BR112021009001A2 - veículos derivados de cholix para administração oral de carga útil heteróloga - Google Patents

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Abstract

VEÍCULOS DERIVADOS DE CHOLIX PARA ADMINISTRAÇÃO ORAL DE CARGA ÚTIL HETERÓLOGA. A presente descrição provê construtos de administração compreendendo um veículo acoplado a uma carga útil heteróloga, onde o acoplamento do veículo à carga útil pode resultar no transporte da carga útil (por exemplo, uma carga útil terapêutica) para dentro e/ou através de células epiteliais polarizadas intactas (por exemplo, células epiteliais do intestino de um mamífero). O construto de administração pode ser parte de uma composição farmacêutica que pode ser administrada por via oral a um indivíduo de maneira a prover terapias aperfeiçoadas efetivas para o tratamento, por exemplo, de doenças inflamatórias ou doenças autoimunes.

Description

VEÍCULOS DERIVADOS DE CHOLIX PARA ADMINISTRAÇÃO ORAL DE CARGA ÚTIL HETERÓLOGA REFERÊNCIA CRUZADA
[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido PCT nº PCT/US2019/021474, depositado em 8 de março de 2019, e dos Pedidos Provisórios US nos 62/888.144, depositado em 16 de agosto de 2019; 62/888.400, depositado em 16 de agosto de 2019; 62/888.133, depositado em 16 de agosto de 2019; 62/816.022, depositado em 8 de março de 2019; e 62/756.889 depositado em 7 de novembro de 2018, pedidos estes que são incorporados aqui como referência em sua totalidade para todos os propósitos.
ANTECEDENTES
[0002] O epitélio intestinal tem frustrado os esforços para a administração oral de moléculas terapêuticas grandes tais como proteínas tendo em vista que proteínas não podem se difundir através da barreira epitelial intacta ou cruzar a barreira através de junções estreitas. Uma vez tomada por uma célula epitelial, a proteína terapêutica ou entra na rota de tráfico lisossômico destrutiva ou é liberada de volta para o lúmen intestinal. Esta incapacidade em ser facilmente transportada através do epitélio intestinal continua a ser um fator limitante no desenvolvimento de formulações orais comercialmente viáveis, particularmente para produtos terapêuticos baseados em polipeptídeo. Uma solução comum é usar administração parenteral tal como administração intravenosa ou subcutânea, no entanto estas rotas de administração podem frequentemente criar efeitos colaterais consideráveis, eficácia terapêutica mais baixa, e reduzir a conveniência do paciente o que pode afetar negativamente a aceitação. Há uma necessidade por composições e métodos aperfeiçoados para o transporte de produtos terapêuticos para ou através de um epitélio, por exemplo, um epitélio intestinal.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
[0003] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionado neste relatório são incorporados aqui como referência na mesma extensão em que cada publicação, patente ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicados como incorporados como referência.
SUMÁRIO
[0004] Em um aspecto, a presente descrição provê um complexo veículo- carga útil compreendendo um veículo capaz de endocitose em uma célula epitelial polarizada e se acumular em uma região da célula em que a carga útil é heteróloga ao veículo. Em algumas realizações, a região é um compartimento apical, um compartimento supranuclear ou um compartimento basal. Em algumas realizações, o veículo é retido na região por pelo menos 5 mins, 10 mins ou 15 minutos na região. Em algumas realizações, o veículo é derivado de um polipeptídeo de Cholix. Em algumas realizações, o veículo é um polipeptídeo apresentando uma sequência de Cholix com um terminal C em qualquer uma das posições 150-195. Em algumas realizações, o veículo é um polipeptídeo apresentando uma sequência de Cholix com um terminal N em qualquer uma das posições 1-41. Em algumas realizações, o veículo é um polipeptídeo apresentando uma sequência de Cholix com um truncamento no terminal N em qualquer uma das posições 35-40. Em algumas realizações, o veículo é um polipeptídeo apresentando uma sequência de Cholix com um terminal C em qualquer uma das posições 150-205. Em algumas realizações, o veículo consiste nos resíduos de aminoácido da posição 40 do terminal N a qualquer uma das posições 150-205 do terminal C da sequência apresentada na SEQ ID NO: 130. Em algumas realizações, o veículo apresenta um terminal C nas posições 150 ou 187 da sequência apresentada na SEQ ID NO: 130. Em algumas realizações, o veículo consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 137. Em algumas realizações, o veículo consiste na sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 137-139. Em algumas realizações, a numeração de posição é baseada no alinhamento do polipeptídeo de Cholix com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 130, onde as posições são numeradas a partir de um terminal N para um terminal C começando com a posição 1 no terminal N. Em algumas realizações, o veículo é capaz de permanecer associado com um receptor de entrada apical mais tempo após a endocitose do veículo na célula epitelial polarizada que um veículo capaz de transcitose através da célula epitelial polarizada. Em algumas realizações, o receptor de entrada apical é um receptor TMEM132. Em algumas realizações, a célula epitelial polarizada compreende uma célula epitelial polarizada gastrointestinal.
[0005] Em um aspecto, a presente descrição provê um complexo veículo- carga útil compreendendo (i) um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando um terminal C em qualquer uma das posições 195-347 e capaz de transcitose através de uma célula epitelial polarizada, acoplado a (ii) uma carga útil heteróloga. Em algumas realizações, a numeração de posição é baseada no alinhamento do polipeptídeo de Cholix com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 130, onde as posições são numeradas a partir de um terminal N para um terminal C começando com a posição 1 no terminal N. Em algumas realizações, o terminal C está em qualquer uma das posições 195-266. Em algumas realizações, o terminal C está em qualquer uma das posições 195-266 de qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78. Em algumas realizações, o terminal C está em qualquer uma das posições 206, 245, 251 ou 266 de uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 130. Em algumas realizações, o terminal C está em qualquer uma das posições 206, 245, 251 ou 266 das SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78. Em algumas realizações, o terminal C está na posição 206 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78. Em algumas realizações, o veículo consiste na sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 131 ou 184. Em algumas realizações, o terminal C está na posição 245 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78. Em algumas realizações, o veículo consiste na sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 132 ou 183. Em algumas realizações, o terminal C está na posição 251 das SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78. Em algumas realizações, o veículo consiste na sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 133 ou 182. Em algumas realizações, o terminal C está na posição 266 das SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78. Em algumas realizações, o veículo consiste na sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 134 ou 181. Em algumas realizações, o veículo consiste na sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78 com truncamento em qualquer uma das posições 195- 347, e apresenta não mais que 5, 4, 3, 2 ou 1 variações em aminoácido em qualquer uma das posições 1-40, 133-151, 152-187 ou 188-206 das SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78.
[0006] Em um aspecto, a presente descrição provê um complexo veículo- carga útil compreendendo (i) um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127-129 ou um fragmento destas capaz de endocitose em uma célula epitelial polarizada ou transcitose de uma célula epitelial polarizada, acoplado a (ii) uma carga útil heteróloga. Em algumas realizações, o veículo compreende um ácido glutâmico na posição 3 e uma alanina na posição
4. Em algumas realizações, o veículo é não tóxico. Em algumas realizações, o veículo é capaz de transcitose da carga útil heteróloga através de uma célula epitelial polarizada. Em algumas realizações, o veículo compreende um fragmento capaz de transcitose de uma célula epitelial polarizada, onde o veículo apresenta um terminal C em qualquer uma das posições 195 para um resíduo do terminal C da sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78. Em algumas realizações, o terminal C está em qualquer uma das posições 195-386 da sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-
78. Em algumas realizações, o terminal C está na posição 386 de qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78. Em algumas realizações, o terminal C está na posição 386 de qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-2. Em algumas realizações, o veículo consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 135.
[0007] Em um aspecto, a presente descrição provê um complexo veículo- carga útil compreendendo (i) um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix que não compreende a SEQ ID NO: 179, e não consiste na SEQ ID NO: 126, complexado com (ii) uma carga útil heteróloga, onde o veículo é capaz de (a)
transcitose da carga útil heteróloga através de uma célula epitelial polarizada; ou (b) transportar a carga útil heteróloga para dentro da célula epitelial polarizada.
Em algumas realizações, o veículo compreende pelo menos 75% de identidade de sequência a uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 130 ou fragmento desta.
Em algumas realizações, o veículo compreende pelo menos 90% de identidade de sequência a uma variante de Cholix apresentada na SEQ ID NO: 130 ou um fragmento desta.
Em algumas realizações, o polipeptídeo de Cholix é uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 130 ou fragmento desta.
Em algumas realizações, o veículo compreende um ácido glutâmico na posição 3 e uma alanina na posição 4. Em algumas realizações, o veículo é não tóxico.
Em algumas realizações, o veículo é capaz de transcitose da carga útil heteróloga através da célula epitelial polarizada.
Em algumas realizações, o veículo apresenta um truncamento no terminal C em qualquer uma das posições 195-633 da sequência apresentada na SEQ ID NO: 130. Em algumas realizações, o truncamento no terminal C está em qualquer uma das posições 195-386 da sequência apresentada na SEQ ID NO: 130. Em algumas realizações, o veículo apresenta um truncamento no terminal C em qualquer uma das posições 195-386 de qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78. Em algumas realizações, o truncamento no terminal C está na posição 386 de qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78. Em algumas realizações, o truncamento no terminal C está na posição 386 de qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-2. Em algumas realizações, o complexo veículo-carga útil compreende uma metionina no terminal N.
Em algumas realizações, o veículo é conjugado sinteticamente à carga útil heteróloga.
Em algumas realizações, o veículo é geneticamente fundido à carga útil heteróloga.
Em algumas realizações, a carga útil heteróloga é uma carga útil terapêutica.
Em algumas realizações, a carga útil terapêutica é uma citocina, um anticorpo, um hormônio ou um ácido nucleico.
Em algumas realizações, a carga útil terapêutica é uma citocina.
Em algumas realizações, a citocina é uma interleucina.
Em algumas realizações, a interleucina é uma IL-10. Em algumas realizações, a IL-10 compreende uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 145. Em algumas realizações, a interleucina é uma IL-22. Em algumas realizações, a IL-22 compreende uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 142. Em algumas realizações, a carga útil terapêutica é um anticorpo. Em algumas realizações, o anticorpo é um anticorpo anti-TNF. Em algumas realizações, a carga útil terapêutica é um hormônio. Em algumas realizações, a carga útil terapêutica é um hormônio de crescimento humano. Em algumas realizações, a carga útil heteróloga é acoplada covalentemente ao veículo. Em algumas realizações, a carga útil heteróloga é acoplada a um terminal C do veículo. Em algumas realizações, a carga útil heteróloga é acoplada a um terminal N do veículo. Em algumas realizações, o veículo é acoplado à carga útil heteróloga por meio de um espaçador. Em algumas realizações, o espaçador é um espaçador não passível de clivagem. Em algumas realizações, o espaçador compreende entre 1 e 100 resíduos de aminoácido. Em algumas realizações, o espaçador compreende até 15 repetições de GS, GGS, GGGS, GGGGS, GGGGGS ou uma combinação destes. Em algumas realizações, o espaçador compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 175. Em algumas realizações, o espaçador consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 176. Em algumas realizações, a carga útil heteróloga é acoplada não covalentemente ao veículo. Em algumas realizações, a carga útil heteróloga é complexada com o veículo por meio de uma nanopartícula.
[0008] Em um aspecto, a presente descrição provê um método para a transcitose de uma carga útil heteróloga através de uma célula epitelial polarizada, compreendendo: (a) o contato de uma membrana apical da célula epitelial polarizada com um complexo veículo-carga útil; e (b) a transcitose do complexo veículo-carga útil através da célula epitelial polarizada, onde o complexo veículo- carga útil compreende um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127-129 ou um fragmento destas capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através da célula epitelial polarizada, acoplada à carga útil heteróloga. Em algumas realizações, o contato da membrana apical da célula epitelial polarizada com o complexo veículo-carga útil compreende a interação do veículo com o receptor de entrada apical TMEM132. Em algumas realizações, a interação do veículo com a proteína TMEM132 de membrana resulta em endocitose mediada por receptor do complexo veículo-carga útil. Em algumas realizações, o veículo que interage com a TMEM132 compreende os resíduos de aminoácido 135-151 da SEQ ID NO: 130 ou uma sequência apresentando pelo menos 90% de identidade de sequência com esta. Em algumas realizações, a transcitose do complexo veículo-carga útil através da célula epitelial polarizada compreende a interação do veículo com qualquer uma ou mais de uma das GRP75, ERGIC-53, e perlecan. Em algumas realizações, a transcitose do complexo veículo-carga útil através da célula epitelial polarizada compreende adicionalmente a localização conjunta do complexo veículo-carga útil com qualquer um ou mais de COPI, EEA1 e Rab7 no lado apical e com Rab11a no lado basal da célula epitelial. Em algumas realizações, o veículo que interage com GRP7 ou ERGIC-53 compreende os resíduos de aminoácido 1-40 e 152-187 da SEQ ID NO: 130 ou de uma sequência apresentando pelo menos 90% de identidade de sequência com esta. Em algumas realizações, o veículo que interage com perlecan compreende os resíduos de aminoácido 188-205 da SEQ ID NO: 130 ou de uma sequência apresentando pelo menos 90% de identidade de sequência com esta. Em algumas realizações, o método pode compreender adicionalmente, subsequente a (b) a liberação do complexo veículo-carga útil para a lamina propria. Em algumas realizações, a célula epitelial polarizada é uma célula epitelial intestinal polarizada.
[0009] Em um aspecto, a presente descrição provê um método para a administração oral de uma carga útil heteróloga a um indivíduo, compreendendo: administração oral de um complexo veículo-carga útil ao indivíduo, onde o veículo é capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através de um epitélio polarizado, liberando, desta forma, a carga útil heteróloga para o indivíduo, e onde o complexo veículo-carga útil compreende um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127-129 ou um fragmento destas capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através do epitélio, acoplado à carga útil heteróloga.
[0010] Em um aspecto, a presente descrição provê um complexo veículo- carga útil para a administração oral de uma carga útil heteróloga a um indivíduo por um método compreendendo: a administração oral do complexo veículo-carga útil ao indivíduo, onde o veículo é capaz de transcitose do complexo veículo- carga útil através de um epitélio polarizado, desta forma, tratando uma doença no indivíduo, e onde o complexo veículo-carga útil compreende um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127-129 ou um fragmento destas capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através do epitélio, acoplado à carga útil heteróloga.
[0011] Em um aspecto, a presente descrição provê um uso de um complexo veículo-carga útil para a administração oral de uma carga útil heteróloga a um indivíduo por um método compreendendo: a administração oral do complexo veículo-carga útil ao indivíduo; onde o veículo é capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através de um epitélio polarizado, desta forma, tratando uma doença no indivíduo, e onde o complexo veículo-carga útil compreende um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127-129 ou um fragmento destas capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através do epitélio, acoplado à carga útil heteróloga.
[0012] Em um aspecto, a presente descrição provê um método para o tratamento de uma doença em um indivíduo, compreendendo: a administração oral de um complexo veículo-carga útil ao indivíduo, onde o veículo é capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através de um epitélio polarizado, desta forma, tratando uma doença no indivíduo, e onde o complexo veículo-carga útil compreende um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127-129 ou um fragmento destas capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através do epitélio, acoplado à carga útil heteróloga.
[0013] Em um aspecto, a presente descrição provê um complexo veículo- carga útil para uso no tratamento de uma doença em um indivíduo por um método compreendendo: a administração oral do complexo veículo-carga útil ao indivíduo, onde o veículo é capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através de um epitélio polarizado, desta forma, tratando a doença no indivíduo, e onde o complexo veículo-carga útil compreende um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando uma sequência de aminoácidos e apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127-129 ou um fragmento destas capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através do epitélio, acoplado à carga útil heteróloga.
[0014] Em um aspecto, a presente descrição provê um uso de um complexo veículo-carga útil na manufatura de um medicamento para o tratamento de uma doença em um indivíduo por um método compreendendo: a administração oral do complexo veículo-carga útil ao indivíduo, onde o veículo é capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através de um epitélio polarizado, desta forma, tratando uma doença no indivíduo, e onde o complexo veículo-carga útil compreende um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127-129 ou um fragmento destas capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através do epitélio, acoplado à carga útil heteróloga. Em algumas realizações, o método compreende adicionalmente a ligação da carga útil heteróloga a um receptor na lamina propria. Em algumas realizações, o método compreende adicionalmente a liberação da carga útil heteróloga na circulação sistêmica. Em algumas realizações, o veículo é um polipeptídeo derivado de
Cholix. Em algumas realizações, o veículo compreende os resíduos de aminoácido 1-206, 1-245, 1-251, 1-266 ou 1-386 da sequência apresentada na SEQ ID NO: 130. Em algumas realizações, o veículo compreende os resíduos de aminoácido 1-206, 1-245, 1-251, 1-266 ou 1-386 da sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 1-2. Em algumas realizações, o veículo compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 131-135 ou 180-
184. Em algumas realizações, o epitélio polarizado é um epitélio de intestino polarizado. Em algumas realizações, a doença é a colite ulcerativa, bursite, proctite, doença de Crohn, esclerose múltipla (MS), Lúpus eritematoso sistêmico (SLE), Doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD), Artrite reumatoide ou Psoríase. Em algumas realizações, a doença é colite ulcerativa. Em algumas realizações, a colite ulcerativa é de branda a moderada ou de moderada a severa. Em algumas realizações, a doença é a doença de Crohn. Em algumas realizações, a doença de Crohn é a doença de Crohn fistulizante. Em algumas realizações, a carga útil é uma interleucina. Em algumas realizações, a interleucina compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NOs: 142 ou 145.
[0015] Em um aspecto, a presente descrição provê um método para o transporte de uma carga útil heteróloga para uma célula epitelial polarizada, compreendendo: (a) o contato da membrana apical da célula epitelial polarizada com um complexo veículo-carga útil; e (b) o transporte do complexo veículo- carga útil para dentro da célula epitelial polarizada, onde o complexo veículo- carga útil compreende um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127-129 ou um fragmento destas capaz de transportar o complexo veículo-carga útil para dentro da célula epitelial, acoplado à carga útil heteróloga. Em algumas realizações, o contato da membrana apical da célula epitelial polarizada com o complexo veículo-carga útil compreende a interação do veículo com o receptor de entrada apical TMEM132. Em algumas realizações, a interação do veículo com o receptor de entrada apical TMEM132 resulta na endocitose mediada por receptor do complexo veículo-carga útil. Em algumas realizações, o método compreende adicionalmente o transporte da carga útil heteróloga para um compartimento apical ou um compartimento basal. Em algumas realizações, o veículo do complexo veículo-carga útil permanece associado com TMEM132 após a endocitose. Em algumas realizações, o veículo que interage com TMEM132 compreende os resíduos de aminoácido 135-151 da SEQ ID NO: 130 ou uma sequência apresentando pelo menos 90% de identidade de sequência com esta. Em algumas realizações, o veículo é um polipeptídeo derivado de Cholix. Em algumas realizações, o veículo consiste nos resíduos de aminoácido 1-151, 1-187, 41-187 ou 40-205 de uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 130. Em algumas realizações, o veículo consiste nos resíduos de aminoácido 1-151, 1-187, 41-187 ou 40-205 da sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 1-2. Em algumas realizações, o veículo consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 136-139. Em algumas realizações, o veículo é acoplado não covalentemente à carga útil heteróloga por meio de uma nanopartícula. Em algumas realizações, uma proporção da carga útil heteróloga para o veículo na nanopartícula é de pelo menos 15000:1. Em algumas realizações, a carga útil heteróloga é um agente redutor de glicose. Em algumas realizações, o agente redutor de glicose é associado de forma não covalente com a nanopartícula. Em algumas realizações, a carga útil heteróloga é um siRNA. Em algumas realizações, o siRNA é associado de forma não covalente com a nanopartícula. Em algumas realizações, o veículo é covalentemente ligado à nanopartícula ou é secado por spray na nanopartícula.
[0016] Em um aspecto, a presente descrição provê um método compreendendo o transporte de uma carga útil heteróloga para dentro de uma célula epitelial polarizada, compreendendo: (a) o contato da membrana apical da célula epitelial polarizada com um complexo veículo-carga útil; e (b) o transporte do complexo veículo-carga útil para dentro da célula epitelial polarizada, onde o complexo veículo-carga útil é o complexo veículo-carga útil compreendendo qualquer um dos veículos para endocitose aqui.
[0017] Em um aspecto, a descrição inclui um complexo veículo-carga útil compreendendo um veículo capaz de ser acumulado em um compartimento apical de uma célula epitelial polarizada pelo menos 5 minutos após a endocitose do veículo, acoplado a uma carga útil heteróloga.
[0018] Em algumas realizações, o veículo é capaz de ser acumulado no compartimento apical da célula epitelial polarizada pelo menos 10 minutos após a endocitose do veículo. Em algumas realizações, o veículo é capaz de ser acumulado no compartimento apical da célula epitelial polarizada pelo menos 15 minutos após a endocitose do veículo.
[0019] Em algumas realizações, a célula epitelial polarizada compreende uma célula epitelial polarizada gastrointestinal. Em algumas realizações, a célula epitelial polarizada compreende uma célula epitelial polarizada gastrointestinal de rato.
[0020] Em um outro aspecto, a descrição inclui um complexo veículo-carga útil compreendendo um veículo capaz de ser acumulado em um compartimento apical de uma célula epitelial polarizada pelo menos 5 minutos após a aplicação intraluminal do veículo a um trato gastrointestinal de um mamífero, acoplado a uma carga útil heteróloga.
[0021] Em algumas realizações, o veículo é capaz de ser acumulado no compartimento apical da célula epitelial polarizada pelo menos 10 minutos após a aplicação intraluminal do veículo ao trato gastrointestinal do mamífero. Em algumas realizações, o veículo é capaz de ser acumulado no compartimento apical da célula epitelial polarizada pelo menos 15 minutos após a aplicação intraluminal do veículo ao trato gastrointestinal do mamífero.
[0022] Em algumas realizações, a aplicação intraluminal compreende a injeção intraluminal no jejuno de um rato.
[0023] Em um outro aspecto, a descrição inclui um complexo veículo-carga útil compreendendo um veículo capaz de ser acumulado em um compartimento supranuclear de uma célula epitelial polarizada pelo menos 5 minutos após a endocitose do veículo, acoplado a uma carga útil heteróloga.
[0024] Em algumas realizações, o veículo é capaz de ser acumulado no compartimento supranuclear da célula epitelial polarizada pelo menos 10 minutos após endocitose do veículo. Em algumas realizações, o veículo é capaz de ser acumulado no compartimento supranuclear da célula epitelial polarizada pelo menos 15 minutos após a endocitose do veículo.
[0025] Em algumas realizações, a célula epitelial polarizada compreende uma célula epitelial polarizada gastrointestinal. Em algumas realizações, a célula epitelial polarizada compreende uma célula epitelial polarizada gastrointestinal de rato.
[0026] Em um outro aspecto, a descrição inclui um complexo veículo-carga útil compreendendo um veículo capaz de ser acumulado em um compartimento supranuclear de uma célula epitelial polarizada pelo menos 5 minutos após a aplicação intraluminal do veículo a um trato gastrointestinal de um mamífero, acoplado a uma carga útil heteróloga.
[0027] Em algumas realizações, o veículo é capaz de ser acumulado no compartimento supranuclear da célula epitelial polarizada pelo menos 10 minutos após a aplicação intraluminal do veículo ao trato gastrointestinal do mamífero. Em algumas realizações, o veículo é capaz de ser acumulado no compartimento supranuclear da célula epitelial polarizada pelo menos 15 minutos após a aplicação intraluminal do veículo ao trato gastrointestinal do mamífero.
[0028] Em algumas realizações, a aplicação intraluminal compreende a injeção intraluminal no jejuno de um rato.
[0029] Em um outro aspecto, a descrição inclui um complexo veículo-carga útil compreendendo um veículo capaz de ser acumulado em um compartimento basal de uma célula epitelial polarizada pelo menos 5 minutos após a endocitose do veículo, acoplado a uma carga útil heteróloga.
[0030] Em algumas realizações, o veículo é capaz de ser acumulado no compartimento basal da célula epitelial polarizada pelo menos 10 minutos após a endocitose do veículo. Em algumas realizações, o veículo é capaz de ser acumulado no compartimento basal da célula epitelial polarizada pelo menos 15 minutos após a endocitose do veículo.
[0031] Em algumas realizações, a célula epitelial polarizada compreende uma célula epitelial polarizada gastrointestinal. Em algumas realizações, a célula epitelial polarizada compreende uma célula epitelial polarizada gastrointestinal de rato.
[0032] Em um outro aspecto, a descrição inclui um complexo veículo-carga útil compreendendo um veículo capaz de ser acumulado em um compartimento basal de uma célula epitelial polarizada pelo menos 5 minutos após a aplicação intraluminal do veículo a um trato gastrointestinal de um mamífero, acoplado a uma carga útil heteróloga.
[0033] Em algumas realizações, o veículo é capaz de ser acumulado no compartimento basal da célula epitelial polarizada pelo menos 10 minutos após a aplicação intraluminal do veículo ao trato gastrointestinal do mamífero. Em algumas realizações, o veículo é capaz de ser acumulado no compartimento basal da célula epitelial polarizada pelo menos 15 minutos após a aplicação intraluminal do veículo ao trato gastrointestinal do mamífero.
[0034] Em algumas realizações, a aplicação intraluminal compreende a injeção intraluminal no jejuno de um rato.
[0035] Em um outro aspecto, a descrição inclui um complexo veículo-carga útil compreendendo um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando um terminal C em qualquer uma das posições 195-347, acoplado a uma carga útil heteróloga. Em algumas realizações, a numeração de posição é baseada no alinhamento do polipeptídeo de Cholix com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 130, onde as posições são numeradas a partir de um terminal N para um terminal C iniciando com a posição 1 no terminal N.
[0036] Em algumas realizações, o truncamento no terminal C está em qualquer uma das posições 195-266 de uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 130. Em algumas realizações, o truncamento no terminal C está em qualquer uma das posições 195-266 de qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ
ID NOs: 1-2 ou 4-78. Em algumas realizações, o truncamento no terminal C está em qualquer uma das posições 206, 245, 251 ou 266 de uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 130. Em algumas realizações, o truncamento no terminal C está em qualquer uma das posições 206, 245, 251 ou 266 das SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78.
[0037] Em algumas realizações, o truncamento no terminal C está na posição 206 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78. Em algumas realizações, o veículo consiste na sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 131 ou 184. Em algumas realizações, o truncamento no terminal C está na posição 245 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78. Em algumas realizações, o veículo consiste na sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 132 ou 183. Em algumas realizações, o truncamento no terminal C está na posição 251 das SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78. Em algumas realizações, o veículo consiste nas sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 133 ou 182. Em algumas realizações, o truncamento no terminal C está na posição 266 das SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78. Em algumas realizações, o veículo consiste na sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 134 ou 181. Em algumas realizações, o veículo consiste na sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78 com truncamento em qualquer uma das posições 195-347, e apresenta não mais que 5, 4, 3, 2 ou 1 variações de aminoácido em qualquer uma das posições 1-40, 133-151, 152-187 ou 188-206 das SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78.
[0038] Em um outro aspecto, a descrição inclui um complexo veículo-carga útil compreendendo um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando um terminal N nas posições 1-41 e um terminal C nas posições 150- 195 ou consistindo nos resíduos de aminoácido de qualquer uma das posições 35- 40 do terminal N para qualquer uma das posições 150-205 do terminal C da sequência apresentada na SEQ ID NO: 130, acoplado a uma carga útil heteróloga. Em algumas realizações, a numeração de posição é baseada no alinhamento do polipeptídeo de Cholix com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 130, onde as posições são numeradas a partir de um terminal N para um terminal C iniciando com a posição 1 no terminal N.
[0039] Em algumas realizações, o veículo é capaz de permanecer associado com um receptor de entrada apical após a endocitose do veículo em uma célula epitelial polarizada. Em algumas realizações, o receptor de entrada apical é um receptor TMEM132 (por exemplo, TMEM132A).
[0040] Em algumas realizações, o veículo consiste nos resíduos de aminoácido a partir da posição 40 do terminal N para qualquer uma das posições 150-205 do terminal C da sequência apresentada na SEQ ID NO: 130. Em algumas realizações, o veículo apresenta um truncamento no terminal C nas posições 150 ou 186 da sequência apresentada na SEQ ID NO: 130.
[0041] Em algumas realizações, o veículo é capaz de transportar a carga útil para um compartimento basal ou um compartimento supranuclear em uma célula epitelial polarizada. Em algumas realizações, o veículo consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 136. Em algumas realizações, o veículo é capaz de transportar a carga útil para um compartimento apical em uma célula epitelial polarizada.
[0042] Em algumas realizações, o veículo consiste na sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 137-139.
[0043] Em um outro aspecto, a descrição inclui um complexo veículo-carga útil compreendendo um derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127-129 ou um fragmento destas capaz de endocitose em uma célula epitelial polarizada ou transcitose de uma célula epitelial polarizada, acoplado a uma carga útil heteróloga.
[0044] Em algumas realizações, o veículo compreende um ácido glutâmico na posição 3 e uma alanina na posição 4.
[0045] Em algumas realizações, o veículo é não tóxico.
[0046] Em algumas realizações, o veículo é capaz de transcitose da carga útil heteróloga através de uma célula epitelial polarizada.
[0047] Em algumas realizações, o veículo compreende um fragmento capaz de transcitose de uma célula epitelial polarizada, onde o veículo apresenta um truncamento no terminal C em qualquer uma das posições 195 para um resíduo do terminal C da sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78. Em algumas realizações, o truncamento no terminal C está em qualquer uma das posições 195-386 da sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78. Em algumas realizações, o truncamento no terminal C está na posição 386 de qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78. Em algumas realizações, o truncamento no terminal C está na posição 386 de qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-2. Em algumas realizações, o veículo consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 135.
[0048] Em um outro aspecto, a descrição inclui um complexo veículo-carga útil compreendendo um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix que não compreende a SEQ ID NO: 179, e não consiste na SEQ ID NO: 126, complexado com uma carga útil heteróloga, onde o veículo é capaz de transcitose da carga útil heteróloga através de uma célula epitelial polarizada; ou de transportar a carga útil heteróloga para dentro da célula epitelial polarizada.
[0049] Em algumas realizações, o veículo compreende pelo menos 75% de identidade de sequência com uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 130 ou fragmento desta. Em algumas realizações, o veículo compreende pelo menos 90% de identidade de sequência com uma variante de Cholix apresentada na SEQ ID NO: 130 ou um fragmento desta. Em algumas realizações, o polipeptídeo de Cholix é uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 130 ou fragmento desta. Em algumas realizações, o veículo compreende um ácido glutâmico na posição 3 e uma alanina na posição 4.
[0050] Em algumas realizações, o veículo é não tóxico.
[0051] Em algumas realizações, o veículo é capaz de transcitose da carga útil heteróloga através da célula epitelial polarizada.
[0052] Em algumas realizações, o veículo apresenta um truncamento no terminal C em qualquer uma das posições 195-633 da sequência apresentada na SEQ ID NO: 130. Em algumas realizações, o truncamento no terminal C está em qualquer uma das posições 195-386 da sequência apresentada na SEQ ID NO:
130. Em algumas realizações, o veículo apresenta um truncamento no terminal C em qualquer uma das posições 195-386 de qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78. Em algumas realizações, o truncamento no terminal C está na posição 386 de qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78. Em algumas realizações, o truncamento no terminal C está na posição 386 de qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-2. Em algumas realizações, o complexo veículo-carga útil compreende uma metionina no terminal N.
[0053] Em algumas realizações, o veículo é conjugado sinteticamente à carga útil heteróloga. Em algumas realizações, o veículo é geneticamente fundido com a carga útil heteróloga.
[0054] Em algumas realizações, a carga útil heteróloga é uma carga útil terapêutica. Em algumas realizações, a carga útil terapêutica é um a citocina, um anticorpo, um hormônio ou um ácido nucleico. Em algumas realizações, a carga útil terapêutica é uma citocina. Em algumas realizações, a citocina é uma interleucina.
[0055] Em algumas realizações, a interleucina é uma IL-10. Em algumas realizações, a IL-10 compreende uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 145. Em algumas realizações, a interleucina é uma IL-22. Em algumas realizações, a IL-22 compreende uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 142.
[0056] Em algumas realizações, a carga útil terapêutica é um anticorpo. Em algumas realizações, o anticorpo é um anticorpo anti-TNF. Em algumas realizações, a carga útil terapêutica é um hormônio. Em algumas realizações, a carga útil terapêutica é um hormônio de crescimento humano.
[0057] Em algumas realizações, a carga útil heteróloga é acoplada covalentemente ao veículo. Em algumas realizações, a carga útil heteróloga é acoplada a um terminal C do veículo. Em algumas realizações, a carga útil heteróloga é acoplada a um terminal N do veículo. Em algumas realizações, o veículo é acoplado à carga útil heteróloga por meio de um espaçador.
[0058] Em algumas realizações, o espaçador é um espaçador não passível de clivagem. Em algumas realizações, o espaçador compreende entre 1 e 100 resíduos de aminoácido. Em algumas realizações, o espaçador compreende até 15 repetições de GS, GGS, GGGS, GGGGS, GGGGGS ou uma combinação destas. Em algumas realizações, o espaçador compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 175. Em algumas realizações, o espaçador consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 176.
[0059] Em algumas realizações, a carga útil heteróloga é acoplada não covalentemente ao veículo. Em algumas realizações, a carga útil heteróloga é complexada com o veículo por meio de uma nanopartícula.
[0060] Em um aspecto, a presente descrição inclui um polinucleotídeo que codifica qualquer um dos complexos veículo-carga úteis (por exemplo, construtos de aplicação) descritos aqui, por exemplo, aqueles compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 147-150, 152-159 ou 188.
[0061] Em um aspecto, a presente descrição inclui um vector compreendendo qualquer um de tais polinucleotídeos que codificam um complexo veículo-carga útil (por exemplo, construto de aplicação) desta descrição.
[0062] Em um aspecto, a presente descrição inclui um método de transcitose de uma carga útil heteróloga através de uma célula epitelial polarizada, compreendendo: (a) o contato de uma membrana apical da célula epitelial polarizada com um complexo veículo-carga útil; e (b) a transcitose do complexo veículo-carga útil através da célula epitelial polarizada, onde o complexo veículo-
carga útil compreende um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127-129 ou um fragmento destas capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através da célula epitelial polarizada, acoplado à carga útil heteróloga. Em algumas realizações, o contato da membrana apical da célula epitelial polarizada com o complexo veículo-carga útil compreende a interação do veículo com o receptor de entrada apical TMEM132. Em algumas realizações, a interação do veículo com a proteína TMEM132 de membrana resulta na endocitose mediada por receptor do complexo veículo-carga útil. Em algumas realizações, o veículo que interage com TMEM132 compreende os resíduos de aminoácido 135-151 da SEQ ID NO: 130 ou uma sequência apresentando pelo menos 90% de identidade de sequência com esta. Em algumas realizações, a transcitose do complexo veículo-carga útil através da célula epitelial polarizada compreende a interação do veículo com qualquer um ou mais de GRP75 (por exemplo, GRP75B), ERGIC-53 e perlecan. Em algumas realizações, a transcitose do complexo veículo-carga útil através da célula epitelial polarizada compreende adicionalmente a localização conjunta do complexo veículo-carga útil com qualquer um ou mais de COPI, EEA1 e Rab7 no lado apical e com Rab11a no lado basal da célula epitelial. Em algumas realizações, o veículo que interage com GRP7 ou ERGIC-53 compreende os resíduos de aminoácido 1-40 e 152-187 da SEQ ID NO: 130 ou de uma sequência apresentando pelo menos 90% de identidade de sequência a esta. Em algumas realizações, o veículo que interage com perlecan compreende os resíduos de aminoácido 188-205 da SEQ ID NO: 130 ou de uma sequência apresentando pelo menos 90% de identidade de sequência com esta. Em algumas realizações, o método compreende adicionalmente, subsequente a (b) a aplicação do complexo veículo-carga útil na lamina propria. Em algumas realizações, a célula epitelial polarizada é uma célula epitelial intestinal polarizada.
[0063] Em um aspecto, a presente descrição inclui um método de administração oral de uma carga útil heteróloga em um indivíduo,
compreendendo: a administração oral de um complexo veículo-carga útil ao indivíduo, onde o veículo é capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através de um epitélio polarizado, aplicando, desta forma a carga útil heteróloga ao indivíduo, e onde o complexo veículo-carga útil compreende um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127- 129 ou um fragmento destas capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através do epitélio polarizado, acoplado à carga útil heteróloga.
[0064] Em um aspecto, a presente descrição inclui um complexo veículo- carga útil para administração oral de uma carga útil heteróloga a um indivíduo por um método compreendendo: a administração oral do complexo veículo-carga útil ao indivíduo, onde o veículo é capaz de transcitose do complexo veículo- carga útil através de um epitélio polarizado, desta forma, tratando uma doença no indivíduo, e onde o complexo veículo-carga útil compreende um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127-129 ou um fragmento destas capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através do epitélio polarizado, acoplado à carga útil heteróloga.
[0065] Em um aspecto, a presente descrição inclui um uso de um complexo veículo-carga útil para administração oral de uma carga útil heteróloga a um indivíduo por um método compreendendo: a administração oral do complexo veículo-carga útil ao indivíduo; onde o veículo é capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através de um epitélio polarizado, desta forma, tratando uma doença no indivíduo, e onde o complexo veículo-carga útil compreende um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127-129 ou um fragmento destas capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através do epitélio polarizado, acoplado à carga útil heteróloga.
[0066] Em um aspecto, a presente descrição inclui um método para o tratamento de uma doença em um indivíduo, compreendendo: a administração oral de um complexo veículo-carga útil ao indivíduo, onde o veículo é capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através de um epitélio polarizado, desta forma, tratando uma doença no indivíduo, e onde o complexo veículo-carga útil compreende um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127-129 ou um fragmento destas capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através do epitélio polarizado, acoplado à carga útil heteróloga.
[0067] Em um aspecto, a presente descrição inclui um complexo veículo- carga útil para uso no tratamento de uma doença em um indivíduo por um método compreendendo: a administração oral do complexo veículo-carga útil ao indivíduo, onde o veículo é capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através de um epitélio polarizado, desta forma, tratando a doença no indivíduo, e onde o complexo veículo-carga útil compreende um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127-129 ou um fragmento destas capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através do epitélio polarizado, acoplado à carga útil heteróloga.
[0068] Em um aspecto, a presente descrição inclui um uso de um complexo veículo-carga útil na manufatura de um medicamento para o tratamento de uma doença em um indivíduo por um método compreendendo: a administração oral do complexo veículo-carga útil ao indivíduo, onde o veículo é capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através de um epitélio polarizado, desta forma, tratando a doença no indivíduo, e onde o complexo veículo-carga útil compreende um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127-129 ou um fragmento destas capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através do epitélio polarizado, acoplado à carga útil heteróloga. Em algumas realizações, o método compreende adicionalmente a ligação da carga útil heteróloga a um receptor na lamina propria. Em algumas realizações, o método compreende adicionalmente a aplicação da carga útil heteróloga na circulação sistêmica. Em algumas realizações, o veículo é um polipeptídeo derivado de Cholix. Em algumas realizações, o veículo compreende os resíduos de aminoácido 1-206, 1-245, 1-251, 1-266 ou 1-386 de uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 130. Em algumas realizações, o veículo compreende os resíduos de aminoácido 1-206, 1-245, 1-251, 1-266 ou 1-386 da sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2. Em algumas realizações, o veículo compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 131-135 ou 180-184. Em algumas realizações, o epitélio polarizado é um epitélio de intestino polarizado. Em algumas realizações, a doença é colite ulcerativa, bursite, proctite, doença de Crohn, esclerose múltipla (MS), Lúpus eritematoso sistêmico (SLE), Doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD), Artrite reumatoide ou Psoríase. Em algumas realizações, a doença é colite ulcerativa. Em algumas realizações, a colite ulcerativa é de branda a moderada ou de moderada a severa. Em algumas realizações, a doença é a doença de Crohn. Em algumas realizações, a doença de Crohn é a doença de Crohn fistulizante. Em algumas realizações, a carga útil é uma interleucina. Em algumas realizações, a interleucina compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 142 ou 145.
[0069] Em um aspecto, a presente descrição inclui um método para o transporte de uma carga útil heteróloga para dentro de uma célula epitelial polarizada, compreendendo: (a) o contato da membrana apical da célula epitelial polarizada com um complexo veículo-carga útil; e (b) o transporte do complexo veículo-carga útil para dentro da célula epitelial polarizada, onde o complexo veículo-carga útil compreende um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127-129 ou um fragmento destas capaz de transportar o complexo veículo-carga útil para dentro da célula epitelial, acoplado à carga útil heteróloga. Em algumas realizações, o contato da membrana apical da célula epitelial polarizada com o complexo veículo-carga útil compreende a interação do veículo com o receptor de entrada apical TMEM132. Em algumas realizações,
a interação do veículo com o receptor de entrada apical TMEM132 resulta na endocitose mediada por receptor do complexo veículo-carga útil. Em algumas realizações, o método compreende adicionalmente o transporte da carga útil heteróloga para um compartimento apical ou um compartimento basal. Em algumas realizações, o veículo do complexo veículo-carga útil permanece associado com TMEM132 após a endocitose. Em algumas realizações, o veículo que interage com TMEM132 compreende os resíduos de aminoácido 135-151 da SEQ ID NO: 130 ou de uma sequência apresentando pelo menos 90% de identidade de sequência com esta. Em algumas realizações, o veículo é um polipeptídeo derivado de Cholix. Em algumas realizações, o veículo consiste nos resíduos de aminoácido 1-151, 1-187, 41-187 ou 40-205 de uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 130. Em algumas realizações, o veículo consiste nos resíduos de aminoácido 1-151, 1-187, 41-187 ou 40-205 da sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 1-2. Em algumas realizações, o veículo consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 136-139. Em algumas realizações, o veículo é acoplado de forma não covalente à carga útil heteróloga por meio de uma nanopartícula. Em algumas realizações, uma proporção da carga útil heteróloga para o veículo na nanopartícula é de pelo menos 15000:1. Em algumas realizações, a carga útil heteróloga é um agente redutor de glicose. Em algumas realizações, o agente redutor de glicose é associado de forma não covalente com a nanopartícula. Em algumas realizações, a carga útil heteróloga é um siRNA. Em algumas realizações, o siRNA é associado de forma não covalente com a nanopartícula. Em algumas realizações, o veículo é ligado de forma covalente à nanopartícula ou é secado por spray na nanopartícula.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0070] Várias características da presente descrição são apresentadas com particularidade nas reivindicações anexas. A patente ou arquivo de depósito contém pelo menos um desenho executado em cor. Cópias desta patente ou publicação de pedido de patente com desenho(s) em cor serão providas pelo
Escritório por solicitação e pagamento da taxa necessária. Uma melhor compreensão das características e vantagens da presente descrição será obtida por referência à descrição detalhada a seguir que apresenta aspectos ilustrativos, nos quais os princípios da descrição são utilizados, nos desenhos anexos (também “Figura” e “FIG.” aqui), nos quais:
[0071] A FIG. 1 mostra esquematicamente uma configuração compreendendo uma câmara apical acima de uma monocamada de célula epitelial e uma câmara basal abaixo de tal monocamada de célula epitelial. Para a permeabilidade apical para basolateral (por exemplo, transcitose), artigos de teste (por exemplo, veículos, construtos de aplicação, cargas úteis etc.) foram aplicados ao lado apical (A) e a quantidade de material permeado (por exemplo, transcitosado) foi determinada (por exemplo, pela utilização de western blotting, cromatografia etc.) no lado basolateral (B).
[0072] A FIG. 2 mostra que um construto de aplicação com SEQ ID NO: 147, compreendendo um veículo (SEQ ID NO: 134) e uma carga útil de IL-22 (SEQ ID NO: 142), transportando a carga útil de IL-22 através de monocamadas de célula epitelial intestinal Caco-2 intacta polarizada de maneira dependente de tempo (a quantidade de proteína no local basolateral foi medida 15, 30 e 45 minutos após o construto de aplicação ter sido aplicado à membrana apical da monocamada tal como descrito acima na FIG. 1). Os dados mostram adicionalmente que quando o construto de aplicação (SEQ ID NO: 147) compreendendo o veículo de SEQ ID NO: 134 e a carga útil de IL-22 da SEQ ID NO: 142 é aplicado a células epiteliais Caco-2, cerca de 2-3 vezes mais IL-22 cruzaram a monocamada de célula epitelial Caco-2 em comparação com quando uma IL-22 (SEQ ID NO: 143) não acoplada a um veículo é aplicada a células epiteliais Caco-2.
[0073] A FIG. 3 mostra que um construto de aplicação com SEQ ID NO: 147, compreendendo um veículo (SEQ ID NO: 134) e uma carga útil de IL-22 (SEQ ID NO: 142), resultou no fato da carga útil de IL-22 ser transportada através de monocamadas de célula epitelial intestinal SMI-100 intacta e polarizada de maneira dependente de tempo (a quantidade de proteína na câmara basolateral foi medida a 15, 30 e 45 minutos após a aplicação do construto de aplicação à membrana apical da monocamada). Os dados mostram adicionalmente que quando o construto de aplicação incluindo o veículo de SEQ ID NO: 134 acoplado à carga útil de IL-22 da SEQ ID NO: 142 é aplicado às células epiteliais SMI- 100, cerca de 2-3 vezes mais IL-22 cruzaram a monocamada de célula epitelial SMI-100 em comparação de quando uma IL-22 (SEQ ID NO: 143) não acoplada a um veículo é aplicada às células epiteliais SMI-100.
[0074] A FIG. 4 demonstra que um construto de aplicação com SEQ ID NO: 147 resulta no fato da IL-22 (SEQ ID NO: 142) ser transportada em quantidades significativas através de um epitélio de intestino polarizado e intacto in vivo. O local apical do epitélio intestinal é destacado pela seta branca #1. A lamina propria é abreviada como s “l.p.”. A membrana basal externa do epitélio polarizado é destacada pela seta branca #2. A localização de IL-22 é indicada pelas setas brancas e fluorescência verde (por exemplo, setas brancas #3), a fluorescência azul indica marcação com DAPI.
[0075] A FIG. 5 mostra que um primeiro construto de aplicação (SEQ ID NO: 147), e um segundo construto de aplicação (SEQ ID NO: 148) transportando uma carga útil de IL-22 através de monocamadas de Caco-2 (“após transporte” se refere à proteína localizada no compartimento basolateral após o transporte através de monocamadas de Caco-2). Os dados de western blot mostram adicionalmente que os construtos de aplicação estavam intactos após o transporte, por exemplo, como mostrado na ausência de produtos de degradação de peso molecular mais baixo. Os transportes da carga útil de IL-22 com construtos de aplicação de SEQ ID NO: 147 e SEQ ID NO: 148 são mostrados em relação ao transporte de uma proteína IL-22 de controle (SEQ ID NO: 143) na ausência de um veículo. A proteína IL-22 de controle consistia na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 143.
[0076] A FIG. 6 mostra a quantidade de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 147) e uma IL-22 (SEQ ID NO: 143) detectadas no compartimento basolateral de monocamadas de célula epitelial Caco-2 após a transcitose. As quantidades de proteína foram normalizadas. Os dados mostram que o transporte de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 147) incluindo um veículo derivado de Cholix (SEQ ID NO: 134) através de células epiteliais polarizadas era dependente da proteína regulada por glicose 75 (GRP75, por exemplo, GRP75B). Células de Caco-2 com nocaute de GRP75 (indicadas como Caco-2GRP75-) mostraram transporte significativamente reduzido do construto de aplicação (SEQ ID NO: 147) em comparação com células que expressam GRP75 (indicado como Caco-2). A dependência do transporte em GRP75 é indicada pela quantidade reduzida de construto de aplicação que foi detectada nos compartimentos basolaterais em células com nocaute de GRP75 em comparação com células que expressam GRP75. O transporte de IL-22 (SEQ ID NO: 143) separadamente não foi afetado pelo nocaute de GRP75.
[0077] A FIG. 7 mostra que o transporte de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 147) através de células epiteliais polarizadas era dependente da proteína núcleo de proteoglicana de sulfato de heparina específica para membrana basal (HSPG). Células Caco-2 com nocaute desta proteína (indicada como Caco-2HSPG- ) mostraram transporte significativamente reduzido do construto de aplicação (SEQ ID NO: 147) em comparação com células que expressam a HSPG (indicadas como Caco-2). A dependência do transporte em HSPG é indicada pela quantidade reduzida de construto de aplicação que foi detectada nos compartimentos basolaterais em células com nocaute de HSPG em comparação com células que expressam a HSPG. O transporte de IL-22 (SEQ ID NO: 143) separadamente (isto é, não acoplada a um veículo) não era dependente de HSPG.
[0078] A FIG. 8 mostra a detecção por microscopia de fluorescência de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 154) nos compartimentos apicais (destacados com seta branca #2) dentro de células epiteliais 15 min após a injeção intraluminal pela utilização de um modelo de injeção intraluminal em rato (a seta branca #1 destaca a superfície apical, a seta branca #3 destaca a membrana basal e a seta branca #4 destaca a lamina propria). Os dados demonstram que um veículo derivado de um exemplo de Cholix41-187 (por exemplo, SEQ ID NO: 137) era capaz de transportar uma carga útil para os compartimentos apicais de células epiteliais, mas não através de células epiteliais. A fluorescência vermelha mostra a localização de um veículo de Cholix, a fluorescência verde mostra a localização de hGH (SEQ ID NO: 146) e a fluorescência azul indica a marcação com DAPI.
[0079] A FIG. 9 mostra a detecção por microscopia de fluorescência de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 156) em compartimentos apicais (destacados com seta branca #2) de células epiteliais 15 min após injeção intraluminal pela utilização de um modelo de injeção intraluminal em rato (a seta branca #1 destaca a superfície apical, a seta branca #3 destaca a membrana basal e a seta branca #4 destaca a lamina propria). Os dados demonstram que um veículo derivado de um exemplo de Cholix40-205 (SEQ ID NO: 138) era capaz de transportar uma carga útil (por exemplo, hGH) para compartimentos apicais de células epiteliais, mas não através de células epiteliais para a lamina propria. Estes dados sugerem adicionalmente que os resíduos 1-39 da SEQ ID NO: 1 podem representar um papel na transcitose, mas podem não ser requeridos para a endocitose de um veículo de Cholix. A fluorescência vermelha mostra a localização de um veículo de Cholix, a fluorescência verde mostra a localização de hGH (SEQ ID NO: 146), e a fluorescência azul indica a marcação com DAPI.
[0080] A FIG. 10A mostra a detecção por microscopia de fluorescência de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 153) em compartimentos apicais no interior de células epiteliais 5 min após a injeção intraluminal do construto de aplicação a jejuno de rato. Nas FIGs. 10A-10C, a fluorescência vermelha mostra a localização de um veículo de Cholix, a fluorescência verde mostra a localização de hGH (SEQ ID NO: 146) e a fluorescência azul indica a marcação com DAPI; a seta branca #1 destaca os compartimentos apicais e a seta branca #2 destaca os compartimentos supranucleares.
[0081] A FIG. 10B mostra a detecção por microscopia de fluorescência de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 153) 10 min após a injeção intraluminal. Os dados demonstram que o veículo transportou a carga útil de hGH dos compartimentos apicais para os supranucleares e para os compartimentos basais no tempo.
[0082] A FIG. 10C mostra a detecção por microscopia de fluorescência de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 153) 15 min após a injeção intraluminal. Os dados demonstram que o veículo transportou a carga útil dos compartimentos apicais para os supranucleares e para os compartimentos basais no tempo.
[0083] As FIGs. 11A-11B mostram o transporte apical-para-basal de hormônio de crescimento humano (hGH, SEQ ID NO: 190) separadamente em comparação com hGH (SEQ ID NO: 146) acoplado a veículos. Os comprimentos do veículo são indicados pelo truncamento no terminal C em relação à SEQ ID NO: 1 de referência (por exemplo, “134” indica um veículo apresentando os resíduos 1-134 da SEQ ID NO: 1). Odos os veículos incluíram adicionalmente uma metionina no terminal N). O western blotting para hGH avaliou qualitativamente a capacidade destas proteínas em serem submetidas a transporte apical-para-basal através de monocamadas polarizadas de células primárias epiteliais do intestino delgado humano in vitro após 2 h. As quantidades de materiais aplicados de forma apical eram equivalentes a uma base molar para o teor de hGH e as coletas basais foram concentradas ~10 vezes antes da análise.
[0084] A FIG. 11A mostra uma comparação do transporte apical-para-basal de hGH (SEQ ID NO: 190) separadamente em relação ao medido para os construtos de aplicação com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 151 – SEQ ID NO: 154 e SEQ ID NO: 159 com truncamentos nas posições 134, 151, 187, 41-187 e 266, respectivamente. Os dados demonstram que os veículos de Cholix com truncamento no terminal C nas posições 134, 151, 187 da SEQ ID NO: 1 ou um truncamento no terminal N na 41 e um truncamento no terminal C na 187 da SEQ ID NO: 1, mostraram transporte apical-para-basal significativamente mais baixo de hGH conjunto em comparação com o construto com um veículo de Cholix (SEQ ID NO: 159) com um truncamento no terminal C na 266.
[0085] A FIG. 11B mostra que os construtos de aplicação com SEQ ID NO: 155 e SEQ ID NO: 157 – SEQ ID NO: 159 e que incluem veículos de Cholix com truncamento no terminal C nas posições 206 (SEQ ID NO: 131), 245 (SEQ ID NO: 132), 251 (SEQ ID NO: 133) e 266 (SEQ ID NO: 134), respectivamente, em comparação com SEQ ID NO: 1 demonstraram transporte apical-para-basal eficiente de hGH conjunto (SEQ ID NO: 146). Enquanto os veículos com Cholix com truncamentos no terminal C nas posições 245 e 251 demostraram um transporte apical-para-basal de hGH conjunto (SEQ ID NO: 146) comparável ao do veículo com o truncamento no terminal C na posição 266, o veículo com um Cholix com truncamento no terminal C na posição 206 mostrou um aumento significativo no transporte apical-para-basal de hGH em comparação com os veículos com truncamentos no terminal C nas posições 245, 251 e 266.
[0086] As FIGs. 12A-12F mostram a extensão do transporte apical para basal através de células epiteliais intestinais polarizadas em jejuno de rato de seis construtos de aplicação, cada um incluindo um veículo de Cholix diferente. A localização do veículo de Cholix (fluorescência vermelha) e de hGH (fluorescência verde) são demonstradas por microscopia de imunofluorescência pela utilização de anticorpos policlonais anti-Cholix e anticorpos monoclonais anti-hGH, respectivamente. As setas brancas indicam a membrana apical, “l-p” refere-se a lamina propria, “GC” refere-se a células caliciformes, e as setas abertas indicam o construto de aplicação presente na lamina propria.
[0087] A FIG. 12A mostra a extensão do transporte apical para basal 15 min após a injeção intraluminal de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 151) incluindo um veículo de Cholix (SEQ ID NO: 140) acoplado a hGH (SEQ ID NO: 146). A FIG. 12A mostra que o veículo não possibilitou que o construto de aplicação entrasse nas células epiteliais, sugerindo que um fragmento funcional da sequência apresentando os resíduos de aminoácido 135-151 da SEQ ID NO: 1 pode representar um papel na endocitose em células epiteliais polarizadas (em contraste, a FIG. 12B demonstra que o veículo com SEQ ID NO: 139 possibilitou a entrada celular do respectivo construto de aplicação por meio de endocitose).
[0088] A FIG. 12B mostra a extensão do transporte apical para basal 15 min após a injeção intraluminal de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 152)
incluindo um veículo de Cholix (SEQ ID NO: 139) acoplado a hGH (SEQ ID NO: 146) como demonstrado por microscopia de imunofluorescência. A FIG. 12B mostra que este construto não entra em células epiteliais (em oposição ao construto com SEQ ID NO: 151 descrito na FIG. 12A), mas principalmente permaneceu apical e, em alguma extensão, em reunidos vesiculares basais, mas não entram na lamina propria, desta forma possibilitando a aplicação de carga útil a compartimentos apicais e basais de uma célula epitelial.
[0089] A FIG. 12C mostra a extensão do transporte apical para basal 15 min após a injeção intraluminal de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 153) incluindo um veículo de Cholix (SEQ ID NO: 136) acoplado a hGH (SEQ ID NO: 146) como demonstrado por microscopia de imunofluorescência. A FIG. 12C mostra que este construto entrou em células epiteliais, alcançou os compartimentos basais e apicais e alcançou também uma região supranuclear da célula, ainda assim permaneceu no interior da célula epitelial, sugerindo que o fragmento de sequência consistindo nos resíduos de aminoácido 152-187 a SEQ ID NO: 1 permite o acesso e liberação para regiões supranucleares, bem como permite a localização em compartimentos basais.
[0090] A FIG. 12D mostra a extensão do transporte apical para basal 15 min após a injeção intraluminal de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 154) incluindo um veículo de Cholix (SEQ ID NO: 137) acoplado a hGH (SEQ ID NO: 146) como demonstrado por microscopia de imunofluorescência. A FIG. 12D mostra que este construto entrou em células epiteliais, mas permaneceu em compartimentos apicais e parece não ter alcançado os compartimentos basais ou supranuclear.
[0091] A FIG. 12E mostra a extensão do transporte apical para basal 15 min após a injeção intraluminal de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 155) incluindo um veículo de Cholix (SEQ ID NO: 131) acoplado a hGH (SEQ ID NO: 146) como demonstrado por microscopia de imunofluorescência. A FIG. 12E mostra que este construto completou o processo de transcitose tal como indicado pelos construtos de aplicação alcançando a lamina propria (ver seta aberta), sugerindo que o fragmento de sequência consistindo nos resíduos de aminoácido 188-206 da sequência apresentada na SEQ ID NO: 1 possibilita que o veículo (e construtos compreendendo tal veículo) se encaixa nos processos de reciclagem basal que permitem a liberação do veículo ou respectivo construto da célula epitelial para um compartimento basolateral (por exemplo, lamina propria).
[0092] A FIG. 12F mostra o transporte através de monocamadas epiteliais de jejuno de rato in vivo 15 min após a injeção intraluminal de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 159) incluindo um veículo de Cholix (SEQ ID NO: 134) acoplado a hGH (SEQ ID NO: 146) como demonstrado por microscopia de imunofluorescência. A FIG. 12F mostra que este construto completou o processo de transcitose tal como indicado pelos construtos de aplicação tendo alcançado a lamina propria (ver seta aberta).
[0093] As FIG. 13A, FIG. 13B e FIG. 13C mostram que os construtos de aplicação com SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 152 e SEQ ID NO: 153, respectivamente, se localizaram conjuntamente com Rab11a no lado apical das células epiteliais. Os dados mostram também que os construtos com SEQ ID NO: 152 e SEQ ID NO: 154 não se localizaram significativamente no lado basal, mas permaneceram principalmente no lado apical. O construto com SEQ ID NO: 153 não se localizou nem no lado apical nem no lado basal, no entanto apenas se localizaram conjuntamente com Rab11a no lado apical e não no lado basal (sub- imagens 3a e 3b da FIG. 13C). Em conjunto, estes resultados sugerem que os veículos que não são capazes de transcitose podem entrar nos sistemas apicais da célula epitelial. As medições foram conduzidas 15 min após a injeção intraluminal. A fluorescência verde mostra a localização de hGH, a fluorescência vermelha mostra a localização de Rab11a (ou Rab11) e a fluorescência azul indica a marcação com DAPI (a descrição experimental inclui a FIG. 13D).
[0094] A FIG. 13D mostra que o construto de aplicação com SEQ ID NO: 159 se localizou conjuntamente com Rab11a no lado basal, mas não significativamente no lado apical da célula epitelial polarizada. Isto sugere que os veículos capazes de transcitose podem utilizar o sistema de reciclagem basal para sua liberação da célula epitelial para a lamina propria (ver sub-imagens 4a e 4b da FIG. 13D).
[0095] As FIGs. 14A-14C mostram efeitos de nocaute de K8, HSPG (perlecan) e GRP75, respectivamente, na função de transcitose de um construto de aplicação com SEQ ID NO: 150 que inclui um veículo derivado de Cholix com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 134 acoplada em hGH por meio de um espaçador cuja sequência é apresentada na SEQ ID NO: 177, em comparação com hGH separadamente (SEQ ID NO: 190). Linhagens celulares estáveis de células Caco-2 não apresentando a expressão de proteínas K8 candidatas específicas (Caco-2K8-), HSPG (Caco-2HSPG-) e GRP75 (Caco-2GRP75-) foram utilizadas como monocamadas in vitro de maneira a se verificar seu envolvimento em veículo de transcitose (por exemplo, veículos de Cholix) por meio de mecanismos de transporte endógenos ativos e seletivos.
[0096] A FIG. 14A que o nocaute de K8 não reduz significativamente a função de transcitose do construto de aplicação (SEQ ID NO: 150).
[0097] A FIG. 14B mostra que o nocaute de HSPG (perlecan) não reduz significativamente a função de transcitose do construto de aplicação (SEQ ID NO: 150).
[0098] A FIG. 14C mostra que o nocaute de GRP75 não reduz significativamente a função de transcitose do construto de aplicação (SEQ ID NO: 150).
[0099] A FIG. 15A mostra as interações de ligação de Biacore™ utilizadas para examinar a dependência de pH das interações veículo de Cholix-GRP75. Para esta finalidade, biotina foi acoplada ao terminal C proteína de Cholix de comprimento total cuja sequência é apresentada na SEQ ID NO: 1 e subsequentemente fixada em uma superfície (por exemplo, superfície de chip, placa de 96 poços de plástico etc.) pela utilização de bioconjunção biotina- estreptavidina e incubada com proteína GRP75 purificada em soluções de tampão a pH 5,5, 6,5 e 7,5, respectivamente. A afinidade de ligação mais alta para esta interação foi medida a pH 6,5.
[0100] A FIG. 15B mostra a dependência de pH da interação de um veículo derivado de Cholix (SEQ ID NO: 189, sequência de Cholix de comprimento total da SEQ ID NO: 1 com uma deleção do resíduo de ácido glutâmico na posição 581) com o receptor apical (por exemplo, TMEM132 tal como TMEM132A), os receptores de evasão de lisossomo (por exemplo, GRP75), receptor de tráfico (por exemplo, ERGIC-53) e receptor basal (por exemplo, perlecan). Esta dependência de pH da interação de receptor tal como determinada em ensaios de ressonância de plasmon indica que um veículo derivado de Cholix pode interagir com certos receptores sequencialmente dependendo de sua localização. Por exemplo, estes dados mostram que um veículo derivado de Cholix apresenta uma afinidade significativamente mais alta para endocitose e receptores precoces de tráfico tal como o receptor de entrada apical e receptor de evasão de lisossomo a pH 7,5. Uma vez o pH tendo caído para cerca de 5,5, a afinidade do veículo de Cholix para estes receptores de tráfico precoce é reduzida, enquanto sua afinidade para o receptor de tráfico apical-basal ERGIC-53 e a proteína de liberação basal perlecan aumenta significativamente neste pH, permitindo que o veículo de Cholix seja “entregue” para receptores liberação de tráfico e basal durante o processo de transcitose vesicular.
[0101] A FIG. 16 mostra interações de ligação significativas a Biacore™ da proteína de Cholix de comprimento total cuja sequência é apresentada na SEQ ID NO: 1 com perlecan e GRP75.
[0102] A FIG. 17 mostra interações de ligação significativas de Biacore™ da proteína de Cholix de comprimento total cuja sequência é apresentada na SEQ ID NO: com GRP75, perlecan e TMEM132A.
[0103] As FIGs. 18A-18D mostram o destino do hormônio de crescimento humano (hGH, SEQ ID NO: 190) que foi administrado por injeção intraluminal (ILI, a superfície luminal é indicada como uma seta branca nas FIG. 18A-FIG.
18F) no jejuno de rato in vivo que foi avaliado primeiro como um transporte de expectativa de controle negativo para lisossomos após absorção celular.
[0104] A FIG. 18A mostra que a localização de hGH (SEQ ID NO: 190) 15 minutos após a injeção (ILI) era limitada a uma pequena população de vesículas na região apical de células epiteliais tal como demonstrado pela detecção por imunofluorescência verde.
[0105] As FIG. 18B, FIG. 18C e FIG. 18D mostram que 15 min após ILI, o hGH (SEQ ID NO: 190) era c-localizado com a proteína 1 de membrana associada a lisossomo (LAMP1, fluorescência vermelha) (FIG. 18B) a proteína relacionada a Ras (Rab7, fluorescência púrpura) (FIG. 18C) com cerca da mesma frequência e características de LAMP1+ residente, lisossomos Rab7+ (FIG. 18D), indicando que o hGH estava direcionado para a rota destrutiva lisossômica (por exemplo, reciclagem) pouco depois da ingestão nas células epiteliais.
[0106] A FIG. 18E e FIG. 18F mostram que um construto de aplicação (SEQ ID NO: 159) que inclui um veículo derivado de Cholix (SEQ ID NO: 134) acoplado a hGH (SEQ ID NO: 146) por meio de um espaçador (SEQ ID NO: 175), foi direcionado para fora da rota lisossômica e, desta forma, não mostra a localização conjunta com LAMP1 (FIG. 18E) ou Rab7 (FIG. 18F), desta forma, possibilitando a transcitose de carga útil funcional através de células epiteliais polarizadas para dentro da lamina propria.
[0107] A FIG. 19A mostra que a distribuição de revestimento da proteína I (COPI, fluorescência vermelha) foi restrita à membrana apical luminal e compartimento apical vesicular das células epiteliais antes da injeção luminal de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 159) que inclui um veículo derivado de Cholix (SEQ ID NO: 134) acoplado a hGH (SEQ ID NO: 146) por meio de um espaçador (SEQ ID NO: 175). Em comparação, após a injeção intraluminal apical (ILI, a superfície luminal é indicada como uma seta branca nas FIG. 19A-FIG. 19D) do construto de aplicação (SEQ ID NO: 159), a FIG. 19B que a COPI foi redistribuída para uma localização supranuclear, indicando localização conjunta das vesículas contendo tanto o construto de aplicação com SEQ ID NO: 159 quanto COPI. A fluorescência azul indica a marcação com DAPI. As medições nas FIGs. 19A-19D foram conduzidas 15 minutos após a ILI.
[0108] A FIG. 19C mostra que LMAN1 (fluorescência verde) localizada conjuntamente com COPI (fluorescência vermelha) na região apical (destacada pela seta branca) de células epiteliais polarizadas antes da injeção de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 159).
[0109] A FIG. 19D mostra que, após a ILI apical (destacada pela seta branca) do construto de aplicação (SEQ ID NO: 159), a LMAN1 interagiu e foi distribuída com o construto de aplicação para a região basal da célula epitelial, que é adjacente à lamina propria (indicada como “l-p”). Desta forma, um mecanismo de redistribuição de LMAN1 parece ser utilizado pelos veículos de Cholix para se deslocarem do lado apical da célula epitelial para um compartimento basal.
[0110] As FIGs. 19E-19H mostram o tráfico de um veículo de Cholix (SEQ ID NO: 134) de compartimentos apical (indicado pela seta branca #1) para o basal (indicado pela branca #2) em células epiteliais 5 (FIG. 19F), 10 (FIG. 19G) e 15 min (FIG. 19H) após a injeção luminal de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 159) compreendendo um veículo derivado de Cholix (SEQ ID NO: 134) acoplado a um hGH (SEQ ID NO: 146) no jejuno de rato. A localização do veículo de Cholix é mostrada por fluorescência verde, a localização do receptor ERGIC é mostrada por fluorescência vermelha e a localização de um outro marcador de ERGIC que pode representar um papel no tráfico apical para basal (também referido aqui como complexo de proteína de tráfico ER-Golgi) é mostrado por fluorescência púrpura; desta forma, a interação do veículo de Cholix e receptor ERGIC é mostrada por fluorescência amarela, a interação do veículo de Cholix e complexo de proteína de tráfico ER-Golgi é mostrada por fluorescência rosa e a interação e/ou localização conjunta do veículo de Cholix, receptor ERGIC e complexo de proteína de tráfico ER-Golgi é mostrada por pontos brancos (sobreposição de fluorescência verde, vermelha e púrpura). A marcação com DAPI é indicada por fluorescência azul.
[0111] A FIG. 19E mostra células epiteliais intestinais polarizadas não tratadas.
[0112] A FIG. 19F mostra a localização e interação do veículo de Cholix (SEQ ID NO: 134) com o complexo de proteína de tráfico ER-Golgi 5 minutos após a injeção luminal no compartimento apical como indicado por sinal de fluorescência rosa nos compartimentos apicais.
[0113] A FIG. 19G mostra o tráfico do veículo de Cholix (SEQ ID NO: 134) em associação com ERGIG-53 para a membrana basal 10 minutos após a injeção luminal seguida de liberação basal release do veículo (e construto) para a lamina propria (seta dourada). Estes dados demonstram que um veículo derivado de Cholix pode utilizar interações específicas com proteínas ERGIC (por exemplo, ERGIC-53) para tráfico vesicular de “sequestro” dos compartimentos apicais e basais de uma célula epitelial polarizada.
[0114] A FIG. 19H mostra quantidades aumentadas do veículo de Cholix (SEQ ID NO: 134) presente na lamina propria 15 minutos após a injeção luminal.
[0115] As FIGs. 19I-19K mostram que um veículo de Cholix (SEQ ID NO: 134) utilizou mecanismos de secreção de proteína basal para o tráfico através de uma célula epitelial polarizada para dentro da lamina propria. As imagens de microscopia de fluorescência foram obtidas 15 min após a injeção luminal de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 159) compreendendo um veículo derivado de Cholix (SEQ ID NO: 134) acoplado a um hGH (SEQ ID NO: 146) em jejuno de rato, e mostram que as vesículas basais (destacadas por círculos brancos e números “1-3” em diferentes células epiteliais) podem conter veículo de Cholix e receptor ERGIC-53, veículo de Cholix e proteína de secreção basal ou todos os três de veículo de Cholix, receptor ERGIC e proteína de secreção basal. A localização do veículo de Cholix é mostrada por fluorescência verde (pela utilização de um anticorpo anti-veículo de Cholix), a localização do receptor ERGIC-53 é mostrada por fluorescência vermelha e a localização da proteína de secreção basal é mostrada por fluorescência púrpura; desta forma, a interação do veículo de Cholix e receptor ERGIC-53 é mostrada por fluorescência amarela, a interação do veículo de Cholix e a proteína de secreção basal perlecan é mostrada por fluorescência rosa e a interação e/ou localização conjunta do veículo de Cholix, receptor ERGIC-53 e perlecan é mostrada por pontos brancos (sobreposição de fluorescência verde, vermelha e púrpura). A marcação com DAPI é indicada por fluorescência azul.
[0116] A FIG. 19I mostra que as vesículas do compartimento basal continham o veículo de Cholix (SEQ ID NO: 134) e o receptor ERGIC-53 como indicado por fluorescência amarela.
[0117] A FIG. 19J mostra que as vesículas do compartimento basal continham o veículo de Cholix (SEQ ID NO: 134) e perlecan como indicado por fluorescência rosa.
[0118] A FIG. 19K mostra que as vesículas do compartimento basal continham o veículo de Cholix (SEQ ID NO: 134), o receptor ERGIC-53 e perlecan tal como indicado por pontos brancos (por exemplo, sobreposição de fluorescência verde, vermelha e púrpura).
[0119] A FIG. 20A mostra a distribuição de um outro elemento de compartimento intermediário do retículo de Golgi endoplasmático (ERGIC), SEC22b, na ausência de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 159). Em tecidos não tratados (isto é, sem injeção de um construto de aplicação), SEC22b e LMAN1 extensivamente localizados conjuntamente no compartimento apical branco LMAN1 separadamente foi observado separadamente próximo à membrana plasmática apical. Nas FIGs. 20A-20D, a fluorescência vermelha mostra a localização de LMAN1, a fluorescência púrpura mostra a localização de SEC22b, a fluorescência verde mostra a localização de hGH, a seta branca indica a superfície apical e “G” indica células caliciformes.
[0120] A FIG. 20B mostra que 5 minutos após a ILI de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 159) incluindo um veículo de Cholix (SEQ ID NO: 134) acoplado a hGH (SEQ ID NO: 146), LMAN1, SEC22b e hGH localizados conjuntamente no compartimento apical, mas não significativamente em compartimentos basais de células epiteliais.
[0121] A FIG. 20C mostra que 10 min após a ILI, o construto de aplicação (SEQ ID NO: 159) e LMAN1 eram observados como localizados conjuntamente no compartimento basal de células epiteliais sem SEC22b, confirmando que LMAN1 interagiu e se deslocou com o construto de aplicação no interior da vesícula a partir do compartimento vesicular apical para o basal de células epiteliais.
[0122] A FIG. 20D mostra que a extensão do construto de aplicação (SEQ ID NO: 159) e LMAN1 localizados conjuntamente no compartimento basal 15 min após a ILI aumentou, com um aumento da quantidade de hGH que alcança a lamina propria no tempo.
[0123] As FIG. 20E-FIG. 20H mostram as mesmas seções de tecido tal como descritas acima e mostradas nas FIG. 20A-FIG. 20D, mas mostrando apenas os sinais de LMAN1 e SEC22b (sem sinal de hGH). Isto demonstra a profunda redistribuição de LMAN1 para o compartimento basal sem uma redistribuição de SEC22b em resposta à aplicação apical de uma liberação (SEQ ID NO: 159). Estes dados demonstram que os construtos de aplicação compreendendo um veículo derivado de Cholix podem utilizar rotas de tráfico endógenas de Cholix que permitem um transporte rápido e eficiente de carga útil através do epitélio intestinal por acoplamento de tal carga útil ao veículo.
[0124] As FIGs. 21A-21E mostram um modelo de superfície exemplificativo de um veículo derivado de Cholix consistindo na SEQ ID NO: 178 (inclui os resíduos de aminoácido 1-265 da SEQ ID NO: 1 e uma metionina no terminal N) que foi utilizado para destacar regiões de interesse selecionadas que podem representar um papel em certas funcionalidades relacionadas à transcitose apical para basal, bem como sua posição e proximidade relativas na superfície da proteína. As regiões de aminoácido localizadas nos resíduos V1 e E39 são adjacentes à superfície exposta dos aminoácidos D150-K186 e K186-L205. Especificamente, a L17-I25 (região X1, SEQ ID NO: 160) e T170-I176 (região X2, SEQ ID NO: 161) são coordenadas para formar m bolso circundado por várias cargas negativas. Similarmente, a K186-H202 (região X3, SEQ ID NO: 162) é coordenada com a I31-E39 (região X4, SEQ ID NO: 163) para formar uma estrutura em crista contínua. Em adição, o modelo de superfície mostra os resíduos D135- N139 (região X5, SEQ ID NO: 164) e os resíduos de asparagina (por exemplo, sítios de glicosilação potencial) destacados em púrpura.
[0125] A FIG. 21A mostra a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de Cholix com SEQ ID NO: 178.
[0126] A FIG. 21B mostra a localização das regiões X1, X3 e X4.
[0127] A FIG. 21C mostra a localização das regiões X1 e X2, bem como de X3 e X4.
[0128] A FIG. 21D mostra a localização das regiões X1, X2, X4 e X5.
[0129] FIG. 21E mostra a localização das regiões X1, X2, X3, X4 e X5.
[0130] As FIGs. 22A-22L ilustram uma análise de rota de tráfico para um construto de aplicação derivado (SEQ ID NO: 149). O construto de aplicação compreendia um veículo derivado de Cholix (SEQ ID NO: 135) acoplado a uma forma ativa secretada de IL-10 (SEQ ID NO: 145) por meio de um espaçador de glicina-serina (SEQ ID NO: 176). Nas FIGs. 22A-22L a seta branca #1 destaca a superfície apical, a seta branca #2 destaca a superfície basal e a seta branca #3 destaca a lamina propria.
[0131] A FIG. 22A mostra que o construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) fortemente se localizou conjuntamente com o antígeno de EEA1 em localizações celulares consistentes com o tráfico tanto nos compartimentos apicais quanto basais e células epiteliais, sugerindo a presença do construto de aplicação derivado de Cholix em compartimentos endossômicos precoces. A fluorescência vermelha mostra a localização do antígeno de EEA1 e a fluorescência verde mostra a localização de IL-10.
[0132] A FIG. 22B mostra que o construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) se localizou conjuntamente fortemente com a Rab7 (esquerda superior) predominantemente no compartimento apical das células epiteliais, mas com localização conjunta apenas limitada em células dentro da lamina propria, sugerindo a presença do construto de aplicação derivado de Cholix em compartimentos endossômicos posteriores (esquerda inferior mostra uma imagem de luz branca e a direita inferior mostra a marcação combinada com marcação com DAPI mostrada em azul, a fluorescência vermelha mostrando a localização do antígeno de EEA1 e a fluorescência verde mostrando a localização de IL-10).
[0133] A FIG. 22C mostra que a LAMP1 foi identificada em vesículas específicas grandes consistentes com lisossomos maduros que não continham o construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) (setas brancas, a fluorescência vermelha mostrando a localização do antígeno de EEA1 e a fluorescência verde mostrando a localização de IL-10). O construto de aplicação (SEQ ID NO: 149), no entanto, se localizou conjuntamente com o antígeno de LAMP1 em locais celulares outros que não estruturas semelhantes a lisossomo, consistente com o tráfico de vesícula tanto nos compartimentos apicais quanto basais de células epiteliais, sugerindo a presença do construto de aplicação derivado de Cholix em compartimentos endossômicos posteriores.
[0134] A FIG. 22D mostra que o construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) também se localizou conjuntamente fortemente com vesículas revestidas com clatrina, particularmente em áreas adjacentes ao núcleo e com Rab11a predominantemente no compartimento basal de células epiteliais, bem como de células selecionadas dentro da lamina propria. A marcação com DAPI é mostrada em azul, fluorescência vermelha mostra a localização do antígeno de IL-10 e a fluorescência verde mostra a localização da clatrina.
[0135] A FIG. 22E mostra que o construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) se localizou conjuntamente com o retículo endoplasmático como demonstrado por calnexina (fluorescência vermelha mostrando a localização da calnexina e a fluorescência verde mostrando a localização de IL-10) em um padrão adjacente ao núcleo em células epiteliais e em uma grande fração de células dentro da lamina propria. Especificamente, o construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) se localizou conjuntamente fortemente com o retículo endoplasmático do compartimento intermediários de Golgi (ERGIC) e o antígeno de LMAN1 pareceu se redistribuir em reposta à endocitose e transcitose do veículo, como mostrado para 5 (FIG. 22F), 10 (FIG. 22G) e 15 minutos após a injeção (FIG. 22H).
[0136] A FIG. 22F mostra que o construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) se localizou conjuntamente fortemente com o retículo endoplasmático do compartimento intermediário de Golgi 53 (ERGIC-53) e o antígeno de LMAN1 (fluorescência vermelha mostrando a localização de ERGIC-53 e LMAN1 e a fluorescência verde mostrando a localização de IL-10, a fluorescência azul mostra a marcação com DAPI) parece ter se redistribuído em reposta à endocitose e transcitose do veículo, como mostrado para 5 minuto após a injeção.
[0137] A FIG. 22G mostra o construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) localizado conjuntamente com o antígeno de LMAN1 10 minutos após a injeção. Os dados mostram uma localização significativa do construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) na lamina propria.
[0138] A FIG. 22H mostra o construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) localizado conjuntamente com o antígeno de LMAN1 15 minutos após a injeção. Os dados mostram uma localização significativa do construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) na lamina propria.
[0139] A FIG. 22I mostra que o construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) não se localizou conjuntamente com os níveis baixos de giantina presente em células epiteliais (a fluorescência vermelha mostrando a localização de IL-10 e a fluorescência verde mostrando a localização de giantina, a fluorescência azul mostra a marcação com DAPI). Alguma giantina se localizou conjuntamente com o construto em um subconjunto de células presentes na lamina propria, sugerindo que o veículo derivado de Cholix não se localiza com o compartimento de Golgi.
[0140] A FIG. 22J mostra que o antígeno 58K localizado em células epiteliais em um sítio apical ao núcleo e o construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) mostrou alguma localização conjunta (a fluorescência vermelha mostrando a localização de IL-10 e a fluorescência verde mostrando a localização do antígeno de Golgi 58K, a fluorescência azul mostra a marcação com DAPI) com esta proteína em uma maneira que sugere um breve deslocamento através deste compartimento. Nenhum antígeno 58K foi observado em células dentro da lamina propria.
[0141] A FIG. 22K mostra que o construto de aplicação (SEQ ID NO: 149, esquerda superior, localização de IL-10) mostrou algum nível de localização conjunta com o antígeno TGN38 (direita superior), que mostrou uma distribuição celular que era restrita ao lado apical dos núcleos em células epiteliais e adjacente ao núcleo em poucas células dentro da lamina propria. A imagem à esquerda inferior mostra uma imagem de luz branca e a direita inferior mostra uma mistura (sobreposição) com sinais de IL-10 (vermelho), TGN38 (verde) e DAPI (fluorescência azul).
[0142] A FIG. 22L mostra que o construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) (localização de IL-10 mostrada por fluorescência verde, direita superior) se localizou conjuntamente fortemente com Rab11a (esquerda superior, a localização mostrada por fluorescência vermelha) predominantemente no compartimento basal de células epiteliais e em células selecionadas dentro da lamina propria. A imagem à esquerda inferior mostra uma imagem de luz branca e à direita inferior mostra uma mistura (sobreposição) com os sinais de IL-10 (verde), Rab11a (vermelho) e DAPI (fluorescência azul).
[0143] As FIGs. 23A-23C mostram imagens de microscopia demonstrando a transcitose de uma IL-10 através de célula epitelial intestinal polarizadas em ratos Wistar em vários pontos no tempo após a aplicação do construto de aplicação com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 149 a jejuno de rato. O construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) incluía um veículo com SEQ ID NO: 135 acoplado a uma carga útil de IL-10 apresentando a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 145 por meio de um espaçador apresentando uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 176. A fluorescência verde indica a presença de IL-10 (por meio de marcação com um anticorpo anti-IL-10). A fluorescência azul indica a marcação com DAPI, que rotula DNA e a fluorescência vermelha indica a presença de CK-8 (citoqueratina-8) com a qual um veículo derivado de Cholix pode se localizar conjuntamente (por exemplo, em uma região supranuclear de uma célula epitelial) durante a transcitose. As setas brancas #1 destacam a membrana apical das células epiteliais e as setas brancas #2 destacam a membrana basal das células epiteliais.
[0144] A FIG. 23A demonstra a extensão da transcitose de IL-10 um minuto após a aplicação luminal do construto de aplicação com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 149 ao jejuno de rato. Os dados mostram que o transporte de uma carga útil de IL-10 do sítio apical para o basal e para a lamina propria ocorreu tão cedo quanto as 1 minuto após a aplicação do construto de aplicação. A seta branca #3 indica a presença de IL-10 na lamina propria (ver, por exemplo, as setas brancas #3).
[0145] A FIG. 23B demonstra a extensão da transcitose de IL-10 cinco minutos após a aplicação luminal do construto de aplicação com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 149 ao jejuno de rato. Os dados mostram uma quantidade maior de carga útil de IL-10 transportada que estava presente na lamina propria (ver, por exemplo, as setas brancas #3) 5 minutos após a aplicação luminal do construto de aplicação.
[0146] A FIG. 23C demonstra a extensão da transcitose de IL-10 dez minutos após a aplicação luminal do construto de aplicação com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 149 ao jejuno de rato. Os dados mostram quantidades ainda maiores de carga útil de IL-10 transportada que estava presente na lamina propria (ver, por exemplo, as setas brancas #3) 10 minutos após a aplicação luminal do construto de aplicação.
[0147] As FIGs. 23D-23F mostram a endocitose apical e tráfico precoce do veículo de Cholix com SEQ ID NO: 135 em células epiteliais 1 min após a injeção luminal do construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) compreendendo o veículo de Cholix com SEQ ID NO: 135 acoplado a uma IL-10 (SEQ ID NO: 145) em jejuno de rato. Os dados mostram que os veículos derivados de Cholix evitam a rota de destruição lisossômica por interação com receptores de evasão de lisossomo. A localização do veículo de Cholix é mostrada por fluorescência verde, a localização do receptor de entrada apical TMEM132 é mostrada por fluorescência vermelha e a localização dos receptores de evasão de lisossomo é mostrada por fluorescência púrpura; desta forma, a interação do veículo de Cholix e do receptor de entrada apical TMEM132 é mostrada por fluorescência amarela, a interação do veículo de Cholix e do receptor de evasão de lisossomo é mostrada por fluorescência rosa e a interação e/ou localização conjunta do veículo de Cholix, receptor de entrada apical TMEM132 e receptor de evasão de lisossomo é mostrada por pontos brancos (sobreposição de fluorescência verde, vermelha e púrpura). A marcação com DAPI é indicada por fluorescência azul.
[0148] A FIG. 23D mostra a localização do veículo de Cholix (SEQ ID NO: 135) na membrana apical (indicado pela seta branca #1) de uma célula epitelial polarizada. A membrana basal é indicada pela seta branca #2 e a lamina propria é indicada pela seta branca #3.
[0149] A FIG. 23E mostra a interação do veículo de Cholix (SEQ ID NO: 135) com o receptor de entrada apical TMEM132 como indicado por fluorescência amarela na e em torno da membrana apical.
[0150] A FIG. 23F mostra que o veículo de Cholix (SEQ ID NO: 135), receptor de entrada apical TMEM132 e receptor de evasão de lisossomo estão em proximidade à membrana apical como mostrado por pontos brancos (por exemplo, a sobreposição de fluorescência verde, vermelha e púrpura) indicado pela seta branca. É assumido que o receptor de evasão de lisossomo (GRP75) pode se aproximar de um complexo veículo de Cholix-receptor de entrada apical, seguido da dissociação do veículo de Cholix do receptor de entrada apical TMEM132 e associação do veículo de Cholix com o receptor de evasão de lisossomo GRP75 devido às alterações no pH ambiental e na dependência de pH desta interação veículo de Cholix-receptor como mostrado, por exemplo, na FIG. 15B.
[0151] As FIGs. 23G-23H mostram o tráfico de um veículo de Cholix (SEQ ID NO: 135) dos compartimentos apicais para os supranucleares em células epiteliais 5 e 15 min após a injeção luminal do construto de aplicação (SEQ ID
NO: 149) compreendendo um veículo derivado de Cholix (SEQ ID NO: 135) acoplado a uma IL-10 (SEQ ID NO: 145) em jejuno de rato. A localização do veículo de Cholix é mostrada por fluorescência verde, a localização do receptor ERGIC é mostrada por fluorescência vermelha, a localização do receptor de entrada apical (por exemplo, TMEM132) é mostrada por fluorescência laranja; e a localização dos receptores de evasão de lisossomo é mostrada por fluorescência púrpura; desta forma, a interação do veículo de Cholix e receptor ERGIC é mostrada por fluorescência amarela, a interação do veículo de Cholix e receptor de evasão de lisossomo é mostrada por fluorescência rosa e a interação e/ou localização conjunta do veículo de Cholix, receptor de entrada apical e receptor de evasão de lisossomo é mostrada por pontos brancos (sobreposição de fluorescência verde, vermelha e púrpura). A marcação com DAPI é indicada por fluorescência azul.
[0152] A FIG. 23G mostra a localização do veículo de Cholix (SEQ ID NO: 135) em uma célula epitelial intestinal polarizada 5 minutos após a injeção luminal do construto de aplicação (SEQ ID NO: 149). Os dados mostram que, após a endocitose apical mediada por receptor, o veículo de Cholix forma complexos com um receptor de evasão de lisossomo e receptor de entrada apical próximos à membrana apical (indicada por pontos brancos (sobreposição de fluorescência verde, vermelha e púrpura) e destacada pela seta branca) e também inicia a interação com o receptor ERGIC como demonstrado por fluorescência amarela (e a seta amarela) ligeiramente mais próxima às regiões supranucleares dentro da célula.
[0153] A FIG. 23H mostra a localização do veículo de Cholix (SEQ ID NO: 135) em uma célula epitelial intestinal polarizada 15 minutos após a injeção luminal do construto de aplicação (SEQ ID NO: 149). Os dados mostram que o veículo se deslocou dos compartimentos apicais para os supranucleares enquanto associado com ERGIC (ver a seta amarela), onde a intensidade da fluorescência amarela é maior em comparação a de 5 minutos após a injeção, indicando um deslocamento aumentado do veículo de Cholix das regiões apicais para as supranucleares no tempo. Os dados mostram adicionalmente a localização do veículo de Cholix na membrana basal e na lamina propria (setas douradas).
[0154] A FIG. 24 mostra um diagrama dos elementos intracelulares do compartimento (por exemplo, regiões celulares, compartimentos e receptores tais como interação de transporte de parceiros receptores (ou TRIPs) de veículos) envolvidos na transcitose apical para basal dos veículos descritos aqui. O processo de transcitose é esquematicamente descrito em um curso de tempo de 15 minutos. Por exemplo, os veículos derivados de Cholix capazes de transcitose podem ou não entrar em lisossomos ou rota(s) de reciclagem apical após endocitose (por exemplo, como mostrado por endossomos de reciclagem ou “RE”). A redistribuição de COPI e LMAN1, mas não de SEC22b, após a aplicação apical de um veículo derivado de Cholix, bem como o acesso a rota(s) de reciclagem do compartimento basal são mostrados como características de rota dos veículos derivados de Cholix. Desta forma, os veículos derivados de Cholix descritos aqui podem utilizar uma série de compartimentos vesiculares intracelulares para o tráfico através de células epiteliais intestinais polarizada que podem culminar em transcitose apical para basal e permitir que tais veículos transportem a carga útil rapidamente e eficientemente (por exemplo, pelo menos 5%, 10%, 20%, 25% ou 50% do material aplicado à superfície apical) (por exemplo, proteínas terapêuticas) para dentro da lamina propria.
[0155] A FIG. 25 mostra que tanto um veículo derivado de Cholix386 (por exemplo, SEQ ID NOs: 135 ou 180) quanto um veículo derivado de Cholix415 (por exemplo, compreendendo os resíduos 1-415 da SEQ ID NO: 1) transportam um agente anti-TNFα (por exemplo, um anticorpo anti-TNFα ou fragmento funcional deste) através de células epiteliais intestinais em 10 minutos e em 40 minutos. Além disto, um construto de Cholix386-anti-TNFα transporta a cerca de 12x a taxa de anti-TNF-α separadamente e um Cholix415-anti-TNFα transporta a ~7x a taxa de anti-TNF-α separadamente.
[0156] A FIG. 26 mostra a pureza da SEQ ID NO: 192-Exenatídeo (SEQ ID NO: 192 reticulada com Exenatídeo (SEQ ID NO: 195)) rodada em um gel de SDS-PAGE marcado com Azul de Coomassie.
[0157] A FIG. 27 mostra a transcitose in vivo de Exenatídeo reticulada com veículos SEQ ID NO: 191 ou SEQ ID NO: 192 através do jejuno de ratos Sprague Dawley. A quantidade (em pM) de Exenatídeo transportada através de tecidos intestinais foi medida a 10 minutos e 40 minutos após o tratamento. Os dados mostram que tanto a SEQ ID NO: 191-Exenatídeo quanto a SEQ ID NO: 192- Exenatídeo são capazes de transportar uma taxa mais alta do que a Exenatídeo separadamente a 10 minutos e a 40 minutos.
[0158] A FIG. 28A mostra que o comprimento dos espaçadores de aminoácido com SEQ ID NOs: 175, 196 e 197 não impactou na habilidade da IL- 22 (SEQ ID NO: 142) quando incluída nos construtos de aplicação com SEQ ID NOs: 147, 198 e 199 para induzir a dimerização do receptor de IL-22. A indução da dimerização do receptor de IL-22 humana recombinante de controle (rhIL-22, SEQ ID NO: 143) é mostrada pela curva preta.
[0159] A FIG. 28B mostra que o acoplamento da carga útil de IL-22 (SEQ ID NO: 142) ao terminal N ou ao terminal C de um veículo compreendendo os resíduos de aminoácido 1-266 da SEQ ID NO: 1 por meio do espaçador com SEQ ID NO: 196 não altera significativamente a habilidade dos construtos de aplicação com SEQ ID NOs: 198, 200 e 201 em induzir a dimerização do receptor de IL-
22. A indução da dimerização do receptor de IL-22 humana recombinante de controle (rhIL-22) é mostrada pela curva preta.
[0160] A FIG. 28C mostra que o comprimento dos espaçadores de aminoácido com SEQ ID NOs: 175, 196 e 197 não impactou na habilidade da IL- 22 (SEQ ID NO: 142) quando incluída nos construtos de aplicação com SEQ ID NOs: 147, 198 e 199 em induzir a ativação de pSTAT3. A ativação de pSTAT3 de IL-22 humana recombinante de controle (rhIL-22, SEQ ID NO: 143) é mostrada pelas curvas pretas.
[0161] A FIG. 28D mostra que o acoplamento da carga útil de IL-22 (SEQ ID NO: 142) ao terminal N ou ao terminal C de um veículo compreendendo os resíduos de aminoácido 1-266 da SEQ ID NO: 1 por meio do espaçador com SEQ ID NO: 196 não alterou significativamente a habilidade dos construtos de aplicação com SEQ ID NOs: 198, 200 e 201 em induzir a ativação de pSTAT3. A ativação de pSTAT3 da IL-22 humana recombinante de controle (rhIL-22) é mostrada pelas curvas pretas.
DESCRIÇÃO DETALHADA I. Introdução
[0162] São providos aqui, em certas realizações, construtos de aplicação (por exemplo, complexo veículo-carga útil) capazes de transportar uma ou mais moléculas de carga útil heterólogas (por exemplo, um ou mais carga produtos terapêuticos úteis) para dentro de células epiteliais (por exemplo, células epiteliais intestinais polarizadas), por exemplo, por endocitose ou através de células epiteliais (por exemplo, células epiteliais intestinais polarizadas), por exemplo, por transcitose. Os construtos de aplicação podem compreender um veículo que é acoplado à carga útil heteróloga. O veículo pode ser capaz de transportar a carga útil heteróloga para dentro ou através de células epiteliais pela utilização de rotas de tráfico endógenas. A utilização de rotas de tráfico endógenas, em oposição ao uso de difusão, pode permitir que o veículo transporte a carga útil heteróloga rapidamente (por exemplo, pelo menos 10-6 cm/s, 10-5 cm/s) e eficientemente (por exemplo, pelo menos 5%, 10%, 20%, 25% ou 50% do material aplicado à superfície apical) para dentro ou através de células epiteliais sem impedir a função de barreira destas células ou a atividade biológica da carga útil heteróloga. II. Veículos
[0163] A parte do veículo de um construto de aplicação provido aqui pode ser qualquer molécula (por exemplo, molécula pequena, polipeptídeo, ácido nucleico etc.) capaz de aumentar a taxa e/ou quantidade de uma carga útil heteróloga (por exemplo, uma carga útil terapêutica) aplicada no e/ou através de um epitélio.
[0164] Um veículo aqui pode apresentar numeroso atributos. Em algumas realizações, um veículo aqui pode apresentar uma atividade de ribosilação de ADP (por exemplo, ribosilação do fator de alongamento 2) reduzida (por exemplo, pelo menos 50% reduzida) ou eliminada em relação ao polipeptídeo de Cholix de ocorrência natural tal como a SEQ ID NO: 3.
[0165] Em algumas realizações, a veículo aqui utiliza uma rota de tráfico endógena para transportar uma carga útil heteróloga acoplada a ele através de uma célula epitelial polarizada. Tal veículo pode ser referido aqui como um veículo de transcitose. Em alguns casos, um veículo aqui pode utilizar uma rota de tráfico endógena para transportar uma carga útil heteróloga acoplada a ele para dentro de uma célula epitelial polarizada. Tal veículo pode ser referido aqui como um veículo de endocitose. Dentro de veículos de endocitose, podem haver veículos que liberam uma carga útil a eles acoplada para regiões específicas dentro de células epiteliais polarizadas tal como um compartimento apical, um compartimento supranuclear ou um compartimento basal.
[0166] Qualquer um dos veículos que pode transportar moléculas acopladas a ele por interação e/ou localização conjunta com uma ou mais proteínas endógenas de tal epitélio. A uma ou mais proteínas endógenas podem ser receptores ou enzimas capazes de deslocar um a veículo para dentro ou através da célula epitelial. A interação e/ou localização conjunta com uma ou mais proteínas endógenas da célula epitelial podem prover um veículo com uma ou mais funções, incluindo endocitose para uma célula epitelial, evitar uma rota de destruição lisossômica, tráfico de um compartimento apical para um compartimento basal, e/ou exocitose da membrana basal da célula epitelial para um compartimento submucoso tal como a lamina propria.
[0167] Uma interação de tal veículo com uma proteína endógena pode ser uma interação seletiva. Tal interação seletiva pode ser uma interação dependente de pH. Em casos em que um veículo interage com duas ou mais proteínas endógenas, tais interações podem ser interações sequenciais em que uma primeira proteína de interação passa o veículo para uma segunda proteína de interação.
Tais interações sequenciais podem ocorrer a um pH diferente (por exemplo, pH 5,5, 7,0, 7,5 etc.). Uma interação entre um veículo e uma proteína endógena pode ser uma interação covalente ou não covalente. As interações não covalentes incluem ligação de hidrogênio, interações de van der Waals, ligações iônicas, interações π-π etc.
[0168] Em alguns casos, uma das proteínas endógenas com a qual um veículo pode interagir pode ser um receptor de entrada apical. Tal receptor de entrada apical pode ser uma proteína de transmembrana 132 (TMEM132). A interação de um veículo com tal receptor de entrada apical pode possibilitar que o veículo entre na célula epitelial por meio de endocitose mediada por receptor.
[0169] Um veículo pode interagir também com um receptor de evasão de lisossomo. Tal interação com um receptor de evasão de lisossomo pode ocorrer no interior da célula epitelial e subsequente à endocitose. Um receptor de evasão de lisossomo pode ser uma proteína regulada por glicose 75 (GRP75, por exemplo, GRP75B). A interação de um veículo com tal receptor de evasão de lisossomo pode possibilitar que o veículo evite ou contorne a degradação lisossômica. Tal habilidade pode permitir que um veículo reduza significativamente a quantidade de carga útil acoplada ao veículo que alcança um lisossomo de uma célula, um destino que a maioria das proteínas terapêuticas têm uma vez absorvidas pelo epitélio intestinal.
[0170] Além disto, um veículo pode interagir com uma proteína de tráfico apical para basal. Tal interação pode ocorrer no interior da célula epitelial e subsequente à endocitose. Tal proteína de tráfico apical para basal pode ser uma proteína do retículo endoplasmático do compartimento intermediário de Golgi (ERGIC), tal como ERGIC-53. A interação de um veículo com uma proteína de ERGIC pode possibilitar que o veículo se desloque de um compartimento apical para um compartimento supranuclear ou um compartimento basal.
[0171] Um veículo de transcitose pode interagir também com uma proteína de liberação basal capaz de promover a exocitose de um veículo de um local basal site de uma célula epitelial. Tal interação pode ocorrer no lado basal de uma célula epitelial w subsequente ao deslocamento de um compartimento apical para um compartimento basal. Tal proteína de liberação basal pode ser perlecan (também chamada aqui de proteína de núcleo de proteoglicana de sulfato de heparina específica de membrana de base ou HSPG). A interação de um veículo com perlecan pode possibilitar que o veículo acesse um sistema de reciclagem basal que permite a liberação do veículo do compartimento basal para um compartimento submucoso tal como a lamina propria.
[0172] Desta forma, um veículo de transcitose aqui pode ser uma molécula que é capaz de interação com as proteínas endógenas TMEM132 (por exemplo, TMEM132A), GRP75 (por exemplo, GRP75B), ERGIC (por exemplo, ERGIC- 53) e perlecan (HSPG), possibilitando que tal veículo transporte uma molécula de carga útil acoplada através de um epitélio polarizado, por exemplo, um epitélio de intestino polarizado.
[0173] Um veículo de endocitose aqui pode ser uma molécula que é capaz de interação com a proteína endógena TMEM132, permitindo a entrada apical de tal veículo. Um veículo de endocitose pode permanecer associado com a TMEM132 após a endocitose (por exemplo, em comparação com um veículo de transcitose que pode estar dissociado da TMEM132 após a endocitose de maneira a interagir, por exemplo, com GRP75 ou uma proteína de ERGIC) e dentro de regiões e compartimentos apicais da célula (por exemplo, uma célula epitelial polarizada). Em alguns casos, tal veículo de endocitose pode interagir também com GRP75. Tais interações com TMEM132 e/ou GRP75 podem permitir que o veículo e uma carga útil acoplada a este evitem ou pelo menos reduzam significativamente (por exemplo, para menos de cerca de 50% em comparação com a molécula de carga útil quando não está acoplada ao veículo), a degradação lisossômica. Em alguns casos, um veículo de endocitose pode permanecer em um compartimento apical e não mostrar translocação significativa para um compartimento basal, para, por exemplo, pelo menos cerca de 5, 10, 15, 30, 60 ou 120 minutos após a aplicação apical (por exemplo, luminal) do veículo em comparação com um veículo de transcitose que pode mostrar transcitose completa de aproximadamente todas as moléculas aplicadas de forma apical, por exemplo, cerca de 5, 10, 15 ou 30 minutos após a aplicação apical (por exemplo, luminal). Em alguns casos, pelo menos cerca de 50%, 75% ou 90% das moléculas de veículo permanecem em compartimentos apicais 5 minutos após a aplicação luminal do veículo. Em alguns casos, pelo menos cerca de 50%, 75% ou 90% das moléculas do veículo permanecem em compartimentos apicais 10 minutos após a aplicação luminal do veículo. Em alguns casos, pelo menos cerca de 50%, 75% ou 90% das moléculas do veículo permanecem em compartimentos apicais 15 minutos após a aplicação luminal do veículo. Em alguns casos, pelo menos cerca de 50%, 75% ou 90% das moléculas do veículo permanecem em compartimentos apicais 30 minutos após a aplicação luminal do veículo. A percentagem de moléculas do veículo que permanecem no compartimento apical da célula epitelial pode ser determinada pela divisão da intensidade do sinal de fluorescência medido em um compartimento basal da célula pela intensidade do sinal de fluorescência medido no compartimento apical da célula no respectivo ponto no tempo.
[0174] Em outros casos, um veículo de endocitose que é capaz de transportar uma carga útil para um compartimento supranuclear ou basal pode interagir com uma proteína de ERGIC e/ou um outro complexo de proteína de tráfico ER-Golgi que possa permitir que o veículo acesse tal compartimentos no interior de uma célula epitelial.
[0175] Um veículo de endocitose ou transcitose pode ser um polipeptídeo. Tal veículo pode ser derivado de um polipeptídeo secretado por uma bactéria, tal como Vibrio cholerae (aqui um polipeptídeo derivado de Cholix). Um veículo pode ser um polipeptídeo quimérico derivado de dois ou mais polipeptídeos bacterianos diferentes. Tais dois ou mais polipeptídeos bacterianos diferentes podem ser derivados de duas ou mais bactérias diferentes (por exemplo, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa etc.), e/ou derivados de duas ou mais cepas diferentes de uma bactéria (por exemplo, duas ou mais cepas diferentes de Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa etc.).
[0176] Um veículo pode ser um polipeptídeo de ocorrência natural ou não natural de um polipeptídeo secretado por tal bactéria.
[0177] Os polipeptídeos de ocorrência não natural incluem aqueles apresentando uma modificação no terminal C e/ou no terminal N.
[0178] Em um exemplo, um polipeptídeo compreende uma ou mais substituições de aminoácido e/ou uma ou mais deleções de aminoácido e/ou uma ou mais adições de aminoácido em relação a um alinhamento de sequência com um polipeptídeo de ocorrência natural (por exemplo, a SEQ ID NO: 3) ou em relação a um alinhamento de sequência com uma sequência consensus (por exemplo, a SEQ ID NO: 130).
[0179] Exemplos de substituições contempladas aqui incluem substituições conservativas de um ou mais aminoácidos. Os seguintes seis grupos cada um contém aminoácidos que são substituições conservativas para um outro: (1) Alanina (A), Serina (S) e Treonina (T); (2) Ácido aspártico (D) e Ácido glutâmico (E); (3) Asparagina (N) e Glutamina (Q); (4) Arginina (R) e Lisina (K); (5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M) e Valina (V) e (6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y) e Triptofano (W).
[0180] Adicionalmente ou alternativamente, as mutações em um veículo contempladas aqui incluem um ou mais de: V1L, L1V, D3E, E4A, E581A etc., por exemplo, em relação às sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2 ou 130 (um número designa a posição do aminoácido, uma letra antes do número designa o aminoácido modificado e uma letra após o número designa o aminoácido substituído). Em alguns casos, um veículo compreende uma valina na posição 1, uma leucina na posição 1, um ácido aspártico na posição 3, um ácido glutâmico na posição 3, um ácido glutâmico na posição 4 ou uma alanina na posição 4 no veículo (numeração em relação às posições na SEQ ID NO: 1).
[0181] Exemplos de deleções incluem truncamentos no terminal N e truncamentos no terminal C.
[0182] Tal como utilizado aqui, quando um truncamento no terminal C é referido como ocorrendo “em” uma posição de aminoácido, tal aminoácido é incluído no polipeptídeo truncado. Quando um truncamento no terminal N é referido como ocorrendo “em” uma posição de aminoácido, tal aminoácido é excluído do polipeptídeo truncado. Por exemplo, em um caso, o veículo compreende a SEQ ID NO: 1 com um truncamento no terminal C na posição 386. Tal veículo termina no aminoácido 386 (A) da SEQ ID NO: 1 em sue terminal C. Adicionalmente, o veículo acima pode ser adicionalmente truncado na posição 20 em seu terminal N, desta forma, apresentando um aminoácido no terminal N de prolina (P) (que é a posição 21 na sequência de referência SEQ ID NO: 1).
[0183] Os truncamentos no terminal N incluem aqueles que removem até 10, 20, 30, 39 ou 40 aminoácidos no terminal N de uma sequência de Cholix aqui (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-3 ou 130). Os truncamentos no terminal C podem ser aqueles descritos aqui. Tais truncamentos no terminal N ou C podem resultar em funções diferentes. Os truncamentos podem ser descritos em relação à sequência do tipo selvagem (por exemplo, a SEQ ID NO: 3), em relação a uma sequência de ocorrência não natural (por exemplo, a SEQ ID NO: 1) ou em relação a uma sequência consensus (por exemplo, a SEQ ID NO: 130), onde os resíduos são numerados a partir do terminal N para o terminal C, iniciando com a posição 1 do terminal N. Por exemplo, um veículo com um truncamento no terminal C na posição 266 em relação à SEQ ID NO: 1 compreende os resíduos de aminoácido 1-266 da SEQ ID NO: 1.
[0184] Exemplos de adições incluem: uma sequência de peptídeos sinalizadora, uma sequência de peptídeos de purificação ou outras modificação no terminal N. Uma sequência de peptídeos sinalizadora pode compreender de 1 a cerca de 40 aminoácidos. Em alguns casos, um veículo compreende uma metionina no terminal N. O termo “cerca de”, tal como utilizado aqui no contexto de um valor numérico ou faixa numérica, refere-se genericamente a ±10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% do valor ou faixa numérica indicada ou reivindicada, a não ser que de outra forma especificada.
[0185] Um veículo pode apresentar uma identidade de sequência substancial (por exemplo, cerca de ou maior que 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou
99% de identidade de sequência ou 100% de identidade de sequência) com um polipeptídeo de ocorrência natural (por exemplo, a SEQ ID NO: 3), um polipeptídeo de ocorrência não natural (por exemplo, a SEQ ID NOs: 1-2) ou com qualquer um dos fragmentos funcionais descritos aqui (por exemplo, as SEQ ID NOs: 160-168).
[0186] O termo “identidade de sequência” ou uma percentagem (%) de identidade de sequência, tal como utilizado aqui é o percentual de resíduos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos e uma sequência selecionada, após o alinhamento das sequências e introdução de espaços vazios, se necessário, para se obter a identidade de sequência percentual máxima, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. O alinhamento para propósitos de determinação da identidade percentual de sequência de aminoácidos pode ser obtido de várias formas que estão dentro do conhecimento de um técnico no assunto, por exemplo, utilizando software de computador publicamente disponível tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar os parâmetros apropriados para a medição de alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para se obter um alinhamento máximo pelo comprimento total das sequências sendo comparadas.
[0187] Um veículo (por exemplo, um veículo de endocitose ou de transcitose) aqui pode ser derivado de um polipeptídeo secretado por uma bactéria Vibrio cholerae (por exemplo, aqueles compreendendo uma sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 3-125 ou 127-129). Tal veículo pode ser referido como um polipeptídeo derivado de Cholix. Um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix pode incluir sequências de polipeptídeo de Cholix de ocorrência natural ou não natural, bem como as sequências eu apresentam pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com um polipeptídeo de Cholix de ocorrência natural (por exemplo, a SEQ ID NO: 3-78) ou não natural (por exemplo, a SEQ ID NO: 1-2) descrito aqui. Um veículo de polipeptídeo de derivado de Cholix pode incluir também fragmentos de endocitose e/ou transcitose (por exemplo, com truncamentos no terminal N ou no terminal C do polipeptídeo de Cholix) de sequências de polipeptídeo de Cholix de ocorrência natural e não natural, onde tais fragmentos de endocitose e/ou transcitose podem apresentar pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências de polipeptídeo de Cholix de ocorrência natural ou não natural.
[0188] TABELA 1 provê comprimento total de sequências de Cholix e derivadas de Cholix exemplificativas.
TABELA 1 – Sequências de Polipeptídeo de Cholix Exemplificativas SEQ ID NO Sequência de aminoácidos Descrição SEQ ID NO: VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 1 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL não natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPM DAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTP KVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALA AHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQ AQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEP EVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQI YNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFC PDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPE NRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREG YVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNN TENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGT GEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERF YRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTG PESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNA
YEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: LEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 2 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL não natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPM DAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTP KVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALA AHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQ AQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEP EVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQI YNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFC PDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPE NRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREG YVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNN TENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGT GEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERF YRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTG PESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNA
YEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 3 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPM DAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTP KVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALA AHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQ AQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEP EVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQI YNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFC PDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPE NRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREG YVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNN TENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGT GEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERF YRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTG PESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNA
YEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 4 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFAVTRPEQSIAKQSIAKQSI AISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTG LALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGG SYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSK KNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDL PDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVF TLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVT QVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGA QAADILSLFCPDADKPCVASNNDQANINVE SRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEA THQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNR IAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAH GYARIKEGTGEYGLPTRAEREARGVMLRV YIPRASLERFYRTNTPLENAERHITQVIGHSL PLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAV AIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPP
YKEQKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 5 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIMDEGKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFAVTRPEQSIAKQSIAISWPS VSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWL VPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVA GTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAME ALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSC AYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDE QEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVA RQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILS LFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYL PENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTRE GYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGN NTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEG TGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLER FYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFT GPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGN AYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDEL
K SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 6 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKPCVASNNDQANINIESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGY VFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTE NEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGE YGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYR TNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPE SAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAY ERLTPAEEAVVKEAIAKEQSISAKPPYKEQK
DELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 7 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKPCVASNNDQANINIESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGY VFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTE NEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGE YGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYR TNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPE SAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAY ERLTPAEEAVVKEAIAKEQSISAKPPYKEQK
DELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKQIQSKLSIP Polipeptídeo 8 SDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKG de Cholix ESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDI de TTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDS ocorrência PASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQT natural
LEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSY KAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPI DAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTP KAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALA AHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCVYQ AQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEP EVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQI YNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFC PDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPE NRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREG YVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNN TENEKKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGT GEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERF YRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTG PESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNA
YEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 9 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPM DAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTP KVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALA AHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQ AQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEP EVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQI YNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFC PDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPE NRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREG YVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNN TENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGT GEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERF YRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTG PESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNA
YEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 10 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPM DAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTP KVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALA AHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQ AQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEP EVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQI YNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFC PDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPE NRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREG YVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNN TENEEKWGGLYVSTHAEVAHGYARIKEGT GEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERF YRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTG PESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNA
YEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 11 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCVYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGY VFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTE NEKKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTG EYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFY RTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGP ESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNA
YEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 12 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKPCVASNNDQANINIESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGY VFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTE NEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGE YGLPTRAERDARGVMLRVYIHRASLERFYR TNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPE SAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAY
EELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 13 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPA VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKSCVASDNDQANINIESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGY VFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTE NEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGE YGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYR TNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPE SAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAY
EELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 14 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLIPEQTSAGAQAADILSLFCPD ADKPCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENR AVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYV FVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTEN EEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEY GLPTRAEREARGVMLRVYIPRASLERFYRT NTPLENAERHITQVIGHSLPLRNEAFTGPES AGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYE
ELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 15 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLIPEQTSAGAQAADILSLFCPD ADKPCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENR AVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYV FVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTEN EEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEY GLPTRAEREARGVMLRVYIPRASLERFYRT NTPLENAERHITQVIGHSLPLRNEAFTGPES AGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYE
ELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 16 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQA QNIVSLFVATRMLFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLIPEQTSAGAQAADILSLFCPD ADKPCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENR AVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYV FVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTEN EEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEY GLPTRAEREARGVMLRVYIPRASLERFYRT NTPLENAERHITQVIGHSLPLRNEAFTGPES AGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYE
ELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 17 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGY VFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTE NEEKWGGLYVATHAEVAHGYARLKKGTG NAELPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFY RTNTPLENAEEHITHVIGHSLPLRNEAFTGP ERVDGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNA
YEVLAIDEEAVAEEQSISAKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 18 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVFFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VTERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKPCVASNNDQANINIESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGY VFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTE NEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGE YGLPTRAERDARGVMLRVYIHRASLERFYR TNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPE SAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAY
EELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 19 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPA VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGY VFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTE NEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGE YGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYR TNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPE SAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAY
EELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 20 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPA VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKSCVALNNDQANINIESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGY VFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTE NEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGE YGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYR TNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPE SAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAY EELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKERKDELK
SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 21 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQAPE VAERLSALRQINENNPGVVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGY VFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTE NEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTG NGGLPTRAERETRGVMLRVYIPRASLERFY RTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGP ESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNA YEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDEL
K SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 22 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCVYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLEEQEPEV AERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYN DYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPD ADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENR AVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYV FVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTEN EEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGN GGLPTRAERETRGVMLRVYIPRASLERFYR TNTPLENAEEHITDVIGHSLPLRNEAFTGPE SAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAY EELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK
SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 23 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AIMVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRYLPDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGY VFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTE NEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGE YGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYR TNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPE RVDGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAY
EELAIDEEAVAKEQSISPKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 24 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKDGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPA VAERLSAIRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKSCVASDNDQANINIESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGY VFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTE NEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGE YGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYR TNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPE SAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAY
EELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 25 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix
SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKDGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKHCVASNNDQANINVESRSGRSYLPE NRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREG YVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNN TENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGT GEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERF YRTNTPLENAERHITQVIGHSLPLRNEAFTG PESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNA
YEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 26 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWRTGLALCWLVPM DAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTP KVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALA AHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQ AQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLEEQEPE VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGY VFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTE NEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGE YGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYR TNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPE SAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAY
EELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 27 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDIT de
TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP
ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL ocorrência EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK natural
AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPM DAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTP KVITVKQGIEQKPVEQRIHFSNGNAMSALA AHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQ AQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEP EVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQI YNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFC PDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPE NRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREG YVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNN TENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGT GEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERF YRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTG PESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNA
YEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 28 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPM DAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTP KVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALA AHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQ AQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEP EVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQI YNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFC PDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLLE NRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREG YVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNN TENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGT GEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERF YRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTG PESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNA
YEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 29 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPM DAIYNYITQKNCTLGDNWFGGSYETVAGTP KVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALA AHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQ AQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEP EVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQI YNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFC PDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPE NRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREG YVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNN TENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGT GEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERF YRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTG PESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNA YEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDEL
K SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 30 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGY VFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTE NEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGE YGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYR TNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPE SAGGEDETVIGWDMAIYAVAIPSTIPGNAY
EELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 31 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPA VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKPCVASNNDQANINVESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGY VFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTE NEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGE YGLPTRAEREARGVMLRVYIPRASLERFYR TNTPLENAERHITQVIGHSLPLRNEAFTGPE SAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAY
EELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 32 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPM DAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTP KVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALA AHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQ AQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEP EVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQI YNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFC PDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPE NRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREG YVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNN TENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGT GEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERF YRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTG PESAGGEDETVIGWDMAIYAVAIPSTIPGNA YEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDEL
K SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 33 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPM DAIYNYITQKNCTLGDNWFGGSYETVAGTP KVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALA AHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQ AQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEP EVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQI YNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFC PDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPE NRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREG YVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNN TENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGT GEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERF YRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTG PESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNA
YEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 34 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCVYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLEEQEPEV AERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYN DYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPD ADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENR AVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYV FVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTEN EEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEY GLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRT NTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPER VDGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYE
ELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 35 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKPCVASNNDQANINIESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGY VFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTE NEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTG NGGLPTRAERETRGVMLRVYIPRASLERFY RTNTPLENAEEHITDVIGHSLPLRNEAFTGP ESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNA YEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDEL
K SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 36 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAIHWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCVYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLEEQEPEV AERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYN DYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPD ADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENR AVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYV FVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTEN EEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEY GLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRT NTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPES AGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYE
ELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 37 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATIRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPM DAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTP KVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALA AHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQ AQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEP EVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQI YNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFC PDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPE NRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREG YVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNN TENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGT GEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERF YRTNTPLENAERHITQVIGHSLPLRNEAFTG PESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNA YEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDEL
K SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 38 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITFGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDI de TTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDS ocorrência PASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQT natural
LEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSY KAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVP MDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAG TPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSA LAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCA YQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQ EPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVAR QIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSL FCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLP ENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTRE GYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGN NTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEG TGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLER FYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFT GPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGN AYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDEL
K SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIP Polipeptídeo 39 GDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKG de Cholix ESIITIGEFATVRATRHYVSQDAPFGVINLDI de TTENGTKTYSFNRKESEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLE natural
QWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKA AQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAI YNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAI TVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHR VCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYNAQQ IVSLFLATRILFTHIDSIFTLNLDGQEPEVAE RLDDLRRINENNPGMVIQVLTVARQIYNDY VTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDAD KSCVASNSDQANINIESRSGRSYLPENRAVI TQQGVTNWTYQELEATHQALTQEGYVFVG YHGTNHVAAQSIVNRISPVPRGSDTESERA WGGLYVSTDASVAYGYARIQEGTADGGGL TPAERKARGVMLRVYLPQASLERFYRINAD LEKERNLVERVIGHPLPLRNEAFTGTDAEE GSDETAIGWDMAIHGVAIPSTIPGNSYAQLP
IDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPELGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 40 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKPCVASNNDQANINIESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGY VFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTE NEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGE YGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYR TNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPE SAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAY
EELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPELGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 41 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPA VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKSCVASDNDQANINIESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGY VFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTE NEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGE YGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYR TNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPE SAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAY
EELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPELGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 42 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKPCVASNNDQANINIESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGY VFVGYHGTNHVAAQNIVNRIAPVPRGNNT ENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTG EYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFY RTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGP ESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNA
YEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPELGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 43 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKPCVASNNDQANINIESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGY VFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTE NEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGE YGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYR TNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPE SAGGEDETVIGWDIAIHAVAIPSTIPGNAYE
ELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPELGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 44 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKPCVASNNDQANINVESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGY VFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTE NEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGE YGLPTRAEREARGVMLRVYIPRASLERFYR TNTPLENAERHITQVIGHSLPLRNEAFTGPE SAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAY
EELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPELGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 45 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMETLAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKPCVASNNDQANINVESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGY VFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTE NEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGE YGLPTRAEREARGVMLRVYIPRASLERFYR TNTPLENAERHITQVIGHSLPLRNEAFTGPE SAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAY
EELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPELGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 46 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKPCVASNNDQANINVESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGY VFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTE NEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGE YGLPTRAEREARGVMLRVYIPRASLERFYR TNTPLENAERHITQVIGHSLPLRNEAFTGPE SAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAY
EELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPELGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 47 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMETLAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKPCVASNNDQANINVESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGY VFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTE NEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGE YGLPTRAEREARGVMLRVYIPRASLERFYR TNTPLENAERHITQVIGHSLPLRNEAFTGPE SAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAY
EELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCLLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 48 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYK AAHKNGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKPCVASNNDQANINVESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGY VFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTE NEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGE YGLPTRAEREARGVMLRVYIPRASLERFYR TNTPLENAERHITQVIGHSLPLRNEAFTGPE SAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAY
EELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPELGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 49 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVIPGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYK AAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPID AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMETLAA HRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQA QNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIY NDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADKPCVASNNDQANINVESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGY VFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTE NEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGE YGLPTRAEREARGVMLRVYIPRASLERFYR TNTPLENAERHITQVIGHSLPLRNEAFTGPE SAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAY EELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKERKDELK
SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 50 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVSQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSFNRKESEFAINWLVPIGEDSPA ocorrência SIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLE natural
QWETQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKA AHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYEDP AQCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQ GIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCG VPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVS LFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERL SALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYV THHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADK SCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVIT PQGVTNWTYQELEATHQALTREDYVFVGY HGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEK WGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLP TRAEQETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTP LENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGG EDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEGLTT
DEEAVVKEAIAKEQSISAKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 51 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYK AAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYED PAQCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVK QGIEQKTVEQRIHFSQKNAMEALAAHRVC GVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIV SLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAER LSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDY VTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDAD KSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVI TPQGVTNWTYQELEATHQALTREDYVFVG YHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEK WGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLP TRAEQETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTP LENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGG EDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEGLTT
DEEAVVKEAIAKEQSISAKPPYKEQKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 52 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix
SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDEIDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYK AAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYED PAQCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVK QGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVC GVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIV SLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAER LSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDY VTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDAD KSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVI TPQGVTNWTYQELEATHQALTREDYVFVG YHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEK WGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLP TRAEQETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTP LENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGG EDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEGLTT
DEEAVVKEAIAKEQSISAKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 53 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDEIDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYK AAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYED PAQCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVK QGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVC GVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIV SLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAER LSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDY VTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDAD KSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVI TPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVG YHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEK WGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLP TRAEQETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTP LENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGG EDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEGLTT
DEEAVVKEAIAKEQSISAKPPYKEQKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 54 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de
TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP
ASIKISVDEIDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL ocorrência EQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYK natural
AAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYED PAQCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVK QGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVC GVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIV SLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAER LSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDY VTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDAD KSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVI TPQGVTNWTYQELEATHQALTREDYVFVG YHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEK WGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLP TRAEQETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTP LENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGG EDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEGLTT
DEEAVVKEAIAKEQSISAKPPYKEQKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 55 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDEIDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYK AAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYED PAQCTYGDDWHGGAYKTVAGIPKAITVKQ GIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCG VPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVS LFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERL SALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYV THHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADK SCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVIT PQGVTNWTYQELEATHQALTREDYVFVGY HGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEK WGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLP TRAEQETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTP LENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGG EDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEGLTT
DEEAVVKEAIAKEQSISAKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 56 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDEIDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYK AAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYED PAQCTYGDDWHGGAYKTVAGIPKAITVKQ GIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCG VPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVS LFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERL SALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYV THHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADK SCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVIT PQGVTNWTYQELEATHQALTREDYVFVGY HGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEK WGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLP TRAEQETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTP LENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGG EDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEGLTT
DEEAVVKEAIAKEQSISAKPPYKEQKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIP Polipeptídeo 57 GDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKG de Cholix ESIITIGEFATVRATRHYVSQDAPFGVINLDI de TTENGTKTYSFNRKESEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLE natural
QWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKA AHKNGSRHKRWANWLTTLPEVVLCFFEDP ELCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQG IEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVP LETLARSRKPRDLPDDLSCAYNAQQIVSLFL ATRILFTHIDSIFTLNLDGQEPEVAERLDDLR RINENNPGMVIQVLTVARQIYNDYVTHHPG LTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVAS NSDQANINIESRSGRSYLPENRAVITQQGVT NWTYQELEATHQALTQEGYVFVGYHGTN HVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGL YVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAE QETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENA EEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDET VIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEGLTTDEE
AVVKEAIAKEQSISAKPPYKEQKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIP Polipeptídeo 58 GDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKG de Cholix ESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDI de TTENGTKTYSFNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLE natural
QWETQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKA AQKDGARHKRWAHWHTGLALCWLVPLD AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGMEQKPVEQRIHFSKKNAMEALA AHRVCGVPLETLARGRKPRDLTDDLQCAY QAQNIVSLFLATRILFSHLDSVFTLNLDEQE PEVAERLTDLRRINENNPGMVTQVLTIARQI YNDYVTEHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFC PDADESCVASNSDQANINIESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEAKHQTLTREGY VFVGYHGTNHVAAQSIVNRITPVPRGNNTE KEEEWGGVYVATHAELAHRYARIKEGTGE NGLPTTEEKKSRGVMLRVYLPRASLERFYR TNIPLENADEHVTQVIGHPLPLRNEAFTGPE SAGGEDETAIGWDMAIHGVAIPSTIPGNSY
AQLPIDEEAVAKEQSISAKPPYKEHDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIP Polipeptídeo 59 GDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKG de Cholix ESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDI de TTENGTKTYSFNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLE natural
QWETQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKA AQKDGARHKRWAHWHTGLALCWLVPLD AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGMEQKPVEQRIHFSKKNAMEALA AHRVCGVPLETLARGRKPRDLTDDLQCAY QAQNIVSLFLATRILFSHLDSVFTLNLDEQE PEVAERLTDLRRINENNPGMVTQVLTIARQI YNDYVTEHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFC PDADESCVASNSDQANINIESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEAKHQTLTREGY VFVGYHGTNHVAAQSIVNRITPVPRGNNTE KEEEWGGVYVATHAEVNHRYARIKEGTGE NGLPTTEEKKSRGVMLRVYLPRASLERFYR TNIPLENADEHVTQVIGHPLPLRNEAFTGPE SAGGEDETAIGWDMAIHGVAIPSTIPGNSY
AQLPIDEEAVAKEQSISAKPPYKEHDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIP Polipeptídeo 60 GDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKG de Cholix ESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDI de TTENGTKTYSFNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLE natural
QWETQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKA AQKDGARHKRWAHWHTGLALCWLVPLD AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGMEQKPVEQRIHFSKKNAMEALA AHRVCGVPLETLARGRKPRDLTDDLQCAY QAQNIVSLFLATRILFSHLDSVFTLNLDEQE PEVAERLTDLRRINENNPGMVTQVLTIARQI YNDYVTEHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFC PDADESCVASNSDQANINIESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEAKHQTLTREGY VFVGYHGTNHVAAQSIVNRITPVPRGNNTE KEEEWGGVYVATHAELAHRYARIKEGTGE NGLPTTEKKKSRGVMLKVYLPRASLERFYR TNIPLENADEHVTQVIGHPLPLRNEAFTGPE SAGGENETAIGWDMAIHGVAIPSTIPGNSY
AQLPIDEEAVAKEQSISAKPPYKEHDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPELGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 61 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDEIDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYK AAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYED PAQCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVK QGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVC GVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIV SLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAER LSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDY VTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDAD KSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVI TPQGVTNWTYQELEATHQALTREDYVFVG YHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEK WGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLP TRAEQETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTP LENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGG EDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEGLTT
DEEAVVKEAIAKEQSISAKPPYKEQKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 62 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVIPGEDSP ocorrência ASIKISVDEIDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYK AAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYED PAQCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVK QGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVC GVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIV SLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAER LSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDY VTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDAD KSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVI TPQGVTNWTYQELEATHQALTREDYVFVG YHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEK WGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLP TRAEQETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTP LENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGG EDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEGLTT
DEEAVVKEAIAKEQSISAKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIP Polipeptídeo 63 GDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKG de Cholix ESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDI de TTENGTKTYSFNRKEGEFAINWLVIPGEDSP ocorrência ASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLE natural
QWETQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKA AQKDGARHKRWAHWHTGLALCWLVPLD AIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK AITVKQGMEQKPVEQRIHFSKKNAMEALA AHRVCGVPLETLARGRKPRDLTDDLQCAY QAQNIVSLFLATRILFSHLDSVFTLNLDEQE PEVAERLTDLRRINENNPGMVTQVLTIARQI YNDYVTEHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFC PDADESCVASNSDQANINIESRSGRSYLPEN RAVITPQGVTNWTYQELEAKHQTLTREGY VFVGYHGTNHVAAQSIVNRITPVPRGNNTE KEEEWGGVYVATHAELAHRYARIKEGTGE NGLPTTEEKKSRGVMLRVYLPRASLERFYR TNIPLENADEHVTQVIGHPLPLRNEAFTGPE SAGGEDETAIGWDMAIHGVAIPSTIPGNSY
AQLPIDEEAVAKEQSISAKPPYKEHDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 64 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVSQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSFNRKESEFAINWLVPIGEDSPA ocorrência SIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLE natural
QWETQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKA AHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYEDP AQCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQ GIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCG VPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVS LFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERL SALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYV THHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADK SCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVIT PQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGY HGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEK WGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLP TRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTP LENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGG EDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAI
DEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 65 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVSQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSFNRKESEFAINWLVPIGEDSPA ocorrência SIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLE natural
QWETQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKA AHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYEDP AQCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQ GIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCG VPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVS LFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERL SALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYV THHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADK SCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVIT PQGVTNWTYQELEATHQALTREDYVFVGY HGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEK WGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLP TRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTP LENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGG EDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAI
DEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 66 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWKTQGNVSFSVTRPEQSIAISWPSVSYN AAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYED PAQCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVK QGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVC GVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIV SLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAER LSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDY VTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDAD KSCVASNNDQANINVESRSGRSYLPENRAV ITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFV GYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEE KWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYG LPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTN TPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESA GGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEE
LAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 67 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYK AAHKNGSRHKRWANWLTTLPKVVLCFYE DPELCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVK QGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVC GVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIV SLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAER LSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDY VTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDAD KSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVI TPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVG YHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEK WGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGNGGLP TRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTP LENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGG EDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAI
DEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 68 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDEIDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYK AAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYED PAQCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVK QGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVC GVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIV SLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAER LSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDY VTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDAD KSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVI TPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVG YHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEK WGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLP TRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTP LENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPERVDG EDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAI
DEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 69 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKMYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDEIDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYK AAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYED PAQCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVK QGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVC GVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIV SLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAER LSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDY VTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDAD KSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVI TPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVG YHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEK WGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLP TRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTP LENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPERVDG EDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAI
DEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 70 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQKRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYK AAHKNGSRHKRWANWLTTLPKVVLCFYE EPELCTYGEDWHGGAYKTVAGTPEAITVK QGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVC GVPLETLARSRKPRDLQDDLSCAYQAQNIV SLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPAVAER LSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDY VTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDAD KSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVI TPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVG YHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEK WGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLP TRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTP LENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGG EDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAI
DEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIP Polipeptídeo 71 GDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKG de Cholix ESIITIGEFATVRATRHYVSQDAPFGVINLDI de TTENGTKTYSFNRKESEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLE natural
QWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKA AHKNGSRHKRWANWLTTLPEVVLCFFEDP ELCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQG IEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVP LETLARSRKPRDLPDDLSCAYNAQQIVSLFL ATRILFTHIDSIFTLNLDGQEPEVAERLDDLR RINENNPGMVIQVLTVARQIYNDYVTHHPG LTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVAS NSDQANINIESRSGRSYLPENRAVITQQGVT NWTYQELEATHQALTQEGYVFVGYHGTN HVAAQSIVNRISPVPRGSDTESERAWGGLY VSTDASVAYGYARIQEGTADGGGLTPAER KARGVMLRVYLPQASLERFYRINADLEKER NLVERVIGHPLPLRNEAFTGTDAEEGSDET AIGWDMAIHGVAIPSTIPGNSYAQLPIDEEA
VAKEQSISAKPPYKEQKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIP Polipeptídeo 72 GDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKG de Cholix ESIITIGEFATVRATRHYVSQDAPFGVINLDI de TTENGTKTYSFNRKESEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLE natural
QWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKA AHKNGSRHKRWANWLTTLPEVVLCFFEDP ELCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQG IEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVP LETLARSRKPRDLPDDLSCAYNAQQIVSLFL ATRILFTHIDSIFTLNLDGQEPEVAERLDDLR RINENNPGMVIQVLTVARQIYNDYVTHHPL LTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVAS NSDQANINIESRSGRSYLPENRAVITQQGVT NWTYQELEATHQALTQEGYVFVGYHGTN HVAAQSIVNRISPVPRGSDTESERAWGGLY VSTDASVAYGYARIQEGTADGGGLTPAER KARGVMLRVYLPQASLERFYRINADLEKER NLVERVIGHPLPLRNEAFTGTDAEEGSDET AIGWDMAIHGVAIPSTIPGNSYAQLPIDEEA VAKEQSISAKPPYKEQKDELK
SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIP Polipeptídeo 73 GDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKG de Cholix ESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDI de TTENGTKTYSFNRKESEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLE natural
QWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKA AHKNGSRHKRWANWLTTLPEVVLCFFEDP ELCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQG IEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVP LETLARSRKPRDLPDDLSCAYNAQQIVSLFL ATRILFTHIDSIFTLNLDGQEPEVAERLDDLR RINENNPGMVIQVLTVARQIYNDYVTHHPG LTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVAS NSDQANINIESRSGRSYLPENRAVITQQGVT NWTYQELEATHQALTQEGYVFVGYHGTN HVAAQSIVNRISPVPRGSDTESERAWGGLY VSTDASVAYGYARIQEGTADGGGLTPAER KARGVMLRVYLPQASLERFYRINADLEKER NLVERVIGHPLPLRNEAFTGTDAEEGSDET AIGWDMAIHGVAIPSTIPGNSYAQLPIDEEA
VAKEQSISAKPPYKEQKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLFIP Polipeptídeo 74 GDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKG de Cholix ESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDI de TTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDS ocorrência PASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQT natural
LEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSY KAAHKNGSRHKRWANWLTTLPKVVLCFY EDPELCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITV KQGIEQKTVEQRIHFSKKNAIEALAAHRVC GVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIV SLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPAVAER LSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDY VTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDAD KSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVI TPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVG YHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEK WGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLP TRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTP LENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGG EDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAI
DEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPELGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 75 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix
SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDEIDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYK AAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYED PAQCTYGDDWYGGAYKTVAGTPKAITVK QGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVC GVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIV SLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAER LSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDY VTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDTD KSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVI TPQGVTNWTYQELEATHQALTREDYVFVG YHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEK WGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLP TRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTP LENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGG EDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAI
DEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: VEDELKIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 76 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYK AAHKNGSRHKRWANWLTTLPKVVLCFYE DPELCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVK QGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVC GVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIV SLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAER LSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDY VTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDAD KSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVI TPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVG YHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEK WGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLP TRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTP LENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGG EDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAI
DEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK SEQ ID NO: VEDELKIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 77 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de
TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP
ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL ocorrência EQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYK natural
AAHKNGSRHKRWANWLTTLPKVVLCFYE DPELCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVK QGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVC GVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIV SLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQAPEVAER LSDLRRINEDNPGMVTQVLTVARQIYNDYV THHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADK SCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVIT PQGVTNWTYQELETTHQALTREGYVFVGY HGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEK WGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLP TRAERETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTP LENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGG EDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAI
DEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK SEQ ID NO: VEDELKIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 78 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYK AAHKNGSRHKRWANWLTTLPKVVLCFYE DPELCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVK QGIEQKAVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVC GVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIV SLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAER LSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDY VTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDAD KSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVI TPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVG YHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEK WGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGNGGLP TRAERETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTP LENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGG EDETVIGWDMAIYAVAIPSTIPGNAYEELAI
DEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK SEQ ID NO: TPEPGKPIQSKLSIPGDVVLDEGVLYYSMTI Polipeptídeo 79 NDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHY de Cholix VSQDAPFGVINLDITTENGTKTYSFNRKESE de FAINWLVPIGEDSPASIKISIDELDQQRNIIEV ocorrência PKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPE natural
HNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWH TGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWF GGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHF SKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPR DLPDDLSCAYNAQQIVSLFLATRILFTHIDSI FTLNLDGQEPEVAERLDDLRRINENNPGMV IQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGA QAADILSLFCPDADKSCVASNSDQANINIES RSGRSYLPENRAVITQQGVTNWTYQELEAT HQALTQEGYVFVGYHGTNHVAAQSIVNRIS PVPRGSDTESERAWGGLYVSTDASVAYGY ARIQEGTADGGGLTPAERKARGVMLRVYL PQASLERFYRINADLEKERNLVERVIGHPLP LRNEAFTGTDAEEGSDETAIGWDMAIHGV AIPSTIPGNSYAQLPIDEEAVAKEQSISAKPP
YKEQKDELK SEQ ID NO: SIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDED Polipeptídeo 80 KGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIN de Cholix LDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGE de DSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDN ocorrência QTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSV natural
SYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLV PIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAG TPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEA LAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCA YQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQ EPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVAR QIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSL FCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLP ENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTRE GYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGN NTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEG TGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLER FYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFT GPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGN AYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDEL
K SEQ ID NO: MTINDEQNDIMDEGKGESIITIGEFATVRAT Polipeptídeo 81 RHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNR de Cholix KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ de RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSF ocorrência AVTRPEQSIAKQSIAISWPSVSYKAAQKEGS natural
RHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQ QNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGI EQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVP LETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLF VATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSA LRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTH HPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSC VASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQ GVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYH GTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKW GGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPT RAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPL ENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGE DETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAID
EEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 82 MTINDEQNDIMDEGKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFTINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSF natural
AVTRPEQSIAKQSIAISWPSVSYKAAQKEGS RHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQ QNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGI EQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVP LETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLF VATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSD LRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTH HPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSC VASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQ GVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYH GTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKW GGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPT RAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPL ENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGE
DETIIGWDMAIHAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 83 MTINDEQNDIMDEGKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSF natural
AVTRPEQSIAKQSIAISWPSVSYKAAQKEGS RHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYIT QQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQ GIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCG VPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVS LFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERL SALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYV THHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADK SCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVIT PQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGY HGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEK WGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLP TRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTP LENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGG
EDETVIGWDMAIHAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 84 MTINDEQNDIMDEGKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSF natural
AVTRPEQSIAKQSIAISWPSVSYKAAQKEGS RHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQ QNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGI EQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVP LETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLF VATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSA LRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTH HPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSC VASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQ GVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYH GTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKW GGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPT RAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPL ENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGE
DETVIGWDMAIHAVAIPS SEQ ID NO: MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT Polipeptídeo 85 RHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNR de Cholix KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ de RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSF ocorrência AVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKR natural
WANWLTTLPKVVLCFYEDPELCTYGDDW HGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKAVEQRI HFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRK PRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHL DSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNP GMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQT SAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQA NINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQ ELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQT IVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAE VAHGYARIKEGTGNGGLPTRAERETRGVM LRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVI GHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMA IYAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSIS
AKPPYKEQKDELK SEQ ID NO: MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGDFATVRAT Polipeptídeo 86 RHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNR de Cholix KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEIDQQR de NIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFA ocorrência VTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRW natural
ANWFTTSPKVTLCFYEDPAQCTYGDDWHG GAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHF SKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPR DLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDS VFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGM VTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAG AQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINI ESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELE ATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVN RIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVA HGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLR VYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGH SLPLRNEAFTGPERVDGEDETVIGWDMAIH AVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTK
PPYKERKDELK SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSQLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 87 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFS natural
VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRW AHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLG DNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKTVE QRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARS RKPRDLTDDLSCVYQAQNIVSLFVATRILFS HLDSVFTLNLEEQEPEVAERLSALRQINENN PGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQ TSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQA NINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQ ELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQT IVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAE VAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVM LRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVI GHSLPLRNEAFTGPERAGGEDETVIGWDM AIHAVAIPS
SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 88 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS natural
VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRW AHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTL GDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPV EQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLAR SRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILF SHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINEN NPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPE QTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQ ANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTY QELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQ TIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHA EVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGV MLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQV IGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDM
AIHAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 89 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS natural
VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRW AHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLG DNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVE QRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARS RKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFS HLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINEN NPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPE QTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQ ANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTY QELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQ TIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHA EVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGV MLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQV IGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDM
AIHAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 90 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNR de
KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ
RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS ocorrência VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRW natural
AHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLG DNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVE QRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARS RKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFS HLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINEN NPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLIPEQ TSAGAQAADILSLFCPDADKPCVASNNDQA NINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQ ELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQT IVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAE VAHGYARIKEGTGEYGLPTRAEREARGVM LRVYIPRASLERFYRTNTPLENAERHITQVI GHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMA
IHAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 91 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFS natural
VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRW AHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLG DNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKTVE QRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARS RKPRDLTDDLSCVYQAQNIVSLFVATRILFS HLDSVFTLNLEEQEPEVAERLSALRQINENN PGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQ TSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQA NINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQ ELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQT IVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAE VAHGYARIKEGTGNGGLPTRAERETRGVM LRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITDVI GHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMA
IHAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 92 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFS natural
VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRW AHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLG DNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVE QRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARS RKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFS HLDSVFTLNLDEQEPAVAERLSALRQINEN NPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPE QTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVALNNDQ ANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTY QELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQ TIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHA EVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGV MLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQV IGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDM
AIHAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 93 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFS natural
VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRW AHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLG DNWFGGSYETVAGTPKAIMVKQGIEQKPV EQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLA RSRKPRYLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRIL FSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINE NNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTP EQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNND QANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWT YQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAA QTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATH AEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARG VMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQ VIGHSLPLRNEAFTGPERVDGEDETVIGWD
MAIHAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 94 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNR de KDGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS natural
VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRW AHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLG DNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVE QRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARS RKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFS HLDSVFTLNLDEQEPAVAERLSAIRQINENN PGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQ TSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASDNDQA NINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQ ELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQT IVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAE VAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVM LRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVI GHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMA
IHAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 95 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNR de KDGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS natural
VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRW AHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLG DNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVE QRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARS RKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFS HLDSVFTLNLDEQEPAVAERLSALRQINEN NPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPE QTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASDNDQ ANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTY QELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQ TIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHA EVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGV MLRVYIPRASLERFYLTNTPLENAEEHITQV IGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDM
AIHAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 96 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS natural
VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRW AHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTL GDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPV EQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLAR SRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILF SHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINEN NPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPE QTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQ ANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTY QELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQ TIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHA EVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGV MLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQV IGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDM
AIHAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 97 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS natural
VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRW AHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTL GDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPV EQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLAR SRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILF SHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINEN NPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPE QTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQ ANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTY QELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQ TIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHA EVAHGYTRIKEGTGEYGLPTRAERDARGV MLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQV IGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDM
AIHAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 98 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS natural
VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRW AHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTL GDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPV EQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLAR SRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILF SHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINEN NPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPE QTSAGAQAADILSLFYPDADKSCVASNNDQ ANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTY QELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQ TIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHA EVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGV MLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQV IGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDM AIHAVAIPS
SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 99 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS natural
VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRW AHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTL GDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPV EQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLAR SRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILF SHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINEN NPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPE QTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQ ANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTY QELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQ TIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHA EVAHGYARIKEGTGNGGLPTRAERETRGV MLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQV IGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDM
AIHAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 100 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFS natural
VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRW AHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQKNCTL GDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPV EQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLAR SRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILF SHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINEN NPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPE QTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQ ANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTY QELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQ TIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHA EVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGV MLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQV IGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDM
AIHAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 101 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNR de
KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ
RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFS ocorrência VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRW natural
AHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLG DNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVE QRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARS RKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFS HLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINEN NPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPE QTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQ ANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTY QELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQ TIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHA EVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGV MLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQV IGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDM
AIHAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPELGKPIQSKLSISSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 102 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS natural
VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRW AHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLG DNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVE QRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARS RKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFS HLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINEN NPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPE QTSAGAQAADILSLFCPDADKPCVASNNDQ ANINVESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWT YQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAA QTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATH AEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARG VMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAERHITQ VIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWD
MAIHAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPELGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 103 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS natural
VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRW AHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLG DNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVE QRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARS RKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFS HLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINEN NPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPE QTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQ ANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTY QELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQ TIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHA EVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGV MLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQV IGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDM
AIHAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPELGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 104 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS natural
VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRW AHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLG DNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVE QRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARS RKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFS HLDSVFTLNLEEQEPEVAERLSALRQINENN PGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQ TSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQA NINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQ ELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQT IVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAE VAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVM LRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVI GHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMA
IHAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPELGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 105 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS natural
VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRW AHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLG DNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVE QRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARS RKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFS HLDSVFTLNLDEQEPAVAERLSALRQINEN NPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPE QTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASDNDQ ANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTY QELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQ TIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHA EVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGV MLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQV IGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDM
AIHAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPELGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 106 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS natural
VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRW AHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLG DNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVE QRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARS RKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFS HLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINEN NPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPE QTSAGAQAADILSLFCPDADKPCVASNNDQ ANINVESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWT YQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAA QTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATH AEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAEREARG VMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAERHITQ VIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWD
MAIHAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPELGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 107 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS natural
VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRW AHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLG DNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVE QRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARS RKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFS HLDSVFTLNLDEQEPAVAERLSALRQINEN NPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPE QTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQ ANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTY QELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQ TIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHA EVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGV MLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQV IGHSLPLRNEAFTGPERVDGEDETVIGWDM
AIHAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPELGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 108 MTINDDQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS natural
VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRW AHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLG DNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVE QRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARS RKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFS HLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINEN NPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPE QTSAGAQAADILSLFCPDADKPCVASNNDQ ANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTY QELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQ NIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATH AEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARG VMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQ VIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWD
MAIHAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 109 MTINDEQNDIMDEGKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSF natural
AVTRPEQSIAKQSIAISWPSVSYKAAHKNGS RHKRWANWLTTLPKVVLCFFEDPELCTYG EDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTV EQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLA RSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRIL FSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINE NNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTP EQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNND QANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWT YQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAA QTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATH AEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARG VMLRVYIPRASLERFYRTNTLLENAEEHITQ VIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWD MAIHAVAIPS
SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 110 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVSQDAPFGVINLDITTENGTKTYSFNR de KESEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQR ocorrência NIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWETQGNVSFAV natural
TRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWA NWFTTSPKVTLCFYEDPAQCTYGDDWHGG AYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFS KKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRD LPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSV FTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMV TQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGA QAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIES RSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEAT HQALTREDYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRI APVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAH GYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRV YIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSL PLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAV
AIPS SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 111 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVSQDAPFGVINLDITTENGTKTYSFNR de KESEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQR ocorrência NIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWETQGNVSFAV natural
TRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWA NWFTTSPKVTLCFYEDPAQCTYGDDWHGG AYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFS KKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRD LPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSV FTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMV TQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGA QAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIES RSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEAT HQALTREDYVFVGYHGTNHAAAQTIVNRI APVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAH GYARIKEGTGEYGLPTRAEQETRGVMLRV YIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSL PLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAV
AIPS SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 112 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNR de
KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ
RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSF ocorrência AVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKR natural
WANWLTTLPKVVLCFYEDPELCTYGDDW HGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRI HFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRK PRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHL DSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNP GMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQT SAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQA NINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQ ELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQT IVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAE VAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVM LRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVI GHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMA
IHAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 113 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSF natural
AVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKR WANWLTTLPKVVLCFYEDPELCTYGDDW HGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRI HFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRK PRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHL DSVFTLNLDEQAPEVAERLSDLRRINEDNP GMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQT SAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQA NINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQ ELETTHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQT IVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAE VAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERETRGVM LRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVI GHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMA
IHAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 114 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSF natural
AVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKR WANWLTTLPKVVLCFYEDPELCTYGDDW HGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRI HFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRK PRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHL DSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNP GMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQT SAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQA NINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQ ELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQT IVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAE VAHGYARIKEGTGNGGLPTRAERETRGVM LRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVI GHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMA
IYAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 115 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEIDQQR ocorrência NIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFA natural
VTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRW ANWFTTSPKVTLCFYEDPAQCTYGDDWHG GAYKTVAGIPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFS KKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRD LPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSV FTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMV TQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGA QAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIES RSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEAT HQALTREDYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRI APVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAH GYARIKEGTGEYGLPTRAEQETRGVMLRV YIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSL PLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAV
AIPS SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 116 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQ ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSF natural
AVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKR WANWLTTLPKVVLCFYEEPELCTYGEDWH GGAYKTVAGTPGAITVKQGIEQKTVEQRIH FSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKP RDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLD SVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPG MVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTS AGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANI NIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQE LEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTI VNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAE VAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVM LRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVI GHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMA
IHAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 117 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNR de KEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQK ocorrência RNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSF natural
AVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKR WANWLTTLPKVVLCFYEEPELCTYGEDWH GGAYKTVAGTPEAITVKQGIEQKTVEQRIH FSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKP RDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLD SVFTLNLDEQEPAVAERLSALRQINENNPG MVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTS AGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANI NIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQE LEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTI VNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAE VAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVM LRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVI GHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMA
IHAVAIPS SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 118 MTINDEQNDIKDEDKGESIIIIGEFATVRATR de Cholix HYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRK de EGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQR ocorrência NIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFA natural
VTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRW ANWLTTLPKVVLCFYEDPELCTYGDDWHG GAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHF SKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPR DLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDS VFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGM VTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAG AQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINI ESRSGRSYLPENRVVITPQGVTNWTYQELD ATHQALTREDYVFVGYHGTNHVAAQTIVN RIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVA HGYARIKEGTGEYGLPTRAERETRGVMLR VYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGH SLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIH
AVAIPS SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPGDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 119 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVSQDAPFGVINLDITTENGTKTYSFNR de KESEFAINWLVPIGEDSPASIKISIDELDQQR ocorrência NIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFA natural
VTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRW ANWLTTLPEVVLCFFEDPELCTYGDDWHG GAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHF SKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPR DLPDDLSCAYNAQQIVSLFLATRILFTHIDSI FTLNLDGQEPEVAERLDDLRRINENNPGMV IQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGA QAADILSLFCPDADKSCVASNSDQANINIES RSGRSYLPENRAVITQQGVTNWTYQELEAT HQALTQEGYVFVGYHGTNHVAAQSIVNRIS PVPRGSDTESERAWGGLYVSTDASVAYGY ARIQEGTADGGGLTPAERKARGVMLRVYL PQASLERFYRINADLEKERNLVERVIGHPLP LRNEAFTGTDAEEGSDETAIGWDMAIHGV
AIPS SEQ ID NO: CSLTPEPGKPIQSKLSIPGDVVLDEGVLYYS Polipeptídeo 120 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT de Cholix RHYVSQDAPFGVINLDITTENGTKTYSFNR de KESEFAINWLVPIGEDSPASIKISIDELDQQR ocorrência NIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFA natural
VTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRW ANWLTTLPEVVLCFFEDPELCTYGDDWHG GAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHF SKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPR DLPDDLSCAYNAQQIVSLFLATRILFTHIDSI FTLNLDGQEPEVAERLDDLRRINENNPGMV IQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSASA QAADILSLFCPDADKSCVASNSDQANINIES RSGRSYLPENRAVITQQGVTNWTYQELEAT HQALTQEGYVFVGYHGTNHVAAQSIVNRIS PVPRGSDTESERAWGGLYVSTDASVAYGY ARIQEGTADGGGLTPAERKARGVMLRVYL PQASLERFYRINADLEKERNLVERVIGHPLP LRNEAFTGTDAEEGSDETAIGWDMAIHGV AIPS
SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKQIQSKLSIP Polipeptídeo 121 SDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKG de Cholix ESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDI de TTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDS ocorrência PASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQT natural
LEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSY KAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPI DAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTP KAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALA AHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCVYQ AQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEP EVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQI YNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFC PDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPE NRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREG YVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNN TENEKKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGT
GEYGLPTRAERDARGVMLRV SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIP Polipeptídeo 122 GDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKG de Cholix ESIITIGEFATVRATRHYVSQDAPFGVINLDI de TTENGTKTYSFNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLE natural
QWETQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKA AEKDGARHKRWAHWHTGLALCWLVPLDA IYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKA ITVKQGMEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARGRKPRDLTDDLQCAYQ AQNIVSLFLATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLTDLRRINENNPGMVTQVLTIARQIY NDYVTEHPGLTPEQTSAGAQAADILSLLCP DADGSCVASNSDQANINIESRSGRSYLPENR AVITPQGVTNWTYQELEAKHQTLTREGYV FVGYHGTNHVAAQSIVNRITPVPRGNNTEK
EEEWGG SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIP Polipeptídeo 123 GDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKG de Cholix ESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDI de TTENGTKTYSFNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLE natural
QWETQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKA AEKDGARHKRWAHWHTGLALCWLVPLDA IYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKA ITVKQGMEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAA HRVCGVPLETLARGRKPRDLTDDLQCAYQ AQNIVSLFLATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLTDLRRINENNPGMVTQVLTIARQIY NDYVTEHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCP DADESCVASNSDQANINIESRSGRSYLPENR AVITPQGVTNWTYQELEAKHQTLTREGYV FVGYHGTNHVAAQSIVNRITPVPRGNNTEK
EEEWGG SEQ ID NO: YSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNI Polipeptídeo 124 AISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTG de Cholix LALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFG de GSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFS ocorrência NGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRD natural
LTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSV FTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMV TQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGA QAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIES RSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEAT HQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRI APVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAH GYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRV YIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSL PLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAV AIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPP
YKERKDELK SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPS Polipeptídeo 125 DVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGE de Cholix SIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDIT de TENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISVDELDQKRNIIEVPKLYSIDLDNQTL natural
EQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYK AAHKNGSRHKRWANWLTTLPKVVLCFYE EPELCTYGEDWHGGAYKTVAGTPEAITVK QGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVC GVPLETLARSRKPRDLQDDLSCAYQAQNIV SLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPAVAER LSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDY VTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDAD KSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVI TPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVG
YHGTNHV SEQ ID NO: VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIP Polipeptídeo 126 GDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKG de Cholix ESIITIGEFATVRATRHYVSQDAPFGVINLDI de
TTENGTKTYSFNRKESEFAINWLVPIGEDSP ocorrência ASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLE não natural
QWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKA AQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAI YNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAI TVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHR VCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYNAQQ IVSLFLATRILFTHIDSIFTLNLDGQEPEVAE RLDDLRRINENNPGMVIQVLTVARQIYNDY VTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDAD
KSCVASNSDQANINIES SEQ ID NO: LFSHLDSVFTLNLHEQEPAVAERLSALRQIN Polipeptídeo 127 ENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLT de Cholix PEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNN de DQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNW ocorrência TYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVA natural
AQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVAT HAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDAR GVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHIT QVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGW DMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKE
QSISAKPPYKERKDELK SEQ ID NO: AVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYV Polipeptídeo 128 FVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTEN de Cholix EEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEY de GLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRT ocorrência NTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPES natural
AGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYE
ELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK SEQ ID NO: AVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYV Polipeptídeo 129 FVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTEN de Cholix EEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEY de GLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRT ocorrência NTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPES natural
AGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYE ELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDEL
[0189] A TABELA 2 provê uma sequência consensus (SEQ ID NO: 130, FÓRMULA I) dos polipeptídeos derivados de Cholix que pode ser utilizada como veículos aqui. TABELA 2 – FÓRMULA I
SEQ ID NO: X1-E-X3-X4-L-X6-I-F-D-E-C-R-S-P-C-X16-L-T-P-E-X21-G- 130 K-X24-I-Q-S-K-L-X30-I-P-X33-D-V-V-L-D-E-G-V-L-Y-Y-S- M-T-I-N-D-E-Q-N-D-I-X56-D-E-X59-K-G-E-S-I-I-T-X67-G- E-F-A-T-X73-R-A-T-R-H-Y-V-X81-Q-D-A-P-F-G-V-I-X90- L-D-I-T-T-E-N-G-T-K-X101-Y-S-X104-N-R-K-X108-X109- E-F-X112-I-X114-W-L-V-X118-X119-G-E-D-S-P-A-S-I-K-I- S-X131-D-E-X134-D-Q-X137-R-N-I-I-E-V-P-K-L-Y-S-I-D-L- D-N-Q-T-L-E-Q-W-X160-X161-Q-G-N-V-X166-F-X168-V-T- R-P-E-X174-X175-I-A-I-S-W-P-S-V-S-Y-X186-A-A-X189-K- X191-G-X193-R-H-K-R-W-A-X200-W-X202-T-X204-X205- X206-X207-X208-X209-L-X211-X212-X213-X214-X215- X216-X217-X218-X219-X220-X221-X222-X223-X224-C-T- X227-G-X229-X230-W-X232-G-G-X235-Y-X237-T-V-A-G- X242-P-X244-X245-I-X247-V-K-Q-G-X252-E-Q-K-X256-V- E-Q-R-I-H-F-S-X265-X266-N-A-X269-X270-X271-L-A-A-H- R-V-C-G-V-P-L-E-T-L-A-R-X288-R-K-P-R-X293-L-X295-D- D-L-X299-C-X301-Y-X303-A-Q-X306-I-V-S-L-F-X312-A-T- R-X316-L-F-X319-H-X321-D-S-X324-F-T-L-N-L-X330- X331-Q-X333-P-X335-V-X337-E-R-L-X341-X342-X343-R- X345-I-N-E-X349-N-P-G-X353-V-X355-Q-V-L-T-X360-A-R- Q-I-Y-N-D-Y-V-T-X371-H-P-X374-L-X376-P-E-Q-T-S-A- X383-A-Q-A-A-D-I-L-S-L-X393-X394-P-D-X397-D-X399- X400-C-V-A-X404-X405-X406-D-Q-A-N-I-N-X413-E-S-R-S- G-R-S-Y-L-X423-E-N-R-A-V-I-T-X431-Q-G-V-T-N-W-T-Y- Q-E-L-X443-X444-X445-H-Q-X448-L-T-X451-E-X453-Y-V- F-V-G-Y-H-G-T-N-H-X465-A-A-Q-X469-I-V-N-R-I-X475-P- V-P-R-G-X481-X482-T-E-X485-E-X487-X488-W-G-G-X492- Y-V-X495-T-X497-A-X499-X500-X501-X502-X503-Y-X505- R-X507-X508-X509-G-T-X512-X513-X514-X515-X516- X517-T-X519-X520-X521-X522-X523-X524-R-G-V-M-L- X530-V-Y-X533-X534-X535-A-S-L-E-R-F-Y-R-X544-N- X546-X547-L-E-X550-X551-X552-X553-X554-X555-X556- X557-V-I-G-H-X562-L-P-L-R-N-E-A-F-T-G-X573-X574- X575-X576-X577-G-X579-X580-E-T-X583-I-G-W-D-X588- A-I-X591-X592-V-A-I-P-S-T-I-P-G-N-X603-Y-X605-X606-L- X608-X609-X610-E-E-A-X614-A-X616-E-Q-S-I-S-X622-K-P- P-Y-K-E-X629-X630-D-E-L-K; onde X1 é selecionado do grupo consistindo em V e L; X3 é selecionado do grupo consistindo em E e D; X4 é selecionado do grupo consistindo em A e E; X6 é selecionado do grupo consistindo em N e K; X16 é selecionado do grupo consistindo em S e L; X21 é selecionado do grupo consistindo em P e L; X24 é selecionado do grupo consistindo em P e Q; X30 é selecionado do grupo consistindo em S e F; X33 é selecionado do grupo consistindo em S e G; X56 é selecionado do grupo consistindo em K e M; X59 é selecionado do grupo consistindo em D e G; X67 é selecionado do grupo consistindo em I e F; X73 é selecionado do grupo consistindo em V e I; X81 é selecionado do grupo consistindo em N e S; X90 é selecionado do grupo consistindo em H e N; X101 é selecionado do grupo consistindo em T e M; X104 é selecionado do grupo consistindo em Y e F; X108 é selecionado do grupo consistindo em E e D; X109 é selecionado do grupo consistindo em G e S; X112 é selecionado do grupo consistindo em A e T; X114 é selecionado do grupo consistindo em N e H; X118 é selecionado do grupo consistindo em P e I; X119 é selecionado do grupo consistindo em I e P; X131 é selecionado do grupo consistindo em V e I; X134 é selecionado do grupo consistindo em L e I; X137 é selecionado do grupo consistindo em Q e K; X160 é selecionado do grupo consistindo em K e E; X161 é selecionado do grupo consistindo em T e N; X166 é selecionado do grupo consistindo em S e F; X168 é selecionado do grupo consistindo em S e A; X174 é selecionado do grupo consistindo em H e Q; X175 é selecionado do grupo consistindo em N, S, SIAKQS, e SIAKQSIAKQS; X186 é selecionado do grupo consistindo em K e N; X189 é selecionado do grupo consistindo em Q, E, e H; X191 é selecionado do grupo consistindo em E, N, e D; X193 é selecionado do grupo consistindo em S e A; X200 é selecionado do grupo consistindo em H e N; X202 é selecionado do grupo consistindo em H, L, F, e R; X204 é selecionado do grupo consistindo em G e T; X205 é selecionado do grupo consistindo em L e S;X206 é selecionado do grupo consistindo em A e P; X207 é selecionado do grupo consistindo em L, E, e K;X208 é selecionado do grupo consistindo em C e V; X209 é selecionado do grupo consistindo em W, V, e T; X211 é selecionado do grupo consistindo em V e no aminoácido; X212 é selecionado do grupo consistindo em P e no aminoácido; X213 é selecionado do grupo consistindo em M, I, L, e no aminoácido; X214 é selecionado do grupo consistindo em D e no aminoácido; X215 é selecionado do grupo consistindo em A e no aminoácido; X216 é selecionado do grupo consistindo em I e no aminoácido; X217 é selecionado do grupo consistindo em Y e C; X218 é selecionado do grupo consistindo em N e F; X219 é selecionado do grupo consistindo em Y e F; X220 é selecionado do grupo consistindo em I e E; X221 é selecionado do grupo consistindo em T e D; X222 é selecionado do grupo consistindo em Q e P; X223 é selecionado do grupo consistindo em Q, E, e A; X224 é selecionado do grupo consistindo em N,
L, e Q; X227 é selecionado do grupo consistindo em L e Y; X229 é selecionado do grupo consistindo em D e E; X230 é selecionado do grupo consistindo em N e D; X232 é selecionado do grupo consistindo em F, H, e Y; X235 é selecionado do grupo consistindo em S e A; X237 é selecionado do grupo consistindo em E e K; X242 é selecionado do grupo consistindo em T e I; X244 é selecionado do grupo consistindo em K, E, e G; X245 é selecionado do grupo consistindo em V e A; X247 é selecionado do grupo consistindo em T e M; X252 é selecionado do grupo consistindo em I e M; X256 é selecionado do grupo consistindo em P, T, e A; X265 é selecionado do grupo consistindo em K, Q, e N; X266 é selecionado do grupo consistindo em G e K; X269 é selecionado do grupo consistindo em M e I; X270 é selecionado do grupo consistindo em S e E; X271 é selecionado do grupo consistindo em A e T; X288 é selecionado do grupo consistindo em S e G; X293 é selecionado do grupo consistindo em D e Y; X295 é selecionado do grupo consistindo em T, P, e Q; X299 é selecionado do grupo consistindo em S e Q; X301 é selecionado do grupo consistindo em A e V; X303 é selecionado do grupo consistindo em Q e N; X306 é selecionado do grupo consistindo em N e Q; X312 é selecionado do grupo consistindo em V e L; X316 é selecionado do grupo consistindo em I e M; X319 é selecionado do grupo consistindo em S e T; X321 é selecionado do grupo consistindo em L e I; X324 é selecionado do grupo consistindo em V e I; X330 é selecionado do grupo consistindo em D, E, e H; X331 é selecionado do grupo consistindo em E e G; X333 é selecionado do grupo consistindo em E e A; X335 é selecionado do grupo consistindo em E e A; X337 é selecionado do grupo consistindo em A e T; X341 é selecionado do grupo consistindo em S, D, e T; X342 é selecionado do grupo consistindo em D e A; X343 é selecionado do grupo consistindo em L e I; X345 é selecionado do grupo consistindo em R e Q; X349 é selecionado do grupo consistindo em N e D; X353 é selecionado do grupo consistindo em M e V; X355 é selecionado do grupo consistindo em T e I; X360 é selecionado do grupo consistindo em V e I; X371 é selecionado do grupo consistindo em H e E; X374 é selecionado do grupo consistindo em G e L; X376 é selecionado do grupo consistindo em T e I; X383 é selecionado do grupo consistindo em G e S; X393 é selecionado do grupo consistindo em F e L; X394 é selecionado do grupo consistindo em C e Y; X397 é selecionado do grupo consistindo em A e T; X399 é selecionado do grupo consistindo em K, E, e G; X400 é selecionado do grupo consistindo em S, P, e H; X404 é selecionado do grupo consistindo em S e L; X405 é selecionado do grupo consistindo em N e D; X406 é selecionado do grupo consistindo em N e S; X413 é selecionado do grupo consistindo em I e V; X423 é selecionado do grupo consistindo em P e L; X431 é selecionado do grupo consistindo em P e Q; X443 é selecionado do grupo consistindo em E e D;X444 é selecionado do grupo consistindo em A e T; X445 é selecionado do grupo consistindo em T e K; X448 é selecionado do grupo consistindo em A e T; X451 é selecionado do grupo consistindo em R e Q; X453 é selecionado do grupo consistindo em G e D; X465 é selecionado do grupo consistindo em V e A;X469 é selecionado do grupo consistindo em T, S, e N; X475 é selecionado do grupo consistindo em A, S, e T; X481 é selecionado do grupo consistindo em N e S; X482 é selecionado do grupo consistindo em N e D; X485 é selecionado do grupo consistindo em N, S, e K; X487 é selecionado do grupo consistindo em E, R, e K; X488 é selecionado do grupo consistindo em K, A, e E; X492 é selecionado do grupo consistindo em L e V; X495 é selecionado do grupo consistindo em A e S; X497 é selecionado do grupo consistindo em H e D; X499 é selecionado do grupo consistindo em E e S; X500 é selecionado do grupo consistindo em V e L; X501 é selecionado do grupo consistindo em A e N; X502 é selecionado do grupo consistindo em H e Y; X503 é selecionado do grupo consistindo em G e R; X505 é selecionado do grupo consistindo em A e T; X507 é selecionado do grupo consistindo em I e L; X508 é selecionado do grupo consistindo em K e Q; X509 é selecionado do grupo consistindo em E e K; X512 é selecionado do grupo consistindo em G e A; X513 é selecionado do grupo consistindo em E, D, e N; X514 é selecionado do grupo consistindo em Y, G, A, e N; X515 é selecionado do grupo consistindo em G e E; X516 é selecionado do grupo consistindo em L e G; X517 é selecionado do grupo consistindo em P e L; X519 é selecionado do grupo consistindo em R, P, e T; X520 é selecionado do grupo consistindo em A e E; X521 é selecionado do grupo consistindo em E e K; X522 é selecionado do grupo consistindo em R, Q, e K; X523 é selecionado do grupo consistindo em D, K, e E; X524 é selecionado do grupo consistindo em A, T, e S; X530 é selecionado do grupo consistindo em R e K; X533 é selecionado do grupo consistindo em I e L; X534 é selecionado do grupo consistindo em P e H; X535 é selecionado do grupo consistindo em R e Q; X544 é selecionado do grupo consistindo em T e I; X546 é selecionado do grupo consistindo em T, A, e I; X547 é selecionado do grupo consistindo em P e D; X550 é selecionado do grupo consistindo em N e K; X551 é selecionado do grupo consistindo em A e E; X552 é selecionado do grupo consistindo em E, R, e D; X553 é selecionado do grupo consistindo em E, N, e R; X554 é selecionado do grupo consistindo em H e L; X555 é selecionado do grupo consistindo em I e V; X556 é selecionado do grupo consistindo em T e E; X557 é selecionado do grupo consistindo em Q, R, H, e D; X562 é selecionado do grupo consistindo em S e P; X573 é selecionado do grupo consistindo em P e T; X574 é selecionado do grupo consistindo em E e D; X575 é selecionado do grupo consistindo em S, A, e R; X576 é selecionado do grupo consistindo em A, E, e V; X577 é selecionado do grupo consistindo em G, E, e D; X579 é selecionado do grupo consistindo em E e S; X580 é selecionado do grupo consistindo em D e N; X583 é selecionado do grupo consistindo em V e A; X588 é selecionado do grupo consistindo em M e I; X591 é selecionado do grupo consistindo em H e Y; X592 é selecionado do grupo consistindo em A e G; X603 é selecionado do grupo consistindo em A e S; X605 é selecionado do grupo consistindo em E e A; X606 é selecionado do grupo consistindo em E, A, Q, G, V, e R; X608 é selecionado do grupo consistindo em A, P, e T; X609 é selecionado do grupo consistindo em I, T, e P; X610 é selecionado do grupo consistindo em D e A; X614 é selecionado do grupo consistindo em V e VVKEAI; X616 é selecionado do grupo consistindo em K e E; X622 é selecionado do grupo consistindo em T, A, e P; andX629 é selecionado do grupo consistindo em R, Q, e H; e X630 é selecionado do grupo consistindo em K e no aminoácido.
[0190] Os veículos podem incluir todos os polipeptídeos derivados de Cholix apresentando uma atividade de ribosilação de ADP reduzida (por exemplo, ribosilação do fator de alongamento 2) ou eliminada em relação a um polipeptídeo de Cholix de ocorrência natural tal como um com a sequência de SEQ ID NO: 3. Tais veículos podem ser referidos como veículos não tóxicos. Exemplos de tais polipeptídeos derivados de Cholix incluem qualquer um dos polipeptídeos com uma sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 1-10 que não apresente uma deleção na posição 581 (por exemplo, uma deleção em E581 como, por exemplo, na SEQ ID NO: 189), uma substituição na posição 581 (por exemplo, uma substituição em E581A) ou uma deleção ou substituição alternativa que torna o veículo não tóxico. Em alguns casos, um veículo apresenta uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 130 com uma mutação na posição 581. Em alguns casos, um veículo apresenta uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-3 com uma mutação na posição 581.
[0191] Em alguns casos, a veículo compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das TABELA 1 ou TABELA 2 com uma deleção, substituição e/ou adição no terminal C, resultando, desta forma, em uma atividade de ribosilação de ADP reduzida ou eliminada. Tal deleção, substituição e/ou adição mantém uma funcionalidade de transporte tal como transcitose ou endocitose. Como tal, alguns dos veículos aqui efetuam transcitose, ou sozinhos ou juntamente com uma carga útil heteróloga, enquanto alguns dos veículos aqui efetuam endocitose, ou sozinhos ou juntamente com uma carga útil heteróloga.
[0192] Em alguns casos, um primeiro veículo derivado de um primeiro polipeptídeo de Cholix pode apresentar propriedades aperfeiçoadas em comparação com um segundo veículo derivado de um segundo polipeptídeo de Cholix. Tais propriedades podem incluir a habilidade de um veículo em transportar uma carga útil heteróloga através de uma célula epitelial polarizada (ou camada celular), uma estabilidade de um veículo (por exemplo, uma estabilidade in vivo ou uma estabilidade ex vivo tal como vida de prateleira), a habilidade de um veículo em ser funcionalmente expresso em um sistema de expressão tal como E. coli ou células CHO, a habilidade de um veículo em ser purificado, por exemplo, pela utilização de métodos cromatográficos e a habilidade em multimerizar (por exemplo, dimerizar) quando, por exemplo, associado (por exemplo, acoplado) com uma carga útil heteróloga. Pode ser surpreendentemente mostrado que um primeiro veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando a sequência da SEQ ID NO: 1 pode apresentar uma ou mais das seguintes propriedades em comparação com um segundo veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando a sequência da SEQ ID NO: 3 e/ou 126: (i) uma função de transcitose aperfeiçoada (por exemplo, uma taxa de transporte aumentada para o transporte de uma carga útil através de células epiteliais); (ii) expressão funcional aperfeiçoada (por exemplo, rendimentos de produto maiores) em E. coli e/ou células CHO; (iii) propriedades de purificação aperfeiçoadas (por exemplo, purezas e/ou rendimentos de recuperação maiores); e (iv) uma estabilidade in vivo aumentada (por exemplo, uma estabilidade de protease e/ou pH amentada, temperatura de fusão). Tal estabilidade in vivo pode ser determinada pela incubação do veículo com, por exemplo, células Caco-2 ou pela administração (por exemplo, injeção em um lúmen) do veículo a um mamífero (por exemplo, um roedor ou um humano). A função aumentada de transcitose, por exemplo, uma velocidade de transporte pode ser determinada, por exemplo, como descrito no EXEMPLO 1 pela determinação da quantidade de veículo e/ou carga útil transportados em uma câmara basolateral em certos pontos no tempo (por exemplo, 1, 5, 10, 15, 20 ou 30 minutos após a aplicação apical do veículo ou construto de aplicação). Em alguns casos, a estabilidade de um veículo em relação a uma protease pode ser determinada pela incubação do veículo com a protease (por exemplo, tripsina) a certas proporções molares (por exemplo, 1:1) e à temperatura ambiente, e medindo-se a quantidade de veículo intacto em vários pontos no tempo (por exemplo, 5, 10, 15, 30 ou 45 minutos) pela utilização, por exemplo, de cromatografia por exclusão de tamanho. A estabilidade do veículo e um certo pH pode ser determinada pela incubação do veículo com um tampão apresentando o pH apropriado (por exemplo, pH 5,5, 6, 6,5, 7 etc.) e medindo-se a quantidade de veículo intacto em vários pontos no tempo (por exemplo, 5, 10, 15, 30 min.) pela utilização, por exemplo, de cromatografia por exclusão de tamanho.
[0193] Um veículo de transcitose pode transportar uma carga útil, acoplada, através de uma célula epitelial. Tal transporte pode ocorrer in vitro, por exemplo, utilizando-se monocamadas de célula epitelial tal como Caco-2 ou monocamadas de célula SMI-100. Em outros casos, tal transporte pode ocorrer in vivo, por exemplo, através de um epitélio intestinal de um indivíduo (por exemplo, um roedor ou um humano) para compartimentos submucosos tais como a lamina propria.
[0194] O mecanismo de ação de um veículo de transcitose pode envolver um ou mais de: endocitose mediada por receptor para dentro de uma célula epitelial polarizada por interação com TMEM132, LMAN1 e/ou GPR75, evitação da rota de destruição lisossômica por interação com GRP75, transporte apical para basal por interação com um receptor ERGIC (por exemplo, ERGIC-53) e liberação a partir da membrana basal para dentro de compartimentos submucosos tais como a lamina propria por interação com perlecan (HSPG).
[0195] Um veículo de transcitose pode ser um que interage com uma ou mais das seguintes proteínas endógenas: TMEM132A, GPR75, proteína ERGIC e perlecan (HSPG) como mostrado nos EXEMPLOS 10 e 12. A interação de um veículo de transcitose com um receptor de entrada apical tal como TMEM132A pode possibilitar a entrada apical do veículo em uma célula epitelial polarizada. A interação de um veículo de transcitose com um receptor de evasão de lisossomo tal como GRP75 pode possibilitar que o veículo e uma carga útil acoplada a ele evitem a degradação lisossômica, desta forma, permitindo o transporte do veículo e carga útil inalterados e funcionalmente intactos. A interação de um veículo de transcitose com uma proteína de transporte apical para basal tal como uma proteína ERGIC (por exemplo, ERGIC-53) pode permitir que o veículo, uma vez endocitado, se desloque para o local basal da célula epitelial. A interação de um veículo de transcitose com uma proteína de liberação basal tal como perlecan pode possibilitar que o veículo entre em sistemas de reciclagem basal e exocitose do veículo nos compartimentos basolaterais, tais como compartimentos submucosos (por exemplo, lamina propria).
[0196] Além disto, um veículo de transcitose pode se localizar conjuntamente com qualquer um ou mais dos antígenos de endossomo precoces (EEA1) da proteína de revestimento I (COPI) para sequestro do maquinário de transporte apical para basal endógeno e com proteína 11a relacionada a Ras (Rab11a) no lado basal da célula epitelial para entrar nos sistemas de secreção basal como mostrado no EXEMPLO 10.
[0197] Em alguns casos, um veículo de transcitose não se localiza conjuntamente com a proteína relacionada a Ras 7 (Rab7) e/ou proteína de membrana 1 associada a lisossomo (LAMP1) durante o transporte através de tal célula epitelial, possibilitando que tal veículo evite a degradação lisossômica como mostrado no EXEMPLO 10.
[0198] Exemplos de veículos de transcitose incluem aqueles apresentando um truncamento no terminal C de qualquer uma das SEQ ID NOs 1-78 ou 130, onde o truncamento no terminal C pode ocorrer no terminal C do polipeptídeo em qualquer posição de aminoácido após o resíduo do terminal C na posição 195 (por exemplo, truncamento em qualquer uma das posições 195-634 das SEQ ID NOs: 1-2). Aa posições de aminoácidos para o truncamento podem ser determinada pela utilização de alinhamento de sequência para a sequência consensus SEQ ID NO: 130 ou qualquer uma das sequências de referência SEQ ID NO: 1, 2 ou 3. A TABELA 3 abaixo ilustra veículos exemplificativos pela identificação de vários resíduos de aminoácido das sequências de tais veículos e posições do terminal C das SEQ ID NOs 1-78 ou 130 que podem ser truncadas. Em alguns casos, os veículos de transcitose incluem os apresentando um truncamento no terminal C de qualquer uma das SEQ ID NOs 1-2 ou 4-78.
TABELA 3 –Veículos de Transcitose Exemplificativos Identificando os Resíduos de Aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-78 ou 130 resíduos AA resíduos AA resíduos AA 1-195 1-246 1-297 1-196 1-247 1-298 1-197 1-248 1-299 1-198 1-249 1-300 1-199 1-250 1-301 1-200 1-251 1-302 1-201 1-252 1-303 1-202 1-253 1-304 1-203 1-254 1-305
1-204 1-255 1-306 1-205 1-256 1-307 1-206 1-257 1-308 1-207 1-258 1-309 1-208 1-259 1-310 1-209 1-260 1-311 1-210 1-261 1-312 1-211 1-262 1-313 1-212 1-263 1-314 1-213 1-264 1-315 1-214 1-265 1-316 1-215 1-266 1-317 1-216 1-267 1-318 1-217 1-268 1-319 1-218 1-269 1-320 1-219 1-270 1-321 1-220 1-271 1-322 1-221 1-272 1-323 1-222 1-273 1-324 1-223 1-274 1-325 1-224 1-275 1-326 1-225 1-276 1-327 1-226 1-277 1-328 1-227 1-278 1-329 1-228 1-279 1-330 1-229 1-280 1-331 1-230 1-281 1-332 1-231 1-282 1-333 1-232 1-283 1-334 1-233 1-284 1-335 1-234 1-285 1-336 1-235 1-286 1-337 1-236 1-287 1-338 1-237 1-288 1-339 1-238 1-289 1-340 1-239 1-290 1-341 1-240 1-291 1-342 1-241 1-292 1-343 1-242 1-293 1-344 1-243 1-294 1-345 1-244 1-295 1-346 1-245 1-296 1-347
[0199] Tais veículos de transcitose podem ser adicionalmente truncados em seus terminais N em uma posição de aminoácido até a posição 20 do terminal N (por exemplo, a SEQ ID NO: 79 que é truncada na posição 17 do terminal N (iniciando com a posição 18)).
[0200] Também contemplados aqui são os veículos de transcitose tais que apresentem pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência, com qualquer uma das sequências de veículo mostradas na TABELA 3.
[0201] Em um caso, o veículo compreende a SEQ ID NO: 1 com um truncamento no terminal C na posição 386. Em um caso, o veículo compreende a SEQ ID NO: 2 com um truncamento no terminal C na posição 386. Em um caso, o veículo compreende as SEQ ID NO: 4-79 com um truncamento no terminal C na posição 386. Em um caso, o veículo compreende a SEQ ID NO: 130 com um truncamento no terminal C na posição 386. Em tais casos, a sequência não inclui a SEQ ID NO: 3 com um truncamento no terminal C na posição 386. Em tais casos, a sequência não inclui a SEQ ID NO: 126.
[0202] Quando um veículo derivado de Cholix apresenta um truncamento no terminal C na posição 386, pode ser referido aqui como Cholix386. O “386” designa o truncamento no terminal C após o aminoácido que mais proximamente se alinha com a posição 386 quando a sequência é parte da ou é alinhada com a SEQ ID NO: 130. Uma Cholix386 não necessita que o polipeptídeo apresente 386 aminoácidos. Por exemplo, um truncamento da SEQ ID NO: 79 na posição 386 resulta em um veículo que é mais curto que 386 resíduos de aminoácido. Exemplos de moléculas do veículo de Cholix386 incluem qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-79 ou 130 truncadas na posição 386 conforme é alinhada para a identidade de sequência mais alta com a SEQ ID NO 130 ou é alinhada com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-3 para a identidade de sequência mais alta, por exemplo, terminando com os resíduos de aminoácido “AQA”.
[0203] Uma Cholix386 pode incluir também polipeptídeos que mantêm substancialmente a mesma função da SEQ ID NO: 180, mas com uma ou mais adições/deleções/substituições e apresentando pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com as moléculas de Cholix386 descritas aqui.
[0204] Um outro exemplo de um veículo de transcitose derivado de Cholix é o Cholix266. Em um caso, um Cholix266 consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 181. Outros fragmentos de Cholix266 podem incluir os de qualquer uma das SEQ ID NO: 1-78 truncadas na posição de aminoácido 266 conforme esta é alinhada para a identidade de sequência mais alta com a SEQ ID NO 130 ou é alinhada com qualquer uma das SEQ ID NOs 1-3 para a identidade de sequência mais alta. Alternativamente, um veículo pode apresentar qualquer sequência da FÓRMULA I (SEQ ID NO: 130) truncada no terminal C na posição 266.
[0205] Um outro exemplo de um veículo de transcitose derivado de Cholix é Cholix251. Em um caso, um Cholix251 consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 182. Outros fragmentos de Cholix251 podem incluir os de qualquer uma das SEQ ID NO: 1-78 truncada na posição de aminoácido 251 conforme é alinhada para a identidade de sequência mais alta com a SEQ ID NO 130 ou é alinhada com qualquer uma das SEQ ID NOs 1-3 para identidade de sequência mais alta. Alternativamente, um veículo pode apresentar qualquer sequência de FÓRMULA I (SEQ ID NO: 130) truncada no terminal C na posição
251.
[0206] Um outro exemplo de um veículo de transcitose derivado de Cholix é o Cholix245. Em um caso, um Cholix245 consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 183. Outros fragmentos de Cholix245 incluem os de qualquer uma das SEQ ID NO: 1-79 truncadas na posição de aminoácido 245 conforme é alinhada para a identidade de sequência mais alta com a SEQ ID NO 130 ou é alinhada com qualquer um adas SEQ ID NOs 1-3 para identidade de sequência mais alta. Alternativamente, um veículo pode apresentar qualquer sequência de FÓRMULA I (SEQ ID NO: 130) truncada no terminal C na posição
245.
[0207] Um outro exemplo de um veículo de transcitose derivado de Cholix é o Cholix206. Em um caso, um Cholix206 consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 184. Outros fragmentos de Cholix206 incluem os de qualquer uma das SEQ ID NO: 1-78 truncadas na posição de aminoácido 206 conforme é alinhada para a identidade de sequência mais alta com a SEQ ID NO 130 ou é alinhada com qualquer uma das SEQ ID NOs 1-3 para identidade de sequência mais alta. Alternativamente, um veículo pode apresentar qualquer sequência de FÓRMULA I (SEQ ID NO: 130) truncada no terminal C na posição
206.
[0208] Outros exemplos de veículos incluem aqueles apresentando um truncamento no terminal C em qualquer uma das posições de aminoácido 195- 634 da sequência apresentada na FÓRMULA I (SEQ ID NO: 130). Preferivelmente, tal truncamento é em uma posição de aminoácido de qualquer um de 195-347 da sequência apresentada na FÓRMULA I (SEQ ID NO: 130).
[0209] No terminal N, um veículo de transcitose pode apresentar qualquer um dos aminoácidos 1-20 das SEQ ID NOs: 1-78 ou 130. Em algumas realizações, o terminal N do veículo apresenta os resíduos de aminoácido 1-20 da SEQ ID NO: 1 ou 2 (100% de identidade de sequência nas posições 1-20) ou uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência para os resíduos de aminoácido 1- 20 da SEQ ID NO: 1 ou 2. Em algumas realizações, os primeiros quatro aminoácidos no terminal N são VEEA (SEQ ID NO: 185). Em algumas realizações, tal veículo não compreende a SEQ ID NO: 126. Em algumas realizações, o terminal N do veículo apresenta os resíduos de aminoácido 1-20 da FÓRMULA I (SEQ ID NO: 130). Qualquer um de tais veículos pode opcionalmente apresentar uma modificação no terminal N como descrita aqui. Tal modificação no terminal N pode ser uma metionina no terminal N. Exemplos de tais veículos são aqueles compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 131-135.
[0210] Como tal, um veículo de transcitose pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir em uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência ou apresentar 100% de identidade de sequência com os resíduos de aminoácido a partir da posição 1 para qualquer um dos resíduos de aminoácido em qualquer uma das posições 205-275 da sequência de aminoácidos apresentada na FÓRMULA I (SEQ ID NO: 130).
[0211] Em tais casos, um veículo de transcitose consiste, consiste essencialmente em ou compreende os resíduos de aminoácido 1-275, 1-266, 1- 265, 2-265, 3-265, 4-265, 5-265, 1-251, 1-250, 2-250, 3-250, 4-250, 5-250, 1- 245, 2-245, 3-245, 4-245, 5-245, 1-206, 1-205, 2-205, 3-205, 4-205 ou 5-205 dos resíduos de aminoácido apresentados na FÓRMULA I (SEQ ID NO: 130). Em vários casos, tal veículo pode consistir em ou consistir essencialmente nos resíduos de aminoácido 1-275, 1-266, 1-265, 2-265, 3-265, 4-265, 5-265, 1-251, 1-250, 2-250, 3-250, 4-250, 5-250, 1-245, 2-245, 3-245, 4-245, 5-245, 1-206, 1- 205, 2-205, 3-205, 4-205 ou 5-205 dos mesmos resíduos de aminoácido apresentados em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-78.
[0212] Especificamente, em alguns casos, tal veículo de transcitose pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir nos resíduos de aminoácido 1-275, 1-266, 1-265, 2-265, 3-265, 4-265, 5-265, 1-251, 1-250, 2- 250, 3-250, 4-250, 5-250, 1-245, 2-245, 3-245, 4-245, 5-245, 1-206, 1-205, 2- 205, 3-205, 4-205 ou 5-205 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1.
[0213] Alternativamente, em alguns casos, tal veículo de transcitose pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir nos resíduos de aminoácido 1-275, 1-266, 1-265, 2-265, 3-265, 4-265, 5-265, 1-251, 1-250, 2- 250, 3-250, 4-250, 5-250, 1-245, 2-245, 3-245, 4-245, 5-245, 1-206, 1-205, 2- 205, 3-205, 4-205 ou 5-205 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2.
[0214] Um veículo pode ser adicionalmente modificado em seu terminal N. Tais modificações no terminal N incluem grupos funcionais que podem aumentar a expressão e/ou estabilidade do polipeptídeo. Tais modificações no terminal podem ser ilustradas pela seguinte designação “FG-Veículo”, onde FG é um grupo funcional fixado no terminal N do veículo. Exemplos de grupos funcionais contemplados aqui incluem uma metionina para expressão bacteriana e outras sequências de sinal para a expressão em células CHO ou células HEK-293. Exemplos de veículos de transcitose com uma metionina no terminal N incluem aqueles apresentando uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 131-135 (TABELA 4). Deve ser observado que os grupos funcionais podem ser também acoplados ao terminal C de um veículo.
TABELA 4 – Veículos Derivados de Cholix de Transcitose Exemplificativos SEQ ID NO Sequência SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEG 131 VLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYV
NQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIG EDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKT QGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAH
WHTGLA SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEG 132 VLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYV
NQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIG EDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKT QGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAH WHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYET
VAGTPKV SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEG 133 VLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYV
NQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIG EDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKT QGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAH WHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYET
VAGTPKVITVKQG SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEG 134 VLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYV
NQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIG EDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKT QGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAH WHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYET
VAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKG SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEG 135 VLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYV
NQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIG EDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKT QGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAH WHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYET VAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRV CGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRIL FSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQV
LTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQA SEQ ID NO: VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVL 184 YYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQ
DAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDS PASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGN VSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHT
GLA SEQ ID NO: VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVL 183 YYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQ
DAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDS PASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGN VSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHT GLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAG
TPKV SEQ ID NO: VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVL 182 YYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQ
DAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDS PASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGN VSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHT GLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAG
TPKVITVKQG SEQ ID NO: VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVL 181 YYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQ
DAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDS PASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGN VSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHT GLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAG
TPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKG SEQ ID NO: VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVL 180 YYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQ
DAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDS PASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGN VSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHT GLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAG TPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGV PLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHL DSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTV
ARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQA SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEG 178 VLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYV
NQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIG EDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKT QGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAH WHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYET
VAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSK SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEG 191 VLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYV
NQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIG EDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKT QGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAH WHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYET VAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRV CGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRIL FSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQV LTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDA
DKSCVASNNDQANINIESCENLFQ SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEG 192 VLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYV
NQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIG EDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKT QGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAH WHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYET VAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRV CGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRIL FSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQV
LTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQACENLFQ SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEG 193 VLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYV
NQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIG EDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKT QGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAH WHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYET VAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRV CGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRIL FSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQV LTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDA
DKSCVASNNDQANINIESCENLFQSGTCHHHHHH SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEG 194 VLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYV
NQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIG EDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKT QGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAH WHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYET VAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRV CGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRIL FSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQV LTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQACENLFQSGTC HHHHHH
[0215] Pela utilização de informação de cristal de um veículo derivado de Cholix apresentando uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 178, um punhado de regiões foram identificadas que podem representar um papel na endocitose e na transcitose. Tais regiões são referidas aqui como X1, X2, X3, X4, X5. A X1 abrange os resíduos de aminoácido 17 – 25, apresenta uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 160 e pode representar um papel no transporte apical para basal de um veículo, por exemplo, permitindo a interação de um veículo com uma proteína ERGIC (por exemplo, ERGIC-53). A X2 abrange os resíduos de aminoácido 170 - 176, apresenta uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 161, e pode representar um papel no acesso do veículo aos compartimentos supranucleares e para deslocar do local apical para o basal de uma célula epitelial, por exemplo, permitindo a interação de um veículo com uma proteína ERGIC. A X3 abrange os resíduos de aminoácido 186 – 202, apresenta a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 162, e pode representar um papel na liberação basal do veículo para dentro dos compartimentos basolaterais, por exemplo, permitindo a interação de um veículo com uma proteína de liberação basal tal como perlecan. A X4 abrange os resíduos de aminoácido 31 – 39, apresenta uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 163, e pode representar um papel no deslocamento do veículo do local apical em uma célula epitelial para o local basal, por exemplo, permitindo a interação de um veículo com uma proteína ERGIC. A X5 abrange os resíduos de aminoácido 135 - 139, apresenta uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 164 e pode representar um papel na entrada apical de um veículo para dentro de uma célula epitelial, por exemplo, permitindo a interação de um veículo com um receptor de entrada apical tal como TMEM132.
[0216] Desta forma, em algumas realizações, um veículo de transcitose inclui os resíduos de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-78 ou 130 nas X1, X2, X3, X4 e/ou X5. Por exemplo, um veículo aqui pode apresentar os aminoácidos 1-266 da SEQ ID NO: 1 ou 2 ou uma sequência apresentando uma identidade de sequência substancial a esta; desde que, no entanto, qualquer uma ou mais das X1, X2, X3, X4, e X5 sejam idênticas às da SEQ ID NO: 1 ou 2. Em uma realização, todas as X1, X2, X3, X4, X5 são idênticas às da SEQ ID NO: 1 ou
2. O mesmo pode ser dito para todos os outros veículos e veículos derivados de Cholix descritos aqui, tais como aqueles providos na TABELA 3 ou TABELA
4.
[0217] Em algumas realizações, os veículos de transcitose excluem aqueles apresentando uma sequência de qualquer uma ou mais das sequências de polipeptídeo de Cholix apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-78 ou 130. Em alguns casos, são excluídos os polipeptídeos que apresentam uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 3 ou uma SEQ ID NO: 3 truncada com um truncamento no terminal C nos resíduos 425-348, 291, 266, 265, 251, 250, 245, 244, 234, 206, 205, 187, 186, 151, 150, 134, 133, bem como o fragmento consistindo nos resíduos 40-187 da SEQ ID NO: 3. Em algumas realizações, os veículos de transcitose excluem os compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma sequência da SEQ ID NO: 126.
[0218] Surpreendentemente, foi identificado também que veículos mais curtos que os veículos de transcitose podem transportar uma carga útil heteróloga para dentro de uma célula epitelial polarizada sem transporte significativo de tal carga útil através da célula epitelial. Tais veículos podem ser referidos aqui como
“veículos de endocitose”. Os veículos de endocitose podem acabar em uma vesícula intracelular ou citosol da célula epitelial.
[0219] Exemplos de veículos de endocitose incluem aqueles apresentando os resíduos de aminoácido de qualquer uma das posições 1-40 para qualquer uma das posições 145-194 da FÓRMULA I (SEQ ID NO: 130). Em algumas realizações, um veículo de endocitose apresenta uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-80 ou 82-120, apresentando um truncamento no terminal C em qualquer uma das posições 145-194 de aminoácido.
[0220] Além disto, qualquer dos veículos de endocitose pode adicionalmente apresentar um truncamento no terminal N. Tal truncamento no terminal N pode remover até 40 aminoácidos do terminal N do veículo. Por exemplo, são contemplados aqui veículos apresentando os aminoácidos VLYY (SEQ ID NO: 186) ou GVLYY (SEQ ID NO: 187) no terminal N que são representativos das posições de aminoácido 41-44 e 40-44 da SEQ ID NO: 130, respectivamente. Em alguns casos, um veículo compreende um grau mais alto de disparidade de sequência nas posições 1-40 em comparação com os aminoácidos 41 até um terminal C (por exemplo, um terminal C em um resíduo de aminoácido selecionado das posições 145-194) da sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-80 ou 82-120 ou SEQ ID NO: 130. Um veículo mais preferivelmente compreende, consiste essencialmente em ou consiste nos resíduos de aminoácido de qualquer uma das posições 1-20 para qualquer uma das posições 150-187 ou de qualquer um dos resíduos de aminoácido nas posições 21-41 para o resíduo de aminoácido na posição 187 ou 205 da sequência de aminoácidos apresentada na FÓRMULA I (SEQ ID NO: 130). A TABELA 5 provê resíduos de aminoácido exemplificativos que um veículo de endocitose pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir em.
TABELA 5 – Resíduos de Aminoácido de Veículos de Cholix Exemplificativos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-78 ou 130
Resíduos AA de Resíduos AA de Cholix Cholix 1-150 1-178 1-151 1-179 1-152 1-180 1-153 1-181 1-154 1-182 1-155 1-183 1-156 1-184 1-157 1-185 1-158 1-186 1-159 1-187 1-160 22-187 1-161 23-187 1-162 24-187 1-163 25-187 1-164 26-187 1-165 27-187 1-166 28-187 1-167 29-187 1-168 30-187 1-169 31-187 1-170 32-187 1-171 33-187 1-172 34-187 1-173 35-187 1-174 38-187 1-175 39-187 1-176 40-187 1-177 41-187
[0221] Em alguns casos, tal veículo apresenta um truncamento no terminal N na posição 39 da FÓRMULA I (SEQ ID NO: 130). Em outros casos, tal veículo apresenta um truncamento no terminal N na posição 40 da FÓRMULA I (SEQ ID NO: 130). Quando tal veículo é também truncado em seu terminal C em qualquer um dos resíduos de aminoácido nas posições 145-206 (isto é, apresentando o resíduo do terminal C de qualquer um dos resíduos 145-206) da sequência apresentada na FÓRMULA I (SEQ ID NO: 130), tal veículo pode ser utilizado para a endocitose de uma carga útil para dentro de uma célula epitelial e transporte de tal carga útil para o(s) compartimento(s) apical(is) de tal célula epitelial (ver, por exemplo, o EXEMPLO 4). Qualquer um destes veículos de endocitose descritos aqui pode compreender também uma modificação no terminal N tal como uma metionina no terminal N. Exemplos de tal veículo são aqueles compreender, consistindo essencialmente em ou consistindo nos resíduos de aminoácido 41-187 da SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 137) ou nos resíduos de aminoácido 40-205 da SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 138).
[0222] Em algumas realizações, um veículo de endocitose pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir nos resíduos de aminoácido 1-150 de qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-78 ou 130. Em algumas realizações, um veículo de endocitose pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir nos resíduos de aminoácido 1-151 de qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-78 ou 130. Em algumas realizações, um veículo de endocitose pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir nos resíduos de aminoácido 1-186 de qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-78 ou 130. Em algumas realizações, um veículo de endocitose pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir nos resíduos de aminoácido 1-187 de qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-78 ou 130. Em um caso, o veículo apresenta os aminoácidos 1-150, 1-151, 1-186 ou 1-187 da SEQ ID NO:
1. Em um outro caso, o veículo apresenta os aminoácidos 1-150, 1-151, 1-186, 1-187 da SEQ ID NO: 2.
[0223] Qualquer um dos veículos de endocitose aqui podem apresentar um grupo funcional (tal como uma metionina) fixado em seu terminal N. Exemplos de veículos de endocitose com uma metionina no terminal N incluem aqueles com as sequências apresentadas em qualquer uma das SEQ ID NOs: 136 ou 139.
[0224] Em outros casos, tal veículo de endocitose compreende os resíduos de aminoácido a partir da posição 40 ou 41 para qualquer um dos resíduos de aminoácido nas posições 187-206 da sequência de aminoácidos apresentada na FÓRMULA I (SEQ ID NO: 130).
[0225] Em tais casos, um veículo de endocitose pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir nos resíduos de aminoácido 40-187 ou 41-187 de qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-80, 82-120 ou
130. Em outros casos, um veículo capaz de transportar uma carga útil heteróloga para dentro de uma célula epitelial polarizada pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir nos resíduos de aminoácido 40-205 ou 41-205 de qualquer uma das sequências apresentadas in SEQ ID NOs: 1-80, 82-120 ou 130.
[0226] Tal veículo pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir nos resíduos de aminoácido 40-187, 41-187, 40-205 ou 41-205 da SEQ ID NO: 1. Sequências de aminoácidos exemplificativas de tais veículos incluem aquelas que consistem em, consistem essencialmente em ou compreendem uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 137 e 138. Tais veículos podem ser capazes de transportar uma carga útil para um compartimento apical de uma célula epitelial polarizada, mas não para um compartimento basal na medida em que estes veículos não possuem os resíduos de aminoácido 1-39 que podem representar um papel no transporte apical para basal.
[0227] Um veículo de endocitose pode compreender o fragmento de endocitose que consiste nos resíduos de aminoácido a partir da posição 134 para a posição 151 da sequência de aminoácidos apresentada na Fórmula I (SEQ ID NO: 130). Em alguns casos, tal fragmento funcional apresenta a sequência apresentada na SEQ ID NO: 165 ou uma sequência com alta (por exemplo, > 90%) identidade de sequência com esta. Veículos exemplificativos incluem aqueles que podem consistir em consistir essencialmente em ou compreender uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 136- 139 (TABELA 6). Veículos que não possuem um ou ambos os fragmentos funcionais com as SEQ ID NOs: 166-167 (TABELA 11) podem transportar carga útil heteróloga para compartimentos apicais de células epiteliais que podem incluir locais em vesículas apicais, no citosol apical da célula e/ou nos sistemas de reciclagem apical tais como endossomos de reciclagem apical. Tal veículo pode interagir com um receptor de entrada apical tal como TMEM132 (por exemplo, TMEM132A), mas não ou não significativamente com proteínas de tráfico basal ou perlecan (HSPG) e podem se localizar conjuntamente com Rab11a em compartimentos apicais da célula epitelial após a endocitose. Em alguns casos, tal veículo pode consistir em consistir essencialmente em ou compreender uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 137-139 (TABELA 6).
TABELA 6 – Veículos de Endocitose Derivados de Cholix Exemplificativos SEQ ID NO Sequência SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEG 136 VLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYV
NQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIG EDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKT
QGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKA SEQ ID NO: MVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHY 137 VNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPI
GEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWK
TQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKA SEQ ID NO: MGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRH 138 YVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVP
IGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQW KTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRW
AHWHTGL SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEG 139 VLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYV
NQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIG EDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDL
[0228] Em outras realizações, um veículo de endocitose pode compreender os fragmentos funcionais que consistem nos resíduos de aminoácido a partir da posição 1 para a posição 40 e da posição 152 para a posição 187, respectivamente, da sequência de aminoácidos apresentada na FÓRMULA I (SEQ ID NO: 130). Em alguns casos, tais fragmentos apresentam as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NO: 166 e 167, respectivamente ou uma sequência com alta (por exemplo, > 90%) identidade de sequência com um ou ambos de tais fragmentos funcionais. Tal veículo pode interagir com um receptor de tráfico apical para basal, mas não significativamente com perlecan. Tal receptor de tráfico habilita tal veículo em transportar uma carga útil para um compartimento supranuclear e/ou basal de uma célula epitelial polarizada. Tal veículo pode consistir em consistir essencialmente em ou compreender os aminoácidos 1-187 da SEQ ID NO: 130. Um exemplo de tal veículo é que apresenta a sequência apresentada na SEQ ID NO: 136.
[0229] Em alguns casos, um veículo de endocitose não é um fragmento da sequência apresentada na SEQ ID NO: 3. Em alguns casos, tal veículo não é um fragmento de qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 4-80 ou 82-120. Em tais casos, um veículo não compreende ou consiste nos resíduos de aminoácido 1-151, 1-187 ou 40-187 da SEQ ID NO: 3. D. Regiões de Sequência Funcional de Veículos
[0230] Em qualquer uma das realizações aqui, uma ou mais regiões de sequência funcional em uma sequência de veículo podem apresentar uma alta (por exemplo, > 90%) identidade de sequência localizada para os resíduos de aminoácido encontrados nestas regiões na FÓRMULA I (SEQ ID NO: 130) de maneira a manter a funcionalidade em numerosos polipeptídeos e realizações. Em alguns casos, os resíduos de aminoácido nestas regiões podem ser restritos àqueles encontrados em polipeptídeos de Cholix de ocorrência natural tais como aqueles apresentando a sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-80 ou 82-120.
1. Domínio de Endocitose
[0231] Em alguns casos, um veículo compreende um domínio que permite que o veículo entre em uma célula epitelial (por exemplo, uma célula epitelial polarizada) no local apical. Em alguns casos, tal domínio permite que o veículo interaja com um receptor de entrada apical. Tal receptor de entrada apical pode ser TMEM132 ou TMEM132A. Tal domínio de interação de TMEM132 pode apresentar uma sequência consensus dos resíduos de aminoácido 135-151 de FÓRMULA I (SEQ ID NO: 130) ou de resíduos de aminoácido das posições
135-151 de qualquer das SEQ ID NOs: 1-120. A TMEM132A é uma proteína de transmembrana que é responsável pela entrada apical de um veículo para uma célula epitelial. De maneira a manter a interação do veículo com a TMEM132A, em algumas realizações, um veículo aqui inclui uma SEQ ID NO: 165 que apresenta uma sequência consensus para um domínio de interação de TMEM132A. Alternativamente, um veículo aqui pode incluir os resíduos de aminoácido 135-151 de qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs: 1-120 ou 130 como seu domínio de interação de TMEM132.
[0232] Além disto, é surpreendentemente presumido que sub-regiões no domínio de interação de TMEM132 podem ser particularmente relevantes para a entrada apical do veículo. Desta forma, um veículo aqui pode interagir com um receptor de entrada apical tal como TMEM132 por meio de uma região de interação com um motivo de aminoácido apresentando os resíduos de aminoácido 135-139 da SEQ ID NO: 130 (por exemplo, “DQQRN” da SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 164). Desta forma, qualquer um dos veículos aqui (incluindo seus polipeptídeos) pode incluir tal motivo ou todo o domínio de interação de TMEM132 (por exemplo, a SEQ ID NO: 165) de maneira a prover a entrada nas células epiteliais no lado apical. Na medida em que tais regiões podem apresentar funções dentro do veículo, as sequências de aminoácidos em tais regiões podem ser conservadas ou apresentam apenas até 1, 2 ou 3, resíduos de aminoácido que são substituições, inserções e/ou deleções.
[0233] Qualquer dos veículos aqui pode incluir um domínio de interação de TMEM132 ou regiões de interação de receptor de maneira a entrar na célula epitelial. Por exemplo, um veículo compreendendo os resíduos de aminoácido 1- 151 da SEQ ID NO: 1, que inclui um domínio de interação de TMEM132 da SEQ ID NO: 165 pode entrar em células epiteliais no lado apical. Similarmente, um veículo de Cholix266, tal como um veículo compreendendo os resíduos de aminoácido 1-266 da SEQ ID NO: 1 (por exemplo, a SEQ ID NO: 181), inclui o domínio de TMEM132 e pode tanto entrar no lado apical das células epiteliais por meio do domínio de TMEM132 quanto transportar uma carga útil heteróloga através de uma célula epitelial polarizada. Outros veículos exemplificativos compreendendo um domínio de interação de TMEM132 são Cholix187, Cholix206, Cholix245, Cholix251 e Cholix386 (por exemplo, as SEQ ID NOs: 136, e 180-184). Em alguns casos, um veículo é um apresentando os resíduos de aminoácido 1- 187, 1-206, 1-245, 1-251, 1-266 ou 1-386 da SEQ ID NO: 1.
[0234] Por outro lado, um veículo não possuindo um domínio de interação de TMEM132, tal como M-Cholix134 apresentando a SEQ ID NO: 140 pode permanecer no lúmen intestinal e não ou não significativamente (por exemplo, menos de 10% do material do veículo que foi aplicado à superfície apical) entrar em uma célula epitelial (ver, por exemplo, o EXEMPLO 6).
2. Domínios Orientados para Compartimento Supranuclear e Basal
[0235] Em alguns casos, um veículo compreende os resíduos de aminoácido 1-40 do terminal N da sequência apresentada na FÓRMULA I (SEQ ID NO: 130). Tal veículo pode ser utilizado para transportar uma carga útil heteróloga de um compartimento apical para um compartimento supranuclear ou compartimento basal (para compartimento submucosos, se tal veículo puder também interagir com uma proteína de liberação basal tal como perlecan) de uma célula epitelial após a endocitose do veículo na célula. Exemplos de tais veículos incluem aqueles compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 131-135 (TABELA 4).
[0236] Em alguns casos, um veículo compreende os resíduos de aminoácido 17-25 e/ou 31-39 da sequência apresentada na FÓRMULA I (SEQ ID NO: 130). Tais regiões podem ser restritas àqueles resíduos de aminoácido encontrados no polipeptídeo de Cholix de ocorrência natural ou incluir até 1, 2, 3 ou 4 substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos. A(s) substituição(ões) podem ser uma ou mais substituições conservativas ou não conservativas. As 1, 2, 3 ou 4 substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos podem preservar uma função dos aminoácidos 17-25 e/ou 31-39. Em alguns casos, um veículo apresenta uma sequência de ocorrência natural em 17-25 e/ou 31-39. Em tais casos, os aminoácidos 17-25 de um veículo podem apresentar a sequência da SEQ ID NO: 160 e/ou os aminoácidos 31-39 do veículo podem apresentar a sequência da SEQ ID NO: 163. A função dos aminoácidos 17-25 e 31-39 pode ser transportada apical para basal. Tal função pode ser determinada como descrito aqui, por exemplo, pela geração de veículos compreendendo truncamentos no terminal N em tais resíduos e comparar com as capacidades de transporte apical para basal destes veículos para aqueles que não apresentam um truncamento no terminal N (ver, por exemplo, os EXEMPLOS 5 e 6). Veículos exemplificativos compreendendo tais regiões e sendo capazes de transporte apical para supranuclear e/ou para basal podem compreender, consistir essencialmente em ou consistir nos resíduos de aminoácido 1-187, 1-206, 1-245, 1-251, 1-266, e 1-386 da sequência apresentada na SEQ ID NO: 1. Em tais casos, um veículo pode consistir na sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 131-136.
[0237] Em alguns casos, um veículo usa um domínio adicional para acessar o compartimento supranuclear e/ou basal. Tal domínio pode apresentar uma sequência consensus dos resíduos de aminoácido 152-187 de FÓRMULA I (SEQ ID NO: 130) ou dos resíduos de aminoácido das posições 152-187 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-120. A função deste domínio pode ser a de acessar regiões supranucleares no interior de uma célula epitelial, alcançar compartimentos basais no interior de uma célula epitelial, e/ou para a localização conjunta do veículo com elementos da rede trans-Golgi tal como a proteína de revestimento I (COPI).
[0238] For exemplo, veículos tais como Cholix187 ou Cholix206, por exemplo, veículos com a sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 136 e 131, respectivamente, que incluem tal região de orientação supranuclear e basal são capazes de acessar regiões supranucleares e compartimentos basais no interior de uma célula epitelial, enquanto um veículo sem tal domínio, tal como um Cholix151 (por exemplo, a SEQ ID NO: 139) permanece no lado apical da célula epitelial e não acessa significativamente regiões supranucleares ou compartimentos basais (ver, por exemplo, o EXEMPLO 6).
[0239] Acredita-se que a sequência dos resíduos de aminoácido 170-176 da SEQ ID NO: 130 (por exemplo, “TRPEHNI,” SEQ ID NO: 161) pode ser de relevância particular para um veículo acessar tais compartimentos supranucleares e basais e se localizar conjuntamente com a COPI.
[0240] Assim, em alguns casos, um veículo compreende um domínio de orientação supranuclear e basal ou sequência consensus dos resíduos de aminoácido 170-176 da Fórmula I (SEQ ID NO: 130) ou SEQ ID NO: 161 (correspondendo aos resíduos de aminoácido 170-176 da SEQ ID NO: 1). Tal veículo pode incluir também um domínio de interação de TMEM132A como descrito acima.
[0241] O domínio de orientação supranuclear e basal é um que apresenta variações mínimas de sequência. Como tal, um veículo aqui pode compreender um domínio de orientação supranuclear e basal que apresenta os resíduos de aminoácido de polipeptídeos de ocorrência natural tais como os de SEQ ID NOs: 3-120 ou pode compreender apenas até 1, 2 ou 3 resíduos de aminoácido que são substituições, inserções e/ou deleções em relação aos resíduos dos polipeptídeos de ocorrência natural tais como aqueles das SEQ ID NOs: 3-120.
[0242] Veículos exemplificativos compreendendo um domínio de orientação supranuclear são Cholix187, Cholix206, Cholix245, Cholix251, Cholix266 e Cholix386. Em alguns casos, um veículo é um apresentando os resíduos de aminoácido 1- 187, 1-206, 1-245, 1-251, 1-266 ou 1-386 da SEQ ID NO: 1.
3. Domínio de Transcitose
[0243] Em alguns casos, um veículo compreende um domínio de transcitose. Tal domínio preferivelmente pode incluir uma sequência consensus dos resíduos de aminoácido 188-206 de FÓRMULA I (SEQ ID NO: 130) ou dos resíduos de aminoácido das posições 188-206 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-120. A função dos resíduos de aminoácido 188-206 pode ser multifacetada e pode representar um papel na transcitose. A região de transcitose pode permitir a interação de um veículo com parceiros de interação semelhantes a receptor de transporte (também referidos aqui como “TRIPs”), retículo endoplasmático do compartimento intermediário de Golgi 53 (ERGIC-53, também referido aqui como LMAN1), proteína regulada por glicose 75 (GRP75) e perlecan em uma maneira dependente de pH e/ou sequencial. Tais interações podem permitir que o veículo acesse os sistemas de reciclagem basal que liberam o veículo (juntamente com qualquer carga útil heteróloga acoplada a ele) a partir da membrana basal da célula epitelial para o compartimento basolateral (por exemplo, a lamina propria).
[0244] Exemplos de veículos capazes de transcitose incluem veículos derivados de Cholix tais como Cholix206, Cholix245, Cholix251, Cholix266 e Cholix386. Em alguns casos, tais veículos apresentam uma sequência de aminoácidos daqueles com os resíduos de aminoácido 1-206, 1-245, 1-251, 1-266 e 1-386 da SEQ ID NO: 130. Em alguns casos, tais veículos apresentam uma sequência de aminoácidos daqueles com os resíduos de aminoácido 1-206, 1-245, 1-251, 1-266 e 1-386 da SEQ ID NO: 1. Em alguns casos, tais veículos apresentam uma sequência de aminoácidos daqueles com os resíduos de aminoácido 1-206, 1-245, 1-251, 1-266 e 1-386 da SEQ ID NO: 2. Exemplos de tais veículos com grupo funcional, metionina no terminal N, são providos nas SEQ ID NO: 131 – SEQ ID NO: 135. Tal veículo (por exemplo, Cholix206, Cholix245, Cholix251, Cholix266 e Cholix386) pode ser utilizado para transporte rápido (por exemplo, pelo menos 10-6 cm/s, 10-5 cm/s) e eficiente (por exemplo, pelo menos 5%, 10%, 20%, 25% ou 50% do material aplicado à superfície apical) de uma carga útil através de uma célula epitelial (ver, por exemplo, EXEMPLO 5).
[0245] É postulado que a sequência dos resíduos de aminoácido 188-206 (por exemplo, “AQKEGSRHKRWAHWHTGLA,” SEQ ID NO: 168) com seus um ou mais resíduos de histidina pode atuar como um comutador de pH, permitindo, desta forma, que o veículo interaja com TRIPs tal como TMEM132, LMAN1, GRP75 e perlecan de maneira sequencial e/ou dependente de pH.
[0246] A TABELA 7 abaixo mostra sequências adicionais de polipeptídeo derivado de Cholix descritas aqui.
TABELA 7 - Exemplos adicionais de Sequências de Polipeptídeo derivado de Cholix SEQ ID NO Sequência SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEG 140 VLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYV
NQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIG
EDSPASIKISVDEL SEQ ID NO: VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVL 179 YYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQ
DAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDS PASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGN VSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHT GLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAG TPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGV PLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHL
DSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINE SEQ ID NO: VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVL 189 YYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQ
DAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDS PASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGN VSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHT GLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAG TPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGV PLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHL DSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTV ARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKS CVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQ ELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPR GNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLP TRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQ VIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDTVIGWDMAIHAVAIPSTI
PGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK III. Carga útil heteróloga
[0247] As cargas úteis heterólogas contempladas aqui podem ser de qualquer natureza, incluindo terapêutica, diagnóstica e de formação de imagem. Uma carga útil pode ser parte de um construto de aplicação. Um construto de aplicação pode incluir um veículo acoplado a uma carga útil heteróloga. A carga útil pode ser acoplada diretamente ou indiretamente, covalentemente ou não covalentemente ao veículo. Quando fixada covalentemente, uma carga útil pode ser diretamente fixada a um veículo ou por meio de um espaçador.
[0248] A carga útil heteróloga pode ser uma molécula pequena, um ácido nucleico, um polipeptídeo, uma proteína, uma nanopartícula ou uma combinação destes. Cargas úteis terapêuticas
[0249] Em alguns casos, a carga útil terapêutica é um polipeptídeo tal como, por exemplo, uma citocina, um hormônio, um fator de crescimento, um anticorpo terapêutico, um ácido nucleico, um antígeno, uma enzima, fator de coagulação, neurotransmissor ou um polímero.
[0250] As citocinas providas aqui incluem quimiocinas e interleucinas (também abreviadas aqui como “ILs”). A interleucina pode ser uma IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL- 27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36, IL-37, IL-38, IL-39 ou IL-40.
[0251] Em alguns casos, a interleucina é uma IL-10 ou uma IL-22. A interleucina pode ser proveniente de qualquer espécie (por exemplo, de um humano ou de um roedor) e é preferivelmente de um organismo ao qual se pretende administrar a carga útil ou construto de aplicação compreendendo tal carga útil. Desta forma, em alguns casos, a interleucina é uma interleucina humana. Uma interleucina provida aqui pode ser um precursor de uma interleucina madura secretada. Tal interleucina precursora pode compreender uma sequência de peptídeos sinalizadora. Por exemplo, em alguns casos, uma carga útil terapêutica pode ser um precursor de uma proteína madura secretada. Em outros casos, a carga útil terapêutica é a proteína secretada. Por exemplo, em alguns casos, a carga útil compreende, consiste essencialmente em ou consiste na SEQ ID NO 141, que é um precursor de comprimento total da IL-22. Em outros casos, a carga útil compreende, consiste essencialmente em ou consiste na SEQ ID NO: 142, que é uma forma secretada da IL-22. Em um outro exemplo, a carga útil compreende, consiste essencialmente em ou consiste na SEQ ID NO 144, que é um precursor de comprimento total da IL-10. Em outros casos, a carga útil compreende, consiste essencialmente em ou consiste na SEQ ID NO: 145, que é uma forma secretada da IL-10.
[0252] Uma carga útil heteróloga pode compreender uma metionina no terminal N. Por exemplo, uma carga útil de IL-22 pode compreender uma metionina no terminal N. Em tais casos, a IL-22 pode apresentar uma sequência da SEQ ID NO: 143.
[0253] Em algumas realizações, a carga útil terapêutica é uma IL-22. A IL- 22 pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir em uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99%% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 141 ou SEQ ID NO: 142 ou um fragmento funcional destas. Em algumas realizações, a carga útil terapêutica compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 142.
[0254] Em algumas realizações, a carga útil terapêutica é uma IL-10. The IL- 10 pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir em uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99%% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 144 ou SEQ ID NO: 145 ou um fragmento funcional destas. Em algumas realizações, a carga útil terapêutica compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 145.
[0255] Os hormônios providos aqui incluem hormônios peptídicos e polipeptídicos. Tais hormônios podem incluir hormônios de crescimento, por exemplo, hormônio de crescimento humano (também referido aqui como hGH ou somatotropina); hormônios pituitários, por exemplo, gonadotropina coriônica, cosintropina, menotropinas, iorticotropina, protirelina, tirotropina, vasopressina, lipressina; hormônios da paratireoide; hormônios da tireoide; hormônios testiculares; hormônios gastrointestinais, por exemplo, polipeptídeo inibidor gástrico, fator de crescimento epidérmico-urogastrone, polipeptídeo inibidor gástrico, peptídeo de liberação de gastrina, gastrinas, pentagastrina, tetragastrina, motilina, neuropeptídeo Y, peptídeo YY, secretina, peptídeo intestinal vasoativo, sincalide; hormônios incretina, por exemplo, peptídeo-1 semelhante a glucagon1 (GLP-1) e polipeptídeo insulinotrópico dependente de glicose (GIP); hormônios metabólicos, por exemplo, insulina; e quaisquer derivados ou fragmentos destes.
[0256] Em algumas realizações, o hormônio é um hormônio de crescimento humano compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NOs: 146 ou 190 ou um fragmento destas.
[0257] Em algumas realizações, a carga útil terapêutica é um agente redutor de glicose. Em tais casos, a carga útil pode ser um agente de GLP-1 ou um agonista de GLP-1. Tal agonista pode ser Exenatídeo ou Liraglutide. Em outros casos, o agente redutor de glicose pode ser uma incretina, uma pró-proteína de glucagon, um peptídeo semelhante a glucagon (por exemplo, outro que não GLP- 1), um polipeptídeo relacionado a glicentina, uma exendin-3, uma exendin-4, lixisenatide (nome comercial Adlyxin® e Lyxumia®, Sanofi), liraglutide (nome comercial Victoza®, Novo Nordisk A/S), semaglutide (nome comercial Ozempic®, Novo Nordisk A/S), albiglutide (nome comercial Tanzeum®, GlaxoSmithKline; dímero de GLP-1 fundido a albumina), dulaglutide (nome comercial Trulicity®, Eli Lilly), um polipeptídeo insulinotrópico dependente de glicose, Tirzepatide (Eli Lilly), Agonista do Receptor Duplo de Amilina Calcitonina DACRA-089, Glargine/Lantus®, Glulisin/Apidra®, Glarine/Toujeo®, Insuman®, Detemir/Levemir®, Lispro/Humalog®/Liprolog®, Humulin®, Linjeta, SuliXen®, NN1045, Insulin plus SymlinTM, PE0139, insulinas de ação rápida e de ação curta (por exemplo Linjeta, PH20, NN1218, HinsBet), (APC-002) hidrogel, insulinas orais, inaláveis, transdérmicas e sublinguais (por exemplo Exubera®, Nasulin®, Afrezza®, Tregopil®, TPM 02,
Capsulin, Oral-lyn®, Cobalamin®, insulina oral, ORMD-0801, NN1953, NN1954, NN1956, VIAtab, e insulina oral Oshadi).
[0258] Em alguns casos, a carga útil terapêutica é um anticorpo terapêutico ou um fragmento de ligação deste. Os anticorpos terapêuticos podem incluir anticorpos anti-TNFα. Tais anticorpos anti-TNFα podem ser humanizados ou anticorpos humanos. Os agentes anti-TNFα pode incluir infliximab (Remicade®), adalimumab (Humira®) ou etanercept (ENBREL®).
[0259] Em alguns casos, a carga útil é um agente antineoplásico t. Os agentes antineoplásicos podem incluir nitrosoureias, por exemplo, carmustina, lomustina, semustina, estrepzotocina; metilhidrazinas, por exemplo, procarbazina, dacarbazina; hormônios esteroidais, por exemplo, glicocorticoides, estrogênios, progestinas, androgênios, tetrahidrodesoxicaricosterona; compostos imunoativos tais como imunossupressores, por exemplo, pirimetamina, trimetopterina, penicilamina, ciclosporina, azatioprina; e imunoestimulantes, por exemplo, levamisol, dietil ditiocarbamato, encefalinas, endorfinas; compostos antimicrobianos tais como antibióticos, por exemplo, beta-lactama, penicilina, cefalosporinas, carbapenimas e monobactamas, inibidores de beta-lactamase, aminoglicosídeos, macrolídeos, tetraciclinas, espectinomicina; antimaláricos, amebicidas; anti protozoários; antifúngicos, por exemplo, anfotericina-beta, antivirais, por exemplo, aciclovir, idoxuridina, ribavirina, trifluridina, vidarbina, ganciclovir; parasiticidas; antihelmínticos; produtos radiofarmacêuticos; fármacos gastrointestinais; compostos hematológicos; imunoglobulinas; proteínas da coagulação sanguínea, por exemplo, fator anti-hemofílico, complexo do fator IX; anticoagulantes, por exemplo, dicumarol, heparina Na; inibidores de fibrolisina, por exemplo, ácido tranexâmico; fármacos cardiovasculares; fármacos antiadrenérgicos periféricos; fármacos anti-hipertensivos de ação central, por exemplo, metildopa, metildopa HCl; vasodilatadores anti- hipertensivos diretos por exemplo, diazóxido, hidralazina HCl; fármacos que afetam o sistema renina-angiotensina; vasodilatadores periféricos, por exemplo, fentolamina; fármacos anti-angina; glicosídeos cardíacos; inodilatadores, por exemplo, amrinona, milrinona, enoximona, fenoximona, imazodan, sulmazol; anti-disritmias; bloqueadores da entrada de cálcio; fármacos que afetam lipídeos do sangue, por exemplo, ranitidina, bosentan, rezulin; fármacos respiratórios; fármacos simpatomiméticos, por exemplo, albuterol, mesilato de bitolterol, dobutamina HCl, dopamina HCl, efedrina sódica (So), epinefrina, fenfluramina HCl, isoproterenol HCl, metoxamina HCl, bitartarato de norepinefrina, fenilefrina HCl, ritodrine HCl; fármacos colinomiméticos, por exemplo, acetilcolina HCl; anticolinesterases, por exemplo, cloreto de edrofônio (Cl); reativadores de colinesterase; fármacos de bloqueio adrenérgico, por exemplo, acebutolol HCl, atenolol, esmolol HCl, labetalol HCl, metoprolol, nadolol, mesilato de fentolamina, propanolol HCl; fármacos antimuscarínicos, por exemplo, metilbrometo de anisotropina, atropina, brometo de clinidío (Br), glicopirrolato, ipratrópio Br, escopolamina HBr; fármacos de bloqueio neuromuscular; fármacos despolarizantes, por exemplo, besilato de atracurio, hexafluorênio Br, iodeto de metocurina, succinilcolina Cl, tubocurarina Cl, vecurônio Br; relaxantes musculares de ação central, por exemplo, baclofen; neurotransmissores e agentes neurotransmissores, por exemplo, acetilcolina, adenosina, trifosfato de adenosina; aminoácidos neurotransmissores, por exemplo, aminoácidos excitatórios, GABA, glicina; neurotransmissores de amina biogênica, por exemplo, dopamina, epinefrina, histamina, norepinefrina, octopamina, serotonina, tiramina; neuropeptídeos, óxido nítrico; fármacos antiparkinson, por exemplo, amaltidina HCl, mesilato de benztropina, carbidopa; fármacos diuréticos, por exemplo, diclorfenamida, metazolamida, bendroflumetiazida, politiazida; fármacos anti-enxaqueca, por exemplo, mesilato de carboprost trometamina ou maleato de metisergide ou um derivado funcional destes.
[0260] Em alguns casos, a carga útil é uma enzima tal como hialuronidase, estreptoquinase, ativador de plasminogênio tissular, uroquinase, PGE-adenosina deaminase; anestésicos intravenosos tais como droperidol, etomidate, citrato de fetanil/droperidol, hexobarbital, cetamina HCl, metohexital Na, tiamilal Na,
tiopental Na; antiepiléticos, por exemplo, carbamazepina, clonazepam, divalproex Na, etosuximida, mefeniloina, parametadiona, feniloina, primidona. Em várias realizações, a carga útil biologicamente ativa é uma enzima selecionada de hialuronidase, estreptoquinase, ativador de plasminogênio tissular, uroquinase ou PGE-adenosina deaminase.
[0261] A TABELA 8 mostra sequências de aminoácidos de cargas úteis terapêuticas exemplificativas providas aqui.
TABELA 8 – Sequências de Aminoácidos de Cargas Úteis Terapêuticas Exemplificativas SEQ ID NO Sequência SEQ ID NO: MAALQKSVSSFLMGTLATSCLLLLALLVQGGAAAPISSHC 141 RLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLF
HGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVV PFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESG
EIKAIGELDLLFMSLRNACI SEQ ID NO: APISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVR 142 LIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQP
YMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVK
KLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI SEQ ID NO: MAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDV 143 RLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQ
PYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTV
KKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI SEQ ID NO: MHSSALLCCLVLLTGVRASPGQGTQSENSCTHFPGNLPNM 144 LRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGC
QALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLR LRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMS
EFDIFINYIEAYMTMKIRN SEQ ID NO: SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMK 145 DQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQA
ENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKA
VEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN SEQ ID NO: FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQK 146 YSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQ
SWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTL MGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLL
YCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF SEQ ID NO: MFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQ 190 KYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLI
QSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQT LMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLL
YCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF SEQ ID NO: H-HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerLysGlnMetGluGluGlu 195 AlaValArgLeuPheIleGluTrpLeuLysAsnGlyGlyProSerSerGlyAla ProProProSer-NH2 IV. Espaçador
[0262] Um veículo pode ser acoplado a uma carga útil heteróloga por meio de um espaçador. Um espaçador provido aqui pode prover flexibilidade estérica, dobramento preciso e/ou atividade e função biológicas apropriadas tanto do veículo quanto da carga útil.
[0263] Um espaçador pode compreender um ou mais resíduos de aminoácido. Em alguns casos, o espaçador é um espaçador a base de aminoácido. Tal espaçador pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir em pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 35, 50, 75 ou 100 resíduos de aminoácido. Em alguns casos, um espaçador compreende, consiste essencialmente em ou consiste em no máximo cerca de 30, 25, 20, 15 ou 10 resíduos de aminoácido. Em alguns casos, a maioria (por exemplo, mais de 90%) destes resíduos de aminoácido são resíduos de glicina e/ou serina.
[0264] Um espaçador pode ser um espaçador passível de clivagem ou um espaçador não passível de clivagem. Em alguns casos, um espaçador passível de clivagem pode ser clivado por uma enzima, por exemplo, uma protease. Um espaçador não passível de clivagem pode ser passível de clivagem por tal enzima. Por exemplo, um espaçador não passível de clivagem pode ser utilizado nos casos em que concentrações sistêmicas mais altas de uma carga útil são um objetivo.
[0265] Um espaçador pode compreender uma ou mais repetições de sequências de oligopeptídeo glicina-serina. Desta forma, em alguns casos, um veículo compreende, consiste essencialmente em ou consiste nas sequências de aminoácidos (GS)x (SEQ ID NO: 169), (GGS)x (SEQ ID NO: 170), (GGGS)x (SEQ ID NO: 171), (GGGGS)x (SEQ ID NO: 172) ou (GGGGGS)x (SEQ ID NO: 173), onde x = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15. Em alguns casos,
um espaçador compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos (GGGGS)x (SEQ ID NO: 174), onde x = 1, 2, 3, 4 ou 5. Em tais casos, um espaçador pode consistir em 5, 10, 15, 20 ou 25 aminoácidos.
[0266] Exemplos de espaçadores providos aqui são aqueles compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 50%, 75%, 90% ou 99% de identidade de sequência com GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 175), GGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO: 176) ou GGGGSNLQGGLRQPR (SEQ ID NO: 177), um fragmento de qualquer uma das acima ou uma combinação de quaisquer das acima. Em alguns casos, o espaçador consiste na sequência de aminoácidos apresentada em qualquer um das SEQ ID NO: 196 (GGGGS) ou SEQ ID NO: 197 (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS). Em alguns casos, qualquer espaçador acima pode compreender um resíduo adicional de glicina ou serina ou no terminal N e/ou no terminal C.
[0267] Em algumas realizações, o acoplamento do espaçador a um veículo para uma carga útil terapêutica compreende uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 50%, 75%, 90% ou 99% de identidade de sequência com as SEQ ID NOs: 175-176. V. Construtos de Aplicação
[0268] São providos aqui construtos de aplicação (por exemplo, um complexo veículo-carga útil) que pode compreender um veículo acoplado a uma carga útil heteróloga. Um veículo pode ser acoplado a tal carga útil covalentemente ou não covalentemente (por exemplo, por meio de interações iônicas, interações de van der Waals, interações π-π etc.). Um veículo pode ser acoplado diretamente ou indiretamente a uma carga útil heteróloga.
[0269] Uma carga útil heteróloga pode ser acoplada a um terminal N e/ou terminal C de um veículo. Em alguns casos, uma carga útil heteróloga é diretamente e covalentemente acoplada a um terminal C de um veículo pela formação de uma ligação amida covalente entre o grupo carboxil do terminal C do veículo e a amina do terminal N da carga útil heteróloga. Em alguns casos,
uma carga útil heteróloga é indiretamente e covalentemente acoplada ao veículo por meio de um espaçador.
[0270] Desta forma, em alguns casos, quando um veículo é covalentemente acoplado a uma carga útil, o construto de aplicação pode ser representado de acordo com a Fórmula II: C-S-P ou Fórmula III: P-S-C, onde C é um veículo, S é um espaçador ou opcionalmente uma ligação e P é uma carga útil heteróloga. Um construto de aplicação pode compreender adicionalmente uma ou mais modificações em seu terminal N e/ou terminal C. Tal(is) modificação(ões) pode(m) incluir um resíduo de metionina no terminal N. Desta forma, a Fórmula II e a Fórmula III podem incluir também uma metionina no terminal N (por exemplo, M+C-S-P) ou (por exemplo, M+P-S-C).
[0271] Um veículo pode ser acoplado a uma carga útil heteróloga por meio de conjugação química/sintética (por exemplo, pela utilização de reações de acoplamento de amida) ou por expressão recombinante em uma célula bacteriana (por exemplo, em E. coli) ou de mamífero (por exemplo, célula de ovário de hamster chinês (CHO)) como uma proteína de fusão.
[0272] Um construto de aplicação ou parte deste (por exemplo, o veículo e/ou espaçador) pode ser um polipeptídeo. O termo “polipeptídeo”, tal como utilizado aqui, pode incluir aminoácidos tanto naturais quanto não naturais.
[0273] Os construtos de aplicação providos aqui podem sofrer transcitose através de células epiteliais polarizadas com uma alta taxa de fluxo por meio de uma ou mais interações de afinidade moderada, dinâmicas de alta capacidade e/ou dependentes de pH do veículo com um ou mais parceiros de interação semelhantes a receptor de transporte (TRIPs). Tais TRIPs podem ser elementos de uma rota de tráfico endógena e, como tal, podem permitir que um veículo transporte carga útil heteróloga através da barreira da célula epitelial sem prejudicar a barreira em si e sem alterar significativamente (por exemplo, modificando quimicamente/enzimaticamente) o veículo ou a carga útil.
[0274] Além disto, as interações com TRIPs podem permitir que um veículo transporte uma carga útil através de um epitélio intacto (por exemplo, um epitélio de intestino polarizado) com taxas de transporte de pelo menos cerca de 10-6 cm/s, 10-5 cm/s ou 10-4 cm/s.
[0275] Em alguns casos, um veículo é indiretamente acoplado de forma não covalente a uma carga útil. Em tais casos, as nanopartículas (por exemplo, lipossomos, nanopartículas metálicas, nanopartículas a base de polímeros etc.) podem ser carregadas (por exemplo, no interior e/ou na superfície da partícula) com moléculas da carga útil (por exemplo, IL-10, IL-22, GLP-1 etc.) e molécula(s) de veículo derivado de Cholix pode(m) ser acoplada(s) a tais nanopartículas (por exemplo, em sua superfície). Em alguns casos, uma proporção de carga útil para veículo pode ser de pelo menos cerca de 15000:1, 10000:1, 5000:1, 2500:1, 1000:1, 500:1, 250:1, 100:1, 50:1, 25:1, 10:1, 5:1, 2.5:1, 1:1. Isto pode permitir o transporte de tais nanopartículas contendo carga útil para dentro ou através de células epiteliais polarizadas (por exemplo, células epiteliais intestinais polarizadas) pela utilização de veículos derivados de Cholix fixados na superfície. Em alguns casos, uma nanopartícula pode liberar a carga útil após a transcitose ou liberação intracelular. Nos casos em que a nanopartícula é transportada através de células epiteliais, a carga útil liberada pode se ligar a receptores dentro do tecido submucoso (por exemplo, a lamina propria) e/ou pode entrar na circulação sistêmica e, assim, prover sistemicamente uma certa função (por exemplo, uma função terapêutica ou de diagnóstico). Em outros casos, onde uma nanopartícula libera a carga útil no interior de uma célula epitelial, a carga útil (por exemplo, um ácido nucleico) pode prover certas funções intracelulares, por exemplo, a produção de transgenes nestas células, modulação da expressão genética etc. Construtos de Aplicação Exemplificativos
[0276] Em várias realizações, um construto de aplicação ou complexo veículo-carga útil compreende (a) um veículo compreendendo um polipeptídeo de Cholix que não compreender a SEQ ID NO: 179, e não consiste na SEQ ID NO: 126, complexado com (b) uma carga útil heteróloga, onde o veículo é capaz de (i) transcitose da carga útil heteróloga através de uma célula epitelial polarizada; ou (ii) transporte da carga útil heteróloga para dentro da célula epitelial polarizada.
[0277] Em algumas realizações, um construto de aplicação compreende um veículo derivado de Cholix compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência com os resíduos de aminoácido 1-386 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 ou 2.
[0278] Em algumas realizações, um construto de aplicação compreende um veículo derivado de Cholix compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência com os resíduos de aminoácido de qualquer a partir de qualquer uma das posições 1-40 para qualquer um dos resíduos de aminoácido nas posições 150-347 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1. Em alguns casos, tal veículo compreende, consiste essencialmente em ou consiste em pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência com os resíduos de aminoácido das posições 1-151, 1-187, 41-187, 1-206, 1-245, 1-251 ou 1-266 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1. Em outros casos, um veículo compreende, consiste essencialmente em ou consiste em pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência com os resíduos de aminoácido das posições 1-151, 1-187, 41-187, 1-206, 1-245, 1-251 ou 1-266 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2.
[0279] Qualquer um de tais veículos podem ser acoplado a uma carga útil terapêutica compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência com as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 141, 142, 144, 145 e 146.
[0280] Tal carga útil terapêutica pode ser acoplada a um veículo derivado de Cholix por meio de um espaçador compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em pelo menos 66%, 73%, 80%, 86%, 93% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 175).
[0281] Desta forma, em alguns casos, um construto de aplicação compreende um veículo compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 134 acoplada por meio de um espaçador a uma carga útil terapêutica compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 142. Em alguns casos, o espaçador compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 66%, 73%, 80%, 86%, 93% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 175.
[0282] Em outros casos, um construto de aplicação compreende um veículo compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 135 acoplada por meio de um espaçador a uma carga útil terapêutica compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 142. Em alguns casos, o espaçador compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 66%, 73%, 80%, 86%, 93% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 175.
[0283] Em alguns casos, um construto de aplicação compreende um veículo compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 134 por meio de um espaçador compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 66%, 73%, 80%, 86%,
93% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 175 a uma carga útil terapêutica. Tal carga útil terapêutica pode ser uma citocina, um hormônio ou um anticorpo terapêutico ou fragmento de ligação funcional destes. Em alguns casos, a carga útil terapêutica compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência com as SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 145 ou SEQ ID NO: 146.
[0284] Em alguns casos, um construto de aplicação compreende um veículo compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 135 por meio de um espaçador compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 66%, 73%, 80%, 86%, 93% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 176 a uma carga útil terapêutica. Tal carga útil terapêutica pode ser uma citocina, um hormônio ou um anticorpo terapêutico ou um fragmento de ligação funcional destes. Em alguns casos, a carga útil terapêutica compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 145.
[0285] Em alguns casos, um construto de aplicação compreende, consiste essencialmente em ou consiste em pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 147-150, 152-159 ou 188.
[0286] Em algumas realizações, um construto de aplicação consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 147.
[0287] Em algumas realizações, um construto de aplicação consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 149.
[0288] Em algumas realizações, um construto de aplicação consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 188.
[0289] Sequências de aminoácidos de construtos de aplicação exemplificativos são mostradas na TABELA 9.
TABELA 9 – Sequências de Aminoácidos de Construtos de Aplicação Exemplificativos SEQ ID NO Sequência SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYY 147 SMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVI
HLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEL DQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAIS WPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYI TQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHF SKGGGGGSGGGGSGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFM LAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTL EEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRN
VQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYY 148 SMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVI
HLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEL DQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAIS WPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYI TQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHF SKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQ NIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENN PGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAGGGGSG GGGSGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLAD NNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDR FQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVK
KLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYY 149 SMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVI
HLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEL DQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAIS WPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYI TQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHF SKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQ NIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENN PGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAGGGGSG GGGSGGGGSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVK TFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVM PQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKA VEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN
SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYY 150 SMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVI
HLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEL DQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAIS WPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYI TQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHF SKGGGGGSNLQGGLRQPRFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAF DTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQK SNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLL KDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALL
KNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYY 151 SMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVI
HLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEL GGGGSGGGGSGGGGSFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTY QEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNL ELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDL EEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNY
GLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYY 152 SMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVI
HLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEL DQQRNIIEVPKLYSIDLGGGGSGGGGSGGGGSFPTIPLSRLFDNA MLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSES IPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLV YGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSK FDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEG
SCGF SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYY 153 SMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVI
HLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEL DQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAIS WPSVSYKAGGGGSGGGGSGGGGSFPTIPLSRLFDNAMLRAHRL HQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNRE ETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSN VYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHN
DDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF SEQ ID NO: MVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQ 154 DAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASI
KISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTR PEHNIAISWPSVSYKAGGGGSGGGGSGGGGSFPTIPLSRLFDNA MLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSES IPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLV YGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSK FDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEG
SCGF SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYY 155 SMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVI
HLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEL DQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAIS WPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLAGGGGSGGGGSGGG GSFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKY SFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLE PVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDG SPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKV
ETFLRIVQCRSVEGSCGF SEQ ID NO: MGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVN 156 QDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPA
SIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVT RPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLGGGGSGG GGSGGGGSFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYI PKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLL IQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLM GRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRK
DMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFHHHHHH SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYY 157 SMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVI
HLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEL DQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAIS WPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYI TQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVGGGGSGGGGSGGGGSFP TIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQ NPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQF LRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRT GQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFL
RIVQCRSVEGSCGF SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYY 158 SMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVI
HLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEL DQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAIS WPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYI TQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGGGGGSGGGGSG GGGSFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQ KYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSW LEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLE DGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMD KVETFLRIVQCRSVEGSCGF
SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYY 159 SMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVI
HLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEL DQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAIS WPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYI TQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHF SKGGGGGSGGGGSGGGGSFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAF DTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQK SNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLL KDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALL
KNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF SEQ ID NO: MLEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYY 188 SMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVI
HLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEL DQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAIS WPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYI TQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHF SKGGGGGSGGGGSGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFM LAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTL EEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRN
VQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYY 198 SMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVI
HLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEL DQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAIS WPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYI TQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHF SKGGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADN NTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRF QPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKK
LGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYY 199 SMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVI
HLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEL DQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAIS WPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYI TQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHF SKGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAPISSHCRLDKSNF QQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCY LMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHI EGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNA CI
SEQ ID NO: MAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIG 200 EKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEV
VPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIK AIGELDLLFMSLRNACIGGGGSVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGK PIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGE FATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAI NWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQ WKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAH WHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAG
TPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKG SEQ ID NO: MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYY 201 SMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVI
HLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEL DQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAIS WPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYI TQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHF SKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQ NIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENN PGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAGGGGSA PISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEK LFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPF LARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIG
ELDLLFMSLRNACI VI. Métodos de Uso
[0290] São providos aqui, em algumas realizações, construtos de aplicação compreendendo um veículo acoplado a uma carga útil heteróloga. Os veículos providos aqui podem ser utilizados para transportar tal carga útil (por exemplo, uma carga útil terapêutica) para vários locais no interior de uma célula epitelial tal como o lado apical (por exemplo, um sistema de reciclagem apical), o lado basal e/ou compartimento(s) supranuclear(es). A liberação através de um epitélio de intestino polarizado pode incluir a liberação para compartimentos submucosos (por exemplo, a lamina propria e/ou outros compartimentos submucosos intestinais) e/ou circulação sistêmica (por exemplo, via o sistema portal hepático). A. Métodos de Tratamento
[0291] As capacidades de alto fluxo de transporte dos veículos providos aqui através de barreiras epiteliais intactas (por exemplo, um epitélio de intestino polarizado) podem ser utilizadas para aplicar moléculas de carga útil terapêutica e/ou de diagnóstico a um indivíduo necessitando de tal tratamento (por exemplo, um humano ou um roedor). Por exemplo, a liberação de carga útil terapêutica para compartimentos submucosos, por exemplo, a lamina propria, pode permitir o tratamento e/ou diagnóstico de doenças ou condições localizadas e/ou originadas a partir de tais locais no trato GI, enquanto a aplicação sistêmica de carga útil pode ser utilizada para prover concentrações terapeuticamente efetivas de várias células, tecidos ou órgãos em um organismo.
[0292] Doenças que podem ser tratadas utilizando-se um construto de aplicação desta descrição podem incluir doenças inflamatórias, doenças autoimunes, câncer, doenças metabólicas, doenças neurodegenerativas e doenças neurológicas, doença virais ou infecções e doença cardiovascular.
[0293] Em alguns casos, a doença inflamatório pode incluir doença inflamatória dos intestinos, psoríase, sepse bacteriana, doença de Crohn (por exemplo, doença de Crohn fistulizante), colite ulcerativa (por exemplo, colite ulcerativa de moderada a severa ou colite ulcerativa de branda a moderada), colite colagenosa, colite linfocítica, colite isquêmica, colite de derivação, síndrome de Behcet, colite indeterminada, pancreatite, inflamação hepática (por exemplo, uma hepatite), bursite, proctite e lesão de célula epitelial.
[0294] Em alguns casos, a doença autoimune pode incluir lúpus eritematoso sistêmico (SLE), pênfigo vulgar, miastenia grave, anemia hemolítica, trombocitopenia púrpura, doença de Grave, doença de Sjogren, dermatomiosite, doença de Hashimoto, polimiosite, esclerose múltipla, diabetes mellitus, artrite reumatoide e escleroderma.
[0295] Em alguns casos, o câncer pode incluir linfomas não de Hodgkin (NHL), linfoma de Hodgkin, leucemia linfocítica crônica, leucemia de célula pilosa, leucemia linfoblástica aguda, mieloma múltiplo, carcinomas de bexiga, rim, ovário, cérvix, mama, pulmão ou câncer nasofaríngio, melanoma maligno, NHL resistente a rituximab e leucemia.
[0296] Em alguns casos, o distúrbio metabólico pode incluir diabetes, diabetes como uma consequência de obesidade, hiperglicemia, dislipidemia, hipertrigliceridemia, síndrome X, resistência a insulina, tolerância a glicose prejudicada (IGT), dislipidemia diabética, hiperlipidemia, doença do fígado gorduroso, esteatohepatite não alcoólica, obesidade, tolerância a glicose prejudicada, glicose em jejum aumentada, resistência insulina, secreção urinária de albumina, obesidade central, hipertensão, triglicerídeos elevados, colesterol LDL elevado e/ou colesterol HDL reduzido, hiperglicemia, hiperinsulinemia, dislipidemia, cetose, hipertrigliceridemia, síndrome X, resistência a insulina, glicose em jejum prejudicada, tolerância a glicose prejudicada (IGT), dislipidemia diabética, gliconeogênese, glicogenólise excessiva, cetoacidose diabética, hipertrigliceridemia, hipertensão, nefropatia diabética, insuficiência renal, falha renal, hiperfagia, perda de massa muscular, neuropatia diabética, retinopatia diabética, coma diabética, aterosclerose, doença coronariana, doença da artéria periférica e hiperlipidemia.
[0297] Em alguns casos, a doença cardiovascular pode incluir doença vascular, doença cardíaca e derrame.
[0298] Outras doenças e condições que podem ser tratadas pela utilização de um construto de aplicação desta descrição podem incluir deficiência do hormônio de crescimento (GHD), síndrome de Turner (TS), síndrome de Noonan, síndrome de Prader-Willi, deficiência do gene homeobox de baixa estatura (SHOX), insuficiência renal crônica, baixa estatura idiopática, síndrome do intestino curto, alergia, doença do enxerto-vs-hospedeiro, anemia, distúrbios das células hematopoiéticas e doenças do sistema endócrino ou sistemas reprodutivos.
[0299] Além disto, um construto de aplicação pode ser administrado como uma composição farmacêutica a um indivíduo necessitando de tal tratamento. Um construto de aplicação aqui pode ser formulado em uma composição terapêutica para eficácia terapêutica aumentada. Por exemplo, um construto de aplicação pode ser formulado de tal fora que é liberado em local(ais) especifico(s) em ou em torno do trato GI de um indivíduo. Em alguns casos, um construto de aplicação pode ser formulado para aumentar sua atividade biológica para engajar células imunes nas várias partes no ou em torno do trato GI, tal como o íleo.
[0300] Um construto de aplicação pode ser administrado por várias rotas de administração. Em alguns casos, a administração inclui administração oral do construto de aplicação. Em alguns casos, um construto de aplicação é administrado oralmente como um tablete ou uma cápsula. B. Métodos Experimentais
[0301] São providos aqui métodos para o teste de transcitose e avaliação faz proteínas de interação do veículo de Cholix (por exemplo, TRIPs).
1. Teste de Transcitose
[0302] A função de transcitose de um construto de aplicação isolado pode ser tratada como uma função da habilidade do construto de aplicação em passar através de uma membrana epitelial (por exemplo, um epitélio de intestino polarizado) por meio de transcitose. A atividade de transcitose do construto de aplicação pode ser testada por qualquer método conhecido de um técnico no assunto, sem limitação. Em várias realizações, a atividade de transcitose pode ser testada pela avaliação da habilidade de um construto de aplicação em entrar em uma célula não polarizada ao qual se liga. Nos casos de um veículo derivado de Cholix, e sem se querer estar ligado a qualquer teoria ou mecanismo de ação em particular, é descrito aqui que a função de transcitose que permite que um construto de aplicação passe através de uma célula epitelial polarizada e a função para entrar em resíduos celulares não polarizados no mesmo domínio ou região, isto é, resíduos de aminoácido 1-266 da SEQ ID NO: 1. Desta forma, a habilidade do construto de aplicação em entrar na célula pode ser avaliada, por exemplo, pela detecção da presença física do construto no interior da célula. Por exemplo, o construto de aplicação pode ser rotulado, por exemplo, com um marcador fluorescente e o construto de aplicação exposto para a célula. Então, as células podem ser lavadas, removendo qualquer construto de aplicação que não entrou na célula e a quantidade de rótulo remanescente na(s) célula(s) pode ser determinada. A detecção do rótulo no interior destas células, por exemplo, pela utilização de microscopia, indica que o construto de aplicação entrou na célula.
[0303] A habilidade de transcitose do construto de aplicação pode ser testada pela avaliação da habilidade de um construto de aplicação em passar através de uma célula epitelial polarizada. Por exemplo, o construto de aplicação pode ser rotulado, por exemplo, com um marcador fluorescente (por exemplo, RFP) e posto em contato com as membranas apicais de uma camada de células epiteliais. Em um outro exemplo, o construto de aplicação pode ser detectado pela utilização de anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais e/ou policlonais) direcionados contra o construto de aplicação ou uma parte deste tal como um veículo derivado de Cholix ou uma carga útil. A fluorescência detectada no lado basolateral da membrana formada pelas células epiteliais (por exemplo, uma câmara basolateral como ilustrada na FIG.1 ou na lamina propria em experimentos in vivo) indica que as capacidades de transcitose do veículo estão intactas.
[0304] Uma transcitose in vivo pode ser testada pela utilização de ratos Wistar machos. Ratos Wistar machos podem ser alojados 3-5 por gaiola com um ciclo luz/escuro de 12/12 h e podem apresentar 225-275 g (aproximadamente com idade de 6-8 semanas) quando colocados em estudo. Os experimentos podem ser conduzidos durante a fase de luz utilizando-se um protocolo de não recuperação que usa anestesia com isoflurano contínua. Uma incisão abdominal de linha média de 4-5 cm que expõe as regiões do jejuno mediano pode ser conduzida. Podem ser preparadas soluções estoques a 3,86 x 10-5 M dos artigos de teste em solução salina tamponada com fosfato (PBS), com 50 µL (para 250 g de peso do rato) sendo administrados por injeção intraluminal (ILI) utilizando-se uma agulha de calibre
29. O mesentério local da injeção pode ser então ser marcado com um marcador permanente. Ao término do estudo, uma região de 3-5 mm que capturou o segmento intestinal marcado pode ser isolado e processado para avaliação microscópica. Os experimentos in vivo podem ser conduzidos de acordo com o Animals (Scientific Procedures) Act de 1986, com uma Diretiva do Conselho das
Comunidades Europeias de 1986 (86/609/EEC), e com os procedimentos éticos da Universidade de Bath.
2. Avaliação das Proteínas de Interação do Veículo de Cholix (isto é, TRIPs)
[0305] De maneira a identificar os parceiros de interação de Cholix (por exemplo, receptores, enzimas etc.) e estabelecer os compartimentos vesiculares em que interagem com polipeptídeos de Cholix (por exemplo, os resíduos 1-266 de uma sequência de Cholix ou uma versão truncada dos mesmos), uma série de ensaios Pull-Down pode ser realizada de maneira a identificar os parceiros potenciais de interação que podem ser seguidos por associações in silico pela utilização de ressonância plasmônica de superfície e, estudos de transcitose in vitro utilizando células epiteliais intestinais humanas polarizadas Caco-2 onde nocaute genético de alvos específicos pode ser obtido, e estudos de transcitose in vivo onde elementos de Cholix e receptores específicos podem ser localizados conjuntamente em estruturas vesiculares estabelecidas. Sem se querer ficar ligado a qualquer teoria, é assumido que um processo de transcitose pode envolver elementos que normalmente estão restritos dentro de elementos vesiculares específicos de células epiteliais intestinais polarizadas, mas que podem se recrutados ou “sequestrados”, por exemplo, por veículos derivados de Cholix, de maneira a deixar o endossomo tardia e evitar a degradação lisossômica após a liberação da célula para um compartimento basolateral (por exemplo, por meio de mecanismos de reciclagem apical, exocitose medida por receptor apical etc.).
3. Medição da localização conjunta de veículos com proteínas celulares
[0306] A localização conjunta de um veículo ou complexo veículo-carga útil descrita aqui com uma ou mais proteínas celulares pode ser determinada por microscopia de fluorescência. Por exemplo, um veículo derivado de Cholix pode ser aplicado à membrana apical de uma célula epitelial polarizada (por exemplo, Caco-2) ou ao tecido epitelial intestinal. Após a endocitose mediada por receptor,
a absorção do veículo na célula pode ser determinada por microscopia de fluorescência, por exemplo, pela utilização de anticorpos anti-veículo de Cholix rotulados ou veículos rotulados com corante ou pela utilização de anticorpos anti- carga útil. As amostras ou seções de tecido podem ser adicionalmente marcadas com marcadores específicos para proteínas celulares tais como Rab7, Rab11, por exemplo, tal como descrito no EXEMPLO 7. Várias técnicas de análise de imagem podem então ser utilizadas para determinar a posição relativa do veículo em relação à proteína celular (ver, por exemplo, EXEMPLO 6).
EXEMPLOS
[0307] Os exemplos a seguir meramente ilustram a descrição e não se destinam a limitar a descrição de forma alguma. EXEMPLO 1 Produção de Construtos de Aplicação Derivados de Cholix
[0308] Neste Exemplo, é descrita a preparação de um construto de aplicação como uma sequência de aminoácidos única compreendendo uma sequência de veículo de Cholix, uma sequência espaçadora e uma carga útil terapêutica.
[0309] Primeiro, o gene do construto de aplicação foi amplificado por PCR, incorporando pares de enzimas de restrição dos sítios de NdeI e EcoRI, PstI e PstI, AgeI e EcoRI ou PstI e EcoRI em duas extremidades dos produtos de PCR. Após a digestão com a enzima de restrição, os produtos de PCR foram clonados em um plasmídeo apropriado para expressão celular, o qual foi digerido com os correspondentes pares de enzimas de restrição. O construto resultante compreendia a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 147 e foi também etiquetada com um motivo 6-His no terminal N da proteína de maneira a facilitar a purificação. Os plasmídeos finais foram verificados por digestões com enzima de restrição e sequenciamento de DNA.
[0310] Os construtos de aplicação foram expressos como se segue: células competentes de E. coli BL21(DE3) pLysS (Novagen, Madison, Wis.) foram transformadas pela utilização de um método de choque térmico padrão na presença do plasmídeo apropriado para gerar células expressando o construto de aplicação, selecionadas em meio contendo ampicilina e isoladas e crescidas em caldo de Luria-Bertani (Difco; Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.) com antibiótico, então induzidas para expressão de proteína pela adição de 1 mM de isopropil-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) a OD 0,6. Duas horas após a indução com IPTG, as células foram coletadas por centrifugação a 5000 rpm por 10 min. Os corpos de inclusão foram isolados após a lise celular e proteínas foram solubilizados em tampão contendo 100 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 2 mM de EDTA, 6 M guanidina HCl, e 65 mM de ditiotreitol. O construto de aplicação solubilizado foi redobrado na presença de 0,1 M de Tris, pH = 7,4, 500 de mM L-arginina, 0,9 mM de GSSG, 2 mM de EDTA. A proteína redobrada (SEQ ID NO: 147) foi purificada por Troca Iônica em sefarose Q e cromatografia em gel de filtração Superdex 200 (Amersham Biosciences, Inc., Suécia). A pureza das proteínas foi avaliada por SDS-PAGE e HPLC analítica (Agilent, Inc. Palo Alto, Calif.).
[0311] O construto de aplicação foi avaliado para se verificar o dobramento apropriado no que diz respeito ao tamanho molecular antecipado. Após a indução, a proteína expressa foi coletada dos corpos de inclusão. A extensão da expressão do construto de aplicação foi verificada por western blot, e o peso molecular aparente foi comparado com a massa calculada.
[0312] Os resultados demonstraram uma produção estável e eficiente do construto de aplicação funcional com altos rendimento e pureza.
EXEMPLO 2 Model in vitro para a Avaliação do Transporte através de Monocamadas de Célula Epitelial
[0313] Este exemplo demonstra um modelo in vitro desenhado para avaliar as propriedades de transporte de construtos de aplicação descritos aqui.
[0314] A FIG. 1 mostra esquematicamente uma configuração compreendendo uma câmara apical acima da monocamada célula epitelial e uma câmara basal abaixo de tal monocamada de célula epitelial.
[0315] Para a permeabilidade apical para basolateral, foram adicionados artigos de teste (por exemplo, construto de aplicação, carga útil etc.) no lado apical (A) e a quantidade de permeação foi determinada no lado basolateral (B). Para a permeabilidade basolateral para apical, foram adicionados artigos de teste no lado basolateral (B) e a quantidade de permeação foi determinada no lado apical (A).
[0316] Os dados podem ser expressos como permeabilidade (Papp) de acordo com a seguinte equação: Papp = (dQ/dt)/ (C0*A). Q/dt é a taxa de permeação, C0 é a concentração inicial do artigo de teste e A é a área da monocamada. Uma proporção de transporte de efluxo (Re) pode ser calculada de acordo com a seguinte equação: (Re) = Papp(B-A)/Papp(A-B). Re > 2 pode indicar um substrato potencial para P-gp ou outros transportadores de efluxo ativos.
[0317] Células SMI-100 ou Caco-2 podem ser utilizadas para avaliar a função de transcitose de um veículo ou construto de aplicação in vitro.
[0318] Para células Caco-2, um ensaio ELISA foi realizado para se avaliar a habilidade de um veículo ou construto de aplicação em se deslocar através de monocamadas de célula Caco-2 por meio de via transcitose. As células Caco-2 (ATCC HTB-37™) foram mantidas em 5% de CO2 a 37°C em meio completo: Meio de Eagle modificado da Dulbecco F12 (DMEM F12) suplementado com 10% de soro bivino fetal, 2,5 mM de glutamina, 100 U de penicilina/ml, e 100 μg de estreptomicina/ml (Gibco BRL, Grand Island, N.Y.). As células foram alimentadas a cada 2 para 3 dias com este meio (meio completo) e passadas a cada 5 para 7 dias. Para os ensaios, as células foram semeadas em placas de 24 ou 96 poços e crescidas para confluência.
[0319] As células Caco-2 foram crescidas monocamadas confluentes em suportes Transwell® de policarbonato com tamanho de poro de 0,4 m revestidos com colágeno (Corning-Costar, Cambridge, MA) e utilizadas 18-25 dias após atingirem uma resistência elétrica trans-epitelial (TER) de > 250 Ω·cm2 tal como medida pela utilização de um voltímetro de haste Millicell-ERS® (Millipore). O transporte apical a basolateral (A→B) de um veículo ou construto de aplicação através destas monocamadas foi determinado pela medição da quantidade de proteína transportada em certos pontos no tempo (por exemplo, 15, 30, e 45 minutos) após a aplicação apical de, por exemplo, 4,7 nM, 23,6 nM e 236 nM do construto de aplicação a 37°C. As medições de TER e a extensão da dextrana fluorescente de 10 kDa (medida pela utilização de um protocolo de exclusão de tamanho de HPLC) foram utilizadas para verificar as propriedades da barreira monocamada durante o curso do estudo. A extensão do transporte do construto de aplicação foi determinada por titulação do meio coletado no ensaio de citotoxicidade baseado em célula. O construto de aplicação transportado foi medido por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) pela utilização de anticorpos (por exemplo, anti-veículo ou anti-carga útil, tal como um anticorpo anti-IL-22) para captura e detecção.
[0320] As monocamadas confluentes de tecidos de intestino delgado humano (SMI-100, MatTek Corporation; Ashland, MA, USA) estabelecidos em cultura de célula inseridos foram deixados estabilizar por 24 h a 37oC antes do uso. Apenas as inserções apresentando uma resistência elétrico trans-epitelial (TEER) de > 400 Ω•cm2 foram considerados como apresentando integridade de monocamada suficiente para uso em estudos. Uma verificação secundária da integridade de monocamada foi realizada pela avaliação da supressão do transporte de dextrana de 70 kD. As câmaras foram lavadas uma vez com tampão de transporte (PBS). As moléculas de teste (por exemplo, construtos de aplicação, cargas úteis etc.), preparadas com uma concentração de 20 µg/mL, foram aplicadas à superfície apical das inserções de volumes de 100 µL. Os volumes basolaterais de 500 µL de PBS foram substituídos em cada ponto no tempo para estudos de transporte. Cada condição experimental foi realizada em triplicata. EXEMPLO 3 Transporte mediado por Veículo de IL-22 através de Células Epiteliais Intestinais Polarizadas
[0321] Este exemplo demonstra que um veículo de SEQ ID NO: 134 pode transportar carga útil de IL-22 (SEQ ID NO: 142) através de células epiteliais intestinais polarizadas in vitro. Este exemplo demonstra adicionalmente que o veículo com SEQ ID NO: 134 pode transportar carga útil biologicamente ativa de IL-22 através de células epiteliais intestinais polarizadas e para a lamina propria in vivo.
[0322] O transporte do construto de aplicação (SEQ ID NO: 147) através de monocamadas de célula Caco-2 e tecido epitelial de intestino delgado (também referido aqui como SMI-100) foi testado pela aplicação do construto de aplicação à membrana apical das células epiteliais, de acordo com o EXEMPLO 2 e como ilustrado na FIG. 1 para transporte apical (A) para basal (B). Os experimentos foram realizados em triplicatas e as amostras da câmara basolateral foram coletadas a 15, 30, e 45 minutos após a aplicação apical de maneira a se determinar a quantidade de proteína transportada. A quantidade de proteína transcitosada foi medida por ensaios ELISA.
[0323] Os dados nas FIG. 2 e FIG. 3 mostram que um veículo com SEQ ID NO: 134 quando acoplado a IL-22, resultou no transporte de carga útil de IL-22 (SEQ ID NO: 142) através de monocamadas tanto de Caco-2 (FIG. 2) quanto de SMI-100 (FIG. 3) de maneira dependente de tempo e que o construto de aplicação resultou em cerca de 2-3 vezes mais IL-22 cruzando as células epiteliais quando em comparação com uma IL-22 (SEQ ID NO: 143) que não foi acoplada a um veículo.
[0324] Para experimentos in vivo, a transcitose foi testada pela utilização de ratos Wistar machos. Os ratos Wistar machos foram alojados 3-5 por gaiola com um ciclo claro-escuro de 12/12 h e apresentavam cerca de 225-275 g de peso (com aproximadamente 6-8 semanas de idade) quando colocados no estudo. Os experimentos foram conduzidos durante a fase de luz utilizando-se um protocolo de não recuperação que utiliza anestesia contínua com isoflurano. Uma incisão abdominal em linha mediana de 4-5 cm que expôs as do jejuno médio foi conduzida. Foram preparadas soluções estoque a 3,86 x 10-5 M do construto de aplicação em solução salina tamponada com fosfato (PBS), com 50 µL (por 250 g de rato) sendo administrada por injeção intraluminal (ILI) utilizando-se agulhas de calibre 29. Mesentério do local de injeção foi então marcado com um marcador permanente. Ao término do estudo, uma região de 3-5 mm que capturou o segmento intestinal marcado foi isolada e processada por avaliação microscópica.
[0325] Os resultados da atividade de transcitose do construto de aplicação com SEQ ID NO: 147 são mostrados na FIG. 4, demonstrando que quantidades significativas de carga útil de IL-22 (SEQ ID NO: 142) cruzaram um epitélio de intestino polarizado e intacto in vivo quando provida como parte de um construto de aplicação que inclui um veículo derivado de Cholix. Esta imagem de microscopia mostra o transporte da carga útil de IL-22 (SEQ ID NO: 142) do local apical do epitélio intestinal (destacado pela seta branca #1) para o local basal das células epiteliais e para a lamina propria (3) (abreviada como “l.p.”) após a aplicação luminal do construto de aplicação da SEQ ID NO: 147 ao jejuno de ratos Wistar. A imagem mostra adicionalmente que a IL-22 interagiu e se ligou com uma extensão significativa a receptores de IL-22 localizados nas células dentro da lamina propria e na membrana basal externa do epitélio polarizado (destacado pelas setas brancas #2), demonstrando que a carga útil de IL-22 estava biologicamente ativa após o transporte. A localização da IL-22 é indicada pelas setas brancas e a fluorescência verde, fluorescência azul indicam a marcação com DAPI.
[0326] Além disto, a FIG. 5 mostra que os construtos de aplicação consistindo nas sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NO: 147 e
SEQ ID NO: 148 foram detectadas no compartimento basolateral após a transcitose. A análise de experimentos com western blot confirmou que ambos os construtos de aplicação estavam inalterados.
[0327] Experimentos de acompanhamento também mostraram que a transcitose dos construtos de aplicação compreendendo um veículo derivado de Cholix pode depender da presença tanto de GRP75 (FIG. 6) quanto da proteína núcleo de proteoglicana de sulfato de heparina específica para membrana basal (HSPG) (FIG. 7) (também referida aqui como “perlecan”). As FIG. 6 e FIG. 7 mostram que a função de transcitose estava significativamente reduzida em células Caco-2 que não continham GRP75 (FIG. 6, isto é, células Caco-2GRP75-) e HSPG (FIG. 7, isto é, células Caco-2HSPG-), respectivamente. Isto indica que tanto GRP75 quanto HSPG são TRIPs que um veículo derivado de Cholix pode interagir com durante a transcitose apical para basal.
[0328] Em conjunto, estes dados demonstram que os veículos derivados de Cholix descritos aqui transportam eficientemente (por exemplo, pelo menos 5%, 10%, 20%, 25% ou 50% do material aplicado à superfície apical) carga útil terapêutica tal como IL-22 através camadas epiteliais polarizadas, com taxas de transporte significativamente amentadas e eficiência de transporte global (por exemplo, pelo menos um aumento de cerca de 2-3 vezes) em comparação com a carga útil separadamente. EXEMPLO 4 Estudos de Transporte in vivo para Células Epiteliais Polarizadas pela utilização de Veículos Derivados de Cholix
[0329] Este exemplo demonstra a capacidade de veículos derivados de Cholix truncados em transportar carga útil para dentro de células epiteliais polarizadas.
[0330] A FIG. 8 mostra a detecção por microscopia de fluorescência de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 154) em compartimentos apicais (destacados com seta branca #2) dentro de células epiteliais 15 min após a injeção intraluminal do construto pela utilização de um modelo de injeção intraluminal em rato (a seta branca #1 destaca a superfície apical, a seta branca #3 destaca a membrana basal e a seta branca #4 destaca a lamina propria). Os dados demonstram que um veículo derivado de Cholix41-187 (por exemplo, SEQ ID NO: 137) é capaz de transportar carga útil para compartimentos apicais de células epiteliais, mas não através de células epiteliais. A fluorescência vermelha mostra a localização de um veículo de Cholix, a fluorescência verde mostra a localização do hGH (SEQ ID NO: 146) e a fluorescência azul indica a marcação com DAPI.
[0331] A FIG. 9 mostra a detecção por microscopia de fluorescência de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 156) em compartimentos apicais (destacados com a seta branca #2) de células epiteliais 15 min após a injeção intraluminal pela utilização de um modelo de injeção intraluminal em rato (a seta branca #1 destaca a superfície apical, a seta branca #3 destaca a membrana basal e a seta branca #4 destaca a lamina propria). Os dados demonstram que um veículo derivado de Cholix40-205 (SEQ ID NO: 138) é capaz de transportar carga útil (por exemplo, hGH) para compartimentos apicais de células epiteliais, mas não através de células epiteliais para a lamina propria. Estes dados sugerem adicionalmente que os resíduos 1-40 da SEQ ID NO: 1 podem representar um papel na transcitose, mas não são requeridos para a endocitose de um veículo de Cholix. A fluorescência vermelha mostra a localização de um veículo de Cholix, a fluorescência verde mostra a localização de hGH (SEQ ID NO: 146) e a fluorescência azul indica a marcação com DAPI.
[0332] A FIG. 10A mostra a detecção por microscopia de fluorescência de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 153) em compartimentos apicais no interior de células epiteliais 5 min após a injeção intraluminal do construto de aplicação a jejuno de rato. Nas FIGs. 10A-10C, a fluorescência vermelha mostra a localização de um veículo de Cholix, a fluorescência verde mostra a localização de hGH (SEQ ID NO: 146) e a fluorescência azul indica a marcação com DAPI; a seta branca #1 destaca os compartimentos apicais e a seta branca #2 destaca os compartimentos supranucleares.
[0333] A FIG. 10B mostra a detecção por microscopia de fluorescência de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 153) 10 min após a injeção intraluminal.
Os dados demonstram que o veículo transportou a carga útil de hGH dos compartimentos apicais para os compartimentos supranucleares e basais no tempo.
[0334] A FIG. 10C mostra a detecção por microscopia de fluorescência de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 153) 15 min após a injeção intraluminal. Os dados demonstram que o veículo transportou a carga útil dos compartimentos apicais para os compartimentos supranucleares e basais no tempo.
[0335] Estes dados demonstram que veículos derivados de Cholix com truncamentos no terminal C na posição 187 ou 205 da SEQ ID NO: 1 e um truncamento no terminal N nas posições 40 ou 41 of SEQ ID NO: 1, respectivamente, pode transportar carga útil para dentro de células epiteliais polarizadas. Estes dados adicionalmente sugerem que os 39 aminoácidos do terminal N do veículo de Cholix podem representar um papel na transcitose, mas não são suficientes para transportar para vesículas basolaterais intracelulares e que 1-187 não é suficiente para a transcitose, mas suficiente para transportar carga útil para dentro de células epiteliais (por exemplo, para compartimentos supranucleares e basais). EXEMPLO 5 Função de Transcitose in vitro de Veículos Derivados de Cholix
[0336] Este exemplo demonstra a função de transcitose apical para basal in vitro de vários veículos derivados de Cholix que foram acoplados a hormônio de crescimento humano por meio de um espaçador pela utilização de expressão recombinante tal como descrito acima no EXEMPLO 1.
[0337] Os seguintes veículos foram avaliados para sua habilidade em cruzar monocamadas de célula epitelial do intestino delgado humana polarizada (TABELA 10): TABELA 10 –Construtos de Aplicação Testados SEQ ID NO Notação de Cholix (em relação à SEQ ID NO: 1)
SEQ ID NO: 151 M+Cholix1-134-(G4S)3-hGH SEQ ID NO: 152 M+Cholix1-151-(G4S)3-hGH SEQ ID NO: 153 M+Cholix1-187-(G4S)3-hGH SEQ ID NO: 154 M+Chx41-187-(G4S)3-hGH SEQ ID NO: 155 M+Cholix1-206-(G4S)3-hGH SEQ ID NO: 156 M+Cholix40-205-(G4S)3-hGH SEQ ID NO: 157 M+Cholix1-245-(G4S)3-hGH SEQ ID NO: 158 M+Cholix1-251-(G4S)3-hGH SEQ ID NO: 159 M+Cholix1-266-(G4S)3-hGH
[0338] As FIGs. 11A-11B mostram o transporte apical-para-basal do hormônio de crescimento humano (hGH, SEQ ID NO: 190) separadamente em comparação com a utilização de hGH acoplado a veículos. Os comprimentos dos veículos estão indicados pelo truncamento no terminal C em relação à SEQ ID NO: 1 de referência (isto é, “134” indica um veículo apresentando os resíduos 1- 134 da SEQ ID NO: 1). Todos os veículos incluíam adicionalmente uma metionina no terminal N. Western blotting para hGH determinou qualitativamente a capacidade destas proteínas em serem submetidas a transporte apical-para-basal através de monocamadas polarizadas de células epiteliais do intestino delgado in vitro após 2 h. as quantidades de materiais aplicados de forma apical eram equivalentes em uma base molar para o teor de hGH e as coletas basais foram concentradas ~10 vezes antes da análise.
[0339] A FIG. 11A mostra uma comparação do transporte apical para basal de hGH (SEQ ID NO: 190) separadamente em relação ao medido para os construtos de aplicação com a sequência apresentada nas SEQ ID NO: 151 – SEQ ID NO: 154 e SEQ ID NO: 159 com truncamentos no terminal C nas posições 134, 151, 187, 41-187 e 266, respectivamente, da SEQ ID NO: 1. Os dados demonstraram que os veículos de Cholix com truncamentos no terminal C nas posições 134, 151, 187 of SEQ ID NO: 1 ou um truncamento no terminal N em 41 e um truncamento no terminal C em 187 da SEQ ID NO: 1, mostraram transporte apical-para-basal significativamente menor de hGH conjunto em comparação com o construto com um veículo de Cholix (SEQ ID NO: 159) com um truncamento no terminal C em 266 da SEQ ID NO: 1.
[0340] A FIG. 11B mostra que os construtos de aplicação com SEQ ID NO: 155 e SEQ ID NO: 157 – SEQ ID NO: 159 incluindo veículos de Cholix com truncamentos no terminal C nas posições 206 (SEQ ID NO: 131), 245 (SEQ ID NO: 132), 251 (SEQ ID NO: 133) e 266 (SEQ ID NO: 134), respectivamente, da SEQ ID NO: 1 demonstraram transporte apical-para-basal eficiente de hGH conjunto (SEQ ID NO: 146). Enquanto os veículos com Cholix com truncamentos no terminal C nas posições 245 e 251 demonstraram transporte apical-para-basal de hGH (SEQ ID NO: 146) comparável ao do veículo com o truncamento no terminal C na posição 266, o veículo com um Cholix com truncamento no terminal C na posição 206 mostrou um aumento significativo do transporte apical-para-basal de hGH em comparação com os veículos com truncamentos no terminal C nas posições 245, 251 e 266.
[0341] Estes resultados sugerem que os resíduos 1-266 de Cholix eram suficientes para o transporte apical-para-basal e que podem funcionar como um elemento de transcitose para a aplicação de várias cargas úteis heterólogas através de células epiteliais. Adicionalmente, foi demonstrado que os elementos dentro dos primeiros 206 resíduos de aminoácido do polipeptídeo de Cholix consistindo na sequência apresentada na SEQ ID NO: 1 eram suficientes para a função de transcitose e, desta forma, podem ser utilizados eficientemente (por exemplo, pelo menos 5%, 10%, 20%, 25% ou 50% do material aplicado à superfície apical) para transportar moléculas de carga útil heteróloga tais como cargas úteis terapêuticas e/ou de diagnóstico através de um camada de célula epitelial (por exemplo, o epitélio intestinal), possibilitando assim a administração oral da carga útil a qual, de outra forma, seria administrável apenas por meio de rotas de administração parenteral (por exemplo, intravenosa ou subcutânea). EXEMPLO 6 Função de Transcitose in vivo de Veículos Derivados de Cholix
[0342] Estes exemplos demonstra a função de transcitose apical para basal in vivo de vários veículos derivados de Cholix que foram acoplados a hormônio de crescimento humano por meio de um espaçador pela utilização de expressão recombinante tal como descrito acima no EXEMPLO 1.
[0343] Os veículos de Cholix selecionados mostrados na TABELA 10 do EXEMPLO 5 foram examinados para sua capacidade de transcitose in vivo após ILI para jejuno de rato.
[0344] Os dados obtidos nestes experimentos mostraram a extensão do transporte apical para basal através de células epiteliais intestinais polarizadas em jejuno de rato de seis construtos de aplicação, cada um incluindo um veículo de Cholix diferente. A localização do veículo de Cholix (fluorescência vermelha) e hGH (fluorescência verde) foi demonstrada (FIGs. 12A-12F) por microscopia de imunofluorescência pela utilização de anticorpos policlonais anti-Cholix e monoclonais anti-hGH, respectivamente. As setas brancas indicam a membrana apical, “l-p” refere-se a lamina propria, “GC” refere-se a células caliciformes e as setas abertas indicam o construto de aplicação presente na lamina propria.
[0345] A FIG. 12A mostra a extensão do transporte apical para basal 15 min após a injeção intraluminal de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 151) incluindo um veículo de Cholix (SEQ ID NO: 140) acoplado a hGH (SEQ ID NO: 146). A FIG. 12A mostra que o veículo não possibilitou que o construto de aplicação entrasse nas células epiteliais, sugerindo que um fragmento funcional de sequência apresentando os resíduos de aminoácido 134-151 da SEQ ID NO: 1 pode representar um papel na endocitose para células epiteliais polarizadas (em contraste, a FIG. 12B demonstra que o veículo com a SEQ ID NO: 139 possibilitou a entrada celular do respectivo construto de aplicação por meio de endocitose).
[0346] A FIG. 12B mostra a extensão do transporte apical para basal 15 min após a injeção intraluminal de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 152) incluindo um veículo de Cholix (SEQ ID NO: 139) acoplado a hGH (SEQ ID NO: 146) como demonstrado por microscopia de imunofluorescência. A FIG. 12B mostra que este construto não entrou em células epiteliais (em oposição ao construto com SEQ ID NO: 151 descrito na FIG. 12A), mas permaneceu principalmente em conjuntos de vesícula apical e, em alguma extensão, em vesícula basal, mas não entrou na lamina propria, desta forma, possibilitando a liberação da carga útil para os compartimentos apicais e basais de uma célula epitelial.
[0347] A FIG. 12C mostra a extensão do transporte apical para basal 15 min após a injeção intraluminal de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 153) incluindo um veículo de Cholix (SEQ ID NO: 136) acoplado a hGH (SEQ ID NO: 146) como demonstrado por microscopia de imunofluorescência. A FIG. 12C mostra que este construto entrou nas células epiteliais, alcançou os compartimentos apicais e basais e também alcançou uma região supranuclear da célula, ainda assim permaneceu no interior da célula epitelial, sugerindo que o fragmento de sequência consistindo nos resíduos de aminoácido 152-187 of SEQ ID NO: 1 pode permitir o acesso e liberação para regiões supranucleares, bem como permitir a localização nos compartimentos basais.
[0348] A FIG. 12D mostra a extensão do transporte apical para basal 15 min após a injeção intraluminal de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 154) incluindo um veículo de Cholix (SEQ ID NO: 137) acoplado a hGH (SEQ ID NO: 146) como demonstrado por microscopia de imunofluorescência. A FIG. 12D mostra que este construto entrou em células epiteliais, mas permaneceu nos compartimentos apicais e parece não alcançar os compartimentos basais ou supra- nucleares.
[0349] A FIG. 12E mostra a extensão do transporte apical para basal 15 min após injeção intraluminal of a construto de aplicação (SEQ ID NO: 155) incluindo a veículo de Cholix (SEQ ID NO: 131) acoplado a hGH (SEQ ID NO: 146) como demonstrado por microscopia de imunofluorescência. A FIG. 12E mostra que este construto completou o processo de transcitose como indicado pelo fato dos construtos de aplicação alcançarem a lamina propria (ver seta aberta), sugerindo que o fragmento de sequência consistindo nos resíduos de aminoácido 188-206 da sequência apresentada na SEQ ID NO: 1 pode fazer com que o veículo (e construtos compreendendo tal veículo) se engaje com processos de reciclagem basal que permitem a liberação do veículo ou respectivo construto da célula epitelial para um compartimento basolateral (por exemplo, a lamina propria).
[0350] A FIG. 12F mostra o transporte através de monocamadas epiteliais de jejuno de rato in vivo 15 min após a injeção intraluminal de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 159) incluindo um veículo de Cholix (SEQ ID NO: 134) acoplado a hGH (SEQ ID NO: 146) como demonstrado por microscopia de imunofluorescência. A FIG. 12F mostra que este construto completou o processo de transcitose como indicado pelo fato dos construtos de aplicação alcançarem a lamina propria (ver seta aberta).
[0351] Desta forma, estes resultados estão alinhados com os dados obtidos dos experimentos de transcitose in vitro descritos no EXEMPLO 5 e demonstraram que os veículos com um truncamento no terminal C em qualquer um dos 206-266 da sequência de Cholix apresentada na SEQ ID NO: 1 pode rapidamente (por exemplo, pelo menos 10-6 cm/s, 10-5 cm/s) e eficientemente (por exemplo, pelo menos 5%, 10%, 20%, 25% ou 50% do material aplicado à superfície apical) transportar moléculas de carga útil (por exemplo, proteínas terapêuticas) através de células epiteliais (por exemplo, através de células epiteliais intestinais polarizadas de um indivíduo). Além disto, estes resultados mostraram que veículos com um truncamento no terminal C em qualquer um dos resíduos 151- 187 da sequência de Cholix apresentada na SEQ ID NO: 1 e/ou um truncamento no terminal N em qualquer um dos resíduos 1-40 da SEQ ID NO: 1 podem ser utilizados para aplicar várias cargas úteis heterólogas a células epiteliais.
[0352] Com base nestes dados, foram identificados fragmentos funcionais de sequência de Cholix a seguir para veículos derivados do polipeptídeo de Cholix da SEQ ID NO: 1.
TABELA 11 – Fragmentos de Sequências de Cholix e sua Função no Polipeptídeo de Cholix da SEQ ID NO: 1 Exemplificativos SEQ ID NO Sequência Função
SEQ ID NO: 135 DQQRNIIEVPKLYSIDL151 Endocitose 165 SEQ ID NO: 1 VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQ Translocação 166 SKLSIPSDVVLDEG40 Apical-Basal SEQ ID NO: LDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPE 151 Localização 167 HNIAISWPSVSYKA187 Supranuclear SEQ ID NO: 188 AQKEGSRHKRWAHWHTGLA206 Liberação Basal 168 EXEMPLO 7 Veículos Derivados de Cholix Se Localiza conjuntamente com Rab11a
[0353] Este exemplo demonstra que veículos derivados de Cholix se localiza conjuntamente com as proteínas relacionadas a Ras, Rab11a (Rab11a ou Rab11). A localização conjunta de um veículo com Rab11a pode ocorrer no lado apical ou no lado basal de uma célula epitelial. Foi mostrado que a localização conjunta do veículo com Rab11a no lado apical de uma célula epitelial pode direcionar o veículo para endossomos de reciclagem apical e/ou para o lúmen intestinal. A localização conjunta do veículo com Rab11a no lado basal de uma célula epitelial indica que o veículo pode utilizar mecanismos de reciclagem basal para sua liberação da membrana basal da célula para compartimentos basolaterais (por exemplo, lamina propria).
[0354] A localização conjunta de quatro construtos de aplicação com Rab11a foi testada por injeção intraluminal (ILI) de 50 µL de 3,86 x 10-5 M de soluções em PBS de quatro diferentes construtos de aplicação. Tais construtos de aplicação consistiram nas sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 152-154 e SEQ ID NO: 159.
[0355] As FIG. 13A, FIG. 13B e FIG. 13C mostram que os construtos de aplicação com SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 152 e SEQ ID NO: 153, respectivamente, se localizaram conjuntamente com Rab11a no lado apical das células epiteliais. Os dados mostram que os construtos com SEQ ID NO: 152 e SEQ ID NO: 154 não se localizaram significativamente no lado basal, mas permaneceram principalmente no lado apical. O construto com a SEQ ID NO:
153 se localizaram tanto no lado apical quanto no lado basal, no entanto se localizaram conjuntamente apenas com Rab11a no lado apical e não no lado basal (ver também, sub-imagens 3a e 3b da FIG. 13C mostrando localização aumentada no local apical em comparação no local basal). Em conjunto, estes resultados sugeriram que os veículos que não são capazes de transcitose apical para basal podem estrar nos sistemas de reciclagem apical dentro de células epiteliais, como demonstraram por localização conjunta com Rab11a no local apical. As medições foram conduzidas 15 min após a injeção intraluminal. A fluorescência verde mostra a localização de hGH, a fluorescência vermelha mostra a localização de Rab11a (ou Rab11), e a fluorescência azul indica a marcação com DAPI (descrição experimental idêntica para a FIG. 13D).
[0356] A FIG. 13D mostra que o construto de aplicação com a SEQ ID NO: 159 localizou conjuntamente com Rab11a no lado basal, mas não significativamente no lado apical de células epiteliais polarizadas. Isto sugeriu que os veículos capazes de transcitose podem utilizar o sistema de reciclagem basal para sua liberação da célula epitelial para a lamina propria (ver também, as sub-imagens 4a e 4b da FIG. 13D mostrando localização aumentada no local apical em comparação com o local basal).
[0357] Estes dados demonstraram que um fragmento funcional de Cholix que possibilita a localização conjunta basal com Rab11a para acessar o sistema de reciclagem basal pode residir pelo menos dentro dos resíduos de aminoácido 187- 266 da SEQ ID NO: 1.
[0358] Além disto, estes dados possibilitam o desenho racional de veículos que podem transportar cargas úteis para vários locais no interior de uma célula epitelial ou através de tal célula epitelial. Por exemplo, veículos derivados de Cholix compreendendo ou consistindo nos resíduos de aminoácido 1-151, 1-187, 41-187, 41-187, 40-205 ou 41-205 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 podem ser utilizados para a liberação intra-epitelial de carga útil, enquanto os veículos derivados de Cholix compreendendo os resíduos de aminoácido 1-266 da SEQ ID NO: 1 podem ser utilizados para transportar carga útil através de tal barreira de célula epitelial e para a lamina propria. EXEMPLO 8 Marcadores de Proteína Específicos Para Compartimento Celular para a Avaliação do Tipo e Localização de Parceiros de Interação com Veículo de Cholix (TRIPs)
[0359] Este exemplo descreve marcadores de proteína específicos para compartimento de célula epitelial que foram utilizados para a determinação de proteínas que interagem com veículos derivados de Cholix durante processos de endocitose e/ou transcitose.
[0360] A TABELA 12 a seguir abaixo mostra marcadores de proteína específicos para compartimento celular exemplificativos utilizados aqui. Por exemplo, construtos de aplicação derivados de Cholix compreendendo uma IL- 10 como a carga útil heteróloga foram seguidos durante experimentos utilizando ou um anticorpo monoclonal (mAb) contra IL-10 e/ou um anticorpo policlonal (pAb) obtido contra o veículo de Cholix (por exemplo, um que compreende os resíduos 1-266 ou 1-386 da SEQ ID NO: 1).
TABELA 12 – Marcadores de Proteína Específicos para Compartimento Celular Alvo pAb/m Reativi Hospe- Diluição Notas Arma- Cat. # Ab -dade deiro para IHC zena- da (P) mento espécie veículo pAb Coelho 1/500 anti-soro -20°C - de total Cholix IL-10 mAb; Human Camun- 1/25 -20°C - pAb o dongo, Cabra EEA1 pAb Camun- Coelho 1/200 Endossom -20°C Ab2900 dongo, o precoce rato, humano
Rab7 mAb Camun Coelho 1/100 Endossom -20°C Ab1267 dongo, o tardio 712 rato, humano Rab11a pAb Camun- Coelho 1/500 Reciclage -20°C Fisher7 dongo, m 1-5300 rato, endossô- humano mica , coelho, cão LAMP pAb Camun Coelho 1/500 Marcador -20°C Ab2417 1 dongo, de 0 rato, lisossomo humano GM130 pAb Camun Coelho 1/500 Cis-Golgi -20°C - dongo, rato, humano Giantin mAb Rato, Camun- 1/20 Golgi -20°C Ab3726 humano dongo 6 58K mAb Camun- Camun- 1/100 Golgi -20°C Nb600- Golgi dongo, dongo 4512 proteín rato, a humano TGN38 mAb Camun- Camun- 1/1000 Trans- -20°C Nb300- dongo, dongo Golgi 575 rato, humano Calnexi pAb Camun- Coelho 1/500 Retículo -20°C Ab2259 n dongo, endoplas- 5 rato, mático humano Clatrin mAb Camun- Camun- 1/500 Endocitos -20°C Ab2731 a dongo, dongo e mediada rato, por humano clatrina
EXEMPLO 9 Estudos de Transcitose in vitro revelaram Parceiros de Interação de Receptores de Transporte (TRIPs) para Veículos derivados de Cholix
[0361] Este exemplo demonstra a determinação de TRIPs com os quais veículos derivados de Cholix interagem durante a transcitose através de células epiteliais polarizadas. Este exemplo demonstra adicionalmente parceiros de interação crítica que podem representar um papel na transcitose de Cholix.
[0362] As FIGs. 14A-14D mostram efeitos de nocaute de K8, HSPG (perlecan) e GRP75, respectivamente, na função de transcitose de um construto de aplicação com SEQ ID NO: 150 que inclui um veículo derivado de Cholix com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 134 acoplado a hGH (SEQ ID NO: 146) por meio de um espaçador cuja sequência é apresentada na SEQ ID NO: 177. Linhagens celulares estáveis de células Caco-2 não apresentando a expressão de proteínas candidatas específicas K8 (Caco-2K8-), HSPG (Caco-2HSPG-), e GRP75 (Caco-2GRP75-) forma utilizadas como monocamadas in vitro para a verificação de seu envolvimento na transcitose de veículo (por exemplo, veículos de Cholix) por meio de mecanismos de transporte endógeno ativos e seletivos.
[0363] Células Caco-2, parentais ou K8, células estáveis de HSPG (perlecan) ou GRP74 de nocaute (KO), foram semeadas a 1,5 x 105 células/ml em cada Transwell. No dia 18, 100 µl de PBS contendo o construto de aplicação (SEQ ID NO: 150) a 20 µg/ml ou controle molar igual de hGH (SEQ ID NO: 190) foram adicionados no lado apical e 500 µl de PBS na câmara basal. A quantidade de proteínas na solução basal após 1 h a 37ºC foi analisada por western blotting. O blot foi sondado com um mAb anti-hGH.
[0364] A FIG. 14A mostra que o nocaute de K8 não reduz significativamente a função de transcitose do construto de aplicação (SEQ ID NO: 150).
[0365] A FIG. 14B mostra que o nocaute de HSPG (perlecan) reduz significativamente a função de transcitose do construto de aplicação (SEQ ID NO: 150).
[0366] A FIG. 14C mostra que o nocaute de GRP75 reduz significativamente a função de transcitose do construto de aplicação (SEQ ID NO: 150).
[0367] A seguir, a dependência de pH da interação entre uma proteína de Cholix e GRP75 foi avaliada. A FIG. 15A mostra interações de ligação de
Biacore™ (por exemplo, ressonância plasmônica de superfície) utilizadas para examinar tal dependência de pH das interações de veículo de Cholix-GRP75. Para este fim, biotina foi acoplada ao terminal C da proteína de Cholix de comprimento total cuja sequência é apresentada na SEQ ID NO: 1 e subsequentemente fixada a uma superfície (por exemplo, superfície de comprimento total, placa de 96 poços de plástico etc.) utilizando-se a conjunção biológica biotina-estreptavidina e incubada com a proteína GRP75 purificada em soluções tampão a pH 5.5, 6,5, e 7,5, respectivamente. A afinidade de ligação mais alta para esta interação foi medida a pH 6,5. A FIG. 15A mostra que a afinidade da proteína de Cholix para GPR75 é de cerca de 20-25 vezes mas alta a pH 6,5 em comparação com pH 7,5 ou pH 5,5.
[0368] Além disto, a FIG. 15B mostra a dependência de pH da interação de um veículo derivado de Cholix (SEQ ID NO: 189) com o receptor apical (por exemplo, TMEM132), os receptores de evasão de lisossomo (por exemplo, GRP75), receptor de tráfico (por exemplo, ERGIC-53) e receptor basal (por exemplo, perlecan). Esta dependência de pH da interação de receptor indica que um veículo derivado de Cholix pode sequencialmente e dependendo de sua localização interagir com certos receptores. Por exemplo, estes dados mostram que um veículo derivado de Cholix apresenta uma afinidade significativamente mais alta para endocitose e receptores de tráfico precoces tais como o receptor de entrada apical e receptor de evasão de lisossomo a pH 7,5. Uma vez ocorrendo uma queda de pH para cerca de 5,5, a afinidade do veículo de Cholix para estes receptores de tráfico precoces decresce, enquanto sua afinidade para o receptor de tráfico apical-basal ERGIC-53 e para a proteína de liberação basal perlecan aumenta significativamente neste pH, permitindo que o veículo de Cholix seja “entregue” para receptores de liberação de tráfico e basal durante o processo de transcitose vesicular.
[0369] A FIG. 16 mostra interações de ligação de Biacore™ significativas e sequenciais da proteína de Cholix comprimento total cuja sequência é apresentada na SEQ ID NO: 1 com perlecan e GRP75, demonstrando que o Cholix interage com ambas as proteínas. Para o experimento de ligação, 20 µl de proteína Cholix- biotina a 50 nM foram capturados em superfície de chip Biacore SA. Foram injetados 60 µl e proteína perlecan humana (HSPG) a 200 nM através da superfície de chip à velocidade de 30 µl/min. Foram então injetados 60 µl de proteína GRP75 humana a 100 nM através da superfície de chip à velocidade de 30 µl/min. A superfície de chip foi regenerada pela injeção de 50 µl de Glicina a 10 mM a pH 1,5 de maneira a remover todas as proteínas ligadas.
[0370] A FIG. 17 mostra interações de ligação de Biacore™ significativas e sequenciais da proteína de Cholix de comprimento total cuja sequência é apresentada na SEQ ID NO: 1 com GRP75, perlecan e TMEM132A, demonstrando que o Cholix interage com todas as três proteínas. Para os experimentos de ligação, 20 µl de proteína Cholix-biotina a 50 nM foram capturados em superfície de chip Biacore SA. Foram injetados 30 µl de proteína GRP75 humana a 100 nM através da superfície de chip à velocidade de 30 µl/min. Foram então injetados 60 µl de uma proteína perlecan humana a 200 nM através da superfície de chip à velocidade de 30 µl/min seguidos de 30 µl de proteína TMEM132A humana a 200 nM. A superfície de chip foi regenerada por injeção de 50 µl de Glicina 10 mM a pH 1,5 de maneira a remover todas as proteínas ligadas.
[0371] Estes dados demonstraram que a GRP75 e perlecan podem representar um papel na função de transcitose dos veículos derivados de Cholix e as proteínas de Cholix ligam as proteínas GRP75, perlecan, TMEM132. EXEMPLO 10 Veículos Derivados de Cholix que Sofrem Transcitose Através de Células Epiteliais Polarizadas não podem se Localizar conjuntamente com LAMP1+ ou Rab7+ e podem ser Direcionados em Afastamento dos Lisossomos durante a Transcitose Apical para Basal
[0372] Este exemplo demonstra que os veículos derivados de um polipeptídeo de Cholix são direcionados em afastamento dos lisossomos durante a transcitose e, desta forma, não interagem com a rota de reciclagem lisossômica que permite que o sofra transcitose inalterado e completamente funcional através de células epiteliais polarizadas.
[0373] As FIGs. 18A-18D mostram o destino de hormônio de crescimento humano (hGH, SEQ ID NO: 190) que foi administrado por injeção intraluminal (ILI, a superfície luminal é indicada como uma seta branca nas FIG. 18A-FIG. 18F) no jejuno de rato in vivo que foi avaliado primeiro como um experimento de controle potencial esperando transporte de hGH para lisossomos após a absorção celular.
[0374] A FIG. 18A mostra que a localização de hGH (SEQ ID NO: 190) 15 minutos após a injeção (ILI) foi limitada a uma pequena população de vesículas na região apical de células epiteliais como demonstrado pela detecção de imunofluorescência verde.
[0375] As FIG. 18B, FIG. 18C e FIG. 18D mostram que 15 min após ILI, hGH (SEQ ID NO: 190) terem sido localizadas conjuntamente com proteína de membrana associada a lisossomo 1 (LAMP1, fluorescência vermelha) (FIG. 18B) e proteína relacionada a (Rab7, fluorescência púrpura) (FIG. 18C) com cerca da mesma frequência e características de lisossomos residentes de LAMP1+, Rab7+ (FIG. 18D), indicando que o hGH foi direcionado para a rota destrutiva lisossômica (por exemplo, reciclagem) logo após a absorção nas células epiteliais.
[0376] As FIG. 18E e FIG. 18F mostram que um construto de aplicação (SEQ ID NO: 159) que inclui um veículo derivado de Cholix (SEQ ID NO: 134) acoplado a hGH (SEQ ID NO: 146) por meio de um espaçador (SEQ ID NO: 175), foi direcionado em afastamento da rota lisossômica e, desta forma, não mostrou localização conjunta ou com LAMP1 (FIG. 18E) ou com Rab7 (FIG. 18F), desta forma, possibilitando a transcitose de carga útil funcional através de células epiteliais polarizadas para a lamina propria.
[0377] A FIG. 19A mostra que a distribuição da proteína I de revestimento (COPI, fluorescência vermelha) ficou restrita à membrana apical luminal e compartimento apical vesicular das células epiteliais antes da injeção luminal de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 159) que inclui um veículo derivado de
Cholix (SEQ ID NO: 134) acoplado a hGH (SEQ ID NO: 146) por meio de um espaçador (SEQ ID NO: 175). Em comparação, a FIG. 19B mostra que a injeção intraluminal apical (ILI, a superfície luminal é indicada como uma seta branca nas FIG. 19A-FIG. 19D) do construto de aplicação (SEQ ID NO: 159), induziu a redistribuição de COPI para um local supranuclear, indicando a localização conjunta das vesículas contendo tanto o construto de aplicação com SEQ ID NO: 159 quanto COPI. A fluorescência azul indica a marcação com DAPI. As medições nas FIGs. 19A-19D foram conduzidas 15 minutos após a ILI.
[0378] A FIG. 19C mostra que a LMAN1 (fluorescência verde) se localizou conjuntamente com COPI (fluorescência vermelha) na região apical (destacada pela seta branca) das células epiteliais polarizadas antes da injeção de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 159).
[0379] A FIG. 19D mostra que, após a ILI apical (destacada pela seta branca) de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 159), a LMAN1 interagiu e foi distribuída com o construto de aplicação para a região basal da célula epitelial, que é adjacente à lamina propria (indicada como “l-p”). Desta forma, a redistribuição de LMAN1 parece ser utilizada pelos veículos de Cholix para se deslocarem do lado apical da célula epitelial para um compartimento basal.
[0380] Um experimento de acompanhamento mostrou que os veículos derivados de Cholix podem utilizar proteínas ERGIC (por exemplo, ERGIC-53) para o trágico dos compartimentos apicais para os basais após a endocitose.
[0381] As FIGs. 19E-19H mostram o tráfico de um veículo de Cholix (SEQ ID NO: 134) do compartimento apical (indicado pela seta branca #1) para o basal (indicado pela seta branca #2) em células epiteliais 5 (FIG. 19F), 10 (FIG. 19G) e 15 min (FIG. 19H) após a injeção luminal de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 159) compreendendo um veículo derivado de Cholix (SEQ ID NO: 134) acoplado a um hGH (SEQ ID NO: 146) em jejuno de rato. A localização do veículo de Cholix é mostrada por fluorescência verde, a localização do receptor de ERGIC é mostrada por fluorescência vermelha e a localização do complexo de proteína de tráfico ER-Golgi é mostrada por fluorescência púrpura; desta forma, a interação do veículo de Cholix e receptor de ERGIC é mostrada por fluorescência amarela, a interação do veículo de Cholix e o complexo de proteína de tráfico ER-Golgi é mostrada por fluorescência rosa e a interação e/ou localização conjunta do veículo de Cholix, receptor de ERGIC e complexo de proteína de tráfico ER-Golgi é mostrada por pontos brancos (sobreposição de fluorescência verde, vermelha e púrpura). A marcação com DAPI é indicada por fluorescência azul.
[0382] A FIG. 19E mostra células epiteliais intestinais polarizadas não tratadas.
[0383] A FIG. 19F mostra a localização e interação do veículo de Cholix (SEQ ID NO: 134) com o complexo de proteína de tráfico ER-Golgi 5 minutos após a injeção luminal no compartimento apical como indicado pelo sinal de fluorescência rosa nos compartimentos apicais.
[0384] A FIG. 19G mostra o tráfico do veículo de Cholix (SEQ ID NO: 134) em associação com ERGIG-53 para a membrana basal 10 minutos após a injeção luminal seguida de liberação basal release do veículo (e construto) para a lamina propria (seta dourada). Estes dados demonstraram que os veículos derivados de Cholix utilizaram interações específicas com proteínas ERGICs para “sequestrar” o tráfico vesicular dos compartimentos apicais para os basais de uma célula epitelial polarizada.
[0385] A FIG. 19H mostra quantidades aumentadas de veículo de Cholix (SEQ ID NO: 134) presente na lamina propria 15 minutos após a injeção luminal.
[0386] As FIGs. 19I-19K mostram que um veículo de Cholix (SEQ ID NO: 134) utilizou mecanismos de secreção de proteína basal para o tráfico através de uma célula epitelial polarizada para a lamina propria. As imagens de microscopia de fluorescência foram obtidas 15 min após a injeção luminal de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 159) compreendendo um veículo derivado de Cholix (SEQ ID NO: 134) acoplado a um hGH (SEQ ID NO: 146) em jejuno de rato, e mostraram que as vesículas basais podem conter veículo de Cholix e receptor de ERGIC-53, veículo de Cholix e proteína de secreção basal ou todos os três de veículo de Cholix, receptor de ERGIC-53 e proteína de secreção basal. A localização do veículo de Cholix é mostrada por fluorescência verde (utilizando- se um anticorpo anti-veículo de Cholix), A localização do receptor ERGIC-53 é mostrada por fluorescência vermelha e a localização da proteína de secreção basal é mostrada por fluorescência púrpura; desta forma, a interação do veículo de Cholix e receptor de ERGIC-53 é mostrada por fluorescência amarela, a interação do veículo de Cholix e proteína de secreção basal é mostrada por fluorescência rosa e a interação e/ou localização conjunta do veículo de Cholix, receptor de ERGIC-53 e proteína de secreção basal é mostrada por pontos brancos (sobreposição de fluorescência verde, vermelha e púrpura). A marcação com DAPI é indicada por fluorescência azul.
[0387] A FIG. 19I mostra que as vesículas do compartimento basal continham veículo de Cholix (SEQ ID NO: 134) e receptor de ERGIC-53 tal como indicado por fluorescência amarela.
[0388] A FIG. 19J mostra que as vesículas do compartimento basal continham veículo de Cholix (SEQ ID NO: 134) e proteína de secreção basal tal como indicado por fluorescência rosa.
[0389] A FIG. 19K mostra que as vesículas do compartimento basal continham veículo de Cholix (SEQ ID NO: 134), receptor de ERGIC-53 e proteína de secreção basal tal como indicado pelos pontos brancos (por exemplo, sobreposição de fluorescência verde, vermelha e púrpura).
[0390] A FIG. 20A mostra a distribuição de um outro elemento do compartimento intermediário do retículo endoplasmático-Golgi (ERGIC), SEC22b, na ausência de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 159). Em tecidos não tratados (isto é, sem injeção de um construto de aplicação), SEC22b e LMAN1 se localizaram conjuntamente extensivamente no compartimento apical, enquanto LMAN1 sozinha foi observada separadamente próxima à membrana plasmática apical. Nas FIGs. 20A-20D, a fluorescência vermelha mostra a localização de LMAN1, a fluorescência púrpura mostra a localização de
SEC22b, a fluorescência verde mostra a localização de hGH, a seta branca indica a superfície apical, e “G” indica células caliciformes.
[0391] A FIG. 20B mostra que 5 minutos após a ILI de um construto de aplicação (SEQ ID NO: 159) incluindo um veículo de Cholix (SEQ ID NO: 134) acoplado a hGH (SEQ ID NO: 146), LMAN1, SEC22b e hGH se localizaram conjuntamente no compartimento apical, mas não significativamente em compartimentos basais das células epiteliais.
[0392] A FIG. 20C mostra que 10 min após a ILI, o construto de aplicação (SEQ ID NO: 159) e LMAN1 foram observados localizados conjuntamente no compartimento basal de células epiteliais sem SEC22b, confirmando que LMAN1 interagiu e se deslocou com o construto de aplicação no interior das vesículas do compartimento vesicular apical para o basal das células epiteliais.
[0393] A FIG. 20D mostra que a extensão da localização conjunta do construto de aplicação (SEQ ID NO: 159) e LMAN1 no compartimento basal 15 min após a ILI aumentou, com uma quantidade significativa de hGH alcançando a lamina propria no tempo.
[0394] As FIG. 20E-FIG. 20H mostram as mesmas seções de tecido descritas acima e mostradas nas FIG. 20A-FIG. 20D, mas mostrando apenas os sinais de LMAN1 e SEC22b (sem sinal de hGH). Isto demonstrou a profunda redistribuição de LMAN1 para o compartimento basal sem uma redistribuição de SEC22b em resposta à aplicação apical de uma liberação (SEQ ID NO: 159). Estes dados demonstraram adicionalmente que os construtos de aplicação compreendendo um veículo derivado de Cholix podem utilizar a tora de tráfico endógena de Cholix que permite o transporte rápido e eficiente de carga útil através do epitélio intestinal por acoplamento de tal carga útil ao veículo.
[0395] Em conjunto, estes dados mostraram que os veículos derivados de Cholix utilizaram mecanismos de tráfico bacteriano endógenos para alcançar a transcitose apical para basal, permitindo que tais veículos e construtos de aplicação compreendendo tais veículos traficassem do lúmen intestinal para a lamina propria sem prejuízo da função de barreira de um epitélio intestinal e sem serem enzimaticamente oi quimicamente modificados durante tal transporte. Estes mecanismos de transporte transepitelial podem possibilitar a administração oral de um construto de aplicação terapêutico compreendendo um veículo derivado de Cholix acoplado a uma carga útil terapêutica e o transporte da carga útil terapêutica através de membranas epiteliais intactas e polarizadas. EXEMPLO 11 Modelo de superfície de um veículo derivado de Cholix
[0396] Este exemplo mostra elementos sequência estrutural de um polipeptídeo de Cholix com SEQ ID NO: 178.
[0397] As FIGs. 21A-21E mostram um modelo de superfície exemplificativo de um veículo derivado de Cholix consistindo na SEQ ID NO: 178 (inclui os resíduos de aminoácido 1-265 da SEQ ID NO: 1 e uma metionina no terminal N) que foi utilizado para destacar as regiões selecionadas de interesse que podem representar um papel em certas funcionalidades relacionadas à transcitose apical para basal, bem como sua posição relativa e proximidade na proteína superfície. As regiões de aminoácidos localizadas nos resíduos V1 e E39 são adjacentes à superfície dos aminoácidos expostos D150-K186 e K186-L205. Especificamente, L17- I25 (região X1, SEQ ID NO: 160) e T170-I176 (região X2, SEQ ID NO: 161) se coordenam para formar um bolso circundado por várias cargas negativas. Similarmente, K186-H202 (região X3, SEQ ID NO: 162) se coordenam com I31-E39 (região X4, SEQ ID NO: 163) para formar uma estrutura em elevação contínua. Em adição, o modelo de superfície model mostra os resíduos D135-N139 (região X5, SEQ ID NO: 164), e os resíduos de asparagina (por exemplo, sítios de glicosilação potenciais) destacados em púrpura.
[0398] A FIG. 21A mostra a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de Cholix com a SEQ ID NO: 178. A FIG. 21B mostra uma localização das regiões X1, X3 e X4. A FIG. 21C mostra uma localização das regiões X1 e X2, bem como X3 e X4. A FIG. 21D mostra uma localização das regiões X1, X2, X4 e X5.
[0399] Estes dados de estrutura mostram que um fragmento funcional de sequências dentro da sequência de Cholix da SEQ ID NO: 1 pode apresentar proximidade entre si tal como as regiões X3 e X4 e regiões X1 e X2. EXEMPLO 12 Construtos de Aplicação de Cholix Interagem e/ou se Localiza conjuntamente com Vários Proteínas Marcadoras Durante a Transcitose Utilizando Compartimentos Distintos
[0400] Este exemplo demonstrou que veículos derivados de Cholix podem utilizar compartimentos distintos para o tráfico para e através de (por exemplo, via transcitose) células epiteliais utilizando várias proteínas marcadoras (ver, por exemplo, o EXEMPLO 8). Estes dados indicam que os construtos de veículo derivado de Cholix podem utilizar “sequestro” específico e rotas endógenas de tráfico de Cholix (FIG. 24). O estudo descrito neste exemplo foi conduzido utilizando-se os construtos de aplicação derivados de Cholix apresentando a sequência apresentada na SEQ ID NO: 149 que inclui um veículo (SEQ ID NO: 135) acoplado a IL-10 (SEQ ID NO: 145) por meio de um espaçador com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 176.
[0401] As FIGs. 22A-22L ilustram uma análise de rota de tráfico para um construto de aplicação derivado (SEQ ID NO: 149). Nas FIGs. 22A-22L a seta branca #1 destaca a superfície apical, a seta branca #2 destaca a superfície basal e a seta branca #3 destaca a lamina propria.
[0402] A FIG. 22A mostra que o construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) se localizou conjuntamente fortemente com o antígeno de EEA1 em locais celulares consistentes com o tráfico tanto nos compartimentos apicais quanto basais de células epiteliais, sugerindo a presença do construto de aplicação derivado de Cholix em compartimentos de endossomo precoce. A fluorescência vermelha mostra a localização do antígeno de EEA1 e a fluorescência verde mostra a localização de IL-10.
[0403] A FIG. 22B mostra que o construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) se localizou conjuntamente fortemente com Rab7 (esquerda superior)
predominantemente no compartimento apical de células epiteliais, mas com localização conjunta apenas limitada em células dentro da lamina propria, sugerindo a presença do construto de aplicação derivado de Cholix em compartimentos de endossomo tardio (esquerda inferior mostra a imagem de luz branca e a direita inferior mostra a marcação misturada com a marcação com DAPI que é mostrada em azul, a fluorescência vermelha mostrando a localização do antígeno de EEA1 e a fluorescência verde mostrando a localização de IL-10).
[0404] A FIG. 22C mostra que LAMP1 foi identificada em vesículas grandes específicas consistentes com lisossomos maduros que não continham o construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) (setas brancas, a fluorescência vermelha mostrando a localização do antígeno de EEA1 e a fluorescência verde mostrando a localização de IL-10). O construto de aplicação (SEQ ID NO: 149), no entanto, se localizou conjuntamente com o antígeno de LAMP1 em locais celulares outros que não estruturas semelhantes a lisossomo, consistente com o tráfico de vesícula tanto nos compartimentos apicais quanto basais de células epiteliais, sugerindo a presença do construto de aplicação derivado de Cholix em compartimentos endossômicos tardios.
[0405] A FIG. 22D mostra que o construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) também se localizou conjuntamente fortemente com vesículas revestidas com clatrina, particularmente em áreas adjacentes ao núcleo e com Rab11a predominantemente no compartimento basal das células epiteliais, bem como em células selecionadas dentro da lamina propria. A marcação com DAPI é mostrada em azul, a fluorescência vermelha mostra a localização do antígeno de IL-10 e a fluorescência verde mostra a localização da clatrina.
[0406] A FIG. 22E mostra que o construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) se localizou conjuntamente com o retículo endoplasmático tal como demonstrado pela calnexina (a fluorescência vermelha mostrando a localização da calnexina e a fluorescência verde mostrando a localização de IL-10) em um padrão adjacente ao núcleo em células epiteliais e em uma grande fração de células dentro da lamina propria. Especificamente, o construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) se localizou conjuntamente fortemente com o compartimento intermediário de Golgi do retículo endoplasmático (ERGIC) e o antígeno de LMAN1 pareceu se redistribuir em resposta à endocitose e transcitose do veículo, como mostrado para 5 (FIG. 22F), 10 (FIG. 22G) e 15 minutos após a injeção (FIG. 22H).
[0407] A FIG. 22F mostra que o construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) se localizou conjuntamente fortemente com o compartimento intermediário de Golgi 53 do retículo endoplasmático (ERGIC-53) e o antígeno de LMAN1 (a fluorescência vermelha mostrando a localização de ERGIC-53 e LMAN1 e a fluorescência verde mostrando a localização de IL-10, a fluorescência azul mostra a marcação com DAPI) pareceu se redistribuir em resposta à endocitose e transcitose do veículo, como mostrado para 5 minuto após a injeção.
[0408] A FIG. 22G mostra que o construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) se localizou conjuntamente com o antígeno de LMAN1 10 minutos após a injeção. Os dados mostram uma localização significativa do construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) na lamina propria.
[0409] A FIG. 22H mostra que o construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) se localizou conjuntamente com o antígeno de LMAN1 15 minutos após a injeção. Os dados mostraram uma localização significativa do construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) na lamina propria.
[0410] A FIG. 22I mostra que o construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) não se localiza conjuntamente com níveis baixos de giantina presente nas células epiteliais (a fluorescência vermelha mostrando a localização de IL-10 e a fluorescência verde mostrando a localização da giantina, a fluorescência azul mostra a marcação com DAPI). Alguma giantina se localizou conjuntamente com o construto em um subconjunto de células presentes na lamina propria, sugerindo que o veículo derivado de Cholix não se localiza com o compartimento de Golgi.
[0411] A FIG. 22J mostra que o antígeno de 58K se localizou em células epiteliais em um local apical para o núcleo e o construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) mostrou alguma localização conjunta (a fluorescência vermelha mostrando a localização de IL-10 e a fluorescência verde mostrando a localização do antígeno de 58K Golgi, a fluorescência azul mostra a marcação com DAPI) com esta proteína em uma maneira que sugere um breve deslocamento através deste compartimento. Nenhum antígeno de 58K foi observado em células dentro da lamina propria.
[0412] A FIG. 22K mostra que o construto de aplicação (SEQ ID NO: 149, esquerda superior, localização de IL-10) mostrou algum nível de localização conjunta com o antígeno de TGN38 (direita superior), que mostrou uma distribuição que era restrita ao lado apical dos núcleos em células epiteliais e adjacentes ao núcleo em umas poucas células dentro da lamina propria. A imagem à esquerda inferior mostra uma imagem de luz branca e a direita inferior mostra uma mistura de sinais (sobreposição) com IL-10 (vermelho), TGN38 (verde) e DAPI (fluorescência azul).
[0413] A FIG. 22L mostra que o construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) (localização de IL-10 mostrada por fluorescência verde, direita superior) se localizou conjuntamente fortemente com Rab11a (esquerda superior, localização mostrada por fluorescência vermelha) predominantemente no compartimento basal de células epiteliais e em células selecionadas dentro da lamina propria. A imagem à esquerda inferior mostra uma imagem de luz branca e a direita inferior mostra uma mistura de sinais (sobreposição) com IL-10 (verde), Rab11a (vermelho) e DAPI (fluorescência azul).
[0414] As FIGs. 23A-23C mostram imagens de microscopia demonstrando a transcitose de uma IL-10 através de células epiteliais intestinais polarizadas em ratos Wistar em vários pontos no tempo após a aplicação luminal do construto de aplicação com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 149 em jejuno de rato. O construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) incluiu um veículo com SEQ ID NO: 135 acoplado a uma carga útil de IL-10 apresentando a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 145 por meio de um espaçador apresentando uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 176. A fluorescência verde indica a presença de IL-10 (por meio de marcação com um anticorpo anti- IL-10). A fluorescência azul indica a marcação com DAPI, que rotula DNA e a fluorescência vermelha indica a presença de CK-8 (citoqueratoina-8) com a qual um veículo derivado de Cholix pode se localizar conjuntamente (por exemplo, em uma região supranuclear de uma célula epitelial) durante a transcitose. As setas brancas #1 destacam a membrana apical das células epiteliais e as setas brancas #2 destacam a membrana basal das células epiteliais.
[0415] A FIG. 23A demonstra a extensão da transcitose de IL-10 um minuto após a aplicação luminal do construto de aplicação com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 149 em jejuno de rato. Os dados mostraram que o transporte de uma carga útil de IL-10 do local apical para o basal e para a lamina propria ocorreu logo a 1 minuto após a aplicação do construto de aplicação. A seta branca #3 indica a presença de IL-10 na lamina propria.
[0416] A FIG. 23B demonstra a extensão da transcitose de IL-10 cinco minutos após a aplicação luminal do construto de aplicação com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 149 em jejuno de rato. Os dados mostraram uma quantidade aumentadas de carga útil de IL-10 transportada que estava presente na lamina propria (ver, por exemplo, as setas brancas #3) 5 minutos após a aplicação luminal do construto de aplicação.
[0417] A FIG. 23C demonstra a extensão da transcitose de IL-10 dez minutos após a aplicação luminal do construto de aplicação com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 149 em jejuno de rato. Os dados mostraram uma quantidade ainda maior de carga útil de IL-10 transportada que estava presente na lamina propria (ver, por exemplo, as setas brancas #3) 10 minutos após a aplicação luminal do construto de aplicação.
[0418] Experimentos de tráfico adicionais utilizando microscopia de fluorescência foram conduzidos de maneira a iluminar o mecanismo de transcitose do veículo de Cholix com SEQ ID NO: 135 que é incluído no construto de aplicação com SEQ ID NO: 149.
[0419] As FIGs. 23D-23F mostram a endocitose apical e o tráfico precoce do veículo de Cholix com SEQ ID NO: 135 em células epiteliais 1 min após a injeção luminal do construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) compreendendo o veículo de Cholix com SEQ ID NO: 135 acoplado a uma IL-10 (SEQ ID NO: 145) em jejuno de rato. Os dados mostraram que os veículos derivados de Cholix evitam a rota de destruição lisossômica por interação com receptores de evasão de lisossomo. A localização do veículo de Cholix é mostrada por fluorescência verde, a localização do receptor de entrada apical (por exemplo, TMEM132) é mostrada por fluorescência vermelha e a localização dos receptores de evasão de lisossomo é mostrada por fluorescência púrpura; desta forma, a interação do veículo de Cholix e receptor de entrada apical é mostrada por fluorescência amarela, a interação do veículo de Cholix e receptor de evasão de lisossomo é mostrada por fluorescência rosa e a interação e/ou localização conjunta do veículo de Cholix, receptor de entrada apical e receptor de evasão de lisossomo é mostrada por pontos brancos (sobreposição de fluorescência verde, vermelha e púrpura). A marcação com DAPI é indicada por fluorescência azul.
[0420] A FIG. 23D mostra a localização do veículo de Cholix (SEQ ID NO: 135) na membrana apical (indicada pela seta branca #1) de uma célula epitelial polarizada. A membrana basal é indicada pela seta branca #2 e a lamina propria é indicada pela seta branca #3.
[0421] A FIG. 23E mostra a interação do veículo de Cholix (SEQ ID NO: 135) com o receptor de entrada apical (por exemplo, TMEM132) tal como indicado por fluorescência amarela na e em torno da membrana apical.
[0422] A FIG. 23F mostra que o veículo de Cholix (SEQ ID NO: 135), receptor de entrada apical e receptor de evasão de lisossomo estão próximos na membrana apical como mostrado pelos pontos brancos (por exemplo, a sobreposição de fluorescência verde, vermelha e púrpura) indicado pela seta branca. É assumido que o receptor de evasão de lisossomo pode se aproximar de um complexo veículo de Cholix-receptor de entrada apical, seguido da dissociação do veículo de Cholix com o receptor de entrada apical e associação do veículo de Cholix com o receptor de evasão de lisossomo devido a alterações no pH ambiental e a dependência de pH destas interações veículo de Cholix- receptor como mostrado, por exemplo, na FIG. 15B.
[0423] As FIGs. 23G-23H mostram o tráfico de um veículo de Cholix (SEQ ID NO: 135) do compartimento apical para o supranuclear em células epiteliais 5 e 15 min após a injeção luminal do construto de aplicação (SEQ ID NO: 149) compreendendo um veículo derivado de Cholix (SEQ ID NO: 135) acoplado a uma IL-10 (SEQ ID NO: 145) em jejuno de rato. A localização do veículo de Cholix é mostrada por fluorescência verde, a localização do receptor de ERGIC é mostrada por fluorescência vermelha, a localização do receptor de entrada apical (por exemplo, TMEM132) é mostrada por fluorescência laranja e a localização of receptores de evasão de lisossomo é mostrada por fluorescência púrpura; desta forma, a interação do veículo de Cholix e receptor de ERGIC é mostrada por fluorescência amarela, a interação do veículo de Cholix e receptor de evasão de lisossomo é mostrada por fluorescência rosa e a interação e/ou localização conjunta do veículo de Cholix, receptor de entrada apical e receptor de evasão de lisossomo é mostrada por pontos brancos (sobreposição de fluorescência verde, vermelha e púrpura). A marcação com DAPI é indicada por fluorescência azul.
[0424] A FIG. 23G mostra a localização do veículo de Cholix (SEQ ID NO: 135) em uma célula epitelial intestinal polarizada 5 minutos após a injeção luminal do construto de aplicação (SEQ ID NO: 149). Os dados mostraram que, após a endocitose apical mediada por receptor, o veículo de Cholix formou complexos com um receptor de evasão de lisossomo e receptor de entrada apical próximo à membrana apical (indicada por pontos brancos (sobreposição de fluorescência verde, vermelha e púrpura) e destacada pela seta branca) e também iniciou uma interação com o receptor de ERGIC como demonstrado por fluorescência amarela (e a seta amarela) ligeiramente mais próximo às regiões supranucleares dentro da célula.
[0425] A FIG. 23H mostra a localização do veículo de Cholix (SEQ ID NO: 135) em uma célula epitelial intestinal polarizada 15 minutos após a injeção luminal do construto de aplicação (SEQ ID NO: 149). Os dados mostraram que o veículo se deslocou dos compartimentos apicais para os supranucleares enquanto associado com ERGIC (ver seta amarela), onde a intensidade da fluorescência amarela é amentada em comparação com 5 minutos após a injeção, indicando um deslocamento aumentado do veículo de Cholix das regiões apicais para as supranucleares no tempo. Os dados mostraram adicionalmente a localização do veículo de Cholix na membrana basal e na lamina propria (setas douradas).
[0426] Em conjunto, estes dados demonstraram que veículos derivados de Cholix podem utilizar rotas endógenas de tráfico de Cholix para a transcitose através de células epiteliais polarizadas e, desta forma, podem ser utilizados para transportar rapidamente e eficientemente carga útil (por exemplo, proteínas terapêuticas tais como interleucinas) através de barreiras de célula epitelial sem prejudicar a atividade biológica de tal carga útil. EXEMPLO 13 Transporte de agentes anti-TNFα através de Camadas de Célula Epitelial
[0427] Este exemplo mostra que o polipeptídeo de veículo derivado de Cholix pode transportar agentes anti-TNFα através de camadas de célula epitelial intactas.
[0428] Os construtos de aplicação são testados para transporte epitelial intestinal como se sege: ratos do tipo selvagem (Sprague Dawley®, ~200 – 250 gramas, ~ 6 semanas de idade, adquiridos da Charles River) são postos em jejum durante a noite para limpar os intestines; preparação de tubos de microcentrífuga contento 4% de formaldeído, tubos para a preservação de tecido, tubes de microcentrífuga para a coleta de sangue, tubos de microcentrífuga para a coleta de soro, PBS e artigo de teste; os animais are preparados para o experimento (os animais são anestesiados com Isoflurano e o abdômen é depilado); preparação de injeções para cada animal (cada animal recebe 4 injeções (2 x jejuno e 2 x cólon); a cavidade abdominal é aberta, são localizados e marcados os locais de injeção com cores distintas; lentamente é injetado o artigo de teste no lúmen (a injeção ocorre a 10 minutos no cólon e 40 minutos no jejuno) e os animais recebem 35 μg de proteína por injeção na concentração de 1 μg/μL; os animais são sacrificados a 50 minutos; o sangue terminal é coletado por meio de punção cardíaca; o jejuno e o cólon são removidos e colocados em uma superfície de trabalho revestida com plástico; os conteúdos de descarga do jejuno e cólon utilizando-se PBS e descartados; é extirpado 1 cm de comprimento de intestine do local da injeção; o tecido extirpado é cortado pela metade e 1 seção é colocada em formaldeído 4%. O tecido restante é então fatiado ao longo do comprimento e imediatamente colocado em um tubo de microcentrífuga e congelado. Este processo pode ser repetido para todos os locais de injeção. O fígado é removido (~1cm3) e dividido em 2 pedaços. É colocada 1 seção de fígado em formaldeído e a segunda é imediatamente armazenada congelada. Amostras de intestino, fígado e sangue são coletadas a 40 min do término. As amostras de sangue são centrifugadas e o soro é transferido para um recipiente para armazenamento. As amostras são transportadas em gelo seco e armazenadas a -80°C. A estratégia de dosagem foi como se segue: Chx386-anti-TNFα 100 µL, 490 pmol / 98 µg (4,9 uM); Chx415-anti-TNFα 100 µL, 490 pmol / 99,5 µg (4,9 uM); anti-TNFα 100 µL, 490 pmol/76 µg (4,9 uM).
[0429] São realizadas análises bioanalíticas do transporte epitelial intestinal dos construtos de Cholix-antiTNF-α pela utilização de um kit IgG1 ELISA de camundongo (abcam®, Cat# ab133045) como se segue: amostras de tecido são obtidas a partir de Brains On-line; 300 μL de tampão de ensaio 1X são adicionados a cada tubo contendo amostra de tecido; o tecido é removido do tampão de ensaio e colocado em uma placa tampada de cultura celular limpa estéril; as amostras intestinais são gentilmente raspadas com um raspador de célula com o cuidado de evitar a coleta do mesentério; as amostras de fígado são tratadas de maneira similar com maceração e homogeneização adicionais; o homogenato celular resultante é transferido de volta para o tuno original; as amostras de tecido restantes e a área de trabalho são enxaguadas com 100 μL de tampão (2x); a solução de homogenato celular é centrifugada na força máxima por 5 minutos; o sobrenadante é aplicado em placa de ELISA de acordo com as instruções do fabricante. O sobrenadante remanescente é armazenado a -20°C para uso posterior.
[0430] A FIG. 25 mostra tanto um veículo derivado de Cholix386 (por exemplo, SEQ ID NOs: 135 ou 180) quanto um veículo derivado de (por exemplo, compreendendo os resíduos 1-415 da SEQ ID NO: 1) transportam um agente anti- TNFα (por exemplo, um anticorpo anti-TNFα ou fragmento funcional deste) através de células epiteliais intestinais em 10 minutos e em 40 minutos. Além disto, um construto de Cholix386-anti-TNFα transporta a cerca de 12x a taxa de anti-TNF-α separadamente e um Cholix415-anti-TNFα transporta a ~7x a taxa de anti-TNF-α separadamente.
[0431] Estes dados demonstraram que os veículos derivados de Cholix são capazes de transportar uma variedade de moléculas de carga útil tais como um agente anti-TNFα através de camadas de célula epitelial polarizada e intacta. EXEMPLO 14 Preparação de construtos de aplicação compreendendo Exenatídeo
[0432] Exenatídeo (SEQ ID NO: 195) é um peptídeo apresentando atividade biológica semelhante a GLP-1 que é estabilizado por uma amina no terminal C e um H no terminal N. Neste Exemplo, dois construtos de ocorrência não natural isolados compreendendo: 1) um veículo apresentando a SEQ ID NO: 194 processado a um veículo apresentando a SEQ ID NO: 192 e reticulado com a SEQ ID NO: 195 e 2) um veículo apresentando a SEQ ID NO: 191 processado para veículo apresentando a SEQ ID NO: 193 e reticulado com a SEQ ID NO: 195 foram preparados e testados para transporte epitelial intestinal in vivo. Os veículos apresentando a SEQ ID NO: 191 e a SEQ ID NO: 192 foram preparados como descrito aqui e o Exenatídeo (SEQ ID NO: 195) (Cat# HOR-246) foi adquirido da ProSpec-Tany Technogene Ltd. PO Box 6591, East Brunswick, NJ
08816. Um Kit de Reticulação Controlada Proteína-Proteína PierceTM (Cat# 23456) compreendendo o agente de reticulação Sulfo-SMCC foi adquirido da ThermoFisher. Ativação e reticulação de carga útil e veículo:
[0433] O Exenatídeo (10 mg) foi dissolvido em 5 mL de H20 para formar uma solução a 2 mg/mL. Sulfo-SMCC (2 mg) foi dissolvido em 2 mL de PBS. Imediatamente depois, 0,088 mL (~5 vezes de excesso molar) da solução de Sulfo-SMCC foram adicionados a 1.0 mL de uma solução de Exenatídeo e foi realizada incubação por 30 minutos à temperatura ambiente. O Sulfo-SMCC não reagido foi removido pela aplicação de 1,0 mL da mistura reacional maleimida- Exenatídeo a uma coluna de dessalinização equilibrada com PBS, eluindo com PBS e coletando frações de 0,5 mL. A absorbância a 280 nm de cada fração foi medida para localizar o pico de proteína. As frações de pico contendo a maior parte da proteína foram reunidas. A concentração de Exenatídeo ativado reunido foi determinada por comparação de sua absorbância a 280 nm com a absorbância da solução de proteína original.
[0434] Os veículos apresentando a SEQ ID NO: 193 e a SEQ ID NO: 194 apresentam uma extensão do terminal C compreendendo um sítio de clivagem TEV flanqueado por dois resíduos de cisteína que formam uma ligação dissulfeto e uma etiqueta His6 no terminal C. Os veículos apresentando a SEQ ID NO: 193 e a SEQ ID NO: 194 foram purificados em uma coluna HisTrap pela utilização de métodos padrão. Foram ativados 2 mg de proteína (200 μL de 10 mg/ml) em PBS a pH 7,4 por tratamento com 2 μl de ditiotreitol 0,1 M e 5 μl de protease para TEV por duas horas a 30°C. A proteína clivada e reduzida foi aplicada a uma coluna 1-ml HisTrap equilibrada com PBS. O fragmento do terminal C ligado à coluna e o terminal N ativado da SEQ ID NO: 191 ou SEQ ID NO: 192 produzido com uma cisteína livre próxima a seu terminal C foi coletado no fluxo.
[0435] O maleimida-Exenatídeo ativado e os veículos (proteína sulfidril-SEQ ID NO: 191 ou proteína sulfidril-SEQ ID NO: 192) foram misturados em quantidades molares iguais e então incubados por 60 minutos à temperatura ambiente. A pureza do complexo SMCC-reticulado com SEQ ID NO: 192 – Exenatídeo foi avaliada em um gel SDS marcado com Coomassie. O complexo apresentava aproximadamente o peso molecular correto e apresentada >90% de pureza (FIG. 26). O construto de aplicação reticulado foi então armazenado a 4°C. EXEMPLO 15 Transcitose In vivo de Construtos de Aplicação de Exenatídeo
[0436] Os construtos de aplicação foram testados para transporte epitelial intestinal como se segue: ratos Sprague Dawley® do tipo selvagem (~200 – 250 gramas, ~ 6 semanas de idade, adquiridos da Charles River) foram deixados em jejum por uma noite para limpar os intestinos. Os seguintes materiais foram preparados: tubos de microcentrífuga contendo formaldeído a 4%, tubos para preservação de tecido, tubos de microcentrífuga para a coleta de sangue, tubos de microcentrífuga para a coleta de soro, PBS e artigo de teste. Os animais foram preparados para o experimento por anestesia com Isoflorano e seus abdomens foram depilados. Foram preparadas quatro injeções para cada animal (2 por jejuno e 2 por cólon). A cavidade abdominal foi aberta. Os locais de injeção foram localizados e marcados com cores distintas. Os artigos de teste foram injetados lentamente no lúmen por 10 minutos para o cólon e 40 minutos para o jejuno. Os animais receberam 35 μg de proteína por injeção na concentração de 1 μg/μL. Os animais foram sacrificados a 50 minutos. O sangue terminal foi coletado por meio de punção cardíaca. O jejuno e o cólon foram removidos e colocados em uma superfície de trabalho revestida com plástico. Os conteúdos do jejuno e do cólon foram lavados pela utilização de PBS e descartados. Um comprimento de 1 cm de intestine foi extirpado do local de injeção. O tecido extirpado foi cortado na metade. Uma seção foi colocada em formaldeído4%. O tecido restante foi então fatiado ao longo do comprimento e imediatamente colocado em um tubo de microcentrífuga e congelado. Este processo foi repetido para todos os locais de injeção. O fígado (~1 cm3) foi removido e dividido em 2 pedaços. Para o armazenamento, uma seção de fígado foi colocada em formaldeído e uma segundo foi imediatamente congelada. Amostras de intestino, fígado & soro sanguíneo foram coletadas a 40 min após a injeção. As amostras de sangue foram centrifugadas e o soro resultante foi transferido para um recipiente para armazenamento. As amostras foram transportadas em gelo seco e armazenadas a -80°C. A estratégia de dosagem foi como se segue: SEQ ID NO: 192-Exenatídeo 100 µL, 490 pmol/29,4 µg (4,9 μM); SEQ ID NO: 191- Exenatídeo 100 µL, 490 pmol/30,9 µg (4,9 μM); SEQ ID NO: 195, 100 µL, 490 pmol/2 µg (4,9 μM).
[0437] A análise bioanalítica do transporte epitelial intestinal do SEQ ID NO: 192-Exenatídeo, SEQ ID NO: 191-Exenatídeo e SEQ ID NO: 195 (Exenatídeo) foi realizada utilizando-se um kit Exendin-4 ELISA (Phoenix Pharma, Cat# EK- 070-94) como se segue: foram obtidas amostras de tecido da Brains On-line; 300 μL de tampão de ensaio (1X) foram adicionados a cada tubo contendo uma amostra de tecido; o tecido foi removido do tampão de ensaio e colocado em uma placa com tampa de cultura celular limpa estéril; as amostras de intestino foram gentilmente raspadas com um raspador de célula, com o cuidado de evitar a coleta do mesentério; as amostras de fígado foram tratadas de maneira similar com maceração e homogeneização adicionais; o homogenato celular resultante foi transferido de volta para o tubo original tube; as amostras de tecido restantes samples e a área de trabalho foram enxaguadas com 100 μL de tampão (2x); a solução de homogenato celular foi centrifugada na força máxima por 5 minutos; o sobrenadante foi aplicado a uma placa de ELISA, a qual foi processada de acordo com as instruções do fabricante; o sobrenadante remanescente foi armazenado a -20°C para uso posterior.
[0438] Tal como mostrado na FIG. 27, o transporte tanto de SEQ ID NO: 192-Exenatídeo quanto de SEQ ID NO: 191-Exenatídeo através de células epiteliais intestinais foi observado a 10 minutos e a 40 minutos. Além disto, tanto o SEQ ID NO: 192-Exenatídeo quanto o SEQ ID NO: 191-Exenatídeo foram transportados em uma taxa maior que a SEQ ID NO: 195 (Exenatídeo) separadamente, especialmente a 40 minutos.
EXEMPLO 16 Comprimento de Espaçador e Acoplamento de Carga Útil ao terminal N ou C de um Veículo não Afeta Significativamente a Atividade Biológica de uma Carga Útil
[0439] Este exemplo mostra que ligantes de aminoácido de vários comprimentos e o acoplamento de uma carga útil heteróloga ao terminal N de um veículo não impacta significativamente a habilidade das cargas úteis em ligarem seu alvo quando incluídas em um construto de aplicação.
[0440] O ensaio de dimerização do receptor de IL-22 foi realizado por semeadura de células DiscoverX HEK293 e incubação das células por 16 h (5000 células por poço) pela utilização das concentrações mostradas do agonista (construto de aplicação contendo a carga útil de IL-22). A luminescência de ponto final foi lida em uma leitora de placa utilizando o Ensaio de Dimerização de IL22RA1/IL10RB PathHunter® eXpress.
[0441] A FIG. 28A mostra que o comprimento dos espaçadores de aminoácido com as SEQ ID NOs: 175, 196, e 197 não impactou na habilidade de IL-22 (SEQ ID NO: 142) quando incluída nos construtos de aplicação com as SEQ ID NOs: 147, 198, e 199 para induzir a dimerização do receptor de IL-22. A indução da dimerização do receptor de IL-22 humana recombinante de controle (rhIL-22, SEQ ID NO: 143) é mostrada pela curva preta.
[0442] A FIG. 28B mostra que o acoplamento da carga útil de IL-22 (SEQ ID NO: 142) ao terminal N ou C de um veículo compreendendo os resíduos de aminoácido 1-266 da SEQ ID NO: 1 por meio do espaçador com SEQ ID NO: 196 não alterou significativamente a habilidade dos construtos de aplicação com as SEQ ID NOs: 198, 200 e 201 em induzir a dimerização do receptor de IL-22. A indução da dimerização do receptor de IL-22 humana recombinante de controle (rhIL-22) é mostrada pela curva preta.
[0443] O ensaio de ativação de pSTAT3 foi conduzido pela utilização de células Colo205 incubadas com 10 µL de agonista (o respectivo construto de aplicação ou controle de IL-22) apresentando as várias concentrações por 15 min.
A extensão da ativação de pSTAT3 foi então lida utilizando-se placas MSD STAT3 (Cat. No. N450SMA-1).
[0444] A FIG. 28C mostra que o comprimento dos espaçadores de aminoácido com as SEQ ID NOs: 175, 196 e 197 não impactou na habilidade de IL-22 (SEQ ID NO: 142) quando incluída nos construtos de aplicação com as SEQ ID NOs: 147, 198 e 199 em induzir a ativação de pSTAT3. A ativação de pSTAT3 de IL-22 humana recombinante de controle (rhIL-22, SEQ ID NO: 143) é mostrada pela curva preta.
[0445] A FIG. 28D mostra que o acoplamento da carga útil de IL-22 (SEQ ID NO: 142) ao terminal N ou C de um veículo compreendendo os resíduos de aminoácido 1-266 da SEQ ID NO: 1 por meio do espaçador com SEQ ID NO: 196 não altera significativamente a habilidade dos construtos de aplicação com as SEQ ID NOs: 198, 200 e 201 em induzir a ativação de pSTAT3. A ativação de pSTAT3 de IL-22 humana recombinante de controle (rhIL-22) é mostrada pela curva preta.
[0446] Todos os artigos e métodos descritos e reivindicados aqui podem ser feitos e executados sem experimentação indevida à luz da presente descrição. Embora os artigos e métodos desta descrição tenham sido descritos em termos de realizações, será claro para os técnicos no assunto que variações podem ser aplicadas aos artigos e métodos sem se afastarem do espírito e escopo da descrição. Todas tais variações e equivalentes óbvias aos técnicos no assunto, sejam atualmente existentes ou a serem desenvolvidas no futuro, são consideradas como dentro do espírito e escopo da descrição tal como definidos nas reivindicações anexas. Todas as patentes, pedidos de patente e publicações mencionadas no relatório são indicativos dos níveis dos técnicos no assunto ao qual a descrição pertence. Todas as patentes, pedidos de patente e publicações são aqui incorporados como referência em sua totalidade para todos os propósitos e na mesma extensão em que cada publicação individual estivesse especificamente e individualmente indicada como sendo incorporada em sua totalidade e para qualquer propósito. A descrição ilustrativamente apresentada aqui pode ser praticada na ausência de qualquer(quaisquer) elemento(s) não especificamente descrito(s) aqui.
Os termos e expressões que forma empregados são utilizados como termos de descrição e não de limitação, e não há qualquer intenção de que no uso de tais termos e expressões sejam excluídos quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou portes destes, no entanto é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da descrição reivindicada.
Desta forma, deve ser entendido que, embora a presente descrição tenha sido especificamente apresentada por realizações e características opcionais, modificações e variações dos conceitos aqui descritos podem ser pensadas pelos técnicos no assunto e que tais modificações e variações são consideradas como estando dentro do escopo desta descrição tal como definida pelas reivindicações anexas.

Claims (128)

REIVINDICAÇÕES
1. Complexo veículo-carga útil compreendendo um veículo capaz de endocitose em uma célula epitelial polarizada e acumular em uma região da célula, caracterizado pelo fato da carga útil ser heteróloga ao veículo.
2. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da região ser um compartimento apical, um compartimento supranuclear ou um compartimento basal.
3. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do veículo ser retido na região por pelo menos 5 mins, 10 mins ou 15 minutos na região.
4. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do veículo ser derivado de um polipeptídeo de Cholix.
5. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato do veículo ser um polipeptídeo apresentando uma sequência de Cholix com um terminal C em qualquer uma das posições 150-195.
6. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato do veículo ser um polipeptídeo apresentando uma sequência de Cholix com um terminal N em qualquer uma das posições 1-41.
7. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato do veículo ser um polipeptídeo apresentando uma sequência de Cholix com um truncamento no terminal N em qualquer uma das posições 35-40.
8. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato do veículo ser um polipeptídeo apresentando uma sequência de Cholix com um terminal C em qualquer uma das posições 150-205.
9. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato do veículo consistir nos resíduos de aminoácido a partir da posição 40 do terminal N para qualquer uma das posições 150-205 do terminal C da sequência apresentada na SEQ ID NO: 130.
10. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato do veículo apresentar um terminal C nas posições 150 ou 187 da sequência apresentada na SEQ ID NO: 130.
11. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato do veículo consistir na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 137.
12. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato do veículo consistir na sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 137-139.
13. Complexo veículo-carga útil de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizado pelo fato da numeração de posição ser baseada no alinhamento do polipeptídeo de Cholix à sequência apresentada na SEQ ID NO: 130, onde as posições são numeradas a partir de um terminal N para um terminal C iniciando na posição 1 no terminal N.
14. Complexo veículo-carga útil de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato do veículo ser capaz de permanecer associado com um receptor de entrada apical mais tempo após a endocitose do veículo na célula epitelial polarizada que um veículo capaz de transcitose através da célula epitelial polarizada.
15. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato do receptor de entrada apical ser um receptor TMEM132.
16. Complexo veículo-carga útil de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato da célula epitelial polarizada compreender um célula epitelial polarizada gastrointestinal.
17. Complexo veículo-carga útil caracterizado pelo fato de compreender: a) um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando um terminal C em qualquer uma das posições 195-347 e capaz de transcitose através de uma célula epitelial polarizada, acoplado a b) uma carga útil heteróloga.
18. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato da numeração de posição ser baseada no alinhamento do polipeptídeo de Cholix à sequência apresentada na SEQ ID NO: 130, onde as posições são numeradas a partir de um terminal N para um terminal C iniciando na posição 1 no terminal N.
19. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato do terminal C estar em qualquer uma das posições 195-
266.
20. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato do terminal C estar em qualquer uma das posições 195- 266 de qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78.
21. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato do terminal C estar em qualquer uma das posições 206, 245, 251 ou 266 uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 130.
22. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato do terminal C estar em qualquer uma das posições 206, 245, 251 ou 266 das SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78.
23. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato do terminal C estar na posição 206 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78.
24. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato do veículo consistir na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NOs: 131 ou 184.
25. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato do terminal C estar na posição 245 de qualquer ruma das SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78.
26. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato do veículo consistir na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NOs: 132 ou 183.
27. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato do terminal C estar na posição 251 das SEQ ID NOs: 1- 2 ou 4-78.
28. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato do veículo consistir na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NOs: 133 ou 182.
29. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato do terminal C estar na posição 266 das SEQ ID NOs: 1- 2 ou 4-78.
30. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato do veículo consistir na sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 134 or 181.
31. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato do veículo consistir na sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78 com truncamento em qualquer uma das posições 195-347, e apresentar não mais que 5, 4, 3, 2 ou 1 variações em aminoácidos em qualquer uma das posições 1-40, 133-151, 152-187 ou 188-206 das SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78.
32. Complexo veículo-carga útil caracterizado pelo fato de compreender: a) um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127-129 ou um fragmento destas capaz de endocitose em uma célula epitelial polarizada ou transcitose de uma célula epitelial polarizada, acoplado a b) uma carga útil heteróloga.
33. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato do veículo compreender um ácido glutâmico na posição 3 e uma alanina na posição 4.
34. Complexo veículo-carga útil de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 33, caracterizado pelo fato do veículo ser não tóxico.
35. Complexo veículo-carga útil de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 34, caracterizado pelo fato do veículo ser capaz de transcitose da carga útil heteróloga através de uma célula epitelial polarizada.
36. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato do veículo compreender um fragmento capaz de transcitose de uma célula epitelial polarizada, onde o veículo apresenta um terminal C em qualquer uma das posições 195 para um resíduo do terminal C da sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78.
37. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato do terminal C estar em qualquer uma das posições 195- 386 da sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78.
38. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato do terminal C estar na posição 386 de qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78.
39. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato do terminal C estar na posição 386 de qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-2.
40. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato do veículo consistir na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 135.
41. Complexo veículo-carga útil caracterizado pelo fato de compreender: a) um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix que não compreende a SEQ ID NO: 179, e não consiste na SEQ ID NO: 126, complexado com b) uma carga útil heteróloga, onde o veículo é capaz de i) transcitose da carga útil heteróloga através de uma célula epitelial polarizada; ou ii) transporte da carga útil heteróloga para dentro da célula epitelial polarizada.
42. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato do veículo compreender pelo menos 75% de identidade de sequência a uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 130 ou fragmento desta.
43. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato do veículo compreender pelo menos 90% de identidade de sequência a uma variante de Cholix apresentada na SEQ ID NO: 130 ou um fragmento desta.
44. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato do polipeptídeo de Cholix ser uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 130 ou fragmento desta.
45. Complexo veículo-carga útil de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 44, caracterizado pelo fato do veículo compreender um ácido glutâmico na posição 3 e uma alanina na posição 4.
46. Complexo veículo-carga útil de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 45, caracterizado pelo fato do veículo ser não tóxico.
47. Complexo veículo-carga útil de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 46, caracterizado pelo fato do veículo ser capaz de transcitose da carga útil heteróloga através da célula epitelial polarizada.
48. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato do veículo apresentar um truncamento no terminal C em qualquer uma das posições 195-633 da sequência apresentada na SEQ ID NO:
130.
49. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato do truncamento no terminal C estar em qualquer uma das posições 195-386 da sequência apresentada na SEQ ID NO: 130.
50. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato do veículo apresentar um truncamento no terminal C em qualquer uma das posições 195-386 de qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78.
51. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato do truncamento no terminal C estar na posição 386 de qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-78.
52. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato do truncamento no terminal C estar na posição 386 de qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-2.
53. Complexo veículo-carga útil de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 52, caracterizado pelo fato de compreender uma metionina no terminal N.
54. Complexo veículo-carga útil de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 53, caracterizado pelo fato do veículo ser conjugado sinteticamente à carga útil heteróloga.
55. Complexo veículo-carga útil de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 53, caracterizado pelo fato do veículo ser geneticamente fundido à carga útil heteróloga.
56. Complexo veículo-carga útil de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 55, caracterizado pelo fato da carga útil heteróloga ser uma carga útil terapêutica.
57. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato da carga útil terapêutica ser uma citocina, um anticorpo, um hormônio ou um ácido nucleico.
58. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato da carga útil terapêutica ser uma citocina.
59. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato da citocina ser uma interleucina.
60. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato da interleucina ser uma IL-10.
61. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato da IL-10 compreender uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 90% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 145.
62. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato da interleucina ser uma IL-22.
63. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato da IL-22 compreender uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 90% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 142.
64. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato da carga útil terapêutica ser um anticorpo.
65. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato do anticorpo ser um anticorpo anti-TNF.
66. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato da carga útil terapêutica ser um hormônio.
67. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato da carga útil terapêutica ser um hormônio do crescimento humano.
68. Complexo veículo-carga útil de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 67, caracterizado pelo fato da carga útil heteróloga ser acoplada covalentemente ao veículo.
69. Complexo veículo-carga útil de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 68, caracterizado pelo fato da carga útil heteróloga ser acoplada a um terminal C do veículo.
70. Complexo veículo-carga útil de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 68, caracterizado pelo fato da carga útil heteróloga ser acoplada a um terminal N do veículo.
71. Complexo veículo-carga útil de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 68, caracterizado pelo fato do veículo ser acoplado à carga útil heteróloga por meio de um espaçador.
72. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato do espaçador ser um espaçador não passível de clivagem.
73. Complexo veículo-carga útil de acordo com qualquer uma das reivindicações 71 a 72, caracterizado pelo fato do espaçador compreender entre 1 e 100 resíduos de aminoácido.
74. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato do espaçador compreender até 15 repetições de GS, GGS, GGGS, GGGGS, GGGGGS ou uma combinação destas.
75. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato do espaçador compreender uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 175.
76. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato do espaçador consistir na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 176.
77. Complexo veículo-carga útil de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 67, caracterizado pelo fato da carga útil heteróloga ser acoplada não covalentemente ao veículo.
78. Complexo veículo-carga útil de acordo com a reivindicação 1 a 67, caracterizado pelo fato da carga útil heteróloga ser complexada ao veículo por meio de uma nanopartícula.
79. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de codificar o complexo veículo-carga útil conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 77.
80. Vetor caracterizado pelo fato de compreender o polinucleotídeo da reivindicação 79.
81. Método para a transcitose de uma carga útil heteróloga através de uma célula epitelial polarizada, caracterizado pelo fato de compreender: (a) o contato de uma membrana apical da célula epitelial polarizada com um complexo veículo-carga útil; e
(b) a transcitose do complexo veículo-carga útil através da célula epitelial polarizada, onde o complexo veículo-carga útil compreende um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127-129 ou um fragmento destas é capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através da célula epitelial polarizada, acoplado à carga útil heteróloga.
82. Método de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato do contato da membrana apical da célula epitelial polarizada com o complexo veículo-carga útil compreender a interação do veículo com o receptor de entrada apical TMEM132.
83. Método de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato da interação do veículo com a proteína da membrana TMEM132 resultar na endocitose mediada por receptor do complexo veículo-carga útil.
84. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 81 a 83, caracterizado pelo fato do veículo que interage com a TMEM132 compreender os resíduos de aminoácido 135-151 da SEQ ID NO: 130 ou uma sequência apresentando pelo menos 90% de identidade de sequência a esta.
85. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 81 a 84, caracterizado pelo fato da transcitose do complexo veículo-carga útil através da célula epitelial polarizada compreender a interação do veículo com qualquer um ou mais de GRP75, ERGIC-53 e perlecan.
86. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 81 a 85, caracterizado pelo fato da transcitose do complexo veículo-carga útil através da célula epitelial polarizada compreender adicionalmente a co-localização do complexo veículo-carga útil com qualquer um ou mais de COPI, EEA1 e Rab7 no lado apical e com Rab11a no lado basal da célula epitelial.
87. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 81 a 86,caracterizado pelo fato do veículo que interage com GRP7 ou ERGIC-53 compreender os resíduos de aminoácido 1-40 e 152-187 da SEQ ID NO: 130 ou uma sequência apresentando pelo menos 90% de identidade de sequência a esta.
88. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 81 a 87, caracterizado pelo fato do veículo que interagem com perlecan compreender os resíduos de aminoácido 188-205 da SEQ ID NO: 130 ou uma sequência apresentando pelo menos 90% de identidade de sequência a esta.
89. Método de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente, subsequente a (b) a liberação do complexo veículo- carga útil na lâmina própria.
90. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 81 a 89, caracterizado pelo fato da célula epitelial polarizada ser uma célula epitelial de intestino polarizada.
91. Método para a administração oral de uma carga útil heteróloga a um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreender: a administração oral de um complexo veículo-carga útil ao indivíduo, onde o veículo é capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através de um epitélio polarizado, desta forma, liberando a carga útil heteróloga para o indivíduo, e onde o complexo veículo-carga útil compreende um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127-129 ou um fragmento destas capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através do epitélio, acoplado à carga útil heteróloga.
92. Complexo veículo-carga útil caracterizado pelo fato de ser para a administração oral de uma carga útil heteróloga a um indivíduo por um método compreendendo: a administração oral do complexo veículo-carga útil ao indivíduo, onde o veículo é capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através de um epitélio polarizado, desta forma, tratando uma doença no indivíduo, e onde o complexo veículo-carga útil compreende um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127-129 ou um fragmento destas capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através do epitélio, acoplado à carga útil heteróloga.
93. Uso de um complexo veículo-carga útil caracterizado pelo fato de ser para a administração oral de uma carga útil heteróloga a um indivíduo por um método compreendendo: a administração oral do complexo veículo-carga útil ao indivíduo; onde o veículo é capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através de um epitélio polarizado, desta forma, tratando uma doença no indivíduo, e onde o complexo veículo-carga útil compreende um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127-129 ou um fragmento destas capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através do epitélio, acoplado à carga útil heteróloga.
94. Método para o tratamento de uma doença em um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreender: a administração oral de um complexo veículo-carga útil ao indivíduo, onde o veículo é capaz de transcitose do complexo veículo- carga útil através de um epitélio polarizado, desta forma, tratando uma doença no indivíduo, e onde o complexo veículo-carga útil compreende um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127-129 ou um fragmento destas capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através do epitélio, acoplado à carga útil heteróloga.
95. Complexo veículo-carga útil caracterizado pelo fato de ser para o tratamento de uma doença em um indivíduo por um método compreendendo: a administração oral do complexo veículo-carga útil ao indivíduo, onde o veículo é capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através de um epitélio polarizado, desta forma, tratando a doença no indivíduo, e onde o complexo veículo-carga útil compreende um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando uma sequência de aminoácidos e apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127-129 ou um fragmento destas capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através do epitélio, acoplado à carga útil heteróloga.
96. Uso de um complexo veículo-carga útil caracterizado pelo fato de ser na manufatura de um medicamento para o tratamento de uma doença em um indivíduo por um método compreendendo: a administração oral do complexo veículo-carga útil ao indivíduo, onde o veículo é capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através de um epitélio polarizado, desta forma, tratando uma doença no indivíduo, e onde o complexo veículo-carga útil compreende um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127-129 ou um fragmento destas é capaz de transcitose do complexo veículo-carga útil através do epitélio, acoplado à carga útil heteróloga.
97. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 96, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a ligação da carga útil heteróloga a um receptor na lâmina própria.
98. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 96, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a liberação da carga útil heteróloga na circulação sistêmica.
99. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 98, caracterizado pelo fato do veículo ser um polipeptídeo derivado de Cholix.
100. Método de acordo com a reivindicação 99, caracterizado pelo fato do veículo compreender os resíduos de aminoácido 1-206, 1-245, 1-251, 1-266 ou 1- 386 da sequência apresentada na SEQ ID NO: 130.
101. Método de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato do veículo compreender os resíduos de aminoácido 1-206, 1-245, 1-251, 1-266 ou 1- 386 da sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 1-2.
102. Método de acordo com a reivindicação 101, caracterizado pelo fato do veículo compreender qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 131-135 ou 180-184.
103. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 102, caracterizado pelo fato do epitélio polarizado ser um epitélio de intestino polarizado.
104. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 103, caracterizado pelo fato da doença ser colite ulcerativa, bursite, proctite, doença de Crohn, esclerose múltipla (MS), Lúpus eritematoso sistêmico (SLE), doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD), artrite reumatóide ou psoríase.
105. Método de acordo com a reivindicação 104, caracterizado pelo fato da doença ser colite ulcerativa.
106. Método de acordo com a reivindicação 105, caracterizado pelo fato da colite ulcerativa ser de branda a moderada ou de moderada a severa.
107. Método de acordo com a reivindicação 104, caracterizado pelo fato a doença ser a doença de Crohn.
108. Método de acordo com a reivindicação 107, caracterizado pelo fato da doença de Crohn ser a doença de Crohn fistulizante.
109. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 108, caracterizado pelo fato da carga útil ser uma interleucina.
110. Método de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato da interleucina compreender a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 142 ou
145.
111. Método para o transporte de uma carga útil heteróloga para dentro de uma célula epitelial polarizada, caracterizado pelo fato de compreender: (a) o contato da membrana apical da célula epitelial polarizada com um a complexo veículo-carga útil; e
(b) o transporte do complexo veículo-carga útil para dentro da célula epitelial polarizada, onde o complexo veículo-carga útil compreende um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix apresentando uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-2, 4-125 ou 127-129 ou um fragmento destas capaz de transportar o complexo veículo-carga útil para dentro da célula epitelial, acoplado à carga útil heteróloga.
112. Método de acordo com a reivindicação 111, caracterizado pelo fato do contato da membrana apical da célula epitelial polarizada com o complexo veículo-carga útil compreender a interação do veículo com o receptor de entrada apical TMEM132.
113. Método de acordo com a reivindicação 111, caracterizado pelo fato da interação do veículo com o receptor de entrada apical TMEM132 resultar na endocitose mediada por receptor do complexo veículo-carga útil.
114. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 113, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente o transporte da carga útil heteróloga para um compartimento apical ou um compartimento basal.
115. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 134, caracterizado pelo fato do veículo do complexo veículo-carga útil permanecer associado com a TMEM132 após a endocitose.
116. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 115, caracterizado pelo fato do veículo que interage com a TMEM132 compreender os resíduos de aminoácido 135-151 da SEQ ID NO: 130 ou uma sequência apresentando pelo menos 90% de identidade de sequência a esta.
117. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 116, caracterizado pelo fato do veículo ser um polipeptídeo derivado de Cholix.
118. Método de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo fato do veículo consistir nos resíduos de aminoácido 1-151, 1-187, 41-187 ou 40-205 de uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 130.
119. Método de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo fato do veículo consistir nos resíduos de aminoácido 1-151, 1-187, 41-187 ou 40-205 da sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 1-2.
120. Método de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo fato do veículo consistir em qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 136-139.
121. Método de acordo com a reivindicação 111 a 120, caracterizado pelo fato do veículo ser acoplado não covalentemente à carga útil heteróloga por meio de uma nanopartícula.
122. Método de acordo com a reivindicação 121, caracterizado pelo fato de uma proporção da carga útil heteróloga para o veículo na nanopartícula ser de pelo menos 15000:1.
123. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 121 a 122, caracterizado pelo fato da carga útil heteróloga ser um agente redutor de glicose.
124. Método de acordo com a reivindicação 123, caracterizado pelo fato do agente redutor de glicose ser associado de forma não covalente com a nanopartícula.
125. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 121 a 122, caracterizado pelo fato da carga útil heteróloga ser um siRNA.
126. Método de acordo com a reivindicação 125, caracterizado pelo fato do siRNA ser associado de forma não covalente com a nanopartícula.
127. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 121 a 126, caracterizado pelo fato do veículo ser ligado covalentemente à nanopartícula ou ser secado por spray na nanopartícula.
128. Método compreendendo o transporte de uma carga útil heteróloga para dentro de uma célula epitelial polarizada, caracterizado pelo fato de compreender: (a) o contato da membrana apical da célula epitelial polarizada com um complexo veículo-carga útil; e
(b) o transporte do complexo veículo-carga útil para dentro da célula epitelial polarizada, onde o complexo veículo-carga útil é o complexo veículo-carga útil conforme definido em qualquer uma das reivindicações 17 a 31.
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