CN100444898C

CN100444898C - 治疗肽的清蛋白结合型衍生物

Info

Publication number: CN100444898C
Application number: CNB2004800300180A
Authority: CN
Inventors: J·劳; T·K·汉森; K·马德森; P·布罗奇; F·Z·迪尔沃德; N·L·乔安森
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2003-09-19
Filing date: 2004-09-17
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2024-09-17
Also published as: ZA200602000B; CN101380476A; CN1867360A

Abstract

具有延长的作用特性的新型多肽衍生物。本发明涉及一种化合物，其包含通过亲水性间隔物与清蛋白结合残基连接的治疗性多肽。本发明也涉及一种化合物，其包含通过亲水性间隔物与清蛋白结合残基连接的治疗性多肽，所述亲水性间隔物通过化学部分(moiety)将所述多肽和清蛋白结合残基分隔开，所述化学部分(moiety)含有至少5个非氢原子，其中30-50%的这些原子是N或O。在本发明的一个实施方案中，间隔物定义为-(CH₂)_lD[(CH₂)_nE]_m(CH₂)_pQ_q-，其中l、m和n独立地是1-20，p是0-10，Q是-Z-(CH₂)_lD[(CH₂)_nG]_m(CH₂)_p-，q是0-5的整数，D、E和G各自独立地选自-O-、NR³-、-N(COR⁴)-、-PR⁵(O)-和-P(OR⁶)(O)-，其中R³、R⁴、R⁵和R⁶独立地代表氢或C_1-6烷基，Z选自-C(O)NH-、-C(O)NHCH₂-、-OC(O)NH-、-C(O)NHCH₂CH₂-、-C(O)CH₂-、-C(O)CH＝CH-、-(CH₂)_s-、-C(O)-、-C(O)O-或-NHC(O)-，其中s是0或1。

Description

治疗肽的清蛋白结合型衍生物

发明领域

本发明涉及胰高血糖素样多肽-1(GLP-1)及其片段的新型衍生物、这些片段的具有延长作用特性的类似物、以及生产和使用它们的方法。本发明还涉及exendin的新型衍生物及其用途。

发明背景

肽被广泛用于医学实践，而且由于它们可以通过重组DNA技术生产，因此预计它们的重要性在未来的几年里还将升高。在将天然肽或其类似物用于治疗时，通常发现它们具有较高的清除率。在希望将治疗剂以高血液水平维持较长时间的情况中，清除率高是不便的，因为需要反复进行施药。清除率高的肽的实例有ACTH、促肾上腺皮质激素释放因子、血管紧张素、降钙素、胰岛素、胰高血糖素、胰高血糖素样多肽-1、胰高血糖素样多肽-2、胰岛素样生长因子-1、胰岛素样生长因子-2、抑胃肽、生长激素释放因子、可激活垂体腺苷酸环化酶的多肽、胰泌素、肠抑胃素(enterogastrin)、促生长素抑制素、促生长素、生长调节素、甲状旁腺激素、血小板生成素、促红细胞生成素、下丘脑释放因子(hypothalamic releasing factors)、催乳素、促甲状腺激素、内啡肽、脑啡肽、加压素、催产素、阿片样物质及其类似物、超氧化物歧化酶、干扰素、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶、和核糖核酸酶。在有些情况中，有可能通过运用合适的药物组合物来改变肽的释放特性，但是这种方法具有多方面的缺点，而且通常不适用。

具有受关注的生物学活性的已知内源肽和蛋白质的数目正在迅速增加，这也是正在进行的人类基因组探索的结果。由于它们的生物学活性，这些多肽中的许多原则上可以用作治疗剂。然而，由于肽酶的快速降解和/或由于肾过滤并排泄到尿中，这些肽常常只具有几分钟的半衰期，因此内源肽并非始终是合适的候选药物。多肽在人血浆中的半衰期变化巨大，由几分钟至超过一周。类似的，小分子药物的半衰期也是高度变化的。然而，尚未完全理解肽、蛋白质、或其它化合物的血浆半衰期的这种高可变性。由此，需要修饰治疗性化合物以提供更长的体内作用持续时间，同时保持低毒性和治疗优势。

血清清蛋白的半衰期超过一周，提高肽的血浆半衰期的一种方法是用与血清清蛋白结合的化学实体对肽进行衍生化作用。

Knudsen等，J.Med.Chem.43：1664-1669，2000显示了酰化GLP-1肽在猪中展示高受体效力和升高10倍的血浆半衰期。

Zobel等，Bioorg.Med.Chem.Lett.13：1513-1515，2003显示了通过与血清清蛋白结合的基于磷酸酯的小分子对氨基末端进行的衍生化作用，抗凝肽在兔中的血浆半衰期升高了10-50倍。

发明概述

本发明涉及包含治疗性多肽且其通过亲水性间隔物与清蛋白结合残基相连的化合物。

本发明还涉及包含治疗性多肽且其通过这样的亲水性间隔物与清蛋白结合残基相连的化合物，即所述间隔物以包含至少5个非氢原子的化学部分(moiety)将多肽与清蛋白结合残基分开，这些非氢原子中的30-50％是N或O。

在本发明的一个实施方案中，间隔物定义为：

-(CH₂)_lD[(CH₂)_nE]_m(CH₂)_pQ_q-，

其中

l、m、和n独立的是1-20且p是0-10，

Q是-Z-(CH₂)_lD[(CH₂)_nG]_m(CH₂)_p-，

q是0-5的整数，

D、E、和G各自独立的选自-O-、-NR³-、-N(COR⁴)-、-PR⁵(O)-、和-P(OR⁶)(O)-，其中R³、R⁴、R⁵、和R⁶独立的代表氢或C_1-6烷基，

Z选自-C(O)NH-、-C(O)NHCH₂-、-OC(O)NH-、-C(O)NHCH₂CH₂-、-C(O)CH₂-、-C(O)CH＝CH-、-(CH₂)_s-、-C(O)-、-C(O)O-、或-NHC(O)-，其中s是0或1，

或其制药学可接受盐或前药。

本发明还涉及具有通式(I)的化合物：

A-W-B-Y-治疗性多肽(I)，

其中

A是清蛋白结合残基，

B是亲水性间隔物-(CH₂)_lD[(CH₂)_nE]_m(CH₂)_pQ_q-，其中

l、m、和n独立的是1-20且p是0-10，

Q是-Z-(CH₂)_lD[(CH₂)_nG]_m(CH₂)_p-，

q是0-5的整数，

Y是连接B与治疗剂的化学基团，且

W是连接A与B的化学基团。

本发明还涉及具有通式(II)的化合物：

A-W-B-Y-治疗性多肽-Y′-B′-W′-A′(II)，

其中

A和A′是清蛋白结合残基，

B和B′是独立选自-(CH₂)_lD[(CH₂)_nE]_m(CH₂)_p-Q_q-的亲水性间隔物，其中

l、m、和n独立的是1-20且p是0-10，

Q是-Z-(CH₂)_lD[(CH₂)_nG]_m(CH₂)_p-，

q是0-5的整数，

Y是连接B与治疗剂的化学基团，而Y′是连接B′与治疗剂的化学基团，且

W是连接A与B的化学基团，而W′是连接A′与B′的化学基团。

在另一个方面，本发明涉及具有通式(III)的化合物：

A

＞W″-B-Y-治疗性多肽(III)，

A′

其中

A和A′是清蛋白结合残基，

B是选自-(CH₂)_lD[(CH₂)_nE]_m(CH₂)_p-Q_q-的亲水性间隔物，其中

l、m、和n独立的是1-20且p是0-10，

Q是-Z-(CH₂)_lD[(CH₂)_nG]_m(CH₂)_p-，

q是0-5的整数，

Y是连接B与治疗剂的化学基团，且

W″是连接B与A和A′的化学基团。

在另一个方面，本发明涉及在治疗性肽与一个或多个清蛋白结合残基之间包含亲水性间隔物的化合物，所述化合物相对于治疗性多肽具有延长的作用特性，其中所述化合物的清蛋白结合部分和游离部分都能够与介导治疗性多肽作用的受体结合。

在一个实施方案中，亲水性间隔物是两个末端都含有合适官能团、在治疗性多肽的氨基与清蛋白结合残基的官能团之间形成桥的无支链寡聚乙二醇部分(moiety)。

在本发明的另一个方面，治疗性多肽是GLP-1肽。

定义

在本说明书中，下列术语具有所示的含义：

术语“清蛋白结合残基”在用于本文时指与人血清清蛋白非共价结合的残基。附着到治疗性多肽上的清蛋白结合残基所具有的针对人血清清蛋白的亲和力通常低于约10μM，优选低于约1μM。已知的清蛋白结合残基的范围包括含4-40个碳原子的线性和分支亲脂性部分(moiety)、具有环戊烷并菲环骨架的化合物、具有10-30个氨基酸残基的肽等。

术语“亲水性间隔物”在用于本文时指以包含至少5个非氢原子的化学部分(moiety)将肽与清蛋白结合残基分开的间隔物，这些非氢原子中的30-50％是N或O。

术语“治疗性多肽”在用于本文时指为了治疗用途而正在或已经开发的多肽。

术语“多肽”和“肽”在用于本文时指由至少五个氨基酸成分通过肽键相连而组成的化合物。氨基酸成分可以来自由遗传密码编码的氨基酸，而且它们可以是不是由遗传密码编码的天然氨基酸，以及合成氨基酸。不是由遗传密码编码的天然氨基酸有例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸、D-丙氨酸、和D-谷氨酰胺。合成氨基酸包括通过化学合成制造的氨基酸，即由遗传密码编码的氨基酸的D-异构体诸如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib(α-氨基异丁酸)、Abu(α-氨基丁酸)、Tle(叔丁基甘氨酸)、β-丙氨酸、3-氨甲基苯甲酸、氨茴酸。

术语“类似物”在用于本文指多肽时指经过修饰的肽，其中肽的一个或多个氨基酸已经用其它氨基酸残基替代和/或其中肽的一个或多个氨基酸残基已经删除和/或其中肽中已经添加了一个或多个氨基酸残基。这些氨基酸残基的添加或删除可以发生在肽的N端和/或C端。使用一种简单的系统来描述类似物：例如，[Arg³⁴]GLP-1(7-37)Lys指第34位天然存在的赖氨酸已经用精氨酸替代且C末端(第38位)已经添加赖氨酸的GLP-1类似物。依照IUPAC-IUB命名法使用氨基酸的标准单字母缩写表述肽类似物及其衍生物的化学式。

术语“衍生物”在用于本文关于肽时指经过化学修饰的肽或其类似物，其中至少一个取代基在未经修饰的肽或其类似物中不存在，即指经过共价修饰的肽。典型的修饰有酰胺、碳水化合物、烷基、酰基、酯等等。GLP-1(7-37)衍生物的一个实例是N^ε26-(γ-Glu(N^α-十六酰基)))-[Arg³⁴，Lys²⁶])GLP-1(7-37)。

术语“GLP-1肽”在用于本文时指GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)、GLP-1类似物、GLP-1衍生物、或GLP-1类似物的衍生物。在一个实施方案中，GLP-1肽是促胰岛素剂。

术语“促胰岛素剂”在用于本文时指作为人GLP-1受体激动剂的化合物，即在含人GLP-1受体的合适介质中刺激cAMP形成的化合物。促胰岛素剂的效力是通过如下所述由剂量-应答曲线计算EC₅₀值而测定的。

用GLP-1和肽类似物刺激来自表达人GLP-1受体的稳定转染细胞系BHK467-12A(tk-ts13)的纯化细胞膜，并使用AlphaScreen^TMcAMP测定试剂盒(Perkin Elmer Life Sciences)测量生成cAMP的效力。

稳定转染细胞系是在NN制备的，并选择高表达克隆用于筛选。在含5％FCS、1％青霉素/链霉素、和0.5mg/ml G418的DMEM中于5％CO₂培养细胞。

用PBS将大约80％汇合的细胞清洗2次，并用Versene收获细胞，以1000rpm离心5分钟，并除去上清液。其它步骤都是在冰上进行的。将细胞沉淀在10ml缓冲液1(20mM Na-HEPES、10mM EDTA，pH＝7.4)用Ultrathurax匀浆20-30秒，以20,000rpm离心15分钟，并将沉淀重悬于10ml缓冲液2(20mM Na-HEPES、0.1mM EDTA，pH＝7.4)。将悬浮液匀浆20-30秒，并以20,000rpm离心15分钟。将悬于缓冲液2、匀浆、和离心重复一次，并将膜重悬于缓冲液2，此时可用于进一步分析或保存于-80℃。

功能受体测定法是通过使用AlphaScreen技术测量由肽诱导的cAMP产量来进行的。AlphaScreen技术的基本原理是内源cAMP与外源添加生物素-cAMP之间的竞争。对cAMP的捕捉是使用缀合在受体珠上的特异抗体来完成的。在AlphaFusion微板分析仪上对形成的cAMP进行计数和测量。使用Graph-Pad Prisme软件计算EC₅₀值。

术语“GLP-2肽”在用于本文时指GLP-2(1-33)、GLP-2类似物、GLP-2衍生物、或GLP-2类似物的衍生物。

术语“exendin-4肽”在用于本文时指exendin-4(1-39)、exendin-4类似物、exendin-4衍生物、或exendin-4类似物的衍生物。在一个实施方案中，exendin-4肽是促胰岛素剂。

术语“稳定的exendin-4肽”和“稳定的GLP-1肽”在用于本文时指由exendin-4(1-39)或GLP-1(7-37)衍生的经过化学修饰的肽，即根据如下方法的测定，在人体中展示至少10小时的体内血浆清除半衰期的类似物或衍生物。用于测定exendin-4肽或GLP-1肽在人体中的血浆清除半衰期的方法是：将肽溶于等渗缓冲液pH 7.4的PBS或任何其它合适缓冲液。外周注射药剂，优选腹部或大腿上部。以频繁间隔和足以覆盖最终清除部分的时程(例如服药前、服药后1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、24(第2天)、36(第2天)、48(第3天)、60(第3天)、72(第4天)、和84(第4天)小时)采集血样，用于测定活性肽。如Wilken等，Diabetologia43(51)：A143，2000中所述测定活性肽的浓度。使用商业性软件2.1版WinNonlin(Pharsight，卡雷，北卡罗来纳州，美国)通过非房室化方法对每一位受试者由浓度-时间数据计算导出药动学参数。通过浓度-时间曲线最终对数线性部分的对数线性回归，评估最终清除速率常数，并用于计算清除半衰期。

术语“DPP-IV保护的”在用于本文指多肽时指为了使所述化合物耐受血浆肽酶二肽酰氨肽酶-4(DPP-IV)而经过化学修饰的多肽。已知血浆中DPP-IV酶牵涉几种肽激素的降解，例如GLP-1、GLP-2、Exendin-4等。由此，为了降低DPP-IV的降解速率，为了开发易受DPP-IV介导水解影响的多肽的类似物和衍生物正在做出巨大努力。

肽对二肽酰氨肽酶IV降解的抵抗力是通过如下降解测定法测定的：将几份肽与一份纯化的二肽酰氨肽酶IV在pH7-8的合适缓冲液(缓冲剂不是清蛋白)中于37℃保温4-22小时。添加三氟乙酸终止酶促反应，并通过HPLC或LC-MS分析将肽降解产物分离和量化。用于进行这种分析的一种方法是：将混合液施加到Zorbax 300SB-C18(30nm孔径，5μm颗粒)150×2.1mm柱上，并用乙腈在0.1％三氟乙酸中的线性梯度(0％-100％乙腈，30分钟)以流速0.5ml/min进行洗脱。可以通过它们在214nm(肽键)或280nm(芳香族氨基酸)的吸光率来监测肽及其降解产物，并通过将它们的峰面积积分而量化。可以使用LC-MS来测定降解模式，其中可以测定各个峰的MS谱。根据在指定时间的完整/降解化合物百分率，评估肽的DPPIV稳定性。

当根据完整化合物在指定时间的百分率，肽比天然肽稳定10倍时，将它定义为对DPPIV稳定的。由此，DPPIV稳定化的GLP-1化合物至少比GLP-1(7-37)稳定10倍。

术语“C_1-6烷基”在用于本文时指具有1-6个碳原子的饱和的、分支的、直链的、或环链烃基。代表性实例包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、正己基、异己基、环己烷等等。

发明详述

在本发明的一个实施方案中，间隔物定义为：

-(CH₂)_lD[(CH₂)_nE]_m(CH₂)_pQ_q-，

其中

l、m、和n独立的是1-20且p是0-10，

Q是-Z-(CH₂)_lD[(CH₂)_nG]_m(CH₂)_p-，

q是0-5的整数，

或其制药学可接受盐或前药。

本发明还涉及具有通式(I)的化合物：

A-W-B-Y-治疗性多肽(I)，

其中

A是清蛋白结合残基，

B是亲水性间隔物-(CH₂)_lD[(CH₂)_nE]_m(CH₂)_pQ_q-，其中

l、m、和n独立的是1-20且p是0-10，

Q是-Z-(CH₂)_lD[(CH₂)_nG]_m(CH₂)_p-，

q是0-5的整数，

Y是连接B与治疗剂的化学基团，且

W是连接A与B的化学基团。

本发明还涉及具有通式(II)的化合物：

A-W-B-Y-治疗性多肽-Y′-B′-W′-A′(II)，

其中

A和A′是清蛋白结合残基，

l、m、和n独立的是1-20且p是0-10，

Q是-Z-(CH₂)_lD[(CH₂)_nG]_m(CH₂)_p-，

q是0-5的整数，

W是连接A与B的化学基团，而W′是连接A′与B′的化学基团。

在本发明的一个实施方案中，Y′选自下组：-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)NHCH₂-、CH₂NHC(O)-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)-、和-C(O)NH-，其中s是0或1。

在本发明的另一个实施方案中，W′选自下组：-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)-、和-C(O)NH-，其中s是0或1。

在另一个方面，本发明涉及具有通式(III)的化合物：

A

＞W″-B-Y-治疗性多肽(III)，

A′

其中

A和A′是清蛋白结合残基，

B是选自-(CH₂)_lD[(CH₂)_nE]_m(CH₂)_p-Q_q-的亲水性间隔物，其中

l、m、和n独立的是1-20且p是0-10，

Q是-Z-(CH₂)_lD[(CH₂)_nG]_m(CH₂)_p-，

q是0-5的整数，

Y是连接B与治疗剂的化学基团，且

W″是连接B与A和A′的化学基团。

在另一个方面，本发明涉及在治疗性肽与一个或多个清蛋白结合残基之间包含亲水性间隔物的化合物，所述化合物相对于治疗性多肽具有延长的作用特性，其中所述化合物的清蛋白结合部分以及游离部分都能够与介导治疗性多肽作用的受体结合。

在一个实施方案中，Y选自下组：-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)NHCH₂-、CH₂NHC(O)-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)-、和-C(O)NH-，其中s是0或1。

在另一个实施方案中，W选自下组：-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)-、和-C(O)NH-，其中s是0或1。

在另一个实施方案中，W″选自下组：

其中s是0、1、或2。

在另一个实施方案中，l是1或2，n和m独立的是1-10，且p是0-10。

在另一个实施方案中，D是-O-。

在本发明的另一个实施方案中，E是-O-。

在本发明的还有一个实施方案中，亲水性间隔物是-CH₂O[(CH₂)₂O]_m(CH₂)_pQ_q-，其中m是1-10，p是1-3，且Q是-Z-CH₂O[(CH₂)₂O]_m(CH₂)_p-。

在另一个实施方案中，q是1。

在另一个实施方案中，G是-O-。

在本发明的还有一个实施方案中，Z选自下组：-C(O)NH-、-C(O)NHCH₂-、和-OC(O)NH-。

在还有一个实施方案中，q是0。

在另一个实施方案中，l是2。

在另一个实施方案中，n是2。

在还有一个实施方案中，亲水性间隔物B是-[CH₂CH₂O]_m+1(CH₂)_pQ_q-。

在还有一个实施方案中，亲水性间隔物B是-(CH₂)_l-O-[(CH₂)_n-O]_m-(CH₂)_p-[C(O)NH-(CH₂)_l-O-[(CH₂)_n-O]_m-(CH₂)_p]_q-，其中l、m、n、和p独立的是1-5，且q是0-5。

在还有一个实施方案中，-W-B-Y-选自下组：

在还有一个实施方案中，＞W″-B-Y-是

在还有一个实施方案中，清蛋白结合残基A选自下组：

其中手性碳原子或是R或是S，

其中手性碳原子或是R或是S，

其中两个手性碳原子独立的或是R或是S，

其中两个手性碳原子独立的或是R或是S，

其中两个手性碳原子独立的或是L或是D，

其中手性碳原子或是R或是S，

其中手性碳原子或是R或是S，

其中两个手性碳原子独立的或是R或是S，

其中两个手性碳原子独立的或是R或是S，

在还有一个实施方案中，亲水性间隔物的摩尔量在80-1000D范围内，或在80-300D范围内。

在本发明的另一个实施方案中，清蛋白结合残基是亲脂性残基。

在另一个实施方案中，清蛋白结合残基在生理pH带负电荷。在另一个实施方案中，清蛋白结合残基包含可以带负电荷的基团。可以带负电荷的一种优选基团是羧酸基团。

在本发明的另一个实施方案中，清蛋白结合残基与清蛋白非共价结合。在另一个实施方案中，清蛋白结合残基所具有的针对人血清清蛋白的亲和力低于约10μM或低于约1μM。

在本发明的还有一个实施方案中，清蛋白结合残基选自：直链烷基、分支烷基、具有ω-羧酸基团的基团、部分或完全氢化的环戊烷并菲环骨架。

在另一个实施方案中，清蛋白结合残基是cibacronyl残基。

在另一个实施方案中，清蛋白结合残基具有6-40个碳原子、8-26个碳原子、或8-20个碳原子。

在另一个实施方案中，清蛋白结合残基是选自下组的酰基：CH₃(CH₂)_rCO-，其中r是4-38的整数，优选4-24的整数，更优选选自下组：CH₃(CH₂)₆CO-、CH₃(CH₂)₈CO-、CH₃(CH₂)₁₀CO-、CH₃(CH₂)₁₂CO-、CH₃(CH₂)₁₄CO-、CH₃(CH₂)₁₆CO-、CH₃(CH₂)₁₈CO-、CH₃(CH₂)₂₀CO-、和CH₃(CH₂)₂₂CO-。

在另一个实施方案中，清蛋白结合残基是直链或分支烷烃α，ω-二羧酸的酰基。

在另一个实施方案中，清蛋白结合残基是选自下组的酰基：HOOC(CH₂)_sCO-，其中s是4-38的整数，优选4-24的整数，更优选选自下组：HOOC(CH₂)₁₄CO-、HOOC(CH₂)₁₆CO-、HOOC(CH₂)₁₈CO-、HOOC(CH₂)₂₀CO-、和HOOC(CH₂)₂₂CO-。

在另一个实施方案中，清蛋白结合残基是通式为CH₃(CH₂)_vCO-NHCH(COOH)(CH₂)₂CO-的基团，其中v是10-24的整数。

在另一个实施方案中，清蛋白结合残基是通式为CH₃(CH₂)_wCO-NHCH((CH₂)₂COOH)CO-的基团，其中w是8-24的整数。

在另一个实施方案中，清蛋白结合残基是通式为COOH(CH₂)_xCO-的基团，其中x是8-24的整数。

在另一个实施方案中，清蛋白结合残基是通式为-NHCH(COOH)(CH₂)₄NH-CO(CH₂)_yCH₃的基团，其中y是8-18的整数。

在本发明的另一个实施方案中，清蛋白结合残基是肽，诸如包含少于40个氨基酸残基的肽。在J.Biol.Chem.277(38)：35035-35043，2002中找到了许多作为清蛋白结合残基的小肽及其鉴定方法。

在本发明的另一个实施方案中，清蛋白结合残基经由间隔物和接头附着到所述治疗性多肽中赖氨酸残基的ε-氨基上。

在另一个实施方案中，清蛋白结合残基经由间隔物和接头附着到所述治疗性多肽中的半胱氨酸、谷氨酸、或天冬氨酸上。

在本发明的一个实施方案中，治疗性多肽是GLP-1肽。

在本发明的另一个实施方案中，治疗性多肽是包含氨基酸序列通式(IV)的GLP-1肽：

Xaa₇-Xaa₈-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa₁₆-Ser-Xaa₁₈-Xaa₁₉-Xaa₂ ₀-Glu-Xaa₂₂-Xaa₂₃-Ala-Xaa₂₅-Xaa₂₆-Xaa₂₇-Phe-Ile-Xaa₃₀-Trp-Leu-Xaa₃₃-Xaa₃₄-Xaa₃₅-Xaa₃₆-Xaa₃₇-Xaa₃₈-Xaa₃₉-Xaa₄₀-Xaa₄₁-Xaa₄₂-Xaa₄₃-Xaa₄₄-Xaa₄₅-Xaa₄₆

通式(IV)(SEQ ID NO：2)

其中

Xaa₇是L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、同组氨酸(homohistidine)、N^α-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、或4-吡啶基丙氨酸；

Xaa₈是丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、Aib、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸、或(1-氨基环辛基)羧酸；

Xaa₁₆是Val或Leu；

Xaa₁₈是Ser、Lys、或Arg；

Xaa₁₉是Tyr或Gln；

Xaa₂₀是Leu或Met；

Xaa₂₂是Gly、Glu、或Aib；

Xaa₂₃是Gln、Glu、Lys、或Arg；

Xaa₂₅是Ala或Val；

Xaa₂₆是Lys、Glu、或Arg；

Xaa₂₇是Glu或Leu；

Xaa₃₀是Ala、Glu、或Arg；

Xaa₃₃是Val或Lys；

Xaa₃₄是Lys、Glu、Asn、或Arg；

Xaa₃₅是Gly或Aib；

Xaa₃₆是Arg、Gly、或Lys；

Xaa₃₇是Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、酰胺或是不存在；

Xaa₃₈是Lys、Ser、酰胺或是不存在；

Xaa₃₉是Ser、Lys、酰胺或是不存在；

Xaa₄₀是Gly、酰胺或是不存在；

Xaa₄₁是Ala、酰胺或是不存在；

Xaa₄₂是Pro、酰胺或是不存在；

Xaa₄₃是Pro、酰胺或是不存在；

Xaa₄₄是Pro、酰胺或是不存在；

Xaa₄₅是Ser、酰胺或是不存在；

Xaa₄₆是酰胺或是不存在；

倘若Xaa₃₈、Xaa₃₉、Xaa₄₀、Xaa₄₁、Xaa₄₂、Xaa₄₃、Xaa₄₄、Xaa₄₅、或Xaa₄₆不存在的话，那么下游的每一个氨基酸残基也不存在。

在本发明的另一个实施方案中，多肽是包含氨基酸序列通式(V)的GLP-1肽：

Xaa₇-Xaa₈-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa₁₈-Tyr-Leu-Glu-Xaa₂₂-Xaa₂₃-Ala-Ala-Xaa₂₆-Glu-Phe-Ile-Xaa₃₀-Trp-Leu-Val-Xaa₃₄-Xaa₃₅-Xaa₃₆-Xaa₃₇-Xaa₃₈

通式(V)(SEQ ID NO：3)

其中

Xaa₇是L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、同组氨酸、N^α-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、或4-吡啶基丙氨酸；Xaa₈是丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、Aib、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸、或(1-氨基环辛基)羧酸；

Xaa₁₈是Ser、Lys、或Arg；

Xaa₂₂是Gly、Glu、或Aib；

Xaa₂₃是Gln、Glu、Lys、或Arg；

Xaa₂₆是Lys、Glu、或Arg；

Xaa₃₀是Ala、Glu、或Arg；

Xaa₃₄是Lys、Glu、或Arg；

Xaa₃₅是Gly或Aib；

Xaa₃₆是Arg或Lys；

Xaa₃₇是Gly、Ala、Glu、或Lys；

Xaa₃₈是Lys、酰胺或是不存在。

在本发明的还有一个实施方案中，GLP-1肽选自：GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、GLP-1(7-36)-酰胺、GLP-1(7-37)、GLP-1(7-38)、GLP-1(7-39)、GLP-1(7-40)、GLP-1(7-41)或其类似物。

在另一个实施方案中，GLP-1肽是选自下组的肽的片段：GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、GLP-1(7-36)酰胺、GLP-1(7-37)、GLP-1(7-38)、GLP-1(7-39)、GLP-1(7-40)、和GLP-1(7-41)或其类似物。

在本发明的另一个实施方案中，GLP-1肽是包含一个经由亲水性间隔物附着在C末端氨基酸残基上的清蛋白结合残基和任选的附着在一个其它氨基酸残基上的第二个清蛋白结合残基的GLP-1(A-B)或其类似物，其中A是1-7的整数而B是38-45的整数。

在另一个实施方案中，GLP-1肽与GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)相比包含不超过15个氨基酸残基发生了替代、添加、或删除，或者与GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)相比包含不超过10个氨基酸残基发生了替代、添加、或删除。

在另一个实施方案中，GLP-1肽与GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：1)相比包含不超过6个氨基酸残基发生了替代、添加、或删除。

在另一个实施方案中，GLP-1包含不超过4个不是由遗传密码编码的氨基酸残基。

在另一个实施方案中，GLP-1肽是DPPIV保护的GLP-1肽。

在另一个实施方案中，依照本发明的化合物是DPPIV稳定化的。

在另一个实施方案中，GLP-1肽在第8位包含Aib残基。

在另一个实施方案中，所述GLP-1肽第7位氨基酸残基选自下组：D-组氨酸、脱氨基组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、同组氨酸、N^α-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、和4-吡啶基丙氨酸。

在另一个实施方案中，GLP-1肽选自下组：Arg³⁴GLP-1(7-37)、Lys³⁸Arg^26，34GLP-1(7-38)、Lys³⁸Arg^26，34GLP-1(7-38)-OH、Lys³⁶Arg^26，34GLP-1(7-36)、Aib^8，22，35GLP-1(7-37)、Aib^8，35GLP-1(7-37)、Aib^8，22GLP-1(7-37)、Aib^8，22，35Arg^26，34Lys³⁸GLP-1(7-38)、Aib^8，35Arg^26，34Lys³⁸GLP-1(7-38)、Aib^8，22Arg^26，34Lys³⁸GLP-1(7-38)、Aib^8，22，35Arg^26，34Lys³⁸GLP-1(7-38)、Aib^8，35Arg^26，34Lys³⁸GLP-1(7-38)、Aib^8，22，35Arg²⁶Lys³⁸GLP-1(7-38)、Aib^8，35Arg²⁶Lys³⁸GLP-1(7-38)、Aib^8，22Arg²⁶Lys³⁸GLP-1(7-38)、Aib^8，22，35Arg³⁴Lys³⁸GLP-1(7-38)、Aib^8，35Arg³⁴Lys³⁸GLP-1(7-38)、Aib^8，22Arg³⁴Lys³⁸GLP-1(7-38)、Aib^8，22，35Ala³⁷Lys³⁸GLP-1(7-38)、Aib^8，35Ala³⁷Lys³⁸GLP-1(7-38)、Aib^8，22Ala³⁷Lys³⁸GLP-1(7-38)、Aib^8，22，35Lys³⁷GLP-1(7-37)、Aib^8，35Lys³⁷GLP-1(7-37)、和Aib^8，22Lys³⁷GLP-1(7-38)。

在另一个实施方案中，GLP-1肽经由相应于氨基酸序列SEQ ID NO：1的第23、26、34、36、或38位的氨基酸残基附着在所述亲水性间隔物上。

在另一个实施方案中，GLP-1肽是exendin-4(SEQ ID NO：4)。

在另一个实施方案中，GLP-1肽是ZP-10，即HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-酰胺(SEQ ID NO：5)。

在另一个实施方案中，GLP-1肽是HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGX或其片段或类似物，其中X＝P或Y。

在本发明的另一个实施方案中，GLP-1肽是Arg¹⁸，Leu²⁰，Gln³⁴，Lys³³(N^ε-(γ-氨基丁酰基(N^α-十六酰基)))Exendin-4(7-45)-酰胺或Arg³³，Leu²⁰，Gln³⁴，Lys¹⁸(N^ε-(γ-氨基丁酰基(N^α-十六酰基)))Exendin-4(7-45)-酰胺。

在本发明的另一个实施方案中，一个清蛋白结合残基经由亲水性间隔物附着在GLP-1肽的C末端氨基酸残基上。

在本发明的另一个实施方案中，第二个清蛋白结合残基附着在GLP-1肽中C末端氨基酸残基以外的氨基酸残基上。

在另一个实施方案中，亲脂性取代基通过亲水性间隔物以这样的方式附着到GLP-1肽上，即间隔物的羧基与GLP-1肽的氨基形成酰胺键。

在本发明的另一个实施方案中，化合物选自下组：

N^ε37-(2-(2-(2-(十二基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-[Aib^8，22，35Lys³⁷]GLP-1(7-37)酰胺

N^ε37-(2-(2-(2-(17-磺基十六酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-[Aib^8，22，35，Lys³⁷]GLP-1(7-37)酰胺

N^ε37-{2-[2-(2-(15-羧基十五酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰基}-[Aib^8，22，35，Lys³⁷]GLP-1(7-37)酰胺

N^ε37-(2-(2-(2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[Aib^8，22，35，Lys³⁷]GLP-1(7-37)酰胺

N^ε37-(2-(2-(2-(19-羧基十九酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[Aib^8，22，35，Lys³⁷]GLP-1(7-37)酰胺

[Aib^8，22，35，Arg^26，34]GLP-1(7-37)Lys(4-(十六酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基)-OH

[Aib^8，22，35，Arg^26，34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(十六酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-OH

N^ε37-(2-[2-(2，6-(S)-二-{2-[2-(2-(十二酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}己酰基氨基)乙氧基]乙氧基})乙酰基-[Aib^8，22，35]GLP-1(7-37)酰胺

N^ε37-(2-[2-(2，6-(S)-二-{2-[2-(2-(十四酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}己酰基氨基)乙氧基]乙氧基})乙酰基-[Aib^8，22，35]GLP-1(7-37)酰胺

[Aib^8，22，35，Arg^26，34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(4-(十六酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-OH

[Aib^8，22，35]GLP-1(7-37)Lys((2-{2-[4-[4-(4-氨基-9，10-二氧-3-磺基-9，10-二氢-蒽-1-基氨基)-2-磺基-苯基氨基]-6-(2-磺基-苯基氨基)-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基))酰胺

[Aib^8，22，35]GLP-1(7-37)Lys(({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(15-羧基十五酰基氨基)-乙氧基]乙氧基}乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基))酰胺

N^ε37-([2-(2-{3-[2，5-二氧-3-(15-羧基十五基硫烷基)-吡咯烷-1-基]-丙酰基氨基}乙氧基)乙氧基)乙酰基]-[D-Ala⁸，Lys³⁷]-GLP-1(7-37)酰胺

[Aib^8，22，35Ala³⁷]-GLP-1(7-37)Lys((2-(2-(2-(11-(草酰基氨基)十一酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基-)))酰胺

[Aib^8，22，35，Ala³⁷]-GLP-1(7-37)Lys({2-[2-(2-{2-[2-(2-(15-羧基-十五酰基氨基)-乙氧基]乙氧基}乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基]酰胺

[Aib^8，22，35，Ala³⁷]-GLP-1(7-37)Lys((2-{2-[11-(5-二甲基氨基萘-1-磺酰基氨基)十一酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基)酰胺

[Aib^8，22，35，Ala³⁷]-GLP-1(7-37)Lys(([2-(2-{2-[1-(4-氯苯甲酰基)-5-甲氧基-2-甲基-1H-吲哚-3-基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基))酰胺

[Aib⁸，Arg^26，34，Glu^22，23，30]-GLP-1H(7-37)Lys(2-(2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)酰胺

[Aib⁸，Arg^26，34，Glu^22，23，30]-GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(二十酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)酰胺

[Gly⁸，Arg^26，34]-GLP-1H-(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(十八酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-OH

[Aib⁸，Arg^26，34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-OH

[Aib⁸]-GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(4-(十六酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-OH

[Aib⁸，Arg^26，34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(十八酰基氨基)-4-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-OH

[Aib⁸，Arg^26，34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(17-羧基庚酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-OH

[Gly⁸，Arg^26，34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-OH

[Aib⁸]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(十六酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-OH

N^ε37-(2-(2-(2-(十二酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-[Aib^8，22，35Lys³⁷]GLP-1H(7-37)-酰胺

N^ε37-(2-(2-(2-(十四酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-[Aib^8，22，35Lys³⁷]GLP-1H(7-37)-酰胺

N^ε37-(2-(2-(2-(十六酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-[Aib^8，22，35Lys³⁷]GLP-1(7-37)-酰胺

N^ε37-(2-(2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-[Aib^8，22，35Lys³⁷]GLP-1(7-37)-酰胺

N^ε37-(2-(2-(2-(二十酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-[Aib^8，22，35Lys³⁷]GLP-1(7-37)-酰胺

N^ε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基))-[Aib⁸，Arg^26，34，Lys³⁶]GLP-1(7-37)-OH

N^ε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基))[Arg^26，34，Lys³⁶]GLP-1(7-37)-OH

N^ε36-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-[Gly⁸，Arg^26，34，Lys³⁶]GLP-1(7-37)-OH

N^ε37-(2-(2-(2-(4-4(4，4，5，5，6，6，7，7，8，8，9，9，9-十三氟壬酰基氨磺酰基-丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基))[Aib^8，22，35，Lys³⁷]GLP-1(7-37)-OH

N^ε37-(2-(2-(2-(3，3，4，4，5，5，6，6，7，7，8，8，9，9，10，10，11，11，12，12，12-二十一氟十二基氧基乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[Aib^8，22，35，Lys³⁷]GLP-1(7-37)-OH

N^ε37-(2-(2-(2-(4-(十六酰基氨磺酰基)丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[Aib^8，22，35，Lys³⁷]GLP-1(7-37)-OH

[Arg^26，34]GLP-1(7-37)Lys({2-(2-(2-(2-[2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)})-OH

[Arg^26，34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(十八酰基氨基)-4-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-OH

N^ε20-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(十六酰基氨基)-4-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-exendin(1-39)

[Ala⁸，Arg^26，34]GLP-1(7-37)Lys((2-[2-((2-草酰基氨基-3-羧基-2-4，5，6，7-四氢-苯并[b]噻吩-6-基-乙酰基氨基))乙氧基]乙氧基乙酰基)酰胺

[Aib^8，22，35]GLP-1(7-37)Lys((2-[2-((2-草酰基氨基-3-羧基-2-4，5，6，7-四氢-苯并[b]噻吩-6-基-乙酰基氨基))乙氧基]乙氧基乙酰基)酰胺

N^ε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(十八酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-[Aib⁸，Arg^26，34，Lys³⁶]GLP-1(7-37)-OH

N^ε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(十八酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-[Gly⁸，Arg^26，34，Lys³⁶]GLP-1(7-37)-OH

N^ε37-2-(2-(2-(4-(4-(十七酰基氨基)-4-(S)-羧基丁酰基氨基)-4-(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基-[Aib^8，22，35，Lys³⁷]GLP-1(7-37)-NH₂

N^ε37-2-(2-[2-(2-[2-(4-[4-(十七酰基氨基)-4-(S)羧基丁酰基氨基]-4-(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基-[Aib^8，22，35，Lys³⁷]GLP-1(7-37)-NH₂

N^ε26-(2-(2-(2-(4-(十六酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-[Aib⁸，Arg³⁴]GLP-1(7-37)-OH

N^ε26-2-(2-2-(2-(2-(2-(4-(十八酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基-[Aib⁸，Arg³⁴]GLP-1(7-37)-OH

[Gly⁸，Arg^26，34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(19-(羧基)十九酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-OH

[Gly⁸，Arg^26，34]GLP-1(7-37)Lys((2-(2-(17-(羧基)十七酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基))-OH

[Gly⁸，Arg^26，34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(4-(19-(羧基)十九酰基氨基)-4-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-OH

[Gly⁸，Arg^26，34]GLP-1(7-37)Lys((2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十六酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)-乙酰基)-OH

[Gly⁸，Arg^26，34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基)-乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)NH₂

N^ε20(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(17-(羧基)十七酰基氨基)-4-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[Lys²⁰]exendin-4(1-39)-NH₂

N^ε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[Aib⁸，Arg^26，34，Lys³⁶]GLP-1(7-37)

N^ε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[Arg^26，34，Lys³⁶]GLP-1(7-37)

N^ε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[Gly⁸，Arg^26，34，Lys³⁶]GLP-1(7-37)

N^ε20-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)-乙氧基)乙酰基)[Lys²⁰]Exendin-4(1-39)-酰胺

N^ε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(十八酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-[Arg^26，34，Lys³⁶]GLP-1(7-37)

N^ε26-(2-[2-(2-[2-(2-[2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基)[Arg³⁴]GLP-1(7-37)-OH

N^ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Arg³⁴]GLP-1(7-37)-OH

N^ε20-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基-氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[Lys²⁰]Exendin-4(1-39)-酰胺

[Gly⁸，Glu^22，23，30，Arg^18，26，34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基))乙氧基)乙酰基)-NH₂

[咪唑基丙酸⁷，Asp¹⁶，Aib^22，35]GLP1(7-37)Lys NH((2-{[4-(17-羧基十七酰基氨基)丁基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙氧基))

[咪唑基丙酸⁷，Aib^22，35]GLP1(7-37)Lys NH((2-{[4-(17-羧基十七酰基氨基)丁基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙氧基))

和

[3-(5-咪唑基)丙酰基⁷，Aib⁸，Arg^26，34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(17-羧基庚酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-OH

在另一个实施方案中，治疗性多肽是GLP-2肽。

在另一个实施方案中，GLP-2肽是DPPIV保护的GLP-2肽。

在另一个实施方案中，GLP-2肽是Gly²-GLP-2(1-33)。

在另一个实施方案中，GLP-2肽是Lys¹⁷Arg³⁰-GLP-2(1-33)。

在本发明的另一个实施方案中，治疗性多肽是人胰岛素或其类似物。

在本发明的另一个实施方案中，治疗性多肽选自下组：Asp^B28-人胰岛素、Lys^B28，Pro^B29-人胰岛素、Lys^B3，Glu^B29-人胰岛素、Gly^A21，Arg^B31，Arg^B32-人胰岛素、和des(B30)人胰岛素。

在本发明的另一个实施方案中，治疗性多肽是人生长激素或其类似物。

在本发明的另一个实施方案中，治疗性多肽是甲状旁腺激素或其类似物。

在本发明的另一个实施方案中，治疗性多肽是人促卵泡激素或其类似物。

在本发明的另一个实施方案中，治疗性多肽的摩尔量小于100kDa、小于50kDa、或小于10kDa。

在本发明的另一个实施方案中，治疗性多肽选自下组：生长因子，诸如血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)；生长调节素，诸如胰岛素生长因子I(IGF-I)、胰岛素生长因子II(IFG-II)、红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、或血管生成素；干扰素，尿激酶原，尿激酶，组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)，纤溶酶原激活剂抑制剂1，纤溶酶原激活剂抑制剂2，血管假性血发病因子；细胞因子，例如白介素(IL)诸如IL-1、IL-1Ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-20、或IL-21，集落刺激因子(CFS)诸如GM-CSF，干细胞因子，肿瘤坏死因子诸如TNF-α，淋巴毒素-α，淋巴毒素-β，CD40L，或CD30L；蛋白酶抑制剂，例如抑酶肽；酶，诸如超氧化物歧化酶、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶、核糖核酸酶、过氧化氢酶、尿酸酶、胆红素氧化酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性磷酸酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、嘌呤核苷磷酸化酶、或巴曲酶；阿片样物质，例如内啡肽、脑啡肽、或非天然阿片样物质；激素或神经肽，例如降钙素、胰高血糖素、促胃液素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、缩胆囊素、促黄体素、促性腺激素释放激素、绒毛膜促性腺激素、促肾上腺皮质激素释放因子、加压素、催产素、抗利尿激素、促甲状腺激素、促甲状腺素释放激素、松弛素、催乳素、YY肽、Y神经肽、胰多肽、瘦素、CART(受可卡因和苯丙胺调节的转录本)、CART相关肽、脂滴相关蛋白、黑皮质素(促黑激素)诸如MC-4、黑色素浓集激素、钠尿肽、肾上腺髓质素、内皮素、胰泌素、糊精、血管活性肠肽(VIP)、可激活垂体腺苷酸环化酶的多肽(PACAP)、铃蟾肽、铃蟾肽样肽、胸腺素、肝素结合蛋白、可溶性CD4、下丘脑释放因子(hypothalmicreleasing factor)、褪黑素(melanotonin)及其类似物。

另一方面，本发明涉及包含依照本发明的化合物以及制药学可接受赋形剂的药物组合物。

在一个实施方案中，药物组合物适于肠胃外施用。

另一方面，本发明涉及依照本发明的化合物用于制备药物的用途。

在本发明的一个实施方案中，将依照本发明的化合物(其中治疗性多肽是GLP-1肽)用于制备治疗或预防高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐受不良、1型糖尿病、肥胖、高血压、X综合征、血脂异常、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管病、中风、炎性肠综合征(inflammatory bowel syndrome)、消化不良、和胃溃疡的药物。

在本发明的另一个实施方案中，将依照本发明的化合物(其中治疗性多肽是GLP-1肽)用于制备延迟或预防2型糖尿病疾病发展的药物。

在本发明的另一个实施方案中，将依照本发明的化合物(其中治疗性多肽是GLP-1肽)用于制备减少食物摄入、降低β-细胞凋亡、提高β-细胞功能和β-细胞质量、和/或恢复β-细胞葡萄糖敏感性的药物。

在本发明的另一个实施方案中，将依照本发明的化合物(其中治疗性多肽是GLP-2肽)用于制备治疗小肠综合征(small bowelsyndrome)、炎性肠综合征、或克罗恩病的药物。

在本发明的另一个实施方案中，将依照本发明的化合物(其中治疗性多肽是胰岛素肽)用于制备治疗或预防高血糖症、1型糖尿病、2型糖尿病、或β-细胞缺乏的药物。

可以通过包括以下步骤的方法来生产治疗性多肽：在合适营养培养基中在容许肽表达的条件下培养包含编码多肽的DNA序列且能够表达该多肽的宿主细胞，然后由培养液回收由此产生的肽。

用于培养细胞的培养基可以是适于培养宿主细胞的任何常规培养基，诸如含有适当补充物的基本或复合培养基。合适的培养基可以由供应商处购买，或者可以依照发表的处方自行配制(例如美国典型培养物收藏中心的目录)。然后可以通过常规流程由培养液回收由细胞生成的肽，包括通过离心或过滤将细胞与培养液分开，借助盐(例如硫酸铵)沉淀上清液或滤出液中的蛋白质性质成分，根据目的肽的类型，通过多种层析流程进行纯化，例如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等等。

适宜的是，编码治疗性多肽的DNA序列可以是源自基因组或cDNA，例如如下得到的DNA序列，即依照标准技术构建基因组或cDNA文库，并使用合成寡核苷酸探针通过杂交筛选编码整个或部分多肽的DNA序列(见例如Sambrook，J.、Fritsch，E.F.、和Maniatis，T.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，冷泉港实验室出版社，纽约，1989)。还可以使用已经建立的标准方法通过人工合成制备编码多肽的DNA序列，例如Beaucage和Caruthers，Tetrahedron Letters 22：1859-1869，1981描述的磷亚酰胺法或Matthes等，EMBO Journal 3：801-805，1984描述的方法。还可以使用特异引物通过聚合酶链式反应来制备DNA序列，例如如US 4,683,202或Saiki等，Science 239：487-491，1988中所述。

可以将DNA序列插入可以方便进行重组DNA操作的任何载体，载体的选择常常取决于它将导入的宿主细胞。由此，载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，它的复制不依赖染色体复制，例如质粒。或者，载体可以是在导入宿主细胞后整合到宿主细胞基因组中并与它所整合的染色体一起复制的载体。

载体优选其中编码肽的DNA序列与DNA转录所必需的额外区段(诸如启动子)可操作相连的表达载体。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，而且可以衍生自编码对于宿主细胞而言的同源或异源蛋白质的基因。适于在多种宿主细胞中指导编码本发明肽的DNA转录的启动子的实例在本领域是众所周知的，见例如Sambrook等，同上。

如果需要，编码肽的DNA序列还可以可操作连接合适的终止子、多聚腺苷酸化信号、转录增强子序列、和翻译增强子序列。本发明的重组载体还可以包含使得载体能够在所研究的宿主细胞中复制的DNA序列。

载体还可以包含选择标记，例如其产物补足宿主细胞缺陷的基因，或者赋予药物抗性的基因，例如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素、或甲氨蝶呤。

为了引导本发明的亲本肽进入宿主细胞的分泌途径，可以在重组载体中提供分泌信号序列(也称为前导序列、前原序列(preprosequence)、或前序列(pre sequence))。将分泌信号序列与编码肽的DNA序列以正确读码框相连接。分泌信号序列通常位于编码肽的DNA序列的5′端。分泌信号序列可以是通常就与肽相连的，或者可以是来自编码另一种分泌性蛋白质的基因。

本领域技术人员熟知用于分别连接编码本发明肽的DNA序列、启动子、和任选的终止子和/或分泌信号序列以及将它们插入包含复制所必需的信息的合适载体的程序(见例如Sambrook等，同上)。

将要导入DNA序列或重组载体的宿主细胞可以是能够生成本发明肽的任何细胞，包括细菌、酵母、真菌、和高等真核细胞。本领域熟知且使用的合适宿主细胞的实例包括但不限于大肠杆菌、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、或哺乳动物的BHK或CHO细胞系。

可用作依照本发明的GLP-1部分(moiety)的化合物的实例见国际专利申请号WO 87/06941(The General Hospital Corporation)，它涉及包含GLP-1(7-37)及其功能衍生物的肽片段，而且涉及它作为促胰岛素剂的用途。

其它GLP-1类似物见国际专利申请号WO 90/11296(The GeneralHospital Corporation)，它涉及包含GLP-1(7-36)及其功能衍生物且所具有的促胰岛素活性超越GLP-1(1-36)或GLP-1(1-37)的促胰岛素活性的肽片段，而且涉及它作为促胰岛素剂的用途。

国际专利申请号WO 91/11457(Buckley等)公布了也可用作依照本发明的GLP-1部分(moiety)的活性GLP-1肽7-34、7-35、7-36、和7-37的类似物。

药物组合物

可以通过常规技术来制备含有依照本发明的化合物的药物组合物，例如如Remington′s Pharmaceutical Sciences，1985或Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995所述。

本发明的一个目的是提供包含以约0.1至25mg/ml浓度存在的依照本发明的化合物的药物制剂，且其中所述制剂的pH是2.0至10.0。药物制剂可以包含以约0.1至50mg/ml浓度存在的依照本发明的化合物，且其中所述制剂的pH是2.0至10.0。制剂还可以包含缓冲系统、防腐剂、等渗剂、螯合剂、稳定剂、和表面活性剂。在本发明的一个实施方案中，药物组合物是水性制剂，即含有水的制剂。这种制剂典型的是溶液或悬浮液。在本发明的另一个实施方案中，药物制剂是水性溶液。术语“水性制剂”定义为至少含有50％w/w水的制剂。同样，术语“水性溶液”定义为至少含有50％w/w水的溶液，而术语“水性悬浮液”定义为至少含有50％w/w水的悬浮液。

在另一个实施方案中，药物制剂是使用前需要医师或患者向其中加入溶剂和/或稀释剂的冻干制剂。

在另一个实施方案中，药物制剂是无需预先溶解即可使用的干制剂(例如冻干或喷雾干燥)。

在另一个方面，本发明涉及包含依照本发明的化合物的水性溶液以及缓冲剂的药物制剂，其中所述化合物以0.1mg/ml或更高的浓度存在，且所述制剂的pH是约2.0至约10.0。

在另一个方面，本发明涉及包含依照本发明的化合物的水性溶液和缓冲剂的药物制剂，其中所述化合物以0.1mg/ml或更高的浓度存在，且其中所述制剂的pH是约7.0至约8.5。

在本发明的另一个实施方案中，制剂的pH选自下组：2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、和10.0。优选的是，制剂的pH与依照本发明的化合物的等电点相差至少一个pH单位，甚至更优选相差至少两个pH单位。

在本发明的另一个实施方案中，缓冲剂选自下组：乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、三(羟甲基)-氨基甲烷、hepes、N-二(羟乙基)甘氨酸、N(羟甲基)甲基甘氨酸、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸、或其混合物。这些具体缓冲剂的每一种构成本发明的一个替换实施方案。

在本发明的另一个实施方案中，制剂还包含制药学可接受防腐剂。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂选自下组：苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯乙醇、苄醇、乙醇、氯丁醇、硫柳汞、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪脲、氯己定(chlorohexidine)、脱氢乙酸钠、氯甲酚、对羟基苯甲酸乙酯、苄索氯铵、chlorphenesine(3-对氯苯氧基丙烷-1，2-二醇)、或其混合物。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂的浓度是0.1mg/ml至30mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂的浓度是0.1mg/ml至20mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂的浓度是0.1mg/ml至5mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂的浓度是5mg/ml至10mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂的浓度是10mg/ml至20mg/ml。这些具体防腐剂的每一种构成本发明的一个替换实施方案。技术人员熟知防腐剂在药物组合物中的用途。有用的参考书是Remington：The Science and Practice ofPharmacy，第19版，1995。

在本发明的另一个实施方案中，制剂还包含等渗剂(isotonicagent)。在本发明的另一个实施方案中，等渗剂选自下组：盐(例如氯化钠)、糖或糖醇、氨基酸(例如L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)、醛醇(例如甘油、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，3-丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)、或其混合物。可以使用任何糖，诸如单糖、二糖、或多糖，或者是水溶性聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、环糊精、可溶淀粉、羟乙基淀粉、和羧甲基纤维素钠。在一个实施方案中，糖添加剂是蔗糖。糖醇定义为具有至少一个-OH基团的C4-C8烃，包括例如甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇、和阿拉伯糖醇。在一个实施方案中，糖醇添加剂是甘露醇。可以单独或联合使用上文所述糖或糖醇。对于用量没有固定的限制，只要糖或糖醇在液体制剂中可溶解，而且对使用本发明方法实现的稳定作用没有不利影响。在一个实施方案中，糖或糖醇的浓度是约1mg/ml至约150mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，等渗剂的浓度是1mg/ml至50mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，等渗剂的浓度是1mg/ml至7mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，等渗剂的浓度是8mg/ml至24mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，等渗剂的浓度是25mg/ml至50mg/ml。这些具体等渗剂的每一种构成本发明的一个替换实施方案。技术人员熟知等渗剂在药物组合物中的用途。有用的参考书是Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy，第19版，1995。

在本发明的另一个实施方案中，制剂还包含螯合剂。在本发明的另一个实施方案中，螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸、和天冬氨酸的盐及其混合物。在本发明的另一个实施方案中，螯合剂的浓度是0.1mg/ml至5mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，螯合剂的浓度是0.1mg/ml至2mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，螯合剂的浓度是2mg/ml至5mg/ml。这些具体螯合剂的每一种构成本发明的一个替换实施方案。技术人员熟知螯合剂在药物组合物中的用途。有用的参考书是Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。

在本发明的另一个实施方案中，制剂还包含稳定剂。技术人员熟知稳定剂在药物组合物中的用途。有用的参考书是Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，第19版，1995。

更具体的说，本发明的组合物是稳定的液体药物组合物，其治疗活性成分包括在以液体药物制剂的形式贮藏的过程中可能形成聚集体的多肽。“形成聚集体”意指多肽分子之间导致寡聚体(可能保持可溶性)或大型可见聚集体(由溶液中沉淀出来)形成的物理相互作用。“贮藏过程中”意指液体药物组合物或制剂在配制后没有立即施用于受试者。相反，配制后，将其包装以便贮藏，采取液体形式、冻结状态、或干燥形式(稍后重构成液体形式或适于施用于受试者的其它形式)。“干燥形式”意指通过冷冻干燥(即冻干法：见例如Williams和Polli，J.Parenteral Sci.Technol.38：48-59，1984)、喷雾干燥(见Masters，1991，在Spray-Drying Handbook一书中，第5版，Longman Scientific and Technical，Essez，英国，第491-676页；Broadhead等，Drug Devel.Ind.Pharm.18：1169-1206，1992；以及Mumenthaler等，Pharm.Res.11：12-20，1994)、或空气干燥(Carpenter和Crowe，Cryobiology 25：459-470，1988；以及Roser，Biopharm.4：47-53，1991)将液体药物组合物或制剂干燥。在液体药物组合物的贮藏过程中由多肽形成聚集体可能对该多肽的生物学活性产生不利影响，导致药物组合物的治疗功效损失。另外，聚集体的形成可能引起其它问题，诸如在使用输注系统施用含有多肽的药物组合物时阻塞管道、膜、或泵。

本发明的药物组合物还可以包含其数量足以减少组合物的贮藏过程中由多肽形成聚集体的氨基酸碱。“氨基酸碱”意指氨基酸或其组合，其中任何指定氨基酸以其游离碱的形式或以其盐的形式存在。在使用氨基酸组合时，可以是所有氨基酸都以它们游离碱的形式存在，可以是所有氨基酸都以它们盐的形式存在，或者一些以它们游离碱的形式存在而另一些以它们盐的形式存在。在一个实施方案中，制备本发明组合物时使用的氨基酸是携带带电荷侧链的氨基酸，诸如精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、和谷氨酸。在一个实施方案中，用于制备本发明组合物的氨基酸是甘氨酸。本发明的药物组合物中可以存在特定氨基酸(例如甲硫氨酸、组氨酸、咪唑、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸、及其混合物)的任何立体异构体(即L或D)或其组合，只要特定氨基酸以其游离碱的形式或其盐的形式存在。在一个实施方案中，使用L-立体异构体。还可以用这些氨基酸的类似物来配制本发明的组合物。“氨基酸类似物”意指天然存在氨基酸的衍生物，它带来了减少本发明液体药物组合物的贮藏过程中由多肽形成聚集体的期望效果。合适的精氨酸类似物包括例如氨基胍、鸟氨酸、和N-单乙基L-精氨酸，合适的甲硫氨酸类似物包括乙硫氨酸和丁硫氨酸，而合适的半胱氨酸类似物包括S-甲基L-半胱氨酸。对于其它氨基酸，以其游离碱的形式或其盐的形式将氨基酸类似物掺入组合物。在本发明的另一个实施方案中，以足以预防或延迟蛋白质聚集的浓度使用氨基酸或其类似物。

在本发明的另一个实施方案中，当担当治疗剂的多肽是包含至少一个甲硫氨酸残基而易受下述氧化影响的多肽时，可以添加甲硫氨酸(或其它含硫氨基酸或其类似物)来抑制甲硫氨酸残基氧化变成甲硫氨酸亚砜。“抑制”意指甲硫氨酸氧化产物随时间的最小积累。抑制甲硫氨酸氧化导致多肽更持久的保持其正确的分子形式。可以使用甲硫氨酸的任何立体异构体(L、D、或其混合物)。添加的数量应当足以抑制甲硫氨酸残基的氧化，使得甲硫氨酸亚砜的数量是管理机构可以接受的。通常，这意味着组合物包含不超过约10％至约30％的甲硫氨酸亚砜。通常，这可以通过以约1∶1至约1000∶1诸如约10∶1至约100∶1的外加甲硫氨酸对甲硫氨酸残基的比率添加甲硫氨酸来实现。

在本发明的另一个实施方案中，制剂还包含选自下组的稳定剂：高分子量聚合物或低分子化合物。在本发明的另一个实施方案中，稳定剂选自：聚乙二醇(例如PEG3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/羟基纤维素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL、HPC-L、和HPMC)、环糊精、含硫物质(如单硫甘油、硫代乙醇酸、和2-甲基硫代乙醇)、和不同的盐(例如氯化钠)。这些具体稳定剂的每一种构成本发明的一个替换实施方案。

药物组合物还可以包含进一步增强其中治疗活性多肽的稳定性的额外稳定剂。本发明特别感兴趣的稳定剂包括但不限于保护多肽免于甲硫氨酸氧化的甲硫氨酸和EDTA，以及保护多肽免于冻融或机械剪切相关聚集的非离子表面活性剂。

在本发明的另一个实施方案中，制剂还包含表面活性剂。在本发明的另一个实施方案中，表面活性剂选自去污剂、乙氧基化蓖麻油、聚乙二醇化(polyglycolyzed)甘油酯、乙酰化甘油单酯、山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物(例如泊洛沙姆，诸如

F68、泊洛沙姆188和407、Triton X-100)、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、星形PEO、聚氧乙烯和聚乙烯衍生物诸如烷基化和烷氧基化衍生物(吐温，例如吐温-20、吐温-40、吐温-80、和Brij-35)、聚氧乙烯羟基硬脂酸酯、甘油单酯或其乙氧基化衍生物、甘油二酯或其聚氧乙烯衍生物、醇、甘油、凝集素、磷脂(例如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、二磷脂酰甘油、和鞘磷脂)、磷脂的衍生物(例如二棕榈酰磷脂酸)和溶血磷脂的衍生物(例如棕榈酰溶血磷脂酰-L-丝氨酸和乙醇胺、胆碱、丝氨酸、或苏氨酸的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酯)、溶血磷脂酰和磷脂酰胆碱的烷基、烷氧基(烷酯)、烷氧(烷醚)衍生物(例如溶血磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱的月桂酰和肉豆蔻酰衍生物)、极性首基(即胆碱、乙醇胺、磷脂酸、丝氨酸、苏氨酸、甘油、肌醇)和带正电荷的DODAC、DOTMA、DCP、BISHOP的修饰、溶血磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰苏氨酸、甘油磷脂(例如脑磷脂)、甘油糖脂(例如吡喃型半乳糖苷脂)、鞘糖脂(例如神经酰胺、神经节苷脂)、十二基磷酸胆碱、鸡卵溶血卵磷脂、梭链孢酸衍生物(例如牛磺-二氢梭链孢酸钠等)、C6-C12的长链脂肪酸及其盐(例如油酸和辛酸)、酰基肉碱及其衍生物、赖氨酸、精氨酸、或组氨酸的N^α-酰化衍生物、赖氨酸或精氨酸的侧链酰化衍生物、包含赖氨酸、精氨酸、或组氨酸与中性或酸性氨基酸的任意组合的二肽的N^α-酰化衍生物、包含中性氨基酸与两个带电荷氨基酸的任意组合的三肽的N^α-酰化衍生物、DSS(多库酯钠，CAS注册号[577-11-7]；多库酯钙，CAS注册号[128-49-4]；多库酯钾，CAS注册号[7491-09-0])、SDS(十二烷基硫酸钠或月桂基硫酸钠)、辛酸钠、胆酸或其衍生物、胆汁酸及其盐、甘氨酸或牛磺酸缀合物、熊去氧胆酸、胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘胆酸钠、N-十六烷基-N，N-二甲基-3-铵-1-丙烷磺酸盐、阴离子单价表面活性剂(烷基-酰基-磺酸盐)、两性离子表面活性剂(例如N-烷基-N，N-二甲基铵-1-丙烷磺酸盐、3-胆胺基-1-丙基二甲基铵-1-丙烷磺酸盐)、阳离子表面活性剂(季铵碱)(例如鲸蜡基-三甲基溴化铵、鲸蜡基吡啶鎓氯化物)、非离子表面活性剂(例如十二烷基β-D-吡喃型葡萄糖苷)、poloxamine(即通过向乙二胺连续添加氧化丙烯和氧化乙烯衍生的四功能嵌段共聚物)(例如Tetronic)、咪唑啉衍生物、或其化合物。这些具体表面活性剂的每一种构成本发明的一个替换实施方案。

技术人员熟知表面活性剂在药物组合物中的用途。有用的参考书是Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。

可以如例如WO 03/002136中所述制备用于肠胃外施用GLP-1化合物的组合物。

可能的是，本发明的肽药物制剂中还存在其它成分。这些额外成分可以包括润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、渗透压调节剂、螯合剂、金属离子、油质媒介、蛋白质(例如人血清清蛋白、明胶、或蛋白质)、和两性离子(例如氨基酸，诸如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、和组氨酸)。这些额外成分当然不应当对本发明药物制剂的总体稳定性产生不利影响。

可以在数个部位对需要这种治疗的患者施用含有依照本发明的化合物的药物组合物，例如局部部位(例如皮肤和粘膜部位)、绕过吸收的部位(例如在动脉、静脉、心脏中施用)、和牵涉吸收的部位(例如在皮肤中、在皮肤下面、在肌肉中、或在腹部施用)。

可以通过数种施用路径对需要这种治疗的患者施用依照本发明的药物组合物，例如舌、舌下、口腔、口中、口服、胃和肠中、鼻、肺(例如通过细支气管和肺泡或其联合)、表皮、真皮、透皮、阴道、直肠、眼(例如通过结膜)、输尿管、和肠胃外。

可以以数种剂型来施用本发明的组合物，例如溶液、悬浮液、乳液、微乳液、复合乳液、泡沫、软膏、糊剂、膏药、药膏、片剂、包衣片、洗液、胶囊(例如硬明胶胶囊和软明胶胶囊)、栓剂、直肠胶囊、滴剂、凝胶、喷雾剂、粉剂、气雾剂、吸入剂、滴眼液、眼膏、洗眼液、阴道栓、阴道环、阴道药膏、注射液、原位转变液(例如原位胶凝、原位安装、原位沉淀、原位结晶)、输液、和植入物。

还可以将本发明的组合物复合或附着(例如通过共价、疏水、和静电相互作用)药物载体、药物投递系统、和高级药物投递系统，从而进一步提高化合物的稳定性、提高生物利用度、提高溶解度、降低不利作用、完成本领域技术人员熟知的计时疗法、和提高患者依从性或其任何组合。载体、药物投递系统、和高级药物投递系统的实例包括但不限于聚合物(例如纤维素及其衍生物)、多糖(例如葡聚糖及其衍生物、淀粉及其衍生物)、聚乙烯醇、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸及其嵌段共聚物、聚乙二醇、载体蛋白(例如清蛋白)、凝胶(例如热胶凝系统，例如本领域技术人员众所周知的嵌段共聚合系统)、胶束、脂质体、微球体、纳米颗粒、液晶及其分散体、L2相及其分散体(本领域技术人员熟知它在脂-水体系中的相特性)、聚合胶束、复合乳液、自身乳化、自身微乳化、环糊精及其衍生物、以及树状分子(dendrimer)。

本发明的组合物可用于配制用于肺部施用化合物的固体、半固体、粉末、和溶液，例如使用计量药剂吸入器、地粉吸入器、和喷雾器，这些都是本领域技术人员众所周知的装置。

本发明的组合物具体可用于配制受控、持续、延长、延迟、和缓慢药物投递系统。更具体的说，而非限制，组合物可用于配制本领域技术人员众所周知的肠胃外受控释放和持续释放系统(这两种系统都导致施用次数减少许多倍)。甚至更优选的是皮下施用的受控释放和持续释放系统。并非限制本发明的范围，有用的受控释放系统和组合物的实例是水凝胶、油质凝胶、液晶、聚合胶束、微球体、纳米颗粒。

用于生产对本发明组合物有用的受控释放系统的方法包括但不限于结晶、浓缩、共结晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高压匀浆、封装、喷雾干燥、微囊化、凝聚、相分离、溶剂蒸发以生成微球体、挤压、和超临界流体过程。一般参考书有Handbook of PharmaceuticalControlled Release，Wise，D.L.编，Marcel Dekker，纽约，2000；以及Drug and the Pharmaceutical Sciences，第99卷，ProteinFormulation and Delivery，MacNally，E.J.编，Marcel Dekker，纽约，2000。

可以借助注射器(任选笔样注射器)的手段通过皮下、肌肉内、腹膜内、或静脉内注射进行肠胃外施用。或者，可以借助输液泵的手段进行肠胃外施用。另一种选择是这样的组合物，它可以是以鼻或肺喷雾的形式施用依照本发明的化合物的溶液或悬浮液。还有一种选择是，还可以使含有本发明化合物的药物组合物适用于经皮施用(例如通过无针注射或贴剂，任选离子电渗贴剂)或经粘膜施用(例如口腔)。

术语“稳定的制剂”指物理稳定性提高、化学稳定性提高、或物理和化学稳定性提高的制剂。

术语“物理稳定性”在本文中用于蛋白质制剂时指作为蛋白质暴露于热-机械压力和/或与去稳定的界面和表面(诸如疏水表面和界面)相互作用的结果，蛋白质形成生物学无活性和/或不溶性的蛋白质聚集体的趋势。可以通过如下手段评估水性蛋白质制剂的物理稳定性：将装入合适的容器(例如药筒或药瓶)的制剂在不同温度下暴露于机械/物理压力(例如摇动)达不同时间后进行视觉检查和/或混浊度测量。对制剂的视觉检查是在黑暗背景下在强烈聚焦灯光下进行的。制剂的混浊度表现为将混浊程度分级的视觉评分，例如由0至3的等级(不显示混浊的制剂对应于视觉评分0，而在日光中显示可见混浊的制剂对应于视觉评分3)。当制剂在日光下显示可见混浊时，将其归类为在蛋白质聚集方面是物理不稳定的。或者，可以通过本领域技术人员众所周知的简单的混浊度测量方法来评估制剂的混浊度。还可以使用蛋白质构象状态的光谱试剂或探针来评估水性蛋白质制剂的物理稳定性。探针优选优先与蛋白质的非天然异构体结合的小分子。蛋白质结构的小分子光谱探针的一个实例是硫黄素(Thioflavin)T。硫黄素T是广泛用于检测淀粉样纤丝的荧光染料。在存在纤丝以及可能有其它蛋白质构型时，硫黄素T在与纤丝蛋白质形式结合后在约450nm处产生新的最大激发并在约482nm处产生增强的发射。未结合的硫黄素T本质上在这些波长没有荧光。

其它小分子可以用作由天然状态变成非天然状态的蛋白质结构变化的探针，例如优先与蛋白质暴露的疏水斑结合的“疏水斑”探针。疏水斑通常埋藏在处于其天然状态的蛋白质的三级结构之中，但是在蛋白质开始去折叠或变性时成为暴露的。这些小分子光谱探针的实例是芳香族、疏水性染料，诸如antrhacene、吖啶、菲咯啉、诸如此类。其它光谱探针有金属-氨基酸复合物，诸如疏水氨基酸(诸如苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、和缬氨酸等等)的钴金属复合物。

术语“化学稳定性”在本文中用于蛋白质制剂时指蛋白质结构中导致化学降解产物形成的化学共价变化，与天然蛋白质结构相比所述化学降解产物的生物学效力可能降低和/或免疫原性可能升高。根据天然蛋白质的类型和本质以及蛋白质所暴露的环境，可能形成多种化学降解产物。正如本领域技术人员众所周知的，几乎不可能完全避免或消除化学降解，而且在蛋白质制剂的贮藏和使用过程中常常看到化学降解产物的数量增加。大多数蛋白质倾向于脱酰胺，在这个过程中谷氨酰胺酰或天冬酰胺酰残基的侧链酰胺基团水解而形成游离的羧酸。其它降解途径涉及高分子量转化产物的形成，其中两个或多个蛋白质分子通过转酰胺基作用和/或二硫键作用彼此共价结合，导致共价结合二聚体、寡聚体、和多聚体降解产物的形成(Stability of ProteinPharmaceuticals，Ahern T.J.和Manning M.C.，Plenum出版社，纽约，1992)。(例如甲硫氨酸残基的)氧化是化学降解的另一种变型。可以通过在暴露于不同环境条件后的多个时间点测量化学降解产物的数量来评估蛋白质制剂的化学稳定性(常常可以通过例如提高温度来加速降解产物的形成)。常常通过根据分子量和/或电荷使用多种层析技术(例如SEC-HPLC和/或RP-HPLC)分离降解产物来测定每一种降解产物的数量。

因此，如上所述，“稳定的制剂”指物理稳定性提高、化学稳定性提高、或物理和化学稳定性提高的制剂。一般而言，制剂在使用和贮藏过程中必需是稳定的(依照推荐的使用和贮藏条件)，直至有效期满。

在本发明的一个实施方案中，包含依照本发明的化合物的药物制剂对于超过6周的使用和超过3年的贮藏是稳定的。

在本发明的另一个实施方案中，包含依照本发明的化合物的药物制剂对于超过4周的使用和超过3年的贮藏是稳定的。

在本发明的另一个实施方案中，包含依照本发明的化合物的药物制剂对于超过4周的使用和超过2年的贮藏是稳定的。

在本发明的还有一个实施方案中，包含依照本发明的化合物的药物制剂对于超过2周的使用和超过2年的贮藏是稳定的。

可以对需要这种治疗的患者肠胃外施用包含依照本发明的GLP-1衍生物的药物组合物。可以借助注射器(任选笔样注射器)的手段通过皮下、肌肉内、或静脉内注射进行肠胃外施用。或者，可以借助输液泵的手段进行肠胃外施用。另一种选择是这样的组合物，它可以是以鼻或肺喷雾的形式施用GLP-1衍生物的粉末或悬浮液。还有一种选择是，还可以经皮(例如贴剂，任选离子电渗贴剂)或经粘膜(例如口腔)施用本发明的GLP-1衍生物。

由此，可以使用制药工业的常规技术来制备本发明的GLP-1衍生物的可注射组合物，它涉及将适合的成分溶解和混合以产生期望的最终产品。

依照一种程序，将GLP-1衍生物溶于数量小于待制备组合物最终体积的水。根据需要添加等渗剂、防腐剂、和缓冲剂。如果需要，根据需要用酸(例如盐酸)或碱(例如氢氧化钠水溶液)调节溶液的pH。最后，用水调整溶液的体积，达到成分的期望浓度。

除了上述成分以外，含有依照本发明的GLP-1衍生物的溶液还可以含有表面活性剂以提高GLP-1衍生物的溶解度和/或稳定性。

例如，可以如欧洲专利号272097(授予Novo Nordisk A/S)或WO 93/18785中所述制备用于鼻内施用某些肽的组合物。

依照本发明的一个优选实施方案，以适于通过注射进行施用的组合物的形式提供GLP-1衍生物。这种组合物可以是即用型注射液，或者可以是必需在注射前溶于溶剂的一定量固体组合物(例如冻干产品)。优选的是，注射液所含有的GLP-1衍生物不少于约2mg/ml、优选不少于约5mg/ml、更优选不少于约10mg/ml，而且优选的是，不超过约100mg/ml。

本发明的GLP-1衍生物可用于治疗多种疾病。将使用的具体GLP-1衍生物和用于任何患者的最佳剂量水平将取决于待治疗的疾病和多种因素，包括所采用具体肽衍生物的功效、患者的年龄、体重、身体活性、和饮食、与其它药物的可能组合、以及病例的严重程度。推荐的是，由本领域技术人员为每位患者个体确定本发明GLP-1衍生物的剂量。

具体而言，设想GLP-1衍生物将可用于制备具有延长作用特性的药物，用于治疗非胰岛素依赖性糖尿病和/或用于治疗肥胖。

在一个实施方案中，本发明涉及依照本发明的化合物用于制备治疗高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐受不良、1型糖尿病、肥胖、高血压、X综合征、血脂异常、β-细胞凋亡、β-细胞缺乏、心肌梗塞、炎性肠综合征、消化不良、认知障碍(例如认知增强)、神经保护、动脉粥样硬化、冠心病和其它心血管病的药物的用途。

在另一个实施方案中，本发明涉及依照本发明的化合物用于制备治疗小肠综合征、炎性肠综合征、或克罗恩病的药物的用途。

在另一个实施方案中，本发明涉及依照本发明的化合物用于制备治疗高血糖症、1型糖尿病、2型糖尿病、或β-细胞缺乏的药物的用途。

使用依照本发明的化合物进行的治疗还可以联合第二种或多种制药学活性物质，例如选自：抗糖尿病药、减肥药、食欲调节药、抗高血压药、用于治疗和/或预防由糖尿病引起的或与其有关的并发症的药物、以及用于治疗和/或预防由肥胖引起的或与其有关的并发症和紊乱的药物。在本文中，表述“抗糖尿病药”包括用于治疗和/或预防胰岛素耐受和其中胰岛素耐受作为病理生理学机制的疾病的化合物。

这些制药学活性物质的实例有：胰岛素、GLP-1拮抗剂、磺酰脲(例如甲苯磺丁脲、格列本脲、格列吡嗪、和格列奇特)、双胍(例如二甲双胍)、氯茴苯酸、葡糖苷酶抑制剂(例如acorbose)、胰高血糖素拮抗剂、DPP-IV(二肽酰肽酶-IV)抑制剂、参与刺激葡糖异生和/或糖原分解的肝酶的抑制剂、葡萄糖摄取调控物、噻唑烷二酮(诸如曲格列酮和环格列酮)、改变脂质代谢的化合物(诸如抗高脂血症药，像HMG CoA抑制剂(他汀))、减少食物摄入的化合物、RXR激动剂、以及作用于β-细胞ATP依赖性钾通道的药物(例如格列本脲、格列吡嗪、格列奇特、和瑞格列奈)；考来烯胺、考来替泊、氯贝丁酯、吉非贝齐、洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、普罗布考、右旋甲状腺素、neteglinide、瑞格列奈；β-阻断药(诸如阿普洛尔、阿替洛尔、噻吗洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔、和美托洛尔)、ACE(血管紧张素转变酶)抑制剂(诸如贝那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、alatriopril、喹那普利、和雷米普利)、钙通道阻断药(诸如硝苯地平、非洛地平、尼卡地平、依拉地平、尼莫地平、地尔硫卓、和维拉帕米)、以及α-阻断药(诸如多沙唑嗪、乌拉地尔、哌唑嗪、和特拉唑嗪)；CART(受可卡因和苯丙胺调节的转录本)激动剂、NPY(神经肽Y)拮抗剂、MC4(黑皮质素4)激动剂、阿立新拮抗剂、TNF(肿瘤坏死因子)激动剂、CRF(促肾上腺皮质激素释放因子)激动剂、CRF BP(促肾上腺皮质激素释放因子结合蛋白)拮抗剂、尿皮质醇激动剂、β3激动剂、MSH(促黑激素)激动剂、MCH(黑色素细胞浓集激素)拮抗剂、CCK(缩胆囊素)激动剂、血清素再摄取抑制剂、血清素和去甲肾上腺素再摄取抑制剂、混合血清素和去甲肾上腺素能化合物、5HT(血清素)激动剂、铃蟾肽激动剂、神经节肽拮抗剂、生长激素、生长激素释放化合物、TRH(促甲状腺激素释放激素)激动剂、UCP 2或3(解偶联蛋白2或3)调控剂、瘦素激动剂、DA激动剂(溴隐亭、doprexin)、脂肪酶/淀粉酶抑制剂、RXR(类维生素A X受体)调控剂、TR β激动剂；组胺H3拮抗剂。

应当理解，依照本发明的化合物与一种或多种上文所述化合物以及任选的一种或多种其它制药学活性物质的任何合适组合认为是属于本发明的范围之内。

下面的实施例将进一步例示本发明，但是不应将其解释为对保护范围的限制。上面的描述和下面的实施例中公布的特色(无论是分开的，或者是以其任何组合)对于认识本发明的不同形式都是重要的。

实施例

对商业性化学试剂使用下列首字母缩写：

DMF：N，N-二甲基甲酰胺

DCC：N，N-二环己基碳二亚胺

NMP：N-甲基-2-吡咯烷酮

TFA：三氟乙酸

THF：四氢呋喃

DIEA：二异丙基乙胺

H₂O：水

CH₃CN：乙腈

HBTU：2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐

Fmoc：9H-芴-9-基甲氧基羰基

Boc：叔丁氧基羰基

OtBu：叔丁酯

tBu：叔丁基

Trt：三苯基甲基

Pmc：2，2，5，7，8-五甲基-苯并二氢吡喃-6-磺酰基

Dde：1-(4，4-二甲基-2，6-二氧环亚己基)乙基

DCM：二氯甲烷

TIS：三异丙基硅烷

Et₂O：二乙醚

H-Glu(OH)-OBu^t：L-谷氨酸α-叔丁酯

HOOC-(CH₂)₁₂-COONSu：ω-羧基十三酸2，5-二氧吡咯烷-1-基酯

HOOC-(CH₂)₁₄-COONSu：ω-羧基十五酸2，5-二氧吡咯烷-1-基酯

HOOC-(CH₂)₁₆-COONSu：ω-羧基十七酸2，5-二氧吡咯烷-1-基酯

HOOC-(CH₂)₁₈-COONSu：ω-羧基十九酸2，5-二氧吡咯烷-1-基酯

缩写

r.t.：室温

PDMS：等离子解吸质谱

MALDI-MS：基质辅助激光解吸/电离质谱

HPLC：高效液相层析

amu：原子质量单位

分析

通过如下降解测定法来测定肽对二肽酰氨肽酶IV的降解的抵抗力：

将几份肽与一份纯化的二肽酰氨肽酶IV在pH7-8的合适缓冲液(缓冲剂不是清蛋白)中于37℃保温4-22小时。添加三氟乙酸终止酶促反应，并通过HPLC或LC-MS分析将肽降解产物分离和量化。用于进行这种分析的一种方法是：将混合液施加到Zorbax 300SB-C18(30nm孔径，5μm颗粒)150×2.1mm柱上，并用乙腈在0.1％三氟乙酸中的线性梯度(0％-100％乙腈，30分钟)以流速0.5ml/min进行洗脱。可以通过它们在214nm(肽键)或280nm(芳香族氨基酸)的吸光率来监测肽及其降解产物，并通过将它们的峰面积积分而量化。可以使用LC-MS来测定降解模式，其中可以测定各个峰的MS谱。根据在指定时间的完整/降解化合物百分率，评估肽的DPPIV稳定性。

当根据完整化合物在指定时间的百分率，肽比天然肽稳定10倍时，将它定义为DPPIV稳定化的。由此，DPPIV稳定化的GLP-1化合物至少比GLP-1(7-37)稳定10倍。

一般合成方法

可以在Fmoc保护的Rink酰胺树脂(Novabiochem)或氯三苯甲基树脂或适于固相肽合成的类似树脂上合成肽。可以使用Boc化学，但是更方便的是使用Fmoc策略，最终在Applied Biosystems 433A肽合成仪上以0.25mmol规模使用FastMoc UV方案，采用溶于N-甲基吡咯烷酮的HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐)来介导偶联(HATU更适于受阻偶联)，并UV监测Fmoc保护基团的脱保护。也可以使用HBTU和HATU以外的偶联剂，例如CurrentOpinion in Chemical Biology 8：211-2210，2004中所述。所使用的受保护氨基酸衍生物可以是适于ABI433A合成仪的在预称重药筒中供应的标准Fmoc-氨基酸(Applied Biosystems)，除了非天然氨基酸，诸如购自诸如Bachem等供应商并转移到空药筒中的Fmoc-Aib-OH(Fmoc-氨基异丁酸)。最后偶联的氨基酸可以是Boc保护的。

可以通过在自动化合成过程中掺入Fmoc-Lys(Dde)-OH，随后用肼选择性脱保护，最终在特定位置导入侧链和接头，对与树脂结合的粗制受保护肽上特定赖氨酸残基进行附着。对赖氨酸可以使用其它正交保护基团。

用于清除Dde保护的程序

可以将树脂(0.25mmol)置于手工摇动器/过滤装置中，并用溶于N-甲基吡咯烷酮的2％肼进行处理(20ml，2×12min)，以除去DDE基团，随后用N-甲基吡咯烷酮进行清洗(4×20ml)。

用于将侧链附着到赖氨酸残基上的程序

可以将氨基酸(相对于树脂为4个摩尔当量)溶于N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1∶1，10ml)。添加羟基苯并三唑(HOBt)(相对于树脂为4个摩尔当量)和二异丙基碳二亚胺(相对于树脂为4个摩尔当量)，并将溶液搅动15分钟。将溶液加到树脂中，并添加二异丙基乙胺(相对于树脂为4个摩尔当量)。将树脂于室温摇动24小时。用N-甲基吡咯烷酮(2×20ml)、N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1∶1，2×20ml)、和二氯甲烷(2×20ml)清洗树脂。

用于清除Fmoc保护的程序

将树脂(0.25mmol)置于手工摇动装置中的滤瓶中，并用N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1∶1，2×20ml)、N-甲基吡咯烷酮(1×20ml)、和哌啶溶于N-甲基吡咯烷酮的20％溶液(3×20ml)进行处理，每次10分钟。用N-甲基吡咯烷酮(2×20ml)、N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1∶1，2×20ml)、和二氯甲烷(2×20ml)清洗树脂。

用于由树脂上切下肽的程序

为了由树脂上切下肽，将树脂在三氟乙酸、水、和三异丙基硅烷混合液(95∶2.5∶2.5)中于室温搅动180分钟。将切割混合液过滤，并通过氮气流将滤出液浓缩成油。用45ml二乙醚由此油中沉淀出粗制肽，并用45ml二乙醚清洗3次。

纯化

可以在填充7μC-18二氧化硅的20mm×250mm柱上通过半制备性HPLC纯化粗制肽。根据肽，可以使用一种或两种纯化系统：

硫酸铵：将柱用溶于0.05M(NH₄)₂SO₄并用浓H₂SO₄调至pH2.5的40％CH₃CN进行平衡。干燥后，将粗制肽溶于5ml 50％乙酸/H₂O，用H₂O稀释至20ml，并注射到柱上。然后用CH₃CN在0.05M(NH₄)₂SO₄ pH2.5中的40％-60％梯度以10ml/分钟流速用50分钟于40℃进行洗脱。收集含肽级分，用3倍体积的H₂O稀释，并流过用0.1％TFA平衡的Sep-

C18药筒(Waters part.#：51910)。然后用溶于0.1％TFA的70％CH₃CN进行洗脱，用水稀释洗脱液后通过冻干法分离纯化的肽。

TFA：干燥后，将粗制肽溶于5ml 50％乙酸/H₂O，用H₂O稀释至20ml，并注射到柱上。然后用CH₃CN在0.1％TFA中的40％-60％梯度以10ml/分钟流速用50分钟于40℃进行洗脱。收集含肽级分。用水稀释洗脱液后将纯化的肽冻干。

可以通过分析性RP-HPLC(保留时间)和LCMS鉴定得到的终产物。

在实验部分中进行的RP-HPLC分析是使用214nmUV检测和Vydac218TP544.6mm×250mm 5μC-18二氧化硅柱(The Separations Group，Hesperia，美国)进行的，洗脱以1ml/分钟流速于42℃进行。不同的洗脱条件是：

A1：将柱用含0.1M(NH₄)₂SO₄并用浓H₂SO₄调至pH2.5的缓冲液进行平衡，并且用CH₃CN在相同缓冲液中的0％-60％梯度用50分钟进行洗脱。

B1：将柱用0.1％TFA/H₂O进行平衡，并且用0％CH₃CN/0.1％TFA/H₂O至60％CH₃CN/0.1％TFA/H₂O梯度在50分钟内进行洗脱。

B6：将柱用0.1％TFA/H₂O进行平衡，并且用0％CH₃CN/0.1％TFA/H₂O至90％CH₃CN/0.1％TFA/H₂O梯度用50分钟进行洗脱。

候选系统是：

B4：使用配备了Waters 2487双波段检测仪的Alliance Waters 2695系统进行RP分析。使用Symmetry 300 C18，5μm，3.9mm×150mm柱于42℃收集214nm和254nm的UV检测峰。用5-95％乙腈、90-0％水、和5％三氟乙酸(1.0％)在水中的线性梯度用15分钟以1.0ml/分钟流速进行洗脱。

LCMS是在由受HP Chemstation软件控制的Hewlett Packard系列1100 G1312A Bin泵、Hewlett Packard系列1100柱隔间、HewlettPackard系列1100G1315A DAD二极管阵列检测仪、Hewlett Packard系列1100MSD、和Sedere 75蒸发光散射检测仪组成的装置上进行的。

HPLC泵与装有下列洗脱液的两个洗脱液储液器相连：

A：0.05％TFA/水

B：0.05％TFA/乙腈

或者，两个系统是：

A：10mM NH₄OH/水

B：10mM NH₄OH/90％乙腈

为了进行分析，于23℃将适当体积的样品(优选20μl)注射到柱上，并用A和B的梯度进行洗脱。

下表给出了所使用的HPLC条件、检测仪设置、和质谱设置。柱：Waters Xterra MS C-18(50×3mm id 5μm)

梯度：5％-100％乙腈线性梯度，用时6.5分，流速1.5ml/分钟检测：210nm(模拟输出来自DAD)

ELS(模拟输出来自ELS)

MS电离模式API-ES；扫描550-1500amu，步长0.1amu

或者，LC-MS分析可以在配备了两个Perkin Elmer系列200微型泵、一个Perkin Elmer系列200自动加样器、一个Applied Biosystems785A UV检测仪、和一个Sedex 75蒸发光散射检测仪的PE-Sciex API100质谱仪上进行。将Waters Xterra 3.0mm×50mm 5μC-18二氧化硅柱以1.5ml/分钟流速于室温进行洗脱。用5％CH₃CN/0.05％TFA/H₂O进行平衡，并用5％CH₃CN/0.05％TFA/H₂O洗脱1分钟，然后用至90％CH₃CN/0.05％TFA/H₂O的线性梯度洗脱7分钟。检测是214nm的UV检测和蒸发光散射。将柱洗脱液的一个级分导入PE-Sciex API 100质谱仪的离子喷射界面。在运行过程中每2秒扫描质量范围300-2000amu。

MALDI-TOF MS分析是使用配备了延迟提取且以线性模式运转的Voyager RP设备(PerSeptive Biosystems公司，弗雷明汉，马萨诸塞)进行的。使用α-氰-4-羟-肉桂酸作为基质，而且质量赋值以外部校准为基础。

实施例1

使用树脂(Rink酰胺，0.68mmol/g，Novabiochem，0.25mmole)在ABI433A机器上依照制造商的指示生成最初的序列。所有保护基团都是酸不稳定的，只有第37位使用的残基是例外(Fmoc-Lys(ivDde)-OH，Novabiochem)，从而容许对此赖氨酸而非任何其它赖氨酸进行特异脱保护。

流程

将上述制备的含GLP-1类似物氨基酸序列的树脂(0.25mmole)置于手工摇动器/过滤装置中，并用溶于N-甲基吡咯烷酮的2％肼进行处理(2×20ml，2×12min)，以除去DDE基团，随后用N-甲基吡咯烷酮进行清洗(4×20ml)。将Fmoc-8-氨基-3，6-二氧辛酸(NeosystemFA03202)(相对于树脂为4个摩尔当量)溶于N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1∶1，20ml)。添加羟基苯并三唑(HOBt)(相对于树脂为4个摩尔当量)和二异丙基碳二亚胺(相对于树脂为4个摩尔当量)，并将溶液搅动15分钟。将溶液加到树脂中，并添加二异丙基乙胺(相对于树脂为4个摩尔当量)。将树脂于室温摇动24小时。用N-甲基吡咯烷酮清洗树脂(4×20ml)。一边摇动一边向树脂中加入哌啶溶于N-甲基吡咯烷酮的20％溶液(3×20ml，3×10min)。用N-甲基吡咯烷酮清洗树脂(4×20ml)。将十二酸(相对于树脂为4个摩尔当量)溶于N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1∶1，20ml)。添加羟基苯并三唑水合物(HOBt；H₂O)(相对于树脂为4个摩尔当量)和二异丙基碳二亚胺(相对于树脂为4个摩尔当量)，并将溶液搅动15分钟。将溶液加到树脂中，并添加二异丙基乙胺(相对于树脂为4个摩尔当量)。将树脂于室温摇动24小时。用N-甲基吡咯烷酮(2×20ml)、N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1∶1，2×20ml)、和二氯甲烷(2×20ml)清洗树脂。为了由树脂上切下肽，将树脂在三氟乙酸、水、和三异丙基硅烷混合液(95∶2.5∶2.5，15ml)中于室温搅动180分钟。将切割混合液过滤，并将滤出液真空浓缩成油。用45ml二乙醚由此油中沉淀出粗制肽，并用45ml二乙醚清洗3次。在填充7μC-18二氧化硅的20mm×250mm柱上通过制备级HPLC纯化粗制肽。将粗制肽溶于5ml 50％乙酸/H₂O，用H₂O稀释至20ml，并注射到柱上。然后用CH₃CN在0.1％TFA和水中的40％-60％梯度以10ml/分钟流速用50分钟于40℃进行洗脱。收集含肽级分。用水稀释洗脱液后将纯化的肽冻干。

HPLC：(方法B6)：RT＝32.8min

HPLC：(方法A1)：RT＝43.6min

LCMS：m/z＝765.0(M+5H)⁵⁺，957.0(M+4H)⁴⁺，1275.0(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝3825.0

实施例2

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法A1)：RT＝45.5min

LCMS：m/z＝792.9(M+5H)⁵⁺，990.9(M+4H)⁴⁺，1320.9(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝3959.9

实施例3

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B1)：RT＝43.8min

HPLC：(方法A1)：RT＝42.0min

LCMS：m/z＝978.3(M+4H)⁴⁺，1303.8(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝3909.6

实施例4

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B1)：RT＝46.4min

HPLC：(方法A1)：RT＝44.4min

LCMS：m/z＝985.5(M+4H)⁴⁺，1313.4(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝3937.6

实施例5

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B1)：RT＝49.5min

HPLC：(方法A1)：RT＝47.1min

LCMS：m/z＝992.5(M+4H)⁴⁺，1322.6(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝3965.7

实施例6

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B6)：RT＝36.28min

LCMS：m/z＝995(M+4H)⁴⁺，1326(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝3977.6

实施例7

[Aib^8，22，35，Arg^26，34]GLP-1(7-37)Ly s(2-(2-(2-(十六酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-OH

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B6)：RT＝37.1min

LCMS：m/z＝999(M+4H)⁴⁺，1332(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝3993.7

实施例8

N^ε37-(2-[2-(2，6-(S)-二-{2-[2-(2-(十二酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}己酰基氨基)乙氧基]乙氧基})乙酰基

-[Aib^8，22，35]GLP-1(7-37)酰胺

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B6)：RT＝38.2min

LCMS：m/z＝1106.7(M+4H)⁴⁺，1475.3(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4433.0

实施例9

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B6)：RT＝42.9min

LCMs：m/z＝1120.9(M+4H)⁴⁺，1494.2(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4480.4

实施例10

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B6)：RT＝36.0min

LCMS：m/z＝1032.0(M+4H)⁴⁺，1374.0(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4122.8

实施例11

为了制备化合物，将DdeLys(Fmoc)-OH加载到Rink树脂上。然后如“合成方法”中所述用哌啶处理树脂，从而选择性清除Fmoc。将2-(2-(2-(Fmoc-氨基)乙氧基)乙氧基)乙酸偶联到赖氨酸的ε-氨基上，并除去Fmoc。添加DMSO和Cibacron Blue 3GA(17个当量)(SigmaC-9534)，并将混合液于60℃加热15小时，用水(3次)、甲醇(2次)、THF(2次)、和二乙醚(2次)进行清洗。如“合成方法”中所述清除Dde保护基团并添加剩余氨基酸。

HPLC：(方法A1)：RT＝38.1min

LCMS：m/z＝1110.4(M+4H)⁴⁺，1436.4(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4435.9

实施例12

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法A1)：RT＝41.2min

HPLC：(方法B6)：RT＝30.7min

LCMS：m/z＝1069.1(M+4H)⁴⁺，1424.6(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4271

实施例13

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法A1)：RT＝45.2min

LCMS：m/z＝1004.0(M+4H)⁴⁺，1338.2(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4010.7

实施例14

[Aib^8，22，35Ala³⁷]GLP-1(7-37)Lys((2-(2-(2-(11-(草酰基氨基)十一酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基-)))酰胺

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC(方法A1)：RT＝37.9min

HPLC(方法B1)：RT＝39.5min

LCMS：m/z＝993.3(M+4H)⁴⁺，1323.9(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝3967.6

实施例15

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC(方法B6)：RT＝31.1min

HPLC(方法A1)：RT＝41.9min

LCMS：m/z＝1376.3(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4125.8

实施例16

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC(方法A1)：RT＝42.6min

HPLC(方法B6)：RT＝30.4min

LCMS：m/z＝1377.3(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4128.8

实施例17

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC(方法A1)：RT＝41.1min

HPLC(方法B6)：RT＝31.1min

LCMS：m/z＝1351.8(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4052.0

实施例18

[Aib⁸，Arg^26，34，Glu^22，23，30]GLP-1H(7-37)Lys(2-(2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)酰胺

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC(方法B6)：RT＝39.3min

LCMS：m/z＝1366.6(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4095.6

实施例19

[Aib⁸，Arg^26，34，Glu^22，23，30]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(二十酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)酰胺

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC(方法B6)：RT＝42.6min

LCMS：m/z＝1375.7(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4123.7

实施例20

[Gly⁸，Arg^26，34]GLP-1H-(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(十八酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-OH

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC(方法B6)：RT＝38.0min(99.9％)

HPLC(方法A1)：RT＝49.0min

LCMS：m/z＝1054.6(M+4H)⁴⁺，1405.3(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4211.8

实施例21

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC(方法B6)：RT＝38.7min

LCMS：m/z＝1029.2(M+4H)⁴⁺，1371.4(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4110.8

实施例22

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC(方法B6)：RT＝34.7min

LCMS：m/z＝1000.3(M+4H)⁴⁺，1337.4(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4110.8

实施例23

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC(方法B6)：RT＝37.5min

LCMS：m/z＝1414.9(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4239.8

实施例24

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC(方法B6)：RT＝32.4min

HPLC(方法A1)：RT＝43.8min

LCMS：m/z＝1381.3(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4140.0

实施例25

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC(方法A1)：RT＝42.3min

LCMS：m/z＝1372.3(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4112.7

实施例26

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC(方法B6)：RT＝33.5min

LCMS：m/z＝1040.3(M+4H)⁴⁺，1386.6(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4155.8

实施例27

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B6)：RT＝32.8min

LC-MS：m/z＝765.7(M+H)⁵⁺，957.0(M+H)⁴⁺，1275.7(M+H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝3822.9

实施例28

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B6)：RT＝34,6min

LC-MS：m/z＝771,4(M+5H)⁵⁺，964,1(M+4H)⁴⁺，1284,9(M+H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝3851,5

实施例29

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B6)：RT＝36,8min

LC-MS：m/z＝970.7(M+4H)⁴⁺，1294.3(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝3879,6

实施例30

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B6)：RT＝39,4min

LC-MS：m/z＝977,9(M+4H)⁴⁺，1303,7(M+H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝3907,6

实施例31

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B6)：RT＝42.7min

LC-MS：m/z＝984.8(M+4H)⁴⁺，1312.8(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝3935.7

实施例32

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B6)RT＝40.7min

LC-MS：m/z＝792.3(M+5H)⁵⁺，989.8(M+4H)⁴⁺，1319.2(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝3955.5

实施例33

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B6)RT＝40.5min

LC-MS：m/z＝789.5(M+5H)⁵⁺，986.3(M+4H)⁴⁺，1314.8(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝3941.5

实施例34

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B6)RT＝38,3min

LC-MS：m/z＝786.8(M+5H)⁵⁺，982.8(M+4H)⁴⁺，1310.1(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝3927,5

实施例35

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B6)RT＝32.4min

LC-MS：m/z＝1042.7(M+4H)⁴⁺，1389.9(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4166.4

实施例36

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B6)RT＝36.7min

LC-MS：m/z＝1062.8(M+4H)⁴⁺，1416.9(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4247.3

实施例37

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B6)：RT＝37.4min

LC-MS：m/z＝1008.8(M+4H)⁴⁺，1344.3(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4030.7

实施例38

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC(方法B6)：RT＝38.5min

LCMS：m/z＝(M+4H)⁴⁺1025.1，(M+3H)³⁺1366.7，计算的(M+H)⁺＝4096.0

实施例39

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC(方法B6)：RT＝37.7min

LCMS：m/z＝(M+4H)⁴⁺1057.8，(M+3H)³⁺1410.2，计算的(M+H)⁺＝4235.9

实施例40

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC(方法B6)：RT＝33.6min

LCMS：m/z＝(M+4H)⁴⁺1205.3，(M+3H)³⁺1606.9，计算的(M+H)⁺＝4816.5

实施例41

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC(方法B6)：RT＝32.1min

HPLC(方法A1)：RT＝42.2min

LCMS：m/z＝1033.3(M+4H)⁴⁺，1376.6(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4126.7

实施例42

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC(方法B1)：RT＝37.4min

HPLC(方法A1)：RT＝35.5min

LCMS：m/z＝1002.5(M+4H)⁴⁺，1336.7(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4007.5

实施例43

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B6)：RT＝39.0min

LC-MS：m/z＝1022.3(M+4H)⁴⁺，1362.3(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4084.6

实施例44

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B6)：RT＝38,6min

LC-MS：m/z＝1015.2(M+4H)⁴⁺，1353.4(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4056.6

实施例45

N^ε37-2-(2-(2-(4-(4-(十七酰基氨基)-4-(S)-羧基丁酰基氨基)-4-(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)

乙酰基-[Aib^8，22，35，Lys³⁷]GLP-1(7-37)-NH₂

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B4)：RT＝10.72min

LCMS：m/z＝1039.0(M+4H)⁴⁺，1385.0(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4152.0

实施例46

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B4)：RT＝10.74min

LCMS：m/z＝1074(M+4H)⁴⁺，1433(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4297

实施例47

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B4)：RT＝10.71min

LCMS：m/z＝979.0(M+4H)⁴⁺，1304.0(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝3910.0

实施例48

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B4)：RT＝11.32min

LCMS：m/z＝1021(M+4H)⁴⁺，1362(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4084

使用Fmoc策略在Advanced Chemtech 348肽合成仪上在氯三苯甲基树脂(Novabiochem)上合成肽(0.5mmol/g，100mg树脂/孔，使用10个孔)。用溶于1-甲基-吡咯烷-2-酮(NMP)的二异丙基碳二亚胺(DIC)(Fluka)和1-羟基苯并三唑(HOBt)/1-羟基-7-氮杂-苯并三唑(HOAt)(2∶1)(Senn Chemicals)介导偶联，使用10个摩尔当量的氨基酸和偶联剂。所使用的受保护氨基酸衍生物是标准的Fmoc-氨基酸(Advanced Chemtech)，除了氨基酸Fmoc-Lys(ivDde)(Novabiochem)和Fmoc-Glu-OtBu(Bachem)。然后将树脂分成5份(0.1mmol)，并用溶于NMP的(Boc)₂O和DIEA(5个摩尔当量)处理N末端。

通过在自动化合成过程中掺入Fmoc-Lys(ivDde)-OH，随后用肼选择性脱保护，从而在特定位置导入侧链和接头，对与树脂结合的粗制受保护肽上特定赖氨酸残基进行附着。

用于清除Dde保护的程序

将树脂(0.1mmol)置于注射器中，并用溶于NMP的3％肼和3％哌啶于室温进行处理(50min)，以除去Dde基团，随后用NMP进行清洗(4×5ml)。

用于将侧链附着到赖氨酸残基上的程序

将OEG或氨基酸(相对于树脂为7个摩尔当量)溶于NMP。添加HOAt(相对于树脂为7个摩尔当量)和二异丙基碳二亚胺(相对于树脂为7个摩尔当量)，并将溶液搅动15分钟。然后，将溶液加到树脂中。将树脂于室温摇动过夜。用NMP清洗树脂(3×5ml)。

用于清除Fmoc保护的程序

将树脂(0.1mmol)置于注射器中，并用哌啶溶于NMP的30％溶液进行处理(5ml，20min)。用NMP(2×5ml)和二氯甲烷(2×5ml)清洗树脂。

用于由树脂上切下肽的程序

为了由树脂上切下肽，将树脂在三氟乙酸、水、和三异丙基硅烷混合液(94∶3∶3)中于室温搅动120分钟。将切割混合液过滤，并通过氮气流将滤出液浓缩成油。用10ml二乙醚由此油中沉淀出粗制肽，并用10ml二乙醚清洗2次。

实施例49

使用氯三苯甲基树脂(0.5mmol/g，Novabiochem，0.1mmole)在Advanced Chemtech 348机器上生成最初的序列。所有保护基团都是酸不稳定的，只有第37位使用的残基是例外(FmocLys(ivDde)-OH，Novabiochem)，从而容许对此赖氨酸而非任何其它赖氨酸进行特异脱保护。

流程

将上述制备的含GLP-1类似物氨基酸序列的树脂(0.1mmole)置于注射器中，并用溶于N-甲基吡咯烷酮的3％肼和3％哌啶进行处理(50ml)，以除去DDE基团，随后用NMP进行清洗(4×5ml)。将Fmoc-8-氨基-3，6-二氧辛酸(Neosystem FA03202)(相对于树脂为7个摩尔当量)溶于NMP。添加HOAt(相对于树脂为7个摩尔当量)和二异丙基碳二亚胺(相对于树脂为7个摩尔当量)，并将溶液搅动15分钟。然后，将溶液加到树脂中。将树脂于室温摇动过夜。用NMP清洗树脂(4×5ml)。向树脂中加入哌啶溶于NMP的30％溶液(5ml，20min)。用NMP(4×5ml)清洗树脂。将C20的N-羟基琥珀酰亚胺酯(相对于树脂为6个摩尔当量，KJ.Ross-Petersen A/S)和DIEA溶于NMP，并添加到树脂中。将树脂于室温摇动过夜。用NMP(3×5ml)和二氯甲烷(2×5ml)清洗树脂。为了由树脂上切下肽，将树脂在三氟乙酸、水、和三异丙基硅烷混合液(94∶3∶3，3ml)中于室温搅动120分钟。将切割混合液过滤，并将滤出液真空浓缩成油。用10ml二乙醚由此油中沉淀出粗制肽，并用10ml二乙醚清洗2次。

纯化

于室温将粗制肽以5-10mg/200μl的浓度溶于DMSO，并施加到于40℃运行的7.8×300mm X-Terra Prep MS C18 10μm柱上。用30％CH₃CN、0.08％TFA以4ml/分钟洗脱5分钟后，用30-65％CH₃CN线性梯度用35分钟对柱进行洗脱。手动收集UV主峰，并通过MALDI-MS鉴定期望峰。

通过测量280nm的UV吸收来测定肽在洗脱液中的浓度，假设酪氨酸和色氨酸的摩尔消光系数分别是1280和3690。

测定浓度后，将洗脱液等分成含期望数量的小瓶，并通过真空离心进行干燥。

HPLC：洗脱于27.9min＝52.9％CH₃CN

MALDI-MS：3996(MH⁺)

实施例50

依照上面的实施例和“一般合成方法”中的方法制备化合物，只是将十八二酸C18作为单保护叔丁酯(相对于树脂为3个摩尔当量)进行附着，而且用HOAt和DIC(也是相对于树脂为3个摩尔当量)在NMP中介导偶联。将粗制肽溶于22.5％CH₃CN、0.1N NaOH用于纯化。

HPLC：洗脱于25.4min＝50.4％CH₃CN

MALDI-MS：3969(MH⁺)

实施例51

依照上面的两个实施例和“一般合成方法”中的方法制备化合物。用HOAt和DIC(相对于树脂为6个摩尔当量)将氨基酸Fmoc-Glu(OtBu)(相对于树脂为6个摩尔当量)偶联到树脂上。将粗制肽溶于22.5％CH₃CN、0.1N NaOH用于纯化。

HPLC：洗脱于27.2min＝52.2％CH₃CN

MALDI-MS：4124(MH⁺)

实施例52

依照上面的三个实施例和“一般合成方法”中的方法制备化合物，所不同的是将另外两个OEG偶联到Lys的侧链上。

HPLC：洗脱于25.0min＝50.0％CH₃CN

MALDI-MS：4259(MH⁺)

实施例53

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC(方法B6)：RT＝38.8min

LCMS：m/z＝1022.3(M+4H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4081.7

实施例54

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC(方法A1)：RT＝41.9min

HPLC(方法B6)：RT＝31.3min

LCMS：m/z＝1722.7(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝5164.9

实施例55

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B6)：RT＝34,2min

LC-MS：m/z＝997,2(M+4H)⁴⁺，1329,4(M+3H)³⁺，1993,2(M+2H)²⁺，计算的(M+H)⁺＝3985,5

实施例56

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B6)：RT＝34,2min

LC-MS：m/z＝993.8(M+4H)⁴⁺，1324.6(M+3H)³⁺，1987.2(M+2H)²⁺，计算的(M+H)⁺＝3971.5

实施例57

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B6)：RT＝34,2min

LC-MS：m/z＝990.3(M+4H)⁴⁺，1320.3(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝3957.4

实施例58

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B6)：RT＝37.7min

LC-MS：m/z＝1216.6(M+4H)⁴⁺，1621.4(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4861.5

实施例59

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B6)：RT＝39.1min

LC-MS：m/z＝1018.8(M+4H)⁴⁺，1357.6(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4070.6

实施例60

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B4)：RT＝12.1min

LCMS：m/z＝993.0(M+4H)⁴⁺，1325.0(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝3970.0

实施例61

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B4)：RT＝11.8min

LCMS：m/z＝1026(M+4H)⁴⁺，1368(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4100

实施例62

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B6)：RT＝32,3min

LC-MS：m/z＝1223.9(M+4H)⁴⁺，1630.8(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4891.5

实施例63

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B6)：RT＝32.0min

HPLC：(方法A1)：RT＝43.4min

LCMS：m/z＝1438.7(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4311.8

实施例64

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B1)：RT＝32.5min

HPLC：(方法A1)：RT＝43.5min

LCMS：m/z＝1028.8(M+4H)⁴⁺，计算的(M+H)⁺＝4108.7

实施例65

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

HPLC：(方法B6)：RT＝33.7min

HPLC：(方法A1)：RT＝44.8min

LCMS：m/z＝1024.8(M+4H)⁴⁺，1365.4(M+3H)³⁺，计算的(M+H)⁺＝4092.8

实施例66

依照实施例1和“一般合成方法”中的方法制备化合物。

MALDI-MS：4127(MH⁺)

HPLC：洗脱于25.5min＝50.6％CH₃CN

生物学发现

GLP-1衍生物在静脉内或皮下施用后的延长效果

通过使用下文所述方法监测它们在皮下施用于健康猪后在血浆中的浓度来测量本发明的多种GLP-1衍生物的延长效果。为了进行比较，还跟踪GLP-1(7-37)在皮下施用后在血浆中的浓度。可以以相同方式测定本发明其它GLP-1衍生物的延长效果。

GLP-1类似物在小种猪中的药动学测试

将测试物溶于适于皮下或静脉内施用的媒介物。调整浓度，使得服药体积是约1ml。

研究在12只雄性

小种猪(Ellegaard

Minipigs ApS)中进行。在动物加入研究前容许约10天的适应期。在适应期开始时，小种猪约5月龄，体重范围8-10kg。

研究在合适的动物房中进行，室温设为21-23℃，相对湿度≥50％。照明循环为12小时明亮和12小时黑暗。照明时间是06:00至18:00。

将动物收容在以草为垫的栏中，每栏六只。

在研究过程中，动物可以自由获取家用品质的饮用水，但是由服药前一天约16时开始禁食，直至服药后约12小时。

在动物到达时和服药日称重。

动物接受一次静脉内或皮下注射。皮下注射在颈右侧进行，距离耳朵大约5-7cm而距离颈中部7-9cm。注射器的针带有阻止器，容许0.5cm的针插入皮肤。

每种测试物注射三只动物。每只动物接受的剂量是2nmol/kg体重。

每周给六只动物服药，而其余六只动物休息。

由每只动物获得完整血浆浓度-时间曲线。依照如下方案采集血样：

静脉内施用后：服药前(0)、注射后0.17(10分钟)、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、和120小时。

皮下施用后：

服药前(0)、注射后0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、和120小时。

每次取样时，由每只动物采集2ml血液。血样是由颈静脉采集的。

将血样收集到装有用于稳定的缓冲液的试管中，以预防对GLP-1类似物的酶促降解。

立即将血浆转移到Micronic管中，每个管转移约200μl血浆。将血浆保存于-20℃直至测定。通过免疫测定法对血浆样品测定GLP-1类似物的含量。

对血浆浓度-时间曲线进行非房室药动学分析。对每种情况计算下列药动学参数：AUC、AUC/剂量、AUC_％Extrap、C_max、t_max、λ_z、t_1/2、CL、CL/f、V_z、V_z/f、和MRT。

对选择的本发明化合物在丹麦兰德瑞斯(Landrace)猪中进行测试。

GLP-1类似物在猪中的药动学测试

自实验开始时将猪(50％杜洛克猪，25％约克夏猪，25％丹麦兰德瑞斯猪，约40kg)禁食。在50μM等渗液(5mM磷酸盐pH 7.4、0.02％吐-20(Merck)、45mg/ml甘露醇(不含热原，Novo Nordisk)中对每头猪施用0.5nmol测试化合物/kg体重。由颈静脉中的导管采集血样。将5ml血样倒入装有175μl如下溶液的冷玻璃杯中：0.18MEDTA、15000KIE/ml抑酶肽(Novo Nordisk)、和0.30mM缬氨酸-Pyrrolidide(Novo Nordisk)pH 7.4。在30分钟内，将样品以5-6000*g离心10分钟。将温度保持于4℃。将上清液转移到另其它玻璃杯中，并保存于-20℃直至使用。

在三明治ELISA或RIA中使用不同的单克隆或多克隆抗体测定肽的血浆浓度。抗体的选择取决于GLP-1衍生物。根据选择的具体GLP-1衍生物，达到血浆峰值浓度的时间在较广范围内变化。

在96孔微量滴定板中进行三明治ELISA的一般测定方案

包被缓冲液(PBS)：磷酸盐缓冲盐水pH 7.2

清洗缓冲液(PBS清洗液)：磷酸盐缓冲盐水、0.05％v/v吐温20pH 7.2

测定缓冲液(BSA缓冲液)：磷酸盐缓冲盐水、10g/L牛血清清蛋白(Fluka 05477)、0.05％v/v吐温20pH 7.2

链霉亲和素缓冲液：磷酸盐缓冲盐水、0.5M NaCl、0.05％v/v吐温20pH 7.2

标准物：血浆基质中的各种化合物

A-TNP：Nonsens抗体

AMDEX：链霉亲和素-辣根过氧化物酶(Amersham RPN4401V)

TMB底物：3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(＜0.02％)、过氧化氢

如下进行测定(体积/孔)：

1)用100μl溶于PBS缓冲液的5μg/ml捕捉抗体进行包被

→于4℃保温o/n

→用PBS清洗液清洗5次

→用最后一次清洗液封闭至少30分钟

→然后将板倒空

2)加入20μl样品和100μl溶于BSA缓冲液的生物素化检测抗体以及10μg/ml A-TNP

→在摇床上于室温保温2小时

→用PBS清洗液清洗5次

→然后将板倒空

3)加入100μl在链霉亲和素缓冲液中1∶8000稀释的AMDEX

→在摇床上于室温保温45-60分钟

→用PBS清洗液清洗5次

→然后将板倒空

4)加入100μl TMB底物

→在摇床上于室温保温x分钟

→加入100μl 4M H₃PO₄终止反应

读取450nm的吸光度，以620nm作为参照。

由标准曲线计算样品中的浓度。

RIA的一般测定方案

DB缓冲液：80mM磷酸盐缓冲液、0.1％人血清清蛋白、10mM EDTA、0.6mM硫柳汞pH 7.5

FAM缓冲液：40mM磷酸盐缓冲液、0.1％人血清清蛋白、0.6mM硫柳汞pH 7.5

木炭：40mM磷酸盐缓冲液、0.6mM硫柳汞、16.7％牛血浆、15g/L活性炭pH 7.5(使用前将悬浮液于4℃混合至少1小时)

标准物：血浆基质中的各种化合物

如下在minisorp管12×75mm中进行测定(体积/管)：

混匀；于4℃保温30分钟；以3000rpm离心30分钟；将上清液转移到新管中后，立即用塞子封上，并在伽马计数器上计数1分钟。

由各个标准曲线计算样品中的浓度。

GLP-1放射受体测定法(RRA)

该方法是使用LEADseeker成像颗粒的放射配体结合测定法。测定体系由包含GLP-1受体的膜碎片、未标记GLP-1类似物、用¹²⁵I标记的人GLP-1、和用小麦胚芽凝集素(WGA)包被的PS LEADseeker颗粒组成。冷的且¹²⁵I标记的GLP-1将竞争与受体的结合。在添加LEADseeker颗粒后，它们将经由WGA残基结合膜碎片上的碳水化合物残基。¹²⁵I分子与LEADseeker颗粒之间的接近引起颗粒发光。

LEADseeker将发出的光成像，而且它与样品中存在的GLP-1类似物的数量成反比。

试剂和材料

动物血浆的预处理：将动物血浆于56℃热处理4小时，并以10,000rpm离心10分钟。然后，添加Val-Pyr(10μM)和aprotenin(500KIE/ml)，并保存于＜-18℃直至使用。

GLP-1类似物校准物：将GLP-1类似物掺入经过热处理的血浆以产生范围约1μM至1pM的稀释系列。

GLP-1RRA测定缓冲液：25mM Na-HEPES(pH＝7.5)、2.5mM CaCl₂、1mMMgCl₂、50mM NaCl、0.1％卵清蛋白、0.003％吐温20、0.005％杆菌肽、0.05％NaN₃。

GLP-1受体悬浮液：由表达人胰GLP-1受体的仓鼠幼鼠肾(BHK)细胞纯化GLP-1受体膜碎片。保存于＜-80℃直至使用。

偶联了WGA的聚苯乙烯LEADseeker成像珠(RPNQ0260，Amersham)：将珠用GLP-1RRA测定缓冲液重构至13.3mg/ml的浓度。然后添加GLP-1受体膜悬浮液，并在使用前末端对末端(end-over-end)倒置于低温(2-8℃)保温至少1小时。

[¹²⁵I]-GLP-1(7-36)酰胺(Novo Nordisk A/S)：保存于＜-18℃直至使用。

99.9％(体积)乙醇(De Dansk Spritfabrikker A/S)：保存于＜-18℃直至使用。

Solvinert 0.45μm疏水性PTFE板(MSRPN0450，Millipore公司)

聚丙烯板(产品目录编号650201，Greiner Bio-One)

白色聚苯乙烯384孔板(产品目录编号781075，Greiner Bio-One)

仪器

水平板混合仪

装配了标准翻斗微量滴定板转子的离心机

Ultra Vap-Drydown Sample Concentrator(Porvair)

LEADseeker^TM Multimodality Imaging System(Amersham)

检验流程

样品制备：

将Solvinert滤板安装在化学相容的接收板(即聚丙烯板)上以收集滤出液。

向

Solvinert滤板的空孔中加入150μl冰冷的99.9％乙醇，随后是50μl校准物或血浆样品。将贮藏盖盖到滤板上。

在水平板混合仪上于18-22℃保温15分钟。

将装配好的滤板和接收板连同盖子放到标准翻斗微量滴定板转子中。然后以1500rpm离心2分钟，将滤出液收集在接收板的空孔中。

使用UltraVap用热(40℃)N₂将滤出液干燥15分钟。向每个孔中加入100μl GLP-1RRA测定缓冲液，使干物质重构。在水平混合仪上保温5分钟。

GLP-1放射受体测定法：

使用如下移液方案和白色聚苯乙烯384孔板：

●35μl GLP-1RRA测定缓冲液

●5μl重构的滤出液

●10μl[¹²⁵I]-GLP-1(7-36)酰胺。使用前将储液在GLP-1RRA测定缓冲液中稀释至20,000cpm/孔。

●15μl预包被到WGA-聚苯乙烯LEADseeker成像珠(0.2mg/孔)上的GLP-1受体膜碎片(≈0.5μg/孔)

将板密封并于18-22℃保温过夜。

使用LEADseeker^TM Multimodality Imaging System检测每个孔的发光，持续10分钟。

在表达克隆人GLP-1受体的细胞系中刺激cAMP形成

用PBS将大约80％汇合的细胞清洗2次，并用Versene收获细胞，以1000rpm离心5分钟，并除去上清液。其它步骤都是在冰上进行的。将细胞沉淀在10ml缓冲液1(20mM Na-HEPES、10mM EDTA，pH＝7.4)用Ultrathurax匀浆20-30秒，以20,000rpm离心15分钟，并将沉淀重悬于10ml缓冲液2(20mM Na-HEPES、0.1mM EDTA，pH＝7.4)。将悬浮液匀浆20-30秒，并以20,000rpm离心15分钟。将悬于缓冲液2、匀浆、和离心重复一次，并将膜重悬于缓冲液2，用于进一步分析或保存于-80℃。

功能受体测定法是通过使用AlphaScreen技术测量由肽诱导的cAMP产量来进行的。AlphaScreen技术的基本原理是内源cAMP与外源添加生物素-cAMP之间的竞争。对cAMP的捕捉是使用缀合在受体珠上的特异抗体来完成的。在AlphaFusion Microplate Analyzer上对形成的cAMP进行计数和测量。使用Graph-Pad Prisme软件计算EC₅₀值。

序列表

<110>Novo Nordisk A/S

<120>治疗肽的清蛋白结合型衍生物

<130>6692-WO

<160>5

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>31

<212>PRT

<213>智人

<400>1

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly

20 25 30

<210>2

<211>40

<212>PRT

<213>合成的构建体

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>位置1的Xaa是L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、α-羟基-组氨酸、同组氨酸、N-α-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸。

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>位置2的Xaa是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸或(1-氨基环辛基)羧酸。

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(10)..(10)

<223>位置10的Xaa是Val或Leu.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(12)..(12)

<223>位置12的Xaa是Ser，Lys或Arg

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(13)..(13)

<223>位置13的Xaa是Tyr或Gln.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(14)..(14)

<223>位置14的Xaa是Leu或Met.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(16)..(16)

<223>位置16的Xaa是Gly，Glu或Aib.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(17)..(17)

<223>位置17的Xaa是Gln，Glu，Lys或Arg.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(19)..(19)

<223>位置19的Xaa是Ala或Val.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(20)..(20)

<223>位置20的Xaa是Lys，Glu或Arg.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(21)..(21)

<223>位置21的Xaa是Glu或Leu.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(24)..(24)

<223>位置24的Xaa是Ala，Glu或Arg.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(27)..(27)

<223>位置27的Xaa是Val或Lys

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(28)..(28)

<223>位置28的Xaa是Lys，Glu，Asn或Arg.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(29)..(29)

<223>位置29的Xaa是Gly或Aib.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(30)..(30)

<223>位置30的Xaa是Arg，Gly或Lys.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(31)..(31)

<223>位置31的Xaa是Gly，Ala，Glu，Pro，Lys，酰胺或不存在.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(32)..(32)

<223>位置32的Xaa是Lys，Ser，酰胺或不存在.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(33)..(33)

<223>位置33的Xaa是Ser，Lys，酰胺或不存在.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(34)..(34)

<223>位置34的Xaa是Gly，酰胺或不存在.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(35)..(35)

<223>位置35的Xaa是Ala，酰胺或不存在.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(36)..(36)

<223>位置36的Xaa是Pro，酰胺或不存在.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(37)..(37)

<223>位置37的Xaa是Pro，酰胺或不存在.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(38)..(38)

<223>位置38的Xaa是Pro，酰胺或不存在.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(39)..(39)

<223>位置39的Xaa是Ser，酰胺或不存在.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(40)..(40)

<223>位置40的Xaa是酰胺或不存在.

<400>2

Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa

1 5 10 15

Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

20 25 30

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

35 40

<210>3

<211>32

<212>PRT

<213>合成的构建体

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(12)..(12)

<223>位置12的Xaa是Ser，Lys或Arg.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(16)..(16)

<223>位置16的Xaa是Gly，Glu或Aib.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(17)..(17)

<223>位置17的Xaa是Gln，Gly，Lys或Arg.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(20)..(20)

<223>位置20的Xaa是Lys，Glu或Arg.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(24)..(24)

<223>位置24的Xaa是Ala，Glu或Arg.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(28).(28)

<223>位置28的Xaa是Lys，Glu或Arg.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(29)..(29)

<223>位置29的Xaa是Gly或Aib.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(30)..(30)

<223>位置30的Xaa是Arg或Lys..

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(31)..(31)

<223>位置31的Xaa是Gly，Ala，Glu或Lys.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(32)..(32)

<223>位置32的Xaa是Lys，酰胺或不存在.

<400>3

Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Xaa Tyr Leu Glu Xaa

1 5 10 15

Xaa Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Xaa Trp Leu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

20 25 30

<210>4

<211>39

<212>PRT

<213>Gila mouster

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(39)..(39)

<223>羧基基团酰胺化.

<400>4

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

<210>5

<211>44

<212>PRT

<213>合成的构建体

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(44)..(44)

<223>羧基基团酰胺化.

<400>5

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys

35 40

Claims

1.化合物，其中所述化合物选自下组：

N^ε37-(2-(2-(2-(十二烷基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-[Aib^8，22，35Lys³⁷]GLP-1(7-37)酰胺

[Aib^8，22，35，Arg^26，34]GLP-1-(7-37)Lys(4-(十六酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基)-OH

[Aib^8，22，35，Arg^26，34]GLP-1-(7-37)Lys(2-(2-(2-(十六酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-OH

[Aib^8，22，35，Arg^26，34]GLP-1-(7-37)Lys(2-(2-(2-(4-(十六酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-OH

N^ε37-([2-(2-{3-[2，5-二氧-3-(15-羧基十五基硫烷基)-吡咯烷-1-基]-丙酰基氨基}乙氧基)乙氧基)乙酰基]-[D-Ala⁸，Lys³⁷]-GLP-1-[7-37]酰胺

[Aib^8，22，35，Ala³⁷]-GLP-1(7-37)Lys({2-[2-(2-{2-[2-(2-(15-羧基-十五酰基氨基)-乙氧基]乙氧基}乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基)酰胺

[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)Lys(2-(2-(2-(4-(十六酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-OH

[Gly⁸，Arg^26，34]GLP1-(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-OH

[Aib⁸]GLP-1-(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(十六酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-OH

N^ε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基))-[Aib⁸，Arg^26，34，Lys³⁶]GLP-1-(7-37)-OH

N^ε36-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-[Gly⁸，Arg^26，34，Lys ³⁶]GLP-1-(7-37)-OH

N^ε37-(2-(2-(2-(4-4(4，4，5，5，6，6，7，7，8，8，9，9，9-十三氟壬酰基氨磺酰基-丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基))[Aib^8，22，35，Lys³⁷]GLP-1-(7-37)-OH

N^ε37-(2-(2-(2-(3，3，4，4，5，5，6，6，7，7，8，8，9，9，10，10，11，11，12，12，12-二十一氟十二基氧基乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[Aib^8，22，35，Lys³⁷]GLP-1-(7-37)-OH

N^ε37-(2-(2-(2-(4-(十六酰基氨磺酰基)丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[Aib^8，22，35，Lys³⁷]GLP-1-(7-37)-OH

N^ε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(十八酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-[Aib⁸，Arg^26，34，Lys³⁶]GLP-1-(7-37)-OH

N^ε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(十八酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-[Gly⁸，Arg^26，34，Lys³⁶]GLP-1-(7-37)-OH

N^ε37-2-(2-(2-(4-(4-(十七酰基氨基)-4-(S)-羧基丁酰基氨基)-4-(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基-[Aib^8，22，35，Lys³⁷]GLP-1-(7-37)-NH₂

N^ε37-2-(2-[2-(2-[2-(4-[4-(十七酰基氨基)-4-(S)羧基丁酰基氨基]-4-(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基-[Aib^8，22，35，Lys³⁷]GLP-1-(7-37)-NH₂

N^ε26-(2-(2-(2-(4-(十六酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-[Aib⁸，Arg³⁴]GLP-1-(7-37)-OH

N^ε26-2-(2-2-(2-(2-(2-(4-(十八酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基-[Aib⁸，Arg³⁴]GLP-1-(7-37)-OH

[Gly⁸，Arg^26，34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(1 9-(羧基)十九酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-OH

N^ε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[Gly⁸，Arg^26，34，Lys³⁶]GLP-1-(7-37)

N^ε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(十八酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)-[Arg^26，34，Lys³⁶]GLP-1-(7-37)

N^ε26-(2-[2-(2-[2-(2-[2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基)[Arg³⁴]GLP-1-(7-37)-OH

N^ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(1 7-羧基十七酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Arg³⁴]GLP-1-(7-37)-OH

N^ε20-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基-氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[Lys²⁰]Exendin-4(1-39)酰胺

和