侧膜处高100％的酶裂解。在某些实施方案中，可裂解的连接子由在底侧膜处表现出的活性比顶侧膜处高200％酶裂解。在某些实施方案中，可裂解的连接子由在底侧膜处表现出的活性比顶侧膜处高500％的酶裂解。在某些实施方案中，可裂解的连接子由在底侧膜处表现出的活性比顶侧膜处高1000％的酶裂解。在某些实施方案中，可裂解的连接子由在底侧膜处表现出的活性比顶侧膜处高2000％的酶裂解。在某些实施方案中，可裂解的连接子由在底侧膜处表现出的活性比顶侧膜处高3000％的酶裂解。在某些实施方案中，可裂解的连接子由在底侧膜处表现出的活性比顶侧膜处高5000％的酶裂解。在某些实施方案中，可裂解的连接子由在底侧膜处表现出的活性比顶侧膜处高10,000％的酶裂解。
更进一步地，表4和5中的结果表明，某些酶在某些上皮细胞系中比其它上皮细胞系中具有更高的浓度或表现出更高的活性。因此，下述试验可以用来检测大分子所穿过的特定上皮细胞系是否具有所需的裂解活性。在某些实施方案中，在呼吸上皮细胞中具有裂解活性，而在肠上皮细胞中没有；在其它实施例中，在呼吸上皮细胞中没有裂解活性，而在肠上皮细胞中有。在某些实施方案中，在呼吸上皮细胞和肠上皮细胞中都有裂解活性。
在某些实施方案中，和膜顶侧相比，所述可裂解的连接子优选用上皮细胞底侧膜处的酶裂解。下述的实施例6.4和随后的表7描述了用于评价这些酶的活性的检测方法，提供了公知的人蛋白酶和肽酶的简称和登记号。由这些蛋白酶和肽酶识别的任何可裂解序列也可以用于本发明的方法和组合物中，其中，和上皮细胞膜的顶侧相比，这些蛋白酶和肽酶优选裂解上皮细胞底侧膜处或血浆中的测试底物。在这种实施方案中，根据本领域公知的标准程序或该蛋白酶和肽酶所识别的已知序列，本领域的技术人员可以容易地确定这些肽酶和蛋白酶识别的氨基酸序列。
下述实施例提供了识别极化上皮细胞底侧膜处和附近的酶的方法。本领域的技术人员可以常规地使用这些方法鉴别其它的裂解酶和由这些酶识别并裂解的化学结构。含有这些可裂解的连接子的输送结构和用含有这些可裂解的连接子的输送结构输送大分子的方法也包含在本发明的范围内，无论这些裂解酶是否出现在表7中。
在其它的实施方案中，所述可裂解的连接子可以是在所述输送结构的环境发生变化后裂解。例如，可裂解的连接子可以是对pH敏感的可裂解的连接子，输送结构从极化上皮细胞底侧膜释放时经历的pH变化可以裂解该连接子。例如，肠内腔是强碱性的，而血浆基本是中性的。因而，可裂解的连接子可以是从碱性转变到中性时发生裂解的部分。裂解可裂解的连接子的输送结构的环境变化可以是输送结构从极化上皮细胞底侧膜释放时经历的任何环境变化，这点是本领域技术人员公知的，但并不限于此。
5.3.输送大分子的方法
另一方面，本发明提供了一种向个体系统地或局部地输送大分子的方法。这些方法通常包含向需要输送大分子的个体的粘膜给予本发明的输送结构。该输送结构通常以下文所述的药物组合物的形式给药。
因此，本发明的某些方面提供了一种向个体输送大分子的方法。该方法包括将个体极化上皮细胞的顶部表面和输送结构接触。在某些实施方案中，输送结构包含受体结合区、穿胞运输区域、可裂解的连接子和向个体输送的大分子。穿胞运输区域能够使大分子穿过所述的上皮细胞底侧膜或穿胞运输到所述的上皮细胞底侧膜。可裂解的连接子通过所述个体极化上皮细胞的底侧膜处的酶或个体血浆中的酶裂解。可裂解的连接子的裂解将大分子从输送结构的其它部分分离，从而将大分子输送到个体中。
在某些实施方案中，极化上皮细胞底侧膜处或附近的酶选自组织蛋白酶GI、糜蛋白酶I、弹性蛋白酶I、枯草杆菌蛋白酶AI、枯草杆菌蛋白酶AII、凝血酶I和尿激酶I。在某些实施方案中，可裂解的连接子包含选自下述的氨基酸序列：Ala-Ala-Pro-Phe(SEQ ID NO.：4)、Gly-Gly-Phe(SEQ IDNO.：5)、Ala-Ala-Pro-Val(SEQ ID NO.：6)、Gly-Gly-Leu(SEQ ID NO.：7)、Ala-Ala-Leu(SEQ ID NO.：8)、Phe-Val-Arg(SEQ ID NO.：9)、Val-Gly-Arg(SEQ ID NO.：10)。
在某些实施方案中，所述受体结合区选自：假单胞菌外毒素A、霍乱毒素、肉毒杆菌毒素、白喉毒素、志贺毒素或类志贺毒素；单克隆抗体；多克隆抗体；单链抗体；TGFα；EGF；IGF-I；IGF-II；IGF-III；IL-1；IL-2；IL-3；IL-6；MIP-1a；MIP-1b；MCAF和IL-8的受体结合区。在某些实施方案中，受体结合区与选自下述的细胞表面受体结合：α2-巨球蛋白受体、EGFR、IGFR、转铁蛋白受体、趋化因子受体、CD25、CD11B、CD11C、CD80、CD86、TNFα受体、TOLL受体、M-CSF受体、GM-CSF受体、清道夫受体和VEGF受体。
在某些实施方案中，所述穿胞运输区域选自假单胞菌外毒素A、白喉毒素、百日咳毒素、霍乱毒素、热敏性大肠杆菌肠毒素、志贺毒素或类志贺毒素的穿胞运输区域。
在某些实施方案中，所述大分子选自肽、多肽、蛋白质、核酸和脂类。在优选的实施方案中，大分子是生长激素。在更优选的实施方案中，大分子是人生长激素。
在某些实施方案中，本发明提供了一种向个体血流中输送大分子而使该大分子的生物利用度至少约为30％的方法，该方法包括向个体施用含有大分子的输送结构，从而将所施用的所有大分子的至少约30％以该大分子的生物可利用形式施用至个体的血流中。在某些实施方案中，所施用的所有大分子的至少约10％是个体生物可利用的。在某些实施方案中所施用的所有大分子的至少约15％是个体生物可利用的。在某些实施方案中，所施用的所有大分子的至少约20％是个体生物可利用的。在某些实施方案中，所施用的所有大分子的至少约25％是个体生物可利用的。在某些实施方案中，所施用的所有大分子的至少约35％是个体生物可利用的。在某些实施方案中，所施用的所有大分子的至少约45％是个体生物可利用的。在某些实施方案中，所施用的所有大分子的至少约50％是个体生物可利用的。在某些实施方案中，所施用的所有大分子的至少约55％是个体生物可利用的。在某些实施方案中，所施用的所有大分子的至少约60％是个体生物可利用的。在某些实施方案中，所施用的所有大分子的至少约65％是个体生物可利用的。在某些实施方案中，所施用的所有大分子的至少约70％是个体生物可利用的。在某些实施方案中，所施用的所有大分子的至少约75％是个体生物可利用的。在某些实施方案中，所施用的所有大分子的至少约80％是个体生物可利用的。在某些实施方案中，所施用的所有大分子的至少约85％是个体生物可利用的。在某些实施方案中，所施用的所有大分子的至少约90％是个体生物可利用的。在某些实施方案中，所施用的所有大分子的至少约95％是个体生物可利用的。在某些实施方案中，通过比较施用含有大分子的输送结构后个体血流中的大分子的量与通过另一给药途径施用大分子后个体血流中的大分子的量来测定大分子的生物利用度百分比。在某些实施方案中，另一给药途径是注射，如皮下注射、静脉注射、动脉内注射等。在其它实施方案中，通过比较施用含有大分子的输送结构后个体的血流中存在的大分子的量与作为输送结构的一部分施用的所有大分子的量来测定大分子的生物利用度百分比。
在某些实施方案中，在给药10分钟后，个体中所输送的大分子在血浆中的浓度达到峰值。在某些实施方案中，在给药15分钟后，个体中所输送的大分子在血浆中的浓度达到峰值。在某些实施方案中，在给药5分钟后，个体中所输送的大分子在血浆中的浓度达到峰值。在某些实施方案中，在给药20分钟后，个体中所输送的大分子在血浆中的浓度达到峰值。在某些实施方案中，在给药25分钟后，个体中所输送的大分子在血浆中的浓度达到峰值。在某些实施方案中，在给药30分钟后，个体中所输送的大分子在血浆中的浓度达到峰值。在某些实施方案中，在给药35分钟后，个体中所输送的大分子在血浆中的浓度达到峰值。在某些实施方案中，在给药40分钟后，个体中所输送的大分子在血浆中的浓度达到峰值。在某些实施方案中，在给药45分钟后，个体中所输送的大分子在血浆中的浓度达到峰值。在某些实施方案中，在给药50分钟后，个体中所输送的大分子在血浆中的浓度达到峰值。在某些实施方案中，在给药55分钟后，个体中所输送的大分子在血浆中的浓度达到峰值。在某些实施方案中，在给药60分钟后，个体中所输送的大分子在血浆中的浓度达到峰值。在某些实施方案中，在给药90分钟后，个体中所输送的大分子在血浆中的浓度达到峰值。在某些实施方案中，在给药120分钟后，个体中所输送的大分子在血浆中的浓度达到峰值。
在某些实施方案中，所输送的大分子在血浆中的峰浓度约为0.01ng/ml-10μg/ml血浆。在某些实施方案中，所输送的大分子在血浆中的峰浓度约为0.01ng/ml-1μg/ml血浆。在某些实施方案中，所输送的大分子在血浆中的峰浓度约为0.01ng/ml-0.1μg/ml血浆。在某些实施方案中，所输送的大分子在血浆中的峰浓度约为0.01ng/ml-10ng/ml血浆。在某些实施方案中，所输送的大分子在血浆中的峰浓度约为1ng/ml-10μg/ml血浆。在某些实施方案中，所输送的大分子在血浆中的峰浓度约为1ng/ml-1μg/ml血浆。在某些实施方案中，所输送的大分子在血浆中的峰浓度约为1ng/ml-0.5μg/ml血浆。在某些实施方案中，所输送的大分子在血浆中的峰浓度约为1ng/ml-0.1μg/ml血浆。在某些实施方案中，所输送的大分子在血浆中的峰浓度约为10ng/ml-1μg/ml血浆。在某些实施方案中，所输送的大分子在血浆中的峰浓度约为10ng/ml-0.5μg/ml血浆。
在某些实施方案中，所输送的大分子在血浆中的峰浓度至少约为10μg/ml血浆。在某些实施方案中，所输送的大分子在血浆中的峰浓度至少约为5μ/ml血浆。在某些实施方案中，所输送的大分子在血浆中的峰浓度至少约为1μg/ml血浆。在某些实施方案中，所输送的大分子在血浆中的峰浓度至少约为500ng/ml血浆。在某些实施方案中，所输送的大分子在血浆中的峰浓度至少约为250ng/ml血浆。在某些实施方案中，所输送的大分子在血浆中的峰浓度至少约为100ng/ml血浆。在某些实施方案中，所输送的大分子在血浆中的峰浓度至少约为50ng/ml血浆。在某些实施方案中，所输送的大分子在血浆中的峰浓度至少约为10ng/ml血浆。在某些实施方案中，所输送的大分子在血浆中的峰浓度至少约为5ng/ml血浆。在某些实施方案中，所输送的大分子在血浆中的峰浓度至少约为1ng/ml血浆。在某些实施方案中，所输送的大分子在血浆中的峰浓度至少约为0.1ng/ml血浆。
而且，不受特定理论或机理的约束，认为在个体的血浆中观察到的相比，口服施用输送结构可以输送更高有效浓度的大分子至个体的肝脏。本文中的“有效浓度”指的是靶大分子的浓度，可以通过监测和/或定量大分子靶向反应的下游效果来测定。不受特定理论或机理的约束，认为口服施用输送结构可以使得输送结构通过消化粘膜如肠粘膜的极化上皮细胞吸收，接着在粘膜底侧处裂解并释放该大分子。本领域的技术人员能够理解，这种消化粘膜底侧膜的血液通过门静脉系统从该位置迁移到肝脏。因此，当大分子在肝脏发挥生物活性，例如由生长激素、胰岛素、IGF-I等与其同源受体结合介导的生物活性，认为该大分子所显现的效果会超过在个体中基于观察到的血浆浓度所预期达到的效果。因此，在某些实施方案中，本发明提供了一种向个体施用大分子的方法，该方法包括向个体口服施用含有大分子的输送结构，其中该大分子被以比个体的血浆中观察到的浓度更高的有效浓度输送到个体的肝脏中。
在某些实施方案中，上皮细胞选自鼻腔上皮细胞、口腔上皮细胞、肠道上皮细胞、直肠上皮细胞、阴道上皮细胞和肺部上皮细胞。
在某些实施方案中，所述个体是哺乳动物。在进一步的实施方案中，该个体为啮齿动物、兔类动物或灵长类动物。在进一步的实施方案中，啮齿动物为小鼠或大鼠。在其它实施例中，兔类动物为野兔。在其它实施方案中，灵长目动物为人、猴子或猿。在优选的实施例中，所述个体为人。
另一方面，本发明提供了一种向个体的血流中输送大分子的方法，与其它给药路径相比，该方法诱导较低滴度的抗该大分子的抗体。不受固有理论或机理的限制，认为与例如注射施用的大分子相比，通过粘膜如肠粘膜进入的大分子使得免疫系统能够更好地耐受该大分子。因此，与如通过皮下、静脉内、动脉内或腹膜注射或其它方式施用大分子相比，用本发明的输送结构经粘膜输送大分子在个体体内产生的抗该大分子的抗体的滴度较低。通常，不同的给药途径检测出抗体的时间点大体相同，例如抗体的滴度可以在通过输送结构或注射施用大分子后约1周、2周、3周、4周、2个月或4个月检测。
因此，在某些实施方案中，本发明提供了向个体的血流中输送大分子的方法，该方法包括将本发明的含有要输送的大分子的输送结构与个体极化上皮细胞的顶侧表面接触，从而将大分子施用到个体的血流中，其中在个体的血清中诱导产生的所述大分子特异性抗体的滴度比皮下给个体施用单独得不含输送结构其它部分的大分子所诱导产生的抗体的滴度低。
在某些实施方案中，所述大分子选自肽、多肽、蛋白质、核酸和脂类。在某些实施方案中，该大分子选自多肽激素、细胞因子、趋化因子、生长因子和凝结因子。在某些实施方案中，该大分子选自IGF-I、IGF-II、IGF-III、EGF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8、IL-12、EPO、生长激素、因子VII、抗利尿激素、降血钙素、甲状旁腺激素、黄体激素释放因子、组织血纤维蛋白溶酶原活化剂、促肾上腺皮质激素、脑啡肽和胰高血糖素样肽1。在进一步的实施方案中，该大分子是人生长激素。在其它实施例中，大分子为人胰岛素。在某些实施方案中，所述个体为小鼠、大鼠、狗、山羊或人。
在某些实施方案中，由输送结构所输送的大分子在个体血清中所诱导的该大分子的特异性抗体的滴度比通过皮下施用不含该输送结构其它部分的大分子所诱导的抗体的滴度低约95％。在某些实施方案中，由输送结构所输送的大分子在个体血清中所诱导的该大分子的特异性抗体的滴度比通过皮下施用不含该输送结构其它部分的大分子所诱导的抗体的滴度低约90％。在某些实施方案中，由输送结构所输送的大分子在个体血清中所诱导的该大分子的特异性抗体的滴度比通过皮下施用不含该输送结构其它部分的大分子所诱导的抗体的滴度低约85％。在某些实施方案中，由输送结构所输送的大分子在个体血清中所诱导的该大分子的特异性抗体的滴度比通过皮下施用不含该输送结构其它部分的大分子所诱导的抗体的滴度低约80％。在某些实施方案中，由输送结构所输送的大分子在个体血清中所诱导的该大分子的特异性抗体的滴度比通过皮下施用不含该输送结构其它部分的大分子所诱导的抗体的滴度低约75％。
在某些实施方案中，由输送结构所输送的大分子在个体血清中所诱导的该大分子的特异性抗体的滴度比通过皮下施用不含该输送结构其它部分的大分子所诱导的抗体的滴度低约70％。在某些实施方案中由输送结构所输送的大分子在个体血清中所诱导的该大分子的特异性抗体的滴度比通过皮下施用不含该输送结构其它部分的大分子所诱导的抗体的滴度低约65％。在某些实施方案中，由输送结构所输送的大分子在个体血清中所诱导的该大分子的特异性抗体的滴度比通过皮下施用不含该输送结构其它部分的大分子所诱导的抗体的滴度低约60％。在某些实施方案中，由输送结构所输送的大分子在个体血清中所诱导的该大分子的特异性抗体的滴度比通过皮下施用不含该输送结构其它部分的大分子所诱导的抗体的滴度低约55％。在某些实施方案中，由输送结构所输送的大分子在个体血清中所诱导的该大分子的特异性抗体的滴度比通过皮下施用不含该输送结构其它部分的大分子所诱导的抗体的滴度低约50％。
在某些实施方案中，由输送结构所输送的大分子在个体血清中所诱导的该大分子的特异性抗体的滴度比通过皮下施用不含该输送结构其它部分的大分子所诱导的抗体的滴度低约50％。在某些实施方案中，由输送结构所输送的大分子在个体血清中所诱导的该大分子的特异性抗体的滴度比通过皮下施用不含该输送结构其它部分的大分子所诱导的抗体的滴度低约45％。在某些实施方案中，由输送结构所输送的大分子在个体血清中所诱导的该大分子的特异性抗体的滴度比通过皮下施用不含该输送结构其它部分的大分子所诱导的抗体的滴度低约40％。在某些实施方案中，由输送结构所输送的大分子在个体血清中所诱导的该大分子的特异性抗体的滴度比通过皮下施用不含该输送结构其它部分的大分子所诱导的抗体的滴度低约35％。在某些实施方案中，由输送结构所输送的大分子在个体血清中所诱导的该大分子的特异性抗体的滴度比通过皮下施用不含该输送结构其它部分的大分子所诱导的抗体的滴度低约30％。
在某些实施方案中，由输送结构所输送的大分子在个体血清中所诱导的该大分子的特异性抗体的滴度比通过皮下施用不含该输送结构其它部分的大分子所诱导的抗体的滴度低约25％。在某些实施方案中，由输送结构所输送的大分子在个体血清中所诱导的该大分子的特异性抗体的滴度比通过皮下施用不含该输送结构其它部分的大分子所诱导的抗体的滴度低约20％。在某些实施方案中，由输送结构所输送的大分子在个体血清中所诱导的该大分子的特异性抗体的滴度比通过皮下施用不含该输送结构其它部分的大分子所诱导的抗体的滴度低约15％。在某些实施方案中，由输送结构所输送的大分子在个体血清中所诱导的该大分子的特异性抗体的滴度比通过皮下施用不含该输送结构其它部分的大分子所诱导的抗体的滴度低约10％。在某些实施方案中，由输送结构所输送的大分子在个体血清中所诱导的该大分子的特异性抗体的滴度比通过皮下施用不含该输送结构其它部分的大分子所诱导的抗体的滴度低约5％。在某些实施方案中，由输送结构所输送的大分子在个体血清中所诱导的该大分子的特异性抗体的滴度比通过皮下施用不含该输送结构其它部分的大分子所诱导的抗体的滴度低约1％。
5.3.1给药方法
本发明的输送结构可以通过本领域普通技术人员公知的方法给药。在某些实施方案中，输送结构和个体的粘膜接触。例如，该粘膜可以存在于个体的眼、鼻、嘴、气管、肺、食道、胃、小肠、大肠、直肠、肛门、汗腺、阴核、阴道或阴茎处。优选地，该粘膜是个体的消化道的粘膜，如嘴、食道、胃、小肠、大肠、直肠的粘膜、
在这种实施方案中，输送结构优选为口服施用于个体。因此，如果需要，可以将输送结构配制成保护其不在胃的酸性环境中降解。例如，本发明的输送结构的许多实施方案包含具有规定活性的多肽区域。除非这些输送结构在胃里不受酸和/或酶水解的影响，否则几乎在所有大分子被输送之前，输送结构通常会被消化。因此，防止输送结构降解的组合物制剂可以用于这些输送结构的给药中。
5.3.2剂量
通常，将药学有效量的本发明的输送结构给予个体。本领域技术人员可以容易地确定输送结构的剂量是否足以输送如下所述有效量的大分子。在某些实施方案中，给予约1μg到约1g的输送结构。在其它的一些实施方案中，给予约10μg到约500mg的输送结构。在其它的一些实施方案中，给予约10μg到约100mg的输送结构。在其它的一些实施方案中，给予约10μg到约1000mg的输送结构。在其它的一些实施方案中，给予约10μg到约250μg的输送结构。在其它的一些实施方案中，给予约10μg到约100μg的输送结构。优选地，给予约10μg到约50μg的输送结构。
含有所施用的输送结构的组合物的体积通常取决于输送结构的浓度和组合物的剂型。在某些实施方案中，输送结构组合物的单位剂量约为0.05ml-1.0ml，优选为约0.5ml。输送结构组合物可以制成含有1到50剂量(如0.5ml-25ml)的剂型，更通常地是含有1到10剂量(如0.5ml-5ml)的剂型。
本发明的输送结构组合物可以以单剂量或多剂量的形式施用。一个剂量与随后的一个或多个剂量之间的时间间隔为约1-约6小时、约6-约12小时、约12-约24小时、约1-约3天、约1天-约1周、约1-约2周、约2周-约1月、约4-约8周、约1-约3月或约1-约6月。
所述被输送的大分子是这样的大分子：已经积累了大量有关其在个体中的剂量、给药频率和评价有效浓度的方法等知识。这些知识可以用于评价在个体中的输送效率、所述大分子的有效浓度和给药频率。因此，本领域公知的技术可以用于确定向个体输送大分子的量是否为有效量，剂量是应该增加或是降低，个体服用输送结构的频率是高还是低，等等问题。
5.3.3.确定输送的大分子的量
本发明的方法可以用于局部或系统地向个体施用药学有效量的大分子。本领域的技术人员可以确定该方法是否输送了这种药学有效量的大分子。具体的方法取决于所输送的大分子，但是通常依赖于该大分子在个体血液中或该大分子发挥作用的个体生物学区室中的浓度的测定。可选择地或者另外，可以监测该大分子作用于个体的效果。
例如，在本发明的某些实施方案中，所输送的大分子为胰岛素，如人胰岛素。在这种实施方案中，本领域的技术人员可以确定药学上有效量的人胰岛素是否输送到了体内，例如通过从个体中取血浆样，然后测定其中的人胰岛素浓度来确定。一个实例是通过ELISA检测来测定人胰岛素浓度，但是本领域技术人员公知的任何其它方法也是合适的。
可选择地，本领域技术人员可以通过监测个体体内的血糖浓度来确定有效量的人胰岛素是否输送到了个体体内。本领域公知的是，人胰岛素除了其它活性外，其可作用于肝细胞以促进肝糖的形成，从而降低血浆中葡萄糖的浓度。因此，可以监测个体血浆中的葡萄糖浓度，从而确定有效量的胰岛素是否被输送。
在确定是否施用了有效量的该大分子的过程中可以对施用的大分子的本领域技术人员公知但不受限制的任何效果进行评价。这些效果的例子包括但不限于受体结合、受体激活、受体结合的下游效果、受体激活的下游效果、化合物的配位、有效的血凝结、骨骼生长、伤口愈合、细胞增殖，等等。评价的具体效果取决于输送的大分子。
5.4.编码输送结构的多核苷酸
另一方面，本发明提供了含有编码输送结构的核苷序列的多核苷酸。这些多核苷酸是用于，例如制备输送结构。另一方面，本发明提供了表达系统，该表达系统包含编码受体结合区、穿胞运输区域和供编码大分子的多核苷酸序列使用的多连接子插入位点的重组多核苷酸序列。多连接子插入位点可以在多核苷酸序列的任何位置，只要该多连接子插入不破坏受体结合区或穿胞运输区域。多连接子插入位点应该在编码可裂解的连接子的多核苷酸序列附近定向，以使可裂解的连接子处的裂解可以将由插入到多连接子插入位点的核酸所编码的大分子从所编码的输送结构中分离。因此，在所述多连接子插入位点位于所编码的输送结构的末端的实施方案中，所述多核苷酸位于多连接子插入位点和该多核苷酸其它部分之间的可裂解的连接子的编码核酸序列。在多连接子插入位点不位于所编码的输送结构的末端的实施方案中，所述多连接子插入位点与编码可裂解的连接子的每个核酸序列侧翼连接。
在某些实施方案中，重组多核苷酸以编码PE、或其部分或其衍生物的多核苷酸为基础。在其它实施方案中，重组多核苷酸以在严格的杂交条件下与编码PE的多核苷酸杂交的多核苷酸为基础。编码PE的核酸序列为SEQID NO.：3。这种序列可用于制备PCR引物，用于分离所需的这种序列的任何部分的编码核酸。例如，PCR可以用于分离编码PE一个或多个功能性区域的核酸。所分离的核酸然后用标准重组技术连接到编码输送结构的其它功能性区域的核酸上。
其它用于制备编码用于本发明输送结构的PE、PE区域或任何其它功能性区域的多核苷酸的体外方法包括但不限于：反向转录、聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)、自我维持序列复制系统(3SR)和QP复制酶扩增系统(QB)。本领域公知的用于构建重组核酸的技术都可以使用。例如，编码蛋白质或其一部分的多核苷酸可以通过使用cDNA的聚合酶链反应来分离，该反应使用基于PE的DNA序列或编码受体结合区的核苷的引物对。
在美国专利4,683,195、Mullis等人1987年的Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263、Erlich等人1989年的PCR Technology，Stockton Press，NY等文献中公开了使用这些克隆和体外扩增方法的指导。在严格、中度严格或高度严格的杂交条件下，编码输送结构或其一部分的多核苷酸也可以通过筛选染色体组或cDNA库来进行分离，该筛选使用选自所需的多核苷酸序列的探针。
通过向输送结构中引入供编码所述大分子的核酸使用的插入位点可以便于构建编码本发明的输送结构的核酸。在某些实施方案中，大分子的插入位点可以引入到编码区域Ib的细胞因子残基的核苷之间。在其它的实施方案中，插入位点可以引入到编码输送结构的核酸的任何位置，只要该插入不破坏其中被编码的功能性区域。在某些实施方案中，插入位点可以位于ER保留区域内。
在更具体的实施方案中，可以除去位于细胞因子编码残基之间的编码部分Ib区域的核苷序列，并用包含可被限制性酶裂解的克隆位点的核苷序列取代。例如，克隆位点可以由PstI识别和裂解。在该实例中，可以将编码侧翼连接PstI序列的大分子的多核苷酸插入到所述载体中。
而且，所述多核苷酸还可以编码输送结构的氨基末端的分泌序列。由于这种结构简化了免疫原的分离，因而可用于在哺乳动物细胞中生产该输送结构。
更进一步地，本发明的多核苷酸还包含编码输送结构的多核苷酸的衍生物。这种衍生物可以不受限制地通过本领域熟知的方法制备。例如，衍生物可以通过编码输送结构的多核苷酸的点特异性突变，包括取代、插入或缺失1、2、3、5、10或更多核苷形成。可选择地，衍生物可以通过随机突变形成。随机突变核酸的一个方法包括在存在0.1mM MnCl2和非平衡的核苷浓度的情况下通过PCR反应扩增核酸。这些条件增加了PCR反应中所使用的聚合酶的误插入速率并产生所扩增的核酸的随意突变。
已经形成并表征了源自PE的嵌合分子的几种位点特异性突变和缺失。例如，编码PE的1-252位氨基酸的核苷的缺失产生了称之为“PE40”的结构。编码PE的1-279位氨基酸的核苷的缺失产生了称之为“PE37”的结构。参考美国专利5,602,095。在这两种结构中，PE的受体结合区，即区域Ia被删除。编码受体结合区的核酸可以与这些结构连接，以产生靶向所述受体结合区识别的细胞表面受体的输送结构。当然，这些重组多核苷酸特别可用于表达受体结合区不是PE的区域Ia的输送结构。该重组多核苷酸任选地可以编码氨基末端甲硫氨酸，以辅助输送结构的表达。在某些实施方案中，受体结合区可以与编码穿胞运输区域的多核苷酸的5′端连接。
其它编码PE的突变形式的核酸包括但不限于PEA553和美国专利5,602,095、5,512,658和5,458,878公开的，以及Vasil等人1986年的Infect.Immunol.52：538-48中描述的核酸，这些核酸可以作为构建本发明输送结构的来源。
相应地，在某些实施方案中，本发明提供了编码输送结构的多核苷酸。该输送结构包含受体结合区、穿胞运输区域、向个体输送的大分子、和可裂解的连接子。可裂解的连接子的裂解能够从输送结构的其它部分分离出所述大分子。可裂解的连接子通过个体中的极化上皮细胞的底侧膜处的酶或血浆中的酶裂解。
在某些实施方案中，所述多核苷酸在严格杂交条件下与本发明的多核苷酸杂交。在进一步的实施方案中，在严格杂交条件下，该多核苷酸与编码本发明输送结构的核酸杂交。
在某些实施方案中，所述多核苷酸编码输送结构，该输送结构进一步包含第二可裂解的连接子。在某些实施方案中，第一和/或第二可裂解的连接子包含选自下述的氨基酸序列：Ala-Ala-Pro-Phe(SEQ ID NO.：4)、Gly-Gly-Phe(SEQ ID NO.：5)、Ala-Ala-Pro-Val(SEQ ID NO.：6)、Gly-Gly-Leu(SEQ ID NO.：7)、Ala-Ala-Leu(SEQ ID NO.：8)、Phe-Val-Arg(SEQ ID NO.：9)、Val-Gly-Arg(SEQ ID NO.：10)。在某些实施方案中，由多核苷酸编码的第一和/或第二可裂解的连接子由选自组织蛋白酶GI、糜蛋白酶I、弹性蛋白酶I、枯草杆菌蛋白酶AI、枯草杆菌蛋白酶AII、凝血酶I和尿激酶I的酶裂解。
在某些实施方案中，由所述多核苷酸编码的受体结合区选自：假单胞菌外毒素A、霍乱毒素、白喉毒素、志贺毒素或类志贺毒素；单克隆抗体；多克隆抗体；单链抗体；TGFα；EGF；IGF-I；IGF-II；IGF-III；IL-1；IL-2；IL-3；IL-6；MIP-1a；MIP-1b；MCAF和IL-8的受体结合区。在某些实施方案中，多核苷酸编码的受体结合区和选自下述的细胞表面受体结合：α2-巨球蛋白受体、EGFR、IGFR、转铁蛋白受体、趋化因子受体、CD25、CD11B、CD11C、CD80、CD86、TNFα受体、TOLL受体、M-CSF受体、GM-CSF受体、清道夫受体和VEGF受体。在进一步的实施方案中，多核苷酸编码的假单胞菌外毒素A的受体结合区为假单胞菌外毒素A的区域Ia。在更进一步的实施方案中，由多核苷酸编码受体结合区的氨基酸序列为SEQ ID NO.：1。
在某些实施方案中，由所述多核苷酸编码的穿胞运输区域选自假单胞菌外毒素A、白喉毒素、百日咳毒素、霍乱毒素、热敏性大肠杆菌肠毒素、志贺毒素或类志贺毒素的穿胞运输区域。在进一步的实施方案中，穿胞运输区域为假单胞菌外毒素A穿胞运输区域。在进一步的实施方案中，假单胞菌外毒素A的穿胞运输区域具有SEQ ID NO.：2的氨基酸序列。
在某些实施方案中，由所述多核苷酸编码的大分子选自肽、多肽和蛋白质。在某些实施方案中，多肽选自多肽激素、细胞因子、趋化因子、生长因子和凝结因子。在进一步的实施方案中，多肽选自IGF-I、IGF-II、IGF-III、EGF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8、IL-12、EPO、生长激素、因子VII、抗利尿激素、降血钙素、甲状旁腺激素、黄体激素释放因子、组织血纤维蛋白溶酶原活化剂、促肾上腺皮质激素、脑啡肽和胰高血糖素样肽1。在进一步的实施方案中，多肽是人生长激素。在其它实施例中，蛋白质为人胰岛素。
在其它实施例中，本发明提供了编码输送结构的多核苷酸，该输送结构包含编码受体结合区的核酸、编码穿胞运输区域的核酸、编码可裂解的连接子的核酸，以及含有多连接子插入位点的核酸序列。多连接子插入位点可以相对于编码可裂解的连接子的核酸序列进行定向，以允许可裂解的连接子的裂解从所述输送结构的其它部分分离出由插入到多连接子插入位点中的核酸编码的大分子。可裂解的连接子通过个体中极化上皮细胞的底侧膜处的酶或血浆中的酶裂解。
5.5.表达载体
另一方面，本发明提供了表达输送结构的表达载体。通常，表达载体为含有表达控制序列的重组多核苷酸分子，该表达控制序列与编码多肽的核苷序列可操作地连接。通过引入合适的启动子、复制序列、可选择标记等，表达载体可以容易地在原核细胞或真核细胞中发挥作用，从而稳定转录和翻译mRNA。表达载体的构建技术和在含有该表达载体的细胞中表达基因的技术是本领域公知的。参考Sambrook等人2001年的MolecularCloning-A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY；以及Ausubel等人编的Current Edition，Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing Associates和Wiley Interscience，NY。
用于表达载体的有用的启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、构建性腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导的MMTV启动子、SV40启动子、MRP pol III启动子、构建性MPSV启动子、四环素诱导的CMV启动子(如人即刻早期CMV启动子)和构建性CMV启动子。
表达载体应含有与表达输送结构的细胞相容的表达和复制信号。用于表达输送结构的表达载体包括：病毒载体，如逆转录酶病毒、腺病毒和腺相关的病毒；质粒载体等。病毒和质粒载体优选用于将表达载体转染到哺乳动物细胞中。例如，其中的表达控制序列含有CMV启动子的表达载体pcDNAl(Invitrogen，San Diego，CA)在这种细胞中具有良好的转染和表达效率。
通过本领域技术人员公知但不受限制的方法，可以将表达载体导入到细胞中表达输送结构。这些方法包括但不限于：通过细胞直接从溶液中摄取所述分子；通过脂质转染促进吸收，如使用脂质体或免疫脂质体；颗粒介导的转染；等等。参考美国专利5,272,065；Goeddel等人编，1990，Methodsin Enzymology，第185卷，Academic Press，Inc.，CA；Krieger 1990年的GeneTransfer and Expression-A Laboratory Manual，Stockton Press，NY；Sambrook等人1989年的Molecular Cloning-A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，NY；以及Ausubel等人编，Current Edition，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates和WileyInterscience，NY。
表达载体也可以含有简化输送结构分离的纯化部分。例如，可以将聚组氨酸部分，如六个组氨酸残基引入蛋白质的氨基末端，该聚组氨酸部分可以通过镍螯合物色谱法方便地一步分离蛋白质。在某些实施方案中，在纯化后，纯化部分可以从输送结构的其它部分裂解。在其它实施方案中，该纯化部分不会干扰输送结构的功能区域的功能，因而不需要裂解。
5.6.表达输送结构的细胞
另一方面，本发明提供了含有表达输送结构的表达载体或其部分的细胞。细胞优选具有高浓度地表达输送结构以便于纯化蛋白质的能力。在某些实施方案中，细胞为原核细胞，如大肠杆菌。如在实施例中所述，输送结构在大肠杆菌中表达时被恰当地折叠并含有合适的二硫键。
在其它的实施方案中，细胞为真核细胞。有用的真核细胞包括酵母菌和哺乳动物细胞。本领域公知的用于表达重组多肽但不限于此的哺乳动物细胞可以用于表达重组多肽。例如中国仓鼠卵母细胞(CHO)可以用于表达输送结构。
5.7.含有输送结构的组合物
本发明的输送结构可以配制成组合物。该组合物通常可以配制成适于将输送结构按照需要即刻使用。例如，如果输送结构不是立即给药，则输送结构可以配制成适合储存的组合物。这种组合物可以是合适的稳定剂与输送结构的冻干制剂。可选择地，输送结构组合物可以与一种或多种合适的稳定剂配制成适于储存在溶液中。本领域公知但不受限制的任何稳定剂都可以使用。例如适于冻干制剂的稳定剂包括但不限于糖、盐、表面活性剂、蛋白质、离液剂、脂类和氨基酸。适于液体制剂的稳定剂包括但不限于糖、盐、表面活性剂、蛋白质、离液剂、脂类和氨基酸。可以在组合物中使用的具体稳定剂包括但不限于海藻糖、血清蛋白、卵磷脂、蛋黄素和精氨酸。用于稳定输送结构的冻干制剂或液体制剂的其它化合物、组合物和方法可以参考美国专利6,573,237、6,525,102、6,391,296、6,255,284、6,133,229、6,007,791、5,997,856和5,917,021。
进一步地，本发明输送结构组合物可以配制成向个体给药。这种疫苗组合物通常包括一种或多种本发明的输送结构和药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载体或媒介物。本领域公知但不限于此的药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载体或媒介物都可以用于本发明。合适的赋形剂、稀释剂、载体或媒介物的实例可以参考Remington′s Pharmaceutical Sciences，第21版，2005，Mack Publishing Co.，Easton。
在某些实施方案中，输送结构组合物被配制成口服给药。在这种实施方案中，该组合物可以配制成保护输送结构免受胃中的酸和/或酶降解。一旦从十二指肠的中性环境穿过进入碱性环境，输送结构就会与粘膜接触，并穿过极化上皮细胞膜。输送结构可以用本领域公知但不受限制的方法配制到这些组合物中。
在某些实施方案中，所述口服制剂包含输送结构和一种或多种在胃中可以保护该输送结构的化合物。例如，保护性的化合物可以防止酸和/或酶降解输送结构。在某些实施方案中，口服制剂包含输送结构和一种或多种便于将该结构从胃中输送到小肠中的化合物。在某些实施方案中，能够防止输送结构在胃中降解的一种或多种化合物也便于将该结构从胃中输送到小肠中。优选地，口服制剂包含一种或多种防止输送结构在胃中降解的化合物和便于将该结构从胃中输送到小肠中的化合物。例如，如Mrsny等人1999年的Vaccine 17：1425-1433中所述，含有碳酸氢钠有助于胃内输送的物质快速地从胃运动到十二指肠。
在其它配制组合物而使输送结构可以通过胃并和小肠的极化上皮细胞膜接触的其它方法包括但不限于：De Young的1989年的Int J Pancreatol.增刊5：31-6公开的肠包衣技术；以及美国专利6,613,332、6,174,529、6,086,918、5,922,680和5,807,832中公开的方法。
5.7.1含有组合物的试剂盒
另一方面，本发明提供了含有本发明组合物的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒进一步包含指导向个体的粘膜施用组合物的说明书。在某些实施方案中，该试剂盒进一步包括指导向个体口服施用该组合物的说明书。
在某些实施方案中，该试剂盒包含在多个容器中的本发明组合物。在某些实施方案中，该组合物可以是单位剂量的形式，如片剂、锭剂、胶囊剂，等等。在某些实施方案中，该组合物可以在给予该组合物的设备中提供或与该设备一起提供，该设备如设计用于给予单剂量组合物的设备，如吸入器。
5.8.制备和测试输送结构
如下所述，本发明的输送结构优选重组制备。不过，输送结构也可以用本领域公知的方法进行化学合成。
5.8.1输送结构的制备
本发明表达和纯化输送结构的方法如下述实施例所述。通常，这些方法取决于向细胞中导入编码输送结构的表达载体，该细胞可以通过载体表达输送结构。然后，纯化输送结构，以向个体给药。
5.8.2测试输送结构
选择了输送结构的区域，将这些区域的功能和输送结构作为一个整体的功能进行常规测试，以确保这些输送结构可以将与该输送结构其它部分分离的大分子输送穿过个体的粘膜。例如，可以通过常规试验测试输送结构的细胞识别、穿胞运输和裂解。可以可以通过用野生型毒素的天生区域进行取代来测试整个嵌合蛋白质，或者测试不同区域的功能。
5.8.2.1受体结合/细胞识别
受体结合区的功能可以通过监测输送结构结合靶受体的能力来测定。这种测定可以通过基于细胞的分析法(cell-based assay)，用细胞表面存在的靶受体来完成，或通过无细胞分析法(cell-free assay)来完成。例如，与靶结合的输送结构可以用亲合色谱法测定。该结构可以与亲合柱中的基质连接，然后检测与基质结合的受体，反之亦然。可选择地，如果已确定抗体与受体结合区或其同源受体结合，则该抗体可以被用来，例如通过免疫测定法检测输送结构中的受体结合区，或者通过竞争性方法检测所述同源受体。检测与细胞上的受体结合的输送结构的示例性细胞分析法包括标记该输送结构，并通过荧光细胞分选法、放射自显影法等方法检测该输送结构与细胞的结合。
5.8.2.2穿胞运输
穿胞运输区域的功能可以作为输送结构穿过上皮细胞膜的能力的函数来测定。由于穿胞运输首先需要与细胞结合，因此这些检测方法也可以用于评价细胞识别区域的功能。
输送结构的穿胞运输活性可以通过本领域熟知但不受限制的方法来测定。在某些实施方案中，穿胞运输活性可以通过检测输送结构进入其结合的非极化细胞的能力进行测定。不受任何已知理论或机理的约束，认为允许穿胞运输区域穿过极化上皮细胞的同一属性也可以让具有穿胞运输区域的分子进入非极化细胞。因此，输送结构进入细胞的能力可以例如通过检测输送结构在细胞内的物理存在来测定。例如，输送结构可以被标记，如用荧光标记进行标记，并将该输送结构暴露于细胞。然后，洗涤该细胞，除去没有进入细胞的输送结构，测定剩余的标记的量。在该部分中检测到的标记表明输送结构已进入到细胞中。
在其它实施方案中，输送结构的穿胞运输能力可以通过检测输送结构穿过极化上皮细胞的能力来测定。例如，输送结构可以被标记，如用荧光标记进行标记，并与上皮细胞的顶侧膜接触。由上皮细胞形成的底侧膜中检测到荧光表明穿胞运输区域功能正常。
5.8.2.3可裂解的连接子的裂解
可裂解的连接子的功能通常在裂解试验中测试。本领域公知但不受限制的任何合适的裂解试验都可以用于测试可裂解的连接子。基于细胞的分析法或非细胞分析法均可用于测试酶裂解可裂解的连接子的能力。
用于测试可裂解的连接子的裂解的示例性非细胞分析法包括：制备极化上皮细胞的提取物，并将已被标记的具有可裂解连接子的输送结构暴露于提取物的与膜相关酶相对应的部分。在这些检测方法中，所述标记可以与要输送的大分子或输送结构的其它部分连接。如上所述，这些酶是在极化上皮细胞底侧膜附近发现的裂解酶。裂解可以检测，例如，通过将输送结构与例如抗体结合并洗脱未结合的分子来检测。如果标记与要输送的大分子连接，则会发现在与抗体结合的分子上有很少的标记或没有标记。可选择地，该检测方法中所用的结合试剂是大分子特异性的，输送结构的其它部分可以被标记。在任何一种情况中，裂解都可以检测。
裂解也可以用基于细胞的分析法来检测，该分析法通过组装在膜中的极化上皮细胞来检测裂解。例如，在允许连接子裂解的条件下，可以将包含可裂解的连接子的已被标记的输送结构或该输送结构的一部分与单层的合适的上皮细胞如Coco-2细胞的顶侧或底侧接触。用与输送结构或其一部分特异性结合的试剂，通过检测所述标记的存在或不存在可以检测裂解。例如，与输送结构特异性结合的抗体可以用于结合含有标记的输送结构，该标记相对于该抗体结合的输送结构部分位于可裂解的连接子的远端。然后通过检测与该抗体结合的分子上的标记的有无来检测裂解。如果发生裂解，在抗体结合的分子上就会观察到很少或观察不到标记。通过进行这些试验，可以确定优选在底侧膜而不是顶侧膜裂解的酶；而且，还可以验证这些酶裂解输送结构中的可裂解的连接子的能力。
进一步地，裂解也可以用美国专利6,759,207中公开的荧光报告子检测法来检测。简而言之，在这种检测方法中，在允许裂解酶裂解报告子的条件下，将荧光报告子与合适的单层上皮细胞的底侧膜接触。所述报告子的裂解改变了荧光报告子的结构，将其从非荧光构型变为荧光构型。观测到的荧光的量表明底侧膜处的裂解酶的活性。
另外，裂解也可以用美国专利6,592,847中公开的分子内淬灭的分子探针来检测。这些探针通常包含荧光部分和淬灭部分，该荧光部分在用合适波长的光激活时释放光子，该淬灭部分在与荧光部分很接近时吸收该光子。探针的裂解将淬灭部分与荧光部分分离，从而使荧光可以被检测到，由此表明发生了裂解。因此，在允许裂解酶裂解探针的条件下，将合适的单层上皮细胞的底侧与该探针接触以使裂解酶裂解该探针，于是可以将该探针用于识别和检测具体的裂解酶进行的裂解。观测到的荧光的量表明所检测的裂解酶的活性。
6.实施例
下述的实施例用于说明本发明，而不是对本发明的限制。
6.1输送结构的构建
根据下述方案，构建了5个示例性输送大鼠生长激素(rGH)的输送结构表达载体。首先，rGH基因用PCR进行扩增，并在PCR产品的两个末端引入Ndel和EcoRI、PstI和PstI、Agel和EcoRI、或PstI和EcoRI限制性酶对。经限制性酶消化后，将PCR产品克隆到pPE64-PstI-Δ553中，并通过相应的限制性酶对对其进行消化。得到的结构称之为pPE-RGH(NdeI-EcoRI)、pntPE-RGH(PstI)、pntPE-RGH(AgeI-EcoRI)和pPE-RGH(PstI-EcoRI)。因此，这些结构包括编码ntPE的区域I和II(图3所示的氨基酸26-372)与rGH(登记号为P01244；参考Seeburg等人1977年的Nature，270：486-494和Page等人1981年的Nucleic Acids Res.，9：2087-2104)的序列，并将6-His部分添加到所述多肽的N末端以方便纯化。最终的质粒通过限制性酶切消化和DNA测序来验证。
含有可裂解的连接子的表达载体通过引入编码合适氨基酸序列的序列进行构建。为了实现这个目的，合成寡核苷酸，该寡核苷酸编码与合适的限制性位点互补的序列和下文所述的氨基酸序列之一，然后将该寡核苷酸连接到如上所述制备的表达载体的ntPE序列和rGH序列之间。对于输送结构1，可裂解的连接子序列为RQPRGGL。对于输送结构2，可裂解的连接子序列为GGLRQPR。对于输送结构3，可裂解的连接子序列为RQPREGR。对于输送结构4，可裂解的连接子序列为RQPRVGR。对于输送结构5，可裂解的连接子序列为RQPRARR。
为了在融合蛋白被抗原递呈细胞摄取时从PE蛋白质中分离出rGH，还在可裂解的连接子与rGH之间插入蛋白酶弗林位点(protease furin site)。为了实现这个目的，制备了包含编码弗林位点和5个不同可裂解的连接子的序列的结构。下表3列出了弗林发夹位点和5个可裂解的连接子的寡核苷酸序列。将每个寡二聚体插入到pPE-RGH(PstI-EcoRI)的PstI位点。通过限制性酶消化和DNA测序验证最终获得的结构pPE-RGH-F1、pPE-RGH-F2、pPE-RGH-F3、pPE-RGH-F4和pPE-RGH-F5。
表3
| 引入了弗林裂解位点和蛋白酶裂解位点的寡核苷酸对 | |
| pPE-RGH-F1 | 1F：AACTGCAGCGCCAGCCTCGAGGAGGATTACTGCAGAA(SEQ ID NO：24)1R：TTCTGCAGTAATCCTCCTCGAGGCTGGCGCTGCAGTT(SEQ ID NO：25) |
| pPE-RGH-F2 | 2F：AACTGCAGGGAGGCTTACGCCAGCCTCGACTGCAGAA(SEQ ID NO：26)2R：TTCTGCAGTCGAGGCTGGCGTAAGCCTCCCTGCAGTT(SEQ ID NO：27) |
| pPE-RGH-F3 | 3F：AACTGCAGCGCCAGCCTCGAGAGGGCCGTCTGCAGAA(SEQ ID NO：28)3R：TTCTGCAGACGGCCCTCTCGAGGCTGGCGCTGCAGTT(SEQ ID NO：29) |
| pPE-RGH-F4 | 4F：AACTGCAGCGCCAGCCTCGAGTCGGCCGTCTGCAGAA(SEQ ID NO：30)4R：TTCTGCAGACGGCCGACTCGAGGCTGGCGCTGCAGTT(SEQ ID NO：31) |
| pPE-RGH-F5 | 5F：AACTGCAGCGCCAGCCTCGAGCACGTCGTCTGCAGAA(SEQ ID NO：32)5R：TTCTGCAGACGACGTGCTCGAGGCTGGCGCTGCAGTT(SEQ ID NO：33) |
6.2输送结构的表达
在合适的质粒存在的情况下，用标准的热休克(heat-shock)方法转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞(Novagen，Madison，WI)，生成ntPE-大鼠生长激素(rGH)表达细胞，在含有氨比西林的介质上筛选，并在含有抗生素的Luria-Bertani肉汤培养基中(Difco；Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ.)分离和生长，然后通过在OD为0.6时加入1mM的异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达。IPTG诱导2小时后，在5,000rpm下离心10分钟得到细胞。裂解细胞后分离包涵体，并将蛋白质溶解在含有100Mm的Tris_HCL(pH 8.0)、2mM EDTA、6M胍盐酸盐和65mM的二硫苏糖醇的缓冲液中。溶解的His ntPE-rGH在0.1M Tris、pH＝7.4、500mM L-精氨酸、0.9mM GSSG、2mM EDTA中重新折叠。将该重新折叠的蛋白质通过Q琼脂糖离子交换法和Superdex 200凝胶过滤色谱法(Amersham BioSciences，Inc.，Sweden)纯化。蛋白质的纯度用SDS-PAGE和分析用HPLC(Agilent，Inc.Palo Alto，CA)分析。
6.3输送结构的表征
下述方法可以用于评价输送结构的重新折叠。根据制造商的说明，通过在Biacore SPR仪器(Biacore，Sweden)中检测如输送结构1与ntPE结合受体CD 91受体和rGH结合蛋白质的结合能力来监测蛋白质重新折叠过程。示例性结构中的其它大分子正确的重新折叠也可以用合适的结合试剂以相似的结合检测法进行检测。通过检测这些结合亲合性，本领域的技术人员可以评价所述输送结构的每部分的正确折叠。
6.4.输送结构的裂解试验
本实例公开了用于鉴定和验证可用于裂解本发明的所述输送结构的可裂解的连接子的酶的试验。首先，从美国典型培养基保藏中心(Manassas，VA)获得第21代Caco-2(ATCC登记号为HTB-37)。从加利福尼亚大学Davis医学院生理系的J.Whiddecombe获得人气管上皮细胞(HTE)。将Caco-2细胞常规地在75cm2的塑料培养瓶(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)上，在含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM中在37℃，5％的CO2/95％的空气气氛中生长。HTE细胞的生长参考Yamaya等人1992年的Am J Physiol.262(6 Pt 1)：L713-24。
为了鉴定合适的可裂解的连接子，将HTE或Caco-2细胞以5×104细胞/cm2的密度接种在24孔胶原涂覆的聚碳酸酯转孔过滤器(Corning，Acton，MA)上培育12-14天。通过EVOM上皮欧姆计和STX2电极(World PrecisionInstruments，Sarasota，FL)测试，汇合的单层跨上皮电阻达到大于500欧姆cm2。为了测试具体酶的活性，向所述单层的底侧(BL)或顶侧(AP)加入待测试肽酶(在250μl DMEM中的500μM或1mM底物，DMEM不含FBS或抗生素)的特异性底物。肽酶底物从Calbiochem有限公司(Division of EMDBiosciences，Inc.，San Diego，CA)得到。将细胞在37℃，5％的CO2/95％的空气气氛中孵育2小时。然后根据制造商的说明，测试底侧和顶侧介质的具体酶的活性。通过测试底物的荧光来评价裂解，因为裂解将淬灭试剂与底物上存在的荧光剂分离，且该分离使荧光变得可以检测，因此该荧光反映裂解。
表4列出了用HTE细胞的进行这些试验的结果，而表5列出了用Caco-2细胞的进行这些试验的结果。对于所有结果，在计算百分比前将基质值减去基线对照值，并进行至少两次测试。表中的百分比表示的是在顶侧或底侧介质的试验中观察到的百分比增加，这种增加取决于哪侧膜显示较高的肽酶活性。需要注意的是，即使将底物加入到膜顶侧的介质中，由于底物透过膜扩散，因此在膜底侧处也可以观测到肽酶活性。
表4
| THE细胞中的测试 | ％AP＞BL | ％BL＞AP | APA405nm | BLA405nm |
| AP-500uM组织蛋白酶BI | 86％ | 0.37 | 0.20 | |
| BL-500uM组织蛋白酶BI | 64％ | 0.35 | 0.21 | |
| AP-500uM组织蛋白酶GI | 882％ | 0.04 | 0.004 | |
| BL-500uM组织蛋白酶GI | 6％ | 0.02 | 0.02 | |
| AP-500uM组织蛋白酶GII | 371％ | 0.02 | 0.01 | |
| BL-500uM组织蛋白酶GII | 0％ | 0％ | 0.02 | 0.02 |
| AP-500uM组织蛋白酶GIII | 11％ | 0.02 | 0.02 | |
| BL-500uM组织蛋白酶GIII | 400％ | 0.01 | 0.03 | |
| AP-500uM糜蛋白酶I | 74％ | 0.04 | 0.02 | |
| BL-500uM糜蛋白酶I | 36％ | 0.03 | 0.04 | |
| AP-500uM弹性蛋白酶I | 49％ | 0.05 | 0.03 | |
| BL-500uM弹性蛋白酶I | 23％ | 0.02 | 0.03 | |
| AP-500uM弹性蛋白酶II | 43％ | 0.29 | 0.20 | |
| BL-500uM弹性蛋白酶II | 31％ | 0.18 | 0.13 | |
| AP-500uM弹性蛋白酶III | 89％ | 0.04 | 0.02 | |
| BL-500uM弹性蛋白酶III | 967％ | 0.03 | 0.003 | |
| AP-500uM弹性蛋白酶IV | 84％ | 0.35 | 0.19 | |
| BL-500uM弹性蛋白酶IV | 65％ | 0.23 | 0.14 | |
| AP-500uM弹性蛋白酶VIII | 529％ | 0.16 | 0.03 | |
| BL-500uM弹性蛋白酶VIII | 181％ | 0.09 | 0.03 | |
| AP-500uM木瓜蛋白酶 | 57％ | 0.02 | 0.02 |
[表4续]
| AP-500木瓜蛋白酶 | 5％ | 0.03 | 0.03 | |
| AP-500uM枯草杆菌蛋白酶AI | 9％ | 0.02 | 0.02 | |
| BL-500uM枯草杆菌蛋白酶AI | 3000％ | 0.001 | 0.03 | |
| AP-500uM枯草杆菌蛋白酶AII | 21％ | 0.02 | 0.02 | |
| BL-500uM枯草杆菌蛋白酶AII | 55％ | 0.01 | 0.02 | |
| AP-500uM凝血酶I | 42％ | 0.15 | 0.11 | |
| BL-500uM凝血酶I | 15％ | 0.09 | 0.10 | |
| AP-500uM凝血酶II | 445％ | 0.40 | 0.07 | |
| BL-500uM凝血酶II | 741％ | 0.41 | 0.05 | |
| AP-500uM尿激酶I | 8％ | 0.11 | 0.10 | |
| BL-500uM尿激酶I | 4％ | 0.13 | 0.13 | |
| AP-1mM组织蛋白酶BI | 17％ | 0.18 | 0.15 | |
| BL-1mM组织蛋白酶BI | 42％ | 0.24 | 0.17 | |
| AP-1mM组织蛋白酶GI | 114％ | 0.05 | 0.02 | |
| BL-1mM组织蛋白酶GI | 47％ | 0.02 | 0.03 | |
| AP-1mM组织蛋白酶GII | 138％ | 0.05 | 0.02 | |
| BL-1mM组织蛋白酶GII | 19％ | 0.03 | 0.03 | |
| AP-1mM组织蛋白酶GIII | 225％ | 0.07 | 0.02 | |
| BL-1mM组织蛋白酶GIII | 54％ | 0.02 | 0.03 | |
| AP-1mM糜蛋白酶I | 35％ | 0.06 | 0.04 | |
| BL-1mM糜蛋白酶I | 90％ | 0.04 | 0.07 | |
| AP-1mM弹性蛋白酶I | 108％ | 0.02 | 0.03 | |
| BL-1mM弹性蛋白酶I | 864％ | 0.01 | 0.09 | |
| AP-1mM弹性蛋白酶II | 62％ | 0.28 | 0.17 | |
| BL-1mM弹性蛋白酶II | 42％ | 0.33 | 0.23 | |
| AP-1mM弹性蛋白酶III | 318％ | 0.02 | 0.01 | |
| BL-1mM弹性蛋白酶III | 131％ | 0.04 | 0.02 | |
| AP-1mM弹性蛋白酶IV | 94％ | 0.41 | 0.21 | |
| BL-1mM弹性蛋白酶IV | 61％ | 0.30 | 0.19 | |
| AP-1mM弹性蛋白酶VIII | 233％ | 0.14 | 0.04 | |
| BL-1mM弹性蛋白酶VIII | 41％ | 0.06 | 0.05 | |
| AP-1mM木瓜蛋白酶 | 424％ | 0.02 | 0.004 | |
| BL-1mM木瓜蛋白酶 | 141％ | 0.02 | 0.01 | |
| AP-1mM枯草杆菌蛋白酶AI | 18％ | 0.03 | 0.03 | |
| BL-1mM枯草杆菌蛋白酶AI | 290％ | 0.01 | 0.04 | |
| AP-1mM枯草杆菌蛋白酶AII | 17％ | 0.03 | 0.02 | |
| BL-1mM枯草杆菌蛋白酶AII | 318％ | 0.01 | 0.04 | |
| AP-1mM凝血酶I | 27％ | 0.17 | 0.14 | |
| BL-1mM凝血酶I | 28％ | 0.17 | 0.13 | |
| AP-1mM凝血酶II | 20％ | 0.12 | 0.10 | |
| BL-1mM凝血酶II | 13％ | 0.05 | 0.06 | |
| AP-1mM尿激酶I | 14％ | 0.19 | 0.21 | |
| BL-1mM尿激酶I | 4％ | 0.21 | 0.20 |
表5
| Caco-2细胞中的测试 | ％AP＞BL | ％BL＞AP | APA405nm | BLA405nm |
| AP-500uM组织蛋白酶BI | 150％ | 0.14 | 0.06 | |
| BL-500uM组织蛋白酶BI | 34％ | 0.17 | 0.12 | |
| AP-10mM组织蛋白酶GI | 195％ | 0.31 | 0.10 | |
| BL-10mM组织蛋白酶GI | 145％ | 0.42 | 1.03 | |
| AP-500uM组织蛋白酶GIII | 35％ | 0.014 | 0.01 | |
| BL-500uM组织蛋白酶GIII | 185％ | 0.03 | 0.01 | |
| AP-500uM组织蛋白酶GI | 232％ | 0.05 | 0.01 | |
| BL-500uM组织蛋白酶GI | 1709％ | 0.01 | 0.15 | |
| AP-500uM组织蛋白酶GII | 3900％ | 0.01 | 0.0003 | |
| BL-500uM组织蛋白酶GII | 1330％ | 0.003 | 0.04 | |
| AP-500uM糜蛋白酶I | 342％ | 0.01 | 0.04 | |
| BL-500uM糜蛋白酶I | 403％ | 0.03 | 0.16 | |
| AP-500uM弹性蛋白酶I | 73％ | 0.01 | 0.01 | |
| BL-500uM弹性蛋白酶I | 295％ | 0.04 | 0.01 | |
| AP-500uM弹性蛋白酶II | 59％ | 0.12 | 0.07 | |
| BL-500uM弹性蛋白酶II | 89％ | 0.01 | 0.02 | |
| AP-500uM弹性蛋白酶III | 85％ | 0.01 | 0.07 | |
| BL-500uM弹性蛋白酶III | 320％ | 0.003 | 0.01 | |
| AP-500uM弹性蛋白酶IV | 32％ | 0.11 | 0.08 | |
| BL-500uM弹性蛋白酶IV | 12％ | 0.02 | 0.02 | |
| AP-500uM弹性蛋白酶VIII | 16％ | 0.02 | 0.02 | |
| BL-500uM弹性蛋白酶VIII | 115％ | 0.01 | 0.02 | |
| AP-500uM木瓜蛋白酶 | 19％ | 0.018 | 0.02 | |
| BL-500uM木瓜蛋白酶 | 339％ | 0.07 | 0.02 | |
| AP-500uM枯草杆菌蛋白酶AI | ***23％ | - | 0.05 | |
| BL-500uM枯草杆菌蛋白酶AI | ***94％ | - | 0.20 | |
| AP-500uM枯草杆菌蛋白酶AI | N/A | - | - | |
| BL-500uM枯草杆菌蛋白酶AI | ***11％ | - | 0.02 | |
| AP-500uM凝血酶I | 81％ | 0.04 | 0.02 | |
| BL-500uM凝血酶I | 254％ | 0.01 | 0.04 | |
| AP-凝血酶II 500uM | 42％ | 0.08 | 0.06 | |
| BL-凝血酶II 500uM | 62％ | 0.09 | 0.06 | |
| AP-500uM尿激酶I | 111％ | 0.12 | 0.06 | |
| BL-500uM尿激酶I | 1044％ | 0.005 | 0.05 | |
| AP-1mM组织蛋白酶BI | 109％ | 0.27 | 0.13 | |
| BL-1mM组织蛋白酶BI | 58％ | 0.12 | 0.2 | |
| AP-20mM组织蛋白酶GI | 129％ | 0.10 | 0.23 | |
| BL-20mM组织蛋白酶GI | 540％ | 0.11 | 0.70 | |
| AP-1mM组织蛋白酶GIII | 37％ | 0.01 | 0.01 | |
| BL-1mM组织蛋白酶GIII | 103％ | 0.07 | 0.03 | |
| AP-1mM组织蛋白酶GI | 107％ | 0.08 | 0.04 | |
| BL-1mM组织蛋白酶GI | 144％ | 0.12 | 0.05 | |
| AP-1mM组织蛋白酶GII | 11％ | 0.05 | 0.06 | |
| BL-1mM组织蛋白酶GII | 7850％ | 0.00 | 0.04 | |
| AP-1mM糜蛋白酶I | 107％ | 0.08 | 0.04 | |
| BL-1mM糜蛋白酶I | 288％ | 0.02 | 0.07 | |
| AP-1mM弹性蛋白酶I | 217％ | 0.03 | 0.001 |
| BL-1mM弹性蛋白酶I | 880％ | 0.003 | 0.02 | |
| AP-1mM弹性蛋白酶II | 27％ | 0.17 | 0.14 | |
| BL-1mM弹性蛋白酶II | 34％ | 0.02 | 0.03 | |
| AP-1mM弹性蛋白酶III | 192％ | 0.02 | 0.01 | |
| BL-1mM弹性蛋白酶III | 77％ | 0.02 | 0.01 | |
| AP-1mM弹性蛋白酶IV | 42％ | 0.16 | 0.11 | |
| BL-1mM弹性蛋白酶IV | 10％ | 0.04 | 0.05 | |
| AP-1mM弹性蛋白酶VIII | 70％ | 0.05 | 0.03 | |
| BL-1mM弹性蛋白酶VIII | 332％ | 0.11 | 0.03 | |
| AP-1mM木瓜蛋白酶 | 61％ | 0.02 | 0.01 | |
| BL-1mM木瓜蛋白酶 | 0％ | 0.005 | 0.005 | |
| AP-1mM枯草杆菌蛋白酶AI | ***61％ | - | 0.13 | |
| BL-1mM枯草杆菌蛋白酶AI | ***44％ | - | 0.09 | |
| AP-1mM枯草杆菌蛋白酶AII | N/A | - | - | |
| BL-1mM枯草杆菌蛋白酶AII | N/A | - | - | |
| AP-1mM凝血酶I | 420％ | 0.11 | 0.02 | |
| BL-1mM凝血酶I | 3400％ | 0.005 | 0.16 | |
| AP-凝血酶II 1mM | 163％ | 0.14 | 0.05 | |
| BL-凝血酶II 1mM | 29％ | 0.11 | 0.09 | |
| AP-1mM尿激酶I | 57％ | 0.17 | 0.11 | |
| BL-1mM尿激酶I | 230％ | 0.05 | 0.15 |
***仅仅表示超过基线控制的％
″-″表示的是低于基线控制的值
6.5示例性大分子-绿色荧光蛋白质的输送
下述实例公开了用于评价示例性输送结构的穿胞运输的试验，其中的输送结构用于输送绿色荧光蛋白质(″GFP″)穿过小鼠上皮细胞膜。需要注意的是，该示例性输送结构不包括可裂解的连接子，但是有或没有可裂解的连接子并不影响输送结构的穿胞运输。
简而言之，将nt-PE-GFP结构施用于约8周的麻醉雌性balb/c小鼠的气管。该鼠通过吸入的异氟烷麻醉且气管暴露。在气管上开一个小洞，以使用本发明的GFP物质。在该试验中，使用100μg单独的GFP或ntPE-GFP。将GFP物质慢慢的直接滴入到暴露的气管上，体积为100μl。15分钟后，将鼠用CO2窒息安乐死。移出气管并用活体检查的cryomolds(cat#4565-Tissue Tek)在OCT(cat#25608-930-Tissue Tek)中冷冻。然后在载玻片上对样品进行切片，并用荧光显微镜法(Nikonmodel Eclipse E400)进行显像。
图1A-1C显示了上皮切片的显微图片。图1A显示了和气管上皮细胞顶侧表面强烈粘附的nt-PE-GFP结构。图1B显示了nt-PE-GFP结构穿过气管上皮细胞的穿胞运输。图1C显示了nt-PE-GFP结构从气管上皮细胞的底侧释放的情况。图1D显示的阴性对照的显微图片，小鼠的气管上皮细胞切片和单独的GFP接触。这些组织暴露了15分钟，以获得这些显微图片。
显微图片显示nt-PE-GFP与小鼠气管上皮细胞的顶侧表面的受体强烈作用，穿胞运输穿过这些上皮组织，并从鼠气管上皮细胞的底侧表面释放。
此外，用下述实施例6.6.1中所述的ELISA方法测定在给予所述输送结构后nt-PE-GFP结构的血浆浓度。给药后，每30分钟从鼻内给予100μg的nt-PE-GFP输送结构的麻醉鼠中提取血清样品。图2显示了该试验的结果，显示了输送结构的峰血浆水平达到500-900ng/ml，表明了该输送结构在鼻内给药后的生物利用度约为22％。
6.6用组织学检测法检测组织内的生长激素蛋白
本实例描述了检测组织中输送的代表性大分子，即生长激素的组织学监测法。在给予输送结构后，动物用CO2窒息安乐死，进行心脏穿刺术放血。移出特定的组织(淋巴结、气管、脑、脾肝、GI通道)，在PBS中短暂洗涤以除去残留的血液并在OCT中冷冻。将切片(5微米厚)置于载玻片上。将载玻片用丙酮固定10分钟并用PBS洗涤。载玻片与3％的过氧化酶一起培育5分钟，然后再用蛋白质封闭5分钟。将初级生长激素抗体在载玻片上孵育30分钟，稀释比为1∶100，再用PBS洗涤。然后将生物素标记的次级抗体孵育约15分钟，再用PBS洗涤。用链霉素HRP标记在载玻片上孵育15分钟，再用PBS洗涤。应用HRP显色5分钟，接着在蒸馏水中洗涤几次。最后，将载玻片用苏木精着色1分钟，盖片，检测GH是否存在。
6.7在体外系统中输送和裂解示例性输送结构
本实例公开了包含大鼠生长激素(rGH)的示例性输送结构，即输送结构2的输送和裂解，这在体外系统中进行并使用人气管上皮细胞。
6.7.1人气管上皮细胞的生长
如前所述，从气管分离人气管上皮细胞(HTE)，并在涂有人胎盘胶原的半渗透过滤系统(0.45um的孔；Corning，Acton，MA)上培养。参考Yamaya等人1992年的Am J Physiol，262：L713-24和Sachs等人2003年的In Vitro CellDev Biol Anim，39：56-62。在涂布后的第10天使用细胞板(Cell sheets)，此时用“筷式”欧姆计(Millicell ERS，Manassas，VA)测试，细胞板的跨上皮电阻(TER)大于100欧姆cm2。
从美国典型培养基保藏中心(Manassas，VA)获得第21代Caco-2细胞。将Caco-2细胞常规地在75cm2的塑料培养瓶(Becton Dickinson，FranklinLakes，NJ)上，在含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM中在37℃，5％的CO2/95％的空气气氛中生长。为了研究输送和裂解，Caco-2细胞以5×104细胞/cm2的密度接种在24孔胶原涂覆的聚碳酸酯转孔过滤器(Corning，Acton，MA)上培育12-14天。用EVOM和STX2电极(WorldPrecision Instruments，Sarasota，FL)测定，汇合的单层跨上皮电阻达到大于500欧姆cm2。
6.7.2输送和裂解试验
为了测定输送和裂解活性，在上皮细胞单层的顶侧上加入输送结构1和2蛋白(100μl DMEM中10μg，该DMEM不含酚红、FBS或抗生素)。细胞在37℃，5％的CO2/95％的空气气氛中孵育4小时。然后通过用Western印迹分析法测定从输送结构上裂解的rGH的存在来评价顶侧和底侧介质处的输送和裂解活性，如下所述。作为对照，将10μg的右旋糖苷荧光素也加入到顶侧孔中以检测渗漏。
在如上所述孵育4小时后，将顶侧和底侧的介质样品通过加入三氯乙酸(TCA)沉淀。每个样品中加入的TCA的量为样品体积的20％。旋涡每个样品，并在冰上静置30分钟。样品在冰上孵育后，以14,000RPM离心10分钟。接着，吸出每个样品的上清液，将含有剩余沉淀颗粒的试管打开、风干。在每个沉淀颗粒中加入4μl 0.2M的NaOH。加入氢氧化钠5分钟后，在36μl 8M的尿素中再次悬浮颗粒。
接着，在每个样品中加入10μl含有DTT(Invitrogen NP0007，NP0009)的样品缓冲液。然后将样品放在100℃上加热阻断5分钟。然后将每个样品的一半(19μl)加载到4％-12％的Tris Bis凝胶(Invitrogen NP3022BOX)上。用于对照，将重组的大鼠GH(RDI RO 125)和输送结构1或输送结构2蛋白直接加载到该凝胶中。在150V下电泳30分钟。样品在30V下经过1小时从凝胶转移的硝化纤维上。
下面的步骤中使用从Invitrogen′s Western Breeze获得的封闭溶液、抗体稀释剂和抗体洗涤溶液。将硝化纤维膜置入封闭缓冲液中4℃孵育过夜。将膜洗涤3次，每次3分钟。然后将膜与10ml的1∶2000兔抗生长激素抗体(RDIRDIRtGHabr)一起在RT中孵育。1小时后，将膜再次洗涤3次，每次3分钟。然后将膜与10ml的1∶2000山羊抗兔IgG AP(Pierce 31340)一起于室温下孵育1小时。将膜洗涤3次，每次3分钟。在膜中加入5μl底物(Pierce34042)。在颜色达到所需的强度时，通过除去底物并加入纯净水来中止反应。最后，将膜在纯净水中洗涤30分钟，风干。
Western印迹分析的结果列于图4。由图4可知，上皮细胞层底侧的介质含有蛋白质，该蛋白质与从输送结构2的其它部分裂解出rGH相同。相比之下，上皮细胞层顶侧的介质主要含有的是完整的输送结构。因此，将输送结构2应用到人体上皮细胞膜顶侧既产生向膜底侧的输送，还产生输送结构的合适裂解，如可用抗-rGH抗体检测的rGH的释放和合适的表观分子量所显示。类似的结果也在输送结构1中观察到(数据没有显示)。
6.8.示例性大分子在体内系统中的输送
本实例公开了示例性输送结构2在鼠模型中的应用，显示了输送结构在体内的有效输送和裂解，以及输送结构2所输送的大分子rGH的生物利用度。
6.8.1.含有大鼠生长激素的输送结构的施用
用动物喂食针，将100μg的输送结构2(体积共为250μl)通过口腔输送给5-6周的雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)。输送结构2用1mg/ml的牛血清蛋白(BSA)和磷酸缓冲盐液(PBS)稀释。作为阳性对照，对照小鼠通过背侧的皮下注射(SC)在PBS中稀释的30μg重组大鼠生长激素(rGH) (体积共为100μl)。口服强饲和SC给药一定时间后，用CO2将小鼠窒息安乐死。如下所述收集和分析小鼠的肝脏和全血。由于输送结构2和rGH之间的分子量不同，因此两种途径施用的rGH分子的数量基本相同。
6.8.2.在体内系统中与输送结构一起施用的示例性大分子的药物动力学
为了评价与输送结构一起给药的示例性大分子的药物动力学，在给药后的特定时间点，用ELISA方法测试rGH的血清浓度。由此获得的血清浓度数据用于比较通过常规皮下给药和与输送结构一起给药的rGH的药物动力学。ELISA方法如下所述。
用200ng/孔的山羊抗-rGH(Diagnostics Systems Laboratories，Cat.No.R01235)涂覆Costar 9018 E.I.A./R.I.A.96-孔板过夜，其中山羊抗-rGH溶于0.2M的NaHCO3-Na2CO3中，pH为9.4。每个96-孔板用含有0.05％Tween20-0.01％thimerosal(洗涤缓冲液)的PBS洗涤四次；用200μl/孔、含有0.5％BSA-0.01％thimerosal(洗涤缓冲液)的PBS/Tween20封闭1小时。用在试验缓冲液(PBST～0.5％BSA)中稀释的重组大鼠GH(Diagnostics SystemsLaboratories，Cat.No.R01205)制作标准曲线。标准曲线的第一点通过在10ml试验缓冲液(1∶200)中加入50μl的重组大鼠GH，旋涡并将200μl移至800μl的试验缓冲液(1∶5)中得到。对于每个孔板，都按照1∶2的稀释比将0.5ml移至0.5ml的试验缓冲液中以获得随后的点。标准曲线的10个点为：100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39和0.195ng/孔。样品以1∶10用试验缓冲液稀释，以100μl/孔加载到96-孔板中，一式三份，孵育过夜。然后将每个96-孔板用洗涤缓冲液洗涤四次，加载100μl/孔的以1∶300溶在试验缓冲液(PBST-0.5％BSA)中的第二抗体(兔抗-rGH，Cell Sciences，Cat.No.PAACl)，并在室温下孵育4小时。然后每个96-孔板用洗涤缓冲液洗涤四次，加载100μl/孔的以1∶300溶在试验缓冲液(PBST-0.5％BSA)中的第三抗体(山羊抗-兔IgG-辣根过氧化物酶(HRP)，Pierce，Cat.No.31460)，并在室温下孵育2小时。所有的涂覆和孵育步骤均在6 RPM的混合器、室温下进行。用于对结合的抗体进行定量的HRP底物、TMB(3，3′，5，5′四甲基联苯胺)在450nm处测定。
ELISA结果记录为每个样品的三个OD(450nm)值的平均值。大鼠GH浓度用超出(exceeding)平均值加上三倍的合适对照值均数的标准误差(SEM)确定。
图5-7列出了ELISA试验的结果。图5列出了BALB/c小鼠的血清rGH浓度，该鼠用皮下(SC)注射的方式给予了30μg的非糖基化重组大鼠GH。各个小鼠血清以1∶10的稀释比测试，并记录rGH浓度的组平均值(每个时间点的n＝4只鼠)。均数的标准误差(SEM)用误差棒表示。如图5所示，在皮下给药rGH后30分钟观测到血清浓度的峰值，约为240ng/ml rGH。
图6列出了BALB/c小鼠的血清rGH浓度，小鼠口服给予了100μg输送结构2。各个小鼠血清以1∶10的稀释比测试，并记录rGH浓度的组平均值(每个时间点的n＝4只小鼠)。均数的标准误差(SEM)用误差棒表示。如图5所示，在施用输送结构2后20分钟观测到血清浓度的峰值，约为280ng/ml rGH。
图7显示了与输送结构2一起施用和皮下施用rGH的药物动力学的比较结果。rGH(SC)和输送结构2(口服)的对照曲线通过如上所述测定的ELISA数据并用药物动力学数据分析软件PK Solution 2.0(Summit ResearchServices，Montrose，CO)得到。如图7所示，输送结构2和皮下施用rGH相比，得到了更高的血清rGH峰浓度。而且，相对于皮下施用rGH，输送结构2得到峰值的时间也较快。相对于皮下施用rGH，输送结构2输送的rGH的生物利用度约为60％。
6.8.3.显示输送结构输送后的大分子活性的检测法
本实例描述了与输送结构2一起输送的示例性大分子rGH在体内的生物学效果。简而言之，在小鼠的肝脏组织中评价类胰岛素生长因子I-结合蛋白3(IGF-I-BP3)、生长激素(GH)受体和类生长因子I(IGF-I)的表达水平，该小鼠如上所述施用了输送结构2或皮下给予了rGH。根据良好表征的GH结合其在IGF-I-BP3上的受体的效果和GH受体水平，对这些转录进行分析。具体地，已经公知的是，在被GH结合后GH受体的功能性激活导致IGF-I-BP3表达的上调和GH受体表达的下调。其中，IGF-I-BP3 mRNA表达上调被认为是GH受体激活最可靠的指征。参考Sondergaard等人2003年的Am J Physiol Endocrinol Metab 285：E427-32。
因此，用定量实时PCR来检测和定量如上准备的约30mg小鼠肝脏组织中的IGF-I-BP3、GH受体、IGF-I和3-磷酸甘油醛酯脱氢酶(GAPDH)mRNA的量。在进一步处理之前，收集的肝脏组织储藏在-70℃下。PCR的实时检测使用Applied Biosystems 7300实时PCR系统(Applied Biosystems，FosterCity，CA)来进行。用RNeasy Protect Mini Kit(Qiagen)从小鼠肝脏中分离总RNA。在Omniscript逆转录酶(Qiagen)方案后总RNA被用于产生适于寡dT寡脱氧核苷酸引物(T12-18)的cDNA。用于扩增cDNA的引物通过PrimerExpress软件(Applied Biosystems)设计，并通过Operon(Alameda，CA)合成，这些引物如表6所示。
表6
| RT-PCR引物 | |
| IGF-I-BP3(正向) | CGCAGAGAAATGGAGGACACA； |
| IGF-I-BP3(反向) | GGACGCCTCTGGGACTCA； |
| GH受体(反向) | GTTGACGAAATAGTGCAACCTGAT； |
| GH受体(反向) | CACGAATCCCGGTCAAACTAA； |
| IGF-I(正向) | GCTATGGCTCCAGCATTCG； |
| IGF-I(反向) | GCTCCGGAAGCAACACTCA |
| GAPDH(正向) | GCAACAGGGTGGTGGACCT |
| GAPDH(反向) | GGATAGGGCCTCTCTTGCTCA |
使用等量的cDNA，一式两份，并用SYBR Green I Master Mix(AppliedBiosystems)扩增。热循环参数如下：95℃下热激活10分钟，40次PCR循环(95℃下熔融15秒，60℃下退火/扩展1分钟)。标准曲线用对照小鼠的肝样品的总RNA的稀释曲线(1∶10、1∶100、1∶500、1∶1,000、1∶2,000)来构建。每次PCT都包括“无模板对照”。相对GAPDH验证和标准化扩增效率。通过溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶电泳验证正确PCR产品的大小。扩增的PCR产品的纯度通过热分解方案来确定。
图8-10显示的是该分析的结果。图8显示的是雌性BALB/c小鼠肝脏中IGF-I-BP3 mRNA的表达水平，该小鼠通过皮下注射了30μg的重组rGH或强饲口服了100μg的输送结构2。从肝脏中提取的总RNA用IGF-I-BP3特异性引物如上所述进行定量RT-PCT。相对3磷酸甘油醛酯脱氢酶(GAPDH)将数值标准化并表达为对照的百分比。如图8所示，皮下施用rGH60分钟后，肝脏中的IGF-1-BP3 mRNA的表达水平约增加250％。与此相比，输送结构2在给药30分钟后，在肝脏中的IGF-1-BP3mRNA的表达水平约增加400％。因此，口服施用输送结构2有效地将rGH输送到测试小鼠的血流中，因而证实了输送结构在体内系统中能够有效地穿过粘膜输送活性大分子。而且，和皮下施用相比，输送结构2能够输送更多的活性rGH到肝脏中，而且观察到rGH的给药效果比皮下施用rGH要快得多。
图9显示了是雌性BALB/c小鼠通过皮下注射重组rGH(30μg)或强饲口服输送结构2(100μg)后肝脏中生长激素(GH)受体mRNA的表达水平。从肝脏中提取的总RNA用GH受体特异性引物如上所述进行定量RT-PCT。相对3磷酸甘油醛酯脱氢酶(GAPDH)将数值标准化并表达为对照的百分比。如图9所示，皮下施用rGH 60分钟后，肝脏中GH受体的mRNA的表达水平约降为给药前的65％。与此相比，输送结构2使这种mRNA的表达水平约降为给药前的15％。因此，这些结果证实口服给予输送结构2有效地将rGH输送到个体的血流中；而且，这些结果还证实与常规皮下施用rGH相比，输送结构2输送了更多活性rGH至小鼠的肝脏，如GH受体mRNA表达的下调节增加所示。
图10显示的是雌性BALB/c小鼠通过皮下注射重组rGH(30μg)或强饲口服输送结构2(100μg)后肝脏中类胰岛素生长因子I(IGF-I)mRNA的表达水平。从肝脏中提取的总RNA用IGF-I受体特异性引物如上所述进行定量RT-PCT。相对3-磷酸甘油醛酯脱氢酶(GAPDH)将数值标准化并表达为对照的百分比。如图10所示，皮下施用rGH或输送结构2施用30分钟后，肝脏中IGF-I mRNA表达水平约降为给药前的20％。因此，皮下施用rGH和口服施用输送结构2产生了相同的效果，这表明输送结构2可以向个体血流中输送活性rGH。
6.9.与输送结构一起给药的大分子的降低的免疫原性
本实施例显示了与输送结构2一起口服的示例性大分子rGH比皮下施用的rGH具有更低的免疫原性。
为了评价rGH的输送结构施用相对于口服施用在小鼠体内的免疫原性，用ELISA方法测试口服施用3、10、或30μg输送结构2或3，或皮下施用10μg的rGH的抗-rGH IgG抗体的血清滴度。为了进行该测试，将100μl的1ng/μl重组rGH在包被缓冲液(coating buffer，0.2M NaHCO3-Na2CO3)中稀释后加入到Costar EIA/RIA孔板中，然后在室温下孵育16-24小时。接着，用300μl的洗涤缓冲液(磷酸盐-缓冲液)洗涤四次。然后将孔板用200μl的封闭缓冲液(溶在磷酸盐缓冲液中的0.5％BSA)封闭，并在室温下孵育1小时。接着，再次用300μl的洗涤缓冲液(磷酸盐-缓冲液)洗涤四次。
准备好孔板后，将100μl稀释的样品、标准阳性对照或作为阴性对照的试验缓冲液加入到合适的孔中，孵育1小时。小鼠血清样品和阳性对照(抗-rGH IgG)在试验缓冲液(溶在磷酸盐缓冲液中的0.5％BSA)中以1∶20稀释。然后孔板用300μl的洗涤缓冲液洗涤四次。接着，用100μl第二抗体(与辣根过氧化物酶鳌合的山羊抗小鼠IgG，0.4mg/ml，Pierce#31430)在试验缓冲液中以1∶6000稀释，并室温下孵育1小时。接着，孔板再次用300μl的洗涤缓冲液洗涤四次。接着，将100μl的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺底物(Sigma)加入到每个孔中，根据颜色的情况孵育2-10分钟。向其中加入100μl/孔的1M的H2SO4中止该反应，记录450nm的吸收率。所有的试验进行三次，将结果平均。
ELISA的典型结果列于图11A-D。这些图中的曲线证实，与皮下施用3μg或10μg的rGH相比，口服施用3μg、10μg和30μg的输送结构2引发更低滴度的抗-rGH IgG抗体。具体来说，在所有皮下施用10μgrGH的8只小鼠中引起实质性的抗-rGH IgG反应，通过强饲口服施用3μg、10μg或30μg输送结构2的8只小鼠只引起很小的抗-rGH IgG反应。而且，无论血清以1∶25稀释(图11A-B)或1∶200稀释(图11C-D)，这些结果是一致的。最后，需要注意的是，施用3μg、10μg或30μg的输送结构2的每只小鼠都产生很小的抗rGH免疫反应，如图11C-D中的紧密聚集的数据点所示。因此，这些结果证实，和常规皮下注射相比，口服输送结构2不仅输送更多活性rGH至肝脏，而且与皮下施用相比，与输送结构2一起口服施用的rGH具有更小的免疫原性。
6.10输送人生长激素的示例性输送结构
本实施例描述了输送人生长激素的示例性输送结构，即输送结构6的构建。使用与上述实施例6.1相似的技术构建用于表达输送结构6的质粒。该质粒编码示例性输送结构6的核苷序列部分如图12所示，而该输送结构的氨基酸序列如图13所示。
6.11输送干扰素α的示例性输送结构
本实施例描述了输送IFNα(在此为IFNα-2b)的示例性输送结构，即输送结构7的构建。使用与上述实施例6.1相似的技术构建用于表达输送结构7的质粒。该质粒编码示例性输送结构7的核苷序列部分如图14所示，而输送结构7的氨基酸序列如图15所示。
6.12在体内系统中输送干扰素α
本实例显示了在小鼠模型系统中用输送结构7输送IFNα-2b至个体血流中。
用动物喂食针，将100μg的输送结构7(体积共为250μl)通过口腔施用于5-6周大小的雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)。输送结构7用1mg/ml的牛血清蛋白(BSA)和磷酸缓冲盐液(PBS)稀释。口服和SC给药一定时间后，用CO2将鼠窒息安乐死。收集所有的血液进行分析，如下所述。
给药后立即用ELISA方法测试一只小鼠的IFNα-2b血清浓度，另外三只小鼠的IFNα-2b血清浓度分别在给药15、30和75分钟后用ELISA方法测试。根据制造商的说明，用R&D系统血清ELISA试剂盒.No.41110-1进行ELISA测试。
以每个样品的三个OD(450nm)平均值表示ELISA结果。ELISA试验结果如图16所示。如图16所示，在给药15分钟后，检测到低浓度(约3ng/ml)的IFNα-2b。给药30分钟后，IFNα-2b的血清浓度约为43ng/ml。给药45分钟后，IFNα-2b的血清浓度降至约13ng/ml。
6.13输送胰岛素原的示例性输送结构
本实例描述了输送胰岛素原的示例性输送结构，即输送结构8的构建。使用与上述实施例6.1相似的技术构建用于表达输送结构8的质粒。输送结构8的氨基酸序列如图17所示。
6.14输送胰岛素的示例性输送结构
本实例描述了输送胰岛素的示例性输送结构，即输送结构9的构建。使用与上述实施例6.1相似并进行了一些改进的技术来构建用于表达输送结构9的质粒。
具体来说，要对用于表达输送结构9的方案进行改进是因为胰岛素包含两个分开的氨基酸链。在这个实施例中，胰岛素的B-链与输送结构的其它部分一起表达，根据实施例6.1的一般方案进行构建。与A-链对应的氨基酸可以是合成的(例如由氨基酸化学合成A-链肽)或重组的(用合适的重组系统如大肠杆菌、酵母等表达)。该两个多肽在一定条件下组合以使A-链和B-链连接。然后，在胰岛素的两个链之间形成二硫键，正如在天然胰岛素进行中度氧化后所发现的一样。输送结构9的两个氨基酸链的氨基酸序列如图19所示。
另外，本发明还提供了输送结构和在个体体内诱导免疫反应的方法。尽管上述描述提供了许多具体实施例，但是这些描述只是举例性的，并不对本发明产生任何限制。对于本领域普通技术人员来说，可以在本发明的基础上进行一些显而易见的修饰和改变。因此，本发明的范围不是由上述描述来限定，而应该参考所附的权利要求书和其所有其等同范围来限定。
本发明引用的所有公开出版物和专利文献在此被纳入本发明作为参考，其参考的程度如同各个公开出版物和专利文献被分别引用一样。这些文献的引用并不意味着承认这些文献相对于本发明为现有技术。
| 表7 | ||||
| 人肽酶类别 | ||||
| 天冬氨酸型肽酶 | 半胱氨酸型肽酶 | 金属肽酶 | 丝氨酸型肽酶 | 苏氨酸型肽酶 |
| BAE1_HUMAN(P56817)BAE2_HUMAN(Q9Y5Z0)CATD_HUMAN(P07339)CATE_HUMAN(P14091)NAP1_HUMAN(O96009)PEPA_HUMAN(P00790PEPC_HUMAN(P20142)RENI_HUMAN(P00797)VPRT_HUMAN(P10265) | BLMH_HUMAN(Q13867)CATB_HUMAN(P07858)CATC_HUMAN(P53634)CATF_HUMAN(Q9UBX1)CATH_HUMAN(P09668)CATK_HUMAN(P43235)CATL_HUMAN(P07711)CATO_HUMAN(P43234)CATS_HUMAN(P25774)CATW_HUMAN(P56202)CATZ_HUMAN(Q9UBR2) | AMPB_HUMAN(Q9H4A4)AMPE_HUMAN(Q07075)AMPN_HUMAN(P15144)ART1_HUMAN(Q9NZ08)LCAP_HUMAN(Q9UIQ6)LKHA_HUMAN(P09960)PSA_HUMAN(P55786)RNPL_HUMAN(Q9HAU8)THDE_HUMAN(Q9UKU6)ACET_HUMAN(P22966)ACE_HUMAN(P12821) | ACRL_HUMAN(P58840)ACRO_HUMAN(P10323)APOA_HUMAN(P08519)BSS4_HUMAN(Q9GZN4)C1R_HUMAN(P00736)C1S_HUMAN(P09871)CAP7_HUMAN(P20160)CATG_HUMAN(P08311)CFAB_HUMAN(P00751)CFAD_HUMAN(P00746)CFAI_HUMAN(P05156) | PS7L_HUMAN(Q8TAA3)PSA1_HUMAN(P25786)PSA2_HUMAN(P25787)PSA3_HUMAN(P25788)PSA4_HUMAN(P25789)PSA5_HUMAN(P28066)PSA6_HUMAN(P60900)PSA7_HUMAN(O14818)PSB1_HUMAN(P20618)PSB2_HUMAN(P49721)PSB3_HUMAN(P49720) |
| 其它肽酶 | ||||
| FAC2_HUMAN(Q9Y256) | ||||
| CSL2_HUMAN(O60911)TNAG_HUMAN(Q9UJW2)CAN1_HUMAN(P07384)CAB2_HUMAN(P17655)CAN3_HUMAN(P20807)CAN5_HUMAN(O15484)CAN6_HUMAN(Q9Y6Q1)CAN7_HUMAN(Q9Y6W3)CAN9_HUMAN(O14815)CANA_HUMAN(Q9HC96)CANB_HUMAN(Q9UMQ6)UBL1_HUMAN(P09936)UBL3_HUMAN(P15374)UBL5_HUMAN(Q9Y5K5)GPI8_HUMAN(Q92643)LGMN_HUMAN(Q99538)CFLA_HUMAN(O15519)I1BC_HUMAN(P29466)ICE2_HUMAN(P42575) | MEPD_HUMAN(P52888)NEUL_HUMAN(Q9BYT8)PMIP_HUMAN(Q99797)MM01_HUMAN(P03956)MM02_HUMAN(P08253)MM03_HUMAN(P08254)MM07_HUMAN(P09237)MM08_HUMAN(P22894)MM09_HUMAN(P14780)MM10_HUMAN(P09238)MM11_HUMAN(P24347)MM12_HUMAN(P39900)MM13_HUMAN(P45452)MM14_HUMAN(P50281)MM15_HUMAN(P51511)MM16_HUMAN(P51512)MM17_HUMAN(Q9ULZ9)MM19_HUMAN(Q99542)MM20_HUMAN(O60882) | CLCR_HUMAN(Q99895)CO2_HUMAN(P06681)CORI_HUMAN(Q9Y5Q5)CRAR_HUMAN(P48740)CTRB_HUMAN(P17538)CTRL_HUMAN(P40313)DES1_HUMAN(Q9UL52)EL1_HUMAN(Q9UNI1)EL2A_HUMAN(P08217)EL2B_HUMAN(P08218)EL3A_HUMAN(P09093)EL3B_HUMAN(P08861)ELNE_HUMAN(P08246)ENTK_HUMAN(P98073)FA10_HUMAN(P00742)FA11_HUMAN(P03951)FA12_HUMAN(P00748)FA7_HUMAN(P08709)FA9_HUMAN(P00740) | PSB4_HUMAN(P28070)PSB5_HUMAN(P28074)PSB6_HUMAN(P28072)PSB7_HUMAN(Q99436)PSB8_HUMAN(P28062)PSB9_HUMAN(P28065)PSBA_HUMAN(P40306) |
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序列表
<110>特里尼蒂生物系统公司
<120>用于无针输送大分子的方法和组合物
<130>10901-014-999
<140>11/244,349
<141>2005-10-04
<150>60/615,970
<151>2004-10-04
<150>60/684,484
<151>2005-05-24
<150>60/718,907
<151>2005-09-19
<160>40
<170>Patentln 3.3
<210>1
<211>266
<212>PRT
<213>绿脓杆菌
<220>
<223>多肽
<400>1
Met His Leu Ile Pro His Trp Ile Pro Leu Val Ala Ser Leu Gly Leu
1 5 10 15
Leu Ala Gly Gly Ser Ser Ala Ser Ala Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu
20 25 30
Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val
35 40 45
Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp Pro Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly
50 55 60
Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala Leu Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu
85 90 95
Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val Glu Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr
100 105 110
Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly Ser Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val
115 120 125
Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser Asn Ile Lys Val Phe Ile His Glu
130 135 140
Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser His Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile
145 150 155 160
Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala Lys Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe
165 170 175
Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn Glu Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile
180 185 190
Ser His Ala Gly Val Ser Val Val Met Ala Gln Thr Gln Pro Arg Arg
195 200 205
Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala Ser Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu
210 215 220
Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn Tyr Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn
225 230 235 240
Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys Ile Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn
245 250 255
Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile Lys Pro
260 265
<210>2
<211>153
<212>PRT
<213>绿脓杆菌
<220>
<223>多肽
<400>2
Thr Val Ile Ser His Arg Leu His Phe Pro Glu Gly Gly Ser Leu Ala
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr
20 25 30
Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr
35 40 45
Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser
130 135 140
Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr
145 150
<210>3
<211>1839
<212>DNA
<213>绿脓杆菌
<220>
<223>多核苷酸
<400>3
gccgaagaag ctttcgacct ctggaacgaa tgcgccaaag cctgcgtgct cgacctcaag 60
gacggcgtgc gttccagccg catgagcgtc gacccggcca tcgccgacac caacggccag 120
ggcgtgctgc actactccat ggtcctggag ggcggcaacg acgcgctcaa gctggccatc 180
gacaacgccc tcagcatcac cagcgacggc ctgaccatcc gcctcgaagg cggcgtcgag 240
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aacgccggca accagctcag ccacatgtcg ccgatctaca ccatcgagat gggcgacgag 420
ttgctggcga agctggcgcg cgatgccacc ttcttcgtca gggcgcacga gagcaacgag 480
atgcagccga cgctcgccat cagccatgcc ggggtcagcg tggtcatggc ccagacccag 540
ccgcgccggg aaaagcgctg gagcgaatgg gccagcggca aggtgttgtg cctgctcgac 600
ccgctggacg gggtctacaa ctacctcgcc cagcaacgct gcaacctcga cgatacctgg 660
gaaggcaaga tctaccgggt gctcgccggc aacccggcga agcatgacct ggacatcaaa 720
cccacggtca tcagtcatcg cctgcacttt cccgagggcg gcagcctggc cgcgctgacc 780
gcgcaccagg cttgccacct gccgctggag actttcaccc gtcatcgcca gccgcgcggc 840
tgggaacaac tggagcagtg cggctatccg gtgcagcggc tggtcgccct ctacctggcg 900
gcgcggctgt cgtggaacca ggtcgaccag gtgatccgca acgccctggc cagccccggc 960
agcggcggcg acctgggcga agcgatccgc gagcagccgg agcaggcccg tctggccctg 1020
accctggccg ccgccgagag cgagcgcttc gtccggcagg gcaccggcaa cgacgaggcc 1080
ggcgcggcca acgccgacgt ggtgagcctg acctgcccgg tcgccgccgg tgaatgcgcg 1140
ggcccggcgg acagcggcga cgccctgctg gagcgcaact atcccactgg cgcggagttc 1200
ctcggcgacg gcggcgacgt cagcttcagc acccgcggca cgcagaactg gacggtggag 1260
cggctgctcc aggcgcaccg ccaactggag gagcgcggct atgtgttcgt cggctaccac 1320
ggcaccttcc tcgaagcggc gcaaagcatc gtcttcggcg gggtgcgcgc gcgcagccag 1380
gacctcgacg cgatctggcg cggtttctat atcgccggcg atccggcgct ggcctacggc 1440
tacgcccagg accaggaacc cgacgcacgc ggccggatcc gcaacggtgc cctgctgcgg 1500
gtctatgtgc cgcgctcgag cctgccgggc ttctaccgca ccagcctgac cctggccgcg 1560
ccggaggcgg cgggcgaggt cgaacggctg atcggccatc cgctgccgct gcgcctggac 1620
gccatcaccg gccccgagga ggaaggcggg cgcctggaga ccattctcgg ctggccgctg 1680
gccgagcgca ccgtggtgat tccctcggcg atccccaccg acccgcgcaa cgtcggcggc 1740
gacctcgacc cgtccagcat ccccgacaag gaacaggcga tcagcgccct gccggactac 1800
gccagccagc ccggcaaacc gccgcgcgag gacctgaag 1839
<210>4
<211>4
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>肽
<400>4
Ala Ala Pro Phe
1
<210>5
<211>3
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>肽
<400>5
Gly Gly Phe
1
<210>6
<211>4
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>肽
<400>6
Ala Ala Pro Val
1
<210>7
<211>3
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>肽
<400>7
Gly Gly Leu
1
<210>8
<211>3
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>肽
<400>8
Ala Ala Leu
1
<210>9
<211>3
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>肽
<400>9
Phe Val Arg
1
<210>10
<211>3
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>肽
<400>10
Val Gly Arg
1
<210>11
<211>5
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>肽
<221>变体
<222>5
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>11
Tyr Val Ala Asp Xaa
1 5
<210>12
<211>5
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>肽
<221>变体
<222>2，3，5
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>12
Asp Xaa Xaa Asp Xaa
1 5
<210>13
<211>4
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>肽
<221>变体
<222>2，4
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>13
Arg Xaa Arg Xaa
1
<210>14
<211>4
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>肽
<221>变体
<222>2，4
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>14
Lys Xaa Arg Xaa
1
<210>15
<211>6
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>肽
<221>变体
<222>6
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>15
Gly Arg Thr Lys Arg Xaa
1 5
<210>16
<211>5
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>肽
<221>变体
<222>5
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>16
Arg Val Arg Arg Xaa
1 5
<210>17
<211>6
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>肽
<221>变体
<222>6
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>17
Asp Arg Val Arg Arg Xaa
1 5
<210>18
<211>6
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>肽
<221>变体
<222>2，6
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>18
Pro Xaa Trp Val Pro Xaa
1 5
<210>19
<211>4
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>肽
<221>变体
<222>4
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>19
Trp Val Ala Xaa
1
<210>20
<211>4
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>肽
<221>变体
<222>1，3，4
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>20
Xaa Phe Xaa Xaa
1
<210>21
<211>4
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>肽
<221>变体
<222>1，3，4
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>21
Xaa Tyr Xaa Xaa
1
<210>22
<211>4
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>肽
<221>变体
<222>1，3，4
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>22
Xaa Trp Xaa Xaa
1
<210>23
<211>16
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>肽
<400>23
Asp Arg Tyr Ile Pro Phe His Leu Leu Val Ala Pro Tyr Ser Pro Ala
1 5 10 15
<210>24
<211>37
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>24
aactgcagcg ccagcctcga ggaggattac tgcagaa 37
<210>25
<211>37
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>25
ttctgcagta atcctcctcg aggctggcgc tgcagtt 37
<210>26
<211>37
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>26
aactgcaggg aggcttacgc cagcctcgac tgcagaa 37
<210>27
<211>37
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>27
ttctgcagtc gaggctggcg taagcctccc tgcagtt 37
<210>28
<211>37
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>28
aactgcagcg ccagcctcga gagggccgtc tgcagaa 37
<210>29
<211>37
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>29
ttctgcagac ggccctctcg aggctggcgc tgcagtt 37
<210>30
<211>37
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>30
aactgcagcg ccagcctcga gtcggccgtc tgcagaa 37
<210>31
<211>37
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>31
ttctgcagac ggccgactcg aggctggcgc tgcagtt 37
<210>32
<211>37
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>32
aactgcagcg ccagcctcga gcacgtcgtc tgcagaa 37
<210>33
<211>37
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>33
ttctgcagac gacgtgctcg aggctggcgc tgcagtt 37
<210>34
<211>1698
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>多核苷酸
<400>34
atggccgaag aagctttcga cctctggaac gaatgcgcca aagcctgcgt gctcgacctc 60
aaggacggcg tgcgttccag ccgcatgagc gtcgacccgg ccatcgccga caccaacggc 120
cagggcgtgc tgcactactc catggtcctg gagggcggca acgacgcgct caagctggcc 180
atcgacaacg ccctcagcat caccagcgac ggcctgacca tccgcctcga aggcggcgtc 240
gagccgaaca agccggtgcg ctacagctac acgcgccagg cgcgcggcag ttggtcgctg 300
aactggctgg taccgatcgg ccacgagaag ccctcgaaca tcaaggtgtt catccacgaa 360
ctgaacgccg gcaaccagct cagccacatg tcgccgatct acaccatcga gatgggcgac 420
gagttgctgg cgaagctggc gcgcgatgcc accttcttcg tcagggcgca cgagagcaac 480
gagatgcagc cgacgctcgc catcagccat gccggggtca gcgtggtcat ggcccagacc 540
cagccgcgcc gggaaaagcg ctggagcgaa tgggccagcg gcaaggtgtt gtgcctgctc 600
gacccgctgg acggggtcta caactacctc gcccagcaac gctgcaacct cgacgatacc 660
tgggaaggca agatctaccg ggtgctcgcc ggcaacccgg cgaagcatga cctggacatc 720
aaacccacgg tcatcagtca tcgcctgcac tttcccgagg gcggcagcct ggccgcgctg 780
accgcgcacc aggcttgcca cctgccgctg gagactttca cccgtcatcg ccagccgcgc 840
ggctgggaac aactcgagca gtgcggctat ccggtgcagc ggctggtcgc cctctacctg 900
gcggcgcggc tgtcgtggaa ccaggtcgac caggtgatcc gcaacgccct ggccagcccc 960
ggcagcggcg gcgacctggg cgaagcgatc cgcgagcagc cggagcaggc ccgtctggcc 1020
ctgaccctgg ccgccgccga gagcgagcgc ttcgtccggc agggcaccgg caacgacgag 1080
gccggcgcgg caaacctgca gggaggatta cgccagcctc gattcccgac catcccgctg 1140
tcccgtctgt tcgacaacgc tatgctgcgt gctcaccgtc tgcaccagct ggctttcgac 1200
acctaccagg agttcgaaga agcatacatc ccgaaagaac agaaatactc cttcctgcaa 1260
aacccgcaga cctccctgtg cttctccgaa tcgatcccga ccccgtccaa ccgtgaagaa 1320
acccagcaga aatccaacct ggagctcctg cgtatctccc tgctgctgat ccagtcctgg 1380
ctcgagccgg ttcagttcct gcgttccgtt ttcgctaact ccctggttta cggtgctagc 1440
gactccaacg tttacgacct gctgaaagac ctggaagaag gtatccagac cctgatgggt 1500
cgtctggaag acggttcccc gcgtaccggt cagatcttca aacagaccta ctccaaattc 1560
gacaccaact cccacaacga cgacgctctg ctgaaaaact acggtctgct gtactgcttc 1620
cgtaaagaca tggacaaagt tgaaaccttc ctgcgtatcg ttcagtgccg ttccgttgaa 1680
ggttcctgcg gtttctaa 1698
<210>35
<211>565
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>多肽
<400>35
Met Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys
1 5 10 15
Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp
20 25 30
Pro Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met
35 40 45
Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala
50 55 60
Leu Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val
65 70 75 80
Glu Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly
85 90 95
Ser Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser
100 105 110
Asn Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser
115 120 125
His Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala
130 135 140
Lys Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn
145 150 155 160
Glu Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val Val
165 170 175
Met Ala Gln Thr Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala
180 185 190
Ser Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn
195 200 205
Tyr Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys
210 215 220
Ile Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile
225 230 235 240
Lys Pro Thr Val Ile Ser His Arg Leu His Phe Pro Glu Gly Gly Ser
245 250 255
Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr
260 265 270
Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys
275 280 285
Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu ValAla Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu
290 295 300
Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro
305 310 315 320
Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln
325 330 335
Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val
340 345 350
Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Leu Gln Gly
355 360 365
Gly Leu Arg Gln Pro Arg Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe
370 375 380
Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp
385 390 395 400
Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr
405 410 415
Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile
420 425 430
Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu
435 440 445
Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val
450 455 460
Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser
465 470 475 480
Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln
485 490 495
Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile
500 505 510
Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp
515 520 525
Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met
530 535 540
Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu
545 550 555 560
Gly Ser Cys Gly Phe
565
<210>36
<211>1620
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>多核苷酸
<400> 36
atggccgaag aagctttcga cctctggaac gaatgcgcca aagcctgcgt gctcgacctc 60
aaggacggcg tgcgttccag ccgcatgagc gtcgacccgg ccatcgccga caccaacggc 120
cagggcgtgc tgcactactc catggtcctg gagggcggca acgacgcgct caagctggcc 180
atcgacaacg ccctcagcat caccagcgac ggcctgacca tccgcctcga aggcggcgtc 240
gagccgaaca agccggtgcg ctacagctac acgcgccagg cgcgcggcag ttggtcgctg 300
aactggctgg taccgatcgg ccacgagaag ccctcgaaca tcaaggtgtt catccacgaa 360
ctgaacgccg gcaaccagct cagccacatg tcgccgatct acaccatcga gatgggcgac 420
gagttgctgg cgaagctggc gcgcgatgcc accttcttcg tcagggcgca cgagagcaac 480
gagatgcagc cgacgctcgc catcagccat gccggggtca gcgtggtcat ggcccagacc 540
cagccgcgcc gggaaaagcg ctggagcgaa tgggccagcg gcaaggtgtt gtgcctgctc 600
gacccgctgg acggggtcta caactacctc gcccagcaac gctgcaacct cgacgatacc 660
tgggaaggca agatctaccg ggtgctcgcc ggcaacccgg cgaagcatga cctggacatc 720
aaacccacgg tcatcagtca tcgcctgcac tttcccgagg gcggcagcct ggccgcgctg 780
accgcgcacc aggcttgcca cctgccgctg gagactttca cccgtcatcg ccagccgcgc 840
ggctgggaac aactcgagca gtgcggctat ccggtgcagc ggctggtcgc cctctacctg 900
gcggcgcggc tgtcgtggaa ccaggtcgac caggtgatcc gcaacgccct ggccagcccc 960
ggcagcggcg gcgacctggg cgaagcgatc cgcgagcagc cggagcaggc ccgtctggcc 1020
ctgaccctgg ccgccgccga gagcgagcgc ttcgtccggc agggcaccgg caacgacgag 1080
gccggcgcgg caaacctgca gggaggctta cgccagcctc gatgcgatct gcctcagacc 1140
cacagcctgg gcagcaggag gaccctgatg ctgctggctc agatgaggag aatcagcctg 1200
tttagctgcc tgaaggatag gcacgatttt ggctttcctc aagaggagtt tggcaaccag 1260
tttcagaagg ctgagaccat ccctgtgctg cacgagatga tccagcagat ctttaacctg 1320
tttagcacca aggatagcag cgctgcttgg gatgagaccc tgctggataa gttttacacc 1380
gagctgtacc agcagctgaa cgatctggag gcttgcgtga tccagggcgt gggcgtgacc 1440
gagacccctc tgatgaagga ggatagcatc ctggctgtga ggaagtactt tcagaggatc 1500
accctgtacc tgaaggagaa gaagtacagc ccctgcgctt gggaagtcgt gagggctgag 1560
atcatgagga gctttagcct gagcaccaac ctgcaagaga gcttgaggtc taaggagtaa 1620
<210>37
<211>539
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>多肽
<400>37
Met Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys
1 5 10 15
Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp
20 25 30
Pro Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met
35 40 45
Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala
50 55 60
Leu Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val
65 70 75 80
Glu Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly
85 90 95
Ser Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser
100 105 110
Asn Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser
115 120 125
His Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala
130 135 140
Lys Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn
145 150 155 160
Glu Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val Val
165 170 175
Met Ala Gln Thr Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala
180 185 190
Ser Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn
195 200 205
Tyr Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys
210 215 220
Ile Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile
225 230 235 240
Lys Pro Thr Val Ile Ser His Arg Leu His Phe Pro Glu Gly Gly Ser
245 250 255
Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr
260 265 270
Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys
275 280 285
Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu
290 295 300
Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro
305 310 315 320
Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln
325 330 335
Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val
340 345 350
Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Leu Gln Gly
355 360 365
Gly Leu Arg Gln Pro Arg Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly
370 375 380
Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu
385 390 395 400
Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu
405 410 415
Phe Gly Ash Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu
420 425 430
Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala
435 440 445
Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln
450 455 460
Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr
465 470 475 480
Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr
485 490 495
Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys
500 505 510
Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser
515 520 525
Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu
530 535
<210>38
<211>460
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>多肽
<400>38
Met Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys
1 5 10 15
Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp
20 25 30
Pro Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met
35 40 45
Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala
50 55 60
Leu Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val
65 70 75 80
Glu Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly
85 90 95
Ser Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser
100 105 110
Asn Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser
115 120 125
His Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala
130 135 140
Lys Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn
145 150 155 160
Glu Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val Val
165 170 175
Met Ala Gln Thr Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala
180 185 190
Ser Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn
195 200 205
Tyr Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys
210 215 220
Ile Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile
225 230 235 240
Lys Pro Thr Val Ile Ser His Arg Leu His Phe Pro Glu Gly Gly Ser
245 250 255
Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr
260 265 270
Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys
275 280 285
Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu
290 295 300
Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro
305 310 315 320
Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln
325 330 335
Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val
340 345 350
Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Leu Gln Gly
355 360 365
Gly Leu Arg Gln Pro Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His
370 375 380
Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
385 390 395 400
Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val
405 410 415
Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu
420 425 430
Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser
435 440 445
Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
450 455 460
<210>39
<211>404
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>多肽
<400>39
Met Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys
1 5 10 15
Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp
20 25 30
Pro Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met
35 40 45
Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala
50 55 60
Leu Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val
65 70 75 80
Glu Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly
85 90 95
Ser Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser
100 105 110
Asn Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser
115 120 125
His Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala
130 135 140
Lys Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn
145 150 155 160
Glu Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val Val
165 170 175
Met Ala Gln Thr Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala
180 185 190
Ser Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn
195 200 205
Tyr Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys
210 215 220
Ile Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile
225 230 235 240
Lys Pro Thr Val Ile Ser His Arg Leu His Phe Pro Glu Gly Gly Ser
245 250 255
Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr
260 265 270
Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys
275 280 285
Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu
290 295 300
Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro
305 310 315 320
Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
385 390 395 400
Thr Pro Lys Thr
<210>40
<211>21
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>多肽
<400>40
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
Claims (68)
1、输送结构，其包含：
a)受体结合区，
b)穿胞运输区域，
c)向个体输送的大分子，以及
d)可裂解的连接子，
其中，所述可裂解的连接子处的裂解将所述大分子从所述结构的其它部分上分离，且其中所述可裂解的连接子被这样的酶裂解：i)该酶在所述个体的极化上皮细胞的底侧膜处的活性大于极化上皮细胞的顶侧膜处的活性，或ii)该酶在所述个体的血浆中的活性大于在该个体的极化上皮细胞的顶侧膜处的活性。
2、权利要求1所述的输送结构，其还包含第二可裂解的连接子。
3、权利要求1所述的输送结构，其中所述可裂解的连接子包含选自以下的氨基酸序列：Ala-Ala-Pro-Phe(SEQ ID NO.：4)、Gly-Gly-Phe(SEQ IDNO.：5)、Ala-Ala-Pro-Val(SEQ ID NO.：6)、Gly-Gly-Leu(SEQ ID NO.：7)、Ala-Ala-Leu(SEQ ID NO.：8)、Phe-Val-Arg(SEQ ID NO.：9)、Val-Gly-Arg(SEQ ID NO.：10)。
4、权利要求1所述的输送结构，其中存在于极化上皮细胞的底侧膜处的所述酶选自组织蛋白酶GI、糜蛋白酶I、弹性蛋白酶I、枯草杆菌蛋白酶AI、枯草杆菌蛋白酶AII、凝血酶I和尿激酶I。
5、权利要求1所述的输送结构，其中所述受体结合区选自以下的受体结合区：假单胞菌外毒素A、霍乱毒素、肉毒杆菌毒素、白喉毒素、志贺毒素或类志贺毒素，单克隆抗体，多克隆抗体，单链抗体，TGFα，EGF，IGF-I，IGF-II，IGF-III，IL-1，IL-2，IL-3，IL-6，MIP-1a，MIP-1b，MCAF和IL-8。
6、权利要求1所述的输送结构，其中所述受体结合区与细胞表面受体结合，该细胞表面受体选自：α2-巨球蛋白受体、表皮生长因子受体、转铁蛋白受体、趋化因子受体、CD25、CD11B、CD11C、CD80、CD86、TNFα受体、TOLL受体、M-CSF受体、GM-CSF受体、清道夫受体和VEGF受体。
7、权利要求5所述的输送结构，其中所述假单胞菌外毒素A的受体结合区是假单胞菌外毒素A的区域Ia。
8、权利要求7所述的输送结构，其中所述假单胞菌外毒素A的受体结合区具有氨基酸序列SEQ ID NO.：1。
9、权利要求1所述的输送结构，其中所述穿胞运输区域选自假单胞菌外毒素A、肉毒杆菌毒素、白喉毒素、百日咳毒素、霍乱毒素、热敏性大肠杆菌肠毒素、志贺毒素或类志贺毒素的穿胞运输区域。
10、权利要求9所述的输送结构，其中所述穿胞运输区域为假单胞菌外毒素A的穿胞运输区域。
11、权利要求10所述的输送结构，其中所述假单胞菌外毒素A的穿胞运输区域具有氨基酸序列SEQ ID NO.：2。
12、权利要求1所述的输送结构，其中所述大分子选自核酸、肽、多肽、蛋白质和脂类。
13、权利要求12所述的输送结构，其中所述多肽选自多肽激素、细胞因子、趋化因子、生长因子和凝结因子。
14、权利要求13所述的输送结构，其中所述多肽选自IGF-I、IGF-II、IGF-III、EGF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8、IL-12、EPO、生长激素、因子VII、抗利尿激素、降血钙素、甲状旁腺激素、黄体激素释放因子、组织血浆纤维蛋白溶酶原活化因子、胰岛素原、胰岛素、糖皮质激素、胰淀素(amylin)、促肾上腺皮质激素、脑啡肽和胰高血糖素样肽1。
15、权利要求14所述的输送结构，其中所述多肽是人生长激素。
16、权利要求12所述的输送结构，其中所述蛋白质是人胰岛素。
17、权利要求12所述的输送结构，其中所述蛋白质是人体IFN-α。
18、权利要求12所述的输送结构，其中所述蛋白质是人体IFN-α2b。
19、权利要求12所述的输送结构，其中所述蛋白质是人胰岛素原。
20、权利要求12所述的输送结构，其包含：第二大分子，该第二大分子选自核酸、肽、多肽、蛋白质、脂类或小的有机分子；第二可裂解的连接子，其中在所述第二可裂解的连接子处的裂解将所述第二大分子从所述结构的其它部分上分离。
21、权利要求17所述的输送结构，其中所述大分子是第一多肽，所述第二大分子是第二多肽。
22、权利要求21所述的输送结构，其中所述第一多肽和所述第二多肽结合形成多聚物。
23、权利要求22所述的输送结构，其中所述多聚物为二聚物、四聚物和八聚物。
24、权利要求23所述的输送结构，其中所述二聚物为抗体。
25、编码输送结构的多核苷酸，所述输送结构包含：
a)受体结合区，
b)穿胞运输区域，
c)向个体输送的大分子，以及
d)可裂解的连接子，
其中，所述可裂解的连接子处的裂解将所述大分子从所述结构的其它部分上分离，且其中所述可裂解的连接子被这样的酶裂解：i)该酶在所述个体的极化上皮细胞的底侧膜处的活性大于在该极化上皮细胞的顶侧膜处的活性，或ii)该酶在所述个体的血浆中的活性大于在该个体的极化上皮细胞的顶侧膜处的活性。
26、在严格杂交条件下与权利要求25所述的多核苷酸杂交的多核苷酸。
27、权利要求25所述的多核苷酸，其中所述输送结构还包含第二可裂解的连接子。
28、权利要求25所述的多核苷酸，其中所述可裂解的连接子包含选自以下的氨基酸序列：Ala-Ala-Pro-Phe(SEQ ID NO.：4)、Gly-Gly-Phe(SEQ IDNO.：5)、Ala-Ala-Pro-Val(SEQ ID NO.：6)、Gly-Gly-Leu(SEQ ID NO.：7)、Ala-Ala-Leu(SEQ ID NO.：8)、Phe-Val-Arg(SEQ ID NO.：9)、Val-Gly-Arg(SEQ ID NO.：10)。
29、权利要求25所述的多核苷酸，其中存在于极化上皮细胞的底侧膜处的所述酶选自组织蛋白酶GI、糜蛋白酶I、弹性蛋白酶I、枯草杆菌蛋白酶AI、枯草杆菌蛋白酶AII、凝血酶I和尿激酶I。
30、权利要求25所述的多核苷酸，其中所述受体结合区选自以下的受体结合区：假单胞菌外毒素A、霍乱毒素、肉毒杆菌毒素、白喉毒素、志贺毒素或类志贺毒素，单克隆抗体，多克隆抗体，单链抗体，TGFα，EGF，IGF-I，IGF-II，IGF-III，IL-1，IL-2，IL-3，IL-6，MIP-1a，MIP-1b，MCAF和IL-8。
31、权利要求25所述的多核苷酸，其中所述受体结合区与细胞表面受体结合，该细胞表面受体选自：α2-巨球蛋白受体、EGFR、IGFR、转铁蛋白受体、趋化因子受体、CD25、CD11B、CD11C、CD80、CD86、TNFα受体、TOLL受体、M-CSF受体、GM-CSF受体、清道夫受体和VEGF受体。
32、权利要求30所述的多核苷酸，其中所述假单胞菌外毒素A的受体结合区是假单胞菌外毒素A的区域Ia。
33、权利要求31所述的多核苷酸，其中所述假单胞菌外毒素A的受体结合区具有氨基酸序列SEQ ID NO.：1。
34、权利要求25所述的多核苷酸，其中所述穿胞运输区域选自假单胞菌外毒素A、肉毒杆菌毒素、白喉毒素、百日咳毒素、霍乱毒素、热敏性大肠杆菌肠毒素、志贺毒素或类志贺毒素的穿胞运输区域。
35、权利要求34所述的多核苷酸，其中所述穿胞运输区域为假单胞菌外毒素A的穿胞运输区域。
36、权利要求35所述的多核苷酸，其中所述假单胞菌外毒素A的穿胞运输区域具有氨基酸序列SEQ ID NO.：2。
37、权利要求25所述的多核苷酸，其中所述大分子选自肽、多肽和蛋白质。
38、权利要求37所述的多核苷酸，其中所述多肽选自多肽激素、细胞因子、趋化因子、生长因子和凝结因子。
39、权利要求38所述的多核苷酸，其中所述多肽选自IGF-I、IGF-II、IGF-III、EGF、IFN-α、IFN-α，2b、IFN-β、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8、IL-12、EPO、生长激素、因子VII、抗利尿激素、降血钙素、甲状旁腺激素、黄体激素释放因子、组织血浆纤维蛋白溶酶原活化剂、胰岛素原、胰岛素、糖皮质激素、胰淀素(amylin)、促肾上腺皮质激素、脑啡肽和胰高血糖素样肽1。
40、权利要求39所述的多核苷酸，其中所述多肽是人生长激素。
41、权利要求39所述的多核苷酸，其中所述蛋白质是人胰岛素。
42、编码输送结构的多核苷酸，所述多核苷酸包含：
a)编码受体结合区的核酸序列，
b)编码穿胞运输区域的核酸序列，
c)编码可裂解的连接子的核酸序列，以及
d)含有多连接子插入位点的核酸序列，
其中，所述可裂解的连接子处的裂解将所述大分子从所述结构的其它部分上分离，且其中所述可裂解的连接子被这样的酶裂解：i)该酶在所述个体的极化上皮细胞的底侧膜处的活性大于在该极化上皮细胞的顶侧膜处的活性，或ii)该酶在所述个体的血浆中的活性大于在该个体的极化上皮细胞的顶侧膜处的活性。
43、含有权利要求25所述的多核苷酸的表达载体。
44、含有权利要求43所述的表达载体的细胞。
45、含有输送结构的组合物，所述输送结构包含：
a)受体结合区，
b)穿胞运输区域，
c)向个体输送的大分子，以及
d)可裂解的连接子，
其中，所述可裂解的连接子处的裂解将所述大分子从所述结构的其它部分上分离，且其中所述可裂解的连接子被这样的酶裂解：i)该酶在所述个体的极化上皮细胞的底侧膜处的活性大于在该极化上皮细胞的顶侧膜处的活性，或ii)该酶在所述个体的血浆中的活性大于在该个体的极化上皮细胞的顶侧膜处的活性。
46、权利要求45所述的组合物，其中所述组合物还包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载体。
47、权利要求45所述的组合物，其中所述组合物被配制成鼻内或口腔施用。
48、向个体输送大分子的方法，该方法包括：将该个体的极化上皮细胞的顶侧表面与输送结构接触，其中所述的输送结构包含受体结合区、穿胞运输区域、可裂解的连接子和所述大分子，其中所述穿胞运输区域将该大分子穿胞运输到所述上皮细胞的底侧膜处并穿过该底侧膜，其中所述可裂解的连接子处的裂解将该大分子从所述结构的其它部分上分离，且其中所述可裂解的连接子被这样的酶裂解：i)该酶在所述个体的极化上皮细胞的底侧膜处的活性大于在该极化上皮细胞的顶侧膜处的活性，或ii)该酶在所述个体的血浆中的活性大于在该个体的极化上皮细胞的顶侧膜处的活性，且其中该可裂解的连接子处的裂解将该大分子从该输送结构的其它部分上分离，从而将该大分子输送到个体。
49、权利要求48所述的方法，其中所述受体结合区选自以下的受体结合区：假单胞菌外毒素A、霍乱毒素、白喉毒素、志贺毒素或类志贺毒素，单克隆抗体，多克隆抗体，单链抗体，TGFα，EGF，IGF-I，IGF-II，IGF-III，IL-1，IL-2，IL-3，IL-6，MIP-1a，MIP-1b，MCAF和IL-8。
50、权利要求48所述的方法，其中所述受体结合区与细胞表面受体结合，该细胞表面受体选自：α2-巨球蛋白受体、EGFR、IGFR、转铁蛋白受体、趋化因子受体、CD25、CD11B、CD11C、CD80、CD86、TNFα受体、TOLL受体、M-CSF受体、GM-CSF受体、清道夫受体和VEGF受体。
51、权利要求48所述的方法，其中所述穿胞运输区域选自假单胞菌外毒素A、肉毒杆菌毒素、白喉毒素、百日咳毒素、霍乱毒素、热敏性大肠杆菌肠毒素、志贺毒素或类志贺毒素的穿胞运输区域。
52、权利要求48所述的方法，其中所述大分子选自肽、多肽、蛋白质、核酸和脂类。
53、权利要求48所述的方法，其中存在于极化上皮细胞的底侧膜处的所述酶选自组织蛋白酶GI、糜蛋白酶I、弹性蛋白酶I、枯草杆菌蛋白酶AI、枯草杆菌蛋白酶AII、凝血酶I和尿激酶I。
54、权利要求48所述的方法，其中所述可裂解的连接子包含选自以下的氨基酸序列：Ala-Ala-Pro-Phe(SEQ ID NO.：4)、Gly-Gly-Phe(SEQ ID NO.：5)、Ala-Ala-Pro-Val(SEQ ID NO.：6)、Gly-Gly-Leu(SEQ ID NO.：7)、Ala-Ala-Leu(SEQ ID NO.：8)、Phe-Val-Arg(SEQ ID NO.：9)、Val-Gly-Arg(SEQ ID NO.：10)。
55、权利要求48所述的方法，其中所述上皮细胞选自鼻腔上皮细胞、口腔上皮细胞、肠道上皮细胞、直肠上皮细胞、阴道上皮细胞和肺部上皮细胞。
56、权利要求48所述的方法，其中所述哺乳动物为人。
57、权利要求48所述的方法，其中所述输送结构与所述上皮细胞的顶侧膜接触。
58、向个体的血流中输送大分子的方法，该方法包括将权利要求1所述的输送结构与该个体的极化上皮细胞的顶侧表面接触，从而使该大分子被输送到个体的血流中，其中，在该个体的血清中诱导的抗该大分子抗体的滴度相对于通过皮下向个体施用与所述输送结构的其它部分分离的该大分子要低。
59、权利要求58所述的方法，其中所述大分子选自核酸、肽、多肽、蛋白质和脂类。
60、权利要求58所述的方法，其中所述大分子选自多肽选自多肽激素、细胞因子、趋化因子、生长因子和凝结因子。
61、权利要求58所述的方法，其中所述大分子选自IGF-I、IGF-II、IGF-III、EGF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8、IL-12、EPO、生长激素、因子VII、抗利尿激素、降血钙素、甲状旁腺激素、黄体生成激素释放因子、组织血浆酶原活化剂、胰岛素原、胰岛素、糖皮质激素、胰淀素(amylin)、促肾上腺皮质激素、脑啡肽和胰增血糖素样肽1。
62、权利要求58所述的方法，其中所述大分子为人生长激素。
63、权利要求58所述的方法，其中所述大分子为人胰岛素。
64、权利要求58所述的方法，其中所述个体为小鼠、狗、山羊或人。
65、权利要求58所述的方法，其中所述与输送结构一起输送的大分子在所述个体的血清中诱导产生的抗该大分子抗体的滴度比通过皮下向该个体施用与输送结构的其它部分分离的该大分子所诱导产生的抗体的滴度低约75％。
66、权利要求58所述的方法，其中所述与输送结构一起输送的大分子在所述个体的血清中诱导产生的抗该大分子抗体的滴度比通过皮下向该个体施用与输送结构的其它部分分离的该大分子所诱导产生的抗体的滴度低约50％。
67、权利要求58所述的方法，其中所述与输送结构一起输送的大分子在所述个体的血清中诱导产生的抗该大分子抗体的滴度比通过皮下向该个体施用与输送结构的其它部分分离的该大分子所诱导产生的抗体的滴度低约25％。
68、权利要求58所述的方法，其中所述与输送结构一起输送的大分子在所述个体的血清中诱导产生的抗该大分子抗体的滴度比通过皮下向该个体施用与输送结构的其它部分分离的该大分子所诱导产生的抗体的滴度低约10％。
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