JP5476304B2 - グルカゴン様ペプチド−1誘導体及びそれらの医薬用途 - Google Patents
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Description
国際公開第01/04156号には、血糖値を低下させるペプチドが開示されている。化合物4、5、6、7、10、11、12、13はGLP-1誘導体であるが、これらの化合物のいずれも、22位にGlu残基及び26位にArg残基を有していない。
欧州特許出願公開第1364967号には、グルカゴン様インスリン分泌性ペプチド、組成物及び方法が開示されている。その実施例1の5つのGLP-1組成物のいずれも、22位にGlu及び26位にArgを有する修飾されたGLP-1配列を含んでいない。
国際公開第2005/027978号には、22位にGlu及び26位にArgを有する、修飾されたGLP-1(7-37)配列を含む新規GLP-1誘導体が開示されている。しかしながら、これらの誘導体は、18、20、23、30、31、34、36、37、又は39位で誘導体化されてはいない。
本発明のさらなる目的は、長時間作用する、すなわち上述した投与計画を有するGLP-1誘導体を提供することである。
この発明の他の目的は、例えば1週間に1回、皮下投与、又は代替として非侵襲的送達に使用される、治療的用量を低減するために、高い作用強度(レセプター親和性)を有するGLP-1誘導体を提供することである。
この発明の他の目的は、GLP-1レセプター(GLP-1R)の細胞外ドメインに対して、高い結合親和性を有するGLP-1誘導体を提供することである。
この発明の他の目的は、タンパク質分解からペプチドを保護し、ペプチドの腎クリアランスを低下させる高いアルブミン結合親和性を有するGLP-1誘導体を提供することである。
さらなる態様では、本発明に係る誘導体の薬学的組成物及び方法及び用途が提供される。
定義及び好ましい実施態様
本明細書中、以下の用語は、以下に示した意味を有する:
ここで使用される「ポリペプチド」及び「ペプチド」なる用語は、ペプチド結合により結合した少なくとも5つの構成アミノ酸からなる化合物を意味する。構成アミノ酸は遺伝暗号によりコードされるアミノ酸の群からのものであり得、また遺伝暗号によりコードされない天然アミノ酸、並びに合成アミノ酸でありうる。遺伝暗号によりコードされない天然アミノ酸は、例えばγ-カルボキシグルタメート、オルニチン、ホスホセリン、D-アラニン及びD-グルタミンである。合成アミノ酸は、化学合成により製造されたアミノ酸、すなわち遺伝暗号によりコードされるアミノ酸のD-異性体、例えばD-アラニン及びD-ロイシン、Aib(α-アミノイソ酪酸)、Abu(α-アミノ酪酸)、Tle(tert-ブチルグリシン)、β-アラニン、3-アミノメチル安息香酸、アントラニル酸を含む。
例えば、リジン残基又はシステイン残基は、化学結合を介してアルブミン結合残基に結合されうる。このような化学結合は、例として、長鎖脂肪酸等、アルブミン結合残基の活性化エステルでアシル化することにより、リジンのイプシロンアミノ基を誘導体化することで得ることができる。
{2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル(構造1)
で、N-イプシロン37が誘導体化されたリジンで置換されており、ここで7位の自然に生じたヒスチジンはデスアミノHisで置換されており、22位の自然に生じたグリシンはグルタメートで置換されており、26及び34位のリジンはアルギニンで置換されている。この誘導体において、[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)アミドのGLP-1(7-37)アナログは、GLP-1(7-37)の37位と同等の位置のアルブミン結合残基、すなわち37位のLysのイプシロンアミノ基で誘導体化されている(アミド結合で共有的に修飾されている)。従って、GLP-1誘導体は2つの成分:互いに共有的に結合しているGLP-1ペプチド部分と誘導体部分を有する化合物である。
本発明で使用される場合、2つの化学部分を接続させる他の例には、限定されるものではないが、アルキル化、エステル形成、アミド形成、又はマレイミドカップリングが含まれる。
「GLP-1(7-37)」なる用語は、GLP-1(7-37)(すなわちペプチド)、並びに対応するアミド(類)を含むことを意図しており、同じことが、GLP-1(7-37)アナログにも適用される。
「GLP-1(7-34)」、「GLP-1(7-35)」、「GLP-1(7-36)」、「GLP-1(7-38)」、「GLP-1(7-39)」、「GLP-1(7-40)」、「GLP-1(7-41)」又はその誘導体は、本発明の誘導体のGLP-1ペプチド部分の正確な長さを特定するために、ここで時折使用される。例えば、「GLP-1(7-34)誘導体」は、最後の3つのC末端アミノ酸残基が欠失しているGLP-1(7-37)誘導体を意味する。他の例として、「GLP-1(7-39)誘導体」は、2つのアミノ酸残基がC末端に付加されているGLP-1(7-37)誘導体を意味する。
Xaa7-Xaa8-Xaa9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Tyr-Xaa20-Glu-Glu-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Arg-Xaa27-Xaa28-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-R 式(I)(配列番号:2)
[上式中、
(Xaa7-Xaa8)は、(L-ヒスチジン-Aib)、(デスアミノ-ヒスチジン-アラニン)、又は(デスアミノ-ヒスチジン-Aib)であり;
Xaa9は、Glu、又はGlu誘導体であり;
Xaa16は、Val、又はLeuであり;
Xaa18は、Ser、Lys、Cys、又はArgであり;
Xaa20は、Leu、又はLysであり;
Xaa23は、Gln、Glu、Lys、Cys、又はArgであり;
Xaa24は、Ala、又はAsnであり;
Xaa25は、Ala、又はValであり;
Xaa27は、Glu、Ala、又はLeuであり;
Xaa28は、Phe、又はPhe誘導体であり;
Xaa30は、Ala、Glu、Lys、又はArgであり;
Xaa31は、Trp、Cys、又はLysであり;
Xaa33は、Val、Cys、又はLysであり;
Xaa34は、Lys、Cys、Glu、Asn、Dap、又はArgであり;
Xaa35は、Gly、Arg、Lys、Aibであるか、又は存在せず;
Xaa36は、Arg、Lysであるか、又は存在せず;
Xaa37は、Gly、Aib、Cys、Lys、イプシロン-アミノ-Lys、Pro、Argであるか、又は存在せず;
Xaa38は、Lys、Glu、Argであるか、又は存在せず;
Xaa39は、Lys、Argであるか、又は存在せず;
Xaa40は、Argであるか、又は存在せず;
Xaa41は、Argであるか、又は存在せず;また
Rはアミドであるか、又は存在せず;
但し、Xaa37、Xaa38、Xaa39、又はXaa40が存在しないならば、下流の各アミノ酸残基も存在せず;
GLP-1(7-37)(配列番号:1)の18、20、23、30、31、34、36、37、又は39位と同等の位置から選択される位置でペグ化され、又はアルブミン結合残基で誘導体化されている]の配列を有する。
「Phe誘導体」の非限定例は、CF3-Phe、例えばm-CF3-Pheである(例えば、実施例3の化合物を参照)。
イプシロン-アミノ-Lys(又はイプシロン-Lys)なる用語は、38番のアミノ酸残基リジンが、(通常のケースの場合)そのアルファアミノ基ではなく、そのイプシロンアミノ基を介して、GLP-1(7-37)ペプチドに結合していることを示すことを意図している(例えば、実施例28の化合物を参照)。
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-R 式(II)(配列番号:3)
[上式中:
Xaa7は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、又は4-ピリジルアラニンであり;
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、又は(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa18は、Ser、Lys、又はArgであり;
Xaa30は、Ala、Glu、Lys、又はArgであり;
Xaa31は、Lys、又はTrpであり;
Xaa33は、Val、又はLysであり;
Xaa34は、Lys、Glu、Dap、又はArgであり;
Xaa35は、Gly、Arg、Lys、Aibであるか、又は存在せず;
Xaa36は、Arg、Lysであるか、又は存在せず;
Xaa37は、Gly、Aib、Lys、イプシロン-アミノ-Lys、Pro、Argであるか、又は存在せず;
Xaa38は、Lys、Glu、Argであるか、又は存在せず;
Xaa39は、Lys、Argであるか、又は存在せず;
Xaa40は、Argであるか、又は存在せず;
Xaa41は、Argであるか、又は存在せず;また
Rはアミドであるか、又は存在せず;
但し、Xaa37、Xaa38、Xaa39、又はXaa40が存在しないならば、下流の各アミノ酸残基も存在せず;
GLP-1(7-37)(配列番号:1)の18、20、23、30、31、34、36、37、又は39位と同等の位置から選択される位置でペグ化され、又はアルブミン結合残基で誘導体化されている]の配列を有する。
ここで使用される「薬学的に許容可能な」なる用語は、通常の医薬用途に適していること、すなわち患者等に重大な有害事象を引き起こさないことを意味している。
ここで使用される「賦形剤」なる用語は、薬学的組成物に通常添加される化学的化合物、例えばバッファー、等張剤、保存料等を意味する。
ここで使用される「有効量」なる用語は、処置しない場合と比較して、患者を処置するのに十分有効な投与量を意味する。
ここで使用される場合「病気の治療(処置)」なる用語は、病気、病状又は疾患を発症した患者の管理及びケアを意味する。治療の目的は、病気、病状又は疾患に抗することである。治療には、病気、病状又は疾患の除去又は制御、並びに病気、病状又は疾患に関連する症候群又は合併症を緩和するために、活性な誘導体を投与することを含む。
-(CH2)lD[(CH2)nE]m(CH2)p-Qq-
[上式中、
l、m及びnは独立して、1−20であり、pは0−10であり、
Qは、-Z-(CH2)lD[(CH2)nG]m(CH2)p-であり、
qは0〜5の範囲の整数であり、
D、E、及びGは独立して、-O-、-NR3-、-N(COR4)-、-PR5(O)-、及び-P(OR6)(O)-から選択され、ここでR3、R4、R5、及びR6は独立して、水素又はC1-6-アルキルを表し、
Zは、-C(O)NH-、-C(O)NHCH2-、-OC(O)NH-、-C(O)NHCH2CH2-、-C(O)CH2-、-C(O)CH=CH-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O-又は-NHC(O)-から選択され、ここでsは0又は1である]から選択される親水性リンカーである。
本発明の他の態様では、リンカーは、Dが-O-である、上述した親水性リンカーである。
本発明の他の態様では、リンカーは、Eが-O-である、上述した親水性リンカーである。
-CH2O[(CH2)2O]m(CH2)pQq-
[上式中、mは1−10であり、pは1−3であり、Qは-Z-CH2O[(CH2)2O]m(CH2)p-であり、Zが上述したものである]のものである。
本発明の他の態様では、リンカーは、qが1である、上述した親水性リンカーである。
本発明の他の態様では、リンカーは、Gが-O-である、上述した親水性リンカーである。
本発明の他の態様では、リンカーは、qが0である、上述した親水性リンカーである。
本発明の他の態様では、リンカーは、lが2である、上述した親水性リンカーである。
本発明の他の態様では、リンカーは、nが2である、上述した親水性リンカーである。
この発明の一態様では、親水性リンカーは
-C(O)-(CH2)l-O-[(CH2CH2-O]m-(CH2)p-[NHC(O)-(CH2)l-O-[(CH2)n-O]m-(CH2)p]q-NH-
[上式中、l、m、n、及びpは独立して、1−5であり、qは0−5である]のものである。
この発明のさらなる他の態様では、親水性リンカーは
-C(O)-CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2[NHC(O)-CH2-O-CH2CH2O-CH2CH2]q-NH-
[上式中、qは0−5である]のものである。
本発明のさらなる他の態様では、親水性リンカーは、
-C(O)-CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-NHC(O)-CH2-O-CH2CH2O-CH2CH2-NH-
のものである。
-[CH2CH2O]m+1(CH2)pQq-
[上式中、m及びpは独立して0−10であり、
Qは-Z-(CH2)lD[(CH2)nG]m(CH2)p-で、上述したものである]のものである。
本発明のさらなる他の態様では、親水性リンカーは、
-(CH2)l-O-[(CH2)n-O]m-(CH2)p-[C(O)NH-(CH2)l-O-[(CH2)n-O]m-(CH2)p]q-
[上式中、l、m、n、及びpは独立して、1−5であり、qは0−5である]のものである。
特定の実施態様では、PEGポリマーは700D以上の分子量、さらなる実施態様においては5kD以上、10kD以上、20kD以上の分子量を有している。PEGポリマーは直鎖状又は分枝状であってよい。PEGポリマーが20KDa以上である場合は、PEGポリマーは、分枝状構造、例えば43kDの分枝状PEGペプチド(Shearwater 2001 カタログ番号2D3XOT01、mPEG2-MAL)を有していることが好ましい。
ペプチドにPEGをカップリングさせるためのいくつかの方法(例えばVeronese, Biomaterials 22:405-417, 2001を参照)があり、それらの全体が、出典明示によりここに援用される。
よって、当業者であれば、ここに記載したGLP-1ペプチドへPEGポリマーを結合させるために、よく知られた技術を利用することができるであろう。
一実施態様では、アルブミン結合残基は親油性残基である。さらなる実施態様では、親油性残基は、場合によっては例えばアルキル化、アシル化、エステル形成、又はアミド形成等のコンジュゲート化学によりリンカーを介してリジン残基に、又はマレイミドカップリングによりシステイン残基に結合される。
本発明のさらなる実施態様では、アルブミン結合残基は、生理学的pHで負に帯電している。本発明の他の態様では、アルブミン結合残基は、負に帯電可能な基を有する。負に帯電可能な好ましい基の一つはカルボン酸基である。
本発明のさらなる実施態様では、アルブミン結合残基はシバクロニル(cibacronyl)残基である。
本発明のさらなる実施態様では、アルブミン結合残基は、rが4〜38の整数、好ましくは4〜24の整数であるCH3(CH2)rCO-を含む群から選択され、より好ましくは、CH3(CH2)6CO-、CH3(CH2)8CO-、CH3(CH2)10CO-、CH3(CH2)12CO-、CH3(CH2)14CO-、CH3(CH2)16CO-、CH3(CH2)18CO-、CH3(CH2)20CO-、及びCH3(CH2)22CO-を含む群から選択されるアシル基である。
本発明の他の実施態様では、アルブミン結合残基は、直鎖状又は分枝状のアルカンα,ω-ジカルボン酸のアシル基である。
親水性スペーサーは、修飾されたGLP-1配列のアミノ基とアルブミン結合残基の官能基との間に架橋を形成する適切な官能基を両末端に有する非分枝状のオリゴエチレングリコール部分を担持しうる。
本発明のGLP-1誘導体、それらを含有する組成物、及びそれらを使用する方法の好ましい実施態様は、本発明の実施例の冒頭近傍にある「発明の実施態様」、「発明のさらなる実施態様」、及び「本発明のさらなる特定の実施態様」と題されたセクションに列挙される。
本発明の多くのGLP-1誘導体を実験部に記載したように合成し、試験した。
本発明のGLP-1誘導体は、実施例を参照して、以下に説明されるように、いくつかの有利で有益な特性を有する。
第1の態様では、本発明のGLP-1誘導体は、潜在的に1日1回未満の投与頻度に適したものにし、好ましくは潜在的に1週間に1回、又はそれ未満の投与頻度に適したものにする遅延化された作用プロファイルを有している。作用プロファイルは、実験動物、例えばマウス又はブタを用いて、薬物動態実験で評価されうる。適切な実験は、本出願の実施例39(ミニブタ)及び実施例43(マウス)に見出される。
第2の特定の実施態様では、本発明のGLP-1誘導体の半減期は、ミニブタに皮下投与した後、32時間以上、好ましくは34時間以上、より好ましくは36時間以上、さらに好ましくは38時間以上、最も好ましくは40時間以上である。
第4の特定の実施態様では、本発明のGLP-1誘導体の半減期は、ミニブタに皮下投与した後、45時間以上、好ましくは50時間以上、より好ましくは55時間以上、さらに好ましくは60時間以上、最も好ましくは65時間以上である。
第6の特定の実施態様では、本発明のGLP-1誘導体の半減期は、ミニブタに皮下投与した後、92時間以上、好ましくは94時間以上、より好ましくは96時間以上、さらに好ましくは98時間以上、最も好ましくは100時間以上である。
従って、本発明のGLP-1誘導体の例示的半減期間隔(hour、hで示す時間)は、ミニブタへの皮下投与で測定して、20−100、30−100、40−100、50−100、60−100、70−100、80−100、又は90−100(時間)である。
第2の特定の実施態様では、本発明のGLP-1誘導体の半減期は、db/dbマウスに皮下投与した後、15時間以上、好ましくは16時間以上、より好ましくは17時間以上、さらに好ましくは18時間以上、最も好ましくは19時間以上である。
第4の特定の実施態様では、本発明のGLP-1誘導体の半減期は、db/dbマウスに皮下投与した後、25時間以上、好ましくは26時間以上、より好ましくは27時間以上、さらに好ましくは28時間以上、最も好ましくは29時間以上である。
従って、本発明のGLP-1誘導体の例示的半減期間隔(hour、hで示す時間)は、db/dbマウスへの皮下投与でアッセイして、5−30、10−30、15−30、20−30、又は25−30(時間)である。
第2の特定の実施態様では、本発明のGLP-1誘導体は、40%以上、好ましくは45%以上、より好ましくは50%以上、さらに好ましくは55%以上、最も好ましくは58%以上のアルファ-ヘリックス含有量を有する。
従って、本発明のGLP-1誘導体のアルファ-ヘリックス含有量の例示的範囲は、20−60、30−60、40−60、及び50−60(%)である。
第4の特定の実施態様では、本発明のGLP-1誘導体は、中性pH、最も好ましくは6−8の範囲で、化学的かつ物理的に安定している。
第5の特定の実施態様では、本発明のGLP-1誘導体は、ほとんど又は全く、凝集傾向を有していない。チオフラビンアッセイで試験される場合、凝集傾向は、リラグルチドの凝集傾向に対して、好ましくはかなり改善されている。
ここで使用される「インスリン分泌性剤」なる用語は、ヒトGLP-1レセプターのアゴニストである誘導体、すなわち、ヒトGLP-1レセプターを含む適切な媒体(このような媒体の一つは以下に開示される)中でcAMPの形成を刺激する誘導体を意味する。
第2の特定の実施態様では、本発明のGLP-1誘導体は、cAMPアッセイを使用して測定した場合に、1.80以下、好ましくは1.60以下、より好ましくは1.40以下、さらに好ましくは1.20以下、最も好ましくは1.00(nM)以下の効力(nMでのEC50)を有する。
第3の特定の実施態様では、本発明のGLP-1誘導体は、cAMPアッセイを使用して測定した場合に、0.80以下、好ましくは0.60以下、より好ましくは0.40以下、さらに好ましくは0.20以下、最も好ましくは0.10(nM)以下の効力(nMでのEC50)を有する。
第5の特定の実施態様では、本発明のGLP-1誘導体は、cAMPアッセイを使用して測定した場合に、0.040以下、好ましくは0.030以下、より好ましくは0.020以下、最も好ましくは0.010(nM)以下の効力(nMでのEC50)を有する。
従って、本発明のGLP-1誘導体の効力(cAMPアッセイを使用して測定した場合、nMでのEC50)の例示的範囲は、0.010−2.00、0.010−1.80、0.010−1.60、0.010−1.40、0.010−1.20、0.010−1.00、0.010−0.80、0.010−0.60、0.010−0.40、0.010−0.30、0.010−0.20、0.010−0.10、及び0.010−0.90(nM)、好ましくは0.010−0.40、0.010−0.30、0.010−0.20、0.010−0.10、及び0.010−0.90(nM)である。
第2の特定の実施態様では、アルブミン結合親和性(すなわち、実施例41のアッセイを使用して測定した場合の、競合曲線のEC50値(nM))は、500以下、好ましくは400以下、より好ましくは300以下、さらに好ましくは200以下、最も好ましくは100(nM)以下である。
従って、本発明のGLP-1誘導体のアルブミン結合親和性(nMでのEC50)の例示的範囲は:1-2000、100-2000、200-2000、400-1500、600-1500、及び800-1500(nM)である。
第1の特定の実施態様では、本発明のGLP-1誘導体は、実施例42のアッセイにおいてIC50/nMとして測定されて、1500以下、好ましくは1000以下、さらに好ましくは500以下、最も好ましくは400(nM)以下の、GLP-1レセプター(nGLP-1R)の細胞外ドメインに対する親和性を有する。
第2の特定の実施態様では、本発明のGLP-1誘導体は、実施例42のアッセイにおいてIC50/nMとして測定されて、300以下、好ましくは200以下、さらに好ましくは150以下、最も好ましくは100(nM)以下の、GLP-1レセプター(nGLP-1R)の細胞外ドメインに対する親和性を有する。
第4の特定の実施態様では、本発明のGLP-1誘導体は、実施例42のアッセイにおいてIC50/nMとして測定されて、15以下、好ましくは10以下、さらに好ましくは8以下、最も好ましくは6(nM)以下の、GLP-1レセプター(nGLP-1R)の細胞外ドメインに対する親和性を有する。
従って、本発明のGLP-1誘導体のnGLP-1R(nMでのIC50)に対する親和性の例示的範囲は:2−1500、2−1000、2−500、2−300、5−500、10−500、及び2−10(nM)である。
第6の特定の実施態様では、本発明のGLP-1誘導体は、リラグルチドより低いIC50値、好ましくは100nM以下、より好ましくは10nM、又は5nMのIC50値でnGLP-1Rに結合している。
ジペプチジルアミノペプチダーゼIVによる分解に対するペプチドの耐性は、以下の分解アッセイにより測定される:ペプチドのアリコート(5nmol)を、5mUの酵素活性に相当する1μLの精製されたジペプチジルアミノペプチダーゼIVと共に、10−180分、100μLの0.1Mトリエチルアミン-HClバッファー、pH7.4において、37℃でインキュベートする。10%のトリフルオロ酢酸を5μL添加することにより、酵素反応を終了させ、ペプチド分解産物を分離し、HPLC分析を使用して定量する。この分析を実施するための一方法は次の通りである:混合物をVydac C18ワイドポア(widepore)(30nmの孔、5μmの粒子)250×4.6mmのカラムに適用し、Siegelら, Regul. Pept. 1999;79;93-102及びMentleinら, Eur. J. Biochem. 1993;214:829-35に従い、0.1%のトリフルオロ酢酸に直線段階的勾配をつけてアセトニトリルが入ったもの(3分間は0%のアセトニトリル、17分間は0−24%のアセトニトリル、1分間は24−48%のアセトニトリル)を、1ml/分の流量で溶出させる。ペプチドとその分解産物は、220nm(ペプチド結合)又は280nm(芳香族アミノ酸)の吸光度をモニターし、標準物質に対するそれらのピーク面積を積分することにより定量される。ジペプチジルアミノペプチダーゼIVによるペプチドの加水分解速度は、10%未満のペプチドが加水分解されるインキュベート時間で推定される。
本発明の実施態様では、一又は複数の上述した特徴の組合せが達成される。
ここで使用される「アルブミン結合部分」なる用語は、ヒト血清アルブミンに非共有結合する残基を意味する。治療用ポリペプチドに結合するアルブミン結合残基は、典型的には1マイクロモル以下、好ましくは500nM以下、さらに好ましくは200nM以下、又は100nM以下のアルブミン結合親和性を有する。
ある範囲のアルブミン結合残基は、遠位酸性基を有する4−40の炭素原子を含む直鎖状又は分枝状の親油性部分として知られている。
以下の式において、結合基からの末端結合は、記載がない限りは、付着結合とみなされ、メチレン基で終結しない。
本発明の他の目的は、0.1mg/ml〜25mg/mlの濃度で存在する本発明の誘導体を含有する薬学的製剤を提供することであり、ここで該製剤は、3.0〜9.0のpHを有する。製剤は、バッファー系、保存料(類)、等張剤(類)、キレート剤(類)、安定剤、及び界面活性剤をさらに含有する。
本発明の一実施態様では、薬学的製剤は、水性製剤、すなわち水分を含有する製剤である。このような製剤は、典型的には溶液又は懸濁液である。
本発明のさらなる実施態様では、薬学的製剤は水溶液である。
「水性製剤」なる用語は、少なくとも50%w/wの水分を含有する製剤と定義される。同様に「水溶液」なる用語も、少なくとも50%w/wの水分を含有する溶液と定義され、「水性懸濁液」なる用語は、少なくとも50%w/wの水分を含有する懸濁液と定義される。
他の実施態様では、薬学的製剤は、何ら事前に溶解することなく使用準備が整った乾燥した製剤(例えば凍結乾燥又は噴霧乾燥)である。
本発明の他の実施態様では、製剤のpHは約7.0〜約9.5である。本発明の他の実施態様では、製剤のpHは約3.0〜約7.0である。本発明の他の実施態様では、製剤のpHは約5.0〜約7.5である。本発明の他の実施態様では、製剤のpHは約7.5〜約9.0である。本発明の他の実施態様では、製剤のpHは約7.5〜約8.5である。本発明の他の実施態様では、製剤のpHは約6.0〜約7.5である。本発明の他の実施態様では、製剤のpHは約6.0〜約7.0である。他の実施態様では、薬学的製剤は8.0〜8.5である。
本発明のさらなる実施態様では、製剤は安定剤をさらに含有する。薬学的組成物に安定剤を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
「凝集体形成」とは、オリゴマーを形成するポリペプチド分子間の物理的相互作用を意図しており、それは溶解したままか、溶液に沈殿し、大きくて可視できる程に会合する可能性がある。「保存中」とは、調製されて直ぐの液状薬学的組成物又は製剤が、被験者に直ぐ投与されるものではないことを意図している。むしろ次の準備のために、液状の形態、凍結状態、液体の形態に後ほど再構成される乾燥した形態、又は被験者への投与に適した他の形態で保存用に包装されている。「乾燥した形態」とは、液状薬学的組成物又は製剤が、凍結乾燥(すなわち氷結乾燥;例えばWilliams及びPolli(1984)J. Parenteral Sci. Technol. 38:48-59を参照)、噴霧乾燥(Masters(1991) Spray-Drying Handbook(第5版;Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp.491-676;Broadheadら, (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206;及びMumenthalerら, (1994) Pharm. Res. 11:12-20)、又は空気乾燥(Carpenter及びCrowe (1988) Cryobiology 25:459-470;及びRoser (1991) Biopharm. 4:47-53)により乾燥されることを意図している。液状薬学的組成物の保存中のポリペプチドによる凝集体形成は、ポリペプチドの生物活性に悪影響を及ぼし、薬学的組成物の治療効果が損なわれるおそれがある。さらに凝集体形成は、そのポリペプチド含有薬学的組成物を、注入系を使用して投与する場合、チューブ、膜、又はポンプの詰まりのような他の問題を生じうる。
本発明のさらなる実施態様では、安定剤は、ポリエチレングリコール(例えばPEG3350)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン、カルボキシ-/ヒドロキシセルロース又はそれらの誘導体(例えばHPC、HPC-SL、HPC-L及びHPMC)、シクロデキストリン類、硫黄含有物質、例えばモノチオグリセロール、チオグリコール酸及び2-メチルチオエタノール、及び種々の塩(例えば塩化ナトリウム)から選択される。これらの特定の安定剤の各一が、本発明の別の実施態様を構成する。
本発明で特に関心を持たれた安定剤は、限定されるものではないが、メチオニンの酸化に対してポリペプチドを保護するEDTA及びメチオニン、及び凍結-解凍又は機械的剪断に関連する凝集からポリペプチドを保護する非イオン性界面活性剤を含む。
薬学的組成物における界面活性剤の使用は、当業者によく知られている。簡便には、Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
本発明の組成物は、本発明の誘導体の安定性を高め、生物学的利用能を増加させ、溶解度を高め、悪影響を低減させ、当業者によく知られている時間治療を達成し、患者のコンプライアンスを高める、又はそれらの任意の組合せのために、例えば共有的、疎水的及び静電気的相互作用を介して、薬剤担体、薬剤送達系、及び先端の薬剤送達系を、さらに組合せ又はこれらに附随させてもよい。担体、薬剤送達系及び先端の薬剤送達系の例は、限定されるものではないが、ポリマー、例えばセルロース及び誘導体、多糖類、例えばデキストラン及び誘導体、デンプン及び誘導体、ポリ(ビニルアルコール)、アクリラート及びメタクリラートポリマー、ポリ乳酸及びポリグリコール酸、及びそれらのブロックコ-ポリマー、ポリエチレングリコール、担体タンパク質、例えばアルブミン、ゲル、例えば熱ゲル化系、例えば当業者によく知られているブロックコ-ポリマー系、ミセル、リポソーム、マイクロスフェア、ナノ粒子、液晶、及びそれらの分散液、L2相、及び脂質-水系における相挙動が当業者によく知られているそこでの分散液、ポリマー性ミセル、多相エマルション、自己乳化剤、自己-マイクロ乳化剤、シクロデキストリン及びそれらの誘導体、及びデンドリマーを含む。
本発明の誘導体を含有する肺用製剤を肺の奥深くに蓄積させることは、吸入技術、例えば限定されるものではないが:低吸入速度(例えば30L/分)、呼吸停止、及び作動のタイミングを修正して最適化されてよい。
ここで使用される場合、タンパク質製剤の「物理的安定性」なる用語は、タンパク質が熱-機械的ストレスに暴露される、及び/又は不安定な表面及び界面、例えば疎水性の表面及び界面と相互作用する結果として、タンパク質が生物学的に不活性になり及び/又は不溶性の凝集体が形成されるといったタンパク質の傾向を意味する。水性タンパク質製剤の物理的安定性は、適切な容器(例えばカートリッジ又はバイアル)に充填された製剤を、種々の時間、異なる温度で機械的/物理的ストレス(例えば攪拌)に暴露した後に、視覚検査及び/又は濁度測定することで評価される。製剤の視覚検査は、暗色背景で、鋭く集光されたライトにおいて実施する。製剤の濁度は、例えば0〜3のスケールで、濁りの程度をランク付けする視覚スコア(濁りのない製剤は視覚スコア0に相当し、日光下で視覚的に濁りのある製剤は視覚スコア3に相当する)により特徴付けられる。製剤は、日光下で視覚的濁りを示す場合に、タンパク質凝集に関して物理的に不安定であると分類される。また製剤の濁度は、当業者によく知られている簡単な濁度測定法により評価することもできる。また水性タンパク質製剤の物理的安定性は、タンパク質の立体構造状態のプローブ又は分光剤を使用して評価することもできる。プローブは、好ましくはタンパク質の非天然配座異性体に結合する小分子である。タンパク質構造の小分子分光プローブの一例はチオフラビンTである。チオフラビンTは、アミロイド原繊維の検出に広範囲に使用されている蛍光染料である。原繊維に、おそらく他のタンパク質立体配置が存在すると、チオフラビンTが約450nmで新たな励起極大を引き起こし、原繊維タンパク質形態に結合した時に、約482nmで増強発光する。未結合のチオフラビンTは本質的には、その波長で非蛍光性である。
本発明の他の実施態様では、本発明の誘導体を含有する薬学的製剤は、使用で4週間以上、保存で3年以上安定している。
本発明のさらなる実施態様では、本発明の誘導体を含有する薬学的製剤は、使用で4週間以上、保存で2年以上安定している。
本発明のさらなる実施態様では、本発明の誘導体を含有する製剤組成物は、使用で2週間以上、保存で2年以上安定している。
一実施態様では、本発明の誘導体は、高血糖症、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病、肥満症、高血圧症、X症候群、脂質代謝異常、認知障害、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、冠動脈心疾患、及び他の心血管障害、炎症性腸症候群、胃腸障害、及び胃潰瘍を治療又は予防する薬剤を調製するために使用される。
他の実施態様では、本発明の誘導体は、2型糖尿病の病気の進行を遅延化又は防止する医薬を調製するために使用される。
他の実施態様では、本発明の誘導体は、食物の取込を低減させ、β-細胞アポトーシスを低減させ、β-細胞機能及びβ-細胞質量を増大させ、及び/又はβ-細胞に対するグルコース感度を回復させる薬剤を調製するために使用される。
本発明の誘導体と、一又は複数の上述した化合物、及び場合によっては一又は複数のさらなる薬理学的活性物質との任意の適切な組合せは、本発明の範囲に入ると考えられると、理解すべきである。
配列に応じて、この本発明のアナログは、ポリペプチドをコードし、ポリペプチドを発現可能なDNA配列を含む宿主細胞を、ペプチドの発現が可能な条件下、適切な栄養培地において培養し、その後、得られたペプチドを培地から回収することを含む方法によっても作製できる。
細胞培養に使用される培地は、宿主細胞の増殖に適した任意の従来からの培地、例えば適切なサプリメントを含有する最小又は複合培地であってよい。適切な培地は商業的供給者から入手可能であり、又は公開されているレシピ(例えば、American Type Culture Collectionのカタログ)に従い調製されてもよい。ついで、細胞により生成されるペプチドは、硫酸アンモニウム等の塩により、上清又は濾液のタンパク質様成分を遠心分離又は濾過、沈殿にて培地から宿主細胞を分離させ、当該分野のペプチドの種類に応じて、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の多様なクロマトグラフィー手順により精製することを含む従来からの手順により、培養培地から回収されてよい。
親ペプチドをコードするDNA配列、プロモーター及び場合によってはターミネーター及び/又は分泌シグナル配列をそれぞれライゲーションし、複製に必要な情報を含む適切なベクターにそれらを挿入するのに使用される手順は、当業者によく知られている(例えば、Sambrookら, 上掲)。
1.i)a)配列番号:1の22位と同等の位置にGlu残基、及び
b)配列番号:1の26位と同等の位置にArg残基、
を含む、配列番号:1の配列7-37に対して、全体で2、3、4、5又は6のアミノ酸置換;
ii)場合によっては、1のアミノ酸残基のC末端伸長、
iii)場合によっては、配列番号:1の37位と同等の位置にあるアミノ酸が存在しない可能性、及び
iv)場合によっては、C末端アミド基、
を有し、配列番号:1の18、20、23、30、31、34、36又は37位、好ましくは配列番号:1の18、23、31、34、36又は37位と同等の位置から選択される位置でペグ化され、又はアルブミン結合残基で誘導体化された、修飾されたGLP-1配列(7-37)(配列番号:1)を含有する、GLP-1誘導体。
b)配列番号:1の26位と同等の位置にArg残基、
を含む、配列番号:1の配列7-37に対して、全体で2、3、4、5又は6のアミノ酸置換、
を有し、配列番号:1の18、20、23、30、31、34、36又は37位、好ましくは配列番号:1の18、23、31、34、36又は37位と同等の位置から選択される位置でペグ化され、又はアルブミン結合残基で誘導体化された、修飾されたGLP-1配列(7-37)(配列番号:1)を含有する、実施態様1のGLP-1誘導体。
4.1のアミノ酸残基のC末端伸長を有し、GLP-1アナログの全長が32アミノ酸である、実施態様1のGLP-1誘導体。
5.C末端アミド基を有する、実施態様1-4のいずれか一つのGLP-1誘導体。
Xaa7-Xaa8-Xaa9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Tyr-Xaa20-Glu-Glu-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Arg-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-R 式(I)(配列番号:2)
[上式中:
Xaa7-Xaa8は、L-ヒスチジン-Aib、デスアミノ-ヒスチジン-アラニン、又はデスアミノ-ヒスチジン-Aibであり;
Xaa9は、Glu、又はGlu誘導体、例えばアルファ,アルファ-ジメチル-Gluであり;
Xaa16は、Val、又はLeuであり;
Xaa18は、Ser、Lys、Cys、又はArgであり;
Xaa20は、Leu、又はLysであり;
Xaa23は、Gln、Glu、Lys、Cys、又はArgであり;
Xaa24は、Ala、又はAsnであり;
Xaa25は、Ala、又はValであり;
Xaa27は、Glu、Ala、又はLeuであり;
Xaa30は、Ala、Glu、Lys、又はArg、好ましくはAla、Glu、又はArgであり;
Xaa31は、Trp、Cys、又はLysであり;
Xaa33は、Val、Cys、又はLysであり;
Xaa34は、Lys、Cys、Glu、Asn、又はArgであり;
Xaa35は、Gly、又はAibであり;
Xaa36は、Arg、又はLysであり;
Xaa37は、Gly、Aib、Cys、Lysであるか、又は存在せず;
Xaa38は、Lys、Gluであるか、又は存在せず;
Rはアミドであるか、又は存在せず;
但し、Xaa37が存在しないならば、Xaa38も存在せず、
配列番号:1の18、20、23、30、31、34、36又は37位、好ましくは配列番号:1の18、23、31、34、36又は37位と同等の位置から選択される位置でペグ化され、又はアルブミン結合残基で誘導体化されている]
の配列を有する、好ましくは、20位にLeuを有することを除けば、式(I)と同一の式(I')の配列を有する、実施態様1-5のいずれか一つのGLP-1誘導体。
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-R 式(II)(配列番号:3)
[上式中:
Xaa7は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、又は4-ピリジルアラニンであり;
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、又は(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa18は、Ser、Lys、又はArgであり;
Xaa30は、Ala、Glu、又はArgであり;
Xaa33は、Val、又はLysであり;
Xaa34は、Lys、Glu、又はArgであり;
Xaa35は、Gly、又はAibであり;
Xaa36は、Arg、又はLysであり;
Xaa37は、Gly、Aib、Lysであるか、又は存在せず;
Xaa38は、Lys、Gluであるか、又は存在せず;
Rはアミドであるか、又は存在せず;
配列番号:1の18、20、23、30、31、34、36又は37位、好ましくは配列番号:1の18、23、31、34、36又は37位と同等の位置から選択される位置でペグ化され、又はアルブミン結合残基で誘導体化されている]
の配列を有する、実施態様1-5のいずれか一つのGLP-1誘導体。
A-は:
[上式中、nは14、15、16、17、18及び19からなる群から選択され、pは10、11、12、13及び14からなる群から選択され、dは0、1、2、3、4及び5からなる群から選択される]
からなる群から選択され、
-B-は:
[上式中、xは0、1、2、3及び4からなる群から選択され、yは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及び12からなる群から選択される]
からなる群から選択され、
-C-は:
[上式中、b及びeはそれぞれ独立して、0、1及び2からなる群から選択され、c及びfはそれぞれ独立して、0、1及び2からなる群から選択され、但し、cが0の場合、bは1又は2であり、又はcが1又は2である場合、bは0であり、fが0である場合、eは1又は2であり、fが1又は2である場合、eは0である]
からなる群から選択され、
-D-は前記アミノ酸残基に結合しており、リンカーである、実施態様1-7のいずれか一つのGLP-1誘導体。
10.実施態様1-9のいずれか一つの誘導体、及び薬学的に許容可能な賦形剤を含有する薬学的組成物。
11.高血糖症、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病、肥満症、高血圧症、X症候群、脂質代謝異常、認知障害、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、冠動脈心疾患及び他の心血管障害、脳卒中、炎症性腸症候群、胃腸障害、及び胃潰瘍の治療又は予防に使用される、実施態様1-9のいずれか一つの誘導体。
i)a)GLP-1(7-37)の22位と同等の位置(配列番号:1の16位)にGlu残基、及び
b)GLP-1(7-37)の26位と同等の位置(配列番号:1の20位)にArg残基、
を含む、配列番号:1の配列に対して、全体で2、3、4、5又は6のアミノ酸置換;
ii)場合によっては、1のアミノ酸残基のC末端伸長、
iii)場合によっては、GLP-1(7-37)の37位と同等の位置(配列番号:1の31位)にあるアミノ酸が存在しない可能性があり、及び
iv)場合によっては、C末端アミド基、
を有し、GLP-1(7-37)の18、20、23、30、31、34、36又は37位と同等の位置(それぞれ、配列番号:1の12、14、17、24、25、28、30又は31位)から選択される位置でペグ化され、又はアルブミン結合残基で誘導体化された、修飾されたGLP-1(7-37)配列を含むGLP-1誘導体を提供する。
本発明は、GLP-1誘導体、その方法及び使用、本発明の請求項及び特定の実施態様のいずれかに相当する、それらの内容を有する薬学的組成物を提供し、ここで対応する位置の番号付けの修正は、上で説明したようになされ、基礎出願の請求項1のGLP-1誘導体について上述したように示している。
1.i)a)配列番号:1の22位と同等の位置にGlu残基、及び
b)配列番号:1の26位と同等の位置にArg残基、
を含む、配列番号:1の配列7-37に対して、全体で2、3、4、5又は6のアミノ酸置換;
ii)場合によっては、1のアミノ酸残基のC末端伸長、
iii)場合によっては、配列番号:1の37位と同等の位置にあるアミノ酸が存在しない可能性、及び
iv)場合によっては、C末端アミド基、
を有し、配列番号:1の18、20、23、30、31、34、36又は37位、好ましくは配列番号:1の18、23、31、34、36又は37と同等の位置から選択される位置でペグ化され、又はアルブミン結合残基で誘導体化された、修飾されたGLP-1配列(7-37)(配列番号:1)を含有する、GLP-1誘導体。
b)配列番号:1の26位と同等の位置にArg残基、
を含む、配列番号:1の配列7-37に対して、全体で2、3、4、5又は6のアミノ酸置換、
を有し、配列番号:1の18、20、23、30、31、34、36又は37位、好ましくは配列番号:1の18、23、31、34、36又は37と同等の位置から選択される位置でペグ化され、又はアルブミン結合残基で誘導体化された、修飾されたGLP-1配列(7-37)(配列番号:1)を含有する、実施態様1のGLP-1誘導体。
4.1のアミノ酸残基のC末端伸長を有し、GLP-1アナログの全長が32アミノ酸である、実施態様1のGLP-1誘導体。
5.C末端アミド基を有する、実施態様1-4のいずれか一つのGLP-1誘導体。
7.配列番号:1の配列7-37に対して、7、8、18、20、23、24、25、27、30、31、33、34及び37位の群からの位置で選択される置換を有する、実施態様1-6のいずれか一つのGLP-1誘導体。
8.デスアミノHis7、Aib8、Lys18、Cys18、Lys20、Cys20、Lys23、Cys23、Asn24、Val25、Ala27、Leu27、Glu30、Lys31、Cys31、Lys33、Cys33、Lys34、Cys34、Asn34、Cys37及びLys37からなる群から選択される置換を有する、実施態様7のGLP-1誘導体。
9.デスアミノHis7、Aib8、Lys18、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、Lys33、Lys34、及びLys37からなる群から選択される置換を有する、実施態様7-8のいずれか一つのGLP-1誘導体。
10.デスアミノHis7及びAib8からなる群から選択される置換を有する、実施態様7-9のいずれか一つのGLP-1誘導体。
12.配列番号:1の配列7-37に対して、7、8、18、20、23、24、25、27、30、31、33、34及び37位の群から選択される位置で、2の置換を有する、実施態様1-5及び11のいずれか一つのGLP-1誘導体。
13.デスアミノHis7、Aib8、Lys18、Cys18、Lys20、Cys20、Lys23、Cys23、Asn24、Val25、Ala27、Leu27、Glu30、Lys31、Cys31、Lys33、Cys33、Lys34、Cys34、Asn34、Cys37及びLys37からなる群から選択される、2の置換を有する、実施態様11-12のいずれか一つのGLP-1誘導体。
14.デスアミノHis7及びAib8からなる群から選択される1のアミノ酸置換と、Lys18、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、Lys33、Lys34、及びLys37からなる群から選択される1のアミノ酸置換を有する、実施態様11-13のいずれか一つのGLP-1誘導体。
15.デスアミノHis7及びAib8からなる群から選択される1のアミノ酸置換と、Lys18、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、Lys33、Lys34、及びLys37からなる群から選択される1のアミノ酸置換を有する、実施態様11-14のいずれか一つのGLP-1誘導体。
17.配列番号:1の配列7-37に対して、7、8、18、20、23、24、25、27、30、31、33、34及び37位の群から選択される位置で、3のアミノ酸置換を有する、実施態様1-5及び16のいずれか一つのGLP-1誘導体。
18.デスアミノHis7、Aib8、Lys18、Cys18、Lys20、Cys20、Lys23、Cys23、Asn24、Val25、Ala27、Leu27、Glu30、Lys31、Cys31、Lys33、Cys33、Lys34、Cys34、Asn34、Cys37及びLys37の群から選択される、3のアミノ酸置換を有する、実施態様16-17のいずれか一つのGLP-1誘導体。
19.デスアミノHis7及びAib8からなる群から選択される1のアミノ酸置換と、Lys18、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、Lys33、Lys34、及びLys37からなる群から選択される2のアミノ酸置換を有する、実施態様16-18のいずれか一つのGLP-1誘導体。
20.デスアミノHis7及びAib8からなる群から選択される1のアミノ酸置換と、Lys18、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、Lys33、Lys34、及びLys37からなる群から選択される2のアミノ酸置換を有する、実施態様16-19のいずれか一つのGLP-1誘導体。
22.7、8、18、20、23、24、25、27、30、31、33、34及び37位の群から選択される位置で、4のアミノ酸置換を有する、実施態様1-5及び21のいずれか一つのGLP-1誘導体。
23.デスアミノHis7、Aib8、Lys18、Cys18、Lys20、Cys20、Lys23、Cys23、Asn24、Val25、Ala27、Leu27、Glu30、Lys31、Cys31、Lys33、Cys33、Lys34、Cys34、Asn34、Cys37及びLys37からなる群から選択される、4のアミノ酸置換を有する、実施態様21-22のいずれか一つのGLP-1誘導体。
24.デスアミノHis7及びAib8からなる群から選択される1のアミノ酸置換と、Lys18、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、Lys33、Lys34、及びLys37からなる群から選択される3のアミノ酸置換を有する、実施態様21-23のいずれか一つのGLP-1誘導体。
25.デスアミノHis7及びAib8からなる群から選択される1のアミノ酸置換と、Lys18、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、Lys33、Lys34、及びLys37からなる群から選択される3のアミノ酸置換を有する、実施態様21-24のいずれか一つのGLP-1誘導体。
27.23位のアルブミン結合残基で誘導体化又はペグ化されている、実施態様1-26のいずれか一つのGLP-1誘導体。
28.31位のアルブミン結合残基で誘導体化又はペグ化されている、実施態様1-26のいずれか一つのGLP-1誘導体。
29.34位のアルブミン結合残基で誘導体化又はペグ化されている、実施態様1-26のいずれか一つのGLP-1誘導体。
30.36位のアルブミン結合残基で誘導体化又はペグ化されている、実施態様1-26のいずれか一つのGLP-1誘導体。
31.37位のアルブミン結合残基で誘導体化又はペグ化されている、実施態様1-26のいずれか一つのGLP-1誘導体。
32.ペグ化されている、実施態様1-31のいずれか一つのGLP-1誘導体。
34.アルブミン結合残基で誘導体化されている、実施態様1-33のいずれか一つのGLP-1誘導体。
Xaa7-Xaa8-Xaa9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Tyr-Xaa20-Glu-Glu-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Arg-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-R 式(I)(配列番号:2)
[上式中:
Xaa7-Xaa8は、L-ヒスチジン-Aib、デスアミノ-ヒスチジン-アラニン、又はデスアミノ-ヒスチジン-Aibであり;
Xaa9は、Glu、又はGlu誘導体、例えばアルファ,アルファ-ジメチル-Gluであり;
Xaa16は、Val、又はLeuであり;
Xaa18は、Ser、Lys、Cys、又はArgであり;
Xaa20は、Leu、又はLysであり;
Xaa23は、Gln、Glu、Lys、Cys、又はArgであり;
Xaa24は、Ala、又はAsnであり;
Xaa25は、Ala、又はValであり;
Xaa27は、Glu、Ala、又はLeuであり;
Xaa30は、Ala、Glu、Lys、又はArg、好ましくはAla、Glu、又はArgであり;
Xaa31は、Trp、Cys、又はLysであり;
Xaa33は、Val、Cys、又はLysであり;
Xaa34は、Lys、Cys、Glu、Asn、又はArgであり;
Xaa35は、Gly、又はAibであり;
Xaa36は、Arg、又はLysであり;
Xaa37は、Gly、Aib、Cys、Lysであるか、又は存在せず;
Xaa38は、Lys、Gluであるか、又は存在せず;
Rはアミドであるか、又は存在せず;
但し、Xaa37が存在しないならば、Xaa38も存在せず、
配列番号:1の18、20、23、30、31、34、36又は37位、好ましくは配列番号:1の18、23、31、34、36又は37と同等の位置から選択される位置でペグ化され、又はアルブミン結合残基で誘導体化されている]
の配列を有する、好ましくは、20位にLeuを有することを除けば、式(I)と同一の式(I')の配列を有する、実施態様1-34のいずれか一つのGLP-1誘導体。
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-R 式(II)(配列番号:3)
[上式中:
Xaa7は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、又は4-ピリジルアラニンであり;
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、又は(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa18は、Ser、Lys、又はArgであり;
Xaa30は、Ala、Glu、又はArgであり;
Xaa33は、Val、又はLysであり;
Xaa34は、Lys、Glu、又はArgであり;
Xaa35は、Gly、又はAibであり;
Xaa36は、Arg、又はLysであり;
Xaa37は、Gly、Aib、Lysであるか、又は存在せず;
Xaa38は、Lys、Gluであるか、又は存在せず;
Rはアミドであるか、又は存在せず;
配列番号:1の18、20、23、30、31、34、36又は37位、好ましくは配列番号:1の18、23、31、34、36又は37位と同等の位置から選択される位置でペグ化され、又はアルブミン結合残基で誘導体化されている]
の配列を有する、実施態様1-35のいずれか一つのGLP-1誘導体。
38.Xaa37及びXaa38が双方とも存在しない、実施態様35-37のいずれか一つのGLP-1誘導体。
39.Xaa37及びXaa38が双方とも存在せず、Xaa36がXaa36-アミドである、実施態様35-38のいずれか一つのGLP-1誘導体。
41.4のアミノ酸が、配列番号:1の配列7-37に対して置換されており、Xaa7がデスアミノ-ヒスチジンである、実施態様35-39のいずれか一つのGLP-1誘導体。
42.5のアミノ酸が、配列番号:1の配列7-37に対して置換されており、Xaa7がデスアミノ-ヒスチジンである、実施態様35-39のいずれか一つのGLP-1誘導体。
43.6のアミノ酸が、配列番号:1の配列7-37に対して置換されており、Xaa7がデスアミノ-ヒスチジンである、実施態様35-39のいずれか一つのGLP-1誘導体。
45.4のアミノ酸が、配列番号:1の配列7-37に対して置換されており、Xaa8がAibである、実施態様35-39のいずれか一つのGLP-1誘導体。
46.5のアミノ酸が、配列番号:1の配列7-37に対して置換されており、Xaa8がAibである、実施態様35-39のいずれか一つのGLP-1誘導体。
47.6のアミノ酸が、配列番号:1の配列7-37に対して置換されており、Xaa8がAibである、実施態様35-39のいずれか一つのGLP-1誘導体。
48.Xaa7がデスアミノ-ヒスチジンである、実施態様35-47のいずれか一つのGLP-1誘導体。
50.親水性スペーサーが、修飾されたGLP-1配列のアミノ基とアルブミン結合残基の官能基との間に架橋が形成されるよう、双方の末端に適切な官能基を有する非分枝状のオリゴエチレングリコール部分である、実施態様49のGLP-1誘導体。
51.アルブミン結合残基で誘導体化されている、実施態様1-59のいずれか一つのGLP-1誘導体。
A-は:
及びスルホンアミドを有していないテトラゾール
[上式中、nは14、15、16、17、18及び19からなる群から選択され、pは10、11、12、13及び14からなる群から選択され、dは0、1、2、3、4及び5からなる群から選択される]
からなる群から選択され、
-B-は:
[上式中、xは0、1、2、3及び4からなる群から選択され、yは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及び12からなる群から選択される]
からなる群から選択され、
-C-は:
[上式中、b及びeはそれぞれ独立して、0、1及び2からなる群から選択され、c及びfはそれぞれ独立して、0、1及び2からなる群から選択され、但し、cが0の場合、bは1又は2であり、又はcが1又は2である場合、bは0であり、fが0である場合、eは1又は2であり、fが1又は2である場合、eは0である]
からなる群から選択され、
-D-は前記アミノ酸残基に結合しており、リンカーである、実施態様1-51のいずれか一つの GLP-1誘導体。
54.誘導体化されたアミノ酸残基がアミノ基を含む、実施態様52-53のいずれか一つのGLP-1誘導体。
55.誘導体化されたアミノ酸残基が、側鎖に第1級アミノ基を含む、実施態様52-54のいずれか一つのGLP-1誘導体。
56.誘導体化されたアミノ酸残基がリジンである、実施態様52-55のいずれか一つのGLP-1誘導体。
57.唯一のアミノ酸残基が誘導体化されている、実施態様52-56のいずれか一つのGLP-1誘導体。
である、実施態様52-57のいずれか一つのGLP-1誘導体。
61.pが12、13及び14からなる群から選択される、好ましくは13である、実施態様52-57及び60のいずれかのGLP-1誘導体。
63.dが0、1及び2からなる群から選択され、pが12、13又は14からなる群から選択され、好ましくはdが1及び2からなる群から選択され、pが13及び14からなる群から選択され、最も好ましくはdが1であり、pが13である、実施態様52-57及び52-62のいずれかのGLP-1誘導体。
である、実施態様52-63のいずれかのGLP-1誘導体。
65.-B-が
である、実施態様52-63のいずれかのGLP-1誘導体。
66.-B-が
である、実施態様52-63のいずれかのGLP-1誘導体。
67.-B-が
である、実施態様52-63のいずれかのGLP-1誘導体。
69.-B-が
である、実施態様52-63のいずれかのGLP-1誘導体。
70.yが2、3、4、5、6、7、8、9及び10からなる群から選択され、好ましくはyが2、3、4、5、6、7及び8からなる群から選択される、実施態様69のGLP-1誘導体。
である、実施態様52-70のいずれかのGLP-1誘導体。
72.cが0及び1からなる群から選択され、bが1及び2からなる群から選択され、好ましくはbが1又は2、好ましくは2であり;cが0である、実施態様71のGLP-1誘導体。
である、実施態様52-70のいずれかのGLP-1誘導体。
74.fが0及び1からなる群から選択され、eが1及び2からなる群から選択され、好ましくははeが1であり、fが0である、実施態様73のGLP-1誘導体。
75.-C-が
である、実施態様52-70のいずれかのGLP-1誘導体。
[上式中、kは0、1、2、3、4、5、11及び27からなる群から選択され、mが0、1、2、3、4、5及び6からなる群から選択される]
からなる群から選択される、実施態様52-70のいずれか一つのGLP-1誘導体。
77.-D-が
である、実施態様52-76のいずれかのGLP-1誘導体。
78.kが1、2、3、11及び27からなる群から選択され、好ましくはkが1である、実施態様77のGLP-1誘導体。
79.mが0、1、2、3及び4からなる群から選択され、好ましくはmが0、1及び2からなる群から選択される、実施態様77-78のいずれかのGLP-1誘導体。
である、実施態様52-76のいずれか一つのGLP-1誘導体。
81.mが0、1、2、3及び4からなる群から選択され、好ましくはmが0、1及び2からなる群から選択される、実施態様80のGLP-1誘導体。
82.-D-が
である、実施態様52-76のいずれかのGLP-1誘導体。
83.mが0、1、2、3及び4からなる群から選択され、好ましくはmが0、1及び2からなる群から選択される、実施態様82のGLP-1誘導体。
である、実施態様52-76のいずれかのGLP-1誘導体。
85.mが0、1、2、3及び4からなる群から選択され、好ましくはmが0、1及び2からなる群から選択される、実施態様84のGLP-1誘導体。
86.-D-が
である、実施態様52-76のいずれかのGLP-1誘導体。
87.mが0、1、2、3及び4からなる群から選択され、好ましくはmが0、1及び2からなる群から選択される、実施態様86のGLP-1誘導体。
88.-D-が
である、実施態様52-76のいずれかのGLP-1誘導体。
89.mが0、1、2、3及び4からなる群から選択され、好ましくはmが0、1及び2からなる群から選択される、実施態様88のGLP-1誘導体。
N-イプシロン37{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド、
N-イプシロン37-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((R)-3-[1-(17-カルボキシヘプタデカノイル)ピペリジン-4-イルカルボニルアミノ]3-カルボキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][,デスアミノHis7,Glu22 Arg26,Arg34,Phe(m-CF3)28]GLP-1-(7-37)アミド、
N-イプシロン30{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[Aib8,Glu22,Arg26,Lys30]GLP-1-(7-37)、
N-イプシロン31{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[Aib8,Glu22,Arg26,Lys31]GLP-1-(7-37)、
N-イプシロン31-(2-{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシ-ノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)[Aib8,Glu22,Arg26,Lys31,Arg34]GLP-1-(7-37)、
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド、
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド、
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)、
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Glu30,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)、
N-イプシロン20-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Lys20,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-(7-37)アミド、
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド、
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド、
[Aib8,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-{2-[4-カルボキシ-4-(4-カルボキシ-4-{4-[4-(16-1H-テトラゾール-5-イル-ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ブチリルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]、
N-イプシロン37(ポリエチレングリコール2000)[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)アミド、
N-イプシロン37(3-((2-(2-(2-(2-(2-ヘキサデシルオキシエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ))プロピオニル)[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-アミド、
N-イプシロン37-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(ヘキサデカノイルアミノ)-4-カルボキシブチリルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチル)エトキシ)エトキシ)アセチル)}-[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Glu30,Arg34,Lys37](GLP-1-(7-37)アミド、
N-イプシロン37-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(ヘキサデカノイルアミノ)-4-カルボキシブチリルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチル)エトキシ)エトキシ)アセチル)}-[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37](GLP-1-(7-37)アミド、
N-イプシロン37-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(オクタデカノイルアミノ)エトキシ)エトキシ)アセチルアミノ)エトキシ)エトキシ)アセチルアミノ)エトキシ)エトキシ)アセチル)[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)アミド、
N-イプシロン36-(2-(2-(2-((2-[2-(2-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ)エトキシ)アセチル)[Aib8,Glu22,Arg26,Glu30,Lys36]GLP-1-(7-37)Glu-アミド、
N-イプシロン37-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド、
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)、及び
N-イプシロン31-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Glu22,Arg26,Lys31]GLP-1-(7-37)、
からなる群から選択される、上述した実施態様のいずれかの誘導体。
95.修飾されたGLP-1配列7-37(配列番号:1)を、上述した実施態様のいずれかに開示したように、誘導体化又はペグ化することを特徴とする、患者におけるGLP-1アナログの作用時間を、約40時間以上に増加させる方法。
97.非経口投与に適している、実施態様96の薬学的組成物。
99.高血糖症、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病、肥満症、高血圧症、X症候群、脂質代謝異常、認知障害、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、冠動脈心疾患及び他の心血管障害、脳卒中、炎症性腸症候群、胃腸障害、及び胃潰瘍を治療又は予防する薬剤を調製するための、実施態様1-93のいずれか一つの誘導体の使用。
100.2型糖尿病の病気の進行を遅延化又は防止する薬剤を調製するための、実施態様1-93のいずれか一つの誘導体の使用。
101.食物の取込を低減させ、β-細胞アポトーシスを低減させ、β-細胞機能及びβ-細胞質量を増大させ、及び/又はβ-細胞に対するグルコース感度を回復させる薬剤を調製するための、実施態様1-93のいずれか一つの誘導体の使用。
1.i)a)GLP-1(7-37)の22位と同等の位置にGlu残基、及び
b)GLP-1(7-37)の26位と同等の位置にArg残基、
を含む、GLP-1(7-37)(配列番号:1)に対して、全体で2−12のアミノ酸置換、
を有し、
ii)GLP-1(7-37)の18、20、23、30、31、34、36、37、又は39位と同等の位置から選択される位置でペグ化され、又はアルブミン結合残基で誘導体化された、修飾されたGLP-1(7-37)配列を含むGLP-1誘導体。
3.GLP-1(7-37)(配列番号:1)に対して、2-8、好ましくは2、3、4、5、6、7、又は8のアミノ酸置換を有する、実施態様1-2のいずれか一つのGLP-1誘導体。
4.3-8、好ましくは4-8、より好ましくは5-8、さらに好ましくは6-8、最も好ましくは7-8のアミノ酸置換を有する、実施態様3のGLP-1誘導体。
5.i)4、ii)5、iii)6、iv)7、又はv)8のアミノ酸置換を有する、実施態様3のGLP-1誘導体。
6.一又は複数の7、8、20、25、28、30、31、34、35、36、又は37位、好ましくは7及び/又は8位で置換されてる、実施態様3-5のいずれか一つのGLP-1誘導体。
8.7-デスアミノ-ヒスチジン又は8-Aibを含む、実施態様7のGLP-1誘導体。
9.一又は複数の7-デスアミノ-ヒスチジン、8-Aib、20K、25V、28F(m-CF3)、30E、30K、31K、34-Dap、34R、35-Aib、35K、35R、36K、37K、37K-イプシロン、37P、及び/又は37Rを含む、実施態様1-7のいずれか一つのGLP-1誘導体。
11.C末端が欠失している、実施態様10のGLP-1誘導体。
12.GLP-1(7-36)、GLP-1(7-35)、又はGLP-1(7-34)誘導体である、実施態様11のGLP-1誘導体。
14.C末端に付加されている、実施態様13のGLP-1誘導体。
15.GLP-1(7-38)、GLP-1(7-39)、GLP-1(7-40)、又はGLP-1(7-41)誘導体である、実施態様14のGLP-1誘導体。
16.(i)C末端アミド基;又は(ii)C末端カルボン酸基、好ましくは遊離のカルボン酸基(-COOH)、又はその塩を有する、実施態様1-15のいずれか一つのGLP-1誘導体。
Xaa7-Xaa8-Xaa9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Tyr-Xaa20-Glu-Glu-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Arg-Xaa27-Xaa28-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-R 式(I)(配列番号:2)
[上式中:
(Xaa7-Xaa8)は、(L-ヒスチジン-Aib)、(デスアミノ-ヒスチジン-アラニン)、又は(デスアミノ-ヒスチジン-Aib)であり;
Xaa9は、Glu、又はGlu誘導体、例えばアルファ,アルファ-ジメチル-Gluであり;
Xaa16は、Val、又はLeuであり;
Xaa18は、Ser、Lys、Cys、又はArgであり;
Xaa20は、Leu、又はLysであり;
Xaa23は、Gln、Glu、Lys、Cys、又はArgであり;
Xaa24は、Ala、又はAsnであり;
Xaa25は、Ala、又はValであり;
Xaa27は、Glu、Ala、又はLeuであり;
Xaa28は、Phe、又はPhe誘導体、例えばm-CF3-Pheであり;
Xaa30は、Ala、Glu、Lys、又はArgであり;
Xaa31は、Trp、Cys、又はLysであり;
Xaa33は、Val、Cys、又はLysであり;
Xaa34は、Lys、Cys、Glu、Asn、Dap、又はArgであり;
Xaa35は、Gly、Arg、Lys、Aibであるか、又は存在せず;
Xaa36は、Arg、Lysであるか、又は存在せず;
Xaa37は、Gly、Aib、Cys、Lys、イプシロン-アミノ-Lys、Pro、Argであるか、又は存在せず;
Xaa38は、Lys、Glu、Argであるか、又は存在せず;
Xaa39は、Lys、Argであるか、又は存在せず;
Xaa40は、Argであるか、又は存在せず;
Xaa41は、Argであるか、又は存在せず;また
Rはアミドであるか、又は存在せず;
但し、Xaa37、Xaa38、Xaa39、又はXaa40が存在しないならば、下流の各アミノ酸残基も存在せず;
GLP-1(7-37)(配列番号:1)の18、20、23、30、31、34、36、37、38又は39位と同等の位置から選択される位置でペグ化され、又はアルブミン結合残基で誘導体化されている]
の配列を有する、好ましくは実施態様1-16のいずれか一つのGLP-1誘導体。
Xaa9が、Gluであり;
Xaa16が、Valであり;
Xaa18が、Serであり;
Xaa20が、Leu又はLysであり;
Xaa23が、Glnであり;
Xaa24が、Alaであり;
Xaa25が、Ala又はValであり;
Xaa27が、Gluであり;
Xaa28が、Phe、又はPhe誘導体、例えばm-CF3-Pheであり;
Xaa30が、Ala、Glu、又はLysであり;
Xaa31が、Trp、又はLysであり;
Xaa33が、Valであり;
Xaa34が、Lys、Dap、又はArgであり;
Xaa35が、Gly、Arg、Lys、Aibであるか、又は存在せず;
Xaa36が、Arg、Lysであるか、又は存在せず;
Xaa37が、Gly、Lys、イプシロン-アミノ-Lys、Pro、Argであるか、又は存在せず;
Xaa38が、Lys、Glu、Argであるか、又は存在せず;
Xaa39が、Lys、Argであるか、又は存在せず;
Xaa40が、Argであるか、又は存在せず;
Xaa41が、Argであるか、又は存在せず;また
Rがアミドであるか、又は存在せず;
但し、Xaa37、Xaa38、Xaa39、又はXaa40が存在しないならば、下流の各アミノ酸残基も存在せず;
GLP-1(7-37)(配列番号:1)の18、20、23、30、31、34、36、37、38又は39位と同等の位置から選択される位置でペグ化され、又はアルブミン結合残基で誘導体化されている、実施態様17のGLP-1誘導体。
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-R 式(II)(配列番号:3)
[上式中:
Xaa7は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、又は4-ピリジルアラニンであり;
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、又は(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa18は、Ser、Lys、又はArgであり;
Xaa30は、Ala、Glu、Lys、又はArgであり;
Xaa31は、Lys、又はTrpであり;
Xaa33は、Val、又はLysであり;
Xaa34は、Lys、Glu、Dap、又はArgであり;
Xaa35は、Gly、Arg、Lys、Aibであるか、又は存在せず;
Xaa36は、Arg、Lysであるか、又は存在せず;
Xaa37は、Gly、Aib、Lys、イプシロン-アミノ-Lys、Pro、Argであるか、又は存在せず;
Xaa38は、Lys、Glu、Argであるか、又は存在せず;
Xaa39は、Lys、Argであるか、又は存在せず;
Xaa40は、Argであるか、又は存在せず;
Xaa41は、Argであるか、又は存在せず;また
Rはアミドであるか、又は存在せず;
但し、Xaa37、Xaa38、Xaa39、又はXaa40が存在しないならば、下流の各アミノ酸残基も存在せず;
GLP-1(7-37)(配列番号:1)の18、20、23、30、31、34、36、37、38又は39位と同等の位置から選択される位置でペグ化され、又はアルブミン結合残基で誘導体化されている]
の配列を有する、好ましくは実施態様1-18のいずれか一つのGLP-1誘導体。
Xaa8が、Ala、又はAibであり;
Xaa18が、Serであり;
Xaa30が、Ala、Glu、又はLysであり;
Xaa31が、Lys、又はTrpであり;
Xaa33が、Valであり;
Xaa34が、Lys、Dap、又はArgであり;
Xaa35が、Gly、Arg、Lys、Aibであるか、又は存在せず;
Xaa36が、Arg、Lysであるか、又は存在せず;
Xaa37が、Gly、Lys、イプシロン-アミノ-Lys、Pro、Argであるか、又は存在せず;
Xaa38が、Lys、Glu、Argであるか、又は存在せず;
Xaa39が、Lys、Argであるか、又は存在せず;
Xaa40が、Argであるか、又は存在せず;
Xaa41が、Argであるか、又は存在せず;また
Rがアミドであるか、又は存在せず;
但し、Xaa37、Xaa38、Xaa39、又はXaa40が存在しないならば、下流の各アミノ酸残基も存在せず;
GLP-1(7-37)(配列番号:1)の18、20、23、30、31、34、36、37、38又は39位と同等の位置から選択される位置でペグ化され、又はアルブミン結合残基で誘導体化されている、実施態様19のGLP-1誘導体。
22.一又は複数の位置、好ましくは2つの位置、3つの位置、又は4つの位置で誘導体化されている、実施態様1-20のいずれか一つのGLP-1誘導体。
23.i)18位、ii)20位、iii)23位、iv)30位、v)31位、vi)34位、vii)36位、viii)37位、ix)38位、及び/又はx)39位で誘導体化されている、実施態様1-22のいずれか一つのGLP-1誘導体。
24.i)20位、ii)30位、iii)31位、iv)36位、v)37位、vi)38位、又はvii)39位で誘導体化されている、実施態様1-23のいずれか一つのGLP-1誘導体。
25.ペグ化されている、実施態様1-24のいずれか一つのGLP-1誘導体。
27.アルブミン結合残基とGLP-1部分との間にリンカーを有し、ここで該リンカーが、好ましくは
i)一又は複数、例えば1-10、好ましくは5-8、より好ましくは6のアルキレングリコール単位;
ii)cが0であり、bが2である、式Xの化合物C;
iii)qが1又は2である、式XVIの化合物;又は
iv)i)-iii)の任意の組合せ、例えばii)とiii)の組合せ;
を含む、好ましくはそうである、実施態様1-24及び26のいずれか一つのGLP-1誘導体。
A-は:
[上式中、テトラゾール環はN置換されていてもよく、
nは14、15、16、17、18及び19からなる群から選択され、pは10、11、12、13及び14からなる群から選択され、dは0、1、2、3、4及び5からなる群から選択される]
からなる群から選択され、
-B-は:
[上式中、xは0、1、2、3及び4からなる群から選択され、yは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及び12からなる群から選択される]
からなる群から選択され、
-C-は:
[上式中、b及びeはそれぞれ独立して、0、1及び2からなる群から選択され、c及びfはそれぞれ独立して、0、1及び2からなる群から選択され、但し、cが0の場合、bは1又は2であり、又はcが1又は2である場合、bは0であり、fが0である場合、eは1又は2であり、fが1又は2である場合、eは0である]
からなる群から選択され、
-D-は前記アミノ酸残基に結合しており、リンカーである、好ましくは実施態様1-27のいずれか一つのGLP-1誘導体。
N-イプシロン37{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン37-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((R)-3-[1-(17-カルボキシヘプタデカノイル)ピペリジン-4-イルカルボニルアミノ]3-カルボキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Phe(m-CF3)28]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン30{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[Aib8,Glu22,Arg26,Lys30]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン31{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[Aib8,Glu22,Arg26,Lys31]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン31-(2-{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシ-ノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)[Aib8,Glu22,Arg26,Lys31,Arg34]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Glu30,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン20-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Lys20,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド;
[Aib8,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-{2-[4-カルボキシ-4-(4-カルボキシ-4-{4-[4-(16-1H-テトラゾール-5-イル-ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ブチリルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル];
N-イプシロン37(ポリエチレングリコール2000)[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)アミド;
N-イプシロン37(3-((2-(2-(2-(2-(2-ヘキサデシルオキシエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ))プロピオニル)[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-アミド;
N-イプシロン37-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(ヘキサデカノイルアミノ)-4-カルボキシブチリルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチル)エトキシ)エトキシ)アセチル)}-[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Glu30,Arg34,Lys37](GLP-1-(7-37)アミド
N-イプシロン37-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(ヘキサデカノイルアミノ)-4-カルボキシブチリルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチル)エトキシ)エトキシ)アセチル)}-[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37](GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン37-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(オクタデカノイルアミノ)エトキシ)エトキシ)アセチルアミノ)エトキシ)エトキシ)アセチルアミノ)エトキシ)エトキシ)アセチル)[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)アミド
N-イプシロン36-(2-(2-(2-((2-[2-(2-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ)エトキシ)アセチル)[Aib8,Glu22,Arg26,Glu30,Lys36]GLP-1-(7-37)Glu−アミド;
N-イプシロン37-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン31-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Glu22,Arg26,Lys31]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン20-(2-{2-[2-(2-{2-[2-((S)-4-カルボキシ-4-ヘキサデカノイルアミノ-ブチリルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}-アセチル)[Aib8,Lys20,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン37-(2-{2-[2-((S)-4-カルボキシ-4-{(S)-4-カルボキシ-4-[(S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]ブチリルアミノ}ブチリルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン37-{2-[2-(2-{(S)-4-[(S)-4-(12-{4-[16-(2-tert-ブチル-2H-テトラゾール-5-イル)-ヘキサデカノイルスルファモイル]ブチリルアミノ}ドデカノイルアミノ)-4-カルボキシブチリルアミノ]-4-カルボキシブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37);
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル][Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37);
N-アルファ37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル][Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,イプシロン-Lys37]GLP-1-(7-37)ペプチド;
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン36-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Glu30,Arg34,Lys36]GLP-1-(7-37)-Glu-Lysペプチド;
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Glu30,Arg34]GLP-1-(7-37)-Glu-Lys(2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル)ペプチド;
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル]-[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Aib35,Lys37]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン31-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Arg34,Arg35,Arg37]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン31{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}-[Aib8,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Arg34,Arg35,Arg37)]GLP-1(7-37)イル[Arg39,Arg40,Arg41];
N-イプシロン31-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Lys35,Lys36]GLP-1-(7-36)アミド;
N-イプシロン31-{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}-N-ベータ34-(2-(ビス-カルボキシメチルアミノ)アセチル)[Aib8,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Dap34]GLP-1(7-34)アミド;及び
N-イプシロン-37-[(S)-4-カルボキシ-4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)ブチリル][Aib8,Glu22,Arg26,34,Lys37]GLP-1(7-37)
から選択される、好ましくは実施態様1-29のいずれか一つのGLP-1誘導体。
32.医薬としての使用のための、実施態様1-30のいずれか一つの誘導体、又は実施態様31の薬学的組成物。
33.高血糖症、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病、肥満症、高血圧症、X症候群、脂質代謝異常、認知障害、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、冠動脈心疾患及び他の心血管障害、脳卒中、炎症性腸症候群、胃腸障害、及び胃潰瘍の治療又は予防に使用される、実施態様1-30のいずれか一つの誘導体、又は実施態様31の薬学的組成物。
34.2型糖尿病の治療又は予防に使用される、実施態様33の誘導体又は薬学的組成物。
36.2型糖尿病を治療又は予防するための、実施態様35の使用。
38.2型糖尿病を治療又は予防するための、実施態様37の方法。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的にのみ使用されており、いかなる方法であっても、本発明を限定するものとは解釈すべきでない。
その全ての可能性のある変形例における、上述した要素の任意の組合せは、他に示されず、又は文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、本発明に含まれる。
ここで他に示されない限りは、ここでの値の範囲の記述は、単に、範囲内に入るそれぞれ別個の値を個々に称する省略方法として提供することを意図しているものであって、ここで個々に列挙されているかのように、それぞれの別個の値が明細書に導入される。特に示さない限り、ここで提供される全ての正確な値は、対応する近似値の代表例である(例えば、特定の要因又は測定値に関して提供される全ての正確な例示的値は、適切な場合は、「約」により修飾される、対応する近似測定値を提供するとみなすことができる)。
ここに記載されている全ての方法は、ここで他に示されず、又は文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、任意の適切な順番で実施することができる。
ここに提供される任意かつ全ての実施例、又は例示的言語(例えば、「等」)の使用は、単に本発明をより例証することを意図しており、他に示されない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。明確に記載していない限りは、明細書中の如何なる語句も、任意の要素が本発明の実施に必須であることを示しているものと解すべきではない。
特に明記せず、文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、成分又は成分類に関して、「含有する」、「有する」、「含む」又は「含める」等の用語を使用する、本発明の任意の側面又は実施態様のここでの記載は、特定の成分又は成分類「からなる」、「本質的になる」、又は「実質的に含有する」といった本発明の類似した側面又は実施態様を支持することを意図したものである(例えば、特定の成分を含有するここに記載の処方は、特に明記しない又は文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、その成分からなる製剤を記載すると理解されるべきである)。
この発明は、適用される法律に容認される最大範囲まで、ここに提供される実施態様、側面又は請求項に列挙された主題事項の全ての修正点及び等価物を含む。
上述の記載及び以下の実施例に開示されている特徴は、双方とも別個に、またその任意の組合せにおいて、様々な形態で本発明を実践するための構成要素でありうる。
r.t: 室温
DIPEA:ジイソプロピルエチルアミン
H2O: 水
CH3CN: アセトニトリル
DMF: NNジメチルホルムアミド
HBTU: 2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-)-1,1,3,3-テトラメチルウロ ニウムヘキサフルオロホスファート
Fmoc: 9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニル
Boc: tert-ブチルオキシカルボニル
OtBu: tert-ブチルエステル
tBu: tert-ブチル
Trt: トリフェニルメチル
Pmc: 2,2,5,7,8-ペンタメチル-クロマン-6-スルホニル
Dde: 1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)エチル
ivDde:1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル
Mtt: 4-メチルトリトル
Mmt: 4-メトキシトリチル
DCM: ジクロロメタン
TIS: トリイソプロピルシラン)
TFA: トリフルオロ酢酸
Et2O: ジエチルエーテル
NMP: 1-メチル-ピロリジン-2-オン
DIPEA:ジイソプロピルエチルアミン
HOAt: 1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
HOBt: 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
DIC: ジイソプロピルカルボジイミド
MW: 分子量
SPPS法A
保護されたペプチジル樹脂を、Fmoc保護基を検出するUVモニタリング、及びNMP(N-メチルピロリドン)におけるカップリングを媒介するHATU(O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート)、又はHBTU(2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート)を使用する、製造者から供給されるファストモック(FastMoc)UVプロトコルを用い、0.25mmol又は1.0mmolスケールにて、アプリド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)433Aペプチド合成器でFmoc法により合成した。ペプチドアミド合成に使用した出発樹脂はリンク(Rink)-アミド樹脂であり、ワン(Wang)又はクロロトリチル樹脂は、カルボキシC末端を有するペプチド用に使用した。使用される保護されたアミノ酸誘導体は、ABI433A合成器に適切な、事前計量されたカートリッジに供給され、Fmoc-Aib-OH(Fmoc-アミノイソ酪酸)等、非天然アミノ酸を除く、標準Fmoc-アミノ酸(例えばAnaspec、又はNovabiochemから供給)であった。N末端アミノ酸は、アルファアミノ基で保護されたBocであった(例えば、Boc-His(Boc)OHは、N末端にHisを有するペプチド用に使用した)。26位にあるリジンのイプシロンアミノ基を、アルブミン結合部分及びスペーサーの結合経路に応じて、Mtt、Mmt、Dde、ivDde、又はBocで保護した。いくつかのケースにおいては、2-Fmoc-オキシ-4-メトキシベンジル又は2,4,6-トリメトキシベンジルに限定されないが、酸性条件下で切断可能な基で、ジペプチドアミド結合で保護されたジペプチドを使用することにより、ペプチド合成が改善される。セリン又はスレオニンがペプチドに存在するケースにおいては、疑似プロリンジペプチドが使用されてもよい(例えば、Novobiochem 2002/2003又は新刊のカタログ、又はW.R. Sampson(1999), J. Pep. Sci. 5, 403を参照)。
ペプチド合成の代替法(方法B)は、マイクロ波ベースのリバティ(Liberty)ペプチド合成器(CEM Corp., North Carolina)におけるFmoc化学によるものであった。樹脂は、0.24mmol/g充填されたテンタゲル(Tentagel)S RAMであった。カップリング化学は、NMP、及び8-10倍過度のモルにて0.3Mのアミノ酸溶液を使用する、NMPにおけるDIC/HOAtであった。カップリング条件を70℃までで5分とした。70℃までで、NMPにおいて5%のピペリジンを使用し、検出を実施した。リジン側鎖の化学的修飾が所望されている場合、リジンをLys(Mtt)として導入した。20分、ストレートのヘキサフルオロイソプロパノールに樹脂を懸濁させ、続いてDCM及びNMPで洗浄することにより、Mtt基を除去した。手動合成、又はリバティにおける一又は複数の自動工程、続く手動カップリングにより、リジンの化学的修飾を実施した。HBTUカップリングを用いる、ABI433におけるFmoc化学により、ペプチド合成の他の方法がなされた。合成後、樹脂をDCMで洗浄し、乾燥させ、TFA/TIS/水(92.5/5/2.5)で2時間処理し、ジエチルエーテルで沈殿させることにより、ペプチドを樹脂から切断した。ペプチドを30%の酢酸、又は類似の溶媒に再溶解させ、アセトニトリル/TFAを使用するC18カラムにおける標準的RP-HPLCにより精製した。ペプチドの同一性をMALDI-MSにより確認した。
保護されたペプチジル樹脂を、NMP(N-メチルピロリドン)におけるカップリングを媒介するHOBt(1-ヒドロキシベンゾゾトリアゾール)及びDIC(ジシクロヘキシルカルボジイミド)を使用する、製造者から供給されるプロトコルを用い、0.25mmolスケールにて、アドバンスド・ケムテック(Advanced ChemTech)合成器(APEX 348)でFmoc法により合成した。ペプチドアミド合成に使用した出発樹脂はリンク-アミド樹脂であり、ワン又はクロロトリチル樹脂を、カルボキシC末端を有するペプチド用に使用した。使用される保護されたアミノ酸誘導体を、標準Fmoc-アミノ酸(例えばAnaspec、又はNovabiochemから供給)とした。N末端アミノ酸は、アルファアミノ基で保護されたBocであった(例えば、Boc-His(Boc)OHは、N末端にHisを有するペプチド用に使用した)。26位にあるリジンのイプシロンアミノ基を、アルブミン結合部分及びスペーサーの結合経路に応じて、Mtt、Mmt、Dde、ivDde、又はBocで保護した。いくつかのケースにおいては、ペプチド、例えばNovabiochemからの疑似プロリン、Fmoc-Ser(tbu)-ΨSer(Me,Me)-OHを使用することにより、ペプチド合成が改善される。例えば、Novobiochem 2002/2003又は新刊のカタログ、又はW.R. Sampson(1999), J. Pep. Sci. 5, 403を参照。
樹脂(0.25mmol)を手動の振揺/濾過装置に配し、N-メチルピロリドンに2%のヒドラジンが入ったものを用いて処理し(20ml、2×12分)で処理し、Dde又はivDde基を除去し、N-メチルピロリドン(4×20ml)で洗浄した。
樹脂(0.25mmol)を手動の振揺/濾過装置に配し、DCMに2%のTFA及び2-3%のTISが入ったもので処理し(20ml、6-12回繰り替えしで5-10分)、Mtt又はMmt基を除去し、DCM(2×20ml)、DCMに10%のMeOH及び5%のDIPEAが入ったもの(2×20ml)、及びN-メチルピロリドン(4×20ml)で洗浄した。
樹脂をシリンジに配し、2×10分、ヘキサフルロ(fluro)イソプロパノールで処理し、Mtt基を除去した。ついで上述したようにして、樹脂をDCM及びNMPで洗浄した。
アルブミン結合残基(式(I)のB-U-側鎖)は、DIC、HOBt/DIC、HOAt/DIC、又はHBTUに限定されるものではないが、標準的なアシル化試薬を使用し、保護されていないペプチドを溶液中でアシル化する、又は樹脂に結合したペプチドをアシル化することにより、ペプチドに結合させることができる。
経路I
活性化した(活性エステル又は対称無水物)アルブミン結合残基(A-B)-式(I)の側鎖、例えばオクタデカン二酸モノ-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル)エステル(Ebashiら,欧州特許第511600号、樹脂に結合したペプチドに対して4モル当量)をNMP(25ml)に溶解させ、樹脂に添加し、室温で一晩振揺した。反応混合物を濾過し、NMP、ジクロロメタン、2-プロパノール、メタノール及びジエチルエーテルを用い、樹脂を広範囲に洗浄した。
アルブミン結合残基(A-(B)-式(I)の側鎖)を、N-メチルピロリドン/塩化メチレン(1:1、10ml)に溶解させた。活性化試薬、例えばヒドロキシベンゾゾトリアゾール(HOBt)(樹脂に対して4モル当量)、及びジイソプロピルカルボジイミド(樹脂に対して4モル当量)を添加し、溶液を15分攪拌した。溶液を樹脂に添加し、ジイソプロピ(propy)エチルアミン(樹脂に対して4モル当量)を添加した。樹脂を、室温で2〜24時間振揺した。樹脂をN-メチルピロリドン(2×20ml)、N-メチルピロリドン/塩化メチレン(1:1)(2×20ml)、及び塩化メチレン(2×20ml)で洗浄した。
活性化した(活性エステル又は対称無水物)アルブミン結合残基(A-B-式(I)の側鎖、例えばオクタデカン二酸モノ-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル)エステル(Ebashiら,欧州特許第511600号、ペプチドに対して1-1.5モル当量)を、有機溶媒、例えばアセトニトリル、THF、DMF、DMSO、又は水/有機溶媒(1-2ml)の混合物に溶解させ、10モル当量のDIPEAと共に、水(10-20ml)にペプチドが入った溶液に添加した。アルブミン結合残基、例えばtert-ブチルにおいて基が保護されているケースでは、反応混合物を凍結乾燥O/Nさせ、後に、単離された粗ペプチドを脱保護し−tert-ブチル基のケースでは、ペプチドを、トリフルオロ酢酸、水及びトリイソプロピルシラン(90:5:5)の混合物に溶解させた。30分後、混合物を真空下で蒸発させ、最終ペプチドを調製用HPLCにより精製した。
樹脂(0.25mmol)を手動の振揺装置の濾過フラスコに配し、N-メチルピロリドン/塩化メチレン(1:1)(2×20ml)、及びN-メチルピロリドン(1×20ml)、N-メチルピロリドンに20%のピペリジンが入った溶液(3×20ml、各10分)で処理した。樹脂を、N-メチルピロリドン(2×20ml)、N-メチルピロリドン/塩化メチレン(1:1)(2×20ml)及び塩化メチレン(2×20ml)で洗浄した。
室温で180分、トリフルオロ酢酸、水及びトリイソプロピルシラン(95:2.5:2.5〜92:4:4)の混合物と共に攪拌することにより、樹脂からペプチドを切断した。切断混合物を濾過し、窒素流により、濾液が油になるまで濃縮した。45mlのジエチルエーテルを用い、この油からペプチドを沈殿させ、45mlのジエチルエーテルで、1〜3回洗浄した。
粗ペプチドを、5μ又は7μのC-18シリカが包装された、20mm × 250mmのカラムにおける、半調製用HPLCにより精製した。ペプチドに応じて、1又は2の精製システムを使用した。
TFA:
乾燥後、粗ペプチドを5mlの50%酢酸H2Oに溶解させ、H2Oを用いて20mlに希釈し、カラムに注入し、0.1%のTFAにおける40-60%のCH3CN勾配を用いて、40℃で50分、10ml/分で溶出させた。ペプチドを含有するフラクションを収集した。溶出液を水で希釈した後、精製されたペプチドを凍結乾燥させた。
濃H2SO4でpH2.5に調節された、0.05Mの(NH4)2SO4に40%のCH3CNが入ったものを用いて、カラムを平衡にした。乾燥後、粗ペプチドを5mlの50%酢酸H2Oに溶解させ、H2Oを用いて20mlに希釈し、カラムに注入し、ついで、0.05Mの(NH4)2SO4における40-60%のCH3CN勾配、pH2.5を用いて、40℃で50分、10ml/分で溶出させた。ペプチドを含有するフラクションを収集し、3容量のH2Oで希釈し、0.1%のTFAで平衡にされたセップ-パック(Sep-Pak)(登録商標)C18カートリッジ(ウォーターズ(Waters)パーツ、#:51910)を通した。ついで、0.1%のTFAを含有する70%のCH3CNで溶出させ、溶出液を水で希釈した後、凍結乾燥により、精製されたペプチドを単離した。
得られた最終生成物を分析用RP-HPLC(保持時間)及びLCMSにより特徴付けした。
RP-HPLC分析を、214nmでのUV検出、及び例えばバイダック(Vydac)218TP54、4.6mm × 250mm、5μのC-18シリカカラム(The Separations Group, Hesperia, USA)を使用して実施し、例えば42℃で1ml/分で溶出させた。多くの場合、次の特定の条件が使用される:
HPLC(方法03_A1_1):RP-分析を、ウォーターズ996ダイオードアレイ検出器が取り付けられたウォーターズ2690システムを使用して実施した。42℃で1ml/分溶出させる、218TP54、4.6mm × 250mm、5μのC-18シリカカラム(The Separations Group, Hesperia)において、214、254、276、及び301nmでのUV検出を収集した。4Mの硫酸でpH2.5に調節された、10%の0.5M硫酸アンモニウムを用いて、カラムを平衡にした。注入後、50分、同様の水性バッファーにおける0%〜60%のアセトニトリル勾配により、サンプルを溶出させた。
HPLC(方法03_B1_2):RP-分析を、ウォーターズ996ダイオードアレイ検出器が取り付けられたウォーターズ2690システムを使用して実施した。42℃で0.5ml/分溶出させる、ゾーバックス300SB-C18(4.5×150mm、5μ)において、214、254、276、及び301nmでのUV検出を収集した。水にTFA(0.1%)が入った水溶液を用いて、カラムを平衡にした。注入後、50分、水にTFA(0.1%)が入った水溶液における0%〜60%のアセトニトリル勾配(+0.1%のTFA)により、サンプルを溶出させた。
HPLC(方法02_B1_1):RP-分析を、ウォーターズ2487二重バンド(dualband)検出器が取り付けられたアリアンス(Alliance)・ウォーターズ2695システムを使用して実施した。42℃で、バイダック218TP53、C18、300Å、5μm、3.2mm × 250mmカラムを使用し、214nmと254nmでのUV検出を収集した。0.5ml/分の流速で、50分以上かけ、0-60%のアセトニトリル、95-35%の水、及び5%のトリフルオロ酢酸(1.0%)の直線状勾配を用いて溶出させた。
HPLC(方法01_B4_2):RP-分析を、ウォーターズ996ダイオードアレイ検出器が取り付けられたウォーターズ600Sシステムを使用して実施した。42℃で、シンメトリー(Symmetry)300 C18、5μm、3.9mm × 150mmカラムを使用し、214nmと254nmでのUV検出を収集した。1.0ml/分の流速で、15分以上かけ、5-95%のアセトニトリル、90-0%の水、及び5%のトリフルオロ酢酸(1.0%)の直線状勾配を用いて溶出させた。
HPLC(方法02_B4_4):RP-分析を、ウォーターズ2487二重バンド検出器が取り付けられたアリアンス・ウォーターズ2695システムを使用して実施した。42℃で、シンメトリー300 C18、5μm、3.9mm × 150mmカラムを使用し、214nmと254nmでのUV検出を収集した。1.0ml/分の流速で、15分以上かけ、5-95%のアセトニトリル、90-0%の水、及び5%のトリフルオロ酢酸(1.0%)の直線状勾配を用いて溶出させた。
HPLC(方法02_B6_1):RP-分析を、ウォーターズ2487二重バンド検出器が取り付けられたアリアンス・ウォーターズ2695システムを使用して実施した。42℃で、バイダック218TP53、C18、300Å、5μm、3.2mm × 250mmカラムを使用し、214nmと254nmでのUV検出を収集した。0.50ml/分の流速で、50分以上かけ、0-90%のアセトニトリル、95-5%の水、及び5%のトリフルオロ酢酸(1.0%)の直線状勾配を用いて溶出させた。
HPLC(方法03_B1_1):RP-分析を、ウォーターズ996ダイオードアレイ検出器が取り付けられたウォーターズ2690システムを使用して実施した。42℃で1ml/分溶出させる、218TP54、4.6mm × 250mm、5μのC-18シリカカラム(The Separations Group, Hesperia)において、214、254、276、及び301nmでのUV検出を収集した。水にTFA(0.1%)が入った水溶液に5%のアセトニトリル(+0.1%のTFA)が入ったものを用いて、カラムを平衡にした。注入後、50分、水にTFA(0.1%)が入った水溶液における0%〜90%のアセトニトリル勾配(+0.1%のTFA)により、サンプルを溶出させた。
また、調製用勾配溶出は上述したように実施することができ、化合物が溶出されるアセトニトリルのパーセンテージが示される。同一性はMALDIにより確認される。
LCMSを、サイエックス(Sciex)API 100シングル四極子(quadropole)質量分析計、パーキン・エルマー・シリーズ200クアード(Quard)ポンプ、パーキン・エルマー・シリーズ200オートサンプラー、アプリド・バイオシステムズ785A UV検出器、セデックス(Sedex)75蒸発性光散乱検出器からなるセットアップにおいて実施した。
機器のコントロールとデータ収集は、ウインドウズ2000コンピューターで起動するサイエックス・サンプルコントロールソフトウェアにより実施した。
B:アセトニトリルに0.05%のトリフルオロ酢酸が入ったもの
を収容する2つの溶出用容器に、HPLCポンプを連結した。
アセトニトリル勾配で溶出させるカラムに、適切な容量(好ましくは20μl)のサンプルを注入することにより、室温で分析を実施する。
使用するHPLC条件、検出器の設定及び質量分析計の設定を、以下に付与する。
カラム:ウォーターズ・エクステラ(Xretta)MS C-18 X 3mm 内径5μm
勾配: 1.5ml/分で、7.5分間直線状の5%-90%アセトニトリル
検出: 210nm(DADからのアナログ出力)
ELS(ELSからのアナログ出力)
MSイオン化モード API-ES
A:水に10mMのNH4OHが入ったもの
B:90%のアセトニトリルに10mMのNH4OHが入ったもの
を収容する2つの溶出用容器に、HPLCポンプを連結した。
A及びBの勾配で溶出させるカラムに、適切な容量(好ましくは20μl)のサンプルを注入することにより、23℃で分析を実施した。使用するHPLC条件、検出器の設定及び質量分析計の設定を、以下に付与する。
カラム:ウォーターズ・エクステラMS C-18 X 3mm 内径5μm
勾配: 1.5ml/分で、6.5分間直線状の5%-100%アセトニトリル
検出: 210nm(DADからのアナログ出力)
ELS(ELSからのアナログ出力)
MSイオン化モード API-ES
スキャン100-1000amuステップ0.1amu
ペプチドの分子量を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分(MALDI-MS)を使用して測定し、マイクロフレックス(Microflex)(Bruker)に記録した。α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸のマトリックスを使用した。
0.1%のTFA/H2Oでカラム(Xterra TM MS C18、5μm、4.6 × 150mmのカラム、P7N 186 000490)を平衡にし、25分間は0%のCH3CN/0.1%のTFA/H2O〜60%のCH3CN/0.1%のTFA/H2Oの勾配、続いて5分以上、60%〜100%の勾配により溶出させる。
天然アミノ酸については1文字記号を使用し、例えばHはL-ヒスチジンであり、AはL-アラニンである。アミノ酸については3文字略語を使用してもよく、例えば、HisはL-ヒスチジンであり、AlaはL-アラニンである。非天然アミノ酸については、3文字略語が使用され、例えばAibはアミノイソ酪酸である。アミノ酸の位置は、アミノ酸記号、例えばLys37の後の上付文字、又はLys37の数字で示されてよい。N末端アミノ基はNH2又はHとして記号化されていてもよい。C末端カルボン酸は、-OH又は-COOHとして記号化されていてもよい。C末端アミド基は-NH2として記号化されている。
上述した手順に従い、以下の誘導体を、本発明の非限定的実施例として調製した:
N-イプシロン37{2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)アミド
調製法:A
HPLC法 B6:
RT=35.49分
LCMS:m/z=1096.2(M+3H)3+
算出されたMW=4380.0
N-イプシロン37{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド
調製法:B
ペプチドを66%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4409.1
N-イプシロン37-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((R)-3-[1-(17-カルボキシヘプタデカノイル)ピペリジン-4-イルカルボニルアミノ]3-カルボキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Phe(m-CF3)28]GLP-1-(7-37)アミド
調製法:A
HPLC(方法B):
RT=11.92分
LCMS:m/z=1474.8(M+3H)3+
算出されたMW=4420.0
N-イプシロン30{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[Aib8,Glu22,Arg26,Lys30]GLP-1-(7-37)
調製法:8-10倍過度のモルのアミノ酸、DIC及びHOAt/HOBt(1:1)を使用するアドバンスド・ケムテックからのアペックス(Apex)396において、ペプチドを調製し、Mtt基をヘキサフルオロイソプロパノールで脱保護することを除けば、方法A。最終生成物を、分析用HPLC及びMALDI-MSで特徴付けした。
HPLC法 I:
RT=27.6分
MALDI-MS:4367.9
N-イプシロン31{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[Aib8,Glu22,Arg26,Lys31]GLP-1-(7-37)
調製法:8-10倍過度のモルのアミノ酸、DIC及びHOAt/HOBt(1:1)を使用するアドバンスド・ケムテックからのアペックス396において、ペプチドを調製し、Mtt基をヘキサフルオロイソプロパノールで脱保護することを除けば、方法A。最終生成物を、分析用HPLC及びMALDI-MSで特徴付けした。
HPLC法 I:
RT=28.4分
MALDI-MS:4252.5
N-イプシロン31-(2-{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシ-ノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)[Aib8,Glu22,Arg26,Lys31,Arg34]GLP-1-(7-37)
調製法:B
ペプチドを66%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4280.9
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド
調製法:B
ペプチドを67%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4451.1
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド
調製法:B
ペプチドを68%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4422.1
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)
調製法:B
ペプチドを69%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4423.1
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Glu30,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)
調製法:B
ペプチドを68%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4481.1
N-イプシロン20-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Lys20,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-(7-37)アミド
調製法:B
ペプチドを62%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4638.3
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド
調製法:B
ペプチドを69%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4624.3
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド
調製法:B
ペプチドを65%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4595.3
[Aib8,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-{2-[4-カルボキシ-4-(4-カルボキシ-4-{4-[4-(16-1H-テトラゾール-5-イル-ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ブチリルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]
調製法:アドバンスド・ケムテックからのアペックス396においてペプチドを調製し、チオアミドリンカーの結合を2つの工程で達成させた。まず、DIC及びHOAt/HOBt(1:1)を使用し、4-スルファモイル酪酸を樹脂にカップリングさせた。ついで、NMPにおいて、カルボニルジイミダゾールと混合された16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカン酸を樹脂に添加し、続いて、DBUを添加した。その他は、実施例の最初に記載したプロトコルと同様である。
算出されたMW=4640.2
N-イプシロン37(ポリエチレングリコール2000)[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)アミド
調製法:経路III
HPLC(方法 A1)
RT=40.88分
LCMS:m/z=不均一ではあるが、出発物質+2000の平均に相当
算出された(M+H)+=5519
N-イプシロン37(3-((2-(2-(2-(2-(2-ヘキサデシルオキシエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ))プロピオニル)[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-アミド
調製法:経路III
HPLC(方法 B6):
RT=42.3分
LCMS:m/z=1353.3(M+3H)3+
算出された(M+H)+=4055.7
N-イプシロン37-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(ヘキサデカノイルアミノ)-4-カルボキシブチリルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチル)エトキシ)エトキシ)アセチル)}-[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Glu30,Arg34,Lys37](GLP-1-(7-37)アミド
調製法:A
HPLC(方法 B6):
RT=36.1分
LCMS:m/z=1419.0(M+3H)3+
算出された(M+H)+=4254.8
N-イプシロン37-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(ヘキサデカノイルアミノ)-4-カルボキシブチリルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチル)エトキシ)エトキシ)アセチル)}-[デスアミノHis7,Glu22, Arg26,Arg34,Lys37](GLP-1-(7-37)アミド
調製法:A
HPLC(方法 B6):
RT=36.06分
LCMS:m/z=1399(M+3H)3+
算出された(M+H)+=4196.8
N-イプシロン37-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(オクタデカノイルアミノ)エトキシ)エトキシ)アセチルアミノ)エトキシ)エトキシ)アセチルアミノ)エトキシ)エトキシ)アセチル)[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)アミド
調製法:A
HPLC(方法B6):
RT=40.1分
LCMS:m/z=1414.6(M+3H)3+
算出された(M+H)+=4240.9
N-イプシロン36-(2-(2-(2-((2-[2-(2-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ)エトキシ)アセチル)[Aib8,Glu22, Arg26,Glu30,Lys36]GLP-1-(7-37)Glu-アミド
調製法:B
ペプチドを68%のアセトニトリル溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4069.6
N-イプシロン37-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド
調製法:B
ペプチドを64%のアセトニトリル溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=3994.6
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)
調製法:B
ペプチドを67%のアセトニトリル溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4283.9
N-イプシロン31-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Glu22,Arg26,Lys31]GLP-1-(7-37)
調製法:8-10倍過度のモルのアミノ酸、DIC及びHOAt/HOBt(1:1)を使用するアドバンスド・ケムテックからのアペックス396において、ペプチドを調製し、Mtt基をヘキサフルオロイソプロパノールで脱保護することを除けば、方法A。最終生成物を、分析用HPLC及びMALDI-MSで特徴付けした。
HPLC法 I:
RT=27.2分
MALDI-MS:4127.9
N-イプシロン20-(2-{2-[2-(2-{2-[2-((S)-4-カルボキシ-4-ヘキサデカノイルアミノ-ブチリルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}-アセチル)[Aib8,Lys20,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-(7-37)アミド
調製法:B
ペプチドを66%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4239.8
N-イプシロン37-(2-{2-[2-((S)-4-カルボキシ-4-{(S)-4-カルボキシ-4[(S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]ブチリルアミノ}ブチリルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)
調製法:B
ペプチドを65%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4397.0
N-イプシロン37-{2-[2-(2-{(S)-4-[(S)-4-(12-{4-[16-(2-tert-ブチル-2H-テトラゾール-5-イル)-ヘキサデカノイルスルファモイル]ブチリルアミノ}ドデカノイルアミノ)-4-カルボキシブチリルアミノ]-4-カルボキシブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)
調製法B
ペプチドを74%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4652.4
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル][Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)
SPPS法Bに類似した調製法
HPLC法 02_B6_1:
RT=34.27分
LCMS:m/z=1072(M+4H)4+
算出された(M)=4284.9
N-アルファ37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル][Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,イプシロン-Lys37]GLP-1-(7-37)ペプチド
SPPS法Bに類似した調製法
HPLC法 I_BDSB2:
RT=10.19分
LCMS:m/z=1072(M+4H)4+
算出された(M)=4284.9
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)
SPPS法Bに類似した調製法
HPLC法 I_BDSB2:
RT=9.96分
LCMS:m/z=1064(M+4H)4+
算出された(M)=4255.8
N-イプシロン36-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル][デスアミノHis7, Glu22, Arg26,Glu30,Arg34, Lys36]GLP-1-(7-37)-Glu-Lysペプチド
SPPS法Bに類似した調製法
HPLC法 I_BDSB2:
RT=6.40分
LCMS:m/z=1111(M+4H)4+
算出された(M)=4444.0
[デスアミノHis7, Glu22, Arg26,Glu30, Arg34]GLP-1-(7-37)-Glu-Lys(2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル)ペプチド
SPPS法Bに類似した調製法
HPLC法 I_BDSB2:
RT=6.52分
LCMS:m/z=1119(M+4H)4+
算出された(M)=4472
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)
SPPS法Bに類似した調製法
HPLC法 02_B6_1:
RT=33.58分
LCMS:m/z=1114(M+4H)4+
算出された(M)=4451.1
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル]-[Aib8,Glu22, Arg26,Arg34, Aib35, Lys37]GLP-1-(7-37)
SPPS法Bに類似した調製法
UPLC 方法04_A3_1:
RT=9.81分
LCMS:m/z=1079(M+4H)4+
算出された(M)=4312.9
N-イプシロン31-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Glu22, Val25, Arg26,Lys31,Arg34, Arg35, Arg37]GLP-1-(7-37)
調製法:SPPS法Cによりペプチドを調製し、最終生成物を分析用HPLC及びMALDI-MSで特徴付けした。
HPLC(02-B4-4):RT=7.9分
HPLC(中性、30-60%、16分以上):RT=5,6分
MALDI-MS:4395
算出されたMW=4397
N-イプシロン31{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}-[Aib8,Glu22,Val25, Arg26,Lys31, Arg34, Arg35, Arg37)]GLP-1(7-37)yl[Arg39,Arg40,Arg41]
調製法:SPPS法Cによりペプチドを調製し、最終生成物を分析用HPLC及びLC-MSで特徴付けした。
HPLC(02-B4-4):RT=7.36分
HPLC(中性):RT=17.5分
MALDI-MS:5022
算出されたMW=5021.8
N-イプシロン31-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Glu22, Val25, Arg26,Lys31,Lys35, Lys36]GLP-1-(7-36)アミド
調製法:SPPS法Cによりペプチドを調製し、最終生成物を分析用HPLC及びMALDI-MSで特徴付けした。
HPLC(02-B4-2):RT=8.4分
HPLC(04-A3-1):RT=7.8分
MALDI-MS:4141
算出されたMW=4140.8
N-イプシロン31-{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}-N-ベータ34-(2-(ビス-カルボキシメチルアミノ)アセチル)[Aib8,Glu22, Val25, Arg26,Lys31, Dap34]GLP-1(7-34)アミド
調製法:SPPS法Cによりペプチドを調製し、最終生成物を分析用HPLC及びMALDI-MSで特徴付けした。
HPLC(02-B6-1):RT=36.7分
HPLC(A4-A3-1):RT=8.9分
MALDI-MS:4015.9
算出されたMW=4015.5
N-イプシロン-37-[(S)-4-カルボキシ-4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)ブチリル][Aib8, Glu22, Arg26,34, Lys37]GLP-1(7-37)
SPPS法Bに類似した調製法
UPLC 方法04_A3_1:
RT=10.26分
LCMS:m/z=1071.7(M+4H)4+
算出された(M)=4284.9
静脈内又は皮下投与後のGLP-1の遅延性
本発明のGLP-1誘導体の遅延性を、以下の方法を使用し、健康なブタに皮下投与した後、血漿におけるその濃度をモニターすることにより測定してよい。続いて、皮下投与後のGLP-1(7-37)の血漿中の濃度と比較してよい。本発明の他のGLP-1誘導体の遅延性は、同様の方式で測定することができる。
本発明の多くのGLP-1誘導体(実施例1、4、5、7、8、9、13及び22の化合物)を、ミニブタにおける薬物動態試験にかけた。リラグルチドを、比較目的のための試験に含めた。第2の比較化合物を、国際公開第2005/027978号の実施例63に記載されているような、すなわち置換(22E+26R)を有するGLP-1誘導体に含めた。
一般的に、試験物質は、皮下又は静脈内投与に適したビヒクルに溶解されている。濃度は、投与量が約1mlになるように調節される。本研究において、試験物質は皮下に投与された。
本研究を、相対湿度≧50%、室温が21-23℃に設定された、適切な動物用の部屋において実施した。12時間は明るく、12時間は暗いというサイクルで、部屋に光をあてた。6.00〜18.00時までを明るいとした。動物を、寝具としてわら作りの囲いにおいて、各囲い毎に6匹を飼った。研究中、動物は、家庭用の質の飲用水に自由に近づくことができるが、投与の前日の午後4時から、投与の約12時間後まで、絶食させた。動物を、到着時、及び投与した日に計量した。
全血漿濃度-時間のプロファイルを各動物から得た。以下のスケジュールに従い、血液サンプルを収集した。
プレ投与(0)、注入後0.17(10分)、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72,96及び120時間。
皮下投与後:
プレ投与(0)、注入後0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72,96及び120時間。
GLP-1誘導体の酵素的分解を防止するために、安定化用のバッファーを含有する試験用チューブに、血液サンプルを収集した。
血漿を、直ちにマイクロニック(Micronic)-チューブに移した。約200μlの血漿を、各マイクロニック-チューブに移した。アッセイまで、血漿を−20℃で保存した。イムノアッセイを使用し、GLP-1誘導体の化合物について、血漿サンプルをアッセイした。
本発明の全ての試験されたGLP-1誘導体は、ミニブタへの皮下投与後、40-100時間の範囲内の半減期を有している。比較化合物リラグルチド及び化合物135の半減期は、それぞれ18時間及び28時間であった。
本発明の選択された誘導体を、デンマーク・ランドレースブタで試験する。
ブタ(50%デュロック、25%ヨークシャー、25%デンマーク・ランドレース、約40kg)を、実験の開始から絶食させる。50μMの等張液(5mMのホスファート、H 7.4、0.02%のトゥイーン(登録商標)-20(Merck)、45mg/mlのマンニトール(ピロゲンフリー、Novo Nordisk)にて、kg体重当たり0.5nmolの試験物質を、各ブタに投与する。頸静脈のカテーテルから、血液サンプルを取り出す。5mlの血液サンプルを、175μlの次の溶液:0.18MのEDTA、15000KIE/mlのアプロチニン(Novo Nordisk)、及び0.30mMのバリン-ピロリジド(Novo Nordisk)、pH7.4を収容したチルド冷却されたグラスに注ぐ。30分以内に、サンプルを10分、5-6000gの遠心分離にかける。温度を4℃で保持する。異なるグラスに上清をピペット取りし、使用するまで、−20℃で保持する。
血漿のポリペプチド濃度を、種々のモノ-又はポリクローナル抗体を使用する、サンドイッチELISA又はRIAにおいて測定する。抗体の選択はGLP-1誘導体に依存する。血漿におけるピーク濃度に達した時間は、選択された特定のGLP-1誘導体に応じて、広範囲で変化する。
コーティング用バッファー(PBS):リン酸緩衝食塩水、pH7.2
洗浄用バッファー(PBS-洗浄):リン酸緩衝食塩水、0.05%v/vのトゥイーン2 0、pH7.2
アッセイ用バッファー(BSA−バッファー):リン酸緩衝食塩水、10g/lのウシ血清
アルブミン
(Fluka 05477)
0.05%v/vのトゥイーン20、
pH7.2
ストレプトアビジン-バッファー:リン酸緩衝食塩水、0.5MのNaCl、0.05% v/vのトゥイーン20、pH7.2
標準体:血漿マトリックスにおける個々の誘導体
A-TNP:ナンセンス抗体
AMDEX:ストレプトアビン(Streptavin)-西洋ワサビ-ペルオキシダーゼ(Amersham RP N4401V)
TMB-基質:3,3',5,5'テトラメチルベンジジン(<0.02 %)、過酸化水素
1)PBS-バッファーに5μg/mlで捕捉抗体(catching antibody)が入ったもの100μlでのコーティング
・4℃でインキュベートo/n
・PBS-洗浄5回
・最小で30分、最後の洗浄でブロック
・ついでプレートを空にする
2)10μg/mlのA-TNPと共に、BSA-バッファーに1μg/mlでビオチン化検出抗体が入ったもの100μl+サンプル20μl
・振揺器において、室温で2時間インキュベート。PBS-洗浄5回。ついでプレートを空にする。
3)ストレプトアビジン-バッファーにおいて、AMDEX100μlを1:8000
・振揺器において、室温で45-60分インキュベート
・PBS-洗浄5回、ついでプレートを空にする
4)TMB-基質100μl
・振揺器において、室温でx分インキュベート
・4MのH3PO4100μlで反応を停止させる
参照として、450nmと620nmでの吸光度を読み取る。
サンプル中の濃度を、標準曲線から算出した。
DB-バッファー:80mMのリン酸バッファー、0.1%のヒト血清アルブミン、10 mMのEDTA、0.6mMのチオマーサル、pH7.5
FAM-バッファー:40mMのリン酸バッファー、0.1%のヒト血清アルブミン、0. 6mMのチオマーサル、pH7.5
木炭:40mMのリン酸バッファー、0.6mMのチオマーサル、16.7%のウシ血漿、 15g/lの活性炭、pH7.5(4℃での使用前、最小1時間、懸濁液を混合)
標準体:血漿マトリックスにおける個々の誘導体
混合−4℃で30分、インキュベート−3000rpmで30分、遠心分離−直後に新たなチューブに上清を移動−ストッパーで閉じ−1分間、ガンマ計測器で計測。
サンプル中の濃度を、個々の標準曲線から算出した。
本方法は、リードシーカー(LEADseeker)画像粒子を使用する、放射測定-リガンド結合アッセイである。アッセイは、GLP-1レセプター、未標識のGLP-1アナログ、125Iで標識されたヒトGLP-1、及び小麦胚芽凝集素(WGA)でコーティングされたPS リードシーカー粒子を含有する膜フラグメントからなる。冷却され、125I-標識されたGLP-1は、レセプターに対する結合について、競合するであろう。リードシーカー粒子が付加される場合、それらは、WGA-残基を介して、膜フラグメントの炭水化物残基に結合するであろう。125I-分子とリードシーカー粒子との間が近接していることで、粒子から光の放射が引き起こされる。リードシーカーは発光した光をイメージし、サンプルに存在するGLP-1アナログの量と可逆的に相関するであろう。
動物血漿の予備処理:動物血漿を56℃で4時間加熱処理し、10000rpmで10分遠心分離した。その後、Val-Pyr(10μM)及びアプロテニン(aprotenin)(500KIE/mL)を添加し、使用するまで<−18℃で保存した。
GLP-1アナログ標準物質:GLP-1アナログを、加熱処理された血漿に混ぜ、約1μM〜1pMの範囲の希釈線を作製した。
GLP-1 RRAアッセイ用バッファー:25mMのNa-HEPES(pH=7.5)、2.5mMのCaCl2、1mMのMgCl2、50mMのNaCl、0.1%の卵白アルブミン、0.003%のトゥイーン20、0.005%のバシトラシン、0.05%のNaN3。
GLP-1レセプター懸濁液:GLP-1レセプター膜を、ヒト膵臓GLP-1レセプターを安定して発現するベビーハムスター腎臓(BHK)細胞から精製した。使用まで<−80℃で保存。
WGAがカップリングしたポリスチレンリードシーカー画像粒子(RPNQ0260, Amersham):ビーズを、GLP-1 RRAアッセイ用バッファーを用いて、13.3mg/mLの濃度に再構成させた。ついで、GLP-1レセプター膜懸濁液を添加し、使用前に少なくとも1時間、回転させつつ、冷状態(2-8℃)でインキュベートした。
[125I]-GLP-1(7-36)アミド(Novo Nordisk A/S)。使用まで<-18℃で保存。
エタノール99.9%容量(De Dansk Spritfabrikker A/S):使用まで<-18℃で保存。
マルチスクリーン(MultiScreen)(登録商標)ソルビナート(Solvinert)0.45μmの疎水性PTFEプレート(MSRPN0450, Millipore Corp.)
ポリプロピレンプレート(カタログ番号650201, Greiner BiO-One)
ホワイト・ポリスチレン384-ウェルプレート(カタログ番号781075, Greiner BiO-One)
水平プレートミキサー
標準的なスイングバケット式マイクロタイタープレート回転アセンブリを具備する遠心分離器
ウルトラバップ(UltraVap)−ドライダウン・サンプル濃縮器(Porvair)
リードシーカーTM多様式画像システム(Amersham)
サンプル調製:
濾液を収集するために、化学-比較用受皿(すなわち、ポリプロピレンプレート)に、マルチスクリーン(MultiScreen)(登録商標)ソルビナートフィルタープレートを搭載。
マルチスクリーン(MultiScreen)(登録商標)ソルビナートフィルタープレートの空のウェルに150μLの氷冷されたエタノール99.9%、ついで50μLの標準物質又は血漿サンプルを添加。
「フィルタープレート上に保存用蓋を配置」
水平プレートミキサーにおいて、18-22℃で15分、インキュベート。
標準的なスイングバケット式マイクロタイタープレート回転アセンブリに、蓋を有する受皿とフィルターのアセンブリを配置。ついで、1500rpmで2分、受皿の空のウェルに濾液を収集。
15分の持続時間、加熱された(40℃)N2を用いるウルトラバップを使用し、濾液をドライダウン。各ウェルに100μLのGLP-1 RRAアッセイ用バッファーを添加することにより、乾燥物質を再構成。水平ミキサーで5分、インキュベート。
次のピペット用スキーム及びホワイト・ポリスチレン384-ウェルプレートを使用
・35μLのGLP-1 RRAアッセイ用バッファー
・5μLの再構成された濾液
・10μLの[125I]-GLP-1(7-36)アミド。保存溶液をGLP-1 RRAアッセイ用バッファーで、使用前に20000cpm/ウェルに希釈した。
・15μLのGLP-1レセプター膜フラグメント(〜0.5μg/ウェル)で、WGA-ポリスチレンリードシーカー画像ビーズ(0.2mg/ウェル)をプレコーティング。
プレートを密封し、18-22℃で一晩インキュベート。
各ウェルからの発光を、10分の持続時間、リードシーカーTM多様式画像システムを使用して検出する。
本発明の多数のGLP-1誘導体の作用強度を、以下に記載するようにして、すなわちヒトGLP-1レセプターを含有する媒体における、環状AMP(cAMP)形成の刺激性について測定した。比較のために、2つの公知のGLP-1誘導体の作用強度、すなわちリラグルチドの作用強度、及び化合物135、置換(22E+26R)を有するGLP-1誘導体の作用強度も、国際公開第2005/027978号の実施例63に記載されているようにして測定した。
ヒトGLP-1レセプターを発現する、安定した形質移入細胞系、BHK467-12A(tk-ts13)からの精製された細胞膜を、当該問題のGLP-1誘導体で刺激させ、cAMP生成の作用強度を、パーキン・エルマー・ライフ・サイエンスからのアルファスクリーンTMcAMPアッセイキットを使用して測定した。
安定した形質移入細胞系を、NN A/S、デンマークで調製し、高発現クローンをスクリーニング用に選択した。DMEM、5%のFCS、1%のPen/Strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)、及び0.5mg/mlの選択マーカーG418において、5%のCO2にて、細胞を増殖させた。
表1から明らかなように、非常に多くのGLP-1誘導体が、従来技術のリラグルチドのGLP-1誘導体よりも有効であった(EC50値の値が低ければ低い程、良好)。本発明の全てのGLP-1誘導体は、化合物135よりも有効であった。
ヒト血清アルブミン(HSA)に対する本発明の多数のGLP-1誘導体の親和性を、以下に記載するようにして、競合シンチレーション近接アッセイ(SPA)により測定した。
ストレプトアビジン-SPAビーズ(GE Healthcare RPNQ0009)を5時間、ビオチン化HSAと共にインキュベートした。バッファーを用いてビーズを洗浄し、未結合のHSAを除去した。ビーズを、125I-標識されたアシル化GLP-1アナログ(N-イプシロン37-[2-(2-[2-((S)-4-((S)-4-(12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ)-4-カルボキシブチリルアミノ)-4-カルボキシブチリルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,125I-Tyr19,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-NH2)と、100mMのHepes、100mMのNaCl、10mMのMgSO4、0.025%のトゥイーン-20、pH7.4において混合した。パーキン・エルマー・オプチプレート-96 6005290のウェルに、混合物をピペットで移し(ウェル当たり100μl)、測定されるGLP-1誘導体の希釈シリーズを100μl、同様のバッファーに添加した。室温でゆっくりと揺らして20時間後、プレートを遠心分離し、トップカウンターにおいて計測した。GLP-1誘導体の濃度の関数として、結合cpmをプロットし、競合曲線のEC50値を、HSAに対する誘導体の親和性の測定値として使用した。
表2:アルブミン結合親和性
表2から明らかなように、本発明のいくつかのGLP-1誘導体は、2000M以下のEC50に相応する、高いアルブミン結合親和性を有する(EC50が低ければ低い程、アルブミン結合親和性は高くなる)。
本発明の多くのGLP-1誘導体(実施例1、3、4、5、6、14、15、16、17、18、19、21、22、23、及び24の化合物)について、GLP-1Rレセプター(nGLP-1R)の単離されたN末端細胞外ドメインに対する結合親和性を、以下に記載するようにして測定した。比較のために、リラグルチドを含めた。
親和性とは、nGLP-1Rへの結合から、125I-エキセンディン-4(9-39)を置き換える、当該問題のGLP-1誘導体の能力度合いのことであり、nGLP-1Rへの結合を次のアッセイにより測定した:タンパク質nGLP-1Rを、Rungeら 2007(Biochemistry, vol. 46, pp. 5830-5840)に記載されたようにして調製し、ビオチン化、及びストレプトアビジンコーティングされたSPAビーズに固定化した。0.1MのNaHCO3にnGLP1Rが入ったものを、1mgのタンパク質に対して75μgのBNHS(Sigma H1759)を使用してビオチン化した。全ての試薬と誘導体を、0.05%v/vのトゥイーン20が入ったPBSに希釈した。結合アッセイを、例えば、最終容量200μlの96ウェルオプチプレート(PerkinElmer 6005290)において実施した。各ウェルには、2mgのストレプトアビジンコーティングされたSPAビーズ(PerkinElmer RPNQ007)、0.1pmolのビオチン化nGLP1R、50pCiの125I-エキセンディン(9-39)、及び1000nM〜0.064nMの範囲の最終濃度の試験用ペプチドが含有せしめられている。プレートを、RTで3時間、シェーカーにおいてインキュベートした。SPA粒子を、10分、1500rpmの遠心分離により沈降させ、トップカウント-NXT(PerkinElmer)において計測した。
nGLP-1R(IC50)に対するリラグルチドの親和性は、1500nMと測定された。本発明の試験されたGLP-1誘導体は、2.0-276(nM)の範囲の親和性を有しており、6つの化合物は2.0-10.0nMの範囲であった。従って、本発明の全ての試験されたGLP-1誘導体は、リラグルチドと比較して、N末端GLP-1レセプターに対して改善された結合親和性性を示す(EC50が低ければ低い程、結合性は高くなる)。
本発明の多数のGLP-1誘導体(実施例1、7、8、9、11、12、13、20、22、及び27の化合物)を、以下に記載するようにして、肥満症、糖尿病のマウスモデル(db/dbマウス)における用量反応研究を試験した。
10-12の週齢の50匹のdb/dbマウス(Taconic, Denmark)を、Novo Nordiskの標準的な動物保護規則に従って飼い、標準的な食べ物(例えば、Altromin 1324, Brogaarden, Gentofte, Denmark)、及び水道水に自由に近づくことができ、24℃で保持した。順応して1週間後、基礎血糖を2回算定した。
平均血糖値に基づき、42匹のマウスをさらなる実験用に選択し、血糖値に合わせて7つのグループ(n=6)に配分した。マウスを、3-6日の期間で4回までの実験に使用し、その後安楽死させた。
1:ビヒクル、皮下
2:GLP-1誘導体、0.3nmol/kg、皮下
3:GLP-1誘導体、1nmol/kg、皮下
4:GLP-1誘導体、3nmol/kg、皮下
5:GLP-1誘導体、10nmol/kg、皮下
6:GLP-1誘導体、30nmol/kg、皮下
7:GLP-1誘導体、100nmol/kg、皮下
ビヒクル:50mMのホスファート、0.05%のトゥイーン80、pH8。GLP-1誘導体をビヒクルに、例えば0.05、0.17、0.5、1.7、5及び17nmol/mlの濃度で溶解させ、300マイクロリットルを、マウス50g毎に、皮下投与した(6ml/kg)。
次の日、血糖を、投与の24、48,72及び96時間後(すなわち2、3、4、5日目の午前9時)に算定し、続いて計量した。いくつかの研究においては、血糖と体重を、投与後120時間(6日目)にさらに算定した。
マウスは個々にデジタル計量で計量した。
仮定
(1)血漿からの化合物の消失は単一指数である;
(2)血糖における影響(デルタBG)は、標準的なS字型用量反応曲線で記載可能である;
(3)吸収及び分配の最初の6時間は無視し、底部から基線(最小0)へのグルコースの回復のみが適合される;
ついで、グルコース反応(Y)(例えばデルタBG)は次の等式
Y=底部+(頂部-底部)/(1+用量*exp(−In2*t/T1/2)/ED50)
により記載可能であり、ここで変数ED50及びT1/2は、以下の通りに定義される:
EDは、BGにおいて最大効果の半分まで上昇させる用量(nmol/kg)である。
T1/2は、半減期(時間)であり;以下は包括的定数である:
頂部(基線グルコースへの回復後の反応)、底部(最大グルコース低下での反応);また次は、各データ設定への定数(各用量)での定数である:
用量(投与量(nmol/kg))。
全てのデータ設定を同時に適合させる。
試験される全ての化合物は、10-30時間の範囲の半減期(T1/2)を有する。
本発明の多数のGLP-1誘導体(実施例3、4、5、7、8、9、11、12、13、14、21、22、及び24の化合物)のα-ヘリカル構造の含有量を、以下に記載するように、円偏光二色性(CD)分光法を使用して推定した。比較目的のために、試験にはリラグルチドも含めた。
遠紫外線円二色性スペクトルを、10mMのトリス/ClO4に、5μM(μM、マイクロモル)のペプチドが入ったもの、pH8.0において、ジャスコ(Jasco)J-715分光偏光計で記録した。生データからバッファーバックグラウンドを引き、ペプチド結合の濃度に基づき、M-1cm-1単位のモル楕円率に対して正規化し、222nmでの強度値を抽出した。
222nmでの強度をアルファ-ヘリカル含有量の測定値として使用し、すなわち、シグナルは、値の-1M-1cm-1が10%アルファ-ヘリカル構造に相当するように、アルファ-ヘリカル含有量に比例している(Venyaminov 及び Yang 1996:「Determination of protein secondary structure」,Circular Dichroism and conformational analysis of biomolecules(Ed. Fasman GD, Plenum Press NY), pp. 69-108)。
スペクトルから、モル楕円率の値(Δε、又はデルタイプシロン)を導き出し、対応するアルファ-ヘリカル含有量を推定した。200-250nmの範囲にあるGLP-1誘導体の全体的なスペクトルの特徴は、それぞれ206nm及び222nmで最小値を有する2つのバンドにより記載される。このことは、有意のアルファ-ヘリカル伸展部を伴う2次構造に一致する。
5μM濃度における実施例4、5、11及び14の化合物についての222nmでのデルタイプシロン値は−2.0〜−3.6の範囲にあり、アルファ-ヘリカル含有量が、20-36%の範囲にあることに相当する。
5μM濃度における実施例3、7、8、9、12、13、21、22、及び24の化合物についての222nmでのデルタイプシロン値は−3.7〜−6.0の範囲にあり、アルファ-ヘリカル含有量が、37-60%の範囲にあることに相当する。
Claims (5)
- N-イプシロン37{2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)アミド;
N-イプシロン30{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[Aib8,Glu22,Arg26,Lys30]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン31{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[Aib8,Glu22,Arg26,Lys31]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37);
から選択される、GLP-1誘導体。 - 請求項1に記載の誘導体又はその薬学的に許容可能な塩、アミド、アルキル、又はエステルと、薬学的に許容可能な賦形剤を含有する薬学的組成物。
- 医薬としての使用のための、請求項1に記載の誘導体、又は請求項2に記載の薬学的組成物。
- 高血糖症、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病、肥満症、高血圧症、X症候群、脂質代謝異常、認知障害、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、冠動脈心疾患及び他の心血管障害、脳卒中、炎症性腸症候群、胃腸障害、及び胃潰瘍の治療又は予防に使用される、請求項1に記載の誘導体、又は請求項2に記載の薬学的組成物。
- 高血糖症、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病、肥満症、高血圧症、X症候群、脂質代謝異常、認知障害、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、冠動脈心疾患及び他の心血管障害、脳卒中、炎症性腸症候群、胃腸障害、及び胃潰瘍の治療又は予防に使用される医薬の製造における、請求項1に記載の誘導体、又は請求項2に記載の薬学的組成物の使用。
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