JP2019505511A - 悪性疾患、自己免疫疾患および炎症性疾患を処置するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

被験体においてＴ細胞疲弊に関与する悪性疾患を処置する方法であって、但し、前述の悪性疾患がＢ細胞悪性腫瘍ではないことを条件とする、方法を開示する。本方法は、治療有効量のＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤を前述の被験体に投与し、それにより、前述のＴ細胞疲弊に関与する悪性疾患を処置する、投与する工程を含む。被験体において自己免疫疾患または炎症性疾患を処置する方法であって、治療有効量のＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤を被験体に投与する工程を含む、方法も開示する。治療有効量のＳＬＡＭＦ１の活性または発現を減少させることができる薬剤を被験体に投与する工程を含む方法であって、但し、前述の薬剤がＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤ではないことを条件とする、方法も開示する。

Description

発明の分野および背景
本発明は、そのいくつかの実施形態では、悪性疾患、自己免疫疾患および炎症性疾患を処置するための、Ｔ細胞疲弊を防止または逆行させ、且つＢ制御性細胞の活性またはレベルを増強するための組成物および方法に関する。

Ｂ細胞悪性腫瘍のタイプが異なれば、関与するＢ細胞分化段階も異なる。例えば、多発性骨髄腫は、悪性形質細胞に原因する疾患であり、一方、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）は、リンパ系前駆細胞から生じる悪性腫瘍であり、バーキットリンパ腫は、胚中心Ｂ細胞を起源とする。

慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）は、西洋で最も一般的な白血病である。この疾患は、末梢血、リンパ系器官、および骨髄内のＢリンパ球の進行性蓄積によって特徴づけられる。この疾患の主な徴候は、免疫調節異常である。ＣＬＬ細胞は、免疫グロブリン分泌細胞にさらに成熟する能力を有意に損なった小型の成熟リンパ球である。Ｂ細胞受容体を保有し、且つＭＨＣＩＩ分子を発現するにもかかわらず、ＣＬＬ細胞は非常に能力の低い抗原提示細胞である。顕著に認められる本疾患の特徴は、アポトーシスの低下であり、それにより、悪性細胞が蓄積する。ｉｎ−ｖｉｖｏでは、ＣＬＬ細胞は、増殖および生存がその微小環境に依存する。

骨髄（ＢＭ）間質は、Ｂリンパ球生成で不可欠な役割を果たし、正常Ｂ細胞および成熟白血病Ｂ細胞の両方に生存適所を提供することができる。ＣＬＬ細胞のＢＭ間質細胞またはＢＭ脈管構造への接着により、これらのリンパ球をアポトーシスから救い出し、その寿命を延ばす。ＣＬＬについて、集合的にＣＬＬ微小環境と呼ばれる、組織内に作出された複雑な細胞および分子の構成は、ＣＬＬクローン拡大のためのシグナルを提供し、一次薬物耐性を生じ得る。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ研究では、ＣＬＬ細胞がその周囲の環境の変化（例えば、炎症性サイトカイン環境、Ｔ細胞の疲弊表現型、または免疫抑制活性を有する骨髄性細胞の分化）を誘導することが示された。これらの相互作用は、細胞間接着に依存するものや、ケモカイン、成長因子によって、おそらく、細胞外基質の構成要素によって媒介されるものもある。

ＳＬＡＭファミリー受容体は、図１に示したＳＬＡＭＦ１（ＣＤ１５０）、ＳＬＡＭＦ２（ＣＤ４８）、ＳＬＡＭＦ３（ＬＹ９）、ＳＬＡＭＦ４（２Ｂ４）、ＳＬＡＭＦ５（ＣＤ８４）、ＳＬＡＭＦ６（Ｌｙ１０８／ＮＴＢＡ）、ＳＬＡＭＦ７（ＣＲＡＣＣ）、ＳＬＡＭＦ８（ＢＬＡＭＥ）、およびＳＬＡＭＦ９（ＣＤ８４Ｈ）からなる。これらの受容体は、コンセンサス配列ＴｘＹｘｘＩ／Ｖを有する免疫受容体チロシン依存性スイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む。コンセンサス配列は、ＳＬＡＭ関連タンパク質（ＳＡＰ）および／またはユーイング肉腫関連転写物２（ＥＡＴ−２）（Ｂ細胞およびマクロファージ中）に対する親和性が高い。ファミリーのうちの２つのメンバー（ＳＬＡＭＦ８およびＳＬＡＭＦ９）は、チロシンモチーフを持たない短鎖細胞内テールを有する。受容体はリガンドを持たず、ほとんどの場合、同種親和性相互作用は、その細胞誘導性カスケードを制御する。ＳＬＡＭファミリー受容体は、Ｂ細胞の発生中の発現が異なる。

ＣＤ８４（ＳＬＡＭ受容体ファミリーのメンバー）は、種々の細胞（ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、血小板、樹状細胞、好酸球、および好中球が含まれる）上に発現される。ＣＤ８４のレベルは、ＣＬＬ患者において上方制御されることが見出されており、ＣＤ８４の活性化は、生存カスケードを誘導し、抗アポトーシス遺伝子Ｂｃｌ−２およびＭｃｌ−１を上昇させることが示されている（非特許文献１）。以前の結果は、ＣＬＬ上に発現されたＣＤ８４およびＣＬＬの微小環境が抗アポトーシス効果を生じる相互作用を媒介し、ＣＬＬの生存を支援することを示している（非特許文献２）。細胞間接触を媒介するＣＤ８４により、ＣＬＬ細胞からのＣＣＬ３の発現および分泌が上昇する。ＣＣＬ３、ＣＣＲ１、およびＣＣＲ５の受容体を高発現する間質細胞は、分泌されたケモカインに結合する。ＣＣＬ３は間質細胞内でのＢｃｌ−２発現の上方制御を誘導し、ＣＬＬを生存させる。さらに、ＣＬＬ３誘導性カスケードにより、ＣＬＬ生存を支持することが公知のサイトカインＩＬ−６およびＩＬ−８（マウスにおけるＫＣ）が分泌される（非特許文献３）。さらに、微小環境におけるＣＤ８４発現は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＣＬＬ病理発生を制御する。微小環境内の細胞上に発現されるＣＤ８４の欠如により、発症が遅延し、ＢＭ区画内にＣＬＬ細胞が蓄積される（非特許文献２）。

ＳＬＡＭＦ１（ＣＤ１５０とも呼ばれる）は、造血幹細胞、Ｂ細胞、活性化Ｔ細胞、血小板、およびマクロファージ上に発現する。ＳＬＡＭＦ１は、その細胞外領域の２０２アミノ酸、２２アミノ酸長の疎水性膜貫通領域、および７７アミノ酸の細胞質領域を有する。ＳＬＡＭＦ１には少なくとも２つのイソ型が存在し、一方は細胞表面上に発現し、他方は分泌型であり、且つ膜貫通領域を欠く。ＳＬＡＭＦ１は、分泌型またはトランスフェクトされたＳＬＡＭＦ１をヒトＢ細胞に添加すると、これらの細胞の成長および分化が上方制御されることが以前に見出されている。ＳＬＡＭＦ１は、自己免疫で役割を果たすことが以前に示されている。ＳＬＡＭＦ１の発現は、健康なコントロールと比較して多発性硬化症患者由来のＴ細胞上で増加し、自己免疫において役割を果たすことが示唆されている。
ＳＬＡＭＦ１はまた、腫瘍で役割を果たすことが以前に示されている。ホジキンリンパ腫細胞株上のＳＬＡＭＦ１受容体へのライゲーションにより、ＡＫＴは細胞質から核へ移行する。このＡＫＴ経路は細胞生存を促進することが公知である（非特許文献４）。ＣＬＬでは、ＳＬＡＭＦ１が過剰発現することにより、正常なＢ細胞と比較して、ＣＬＬ細胞においてＳＬＡＭＦ１を介したシグナル伝達調節の異常が示唆された（非特許文献５）。多発性骨髄腫患者では、健康なコントロールと比較して、ＳＬＡＭＦ１がＲＮＡ発現に関して多発性骨髄腫細胞において高発現する遺伝子であることが見出された。ＳＬＡＭＦ１の別の興味深い特徴は、中枢神経系の腫瘍上ならびに子宮頸部、食道、直腸、および口腔の癌腫内ならびに皮膚基底細胞癌内で発現することであり、これらの腫瘍に対応する正常組織ではこの受容体を発現しない。

プログラム細胞死１（ＰＤ−１）およびプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）は、免疫応答の制御に関与することが示された細胞表面分子である。ＰＤ−Ｌ１は、ＰＤ１受容体のリガンドである。ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、樹状細胞（ＤＣ）、上皮細胞、内皮細胞、およびマクロファージ上に発現する。ＰＤ−Ｌ１は、２９０アミノ酸からなり、膜貫通ドメインおよび短鎖細胞内ドメインを有する。機能的に、ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞上のＰＤ−１に結合する場合、Ｔ細胞の免疫コインヒビターとして記載されている（図２を参照のこと）。膜結合ＰＤ−１は、２８８アミノ酸からなるタンパク質である。その構造は、免疫グロブリンドメインを有する膜貫通部分ならびにＩＴＩＭおよびＩＴＳＭを有する細胞内部分からなる。ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１誘導性経路は、Ｔ細胞疲弊の制御において中心的役割を果たす。疲弊したＴ細胞は、ＰＤ−１、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、リンパ球活性化遺伝子３（Ｌａｇ−３）、Ｔｉｍ−３、２Ｂ４、およびＣＤ１６０などを過剰発現することが示されている。

ＰＤ−１はＣＬＬ細胞上で上方制御されることが以前に示されている（非特許文献６）。Ｅμ−ＴＣＬ１ ＣＬＬモデルマウスにおいてＣＤ８^＋Ｔ細胞上でＰＤ−１が過剰発現することが記載されていた。ＩＦＮγおよびＣＤ１０７の両方がＣＤ８^＋Ｔ細胞上で低下するという点で、これらの細胞のエフェクター機能は影響を受けていた。抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＰＤ−１抗体を使用した臨床試験が、以下の免疫学的癌において試みられている；進行期ＣＬＬ、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、再発性ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、および急性骨髄球性白血病（非特許文献７）。固形腫瘍（例えば、黒色腫、非小細胞肺癌、および進行性腎細胞癌）を用いた抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＰＤ−１抗体についての臨床試験も行われている（非特許文献７）。ＣＬＬ動物モデル（Ｅμ−ＴＣＬ１マウスモデル）における抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置も試みられている。それにより、脾臓におけるＴ細胞機能の増加（ＰＤ−１、Ｌａｇ−３、ＫＬＲＧ−１、および２Ｂ４（全て疲弊マーカーとして記載されている）の発現の低下によって示された）、これらのＴ細胞の機能性の増加（ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＦＮγの増加によって示された）、およびＣＤ８Ｔ細胞上のＣＤ１０７（エフェクター細胞の細胞傷害性マーカー）の増加という結果が得られた（非特許文献８）。

Ｌａｇ−３は、活性化されたＴ細胞およびＮＫ細胞上に見出される。Ｌａｇ−３は、ＭＨＣ−ＩＩに結合し（図２を参照のこと）、ＣＤ４^＋Ｔ細胞増殖を阻害し、Ｔ細胞におけるＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、およびＴＮＦα産生を低下させることが示されている。現在、黒色腫、腎細胞癌、乳癌、および膵臓癌についてのＬａｇ３に対する抗体の効果が臨床試験されており、乳癌および腎癌においてはいくらか奏効を示し、残りの癌は依然として進行中である（非特許文献９）。黒色腫、結腸腺癌、および線維肉腫の細胞株を注射した癌マウスモデルにおいて、ＰＤ−１およびＬａｇ−３の組み合わせによる遮断効果が示されている。腺癌および線維肉腫を注射したマウスにおける併用処置は、抗ＰＤ−１または抗Ｌａｇ−３のみでの処置と比較して有効であった（非特許文献１０）。

ＣＴＬＡ−４は膜貫通タンパク質である。ＣＴＬＡ−４は、活性化Ｔ細胞で強く誘導される。そのリガンドはＢ７タンパク質である。ＰＤ−１、Ｌａｇ−３、およびＣＴＬＡ−４は全て、Ｔ細胞の共抑制分子とされている（図２を参照のこと）。抗ＣＴＬ４は、黒色腫、前立腺癌、腎細胞癌、および非ホジキンリンパ腫についての臨床試験で使用されている（非特許文献１１）。併用療法も試験されている。黒色腫において、抗ＣＴＬＡ−４および抗ＰＤ−１の併用は、これらを単独使用して処置した患者と比較して、臨床的な腫瘍奏効がより迅速且つ深かった。

特許文献１には、ＣＬＬ細胞の生存に不可欠な調節タンパク質としてのＣＤ８４が教示されている。この所見に基づいて、特許文献１の発明者らは、Ｂ−ＣＬＬ処置の標的として、および疾患のマーカーとしてのＣＤ８４の使用を示唆している。

特許文献２は、ＣＤ８４に特異的に結合し、且つ（ｉ）慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞における間質細胞の抗アポトーシス活性を下方制御し；そして／または（ｉｉ）骨髄からのＣＬＬ細胞の動員を誘導する抗原認識ドメインを含む単離された抗体を提供している。

さらなる関連技術：
特許文献３は、ＣＤ８４様ポリペプチド活性をアゴナイズするかアンタゴナイズすることによって慢性白血病などの疾患を処置する方法を開示している。

特許文献４は、ＮＫ細胞の溶解活性を増加させるためのワクチン産生のために共刺激ポリペプチド（例えば、ＣＤ８４）発現腫瘍細胞を使用した、患者における腫瘍の処置または予防を開示している。

国際公開第２０１０／０３５２５９号パンフレット 国際公開第２０１５／１１８５３８号パンフレット 米国特許出願公開第２００５００２７１１４号明細書 米国特許出願公開第２００５００２５７８９号明細書

Ｂｉｎｓｋｙ−Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈ Ｉ． ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２０１４）３３：１００６−１０１６ Ｍａｒｏｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１６ ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ Ｂｉｎｓｋｙ−Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈ，Ｉ． ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２０１４）３３（８）：１００６−１０１６ Ｙｕｒｃｈｅｎｋｏ Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｏｎｃｏｌ（２０１１）３３（１）：９−１８ Ｓｃｈｗｅｉｇｈｏｆｅｒ Ｃ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（２０１１）６（１２）：ｅ２８２７７ Ｇｒｚｙｗｎｏｗｉｃｚ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（２０１２）７（４）：ｅ３５１７８ Ｘｉａ，Ｙ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ Ｏｃｔ １６，２０１５ ＭｃＣｌａｎａｈａｎ，Ｆ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１５）１２６（２）：２０３−２１１ Ｓｉｅｒｒｏ，Ｒｏｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ． ２０１１ Ｗｏｏ Ｓ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０１２）７２（４）：９１７−９２７ Ｉｔｏ Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ（２０１５）：６０５４７８

本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、Ｔ細胞疲弊に関与する悪性疾患の処置を必要とする被験体において、前述の疾患を処置する方法であって、但し、前述の悪性疾患がＢ細胞悪性腫瘍ではないことを条件とし、治療有効量のＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤を前述の被験体に投与し、それにより、前述のＴ細胞疲弊に関与する悪性疾患を処置する、投与する工程を含む、方法を提供する。

本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、Ｔ細胞疲弊に関与する悪性疾患の処置を必要とする被験体において、前述の疾患を処置するための治療有効量のＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤の使用であって、但し、前述の悪性疾患がＢ細胞悪性腫瘍ではないことを条件とする、使用を提供する。

本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、Ｔ細胞疲弊の防止または逆行を必要とする被験体において、前述のＴ細胞疲弊を防止または逆行する方法であって、治療有効量のＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤を前述の被験体に投与し、但し、前述の被験体がＢ細胞悪性腫瘍と診断されておらず、それにより、前述の被験体における前述のＴ細胞疲弊を防止または逆行する、投与する工程を含む、方法を提供する。

本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、自己免疫疾患または炎症性疾患の処置を必要とする被験体において、前述の疾患を処置する方法であって、治療有効量のＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤を被験体に投与し、それにより、前述の被験体における自己免疫疾患または炎症性疾患を処置する、投与する工程を含む、方法を提供する。

本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、自己免疫疾患または炎症性疾患の処置を必要とする被験体において、前述の疾患を処置するための治療有効量のＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤の使用を提供する。

本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、Ｂ制御性細胞の活性またはレベルの上昇を必要とする被験体において、前述の活性またはレベルを上昇させる方法であって、治療有効量のＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤を被験体に投与し、それにより、前述の被験体における前述のＢ制御性細胞の活性またはレベルが上昇する、投与する工程を含む、方法を提供する。

本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、Ｔ細胞疲弊に関与する悪性疾患の処置を必要とする被験体において、前述の疾患を処置する方法であって、治療有効量のＳＬＡＭＦ１の活性または発現を減少させることができる薬剤を前述の被験体に投与し、但し、前述の薬剤がＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤ではないことを条件とし、それにより、前述のＴ細胞疲弊に関与する悪性疾患を処置する、投与する工程を含む、方法を提供する。

本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、Ｔ細胞疲弊に関与する悪性疾患の処置を必要とする被験体において、前述の疾患を処置するための治療有効量のＳＬＡＭＦ１の活性または発現を減少させることができる薬剤の使用であって、但し、前述の薬剤がＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤ではないことを条件とする、使用を提供する。

本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、Ｔ細胞疲弊の防止または逆行を必要とする被験体において、前述のＴ細胞疲弊を防止または逆行する方法であって、治療有効量のＳＬＡＭＦ１の活性または発現を減少させることができる薬剤を前述の被験体に投与し、但し、前述の薬剤がＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤ではないことを条件とし、それにより、前述の被験体における前述のＴ細胞疲弊を防止または逆行する、投与する工程を含む、方法を提供する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、被験体は悪性疾患と診断されている。

本発明のいくつかの実施形態によれば、悪性疾患は固形腫瘍である。

本発明のいくつかの実施形態によれば、固形腫瘍は、黒色腫、肺癌、腎細胞癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、頭頸部癌、結腸腺癌、線維肉腫、子宮頸部癌、食道癌、直腸癌、口腔癌、肝臓癌、および膵臓癌からなる群から選択される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、悪性疾患は、Ｔ細胞悪性腫瘍または骨髄性悪性腫瘍を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、悪性疾患はＢ細胞悪性腫瘍である。

本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｂ細胞悪性腫瘍は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）／慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫−粘膜関連リンパ系組織リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、毛様細胞白血病、原発性中枢神経系リンパ腫、脾性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、リンパ球形質細胞性リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性リンパ芽球性プレＢ細胞白血病、形質細胞性白血病、プレＢ細胞白血病、早期プレＢ細胞白血病、およびプレＢ急性リンパ芽球様白血病からなる群から選択される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｂ制御性細胞の活性またはレベルの上昇は、脾臓内のＢ制御性細胞レベルの増加によって示される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｂ制御性細胞の活性またはレベルの上昇は、Ｂ制御性細胞による抗炎症性サイトカイン産生の増加によって示される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、抗炎症性サイトカインは、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ−１、およびＩＬ−３５からなる群から選択される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｂ制御性細胞の活性またはレベルの上昇は、Ｂ制御性細胞によるＣＤ１９、ＩＬ−１０、およびＣＤ１ｄからなる群から選択されるＢｒｅｇマーカーの発現の増加に関連する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｂ制御性細胞の活性またはレベルの上昇は、Ｂ１０Ｂ制御性細胞の増加に関連する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、被験体は、自己免疫疾患または炎症性疾患と診断されている。

本発明のいくつかの実施形態によれば、自己免疫疾患または炎症性疾患は、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節炎、および狼瘡からなる群から選択される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、自己免疫疾患または炎症性疾患は慢性容態である。

本発明のいくつかの実施形態によれば、自己免疫疾患または炎症性疾患は急性容態である。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤は、ポリヌクレオチド剤である。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリヌクレオチド剤は、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボザイム、およびＤＮＡザイムからなる群から選択される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤は抗体である。

本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体は、ＣＤ８４の細胞外部分の少なくとも１つのエピトープに結合する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体はＣＤ８４中和抗体である。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＳＬＡＭＦ１の活性または発現を減少させることができる薬剤は、ポリヌクレオチド剤である。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリヌクレオチド剤は、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボザイム、およびＤＮＡザイムからなる群から選択される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＳＬＡＭＦ１の活性または発現を減少させることができる薬剤は、ＳＬＡＭＦ１抗体である。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤は、Ｔ細胞上のプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、リンパ球活性化遺伝子３（Ｌａｇ−３）、キラー細胞レクチン様受容体Ｇ１（ＫＬＲＧ１）、および／または２Ｂ４の活性または発現を下方制御する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、治療有効量のＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤により、Ｔ細胞によるＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮγの産生、および／またはＣＤ１０７の発現の増加に関連するＴ細胞疲弊が逆行する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、被験体に化学療法薬、抗体免疫療法、および／または放射線療法を施す工程をさらに含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、被験体はヒト被験体である。

別段の定義がない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語および／または科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されている意味を有する。本明細書中に記載の方法および材料に類似するか等価な方法および材料を本発明の実施形態の実施または試験で使用することができるが、例示的な方法および／または材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含む本特許明細書を優先するものとする。さらに、材料、方法、および実施例は例示のみを目的とし、本発明を必然的に制限することを意図しない。

図面のいくつかの表示の簡単な説明
本発明のいくつかの実施形態を、ほんの一例として、添付の図面を参照して本明細書中に記載する。ここでは図面に関して詳細に言及しているが、示した特定事項は本発明の実施形態の例示および考察の実例を目的としていることを強く主張する。これに関して、図面と共に説明を参照することにより、どのようにして本発明の実施形態を実施することができるかが当業者に明らかとなる。

図１は、ＳＬＡＭファミリー受容体およびそのリガンドの略図である。ＳＬＡＭＦ８およびＳＬＡＭＦ９を除いて、全てのＳＬＡＭファミリー受容体を２つの細胞上に示す。ＳＬＡＭＦ２（ＣＤ４８）とＳＬＡＭＦ４（２Ｂ４）とが相互に結合することを除いて、全てのＳＬＡＭファミリー受容体は、異なる細胞上の同種のＳＬＡＭファミリー受容体と相互に結合する。さらに、これらの受容体の細胞内ＩＴＳＭを図中に示し、ＳＬＡＭＦ８およびＳＬＡＭＦ９は細胞内ＩＴＳＭを欠く（Ｃａｎｎｏｎｓ、Ｔａｎｇｙｅ ｅｔ ａｌ． ２０１１から組み入れる）。 図２は、Ｔ細胞の共刺激／共抑制の略図である。抗原提示細胞は、Ｔ細胞上のその受容体との結合の際に共刺激性（緑色のドットの矢印）または共抑制性（赤色のドットの矢印）のいずれかである多数のリガンドを発現することによって、Ｔ細胞に影響を及ぼす。これらのうちで、ＰＤ−１、Ｌａｇ−３、およびＣＴＬＡ−４は全て、共抑制性を示す（赤色のドットの矢印）。 図３Ａ〜Ｈは、ＣＤ８４活性化後に微小環境細胞およびＣＬＬ細胞上でＳＬＡＭＦ１発現が上昇することを示すグラフである。（図３Ａ〜Ｃ）１×１０^５個のＭ２１０Ｂ４細胞を、作動性抗ＣＤ８４抗体（４μｇ／ｍｌ）またはＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体（４μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。（図３Ａ）２４時間後、細胞を採取した。ＲＮＡを精製し、ＳＬＡＭＦ１ ｍＲＮＡをｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した（ｎ＝５、両側で比率についての対応のあるｔ検定、*Ｐ＜０．０５）。（図３Ｂ〜Ｃ）４８時間後、ＳＬＡＭＦ１のタンパク質レベルをフローサイトメトリーによって決定した（図３Ｂ）（ｎ＝６、両側で比率についての対応のあるｔ検定、*Ｐ＜０．０５）。代表的なヒストグラムを図３Ｃに示し、ここで、ＣＤ８４で刺激した試料を黒色で示し、コントロールを薄灰色で示している。（図３Ｄ〜Ｅ）ＮＬＣ（図３Ｄ）またはＢＭ穿刺液から成長させたＢＭ間質細胞（図３Ｅ）を、作動性抗ＣＤ８４抗体（４μｇ／ｍｌ）またはＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体（４μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。２４時間後に細胞を採取し、ＲＮＡを精製し、ＳＬＡＭＦ１ ｍＲＮＡを、ｑＲＴ−ＰＣＲ（ｎ＝１）を使用して決定した。（図３Ｆ〜Ｈ）１×１０^７個のＣＬＬ細胞を、作動性抗ＣＤ８４抗体（４μｇ／ｍｌ）またはＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体（４μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。（図３Ｆ）２４時間後に細胞を採取し、ＲＮＡを精製し、ｍＲＮＡレベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した（ｎ＝５、両側で比率についての対応のあるｔ検定、*Ｐ＜０．０５（図３Ｇ〜Ｈ）。４８時間後、ＳＬＡＭＦ１のタンパク質レベルをフローサイトメトリーによって決定した（ｎ＝６、両側で比率についての対応のあるｔ検定、*Ｐ＜０．０５）。代表的なヒストグラムを図３Ｈに示し、ここで、ＣＤ８４で刺激した試料を黒色で示し、コントロールを薄灰色で示している。 図４Ａ〜Ｅは、ＳＬＡＭＦ１がＣＬＬ患者に由来するＢＭ中およびＥμ−ＴＣＬ１トランスジェニックマウス由来のＴＣＬ細胞上に過剰発現されることを示すグラフである。（図４Ａ）健康であることが確認された骨髄またはＣＬＬ患者の骨髄由来の骨髄穿刺液に由来する骨髄間質細胞を播種した。採取後、骨髄間質細胞を３週間成長させ、ＳＬＡＭＦ１発現について染色した。健康な患者（図４Ｂに示す）およびＣＬＬ患者（図４Ｃに示す）についての代表的なヒストグラムを示し、ここで、患者の染色については黒色で示し、アイソタイプコントロールの染色については薄灰色で示す（ｎ＝３〜６、両側ｔ検定、**ｐ＜０．０１）。（図４Ｄ）ＴＣＬ細胞およびＢ細胞を、罹患Ｅμ−ＴＣＬ１トランスジェニックマウスの脛骨および大腿骨からフラッシュアウトし、フローサイトメトリーを使用したＳＬＡＭＦ１発現についての染色によって比較し、代表的なヒストグラム（図４Ｅに示す）を示した。ここで、ＴＣＬを黒色で示し、Ｂ２２０集団を薄灰色で示す（ｎ＝３、両側ｔ検定（Ｔｗｐ−ｔａｉｌｅｄ Ｔ ｔｅｓｔ）、*ｐ＜０．０５）。 図５は、間質細胞が、ＣＬＬ細胞と接触した場合にＳＬＡＭＦ１の発現が増加することを示すグラフである。１×１０^５個のＭ２１０Ｂ４細胞を２４ウェルプレート中にプレートし、２４時間後、１．６×１０６個のＣＬＬ細胞を接着層上に播種した。４８時間後、ＣＬＬを洗い流し、間質細胞を採取し、フローサイトメトリーにおいてＳＬＡＭＦ１発現について染色した（ｎ＝４、*ｐ＜０．０５）。 図６Ａ〜Ｂは、養子移入モデルにおけるＴＣＬ集団の発達を示すグラフである。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに４×１０^７個のＴＣＬ−１脾細胞を注射した。（図６Ａ）異なる日に、尾静脈から採血し、ＣＤ５＋Ｂ２２０＋集団について染色した（ｎ＝６〜１０）。（図６Ｂ）４７日目に養子移入実験のために動物を屠殺し、脾臓、ＢＭ、およびＰＢ中のＣＤ５＋Ｂ２２０＋集団を決定した（ｎ＝６）。 図７Ａ〜Ｄは、ＣＤ８４がｉｎ ｖｉｖｏでのＴＣＬ−１細胞の維持を支持することを示すグラフである。ＴＣＬ−１脾細胞（４×１０^７個）を、Ｃ５７ＢＬ／６ｗｔマウスまたはＣＤ８４^−／−マウスにｉ．ｖ．注射した。（図７Ａ〜Ｄ）１４日後、マウスを屠殺し、各区画中の悪性ＣＤ５／Ｂ２２２０細胞集団数を、フローサイトメトリーによって（図７Ａ）末梢血（ｎ＝２１、****ｐ＜０．０００１）、（図７Ｂ）脾臓（ｎ＝１４、****ｐ＝０．０００１）、（図７Ｃ）腹膜（ｎ＝１６、****ｐ＜０．０００１）、および（図７Ｄ）骨髄（ｎ＝１４、****ｐ＜０．０００１）において測定した。 図８Ａ〜Ｉは、ＳＬＡＭＦ１発現がＴＣＬ１−Ｅμ ＣＬＬモデルマウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ８４によって制御されることを示すグラフである。（図８Ａ〜Ｂ）ＴＣＬ−１脾細胞（４×１０^７個）を、Ｃ５７ＢＬ／６ｗｔマウスまたはＣＤ８４^−／−マウスの尾静脈内にｉ．ｖ．注射した。１４日後、マウスを屠殺し、ＢＭおよび腹膜中のＣＤ５／Ｂ２２０ ＳＬＡＭＦ１発現ＴＣＬ細胞またはＢ２２０ ＳＬＡＭＦ１発現Ｂ細胞の数を決定し、フローサイトメトリーによって分析した。（図８Ａ）腹膜（ｎ＝４、**ｐ＜０．０１）。代表的なヒストグラムを図８Ｂに示し、ヒストグラムは、ＣＤ８４^−／−ＴＣＬを黒色曲線として示し、ｗｔを薄灰色曲線として示す。（図８Ｃ）骨髄（ｎ＝４、**ｐ＝０．０１）。代表的なヒストグラムを図８Ｄに示し、ヒストグラムは、ＣＤ８４^−／−ＴＣＬを黒色曲線として示し、ｗｔを薄灰色曲線として示す。（図８Ｅ）動物に４×１０^７個のＴＣＬ−１脾細胞を注射し、２日目からｉ．ｖ．で１ｍｇ／ｋｇ体重のＢ４抗体またはアイソタイプコントロール抗体で処置した。１４日後、マウスを屠殺し、ＢＭおよび腹膜中のＣＤ５／Ｂ２２０ ＳＬＡＭＦ１発現ＴＣＬ細胞またはＢ２２０ ＳＬＡＭＦ１発現Ｂ細胞の数を決定し、フローサイトメトリーによって分析した（ｎ＝４、*ｐ＜０．０５ **ｐ＜０．０１）。腹膜（図８Ｆ）および骨髄（図８Ｇ）の代表的なヒストグラムを示し、ここで、ＣＤ８４^−／−ＴＣＬを黒色曲線として示し、ｗｔを薄灰色として示す。（図８Ｈ）ｗｔ動物またはＣＤ８４^−／−動物から採取し、且つ４×１０^７個のＴＣＬ−１脾細胞を注射した骨髄間質細胞を、コンフルエンスまで３週間成長させ、ＳＬＡＭＦ１発現についてフローサイトメトリーで測定した。代表的なヒストグラムを図８Ｉに示し、ここで、ＣＤ８４^−／−ＴＣＬを黒色曲線として示し、ｗｔを薄灰色曲線として示す（ｎ＝５〜６）。 図９Ａ〜Ｊは、ＳＬＡＭＦ１の下方制御がＣＬＬ細胞死を誘導することを示すグラフである。（図９Ａ〜Ｃ）２×１０^６個のＣＬＬ細胞を、１０μｇ／ｍｌ拮抗性抗ＳＬＡＭＦ１と２４時間インキュベートし、アネキシンＶおよび７ＡＡＤで染色し、図９Ｂ〜Ｃに代表的な線図を示した（ｎ＝３、**ｐ＜０．０１）。（図９Ｄ〜Ｅ）０．６２５×１０^５個または０．５×１０^５個のＭ２１０Ｂ４を播種して７０％コンフルエンスまでにし、２４時間後、ｓｉＣＴＲＬまたはｓｉＳＬＡＭＦ１を添加し、細胞をエレクトロポレートした。２４時間後に細胞を採取し、ＲＮＡを精製し、ＳＬＡＭＦ１のｍＲＮＡレベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した（図９Ｄ）（ｎ＝３、*ｐ＜０．０５）。４８時間後に細胞を回収し、ＳＬＡＭＦ１のタンパク質レベルを、フローサイトメトリーによって決定した（図９Ｅ）（ｎ＝７、**ｐ＜０．０１）。（図９Ｆ〜Ｊ）０．６２５×１０^５個または０．５×１０^５個のＭ２１０Ｂ４をプレートして７０％コンフルエンスにし、２４時間後にｓｉＣＴＲＬまたはｓｉＳＬＡＭＦ１を添加し、細胞をエレクトロポレートした。さらに２４時間後、１．６×１０^６個のＣＬＬ細胞を、エレクトロポレートした層の上部に播種した。細胞を４８時間共培養し、その後にＣＬＬ細胞の生存を、アネキシンＶおよび７ＡＡＤでの染色によってフローサイトメトリーにて決定した。ＣＬＬ細胞の生存（図９Ｆ）および細胞死（図９Ｇ）を示す。代表的なプロットを、図９Ｈ〜Ｊに示す（ｎ＝３〜６、***ｐ＜０．００１、*ｐ＜０．０５）。 図１０Ａ〜Ｂは、ＳＬＡＭＦ１でのＭ２１０Ｂ４の刺激によってＢｃｌ−２およびＰＤ−Ｌ１が増加することを示すグラフである。１×１０^５個のＭ２１０Ｂ４細胞を、作動性抗ＳＬＡＭＦ１抗体（１０μｇ／ｍｌ）またはアイソタイプコントロールラットＩｇＧ１と７２時間インキュベートした。ＲＮＡを精製し、Ｂｃｌ−２（図１０Ａ）またはＰＤ−Ｌ１（図１０Ｂ）のｍＲＮＡ発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した（ｎ＝１）。 図１１Ａ〜Ｂは、多発性骨髄腫におけるＣＤ８４によるＳＬＡＭＦ１の制御を示すグラフである。（図１１Ａ）骨髄穿刺液由来の多発性骨髄腫細胞を、作動性抗ＣＤ８４抗体（４μｇ／ｍｌ）またはＩｇＧ１（ｋアイソタイプコントロール）（４μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。２４時間後に細胞を回収し、ＲＮＡを精製し、ＳＬＡＭＦ１のｍＲＮＡレベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲで決定した（ｎ＝１）。（図１１Ｂ）健康であることが確認された骨髄またはＣＬＬ患者の骨髄由来の骨髄穿刺液に由来する骨髄間質細胞を播種した。採取後、骨髄間質細胞を、コンフルエンスまで３週間成長させ、ＳＬＡＭＦ１発現について染色した（ｎ＝１）。 図１２Ａ〜Ｄは、ＣＤ８４が他のＢ細胞悪性腫瘍においてＳＬＡＭＦ１を制御し得ることを示すグラフである。（図１２Ａ〜Ｂ）１×１０^７個の６９７細胞またはＲＥＨ細胞（急性リンパ芽球性白血病細胞株）を、作動性抗ＣＤ８４（４μｇ／ｍｌ）またはＩｇＧ１アイソタイプコントロール（４μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。２４時間後に細胞を採取し、ＲＮＡを精製し、ＳＬＡＭＦ１のｍＲＮＡレベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲで決定した（ｎ＝２）。（図１２Ｃ〜Ｄ）１×１０^７個のＲａｍｏｓ細胞またはＤａｕｄｉ細胞（バーキットリンパ腫細胞株）を、作動性抗ＣＤ８４抗体（４μｇ／ｍｌ）またはＩｇＧ１（ｋアイソタイプコントロール）（４μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。２４時間後に細胞を採取し、ＲＮＡを精製し、ＳＬＡＭＦ１のｍＲＮＡレベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲで決定した（ｎ＝３）。 図１３Ａ〜Ｈは、ＣＤ８４活性化後に微小環境細胞およびＣＬＬ細胞上でＰＤ−Ｌ１が上昇することを示すグラフである。（図１３Ａ〜Ｃ）１×１０^５個のＭ２１０Ｂ４細胞を、作動性抗ＣＤ８４抗体（４μｇ／ｍｌ）またはＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体（４μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。（図１３Ａ）２４時間後、細胞を採取した。ＲＮＡを精製し、ＰＤ−Ｌ１ ｍＲＮＡをｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した（ｎ＝５、両側で比率についての対応のあるｔ検定、*Ｐ＜０．０５）。（図１３Ｂ〜Ｃ）４８時間後、ＰＤ−Ｌ１のタンパク質レベルをフローサイトメトリーによって決定した（図１３Ｂ）（ｎ＝６、両側で比率についての対応のあるｔ検定、*Ｐ＜０．０５）。代表的なヒストグラムを図１３Ｃに示し、ここで、ＣＤ８４で刺激した試料を黒色で示し、コントロールを薄灰色で示している。（図１３Ｄ〜Ｅ）ＮＬＣ（図１３Ｄ）またはＢＭ穿刺液から成長させたＢＭ間質細胞（図１３Ｅ）を、作動性抗ＣＤ８４抗体（４μｇ／ｍｌ）またはＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体（４μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。２４時間後に細胞を採取し、ＲＮＡを精製し、ＰＤ−Ｌ１ ｍＲＮＡをｑＲＴ−ＰＣＲ（ｎ＝１）で決定した。（図１３Ｆ〜Ｈ）１×１０^７個のＣＬＬ細胞を、作動性抗ＣＤ８４抗体（４μｇ／ｍｌ）またはＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体（４μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。（図１３Ｆ）２４時間後に細胞を採取し、ＲＮＡを精製し、ｍＲＮＡレベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した（ｎ＝３、両側で比率についての対応のあるｔ検定、*Ｐ＜０．０５）。（図１３Ｇ〜Ｈ）４８時間後、ＰＤ−Ｌ１のタンパク質レベルをフローサイトメトリーによって決定した（ｎ＝４、両側で比率についての対応のあるｔ検定、*Ｐ＜０．０５）。代表的なヒストグラムを図１３Ｈに示し、ここで、ＣＤ８４で刺激した試料を黒色で示し、コントロールを薄灰色で示している。 図１４Ａ〜Ｅは、ＣＤ８４がＰＤ−１をＣＬＬ細胞においては下方制御するが、骨髄間質細胞においては下方制御しないことを示すグラフである（図１４Ａ〜Ｂ）。健康であることが確認された患者の骨髄穿刺液から成長させた骨髄間質細胞を、コンフルエンスまでおよそ３週間成長させ、作動性抗ＣＤ８４抗体（４μｇ／ｍｌ）またはＩｇＧ１アイソタイプコントロール（４μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。２４時間後に細胞を採取し、ＲＮＡを精製し、ＰＤ−１のｍＲＮＡレベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲ（ｎ＝１）で決定した。４８時間後、ＰＤ−Ｌ１のタンパク質レベルをフローサイトメトリーによって決定した（図１４Ａ〜Ｂ）（ｎ＝３）。（図１４Ｃ〜Ｅ）１×１０^７個のＣＬＬ細胞を、作動性抗ＣＤ８４抗体（５μｇ／ｍｌ）またはＩｇＧ１（ｋアイソタイプコントロール）（４μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。２４時間後に細胞を採取し、ＲＮＡを精製し、ＰＤ−１のｍＲＮＡレベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲで決定した（ｎ＝３、両側で比率についての対応のあるｔ検定、**Ｐ＜０．０１．）。４８時間後、ＰＤ−Ｌ１のタンパク質レベルをフローサイトメトリーによって決定した（図１４Ｄ〜Ｅ）（ｎ＝２）。代表的なヒストグラムを図１４Ｅに示し、ここで、ＣＤ８４で刺激した試料を黒色で示し、コントロールを薄灰色で示している。 図１５Ａ〜Ｊは、ＰＤ−Ｌ１発現がＴＣＬ１−Ｅμ ＣＬＬモデルマウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ８４によって制御されることを示すグラフである。（図１５Ａ〜Ｇ）ＴＣＬ−１脾細胞（４×１０^７個）を、Ｃ５７ＢＬ／６ｗｔマウスまたはＣＤ８４^−／−マウスの尾静脈内にｉ．ｖ．注射した。１４日後、マウスを屠殺し、末梢血、脾臓、および腹膜中のＣＤ５／Ｂ２２０ ＰＤ−Ｌ１発現ＴＣＬ細胞の数を決定し、フローサイトメトリーによって分析した。（図１５Ａ、Ｂ）末梢血（ｎ＝６〜７、両側ｔ検定、**ｐ＜０．０１）、（図１５Ｃ〜Ｄ）脾臓（ｎ＝６〜７、両側ｔ検定、*ｐ＜０．０５、**ｐ＝０．０１）、（図１５Ｅ〜Ｇ）腹膜（ｎ＝３〜５、両側ｔ検定、**ｐ＜０．０１）。腹膜の代表的なヒストグラムを図１５Ｇに示し、ここで、ＣＤ８４^−／−ＴＣＬを黒色曲線として示し、ｗｔを薄灰色として示す。（図１５Ｈ）動物に、４×１０^７個のＴＣＬ−１脾細胞を注射し、２日目からｉ．ｖ．で１ｍｇ／ｋｇ体重のＢ４抗体またはアイソタイプコントロール抗体で処置した。１４日後、マウスを屠殺し、腹膜中のＣＤ５／Ｂ２２０ ＰＤ−Ｌ１発現ＴＣＬ細胞の数を決定し、フローサイトメトリーによって分析した（ｎ＝４、両側ｔ検定**ｐ＜０．０１）。（図１５Ｉ〜Ｊ）ｗｔ動物またはＣＤ８４^−／−動物のいずれかから採取し、且つ４×１０^７個のＴＣＬ−１脾細胞を注射した骨髄間質細胞を、コンフルエンスまで３週間成長させ、ＰＤ−Ｌ１発現についてフローサイトメトリーで測定した（ｎ＝６〜８）。ＢＭ間質細胞の代表的なヒストグラムを図１５Ｊに示し、ここで、ＣＤ８４^−／−から採取したＢＭ間質細胞を黒色曲線として示し、ｗｔから採取したＢＭ間質細胞を薄灰色曲線として示す。 図１６Ａ〜Ｂは、ＰＤ−１発現がｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ８４によって制御されることを示すグラフである。（図１６Ａ〜Ｂ）ＴＣＬ−１脾細胞（４×１０^７個）を、Ｃ５７ＢＬ／６ｗｔマウスまたはＣＤ８４^−／−マウスの尾静脈にｉ．ｖ．注射した。２８日後、マウスを屠殺し、腹膜腔中のＣＤ５／Ｂ２２０ ＰＤ−Ｌ１発現ＴＣＬ細胞の数を、フローサイトメトリー（ｎ＝４〜５、両側ｔ検定、**ｐ＜０．０１）によって決定した。腹膜の代表的なヒストグラムを図１６Ｂに示し、ここで、ＣＤ８４^−／−ＴＣＬを黒色曲線として示し、ｗｔを薄灰色として示す。 図１７Ａ〜Ｋは、ＴＣＬ上のＰＤ−Ｌ１の減少後にＴ細胞上の疲弊性マーカーが減少することを示すグラフである。（図１７Ａ〜Ｃ）ＴＣＬ−１脾細胞（４×１０^７個）を、Ｃ５７ＢＬ／６ｗｔマウスまたはＣＤ８４^−／−マウスの尾静脈内にｉ．ｖ．注射した。１４日後、マウスを屠殺し、脾臓を採取し、ＰＤ−１（図１７Ａ）およびＬａｇ−３（図１７Ｂ）を発現するＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の数を、フローサイトメトリーによって決定した（ｎ＝２）。２つの独立した実験において脾臓中に染色が認められなかったので（ｎ＝６〜７、片側ｔ検定*ｐ＜０．０５）、末梢血中のＣＴＬＡ−４の数（図１７Ｃ）を決定した。（図１７Ｄ〜Ｆ）ＴＣＬ−１脾細胞（４×１０^７個）を、Ｃ５７ＢＬ／６ｗｔマウスまたはＣＤ８４^−／−マウスの尾静脈内にｉ．ｖ．注射した。１４日後、マウスを屠殺し、腹膜腔由来の細胞を採取し、ＰＤ−１（図１７Ｄ）、Ｌａｇ−３（図１７Ｆ）、およびＣＴＬＡ−４（図１７Ｈ）を発現するＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の数を、フローサイトメトリーによって決定した（ｎ＝４〜５、片側ｔ検定*ｐ＜０．０５）。ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞のＰＤ−１（図１７Ｅ中）、Ｌａｇ−３（図１７Ｇ中）、およびＣＴＬＡ−４（図１７Ｉ中）についての代表的なヒストグラムは、ＣＤ８４^−／−Ｔ細胞を黒色曲線として示し、ｗｔを薄灰色曲線として示す。（図１７Ｊ〜Ｋ）ＴＣＬ−１脾細胞（４×１０^７個）を、Ｃ５７ＢＬ／６ｗｔマウスまたはＣＤ８４^−／−マウスの尾静脈内にｉ．ｖ．注射した。１４日後、マウスを屠殺し、リンパ節中のＣＤ５／Ｂ２２０ ＰＤ−Ｌ１発現ＴＣＬ細胞の数を、フローサイトメトリーによって決定した（図１７Ｊ）（ｎ＝４〜５）。逆に、同一器官中のＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞上のＣＴＬＡ−４、Ｌａｇ−３、およびＰＤ−１の発現を、フローサイトメトリーによって決定した（図１７Ｋ）（ｎ＝４〜５）。 図１８Ａ〜Ｆは、６月齢のキメラＴＣＬ−ＣＤ８４^−／−マウスが、ＴＣＬ上のＰＤ−Ｌ１レベルの低下を示し、逆に、Ｔ細胞上のＰＤ−１の低下を示すことを示すグラフである。（図１８Ａ〜Ｄ）８週齢のＴＣＬ−１マウスまたはネガティブコントロール同腹子（ｗｔ）に由来するＢＭ細胞（５×１０^６個）を、致死量の放射線を照射したＣ５７ＢＬ／６（ｗｔ）マウスまたはＣＤ８４欠損（ＣＤ８４^−／−）マウスに注射した。（図１８Ａ、１８Ｃ）６ヶ月後、マウスを屠殺し、脾臓および腹膜腔由来の細胞を採取し、悪性ＣＤ５＋Ｂ２２０細胞を、腹膜（図１８Ａ）および脾臓（図１８Ｃ）内のＰＤ−Ｌ１発現について分析した（ｎ＝３〜４、両側ｔ検定、*ｐ＜０．０５）。（図１８Ｂ、１８Ｄ）８週齢ＴＣＬ−１マウスまたはネガティブコントロール同腹子（ｗｔ）に由来するＢＭ細胞（５×１０^６個）を、致死量の放射線を照射したＣ５７ＢＬ／６（ｗｔ）またはＣＤ８４欠損（ＣＤ８４^−／−）マウスに注射した。６ヶ月後、マウスを屠殺し、脾臓および腹膜腔由来の細胞を採取し、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、腹膜（図１８Ａ）および脾臓（図１８Ｃ）内のＰＤ−１発現について分析した（ｎ＝３〜４、両側ｔ検定、*ｐ＜０．０５）。（図１８Ｅ〜Ｆ）ＣＴＬＡ−４、Ｌａｇ−３、およびＰＤ−１発現の基礎状態を調査するために、非注射マウスの腹膜腔（図１８Ｅ）および脾臓（図１８Ｆ）内のＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞を採取した。 図１９Ａ〜Ｂは、ＣＤ８４^−／−ＴＣＬ注射マウス由来のＴ細胞の機能性の増加を示すグラフである。（図１９Ａ〜Ｂ）ＴＣＬ−１脾細胞（４×１０^７個）を、Ｃ５７ＢＬ／６ｗｔマウスまたはＣＤ８４^−／−マウスの尾静脈内にｉ．ｖ．注射した。１４日後、マウスを屠殺し、脾臓を採取し、Ｔ細胞を、Ｂ２２０ビーズを使用してＢ細胞を濾去することによって回収した。Ｔ細胞を活性化するために、Ｔ細胞をＣＤ３およびＣＤ２８をコーティングしたプレート上で２４時間さらにインキュベートした。ＲＮＡを精製し、ＩＬ−４（図１９Ａ）およびＩＦＮγ（図１９Ｂ）のｍＲＮＡレベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲで決定した（ｎ＝３〜４、ｐ＝０．１５）。 図２０Ａ〜Ｆは、ＣＬＬ患者において骨髄間質細胞上のＰＤ−Ｌ１発現が増加し、ＣＤ８４発現も増加することを示すグラフである。（図２０Ａ〜Ｆ）健康であることが確認された骨髄、ＣＬＬ患者または多発性骨髄腫患者の骨髄由来の骨髄穿刺液に由来する骨髄間質細胞を播種した。採取後、骨髄間質細胞を３週間成長させ、ＰＤ−Ｌ１発現（図２０Ａ）またはＣＤ８４発現（図２０Ｄ）の統計のために染色した。健康な患者（図２０Ｂ中に示す）およびＣＬＬ患者（図２０Ｃ中）のＰＤ−Ｌ１についての代表的なヒストグラムならびに健康な患者（図２０Ｅ中に示す）およびＣＬＬ患者（図２０Ｆ中）のＣＤ８４についての代表的なヒストグラムを示し、ここで、患者の染色を黒色で示し、アイソタイプコントロールを薄灰色で示す（ｎ＝３〜６、両側ｔ検定、**ｐ＜０．０１）。 図２１Ａ〜Ｂは、多発性骨髄腫におけるＣＤ８４によるＰＤ−Ｌ１の制御を示すグラフである。（図２１Ａ〜Ｂ）骨髄穿刺液由来の多発性骨髄腫細胞を、作動性抗ＣＤ８４抗体（４μｇ／ｍｌ）またはＩｇＧ１アイソタイプコントロール（４μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。２４時間後に細胞を採取し、ＲＮＡを精製し、ＰＤ−Ｌ１（図２１Ａ）またはＰＤ−１（図２１Ｂ）のｍＲＮＡレベルをｑＲＴ−ＰＣＲで決定した（ｎ＝１）。 図２２Ａ〜Ｆは、ＣＤ８４が他のＢ細胞悪性腫瘍においてＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１を制御し得ることを示すグラフである。（図２２Ａ〜Ｄ）１×１０^７個のＲａｍｏｓ細胞またはＤａｕｄｉ細胞（バーキットリンパ腫細胞株）を、作動性抗ＣＤ８４抗体（４μｇ／ｍｌ）またはＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体（４μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。２４時間後に細胞を採取し、ＲＮＡを精製し、Ｒａｍｏｓ（図２２Ａ）およびＤａｕｄｉ（図２２Ｃ）についてのＰＤ−Ｌ１またはＲａｍｏｓ（図２２Ｂ）およびＤａｕｄｉ（図２２Ｄ）についてのＰＤ−１のｍＲＮＡレベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲで決定した（ｎ＝２〜４）。（図２２Ｅ〜Ｆ）１×１０^７個の６９７細胞またはＲＥＨ細胞（急性リンパ芽球性白血病細胞株）を、作動性抗ＣＤ８４抗体（４μｇ／ｍｌ）またはＩｇＧ１（ｋアイソタイプコントロール）（４μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。２４時間後に細胞を採取し、ＲＮＡを精製し、ＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡレベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲで決定した（ｎ＝２）。 図２３Ａ〜Ｇは、ＣＤ８４の活性化によりＰＤ−Ｌ１発現が上昇することを示すグラフである。患者またはＣＬＬモデルマウスＥμ−ＴＣＬ１のいずれかに由来するＣＬＬ細胞を５μｇ／ｍｌ ＣＤ８４で刺激し、精製後のｍＲＮＡに関するＰＤ−Ｌ１レベルを、ＰＤ−Ｌ１およびＰＳＭＢのプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによって試験し（ｎ＝３）（*ｐ＜０．０５）（図２３Ａ）、タンパク質レベルをフローサイトメトリーによって試験した（ｎ＝４）（*ｐ＜０．０５）（図２３Ａ〜Ｂ）。ヒトＣＬＬ（ｎ＝４）および健康な患者（ｎ＝４）（*ｐ＜０．０５）（図２３Ｃ）またはＥμ−ＴＣＬ１マウス（ｎ＝５）および健康なマウス（ｎ＝５）（*ｐ＜０．０５）（図２３Ｄ）に由来する骨髄間質細胞を採取し、コンフルエントまで成長させ、そのＰＤ−Ｌ１の基礎レベルについて試験した。Ｍ２１０Ｂ４を４μｇ／ｍｌ ＣＤ８４で刺激し、ＰＤ−Ｌ１およびＬ３２のプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡレベルに関して分析し（ｎ＝５）（*ｐ＜０．０５）（図２３Ｅ）、または、タンパク質レベルに関してフローサイトメトリーによって分析した（ｎ＝６）（**ｐ＜０．０１）（図２３Ｅ）。健康な患者またはＣＬＬ患者のいずれかに由来する骨髄間質細胞（図２３Ｆ）またはＣＬＬ患者由来の単球（図２３Ｇ）を、４μｇ／ｍｌ ＣＤ８４によって刺激し、精製し、ｍＲＮＡに関してハウスキーピング遺伝子としてＰＳＭＢを使用したＲＴ−ＰＣＲによって分析した（ｎ＝３）（*ｐ＜０．０５）。 図２４Ａ〜Ｃは、細胞表面ＣＤ８４の活性化により、ｐＡＫＴおよびｍＴＯＲを介してＰＤ−Ｌ１レベルが上昇することを示すグラフである。（図２４Ａ）１×１０^５個の細胞を２４ウェルプレート中にてＣＤ８４（４μｇ／ｍｌ、ＳＣＢＴ）で３０分間刺激し、その後に抗ＦＡＢ交叉を５分間行った。その後に溶解し、１２％ｗｔ／ｖｏｌのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ハウスキーピング遺伝子として抗ホスホＳ６、抗ホスホＡＫＴｔ、抗ホスホＥＲＫ、およびアクチンを使用してブロットした。示したブロットは、３つの実験の代表である。（図２４Ｂ〜Ｃ）１×１０^５個の細胞を、２４ウェルプレート中にてＣＤ８４（４μｇ／ｍｌ、ＳＣＢＴ）で２０分間刺激し、その後に抗ＦＡＢ交叉を５分間行った。その後に固定し、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅキットを用いて透過処理を行い、抗ｐＡＫＴ（細胞シグナル伝達）および抗ウサギ二次ＡＰＣ抗体について染色した。 図２５Ａ〜Ｉは、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ８４^−／−マウス由来のＴＣＬ−１細胞上のＰＤ−Ｌ１発現の減少を示すグラフである。ＴＣＬ−１脾細胞（４×１０^７個）を、Ｃ５７ＢＬ／６ｗｔマウスまたはＣＤ８４^−／−マウスの尾静脈内にｉ．ｖ．注射した。１４〜２１日後、マウスを屠殺し、末梢血中（ｎ＝８〜１０、***ｐ＜０．００１）（図２５Ａ、２５Ｅ）、脾臓中（ｎ＝１２〜１４、****ｐ＜０．００１）（図２５Ｂ）、腹膜中（ｎ＝６〜１０、****ｐ＜０．００１）（図２５Ｃ）、ＢＭ中（ｎ＝７〜１０、****ｐ＜０．０００１）（図２５Ｄ）、およびリンパ節中（ｎ＝７〜８、有意でないｐ＝０．９８９３）（図２５Ｆ）のＣＤ５／ＣＤ１９ ＴＣＬ細胞上のＰＤ−Ｌ１の発現をフローサイトメトリーによって決定した。末梢血由来の代表的なヒストグラムを示す。（図２５Ｇ）動物に４×１０^７個のＴＣＬ−１脾細胞を注射し、２日目からｉ．ｖ．で１ｍｇ／ｋｇ体重のＢ４抗体またはアイソタイプコントロール抗体で処置した。１４日後、マウスを屠殺し、腹膜由来のＴＣＬ１細胞上のＰＤ−Ｌ１発現を決定した（ｎ＝４、**ｐ＜０．０１）。（図２５Ｈ〜Ｉ）８週齢のＴＣＬ−１マウスまたはネガティブコントロール同腹子（ｗｔ）に由来するＢＭ細胞（５×１０^６個）を、致死量の放射線を照射したＣ５７ＢＬ／６（ｗｔ）マウスまたはＣＤ８４欠損（ＣＤ８４^−／−）マウスに注射した。６ヶ月後、マウスを屠殺し、腹膜中（図２５Ｈ）および脾臓中（図２５Ｉ）のＴＣＬ１細胞上のＰＤ−Ｌ１発現を決定した（ｎ＝３〜４、*ｐ＜０．０５）。 図２６Ａ〜Ｇは、ｉｎ ｖｉｖｏでのマウスＣＬＬを注射したＣＤ８４^−／−マウスにおける微小環境上のＰＤ−Ｌ１発現が減少したことを示すグラフである。ＴＣＬ−１脾細胞（４×１０^７個）を、Ｃ５７ＢＬ／６ｗｔマウスまたはＣＤ８４^−／−マウスの尾静脈内にｉ．ｖ．注射した。１４〜２１日後、マウスを屠殺し、骨髄間質細胞上（ｎ＝９〜１０、**ｐ＜０．０１）（図２６Ａ）（代表的なヒストグラム（図２６Ｂ）を含む）、骨髄および脾臓中のマクロファージ上（ｎ＝９〜１０、ｎ＝５〜６、**ｐ＜０．０１）（図２６Ｃ、２６Ｅ）および樹状細胞上（ｎ＝９〜１０、ｎ＝６、**ｐ＜０．０１）（図２６Ｄ、２６Ｆ）、ならびに末梢血中の単球上（ｎ＝７〜９、****ｐ＜０．００１）（図２６Ｇ）のＰＤ−Ｌ１発現を決定した。 図２７Ａ〜Ｈは、マウスＣＬＬを注射したＣＤ８４^−／−マウスのＣＤ８Ｔ細胞の疲弊が低下したことを示すグラフである。ＴＣＬ−１脾細胞（４×１０^７個）を、Ｃ５７ＢＬ／６ｗｔマウスまたはＣＤ８４^−／−マウスの尾静脈内にｉ．ｖ．注射した。１４〜２１日後、マウスを屠殺し、脾臓（ｎ＝６〜１１、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、****ｐ＜０．００１）（図２７Ａ〜Ｂ）、末梢血（ｎ＝５〜１１、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１）（図２７Ｃ）、腹膜腔（ｎ＝６〜１０、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１）（図２７Ｄ）、および骨髄（ｎ＝４〜７、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１）（図２７Ｅ）に関するＣＤ４（ｓ４）およびＣＤ８の疲弊性マーカーＰＤ−１、Ｌａｇ−３、ＣＴＬＡ−４、２Ｂ４、およびＫＬＲＧ１の発現を決定した。脾臓から細胞を同様に回収し、抗ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と２４時間培養し、培養の最後の２時間はブレフェルジン−Ａと培養した。次いで、これらの細胞を採取し、ＣＤ４Ｔ細胞を、ＩＦＮγおよびＩＬ−２（ｓ４）の発現について試験し、ＣＤ８Ｔ細胞を、ＩＦＮγ、ＩＬ−２グランザイムＢ、およびＬＡＭＰ−１の発現について試験した（ｎ＝７〜８、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、有意でないｐ＝０．３１７２）（図２７Ｆ〜Ｇ）。８週齢のＴＣＬ−１マウスまたはネガティブコントロール同腹子（ｗｔ）に由来するＢＭ細胞（５×１０^６個）を、致死量の放射線を照射したＣ５７ＢＬ／６（ｗｔ）マウスまたはＣＤ８４欠損（ＣＤ８４^−／−）マウスに注射した。６ヶ月後、マウスを屠殺し、腹膜および脾臓中のＣＤ８（図２７Ｈ）Ｔ細胞上およびＣＤ４（ｓ４）Ｔ細胞上のＰＤ−１の発現を決定した（ｎ＝３〜４、*ｐ＜０．０５）。 図２８Ａ〜Ｃは、マウスＣＬＬを持たないＣＤ８４^−／−マウスのＣＤ８Ｔ細胞の機能性に相違は無いことを示すグラフである。細胞を脾臓から採取し、抗ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と２４時間培養し、培養の最後の２時間はブレフェルジン−Ａと培養した。ＣＤ８Ｔ細胞を、以下の疲弊性マーカー：ＰＤ−１、Ｌａｇ−３、ＣＴＬＡ−４、２Ｂ４、ＫＬＲＧ−１（ｎ＝５〜７、有意でないｐ＝０．９５０８、有意でないｐ＝０．７８３６、有意でないｐ＝０．３０２６、有意でないｐ＝０．８２５３、有意でないｐ＝０．９９０９）（図２８Ａ、２８Ｃ）およびサイトカイン／細胞傷害性マーカー：ＩＦＮγ、ＩＬ−２、グランザイムＢ、およびＬＡＭＰ−１（ｎ＝５〜７、有意でないｐ＝０．６４６１、有意でないｐ＝０．７８９７、有意でないｐ＝０．８７４０、有意でないｐ＝０．８４９５）（図２８Ｂ）について染色した。 図２９Ａ〜Ｆは、ヒトＣＬＬにおけるＣＤ８４の破壊によってＣＬＬおよび間質細胞上のＰＤ−Ｌ１が減少し、低疲弊Ｔ細胞も誘導されることを示すグラフである。ＣＬＬ細胞をｓｉＣＤ８４（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）で２４時間処置し、ＣＤ８４（ｎ＝４、*ｐ＜０．０５）（図２９Ａ）およびＰＤ−Ｌ１（ｎ＝４、***ｐ＜０．００１）（図２９Ｂ）の量を試験した。その後、これらの細胞を、同一の患者に由来するＭ２１０Ｂ４細胞またはＴ細胞のいずれかとインキュベートした。Ｍ２１０Ｂ４細胞を、そのＰＤ−Ｌ１量について染色した（ｎ＝３、**ｐ＜０．０１）（図２９Ｃ）。Ｔ細胞を、ＣＤ４およびＣＤ８について染色し、疲弊マーカーＰＤ−１、ＬＡＧ−３、およびＣＴＬＡ−４についても染色した（ｎ＝２）（図２９Ｄ〜Ｆ）。 図３０Ａ〜Ｄは、ＣＤ８４の活性化により多発性骨髄腫（ＭＭ）におけるＰＤ−Ｌ１発現が誘導されることを示すグラフである。（図３０Ａ〜Ｂ）ヒトＭＭ（ｎ＝３）および健康な患者（ｎ＝４）（**ｐ＜０．０１、*ｐ＜０．５）に由来する骨髄間質細胞を採取し、コンフルエントまで成長させ、この細胞のＣＤ８４およびＰＤ−Ｌ１の基礎レベルについて試験した。（図３０Ｃ）ヒトＭＭに由来する骨髄間質細胞を採取し、コンフルエントまで成長させ、その後に、４μｇ／ｍｌ ＣＤ８４で刺激し、ｍＲＮＡレベルに関してＰＤ−Ｌ１およびハウスキーピング遺伝子としてのＰＳＭＢのプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによって分析し（ｎ＝３）（*ｐ＜０．０５）、または、タンパク質レベルに関してフローサイトメトリーによって分析した（ｎ＝３）（*ｐ＜０．０５）。（図３０Ｄ）ヒトＭＭに由来する骨髄穿刺液（ＣＤ１３８＋、ＣＤ３８＋）を５μｇ／ｍｌ ＣＤ８４で刺激し、ｍＲＮＡレベルに関してＰＤ−Ｌ１およびハウスキーピング遺伝子としてのＰＳＭＢのプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによって分析し（ｎ＝５）（**ｐ＜０．０１）（２４時間）、または、タンパク質レベルに関してフローサイトメトリーによって分析した（ｎ＝３）（*ｐ＜０．０５）（４８時間）。 図３１Ａ〜Ｅは、ＭＭキメラＣＤ８４^−／−がＰＤ−Ｌ１発現の低下を示し、且つ、Ｔ細胞疲弊の低下を示すことを示すグラフである。ＣＤ８４^−／−マウスまたはｗｔマウスに致死量の放射線を照射し、その骨髄を、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａｌｗｒｉｊ骨髄を使用して再構築し、その後に、５ＴＧＭ１ ＭＭ細胞株を注射した。（図３１Ａ）骨髄中のＭＭ細胞は、ＣＤ８４欠損微小環境においてＰＤ−Ｌ１発現が低下した（ｎ＝４）。（図３１Ｂ〜Ｃ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＰＤ−１、Ｌａｇ−３、ＣＴＬＡ−４、２Ｂ４、およびＫＬＲＧ−１が有意に低下し（ｎ＝３〜４、**ｐ＝０．０１、*ｐ＜０．０５）（図３１Ｂ）、サイトカインおよび細胞傷害性因子が増加した（図３１Ｃ）（ｎ＝３〜４）。（図３１Ｄ〜Ｅ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、ＰＤ−１、Ｌａｇ−３、ＣＴＬＡ−４、２Ｂ４、およびＫＬＲＧ−１が低下し（ｎ＝３〜４、**ｐ＝０．０１、*ｐ＜０．０５）（図３１Ｄ）、サイトカインおよび細胞傷害性因子が増加した（図３１Ｅ）（ｎ＝３〜４）。 図３２Ａ〜Ｂは、非造血器官を起源とすることを示すＣＤ３４およびＣＤ４５について染色した、ヒト骨髄穿刺液から成長させた初代間質細胞（図３２Ａ）およびマウス脛骨大腿骨からフラッシュアウトした初代間質細胞（図３２Ｂ）を示すグラフである。 図３３は、リンパ節中のＣＤ８Ｔ細胞疲弊マーカーを示すグラフである（ｎ＝３〜８、有意でないｐ＝０．１７３８、有意でないｐ＝０．４８９５、有意でないｐ＝０．８７９８、有意でないｐ＝０．９１９０、有意でないｐ＝０．４３８１）。 図３４Ａ〜Ｂは、アネキシン−ＶでゲートしたＴＣＬ（ＣＤ１９、ＣＤ５陽性）細胞、７ＡＡＤ陰性細胞、および生細胞のみのＰＤ−Ｌ１発現を示すグラフである（ｎ＝２〜４、**ｐ＜０．０１、*ｐ＜０．０５）。 図３５Ａ〜Ｆは、マウスＣＬＬを注射したＣＤ８４^−／−マウスのＣＤ４Ｔ細胞の疲弊が低下したことを示すグラフである。ＴＣＬ−１脾細胞（４×１０^７個）を、Ｃ５７ＢＬ／６ｗｔマウスまたはＣＤ８４^−／−マウスの尾静脈内にｉ．ｖ．注射した。１４〜２１日後、マウスを屠殺し、脾臓（ｎ＝６〜１１、有意でないｐ＝０．１６６４、*ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１）（図３５Ａ）；末梢血（ｎ＝５〜１１、有意でないｐ＝０．３１２４、*ｐ＜０．０５、有意でないｐ＝０．５２８５、*ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０５）（図３５Ｂ）；腹膜腔（ｎ＝６〜１０、**ｐ＜０．０１、*ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１）（図３５Ｃ）；および骨髄（ｎ＝４〜７、有意でないｐ＝０．０９００、*ｐ＜０．０５、有意でないｐ＝０．６５６９、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１）（図３５Ｄ）に関するＣＤ４の疲弊性マーカーＰＤ−１、Ｌａｇ−３、ＣＴＬＡ−４、２Ｂ４、およびＫＬＲＧ１の発現を決定した。脾臓から細胞を回収し、抗ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と２４時間培養し、培養の最後の２時間はブレフェルジン−Ａと培養した。次いで、これらの細胞を採取し、ＣＤ４Ｔ細胞を、ＩＦＮγおよびＩＬ−２の発現について試験した（ｎ＝７〜８、*ｐ＜０．０５、有意でないｐ＝０．３１７２）（図３５Ｅ）。８週齢のＴＣＬ−１マウスまたはネガティブコントロール同腹子（ｗｔ）に由来するＢＭ細胞（５×１０^６個）を、致死量の放射線を照射したＣ５７ＢＬ／６（ｗｔ）またはＣＤ８４⁻欠損（ＣＤ８４^−／−）マウスに注射した。６ヶ月後、マウスを屠殺し、ＣＤ４上のＰＤ−１の発現を決定した（図３５Ｆ）（ｎ＝３〜４、*ｐ＜０．０５）。 図３６Ａ〜Ｂは、ｓｉＣＤ８４で処置したＣＬＬと共培養したＭ２１０Ｂ４細胞のＣＤ８４レベルが低下することを示すグラフである（ｎ＝３、*ｐ＜０．０５）（図３６Ａ）。共培養前に、ＣＬＬ細胞をビーズ（抗ＣＤ１９ビーズ、Ｍｉｌｔｅｎｙｌ）で精製し、ＣＬＬ細胞を単独で含むことを決定し（図３６Ｂ）、その後にＣＤ８４に対するｓｉＲＮＡで処置した。 図３７Ａ〜Ｂは、ＭＭキメラマウスを示す図である。ＣＤ８４^−／−マウスまたはｗｔマウスに致死量の放射線を照射し、その骨髄を、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａｌｗｒｉｊ骨髄を使用して再構築し、その後に、５ＴＧＭ１ ＭＭ細胞株を注射した。注射マウスとＷＴとを比較し、ＭＭ細胞を明確に示す。 図３８は、急性ＤＳＳ誘導性結腸炎におけるＣＤ８４の役割を示すグラフである。マウスを、その飲料水を介して２％ＤＳＳで５日間処置し、次いで、通常の水を４〜７日間、または実験終了まで与えた。疾患の進行をモニタリングするためにマウスを毎日計量した。グラフは、ＣＤ８４ｋｏマウスと比較したｗｔマウスの体重変化率を示す。バーはＳＥＭを示す。 図３９は、慢性ＤＳＳ誘導性結腸炎におけるＣＤ８４の役割を示すグラフである。ｗｔマウスおよびＣＤ８４^−／−マウスを、２サイクルの２％ＤＳＳで処置した。第１のサイクルは、０日目〜５日目の処置およびその後の１０日間の回復のための水での処置であった。第２のサイクルでＤＳＳを１５日目にさらに５日間投与し、その後に定期的に飲料水を与えた。疾患の進行をモニタリングするために体重を毎日モニタリングした。グラフは、ＣＤ８４ｋｏマウスと比較したｗｔマウスの体重変化を示す。バーはＳＥＭを示す。 図４０Ａ〜Ｄは、ＣＤ８４が結腸炎において制御性Ｂ細胞集団に影響を及ぼすことを示すグラフである。ｗｔマウスおよびＣＤ８４^−／−マウスを、その飲料水を介して２％ＤＳＳで５日間処置し、その後に通常の水を実験終了まで与えた。１０日目にマウスを屠殺し、その脾臓および腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）を採取した。Ｂ細胞を、ｂ２２０^＋ビーズを使用して富化し、ＬＰＳ^＋ＰＩＭ（ＰＭＡ、イオノマイシン、およびモネンシン）で５時間または２４時間活性化した。ＢｒｅｇサブセットについてＦＡＣＳ分析を行った。総Ｂｒｅｇ：ＣＤ１９^＋、ＩＬ−１０^＋；Ｂ１０：ＣＤ１９^＋、ＩＬ−１０^＋、ＣＤ１ｄ^ｈｉ、ＣＤ５^＋；Ｍｚ：ＣＤ１９^＋、ＩＬ−１０^＋、ＣＤ２４^＋、ＣＤ２１^＋、ＣＤ２３⁻；Ｔ２−ＭｚＰ：ＣＤ１９^＋、ＩＬ−１０^＋、ＣＤ２４^＋、ＣＤ２１^＋、ＣＤ２３^＋。（図４０Ａ）５時間活性化した脾臓集団。（図４０Ｂ）５時間活性化したＭＬＮ集団。（図４０Ｃ）２４時間活性化した脾臓集団。（図４０Ｄ）２４時間活性化したＭＬＮ集団。各ドットは生物学的反復を表し、バーはＳＥＭを示す。有意でないｐ＞０．０１、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、***ｐ＜０．００１、****ｐ＜０．０００１。 図４１Ａ〜Ｆは、ＥＡＥにおけるＣＤ８４の役割を示すグラフである。マウスに、ＭＯＧペプチドを含むフロイント完全アジュバントをＳ．Ｃ．で尾骨付近に注射し、その後、０日目および２日目に百日咳毒素をＩ．Ｐ．注射した。マウスを毎日スコアリングし（図４１Ａ）、２日毎に計量した（図４１Ｂ）。２７日目に、各群由来の２匹のマウスを屠殺し、５時間（図４１Ｃ）または２４時間（図４１Ｄ）の活性化後の脾臓中のＢｒｅｇ集団について分析した。（図４１Ｅ）脾細胞を、ＣＤ３＋Ａｂで２４時間活性化した。Ｔｈ１（ＩＮＦγおよびＴ−Ｂｅｔ）およびＴｈ１７（ＩＬ−１７およびＲＯＲγＴ）の各マーカーをＦＡＣＳによって分析した。（図４１Ｆ）脾細胞をＴｒｅｇ集団（ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＦＯＸＰ３＋）およびＴｈ１７集団（ＣＤ４＋、ＲｏＲγＴ＋）について分析した。各ドットは生物学的反復を表し、バーはＳＥＭを示す。有意でないｐ＞０．０１、*ｐ＜０．０１、**ｐ＜０．００１。

発明の特定の実施形態の説明
本発明は、そのいくつかの実施形態では、悪性疾患、自己免疫疾患、および炎症性疾患を処置するための、Ｔ細胞疲弊を防止または逆行させ、且つＢ制御性細胞の活性またはレベルを増強するための組成物および方法に関する。

本発明の原理および操作を、図面および添付の説明を参照してより深く理解することができる。

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明が必ずしも以下の説明に記載されているか実施例に例示されている詳細な記述を適用してそれに制限されるわけではないと理解すべきである。本発明は、他の実施形態が可能であるか、種々の方法で実施または実行することが可能である。また、本明細書中で使用した表現および用語は、説明を目的とし、本発明を制限すると見なすべきではないと理解すべきである。

免疫系のバランスは、組織の損傷および自己免疫疾患の発生を防止するための寛容を維持しながら、（例えば、病原体および腫瘍を排除するための）有効な応答を達成するために極めて重要である。Ｔ細胞は、このバランスを保存するための中核を成し、共刺激シグナルと抑制シグナル（すなわち、免疫チェックポイント）との間のバランスによって制御され、これらのシグナルの多くがリガンド−受容体相互作用によって開始される。種々の免疫チェックポイントが存在しており（例えば、図２を参照のこと）、そのうちで、２つの免疫チェックポイント阻害受容体である細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）が挙げられる。ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１は、免疫応答を異なるレベルで異なる機序によって制御し、臨床癌免疫療法分野において最も積極的に研究されている（Ｐａｒｄｏｌｌ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ（２０１２）１２：２５２−２６４）。

腫瘍は、特に腫瘍抗原に特異的なＴ細胞に対して、主要な免疫耐性機序として一定の免疫チェックポイント経路を盗用することが公知である。さらに、慢性ウイルス感染および癌などで生じる慢性抗原暴露によって免疫チェックポイント発現が持続され、それにより、同種抗原特異的Ｔ細胞の間で疲弊状態が誘導され得る（Ｐａｒｄｏｌｌ、（２０１２）前出）。

本発明の実施の際に、本発明者らは、ここに、ＣＤ８４の刺激が別のＳＬＡＭファミリーメンバーであるＳＬＡＭＦ１の発現を上方制御することを明らかにした（以下の実施例の部の実施例２〜３を参照のこと）。微小環境の間質細胞内などにおけるＳＬＡＭＦ１の下方制御は、ＣＬＬ細胞のアポトーシスを誘導する（以下の実施例の部の実施例４を参照のこと）。ＣＤ８４は、種々のＢ細胞悪性腫瘍（多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、および急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）が含まれる）においてＳＬＡＭＦ１発現を制御することを示した（以下の実施例の部の実施例６を参照のこと）。

重要なことに、本発明者らは、ＣＤ８４が、おそらくＳＬＡＭＦ１を介してＰＤ−Ｌ１の発現レベルを調節することを明らかにした（以下の実施例の部の実施例５および７を参照のこと）。ＰＤ−Ｌ１レベルは、ＣＤ８４の活性化後に上方制御され（以下の実施例の部の実施例７を参照のこと）、ＣＤ８４ノックアウトマウスにおいて有意に低下した（以下の実施例の部の実施例９を参照のこと）。ＰＤ−Ｌ１はその受容体ＰＤ−１に結合し、ここで、ＰＤ−１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのＴ細胞の公知のコインヒビターである。ＰＤ−１は、典型的には、Ｔ細胞上でＬａｇ−３およびＣＴＬＡ−４と同時発現し、これらは全て疲弊性Ｔ細胞のマーカーと見なされている。本発明者らは、ＰＤ−１、Ｌａｇ−３、およびＣＴＬＡ−４の各レベルがＣＤ８４欠損ＣＬＬモデルマウスにおいて有意に低下することをさらに示した（以下の実施例の部の実施例９を参照のこと）。さらに、ＩＬ−４レベルおよびＩＦＮ−γレベルの上昇が示すように、ＣＤ８４欠損ＣＬＬモデルマウスから採取したＴ細胞は、通常のＣＬＬマウス由来のＴ細胞と比較して機能性が増大した（以下の実施例の部の実施例９を参照のこと）。ＣＤ８４は、種々のＢ細胞悪性腫瘍（ＣＬＬ、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、およびＡＬＬが含まれる）においてＰＤ−Ｌ１発現を制御することを示した（以下の実施例の部の実施例１０〜１１を参照のこと）。

したがって、ＣＤ８４は、Ｔ細胞活性の阻害（例えば、Ｔ細胞上の疲弊表現型（例えば、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１の発現）を増強し、それにより、Ｔ細胞が悪性細胞を攻撃して死滅させる能力を低下させることによる）および悪性細胞のアポトーシスの低下（例えば、ＳＬＡＭＦ１の発現による）の両方による悪性細胞生存の増強で主な役割を果たす。まとめると、ＣＤ８４の活性または発現の下方制御を、ＣＤ８４誘導性生存経路を妨害し、且つ悪性細胞のアポトーシスおよび死滅を増強するための治療法として使用することができる。

本発明者らは、ＣＤ８４がＢｒｅｇ活性で役割を果たすことをｉｎ ｖｉｖｏでさらに示した。すなわち、ＣＤ８４発現によってＢｒｅｇアネルギーを生じ、それにより、自己免疫および炎症を媒介する。具体的には、本発明者らは、ＣＤ８４ノックアウトマウスにおいて、結腸炎の重症度が低いことを例証した（以下の実施例の部の実施例１２〜１４を参照のこと）。これらの結果は、急性結腸炎および慢性結腸炎の両方について類似していた（以下の実施例の部の実施例１２〜１３を参照のこと）。同様に、ＣＤ８４ノックアウトマウスにおけるＥＡＥはより軽度である（以下の実施例の部の実施例１５を参照のこと）。このより軽度の病徴に伴って、ＣＤ８４ノックアウト動物の脾臓ではＢ制御性細胞のレベルがより高かった（以下の実施例の部の実施例１４および１５を参照のこと）。まとめると、これらの結果は、制御性Ｂ細胞アネルギーにおけるＣＤ８４の新規の役割を示唆している。したがって、ＣＤ８４の活性または発現の下方制御を、Ｂｒｅｇの制御活性を増加させ、それにより、自己免疫および炎症状態の処置を増強するための治療法としてさらに使用することができる。

したがって、本発明の１つの態様によれば、Ｔ細胞疲弊の防止または逆行を必要とする被験体において、前述のＴ細胞疲弊を防止または逆行する方法であって、治療有効量のＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤を前述の被験体に投与し、但し、前述の被験体がＢ細胞悪性腫瘍と診断されておらず、それにより、前述の被験体における前述のＴ細胞疲弊を防止または逆行する、投与する工程を含む、方法を提供する。

本発明の別の態様によれば、Ｔ細胞疲弊の防止または逆行を必要とする被験体において、前述のＴ細胞疲弊を防止または逆行する方法であって、治療有効量のＳＬＡＭＦ１の活性または発現を減少させることができる薬剤を前述の被験体に投与し、但し、前述の薬剤がＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤ではないことを条件とし、それにより、前述の被験体における前述のＴ細胞疲弊を防止または逆行する、投与する工程を含む、方法を提供する。

本明細書中で使用される場合、用語「被験体」または「必要とする被験体」は、Ｔ細胞疲弊に関与する疾患または容態を有する任意の年齢の哺乳動物（例えば、ヒト被験体）の雄または雌をいう。

本明細書中で使用される場合、句「Ｔ細胞疲弊」または「疲弊したＴ細胞」は、典型的には慢性的な感染または癌の間に起こる持続的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達から生じるＴ細胞機能障害の状態をいう。Ｔ細胞疲弊は、不完全なシグナル伝達またはシグナル伝達の欠損からではなく、持続的なシグナル伝達から生じるという点で、アネルギーと区別される。Ｔ細胞疲弊は、Ｔ細胞のエフェクター機能の低下および抑制性受容体の持続的発現と定義される（「疲弊したＴ細胞表現型」ともいう）。疲弊は、外因性の負制御経路（例えば、免疫調節サイトカイン（ＩＬ−１０およびトランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β））、ＩＬ−３５など）および細胞内因性の負制御（共刺激）経路（例えば、ＰＤ−１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｌａｇ−３、ＣＴＬＡ−４、Ｔｉｍ−３）の両方に起因し得る。したがって、Ｔ細胞疲弊は、Ｔ細胞による感染および腫瘍の最適な調節を妨げる。

Ｔ細胞に関する場合の「機能障害の」という用語は、典型的には、抗原認識に対する不応答、具体的には、抗原認識を下流Ｔ細胞エフェクター機能（増殖、サイトカイン産生（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮγ）、および／または標的細胞の死滅など）に変換する能力の障害をいう。

本明細書中で使用される場合、用語「防止」は、疾患または容態（例えば、悪性疾患）に応答して発生すると予想されるＴ細胞疲弊の発生の延期および／または疲弊したＴ細胞の数の減少をいう。

本明細書中で使用される場合、用語「逆行」は、疲弊したＴ細胞のＴ細胞機能の再生、再活性化、修復、または増強をいう。

Ｔ細胞機能の増強の例には、介入前のレベルと比較したＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγおよび／またはＩＬ−４分泌の増加（抗原依存性または抗原非依存性）、増殖の増加、抗原応答性の増加（例えば、ウイルス、病原体、または腫瘍クリアランス）が含まれるが、これらに限定されない。

１つの実施形態によれば、Ｔ細胞機能は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、または２００％増強される。Ｔ細胞機能の強化の測定は当業者に公知であり、例えば、フローサイトメトリーアッセイ（ＦＡＣＳ）、ＥＬＩＳＡ、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）、ＥＬＩＳｐｏｔ、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）、ウイルス抑制アッセイ（ＶＳＡ）、細胞傷害性アッセイ、および増殖アッセイが含まれる。

１つの実施形態によれば、Ｔ細胞疲弊を、治療有効量のＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤を被験体に投与することによって防止または逆行する。

本明細書中で使用される場合、ＬＹ９ＢまたはＳＬＡＭＦ５としても公知の用語「ＣＤ８４」は、ＣＤ８４遺伝子の発現したイソ型をいう。例には、Ｑ９ＵＩＢ８−１、Ｑ９ＵＩＢ８−２、Ｑ９ＵＩＢ８−３、Ｑ９ＵＩＢ８−４、Ｑ９ＵＩＢ８−５、Ｑ９ＵＩＢ８−６、およびＱ９ＵＩＢ８−７が含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態によれば、ＣＤ８４はヒトＣＤ８４である。１つの実施形態によれば、ＣＤ８４は、受入番号ＮＰ＿００１１７１８０８．１、ＮＰ＿００１１７１８１０．１、ＮＰ＿００１１７１８１１．１、またはＮＰ＿００３８６５．１に記載されている。

本発明のこの態様の特定の実施形態によれば、ＣＤ８４の活性または発現の減少は、全てのＣＤ８４イソ型に関連する。この目的のために、ＣＤ８４の全てのイソ型（すなわち、汎ＣＤ８４）を認識する薬剤を使用する。

別の実施形態によれば、Ｔ細胞疲弊を、治療有効量のＳＬＡＭＦ１の活性または発現を減少させることができる薬剤を被験体に投与することによって防止または逆行させる。

本明細書中で使用される場合、ＳＬＡＭ、ＣＤ１５０、またはＣＤｗ１５０としても公知の用語「ＳＬＡＭＦ１」は、ＳＬＡＭＦ１遺伝子の発現されたイソ型をいう。例には、Ｑ１３２９１が含まれるが、これに限定されない。１つの実施形態によれば、ＳＬＡＭＦ１は、受入番号ＮＰ＿００３０２８．１に記載されている。

ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１を、ゲノムレベル（例えば、ＤＮＡ編集ツールを使用する）および／または転写物レベル（転写および／または翻訳を干渉する種々の分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング剤（例えば、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）、リボザイム、およびＤＮＡザイム）を使用する）、またはタンパク質レベル（例えば、アンタゴニスト、ポリペプチドを切断する酵素などを使用する）で下方制御することができる。

以下は、ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１の発現レベルおよび／または活性を下方制御することができる薬剤のリストである。

ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１を下方制御することができる薬剤の一例は、ＣＤＲ含有ポリペプチド（ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１に特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントなど）である。１つの特定の実施形態によれば、抗体は、ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１の細胞外部分の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合し、同種親和性相互作用の干渉などによってその活性を中和／遮断する。

本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ」は、抗体のパラトープが結合する抗原上の任意の抗原決定基をいう。

エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または炭水化物の側鎖などの分子の化学的に活性な表面群からなり、通常、特異的な三次元構造の特徴および特異的な電荷の特徴を有する。

本発明で使用される用語「抗体」には、インタクトな分子ならびにマクロファージに結合することができるその機能的フラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖなど）が含まれる。これらの機能的抗体フラグメントを以下のように定義する：（１）Ｆａｂ、抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含み、全抗体を酵素パパインで消化してインタクトな軽鎖および１本の重鎖の一部を得ることによって産生することができるフラグメント；（２）Ｆａｂ’、全抗体をペプシンで処置し、その後に還元してインタクトな軽鎖および重鎖の一部を生じることによって得ることができる抗体分子のフラグメント；１抗体分子あたり２つのＦａｂ’フラグメントが得られる；（３）（Ｆａｂ’）２、酵素ペプシンで全抗体を処置し、その後の還元を行わないことによって得ることができる抗体のフラグメント；Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって互いに保持された２つのＦａｂ’フラグメントの二量体である；（４）Ｆｖ、２つの鎖として発現した軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作されたフラグメントとして定義される；および（５）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）、遺伝的に融合された短鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された分子。

ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体ならびにこれらのフラグメントの産生方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。

本発明のいくつかの実施形態の抗体フラグメントを、抗体のタンパク質分解性加水分解によってまたはフラグメントをコードするＤＮＡの大腸菌もしくは哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養または他のタンパク質発現系）での発現によって調製することができる。抗体フラグメントを、従来の方法による全抗体のペプシン消化またはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体フラグメントを、抗体をペプシンで酵素的に切断してＦ（ａｂ’）２と呼ばれる５Ｓフラグメントを得ることによって産生することができる。このフラグメントを、チオール還元剤、および、任意選択的に、ジスルフィド結合の切断に起因するスルフヒドリル基のための保護基を使用してさらに切断して、３．５Ｓの一価のＦａｂ’フラグメントを産生することができる。あるいは、ペプシンを使用した酵素的切断によって２つの一価のＦａｂ’フラグメントおよび１つのＦｃフラグメントが直接産生される。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，０３６，９４５号明細書および同第４，３３１，６４７号明細書、ならびにこれらに含まれる引用文献（これらの特許は、その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９−１２６（１９５９））も参照のこと。フラグメントがインタクトな抗体によって認識される抗原に結合する限り、他の抗体切断方法（一価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝学的な技術など）も使用することができる。

Ｆｖフラグメントは、ＶＨ鎖とＶＬ鎖との会合を含む。Ｉｎｂａｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２６５９−６２（１９７２０）に記載のように、この会合は非共有結合性であり得る。あるいは、可変鎖を、分子間ジスルフィド結合によって連結するか、グルタルアルデヒドなどの化学物質によって架橋することができる。好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによって接続されたＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）を、オリゴヌクレオチドによって接続されたＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製する。構造遺伝子を発現ベクターに挿入し、その後に大腸菌などの宿主細胞に導入する。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを橋渡しするリンカーペプチドを使用して、単一のポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖの産生方法は、例えば、（Ｗｈｉｔｌｏｗ ａｎｄ Ｆｉｌｐｕｌａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２：９７−１０５（１９９１）；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６（１９８８）；Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１２７１−７７（１９９３）；および米国特許第４，９４６，７７８号明細書（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。

抗体フラグメントの別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）を、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。かかる遺伝子を、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって調製する。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ ａｎｄ Ｆｒｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ，２：１０６−１０（１９９１））を参照のこと。

非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、または非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合サブシーケンスなど）のキメラ分子である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種（マウス、ラット、またはウサギなど）のＣＤＲ由来の残基（ドナー抗体）と置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基を、対応する非ヒト残基と置換する。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体中や移入されるＣＤＲまたはフレームワーク配列中のいずれにも見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、実質的に全ての（少なくとも１つの、典型的には２つの）可変ドメインを含むであろう。前述の可変ドメインは、全てまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、全てまたは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含むであろう（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。

非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、１つまたは複数のアミノ酸残基に非ヒトの供給源由来のアミノ酸残基に導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基を、しばしば、移入残基といい、典型的には、移入可変ドメインから取る。本質的には、Ｗｉｎｔｅｒらの方法（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））にしたがって、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列を対応するヒト抗体配列の代わりに使用することによってヒト化することができる。したがって、かかるヒト化抗体は、実質的にインタクト未満のヒト可変ドメインを非ヒト種由来の対応配列と置換されているキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。実際に、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体中の類似の部位由来の残基と置換されたヒト抗体である。

ヒト抗体を、当該分野で公知の種々の技術（ファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））が含まれる）を使用して産生することもできる。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１））。同様に、ヒト抗体を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活化されているトランスジェニック動物（例えば、マウス）にヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによって作製することができる。チャレンジの際、ヒト抗体産生が認められ、この産生は、あらゆる点で（遺伝子の再構成、アセンブリ、および抗体レパートリーが含まれる）ヒトにおいて認められる産生に類似している。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書、および以下の科学刊行物に記載されている：Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８２６（１９９６）；およびＬｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３，６５−９３（１９９５）。

１つの実施形態によれば、抗体は、ＣＤ８４の細胞外部分の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合し、エピトープの同種親和性相互作用の干渉などによってエピトープの活性を中和／遮断する。

１つの実施形態によれば、ＣＤ８４に特異的に結合することができるＣＤＲ含有ポリペプチド（例えば、抗体）を、２００９年９月２３日に寄託番号ＣＮＣＭ Ｉ−４２２８（Ｆ８）でＣＮＣＮ Ｐａｓｔｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔに寄託されているハイブリドーマから産生することができる。本技術にしたがって使用することができるさらなる抗ＣＤ８４抗体は、国際公開第２０１０／０３５２５９号パンフレットおよび同第２０１５／１１８５３８号パンフレット（これらは共に本明細書中で参考として援用される）に教示されている。

さらにまたはあるいは、ＣＤ８４に特異的に結合することができるＣＤＲ含有ポリペプチド（例えば、抗体）は、例えば、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＯｒｉＧｅｎｅ、Ａｂｃａｍなどから市販されている。

１つの実施形態によれば、ＳＬＡＭＦ１に特異的に結合することができるＣＤＲ含有ポリペプチド（例えば、抗体）は、例えば、Ａｂｃａｍ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙなどから市販されている。

ＣＤ８４活性またはＳＬＡＭＦ１活性を下方制御するために使用することができる別の分子は、それぞれＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１に結合するが、ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１の同種親和性相互作用の阻害などによってＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１のシグナル伝達活性を阻害するＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１の非機能的形態である。

したがって、本教示は、可溶性のＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１（すなわち、非膜結合型）のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドをさらに提供し、ここで、可溶性のＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１は、細胞上に（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、間質細胞上に）発現されたＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１に、例えば、少なくとも１０^−５ｎＭの結合親和性でそれぞれ結合し、その同種親和性相互作用（すなわち、ある細胞の表面上の分子の、別の細胞の表面上の同一の分子への結合）を阻害する。

１つの特定の実施形態によれば、可溶性のＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１は、ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１の細胞外ドメインを含み、膜貫通ドメインを欠く。本教示にしたがって使用することができる例示的な可溶性ＣＤ８４ポリペプチドは、国際公開第２０１０／０３５２５９号パンフレット（本明細書中で参考として援用される）に教示されている。

１つの特定の実施形態によれば、可溶性のＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１は、可溶性のＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１の溶解性を増大させるための部分に融合している。

１つの特定の実施形態によれば、可溶性のＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１の溶解性を増大させるための部分は、異種アミノ酸配列またはＰＥＧなどの化学的部分などである。

本明細書中で使用される場合、句「異種アミノ酸配列」は、ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１のアミノ酸配列の一部を内因性に形成しないアミノ酸配列をいう。好ましくは、異種アミノ酸配列は、可溶性のＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１のポリペプチドの生物学的活性を下方制御しない。

ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１を、ＲＮＡサイレンシングによって下方制御することもできる。本明細書中で使用される場合、句「ＲＮＡサイレンシング」は、対応するタンパク質コード遺伝子の発現が阻害または「サイレンシング」されるＲＮＡ分子によって媒介される調節機構群（例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、転写遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、クエリング、相互抑制効果、および翻訳抑制）をいう。ＲＮＡサイレンシングは、多くのタイプの生物（植物、動物、および真菌が含まれる）で認められている。

本明細書中で使用される場合、用語「ＲＮＡサイレンシング剤」は、標的遺伝子の発現を特異的に阻害または「サイレンシング」することができるＲＮＡをいう。一定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、転写後サイレンシング機序によってｍＲＮＡ分子の完全なプロセシング（例えば、全翻訳および／または全発現）を防止することができる。ＲＮＡサイレンシング剤には、非コードＲＮＡ分子（例えば、対合鎖を含むＲＮＡ二重鎖）およびかかる小型の非コードＲＮＡを生成することができる前駆体ＲＮＡが含まれる。例示的なＲＮＡサイレンシング剤には、ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡなど）が含まれる。１つの実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、ＲＮＡ干渉を誘導することができる。別の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、翻訳抑制を媒介することができる。

本発明の１つの実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング剤は、標的ＲＮＡ（例えば、ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１）に特異的であり、且つ、標的遺伝子と９９％またはそれ未満の大域的相同性（例えば、標的遺伝子と９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％未満の大域的相同性）を示す遺伝子またはスプライスバリアントを交差して阻害またはサイレンシングしない。

ＲＮＡ干渉は、動物における短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって媒介される配列特異的転写後遺伝子サイレンシングプロセスをいう。植物における対応するプロセスを、一般に、転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングといい、真菌においてはクエリングともいう。転写後遺伝子サイレンシングプロセスは、外来遺伝子の発現を防止するために使用される進化的に保存された細胞防御機序であると考えられており、多様なフローラおよび門で共有されている。外来遺伝子発現からのかかる防御は、ウイルス感染または細胞応答を介した宿主ゲノムへのトランスポゾンエレメントの無作為な組み込みに由来する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の産生に応答して、相同な一本鎖ＲＮＡまたはウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊するように進化したのかもしれない。

細胞内の長鎖ｄｓＲＮＡの存在により、Ｄｉｃｅｒと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が刺激される。Ｄｉｃｅｒは、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として公知のｄｓＲＮＡの短片へのｄｓＲＮＡのプロセシングに関与する。Ｄｉｃｅｒ活性に由来する短干渉ＲＮＡは、典型的には、約２１〜約２３ヌクレオチド長であり、約１９塩基対の二重鎖を含む。ＲＮＡｉ応答はまた、一般にＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介するエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とする。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で起こる。

したがって、本発明のいくつかの実施形態は、ｍＲＮＡ由来のタンパク質発現を下方制御するためのｄｓＲＮＡの使用を意図する。

１つの実施形態によれば、ｄｓＲＮＡは、３０ｂｐを超える。長鎖ｄｓＲＮＡ（すなわち、３０ｂｐを超えるｄｓＲＮＡ）は、これらの二本鎖ＲＮＡのより長い領域はインターフェロン応答およびＰＫＲ応答を誘導するであろうと考えられるので、使用が非常に制限されている。しかし、長鎖ｄｓＲＮＡの使用は、細胞が最適なサイレンシング配列を選択することができ、それにより、多数のｓｉＲＮＡを試験する必要が軽減される；長鎖ｄｓＲＮＡはｓｉＲＮＡに必要なサイレンシングライブラリーよりも複雑でないサイレンシングライブラリーが可能であると考えられる；そしておそらく最も重要なことは、長鎖ｄｓＲＮＡは治療薬として使用した場合にウイルス回避変異を防止することができるという点で多数の利点を得ることができる。

種々の研究は、長鎖ｄｓＲＮＡを使用して、ストレス応答を誘導することや有意なオフターゲット効果を生じることなく、遺伝子発現をサイレンシングすることができることを実証している−例えば、（Ｓｔｒａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．１３ ３８０３−３８１０；Ｂｈａｒｇａｖａ Ａ ｅｔ ａｌ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００４；１３：１１５−１２５；Ｄｉａｌｌｏ Ｍ．， ｅｔ ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．２００３；１３：３８１−３９２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ Ｐ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００２；９９：１４４３−１４４８；Ｔｒａｎ Ｎ．， ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００４；５７３：１２７−１３４）を参照のこと。

特に、本発明は、そのいくつかの実施形態によれば、インターフェロン経路が活性化されない細胞（例えば、胚細胞および卵母細胞）内での遺伝子サイレンシングのための長鎖ｄｓＲＮＡ（３０塩基超の転写物）の導入を意図する。例えば、Ｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２００１，Ｖｏｌ ９８，ｐａｇｅｓ １４４２８−１４４３３およびＤｉａｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｏｃｔｏｂｅｒ １，２００３，１３（５）：３８１−３９２．ｄｏｉ：１０．１０８９／１５４５４５７０３３２２６１７０６９を参照のこと。

本発明は、いくつかの実施形態によれば、遺伝子発現の下方制御のためのインターフェロン経路およびＰＫＲ経路を誘導しないように特異的に設計された長鎖ｄｓＲＮＡの導入も意図する。例えば、Ｓｈｉｎａｇｗａ ａｎｄ Ｉｓｈｉｉ（Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．１７（１１）：１３４０−１３４５，２００３）は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）プロモーターから長鎖二本鎖ＲＮＡを発現するためのｐＤＥＣＡＰと命名されたベクターを開発した。ｐＤＥＣＡＰ由来の転写物が細胞質へのｄｓ−ＲＮＡの排出を容易にする５’−キャップ構造および３’−ポリ（Ａ）テールの両方を欠くので、ｐＤＥＣＡＰ由来の長鎖ｄｓ−ＲＮＡはインターフェロン応答を誘導しない。

哺乳動物系におけるインターフェロン経路およびＰＫＲ経路の別の回避方法は、トランスフェクションまたは内因性発現のいずれかを介した低分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の導入による。

用語「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する低分子阻害ＲＮＡ二重鎖（一般に、１８〜３０塩基対）をいう。典型的には、ｓｉＲＮＡは、中央に１９ｂｐの二重鎖領域、末端に対称性の２塩基３’オーバーハングを有する２１量体として化学合成されるが、２５〜３０塩基長の化学合成されたＲＮＡ二重鎖が２１量体と比較して同一の位置で１００倍もの効力を有し得ることが最近記載されている。ＲＮＡｉの誘発においてより長いＲＮＡを使用して認められた効力の増加は、生成物（２１量体）の代わりに基質（２７量体）をＤｉｃｅｒに提供し、これにより、ｓｉＲＮＡ二重鎖のＲＩＳＣへの侵入の速度および効率が改善されることに起因すると理論付けられる。

３’−オーバーハングの位置がｓｉＲＮＡの効力に影響を及ぼし、アンチセンス鎖上に３’−オーバーハングを有する非対称二重鎖が、一般に、センス鎖上に３’−オーバーハングを有する非対称二重鎖より効力が高いことが見出されている（Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ． ２００５）。アンチセンス転写物を標的にした場合に逆の有効性パターンが認められるので、これはＲＩＳＣへの非対称鎖の負荷に起因し得る。

二本鎖干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の鎖を接続して、ヘアピン構造またはステム−ループ構造（例えば、ｓｈＲＮＡ）を形成することができる。したがって、記載のように、本発明のいくつかの実施形態のＲＮＡサイレンシング剤はまた、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり得る。

用語「ｓｈＲＮＡ」は、本明細書中で使用される場合、相補配列の第１および第２の領域を含むステム−ループ構造を有するＲＮＡ剤であって、領域の相補性の程度および配向が領域間で塩基対合が起こるのに十分であり、第１および第２の領域がループ領域によって接合し、ループがループ領域内のヌクレオチド間（またはヌクレオチド類似体間）の塩基対合の欠如に起因する、ＲＮＡ剤をいう。ループ内のヌクレオチド数は、３〜２３、５〜１５、７〜１３、４〜９、または９〜１１（表記の数値を含む）である。ループ内のいくつかのヌクレオチドは、ループ内の他のヌクレオチドとの塩基対相互作用に関与し得る。ループを形成するために使用することができるオリゴヌクレオチド配列の例には、５’−ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ−３’（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０）および５’−ＵＵＵＧＵＧＵＡＧ−３’（Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２００２）ＲＮＡ ８：１４５４）が含まれる。得られた一本鎖オリゴヌクレオチドがＲＮＡｉ機序と相互作用することができる二本鎖領域を含むステム−ループ構造またはヘアピン構造を形成することが当業者に認識されるであろう。

本発明のいくつかの実施形態との使用に適切なＲＮＡサイレンシング剤を、以下のように合成することができる。第１に、ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１のｍＲＮＡ配列を、ＡＡジヌクレオチド配列のＡＵＧ開始コドンの下流側にスキャンする。ＡＡおよび３’隣接１９ヌクレオチドの各出現を、潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として記録する。非翻訳領域（ＵＴＲ）は調節タンパク質結合部位内でより豊富であるので、好ましくは、ｓｉＲＮＡ標的部位を、読み取り枠から選択する。ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体は、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合を干渉し得る（ＴｕｓｃｈｌＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５）。しかし、ＧＡＰＤＨについて、５’ＵＴＲに指向するｓｉＲＮＡが約９０％の細胞ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの減少を媒介し、タンパク質レベルを完全に消失させることが証明されたので、非翻訳領域に指向するｓｉＲＮＡも有効であり得ることが認識されるであろう（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｎ／９１／９１２．ｈｔｍｌ）。

第２に、任意の配列アラインメントソフトウェア（ＮＣＢＩサーバから利用可能なＢＬＡＳＴソフトウェア（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）など）を使用して、潜在的な標的部位を適切なゲノムデータベース（例えば、ヒト、マウス、ラットなど）と比較する。他のコード配列と有意な相同性を示す推定標的部位を除外する。

適格な標的配列を、ｓｉＲＮＡ合成のためのテンプレートとして選択する。Ｇ／Ｃ含量が５５％を超える配列と比較して遺伝子サイレンシングの媒介に有効であることが証明されているので、Ｇ／Ｃ含量が低い配列が好ましい。いくつかの標的部位を、評価する標的遺伝子の長さに沿って選択することが好ましい。選択したｓｉＲＮＡをより良好に評価するために、ネガティブコントロールを併用することが好ましい。ネガティブコントロールｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡとヌクレオチド組成が同一であるが、ゲノムとの相同性を欠くことが好ましい。したがって、任意の他の遺伝子といかなる有意な相同性も示さないことを条件として、ｓｉＲＮＡのスクランブルヌクレオチド配列を使用することが好ましい。

例えば、適切なＣＤ８４ ｓｉＲＮＡを、例えば、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｑｉａｇｅｎ、またはＯｒｉＧｅｎｅから購入することができる。適切なＳＬＡＭＦ１ ｓｉＲＮＡを、例えば、ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ、Ｑｉａｇｅｎｏｒ、ＯｒｉＧｅｎｅから購入することができる。

本発明のいくつかの実施形態のＲＮＡサイレンシング剤は、ＲＮＡのみを含む分子に制限される必要はないが、化学修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに含むと認識されるであろう。

いくつかの実施形態では、本明細書中に提供したＲＮＡサイレンシング剤を、細胞透過性ペプチドと機能的に会合することができる。本明細書中で使用される場合、「細胞透過性ペプチド」は、細胞の細胞質および／または核膜を通過する膜透過性複合体の輸送に関連するエネルギー非依存性（すなわち、非エンドサイトーシスの）移行性を付与する短い（約１２〜３０残基）アミノ酸配列または機能的モチーフを含むペプチドである。本発明のいくつかの実施形態の膜透過性複合体で使用される細胞透過性ペプチドは、好ましくは、遊離型であるか、ジスルフィド結合のために修飾されている二本鎖リボ核酸とジスルフィド結合を形成するように誘導体化されている少なくとも１つの非機能的システイン残基を含む。かかる性質を付与する代表的なアミノ酸モチーフは、米国特許第６，３４８，１８５号明細書（その内容が、本明細書中で参考として明確に援用される）に列挙されている。本発明のいくつかの実施形態の細胞透過性ペプチドには、好ましくは、ペネトラチン、トランスポータン、ｐＩｓｌ、ＴＡＴ（４８−６０）、ｐＶＥＣ、ＭＴＳ、およびＭＡＰが含まれるが、これらに限定されない。

ＲＮＡサイレンシング剤を使用してターゲティングされるべきｍＲＮＡには、その発現が望ましくない表現型形質と相関するｍＲＮＡが含まれるが、これに限定されない。ターゲティングされ得る例示的なｍＲＮＡは、短縮タンパク質をコードする（すなわち、欠損を含む）ｍＲＮＡである。したがって、本発明のいくつかの実施形態のＲＮＡサイレンシング剤を、いずれかの欠失側の橋渡し領域にターゲティングすることができる。かかるＲＮＡサイレンシング剤の細胞内への導入により、非変異タンパク質に影響を及ぼすことなく変異タンパク質が下方制御されるであろう。

別の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング剤は、ｍｉＲＮＡであり得る。用語「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」、および「ｍｉＲ」は、同義語であり、遺伝子発現を制御する約１９〜２８ヌクレオチド長の非コード一本鎖ＲＮＡ分子の集合体をいう。ｍｉＲＮＡは、広範な生物（ウイルス→ヒト）で見出されており、発生、ホメオスタシス、および疾患の病因学の各分野で役割を果たすことが示されている。

以下にｍｉＲＮＡ活性の機序を簡潔に記載する。

ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子が転写されて、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとして公知のｍｉＲＮＡ前駆体が産生される。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、典型的には、複数のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを含む多シストロン性ＲＮＡの一部である。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、ステムおよびループを有するヘアピンを形成し得る。ステムは、ミスマッチ塩基を含み得る。

ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡのヘアピン構造は、ＲＮアーゼＩＩＩエンドヌクレアーゼであるＤｒｏｓｈａによって認識される。Ｄｒｏｓｈａは、典型的には、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ内の末端ループを認識し、およそ２らせんターンをステムに切断して、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとして公知の６０〜７０ヌクレオチドの前駆体を産生する。Ｄｒｏｓｈａは、ＲＮアーゼＩＩＩエンドヌクレアーゼに特有の付着型切断を使用してｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを切断して、５’リン酸および約２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡステムループが得られる。Ｄｒｏｓｈａ切断部位を超えて及ぶステムのおよそ１つのらせんターン（約１０ヌクレオチド）は、効率的なプロセシングに不可欠であると推定される。次いで、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、Ｒａｎ−ＧＴＰおよび核外排出受容体Ｅｘ−ｐｏｒｔｉｎ−５によって核から細胞質に能動的に輸送される。

次いで、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの二本鎖ステムは、ＲＮアーゼＩＩＩエンドヌクレアーゼでもあるＤｉｃｅｒによって認識される。Ｄｉｃｅｒはまた、ステムループの塩基で５’リン酸および３’オーバーハングを認識することができる。次いで、Ｄｉｃｅｒは、ステムループの塩基から末端ループの２つのらせんターンを切断して除去して、さらなる５’リン酸および約２ヌクレオチドの３’オーバーハングが得られる。得られたｓｉＲＮＡ様二重鎖（ミスマッチを含み得る）は、成熟ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊として公知の類似サイズのフラグメントを含む。ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡおよびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの反対のアームに由来し得る。ｍｉＲＮＡ＊配列は、クローン化ｍｉＲＮＡライブラリー中に見出され得るが、典型的には、ｍｉＲＮＡより頻度が低い。

ｍｉＲＮＡは、最初はｍｉＲＮＡ＊との二本鎖種として存在するが、ｍｉＲＮＡは、最終的に、一本鎖ＲＮＡとして、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として公知のリボ核タンパク質複合体に組み合わされるようになる。種々のタンパク質がＲＩＳＣを形成することができ、それにより、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖に対する特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｔｙ）、標的遺伝子の結合部位、ｍｉＲＮＡの活性（抑制または活性化）を変動させることができ、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖の鎖がＲＩＳＣ内に負荷される。

ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二重鎖のｍｉＲＮＡ鎖がＲＩＳＣ内に負荷される場合、ｍｉＲＮＡ＊は除去および分解される。ＲＩＳＣ内に負荷されるｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二重鎖の鎖は、５’末端があまり強固に対合されていない鎖である。ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊の両末端がおおよそ等価な５’対合を有する場合、ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊の両方は、遺伝子サイレンシング活性を有し得る。

ＲＩＳＣは、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間の、特にｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜７による高レベルの相補性に基づいて標的核酸を同定する。

多くの研究によって翻訳を有効に阻害するためのｍｉＲＮＡとそのｍＲＮＡ標的との間の塩基対合要件が調査されている（Ｂａｒｔｅｌ ２００４，Ｃｅｌｌ １１６−２８１に概説）。哺乳動物細胞では、ｍｉＲＮＡの最初の８ヌクレオチドが重要であり得る（Ｄｏｅｎｃｈ＆Ｓｈａｒｐ ２００４ ＧｅｎｅｓＤｅｖ ２００４−５０４）。しかし、マイクロＲＮＡの他の部分もｍＲＮＡ結合に関与し得る。さらに、３’での塩基対合が十分であるので、５’での不十分な対合を埋め合わせることができる（Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００５ ＰＬｏＳ ３−ｅ８５）。全ゲノムに関するｍｉＲＮＡ結合を解析するコンピュータによる研究により、標的結合におけるｍｉＲＮＡの５’の塩基２〜７の特異的役割が示唆されたが、通常は「Ａ」であることが見出された第１のヌクレオチドの役割も認識された（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ． ２００５ Ｃｅｌｌ １２０−１５）。同様に、Ｋｒｅｋら（２００５，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３７−４９５）によって、ヌクレオチド１〜７または２〜８を使用して標的が同定および確証された。

ｍＲＮＡ内の標的部位は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、またはコード領域内に存在し得る。興味深いことに、複数のｍｉＲＮＡは、同一の部位または複数の部位を認識することによって同一のｍＲＮＡ標的を制御することができる。最も一般的に同定される標的内に複数のｍｉＲＮＡ結合部位が存在することは、複数のＲＩＳＣの共同作用が最も効率よく翻訳を阻害するということを示し得る。

ｍｉＲＮＡは、以下の２つの機序のうちのいずれかによって遺伝子発現を下方制御するようにＲＩＳＣに指示することができる：ｍＲＮＡの切断または翻訳抑制。ｍＲＮＡがｍｉＲＮＡに対して一定の程度の相補性を有する場合、ｍｉＲＮＡはｍＲＮＡの切断を特定することができる。ｍｉＲＮＡが切断を誘導する場合、典型的には、ｍｉＲＮＡの残基１０および１１へのヌクレオチド対合の間が切断される。あるいは、ｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡに対する必要な程度の相補性を持たない場合、ｍｉＲＮＡは翻訳を抑制することができる。動物はｍｉＲＮＡと結合部位との間の相補性がより低いかもしれないので、動物において翻訳抑制がより広く認められ得る。

ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊の任意の対の５’末端および３’末端が変動し得ることに注意すべきである。この変動は、切断部位に関するＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒの酵素プロセシングの変動に起因し得る。ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊の５’末端および３’末端の変動は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡおよびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのステム構造内のミスマッチに起因し得る。ステム鎖のミスマッチにより、異なるヘアピン構造集団が生じ得る。ステム構造の変動により、ＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒによる切断産物も変動し得る。

用語「マイクロＲＮＡ模倣物」は、ＲＮＡｉ経路に入って遺伝子発現を制御することができる合成非コードＲＮＡをいう。ｍｉＲＮＡ模倣物は、内因性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の機能を模倣し、成熟した二本鎖分子または模倣物前駆体（すなわち、例えば、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）として設計され得る。ｍｉＲＮＡ模倣物は、修飾または未修飾のＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、または代替核酸化学物質（例えば、ＬＮＡまたは２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ））から構成され得る。成熟した二本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物について、二重鎖領域の長さは、１３〜３３ヌクレオチド、１８〜２４ヌクレオチド、または２１〜２３ヌクレオチドの間で変動し得る。ｍｉＲＮＡはまた、合計で少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０ヌクレオチドを含み得る。ｍｉＲＮＡ配列は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの最初の１３〜３３ヌクレオチドであり得る。ｍｉＲＮＡ配列はまた、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの最後の１３〜３３ヌクレオチドであり得る。

本明細書中の上記に提供した説明から、ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１を発現する細胞のｍｉＲＮＡとの接触が、以下の多くの方法に影響を受け得ることが認識されるであろう：
１．ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１を発現する細胞の、成熟二本鎖ｍｉＲＮＡでの一過性トランスフェクション。
２．ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１を発現する細胞の、成熟ｍｉＲＮＡをコードする発現ベクターでの安定な、または一過性のトランスフェクション。
３．ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１を発現する細胞の、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡをコードする発現ベクターでの安定な、または一過性のトランスフェクション。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列は、４５〜９０、６０〜８０、または６０〜７０ヌクレオチドを含み得る。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列は、本明細書中に記載のｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊を含み得る。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列はまた、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの５’末端および３’末端由来の０〜１６０ヌクレオチドが排除されているｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列であり得る。
４．ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１を発現する細胞の、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡをコードする発現ベクターでの安定な、または一過性のトランスフェクション。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列は、４５〜３０，０００、５０〜２５，０００、１００〜２０，０００、１，０００〜１，５００、または８０〜１００ヌクレオチドを含み得る。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列は、本明細書中に記載のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡ＊、ならびにそのバリアントを含み得る。

ｍｉＲＮＡ模倣物を、化学合成法または組換え法によって調製することができる。

ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１を下方制御することができる別の薬剤は、それぞれＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１のｍＲＮＡ転写物またはＤＮＡ配列を特異的に切断することができるＤＮＡザイム分子である。ＤＮＡザイムは、一本鎖および二本鎖の標的配列の両方を切断することができる一本鎖ポリヌクレオチドである（Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｒ．Ｒ．ａｎｄ Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９５；２：６５５；Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．＆ Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９７；９４３：４２６２）。ＤＮＡザイムの一般的なモデル（「１０−２３」モデル）が提案されている。「１０−２３」ＤＮＡザイムは、それぞれ７〜９のデオキシリボヌクレオチドの２つの基質認識ドメインに隣接した１５のデオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを有する。このＤＮＡザイムタイプは、その基質ＲＮＡをプリン：ピリミジンジャンクションで有効に切断することができる（Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．＆ Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９；ＤＮＡザイムの概説については、Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ，ＬＭ（ＣｕｒｒＯｐｉｎＭｏｌＴｈｅｒ ４：１１９−２１（２００２））を参照のこと）。

一本鎖および二本鎖の標的切断部位を認識する操作された合成ＤＮＡザイムの構築および増幅の例は、Ｊｏｙｃｅらの米国特許第６，３２６，１７４号明細書に開示されている。ヒトウロキナーゼ受容体に指向する類似設計のＤＮＡザイムは、ウロキナーゼ受容体発現を阻害し、ｉｎ ｖｉｖｏでの結腸癌細胞転移を首尾よく阻害することが最近認められた（Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ａｂｓｔｒａｃｔ ４０９，Ａｎｎ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．ｗｗｗ．ａｓｇｔ．ｏｒｇ）。別の適用では、ｂｃｒ−ａｂ１癌遺伝子に相補的なＤＮＡザイムは、白血病細胞内の癌遺伝子発現の阻害ならびにＣＭＬおよびＡＬＬの場合の自家骨髄移植における再発率の低下に成功した。

ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１を、それぞれＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１をコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリッド形成することができるアンチセンスポリヌクレオチドの使用によって下方制御することもできる。

アンチセンスアプローチに重要な２つの態様を考慮しながら、ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１を効率的に下方制御するために使用することができるアンチセンス分子を設計しなければならない。第１の態様は、適切な細胞の細胞質内へのオリゴヌクレオチドの送達であり、第２の態様は、細胞内の設計したｍＲＮＡにその翻訳を阻害する方法で特異的に結合するオリゴヌクレオチドの設計である。

先行技術は、広範な種々の細胞型内にオリゴヌクレオチドを効率的に送達させるために使用することができる多数の送達ストラテジーを教示している（例えば、Ｌｕｆｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７６：７５−６（１９９８）；Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ ９１：８５２−６２（１９９８）；Ｒａｊｕｒ ｅｔ ａｌ． ＢｉｏｃｏｎｊｕｇＣｈｅｍ ８：９３５−４０（１９９７）；Ｌａｖｉｇｎｅ ｅｔ ａｌ． ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２３７：５６６−７１（１９９７）、およびＡｏｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２３１：５４０−５（１９９７）を参照のこと）。

さらに、標的ｍＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドの両方の構造変化のエネルギー論を説明する熱力学サイクルに基づいた、標的ｍＲＮＡに対する結合親和性が最も高いと予想される配列を同定するためのアルゴリズムも利用可能である（例えば、Ｗａｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ． ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ ６５：１−９（１９９９）を参照のこと）。

かかるアルゴリズムは、細胞におけるアンチセンスアプローチを実行するために首尾よく使用されている。例えば、Ｗａｌｔｏｎらが開発したアルゴリズムにより、科学者らは、ウサギβ−グロビン（ＲＢＧ）転写物およびマウス腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）転写物のアンチセンスオリゴヌクレオチドを首尾よく設計することができた。同研究グループは、最近になって、細胞培養における３つのモデル標的ｍＲＮＡ（ヒト乳酸デヒドロゲナーゼＡおよびＢならびにラットｇｐ１３０）に対する合理的に選択されたオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性が、動力学的ＰＣＲ技術によって評価したところ、ほとんど全ての場合（ホスホジエステルオリゴヌクレオチドおよびホスホロチオアートオリゴヌクレオチドの化学的性質を使用した２つの細胞型における３つの異なる標的に対する試験が含まれる）で有効であることが証明されたことを報告している。

さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系を使用した特異的オリゴヌクレオチドの設計およびその効率の予想のためのいくつかのアプローチも、公開された（Ｍａｔｖｅｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：１３７４−１３７５（１９９８））。

いくつかの臨床試験では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの安全性、実施可能性、および活性が証明された。例えば、癌の処置に適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドが首尾よく使用されており（Ｈｏｌｍｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，ＣｕｒｒＯｐｉｎＭｏｌＴｈｅｒ １：３７２−８５（１９９９））、一方で、ｃ−ｍｙｂ遺伝子、ｐ５３、およびＢｃｌ−２を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる血液学的悪性疾患の処置が臨床試験に入っており、患者で忍容性が認められたことが示されている（ＧｅｒｗｉｔｚＣｕｒｒＯｐｉｎＭｏｌＴｈｅｒ １：２９７−３０６（１９９９））。

最近になって、ヒトヘパラナーゼ遺伝子発現のアンチセンス媒介抑制が、マウスモデルにおいてヒト癌細胞の胸膜播種を阻害することが報告されている（Ｕｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１：７８５５−６０（２００１））。

したがって、上記のように精度の高いアンチセンス設計アルゴリズムおよび広範な種々のオリゴヌクレオチド送達系が生成されているアンチセンステクノロジー分野の最近の発展により、当業者は、過度に試行錯誤する実験に頼ることなく既知配列発現の下方制御に適切なアンチセンスアプローチを設計および実行することが可能であるというのが現在の統一見解である。

ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１を下方制御することができる別の薬剤は、ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１をそれぞれコードするｍＲＮＡ転写物を特異的に切断することができるリボザイム分子である。リボザイムは、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡの切断による遺伝子発現の配列特異的阻害のための使用が増加している（Ｗｅｌｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＣｕｒｒＯｐｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４８６−９６（１９９８））。任意の特異的な標的ＲＮＡを切断するようにリボザイムを設計することができるようになり、基礎研究および治療への応用における有益な手段となっている。治療領域では、リボザイムは、感染症におけるウイルスＲＮＡ、癌における優性癌遺伝子、および遺伝的障害における特異的体細胞変異を標的にするために活用されている（Ｗｅｌｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＣｌｉｎＤｉａｇｎＶｉｒｏｌ．１０：１６３−７１（１９９８））。最も注目すべきは、ＨＩＶ患者のためのいくつかのリボザイム遺伝子療法プロトコールは、既に第Ｉ相試験段階である。最近になって、リボザイムは、トランスジェニック動物研究、遺伝子標的の検証、および経路の解明のために使用されている。いくつかのリボザイムは、種々の臨床試験段階にある。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、ヒト臨床試験で研究されるために最初に合成されたリボザイムであった。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、ＶＥＧＦ−ｒ（血管内皮成長因子受容体）（血管形成経路における重要成分）の形成を特異的に阻害する。Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．および他の企業は、動物モデルにおいて抗血管形成治療薬の重要性を証明してきた。ＨＥＰＴＡＺＹＭＥ（Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを選択的に破壊するように設計されたリボザイム）は、細胞培養アッセイにおいてＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの減少に有効であることが見出された（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ウェブのホームページから援用）。

細胞内でＣＤ８４遺伝子またはＳＬＡＭＦ１遺伝子の発現を制御するさらなる方法は、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）を介する方法である。最近の研究において、配列特異的様式で二本鎖らせんＤＮＡ中のポリプリン／ポリピリミジン（ｐｏｌｙｐｉｒｉｍｉｄｉｎｅ）領域を認識して結合することができるＴＦＯを設計することができることが示された。これらの認識規則は、Ｍａｈｅｒ ＩＩＩ，Ｌ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９；２４５：７２５−７３０；Ｍｏｓｅｒ，Ｈ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７；２３８：６４５−６３０；Ｂｅａｌ，Ｐ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２；２５１：１３６０−１３６３；Ｃｏｏｎｅｙ，Ｍ．， ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８；２４１：４５６−４５９；およびＨｏｇａｎ，Ｍ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．，ＥＰ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ３７５４０８によって概説されている。オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｏｔｉｄｅ）の修飾（介入物の導入および骨格置換など）ならびに結合条件の最適化（ｐＨおよびカチオン濃度）は、ＴＦＯ活性の固有の障壁（電荷斥力およ安定性など）の克服に役立ち、最近、合成オリゴヌクレオチドが特異的配列を標的にすることができることが示された（最近の概説については、Ｓｅｉｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００３；１１２：４８７−９４を参照のこと）。

一般に、三重鎖形成性オリゴヌクレオチドは、以下の対応配列を有する：
オリゴ ３’−−Ａ Ｇ Ｇ Ｔ
二重鎖 ５’−−Ａ Ｇ Ｃ Ｔ
二重鎖 ３’−−Ｔ Ｃ Ｇ Ａ

しかし、Ａ−ＡＴおよびＧ−ＧＣトリプレットが最も高い三重らせん安定性を有することが示されている（Ｒｅｉｔｈｅｒ ａｎｄ Ｊｅｌｔｓｃｈ，ＢＭＣ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００２，Ｓｅｐｔ１２，Ｅｐｕｂ）。同一の著者は、Ａ−ＡＴおよびＧ−ＧＣ則にしたがって設計したＴＦＯが非特異的三重鎖を形成しないことを証明しており、このことは、三重鎖形成が実際に配列特異的であることを示している。

したがって、ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１の調節領域内の任意の所与の配列について、三重鎖形成性配列を考案することができる。三重鎖形成性オリゴヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも１５、より好ましくは２５、さらにより好ましくは３０またはそれを超えるヌクレオチド長（５０ｂｐまたは１００ｂｐまで）である。

（例えば、カチオン性リポソームを介した）ＴＦＯでの細胞のトランスフェクションおよび標的ＤＮＡを使用した三重らせん構造の形成により、立体および機能の変化、転写の開始および伸長の遮断が誘導され、それにより、内因性ＤＮＡに望ましい配列変化が起こり、それにより、遺伝子発現が特異的に下方制御される。ＴＦＯで処置した細胞内での遺伝子発現のかかる抑制の例には、哺乳動物細胞内でのエピソームｓｕｐＦＧ１遺伝子および内因性ＨＰＲＴ遺伝子のノックアウト（Ｖａｓｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９；２７：１１７６−８１およびＰｕｒｉ， ｅｔ ａｌ．，Ｊ ＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００１；２７６：２８９９１−９８）ならびにＥｔｓ２転写因子（前立腺癌病因学において重要）（Ｃａｒｂｏｎｅ， ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２００３；３１：８３３−４３）および炎症促進性ＩＣＡＭ−１遺伝子（Ｂｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００２；２７７：３２４７３−７９）の発現の配列特異的および標的特異的な下方制御が含まれる。さらに、Ｖｕｙｉｓｉｃｈ ａｎｄ Ｂｅａｌは、最近、配列特異的ＴＦＯが、ｄｓＲＮＡに結合し、ｄｓＲＮＡ依存性酵素（ＲＮＡ依存性キナーゼなど）の活性を阻害し得ることを示した（Ｖｕｙｉｓｉｃｈ ａｎｄ Ｂｅａｌ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０００；２８：２３６９−７４）。

さらに、前述の原理にしたがって設計されたＴＦＯは、ＤＮＡを修復することができる特異的変異誘発を誘導し得、したがって、内在性遺伝子の発現の下方制御と上方制御の両方をもたらす（Ｓｅｉｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００３；１１２：４８７−９４）。有効なＴＦＯの設計、合成、および投与の詳細な記載は、Ｆｒｏｅｈｌｅｒらの米国特許出願公開第２００３０１７０６８号明細書および同第２００３００９６９８０号明細書、ならびにＥｍａｎｕｅｌｅらの同第２００２０１２８２１８号明細書および同第２００２０１２３４７６号明細書、ならびにＬａｗｎの米国特許第５，７２１，１３８号明細書に見出すことができる。

ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１を、遺伝子構造の機能喪失変化に関与する標的変異（例えば、点変異、欠失、および挿入）の導入を介して遺伝子（例えば、それぞれ、ＣＤ８４遺伝子またはＳＬＡＭＦ１遺伝子）を不活化することによって下方制御することもできる。

本明細書中で使用される場合、句「機能喪失変化」は、発現した産物（すなわち、ｍＲＮＡ転写物および／または翻訳されたタンパク質）の発現レベルおよび／または活性を下方制御する遺伝子（例えば、ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１）のＤＮＡ配列の任意の変異をいう。かかる機能喪失変化の非限定的な例には、ミスセンス変異（すなわち、タンパク質中のあるアミノ酸残基を別のアミノ酸残基と交換し、それにより、タンパク質の酵素活性が消失する変異）；ナンセンス変異（すなわち、タンパク質中の終止コドン（例えば、酵素活性を欠くより短いタンパク質を生じさせる初期終止コドン）を導入する変異；フレームシフト変異（すなわち、タンパク質の二次構造または三次構造に影響を及ぼし、それにより、非変異ポリペプチドの酵素活性を欠く非機能性タンパク質が生じる、終止コドンを読み枠（例えば、酵素活性を欠く短縮タンパク質）またはより長いアミノ酸配列（例えば、リードスルータンパク質）に導入することによってタンパク質の読み枠が変化し、それにより、早期に終止し得る核酸の変異（通常は、欠失または挿入））；酵素活性が消失したフレームシフト変異または修飾終止コドン変異に起因するリードスルー変異（すなわち、終止コドンがアミノ酸コドンに変異する場合）；プロモーター変異（すなわち、特異的遺伝子産物が下方制御される、通常は遺伝子の転写開始部位に対して５’側のプロモーター配列の変異）；制御変異（すなわち、遺伝子産物の発現に影響を及ぼす、遺伝子の上流もしくは下流または遺伝子内の領域の変異）；欠失変異（すなわち、遺伝子配列内のコード核酸が欠失し、フレームシフト変異またはインフレーム変異（コード配列内の１つまたは複数のアミノ酸コドンの欠失）が起こり得る変異；挿入変異（すなわち、遺伝子配列内にコード核酸または非コード核酸が挿入され、それにより、１つまたは複数のアミノ酸コドンのフレームシフト変異またはインフレームシフトが起こり得る変異）；逆位（すなわち、コード配列または非コード配列が逆になる変異）；スプライス変異（すなわち、異常なスプライシングまたは不十分なスプライシングが生じる変異）；および重複変異（すなわち、インフレームであり得るか、フレームシフトを生じ得る、重複したコード配列または非コード配列が生じる変異）が含まれる。

特定の実施形態によれば、遺伝子の機能喪失変化は、遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子を含み得る。

本明細書中で使用される用語「対立遺伝子」は、１つまたは複数の遺伝子座の別の形態のうちのいずれかをいい、全ての対立遺伝子が形質または特徴に関連する。二倍体細胞または二倍体生物では、所与の遺伝子の２つの対立遺伝子は、相同染色体対上の対応する遺伝子座を占める。

他の特定の実施形態によれば、遺伝子の機能喪失変化は、遺伝子の両方の対立遺伝子を含む。かかる例では、例えば、ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１は、ホモ接合体またはヘテロ接合体であり得る。この実施形態によれば、ホモ接合性は、例えば、ＣＤ８４遺伝子座またはＳＬＡＭＦ１遺伝子座の両方の対立遺伝子が同一のヌクレオチド配列によって特徴づけられる条件である。ヘテロ接合性は、例えば、ＣＤ８４遺伝子座またはＳＬＡＭＦ１遺伝子座の遺伝子の異なる条件をいう。

目的の遺伝子に核酸の変化を導入する方法は、当該分野で周知であり（例えば、Ｍｅｎｋｅ Ｄ．Ｇｅｎｅｓｉｓ（２０１３）５１：−６１８；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：１２８８−１２９２；Ｓａｎｔｉａｇｏ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ ＡｃａｄＳｃｉ ＵＳＡ（２００８）１０５：５８０９−５８１４；国際公開第２０１４０８５５９３号パンフレット、同第２００９０７１３３４号パンフレット、および同第２０１１１４６１２１号パンフレット；米国特許第８７７１９４５号明細書、同第８５８６５２６号明細書、同第６７７４２７９号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号明細書、同第２００５００２６１５７号明細書、同第２００６００１４２６４号明細書（それらの内容全体が参考として援用される）を参照のこと）、この方法には、標的相同組換え、部位特異的リコンビナーゼ、ＰＢトランスポザーゼ、および操作されたヌクレアーゼによるゲノム編集が含まれる。目的の遺伝子に核酸の変化を導入するための薬剤を、公的に利用可能な情報源から設計するか、Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ、Ａｄｄｇｅｎｅ、およびＳａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入することができる。

目的の遺伝子に核酸の変化を導入するために使用される種々の例示的な方法および本発明の特定の実施形態にしたがって使用することができる前述の方法を実施するための薬剤を以下に説明する。

操作されたエンドヌクレアーゼを使用したゲノム編集−このアプローチは、人為的に操作されたヌクレアーゼを使用した逆遺伝学法であって、ゲノムの所望の位置で切断して特異的な二本鎖の分解物を作製し、次いで、細胞内プロセス（相同組換え修復（ＨＤＳ）および非相同末端結合（ＮＦｆＥＪ）など）によって修復される、逆遺伝学法をいう。ＮＦｆＥＪは、二本鎖分解物中のＤＮＡ末端を直接接合する一方で、ＨＤＲは、分解点で喪失したＤＮＡ配列を再生するためのテンプレートとして相同配列を利用する。ゲノムＤＮＡに特異的ヌクレオチド修飾を導入するために、所望の配列を含むＤＮＡ修復テンプレートがＨＤＲ中に存在しなければならない。伝統的な制限エンドヌクレアーゼを使用してゲノム編集を行うことができない。何故なら、ほとんどの制限酵素が標的としてＤＮＡ上の数塩基対を認識し、認識された塩基対の組み合わせがゲノム全域の多数の位置で見出される可能性が非常に高く、それにより、所望の位置に制限されない多数の切断物が生じるからである。この課題を克服し、部位特異的な一本鎖または二本鎖の分解物を作製するために、これまでにいくつかの異なるヌクレアーゼクラスが発見されており、生物工学によって作製されている。これらのヌクレアーゼには、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が含まれる。

メガヌクレアーゼ−メガヌクレアーゼは、一般に、以下の４つのファミリーに分類される：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓｂｏｘファミリー、およびＨＮＨファミリー。これらのファミリーは、触媒活性および認識配列に影響を及ぼす構造モチーフによって特徴づけられる。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメンバーは、保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの１つまたは２つのコピーを有することによって特徴づけられる。メガヌクレアーゼの４つのファミリーは、保存された構造エレメント、したがって、ＤＮＡ認識配列の特異性および触媒活性に関して相互に大きく異なる。メガヌクレアーゼは、一般に、微生物種で認められ、非常に長い認識配列（＞１４ｂｐ）を有するという固有の性質を有し、したがって、必然的に所望の位置での切断に非常に特異的となる。これを、ゲノム編集において部位特異的な二本鎖分解物を作製するために活用することができる。当業者は、これらの天然に存在するメガヌクレアーゼを使用することができるが、かかる天然に存在するメガヌクレアーゼの数は限られている。この課題を克服するために、変異誘発および高処理スクリーニング法を使用して、固有の配列を認識するメガヌクレアーゼバリアントを作製している。例えば、種々のメガヌクレアーゼを融合して、新規の配列を認識するハイブリッド酵素を作製している。あるいは、メガヌクレアーゼのＤＮＡ相互作用アミノ酸を、配列特異的メガヌクレアーゼを設計するように変更することができる（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号明細書を参照のこと）。メガヌクレアーゼを、例えば、Ｃｅｒｔｏ，ＭＴ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１２）９：０７３−９７５；米国特許第８，３０４，２２２号明細書；同第８，０２１，８６７号明細書；同第８，１１９，３８１号明細書；同第８，１２４，３６９号明細書；同第８，１２９，１３４号明細書；同第８，１３３，６９７号明細書；同第８，１４３，０１５号明細書；同第８，１４３，０１６号明細書；同第８，１４８，０９８号明細書；または同第８，１６３，５１４号明細書（それぞれの内容全体が本明細書中で参考として援用される）に記載の方法を使用して設計することができる。あるいは、配列特異的切断特性を有するメガヌクレアーゼを、市販の技術（例えば、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ’ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒ（商標）ゲノム編集テクノロジー）を使用して得ることができる。

ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ−２つの異なる操作ヌクレオチドクラスであるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は共に、標的二本鎖分解物の産生で有効であることが証明されている（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｍａｈｆｏｕｚ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

基本的に、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの制限エンドヌクレアーゼテクノロジーは、特異的ＤＮＡ結合ドメイン（それぞれ、一連のジンクフィンガードメインまたはＴＡＬＥ反復のいずれか）に連結した非特異的ＤＮＡ切断酵素を利用する。典型的には、ＤＮＡの認識部位および切断部位が相互に離れている制限酵素を選択する。切断部分を分離し、次いで、ＤＮＡ結合ドメインに連結し、それにより、所望の配列に対する特異性が非常に高いエンドヌクレアーゼが得られる。かかる性質を有する例示的な制限酵素はＦｏｋｌである。さらに、Ｆｏｋｌは、ヌクレアーゼ活性を有するために二量体化が必要であるという利点を有し、これは、各ヌクレアーゼパートナーが固有のＤＮＡ配列を認識するので、特異性が劇的に増加することを意味する。この効果を増強するために、Ｆｏｋｌヌクレアーゼを、ヘテロ二量体としてのみ機能することができるように操作し、触媒活性が増大した。ヘテロ二量体として機能するヌクレアーゼは、望ましくないホモ二量体活性の可能性を回避し、したがって、二本鎖分解物の特異性が増加する。

したがって、例えば、特異的部位を標的にするために、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮをヌクレアーゼ対として構築し、対の各メンバーを標的部位で隣接配列に結合するように設計する。細胞内での一過性発現の際、ヌクレアーゼはその標的部位に結合し、ＦｏｋＩドメインがヘテロ二量体化して二本鎖分解物を作製する。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介したこれらの二本鎖分解物の修復により、小さな欠失または小さな配列挿入が最も頻繁に起こる。ＮＨＥＪによる各修復が固有のものであるので、単一のヌクレアーゼ対を使用すると、標的部位である範囲の異なる欠失を有する一連の対立遺伝子を産生することができる。欠失は、典型的には、数塩基対長から数百塩基対長までの程度の範囲に及ぶが、細胞培養において２対のヌクレアーゼを同時に使用することによってより大きな欠失の生成に成功している（Ｃａｒｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。さらに、標的領域と相同するＤＮＡのフラグメントをヌクレアーゼ対と併せて導入する場合、相同組換え修復を介して二本鎖分解物を修復して、特異的に修飾することができる（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００５）。

ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの両方のヌクレアーゼ部分が類似する性質を有するにもかかわらず、これらの操作されたヌクレアーゼの間の相違は、これらのＤＮＡ認識ペプチドにある。ＺＦＮはＣｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーに依存し、ＴＡＬＥＮはＴＡＬＥに依存する。これらのＤＮＡ認識ペプチドドメインの両方は、天然にはそのタンパク質中に組み合わせて見出されるという特徴を有する。Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーは、典型的には、３ｂｐ離れて反復して認められ、種々の核酸相互作用タンパク質中に多様な組み合わせで見出される。ＴＡＬＥは、他方では、アミノ酸と認識されたヌクレオチド対との間で認識比１：１にて反復して見出される。ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥの両方は反復パターンで生じるので、広範な種々の配列特異性を作出するために異なる組み合わせを試すことができる。部位特異的ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼの作製アプローチには、特に、例えば、モジュールアセンブリ（必要な配列を対象とするためにトリプレット配列と相関するジンクフィンガーを一列に並べて付着させる）、ＯＰＥＮ（ペプチドドメイン対トリプレットヌクレオチドの厳密性の低い選択、その後の細菌系内でのペプチドの組み合わせ対最終標的の厳密性の高い選択）、およびジンクフィンガーライブラリーの細菌ワンハイブリッドスクリーニングなどが含まれる。ＺＦＮを、例えば、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から有料で設計して入手することもできる。

ＴＡＬＥＮを設計して得る方法は、例えば、Ｒｅｙｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１２ Ｍａｙ；３０（５）：４６０−５；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１１）２９：１４３−１４８；Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１１）３９（１２）：ｅ８２、およびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１１）２９（２）：１４９−５３に記載されている。Ｍｏｊｏ Ｈａｎｄと命名された最近開発されたウェブベースのプログラムを、ゲノム編集に応用するためのＴＡＬ構築物およびＴＡＬＥＮ構築物を設計するために、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃが導入した（ｗｗｗ．ｔａｌｅｎｄｅｓｉｇｎ．ｏｒｇからアクセスすることができる）。ＴＡＬＥＮを、例えば、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から有料で設計して入手することもできる。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系−多くの細菌および古細菌は、侵入してきたファージおよびプラスミドの核酸を分解することができる内因性のＲＮＡ系適応免疫系を含む。これらの系は、ＲＮＡ構成要素を産生するクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）遺伝子およびタンパク質構成要素をコードするＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子からなる。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、特定のウイルスおよびプラスミドに相補的な短いストレッチを含み、対応する病原体の相補核酸を分解するようにＣａｓヌクレアーゼに指示するガイドとして作用する。化膿性連鎖球菌のタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の研究で、以下の３つの構成要素がＲＮＡ／タンパク質複合体を形成し、共に配列特異的ヌクレアーゼ活性に十分であることが示された：Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、標的配列に相同な２０塩基対を含むｃｒＲＮＡ、およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３７：８１６−８２１）。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の融合物から構成される合成キメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｃｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ標的を切断するようにＣａｓ９に指示することができることがさらに証明された。種々の異なる種において合成ｇＲＮＡと併せてＣａｓ９の一過性発現を使用して標的二本鎖分解物を産生することができることも証明された（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１３；Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３；ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３ａ，ｂ；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

ゲノム編集のためのＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ系は、以下の２つの異なる構成要素を含む：ｇＲＮＡおよびエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）。

ｇＲＮＡは、典型的には、１つのキメラ転写物中の標的相同配列（ｃｒＲＮＡ）とｃｒＲＮＡをＣａｓ９ヌクレアーゼに連結させた内因性細菌ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との組み合わせをコードする２０ヌクレオチド配列である。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は、ｇＲＮＡ配列と相補ゲノムＤＮＡとの間の塩基対合によって標的配列に配置される。Ｃａｓ９の結合を成功させるために、ゲノム標的配列は、標的配列の直後に正確なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列も含まなければならない。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の結合により、Ｃａｓ９が両方のＤＮＡ鎖を切断して二本鎖分解物を生じることができるように、Ｃａｓ９がゲノム標的配列に局在化される。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと同様に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによって産生された二本鎖分解物は、相同組換えまたはＮＨＥＪを経ることができる。

Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、以下の２つの機能的ドメインを有する：ＲｕｖＣおよびＨＮＨ（それぞれ異なるＤＮＡ鎖を切断する）。これらの両ドメインが活性である場合、Ｃａｓ９はゲノムＤＮＡ中に二本鎖分解物を生じさせる。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの有意な利点は、この系の高い効率と合成ｇＲＮＡを容易に作製する能力が組み合わせられると、複数の遺伝子を同時に標的にすることができるという点である。さらに、この変異を保有する細胞の多くは、標的遺伝子中に２対立遺伝子変異が存在する。

しかし、ｇＲＮＡ配列とゲノムＤＮＡ標的配列との間の塩基対合相互作用が明らかに柔軟であることにより、Ｃａｓ９によって切断されるべき標的配列との適合が不完全になる。

単一の不活性触媒ドメイン（ＲｕｖＣ−またはＨＮＨ−のいずれか）を含むＣａｓ９酵素の改変バージョンを、「ニッカーゼ」と呼ぶ。１つのヌクレアーゼドメインしか持たないので、Ｃａｓ９ニッカーゼは、標的ＤＮＡの１つの鎖のみを切断し、それにより、一本鎖の分解物、すなわち「ニック」を作製する。一本鎖分解物（すなわち、ニック）は、通常は、テンプレートとしてインタクトな相補ＤＮＡ鎖を使用して、ＨＤＲ経路を介して迅速に修復される。しかし、Ｃａｓ９ニッカーゼによって導入された２つの近位の反対の鎖のニックは、二本鎖分解物として処理され、これは、しばしば「ダブルニック」ＣＲＩＳＰＲシステムという。ダブルニックを、遺伝子標的に対してどのような効果を望むかに依存してＮＨＥＪまたはＨＤＲのいずれかによって修復することができる。したがって、特異性およびオフターゲット効果の低下が重要である場合、ゲノムＤＮＡに近接する標的配列およびゲノムＤＮＡの逆鎖上の標的配列を使用して２つのｇＲＮＡを設計することによってダブルニックを作製するためのＣａｓ９ニッカーゼを使用することにより、いずれかのｇＲＮＡのみではゲノムＤＮＡを変化させないニックが得られるので、オフターゲット効果が低減するであろう。

２つの不活性な触媒ドメインを含むＣａｓ９酵素の改変バージョン（デッドＣａｓ９、すなわちｄＣａｓ９）は、ヌクレアーゼ活性を持たない一方で、依然としてｇＲＮＡ特性に基づいてＤＮＡに結合することができる。ｄＣａｓ９を、既知の制御ドメインへの不活性酵素の融合によって遺伝子発現を活性化するか抑制するためのＤＮＡ転写制御因子のプラットフォームとして利用することができる。例えば、ゲノムＤＮＡ中の標的配列へのｄＣａｓ９のみの結合により、遺伝子転写を干渉することができる。

標的配列を選択および／または設計するのに役立つ公的に利用可能なツールならびにバイオインフォマティクスによって決定された異なる種内の異なる遺伝子の固有のｇＲＮＡのリストが多数存在する（Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇ研究室のＴａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂｏｕｔｒｏｓ研究室のＴａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ（Ｅ−ＣＲＩＳＰ）、ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓ：Ｃａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒ、ＣａｓＦｉｎｄｅｒ：ゲノム内の特異的Ｃａｓ９標的を同定するためのＦｌｅｘｉｂｌｅアルゴリズム、およびＣＲＩＳＰＲ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒなど）。

ＣＲＩＳＰＲシステムを使用するために、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９の両方を標的細胞内で発現させなければならない。挿入ベクターは、単一のプラスミド上の両カセットを含むことができるか、カセットを、２つの個別のプラスミドから発現させる。ＣＲＩＳＰＲプラスミドは、市販されている（Ａｄｄｇｅｎｅのｐｘ３３０プラスミドなど）。

「ヒット・アンド・ラン」または「イン・アウト］は、２工程組換え手順を含む。第１の工程では、二重ポジティブ／ネガティブ選択マーカーカセットを含む挿入型ベクターを使用して、所望の配列変化を導入する。挿入ベクターは、標的遺伝子座に相同な単一の連続領域を含み、目的の変異を保有するように改変されている。このターゲティング構築物を、制限酵素を用いて相同領域内の１つの部位で線状化し、細胞内にエレクトロポレートし、ポジティブ選択を行って相同組換え体を単離する。これらの相同組換え体は、選択カセットを含むベクター配列の介在によって分離される局所重複を含む。第２の工程では、標的にされたクローンをネガティブ選択に供して、重複配列間の染色体内組換えによって選択カセットを喪失した細胞を同定する。局所組換え事象により重複が除去され、組換え部位に応じて、対立遺伝子が、変異が導入されたままであるか、野生型に復帰する。最終的に、いかなる外因性配列を保持することなく所望の改変が導入される。

「二重置換」または「タグ・アンド・エクスチェンジ」ストラテジーは、ヒット・アンド・ランアプローチに類似しているが、２つの異なるターゲティング構築物を使用する必要がある２工程選択手順を含む。第１の工程では、３’および５’の相同アームを有する標準的なターゲティングベクターを使用して、ミスマッチが導入されるべき位置の付近に二重ポジティブ／ネガティブ選択カセットを挿入する。エレクトロポレーションおよびポジティブ選択の後、相同的に標的にされたクローンを同定する。次に、所望の変異を有する相同領域を含む第２のターゲティングベクターを、標的にされたクローン内にエレクトロポレートし、ネガティブ選択を適用して選択カセットを除去し、変異を導入する。最終対立遺伝子は、望ましくない外因性配列を排除しながら所望の変異を含む。

部位特異的リコンビナーゼ−Ｐ１バクテリオファージに由来するＣｒｅリコンビナーゼおよび出芽酵母に由来するＦｌｐリコンビナーゼは、それぞれが固有の３４塩基対ＤＮＡ配列（それぞれ、「Ｌｏｘ」および「ＦＲＴ」と名付けられている）を認識する部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼであり、Ｌｏｘ部位またはＦＲＴ部位のいずれかに隣接する配列を、ＣｒｅリコンビナーゼまたはＦｌｐリコンビナーゼのそれぞれの発現の際に部位特異的組換えを介して容易に除去することができる。例えば、Ｌｏｘ配列は、１３塩基対の逆方向反復に隣接した非対称の８塩基対スペーサー領域から構成される。Ｃｒｅは、１３塩基対の逆方向反復への結合ならびにスペーサー領域内の鎖の切断および再ライゲーションの触媒によって３４塩基対のｌｏｘＤＮＡ配列を組換える。スペーサー領域内のＣｒｅによって作製された付着型ＤＮＡ切断物を、６塩基対で分離することにより、確実に同一の重複領域を有する組換え部位のみを組換えることを確認するための相同性センサーとして作用する重複領域が得られる。

基本的に、部位特異的リコンビナーゼ系は、相同組換え後の選択カセットを除去する手段を提供する。この系はまた、一過性様式または組織特異的様式で不活化または活性化することができる条件で変化する対立遺伝子の生成が可能である。注目すべきは、ＣｒｅリコンビナーゼおよびＦｌｐリコンビナーゼは、３４塩基対のＬｏｘまたはＦＲＴの「傷跡」を残すことである。残存するＬｏｘ部位またはＦＲＴ部位は、典型的には、改変された遺伝子座のイントロンまたは３’ＵＴＲに置き去りにされ、最新のエビデンスでは、これらの部位が通常は遺伝子機能を有意に干渉しないことを示唆している。

したがって、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ組換えおよびＦｌｐ／ＦＲＴ組換えは、目的の変異、２つのＬｏｘ配列またはＦＲＴ配列、および、典型的には、２つのＬｏｘ配列またはＦＲＴ配列の間に配置された選択カセットを含む３’および５’の相同アームを有するターゲティングベクターの導入を含む。ポジティブ選択を適用し、標的にされた変異を含む相同組換え体を同定する。ネガティブ選択と併せたＣｒｅまたはＦｌｐの一過性発現により、選択カセットを切り出し、カセットを喪失した細胞を選択する。最終的な標的にされた対立遺伝子は、外因性配列のＬｏｘまたはＦＲＴの傷跡を含む。

トランスポザーゼ−本明細書中で使用される場合、用語「トランスポザーゼ」は、トランスポゾンの末端に結合し、トランスポゾンのゲノムの別の部分への移動を触媒する酵素をいう。

本明細書中で使用される場合、用語「トランスポゾン」は、単一の細胞のゲノム内の異なる位置に動き回ることができるヌクレオチド配列を含む可動遺伝子エレメントをいう。このプロセスでは、トランスポゾンは、細胞のゲノム内のＤＮＡを変異させ、そして／またはＤＮＡ量を変化させることができる。

細胞（例えば、脊椎動物）内を移行することもできる多数のトランスポゾン系が単離または設計されている（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（Ｉｚｓｖaｋ ａｎｄ Ｉｖｉｃｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００４）９，１４７−１５６）、ｐｉｇｇｙＢａｃ（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００７）１５，１３９−１４５）、Ｔｏｌ２（Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ（２０００）９７（２１）：１１４０３−１１４０８）、またはＦｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ（Ｍｉｓｋｅｙ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡＣｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｄｅｃ １，（２００３）３１（２３）：６８７３−６８８１）など）。一般に、ＤＮＡトランスポゾンは、簡潔なカット・アンド・ペースト様式で、あるＤＮＡ部位から別のＤＮＡ部位に移行する。これらの各エレメントは、独自の利点を有しており、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙは、領域特異的変異誘発で特に有用であるのに対して、Ｔｏｌ２は発現された遺伝子に取り込まれる傾向が最も高い。機能亢進系に、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙおよびｐｉｇｇｙＢａｃを利用可能である。最も重要には、これらのトランスポゾンは、異なる標的部位優先度を有しており、したがって、重複しているが、異なる遺伝子組に配列変化を導入することができる。したがって、考えられる最大の遺伝子範囲を達成するために、１つを超えるエレメントを使用することが特に好ましい。異なるトランスポザーゼ間で基本的機序は共通であり、したがって、ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）を一例として記載している。

ＰＢは、イラクサキンウワバガ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）から最初に単離された２．５ｋｂの昆虫トランスポゾンである。ＰＢトランスポゾンは、トランスポザーゼ（ＰＢアーゼ）に隣接する非対称の末端反復配列からなる。ＰＢアーゼは、末端反復を認識し、「カット・アンド・ペースト」ベースの機序を介して移行を誘導し、宿主ゲノム内のテトラヌクレオチド配列ＴＴＡＡに優先的に移行する。挿入の際、ＴＴＡＡ標的部位は、ＰＢトランスポゾンがこのテトラヌクレオチド配列に隣接するように重複する。移動する場合、典型的にはＰＢ自体が正確に切除されて単一のＴＴＡＡ部位を再確立し、それにより、宿主配列がそのプレトランスポゾン状態に修復される。切除後、ＰＢは新規の位置に移行することができるか、ゲノムから永久に失われ得る。

典型的には、トランスポザーゼ系は、Ｃｒｅ／ＬｏｘまたはＦｌｐ／ＦＲＴを使用する場合と類似する、相同組換え終了後に選択カセットを除去する別の方法を提供する。したがって、例えば、ＰＢトランスポザーゼ系は、目的の変異、内因性ＴＴＡＡ配列部位の２つのＰＢ末端反復配列、ならびにＰＢ末端反復配列の間に配置された選択カセットを含む３’および５’の相同アームを有するターゲティングベクターの導入を含む。ポジティブ選択を適用し、標的にされた変異を含む相同組換え体を同定する。ネガティブ選択と併せたＰＢアーゼの一過性発現による除去により、選択カセットを切り出し、カセットを喪失した細胞を選択する。最終的な標的にされた対立遺伝子は、外因性配列を持たない変異が導入される。

ＰＢを配列変化の導入に有用にするために、特定の変異が挿入される位置から比較的近位に未変性のＴＴＡＡ部位が存在しなければならない。

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）プラットフォームを使用したゲノム編集−このゲノム編集プラットフォームは、哺乳動物生細胞のゲノム内にＤＮＡ配列を挿入、欠失、または置換することが可能なｒＡＡＶベクターに基づく。ｒＡＡＶゲノムは、ポジティブセンスまたはネガティブセンスのいずれかで約４．７ｋｂ長の一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）分子である。これらの一本鎖ＤＮＡウイルスベクターは、形質導入率が高く、ゲノム内の二本鎖ＤＮＡ分解物の非存在下で内因性相同組換えを刺激するという固有の性質を有する。当業者は、所望のゲノム遺伝子座を標的にし、細胞内の内因性遺伝子を全体的および／または微細に変化させるためのｒＡＡＶベクターを設計することができる。ｒＡＡＶゲノム編集は、単一の対立遺伝子を標的にし、いかなるオフターゲットゲノム変化を生じないという点で有利である。ｒＡＡＶゲノム編集テクノロジーは、市販されている（例えば、Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）のｒＡＡＶ ＧＥＮＥＳＩＳ（商標）システム）。

薬剤がランダム変異を引き起こす変異原であり得、ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１の発現レベルおよび／または活性を下方制御する細胞を選択することができると認識されるであろう。

変異原は、遺伝因子、化学薬品、または照射物であり得るが、これらに限定されない。例えば、変異原は、電離放射線（紫外線、γ線、またはα粒子などであるが、これらに限定されない）であり得る。他の変異原には、コピーエラーを生じ得る塩基類似体；脱アミノ化剤（亜硝酸など）；挿入剤（臭化エチジウムなど）；アルキル化剤（ブロモウラシルなど）；トランスポゾン；天然および合成のアルカロイド；臭素およびその誘導体；アジ化ナトリウム；ソラレン（例えば、紫外放射線との組み合わせ）が含まれ得るが、これらに限定されない。変異原は、化学変異原（ＩＣＲ１９１、１，２，７，８−ジエポキシ−オクタン（ＤＥＯ）、５−ａｚａＣ、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、またはエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）などであるが、これらに限定されない）であり得る。

有効性を認定し、配列変化を検出する方法は、当該分野で周知であり、ＤＮＡ配列決定、電気泳動、酵素ベースのミスマッチ検出アッセイ、およびハイブリッド形成アッセイ（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリッド形成、プライマー伸長、サザンブロット、ノーザンブロット、およびドットブロット分析など）が含まれるが、これらに限定されない。

特定の遺伝子の配列変化を、例えば、クロマトグラフィ、電気泳動法、免疫検出アッセイ（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット分析など）、および免疫組織化学を使用して、タンパク質レベルで検出することもできる。

さらに、当業者は、構築物を使用した相同組換え事象を経た形質転換細胞を効率的に選択するためのポジティブおよび／またはネガティブ選択マーカーを含むノックイン／ノックアウト構築物を容易に設計することができる。ポジティブ選択は、外来ＤＮＡを取り込んだクローン集団を富化する手段を提供する。かかるポジティブマーカーの非限定的な例には、グルタミンシンターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、抗生物質耐性を付与するマーカー（ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、およびブラストサイジンＳの耐性カセットなど）が含まれる。ネガティブ選択マーカーは、マーカー配列（例えば、ポジティブマーカー）の無作為な取り込みおよび／または排除に対して選択する必要がある。かかるネガティブマーカーの非限定的な例には、ガンシクロビル（ＧＣＶ）を細胞傷害性ヌクレオシド類似体に変換する単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ａｄｅｎｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＡＲＰＴ）が含まれる。

ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１を下方制御するために本発明のいくつかの実施形態と共に使用することができる別の薬剤は、ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１の活性化または基質結合を防止する分子である。

１つの実施形態によれば、使用される薬剤がＳＬＡＭＦ１の活性または発現を減少させることができる薬剤である場合、薬剤は、ＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤ではない。

１つの実施形態によれば、被験体は悪性疾患と診断されている。

１つの実施形態によれば、被験体は、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染症（例えば、ウイルス性疾患）と診断されている。

本明細書中で使用される場合、用語「診断された」、「診断（ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）」、または「診断（ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ）」は、病理（例えば、悪性腫瘍）の分類をいう。

１つの実施形態によれば、被験体を処置することができる。

したがって、別の態様によれば、Ｔ細胞疲弊に関与する悪性疾患の処置を必要とする被験体において、前述の疾患を処置する方法であって、治療有効量のＳＬＡＭＦ１の活性または発現を減少させることができる薬剤を前述の被験体に投与する工程を含む、方法を提供する。

別の態様によれば、Ｔ細胞疲弊に関与する悪性疾患の処置を必要とする被験体において、前述の疾患を処置するための治療有効量のＳＬＡＭＦ１の活性または発現を減少させることができる薬剤の使用であって、但し、前述の薬剤がＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤ではないことを条件とする、使用を提供する。

別の態様によれば、Ｔ細胞疲弊に関与する悪性疾患の処置を必要とする被験体において、前述の疾患を処置する方法であって、但し、前述の悪性疾患がＢ細胞悪性腫瘍ではないことを条件とし、治療有効量のＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤を前述の被験体に投与する工程を含む、方法を提供する。

別の態様によれば、Ｔ細胞疲弊に関与する悪性疾患の処置を必要とする被験体において、前述の疾患を処置するための治療有効量のＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤の使用であって、但し、前述の悪性疾患がＢ細胞悪性腫瘍ではないことを条件とする、使用を提供する。

本明細書中で使用される場合、用語「処置」には、容態の進行の抑止、実質的な阻害、遅延、または逆行、容態の臨床症状もしくは審美的症状の実質的な回復、または容態の臨床症状もしくは審美的症状の外観の実質的な防止が含まれる。

１つの実施形態によれば、疾患に関連する１つまたは複数の症状が緩和されるか排除される場合、個体は首尾よく「処置される」。処置には、癌細胞の増殖の減少（または癌細胞の破壊）、疾患に起因する症状の減少、罹患個体の生活の質の向上、疾患を処置するために必要な他の医薬の用量の減少、疾患進行の遅延、および／または個体の延命が含まれるが、これらに限定されない。

処置を、特定の疾患または容態を評価するための当該分野で公知の任意の方法を使用して（例えば、血液検査、超音波、ＣＴスキャン、ＭＲＩなどを使用して）評価することができ、当業者はかかる方法を決定することができる。

本明細書中で使用される場合、用語「悪性疾患」または「癌」は、任意の癌性疾患をいう。癌細胞は、無制限の増殖、特殊化機能の喪失、不死、有意な転移能、抗アポトーシス活性の有意な増加、迅速な成長速度および増殖速度、ならびに一定の特徴的な形態および細胞マーカーなどの表現型に関連し得る。特定の実施形態によれば、癌はＴ細胞の疲弊を含む。

いくつかの環境下で、癌細胞は腫瘍の形態であろう。かかる細胞は、動物内に局所的に存在することができ（例えば、固形腫瘍）、あるいは、癌細胞は、独立した細胞（例えば、白血病細胞（非固形腫瘍）として血流中を循環することができるか、体内全体に分散し得る（例えば、転移）。本明細書中で使用される癌という用語は、任意の病期および任意の形態の全てのタイプの癌を含むと認識されるであろう。

本発明のいくつかの実施形態の方法による診断または処置を実現可能な悪性疾患のタイプには、良性腫瘍、疣贅、ポリープ、前癌状態、および悪性腫瘍／癌が含まれる。

本発明の方法を使用して処置することができる癌性疾患の具体例には、胃腸管の腫瘍（結腸癌、直腸癌腫、直腸結腸癌、結腸直腸癌、結腸直腸腺腫、遺伝性非ポリポーシスタイプ１、遺伝性非ポリポーシスタイプ２、遺伝性非ポリポーシスタイプ３、遺伝性非ポリポーシスタイプ６；結腸直腸癌、遺伝性非ポリポーシスタイプ７、小腸および／または大腸癌腫、食道癌、食道癌を伴う肥厚化、胃癌腫、膵癌、膵内分泌腫瘍）、子宮内膜癌、隆起性皮膚線維肉腫、胆嚢癌、胆道腫瘍、前立腺癌、前立腺腺癌、腎癌（例えば、ウィルムス腫瘍タイプ２またはタイプ１）、肝臓癌（例えば、肝芽腫、肝細胞癌腫、肝細胞癌）、膀胱癌、胎児性横紋筋肉腫、胚細胞腫瘍、絨毛性腫瘍、精巣生殖細胞腫瘍、卵巣、子宮、卵巣上皮の未分化奇形腫、仙尾骨腫瘍、絨毛癌、胎盤性絨毛腫瘍、成人上皮性腫瘍、卵巣癌、漿液性卵巣癌、卵巣性性索腫瘍、子宮頸癌腫、子宮頸部癌腫、小細胞性肺癌および非小細胞性肺癌、鼻咽頭癌腫、乳房癌腫（例えば、乳管癌、浸潤性乳管内癌、散発性乳癌；乳癌、乳癌感受性、タイプ４乳癌、乳癌−１、乳癌−３；乳癌−卵巣癌）、扁平上皮癌（例えば、頭頸部）、神経原性腫瘍、星状細胞腫、神経節芽細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、腺癌、副腎腫瘍、遺伝性副腎皮質癌、悪性脳腫瘍（腫瘍）、種々の他の癌腫（例えば、気管支原性大細胞、腺管癌、エールリッヒ・レットル腹水癌腫、類表皮癌腫、大細胞癌腫、ルイス肺癌腫、髄様癌、粘膜類表皮癌、燕麦細胞癌、小細胞癌、紡錘細胞癌、有棘細胞癌、移行上皮細胞癌、未分化癌、癌肉腫、絨毛癌、嚢胞腺癌）、上衣芽腫、上皮腫、赤白血病（例えば、フレンド赤白血病、リンパ芽球性赤白血病）、線維肉腫、巨細胞腫、グリア腫瘍、膠芽細胞腫（例えば、多形膠芽細胞腫、星状細胞腫）、神経膠腫 ヘパトーム、ヘテロハイブリドーマ、ヘテロミエローマ、組織球腫、ハイブリドーマ（例えば、Ｂ細胞）、副腎腫、インスリノーマ、膵島腫瘍、角化腫、平滑筋芽細胞腫、平滑筋肉腫、白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性プレＢ細胞白血病、急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、急性巨核芽球性白血病、単球性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄球性白血病、好酸球増加症を伴う急性骨髄球性白血病、Ｂ細胞白血病、好塩基球性白血病、慢性骨髄白血病、慢性白血病、Ｂ細胞白血病、好酸球性白血病、フレンド白血病、顆粒球性白血病、または骨髄球性白血病、毛様細胞性白血病、リンパ球性白血病、巨核芽球性白血病、単球性白血病、単球−マクロファージ性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、形質細胞性白血病、プレＢ細胞性白血病、前骨髄球性白血病、亜急性Ｔ細胞、リンパ系新生物、骨髄性悪性腫瘍素因、急性非リンパ急性白血病）、リンパ肉腫、リンパ腫（例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、組織球性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、Ｔ細胞性リンパ腫、胸腺リンパ腫）、黒色腫、乳腺腫瘍、肥満細胞腫、髄芽腫、中皮腫、転移性腫瘍、単球腫瘍、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄腫、腎芽腫、神経組織グリア腫瘍、神経組織神経細胞腫、神経鞘腫、神経芽細胞腫、乏突起膠腫、骨軟骨腫、オステオミエローマ、骨肉腫（例えば、ユーイング骨肉腫）、乳頭腫、移行細胞、クロム親和性細胞腫、下垂体腫瘍（浸潤性）、プラズマ細胞腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫（例えば、ユーイング肉腫、組織球性細胞肉腫、イエンセン肉腫、骨原性肉腫、細網肉腫）、シュワン細胞腫、皮下腫瘍、奇形癌腫（例えば、多能性）、テラトーマ、精巣腫瘍、胸腺腫および毛包上皮腫、胃がん、線維肉腫、多形性膠芽細胞腫；多発性グロムス腫瘍、リー・フラウメニ症候群、脂肪肉腫、リンチ癌ファミリー症候群ＩＩ、雄胚細胞腫瘍、肥満細胞性白血病、甲状腺髄様癌、多発性髄膜腫、内分泌新形成 粘液肉腫、傍神経節腫、家族性非クロム親和性、毛母腫、乳頭状、家族性および散発性、ラブドイド素因症候群、家族性ラブドイド腫瘍、軟部組織肉腫、および膠芽細胞腫を伴うターコット症候群が含まれるが、これらに限定されない。

前癌状態は、当該分野で十分に特徴づけられており、周知である（例えば、Ｂｅｒｍａｎ ＪＪ．ａｎｄ Ｈｅｎｓｏｎ ＤＥ．，２００３．Ｃｌａｓｓｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｅｃａｎｃｅｒｓ：ａ ｍｅｔａｄａｔａ ａｐｐｒｏａｃｈ．ＢＭＣ Ｍｅｄ Ｉｎｆｏｒｍ ＤｅｃｉｓＭａｋ．３：８を参照のこと）。本発明の方法によって処置可能な前癌状態のクラスには、後天性の小型または顕微鏡性の前癌状態、核異型を有する後天性の大きな病変、癌に進行する遺伝子性過形成症候群を併発する前駆病変、ならびに後天性のびまん性過形成およびびまん性異形成が含まれる。小型または顕微鏡性の前癌状態の例には、ＨＧＳＩＬ（子宮頸部の上皮内高度扁平上皮異型）、ＡＩＮ（肛門上皮内新形成）、声帯の形成異常、（結腸の）異常陰窩、ＰＩＮ（前立腺上皮内腫瘍）が含まれる。核異型を有する後天性の大きな病変の例には、管状腺腫、ＡＩＬＤ（異蛋白血症を伴う血管免疫芽球性リンパ節症）、非定型髄膜腫、胃ポリープ、大局面型類乾癬、脊髄形成異常、上皮内乳頭性移行上皮癌、過剰な芽球を伴う不応性貧血、およびシュナイダー乳頭腫が含まれる。癌に進行する遺伝子性過形成症候群を併発する前駆病変の例には、非定型黒子症候群、Ｃ細胞腺癌症、およびＭＥＡが含まれる。後天性のびまん性過形成およびびまん性異形成の例には、ＡＩＤＳ、非定型リンパ組織過形成、骨のパジェット病、移植後リンパ増殖性疾患、および潰瘍性大腸炎が含まれる。

１つの実施形態によれば、癌は、Ｔ細胞疲弊を誘導する癌である。

１つの実施形態によれば、癌は、固形腫瘍を含む。

例えば、固形腫瘍（癌）は、副腎皮質癌、肛門癌、膀胱癌、脳腫瘍、神経膠腫、乳房癌腫、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、肝外胆管癌、ユーイング腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、眼球の癌、胆嚢癌、胃がん、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、頭頸部癌、下咽頭癌、島細胞癌、腎臓癌、喉頭癌、口唇口腔癌、肝臓癌、肺癌、黒色腫、中皮腫、メルケル細胞癌、転移性扁平上皮頭頸部癌、骨髄腫、鼻咽喉癌、神経芽細胞腫、口腔がん、口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、副鼻腔および鼻腔の癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、前立腺癌、横紋筋肉腫、直腸癌、腎細胞癌、唾液腺癌、皮膚癌、軟部組織肉腫、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、膣癌、外陰癌、またはウィルムス腫瘍であり得る。

さらなる実施形態によれば、癌は、肝臓癌（例えば、肝細胞癌腫）、肺癌（例えば、肺癌腫（非小細胞性肺癌および肺腺癌など））、乳癌（例えば、乳房癌腫（乳腺癌など））、結腸癌（例えば、直腸結腸癌、結腸腺癌）、腎癌（例えば、腎細胞癌）、前立腺癌、卵巣癌、頭頸部癌、線維肉腫、子宮頸部癌、食道癌、直腸癌、口腔癌、および膵臓癌からなる群から選択される固形腫瘍である。

１つの特定の実施形態によれば、腫瘍は、転移性固形腫瘍（例えば、転移性癌細胞によって形成される）である。

１つの実施形態によれば、悪性疾患は、造血性癌である。

１つの実施形態によれば、悪性疾患は、Ｔ細胞悪性腫瘍または骨髄性悪性腫瘍である。

例示的なＴ細胞悪性疾患には、前駆Ｔ−リンパ芽球性リンパ腫／白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラー細胞／Ｔ細胞リンパ腫（鼻型）、腸疾患関連腸管Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、および不特定末梢Ｔ細胞リンパ腫が含まれるが、これらに限定されない。

例示的な骨髄性悪性疾患には、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄球性白血病、急性骨髄球性白血病、成人急性骨髄球性白血病、小児急性骨髄球性白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、ならびに好酸球増加症およびＰＤＧＦＲ−Ａもしくは−Ｂ、もしくはＦＧＦＲ１の異常に関連する骨髄性新生物が含まれるが、これらに限定されない。

１つの実施形態によれば、悪性疾患は、Ｂ細胞悪性腫瘍ではない（例えば、ＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤を被験体に投与する場合）。

１つの実施形態によれば、悪性疾患は、Ｂ細胞悪性腫瘍である（例えば、ＳＬＡＭＦ１の活性または発現を減少させることができる薬剤を被験体に投与する場合）。

本明細書中で使用される場合、用語「Ｂ細胞悪性腫瘍」は、任意のサブタイプまたは分化段階のＢリンパ球（例えば、早期プレＢ細胞、プレＢ細胞、成熟Ｂ細胞、形質細胞）を含む造血組織またはリンパ系組織の悪性腫瘍をいう。

１つの実施形態によれば、Ｂ細胞悪性腫瘍は、リンパ腫、白血病、または骨髄腫を含む。

かかる疾患には、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）／慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫−粘膜関連リンパ系組織リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、毛様細胞白血病、原発性中枢神経系リンパ腫、脾性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、リンパ球形質細胞性リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、急性リンパ球性白血病（急性リンパ芽球性白血病またはＡＬＬとしても公知）、急性リンパ芽球性プレＢ細胞白血病、形質細胞性白血病、プレＢ細胞白血病（例えば、プレＢ ＡＬＬ）、早期プレＢ細胞ＡＬＬ（例えば、早期プレＢ ＡＬＬ）、またはプレＢ急性リンパ芽球様白血病が含まれるが、これらに限定されない。

１つの実施形態によれば、Ｂ細胞悪性腫瘍はＣＬＬである。

本明細書中で使用される場合、用語「Ｂ−ＣＬＬ」または「ＣＬＬ」は、Ｂ細胞の異常な新生物増殖をいう。ＣＬＬは、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）（主にリンパ節に存在する非ホジキンリンパ腫の１つのタイプ）と呼ばれる疾患と同一であると考えられる。世界保健機関は、ＣＬＬおよびＳＬＬは同一疾患の異なる病期を示すと見なしている（Ｃｈｉｏｒａｚｚｉ Ｎ，Ｒａｉ ＫＲ，Ｆｅｒｒａｒｉｎｉ Ｍ（２００５）．“Ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ” Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５２（８）：８０４−１５）。

本発明の方法を、Ｔ細胞の疲弊に関与する他の疾患の処置のために実施することができる。かかる疾患には、例えば、免疫関連疾患（自己免疫疾患、炎症性疾患、および感染症（例えば、未解決の急性感染症および慢性感染症）が含まれる）が含まれる。

前述のように、本発明者らは、ＣＤ８４がＢｒｅｇ活性で役割を果たすことをさらに明らかにした。具体的には、本発明者らは、ＣＤ８４発現の非存在下で、免疫応答の負の制御因子として公知のＢ制御性細胞の活性およびレベルが顕著に増加することを明らかにした。したがって、Ｂ制御性細胞の非存在下で、自己免疫および炎症が顕著に減少する。したがって、本発明の方法を、Ｂ制御性細胞が関与する疾患（自己免疫疾患、炎症性疾患、および感染症が含まれる）の処置のためにさらに実施することができる。

本発明の別の態様によれば、自己免疫疾患または炎症性疾患の処置を必要とする被験体において、前述の疾患を処置する方法であって、治療有効量のＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤を被験体に投与し、それにより、前述の被験体における自己免疫疾患または炎症性疾患を処置する、投与する工程を含む、方法を提供する。

本発明の別の態様によれば、自己免疫疾患または炎症性疾患の処置を必要とする被験体において、前述の疾患を処置するための治療有効量のＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤の使用を提供する。

本発明の別の態様によれば、Ｂ制御性細胞の活性またはレベルの上昇を必要とする被験体において、前述の活性またはレベルを上昇させる方法であって、治療有効量のＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤を被験体に投与し、それにより、前述の被験体における前述のＢ制御性細胞の活性またはレベルが上昇する、投与する工程を含む、方法を提供する。

用語「Ｂ制御性細胞」または「Ｂｒｅｇ」は、免疫応答を抑制するＢ細胞をいう。Ｂｒｅｇは、Ｔ細胞活性化を抑制することができ（直接または間接的）、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、他の先天免疫細胞、または他のＢ細胞も抑制することができる。Ｂｒｅｇは、任意のＢ細胞マーカー（ＣＤ１９、ＣＤ１ｄ、ＣＤ５、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、またはＴ細胞 免疫グロブリンムチン−１（ＴＩＭ−１）が含まれるが、これらに限定されない）を発現することができる。Ｂｒｅｇは、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ−１、および／またはＩＬ−３５を分泌することもできる。

１つの実施形態によれば、Ｂ制御性細胞の活性またはレベルは、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、または２００％増強される。Ｂ細胞レベルの増強の測定方法は、当業者に公知であり、例えば、フローサイトメトリーアッセイ（ＦＡＣＳ）が含まれる。同様に、Ｂ細胞機能の増強の測定方法は、当業者に公知であり、例えば、フローサイトメトリーアッセイ（ＦＡＣＳ）、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳｐｏｔ、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）、および増殖アッセイが含まれる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｂ制御性細胞の活性またはレベルの上昇は、脾臓内のＢ制御性細胞レベルの増加によって示される。

本発明の特定の実施形態によれば、Ｂ制御性細胞の活性またはレベルの上昇は、Ｂ１０Ｂ制御性細胞の増加に関連する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｂ制御性細胞の活性またはレベルの上昇は、Ｂ制御性細胞による抗炎症性サイトカイン産生の増加によって示される。例示的な抗炎症性サイトカインには、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ−１、およびＩＬ−３５が含まれるが、これらに限定されない。

本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｂ制御性細胞の活性またはレベルの上昇は、Ｂｒｅｇマーカー発現の増加に関連する。例示的なＢｒｅｇマーカーには、ＣＤ１９、ＣＤ１ｄ、ＣＤ５、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、および／またはＴＩＭ−１が含まれるが、これらに限定されない。

例示的な感染症には、慢性感染症、亜急性感染症、急性感染症、ウイルス性疾患、細菌性疾患、原生動物性疾患、寄生虫病、真菌性疾患、マイコプラズマ性疾患、およびプリオン病が含まれるが、これらに限定されない。

１つの実施形態によれば、Ｔ細胞の疲弊に関連する疾患は、ウイルス感染を含む。

１つの実施形態によれば、Ｔ細胞の疲弊に関連する疾患は、慢性ウイルス感染を含む。

例示的なウイルス感染には、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、フレンド白血病ウイルス、マウス肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、エボラウイルス、およびデングウイルスに起因する感染が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の方法によって処置することができる例示的な自己免疫疾患には、心血管疾患、リウマチ様疾患、腺疾患、胃腸疾患、皮膚疾患、肝疾患、神経学的疾患、筋疾患、腎疾患、生殖に関連する疾患、結合組織病、および全身性疾患が含まれるが、これらに限定されない。

自己免疫性心血管疾患の例には、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、血栓症、ウェゲナー肉芽腫症、高安動脈炎、川崎症候群、抗第ＶＩＩＩ因子自己免疫疾患、壊死性小血管脈管炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、微量免疫型巣状壊死性糸球体腎炎および半月体形成性糸球体腎炎、抗リン脂質症候群、抗体誘導性心不全、血小板減少性紫斑、自己免疫性溶血性貧血、シャーガス病における心自己免疫、および抗ヘルパーＴリンパ球自己免疫が含まれるが、これらに限定されない。

自己免疫性リウマチ様疾患の例には、関節リウマチおよび強直性脊椎炎が含まれるが、これらに限定されない。

自己免疫性腺疾患の例には、膵臓疾患、Ｉ型糖尿病、甲状腺疾患、グレーブス病、甲状腺炎、自発性自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺炎、特発性粘液水腫、卵巣自己免疫、自己免疫性抗精子不妊症、自己免疫性前立腺炎、およびタイプＩ多腺性自己免疫症候群が含まれるが、これらに限定されない。疾患には、膵臓の自己免疫疾患、１型糖尿病、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病、自発性自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺炎、特発性粘液水腫、卵巣自己免疫、自己免疫性抗精子不妊症、自己免疫性前立腺炎、およびタイプＩ多腺性自己免疫症候群が含まれるが、これらに限定されない。

自己免疫性胃腸疾患の例には、慢性炎症性腸疾患、セリアック病、結腸炎、回腸炎、およびクローン病が含まれるが、これらに限定されない。

自己免疫性皮膚疾患の例には、自己免疫性水疱性皮膚疾患（尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、および落葉状天疱瘡などであるが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。

自己免疫性肝疾患の例には、肝炎、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、および自己免疫性肝炎が含まれるが、これらに限定されない。

自己免疫性神経学的疾患の例には、多発性硬化症、アルツハイマー病、重症筋無力症、ニューロパシー、運動ニューロパシー、ギラン・バレー症候群および自己免疫性ニューロパシー、筋無力症、ランバート・イートン筋無力症候群、腫瘍随伴性神経学的疾患、小脳萎縮、傍腫瘍性小脳萎縮および全身強直症候群、非傍腫瘍性スティッフマン症候群、進行性小脳萎縮、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症、シデナム舞踏病（Ｓｙｄｅｈａｍ ｃｈｏｒｅａ）、ジルドラトゥレット症候群および自己免疫性多腺性内分泌症、異常免疫ニューロパシー、後天性神経性筋強直症、先天性多発性関節拘縮、神経炎、視神経炎、および神経変性疾患が含まれるが、これらに限定されない。

自己免疫性筋疾患の例には、筋炎、自己免疫性筋炎および原発性シェーグレン症候群、ならびに平滑筋自己免疫疾患が含まれるが、これらに限定されない。

自己免疫性腎疾患の例には、腎炎および自己免疫性間質性腎炎が含まれるが、これらに限定されない。

生殖に関連する自己免疫疾患の例には、反復胎児消失が含まれるが、これに限定されない。

自己免疫性結合組織病の例には、耳疾患、自己免疫性耳疾患、および内耳の自己免疫疾患が含まれるが、これらに限定されない。

自己免疫性全身疾患の例には、全身性エリテマトーデスおよび全身性硬化症が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の方法によって処置することができる例示的な炎症性疾患には、慢性炎症性疾患および急性炎症性疾患が含まれるが、これらに限定されない。

過敏症に関連する炎症性疾患
過敏症の例には、Ｉ型過敏症、ＩＩ型過敏症、ＩＩＩ型過敏症、ＩＶ型過敏症、即時型過敏症、抗体媒介性過敏症、免疫複合体媒介性過敏症、Ｔリンパ球媒介性過敏症、およびＤＴＨが含まれるが、これらに限定されない。

Ｉ型過敏症または即時型過敏症（喘息など）。

ＩＩ型過敏症には、リウマチ様疾患、リウマチ様自己免疫疾患、関節リウマチ（Ｋｒｅｎｎ Ｖ． ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ ２０００ Ｊｕｌ；１５（３）：７９１）、脊椎炎、強直性脊椎炎（Ｊａｎ Ｖｏｓｗｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ ２００１；３（３）：１８９）、全身性疾患、全身性自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス（Ｅｒｉｋｓｏｎ Ｊ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ １９９８；１７（１−２）：４９）、硬化症、全身性硬化症（Ｒｅｎａｕｄｉｎｅａｕ Ｙ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９ Ｍａｒ；６（２）：１５６）；Ｃｈａｎ ＯＴ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ １９９９ Ｊｕｎ；１６９：１０７）、腺疾患、腺自己免疫疾患、膵臓自己免疫疾患、糖尿病、Ｉ型糖尿病（Ｚｉｍｍｅｔ Ｐ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ １９９６ Ｏｃｔ；３４ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ１２５）、甲状腺疾患、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病（Ｏｒｇｉａｚｚｉ Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ２０００ Ｊｕｎ；２９（２）：３３９）、甲状腺炎、自発性自己免疫性甲状腺炎（Ｂｒａｌｅｙ−Ｍｕｌｌｅｎ Ｈ．ａｎｄ Ｙｕ Ｓ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００ Ｄｅｃ １５；１６５（１２）：７２６２）、橋本甲状腺炎（Ｔｏｙｏｄａ Ｎ． ｅｔ ａｌ．，Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ １９９９ Ａｕｇ；５７（８）：１８１０）、粘液水腫、特発性粘液水腫（Ｍｉｔｓｕｍａ Ｔ．Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ．１９９９ Ａｕｇ；５７（８）：１７５９）；自己免疫性生殖性疾患、卵巣疾患、卵巣自己免疫（Ｇａｒｚａ ＫＭ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８ Ｆｅｂ；３７（２）：８７）、自己免疫性抗精子不妊症（Ｄｉｅｋｍａｎ ＡＢ． ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ Ｍａｒ；４３（３）：１３４）、反復胎児消失（Ｔｉｎｃａｎｉ Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ｌｕｐｕｓ １９９８；７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１０７−９）、神経変性疾患、神経学的疾患、神経学的自己免疫疾患、多発性硬化症（Ｃｒｏｓｓ ＡＨ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ ２００１ Ｊａｎ １；１１２（１−２）：１）、アルツハイマー病（Ｏｒｏｎ Ｌ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ Ｓｕｐｐｌ．１９９７；４９：７７）、重症筋無力症（Ｉｎｆａｎｔｅ ＡＪ．Ａｎｄ Ｋｒａｉｇ Ｅ，Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９；１８（１−２）：８３）、運動ニューロパシー（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ＡＪ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０００ Ｍａｙ；７（３）：１９１）、ギラン・バレー症候群、ニューロパシー、および自己免疫性ニューロパシー（Ｋｕｓｕｎｏｋｉ Ｓ．Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ．２０００ Ａｐｒ；３１９（４）：２３４）、筋無力性疾患、ランバート・イートン筋無力症候群（Ｔａｋａｍｏｒｉ Ｍ．Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ．２０００ Ａｐｒ；３１９（４）：２０４）、腫瘍随伴性神経学的疾患、小脳萎縮、傍腫瘍性小脳萎縮、非傍腫瘍性スティッフマン症候群、小脳萎縮、進行性小脳萎縮、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症、シデナム舞踏病（Ｓｙｄｅｈａｍ ｃｈｏｒｅａ）、ジルドラトゥレット症候群、多腺性内分泌症、自己免疫性多腺性内分泌症（Ａｎｔｏｉｎｅ ＪＣ．ａｎｄ Ｈｏｎｎｏｒａｔ Ｊ．Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ（Ｐａｒｉｓ）２０００ Ｊａｎ；１５６（１）：２３）；ニューロパシー、異常免疫ニューロパシー（Ｎｏｂｉｌｅ−Ｏｒａｚｉｏ Ｅ． ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒ Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ Ｓｕｐｐｌ １９９９；５０：４１９）；神経性筋強直症、後天性神経性筋強直症、先天性多発性関節拘縮（Ｖｉｎｃｅｎｔ Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．１９９８ Ｍａｙ １３；８４１：４８２）、心血管疾患、心血管自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症（Ｍａｔｓｕｕｒａ Ｅ． ｅｔ ａｌ．，Ｌｕｐｕｓ．１９９８；７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１３５）、心筋梗塞（Ｖａａｒａｌａ Ｏ．Ｌｕｐｕｓ．１９９８；７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１３２）、血栓症（Ｔｉｎｃａｎｉ Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ｌｕｐｕｓ １９９８；７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１０７−９）、肉芽腫症、ウェゲナー肉芽腫症、動脈炎、高安動脈炎、および川崎症候群（Ｐｒａｐｒｏｔｎｉｋ Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｅｎ Ｋｌｉｎ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ ２０００ Ａｕｇ ２５；１１２（１５−１６）：６６０）；抗第ＶＩＩＩ因子自己免疫疾患（Ｌａｃｒｏｉｘ−Ｄｅｓｍａｚｅｓ Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ．２０００；２６（２）：１５７）；脈管炎、壊死性小血管脈管炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、糸球体腎炎、微量免疫型巣状壊死性糸球体腎炎、半月体形成性糸球体腎炎（Ｎｏｅｌ ＬＨ．Ａｎｎ Ｍｅｄ Ｉｎｔｅｒｎｅ（Ｐａｒｉｓ）．２０００ Ｍａｙ；１５１（３）：１７８）；抗リン脂質症候群（Ｆｌａｍｈｏｌｚ Ｒ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ １９９９；１４（４）：１７１）；心不全、心不全におけるアゴニスト様β−アドレノセプター抗体（Ｗａｌｌｕｋａｔ Ｇ． ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ．１９９９ Ｊｕｎ １７；８３（１２Ａ）：７５Ｈ）、血小板減少性紫斑（Ｍｏｃｃｉａ Ｆ．Ａｎｎ Ｉｔａｌ Ｍｅｄ Ｉｎｔ．１９９９ Ａｐｒ−Ｊｕｎ；１４（２）：１１４）；溶血性貧血、自己免疫性溶血性貧血（Ｅｆｒｅｍｏｖ ＤＧ． ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ １９９８ Ｊａｎ；２８（３−４）：２８５）、胃腸疾患、胃腸管の自己免疫疾患、腸疾患、慢性炎症性腸疾患（Ｇａｒｃｉａ Ｈｅｒｏｌａ Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．２０００ Ｊａｎ；２３（１）：１６）、セリアック病（Ｌａｎｄａｕ ＹＥ．ａｎｄ Ｓｈｏｅｎｆｅｌｄ Ｙ．Ｈａｒｅｆｕａｈ ２０００ Ｊａｎ １６；１３８（２）：１２２）、筋系の自己免疫疾患、筋炎、自己免疫性筋炎、シェーグレン症候群（Ｆｅｉｓｔ Ｅ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００ Ｓｅｐ；１２３（１）：９２）；平滑筋自己免疫疾患（Ｚａｕｌｉ Ｄ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ １９９９ Ｊｕｎ；５３（５−６）：２３４）、肝疾患、肝自己免疫疾患、自己免疫性肝炎（Ｍａｎｎｓ ＭＰ．Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ ２０００ Ａｕｇ；３３（２）：３２６）、および原発性胆汁性肝硬変（Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ ＣＰ． ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．１９９９ Ｊｕｎ；１１（６）：５９５）が含まれるが、これらに限定されない。

ＩＶ型過敏症またはＴ細胞媒介性過敏症には、リウマチ様疾患、関節リウマチ（Ｔｉｓｃｈ Ｒ，ＭｃＤｅｖｉｔｔ ＨＯ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９４ Ｊａｎ １８；９１（２）：４３７）、全身性疾患、全身性自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス（Ｄａｔｔａ ＳＫ．，Ｌｕｐｕｓ １９９８；７（９）：５９１）、腺疾患、腺自己免疫疾患、膵臓疾患、膵臓自己免疫疾患、１型糖尿病（Ｃａｓｔａｎｏ Ｌ．ａｎｄ Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ ＧＳ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６４７）；甲状腺疾患、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病（Ｓａｋａｔａ Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １９９３ Ｍａｒ；９２（１）：７７）；卵巣疾患（Ｇａｒｚａ ＫＭ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８ Ｆｅｂ；３７（２）：８７）、前立腺炎、自己免疫性前立腺炎（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ＲＢ． ｅｔ ａｌ．，Ｕｒｏｌｏｇｙ １９９７ Ｄｅｃ；５０（６）：８９３）、多腺性症候群、多腺性自己免疫症候群、タイプＩ多腺性自己免疫症候群（Ｈａｒａ Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９１ Ｍａｒ １；７７（５）：１１２７）、神経学的疾患、自己免疫性神経学的疾患、多発性硬化症、神経炎、視神経炎（Ｓｏｄｅｒｓｔｒｏｍ Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １９９４ Ｍａｙ；５７（５）：５４４）、重症筋無力症（Ｏｓｈｉｍａ Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９０ Ｄｅｃ；２０（１２）：２５６３）、全身強直症候群（Ｈｉｅｍｓｔｒａ ＨＳ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００１ Ｍａｒ ２７；９８（７）：３９８８）、心血管疾患、シャーガス病における心自己免疫（Ｃｕｎｈａ−Ｎｅｔｏ Ｅ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９６ Ｏｃｔ １５；９８（８）：１７０９）、自己免疫性血小板減少性紫斑（Ｓｅｍｐｌｅ ＪＷ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １９９６ Ｍａｙ １５；８７（１０）：４２４５）、抗ヘルパーＴリンパ球自己免疫（Ｃａｐｏｒｏｓｓｉ ＡＰ． ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８；１１（１）：９）、溶血性貧血（Ｓａｌｌａｈ Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｈｅｍａｔｏｌ １９９７ Ｍａｒ；７４（３）：１３９）、肝疾患、肝自己免疫疾患、肝炎、慢性活動性肝炎（Ｆｒａｎｃｏ Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ １９９０ Ｍａｒ；５４（３）：３８２）、胆汁性肝硬変、原発性胆汁性肝硬変（Ｊｏｎｅｓ ＤＥ．Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ（Ｃｏｌｃｈ）１９９６ Ｎｏｖ；９１（５）：５５１）、腎疾患、腎自己免疫疾患、腎炎、間質性腎炎（Ｋｅｌｌｙ ＣＪ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ １９９０ Ａｕｇ；１（２）：１４０）、結合組織病、耳疾患、自己免疫性結合組織病、自己免疫性耳疾患（Ｙｏｏ ＴＪ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９４ Ａｕｇ；１５７（１）：２４９）、内耳疾患（Ｇｌｏｄｄｅｋ Ｂ． ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９９７ Ｄｅｃ ２９；８３０：２６６）、皮膚病、皮膚疾患、真皮疾患、水疱性皮膚疾患、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、および落葉状天疱瘡が含まれるが、これらに限定されない。

遅延型過敏症の例には、接触皮膚炎および薬疹が含まれるが、これらに限定されない。

過敏症を媒介するＴリンパ球のタイプの例には、ヘルパーＴリンパ球および細胞傷害性Ｔリンパ球が含まれるが、これらに限定されない。

ヘルパーＴリンパ球媒介性過敏症の例には、Ｔ_ｈ１リンパ球媒介性過敏症およびＴ_ｈ２リンパ球媒介性過敏症が含まれるが、これらに限定されない。

１つの実施形態によれば、炎症性疾患は、Ｂ細胞悪性腫瘍ではない。

１つの特定の実施形態によれば、炎症性疾患は、Ｂ−ＣＬＬではない。

１つの実施形態によれば、自己免疫疾患または炎症性疾患は、慢性容態である。

１つの実施形態によれば、自己免疫疾患または炎症性疾患は、急性容態である。

１つの実施形態によれば、被験体は、自己免疫疾患または炎症性疾患（例えば、処置前）と診断されている。

１つの特定の実施形態によれば、自己免疫疾患または炎症性疾患は、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、関節炎、または狼瘡である。

（ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１の活性または発現を減少させることができる）本発明のいくつかの実施形態の薬剤を、薬剤自体または適切な担体または賦形剤と混合した医薬組成物として生物に投与することができる。

本明細書中で使用される場合、「医薬組成物」は、他の化学成分（生理学的に適切な担体および賦形剤など）を有する１つまたは複数の本明細書中に記載の有効成分の調製物をいう。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。

本明細書中の用語「有効成分」は、生物学的効果（すなわち、ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１の活性または発現の下方制御）を発揮することができる薬剤をいう。

互換性に使用することができる以下の句「生理学的に許容され得る担体」および「薬学的に許容され得る担体」は、生物に対して有意な刺激を引き起こさず、且つ、投与した化合物の生物学的な活性および性質を抑制しない担体または希釈剤をいう。これらの句にはアジュバントが含まれる。

本明細書中の用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質をいう。賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖および種々のタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、およびポリエチレングリコールが含まれるが、これらに限定されない。

薬物の処方および投与のための技術は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，” Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ（本明細書中で参考として援用される）に見出すことができる。

適切な投与経路には、例えば、経口、直腸、経粘膜、特に、経鼻、腸、または非経口送達（筋肉内、皮下、および髄内注射が含まれる）、ならびに髄腔内、直接脳室内、心臓内（例えば、右心室内または左心室内）、一般的な冠状動脈内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼内への注射が含まれ得る。

あるいは、医薬組成物を、全身様式よりも局所様式で、例えば、患者の組織領域内への医薬組成物の直接注射によって投与することができる。

用語「組織」は、機能を喪失させるか機能するように設計された細胞からなる生物の一部をいう。例には、脳組織、網膜、皮膚組織、肝臓組織、膵臓組織、骨、軟骨、結合組織、血液組織、筋肉組織、心臓組織、脳組織、脈管組織、腎臓組織、肺組織、生殖腺組織、造血組織が含まれるが、これらに限定されない。

本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物を、当該分野で周知のプロセス（例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、湿式粉砕、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥プロセス）によって製造することができる。

したがって、本発明のいくつかの実施形態にしたがって用いる医薬組成物を、薬学的に使用することができる、有効成分の調製物への加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容され得る担体を使用して従来の様式で処方することができる。適切な処方物は、選択された投与経路に依存する。

注射のために、医薬組成物の有効成分を、水溶液、好ましくは、生理学的に適合した緩衝液（ハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水など）に配合することができる。経粘膜投与のために、透過すべきバリアに適切な浸透剤を、処方物中に使用する。かかる浸透剤は、一般に、当該分野で公知である。

経口投与のために、医薬組成物を、活性化合物を当該分野で周知の薬学的に許容され得る担体と組み合わせることによって容易に処方することができる。かかる担体は、患者が経口摂取するために、医薬組成物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、および懸濁液などとして処方することができる。経口用の薬理学的調製物を、固体賦形剤を使用して、任意選択的に得られた混合物を粉砕し、必要に応じて適切な補助剤を添加後に顆粒混合物を加工して錠剤または糖衣錠コアを得ることによって作製することができる。適切な賦形剤は、特に、充填剤（糖（ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールが含まれる）など）；セルロース調製物（例えば、メイズデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）など）；および／または生理学的に許容され得るポリマー（ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）など）である。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を添加することができる。

糖衣錠コアに適切なコーティングを施す。この目的のために、任意選択的にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含み得る糖濃縮液を使用することができる。識別のためか活性化合物の用量の異なる組み合わせを特徴づけるために、染料または顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに添加することができる。

経口で使用することができる医薬組成物には、ゼラチンで作製した押し込み式カプセルならびにゼラチンおよび可塑剤（グリセロールまたはソルビトールなど）で作製した柔らかい密閉カプセルが含まれる。押し込み式カプセルは、充填剤（ラクトースなど）、結合剤（デンプンなど）、潤滑剤（タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および、任意選択的に、安定剤と混合した有効成分を含むことができる。軟カプセルでは、有効成分を、適切な液体（脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁することができる。さらに、安定剤を添加することができる。経口投与のための全ての処方物は、選択された投与経路に適切な投薬量にすべきである。

口内投与のために、組成物は、従来の様式で処方した錠剤またはロゼンジの形態を取ることができる。

鼻孔吸入による投与のために、本発明のいくつかの実施形態にしたがって使用するための有効成分は、適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、または二酸化炭素）を使用して加圧パックまたはネブライザーから噴射されるエアロゾルスプレーの形態で送達されると都合が良い。加圧エアロゾルの場合、投薬単位を、一定量を送達させるための弁を取り付けることによって決定することができる。化合物の散剤混合物および適切な散剤基剤（ラクトースまたはデンプンなど）を含む、例えば、ディスペンサで用いるゼラチンのカプセルおよびカートリッジを処方することができる。

本明細書中に記載の医薬組成物を、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために処方することができる。注射用処方物は、例えば、任意選択的に防腐剤を添加したアンプルまたは分割投与容器中に単位投薬形態で存在し得る。組成物は、油性または水性のビヒクルを含む懸濁液、溶液、または乳濁液であってよく、配合剤（懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤など）を含むことができる。

非経口投与のための医薬組成物には、水溶性形態の活性調製物の水溶液が含まれる。さらに、有効成分の懸濁液を、適切な油または水ベースの注射用懸濁液として調製することができる。適切な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（ゴマ油など）または合成脂肪酸エステル（オレイン酸エチル、トリグリセリド、またはリポソームなど）が含まれる。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘性を増大させる物質（カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなど）を含むことができる。任意選択的に、懸濁液は、適切な安定剤または高濃度溶液を調製するために有効成分の溶解性を増大させる薬剤も含むことができる。

あるいは、有効成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば、無菌の発熱物質を含まない水ベースの溶液）で再構成するための粉末形態であり得る。

本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物を、例えば、従来の坐剤基剤（カカオバターまたは他のグリセリドなど）を使用して、直腸組成物（坐剤または停留浣腸など）に処方することもできる。

本発明のいくつかの実施形態の状況での使用に適切な医薬組成物には、意図する目的を達成するのに有効な量で有効成分を含む組成物が含まれる。より具体的には、治療有効量は、障害（例えば、悪性疾患）の症状の防止、軽減、もしくは回復、または処置される被験体の延命に有効な量の有効成分（例えば、ＣＤ８４またはＳＬＡＭＦ１の活性または発現を減少させることができる薬剤）を意味する。

１つの実施形態によれば、治療有効量は、疲弊したＴ細胞上のプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、リンパ球活性化遺伝子３（Ｌａｇ−３）、キラー細胞レクチン様受容体Ｇ１（ＫＬＲＧ１）、および／または２Ｂ４（すなわち、Ｔ細胞疲弊のマーカー）のうちの少なくとも１つの活性または発現を下方制御する。

Ｔ細胞疲弊マーカー（例えば、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、Ｌａｇ−３、ＫＬＲＧ１、および／または２Ｂ４）の下方制御を、当該分野で公知の任意の方法を使用して（例えば、ＦＡＣＳ分析を使用して）評価することができる。１つの実施形態によれば、Ｔ細胞疲弊マーカーは、本発明のいくつかの実施形態の薬剤で処置していない疲弊したＴ細胞と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％下方制御される。

１つの実施形態によれば、治療有効量は、Ｔ細胞によるサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮγ）の産生および／またはＣＤ１０７の発現の増加に関連するＴ細胞疲弊を逆行させる。

サイトカイン産生の増加を、当該分野で公知の任意の方法を使用して（例えば、ＥＬＩＳＡを使用して）評価することができる。１つの実施形態によれば、サイトカイン産生は、本発明のいくつかの実施形態の薬剤で処置していない疲弊したＴ細胞と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％増加する。

同様に、Ｔ細胞の再活性化に関連する細胞マーカー（例えば、ＣＤ１０７）の発現の増加を、当該分野で公知の任意の方法を使用して（例えば、ＦＡＣＳ分析を使用して）評価することができる。１つの実施形態によれば、Ｔ細胞マーカーは、本発明のいくつかの実施形態の薬剤で処置していない疲弊したＴ細胞と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％増加する。

１つの実施形態によれば、治療有効量は、Ｔ細胞疲弊を逆行させ、それにより、悪性細胞を死滅させる（例えば、エフェクターＴ細胞による）。

１つの実施形態によれば、治療有効量は、悪性細胞のアポトーシスを誘導する（すなわち、ＣＤ８４誘導性生存経路の妨害に起因する）。

細胞の死滅またはアポトーシスを、当該分野で公知の任意の方法（例えば、細胞増殖アッセイ、ＦＡＣＳ分析など）を使用して評価することができる。

治療有効量の決定は、特に、本明細書中に提供した詳細な開示を考慮すると、当業者の能力の範囲内である。

本発明の方法で使用される任意の調製物のために、治療有効量または治療有効用量を、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび細胞培養アッセイから最初に推定することができる。例えば、動物モデルにおいて所望の濃度または力価を達成するための用量を処方することができる。かかる情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。

Ｔ細胞疲弊のモデルは、慢性のウイルス性疾患または悪性腫瘍を有する任意の動物モデル（例えば、マウス）であり得る。かかるモデルは、ＭｃＧａｒｙ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ”，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ ＨＩＶ ＡＩＤＳ（２０１４）９（５）：４９２−４９９（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。さらに、末期のクローン性および致死性の白血病に進行するマウスＣＬＬを発症するＥμ−ＴＣＬ１（ＴＣＬ−１）トランスジェニックマウスは、以前に記載されており（Ｂｉｃｈｉ Ｒ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２００２）９９（１０）：６９５５−６９６０）、以下の実施例の節にも記載している。さらにまたはあるいは、Ｂ−ＣＬＬ動物モデル（以前に記載のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスキメラなど）（Ｓｈｉｍｏｎｉ Ａ，Ｍａｒｃｕｓ Ｈ，Ｃａｎａａｎ Ａ，ｅｔ ａｌ． Ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ Ｂ−ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎ ｈｕｍａｎ／ｍｏｕｓｅ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｃｈｉｍｅｒａ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｌｏｗ−ｓｔａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｌｏｏｄ．１９９７；８９：２２１０−２２１８）を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏで本発明の薬剤の治療有効性を決定することができる。

本明細書中に記載の有効成分の毒性および治療有効性を、標準的な薬学的手順によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、細胞培養、または実験動物において決定することができる。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイおよび細胞培養アッセイならびに動物研究から得たデータを、ヒトで用いる投薬量範囲の処方で使用することができる。投薬量は、使用した投薬形態および利用した投与経路に応じて変動し得る。正確な処方、投与経路、および投薬量を、患者の容態を考慮して各医師が選択することができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ， ｅｔ ａｌ．，１９７５，ｉｎ “Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ｃｈ．１ ｐ．１を参照のこと）。

投薬量および投薬間隔を、有効成分の（組織）レベルが生物学的効果（最小有効濃度、ＭＥＣ）を誘導するか抑制するのに十分になるように個別に調整することができる。ＭＥＣは、各調製で変動するであろうが、ｉｎ ｖｉｔｒｏデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は、個体の特徴および投与経路に依存するであろう。検出アッセイを使用して、血漿濃度を決定することができる。

処置すべき容態の重症度および応答性に応じて、単回または複数回投与することができ、処置クールは、数日から数週間まで、治癒するまで、または病状が軽減するまで継続される。

組成物の投与量は、勿論、処置される被験体、苦痛の重症度、投与様式、担当医の判断などに依存するであろう。

本発明のいくつかの実施形態の組成物は、必要に応じて、有効成分を含む１つまたは複数の単位投薬形態を含むことができるパックまたは取り出しデバイス（ＦＤＡ承認済みキットなど）中に存在し得る。パックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔（ブリスター包装など）を含み得る。パックまたは取り出しデバイスは、投与の説明書を同梱することができる。パックおよび取り出しデバイスは、医薬品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって指示された形式で容器に添付した通知書も同梱することができる。この通知書は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与に関する当局の承認を反映している。かかる通知書は、例えば、処方薬について米国食品医薬品局によって承認されたラベルまたは承認された製品の添付文書であり得る。適合する薬学的担体中に処方された本発明の調製物を含む組成物を、上記でさらに詳述するように、調製し、適切な容器に封入し、適応容態の処置についてラベルに記載することもできる。

悪性疾患の処置を増強するために、本発明は、さらに、照射療法、化学療法、生物療法（例えば、免疫療法（例えば、抗体免疫療法）または移植（例えば、骨髄移植））、光線療法および光力学療法、手術、栄養療法、切除療法、照射療法と化学療法の併用、小線源療法、陽子線療法、細胞療法、および光子線放射線外科療法、またはその組み合わせなどのさらなる治療を被験体に施すことを想定している。鎮痛剤および他の処置レジメンも意図する。化学療法薬の例を、以下に詳述する。

本明細書中で使用される場合、用語「化学療法」または「化学療法の」は、新生物または転移の成長を低下、防止、緩和、制限、および／または遅延するか、新生物の壊死もしくはアポトーシスまたは任意の他の機序によって新生物細胞を直接死滅させる薬剤、または、そうでなければ、新生物疾患（例えば、癌）を有する被験体において新生物または転移の成長を低下、防止、緩和、制限、および／または遅延するための薬学的有効量で使用することができる薬剤をいう。

化学療法薬には、フルオロピリミジン；ピリミジンヌクレオシド；プリンヌクレオシド；抗葉酸剤、白金剤；アントラサイクリン／アントラセンジオン；エピポドフィロトキシン；カンプトセシン（例えば、カレニテシン）；ホルモン；ホルモン複合体；抗ホルモン薬；酵素、タンパク質、ペプチド、ポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体；免疫学的薬剤；ビンカアルカロイド；タキサン；エポチロン；抗微小管剤；アルキル化剤；代謝拮抗物質；トポイソメラーゼインヒビター；抗ウイルス剤；ならびに種々の他の細胞毒性剤および細胞増殖抑制薬が含まれるが、これらに限定されない。

１つの特定の実施形態によれば、化学療法薬には、アバレリクス、アルデスロイキン、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アザシチジン、ベバクジマブ、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルステロン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セレコキシブ、セツキシマブ、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、アクチノマイシンＤ、ダルベポエチンアルファ、ダルベポエチンアルファ、ダウノルビシン（リポソーム製剤）、ダウノルビシン、デシタビン、デニロイキンディフチトクス、デクスラゾキサン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロモスタノロンプロピオナート、エリオットＢ液、エピルビシン、エポエチンアルファ、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル５−ＦＵ、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、酢酸ゴセレリン、酢酸ヒストレリン、ヒドロキシ尿素、イブリツモマブチウキセタン、イダルビシン、イフォスファミド、メシル酸イマチニブ、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα−２ｂ、イリノテカン、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリン、酢酸ロイプロリド、レバミソール、ロムスチン、ＣＣＮＵ、メクロレタミン、ナイトロジェンマスタード、酢酸メゲストロール、メルファラン、Ｌ−ＰＡＭ、メルカプトプリン６−ＭＰ、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、フェンプロピオン酸ナンドロロン、ネララビン、ノフェツモマブ、オプレルベキン、オプレルベキン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パリフェルミン、パミドロナート、ペグアデマーゼ、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペメトレキセドジナトリウム、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシンミトラマイシン、ポルフィマーナトリウム、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、リツキシマブ、サルグラモスチム、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、マレイン酸スニチニブ、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシドＶＭ−２６、テストラクトン、チオグアニン６−ＴＧ、チオテパ、チオテパ、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノインＡＴＲＡ、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ゾレドロナート、およびゾレドロン酸が含まれるが、これらに限定されない。

別の実施形態によれば、自己免疫疾患または炎症性疾患の処置を増強するために、本発明は、さらに、処置が恩恵を得ることができるさらなる療法を被験体に施すことを想定している。当業者は、かかる決定を行うことができる。

したがって、例えば、消炎療法には、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド性抗炎症薬）、コルチコステロイド（プレドニゾンなど）、および抗ヒスタミンが含まれ得るが、これらに限定されない。

本明細書中で使用される場合、用語「約」は、±１０％をいう。

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）｝、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびこれらの活用変化した用語は、「〜が含まれ得るが、これらに限定されない」を意味する。

用語「〜からなる」は、「〜を含み、それに限定される」を意味する。

用語「〜から本質的になる」は、組成物、方法、または構造がさらなる成分、工程、および／または部分を含むことができるが、さらなる成分、工程、および／または部分が特許請求の範囲に記載の組成物、方法、または構造の基本的特徴および新規の特徴を実質的に変化させない場合に限ることを意味する。

本明細書中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈上別段の指示が明確にない限り、複数形が含まれる。例えば、用語「化合物」または「少なくとも１つの化合物」には、複数の化合物（その混合物が含まれる）を含むことができる。

本願を通して、本発明の種々の実施形態を、範囲形式で示すことができる。範囲形式での記載は便宜および簡潔さのみを目的とし、本発明の範囲を柔軟性がなく制限されると解釈すべきではないと理解すべきである。したがって、範囲の記載は、その範囲内の全ての可能な部分範囲および個別の数値を具体的に開示していると見なすべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの具体的に開示された部分範囲およびその範囲内の個別の数値（例えば、１、２、３、４、５、および６）を有すると見なすべきである。範囲の幅と無関係にこれを適用する。

数値の範囲を本明細書中に示すときはいつでも、示した範囲内の任意の引用した数値（小数または整数）を含むことを意味する。最初に示した数「と」２番目に示した数「との間の範囲」および最初に示した数「から」２番目に示した数「までの範囲」という句を、本明細書中で互換的に使用し、これらの句は、最初に示した数および２番目に示した数ならびにこれらの間の小数および整数が含まれることを意味する。

本明細書中で使用される場合、用語「方法」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術、および手順をいい、化学分野、薬理学分野、生物学分野、生化学分野、および医学分野の当業者に公知であるか、当業者によって公知の様式、手段、技術、および手順から容易に作出される様式、手段、技術、および手順が含まれる。

本明細書中で使用される場合、用語「処置」には、容態の進行の抑止、実質的な阻害、遅延、または逆行、容態の臨床症状もしくは審美的症状の実質的な回復、または容態の臨床症状もしくは審美的症状の外観の実質的な防止が含まれ得るが、これらに限定されない。

明確にするための個別の実施形態の文脈に記載の本発明の一定の特徴を単一の実施形態に組み合わせて提供することもできると認識される。逆に、簡潔にするための単一の実施形態の文脈に記載の本発明の種々の特徴を、個別に、任意の適切なサブコンビネーションで、または、適切な場合は、本発明の任意の他の記載の実施形態で提供することもできる。種々の実施形態の文脈中に記載の一定の特徴は、実施形態がその要素なしでも無効でない限り、実施形態の不可欠な特徴であるとみなされない。

前述の本明細書中および以下の特許請求の範囲に記載の本発明の種々の実施形態および態様は、以下の実施例において実験的に裏付けされる。

ここで、以下の実施例に言及し、前述の説明と共に、非限定的な様式で本発明を例示する。

一般に、本明細書中で使用した命名法および本発明で利用した実験手順には、分子技術、生物化学的技術、微生物学的技術、および組換えＤＮＡ技術が含まれる。かかる技術は、文献に余すところなく説明されている。例えば、以下を参照のこと：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）“Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号明細書；同第４，６８３，２０２号明細書；同第４，８０１，５３１号明細書；同第５，１９２，６５９号明細書、および同第５，２７２，０５７号明細書に記載の方法論；“Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），“Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；利用可能な免疫アッセイは、特許および科学文献に広範に記載されており、例えば、以下を参照のこと：米国特許第３，７９１，９３２号明細書；同第３，８３９，１５３号明細書；同第３，８５０，７５２号明細書；同第３，８５０，５７８号明細書；同第３，８５３，９８７号明細書；同第３，８６７，５１７号明細書；同第３，８７９，２６２号明細書；同第３，９０１，６５４号明細書；同第３，９３５，０７４号明細書；同第３，９８４，５３３号明細書；同第３，９９６，３４５号明細書；同第４，０３４，０７４号明細書；同第４，０９８，８７６号明細書；同第４，８７９，２１９号明細書；同第５，０１１，７７１号明細書、および同第５，２８１，５２１号明細書；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ” Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ” Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，Ｅｄｓ．（１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ” Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ” ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ” Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）および“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌ．１−３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；“ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ” ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；その全てが、本明細書中に完全に記載されているかのうように、参考として援用される。他の一般的な参考文献を、本明細書中に提供している。本明細書中の手順は、当該分野で周知であると考えられ、読み手の便宜のために提供している。本明細書中に含まれる全ての情報は、本明細書中で参考として援用される。

一般的な材料および実験手順
間質細胞株
マウスＢＭ細胞株Ｍ２１０Ｂ４（ＣＲＬ−１９７２）を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から購入し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０中に維持した。細胞を３日毎に継代し、新規の継代は、１４．５×１０^３細胞／ｃｍ^２を播種した。

初代ヒトＣＬＬ細胞
Ｂ−ＣＬＬ細胞を、種々の病期のＣＬＬ患者の末梢血から得た（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ；Ｔｅｌ−Ａｖｉｖ Ｓｏｕｒａｓｋｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｅｌ Ａｖｉｖ，Ｉｓｒａｅｌ；およびＡｓａｆ Ｈａｒｏｆｅｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｚｒｉｆｉｎ，Ｉｓｒａｅｌ）。

初代ヒトＢＭ細胞
初代ヒト骨髄（ＢＭ）間質細胞（ＢＭＳＣ）培養物を、確認されたＣＬＬ患者および健康な骨髄の特徴を有する患者の両方から得たＢＭ穿刺液から樹立した（Ａｓａｆ Ｈａｒｏｆｅｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｚｒｉｆｆｉｎ，Ｉｓｒａｅｌ）。単核球を、フィコール・ハイパーク密度勾配上に重層することによって単離した。その後に１×１０^６個の細胞を、ウシ胎児血清を含む２４ウェルプレートにプレートし、１時間インキュベートして細胞を接着させ、次いで、チャン培地を添加した（ゲンタマイシン、Ｌ−グルタミンを含むチャン培地、Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。培養物をコンフルエントまで毎週培地を交換しておよそ３週間成長させた。

使用したさらなる細胞株：
ｍ２１０Ｂ４（骨髄マウス間質細胞株）、ＲＥＨ（急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞株）、６９７（ＡＬＬ細胞株）、Ｄａｕｄｉ（バーキットリンパ腫細胞株）、およびＲａｍｏｓ（バーキットリンパ腫細胞株）を使用した。ｍ２１０Ｂ４細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０を用いて培養した。細胞を３日毎に継代し、新規の継代は、１４．５×１０^３細胞／ｃｍ^２を播種した。ＲＥＨ細胞、６９７細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、およびＲａｍｏｓ細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０を用いて培養した。細胞を、４日毎に１〜３回継代した。

共培養
共培養では、Ｍ２１０Ｂ４：ＣＬＬについて１：１６の比を使用した。以前に記載のように、この比では、Ｍ２１０Ｂ４細胞はＣＬＬ細胞より生存に有利であるからである（Ｋｕｒｔｏｖａ，Ａ．Ｖ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２００９）１１４（２０）：４４４１−４４５０）。

異なる解剖学的部位からの細胞の単離
マウス脾細胞を、顕微鏡スライドの間または４０マイクロメートルメッシュによって脾臓を粉砕することによって単離した。脛骨および大腿骨由来の骨髄細胞を、シリンジを使用してフラッシュアウトした。腹膜腔由来の細胞を、ＰＢＳ／ＢＳＡの注射および流体の回収によって回収した。末梢血由来の細胞を、眼窩静脈叢／尾静脈から回収した。ＲＢＣ溶解緩衝液（５分間）を使用して赤血球を除去し、その後に洗浄して細胞を回収した。最後に、細胞を４０マイクロメートルメッシュで濾過し、注射またはフローサイトメトリー染色のいずれかのために調製した。

ＲＮＡの単離および逆転写
ＣＬＬ細胞またはＭ２１０Ｂ４細胞由来の総ＲＮＡを、以前に記載のように単離した（Ｂｉｎｓｋｙ，Ｉ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２００７）１０４（３３）：１３４０８−１３４１３；Ｂｉｎｓｋｙ，Ｉ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１０）１８４（９）：４７６１−４７６９）。初代ヒトＢＭ細胞試料およびＴ細胞試料由来のｍＲＮＡを、製造者のマニュアルにしたがってＰｅｒｆｅｃｔ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ培養細胞キット（５ Ｐｒｉｍｅ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して単離した。

フローサイトメトリーのための染色
単離した細胞および培養したＭ２１０Ｂ４細胞を、特異的抗体（以下の表１を参照のこと）を含む染色緩衝液（０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を使用して、氷上にて暗所で３０分間染色した。細胞を洗浄して非結合抗体を除去し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって測定した。アイソタイプコントロールを、データシートにしたがって使用した。結果を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン１０、Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を使用して解析した。

表１：ＦＡＣＳ染色のために使用した抗体

Ｔ細胞のＲＮＡ発現
マウス脾臓を、上記のように処理し、その後にＢ２２０抗マウスビーズ（２５μｌビーズ／１０^７細胞ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）マイクロビーズ、マウス、Ｍｉｌｔｅｎｙｌ）と３０分間インキュベートした。次いで、磁石と２０分間インキュベートしてＢ細胞を除去し、次いで、上清（主にＴ細胞）を、ＣＤ３およびＣＤ２８をコーティングしたプレート上で２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞を採取し、ＲＮＡを精製した。
Ｔ細胞のタンパク質発現

マウス脾臓を採取し、Ｔ細胞を抗ＣＤ３含有培地で刺激し、その後に疲弊マーカーについて染色するか、あるいは、固定し、透過処理し（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅキット）、その後にサイトカインおよび細胞傷害性因子について染色した。

ＣＤ８４刺激
Ｍ２１０Ｂ４間質細胞を、刺激の前日に２４ウェルプレート（１×１０^５／ウェル）に播種した。ヒトＣＬＬ細胞を、実験前日に２０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ中で解凍した。刺激のために、培地を、活性化ＣＤ８４抗体（クローン１５２−１Ｄ５、Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ、またはＳＣＢＴ）（Ｍ２１０Ｂ４ ４μｇ／ｍｌ、ＣＬＬ １×１０^７細胞、５または１０μｇ／ｍｌ）またはアイソタイプコントロール（ＩｇＧ１、クローンＭＯＰＣ−２１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を含む培地と１時間交換した。細胞を洗浄し、ＣＤ８４を１μｇのＦ（ａｂ’）_２抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と架橋させ、その後に以前に記載のように表示の時間インキュベートした（Ｂｉｎｓｋｙ−Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈ，Ｉ． ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２０１４）３３（８）：１００６−１０１６）。

ＳＬＡＭＦ１刺激
Ｍ２１０Ｂ４間質細胞を、刺激前日に２４ウェルプレート（１×１０^５／ウェル）に播種した。刺激のために、培地を、活性化抗ＳＬＡＭＦ１抗体（１０μｇ／ｍｌ、クローン：９Ｄ１、Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはアイソタイプコントロールラットＩｇＧ１（クローン：ｅＢＲＧ１、Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含む培地と７２時間交換した。細胞を洗浄し、ＳＬＡＭＦ１を１μｇのＦ（ａｂ’）_２抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と架橋させ、その後に２４時間インキュベートした。

ＣＤ８４ブロッキング
実験前日にＭ２１０Ｂ４間質細胞を、２４ウェルプレート（１×１０^５細胞／ウェル）に播種し、ＣＬＬ細胞を解凍した。全実験において、５μｇ／ｍｌのＣＤ８４−Ｂ４抗体を、培養物におけるＣＤ８４同種親和性相互作用のブロッキングのために使用した。同量のＩｇＧ２ａ（ＭＯＰＣ−１７３、ＢｉｏｌｅｇｅｎｄまたはｅＢＭ２ａ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、アイソタイプコントロールとして使用した。間質細胞上のＣＤ８４を特異的にブロックするために、Ｂ４抗体を間質細胞上で１時間インキュベートし、非結合抗体を培地での３回の洗浄によって除去し、次いで、ＣＬＬ（１．６×１０^６個）を添加した。

ＳＬＡＭＦ１ブロッキング
実験前日に２×１０^６個のＣＬＬ細胞を解凍し、２４ウェルプレートに播種した。全実験において、１０μｇ／ｍｌの抗ＳＬＡＭＦ１抗体を、培養物におけるＣＤ８４同種親和性相互作用のブロッキングのために使用した（クローン：Ａ１２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。同量のＩｇＧ１（κ）（ＭＯＰＣ−２１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）をアイソタイプコントロールとして使用し、２４時間インキュベートした。

ｓｉＲＮＡによるＳＬＡＭＦ１下方制御
ＳＬＡＭＦ１を、Ｎｅｐａｇｅｎｅ ＳｕｐｅｒエレクトロポレーターＮＥＰＡ２１タイプＩＩを使用したエレクトロポレーションによって導入したｓｉＲＮＡによって下方制御した。接着性Ｍ２０１Ｂ４細胞（０．６２５×１０^５個）に、１２５Ｖの接着細胞電極を使用して１２０ｎＭ ｓｉＲＮＡで３ミリ秒、エレクトロポレートした。ＳｉＲＮＡを、ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅから購入した：マウスＳＬＡＭＦ１：Ｄｈａｒｍａｃｏｎ ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ＋ＳＭＡＲＴプールマウスＳＬＡＭＦ１（カタログ番号Ｌ−０５６０２１−０１−０００５）、非特異的コントロールｓｉＲＮＡ：Ｄｈａｒｍａｃｏｎ ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ＋非ターゲティングプール（Ｄ−００１８１０−１０）。

細胞生存度
ＣＬＬ細胞生存度を、製造者（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のプロトコールにしたがってアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ／７−ＡＡＤ染色を使用して決定し、フローサイトメトリーによって評価した。

ＴＣＬ−１養子移入
Ｅμ−ＴＣＬ１（ＴＣＬ−１）トランスジェニックマウスは、末期のクローン性および致死性の白血病に進行するマウスＣＬＬを発症する（Ｂｉｃｈｉ Ｒ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２００２）９９（１０）：６９５５−６９６０）。現在までに、このマウスは、元も広く検証され、広く使用されてきたマウスＣＬＬモデルである。Ｅμ−ＴＣＬ１マウスは、腹膜腔、末梢血、骨髄、およびリンパ系器官内にＢ２２０^ｉｎｔＩｇＭ^＋ＣＤ５^＋Ｂリンパ球を蓄積する。ＴＣＬ１トランスジェニックマウスは、非変異ＣＬＬ疾患の特徴を示すことが示されており、Ｂ細胞受容体の特徴がヒト疾患に類似し、後成的変化もヒトＣＬＬと類似する。

したがって、ＴＣＬ−１トランスジェニックマウスを、９月齢から末梢血中のその悪性集団（ＣＤ５＋Ｂ２２０＋細胞）について分析した。末梢血（ＰＢ）中の悪性集団が３０％を超えるマウスを屠殺し、注射のためにその脾細胞を調製した。ＴＣＬ−１脾細胞（４×１０^７個）を、６〜８週齢の雌レシピエント野生型（ｗｔ）マウスの尾静脈に注射した。末梢血中の生着の進行を、フローサイトメトリーを使用してＢ２２０／ＣＤ５集団についてモニタリングした。

ｉｎ ｖｉｖｏＣＤ８４ブロッキング
ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ８４のブロッキングを、Ｂ４抗体およびＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して行った。４時間の実験において、２０μｇの抗体を、ＣＬＬ注射の１時間後に尾静脈にｉ．ｖ．注射した。養子移入実験では、Ｂ４抗体またはＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール抗体での処置をＴＣＬ−１脾細胞注射後から２日目に開始し、１ｍｇ／ｋｇ体重の尾静脈注射を２日毎に継続した。

マウス
ＳＬＡＭＦ５（ＣＤ８４）欠損マウスを、以前に記載のように使用した（Ｃａｎｎｏｎｓ Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０１０）３２：２５３−６５を参照のこと）。全動物は、６〜１０週齢の動物を使用した。全動物手順は、ワイツマン科学研究所の動物研究委員会によって承認されていた。

ＥＡＥモデル
１０週齢の野生型（ｗｔ）マウスまたはＣＤ８４ノックアウト（ＣＤ８４^−／−ｋｏまたはＣＤ８４ｋｏ）マウスに、２００μｇのＭＯＧ３５−５５ペプチド／１００μｌ／マウスを皮下（Ｓ．Ｃ．）注射した。ＭＯＧ３５−５５ペプチド調製物は、４ｍｇ／ｍｌの熱殺菌結核菌を含む完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）をさらに含んでいた。用量を、マウス尾部付近の２つの部位への投与のために２つの分割した（５０μｌ乳濁液／部位）。次いで、マウスに、２００ｎｇ百日咳毒素（ＰＴ）（２００μｌ ＰＢＳ中）を腹腔内（Ｉ．Ｐ．）に注射した。ＰＴ注射を４８時間後に繰り返した（すなわち、ＰＴを、０日目および２日目に投与した）。

マウスをスコアリングし、ＥＡＥの臨床症状について毎日または２日毎に（表示の通り）計量した。スコアリングは以下の通りであった：０＝疾患なし、１＝尾部の引きずりおよび／または不安定な歩行、２＝後肢不全麻痺、２．５＝後肢部分麻痺、３＝後肢麻痺、４＝後肢および前肢の麻痺、５＝瀕死／死亡。

結腸炎モデル
急性疾患：６〜８週齢のｗｔマウスまたはＣＤ８４ｋｏマウスに、飲料水を介して２％ＤＳＳを５日間投与した。５日目に、飲料水を正常な水に４〜７日間、または実験終了まで交換した。疾患の進行をモニタリングするために、マウスを毎日計量した。

慢性疾患：６〜８週齢のｗｔマウスまたはＣＤ８４ｋｏマウスに、５日間の２％ＤＳＳ投与を２サイクル行い、２サイクルの間に１０日間回復させた。具体的には、第１サイクルは０日目〜５日目であり、その後に水で１０日間回復させた。ＤＳＳの第２のサイクルを、１５日目からさらに５日間行い、その後に定期的に飲料水を与えた。疾患の進行をモニタリングするために、マウスを毎日計量した。

Ｂ制御性細胞の単離および活性化
脾臓または腸間膜リンパ節を、処置終了時にｗｔマウスまたはＣＤ８４ｋｏマウスから得た。Ｂ細胞を、Ｂ２２０^＋ビーズを使用して富化し、ＬＰＳで５時間または２４時間活性化させた。活性化の最後の５時間にＰＩＭ（ＰＭＡ、イオノマイシンおよびモネンシン）を添加した。次いで、フローサイトメトリーによる制御性Ｂ細胞集団を評価するために、細胞を細胞外マーカーおよび細胞内マーカーについて染色した。

統計
Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．０ｆ，ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、データを解析した。一般に、ＳＥＭを用いた平均を示す。有意差を判定するために、実験に応じて片側または両側のスチューデントｔ検定を使用した。データの正規化のために、非正規分布データポイントを修正するために比率のｔ検定を行った。ｐ値が０．０５以下の結果を有意と見なした。

ＣＤ８４の標的遺伝子
ＣＬＬ生存の微小環境調節の制御におけるＣＤ８４の役割を追跡するために、本発明者らは、微小環境細胞内のＣＤ８４の標的遺伝子を調査した。ヒト患者由来のナース様細胞またはＭ２１０Ｂ４間質細胞上に発現したＣＤ８４を、抗ＣＤ８４抗体（４μｇ／ｍｌ）またはコントロールＩｇＧ抗体で２４時間刺激した。さらに、ＣＬＬ患者および健康なＢＭの両方の吸引液由来の初代患者骨髄（ＢＭ）試料上に発現したＣＤ８４を、抗ＣＤ８４ Ｂ４抗体（本発明者らの研究室で開発した遮断抗体）を使用したＣＬＬとの共培養設定において２４時間ブロッキングした（Ｂｉｎｓｋｙ−Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈ Ｉ． ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２０１４）３３：１００６−１０１６）。ＲＮＡを精製し、ＣＤ８４によって発現が調整された遺伝子を、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）発現分析システムによって分析した。ＣＤ８４活性化後に上方制御され、且つブロッキングした場合に下方制御される遺伝子の１つはＳＬＡＭＦ１であった（データ示さず）。

ＳＬＡＭＦ１発現は間質細胞におけるＣＤ８４標的遺伝子である
ＳＬＡＭＦ１は、受容体のＳＬＡＭファミリーのさらなるメンバーであり、細胞−細胞相互作用を媒介することが公知である（Ｃａｎｎｏｎｓ Ｊ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１１）２９：６６５−７０５）。最初に、ＤＮＡチップの結果を確認した。したがって、Ｍ２１０Ｂ４間質細胞を、抗ＣＤ８４刺激抗体（４μｇ／ｍｌ）で刺激し、ＳＬＡＭＦ１ ｍＲＮＡレベル（図３Ａ）およびタンパク質レベル（図３Ｂ〜Ｃ）を分析した。ＣＤ８４刺激により、Ｍ２１０Ｂ４間質細胞におけるＳＬＡＭＦ１発現レベルが有意に上昇した。さらに、ＳＬＡＭＦ１ ｍＲＮＡは、単球由来ナース様細胞（ＮＬＣ）（図３Ｄ）および健康な患者由来の初代ヒト骨髄間質細胞（図３Ｅ）の活性化後に上方制御された。興味深いことに、ＣＬＬ上に発現したＣＤ８４の刺激により、ＳＬＡＭＦ１ ｍＲＮＡレベル（図３Ｆ）およびタンパク質レベル（図３Ｇ〜Ｈ）が上昇した。これらの結果は、ＣＤ８４がＣＬＬおよびその微小環境内の細胞の両方においてＳＬＡＭＦ１の発現を誘導することを示唆している。

次に、間質細胞になるようにｉｎ ｖｉｔｒｏで成長した骨吸引液に由来する細胞上のＳＬＡＭＦ１発現を分析した。興味深いことに、これらの患者由来の骨髄間質細胞は、健康であることが確認された骨髄由来の細胞と比較してＳＬＡＭＦ１発現が約５倍に増加した。このことは、受容体が疾患の病理発生で役割を果たし得ることを示す（図４Ａ〜Ｃ）。

次に、Ｅμ−ＴＣＬ１トランスジェニックマウス細胞（ＣＬＬのマウスモデルである）由来のＢＭ上のＳＬＡＭＦ１の発現を判定した。同一マウス由来の非悪性Ｂ細胞上の発現と比較して、マウスＴＣＬ−１由来ＢＭ細胞上のＳＬＡＭＦ１発現は有意に増加した（図４Ｄ〜Ｅ）。

ＳＬＡＭＦ１発現はＣＤ８４依存様式でのＣＬＬおよびその微小環境への接触後に上方制御される。
以前の結果は、ＣＤ８４がｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方においてＣＬＬ−微小環境相互作用で重要な役割を果たすことを示していた（Ｍａｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，２０１６、投稿中）。この相互作用がＳＬＡＭＦ１発現を誘導するかどうかを判定するために、患者末梢血試料由来のヒトＣＬＬ細胞を、Ｍ２１０Ｂ４間質細胞株と共培養し、Ｍ２１０Ｂ４間質細胞上のＳＬＡＭＦ１発現を比較した。図５に示すように、ＳＬＡＭＦ１レベルは、前述の細胞をＣＬＬ細胞と共に成長させた場合、有意に増加した。これは、ＳＬＡＭＦ１がこれらの２つの細胞間の相互作用に関与することを示唆している。

本発明者らは、ＣＤ８４刺激がｉｎ ｖｉｔｒｏでＳＬＡＭＦ１発現を制御するので、ＣＤ８４刺激はｉｎ ｖｉｖｏでのその発現に影響を及ぼすであろうという仮説を立てた。したがって、ＣＤ８４のＳＬＡＭＦ１発現に及ぼすｉｎ ｖｉｖｏでの影響を、マウスが進行性ＣＬＬ疾患に類似する疾患を発症する養子移入モデル（すなわち、Ｈｏｆｂａｕｅｒ Ｊ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ（２０１１）２５（９）：１４５２−１４５８によって以前に記載されたモデル）において分析した。腫瘍保有ＴＣＬ−１マウス由来の脾臓細胞を、コアイソジェニック野生型マウスまたはＣＤ８４欠損マウスに注射し、ＣＬＬ様疾患の発症をモニタリングした。細胞移入後１２日目に野生型微小環境内の末梢血中にＴＣＬ−１細胞が検出され、その数は経時的に増加した（図６Ａ）。７週間後、ＴＣＬ−１細胞は、約４０％の脾臓リンパ球、２５％のＢＭ、および５８％の末梢血を含んでいた（図６Ｂ）。

重要には、１４日後に、全ての区画（ＢＭ、脾臓、腹膜、および末梢血）においてＣＤ８４欠損微小環境内の悪性集団の有意な減少が検出された（図７Ａ〜Ｄ）。ＢＭ（約４０％減少）では差はより小さいが、脾臓および腹膜（それぞれ、約５５％減少）ならびに末梢血（約６５％減少）の差はより明白であった。異なる実験間でＴＣＬ集団の百分率が変動したので、結果を野生型群に対して正規化した（図７Ａ〜Ｄ）。

次に、ＴＣＬ−１細胞上のＳＬＡＭＦ１発現を分析した。図８Ａおよび８Ｃに示すように、ＴＣＬ−１細胞上のＳＬＡＭＦ１レベルは、その野生型コントロールと比較して、ＣＤ８４−／−環境内への養子移入後１４日目に有意に減少した。この低下は、腹膜（図８Ａ〜Ｂ）およびＢＭ（図８Ｃ〜Ｄ）（Ｅμ−ＴＣＬ１マウスモデルにおいて重要であることが以前に見出されていた２つの器官（Ｂｉｃｈｉ Ｒ． ｅｔ ａｌ．，（２００２），前出））で検出された。しかし、脾臓および末梢血ではＳＬＡＭＦ１発現の変化は認められなかった（データ示さず）。正常なＢ細胞上でもＳＬＡＭＦ１の減少が検出されたので、制御は悪性集団に限らなかったが（図８Ａ、８Ｃ）、これらの細胞の微小環境が依然として悪性であることに留意することが重要である。さらに、ＴＣＬ−１移入野生型マウスの抗ＣＤ８４ Ｂ４ハイブリドーマでの処置により、腹膜および骨髄においてＴＣＬ１細胞上のＳＬＡＭＦ１の発現量が減少した（図８Ｅ〜Ｇ）。

ＢＭ間質細胞上のＳＬＡＭＦ１発現に及ぼす腫瘍環境の影響を判定するために、骨髄間質細胞を採取し、ＳＬＡＭＦ１発現について分析した。培養３週間後、これらの細胞は、依然としてＳＬＡＭＦ１発現量が減少していた（図８Ｈ〜Ｉ）。

ＳＬＡＭＦ１の下方制御はＣＬＬ細胞死を誘導する
ＳＬＡＭＦ１がＣＬＬ生存の制御に関与しているかどうかを判定するために、初代ＣＬＬ細胞を、拮抗性ＳＬＡＭＦ１抗体（クローン：Ａ１２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いるか用いないで４８時間インキュベートし、生存の差を判定した。図９Ａ〜Ｃに示すように、ＣＬＬ細胞を用いた場合、生存ＣＬＬ細胞は２５％減少した。

次に、ＣＬＬ細胞の生存に関する間質上に発現したＳＬＡＭＦ１の役割を試験した。したがって、Ｍ２１０Ｂ４間質細胞におけるＳＬＡＭＦ１発現はｓｉＲＮＡによって下方制御され、ＣＬＬ生存に及ぼす影響をモニタリングした。ＳＬＡＭＦ１のｍＲＮＡレベル（図９Ｄ）の７０％減少およびタンパク質レベル（図９Ｅ）の６０％減少が、ＳＬＡＭＦ１ ｓｉＲＮＡで処置したＭ２１０Ｂ４間質細胞において検出された。次に、４８時間共培養のために、ＣＬＬ細胞をｓｉＳＬＡＭＦ１処置したＭ２１０Ｂ４間質細胞に添加した。微小環境におけるＳＬＡＭＦ１発現のノックダウンにより生ＣＬＬ細胞が４３％低下し（図９Ｆ、９Ｈ）、単一培養で成長させたＣＬＬ細胞の生存レベルおよびアポトーシスレベルに到達した（図９Ｆ〜Ｊ）。この結果は、間質上に発現したＳＬＡＭＦ１がＣＬＬ生存を制御することを示唆している。

ＳＬＡＭＦ１の刺激がＢｃｌ−２およびＰＤ−Ｌ１を増加させる
微小環境内に発現したＳＬＡＭＦ１の役割をさらに解明するために、その下方制御で誘導されたカスケードを追跡した。したがって、Ｍ２１０Ｂ４間質細胞上に発現したＳＬＡＭＦ１を、抗ＳＬＡＭＦ１抗体（１０μｇ／ｍｌ、クローン：９Ｄ１、Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって活性化し、この刺激後に発現が上方制御された遺伝子を追跡した。図１０Ａ〜Ｂに示すように、Ｂｃｌ２（図１０Ａ）およびプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）（図１０Ｂ）のｍＲＮＡレベルの増加が検出された。

ＣＤ８４は多発性骨髄腫細胞、急性リンパ球性白血病細胞、およびバーキットリンパ腫細胞上のＳＬＡＭＦ１発現を制御する
本発明者らは、ＳＬＡＭＦ１発現の制御がＣＬＬに特異的なものであるのかどうか、またはこの制御が他の悪性疾患でも見出されるかどうかを判定することに興味を持った。したがって、患者に由来する初代多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞上のＣＤ８４を活性化した（図１１Ａ）。ＣＤ８４の刺激により、ＳＬＡＭＦ１発現が約２倍上昇した（図１１Ａ）。さらに、初代多発性骨髄腫患者細胞上のＳＬＡＭＦ１発現は、健康なコントロール細胞上のそのレベルと比較して、１０倍超であった（図１１Ｂ）。

次に、ＣＤ８４刺激後の急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）およびバーキットリンパ腫細胞株におけるＳＬＡＭＦ１発現を分析した。また、２４時間の刺激によりＡＬＬ細胞株６９７およびＲＥＨ（図１２Ａ〜Ｂ）ならびにバーキットリンパ腫細胞株ＲａｍｏｓおよびＤａｕｄｉ（図１２Ｃ〜Ｄ）上のＳＬＡＭＦ１発現レベルが上昇し、この制御の役割がＢ細胞悪性腫瘍でより一般的であり、ＣＬＬとのみ関与するわけではないことを示す。

（実施例７A）
ＰＤ−Ｌ１はＣＤ８４刺激後に上方制御される
追跡するために選択された別のＣＤ８４標的遺伝子はＰＤ−Ｌ１であった。ＣＤ８４がその発現を制御する能力を検証するために、Ｍ２１０Ｂ４マウス間質細胞株（図１３Ａ〜Ｃおよび２３Ｅ）、ヒト患者由来ナース様細胞（図１３Ｄおよび２３Ｇ）、ヒトおよびマウスの両方のＣＬＬ細胞（図１３Ｆ〜Ｈおよび２３Ａ〜Ｂ）、ならびにヒト初代骨髄（健康）およびＣＬＬ間質細胞（図１３Ｅおよび２３Ｆ）上に発現したＣＤ８４を、抗ＣＤ８４抗体またはコントロールＩｇＧ抗体で２４時間刺激した。図１３Ａ、１３Ｄ、１３Ｅ、１３Ｆ、２３Ａ〜Ｂ、２３Ｅ、および２３Ｆに示すように、ＰＤ−Ｌ１ ｍＲＮＡレベルは、刺激した全ての細胞において上昇した。さらに、初代ＣＬＬ患者骨髄試料におけるアンタゴニスト抗ＣＤ８４処置に対して実施したＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）分析におけるＰＤ−Ｌ１ ｍＲＮＡレベルは、ＣＬＬとの共培養での健康なＢＭにおけるそのレベルと比較して減少した（データ示さず）。さらに、ＣＬＬ患者／ＣＬＬマウスモデルに由来するマウスおよびヒトの間質細胞上のＰＤ−Ｌ１の発現レベルは、健康なコントロールと比較して有意に上昇した（図２３Ｃ〜Ｄ）。これらの細胞は、ＣＤ３４およびＣＤ４５の染色によって間質細胞であり、したがって、非造血起源であると判定された（図３２Ａ〜Ｂ）。

次に、ＰＤ−Ｌ１受容体、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）の発現を、抗ＣＤ８４抗体刺激の前または後で分析した。健康な患者のＢＭ細胞（図１４Ａ）またはＭ２１０Ｂ４間質細胞（図１４Ｂ）上のＣＤ８４の刺激は、ＰＤ−１タンパク質発現レベルに影響を及ぼさなかった。興味深いことに、ＣＬＬ細胞上に発現したＣＤ８４の刺激により、ＰＤ−１ ｍＲＮＡ（図１４Ｃ）およびタンパク質（図１４Ｄ〜Ｅ）の発現レベルが有意に減少した。

（実施例７B）
ＣＤ８４活性化はＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路を介してＰＤ−Ｌ１を情報制御する
本発明者らは、次に、ＰＤ−Ｌ１を発現するＣＤ８４誘導性カスケードを追跡した。ＰＤ−Ｌ１の発現は、ＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路およびＭＡＰＫ経路の制御下にあることが以前に示されている。したがって、これらの経路を、ＣＤ８４刺激したＭ２１０Ｂ４細胞において分析した。ＭＡＰＫ経路の変化はほとんど検出されなかったが（図２４Ａ）、ＣＤ８４刺激により、非活性化Ｍ２１０Ｂ４細胞と比較して、活性化細胞においてｐＡＫＴレベルが上昇した（図２４Ａ〜Ｂ）。さらに、ＣＤ８４刺激により、Ｓ６（肺癌における公知のＰＤ−Ｌ１制御因子）のリン酸化が誘導された。このことは、フローサイトメトリーによってさらに確認された（図２４Ｂ〜Ｃ）。したがって、ＣＤ８４は、ＡＫＴ／ｍＴＯＲおよびホスホ−Ｓ６の活性化によってＰＤ−Ｌ１タンパク質発現を上昇させた。

ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１レベルはｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ８４によって制御される
以前の研究では、免疫系を回避するために白血病前駆体によって使用される免疫コインヒビターとしてＰＤ−Ｌ１が記載されている（Ｎｏｒｄｅ，Ｗ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０１１）７１（１５）：５１１１−５１２２）。さらに、他の研究では、Ｅμ−ＴＣＬ１ ＣＬＬモデルマウスにおけるＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１経路のブロッキングによってＣＬＬ誘導性慢性炎症が消散することが示されている（ＭｃＣｌａｎａｈａｎ，Ｆ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１５）１２６（２）：２０３−２１１）。それ故、ＣＬＬ疾患の進行におけるＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１経路でのＣＤ８４の制御的役割をｉｎ ｖｉｖｏで追跡した。ＴＣＬ−１マウス由来の脾臓を採取し、コアイソジェニック野生型マウスまたはＣＤ８４−／−マウスに注射し、ＢＭ、リンパ節（ＬＮ）、脾臓、末梢血、および腹膜を採取した。図１５Ａ〜Ｇおよび２５Ａ〜Ｅに示すように、リンパ節を除くＣＤ８４を欠く微小環境から採取した全ての器官に由来するＴＣＬ−１細胞上のＰＤ−Ｌ１レベルの有意な低下が検出された（図２５Ｆ）。したがって、微小環境上に発現したＣＤ８４は、ＰＤ−Ｌ１発現を制御する。ＣＤ８４の非存在下では、ＴＣＬ細胞上のＰＤ−Ｌ１レベルはより低かった。さらに、拮抗性抗ＣＤ８４ Ｂ４ハイブリドーマで処置したマウス（図１５Ｈに示す）では、腹膜腔におけるＰＤ−Ｌ１の発現レベルが有意に低下した（図１５Ｉおよび２５Ｇ）。これは、さらに、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ８４のＰＤ−Ｌ１に対する制御的役割を示す。さらに、これらのマウスに由来する骨髄間質細胞をおよそ３週間成長させ、そのＰＤ−Ｌ１レベルを分析し（図１５Ｊおよび２６Ａ）、これらの結果は、ＣＤ８４を欠く微小環境のＢＭ細胞上のＰＤ−Ｌ１発現が有意に減少することを証明している。さらに、ＣＤ８４欠損環境におけるＢＭマクロファージ（図２６Ｃ）、ＢＭ ＤＣ（図２６Ｄ）、脾臓マクロファージ（図２６Ｅ）、脾臓ＤＣ（図２６Ｆ）、およびＰＢ単球（図２６Ｇ）は、コントロール由来の細胞と比較して、ＰＤ−Ｌ１発現が低下した。これらの結果は、腫瘍微小環境におけるＰＤ−Ｌ１発現の包括的制御がＣＤ８４によって媒介されることを示唆している。

ＰＤ−Ｌ１発現がＣＤ８４^−／−マウスにおいて減少するので、ＴＣＬ細胞上の受容体（ＰＤ−１）の量も分析した。注射２８日後に、平均蛍光（ＭＦＩ）は、コントロールマウスと比較して、ＣＤ８４^−／−マウスにおいて約２倍有意に増加し（図１６Ａ〜Ｂ）、この結果は、ＣＤ８４刺激がＰＤ−１を減少させるという前述のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＬＬ細胞の結果（図１４Ｃ〜Ｅ）と一致する。

ＰＤ−１、Ｌａｇ３、２ｂ４、ＫＬＲＧ−１、およびＣＴＬＡ−４の発現は、ＣＤ８４^−／−ＣＬＬ養子移入マウスにおいて、ＰＤ−Ｌ１が低下した器官のみで減少する
ＰＤ−１は、疲弊性および機能障害性の腫瘍浸潤Ｔ細胞上でＬａｇ−３およびＣＴＬＡ−４と同時発現することが示された（Ｂａｉｔｓｃｈ，Ｌ． ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（２０１２）７（２）：ｅ３０８５２；Ｄｕｒａｉｓｗａｍｙ，Ｊ． ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０１３）７３（１２）：３５９１−３６０３）。したがって、本発明者らは、ＣＤ８４^−／−マウスにおけるＰＤ−Ｌ１発現の減少によってより機能的なＴ細胞が誘導され、それ故、疲弊性表現型がより少なくなると示唆した。したがって、ＣＤ８４^−／−養子移入マウスにおけるＴ細胞疲弊性表現型を分析した。

図１７Ａ〜Ｉおよび２７Ａ〜Ｅに示すように、ＴＣＬ細胞上のＰＤ−Ｌ１レベルが脾臓、腹膜、および末梢血において低い場合、ＣＤ８Ｔ細胞上のＰＤ−１、Ｌａｇ−３、２Ｂ４、ＫＬＲＧ−１、およびＣＴＬＡ４の細胞表面発現レベルは低下した。リンパ節では、ＰＤ−Ｌ１が減少しなかった場合、Ｌａｇ−３、ＣＴＬＡ−４、およびＰＤ−１は有意に減少しなかった（図１７Ｊ〜Ｋおよび図３３）。

ＰＤ−１、ＬＡＧ３、およびＣＴＬＡ−４に及ぼす影響が悪性細胞上のＰＤ−Ｌ１発現の減少に起因し、Ｔ細胞内のＣＤ８４の内因性の欠如に起因しなかったことをさらに証明するために、ＣＤ８４^−／−マウスを照射し、このマウスに野生型ＴＣＬ ＢＭを注射することによってキメラマウスを作出した。免疫細胞を有するこの作出マウスはＣＤ８４を発現したが、一方、微小環境はこのタンパク質を発現しなかった。図１８Ａ〜Ｄ、２５Ｈ〜Ｉ、および２７Ｈに示すように、ＣＤ８４^−／−環境に由来するＴＣＬ細胞に関してはＰＤ−Ｌ１染色が有意に減少し、逆に、Ｔ細胞ではＰＤ−１が減少した。これは、発現の減少がＴ細胞の内因性の影響ではないことを示唆している。

さらに、野生型マウスおよびＣＤ８４^−／−マウスの腹膜および脾臓に由来する非注射ＣＤ３活性化細胞の比較により、注射マウスにおいて認められるような疲弊性表現型に対する有意な影響は示されず、制御がＴＣＬ−１依存性であるという主張が強められた（図１８Ｅ〜Ｆおよび２８Ａ〜Ｃ）。

次いで、本発明者らは、ＴＣＬ−１由来Ｔ細胞に及ぼすＣＤ８４依存性の影響を判断することを求めた。この目的のために、ＣＤ８４^−／−マウスまたは野生型ＣＬＬ養子移入モデルマウス由来の脾臓を採取し、Ｂ２２０陰性集団を採取した。次いで、細胞を、ＣＤ３−ＣＤ２８をコーティングしたプレート上で２４時間成長させた。ｍＲＮＡをＴ細胞から精製し、次いで、サイトカインレベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。図１９Ａ〜Ｂに示すように、ＣＤ８４^−／−マウスから採取したＴ細胞は、野生型環境におけるレベルと比較して、ＩＬ−４（図１９Ａ）およびＩＦＮγ（図１９Ｂ）のｍＲＮＡが増加した。これは、微小環境上に発現したＣＤ８４がＰＤ−Ｌ１レベルを上方制御し、それによりＴ細胞活性を低下させることを示唆している。ＣＤ８４の非存在下では、ＰＤ−Ｌ１レベルが低下し、それにより、より機能的なＴ細胞が得られる。このより機能的なＴ細胞によって疲弊性マーカーが減少し、ＩＬ−４およびＩＦＮγのレベルがより高くなる。

ＣＬＬ患者および多発性骨髄腫患者は、その骨髄間質上のＰＤ−Ｌ１発現が増加する
これらの結果を実証するために、健康であることが確認された患者およびＣＬＬ患者の両方、ならびに多発性骨髄腫患者に由来する骨髄穿刺液に由来する間質細胞上のＰＤ−Ｌ１およびＣＤ８４の発現を分析した。ＣＬＬ患者およびＭＭ患者に由来する細胞上のＰＤ−Ｌ１（図２０Ａ〜Ｃおよび図３０Ｂ）およびＣＤ８４（図２０Ｄ〜Ｆおよび図３０Ａ）の発現レベルは、健康なコントロールに由来する細胞と比較して、顕著に増加した。

（実施例１１A）
ＰＤ−Ｌ１はさらなるＢ細胞悪性疾患においてＣＤ８４によって制御される
本発明者らは、次に、さらなるＢ細胞悪性腫瘍におけるＣＤ８４によるＰＤ−Ｌ１発現の制御を調査することを求めた。

図２１Ａおよび３０Ｄに示すように、ＣＤ８４の活性化後にＰＤ−Ｌ１の増加が検出された。図２１Ａおよび３０Ｄでは、細胞をｍＲＮＡレベルについて選別し、タンパク質レベルを調査するためにＣＤ３８およびＣＤ１３８について染色した。さらに、この試料では、受容体ＰＤ−１の発現は減少し（図２１Ｂ）、これは、ＣＬＬ細胞で認められる発現（図１４Ｃ〜Ｄ）と類似していた。ＣＤ８４がＭＭの微小環境においてＰＤ−Ｌ１を制御するかどうかをさらに判定するために、患者の骨髄穿刺液に由来する骨髄間質細胞を、ＣＤ８４で刺激した。ＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方において、ＰＤ−Ｌ１が有意に増加した（図３０Ｃ）。

さらに、バーキットリンパ腫細胞株（ＲａｍｏｓおよびＤａｕｄｉ）上に発現したＣＤ８４の、抗ＣＤ８４抗体（４μｇ／ｍｌ）での刺激により、ＰＤ−Ｌ１ ｍＲＮＡ量がそれぞれ４倍および２．５倍上昇した（それぞれ、図２２Ａおよび２２Ｃ）。この刺激により、ＣＬＬおよびＭＭについて認められるように、ＰＤ−１受容体の量が減少し、Ｄａｕｄｉ細胞株については約０．９倍、Ｒａｍｏｓ細胞株については約０．７倍であった（それぞれ、図２２Ｂおよび２２Ｄ）。急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞株ＲＥＨおよび６９７に関する刺激も分析し、ＰＤ−Ｌ１ ｍＲＮＡの増加は、それぞれ約２倍および４倍であった（それぞれ、図２２Ｅ〜Ｄ）。

まとめると、これは、種々のＢ細胞悪性腫瘍においてＣＤ８４がＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１発現を制御することを示す。

（実施例１１B）
ＣＤ８４活性化はまたｉｎ ｖｉｖｏで多発性骨髄腫細胞においてＰＤ−Ｌ１を上方制御する可能性がある
ＣＬＬにおいて認められるようにＣＤ８４欠損がＴ細胞に影響を及ぼし得るかという疑問に取り組むために、本発明者らは、５ＴＧＭ１モデルおよびＣ５７ＢＬ／ＫａＬｗＲｉｊＨｓｄモデルを使用した。このモデルは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに移植して骨髄腫を作出することができないので、Ｃ５７ＢＬ／６ ＣＤ８４^−／−マウスおよびＷＴマウスに照射し、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＲｉｊＨｓｄマウスの骨髄を使用して再構築した。次いで、マウスに５ＴＧＭ１細胞をＩ．Ｖ．注射し、それにより、多発性骨髄腫疾患を発症させた（図３７Ａ〜Ｂ）。

図３１Ａに示すように、ＢＭ中の５ＴＧＭ１細胞上のＰＤ−Ｌ１発現が低下した。さらに、ＣＤ８Ｔ細胞およびＣＤ４Ｔ細胞は、疲弊マーカーが低下し（図３１Ｂ、３１Ｄ）、サイトカインおよび細胞傷害性因子が増加した（図３１Ｃ、３１Ｅ）。

まとめると、これらの結果は、ＭＭ中のＣＤ８４の調節機構が類似していることを示唆している。

（実施例１１C）
ＣＬＬ由来ヒトＴ細胞の活性の制御
本明細書中に記載のマウスモデルは、ＣＤ８４によるＰＤ−Ｌ１発現の制御を示し、ＣＤ８４はＴ細胞の機能性の制御因子として利用することができる。本発明者らは、次に、ＣＤ８４がＣＬＬ患者に由来する細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現およびＴ細胞機能を制御するかどうかを判断することを求めた。この目的のために、末梢血（ＰＢ）ＣＬＬ細胞を精製し（ＣＤ１９ビーズ後の純度を図３６Ｂに示す）、ｓｉＣＤ８４またはｓｉＣＴＲＬ（１００ｎｍ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）で処置した。２４時間後、末梢血の血球の残部を、４８時間共培養物に戻した。

ＣＬＬ細胞におけるＣＤ８４発現の減少により、これらの細胞上のＰＤ−Ｌ１発現が下方制御される（図２９Ａ〜Ｂ）。顕著には、ＣＤ８４欠損ＣＬＬ細胞とインキュベートしたＴ細胞は、疲弊マーカーＰＤ−１、Ｌａｇ−３、およびＣＴＬＡ−４の発現レベルが低下した（図２９Ｄ〜Ｅ）。興味深いことに、マウスＴＣＬ−１モデルにおける表現型と非常に類似する様式で、ＣＤ８^＋Ｔ細胞に及ぼす影響は、ＣＤ４＋集団に及ぼす影響と比較して有意であった（図２９Ｆ）。

最後に、本発明者らは、ＣＤ８４の破壊によって微小環境で認められたＰＤ−Ｌ１の増加を無効にすることができるかどうか判断することを求めた。この目的のために、ＣＬＬ細胞におけるＣＤ８４発現レベルを、ｓｉＣＤ８４を用いて下方制御した。２４時間後、これらの細胞を、Ｍ２１０Ｂ４細胞とさらに４８時間共培養した。ＣＬＬ上のＣＤ８４レベルが低下した場合、単独培養したＭ２１０Ｂ４で検出された発現レベルに対してＰＤ−Ｌ１が有意に減少し（図２９Ｃ）、さらに、Ｍ２１０Ｂ４はＣＤ８４も減少した（図３６Ａ）。

まとめると、これらの結果は、ＣＬＬにおけるＣＤ８４発現の減少によってＣＬＬ上および微小環境内のＰＤ−Ｌ１発現レベルが下方制御され、それにより、Ｔ細胞活性が誘導されることを示唆している。

急性ＤＳＳ誘導性結腸炎におけるＣＤ８４の役割
マウスにおけるＢｒｅｇを研究するためのモデルの１つは、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導性結腸炎モデルである。ＣＤ８４が結腸炎で役割を果たすかどうかを理解するために、ＣＤ８４が結腸炎の発症および重症度において役割を果たすかどうかを最初に評価した。急性ＤＳＳモデルでは、マウスに２％ＤＳＳを含む飲料水を５日間与え、次いで、実験終了まで通常の水を４〜７日間与えた。疾患の臨床徴候を追跡するために、処置したマウスを毎日計量した。図３８に示すように、ＣＤ８４^−／−（ＣＤ８４ｋｏ）マウスは、野生型（ｗｔ）マウスと比較して、体重減少が少なかった。これらの結果は、ＣＤ８４が結腸炎誘導において役割を果たし、ＣＤ８４の非存在下で炎症応答が低下することを示唆している。

慢性ＤＳＳ誘導性結腸炎におけるＣＤ８４の役割
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、典型的には慢性病状として公知である。慢性結腸炎マウスモデルは、急性疾患と比較した場合、異なる免疫応答および異なるサイトカインを示す。したがって、本発明者らは、次に、ＤＳＳを反復サイクルによって投与して慢性腸炎を引き起こした慢性結腸炎モデルを分析した。マウスに、５日間の２％ＤＳＳ投与を２サイクル行い、２サイクルの間に１０日間回復させた。図３９に示すように、ＣＤ８４^−／−（ｋｏ）マウスは、第２サイクルのＤＳＳに対して完全な耐性を示し、その治癒過程を継続した。これらの結果は、炎症中の免疫応答の制御におけるＣＤ８４の役割を意味している。

ＣＤ８４は結腸炎における制御性Ｂ細胞集団に影響を及ぼす
ＣＤ８４欠損マウスのＤＳＳ誘導性結腸炎に対する耐性がより高かったので、本発明者らは、次に、ＣＤ８４がＢｒｅｇサブセットの制御で役割を果たすかどうかを試験した。この目的のために、制御性Ｂ細胞の異なるサブセット（すなわち、Ｂ１０：ＣＤ１９^＋、ＩＬ−１０^＋、ＣＤ１ｄ^ｈｉ，ＣＤ５^＋；Ｍｚ：ＣＤ１９^＋、ＩＬ−１０^＋、ＣＤ２４^＋、ＣＤ２１^＋、ＣＤ２３−；Ｔ２−ＭｚＰ：ＣＤ１９^＋、ｉｌ−１０^＋、ＣＤ２４^＋、ＣＤ２１^＋、ＣＤ２３^＋）を、脾臓および腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）で分析した。

脾臓およびＭＬＮを、ＤＳＳ誘導性結腸炎の開始から１０日目にｗｔマウスおよびＣＤ８４^−／−マウスから採取した。Ｂ細胞を、Ｂ２２０^＋ビーズを使用して富化し、ＬＰＳで５時間または２４時間活性化した。活性化の最後の５時間にＰＩＭ（ＰＭＡ、イオノマイシン、およびモネンシン）を添加した。図４０Ａおよび４０Ｃで認められるように、ＣＤ８４欠損により、５時間または２４時間の活性化両方において脾臓内のほとんど全ての制御性Ｂ細胞集団が有意に増加した。しかし、腸間膜リンパ節では、ＣＤ８４欠損による制御性Ｂ細胞集団の減少が認められた（図４０Ｂおよび４０Ｄ）。これらの結果は、ＣＤ８４が脾臓およびＭＬＮの両方における制御性Ｂ細胞生成に影響を及ぼすことを示し得る。脾臓におけるＢｒｅｇの有意な増加は、ＣＤ８４^−／−マウスで認められたより軽度の疾患と相関した。

ＥＡＥにおけるＣＤ８４の役割
Ｂｒｅｇの分化および機能の制御におけるＣＤ８４の関与を評価するために、別の動物モデル（すなわち、多発性硬化症（ＭＳ）のための実験的自己免疫性能脊髄炎（ＥＡＥ）マウスモデル）を使用した。ＭＯＧ３５−５５ペプチドおよび百日咳毒素（ＰＴ）で処置することによってｗｔマウスおよびＣＤ８４^−／−ｋｏマウスにＥＡＥを誘導した。臨床ＥＡＥ表現型を観察するために、マウスを２７日間追跡した。より低い臨床スコア（図４１Ａ）およびより少ない体重減少（図４１Ｂ）によって認められるように、結果は、ＣＤ８４^−／−ｋｏマウスがｗｔマウスと比較して疾患が有意に軽度であることを示していた。疾患２７日目に、脾臓内の制御性Ｂ細胞集団を、５時間（図４１Ｃ）または２４時間（図４１Ｄ）の活性化後に分析した。図４１Ｃ〜Ｄに示すように、Ｂｒｅｇ集団（すなわち、Ｂ１０、Ｍｚ、およびＴ２−ＭｚＰ）の有意な増加が、２つの時点で検出された。さらに、このモデルにおけるＴ細胞応答を分析した。ＣＤ４Ｔ細胞集団において有意差は検出されなかった（図４１Ｅ〜Ｆ）。これらの結果は、ＣＤ８４欠損がＥＡＥの誘導からマウスを防御し、この結果は制御性Ｂ細胞集団の上昇に起因する可能性が高いことを示唆している。

本発明をその特定の実施形態と併せて記載しているが、多数の変更形態、修正形態、および変形形態が当業者に自明であることが明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の意図および広範にわたる範囲内に含まれるかかる全ての変更形態、修正形態、および変形形態が含まれることが意図される。

本明細書中に記載の全ての刊行物、特許、および特許出願は、各々の刊行物、特許、および特許出願が具体的且つ個別に本明細書中で参考として援用されることが示されるのと同一の範囲でその全体が本明細書中に組み入れられる。さらに、本願中の任意の参考文献を引用および同定することにより、かかる参考文献が本発明の先行技術として利用可能と承認したと解釈されるべきではない。節の見出しを使用している範囲に本発明が必然的に制限されると解釈すべきではない。

Claims (40)

1. Ｔ細胞疲弊に関与する悪性疾患の処置を必要とする被験体において、前記疾患を処置する方法であって、但し、前記悪性疾患がＢ細胞悪性腫瘍ではないことを条件とし、治療有効量のＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤を前記被験体に投与し、それにより、前記Ｔ細胞疲弊に関与する悪性疾患を処置する、投与する工程を含む、方法。
2. Ｔ細胞疲弊に関与する悪性疾患の処置を必要とする被験体において、前記疾患を処置するための治療有効量のＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤の使用であって、但し、前記悪性疾患がＢ細胞悪性腫瘍ではないことを条件とする、使用。
3. Ｔ細胞疲弊の防止または逆行を必要とする被験体において、前記Ｔ細胞疲弊を防止または逆行する方法であって、治療有効量のＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤を前記被験体に投与し、但し、前記被験体がＢ細胞悪性腫瘍と診断されておらず、それにより、前記被験体における前記Ｔ細胞疲弊を防止または逆行する、投与する工程を含む、方法。
4. 自己免疫疾患または炎症性疾患の処置を必要とする被験体において、前記疾患を処置する方法であって、治療有効量のＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤を被験体に投与し、それにより、前記被験体における前記自己免疫疾患または炎症性疾患を処置する、投与する工程を含む、方法。
5. 自己免疫疾患または炎症性疾患の処置を必要とする被験体において、前記疾患を処置するための治療有効量のＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤の使用。
6. Ｂ制御性細胞の活性またはレベルの上昇を必要とする被験体において、前記活性またはレベルを上昇させる方法であって、治療有効量のＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤を被験体に投与し、それにより、前記被験体における前記Ｂ制御性細胞の活性またはレベルが上昇する、投与する工程を含む、方法。
7. 前記被験体が悪性疾患と診断されている、請求項３に記載の方法。
8. 前記悪性疾患が固形腫瘍である、請求項１もしくは７に記載の方法または請求項２に記載の使用。
9. 前記固形腫瘍が、黒色腫、肺癌、腎細胞癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、頭頸部癌、結腸腺癌、線維肉腫、子宮頸部癌、食道癌、直腸癌、口腔癌、肝臓癌、および膵臓癌からなる群から選択される、請求項８に記載の方法または使用。
10. 前記悪性疾患が、Ｔ細胞悪性腫瘍または骨髄性悪性腫瘍を含む、請求項１もしくは７に記載の方法または請求項２に記載の使用。
11. 前記被験体が自己免疫疾患または炎症性疾患と診断されている、請求項６に記載の方法。
12. 前記自己免疫疾患または炎症性疾患が、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節炎、および狼瘡からなる群から選択される、請求項４もしくは１１に記載の方法または請求項５に記載の使用。
13. 前記自己免疫疾患または炎症性疾患が慢性容態である、請求項４、１１、もしくは１２に記載の方法または請求項５もしくは１２に記載の使用。
14. 前記自己免疫疾患または炎症性疾患が急性容態である、請求項４、１１、もしくは１２に記載の方法または請求項５もしくは１２に記載の使用。
15. 前記ＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤が、ポリヌクレオチド剤である、請求項１、３、４、もしくは６のいずれか１項に記載の方法または請求項２もしくは５に記載の使用。
16. 前記ポリヌクレオチド剤が、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボザイム、およびＤＮＡザイムからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記ＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤が抗体である、請求項１、３、４、もしくは６のいずれか１項に記載の方法または請求項２もしくは５の使用。
18. 前記抗体が、前記ＣＤ８４の細胞外部分の少なくとも１つのエピトープに結合する、請求項１７に記載の方法または使用。
19. 前記抗体がＣＤ８４中和抗体である、請求項１７または１８に記載の方法または使用。
20. 前記ＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤が、前記Ｔ細胞上のプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、リンパ球活性化遺伝子３（Ｌａｇ−３）、キラー細胞レクチン様受容体Ｇ１（ＫＬＲＧ１）、および／または２Ｂ４のうちの任意の１つの活性または発現を下方制御する、請求項１もしくは３に記載の方法または請求項２に記載の使用。
21. 前記治療有効量のＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤により、前記Ｔ細胞によるＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮγの産生、および／またはＣＤ１０７の発現の増加に関連する前記Ｔ細胞疲弊が逆行する、請求項１もしくは３に記載の方法または請求項２に記載の使用。
22. 前記Ｂ制御性細胞の活性またはレベルの上昇が、脾臓内のＢ制御性細胞レベルの増加によって示される、請求項６に記載の方法。
23. 前記Ｂ制御性細胞の活性またはレベルの上昇が、前記Ｂ制御性細胞による抗炎症性サイトカイン産生の増加によって示される、請求項６に記載の方法。
24. 前記抗炎症性サイトカインが、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ−１、およびＩＬ−３５からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法または使用。
25. 前記Ｂ制御性細胞の活性またはレベルの上昇が、前記Ｂ制御性細胞によるＣＤ１９、ＩＬ−１０、およびＣＤ１ｄからなる群から選択されるＢｒｅｇマーカーの発現の増加に関連する、請求項６に記載の方法。
26. 前記Ｂ制御性細胞の活性またはレベルの上昇が、Ｂ１０Ｂ制御性細胞の増加に関連する、請求項６に記載の方法。
27. Ｔ細胞疲弊に関与する悪性疾患の処置を必要とする被験体において、前記疾患を処置する方法であって、治療有効量のＳＬＡＭＦ１の活性または発現を減少させることができる薬剤を前記被験体に投与し、但し、前記薬剤がＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤ではないことを条件とし、それにより、前記Ｔ細胞疲弊に関与する悪性疾患を処置する、投与する工程を含む、方法。
28. Ｔ細胞疲弊に関与する悪性疾患の処置を必要とする被験体において、前記疾患を処置するための治療有効量のＳＬＡＭＦ１の活性または発現を減少させることができる薬剤の使用であって、但し、前記薬剤がＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤ではないことを条件とする、使用。
29. Ｔ細胞疲弊の防止または逆行を必要とする被験体において、前記Ｔ細胞疲弊を防止または逆行する方法であって、治療有効量のＳＬＡＭＦ１の活性または発現を減少させることができる薬剤を前記被験体に投与し、但し、前記薬剤がＣＤ８４の活性または発現を減少させることができる薬剤ではないことを条件とし、それにより、前記被験体における前記Ｔ細胞疲弊を防止または逆行する、投与する工程を含む、方法。
30. 前記被験体が悪性疾患と診断されている、請求項２９に記載の方法。
31. 前記悪性疾患がＢ細胞悪性腫瘍である、請求項２７もしくは３０に記載の方法または請求項２８に記載の使用。
32. 前記Ｂ細胞悪性腫瘍が、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）／慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫−粘膜関連リンパ系組織リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、毛様細胞白血病、原発性中枢神経系リンパ腫、脾性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、リンパ球形質細胞性リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性リンパ芽球性プレＢ細胞白血病、形質細胞性白血病、プレＢ細胞白血病、早期プレＢ細胞白血病、およびプレＢ急性リンパ芽球様白血病からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法または使用。
33. 前記ＳＬＡＭＦ１の活性または発現を減少させることができる薬剤がポリヌクレオチド剤である、請求項２７もしくは２９に記載の方法または請求項２８に記載の使用。
34. 前記ポリヌクレオチド剤が、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボザイム、およびＤＮＡザイムからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法または使用。
35. 前記ＳＬＡＭＦ１の活性または発現を減少させることができる薬剤がＳＬＡＭＦ１抗体である、請求項２７もしくは２９に記載の方法または請求項２８に記載の使用。
36. 前記ＳＬＡＭＦ１の活性または発現を減少させることができる薬剤が、前記Ｔ細胞上のプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、リンパ球活性化遺伝子３（Ｌａｇ−３）、キラー細胞レクチン様受容体Ｇ１（ＫＬＲＧ１）、および／または２Ｂ４の活性または発現を下方制御する、請求項２７もしくは２９に記載の方法または請求項２８に記載の使用。
37. 前記治療有効量のＳＬＡＭＦ１の活性または発現を減少させることができる薬剤により、前記Ｔ細胞によるＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮγの産生および／またはＣＤ１０７の発現の増加に関連する前記Ｔ細胞疲弊が逆行する、請求項２７もしくは２９に記載の方法または請求項２８に記載の使用。
38. 前記被験体に化学療法薬、抗体免疫療法、および／または放射線療法を施す工程をさらに含む、請求項１、３、４、６、２７、または２９のいずれか１項に記載の方法。
39. 化学療法薬、抗体免疫療法、および／または放射線療法の使用をさらに含む、請求項２、５、または２８のいずれか１項に記載の使用。
40. 前記被験体がヒト被験体である、請求項１、３、４、６、２７、もしくは２９のいずれか１項に記載の方法または請求項２、５、もしくは２８のいずれか１項に記載の使用。