CN113347997A - 用于经口递送异源有效载荷的Cholix衍生的携带体 - Google Patents

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冯卫军
塔希尔·玛穆德
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刘可伊
兰德尔·J·米斯尼
查尔斯·奥尔森
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Abstract

本公开提供了递送构建体，其包含与异源有效载荷偶联的携带体，其中所述携带体与所述有效载荷的偶联可以导致所述有效载荷(例如，治疗性有效载荷)被转运到完整的极化上皮细胞(例如，哺乳动物的肠上皮细胞)中和/或转运穿过所述细胞。所述递送构建体可以是药物组合物的部分，所述药物组合物可以口服施用给受试者，以提供用于治疗例如炎性疾病或自身免疫疾病的改进的有效疗法。

Description

用于经口递送异源有效载荷的Cholix衍生的携带体
交叉引用
本申请要求2019年3月8日提交的PCT申请号PCT/US2019/021474和2019年8月16日提交的美国临时申请号62/888,144；2019年8月16日提交的62/888,400；2019年8月16日提交的62/888,133；2019年3月8日提交的62/816,022；以及2018年11月7日提交的62/756,889的权益，所述申请出于所有目的以引用方式整体并入本文。
背景技术
肠上皮已妨碍经口施用大治疗性分子诸如蛋白质的努力，因为蛋白质不可穿过完整的上皮屏障扩散或通过紧密连接穿过屏障扩散。一旦被上皮细胞吸收，治疗性蛋白质即进入破坏性的溶酶体运输途径或重新释放到肠腔中。这种无法容易地穿过肠上皮转运继续成为开发商业上可行的口服制剂的限制性因素，尤其是对于基于多肽的治疗剂。常见解决方案是使用肠胃外施用，诸如静脉内或皮下施用，但是这些施用途径通常可产生相当大的副作用、降低治疗功效，并且降低患者便利性，由此可能负面地影响依从性。需要用于将治疗剂转运到上皮(例如，肠上皮)中或转运穿过所述上皮的改进的组合物和方法。
以引用方式并入
在本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请以引用的方式并入本文，其程度就如同每个单独的公布、专利或专利申请被具体和单独地指出以引用的方式并入一般。
发明内容
在一个方面，本公开提供一种携带体-有效载荷复合物，其包含携带体，所述携带体能够胞吞到极化上皮细胞中并聚积在细胞的区域中，其中有效载荷对于携带体是异源的。在一些实施方案中，所述区域为顶端区室、核上区室或基底区室。在一些实施方案中，携带体在所述区域中保留至少5分钟、10分钟或15分钟。在一些实施方案中，携带体衍生自Cholix多肽。在一些实施方案中，携带体为具有Cholix序列的多肽，其在位置150-195中的任一个处具有C末端。在一些实施方案中，携带体为具有Cholix序列的多肽，其在位置1-41中的任一个处具有N末端。在一些实施方案中，携带体为具有Cholix序列的多肽，其在位置35-40中的任一个处具有N末端截短。在一些实施方案中，携带体为具有Cholix序列的多肽，其在位置150-205中的任一个处具有C末端。在一些实施方案中，携带体由从SEQ ID NO:130所示的序列的N末端位置40至C末端位置150-205中的任一个位置的氨基酸残基组成。在一些实施方案中，携带体具有处于SEQ ID NO:130所示的序列的位置150或187处的C末端。在一些实施方案中，携带体由SEQ ID NO:137所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，携带体由SEQ ID NO:137-139中的任一个所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，位置编号是基于Cholix多肽与SEQ ID NO:130所示的序列的比对，其中位置从N末端到C末端进行编号，从N末端处的位置1开始。在一些实施方案中，与能够穿过极化上皮细胞胞吞转运的携带体相比，所述携带体能够在携带体胞吞到极化上皮细胞中之后更长时间地保持与顶端进入受体缔合。在一些实施方案中，顶端进入受体为TMEM132受体。在一些实施方案中，极化上皮细胞包括胃肠极化上皮细胞。
在一个方面，本公开提供一种携带体-有效载荷复合物，其包含(i)携带体，所述携带体衍生自具有处于位置195-347中的任一个处的C末端的Cholix多肽并且能够穿过极化上皮细胞胞吞转运，(ii)异源有效载荷，所述携带体与所述异源有效载荷偶联。在一些实施方案中，位置编号是基于Cholix多肽与SEQ ID NO:130所示的序列的比对，其中位置从N末端到C末端进行编号，从N末端处的位置1开始。在一些实施方案中，C末端处于位置195-266中的任一个处。在一些实施方案中，C末端处于SEQ ID NO:1-2或4-78所示的任一序列的位置195-266中的任一个处。在一些实施方案中，C末端处于SEQ ID NO:130所示的序列的位置206、245、251或266中的任一个处。在一些实施方案中，C末端处于SEQ ID NO:1-2或4-78的位置206、245、251或266中的任一个处。在一些实施方案中，C末端处于SEQ ID NO:1-2或4-78中的任一个的位置206处。在一些实施方案中，携带体由SEQ ID NO:131或184所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，C末端处于SEQ ID NO:1-2或4-78中的任一个的位置245处。在一些实施方案中，携带体由SEQ ID NO:132或183所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，C末端处于SEQ ID NO:1-2或4-78的位置251处。在一些实施方案中，携带体由SEQID NO:133或182所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，C末端处于SEQ ID NO:1-2或4-78的位置266处。在一些实施方案中，携带体由SEQ ID NO:134或181所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，携带体由具有处于位置195-347中的任一个处的截短的SEQ ID NO:1-2或4-78所示的序列组成，并且具有处于SEQ ID NO:1-2或4-78的位置1-40、133-151、152-187或188-206中的任一个处的不超过5、4、3、2或1个氨基酸变异。
在一个方面，本公开提供一种携带体-有效载荷复合物，其包含(i)携带体，所述携带体衍生自包含SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够胞吞到极化上皮细胞中或极化上皮细胞胞吞转运的片段，(ii)异源有效载荷，所述携带体与所述异源有效载荷偶联。在一些实施方案中，携带体包含位置3处的谷氨酸和位置4处的丙氨酸。在一些实施方案中，携带体是无毒的。在一些实施方案中，携带体能够穿过极化上皮细胞胞吞转运异源有效载荷。在一些实施方案中，携带体包含能够极化上皮细胞胞吞转运的片段，其中携带体具有处于SEQ ID NO:1-2或4-78中的任一个所示的序列的位置195至C末端残基中的任一个处的C末端。在一些实施方案中，C末端处于SEQ IDNO:1-2或4-78中的任一个所示的序列的位置195-386中的任一个处。在一些实施方案中，C末端处于SEQ ID NO:1-2或4-78所示的任一序列的位置386处。在一些实施方案中，C末端处于SEQ ID NO:1-2所示的任一序列的位置386处。在一些实施方案中，携带体由SEQ ID NO:135所示的氨基酸序列组成。
在一个方面，本公开提供一种携带体-有效载荷复合物，其包含(i)携带体，所述携带体衍生自不包含SEQ ID NO:179并且不由SEQ ID NO:126组成的Cholix多肽，所述携带体与(ii)异源有效载荷复合，其中携带体能够(a)穿过极化上皮细胞胞吞转运异源有效载荷；或(b)将异源有效载荷转运到极化上皮细胞中。在一些实施方案中，携带体相比于SEQ IDNO:130所示的序列或其片段包含至少75％的序列一致性。在一些实施方案中，携带体相比于SEQ ID NO:130所示的Cholix变体或其片段包含至少90％的序列一致性。在一些实施方案中，Cholix多肽为SEQ ID NO:130所示的序列或其片段。在一些实施方案中，携带体包含位置3处的谷氨酸和位置4处的丙氨酸。在一些实施方案中，携带体是无毒的。在一些实施方案中，携带体能够穿过极化上皮细胞胞吞转运异源有效载荷。在一些实施方案中，携带体具有处于SEQ ID NO:130所示的序列的位置195-633中的任一个处的C末端截短。在一些实施方案中，C末端截短处于SEQ ID NO:130所示的序列的位置195-386中的任一个处。在一些实施方案中，携带体具有处于SEQ ID NO:1-2或4-78所示的任一序列的位置195-386中的任一个处的C末端截短。在一些实施方案中，C末端截短处于SEQ ID NO:1-2或4-78所示的任一序列的位置386处。在一些实施方案中，C末端截短处于SEQ ID NO:1-2所示的任一序列的位置386处。在一些实施方案中，携带体-有效载荷复合物包含N末端甲硫氨酸。在一些实施方案中，携带体与异源有效载荷合成性地缀合。在一些实施方案中，携带体与异源有效载荷遗传性地融合。在一些实施方案中，异源有效载荷为治疗性有效载荷。在一些实施方案中，治疗性有效载荷为细胞因子、抗体、激素或核酸。在一些实施方案中，治疗性有效载荷为细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子为白介素。在一些实施方案中，白介素为IL-10。在一些实施方案中，IL-10包含相比于SEQ ID NO:145所示的氨基酸序列具有至少90％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，白介素为IL-22。在一些实施方案中，IL-22包含相比于SEQID NO:142所示的氨基酸序列具有至少90％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，治疗性有效载荷为抗体。在一些实施方案中，抗体为抗TNF抗体。在一些实施方案中，治疗性有效载荷为激素。在一些实施方案中，治疗性有效载荷为人生长激素。在一些实施方案中，异源有效载荷与携带体共价偶联。在一些实施方案中，异源有效载荷与携带体的C末端偶联。在一些实施方案中，异源有效载荷与携带体的N末端偶联。在一些实施方案中，携带体通过间隔子而与异源有效载荷偶联。在一些实施方案中，间隔子为不可裂解的间隔子。在一些实施方案中，间隔子包含介于1与100个之间的氨基酸残基。在一些实施方案中，间隔子包含多达15个重复的GS、GGS、GGGS、GGGGS、GGGGGS，或其组合。在一些实施方案中，间隔子包含SEQ ID NO:175所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，间隔子由SEQ ID NO:176所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，异源有效载荷与携带体非共价偶联。在一些实施方案中，异源有效载荷通过纳米颗粒而与携带体复合。
在一个方面，本公开提供一种穿过极化上皮细胞胞吞转运异源有效载荷的方法，其包括：(a)使极化上皮细胞的顶端膜与携带体-有效载荷复合物接触；以及(b)穿过极化上皮细胞胞吞转运携带体-有效载荷复合物，其中携带体-有效载荷复合物包含携带体，所述携带体衍生自具有SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够穿过极化上皮细胞胞吞转运携带体-有效载荷复合物的片段，所述携带体与异源有效载荷偶联。在一些实施方案中，使极化上皮细胞的顶端膜与携带体-有效载荷复合物接触包括携带体与顶端进入受体TMEM132的相互作用。在一些实施方案中，携带体与膜蛋白TMEM132的相互作用导致对携带体-有效载荷复合物的受体介导的胞吞。在一些实施方案中，与TMEM132相互作用的携带体包含SEQ ID NO:130的氨基酸残基135-151，或相比于其具有至少90％序列一致性的序列。在一些实施方案中，携带体-有效载荷复合物穿过极化上皮细胞的胞吞转运包括携带体相互作用于GRP75、ERGIC-53和串珠蛋白聚糖(perlecan)中的任何一种或多种。在一些实施方案中，携带体-有效载荷复合物穿过极化上皮细胞的胞吞转运还包括携带体-有效载荷复合物与COPI、EEA1和Rab7中的任何一种或多种共定位在上皮细胞的顶端侧，以及与Rab11a共定位在上皮细胞的基底侧。在一些实施方案中，与GRP7或ERGIC-53相互作用的携带体包含SEQ ID NO:130的氨基酸残基1-40和152-187，或相比于其具有至少90％序列一致性的序列。在一些实施方案中，与串珠蛋白聚糖相互作用的携带体包含SEQ ID NO:130的氨基酸残基188-205，或相比于其具有至少90％序列一致性的序列。在一些实施方案中，所述方法还可以包括在(b)之后将携带体-有效载荷复合物递送到固有层中。在一些实施方案中，极化上皮细胞为极化肠上皮细胞。
在一个方面，本公开提供一种将异源有效载荷经口递送至受试者的方法，其包括：向受试者经口施用携带体-有效载荷复合物，其中携带体能够穿过极化上皮胞吞转运携带体-有效载荷复合物，从而将异源有效载荷递送至受试者，并且其中携带体-有效载荷复合物包含携带体，所述携带体衍生自具有SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够穿过上皮胞吞转运携带体-有效载荷复合物的片段，所述携带体与异源有效载荷偶联。
在一个方面，本公开提供一种用于通过方法将异源有效载荷经口递送至受试者的携带体-有效载荷复合物，所述方法包括：向受试者经口施用携带体-有效载荷复合物，其中携带体能够穿过极化上皮胞吞转运携带体-有效载荷复合物，从而治疗受试者的疾病，并且其中携带体-有效载荷复合物包含携带体，所述携带体衍生自具有SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够穿过上皮胞吞转运携带体-有效载荷复合物的片段，所述携带体与异源有效载荷偶联。
在一个方面，本公开提供携带体-有效载荷复合物用于通过方法将异源有效载荷经口递送至受试者的用途，所述方法包括：向受试者经口施用携带体-有效载荷复合物；其中携带体能够穿过极化上皮胞吞转运携带体-有效载荷复合物，从而治疗受试者的疾病，并且其中携带体-有效载荷复合物包含携带体，所述携带体衍生自具有SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够穿过上皮胞吞转运携带体-有效载荷复合物的片段，所述携带体与异源有效载荷偶联。
在一个方面，本公开提供一种治疗受试者的疾病的方法，其包括：向受试者经口施用携带体-有效载荷复合物，其中携带体能够穿过极化上皮胞吞转运携带体-有效载荷复合物，从而治疗受试者的疾病，并且其中携带体-有效载荷复合物包含携带体，所述携带体衍生自具有SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够穿过上皮胞吞转运携带体-有效载荷复合物的片段，所述携带体与异源有效载荷偶联。
在一个方面，本公开提供一种用于通过方法治疗受试者的疾病的携带体-有效载荷复合物，所述方法包括：向受试者经口施用携带体-有效载荷复合物，其中携带体能够穿过极化上皮胞吞转运携带体-有效载荷复合物，从而治疗受试者的疾病，并且其中携带体-有效载荷复合物包含携带体，所述携带体衍生自具有SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够穿过上皮胞吞转运携带体-有效载荷复合物的片段，所述携带体与异源有效载荷偶联。
在一个方面，本公开提供携带体-有效载荷复合物在用于通过方法治疗受试者的疾病的药物的制造中的用途，所述方法包括：向受试者经口施用携带体-有效载荷复合物，其中携带体能够穿过极化上皮胞吞转运携带体-有效载荷复合物，从而治疗受试者的疾病，并且其中携带体-有效载荷复合物包含携带体，所述携带体衍生自具有SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够穿过上皮胞吞转运携带体-有效载荷复合物的片段，所述携带体与异源有效载荷偶联。在一些实施方案中，所述方法还包括使异源有效载荷与固有层中的受体结合。在一些实施方案中，所述方法还包括将异源有效载荷递送到体循环中。在一些实施方案中，携带体为Cholix衍生的多肽。在一些实施方案中，携带体包含SEQ ID NO:130所示的序列的氨基酸残基1-206、1-245、1-251、1-266或1-386。在一些实施方案中，携带体包含SEQ ID NO:1-2所示的序列的氨基酸残基1-206、1-245、1-251、1-266或1-386。在一些实施方案中，携带体包含SEQ ID NO:131-135或180-184所示的氨基酸序列中的任一个。在一些实施方案中，极化上皮为极化肠上皮。在一些实施方案中，疾病为溃疡性结肠炎、囊炎、直肠炎、克罗恩病、多发性硬化症(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)、移植物抗宿主病(GVHD)、类风湿性关节炎或银屑病。在一些实施方案中，疾病为溃疡性结肠炎。在一些实施方案中，溃疡性结肠炎为轻度至中度或中度至重度的。在一些实施方案中，疾病为克罗恩病。在一些实施方案中，克罗恩病为瘘管型克罗恩病。在一些实施方案中，有效载荷为白介素。在一些实施方案中，白介素包含SEQ ID NO:142或145的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供一种将异源有效载荷转运到极化上皮细胞中的方法，其包括：(a)使极化上皮细胞的顶端膜与携带体-有效载荷复合物接触；以及(b)将携带体-有效载荷复合物转运到极化上皮细胞中，其中携带体-有效载荷复合物包含携带体，所述携带体衍生自具有SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够将携带体-有效载荷复合物转运到上皮细胞中的片段，所述携带体与异源有效载荷偶联。在一些实施方案中，使极化上皮细胞的顶端膜与携带体-有效载荷复合物接触包括携带体与顶端进入受体TMEM132的相互作用。在一些实施方案中，携带体与顶端进入受体TMEM132的相互作用导致对携带体-有效载荷复合物的受体介导的胞吞。在一些实施方案中，所述方法还包括将异源有效载荷转运至顶端区室或基底区室。在一些实施方案中，携带体-有效载荷复合物的携带体在胞吞之后保持与TMEM132缔合。在一些实施方案中，与TMEM132相互作用的携带体包含SEQ ID NO:130的氨基酸残基135-151，或相比于其具有至少90％序列一致性的序列。在一些实施方案中，携带体为Cholix衍生的多肽。在一些实施方案中，携带体由SEQ ID NO:130所示的序列的氨基酸残基1-151、1-187、41-187或40-205组成。在一些实施方案中，携带体由SEQ ID NO:1-2所示的序列的氨基酸残基1-151、1-187、41-187或40-205组成。在一些实施方案中，携带体由SEQ ID NO:136-139所示的氨基酸序列中的任一个组成。在一些实施方案中，携带体通过纳米颗粒而与异源有效载荷非共价偶联。在一些实施方案中，纳米颗粒上异源有效载荷与携带体的比率为至少15,000:1。在一些实施方案中，异源有效载荷为降糖剂。在一些实施方案中，降糖剂与纳米颗粒非共价缔合。在一些实施方案中，异源有效载荷为siRNA。在一些实施方案中，siRNA与纳米颗粒非共价缔合。在一些实施方案中，携带体与纳米颗粒共价连接或喷雾干燥在纳米颗粒上。
在一个方面，本公开提供一种包括将异源有效载荷转运到极化上皮细胞中的方法，其包括：(a)使极化上皮细胞的顶端膜与携带体-有效载荷复合物接触；以及(b)将携带体-有效载荷复合物转运到极化上皮细胞中，其中携带体-有效载荷复合物为包含本文的任何胞吞携带体的携带体-有效载荷复合物。
在一个方面，本公开包括一种携带体-有效载荷复合物，其包含携带体，所述携带体能够在对携带体的胞吞后至少5分钟聚积在极化上皮细胞的顶端区室中，所述携带体与异源有效载荷偶联。
在一些实施方案中，携带体能够在对携带体的胞吞后至少10分钟聚积在极化上皮细胞的顶端区室中。在一些实施方案中，携带体能够在对携带体的胞吞后至少15分钟聚积在极化上皮细胞的顶端区室中。
在一些实施方案中，极化上皮细胞包括胃肠极化上皮细胞。在一些实施方案中，极化上皮细胞包括大鼠胃肠极化上皮细胞。
在另一方面，本公开包括一种携带体-有效载荷复合物，其包含携带体，所述携带体能够在将携带体管腔内施加至哺乳动物的胃肠道后至少5分钟聚积在极化上皮细胞的顶端区室中，所述携带体与异源有效载荷偶联。
在一些实施方案中，携带体能够在将携带体管腔内施加至哺乳动物的胃肠道后至少10分钟聚积在极化上皮细胞的顶端区室中。在一些实施方案中，携带体能够在将携带体管腔内施加至哺乳动物的胃肠道后至少15分钟聚积在极化上皮细胞的顶端区室中。
在一些实施方案中，管腔内施加包括管腔内注射到大鼠空肠中。
在另一方面，本公开包括一种携带体-有效载荷复合物，其包含携带体，所述携带体能够在对携带体的胞吞后至少5分钟聚积在极化上皮细胞的核上区室中，所述携带体与异源有效载荷偶联。
在一些实施方案中，携带体能够在对携带体的胞吞后至少10分钟聚积在极化上皮细胞的核上区室中。在一些实施方案中，携带体能够在对携带体的胞吞后至少15分钟聚积在极化上皮细胞的核上区室中。
在一些实施方案中，极化上皮细胞包括胃肠极化上皮细胞。在一些实施方案中，极化上皮细胞包括大鼠胃肠极化上皮细胞。
在另一方面，本公开包括一种携带体-有效载荷复合物，其包含携带体，所述携带体能够在将携带体管腔内施加至哺乳动物的胃肠道后至少5分钟聚积在极化上皮细胞的核上区室中，所述携带体与异源有效载荷偶联。
在一些实施方案中，携带体能够在将携带体管腔内施加至哺乳动物的胃肠道后至少10分钟聚积在极化上皮细胞的核上区室中。在一些实施方案中，携带体能够在将携带体管腔内施加至哺乳动物的胃肠道后至少15分钟聚积在极化上皮细胞的核上区室中。
在一些实施方案中，管腔内施加包括管腔内注射到大鼠空肠中。
在另一方面，本公开包括一种携带体-有效载荷复合物，其包含携带体，所述携带体能够在对携带体的胞吞后至少5分钟聚积在极化上皮细胞的基底区室中，所述携带体与异源有效载荷偶联。
在一些实施方案中，携带体能够在对携带体的胞吞后至少10分钟聚积在极化上皮细胞的基底区室中。在一些实施方案中，携带体能够在对携带体的胞吞后至少15分钟聚积在极化上皮细胞的基底区室中。
在一些实施方案中，极化上皮细胞包括胃肠极化上皮细胞。在一些实施方案中，极化上皮细胞包括大鼠胃肠极化上皮细胞。
在另一方面，本公开包括一种携带体-有效载荷复合物，其包含携带体，所述携带体能够在将携带体管腔内施加至哺乳动物的胃肠道后至少5分钟聚积在极化上皮细胞的基底区室中，所述携带体与异源有效载荷偶联。
在一些实施方案中，携带体能够在将携带体管腔内施加至哺乳动物的胃肠道后至少10分钟聚积在极化上皮细胞的基底区室中。在一些实施方案中，携带体能够在将携带体管腔内施加至哺乳动物的胃肠道后至少15分钟聚积在极化上皮细胞的基底区室中。
在一些实施方案中，管腔内施加包括管腔内注射到大鼠空肠中。
在另一方面，本公开包括一种携带体-有效载荷复合物，其包含携带体，所述携带体衍生自具有处于位置195-347中的任一个处的C末端的Cholix多肽，与异源有效载荷偶联。在一些实施方案中，位置编号是基于Cholix多肽与SEQ ID NO:130所示的序列的比对，其中位置从N末端到C末端进行编号，从N末端处的位置1开始。
在一些实施方案中，C末端截短处于SEQ ID NO:130所示的序列的位置195-266中的任一个处。在一些实施方案中，C末端截短处于SEQ ID NO:1-2或4-78所示的任一序列的位置195-266中的任一个处。在一些实施方案中，C末端截短处于SEQ ID NO:130所示的序列的位置206、245、251或266中的任一个处。在一些实施方案中，C末端截短处于SEQ ID NO:1-2或4-78的位置206、245、251或266中的任一个处。
在一些实施方案中，C末端截短处于SEQ ID NO:1-2或4-78中的任一个的位置206处。在一些实施方案中，携带体由SEQ ID NO:131或184所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，C末端截短处于SEQ ID NO:1-2或4-78中的任一个的位置245处。在一些实施方案中，携带体由SEQ ID NO:132或183所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，C末端截短处于SEQ ID NO:1-2或4-78的位置251处。在一些实施方案中，携带体由SEQ ID NO:133或182所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，C末端截短处于SEQ ID NO:1-2或4-78的位置266处。在一些实施方案中，携带体由SEQ ID NO:134或181所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，携带体由具有处于位置195-347中的任一个处的截短的SEQ ID NO:1-2或4-78所示的序列组成，并且具有处于SEQ ID NO:1-2或4-78的位置1-40、133-151、152-187或188-206中的任一个处的不超过5、4、3、2或1个氨基酸变异。
在另一方面，本公开包括一种携带体-有效载荷复合物，其包含携带体，所述携带体衍生自具有处于位置1-41处的N末端和处于位置150-195处的C末端的Cholix多肽，或由从SEQ ID NO:130所示的序列的N末端位置35-40中任一个至C末端位置150-205中的任一个的氨基酸残基组成，与异源有效载荷偶联。在一些实施方案中，位置编号是基于Cholix多肽与SEQ ID NO:130所示的序列的比对，其中位置从N末端到C末端进行编号，从N末端处的位置1开始。
在一些实施方案中，在携带体胞吞到极化上皮细胞中之后，携带体能够保持与顶端进入受体缔合。在一些实施方案中，顶端进入受体为TMEM132受体(例如，TMEM132A)。
在一些实施方案中，携带体由从SEQ ID NO:130所示的序列的N末端位置40至C末端位置150-205中的任一个位置的氨基酸残基组成。在一些实施方案中，携带体具有处于SEQ ID NO:130所示的序列的位置150或186处的C末端截短。
在一些实施方案中，携带体能够将有效载荷转运至极化上皮细胞中的基底区室或核上区室。在一些实施方案中，携带体由SEQ ID NO:136所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，携带体能够将有效载荷转运至极化上皮细胞中的顶端区室。
在一些实施方案中，携带体由SEQ ID NO:137-139中的任一个所示的氨基酸序列组成。
在另一方面，本公开包括一种携带体-有效载荷复合物，其包含携带体，所述携带体衍生自具有SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够胞吞到极化上皮细胞中或极化上皮细胞胞吞转运的片段，所述携带体与异源有效载荷偶联。
在一些实施方案中，携带体包含位置3处的谷氨酸和位置4处的丙氨酸。
在一些实施方案中，携带体是无毒的。
在一些实施方案中，携带体能够穿过极化上皮细胞胞吞转运异源有效载荷。
在一些实施方案中，携带体包含能够极化上皮细胞胞吞转运的片段，其中携带体具有处于SEQ ID NO:1-2或4-78中的任一个所示的序列的位置195至C末端残基中的任一个处的C末端截短。在一些实施方案中，C末端截短处于SEQ ID NO:1-2或4-78中的任一个所示的序列的位置195-386中的任一个处。在一些实施方案中，C末端截短处于SEQ ID NO:1-2或4-78所示的任一序列的位置386处。在一些实施方案中，C末端截短处于SEQ ID NO:1-2所示的任一序列的位置386处。在一些实施方案中，携带体由SEQ ID NO:135所示的氨基酸序列组成。
在另一方面，本公开包括一种携带体-有效载荷复合物，其包含携带体，所述携带体衍生自不包含SEQ ID NO:179并且不由SEQ ID NO:126组成的Cholix多肽，与异源有效载荷复合，其中携带体能够穿过极化上皮细胞胞吞转运异源有效载荷；或将异源有效载荷转运到极化上皮细胞中。
在一些实施方案中，携带体相比于SEQ ID NO:130所示的序列或其片段包含至少75％的序列一致性。在一些实施方案中，携带体相比于SEQ ID NO:130所示的Cholix变体或其片段包含至少90％的序列一致性。在一些实施方案中，Cholix多肽为SEQ ID NO:130所示的序列或其片段。在一些实施方案中，携带体包含位置3处的谷氨酸和位置4处的丙氨酸。
在一些实施方案中，携带体是无毒的。
在一些实施方案中，携带体能够穿过极化上皮细胞胞吞转运异源有效载荷。
在一些实施方案中，携带体具有处于SEQ ID NO:130所示的序列的位置195-633中的任一个处的C末端截短。在一些实施方案中，C末端截短处于SEQ ID NO:130所示的序列的位置195-386中的任一个处。在一些实施方案中，携带体具有处于SEQ ID NO:1-2或4-78所示的任一序列的位置195-386中的任一个处的C末端截短。在一些实施方案中，C末端截短处于SEQ ID NO:1-2或4-78所示的任一序列的位置386处。在一些实施方案中，C末端截短处于SEQ ID NO:1-2所示的任一序列的位置386处。在一些实施方案中，携带体-有效载荷复合物包含N末端甲硫氨酸。
在一些实施方案中，携带体与异源有效载荷合成性地缀合。在一些实施方案中，携带体与异源有效载荷遗传性地融合。
在一些实施方案中，异源有效载荷为治疗性有效载荷。在一些实施方案中，治疗性有效载荷为细胞因子、抗体、激素或核酸。在一些实施方案中，治疗性有效载荷为细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子为白介素。
在一些实施方案中，白介素为IL-10。在一些实施方案中，IL-10包含相比于SEQ IDNO:145所示的氨基酸序列具有至少90％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，白介素为IL-22。在一些实施方案中，IL-22包含相比于SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列具有至少90％序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，治疗性有效载荷为抗体。在一些实施方案中，抗体为抗TNF抗体。在一些实施方案中，治疗性有效载荷为激素。在一些实施方案中，治疗性有效载荷为人生长激素。
在一些实施方案中，异源有效载荷与携带体共价偶联。在一些实施方案中，异源有效载荷与携带体的C末端偶联。在一些实施方案中，异源有效载荷与携带体的N末端偶联。在一些实施方案中，携带体通过间隔子而与异源有效载荷偶联。
在一些实施方案中，间隔子为不可裂解的间隔子。在一些实施方案中，间隔子包含介于1与100个之间的氨基酸残基。在一些实施方案中，间隔子包含多达15个重复的GS、GGS、GGGS、GGGGS、GGGGGS，或其组合。在一些实施方案中，间隔子包含SEQ ID NO:175所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，间隔子由SEQ ID NO:176所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，异源有效载荷与携带体非共价偶联。在一些实施方案中，异源有效载荷通过纳米颗粒而与携带体复合。
在一个方面，本公开包括一种编码本文所述的携带体-有效载荷复合物(例如，递送构建体)中的任一种的多核苷酸，例如，包含SEQ ID NO:147-150、152-159或188所示的氨基酸序列中的任一个、基本上由其组成或由其组成的那些复合物。
在一个方面，本公开包括一种载体，其包含编码本公开的携带体-有效载荷复合物(例如，递送构建体)的此类多核苷酸中的任一种。
在一个方面，本公开包括一种穿过极化上皮细胞胞吞转运异源有效载荷的方法，其包括：(a)使极化上皮细胞的顶端膜与携带体-有效载荷复合物接触；以及(b)穿过极化上皮细胞胞吞转运携带体-有效载荷复合物，其中携带体-有效载荷复合物包含携带体，所述携带体衍生自具有SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够穿过极化上皮细胞胞吞转运携带体-有效载荷复合物的片段，所述携带体与异源有效载荷偶联。在一些实施方案中，使极化上皮细胞的顶端膜与携带体-有效载荷复合物接触包括携带体与顶端进入受体TMEM132的相互作用。在一些实施方案中，携带体与膜蛋白TMEM132的相互作用导致对携带体-有效载荷复合物的受体介导的胞吞。在一些实施方案中，与TMEM132相互作用的携带体包含SEQ ID NO:130的氨基酸残基135-151，或相比于其具有至少90％序列一致性的序列。在一些实施方案中，携带体-有效载荷复合物穿过极化上皮细胞的胞吞转运包括携带体相互作用于GRP75(例如，GRP75B)、ERGIC-53和串珠蛋白聚糖中的任何一种或多种。在一些实施方案中，携带体-有效载荷复合物穿过极化上皮细胞的胞吞转运还包括携带体-有效载荷复合物与COPI、EEA1和Rab7中的任何一种或多种共定位在上皮细胞的顶端侧，以及与Rab11a共定位在上皮细胞的基底侧。在一些实施方案中，与GRP7或ERGIC-53相互作用的携带体包含SEQ ID NO:130的氨基酸残基1-40和152-187，或相比于其具有至少90％序列一致性的序列。在一些实施方案中，与串珠蛋白聚糖相互作用的携带体包含SEQ ID NO:130的氨基酸残基188-205，或相比于其具有至少90％序列一致性的序列。在一些实施方案中，所述方法还包括在(b)之后将携带体-有效载荷复合物递送到固有层中。在一些实施方案中，极化上皮细胞为极化肠上皮细胞。
在一个方面，本公开包括一种将异源有效载荷经口递送至受试者的方法，其包括：向受试者经口施用携带体-有效载荷复合物，其中携带体能够穿过极化上皮胞吞转运携带体-有效载荷复合物，从而将异源有效载荷递送至受试者，并且其中携带体-有效载荷复合物包含携带体，所述携带体衍生自具有SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够穿过极化上皮胞吞转运携带体-有效载荷复合物的片段，所述携带体与异源有效载荷偶联。
在一个方面，本公开包括一种用于通过方法将异源有效载荷经口递送至受试者的携带体-有效载荷复合物，所述方法包括：向受试者经口施用携带体-有效载荷复合物，其中携带体能够穿过极化上皮胞吞转运携带体-有效载荷复合物，从而治疗受试者的疾病，并且其中携带体-有效载荷复合物包含携带体，所述携带体衍生自具有SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够穿过极化上皮胞吞转运携带体-有效载荷复合物的片段，所述携带体与异源有效载荷偶联。
在一个方面，本公开包括携带体-有效载荷复合物用于通过方法将异源有效载荷经口递送至受试者的用途，所述方法包括：向受试者经口施用携带体-有效载荷复合物；其中携带体能够穿过极化上皮胞吞转运携带体-有效载荷复合物，从而治疗受试者的疾病，并且其中携带体-有效载荷复合物包含携带体，所述携带体衍生自具有SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够穿过极化上皮胞吞转运携带体-有效载荷复合物的片段，所述携带体与异源有效载荷偶联。
在一个方面，本公开包括一种治疗受试者的疾病的方法，其包括：向受试者经口施用携带体-有效载荷复合物，其中携带体能够穿过极化上皮胞吞转运携带体-有效载荷复合物，从而治疗受试者的疾病，并且其中携带体-有效载荷复合物包含携带体，所述携带体衍生自具有SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够穿过极化上皮胞吞转运携带体-有效载荷复合物的片段，所述携带体与异源有效载荷偶联。
在一个方面，本公开包括一种用于通过方法治疗受试者的疾病的携带体-有效载荷复合物，所述方法包括：向受试者经口施用携带体-有效载荷复合物，其中携带体能够穿过极化上皮胞吞转运携带体-有效载荷复合物，从而治疗受试者的疾病，并且其中携带体-有效载荷复合物包含携带体，所述携带体衍生自具有SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够穿过极化上皮胞吞转运携带体-有效载荷复合物的片段，所述携带体与异源有效载荷偶联。
在一个方面，本公开包括携带体-有效载荷复合物在用于通过方法治疗受试者的疾病的药物的制造中的用途，所述方法包括：向受试者经口施用携带体-有效载荷复合物，其中携带体能够穿过极化上皮胞吞转运携带体-有效载荷复合物，从而治疗受试者的疾病，并且其中携带体-有效载荷复合物包含携带体，所述携带体衍生自具有SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够穿过极化上皮胞吞转运携带体-有效载荷复合物的片段，所述携带体与异源有效载荷偶联。在一些实施方案中，所述方法还包括使异源有效载荷与固有层中的受体结合。在一些实施方案中，所述方法还包括将异源有效载荷递送到体循环中。在一些实施方案中，携带体为Cholix衍生的多肽。在一些实施方案中，携带体包含SEQ ID NO:130所示的序列的氨基酸残基1-206、1-245、1-251、1-266或1-386。在一些实施方案中，携带体包含SEQ ID NO:1-2中的任一个所示的序列的氨基酸残基1-206、1-245、1-251、1-266或1-386。在一些实施方案中，携带体包含SEQ IDNO:131-135或180-184所示的氨基酸序列中的任一个。在一些实施方案中，极化上皮为极化肠上皮。在一些实施方案中，疾病为溃疡性结肠炎、囊炎、直肠炎、克罗恩病、多发性硬化症(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)、移植物抗宿主病(GVHD)、类风湿性关节炎或银屑病。在一些实施方案中，疾病为溃疡性结肠炎。在一些实施方案中，溃疡性结肠炎为轻度至中度或中度至重度的。在一些实施方案中，疾病为克罗恩病。在一些实施方案中，克罗恩病为瘘管型克罗恩病。在一些实施方案中，有效载荷为白介素。在一些实施方案中，白介素包含SEQ ID NO:142或145的氨基酸序列。
在一个方面，本公开包括一种将异源有效载荷转运到极化上皮细胞中的方法，其包括：(a)使极化上皮细胞的顶端膜与携带体-有效载荷复合物接触；以及(b)将携带体-有效载荷复合物转运到极化上皮细胞中，其中携带体-有效载荷复合物包含携带体，所述携带体衍生自具有SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够将携带体-有效载荷复合物转运到上皮细胞中的片段，所述携带体与异源有效载荷偶联。在一些实施方案中，使极化上皮细胞的顶端膜与携带体-有效载荷复合物接触包括携带体与顶端进入受体TMEM132的相互作用。在一些实施方案中，携带体与顶端进入受体TMEM132的相互作用导致对携带体-有效载荷复合物的受体介导的胞吞。在一些实施方案中，所述方法还包括将异源有效载荷转运至顶端区室或基底区室。在一些实施方案中，携带体-有效载荷复合物的携带体在胞吞之后保持与TMEM132缔合。在一些实施方案中，与TMEM132相互作用的携带体包含SEQ ID NO:130的氨基酸残基135-151，或相比于其具有至少90％序列一致性的序列。在一些实施方案中，携带体为Cholix衍生的多肽。在一些实施方案中，携带体由SEQ ID NO:130所示的序列的氨基酸残基1-151、1-187、41-187或40-205组成。在一些实施方案中，携带体由SEQ ID NO:1-2所示的序列的氨基酸残基1-151、1-187、41-187或40-205组成。在一些实施方案中，携带体由SEQ ID NO:136-139所示的氨基酸序列中的任一个组成。在一些实施方案中，携带体通过纳米颗粒而与异源有效载荷非共价偶联。在一些实施方案中，纳米颗粒上异源有效载荷与携带体的比率为至少15,000:1。在一些实施方案中，异源有效载荷为降糖剂。在一些实施方案中，降糖剂与纳米颗粒非共价缔合。在一些实施方案中，异源有效载荷为siRNA。在一些实施方案中，siRNA与纳米颗粒非共价缔合。在一些实施方案中，携带体与纳米颗粒共价连接或喷雾干燥在纳米颗粒上。
附图说明
本公开的各种特征在随附的权利要求中具体地陈述。本专利或申请文件包含至少一张彩色附图。具有一张或多张彩色附图的本专利或专利申请公布的副本将在请求且支付必要费用时由官方提供。通过参考阐述示例性方面的以下详细描述和附图(以下也称“图示”和“图”)将获得对本公开的特征和优点的更好的理解，在所述示例性方面中采用了本公开的原理，在所述附图中:
图1示意性地示出一种装置，其包括上皮细胞单层上方的顶端腔室和所述上皮细胞单层下方的基底腔室。对于顶端到基底外侧的通透性(例如，胞吞转运)，将测试制品(例如，携带体、递送构建体、有效载荷等)施加至顶端侧(A)并且确定基底外侧(B)上的透过(例如，被胞吞转运)材料的量(例如，使用蛋白质印迹、色谱法等)。
图2示出包含携带体(SEQ ID NO:134)和IL-22有效载荷(SEQ ID NO:142)的具有SEQ ID NO:147的递送构建体以时间依赖性方式穿过完整的极化的Caco-2肠上皮细胞单层转运IL-22有效载荷(基底外侧部位上的蛋白质的量在将递送构建体施加至单层的顶端膜后15、30和45分钟时测量，如上文在图1中所述)。数据进一步示出，当将包含SEQ ID NO:134的携带体和SEQ ID NO:142的IL-22有效载荷的递送构建体(SEQ ID NO:147)施加至Caco-2上皮细胞时，与将未与携带体偶联的IL-22(SEQ ID NO:143)施加至Caco-2上皮细胞时相比，穿过Caco-2上皮细胞单层的IL-22约2-3倍更多。
图3示出包含携带体(SEQ ID NO:134)和IL-22有效载荷(SEQ ID NO:142)的具有SEQ ID NO:147的递送构建体导致IL-22有效载荷以时间依赖性方式被转运穿过完整且极化的SMI-100肠上皮细胞单层(基底外侧腔室中的蛋白质的量在将递送构建体施加至单层的顶端膜后15、30和45分钟时测量)。数据进一步示出，当将包括与SEQ ID NO:142的IL-22有效载荷偶联的SEQ ID NO:134的携带体的递送构建体施加至SMI-100上皮细胞时，与将未与携带体偶联的IL-22(SEQ ID NO:143)施加至SMI-100上皮细胞时相比，穿过SMI-100上皮细胞单层的IL-22约2-3倍更多。
图4表明，具有SEQ ID NO:147的递送构建体导致IL-22(SEQ ID NO:142)在体内以显著的量被转运穿过完整且极化的肠上皮。肠上皮的顶端部位通过白色箭头#1突出显示。固有层缩写为“l.p.”。极化上皮的外基底膜通过白色箭头#2突出显示。IL-22定位通过白色箭头和绿色荧光指示(例如，白色箭头#3)，蓝色荧光指示DAPI染色。
图5示出第一递送构建体(SEQ ID NO:147)和第二递送构建体(SEQ ID NO:148)转运IL-22有效载荷穿过Caco-2单层(“在转运后”是指蛋白质在转运穿过Caco-2单层之后位于基底外侧区室中)。蛋白质印迹数据进一步显示，递送构建体在转运之后是完整的，例如，如通过不存在较低分子量的降解产物所显示。相对于不存在携带体的情况下IL-22对照蛋白(SEQ ID NO:143)的转运示出利用递送构建体SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:148转运IL-22有效载荷。对照蛋白IL-22由SEQ ID NO:143所示的氨基酸序列组成。
图6示出在胞吞转运之后，在Caco-2上皮细胞单层的基底外侧区室中检测到的递送构建体(SEQ ID NO:147)和IL-22(SEQ ID NO:143)的量。对蛋白质量进行归一化。数据示出，包括Cholix衍生的携带体(SEQ ID NO:134)的递送构建体(SEQ ID NO:147)穿过极化上皮细胞的转运依赖于葡萄糖调节蛋白75(GRP75，例如GRP75B)。与表达GRP75的细胞(指示为Caco-2)相比，具有GRP75敲低的Caco-2细胞(指示为Caco-2GRP75-)显示出显著减少的递送构建体(SEQ ID NO:147)转运。转运对GRP75的依赖性通过与表达GRP75的细胞相比，在GRP75敲低细胞中在基底外侧区室中检测到的递送构建体的量的减少指示。单独的IL-22(SEQ IDNO:143)的转运不受GRP75敲低的影响。
图7示出递送构建体(SEQ ID NO:147)穿过极化上皮细胞的转运依赖于基底膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白(HSPG)。与表达HSPG的细胞(指示为Caco-2)相比，具有此蛋白的敲低的Caco-2细胞(指示为Caco-2HSPG-)显示出显著减少的递送构建体(SEQ IDNO:147)转运。转运对HSPG的依赖性通过与表达HSPG的细胞相比，在HSPG敲低细胞中在基底外侧区室中检测到的递送构建体的量的减少指示。单独的IL-22(SEQ ID NO:143)(即，未与携带体偶联)的转运不依赖于HSPG。
图8描绘使用大鼠管腔内注射模型，在管腔内注射后15分钟，上皮细胞内的顶端区室(用白色箭头#2突出显示)中的递送构建体(SEQ ID NO:154)的荧光显微镜检测(白色箭头#1突出显示顶端表面，白色箭头#3突出显示基底膜，并且白色箭头#4突出显示固有层)。数据表明，衍生自Cholix41-187的实例的携带体(例如，SEQ ID NO:137)能够将有效载荷转运至上皮细胞的顶端区室，但是未穿过上皮细胞。红色荧光示出Cholix携带体的定位，绿色荧光示出hGH(SEQ ID NO:146)的定位，并且蓝色荧光指示DAPI染色。
图9描绘使用大鼠管腔内注射模型，在管腔内注射后15分钟，上皮细胞的顶端区室(用白色箭头#2突出显示)中的递送构建体(SEQ ID NO:156)的荧光显微镜检测(白色箭头#1突出显示顶端表面，白色箭头#3突出显示基底膜，并且白色箭头#4突出显示固有层)。数据表明，衍生自Cholix40-205的实例的携带体(SEQ ID NO:138)能够将有效载荷(例如，hGH)转运至上皮细胞的顶端区室，但是未穿过上皮细胞转运到固有层中。这些数据进一步表明，SEQ ID NO:1的残基1-39可以在胞吞转运中发挥作用，但是可能不是对Cholix携带体的胞吞所需要的。红色荧光示出Cholix携带体的定位，绿色荧光示出hGH(SEQ ID NO:146)的定位，并且蓝色荧光指示DAPI染色。
图10A描绘在将递送构建体管腔内注射至大鼠空肠后5分钟，上皮细胞内部的顶端区室中的递送构建体(SEQ ID NO:153)的荧光显微镜检测。在图10A-10C中，红色荧光示出Cholix携带体的定位，绿色荧光示出hGH(SEQ ID NO:146)的定位，并且蓝色荧光指示DAPI染色；白色箭头#1突出显示顶端区室，并且白色箭头#2突出显示核上区室。
图10B描绘在管腔内注射后10分钟递送构建体(SEQ ID NO:153)的荧光显微镜检测。数据表明，随着时间的推移，携带体将hGH有效载荷从顶端区室转运到核上区室和基底区室。
图10C描绘在管腔内注射后15分钟递送构建体(SEQ ID NO:153)的荧光显微镜检测。数据表明，随着时间的推移，携带体将有效载荷从顶端区室转运到核上区室和基底区室。
图11A-11B描绘与偶联于携带体的hGH(SEQ ID NO:146)相比，单独的人生长激素(hGH，SEQ ID NO:190)的顶端到基底转运。携带体长度通过相对于参考SEQ ID NO:1的C末端截短指示(例如，“134”指示具有SEQ ID NO:1的残基1-134的携带体)。所有携带体还包含N末端甲硫氨酸)。HGH的蛋白质印迹法定性地评估在2h之后这些蛋白质在体外穿过单层极化的原代人小肠上皮细胞进行顶端到基底转运的能力。顶端施加的材料的量以摩尔计相当于hGH含量并且在分析之前基底收集物被浓缩约10倍。
图11A示出单独的hGH(SEQ ID NO:190)的顶端到基底转运相对于针对递送构建体所测量的顶端到基底转运的比较，所述递送构建体包含具有相应地处于位置134、151、187、41-187和266处的截短的SEQ ID NO:151–SEQ ID NO:154和SEQ ID NO:159所示的序列。数据表明，与包含具有处于266处的C末端截短的Cholix携带体(SEQ ID NO:159)的构建体相比，具有处于SEQ ID NO:1的位置134、151、187处的C末端截短的，或处于SEQ ID NO:1的41处的N末端截短和187处的C末端截短的Cholix携带体显示出对联合的hGH的显著较低的顶端到基底转运。
图11B示出，与SEQ ID NO:1相比，具有SEQ ID NO:155和SEQ ID NO:157–SEQ IDNO:159并且包括具有相应地处于位置206(SEQ ID NO:131)、245(SEQ ID NO:132)、251(SEQID NO:133)和266(SEQ ID NO:134)处的C末端截短的Cholix携带体的递送构建体展示出对联合的hGH(SEQ ID NO:146)有效的顶端到基底转运。虽然具有处于位置245和251处的Cholix C末端截短的携带体展示出与具有处于位置266处的C末端截短的携带体相当的对联合的hGH(SEQ ID NO:146)的顶端到基底转运，但是与具有处于位置245、251和266处的C末端截短的携带体相比，具有处于位置206处的Cholix C末端截短的携带体显示出对hGH显著增强的顶端到基底转运。
图12A-12F示出各自包括不同的Cholix携带体的六种递送构建体在大鼠空肠中穿过极化肠上皮细胞的顶端到基底转运的程度。Cholix携带体(红色荧光)和hGH(绿色荧光)的定位通过分别使用多克隆抗Cholix抗体和单克隆抗hGH抗体通过免疫荧光显微镜法展示。白色箭头指示顶端膜，“l-p”是指固有层，“GC”是指杯状细胞，并且空心箭头指示固有层中存在的递送构建体。
图12A示出包括与hGH(SEQ ID NO:146)偶联的Cholix携带体(SEQ ID NO:140)的递送构建体(SEQ ID NO:151)的管腔内注射后15分钟的顶端到基底转运程度。图12A示出携带体不能使递送构建体进入上皮细胞，表明具有SEQ ID NO:1的氨基酸残基135-151的功能序列片段可以在胞吞进入极化上皮细胞中发挥作用(相比之下，图12B表明具有SEQ ID NO:139的携带体使得相应的递送构建体能够通过胞吞而进入细胞)。
图12B示出包括与hGH(SEQ ID NO:146)偶联的Cholix携带体(SEQ ID NO:139)的递送构建体(SEQ ID NO:152)的管腔内注射后15分钟的顶端到基底转运程度，如通过免疫荧光显微镜法所展示。图12B示出此构建体的确进入上皮细胞(与图12A中描述的具有SEQID NO:151的构建体相反)，但是主要保留在顶端，并且在一定程度上保留在基底囊泡池(basal vesicular pool)中，但是未进入固有层，从而实现将有效载荷递送到上皮细胞的顶端区室和基底区室中。
图12C示出包括与hGH(SEQ ID NO:146)偶联的Cholix携带体(SEQ ID NO:136)的递送构建体(SEQ ID NO:153)的管腔内注射后15分钟的顶端到基底转运程度，如通过免疫荧光显微镜法所展示。图12C示出此构建体进入上皮细胞，到达顶端区室和基底区室并且还到达细胞的核上区域，而仍保留在上皮细胞内部，表明由SEQ ID NO:1的氨基酸残基152-187组成的序列片段可以允许进入并递送至核上区域，并且允许定位在基底区室中。
图12D示出包括与hGH(SEQ ID NO:146)偶联的Cholix携带体(SEQ ID NO:137)的递送构建体(SEQ ID NO:154)的管腔内注射后15分钟的顶端到基底转运程度，如通过免疫荧光显微镜法所展示。图12D示出此构建体进入上皮细胞，但保留在顶端区室中并且似乎未到达基底区室或核上区室。
图12E示出包括与hGH(SEQ ID NO:146)偶联的Cholix携带体(SEQ ID NO:131)的递送构建体(SEQ ID NO:155)的管腔内注射后15分钟的顶端到基底转运程度，如通过免疫荧光显微镜法所展示。图12E示出此构建体完成胞吞转运过程，如通过递送构建体到达固有层(参见空心箭头)所指示的，表明由SEQ ID NO:1所示的序列的氨基酸残基188-206组成的序列片段可以使得携带体(以及包含所述携带体的构建体)能够与基底再循环过程相关联，从而允许携带体或相应的构建体从上皮细胞释放到基底外侧区室(例如，固有层)中。
图12F示出在包括与hGH(SEQ ID NO:146)偶联的Cholix携带体(SEQ ID NO:134)的递送构建体(SEQ ID NO:159)的管腔内注射后15分钟，在体内转运穿过大鼠空肠上皮单层，如通过免疫荧光显微镜法所展示。图12F示出此构建体完成胞吞转运过程，如通过递送构建体到达固有层(参见空心箭头)所指示。
图13A、图13B和图13C示出分别具有SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:153的递送构建体与Rab11a共定位在上皮细胞的顶端侧上。数据还显示，具有SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:154的构建体不显著定位在基底侧上，而是主要保留在顶端侧。具有SEQID NO:153的构建体的确定位在顶端和基底侧，但是仅与Rab11a共定位在顶端侧而不是基底侧(图13C的子图像3a和3b)。总而言之，这些结果表明，不能胞吞转运的携带体可以进入上皮细胞的顶端再循环系统。在管腔内注射后15分钟进行测量。绿色荧光示出hGH的定位，红色荧光示出Rab11a(或Rab11)的定位，并且蓝色荧光指示DAPI染色(实验描述包括图13D)。
图13D示出具有SEQ ID NO:159的递送构建体与Rab11a共定位在基底侧上，但不显著共定位在极化上皮细胞的顶端侧上。这表明能够胞吞转运的携带体可以利用基底再循环系统以使其从上皮细胞释放到固有层中(参见图13D的子图像4a和4b)。
图14A-14C分别示出与单独的hGH(SEQ ID NO:190)相比，对于具有SEQ ID NO:150的递送构建体的胞吞转运功能而言，K8、HSPG(串珠蛋白聚糖)和GRP75的敲除效应，所述递送构建体包括通过间隔子(其序列如SEQ ID NO:177所示)而与hGH偶联的具有SEQ ID NO:134所示的序列的Cholix衍生的携带体。缺乏对特定候选蛋白K8(Caco-2K8-)、HSPG(Caco-2HSPG-)和GRP75(Caco-2GRP75-)的表达的Caco-2细胞的稳定细胞系在体外用作单层，以验证它们参与通过主动和选择性内源性转运机制进行的携带体(例如，Cholix携带体)胞吞转运。
图14A示出K8敲除不显著降低递送构建体(SEQ ID NO:150)的胞吞转运功能。
图14B示出HSPG(串珠蛋白聚糖)敲除确实显著降低递送构建体(SEQ ID NO:150)的胞吞转运功能。
图14C示出GRP75敲除确实显著降低递送构建体(SEQ ID NO:150)的胞吞转运功能。
图15A示出用于检查Cholix携带体-GRP75相互作用的pH依赖性的BiacoreTM结合相互作用。为此，将生物素与全长Cholix蛋白(其序列如SEQ ID NO:1所示)的C末端偶联并且随后通过使用生物素-链霉抗生物素蛋白生物缀合而连接至表面(例如，芯片表面、塑料96孔板等)并且与纯化的GRP75蛋白一起分别在pH 5.5、6.5和7.5的缓冲溶液中孵育。这种相互作用的最高结合亲和力在pH 6.5下测得。
图15B示出Cholix衍生的携带体(SEQ ID NO:189，缺失位置581处的谷氨酸残基的SEQ ID NO:1的全长Cholix序列)与顶端受体(例如，TMEM132，诸如TMEM132A)、溶酶体回避受体(lysosome avoidance receptor)(例如，GRP75)、运输受体(例如，ERGIC-53)以及基底受体(例如，串珠蛋白聚糖)的相互作用的pH依赖性。如在等离子体共振测定中确定的受体相互作用的这种pH依赖性表明，Cholix衍生的携带体可以取决于其位置而顺序地与某些受体相互作用。例如，这些数据显示，Cholix衍生的携带体在pH 7.5下对胞吞和早期运输受体诸如顶端进入受体和溶酶体回避受体具有显著较高的亲和力。一旦pH下降至约5.5，Cholix携带体对这些早期运输受体的亲和力就降低，而其对顶端-基底运输受体ERGIC-53和基底释放蛋白串珠蛋白聚糖的亲和力在所述pH下则显著增加，从而允许Cholix携带体在囊泡胞吞转运过程中“被转交”给运输和基底释放受体。
图16示出序列如SEQ ID NO:1所示的全长Cholix蛋白与串珠蛋白聚糖和GRP75的显著BiacoreTM结合相互作用。
图17示出序列如SEQ ID NO:1所示的全长Cholix蛋白与GRP75、串珠蛋白聚糖和TMEM132A的显著BiacoreTM结合相互作用。
图18A-18D示出首先作为阴性对照评估通过管腔内注射(ILI，管腔表面在图18A-图18F中以白色箭头指示)施用到大鼠空肠中的人生长激素(hGH，SEQ ID NO:190)在体内的命运，预期在细胞摄取后转运至溶酶体。
图18A示出在注射(ILI)后15分钟hGH(SEQ ID NO:190)的定位局限于上皮细胞的顶端区域中的囊泡小群体，如通过绿色免疫荧光检测所展示。
图18B、图18C和图18D示出在ILI后15分钟，hGH(SEQ ID NO:190)与溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1，红色荧光)(图18B)和Ras相关蛋白(Rab7，紫色荧光)(图18C)以大约相同的频率和驻留的LAMP1+、Rab7+溶酶体特征共定位(图18D)，表明hGH在摄取到上皮细胞中之后不久即被引导至溶酶体破坏(例如，再循环)途径。
图18E和图18F示出包括通过间隔子(SEQ ID NO:175)而与hGH(SEQ ID NO:146)偶联的Cholix衍生的携带体(SEQ ID NO:134)的递送构建体(SEQ ID NO:159)被引导离开溶酶体途径并且因此不显示出与LAMP1(图18E)或Rab7(图18F)的共定位，从而使得功能性有效载荷能够穿过极化上皮细胞胞吞转运到固有层中。
图19A示出在管腔注射包括通过间隔子(SEQ ID NO:175)而与hGH(SEQ ID NO:146)偶联的Cholix衍生的携带体(SEQ ID NO:134)的递送构建体(SEQ ID NO:159)之前，包被蛋白I(COPI，红色荧光)的分布局限于上皮细胞的管腔顶端膜和顶端囊泡区室。相比之下，在递送构建体(SEQ ID NO:159)的顶端管腔内注射(ILI，管腔表面在图19A-图19D中以白色箭头指示)之后，图19B示出COPI重新分布至核上位置，表明包含具有SEQ ID NO:159的递送构建体和COPI两者的囊泡的共定位。蓝色荧光指示DAPI染色。图19A-19D中的测量在ILI后15分钟进行。
图19C示出在注射递送构建体(SEQ ID NO:159)之前，LMAN1(绿色荧光)与COPI(红色荧光)共定位在极化上皮细胞的顶端区域(通过白色箭头突出显示)中。
图19D示出，在顶端ILI(通过白色箭头突出显示)递送构建体(SEQ ID NO:159)之后，LMAN1与递送构建体相互作用并且与其一起分布至上皮细胞的基底区域，所述基底区域与固有层(表示为“l-p”)相邻。因此，Cholix携带体似乎采用LMAN1重新分布机制而从上皮细胞的顶端侧移动到基底区室。
图19E-19H示出在将包含与hGH(SEQ ID NO:146)偶联的Cholix衍生的携带体(SEQID NO:134)的递送构建体(SEQ ID NO:159)管腔注射在大鼠空肠中后5分钟(图19F)、10分钟(图19G)和15分钟(图19H)，Cholix携带体(SEQ ID NO:134)在上皮细胞中从顶端区室(通过白色箭头#1指示)运输至基底区室(通过白色箭头#2指示)。Cholix携带体定位通过绿色荧光示出，ERGIC受体定位通过红色荧光示出，并且可在顶端到基底运输中发挥作用的ERGIC的另一标志物(在本文也称为ER-高尔基体运输蛋白复合物)的定位通过紫色荧光示出；因此Cholix携带体与ERGIC受体的相互作用通过黄色荧光示出，Cholix携带体与ER-高尔基体运输蛋白复合物的相互作用通过粉色荧光示出，并且Cholix携带体、ERGIC受体和ER-高尔基体运输蛋白复合物的相互作用和/或共定位通过白色斑点(绿色、红色和紫色荧光的叠加)示出。DAPI染色通过蓝色荧光指示。
图19E示出未处理的极化肠上皮细胞。
图19F示出在管腔注射后5分钟，Cholix携带体(SEQ ID NO:134)与ER-高尔基体运输蛋白复合物在顶端区室中的定位和相互作用，如通过顶端区室中的粉色荧光信号所指示。
图19G示出在管腔注射后10分钟，与ERGIG-53缔合的Cholix携带体(SEQ ID NO:134)运输到基底膜，接着携带体(和构建体)基底释放到固有层(金色箭头)中。这些数据表明，Cholix衍生的携带体可以利用与ERGIC蛋白(例如，ERGIC-53)的特异性相互作用来“劫持”囊泡，从而使其从极化上皮细胞的顶端区室运输到基底区室。
图19H示出在管腔注射后15分钟，固有层中存在的Cholix携带体(SEQ ID NO:134)的量增加。
图19I-19K示出，Cholix携带体(SEQ ID NO:134)利用基底蛋白分泌机制而穿过极化上皮细胞运输到固有层中。在大鼠空肠中管腔注射包含与hGH(SEQ ID NO:146)偶联的Cholix衍生的携带体(SEQ ID NO:134)的递送构建体(SEQ ID NO:159)后15分钟获取荧光显微镜图像，并且其示出，基底囊泡(通过白色的环和数字“1-3”在不同的上皮细胞中突出显示)可以包含Cholix携带体和ERGIC-53受体、Cholix携带体和基底分泌蛋白，或Cholix携带体、ERGIC受体和基底分泌蛋白中的全部三种。Cholix携带体定位通过绿色荧光示出(使用抗Cholix携带体抗体)，ERGIC-53受体定位通过红色荧光示出，并且基底分泌蛋白的定位通过紫色荧光示出；因此Cholix携带体与ERGIC-53受体的相互作用通过黄色荧光示出，Cholix携带体与基底分泌蛋白串珠蛋白聚糖的相互作用通过粉色荧光示出，并且Cholix携带体、ERGIC-53受体和串珠蛋白聚糖的相互作用和/或共定位通过白色斑点(绿色、红色和紫色荧光的叠加)示出。DAPI染色通过蓝色荧光指示。
图19I示出基底区室囊泡包含Cholix携带体(SEQ ID NO:134)和ERGIC-53受体，如通过黄色荧光所指示。
图19J示出基底区室囊泡包含Cholix携带体(SEQ ID NO:134)和串珠蛋白聚糖，如通过粉色荧光所指示。
图19K示出基底区室囊泡包含Cholix携带体(SEQ ID NO:134)、ERGIC-53受体和串珠蛋白聚糖，如通过白色斑点(例如，绿色、红色和紫色荧光的叠加)所指示。
图20A示出在不存在递送构建体(SEQ ID NO:159)的情况下，另一内质网-高尔基体-中间区室(ERGIC)元件SEC22b的分布。在未处理的(即，未注射递送构建体的)组织中，SEC22b和LMAN1广泛地共定位在顶端区室中，而仅仅LMAN1则被单独地观察到靠近顶端质膜。在图20A-20D中，红色荧光示出LMAN1的定位，紫色荧光示出SEC22b的定位，绿色荧光示出hGH的定位，白色箭头指示顶端表面，并且“G”指示杯状细胞。
图20B示出，在ILI包括与hGH(SEQ ID NO:146)偶联的Cholix携带体(SEQ ID NO:134)的递送构建体(SEQ ID NO:159)后5分钟，LMAN1、SEC22b和hGH共定位在顶端区室中，但是不显著共定位在上皮细胞的基底区室中。
图20C示出，在ILI后10分钟，观察到递送构建体(SEQ ID NO:159)和LMAN1共定位在上皮细胞的基底区室中，而没有SEC22b，证实LMAN1与递送构建体在囊泡内部相互作用并且与其一起从上皮细胞的顶端囊泡区室移动到基底囊泡区室。
图20D示出，在ILI后15分钟，递送构建体(SEQ ID NO:159)和LMAN1在基底区室中的共定位的程度增加，并且到达固有层的hGH的量随着时间的推移而增加。
图20E-图20H示出与上文描述且在图20A-图20D中示出的相同组织切片，但是仅示出LMAN1和SEC22b信号(无hGH信号)。这表明响应于递送(SEQ ID NO:159)的顶端施加，LMAN1在基底区室中大幅重新分布，而SEC22b则没有重新分布。这些数据表明，包含Cholix衍生的携带体的递送构建体可以利用内源性Cholix运输途径，从而通过将所述有效载荷与携带体偶联而允许将有效载荷快速且有效地转运穿过肠上皮。
图21A-21E示出由SEQ ID NO:178(包括SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-265和N末端甲硫氨酸)组成的Cholix衍生的携带体的示例性表面模型，其用于突出显示可以在与顶端到基底胞吞转运相关的某些功能性中发挥作用的受关注的选定区域，以及它们在蛋白质表面上的相对位置和接近度。位于残基V1和E39内的氨基酸区域与表面暴露的氨基酸D150-K186和K186-L205相邻。具体地，L17-I25(区域X1，SEQ ID NO:160)和T170-I176(区域X2，SEQ ID NO:161)相互协调以形成被若干负电荷围绕的口袋。类似地，K186-H202(区域X3，SEQ ID NO:162)与I31-E39(区域X4，SEQ ID NO:163)相互协调以形成连续的脊结构。此外，表面模型示出残基D135-N139(区域X5，SEQ ID NO:164)和用紫色突出显示的天冬酰胺残基(例如，潜在的糖基化位点)。
图21A示出具有SEQ ID NO:178的Cholix多肽的氨基酸序列。
图21B示出区域X1、X3和X4的位置。
图21C示出区域X1和X2以及X3和X4的位置。
图21D示出区域X1、X2、X4和X5的位置。
图21E示出区域X1、X2、X3、X4和X5的位置。
图22A-22L示出衍生的递送构建体(SEQ ID NO:149)的运输途径分析。递送构建体包含通过甘氨酸-丝氨酸间隔子(SEQ ID NO:176)而与IL-10的活性分泌形式(SEQ ID NO:145)偶联的Cholix衍生的携带体(SEQ ID NO:135)。在图22A-22L中，白色箭头#1突出显示顶端表面，白色箭头#2突出显示基底表面，并且白色箭头#3突出显示固有层。
图22A示出递送构建体(SEQ ID NO:149)与EEA1抗原强烈共定位在细胞位置中，这与上皮细胞的顶端和基底区室处的运输相一致，表明Cholix衍生的递送构建体存在于早期内体区室中。红色荧光示出EEA1抗原的定位，并且绿色荧光示出IL-10的定位。
图22B示出递送构建体(SEQ ID NO:149)与Rab7(左上图)主要强烈共定位在上皮细胞的顶端区室中，但是仅有限地共定位在固有层内的细胞中，表明Cholix衍生的递送构建体存在于晚期内体区室中(左下图示出白光图像，并且右下图示出合并染色，其中DAPI染色以蓝色示出，红色荧光示出EEA1抗原的定位，并且绿色荧光示出IL-10的定位)。
图22C示出在与不含递送构建体(SEQ ID NO:149)的成熟溶酶体一致的特定大囊泡中鉴定出LAMP1(白色箭头，红色荧光示出EEA1抗原的定位，并且绿色荧光示出IL-10的定位)。然而，递送构建体(SEQ ID NO:149)与LAMP1抗原共定位在除类溶酶体结构之外的细胞位置中，这与上皮细胞的顶端区室和基底区室处的囊泡运输相一致，表明Cholix衍生的递送构建体存在于晚期内体区室中。
图22D示出递送构建体(SEQ ID NO:149)还与网格蛋白包被的囊泡强烈共定位，尤其是在与细胞核相邻的区域中，并且与Rab11a主要强烈共定位在上皮细胞的基底区室中以及固有层内的选定细胞中。DAPI染色以蓝色示出，红色荧光示出IL-10抗原的定位，并且绿色荧光示出网格蛋白的定位。
图22E示出递送构建体(SEQ ID NO:149)与内质网以与细胞核相邻的模式共定位在上皮细胞中以及固有层内的大部分细胞中，如通过钙联蛋白所展示(红色荧光示出钙联蛋白的定位，并且绿色荧光示出IL-10的定位)。具体地，递送构建体(SEQ ID NO:149)与内质网-高尔基体中间区室(ERGIC)强烈共定位并且LMAN1抗原似乎响应于携带体胞吞和胞吞转运而重新分布，如针对注射后5分钟(图22F)、10分钟(图22G)和15分钟(图22H)所示。
图22F示出递送构建体(SEQ ID NO:149)与内质网-高尔基体中间区室53(ERGIC-53)强烈共定位并且LMAN1抗原(红色荧光示出ERGIC-53和LMAN1的定位，并且绿色荧光示出IL-10的定位，蓝色荧光示出DAPI染色)似乎响应于携带体胞吞和胞吞转运而重新分布，如针对注射后5分钟所示。
图22G示出在注射后10分钟，递送构建体(SEQ ID NO:149)与LMAN1抗原共定位。数据示出递送构建体(SEQ ID NO:149)在固有层中的显著定位。
图22H示出在注射后15分钟，递送构建体(SEQ ID NO:149)与LMAN1抗原共定位。数据示出递送构建体(SEQ ID NO:149)在固有层中的显著定位。
图22I示出递送构建体(SEQ ID NO:149)不与上皮细胞中存在的低水平的巨蛋白共定位(红色荧光示出IL-10的定位，并且绿色荧光示出巨蛋白的定位，蓝色荧光示出DAPI染色)。一些巨蛋白与构建体共定位在固有层中存在的细胞亚群中，表明Cholix衍生的携带体不与高尔基体区室一起定位。
图22J示出58K抗原定位在上皮细胞中，处于细胞核顶端的部位，并且递送构建体(SEQ ID NO:149)显示出与此蛋白的一些共定位(红色荧光示出IL-10的定位，并且绿色荧光示出58K高尔基体抗原的定位，蓝色荧光示出DAPI染色)，其方式表明短暂移动穿过此区室。在固有层内的细胞中未观察到58K抗原。
图22K示出，递送构建体(SEQ ID NO:149，左上图，IL-10定位)显示出与TGN38抗原一定水平的共定位(右上图)，其显示出细胞分布局限于上皮细胞中的细胞核的顶端侧并且在固有层内的少数细胞中邻近细胞核。左下图像示出白光图像并且右下图示出与IL-10(红色)、TGN38(绿色)和DAPI信号(蓝色荧光)的合并(叠加)。
图22L示出，递送构建体(SEQ ID NO:149)(IL-10定位通过绿色荧光示出，右上图)与Rab11a(左上图，定位通过红色荧光示出)主要强烈共定位在上皮细胞的基底区室和固有层内的选定细胞中。左下图像示出白光图像并且右下图示出与IL-10(绿色)、Rab11a(红色)和DAPI信号(蓝色荧光)的合并(叠加)。
图23A-23C示出显微镜图像，其展示出在向大鼠空肠中管腔施加具有SEQ ID NO:149所示的序列的递送构建体之后的各个时间点，IL-10胞吞转运穿过Wistar大鼠的极化肠上皮细胞。递送构建体(SEQ ID NO:149)包括通过具有SEQ ID NO:176所示的氨基酸序列的间隔子而与具有SEQ ID NO:145所示的氨基酸的IL-10有效载荷偶联的具有SEQ ID NO:135的携带体。绿色荧光指示IL-10的存在(通过使用抗IL-10抗体进行染色)。蓝色荧光指示DAPI染色，其标记DNA，并且红色荧光指示CK-8(细胞角蛋白-8)的存在，Cholix衍生的携带体在胞吞转运期间可以与所述CK-8共定位(例如，在上皮细胞的核上区域中)。白色箭头#1突出显示上皮细胞的顶端膜，并且白色箭头#2突出显示上皮细胞的基底膜。
图23A展示在向大鼠空肠中管腔施加具有SEQ ID NO:149所示的序列的递送构建体后1分钟时IL-10的胞吞转运程度。数据显示，IL-10有效载荷从顶端到基底部位并进入固有层中的转运早在递送构建体施加后的1分钟时发生。白色箭头#3指示IL-10存在于固有层中(参见例如，白色箭头#3)。
图23B展示在向大鼠空肠中管腔施加具有SEQ ID NO:149所示的序列的递送构建体后5分钟时IL-10的胞吞转运程度。数据显示，在管腔施加递送构建体后5分钟，固有层中存在(参见例如，白色箭头#3)的转运的IL-10有效载荷的量增加。
图23C展示在向大鼠空肠中管腔施加具有SEQ ID NO:149所示的序列的递送构建体后10分钟时IL-10的胞吞转运程度。数据显示，在管腔施加递送构建体后10分钟，固有层中存在(参见例如，白色箭头#3)的转运的IL-10有效载荷的量甚至更高。
图23D-23F示出在向大鼠空肠中管腔注射包含与IL-10(SEQ ID NO:145)偶联的具有SEQ ID NO:135的Cholix携带体的递送构建体(SEQ ID NO:149)后1分钟，具有SEQ IDNO:135的Cholix携带体在上皮细胞中的顶端胞吞和早期运输。数据显示，Cholix衍生的携带体通过与溶酶体回避受体相互作用而避开溶酶体破坏途径。Cholix携带体定位通过绿色荧光示出，顶端进入受体TMEM132定位通过红色荧光示出，并且溶酶体回避受体的定位通过紫色荧光示出；因此Cholix携带体与顶端进入受体TMEM132的相互作用通过黄色荧光示出，Cholix携带体与溶酶体回避受体的相互作用通过粉色荧光示出，并且Cholix携带体、顶端进入受体TMEM132和溶酶体回避受体的相互作用和/或共定位通过白色斑点(绿色、红色和紫色荧光的叠加)示出。DAPI染色通过蓝色荧光指示。
图23D示出Cholix携带体(SEQ ID NO:135)定位在极化上皮细胞的顶端膜(通过白色箭头#1指示)处。基底膜通过白色箭头#2指示并且固有层通过白色箭头#3指示。
图23E示出Cholix携带体(SEQ ID NO:135)与顶端进入受体TMEM132的相互作用，如通过顶端膜处及其附近的黄色荧光所指示。
图23F示出Cholix携带体(SEQ ID NO:135)、顶端进入受体TMEM132和溶酶体回避受体在顶端膜处紧密接近，如通过白色箭头指示的白色斑点(例如，绿色、红色和紫色荧光的叠加)所示。假设溶酶体回避受体(GRP75)可以接近Cholix携带体-顶端进入受体复合物，接着由于pH环境的变化和这些Cholix携带体-受体相互作用的pH依赖性(如例如图15B所示)，Cholix携带体与顶端进入受体TMEM132解离并且Cholix携带体与溶酶体回避受体GRP75缔合。
图23G-23H示出，在将包含与IL-10(SEQ ID NO:145)偶联的Cholix衍生的携带体(SEQ ID NO:135)的递送构建体(SEQ ID NO:149)管腔注射在大鼠空肠中后5和15分钟，Cholix携带体(SEQ ID NO:135)在上皮细胞中从顶端区室运输到核上区室。Cholix携带体定位通过绿色荧光示出，ERGIC受体定位通过红色荧光示出，顶端进入受体(例如，TMEM132)定位通过橙色荧光示出；并且溶酶体回避受体的定位通过紫色荧光示出；因此Cholix携带体与ERGIC受体的相互作用通过黄色荧光示出，Cholix携带体与溶酶体回避受体的相互作用通过粉色荧光示出，并且Cholix携带体、顶端进入受体和溶酶体回避受体的相互作用和/或共定位通过白色斑点(绿色、红色和紫色荧光的叠加)示出。DAPI染色通过蓝色荧光指示。
图23G示出，在管腔注射递送构建体(SEQ ID NO:149)后5分钟，Cholix携带体(SEQID NO:135)定位在极化肠上皮细胞中。数据显示，在顶端受体介导的胞吞之后，Cholix携带体与靠近顶端膜的溶酶体回避受体和顶端进入受体形成复合物(通过白色斑点(绿色、红色和紫色荧光的叠加)指示并且通过白色箭头突出显示)并且还开始与略微更靠近细胞内的核上区域的ERGIC受体相互作用，如通过黄色荧光(和黄色箭头)所展示。
图23H示出，在管腔注射递送构建体(SEQ ID NO:149)后15分钟，Cholix携带体(SEQ ID NO:135)定位在极化肠上皮细胞中。数据显示，携带体从顶端区室移动到核上区室，同时与ERGIC缔合(参见黄色箭头)，其中黄色荧光强度与注射后5分钟相比增加，表明Cholix携带体从顶端区域到核上区域的移动随时间而增加。数据还显示，Cholix携带体定位在基底膜和固有层(金色箭头)中。
图24示出本文所述的携带体的顶端到基底胞吞转运中涉及的细胞内区室元件(例如，细胞区域、区室和受体，诸如携带体的转运受体相互作用配偶体(或TRIP))的图。胞吞转运过程示意性地描述在15分钟的时间过程内。例如，能够胞吞转运的Cholix衍生的携带体在胞吞之后可以不进入或可以不显著进入溶酶体或(多个)顶端再循环途径(例如，如通过再循环内体或“RE”所描绘)。在Cholix衍生的携带体的顶端施加以及进入(多个)基底区室再循环途径之后COPI和LMAN1但不是SEC22b的重新分布作为Cholix衍生的携带体的途径特征示出。因此，本文所述的Cholix衍生的携带体可以利用一系列细胞内囊泡区室而运输通过极化肠上皮细胞，这可以在顶端到基底胞吞转运中达到顶峰并且允许此类携带体快速且有效地(例如，施加至顶端表面的材料的至少5％、10％、20％、25％或50％)使有效载荷(例如，治疗性蛋白质)穿梭到固有层中。
图25示出，Cholix386衍生的携带体(例如，SEQ ID NO:135或180)和Cholix415衍生的携带体(例如，包含SEQ ID NO:1的残基1-415)在10分钟和40分钟时均将抗TNFα剂(例如，抗TNFα抗体或其功能片段)转运穿过肠上皮细胞。此外，Cholix386-抗-TNFα构建体以单独的抗TNF-α的速率的约12x转运并且Cholix415-抗-TNFα以单独的抗TNF-α的速率的约7x转运。
图26示出在考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶上跑样的SEQ ID NO:192-艾塞那肽(Exenatide)(与艾塞那肽(SEQ ID NO:195)交联的SEQ ID NO:192)的纯度。
图27示出与携带体SEQ ID NO:191或SEQ ID NO:192交联的艾塞那肽在体内胞吞转运穿过Sprague Dawley大鼠的空肠。转运穿过肠组织的艾塞那肽的量(以pM计)在处理后10分钟和40分钟时测量。数据显示，在10分钟和40分钟时，SEQ ID NO:191-艾塞那肽和SEQID NO:192-艾塞那肽均能够以比单独的艾塞那肽更高的速率转运。
图28A示出，具有SEQ ID NO:175、196和197的氨基酸间隔子的长度不影响IL-22(SEQ ID NO:142)(当被包括在具有SEQ ID NO:147、198和199的递送构建体中时)诱导IL-22受体二聚化的能力。对照重组人IL-22(rhIL-22，SEQ ID NO:143)对受体二聚化的诱导通过黑色曲线示出。
图28B示出，IL-22有效载荷(SEQ ID NO:142)通过具有SEQ ID NO:196的间隔子而与包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-266的携带体的N末端或C末端的偶联不显著改变具有SEQ ID NO:198、200和201的递送构建体诱导IL-22受体二聚化的能力。对照重组人IL-22(rhIL-22)对受体二聚化的诱导通过黑色曲线示出。
图28C示出，具有SEQ ID NO:175、196和197的氨基酸间隔子的长度不影响IL-22(SEQ ID NO:142)(当被包括在具有SEQ ID NO:147、198和199的递送构建体中时)诱导pSTAT3活化的能力。对照重组人IL-22(rhIL-22，SEQ ID NO:143)的pSTAT3活化通过黑色曲线示出。
图28D示出，IL-22有效载荷(SEQ ID NO:142)通过具有SEQ ID NO:196的间隔子而与包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-266的携带体的N末端或C末端的偶联不显著改变具有SEQ ID NO:198、200和201的递送构建体诱导pSTAT3活化的能力。对照重组人IL-22(rhIL-22)的pSTAT3活化通过黑色曲线示出。
具体实施方式
I.引言
在某些实施方案中，本文提供了递送构建体(例如，携带体-有效载荷复合物)，其能够将一个或多个异源有效载荷分子(例如，一种或多种治疗性有效载荷)例如通过胞吞而转运到上皮细胞(例如，极化肠上皮细胞)中，或例如通过胞吞转运而转运穿过上皮细胞(例如，极化肠上皮细胞)。递送构建体可以包含与异源有效载荷偶联的携带体。携带体可能够使用内源性运输途径而将异源有效载荷转运到上皮细胞中或转运穿过所述上皮细胞。与使用被动扩散相反，利用内源性运输途径可以允许携带体快速(例如，至少10-6厘米/秒、10-5厘米/秒)且有效地(例如，施加至顶端表面的材料的至少5％、10％、20％、25％或50％)使异源有效载荷穿梭到上皮细胞中或穿梭穿过所述上皮细胞，而不损害这些细胞的屏障功能或异源有效载荷的生物活性。
II.携带体
本文提供的递送构建体的携带体部分可以是能够增加递送到上皮中和/或递送穿过所述上皮的异源有效载荷(例如，治疗性有效载荷)的速率和/或量的任何分子(例如，小分子、多肽、核酸等)。
本文的携带体可以具有多种属性。在一些实施方案中，相对于天然存在的Cholix多肽，诸如SEQ ID NO:3，本文的携带体可以具有降低的(例如，降低至少50％)或消融的ADP核糖基化活性(例如，延伸因子2的核糖基化)。
在一些实施方案中，本文的携带体利用内源性运输途径而将与其偶联的异源有效载荷转运穿过极化上皮细胞。所述携带体在本文可以称为胞吞转运携带体。在一些情况下，本文的携带体可以利用内源性运输途径而将与其偶联的异源有效载荷转运到极化上皮细胞中。所述携带体在本文可以称为胞吞携带体。在胞吞携带体内，可以存在携带体，其将与其偶联的有效载荷递送到极化上皮细胞内的特定区域中，诸如顶端区室、核上区室或基底区室。
本文的任何携带体都可以通过与所述上皮的一种或多种内源性蛋白质相互作用和/或共定位来转运与其偶联的分子。一种或多种内源性蛋白质可以是能够将携带体移动到上皮细胞中或移动穿过所述上皮细胞的受体或酶。与上皮细胞的一种或多种内源性蛋白质相互作用和/或共定位可以为携带体提供一种或多种功能，包括胞吞到上皮细胞中、避开溶酶体破坏途径、从顶端区室运输到基底区室，和/或从上皮细胞的基底膜胞吐到粘膜下区室诸如固有层中。
所述携带体与内源性蛋白质的相互作用可以是选择性相互作用。所述选择性相互作用可以是pH依赖性相互作用。在携带体与两种或更多种内源性蛋白质相互作用的情况下，此类相互作用可以是顺序性相互作用，其中第一相互作用蛋白将携带体转交给第二相互作用蛋白。此类顺序性相互作用可以在不同的pH(例如，pH 5.5、7.0、7.5等)下发生。携带体与内源性蛋白质之间的相互作用可以是共价或非共价相互作用。非共价相互作用包括氢键合、范德华相互作用、离子键、π-π相互作用等。
在一些情况下，可以与携带体相互作用的内源性蛋白质中的一种可以是顶端进入受体。所述顶端进入受体可以是跨膜蛋白132(TMEM132)。携带体与所述顶端进入受体的相互作用可以使得携带体能够通过受体介导的胞吞而进入上皮细胞。
携带体还可以与溶酶体回避受体相互作用。与溶酶体回避受体的所述相互作用可以发生在上皮细胞内部并且在胞吞之后。溶酶体回避受体可以是葡萄糖调节蛋白75(GRP75，例如GRP75B)。携带体与所述溶酶体回避受体的相互作用可以使得携带体能够避开或避免溶酶体降解。所述能力可以允许携带体显著减少到达细胞溶酶体的与携带体偶联的有效载荷的量，而这是大多数治疗性蛋白质一旦被肠上皮吸收就要面临的命运。
此外，携带体可以与顶端到基底运输蛋白相互作用。所述相互作用可以发生在上皮细胞内部并且在胞吞之后。所述顶端到基底运输蛋白可以是内质网-高尔基体中间区室(ERGIC)蛋白，诸如ERGIC-53。携带体与ERGIC蛋白的相互作用可以使得携带体能够从顶端区室移动到核上区室或基底区室。
胞吞转运携带体还可以与能够促进携带体从上皮细胞的基底部位胞吐的基底释放蛋白相互作用。所述相互作用可以发生在上皮细胞的基底部位，并在从顶端区室移动到基底区室之后发生。所述基底释放蛋白可以是串珠蛋白聚糖(在本文也称为基底膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或HSPG)。携带体与串珠蛋白聚糖的相互作用可以使得携带体能够进入基底再循环系统，从而允许携带体从基底区室释放到粘膜下区室诸如固有层中。
因此，本文的胞吞转运携带体可以是能够与内源性蛋白质TMEM132(例如TMEM132A)、GRP75(例如GRP75B)、ERGIC(例如ERGIC-53)和串珠蛋白聚糖(HSPG)相互作用的分子，从而使得所述携带体能够将与其偶联的有效载荷分子转运穿过极化上皮(例如极化肠上皮)。
本文的胞吞携带体可以是能够与内源性蛋白质TMEM132相互作用的分子，从而允许所述携带体进入顶端。在胞吞后，胞吞携带体可以保持与TMEM132缔合(例如，与胞吞后可以与TMEM132解离而与例如GRP75或ERGIC蛋白相互作用的胞吞转运携带体相比)并处于细胞(例如，极化上皮细胞)的顶端区域和区室内。在一些情况下，所述胞吞携带体也可以与GRP75相互作用。与TMEM132和/或GRP75的此类相互作用可以允许携带体和与其偶联的有效载荷避免或至少显著减少(例如，与未偶联至携带体时的有效载荷分子相比，少于约50％)溶酶体降解。在一些情况下，胞吞携带体可以保留在顶端区室中，并且与在顶端(例如，管腔)施加后例如约5、10、15或30分钟可以显示出几乎所有顶端施加分子的完全胞吞转运的胞吞转运携带体相比，在顶端(例如，管腔)施加携带体后例如至少约5、10、15、30、60或120分钟内不显示出显著的易位到基底区室。在一些情况下，在管腔施加携带体后5分钟，至少约50％、75％或90％的携带体分子保留在顶端区室中。在一些情况下，在管腔施加携带体后10分钟，至少约50％、75％或90％的携带体分子保留在顶端区室中。在一些情况下，在管腔施加携带体后15分钟，至少约50％、75％或90％的携带体分子保留在顶端区室中。在一些情况下，在管腔施加携带体后30分钟，至少约50％、75％或90％的携带体分子保留在顶端区室中。保留在上皮细胞的顶端区室中的携带体分子的百分比可以通过将在相应的时间点在细胞的基底区室中测量的荧光信号的强度除以在细胞的顶端区室中测量的荧光信号的强度来确定。
在其他情况下，能够将有效载荷转运至核上区室或基底区室的胞吞携带体可以与ERGIC蛋白和/或另一ER-高尔基体运输蛋白复合物相互作用，这可以允许携带体进入上皮细胞内部的此类区室。
胞吞携带体或胞吞转运携带体可以是多肽。所述携带体可以衍生自由细菌诸如霍乱弧菌(Vibrio cholerae)分泌的多肽(在本文为Cholix衍生的多肽)。携带体可以是衍生自两种或更多种不同细菌多肽的嵌合多肽。此类两种或更多种不同的细菌多肽可以源自两种或更多种不同的细菌(例如，霍乱弧菌、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等)，和/或源自两种或更多种不同的细菌菌株(例如，霍乱弧菌、铜绿假单胞菌的两种或更多种不同的菌株等)。
携带体可以是所述细菌分泌的多肽的天然或非天然存在的多肽。
非天然存在的多肽可以包括具有C和/或N末端修饰的那些。
在一个实例中，相对于与天然存在的多肽(例如，SEQ ID NO:3)的序列比对，或相对于与共有序列(例如，SEQ ID NO:130)的序列比对，多肽包含一个或多个氨基酸置换，和/或一个或多个氨基酸缺失，和/或一个或多个氨基酸添加。
本文设想的置换的实例包括一个或多个氨基酸的保守性置换。以下六个组各自包含彼此的保守性置换的氨基酸：(1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)；(2)天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；(3)天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)；(4)精氨酸(R)和赖氨酸(K)；(5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)；以及(6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。
附加地或可替代地，本文设想的携带体中的突变包括以下中的一个或多个：V1L、L1V、D3E、E4A、E581A等，例如，相对于SEQ ID NO:1、2或130所示的序列(数字表示氨基酸位置，数字前面的字母表示修饰的氨基酸，并且数字后面的字母表示置换的氨基酸)。在一些情况下，携带体包含在携带体中的位置1处的缬氨酸、位置1处的亮氨酸、位置3处的天冬氨酸、位置3处的谷氨酸、位置4处的谷氨酸，或位置4处的丙氨酸(相对于SEQ ID NO:1中的位置进行编号)。
缺失的实例包括N末端截短和C末端截短。
如本文所用，当C末端截短被称为发生在氨基酸位置“处”时，所述氨基酸被包括在截短的多肽中。当N末端截短被称为发生在氨基酸位置“处”时，所述氨基酸不被包括在截短的多肽中。例如，在一种情况下，携带体包含具有处于位置386处的C末端截短的SEQ ID NO:1。所述携带体在其C末端在SEQ ID NO:1的氨基酸386(A)处结束。另外，以上携带体可以在其N末端在位置20处进一步截短，从而具有N末端氨基酸脯氨酸(P)(其为参考序列SEQ IDNO:1中的位置21)。
N末端截短包括在本文的Cholix序列(例如，SEQ ID NO:1-3或130中的任一个)的N末端去除多达10、20、30、39或40个氨基酸的那些。C末端截短可以是本文所述的那些。此类N和/或C末端截短可以导致不同的功能。截短可以描述为相对于野生型序列(例如，SEQ IDNO:3)、相对于非天然存在的序列(例如，SEQ ID NO:1)或相对于共有序列(例如，SEQ IDNO:130)，其中残基从N末端到C末端进行编号，从N末端处的位置1开始。例如，相对于SEQ IDNO:1具有处于位置266处的C末端截短的携带体包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-266。
添加的实例包括：信号肽序列、纯化肽序列或其他N末端修饰。信号肽序列可以包含1至约40个氨基酸。在一些情况下，携带体包含N末端甲硫氨酸。除非另外指明，否则如本文在数值或范围的上下文中使用的术语“约”通常是指所引用或要求的数值或范围的±10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
携带体可以相比于天然存在的多肽(例如，SEQ ID NO:3)、非天然存在的多肽(例如，SEQ ID NO:1-2)或本文所述的任何功能片段(例如，SEQ ID NO:160-168)具有基本序列一致性(例如，约或大于50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的序列一致性，或100％的序列一致性)。
如本文所用，术语“序列一致性”或序列一致性的百分比(％)是为了实现最大序列一致性百分比，并且不考虑任何保守性质置换作为序列一致性的部分，在将序列比对并且在需要时引入空位之后，候选序列中与选定序列中的残基相同的残基的百分比。用于确定氨基酸序列一致性百分比的比对可以以在本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。
本文的携带体(例如，胞吞携带体或胞吞转运携带体)可以衍生自由霍乱弧菌细菌分泌的多肽(例如，包含SEQ ID NO:3-125或127-129中的任一个的序列的那些)。所述携带体可以称为Cholix衍生的多肽。衍生自Cholix多肽的携带体可以包括天然和非天然存在的Cholix多肽序列，以及相比于本文所述的天然(例如，SEQ ID NO:3-78)或非天然(例如，SEQID NO:1-2)存在的Cholix多肽具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列一致性的那些序列。Cholix多肽衍生的携带体还可以包括天然和非天然存在的Cholix多肽序列的胞吞和/或胞吞转运片段(例如，Cholix多肽的N和/或C末端截短)，其中此类胞吞和/或胞吞转运片段可以相比于任何此类天然或非天然存在的Cholix多肽序列具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的序列一致性。
表1提供示例性全长Cholix和Cholix衍生的序列。
表1-示例性Cholix多肽序列
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表2提供可以用作本文的携带体的Cholix衍生的多肽的共有序列(SEQ ID NO:130，式I)。
表2-式I
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携带体可以包括相对于天然存在的Cholix多肽诸如具有SEQ ID NO:3的序列的多肽具有降低或消融的ADP核糖基化活性(例如，延长因子2的核糖基化)的所有Cholix衍生的多肽。此类携带体可以称为无毒携带体。此类Cholix衍生的多肽的实例包括具有SEQ IDNO:1-10中的任一个所示的序列的多肽中的任一种，其可以具有位置581处的缺失(例如，E581缺失，如例如在SEQ ID NO:189中)、位置581处的置换(例如，E581A置换)，或使得携带体无毒的可替代性缺失或置换。在一些情况下，携带体具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列，其在位置581处具有突变。在一些情况下，携带体具有SEQ ID NO:1-3中的任一个的氨基酸序列，其在位置581处具有突变。
在一些情况下，携带体包含表1或表2中的任一个的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成，具有C末端缺失、置换和/或添加，从而导致ADP核糖基化活性降低或消融。所述缺失、置换和/或添加维持转运功能，诸如胞吞转运或胞吞。因此，本文的一些携带体单独或与异源有效载荷一起胞吞转运，同时本文的一些携带体单独或与异源有效载荷一起胞吞。
在一些情况下，与衍生自第二Cholix多肽的第二携带体相比，衍生自第一Cholix多肽的第一携带体可以具有改善的特性。此类特性可以包括携带体将异源有效载荷转运穿过极化上皮细胞(或细胞层)的能力、携带体的稳定性(例如，体内稳定性或离体稳定性，诸如保质期)、携带体在表达系统诸如大肠杆菌或CHO细胞中被功能性地表达的能力、携带体(例如，使用色谱方法)被纯化的能力，以及例如当与异源有效载荷缔合(例如，偶联)时多聚化(例如二聚化)的能力。可以令人惊奇地显示，与衍生自具有SEQ ID NO:3和/或126的序列的Cholix多肽的第二携带体相比，衍生自具有SEQ ID NO:1的序列的Cholix多肽的第一携带体可以具有一种或多种以下特性：(i)胞吞转运功能增强(例如，将有效载荷转运穿过上皮细胞的转运速率增加)；(ii)在大肠杆菌和/或CHO细胞中的功能表达改善(例如，产生收率更高)；(iii)纯化特性改善(例如，纯度和/或回收收率更高)；以及(iv)体内稳定性增强(例如，蛋白酶和/或pH稳定性增高、解链温度增加)。所述体内稳定性可以通过将携带体与例如Caco-2细胞一起孵育或通过将携带体施用(例如，注射到管腔中)给哺乳动物(例如，啮齿动物或人)来确定。胞吞转运功能(例如转运的速度或速率)的增强可以，例如，如实施例1中所述通过确定在特定时间点(例如，顶端施加携带体或递送构建体后1、5、10、15、20或30分钟)基底外侧腔室中的转运的携带体和/或有效载荷的量来确定。在一些情况下，携带体对抗蛋白酶的稳定性可以通过将携带体与蛋白酶(例如，胰蛋白酶)在特定摩尔比(例如，1:1)和环境温度下一起孵育，并在各个时间点(例如，5、10、15、30或45分钟)使用例如尺寸排阻色谱测量完整携带体的量来确定。携带体在特定pH下的稳定性可以通过将携带体与具有适当pH(例如，pH 5.5、6、6.5、7等)的缓冲液一起孵育并在各个时间点(例如，5、10、15、30分钟)使用例如尺寸排阻色谱测量完整携带体的量来确定。
胞吞转运携带体可以将与其偶联的有效载荷转运穿过上皮细胞。所述转运可以发生在体外，例如，使用上皮细胞单层，诸如Caco-2或SMI-100细胞单层。在其他情况下，所述转运可以发生在体内，例如，穿过受试者(例如，啮齿动物或人)的肠上皮进入粘膜下区室诸如固有层。
胞吞转运携带体的作用机制可以涉及以下中的一种或多种：通过与TMEM132、LMAN1和/或GPR75的相互作用实现受体介导的胞吞进入极化上皮细胞、通过与GRP75的相互作用而避开溶酶体破坏途径、通过与ERGIC受体(例如，ERGIC-53)的相互作用而实现顶端到基底转运，以及通过与串珠蛋白聚糖(HSPG)的相互作用而实现从基底膜释放到粘膜下区室诸如固有层中。
胞吞转运携带体可以是与以下内源性蛋白质中的一种或多种相互作用的携带体：TMEM132A、GPR75、ERGIC蛋白以及串珠蛋白聚糖(HSPG)，如实施例10和12中所示。胞吞转运携带体与顶端进入受体诸如TMEM132A的相互作用可以使得携带体能够顶端进入到极化上皮细胞中。胞吞转运携带体与溶酶体回避受体诸如GRP75的相互作用可以使得携带体和与其偶联的有效载荷能够避免溶酶体降解，从而允许未改变且功能完整的携带体和有效载荷的转运。胞吞转运携带体与顶端到基底转运蛋白诸如ERGIC蛋白(例如，ERGIC-53)的相互作用可以允许携带体一旦被胞吞即移动至上皮细胞的基底部位。胞吞转运携带体与基底释放蛋白诸如串珠蛋白聚糖的相互作用可以使得携带体能够进入基底再循环系统并且使得携带体能够胞吐进入基底外侧区室，诸如粘膜下区室(例如，固有层)中。
此外，胞吞转运携带体可以与包被蛋白I(COPI)、早期内体抗原1(EEA1)中的任何一种或多种共定位以劫持内源性顶端到基底转运机制，并且与Ras相关蛋白11a(Rab11a)共定位在上皮细胞的基底侧以进入基底分泌系统，如实施例10中所示。
在一些情况下，在转运穿过所述上皮细胞的过程中，胞吞转运携带体不与Ras相关蛋白7(Rab7)和/或溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)共定位，从而使得所述携带体能够避免溶酶体降解，如实施例10中所示。
胞吞转运携带体的实例包括具有SEQ ID NO 1-78或130中的任一个的C末端截短的那些，其中C末端截短可以发生在多肽的C末端，处于位置195处的C末端残基之后的任何氨基酸位置(例如，截短处于SEQ ID NO:1-2的位置195-634中的任一个)。截短的氨基酸位置可以通过使用与共有序列SEQ ID NO:130或参考序列SEQ ID NO:1、2或3中的任一个的序列比对来确定。以下表3示出通过鉴定此类携带体的各种氨基酸残基序列以及SEQ ID NO1-78或130可被截短的C末端位置获得的示例性携带体。在一些情况下，胞吞转运携带体包括具有SEQ ID NO 1-2或4-78中的任一个的C末端截短的那些。
表3–鉴定SEQ ID NO:1-78或130中的任一个的氨基酸残基的示例性胞吞转运携带体
Figure BDA0003152357000001181
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此类胞吞转运携带体还可以在其N末端在高达N末端位置20的氨基酸位置处截短(例如，在N末端位置17处截短的SEQ ID NO:79(从位置18开始))。
本文还设想了相比于表3所示的任一携带体序列具有至少约80％、85％、90％、95％、98％或99％序列一致性的胞吞转运携带体。
在一种情况下，携带体包含具有处于位置386处的C末端截短的SEQ ID NO:1。在一种情况下，携带体包含具有处于位置386处的C末端截短的SEQ ID NO:2。在一种情况下，携带体包含具有处于位置386处的C末端截短的SEQ ID NO:4-79。在一种情况下，携带体包含具有处于位置386处的C末端截短的SEQ ID NO:130。在此类情况下，所述序列不包括具有处于位置386处的C末端截短的SEQ ID NO:3。在此类情况下，所述序列不包括SEQ ID NO:126。
当Cholix衍生的携带体具有处于位置386处的C末端截短时，其在本文可以称为Cholix386。“386”是指当该序列为SEQ ID NO:130的部分或与其比对时，与位置386最接近地对齐的氨基酸之后的C末端截短。cholix386不需要该多肽中具有386个氨基酸。例如，SEQ IDNO:79在位置386处的截短导致短于386个氨基酸残基的携带体。Cholix386携带体分子的实例包括当与SEQ ID NO 130针对最高序列一致性比对时或与SEQ ID NO:1-3中的任一个针对最高序列一致性比对时在位置386处截短的SEQ ID NO:1-79或130中的任一个，例如以氨基酸残基“AQA”结束。
Cholix386还可以包括多肽，该多肽维持与SEQ ID NO:180基本上相同的功能，但具有一个或多个添加/缺失/置换，并且相比于本文所述的Cholix386分子具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。
Cholix衍生的胞吞转运携带体的另一实例为Cholix266。在一种情况下，Cholix266由SEQ ID NO:181的氨基酸序列组成。其他Cholix266片段可以包括当与SEQ ID NO 130针对最高序列一致性比对时或与SEQ ID NO:1-3中的任一个针对最高序列一致性比对时在氨基酸位置266处截短的SEQ ID NO:1-78中的任一个的那些片段。可替代地，携带体可以具有式I(SEQ ID NO:130)的在位置266处在C末端截短的任何序列。
Cholix衍生的胞吞转运携带体的另一实例为Cholix251。在一种情况下，Cholix251由SEQ ID NO:182的氨基酸序列组成。其他Cholix251片段可以包括当与SEQ ID NO 130针对最高序列一致性比对时或与SEQ ID NO:1-3中的任一个针对最高序列一致性比对时在氨基酸位置251处截短的SEQ ID NO:1-78中的任一个的那些片段。可替代地，携带体可以具有式I(SEQ ID NO:130)的在位置251处在C末端截短的任何序列。
Cholix衍生的胞吞转运携带体的另一实例为Cholix245。在一种情况下，Cholix245由SEQ ID NO:183的氨基酸序列组成。其他Cholix245片段包括当与SEQ ID NO 130针对最高序列一致性比对时或与SEQ ID NO:1-3中的任一个针对最高序列一致性比对时在氨基酸位置245处截短的SEQ ID NO:1-79中的任一个的那些片段。可替代地，携带体可以具有式I(SEQ ID NO:130)的在位置245处在C末端截短的任何序列。
Cholix衍生的胞吞转运携带体的另一实例为Cholix206。在一种情况下，Cholix206由SEQ ID NO:184的氨基酸序列组成。其他Cholix206片段包括当与SEQ ID NO 130针对最高序列一致性比对时或与SEQ ID NO:1-3中的任一个针对最高序列一致性比对时在氨基酸位置206处截短的SEQ ID NO:1-78中的任一个的那些片段。可替代地，携带体可以具有式I(SEQ ID NO:130)的在位置206处在C末端截短的任何序列。
携带体的其他实例包括具有处于式I(SEQ ID NO:130)所示的序列的氨基酸位置195-634中的任一个处的C末端截短的那些。优选地，所述截短处于式I(SEQ ID NO:130)所示的序列的195-347中的任一个的氨基酸位置处。
在N末端，胞吞转运携带体可以具有SEQ ID NO:1-78或130的氨基酸1-20中的任一个。在一些实施方案中，携带体的N末端具有SEQ ID NO:1或2的氨基酸残基1-20(在位置1-20处100％的序列一致性)，或相比于SEQ ID NO:1或2的氨基酸残基1-20具有至少约80％、85％、90％、95％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，N末端的前四个氨基酸为VEEA(SEQ ID NO:185)。在一些实施方案中，所述携带体不包括SEQ ID NO:126。在一些实施方案中，携带体的N末端具有式I(SEQ ID NO:130)的氨基酸残基1-20。此类携带体中的任一个可以任选地具有如本文所述的N末端修饰。所述N末端修饰可以是N末端甲硫氨酸。此类携带体的实例是包含SEQ ID NO:131-135中的任一个所示的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成的那些。
因此，胞吞转运携带体可以包含相比于式I(SEQ ID NO:130)所示的氨基酸序列的位置1至位置205-275中的任一个处的氨基酸残基中的任一个的氨基酸残基具有至少约80％、85％、90％、95％、98％或99％序列一致性或具有100％序列一致性的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
在此类情况下，胞吞转运携带体由式I(SEQ ID NO:130)所示的氨基酸残基的氨基酸残基1-275、1-266、1-265、2-265、3-265、4-265、5-265、1-251、1-250、2-250、3-250、4-250、5-250、1-245、2-245、3-245、4-245、5-245、1-206、1-205、2-205、3-205、4-205或5-205组成，基本上由其组成或包含所述氨基酸残基。在各种情况下，所述携带体可以由或基本上由SEQ ID NO:1-78中的任一个所示的相同氨基酸残基的氨基酸残基1-275、1-266、1-265、2-265、3-265、4-265、5-265、1-251、1-250、2-250、3-250、4-250、5-250、1-245、2-245、3-245、4-245、5-245、1-206、1-205、2-205、3-205、4-205或5-205组成。
具体地，在一些情况下，所述胞吞转运携带体可以包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的氨基酸残基1-275、1-266、1-265、2-265、3-265、4-265、5-265、1-251、1-250、2-250、3-250、4-250、5-250、1-245、2-245、3-245、4-245、5-245、1-206、1-205、2-205、3-205、4-205或5-205，基本上由其组成或由其组成。
可替代地，在一些情况下，所述胞吞转运携带体可以包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的氨基酸残基1-275、1-266、1-265、2-265、3-265、4-265、5-265、1-251、1-250、2-250、3-250、4-250、5-250、1-245、2-245、3-245、4-245、5-245、1-206、2-205、2-205、3-205、4-205或5-205，基本上由其组成或由其组成。
携带体还可以在其N末端进行修饰。此类N末端修饰包括可以增强多肽的表达和/或稳定性的官能团。此类末端修饰可以通过以下名称“FG-携带体”示出，其中FG为与携带体的N末端连接的官能团。本文设想的官能团的实例包括用于细菌表达的甲硫氨酸和用于在CHO细胞或HEK-293细胞中表达的其他信号序列。具有N末端甲硫氨酸的胞吞转运携带体的实例包括具有SEQ ID NO:131-135中的任一个所示的氨基酸序列的那些(表4)。应当指出，官能团也可以与携带体的C末端偶联。
表4–示例性Cholix衍生的胞吞转运携带体
Figure BDA0003152357000001221
Figure BDA0003152357000001231
Figure BDA0003152357000001241
Figure BDA0003152357000001251
使用具有SEQ ID NO:178的氨基酸序列的Cholix衍生的携带体的晶体结构信息，鉴定出可以在胞吞和胞吞转运中发挥作用的几个区域。此类区域在本文称为X1、X2、X3、X4、X5。X1跨氨基酸残基17–25，具有SEQ ID NO:160的氨基酸序列，并且可以在携带体的顶端到基底转运中发挥作用，例如，通过允许携带体与ERGIC蛋白(例如，ERGIC-53)的相互作用。X2跨氨基酸残基170–176，具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列，并且可以在携带体进入核上区室以及从上皮细胞的顶端到基底部位的移动中发挥作用，例如，通过允许携带体与ERGIC蛋白的相互作用。X3跨氨基酸残基186–202，具有SEQ ID NO:162的氨基酸序列，并且可以在携带体基底释放到基底外侧区室中发挥作用，例如，通过允许携带体与基底释放蛋白(诸如串珠蛋白聚糖)的相互作用。X4跨氨基酸残基31–39，具有SEQ ID NO:163的氨基酸序列，并且可以在携带体从上皮细胞的顶端部位到基底部位的移动中发挥作用，例如，通过允许携带体与ERGIC蛋白的相互作用。X5跨氨基酸残基135–139，具有SEQ ID NO:164的氨基酸序列，并且可以在携带体顶端进入上皮细胞中发挥作用，例如，通过允许携带体与顶端进入受体(诸如TMEM132)的相互作用。
因此，在一些实施方案中，胞吞转运携带体包括SEQ ID NO:1-78或130中的任一个在X1、X2、X3、X4和/或X5处的氨基酸残基。例如，本文的携带体可以具有SEQ ID NO:1或2的氨基酸1-266，或相比于其具有基本序列一致性的序列；然而，前提条件是X1、X2、X3、X4和X5中的任何一个或多个与SEQ ID NO:1或2的那些相同。在一个实施方案中，所有X1、X2、X3、X4、X5均与SEQ ID NO:1或2的那些相同。这同样适用于所有其他携带体和本文所述的Cholix衍生的携带体，诸如表3或表4中提供的那些。
在一些实施方案中，胞吞转运携带体不包括具有SEQ ID NO:1-78或130所示的Cholix序列多肽中的任何一个或多个的序列的那些。在一些情况下，不包括那些多肽，所述多肽具有SEQ ID NO:3所示的序列，或具有处于残基425-348、291、266、265、251、250、245、244、234、206、205、187、186、151、150、134、133处的C末端截短的截短的SEQ ID NO:3，以及由SEQ ID NO:3的残基40-187组成的片段。在一些实施方案中，胞吞转运携带体不包括包含SEQ ID NO:126的序列的那些，基本上由其组成或由其组成的那些。
令人惊讶的是，另外已经鉴定，短于胞吞转运携带体的携带体可以将异源有效载荷转运到极化上皮细胞中，而不显著转运所述有效载荷穿过上皮细胞。此类携带体在本文可以称为“胞吞携带体”。胞吞携带体可以最终处于上皮细胞的细胞内囊泡或胞质溶胶中。
胞吞携带体的实例包括具有从式I(SEQ ID NO:130)的位置1-40中的任一个至位置145-194中的任一个位置的氨基酸残基的那些。在一些实施方案中，胞吞携带体具有SEQID NO:1-80或82-120中的任一个的氨基酸序列，其具有处于氨基酸位置145-194中的任一个处的C末端截短。
此外，胞吞携带体中的任一个还可以具有N末端截短。所述N末端截短可以从携带体的N末端去除多达40个氨基酸。例如，本文设想的是在N末端具有氨基酸VLYY(SEQ ID NO:186)或GVLYY(SEQ ID NO:187)的携带体，其分别代表SEQ ID NO:130的氨基酸位置41-44和40-44。在一些情况下，与SEQ ID NO:1-80或82-120或SEQ ID NO:130中的任一个所示的氨基酸序列的氨基酸41至C末端(例如，选自位置145-194的氨基酸残基处的C末端)相比，携带体在位置1-40处包含更高程度的序列差异性。携带体最优选地包含从式I(SEQ ID NO:130)所示的氨基酸序列的位置1-20中的任一个至位置150-187中的任一个位置的氨基酸残基，或从位置21-41处的任一氨基酸残基至位置187或205处的氨基酸残基的氨基酸残基，基本上由其组成，或由其组成。表5提供胞吞携带体可以包含，基本上由其组成或由其组成的示例性氨基酸残基。
表5–SEQ ID NO:1-78或130中的任一个的Cholix携带体的示例性氨基酸残基
Cholix氨基酸残基 Cholix氨基酸残基
1-150 1-178
1-151 1-179
1-152 1-180
1-153 1-181
1-154 1-182
1-155 1-183
1-156 1-184
1-157 1-185
1-158 1-186
1-159 1-187
1-160 22-187
1-161 23-187
1-162 24-187
1-163 25-187
1-164 26-187
1-165 27-187
1-166 28-187
1-167 29-187
1-168 30-187
1-169 31-187
1-170 32-187
1-171 33-187
1-172 34-187
1-173 35-187
1-174 38-187
1-175 39-187
1-176 40-187
1-177 41-187
在一些情况下，所述携带体具有处于式I(SEQ ID NO:130)的位置39处的N末端截短。在其他情况下，所述携带体具有处于式I(SEQ ID NO:130)的位置40处的N末端截短。当所述携带体也在式I(SEQ ID NO:130)所示的序列的位置145-206处的氨基酸残基中的任一个处在其C末端截短时(即，具有残基145-206中的任一个的C末端残基)，所述携带体可以用于使有效载荷胞吞到上皮细胞中并且将所述有效载荷转运至所述上皮细胞的(多个)顶端区室(参见，例如，实施例4)。本文所述的这些胞吞携带体中的任一个还可以包含N末端修饰，诸如N末端甲硫氨酸。所述携带体的实例是包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基41-187(SEQID NO:137)，或SEQ ID NO:1的氨基酸残基40-205(SEQ ID NO:138)，基本上由其组成或由其组成的那些。
在一些实施方案中，胞吞携带体可以包含SEQ ID NO:1-78或130所示的任一序列的氨基酸残基1-150，基本上由其组成或由其组成。在一些实施方案中，胞吞携带体可以包含SEQ ID NO:1-78或130所示的任一序列的氨基酸残基1-151，基本上由其组成或由其组成。在一些实施方案中，胞吞携带体可以包含SEQ ID NO:1-78或130所示的任一序列的氨基酸残基1-186，基本上由其组成或由其组成。在一些实施方案中，胞吞携带体可以包含SEQID NO:1-78或130所示的任一序列的氨基酸残基1-187，基本上由其组成或由其组成。在一种情况下，携带体具有SEQ ID NO:1的氨基酸1-150、1-151、1-186或1-187。在另一情况下，携带体具有SEQ ID NO:2的氨基酸1-150、1-151、1-186、1-187。
本文的胞吞携带体中的任一个可以具有与其N末端连接的官能团(诸如甲硫氨酸)。具有N末端甲硫氨酸的胞吞携带体的实例包括具有SEQ ID NO:136或139中的任一个所示的序列的那些。
在其他情况下，所述胞吞携带体包含从式I(SEQ ID NO:130)所示的氨基酸序列的位置40或41至位置187-206处的任一氨基酸残基的氨基酸残基。
在此类情况下，胞吞携带体可以包含SEQ ID NO:1-80、82-120或130所示的任一序列的氨基酸残基40-187或41-187，基本上由其组成或由其组成。在其他情况下，能够将异源有效载荷转运到极化上皮细胞中的携带体可以包含SEQ ID NO:1-80、82-120或130所示的任一序列的氨基酸残基40-205或41-205，基本上由其组成，或由其组成。
所述携带体可以包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基40-187、41-187、40-205或41-205，基本上由其组成，或由其组成。此类携带体的示例性氨基酸序列包括由SEQ ID NO:137和138所示的氨基酸序列组成，基本上由其组成或包含所述序列的那些。此类携带体可能够将有效载荷转运至极化上皮细胞的顶端区室，但是不能转运至基底区室，因为那些携带体缺乏可以在顶端到基底转运中发挥作用的氨基酸残基1-39。
胞吞携带体可以包含由式I(SEQ ID NO:130)所示的氨基酸序列的位置134至位置151的氨基酸残基组成的胞吞片段。在一些情况下，此类功能片段具有SEQ ID NO:165所示的序列，或相比于其具有高(例如，>90％)序列一致性。示例性携带体包括可以由SEQ IDNO:136-139(表6)中的任一个所示的氨基酸序列组成，基本上由其组成或包含所述序列的那些。缺乏SEQ ID NO:166-167(表11)的功能片段中的一者或两者的携带体可以将异源有效载荷转运至上皮细胞的顶端区室，其可以包括在顶端囊泡中、细胞的顶端胞质溶胶中和/或顶端再循环系统诸如顶端再循环内体中的位置。所述携带体可以与顶端进入受体诸如TMEM132(例如，TMEM132A)相互作用，但是不与或不显著与基底运输蛋白或串珠蛋白聚糖(HSPG)相互作用，并且可以在胞吞之后与Rab11a共定位在上皮细胞的顶端区室中。在一些情况下，所述携带体可以由SEQ ID NO:137-139(表6)中的任一个所示的氨基酸序列组成，基本上由其组成或包含所述序列。
表6–示例性Cholix衍生的胞吞携带体
Figure BDA0003152357000001291
Figure BDA0003152357000001301
在其他实施方案中，胞吞携带体可以包含功能片段，所述功能片段由式I(SEQ IDNO:130)所示的氨基酸序列的相应地从位置1至位置40以及从位置152至位置187的氨基酸残基组成。在一些情况下，此类片段具有相应地如SEQ ID NO:166和167所示的氨基酸序列，或相比于此类功能片段中的一者或两者具有高(例如，>90％)序列一致性。所述携带体可以与顶端到基底运输受体相互作用，但不显著与串珠蛋白聚糖相互作用。所述运输受体使得所述携带体能够将有效载荷转运至极化上皮细胞的核上区室和/或基底区室。所述携带体可以由SEQ ID NO:130的氨基酸1-187组成，基本上由其组成，或包含所述氨基酸。所述携带体的实例是具有SEQ ID NO:136所示的序列的携带体。
在一些情况下，胞吞携带体不是SEQ ID NO:3所示序列的片段。在一些情况下，所述携带体不是SEQ ID NO:4-80或82-120所示的任一序列的片段。在此类情况下，携带体不包含SEQ ID NO:3的氨基酸残基1-151、1-187或40-187或不由其组成。
D.携带体的功能序列区域
在本文的任何实施方案中，携带体序列内的(多个)功能序列区域可以相比于式I(SEQ ID NO:130)中的那些区域中存在的氨基酸残基具有局部高(例如，>90％)序列一致性，以便在众多多肽和实施方案间保持功能性。在一些情况下，那些区域中的氨基酸残基可以局限于天然存在的Cholix多肽中存在的那些，诸如具有SEQ ID NO:1-80或82-120中的任一个所示的序列的那些。
1.胞吞结构域
在一些情况下，携带体包含允许携带体在顶端部位进入上皮细胞(例如，极化上皮细胞)的结构域。在一些情况下，所述结构域允许携带体与顶端进入受体相互作用。所述顶端进入受体可以是TMEM132或TMEM132A。这种与TMEM132相互作用的结构域可具有式I(SEQID NO:130)的氨基酸残基135-151的共有序列，或SEQ ID NO:1-120中的任一个的位置135-151的氨基酸残基的共有序列。TMEM132A为负责携带体顶端进入到上皮细胞中的跨膜蛋白。为了维持携带体与TMEM132A的相互作用，在一些实施方案中，本文的携带体包括SEQ IDNO:165，其示出与TMEM132A相互作用的结构域的共有序列。可替代地，本文的携带体可以包括SEQ ID NO:1-120或130中的任何一个或多个的氨基酸残基135-151作为其与TMEM132A相互作用的结构域。
此外，令人惊讶地推测，与TMEM132相互作用的结构域内的子区域可与携带体的顶端进入尤其相关。因此，本文的携带体可通过具有氨基酸基序的相互作用区域而与顶端进入受体诸如TMEM132相互作用，所述氨基酸基序具有SEQ ID NO:130的氨基酸残基135-139(例如，SEQ ID NO:1的“DQQRN”；SEQ ID NO:164)。因此，本文的任何携带体(包括其多肽)可包括这样的基序或与TMEM132相互作用的整个结构域(例如，SEQ ID NO:165)以便提供在顶端侧进入上皮细胞的入口。由于此类区域可以在携带体内具有功能，因此此类区域中的氨基酸序列可以是保守的，或仅具有多达1、2或3个置换、插入和/或缺失的氨基酸残基。
本文的任何携带体可包括TMEM132相互作用结构域或受体相互作用区域，以便进入上皮细胞。例如，包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-151的携带体(其包括SEQ ID NO:165的TMEM132相互作用结构域)可以在顶端侧进入上皮细胞。类似地，Cholix266携带体，诸如包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-266(例如，SEQ ID NO:181)的携带体，包括TMEM132结构域，并且既可以通过TMEM132结构域进入上皮细胞的顶端侧，又可以将异源有效载荷转运穿过极化上皮细胞。包含TMEM132相互作用结构域的其他示例性携带体为Cholix187、Cholix206、Cholix245、Cholix251和Cholix386(例如，SEQ ID NO:136和180-184)。在一些情况下，携带体为具有SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-187、1-206、1-245、1-251、1-266或1-386的携带体。
另一方面，缺乏TMEM132相互作用结构域的携带体，诸如具有SEQ ID NO:140的M-Cholix134，可以保留在肠腔中并且不或不显著(例如，施加至顶端表面的携带体材料的少于10％)进入上皮细胞(参见，例如，实施例6)。
2.核上和基底区室靶向结构域
在一些情况下，携带体包含式I(SEQ ID NO:130)所示的序列的N-末端氨基酸残基1-40。所述携带体可以用于在携带体胞吞进入细胞后将异源有效载荷从上皮细胞的顶端转运至核上或基底区室(并进入粘膜下区室，如果所述携带体还可以与基底释放蛋白诸如串珠蛋白聚糖相互作用的话)。此类携带体的实例包括包含SEQ ID NO:131-135所示的氨基酸序列的那些(表4)。
在一些情况下，携带体包含式I(SEQ ID NO:130)所示的序列的氨基酸残基17-25和/或31-39。此类区域可局限于在天然存在的Cholix多肽中存在的那些氨基酸残基，或包括多达1、2、3或4个氨基酸置换、插入和/或缺失。一个或多个置换可以是一个或多个保守或非保守置换。1、2、3或4个氨基酸置换、插入和/或缺失可以保留氨基酸17-25和/或31-39的功能。在一些情况下，携带体在17-25和/或31-39处具有天然存在的序列。在此类情况下，携带体的氨基酸17-25可以具有SEQ ID NO:160的序列，和/或携带体的氨基酸31-39可以具有SEQ ID NO:163的序列。氨基酸17-25和31-39的功能可以是顶端到基底转运。所述功能可以如本文其他地方所述，例如，通过产生包含处于此类残基处的N末端截短的携带体并将这些携带体的顶端到基底转运能力与不具有N末端截短的那些进行比较来确定(参见，例如，实施例5和6)。包含此类区域并且能够进行顶端到核上和/或基底转运的示例性携带体可以包含SEQ ID NO:1所示的序列的氨基酸残基1-187、1-206、1-245、1-251、1-266和1-386、基本上由其组成，或由其组成。在此类情况下，携带体可以由SEQ ID NO:137-139中的任一个所示的氨基酸序列组成。
在一些情况下，携带体使用另外的结构域来进入核上和/或基底区室。所述结构域可以具有式I(SEQ ID NO:130)的氨基酸残基152-187的共有序列，或SEQ ID NO:1-120中的任一个的位置152-187的氨基酸残基的共有序列。此结构域的功能可以是进入上皮细胞内的核上区域，到达上皮细胞内的基底区室，和/或用于携带体与跨高尔基体网络的元件(诸如包被蛋白I(COPI))的共定位。
例如，携带体诸如Cholix187或Cholix206，例如具有分别如SEQ ID NO:136和131所示的序列的携带体(其包括所述核上和基底靶向区域)能够进入上皮细胞内的核上区域和基底区室，而没有所述结构域的携带体，诸如Cholix151(例如，SEQ ID NO:139)保留在上皮细胞的顶端侧并且不显著进入核上区域或基底区室(参见，例如实施例6)。
据信，SEQ ID NO:130的氨基酸残基170-176的序列(例如，“TRPEHNI”、SEQ ID NO:161)可与携带体进入此类核上和基底区室并与COPI共定位尤其相关。
因此，在一些情况下，携带体包含核上和基底靶向结构域，或式I(SEQ ID NO:130)的氨基酸残基170-176的共有序列，或SEQ ID NO:161(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基170-176)。所述携带体还可以包括如上文所述的TMEM132A相互作用结构域。
核上和基底靶向结构域是可以具有最小序列变异的结构域。因此，本文的携带体可以包含具有天然存在的多肽(诸如具有SEQ ID NO:3-120的那些)的氨基酸残基的核上和基底靶向结构域，或相对于天然存在的多肽(诸如具有SEQ ID NO:3-120的那些)的残基而言，可以仅包含多达1、2或3个置换、插入和/或缺失的氨基酸残基。
包含核上靶向结构域的示例性携带体为Cholix187、Cholix206、Cholix245、Cholix251、Cholix266和Cholix386。在一些情况下，携带体为具有SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-187、1-206、1-245、1-251、1-266或1-386的携带体。
3.胞吞转运结构域
在一些情况下，携带体包含胞吞转运结构域。所述结构域优选地可以包括式I(SEQID NO:130)的氨基酸残基188-206的共有序列，或SEQ ID NO:1-120中的任一个的位置188-206的氨基酸残基的共有序列。氨基酸残基188-206的功能可以是多样的，并且可以在胞吞转运中发挥作用。胞吞转运区域可以允许携带体与转运受体样相互作用配偶体(本文也称为“TRIP”)、内质网-高尔基体中间区室53(ERGIC-53，本文也称为LMAN1)、葡萄糖调节蛋白75(GRP75)和串珠蛋白聚糖以pH依赖性和/或顺序方式相互作用。此类相互作用可以允许携带体进入基底再循环系统，所述系统将携带体(连同与其偶联的任何异源有效载荷)从上皮细胞的基底膜释放到基底外侧区室(例如固有层)中。
能够胞吞转运的携带体的实例包括Cholix衍生的携带体，诸如Cholix206、Cholix245、Cholix251、Cholix266和Cholix386。在一些情况下，此类携带体具有包含SEQ IDNO:130的氨基酸残基1-206、1-245、1-251、1-266和1-386的那些的氨基酸序列。在一些情况下，此类携带体具有包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-206、1-245、1-251、1-266和1-386的那些的氨基酸序列。在一些情况下，此类携带体具有包含SEQ ID NO:2的氨基酸残基1-206、1-245、1-251、1-266和1-386的那些的氨基酸序列。具有官能团N末端甲硫氨酸的此类携带体的实例在SEQ ID NO:131–SEQ ID NO:135中提供。所述携带体(例如，Cholix206、Cholix245、Cholix251、Cholix266和Cholix386)可以用于快速(例如，至少10-6厘米/秒、10-5厘米/秒)且有效地(例如，施加至顶端表面的材料的至少5％、10％、20％、25％或50％)将有效载荷转运穿过上皮细胞(参见，例如，实施例5)。
据推测，氨基酸残基188-206的序列(例如，“AQKEGSRHKRWAHWHTGLA”，SEQ ID NO:168)以其一个或多个组氨酸残基可以充当pH开关，从而允许携带体与TRIP诸如TMEM132、LMAN1、GRP75和串珠蛋白聚糖以顺序和/或pH依赖性方式相互作用。
下表7示出本文所述的额外的Cholix衍生的多肽序列。
表7-Cholix衍生的多肽序列的额外实例
Figure BDA0003152357000001341
Figure BDA0003152357000001351
III.异源有效载荷
本文设想的异源有效载荷可以具有任何性质，包括治疗性、诊断性和成像性。有效载荷可以是递送构建体的部分。递送构建体可以包括与异源有效载荷偶联的携带体。有效载荷可以直接或间接、共价或非共价地偶联于携带体。当共价连接时，有效载荷可以直接连接至携带体或通过间隔子连接至携带体。
异源有效载荷可以是小分子、核酸、多肽、蛋白质、纳米颗粒或其组合。
治疗性有效载荷
在一些情况下，治疗性有效载荷为多肽，诸如细胞因子、激素、生长因子、治疗性抗体、核酸、抗原、酶、凝血因子、神经递质或聚合物。
本文提供的细胞因子包括趋化因子和白介素(在本文也缩写为“IL”)。白介素可以是IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36、IL-37、IL-38、IL-39或IL-40。
在一些情况下，白介素为IL-10或IL-22。白介素可以来自任何物种(例如，来自人或啮齿动物)，并且优选地来自预期向其施用有效载荷或包含所述有效载荷的递送构建体的生物体。因此，在一些情况下，白介素为人白介素。本文提供的白介素可以是成熟的分泌性白介素的前体。这样的前体白介素可以包含信号肽序列。例如，在一些情况下，治疗性有效载荷可以是成熟的分泌性蛋白的前体。在其他情况下，治疗性有效载荷为分泌性蛋白。例如，在一些情况下，有效载荷包含IL-22的全长前体的SEQ ID NO 141，基本上由其组成，或由其组成。在其他情况下，有效载荷包含IL-22的分泌形式的SEQ ID NO 142，基本上由其组成，或由其组成。在另一实例中，有效载荷包含IL-10的全长前体的SEQ ID NO 144，基本上由其组成，或由其组成。在其他情况下，有效载荷包含IL-10的分泌形式的SEQ ID NO:145，基本上由其组成，或由其组成。
异源有效载荷可以包含N末端甲硫氨酸。例如，IL-22有效载荷可以包含N末端甲硫氨酸。在此类情况下，IL-22可以具有SEQ ID NO:143的序列。
在一些实施方案中，治疗性有效载荷为IL-22。IL-22可以包含相比于SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列或其功能片段具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，治疗性有效载荷包含SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
在一些实施方案中，治疗性有效载荷为IL-10。IL-10可以包含相比于SEQ ID NO:144或SEQ ID NO:145所示的氨基酸序列或其功能片段具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，治疗性有效载荷包含SEQ ID NO:145所示的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
本文提供的激素可以包括肽和多肽激素。此类激素可以包括：生长激素，例如，人生长激素(在本文也称为hGH或促生长素)；垂体激素，例如绒毛膜促性腺激素、促皮质素、促生育素、iorticotropin、促甲状腺激素释放激素、促甲状腺素、加压素、赖氨酸加压素；甲状旁腺激素；甲状腺激素；睾丸激素；胃肠激素，例如抑胃多肽、表皮生长因子-尿抑胃素、抑胃多肽、胃泌素释放肽、胃泌素、五肽胃泌素、四肽胃泌素、胃动素、神经肽Y、肽YY、促胰液素、血管活性肠肽、辛卡利特；肠促胰岛素激素，例如胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)；代谢激素，例如胰岛素；以及其任何衍生物或片段。
在一些实施方案中，激素为人生长激素，其包含相比于SEQ ID NO:146或SEQ IDNO:190所示的氨基酸序列或其片段具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
在一些实施方案中，治疗性有效载荷为降糖剂。在此类情况下，有效载荷可以是GLP-1剂或GLP-1激动剂。所述激动剂可以是艾塞那肽或利拉鲁肽。在其他情况下，降糖剂可以是：肠促胰岛素、胰高血糖素前蛋白、胰高血糖素样肽(例如，不同于GLP-1)、肠高血糖素相关多肽、毒蜥外泌肽-3、毒蜥外泌肽-4、利司那肽(lixisenatide)(商品名
Figure BDA0003152357000001371
和
Figure BDA0003152357000001372
Sanofi)、利拉鲁肽(商品名
Figure BDA0003152357000001373
Novo Nordisk A/S)、司美格鲁肽(semaglutide)(商品名
Figure BDA0003152357000001374
Novo Nordisk A/S)、阿必鲁肽(商品名
Figure BDA0003152357000001375
GlaxoSmithKline；与白蛋白融合的GLP-1二聚体)、杜拉鲁肽(dulaglutide)(商品名
Figure BDA0003152357000001376
Eli Lilly)、葡萄糖依赖性促胰岛素多肽、Tirzepatide(EliLilly)、双胰淀素降钙素受体激动剂(Dual Amylin Calcitonin Receptor Agonist)DACRA-089、甘精胰岛素(Glargine)
Figure BDA0003152357000001377
Figure BDA0003152357000001378
Figure BDA0003152357000001381
Linjeta、
Figure BDA0003152357000001382
NN1045、胰岛素加SymlinTM、PE0139、速效和短效胰岛素(例如，Linjeta、PH20、NN1218、HinsBet)、(APC-002)水凝胶、口服的、可吸入的、透皮的和舌下胰岛素(例如
Figure BDA0003152357000001383
TPM 02、Capsulin、
Figure BDA0003152357000001384
口服胰岛素、ORMD-0801、NN1953、NN1954、NN1956、VIAtab和Oshadi口服胰岛素)。
在一些情况下，治疗性有效载荷为治疗性抗体或其结合片段。治疗性抗体可以包括抗TNFα抗体。此类抗TNFα抗体可以是人源化的或人抗体。抗TNFα剂可以包括英夫利昔单抗(infliximab)
Figure BDA0003152357000001385
阿达木单抗(adalimumab)
Figure BDA0003152357000001386
或依那西普(etanercept)
Figure BDA0003152357000001387
在一些情况下，有效载荷为抗肿瘤剂。抗肿瘤剂可以包括：亚硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine)、链脲佐菌素(strepzotocin)；甲基肼，例如丙卡巴肼、达卡巴嗪；类固醇激素，例如糖皮质激素、雌激素、孕激素、雄激素、四氢脱氧皮质酮(tetrahydrodesoxycaricosterone)；免疫活性化合物，诸如免疫抑制剂，例如乙胺嘧啶、三甲氨喋呤(trimethopterin)、青霉胺、环孢霉素、硫唑嘌呤；以及免疫刺激剂，例如左旋咪唑、二硫代氨基甲酸二乙酯、脑啡肽、内啡肽；抗微生物化合物，诸如抗生素，例如β-内酰胺、青霉素、头孢菌素、碳青霉烯(carbapenim)和单环β-内酰胺类(monobactam)、β-内酰胺酶抑制剂、氨基糖苷、大环内酯、四环素、壮观霉素；抗疟剂、抗阿米巴药；抗原虫药(antiprotazoal)；抗真菌剂，例如两性霉素-β，抗病毒剂，例如，阿昔洛韦(acyclovir)、碘苷、利巴韦林(ribavirin)、三氟尿苷、阿糖腺苷、更昔洛韦(gancyclovir)；杀寄生虫剂；驱虫药(antihalmintics)；放射性药物(radiopharmaceutic)；胃肠药；血液化合物(hematologic compound)；免疫球蛋白；凝血蛋白，例如抗血友病因子、因子IX复合物；抗凝剂，例如双香豆素、肝素钠；纤维溶素抑制剂，例如氨甲环酸；心血管药物；外周抗肾上腺素药；中枢作用抗高血压药，例如甲基多巴、甲基多巴盐酸盐；抗高血压直接血管扩张剂，例如二氮嗪、盐酸肼屈嗪；影响肾素-血管紧张素系统的药物；外周血管扩张剂，例如酚妥拉明；抗心绞痛药；强心苷；强心扩血管剂(inodilator)，例如氨力农(amrinone)、米力农(milrinone)、依诺昔酮(enoximone)、氢甲苯咪酮(fenoximone)、伊马唑旦(imazodan)、硫马唑(sulmazole)；抗心律失常药；钙进入阻滞剂；影响血脂的药物，例如雷尼替丁(ranitidine)、波生坦(bosentan)、rezulin；呼吸系统药物；拟交感神经药，例如沙丁胺醇、甲磺酸比托特罗、盐酸多巴酚丁胺、盐酸多巴胺、麻黄碱钠(So)、肾上腺素、盐酸芬氟拉明(fenfluramine HCl)、盐酸异丙肾上腺素、盐酸甲氧胺、重酒石酸去甲肾上腺素、盐酸去氧肾上腺素、盐酸利托君(ritodrine HCl)；拟胆碱药，例如乙酰胆碱盐酸盐；抗胆碱酯酶，例如氯化(Cl)滕喜龙(edrophonium chloride)；胆碱酯酶复活剂；肾上腺素能阻断药，例如盐酸醋丁洛尔(acebutolol HCl)、阿替洛尔(atenolol)、盐酸艾司洛尔(esmolol HCl)、盐酸拉贝洛尔(labetalol HCl)、美托洛尔(metoprolol)、纳多洛尔(nadolol)、甲磺酸酚妥拉明、盐酸普萘洛尔(propanolol HCl)；抗毒蕈碱药物，例如甲溴辛托品(anisotropine methylbromide)、阿托品、克利溴铵(clinidium bromide)(Br)、格隆溴铵(glycopyrrolate)、异丙托溴铵(ipratropium Br)、东莨菪碱氢溴酸盐(scopolamine HBr)；神经肌肉阻断药；去极化药物，例如苯磺酸阿曲库铵、己芴溴铵(hexafluorenium Br)、碘二甲箭毒、氯化琥珀酰胆碱(succinylcholine Cl)、氯化筒箭毒碱、维库溴铵；中枢作用肌肉松弛剂，例如巴氯芬；神经递质和神经递质剂，例如乙酰胆碱、腺苷、三磷酸腺苷；氨基酸神经递质，例如兴奋性氨基酸、GABA、甘氨酸；生物胺神经递质，例如多巴胺、肾上腺素、组胺、去甲肾上腺素、奥克巴胺、5-羟色胺、酪胺；神经肽、一氧化氮；抗帕金森药，例如盐酸金刚烷胺(amaltidine HCl)、甲磺酸苄托品、卡比多巴；利尿药，例如双氯非那胺、醋甲唑胺、苄氟噻嗪、泊利噻嗪；抗偏头痛药，例如甲磺酸卡前列素氨丁三醇(carboprost tromethamine mesylate)或马来酸美西麦角(methysergidemaleate)，或其功能衍生物。
在一些情况下，有效载荷为酶，诸如透明质酸酶、链激酶、组织纤溶酶原激活剂、尿激酶、PGE-腺苷脱氨酶；静脉内麻醉剂，诸如氟哌利多(droperidol)、依托咪酯、柠檬酸芬太尼/氟哌利多、海索比妥(hexobarbital)、盐酸氯胺酮、美索比妥钠(methohexital Na)、硫戊巴比妥钠(thiamylal Na)、硫喷妥钠(thiopental Na)；抗癫痫药，例如卡马西平(carbamazepine)、氯硝西泮(clonazepam)、双丙戊酸钠、乙琥胺、美芬妥英(mephenyloin)、甲乙双酮、苯妥英(phenyloin)、扑米酮(primidone)。在各种实施方案中，生物活性有效载荷为选自透明质酸酶、链激酶、组织纤溶酶原激活剂、尿激酶或PGE-腺苷脱氨酶的酶。
表8示出本文提供的示例性治疗性有效载荷的氨基酸序列。
表8–示例性治疗性有效载荷的氨基酸序列
Figure BDA0003152357000001401
Figure BDA0003152357000001411
IV.间隔子
携带体可以通过间隔子而与异源有效载荷偶联。本文提供的间隔子可以提供携带体和有效载荷两者的空间柔性、准确折叠和/或恰当的生物活性和功能。
间隔子可以包含一个或多个氨基酸残基。在一些情况下，间隔子为基于氨基酸的间隔子。所述间隔子可以包含至少约5、10、15、20、25、35、50、75或100个氨基酸残基，基本上由其组成，或由其组成。在一些情况下，间隔子包含至多约30、25、20、15或10个氨基酸残基，基本上由其组成，或由其组成。在一些情况下，这些氨基酸残基中的大多数(例如，多于90％)为甘氨酸和/或丝氨酸残基。
间隔子可以是可裂解或不可裂解的间隔子。在一些情况下，可裂解的间隔子可以通过酶例如蛋白酶而被裂解。不可裂解的间隔子不可通过所述酶进行裂解。例如，不可裂解的间隔子可以用于其中更高的有效载荷系统浓度为目标的情况。
间隔子可以包含一个或多个重复的甘氨酸-丝氨酸寡肽序列。因此，在一些情况下，携带体包含、基本上由或由以下组成：氨基酸序列(GS)x(SEQ ID NO:169)、(GGS)x(SEQID NO:170)、(GGGS)x(SEQ ID NO:171)、(GGGGS)x(SEQ ID NO:172)或(GGGGGS)x(SEQ IDNO:173)，其中x＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些情况下，间隔子包含、基本上由或由以下组成：氨基酸序列(GGGGS)x(SEQ ID NO:174)，其中x＝1、2、3、4或5。在此类情况下，间隔子可以由5、10、15、20或25个氨基酸组成。
本文提供的间隔子的实例为包含相比于GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:175)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:176)或GGGGSNLQGGLRQPR(SEQ ID NO:177)、上述任一个的片段，或上述任何的组合具有至少50％、75％、90％或99％序列一致性的氨基酸序列，基本上由该氨基酸序列组成或由该氨基酸序列组成的那些。在一些情况下，间隔子由SEQ ID NO:196(GGGGS)或SEQ ID NO:197(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)中的任一个所示的氨基酸序列组成。在一些情况下，以上间隔子中的任一个可以包含处于N末端和/或C末端的另一甘氨酸或丝氨酸残基。
在一些实施方案中，将携带体与治疗性有效载荷偶联的间隔子包含相比于SEQ IDNO:175-176具有至少50％、75％、90％或99％序列一致性的氨基酸序列。
V.递送构建体
本文提供了递送构建体(例如，携带体-有效载荷复合物)，其可以包含与异源有效载荷偶联的携带体。携带体可以共价或非共价地(例如，通过离子相互作用、范德华相互作用、π-π相互作用等)偶联于所述有效载荷。携带体可以直接或间接地偶联于异源有效载荷。
异源有效载荷可以与携带体的N末端和/或C末端偶联。在一些情况下，异源有效载荷通过在携带体的C末端羧基与异源有效载荷的N末端胺之间形成共价酰胺键而直接且共价地偶联于携带体的C末端。在一些情况下，异源有效载荷通过间隔子而间接且共价地偶联于携带体。
因此，在一些情况下，当携带体与有效载荷共价偶联时，递送构建体可以根据式II：C-S-P或式III：P-S-C表示，其中C为携带体，S为间隔子，或任选地为键，并且P为异源有效载荷。递送构建体还可以包含处于其N末端和/或C末端处的一个或多个修饰。所述一个或多个修饰可以包括N末端甲硫氨酸残基。因此，式II和式III还可以包括N末端甲硫氨酸(例如，M+C-S-P)或(例如，M+P-S-C)。
携带体可以通过化学/合成缀合(例如，使用酰胺偶联反应)或通过在细菌(例如，大肠杆菌)或哺乳动物(例如，中国仓鼠卵巢(CHO))细胞中作为融合蛋白重组表达而与异源有效载荷偶联。
递送构建体或其部分(例如，携带体和/或间隔子)可以是多肽。如本文所用，术语“多肽”可以包括天然和非天然氨基酸。
本文提供的递送构建体可以通过携带体与一种或多种转运受体样相互作用配偶体(TRIP)的一种或多种中等亲和力、高容量动态和/或pH依赖性相互作用以高通量率穿过极化上皮细胞胞吞转运。此类TRIP可以是内源性运输途径的元件，并且因此，可以允许携带体将异源有效载荷转运穿过上皮细胞屏障，而不损害屏障本身，并且不显著改变(例如，化学/酶促修饰)携带体或有效载荷。
此外，与TRIP的相互作用可以允许携带体以至少约10-6厘米/秒、10-5厘米/秒或10-4厘米/秒的转运速率将有效载荷转运穿过完整上皮(例如，极化的肠上皮)。
在一些情况下，携带体与有效载荷间接且非共价地偶联。在此类情况下，纳米颗粒(例如，脂质体、金属纳米颗粒、基于聚合物的纳米颗粒等)可以被加载(例如，在颗粒的内部和/或表面上)有效载荷分子(例如，IL-10、IL-22、GLP-1等)并且(多个)Cholix衍生的携带体分子可以与此类纳米颗粒偶联(例如，偶联到其表面上)。在一些情况下，有效载荷与携带体的比率可以为至少约15000:1、10000:1、5000:1、2500:1、1000:1、500:1、250:1、100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、2.5:1、1:1。这可以允许使用与表面连接的Cholix衍生的携带体而将此类含有效载荷的纳米颗粒转运到极化上皮细胞(例如，极化的肠上皮细胞)中或转运穿过所述细胞。在一些情况下，纳米颗粒可以在胞吞转运或细胞内递送后释放有效载荷。在纳米颗粒穿过上皮细胞转运的情况下，所释放的有效载荷可以与粘膜下组织(例如固有层)内的受体结合和/或可以进入体循环并且因此系统地提供某种功能(例如，治疗或诊断功能)。在其他情况下，当纳米颗粒在上皮细胞内部释放有效载荷时，有效载荷(例如，核酸)可提供某些细胞内功能，例如在这些细胞内产生转基因、调节基因表达等。
示例性递送构建体
在各种实施方案中，递送构建体或携带体-有效载荷复合物包含(a)携带体，所述携带体包括不包含SEQ ID NO:179并且不由SEQ ID NO:126组成的Cholix多肽，(b)异源有效载荷，所述携带体与所述异源有效载荷复合，其中携带体能够(i)穿过极化上皮细胞胞吞转运异源有效载荷；或(ii)将异源有效载荷转运到极化上皮细胞中。
在一些实施方案中，递送构建体包含Cholix衍生的携带体，所述携带体相比于SEQID NO:1或2所示的氨基酸序列的氨基酸残基1-386包含(基本上由以下组成或由以下组成)至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列一致性。
在一些实施方案中，递送构建体包含Cholix衍生的携带体，所述携带体相比于SEQID NO:1所示的氨基酸序列的位置1-40中的任一个至位置150-347处的任一个氨基酸残基的氨基酸残基包含(基本上由以下组成或由以下组成)至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列一致性。在一些情况下，所述携带体相比于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的位置1-151、1-187、41-187、1-206、1-245、1-251或1-266的氨基酸残基包含(基本上由以下组成或由以下组成)至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列一致性。在其他情况下，携带体相比于SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的位置1-151、1-187、41-187、1-206、1-245、1-251或1-266的氨基酸残基包含(基本上由以下组成或由以下组成)至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列一致性。
此类携带体中的任一个可以与治疗性有效载荷偶联，所述治疗性有效载荷相比于SEQ ID NO:141、142、144、145和146所示的氨基酸序列包含(基本上由以下组成或由以下组成)至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列一致性。
所述治疗性有效载荷可以通过间隔子而与Cholix衍生的携带体偶联，所述间隔子相比于氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:175)包含(基本上由以下组成或由以下组成)至少66％、73％、80％、86％、93％或100％的序列一致性。
因此，在一些情况下，递送构建体包含携带体，所述携带体包含相比于SEQ ID NO:134具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成，所述携带体通过间隔子而与治疗性有效载荷偶联，所述治疗性有效载荷包含相比于SEQ ID NO:142具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在一些情况下，间隔子包含相比于SEQ ID NO:175具有至少66％、73％、80％、86％、93％或100％序列一致性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
在其他情况下，递送构建体包含携带体，所述携带体包含相比于SEQ ID NO:135具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成，所述携带体通过间隔子而与治疗性有效载荷偶联，所述治疗性有效载荷包含相比于SEQ ID NO:142具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些情况下，间隔子包含相比于SEQ ID NO:175具有至少66％、73％、80％、86％、93％或100％序列一致性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
在一些情况下，递送构建体包含携带体，所述携带体包含相比于SEQ ID NO:134具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成，所述携带体通过间隔子而与治疗性有效载荷偶联，所述间隔子包含相比于SEQID NO:175具有至少66％、73％、80％、86％、93％或100％序列一致性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。所述治疗性有效载荷可以是细胞因子、激素或治疗性抗体或其功能性结合片段。在一些情况下，治疗性有效载荷包含相比于SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:145或SEQ ID NO:146具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
在一些情况下，递送构建体包含携带体，所述携带体包含相比于SEQ ID NO:135具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成，所述携带体通过间隔子而与治疗性有效载荷偶联，所述间隔子包含相比于SEQID NO:176具有至少66％、73％、80％、86％、93％或100％序列一致性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。所述治疗性有效载荷可以是细胞因子、激素或治疗性抗体或其功能性结合片段。在一些情况下，治疗性有效载荷包含相比于SEQ ID NO:145具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
在一些情况下，递送构建体相比于SEQ ID NO:147-150、152-159或188中的任一个所示的氨基酸序列包含(基本上由以下组成或由以下组成)至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列一致性。
在一些实施方案中，递送构建体由SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，递送构建体由SEQ ID NO:149所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，递送构建体由SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列组成。
本文的示例性递送构建体的氨基酸序列在表9中示出。
表9–示例性递送构建体的氨基酸序列
Figure BDA0003152357000001461
Figure BDA0003152357000001471
Figure BDA0003152357000001481
Figure BDA0003152357000001491
Figure BDA0003152357000001501
Figure BDA0003152357000001511
VI.使用方法
在一些实施方案中，本文提供包含与异源有效载荷偶联的携带体的递送构建体。本文提供的携带体可以用于将所述有效载荷(例如，治疗性有效载荷)转运至上皮细胞内部的各个位置，诸如顶端侧(例如，顶端再循环系统)、基底侧和/或(多个)核上区室。穿过极化肠上皮的递送可以包括递送至粘膜下区室(例如，固有层和/或其他粘膜下肠区室)和/或体循环(例如，通过肝门系统)。
A.治疗方法
本文提供的携带体穿过完整上皮屏障(例如，极化的肠上皮)的高通量转运能力可以用于将治疗性和/或诊断性有效载荷分子递送至有需要的受试者(例如，人或啮齿动物)。例如，将治疗性有效载荷递送至粘膜下区室，例如固有层，可以允许治疗和/或诊断位于和/或起源于胃肠道中的此类位置的疾病或病状，而有效载荷的全身递送可以用于在生物体内的各种细胞、组织或器官中提供治疗有效的浓度。
可以使用本公开的递送构建体治疗的疾病可以包括炎性疾病、自身免疫疾病、癌症、代谢疾病、神经变性疾病和神经系统疾病、病毒疾病或感染，以及心血管疾病。
在一些情况下，炎性疾病可以包括：炎性肠病、银屑病、细菌性脓毒症、克罗恩病(例如，瘘管性克罗恩病)、溃疡性结肠炎(例如，中度至重度溃疡性结肠炎或轻度至中度溃疡性结肠炎)、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、白塞氏综合征(Behcet's syndrome)、未定型结肠炎、胰腺炎、肝脏炎症(例如，肝炎)、囊炎、直肠炎和上皮细胞损伤。
在一些情况下，自身免疫疾病可以包括系统性红斑狼疮(SLE)、寻常型天疱疮、重症肌无力、溶血性贫血、血小板减少性紫癜、格雷夫病、斯耶格伦氏病(Sjogren’sdisease)、皮肌炎、桥本病(Hashimoto’s disease)、多肌炎、多发性硬化症、糖尿病、类风湿性关节炎和硬皮病。
在一些情况下，癌症可以包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌或鼻咽癌、恶性黑色素瘤、利妥昔单抗抗性NHL和白血病。
在一些情况下，代谢病症可以包括糖尿病、肥胖症导致的糖尿病、高血糖症、血脂异常、高甘油三酯血症、X综合征、胰岛素抗性、葡萄糖耐量减低(IGT)、糖尿病性血脂异常、高脂血症、脂肪肝病、非酒精性脂肪肝炎、肥胖症、葡萄糖耐量减低、空腹血糖升高、胰岛素抗性、尿白蛋白分泌、向心性肥胖、高血压、甘油三酯升高、LDL胆固醇升高和/或HDL胆固醇降低、高血糖症、高胰岛素血症、血脂异常、酮病、高甘油三酯血症、X综合征、胰岛素抗性、空腹血糖减低、葡萄糖耐量减低(IGT)、糖尿病性血脂异常、糖原异生、糖原分解过度、糖尿病性酮酸中毒、高甘油三酯血症、高血压、糖尿病性肾病、肾功能不全、肾衰竭、食欲过盛、肌肉萎缩、糖尿病性神经病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性昏迷、动脉硬化、冠心病、外周动脉疾病以及高脂血症。
在一些情况下，心血管疾病可以包括血管疾病、心脏疾病和中风。
可以使用本公开的递送构建体治疗的其他疾病和病症可以包括生长激素缺乏症(GHD)、特纳综合征(TS)、努南综合征、普拉德-威利综合征(Prader-Willi syndrome)、身材矮小同源盒基因(short stature homeobox-containing gene，SHOX)缺乏、慢性肾功能不全、特发性身材矮小、短肠综合征、过敏、移植物抗宿主病、贫血、造血细胞病症，以及内分泌系统或生殖系统疾病。
此外，递送构建体可以作为药物组合物施用给有需要的受试者。可以将本文的递送构建体配制成药物组合物以提高治疗功效。例如，递送构建体可以被配制成使得其在受试者的胃肠道中或周围的(多个)特定位置释放。在一些情况下，递送构建体可以被配制成增加其在胃肠道中或周围的各个部分(诸如回肠)中接合免疫细胞的生物活性。
递送构建体可以通过各种施用途径进行施用。在一些情况下，施用包括经口施用递送构建体。在一些情况下，递送构建体作为片剂或胶囊进行经口施用。
B.实验方法
本文提供了用于对Cholix携带体相互作用蛋白(例如，TRIP)进行胞吞转运测试和评估的方法。
1.胞吞转运测试
分离的递送构建体的胞吞转运功能可以被测试为随着递送构建体通过胞吞转运而穿过上皮膜(例如，极化的肠上皮)的能力而变化。非限制性地，可以通过本领域技术人员已知的任一方法来测试递送构建体的胞吞转运活性。在各种实施方案中，可以通过评估递送构建体进入与其结合的非极化细胞的能力来测试胞吞转运活性。在Cholix衍生的携带体的情况下，并非意在受任何特定理论或作用机制的约束的情形下，本文描述了，允许递送构建体穿过极化上皮细胞的胞吞转运功能和进入非极化细胞的功能存在于相同的结构域或区域中，即，SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-266。因此，例如，可以通过检测构建体在细胞内部的物理存在来评估递送构建体进入细胞的能力。例如，递送构建体可以用例如荧光标志物标记，并且将递送构建体暴露于细胞外。然后，可以将细胞洗涤，以去除未进入细胞的任何递送构建体，并可以确定剩余在细胞中的标记的量。例如，利用显微镜检测到在这些细胞内的标记表示递送构建体已经进入到细胞中。
可通过评估递送构建体穿过极化上皮细胞的能力来测试递送构建体的胞吞转运能力。例如，递送构建体可以用例如荧光标志物(例如，RFP)来标记，并与上皮细胞层的顶端膜接触。在另一个实例中，可以使用针对递送构建体或其部分诸如Cholix衍生的携带体或有效载荷的抗体(例如，单克隆和/或多克隆抗体)来检测递送构建体。在由上皮细胞形成的膜的基底外侧(例如，如图1所示的基底外侧腔室或体内实验中的固有层)上检测到的荧光表明携带体的胞吞转运能力是完整的。
可以采用雄性Wistar大鼠来测试体内胞吞转运。每笼可容纳雄性Wistar大鼠3-5只，光/暗周期为12/12小时，研究时其可以为225-275克(大约6-8周龄)。可以使用持续异氟醚麻醉的非恢复方案在光照阶段进行实验。可以切割4-5cm的使空肠中段区域露出的腹部中线切口。可以在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备浓度为3.86x 10-5M试品的储备溶液，使用29号针经管腔内注射(ILI)施用50μL(每250g大鼠)。然后，可以采用永久性标志物来标记注射部位的肠系膜。在研究结束时，可以将捕捉到被标记肠段的3-5mm区域分离并处理以进行显微评估。可以根据1986年英国动物(科学程序)法案、1986年欧洲共同体理事会指令(86/609/EEC)和巴斯大学的伦理审查程序进行体内实验。
2.对Cholix携带体相互作用蛋白(即，TRIP)的评估
为了鉴定Cholix相互作用配偶体(例如，受体、酶等)并建立它们与Cholix多肽(例如，Cholix序列的残基1-266或其截短型)相互作用所在的囊泡区室，可以进行一系列下拉式测定(pull-down assay)来鉴定潜在的相互作用配偶体，然后可以使用表面等离子体共振进行计算机实验缔合(association)，使用极化的Caco-2人肠上皮细胞进行体外胞吞转运研究，其中可以实现对特定靶标的基因敲低，并且进行体内胞吞转运研究，其中Cholix元件和特定受体可以共定位在已建立的囊泡结构中。不受任何理论的束缚，假设胞吞转运过程可以涉及这样的元件：其通常被限制在极化肠上皮细胞的特定囊泡元件内，但可以被例如Cholix衍生的携带体募集或“劫持”，以离开晚期内体并在(例如，通过顶端再循环机制、顶端受体介导的胞吐作用等)从细胞释放到基底外侧区室后避免溶酶体降解。
3.测量携带体与细胞蛋白的共定位
本文所述的携带体或携带体-有效载荷复合物与一种或多种细胞蛋白的共定位可以通过荧光显微镜法确定。例如，可以将Cholix衍生的携带体施加至一个或多个极化上皮细胞(例如，Caco-2)的顶端膜或施加至肠上皮组织。在受体介导的胞吞之后，携带体被摄取到细胞中可以通过荧光显微镜法确定，例如，通过使用标记的抗Cholix携带体抗体或染料标记的携带体，或通过使用抗有效载荷抗体。样品或组织切片可以进一步用对细胞蛋白诸如Rab7、Rab11具有特异性的标志物染色，例如，如实施例7中所述。然后可以使用各种图像分析技术来确定携带体与细胞蛋白的相对位置(参见，例如，实施例6)。
实施例
以下实施例仅对本公开进行了说明，并不旨在以任何方式限制本公开。
实施例1
Cholix衍生的递送构建体的制备
在本实施例中，描述了递送构建体制备为包含Cholix携带体序列、间隔子序列和治疗性有效载荷的单个氨基酸序列。
首先，通过PCR扩增递送构建体的基因，从而在PCR产物的两个末端处掺入NdeI和EcoRI、PstI和PstI、AgeI和EcoRI或PstI和EcoRI位点的限制性酶对。在限制性酶消化后，将PCR产物克隆到适当的质粒中以用于细胞表达，对其用对应的限制性酶对进行消化。所得构建体包含SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列，并且还在该蛋白质的N末端用6-His基序加标签以有利于纯化。通过限制性酶消化和DNA测序来验证最终的质粒。
如下表达递送构建体：在适当质粒的存在下，使用标准热激法转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞(Novagen，Madison,Wis.)以产生递送构建体表达细胞，在含氨苄青霉素的培养基上选择，分离并且在具有抗生素的Luria-Bertani肉汤(Difco；BectonDickinson，Franklin Lakes,N.J.)中生长，然后通过在OD 0.6下添加1mM异丙基-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)而诱导蛋白质表达。IPTG诱导后两小时，通过以5,000rpm离心10分钟来收获细胞。在细胞裂解后分离包涵体，并将蛋白质溶解于含有100mM Tris-HCl(pH 8.0)、2mM EDTA、6M盐酸胍和65mM二硫苏糖醇的缓冲液中。在0.1M Tris(pH＝7.4)、500mM L-精氨酸、0.9mM GSSG、2mM EDTA的存在下使溶解的递送构建体重折叠。通过Q琼脂糖离子交换和Superdex 200凝胶过滤色谱(Amersham Biosciences公司，Sweden)来纯化重折叠的蛋白质(SEQ ID NO:147)。蛋白质的纯度通过SDS-PAGE和分析HPLC(Agilent公司，Palo Alto,CA)进行评估。
关于其预期分子大小，对递送构建体进行评估，以验证正确折叠。在诱导后，从包涵体中收集表达的蛋白质。通过蛋白质印迹来验证递送构建体的表达程度，并将表观分子量与计算得到的质量相比较。
结果表明功能性递送构建体以高收率和纯度稳定且有效地产生。
实施例2
用于评估穿过上皮细胞单层的转运的体外模型
本实施例展示了被设计用于评估本文所述的递送构建体的转运特性的体外模型。
图1示意性地示出一种装置，其包括上皮细胞单层上方的顶端腔室和所述上皮细胞单层下方的基底腔室。
对于顶端到基底外侧的通透性，将测试制品(例如，递送构建体、有效载荷等)添加至顶端侧(A)，并在基底外侧(B)确定穿透的量。对于基底外侧到顶端的通透性，将测试制品添加至基底外侧(B)，并在顶端侧(A)确定穿透的量。
根据以下等式，数据可以表示为通透性(Papp)：Papp＝(dQ/dt)/(C0*A)。Q/dt为穿透速率，C0为测试制品的初始浓度，并且A为单层的面积。外排转运比率(Re)可以根据以下等式计算：(Re)＝Papp(B-A)/Papp(A-B)。Re>2可以指示P-gp或其他活性外排转运体的潜在底物。
SMI-100或Caco-2细胞可以用于在体外评估携带体或递送构建体的胞吞转运功能。
对于Caco-2细胞，进行ELISA测定，以评估携带体或递送构建体通过胞吞转运而移动穿过Caco-2细胞单层的能力。将Caco-2(ATCC HTB-37TM)细胞维持在5％CO2中在37℃下在完全培养基中：杜氏改良的伊格尔培养基F12(DMEM F12)，其补充有10％胎牛血清、2.5mM谷氨酰胺、100U青霉素/ml，以及100μg链霉素/ml(Gibco BRL，Grand Island,N.Y.)。每2到3天用此培养基(指定的完全培养基)饲养细胞并且每5到7天传代。对于测定，将细胞接种到24或96孔板中并使其生长至铺满。
使Caco-2细胞在胶原包被的0.4-μm孔径聚碳酸酯膜transwell支持体(Corning-Costar，Cambridge,MA)上作为铺满的单层生长，并且在获得>250Ω·cm2的跨上皮电阻(TER)(使用筷子式
Figure BDA0003152357000001571
电压表(Millipore)测量)后18-25天使用。通过在37℃下在例如顶端施加4.7nM、23.6nM和236nM递送构建体后在特定时间点(例如，15、30和45分钟)测量转运的蛋白量来确定携带体或递送构建体穿过这些单层的顶端到基底外侧(A→B)转运。在研究过程中，使用TER测量结果和10kDa荧光葡聚糖的范围(使用HPLC尺寸排阻方案测量)来验证单层屏障特性。通过在基于细胞的细胞毒性测定中滴定收集的培养基来确定递送构建体的转运程度。通过使用用于捕捉和检测的抗体(例如，抗携带体抗体或抗有效载荷抗体，诸如抗IL-22抗体)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来测量转运的递送构建体。
使在细胞培养插入物上建立的铺满的人小肠组织单层(SMI-100，MatTek公司；Ashland,MA,USA)在使用前得以在37℃下稳定化24h。只有跨上皮电阻(TEER)>400Ω·cm2的插入物才被视为具有足够的单层完整性以用于研究。通过评估对70kD葡聚糖转运的抑制，进行单层完整性的二次验证。将腔室用转运缓冲液(PBS)洗涤一次。将以20μg/mL的浓度制备的测试分子(例如，递送构建体、有效载荷等)以100μL的体积施加至插入物的顶端表面。在每个时间点替换500μL PBS的基底外侧体积以用于转运研究。每个实验条件一式三份地进行。
实施例3
携带体介导的IL-22穿过极化肠上皮细胞的转运
本实施例表明，SEQ ID NO:134的携带体可以在体外将IL-22有效载荷(SEQ IDNO:142)转运穿过极化肠上皮细胞。本实施例进一步表明，具有SEQ ID NO:134的携带体可以在体内将生物活性IL-22有效载荷转运穿过极化肠上皮细胞并转运至固有层。
根据实施例2并且如图1针对顶端(A)到基底(B)转运所示，通过将递送构建体施加至上皮细胞的顶端膜来测试递送构建体(SEQ ID NO:147)穿过Caco-2细胞单层和小肠上皮组织(本文也称为SMI-100)的转运。实验一式三份地进行，并且在顶端施加后15、30和45分钟收集来自基底外侧腔室的样品，以确定转运的蛋白质的量。使用ELISA测定来测量胞吞转运的蛋白质的量。
图2和图3中的数据显示，当与IL-22偶联时，具有SEQ ID NO:134的携带体导致IL-22有效载荷(SEQ ID NO:142)以时间依赖性方式转运穿过Caco-2(图2)和SMI-100(图3)单层，并且在与未偶联于携带体的IL-22(SEQ ID NO:143)相比时，递送构建体导致穿过上皮细胞的IL-22约2-3倍得更多。
对于体内实验，使用雄性Wistar大鼠来测试胞吞转运。每笼容纳3-5只雄性Wistar大鼠，光/暗周期为12/12h，并且用于研究时其为约225-275g(大约6-8周龄)。使用持续异氟烷麻醉的非恢复方案，在光照阶段进行实验。切割4-5cm的使空肠中段区域露出的中线腹部切口。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备递送构建体的3.86x10-5 M储备溶液，使用29号针通过管腔内注射(ILI)施用50μL(每250g大鼠)。然后，采用永久性标志物来标记注射部位的肠系膜。在研究结束时，将捕捉到了被标记肠段的3-5mm区域分离并处理以进行显微评估。
具有SEQ ID NO:147的递送构建体的胞吞转运活性的结果在图4中示出，其表明，当作为包括衍生自Cholix的携带体的递送构建体的部分提供时，显著量的IL-22有效载荷(SEQ ID NO:142)在体内穿过完整且极化的肠上皮。此显微镜图像显示，在将SEQ ID NO:147的递送构建体管腔内施加至Wistar大鼠的空肠后，IL-22有效载荷(SEQ ID NO:142)从肠上皮的顶端部位(通过白色箭头#1突出显示)转运到上皮细胞的基底部位并进入固有层(3)(缩写为“l.p.”)中。所述图像进一步显示，IL-22与位于固有层内的细胞上的以及位于极化上皮的外基底膜上的IL-22受体相互作用并在很大程度上结合(通过白色箭头#2突出显示)，表明IL-22有效载荷在转运后仍具有生物活性。IL-22定位通过白色箭头和绿色荧光指示，蓝色荧光指示DAPI染色。
此外，图5示出，在胞吞转运后在基底外侧区室处检测到由SEQ ID NO:147和SEQID NO:148所示的氨基酸序列组成的递送构建体。蛋白质印迹实验的分析证实两种递送构建体均未改变。
后续实验还显示，包含Cholix衍生的携带体的递送构建体的胞吞转运可以依赖于GRP75(图6)和基底膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白(HSPG)(图7)(在本文也称为“串珠蛋白聚糖”)的存在。图6和图7分别示出胞吞转运功能在缺乏GRP75(图6，即Caco-2GRP75-细胞)和HSPG(图7，即Caco-2HSPG-细胞)的Caco-2细胞中显著降低。这表明GRP75和HSPG都是Cholix衍生的携带体在顶端到基底胞吞转运期间可以与其相互作用的TRIP。
总之，这些数据表明，本文所述的Cholix衍生的携带体有效地(例如，施加至顶端表面的材料的至少5％、10％、20％、25％或50％)将治疗性有效载荷诸如IL-22转运穿过极化的上皮层，与单独的有效载荷相比，具有显著增加的转运速率和总体转运效率(例如，增加至少约2-3倍)。
实施例4
使用Cholix衍生的携带体进行进入极化上皮细胞的体内转运研究
本实施例展示了截短的Cholix衍生的携带体将有效载荷转运到极化上皮细胞中的能力。
图8描绘，使用大鼠管腔内注射模型，在管腔内注射构建体后15分钟，上皮细胞内的顶端区室(用白色箭头#2突出显示)中的递送构建体(SEQ ID NO:154)的荧光显微镜检测(白色箭头#1突出显示顶端表面，白色箭头#3突出显示基底膜，并且白色箭头#4突出显示固有层)。数据表明，衍生自Cholix41-187的携带体(例如，SEQ ID NO:137)能够将有效载荷转运至上皮细胞的顶端区室，但是不穿过上皮细胞。红色荧光示出Cholix携带体的定位，绿色荧光示出hGH(SEQ ID NO:146)的定位，并且蓝色荧光指示DAPI染色。
图9描绘，使用大鼠管腔内注射模型，在管腔内注射后15分钟，上皮细胞的顶端区室(用白色箭头#2突出显示)中的递送构建体(SEQ ID NO:156)的荧光显微镜检测(白色箭头#1突出显示顶端表面，白色箭头#3突出显示基底膜，并且白色箭头#4突出显示固有层)。数据表明，衍生自Cholix40-205的携带体(SEQ ID NO:138)能够将有效载荷(例如，hGH)转运至上皮细胞的顶端区室，但是不穿过上皮细胞转运到固有层中。这些数据进一步表明，SEQID NO:1的残基1-40可以在胞吞转运中发挥作用，但是可能不是Cholix携带体的胞吞所需要的。红色荧光示出Cholix携带体的定位，绿色荧光示出hGH(SEQ ID NO:146)的定位，并且蓝色荧光指示DAPI染色。
图10A描绘，在将递送构建体管腔内注射至大鼠空肠后5分钟，上皮细胞内部的顶端区室中的递送构建体(SEQ ID NO:153)的荧光显微镜检测。在图10A-10C中，红色荧光示出Cholix携带体的定位，绿色荧光示出hGH(SEQ ID NO:146)的定位，并且蓝色荧光指示DAPI染色；白色箭头#1突出显示顶端区室，并且白色箭头#2突出显示核上区室。
图10B描绘在管腔内注射后10分钟递送构建体(SEQ ID NO:153)的荧光显微镜检测。数据表明，随着时间的推移，携带体将hGH有效载荷从顶端区室转运到核上区室和基底区室。
图10C描绘在管腔内注射后15分钟递送构建体(SEQ ID NO:153)的荧光显微镜检测。数据表明，随着时间的推移，携带体将有效载荷从顶端区室转运到核上区室和基底区室。
这些数据表明，具有分别处于SEQ ID NO:1的位置187或205处的C末端截短和处于SEQ ID NO:1的位置40或41处的N末端截短的Cholix衍生的携带体可以将有效载荷转运到极化上皮细胞中。这些数据进一步表明，Cholix携带体的N末端39个氨基酸可以在胞吞转运中发挥作用，但不足以转运至基底外侧细胞内囊泡，并且1-187不足以胞吞转运，但足以将有效载荷转运到上皮细胞中(例如，转运到核上区室和基底区室中)。
实施例5
Cholix衍生的携带体的体外胞吞转运功能
本实施例展示了，使用如上文在实施例1中描述的重组表达，通过间隔子而与人生长激素偶联的各种Cholix衍生的携带体的体外顶端到基底胞吞转运功能。
评估了以下携带体穿过极化的人小肠上皮细胞单层的能力(表10)：
表10–所测试的递送构建体
Figure BDA0003152357000001611
Figure BDA0003152357000001621
图11A-11B描绘与使用偶联于携带体的hGH相比，单独的人生长激素(hGH，SEQ IDNO:190)的顶端到基底转运。携带体长度通过相对于参考SEQ ID NO:1的C末端截短指示(即，“134”指示具有SEQ ID NO:1的残基1-134的携带体)。所有携带体还包括N末端甲硫氨酸。hGH的蛋白质印迹定性地评估在2h之后这些蛋白质在体外穿过原代人小肠上皮细胞的极化单层进行顶端到基底转运的能力。顶端施加的材料的量以摩尔计相当于hGH含量，并且在分析之前基底收集物被浓缩约10倍。
图11A示出单独的hGH(SEQ ID NO:190)的顶端到基底转运相对于针对递送构建体所测量的顶端到基底转运的比较，所述递送构建体包含具有相应地处于SEQ ID NO:1的位置134、151、187、41-187和266处的C末端截短的SEQ ID NO:151–SEQ ID NO:154和SEQ IDNO:159所示的序列。数据表明，与包含具有处于SEQ ID NO:1的266处的C末端截短的Cholix携带体(SEQ ID NO:159)的构建体相比，具有处于SEQ ID NO:1的位置134、151、187处的C末端截短的，或具有处于SEQ ID NO:1的41处的N末端截短和187处的C末端截短的Cholix携带体显示出联合的hGH的显著较低的顶端到基底转运。
图11B示出，具有SEQ ID NO:155和SEQ ID NO:157–SEQ ID NO:159的包括Cholix携带体的递送构建体展示出联合的hGH(SEQ ID NO:146)的有效的顶端到基底转运，其中所述Cholix携带体具有相应地处于SEQ ID NO:1的位置206(SEQ ID NO:131)、245(SEQ IDNO:132)、251(SEQ ID NO:133)和266(SEQ ID NO:134)处的C末端截短。虽然具有处于位置245和251处的Cholix C末端截短的携带体展示出与具有处于位置266处的C末端截短的携带体相当的hGH(SEQ ID NO:146)的顶端到基底转运，但是与具有处于位置245、251和266处的C末端截短的携带体相比，具有处于位置206处的Cholix C末端截短的携带体显示出hGH的顶端到基底转运的显著增强。
这些结果表明，Cholix的残基1-266足以进行顶端到基底转运，并且它可以用作胞吞转运元件以穿过上皮细胞递送各种异源有效载荷。另外，已证明，由SEQ ID NO:1所示的序列组成的Cholix多肽的前206个氨基酸残基内的元件足以实现胞吞转运功能，并且因此可以用于有效地(例如，施加至顶端表面的材料的至少5％、10％、20％、25％或50％)使异源有效载荷分子诸如治疗性和/或诊断性有效载荷穿梭穿过上皮细胞层(例如，肠上皮)，从而实现对原本将只能通过肠胃外施用途径(例如，静脉内或皮下)施用的有效载荷进行经口施用。
实施例6
Cholix衍生的携带体的体内胞吞转运功能
本实施例展示了，使用如上文在实施例1中描述的重组表达，通过间隔子而与人生长激素偶联的各种Cholix衍生的携带体的体内顶端到基底胞吞转运功能。
在ILI到大鼠空肠中之后，检查实施例5的表10中所示的选定Cholix携带体在体内胞吞转运的能力。
在这些实验中获得的数据示出各自包括不同的Cholix携带体的六种递送构建体在大鼠空肠中穿过极化肠上皮细胞的顶端到基底转运的程度。Cholix携带体(红色荧光)和hGH(绿色荧光)的定位分别使用多克隆抗Cholix抗体和单克隆抗hGH抗体通过免疫荧光显微镜法来展示(图12A-12F)。白色箭头指示顶端膜，“l-p”是指固有层，“GC”是指杯状细胞，并且空心箭头指示固有层中存在的递送构建体。
图12A示出包括与hGH(SEQ ID NO:146)偶联的Cholix携带体(SEQ ID NO:140)的递送构建体(SEQ ID NO:151)的管腔内注射后15分钟的顶端到基底转运程度。图12A示出携带体不能使递送构建体进入上皮细胞，表明具有SEQ ID NO:1的氨基酸残基134-151的功能序列片段可以在胞吞进入极化上皮细胞中发挥作用(相比之下，图12B表明具有SEQ ID NO:139的携带体使得相应的递送构建体能够通过胞吞而进入细胞)。
图12B示出包括与hGH(SEQ ID NO:146)偶联的Cholix携带体(SEQ ID NO:139)的递送构建体(SEQ ID NO:152)的管腔内注射后15分钟的顶端到基底转运程度，如通过免疫荧光显微镜法所展示。图12B示出此构建体的确进入上皮细胞(与图12A中描述的具有SEQID NO:151的构建体相反)，但是主要保留在顶端，并且在一定程度上保留在基底囊泡池中，但是未进入固有层，从而实现将有效载荷递送到上皮细胞的顶端区室和基底区室中。
图12C示出包括与hGH(SEQ ID NO:146)偶联的Cholix携带体(SEQ ID NO:136)的递送构建体(SEQ ID NO:153)的管腔内注射后15分钟的顶端到基底转运程度，如通过免疫荧光显微镜法所展示。图12C示出此构建体进入上皮细胞，到达顶端区室和基底区室并且还到达细胞的核上区域，而仍保留在上皮细胞内部，表明由SEQ ID NO:1的氨基酸残基152-187组成的序列片段可以允许进入并递送至核上区域，并且允许定位在基底区室中。
图12D示出包括与hGH(SEQ ID NO:146)偶联的Cholix携带体(SEQ ID NO:137)的递送构建体(SEQ ID NO:154)的管腔内注射后15分钟的顶端到基底转运程度，如通过免疫荧光显微镜法所展示。图12D示出此构建体进入上皮细胞，但保留在顶端区室中并且似乎未到达基底区室或核上区室。
图12E示出包括与hGH(SEQ ID NO:146)偶联的Cholix携带体(SEQ ID NO:131)的递送构建体(SEQ ID NO:155)的管腔内注射后15分钟的顶端到基底转运程度，如通过免疫荧光显微镜法所展示。图12E示出此构建体完成胞吞转运过程，如通过递送构建体到达固有层(参见空心箭头)所指示的，表明由SEQ ID NO:1所示的序列的氨基酸残基188-206组成的序列片段可以使得携带体(以及包含所述携带体的构建体)能够与基底再循环过程相关联，从而允许携带体或相应的构建体从上皮细胞释放到基底外侧区室(例如，固有层)中。
图12F示出在包括与hGH(SEQ ID NO:146)偶联的Cholix携带体(SEQ ID NO:134)的递送构建体(SEQ ID NO:159)的管腔内注射后15分钟，在体内转运穿过大鼠空肠上皮单层，如通过免疫荧光显微镜法所展示。图12F示出此构建体完成胞吞转运过程，如通过递送构建体到达固有层(参见空心箭头)所指示。
因此，这些结果与从实施例5中描述的体外胞吞转运实验获得的数据一致，并且表明，具有处于SEQ ID NO:1所示的Cholix序列的残基206-266中的任一个处的C末端截短的携带体可以快速(例如，至少10-6厘米/秒、10-5厘米/秒)且有效地(例如，施加至顶端表面的材料的至少5％、10％、20％、25％或50％)穿过上皮细胞(例如，穿过受试者的极化的肠上皮细胞)转运有效载荷分子(例如，治疗性蛋白质)。此外，这些结果显示，具有处于SEQ ID NO:1所示的Cholix序列的残基151-187中的任一个处的C末端截短和/或处于SEQ ID NO:1的残基1-40中的任一个处的N末端截短的携带体可以用于将各种异源有效载荷递送到上皮细胞中。
基于这些数据，鉴定出衍生自SEQ ID NO:1的Cholix多肽的携带体的以下功能性Cholix序列片段。
表11–示例性Cholix序列片段以及其在SEQ ID NO:1的Cholix多肽内的功能
Figure BDA0003152357000001651
实施例7
Cholix衍生的携带体与Rab11a共定位
本实施例展示，Cholix衍生的携带体与Ras相关蛋白Rab11a(Rab11a或Rab11)共定位。携带体与Rab11a的共定位可以发生在上皮细胞的顶端侧或基底侧。据显示，携带体与Rab11a在上皮细胞的顶端侧的共定位可以将携带体引导至顶端再循环内体和/或肠腔中。携带体与Rab11a在上皮细胞的基底侧的共定位表明，携带体可以利用基底再循环机制而使其从基底细胞膜释放到基底外侧区室(例如，固有层)中。
通过管腔内注射(ILI)50μL四种不同的递送构建体在PBS中的3.86x10-5 M溶液来测试四种递送构建体与Rab11a的共定位。此类递送构建体由SEQ ID NO:152-154和SEQ IDNO:159所示的氨基酸序列组成。
图13A、图13B和图13C示出分别具有SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:153的递送构建体与Rab11a共定位在上皮细胞的顶端侧上。数据还显示，具有SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:154的构建体不显著定位在基底侧上，而是主要保留在顶端侧。具有SEQID NO:153的构建体的确定位在顶端和基底侧，但是仅与Rab11a共定位在顶端侧而不是基底侧(另外参见图13C的子图像3a和3b，其示出相比于基底部位，在顶端部位的定位增加)。总之，这些结果表明，不能进行顶端到基底胞吞转运的携带体可以进入上皮细胞内的顶端再循环系统，如与Rab11a在顶端部位的共定位所证明的。在管腔内注射后15分钟进行测量。绿色荧光示出hGH的定位，红色荧光示出Rab11a(或Rab11)的定位，并且蓝色荧光指示DAPI染色(实验描述与图13D相同)。
图13D示出具有SEQ ID NO:159的递送构建体与Rab11a共定位在基底侧上，但不显著共定位在极化上皮细胞的顶端侧上。这表明能够胞吞转运的携带体可以利用基底再循环系统以使其从上皮细胞释放到固有层中(另外参见图13D的子图像4a和4b，其示出与基底部位相比，在顶端部位的定位增加)。
这些数据表明，能够与Rab11a进行基底共定位以进入基底再循环系统的Cholix的功能片段可以至少存在于SEQ ID NO:1的氨基酸残基187-266内。
此外，这些数据实现携带体的合理设计，所述携带体可以将有效载荷转运至上皮细胞内部的各个位置或转运穿过所述上皮细胞。例如，包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的氨基酸残基1-151、1-187、41-187、41-187、40-205或41-205或由其组成的Cholix衍生的携带体可以用于上皮内有效载荷递送，而包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-266的Cholix衍生的携带体可以用于将有效载荷转运穿过所述上皮细胞屏障并进入固有层。
实施例8
用于评估Cholix携带体相互作用配偶体(TRIP)的类型和位置的细胞区室特异性蛋白质标志物
本实施例描述了上皮细胞区室特异性蛋白质标志物，其用于确定在胞吞和/或胞吞转运过程中与Cholix衍生的携带体相互作用的蛋白质。
以下表12示出本文所用的示例性细胞区室特异性蛋白质标志物。例如，在使用抗IL-10的单克隆抗体(mAb)和/或对抗Cholix携带体(例如，包含SEQ ID NO:1的残基1-266或1-386的携带体)产生的多克隆抗体(pAb)的实验期间，包含IL-10作为异源有效载荷的Cholix衍生的递送构建体如下。
表12–细胞区室特异性蛋白质标志物
Figure BDA0003152357000001671
Figure BDA0003152357000001681
实施例9
体外胞吞转运研究揭示Cholix衍生的携带体的转运受体相互作用配偶体(TRIP)
本实施例展示了确定Cholix衍生的携带体在穿过极化上皮细胞胞吞转运期间与其相互作用的TRIP。本实施例进一步展示可以在Cholix胞吞转运中发挥作用的关键性相互作用配偶体。
图14A-14D分别示出对于具有SEQ ID NO:150的递送构建体的胞吞转运功能而言，K8、HSPG(串珠蛋白聚糖)和GRP75的敲除效应，所述递送构建体包括通过间隔子(其序列如SEQ ID NO:177所示)而与hGH(SEQ ID NO:146)偶联的具有SEQ ID NO:134所示的序列的Cholix衍生的携带体。缺乏对特定候选蛋白K8(Caco-2K8-)、HSPG(Caco-2HSPG-)和GRP75(Caco-2GRP75-)的表达的Caco-2细胞的稳定细胞系在体外用作单层，以验证它们参与通过主动和选择性内源性转运机制进行的携带体(例如，Cholix携带体)胞吞转运。
将Caco-2细胞，亲代或K8、HSPG(串珠蛋白聚糖)或GRP74敲低(KO)的稳定细胞以1.5x105个细胞/ml接种在每个transwell中。在第18天，将含有20μg/ml递送构建体(SEQ IDNO:150)或等摩尔对照hGH(SEQ ID NO:190)的100μl PBS添加到顶端侧，并在基底腔室中添加500μl的PBS。在37℃下1h后，通过蛋白质印迹分析基底溶液中蛋白质的量。使用抗hGHmAb探测印迹。
图14A示出K8敲除不显著降低递送构建体(SEQ ID NO:150)的胞吞转运功能。
图14B示出HSPG(串珠蛋白聚糖)敲除确实显著降低递送构建体(SEQ ID NO:150)的胞吞转运功能。
图14C示出GRP75敲除确实显著降低递送构建体(SEQ ID NO:150)的胞吞转运功能。
接下来，评估Cholix蛋白与GRP75之间的相互作用的pH依赖性。图15A示出用于检查Cholix携带体-GRP75相互作用的所述pH依赖性的BiacoreTM结合相互作用(例如，表面等离子体共振)。为此，将生物素与全长Cholix蛋白(其序列如SEQ ID NO:1所示)的C末端偶联并且随后通过使用生物素-链霉抗生物素蛋白生物缀合而连接至表面(例如，芯片表面、塑料96孔板等)并且与纯化的GRP75蛋白一起分别在pH 5.5、6.5和7.5的缓冲溶液中孵育。这种相互作用的最高结合亲和力在pH 6.5下测得。图15A示出，与pH 7.5或pH 5.5相比，Cholix蛋白对GPR75的亲和力在pH 6.5下高约20-25倍。
此外，图15B示出Cholix衍生的携带体(SEQ ID NO:189)与顶端受体(例如，TMEM132)、溶酶体回避受体(例如，GRP75)、运输受体(例如，ERGIC-53)以及基底受体(例如，串珠蛋白聚糖)的相互作用的pH依赖性。受体相互作用的这种pH依赖性表明，Cholix衍生的携带体可以顺序地并且依赖于其位置而与某些受体相互作用。例如，这些数据显示，Cholix衍生的携带体在pH 7.5下对胞吞和早期运输受体诸如顶端进入受体和溶酶体回避受体具有显著较高的亲和力。一旦pH下降至约5.5，Cholix携带体对这些早期运输受体的亲和力就降低，而其对顶端-基底运输受体ERGIC-53和基底释放蛋白串珠蛋白聚糖的亲和力在所述pH下则显著增加，从而允许Cholix携带体在囊泡胞吞转运过程中“被转交”给运输和基底释放受体。
图16示出序列如SEQ ID NO:1所示的全长Cholix蛋白与串珠蛋白聚糖和GRP75的显著且顺序性的BiacoreTM结合相互作用，表明Cholix与这两种蛋白质均相互作用。对于结合实验，20μl的50nM cholix-生物素蛋白被捕捉在Biacore SA芯片表面上。以30μl/min的速度注射60μl的200nM人串珠蛋白聚糖(HSPG)蛋白通过芯片表面。接着，以30μl/min的速度注射60μl的100nM人GRP75蛋白通过芯片表面。通过注射50μl的pH 1.5的10mM甘氨酸除去所有结合蛋白来使芯片表面再生。
图17示出序列如SEQ ID NO:1所示的全长Cholix蛋白与GRP75、串珠蛋白聚糖和TMEM132A的显著且顺序性的BiacoreTM结合相互作用，表明Cholix与所有三种蛋白质均相互作用。对于结合实验，20μl的50nM cholix-生物素蛋白被捕捉在Biacore SA芯片表面上。以30μl/min的速度注射30μl的100nM人GRP75蛋白通过芯片表面。然后以30μl/min的速度注射60μl的200nM人串珠蛋白聚糖蛋白通过芯片表面，接着注射30μl的200nM人TMEM132A蛋白。通过注射50μl的pH 1.5的10mM甘氨酸除去所有结合蛋白来使芯片表面再生。
这些数据表明，GRP75和串珠蛋白聚糖可以在Cholix衍生的携带体的胞吞转运功能中发挥作用，并且Cholix蛋白结合GRP75、串珠蛋白聚糖、TMEM132蛋白。
实施例10
胞吞转运穿过极化上皮细胞的Cholix衍生的携带体不可与LAMP1+或Rab7+共定位，并且可以在顶端到基底胞吞转运期间被引导离开溶酶体
本实施例展示，由Cholix多肽衍生的携带体在胞吞转运期间被引导离开溶酶体并且因此不与溶酶体再循环途径相互作用，从而允许携带体不改变且全功能地胞吞转运穿过极化上皮细胞。
图18A-18D示出首先作为潜在对照实验评估通过管腔内注射(ILI，管腔表面在图18A-图18F中以白色箭头指示)施用到大鼠空肠中的人生长激素(hGH，SEQ ID NO:190)在体内的命运，预期hGH在细胞摄取后转运至溶酶体。
图18A示出在注射(ILI)后15分钟，hGH(SEQ ID NO:190)的定位局限于上皮细胞的顶端区域中的囊泡小群体，如通过绿色免疫荧光检测所展示。
图18B、图18C和图18D示出在ILI后15分钟，hGH(SEQ ID NO:190)与溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1，红色荧光)(图18B)和Ras相关蛋白(Rab7，紫色荧光)(图18C)以大约相同的频率和驻留的LAMP1+、Rab7+溶酶体特征共定位(图18D)，表明hGH在摄取到上皮细胞中之后不久即被引导至溶酶体破坏(例如，再循环)途径。
图18E和图18F示出包括通过间隔子(SEQ ID NO:175)而与hGH(SEQ ID NO:146)偶联的Cholix衍生的携带体(SEQ ID NO:134)的递送构建体(SEQ ID NO:159)被引导离开溶酶体途径并且因此不显示出与LAMP1(图18E)或Rab7(图18F)的共定位，从而使得功能性有效载荷能够穿过极化上皮细胞胞吞转运到固有层中。
图19A示出在管腔注射包括通过间隔子(SEQ ID NO:175)而与hGH(SEQ ID NO:146)偶联的Cholix衍生的携带体(SEQ ID NO:134)的递送构建体(SEQ ID NO:159)之前，包被蛋白I(COPI，红色荧光)的分布局限于上皮细胞的管腔顶端膜和顶端囊泡区室。相比之下，图19B示出，递送构建体(SEQ ID NO:159)的顶端管腔内注射(ILI，管腔表面在图19A-图19D中以白色箭头指示)诱导COPI重新分布至核上位置，表明包含具有SEQ ID NO:159的递送构建体和COPI两者的囊泡的共定位。蓝色荧光指示DAPI染色。图19A-19D中的测量在ILI后15分钟进行。
图19C示出在注射递送构建体(SEQ ID NO:159)之前，LMAN1(绿色荧光)与COPI(红色荧光)共定位在极化上皮细胞的顶端区域(通过白色箭头突出显示)中。
图19D示出，在顶端ILI(通过白色箭头突出显示)递送构建体(SEQ ID NO:159)之后，LMAN1与递送构建体相互作用并且与其一起分布至上皮细胞的基底区域，所述基底区域与固有层(表示为“l-p”)相邻。因此，Cholix携带体似乎采用LMAN1重新分布而从上皮细胞的顶端侧移动到基底区室。
后续实验显示，Cholix衍生的携带体在胞吞之后可以利用ERGIC蛋白(例如，ERGIC-53)从顶端运输至基底区室。
图19E-19H示出在将包含与hGH(SEQ ID NO:146)偶联的Cholix衍生的携带体(SEQID NO:134)的递送构建体(SEQ ID NO:159)管腔注射在大鼠空肠中后5分钟(图19F)、10分钟(图19G)和15分钟(图19H)，Cholix携带体(SEQ ID NO:134)在上皮细胞中从顶端区室(通过白色箭头#1指示)运输至基底区室(通过白色箭头#2指示)。Cholix携带体定位通过绿色荧光示出，ERGIC受体定位通过红色荧光示出，并且ER-高尔基体运输蛋白复合物的定位通过紫色荧光示出；因此Cholix携带体与ERGIC受体的相互作用通过黄色荧光示出，Cholix携带体与ER-高尔基体运输蛋白复合物的相互作用通过粉色荧光示出，并且Cholix携带体、ERGIC受体和ER-高尔基体运输蛋白复合物的相互作用和/或共定位通过白色斑点(绿色、红色和紫色荧光的叠加)示出。DAPI染色通过蓝色荧光指示。
图19E示出未处理的极化肠上皮细胞。
图19F示出在管腔注射后5分钟，Cholix携带体(SEQ ID NO:134)与ER-高尔基体运输蛋白复合物在顶端区室中的定位和相互作用，如通过顶端区室中的粉色荧光信号所指示。
图19G示出在管腔注射后10分钟，与ERGIG-53缔合的Cholix携带体(SEQ ID NO:134)运输到基底膜，接着携带体(和构建体)基底释放到固有层(金色箭头)中。这些数据表明，Cholix衍生的携带体利用与ERGIC蛋白的特异性相互作用来“劫持”囊泡，从而使其从极化上皮细胞的顶端区室运输到基底区室。
图19H示出在管腔注射后15分钟，固有层中存在的Cholix携带体(SEQ ID NO:134)的量增加。
图19I-19K示出，Cholix携带体(SEQ ID NO:134)利用基底蛋白分泌机制而穿过极化上皮细胞运输到固有层中。在大鼠空肠中管腔注射包含与hGH(SEQ ID NO:146)偶联的Cholix衍生的携带体(SEQ ID NO:134)的递送构建体(SEQ ID NO:159)后15分钟获取荧光显微镜图像，并且其示出，基底囊泡可以包含Cholix携带体和ERGIC-53受体、Cholix携带体和基底分泌蛋白，或Cholix携带体、ERGIC-53受体和基底分泌蛋白中的全部三种。Cholix携带体定位通过绿色荧光示出(使用抗Cholix携带体抗体)，ERGIC-53受体定位通过红色荧光示出，并且基底分泌蛋白的定位通过紫色荧光示出；因此Cholix携带体与ERGIC-53受体的相互作用通过黄色荧光示出，Cholix携带体与基底分泌蛋白的相互作用通过粉色荧光示出，并且Cholix携带体、ERGIC-53受体和基底分泌蛋白的相互作用和/或共定位通过白色斑点(绿色、红色和紫色荧光的叠加)示出。DAPI染色通过蓝色荧光指示。
图19I示出基底区室囊泡包含Cholix携带体(SEQ ID NO:134)和ERGIC-53受体，如通过黄色荧光所指示。
图19J示出基底区室囊泡包含Cholix携带体(SEQ ID NO:134)和基底分泌蛋白，如通过粉色荧光所指示。
图19K示出基底区室囊泡包含Cholix携带体(SEQ ID NO:134)、ERGIC-53受体和基底分泌蛋白，如通过白色斑点(例如，绿色、红色和紫色荧光的叠加)所指示。
图20A示出在不存在递送构建体(SEQ ID NO:159)的情况下，另一内质网-高尔基体-中间区室(ERGIC)元件SEC22b的分布。在未处理的(即，未注射递送构建体的)组织中，SEC22b和LMAN1广泛地共定位在顶端区室中，而仅仅LMAN1则被单独地观察到靠近顶端质膜。在图20A-20D中，红色荧光示出LMAN1的定位，紫色荧光示出SEC22b的定位，绿色荧光示出hGH的定位，白色箭头指示顶端表面，并且“G”指示杯状细胞。
图20B示出，在ILI包括与hGH(SEQ ID NO:146)偶联的Cholix携带体(SEQ ID NO:134)的递送构建体(SEQ ID NO:159)后5分钟，LMAN1、SEC22b和hGH共定位在顶端区室中，但是不显著共定位在上皮细胞的基底区室中。
图20C示出，在ILI后10分钟，观察到递送构建体(SEQ ID NO:159)和LMAN1共定位在上皮细胞的基底区室中，而没有SEC22b，证实LMAN1与递送构建体在囊泡内部相互作用并且与其一起从上皮细胞的顶端囊泡区室移动到基底囊泡区室。
图20D示出，在ILI后15分钟，递送构建体(SEQ ID NO:159)和LMAN1在基底区室中的共定位的程度增加，并且随着时间的推移显著量的hGH到达固有层。
图20E-图20H示出与上文描述且在图20A-图20D中示出的相同组织切片，但是仅示出LMAN1和SEC22b信号(无hGH信号)。这些表明响应于递送(SEQ ID NO:159)的顶端施加，LMAN1明显重新分布至基底区室，而SEC22b则没有重新分布。这些数据进一步表明，包含Cholix衍生的携带体的递送构建体可以利用内源性Cholix运输途径，从而通过将所述有效载荷与携带体偶联而允许将有效载荷快速且有效地转运穿过肠上皮。
总而言之，这些数据表明，Cholix衍生的携带体利用内源性细菌运输机制来实现顶端到基底的胞吞转运，从而允许此类携带体和包含此类携带体的递送构建体从肠腔运输到固有层，而不损害肠上皮的屏障功能并且在所述转运过程中没有酶促或化学修饰。这种跨上皮转运机制可以实现包含与治疗性有效载荷偶联的Cholix衍生的携带体的治疗性递送构建体的口服施用以及治疗性有效载荷穿过完整且极化的上皮膜的转运。
实施例11
Cholix衍生的携带体的表面模型
本实施例示出具有SEQ ID NO:178的Cholix多肽的结构序列元件。
图21A-21E示出由SEQ ID NO:178(包括SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-265和N末端甲硫氨酸)组成的Cholix衍生的携带体的示例性表面模型，其用于突出显示可以在与顶端到基底胞吞转运相关的某些功能性中发挥作用的受关注的选定区域，以及它们在蛋白质表面上的相对位置和接近度。位于残基V1和E39内的氨基酸区域与表面暴露的氨基酸D150-K186和K186-L205相邻。具体地，L17-I25(区域X1，SEQ ID NO:160)和T170-I176(区域X2，SEQ ID NO:161)相互协调以形成被若干负电荷围绕的口袋。类似地，K186-H202(区域X3，SEQ ID NO:162)与I31-E39(区域X4，SEQ ID NO:163)相互协调以形成连续的脊结构。此外，表面模型示出残基D135-N139(区域X5，SEQ ID NO:164)和用紫色突出显示的天冬酰胺残基(例如，潜在的糖基化位点)。
图21A示出具有SEQ ID NO:178的Cholix多肽的氨基酸序列。图21B示出区域X1、X3和X4的位置。图21C示出区域X1和X2以及X3和X4的位置。图21D示出区域X1、X2、X4和X5的位置。
此结构数据显示，SEQ ID NO:1的Cholix序列内的功能序列片段可以彼此紧密接近，诸如区域X3和X4以及区域X1和X2。
实施例12
在使用不同区室胞吞转运期间，Cholix衍生的递送构建体与各种标志物蛋白相互作用和/或共定位
本实施例展示，使用各种标志物蛋白，Cholix衍生的携带体可以利用不同的区室用于运输到和穿过(例如，通过胞吞转运)上皮细胞(参见例如，实施例8)。这些数据表明，Cholix衍生的携带体构建体可以利用或“劫持”特异性且内源性的Cholix运输途径(图24)。本实施例中所述的研究使用具有SEQ ID NO:149所示的序列的Cholix衍生的递送构建体进行，所述构建体包括通过具有SEQ ID NO:176所示的序列的间隔子而与IL-10(SEQ ID NO:145)偶联的携带体(SEQ ID NO:135)。
图22A-22L示出衍生的递送构建体(SEQ ID NO:149)的运输途径分析。在图22A-22L中，白色箭头#1突出显示顶端表面，白色箭头#2突出显示基底表面，并且白色箭头#3突出显示固有层。
图22A示出递送构建体(SEQ ID NO:149)与EEA1抗原强烈共定位在细胞位置中，这与上皮细胞的顶端和基底区室处的运输相一致，表明Cholix衍生的递送构建体存在于早期内体区室中。红色荧光示出EEA1抗原的定位，并且绿色荧光示出IL-10的定位。
图22B示出递送构建体(SEQ ID NO:149)与Rab7(左上图)主要强烈共定位在上皮细胞的顶端区室中，但是仅有限地共定位在固有层内的细胞中，表明Cholix衍生的递送构建体存在于晚期内体区室中(左下图示出白光图像，并且右下图示出合并染色，其中DAPI染色以蓝色示出，红色荧光示出EEA1抗原的定位，并且绿色荧光示出IL-10的定位)。
图22C示出在与不含递送构建体(SEQ ID NO:149)的成熟溶酶体一致的特定大囊泡中鉴定出LAMP1(白色箭头，红色荧光示出EEA1抗原的定位，并且绿色荧光示出IL-10的定位)。然而，递送构建体(SEQ ID NO:149)与LAMP1抗原共定位在除类溶酶体结构之外的细胞位置中，这与上皮细胞的顶端区室和基底区室处的囊泡运输相一致，表明Cholix衍生的递送构建体存在于晚期内体区室中。
图22D示出递送构建体(SEQ ID NO:149)还与网格蛋白包被的囊泡强烈共定位，尤其是在与细胞核相邻的区域中，并且与Rab11a主要强烈共定位在上皮细胞的基底区室中以及固有层内的选定细胞中。DAPI染色以蓝色示出，红色荧光示出IL-10抗原的定位，并且绿色荧光示出网格蛋白的定位。
图22E示出递送构建体(SEQ ID NO:149)与内质网以与细胞核相邻的模式共定位在上皮细胞中以及固有层内的大部分细胞中，如通过钙联蛋白所展示(红色荧光示出钙联蛋白的定位，并且绿色荧光示出IL-10的定位)。具体地，递送构建体(SEQ ID NO:149)与内质网-高尔基体中间区室(ERGIC)强烈共定位并且LMAN1抗原似乎响应于携带体胞吞和胞吞转运而重新分布，如针对注射后5分钟(图22F)、10分钟(图22G)和15分钟(图22H)所示。
图22F示出递送构建体(SEQ ID NO:149)与内质网-高尔基体中间区室53(ERGIC-53)强烈共定位并且LMAN1抗原(红色荧光示出ERGIC-53和LMAN1的定位，并且绿色荧光示出IL-10的定位，蓝色荧光示出DAPI染色)似乎响应于携带体胞吞和胞吞转运而重新分布，如针对注射后5分钟所示。
图22G示出在注射后10分钟，递送构建体(SEQ ID NO:149)与LMAN1抗原共定位。数据示出递送构建体(SEQ ID NO:149)在固有层中的显著定位。
图22H示出在注射后15分钟，递送构建体(SEQ ID NO:149)与LMAN1抗原共定位。数据示出递送构建体(SEQ ID NO:149)在固有层中的显著定位。
图22I示出递送构建体(SEQ ID NO:149)不与上皮细胞中存在的低水平的巨蛋白共定位(红色荧光示出IL-10的定位，并且绿色荧光示出巨蛋白的定位，蓝色荧光示出DAPI染色)。一些巨蛋白与构建体共定位在固有层中存在的细胞亚群中，表明Cholix衍生的携带体不与高尔基体区室一起定位。
图22J示出58K抗原定位在上皮细胞中，处于细胞核顶端的部位，并且递送构建体(SEQ ID NO:149)显示出与此蛋白的一些共定位(红色荧光示出IL-10的定位，并且绿色荧光示出58K高尔基体抗原的定位，蓝色荧光示出DAPI染色)，其方式表明短暂移动穿过此区室。在固有层内的细胞中未观察到58K抗原。
图22K示出，递送构建体(SEQ ID NO:149，左上图，IL-10定位)显示出与TGN38抗原一定水平的共定位(右上图)，其显示出细胞分布局限于上皮细胞中的细胞核的顶端侧并且在固有层内的少数细胞中邻近细胞核。左下图像示出白光图像并且右下图示出与IL-10(红色)、TGN38(绿色)和DAPI信号(蓝色荧光)的合并(叠加)。
图22L示出，递送构建体(SEQ ID NO:149)(IL-10定位通过绿色荧光示出，右上图)与Rab11a(左上图，定位通过红色荧光示出)主要强烈共定位在上皮细胞的基底区室和固有层内的选定细胞中。左下图像示出白光图像并且右下图示出与IL-10(绿色)、Rab11a(红色)和DAPI信号(蓝色荧光)的合并(叠加)。
图23A-23C示出显微镜图像，其展示出在向大鼠空肠中管腔施加具有SEQ ID NO:149所示的序列的递送构建体之后的各个时间点，IL-10胞吞转运穿过Wistar大鼠的极化肠上皮细胞。递送构建体(SEQ ID NO:149)包括通过具有SEQ ID NO:176所示的氨基酸序列的间隔子而与具有SEQ ID NO:145所示的氨基酸的IL-10有效载荷偶联的具有SEQ ID NO:135的携带体。绿色荧光指示IL-10的存在(通过使用抗IL-10抗体进行染色)。蓝色荧光指示DAPI染色，其标记DNA，并且红色荧光指示CK-8(细胞角蛋白-8)的存在，Cholix衍生的携带体在胞吞转运期间可以与所述CK-8共定位(例如，在上皮细胞的核上区域中)。白色箭头#1突出显示上皮细胞的顶端膜，并且白色箭头#2突出显示上皮细胞的基底膜。
图23A展示在向大鼠空肠中管腔施加具有SEQ ID NO:149所示的序列的递送构建体后1分钟时IL-10的胞吞转运程度。数据显示，IL-10有效载荷从顶端到基底部位并进入固有层中的转运早在递送构建体施加后的1分钟时发生。白色箭头#3指示IL-10存在于固有层中。
图23B展示在向大鼠空肠中管腔施加具有SEQ ID NO:149所示的序列的递送构建体后5分钟时IL-10的胞吞转运程度。数据显示，在管腔施加递送构建体后5分钟，固有层中存在(参见例如，白色箭头#3)的转运的IL-10有效载荷的量增加。
图23C展示在向大鼠空肠中管腔施加具有SEQ ID NO:149所示的序列的递送构建体后10分钟时IL-10的胞吞转运程度。数据显示，在管腔施加递送构建体后10分钟，固有层中存在(参见例如，白色箭头#3)的转运的IL-10有效载荷的量甚至更高。
已经进行了利用荧光显微镜法的附加的运输实验，以阐明被包含在具有SEQ IDNO:149的递送构建体中的具有SEQ ID NO:135的Cholix携带体的胞吞转运机制。
图23D-23F示出在向大鼠空肠中管腔注射包含与IL-10(SEQ ID NO:145)偶联的具有SEQ ID NO:135的Cholix携带体的递送构建体(SEQ ID NO:149)后1分钟，具有SEQ IDNO:135的Cholix携带体在上皮细胞中的顶端胞吞和早期运输。数据显示，Cholix衍生的携带体通过与溶酶体回避受体相互作用而避开溶酶体破坏途径。Cholix携带体定位通过绿色荧光示出，顶端进入受体(例如，TMEM132)定位通过红色荧光示出，并且溶酶体回避受体的定位通过紫色荧光示出；因此Cholix携带体与顶端进入受体的相互作用通过黄色荧光示出，Cholix携带体与溶酶体回避受体的相互作用通过粉色荧光示出，并且Cholix携带体、顶端进入受体和溶酶体回避受体的相互作用和/或共定位通过白色斑点(绿色、红色和紫色荧光的叠加)示出。DAPI染色通过蓝色荧光指示。
图23D示出Cholix携带体(SEQ ID NO:135)定位在极化上皮细胞的顶端膜(通过白色箭头#1指示)处。基底膜通过白色箭头#2指示并且固有层通过白色箭头#3指示。
图23E示出Cholix携带体(SEQ ID NO:135)与顶端进入受体(例如，TMEM132)的相互作用，如通过顶端膜处及其附近的黄色荧光所指示。
图23F示出Cholix携带体(SEQ ID NO:135)、顶端进入受体和溶酶体回避受体在顶端膜处紧密接近，如通过白色箭头指示的白色斑点(例如，绿色、红色和紫色荧光的叠加)所示。假设溶酶体回避受体可以接近Cholix携带体-顶端进入受体复合物，接着由于pH环境的变化和这些Cholix携带体-受体相互作用的pH依赖性(如例如图15B所示)，Cholix携带体与顶端进入受体解离并且Cholix携带体与溶酶体回避受体缔合。
图23G-23H示出，在将包含与IL-10(SEQ ID NO:145)偶联的Cholix衍生的携带体(SEQ ID NO:135)的递送构建体(SEQ ID NO:149)管腔注射在大鼠空肠中后5和15分钟，Cholix携带体(SEQ ID NO:135)在上皮细胞中从顶端区室运输到核上区室。Cholix携带体定位通过绿色荧光示出，ERGIC受体定位通过红色荧光示出，顶端进入受体(例如，TMEM132)定位通过橙色荧光示出；并且溶酶体回避受体的定位通过紫色荧光示出；因此Cholix携带体与ERGIC受体的相互作用通过黄色荧光示出，Cholix携带体与溶酶体回避受体的相互作用通过粉色荧光示出，并且Cholix携带体、顶端进入受体和溶酶体回避受体的相互作用和/或共定位通过白色斑点(绿色、红色和紫色荧光的叠加)示出。DAPI染色通过蓝色荧光指示。
图23G示出，在管腔注射递送构建体(SEQ ID NO:149)后5分钟，Cholix携带体(SEQID NO:135)定位在极化肠上皮细胞中。数据显示，在顶端受体介导的胞吞之后，Cholix携带体与靠近顶端膜的溶酶体回避受体和顶端进入受体形成复合物(通过白色斑点(绿色、红色和紫色荧光的叠加)指示并且通过白色箭头突出显示)并且还开始与略微更靠近细胞内的核上区域的ERGIC受体相互作用，如通过黄色荧光(和黄色箭头)所展示。
图23H示出，在管腔注射递送构建体(SEQ ID NO:149)后15分钟，Cholix携带体(SEQ ID NO:135)定位在极化肠上皮细胞中。数据显示，携带体从顶端区室移动到核上区室，同时与ERGIC缔合(参见黄色箭头)，其中黄色荧光强度与注射后5分钟相比增加，表明Cholix携带体从顶端区域到核上区域的移动随时间而增加。数据还显示，Cholix携带体定位在基底膜和固有层(金色箭头)中。
总之，这些数据表明，Cholix衍生的携带体可以利用内源性Cholix运输途径而穿过极化上皮细胞进行胞吞转运，并且因此可以用于快速且有效地将有效载荷(例如，治疗性蛋白质，诸如白介素)转运穿过上皮细胞屏障而不损害所述有效载荷的生物活性。
实施例13
抗TNFα剂穿过上皮细胞层的转运
本实施例显示，Cholix多肽衍生的携带体可以穿过完整的上皮细胞层转运抗TNFα剂。
如下测试递送构建体的肠上皮转运：将野生型大鼠(Sprague
Figure BDA0003152357000001811
约200–250克，约6周龄，购自Charles River)禁食过夜以清肠，准备含有4％甲醛的微量离心管、用于组织保存的管、用于血液收集的微量离心管、用于血清收集的微量离心管、PBS和测试制品；将动物准备好用于实验(用异氟烷使动物麻醉，并且对腹部剃毛)；针对每只动物准备注射(每只动物接受4次注射(2x空肠和2x结肠)；打开腹腔，用有区分性的颜色定位并标记注射部位；将测试制品缓慢注射到管腔中(注射在结肠中进行10分钟并且在空肠中进行40分钟)并且动物每次注射接受浓度为1μg/μL的35μg蛋白质；在50分钟时使动物安乐死；通过心脏穿刺收集末梢血；取出空肠和结肠并且放置在塑料衬里的工作表面上；使用PBS冲洗空肠和结肠的内容物并丢弃；从注射部位切除1cm长的肠子；将切除的组织切成两半，并且将1个切片放置到4％甲醛中。然后将其余组织纵向切成薄片并且立即放置在微量离心管中并冷冻。此过程可以重复用于所有注射部位。取出肝脏(约1cm3)并分成2片。将1个肝脏切片放置在甲醛中并且将第二个立即冷冻储存。在40分钟结束时收集肠、肝脏和血清样品。将血液样品离心并且将血清转移到用于储存的容器中。样品在干冰上运输并且储存在-80℃下。给药策略如下：Chx386-抗TNFα100μL，490pmol/98μg(4.9uM)；Chx415-抗TNFα100μL，490pmol/99.5μg(4.9uM)；抗TNFα100μL，490pmol/76μg(4.9uM)。
Cholix-抗TNF-α构建体的肠上皮转运的生物分析是使用小鼠IgG1 ELISA试剂盒(
Figure BDA0003152357000001812
目录号ab133045)如下进行：由Brains On-line获得组织样品；将300μL测定缓冲液1X添加到含有组织样品的每个管中；将组织从测定缓冲液中取出并且放置在无菌、干净的细胞培养盖板上；小心地用细胞刮刀轻刮肠样品以避免收集肠系膜；以类似方式处理肝脏样品，另外进行浸渍和匀浆；将所得的细胞匀浆重新转移到原始管中；用100μL缓冲液冲洗其余组织样品和工作区域(2x)；将细胞匀浆溶液以最大力离心5分钟；根据制造商的说明书将上清液施加至ELISA板。其余上清液储存在-20℃下用于后期使用。
图25示出，Cholix386衍生的携带体(例如，SEQ ID NO:135或180)和Cholix415衍生的携带体(例如，包含SEQ ID NO:1的残基1-415)在10分钟和40分钟时均将抗TNFα剂(例如，抗TNFα抗体或其功能片段)转运穿过肠上皮细胞。此外，Cholix386-抗-TNFα构建体以单独的抗TNF-α的速率的约12x转运并且Cholix415-抗-TNFα以单独的抗TNF-α的速率的约7x转运。
这些数据表明，Cholix衍生的携带体能够将多种有效载荷分子诸如抗TNFα剂转运穿过完整且极化的上皮细胞层。
实施例14
包含艾塞那肽的递送构建体的制备
艾塞那肽(SEQ ID NO:195)为通过C末端胺和N末端H稳定化的具有GLP-1样生物活性的肽。在本实施例中，对两种非天然存在的分离的构建体进行制备并且测试体内肠上皮转运，所述构建体包含1)具有SEQ ID NO:194的携带体，其被处理成具有SEQ ID NO:192的携带体并且与SEQ ID NO:195交联，以及2)具有SEQ ID NO:191的携带体，其被处理成具有SEQ ID NO:193的携带体并且与SEQ ID NO:195交联。如本文所述制备具有SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192的携带体，并且艾塞那肽(SEQ ID NO:195)(目录号HOR-246)购自ProSpec-Tany Technogene公司.PO Box 6591,East Brunswick,NJ 08816。包含Sulfo-SMCC交联剂的PierceTM Controlled Protein-Protein Crosslinking试剂盒(目录号23456)购自ThermoFisher。
有效载荷和携带体活化和交联：
将艾塞那肽(10mg)溶解于5mL H2O中，以形成2mg/mL溶液。将Sulfo-SMCC(2mg)溶解于2mL的PBS中。此后立即将0.088mL(约5倍摩尔过量)的Sulfo-SMCC溶液添加到1.0mL艾塞那肽溶液中并且在室温下孵育30分钟。通过将1.0mL马来酰亚胺-艾塞那肽反应混合物施加至用PBS平衡的脱盐柱、用PBS洗脱并收集0.5mL级分来除去未反应的Sulfo-SMCC。测量各级分在280nm处的吸光度以定位蛋白质峰。将含有大部分蛋白质的峰级分汇集。通过将其在280nm处的吸光度与原始蛋白质溶液的吸光度进行比较，确定汇集的活化艾塞那肽的浓度。
具有SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194的携带体具有包含TEV切割位点的C末端延伸，所述切割位点侧接有形成二硫键的两个半胱氨酸残基和C末端His6标签。使用标准方法在HisTrap柱上纯化具有SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194的携带体。通过在30℃下用2μl的0.1M二硫苏糖醇和5μl的TEV蛋白酶处理两小时来激活pH 7.4的PBS中的2mg蛋白质(200μL，10mg/ml)。将经过裂解和还原的蛋白质施加至用PBS平衡的1-ml HisTrap柱。与柱结合的C末端片段和在其C末端附近具有游离半胱氨酸的活化的N末端SEQ ID NO:191或SEQ ID NO:192产物被收集在流穿液(flow through)中。
将马来酰亚胺活化的艾塞那肽和携带体(巯基-SEQ ID NO:191蛋白或巯基-SEQID NO:192蛋白)以等摩尔量混合，并且接着在室温下孵育60分钟。在考马斯染色的SDS凝胶上评估SMCC交联的SEQ ID NO:192–艾塞那肽复合物的纯度。该复合物接近正确的分子量并且具有>90％的纯度(图26)。然后将交联的递送构建体储存在4℃下。
实施例15
艾塞那肽递送构建体的体内胞吞转运
如下测试递送构建体的肠上皮转运：将野生型Sprague
Figure BDA0003152357000001831
大鼠(约200-250克，约6周龄，购自Charles River)禁食过夜以清肠。准备以下材料：含有4％甲醛的微量离心管、用于组织保存的管、用于血液收集的微量离心管、用于血清收集的微量离心管、PBS以及测试制品。通过用异氟烷麻醉动物并将其腹部剃毛来为实验做好准备。针对每只动物准备四次注射(每个空肠2次并且每个结肠2次)。打开腹腔。用有区分性的颜色定位并标记注射部位。将测试制品缓慢注射到管腔中，对于结肠历时10分钟并且对于空肠历时40分钟。动物每次注射接受浓度为1μg/μL的35μg蛋白质。在50分钟时使动物安乐死。通过心脏穿刺收集末梢血。取出空肠和结肠并且放置在塑料衬里的工作表面上。使用PBS冲洗空肠和结肠的内容物并丢弃。从注射部位切除1cm长的肠。将切除的组织切成两半。将1个切片放置到4％甲醛中。然后将其余组织纵向切成薄片并且立即放置在微量离心管中并冷冻。此过程重复用于所有注射部位。取出肝脏(约1cm3)并分成2片。为了储存，将一个肝脏切片放置在甲醛中并且第二个立即冷冻。在注射后40分钟收集肠、肝脏和血清样品。将血液样品离心并且将所得血清转移至用于储存的容器。样品在干冰上运输并且储存在-80℃下。给药策略如下：SEQ ID NO:192-艾塞那肽100μL，490pmol/29.4μg(4.9μM)；SEQ ID NO:191-艾塞那肽100μL，490pmol/30.9μg(4.9μM)；SEQ ID NO:195，100μL，490pmol/2μg(4.9μM)。
SEQ ID NO:192-艾塞那肽、SEQ ID NO:191-艾塞那肽和SEQ ID NO:195(艾塞那肽)的肠上皮转运的生物分析是使用毒蜥外泌肽-4ELISA试剂盒(Phoenix Pharma，目录号EK-070-94)如下进行：由Brains On-line获得组织样品；将300μL测定缓冲液(1X)添加到含有组织样品的每个管中；将组织从测定缓冲液中取出并且放置在无菌、干净的细胞培养盖板上；小心地用细胞刮刀轻刮肠样品以避免收集肠系膜；以类似方式处理肝脏样品，另外进行浸渍和匀浆；将所得的细胞匀浆重新转移到原始管中；用100μL缓冲液冲洗其余组织样品和工作区域(2x)；将细胞匀浆溶液以最大力离心5分钟；将上清液施加至ELISA板，对其根据制造商的说明书进行处理；将其余上清液储存于-20℃用于后期使用。
如图27所描绘，在10分钟和40分钟时观察到SEQ ID NO:192-艾塞那肽和SEQ IDNO:191-艾塞那肽二者都转运穿过肠上皮细胞。此外，SEQ ID NO:192-艾塞那肽和SEQ IDNO:191-艾塞那肽均以比单独的SEQ ID NO:195(艾塞那肽)更高的速率转运，尤其是在40分钟时。
实施例16
间隔子长度和有效载荷与携带体的N末端或C末端的偶联不显著影响有效载荷的生物活性
本实施例显示，各种长度的氨基酸接头以及异源有效载荷与携带体N末端的偶联不显著影响有效载荷在被包含在递送构建体中时结合其靶标的能力。
IL-22受体二聚化测定是通过使用所示浓度的激动剂(含有IL-22有效载荷的递送构建体)接种DiscoverX HEK293细胞并将细胞孵育16小时(5,000个细胞/孔)来进行。使用
Figure BDA0003152357000001851
eXpress IL22RA1/IL10RB Dimerization Assay在读板器上读取终点发光。
图28A示出，具有SEQ ID NO:175、196和197的氨基酸间隔子的长度不影响IL-22(SEQ ID NO:142)(当被包括在具有SEQ ID NO:147、198和199的递送构建体中时)诱导IL-22受体二聚化的能力。对照重组人IL-22(rhIL-22，SEQ ID NO:143)对受体二聚化的诱导通过黑色曲线示出。
图28B示出，IL-22有效载荷(SEQ ID NO:142)通过具有SEQ ID NO:196的间隔子而与包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-266的携带体的N末端或C末端的偶联不显著改变具有SEQ ID NO:198、200和201的递送构建体诱导IL-22受体二聚化的能力。对照重组人IL-22(rhIL-22)对受体二聚化的诱导通过黑色曲线示出。
pSTAT3活化测定是使用与10μL不同浓度的激动剂(相应的递送构建体或IL-22对照)一起孵育15分钟的Colo205细胞进行。然后使用MSD STAT3板(目录号N450SMA-1)读取pSTAT3活化的程度。
图28C示出，具有SEQ ID NO:175、196和197的氨基酸间隔子的长度不影响IL-22(SEQ ID NO:142)(当被包括在具有SEQ ID NO:147、198和199的递送构建体中时)诱导pSTAT3活化的能力。对照重组人IL-22(rhIL-22，SEQ ID NO:143)的pSTAT3活化通过黑色曲线示出。
图28D示出，IL-22有效载荷(SEQ ID NO:142)通过具有SEQ ID NO:196的间隔子而与包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-266的携带体的N末端或C末端的偶联不显著改变具有SEQ ID NO:198、200和201的递送构建体诱导pSTAT3活化的能力。对照重组人IL-22(rhIL-22)的pSTAT3活化通过黑色曲线示出。
根据本公开，可以在不进行过度实验的情况下制造和实施本文所公开和要求保护的所有制品和方法。虽然已经根据具体实施方案描述了本公开的制品和方法，但是对于本领域的技术人员来说，可以在不脱离本公开的精神和范围的情况下对制品和方法做出变化是显而易见的。对于本领域技术人员来说显而易见的所有此类变化和等同物，无论是现在存在的还是后来开发的，都被认为在所附权利要求所定义的本公开的精神和范围内。本说明书中提及的所有专利、专利申请和出版物都表示本公开所属领域的普通技术人员的水平。所有专利、专利申请和出版物在本文中以引用的方式完整地并入本文中用于所有目的，如同每一个单独的出版物均被明确地和单独地表示为通过引用整体并入而用于任何目的。在没有本文未具体公开的任何元件的情况下，都可以适当地实施本文说明性描述的公开内容。已使用的术语和表达被用作描述术语而非限制性术语，并且在使用此类术语和表达时无意排除所示出和描述的特征或其部分的任何等价物，但应认识到，在本公开所要求的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，虽然已经通过具体实施方案和任选的特征具体公开了本公开内容，但是本领域技术人员可以采取对本文所公开的概念的修改和变化，并且这些修改和变化被认为是在所附权利要求所定义的本公开的范围内。

Claims (129)

1.一种携带体-有效载荷复合物，包含携带体，所述携带体能够胞吞到极化上皮细胞中并聚积在所述细胞的区域中，其中所述有效载荷对于所述携带体是异源的。
2.如权利要求1所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述区域为顶端区室、核上区室或基底区室。
3.如权利要求1所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体在所述区域中保留至少5分钟、10分钟或15分钟。
4.如权利要求1所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体衍生自Cholix多肽。
5.如权利要求4所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体为具有Cholix序列的多肽，其C末端处于位置150-195中的任一个处。
6.如权利要求5所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体为具有Cholix序列的多肽，其N末端处于位置1-41中的任一个处。
7.如权利要求4所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体为具有Cholix序列的多肽，其N末端截短处于位置35-40中的任一个处。
8.如权利要求7所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体为具有Cholix序列的多肽，其C末端处于位置150-205中的任一个处。
9.如权利要求4所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体由从SEQ ID NO:130所示的序列的N末端位置40至C末端位置150-205中的任一个位置的氨基酸残基组成。
10.如权利要求4所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体具有处于SEQ IDNO:130所示的序列的位置150或187处的C末端。
11.如权利要求4所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体由SEQ ID NO:137所示的氨基酸序列组成。
12.如权利要求4所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体由SEQ ID NO:137-139中的任一个所示的氨基酸序列组成。
13.如权利要求5-8中的任一项所述的携带体-有效载荷复合物，其中位置编号是基于所述Cholix多肽与SEQ ID NO:130所示的序列的比对，其中位置从N末端到C末端进行编号，从所述N末端处的位置1开始。
14.如权利要求1-13中的任一项所述的携带体-有效载荷复合物，其中与能够穿过所述极化上皮细胞胞吞转运的携带体相比，所述携带体能够在所述携带体胞吞到所述极化上皮细胞中之后更长时间地保持与顶端进入受体缔合。
15.如权利要求14所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述顶端进入受体为TMEM132受体。
16.如权利要求1-15中的任一项所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述极化上皮细胞包括胃肠极化上皮细胞。
17.一种携带体-有效载荷复合物，包含
a)携带体，所述携带体衍生自具有处于位置195-347中的任一个处的C末端的Cholix多肽并且能够穿过极化上皮细胞胞吞转运，
b)异源有效载荷，所述携带体与所述异源有效载荷偶联。
18.如权利要求17所述的携带体-有效载荷复合物，其中位置编号是基于所述Cholix多肽与SEQ ID NO:130所示的序列的比对，其中位置从N末端到C末端进行编号，从所述N末端处的位置1开始。
19.如权利要求17所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述C末端处于位置195-266中的任一个处。
20.如权利要求17所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述C末端处于SEQ ID NO:1-2或4-78所示的任一序列的位置195-266中的任一个处。
21.如权利要求17所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述C末端处于SEQ ID NO:130所示的序列的位置206、245、251或266中的任一个处。
22.如权利要求17所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述C末端处于SEQ ID NO:1-2或4-78的位置206、245、251或266中的任一个处。
23.如权利要求22所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述C末端处于SEQ ID NO:1-2或4-78中的任一个的位置206处。
24.如权利要求17所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体由SEQ ID NO:131或184所示的氨基酸序列组成。
25.如权利要求17所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述C末端处于SEQ ID NO:1-2或4-78中的任一个的位置245处。
26.如权利要求17所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体由SEQ ID NO:132或183所示的氨基酸序列组成。
27.如权利要求17所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述C末端处于SEQ ID NO:1-2或4-78的位置251处。
28.如权利要求17所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体由SEQ ID NO:133或182所示的氨基酸序列组成。
29.如权利要求17所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述C末端处于SEQ ID NO:1-2或4-78的位置266处。
30.如权利要求17所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体由SEQ ID NO:134或181所示的氨基酸序列组成。
31.如权利要求17所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体由在位置195-347中的任一个处具有截短的SEQ ID NO:1-2或4-78所示的序列组成，并且在SEQ ID NO:1-2或4-78的位置1-40、133-151、152-187或188-206中的任一个处具有不超过5、4、3、2或1个氨基酸变异。
32.一种携带体-有效载荷复合物，包含
a)携带体，所述携带体衍生自包含SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够胞吞到极化上皮细胞中或极化上皮细胞胞吞转运的片段，
b)异源有效载荷，所述异源有效载荷与所述携带体偶联。
33.如权利要求32所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体包含位置3处的谷氨酸和位置4处的丙氨酸。
34.如权利要求32-33中的任一项所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体是无毒的。
35.如权利要求32-34中的任一项所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体能够穿过极化上皮细胞胞吞转运所述异源有效载荷。
36.如权利要求32所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体包含能够极化上皮细胞胞吞转运的片段，其中所述携带体具有处于在SEQ ID NO:1-2或4-78中的任一个所示的序列的位置195至C末端残基中的任一个处的C末端。
37.如权利要求36所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述C末端处于SEQ ID NO:1-2或4-78中的任一个所示的序列的位置195-386中的任一个处。
38.如权利要求37所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述C末端处于SEQ ID NO:1-2或4-78所示的任一序列的位置386处。
39.如权利要求38所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述C末端处于SEQ ID NO:1-2所示的任一序列的位置386处。
40.如权利要求39所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体由SEQ ID NO:135所示的氨基酸序列组成。
41.一种携带体-有效载荷复合物，包含
a)携带体，所述携带体衍生自不包含SEQ ID NO:179并且不由SEQ ID NO:126组成的Cholix多肽，
b)异源有效载荷，所述异源有效载荷与所述携带体复合，
其中所述携带体能够
i)穿过极化上皮细胞胞吞转运所述异源有效载荷；或
ii)将所述异源有效载荷转运到所述极化上皮细胞中。
42.如权利要求41所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体相比于SEQ ID NO:130所示的序列或其片段包含至少75％的序列一致性。
43.如权利要求42所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体相比于SEQ ID NO:130所示的Cholix变体或其片段包含至少90％的序列一致性。
44.如权利要求41所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述Cholix多肽为SEQ ID NO:130所示的序列或其片段。
45.如权利要求41-44中的任一项所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体包含位置3处的谷氨酸和位置4处的丙氨酸。
46.如权利要求41-45中的任一项所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体是无毒的。
47.如权利要求41-46中的任一项所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体能够穿过所述极化上皮细胞胞吞转运所述异源有效载荷。
48.如权利要求47所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体具有处于SEQ IDNO:130所示的序列的位置195-633中的任一个处的C末端截短。
49.如权利要求48所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述C末端截短处于SEQ IDNO:130所示的序列的位置195-386中的任一个处。
50.如权利要求49所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体具有处于SEQ IDNO:1-2或4-78所示的任一序列的位置195-386中的任一个处的C末端截短。
51.如权利要求50所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述C末端截短处于SEQ IDNO:1-2或4-78所示的任一序列的位置386处。
52.如权利要求51所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述C末端截短处于SEQ IDNO:1-2所示的任一序列的位置386处。
53.如权利要求1-52中的任一项所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体-有效载荷复合物包含N末端甲硫氨酸。
54.如权利要求1-53中的任一项所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体与所述异源有效载荷合成性地缀合。
55.如权利要求1-53中的任一项所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体与所述异源有效载荷遗传性地融合。
56.如权利要求1-55中的任一项所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述异源有效载荷为治疗性有效载荷。
57.如权利要求56所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述治疗性有效载荷为细胞因子、抗体、激素或核酸。
58.如权利要求57所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述治疗性有效载荷为细胞因子。
59.如权利要求58所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述细胞因子为白介素。
60.如权利要求59所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述白介素为IL-10。
61.如权利要求60所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述IL-10包含相比于SEQ IDNO:145所示的氨基酸序列具有至少90％序列一致性的氨基酸序列。
62.如权利要求59所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述白介素为IL-22。
63.如权利要求62所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述IL-22包含相比于SEQ IDNO:142所示的氨基酸序列具有至少90％序列一致性的氨基酸序列。
64.如权利要求57所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述治疗性有效载荷为抗体。
65.如权利要求64所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述抗体为抗TNF抗体。
66.如权利要求57所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述治疗性有效载荷为激素。
67.如权利要求66所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述治疗性有效载荷为人生长激素。
68.如权利要求1-67中的任一项所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述异源有效载荷与所述携带体共价偶联。
69.如权利要求1-68中的任一项所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述异源有效载荷与所述携带体的C末端偶联。
70.如权利要求1-68中的任一项所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述异源有效载荷与所述携带体的N末端偶联。
71.如权利要求1-68中的任一项所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体通过间隔子而与所述异源有效载荷偶联。
72.如权利要求71所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述间隔子为不可裂解的间隔子。
73.如权利要求71-72中的任一项所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述间隔子包含介于1与100个之间的氨基酸残基。
74.如权利要求73所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述间隔子包含多达15个重复的GS、GGS、GGGS、GGGGS、GGGGGS，或其组合。
75.如权利要求71所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述间隔子包含SEQ ID NO:175所示的氨基酸序列。
76.如权利要求71所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述间隔子由SEQ ID NO:176所示的氨基酸序列组成。
77.如权利要求1-67中的任一项所述的携带体-有效载荷复合物，其中所述异源有效载荷与所述携带体非共价偶联。
78.如权利要求1-67所述的携带体复合物，其中所述异源有效载荷通过纳米颗粒而与所述携带体复合。
79.一种多核苷酸，编码如权利要求1-77中的任一项所述的携带体-有效载荷复合物。
80.一种载体，包含如权利要求79所述的多核苷酸。
81.一种穿过极化上皮细胞胞吞转运异源有效载荷的方法，包括：
(a)使所述极化上皮细胞的顶端膜与携带体-有效载荷复合物接触；以及
(b)穿过所述极化上皮细胞胞吞转运所述携带体-有效载荷复合物，
其中所述携带体-有效载荷复合物包含携带体，所述携带体衍生自具有SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够穿过所述极化上皮细胞胞吞转运所述携带体-有效载荷复合物的片段，所述携带体与所述异源有效载荷偶联。
82.如权利要求81所述的方法，其中使所述极化上皮细胞的所述顶端膜与所述携带体-有效载荷复合物接触包括所述携带体与顶端进入受体TMEM132的相互作用。
83.如权利要求81所述的方法，其中所述携带体与膜蛋白TMEM132的相互作用导致对所述携带体-有效载荷复合物的受体介导的胞吞。
84.如权利要求81-83中的任一项所述的方法，其中与TMEM132相互作用的所述携带体包含SEQ ID NO:130的氨基酸残基135-151，或相比于其具有至少90％序列一致性的序列。
85.如权利要求81-84中的任一项所述的方法，其中所述携带体-有效载荷复合物穿过所述极化上皮细胞的所述胞吞转运包括所述携带体相互作用于GRP75、ERGIC-53和串珠蛋白聚糖中的任何一种或多种。
86.如权利要求81-85中的任一项所述的方法，其中所述携带体-有效载荷复合物穿过所述极化上皮细胞的所述胞吞转运还包括所述携带体-有效载荷复合物与COPI、EEA1和Rab7中的任何一种或多种共定位在所述上皮细胞的顶端侧，以及与Rab11a共定位在所述上皮细胞的基底侧。
87.如权利要求81-86中的任一项所述的方法，其中与GRP7或ERGIC-53相互作用的所述携带体包含SEQ ID NO:130的氨基酸残基1-40和152-187，或相比于其具有至少90％序列一致性的序列。
88.如权利要求81-87中的任一项所述的方法，其中与串珠蛋白聚糖相互作用的所述携带体包含SEQ ID NO:130的氨基酸残基188-205，或相比于其具有至少90％序列一致性的序列。
89.如权利要求81所述的方法，还包括在(b)之后将所述携带体-有效载荷复合物递送到固有层中。
90.如权利要求81-89中的任一项所述的方法，其中所述极化上皮细胞为极化肠上皮细胞。
91.一种将异源有效载荷经口递送至受试者的方法，包括：
92.向所述受试者经口施用携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体能够穿过极化上皮胞吞转运所述携带体-有效载荷复合物，从而将所述异源有效载荷递送至所述受试者，并且其中所述携带体-有效载荷复合物包含携带体，所述携带体衍生自具有SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够穿过所述上皮胞吞转运所述携带体-有效载荷复合物的片段，所述携带体与所述异源有效载荷偶联。
93.一种用于通过方法将异源有效载荷经口递送至受试者的携带体-有效载荷复合物，所述方法包括：
向所述受试者经口施用所述携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体能够穿过极化上皮胞吞转运所述携带体-有效载荷复合物，从而治疗所述受试者的疾病，并且其中所述携带体-有效载荷复合物包含携带体，所述携带体衍生自具有SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够穿过所述上皮胞吞转运所述携带体-有效载荷复合物的片段，所述携带体与所述异源有效载荷偶联。
94.携带体-有效载荷复合物用于通过方法将异源有效载荷经口递送至受试者的用途，所述方法包括：
向所述受试者经口施用所述携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体能够穿过极化上皮胞吞转运所述携带体-有效载荷复合物，从而治疗所述受试者的疾病，并且其中所述携带体-有效载荷复合物包含携带体，所述携带体衍生自具有SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够穿过所述上皮胞吞转运所述携带体-有效载荷复合物的片段，所述携带体与所述异源有效载荷偶联。
95.一种治疗受试者的疾病的方法，包括：
向所述受试者经口施用携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体能够穿过极化上皮胞吞转运所述携带体-有效载荷复合物，从而治疗所述受试者的疾病，并且其中所述携带体-有效载荷复合物包含携带体，所述携带体衍生自具有SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够穿过所述上皮胞吞转运所述携带体-有效载荷复合物的片段，所述携带体与所述异源有效载荷偶联。
96.一种用于通过方法治疗受试者的疾病的携带体-有效载荷复合物，所述方法包括：
向所述受试者经口施用所述携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体能够穿过极化上皮胞吞转运所述携带体-有效载荷复合物，从而治疗所述受试者的所述疾病，并且其中所述携带体-有效载荷复合物包含携带体，所述携带体衍生自具有SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够穿过所述上皮胞吞转运所述携带体-有效载荷复合物的片段，所述携带体与所述异源有效载荷偶联。
97.携带体-有效载荷复合物在用于通过方法治疗受试者的疾病的药物的制造中的用途，所述方法包括：
向所述受试者经口施用所述携带体-有效载荷复合物，其中所述携带体能够穿过极化上皮胞吞转运所述携带体-有效载荷复合物，从而治疗所述受试者的所述疾病，并且其中所述携带体-有效载荷复合物包含携带体，所述携带体衍生自具有SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够穿过所述上皮胞吞转运所述携带体-有效载荷复合物的片段，所述携带体与所述异源有效载荷偶联。
98.如权利要求91-97中的任一项所述的方法，还包括使所述异源有效载荷与固有层中的受体结合。
99.如权利要求91-97中的任一项所述的方法，还包括将所述异源有效载荷递送到体循环中。
100.如权利要求91-99中的任一项所述的方法，其中所述携带体为Cholix衍生的多肽。
101.如权利要求99所述的方法，其中所述携带体包含SEQ ID NO:130所示的序列的氨基酸残基1-206、1-245、1-251、1-266或1-386。
102.如权利要求101所述的方法，其中所述携带体包含SEQ ID NO:1-2所示的序列的氨基酸残基1-206、1-245、1-251、1-266或1-386。
103.如权利要求102所述的方法，其中所述携带体包含SEQ ID NO:131-135或180-184所示的氨基酸序列中的任一个。
104.如权利要求91-102中的任一项所述的方法，其中所述极化上皮为极化肠上皮。
105.如权利要求91-103中的任一项所述的方法，其中所述疾病为溃疡性结肠炎、囊炎、直肠炎、克罗恩病、多发性硬化症(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)、移植物抗宿主病(GVHD)、类风湿性关节炎或银屑病。
106.如权利要求104所述的方法，其中所述疾病为溃疡性结肠炎。
107.如权利要求105所述的方法，其中所述溃疡性结肠炎为轻度至中度或中度至重度的。
108.如权利要求104所述的方法，其中所述疾病为克罗恩病。
109.如权利要求107所述的方法，其中所述克罗恩病为瘘管型克罗恩病。
110.如权利要求91-108中的任一项所述的方法，其中所述有效载荷为白介素。
111.如权利要求109所述的方法，其中所述白介素包含SEQ ID NO:142或145的氨基酸序列。
112.一种将异源有效载荷转运到极化上皮细胞中的方法，包括：
(a)使所述极化上皮细胞的顶端膜与携带体-有效载荷复合物接触；以及
(b)将所述携带体-有效载荷复合物转运到所述极化上皮细胞中，
其中所述携带体-有效载荷复合物包含携带体，所述携带体衍生自具有SEQ ID NO:1-2、4-125或127-129中的任一个所示的氨基酸序列的Cholix多肽，或其能够将所述携带体-有效载荷复合物转运到所述上皮细胞中的片段，所述携带体与所述异源有效载荷偶联。
113.如权利要求111所述的方法，其中使所述极化上皮细胞的所述顶端膜与所述携带体-有效载荷复合物接触包括所述携带体与顶端进入受体TMEM132的相互作用。
114.如权利要求111所述的方法，其中所述携带体与所述顶端进入受体TMEM132的相互作用导致对所述携带体-有效载荷复合物的受体介导的胞吞。
115.如权利要求111-113中的任一项所述的方法，还包括将所述异源有效载荷转运至顶端区室或基底区室。
116.如权利要求111-134中的任一项所述的方法，其中所述携带体-有效载荷复合物的所述携带体在胞吞后保持与TMEM132缔合。
117.如权利要求111-115中的任一项所述的方法，其中与TMEM132相互作用的所述携带体包含SEQ ID NO:130的氨基酸残基135-151，或相比于其具有至少90％序列一致性的序列。
118.如权利要求111-116中的任一项所述的方法，其中所述携带体为Cholix衍生的多肽。
119.如权利要求117所述的方法，其中所述携带体由SEQ ID NO:130所示的序列的氨基酸残基1-151、1-187、41-187或40-205组成。
120.如权利要求117所述的方法，其中所述携带体由SEQ ID NO:1-2所示的序列的氨基酸残基1-151、1-187、41-187或40-205组成。
121.如权利要求117所述的方法，其中所述携带体由SEQ ID NO:136-139所示的氨基酸序列中的任一个组成。
122.如权利要求111-120所述的方法，其中所述携带体通过纳米颗粒而与所述异源有效载荷非共价偶联。
123.如权利要求121所述的方法，其中所述纳米颗粒上所述异源有效载荷与所述携带体的比率为至少15,000:1。
124.如权利要求121-122中的任一项所述的方法，其中所述异源有效载荷为降糖剂。
125.如权利要求123所述的方法，其中所述降糖剂与所述纳米颗粒非共价缔合。
126.如权利要求121-122中的任一项所述的方法，其中所述异源有效载荷为siRNA。
127.如权利要求125所述的方法，其中所述siRNA与所述纳米颗粒非共价缔合。
128.如权利要求121-126中的任一项所述的方法，其中所述携带体与所述纳米颗粒共价连接或喷雾干燥在所述纳米颗粒上。
129.一种包括将异源有效载荷转运到极化上皮细胞中的方法，包括：
(a)使所述极化上皮细胞的顶端膜与携带体-有效载荷复合物接触；以及
(b)将所述携带体-有效载荷复合物转运到所述极化上皮细胞中，
其中所述携带体-有效载荷复合物为如权利要求17-31中的任一项所述的携带体-有效载荷复合物。
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