CN105198999A - 一种融合蛋白、其制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种融合蛋白将HSA和IL21融合表达,制备的融合蛋白,不仅仍具有IL21活性,且IL21的半衰期显著延长,稳定性有很大的改善。本发明还提供了编码该融合蛋白的核酸序列以及该融合蛋白的制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品领域,更确切的讲是一种融合蛋白及其应用。
背景技术
细胞因子在机体免疫反应中起着不可替代的作用,白介素-21(IL21)是2000年被发现的一种四螺旋束细胞因子,IL21主要是由活化的CD4+Th细胞分泌。其基因定位于四号染色体长臂26-27(4q26-27)位,编码产生的多肽前体是由162个氨基酸组成,后经过Gly酶切,在第31为断开形成含131个氨基酸残基、分子量为15KD的成熟IL21分子。IL21受体IL21R属于I型细胞因子受体,是由α链和γc链组成,受体分布广泛,主要存在于T细胞、B细胞、NKT细胞、DC细胞及角质化细胞等表面。IL21在固有免疫和适应性免疫中发挥重要的调节作用,是一种重要的的免疫调节因子。由于IL21分子量比较小,分子不稳定,在体内容易降解,因此大制备困难。
现有技术中的IL21的制备方法复杂、成本高昂。现有技术中制备IL21的方法中,直接在大肠杆菌中上清表达,使用的载体为PGEX4-T,表达产物带有GST标签,后期需要将GST标签去除,工艺复杂、成本较高。也有在毕赤酵母中表达,使用的表达载体为PPIC9K,即通过高卡那抗性筛选表达量价高的克隆,由于IL21稳定性较差,因此制备困难。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有较长半衰期且稳定性良好的细胞因子IL21融合蛋白,及其应用。
本发明的另一目的是提供一种制备所述IL21融合蛋白的方法。
本发明的再一目的是提供一种制备IL21蛋白的方法。
在本发明的第一方面,提供了一种融合蛋白,所述融合蛋白具有式Ia或式Ib所述结构:
A-B-C(Ia),或
C-B-A(Ib)
其中,
A为包括白介素-21的多肽元件;
B为连接肽;
C为包括血清白蛋白的多肽元件;
“-”表示连接上述各元件的肽键。
在另一优选例中,所述白介素-21为哺乳动物的白介素-21。优选地,所述白介素-21为人白介素-21。
在另一优选例中,所述血清白蛋白为哺乳动物的血清白蛋白。优选地,所述血清白蛋白为人血清白蛋白。
在另一优选例中,所述元件A的长度为100-200个氨基酸。
在另一优选例中,所述元件A包含SEQIDNO:1中第30-162位所示的氨基酸序列并且长度为133-170个氨基酸。
在另一优选例中,所述元件A的氨基酸序列如SEQIDNO.:1中第30-162位所示。
在另一优选例中,所述的元件C包含SEQIDNO:2中第25-609位所示的氨基酸序列,并且长度为585-650个氨基酸序列。
在另一优选例中,所述元件C的氨基酸序列如SEQIDNO.:2中第25-609位所示。
在另一优选例中,所述连接肽的长度为0-10氨基酸,较佳地为1-5个氨基酸。更佳地,所述连接肽为GGGGS。
在另一优选例中,编码所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:4所示。
在另一优选例中,所述融合蛋白具有以下特性:
a)具有免疫调节活性;
能够调节免疫细胞分化,提高NK细胞,CTL细胞杀伤活性;
b)可抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭,促进肿瘤细胞的凋亡;和
c)血浆半衰期≥3天。较佳地≥4天,最佳地≥5天。
在另一优选例中,所述免疫调节活性是指所述融合蛋白能够调节免疫细胞分化,提高NK细胞和/或提高CTL细胞杀伤活性。
在另一优选例中,所述可抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭是指所述融合蛋白能够抑制黑色素瘤细胞迁移和侵袭和/或促进Jurkat细胞凋亡。
在本发明的第二方面,提供了一种分离的多核苷酸,所述多核苷酸编码根据本发明第一方面的融合蛋白。
在另一优选例中,所述的多核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。
在本发明的第三方面,提供了一种载体,所述载体包括根据本发明第二方面的多核苷酸。
在本发明的第四方面,提供了一种宿主细胞,
所述宿主细胞表达根据本发明第一方面的融合蛋白;和/或
所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体;和/或
所述宿主细胞基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中,所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞(如酵母细胞)。
在另一优选例中,所述宿主细胞为毕赤酵母GS115菌株。
在本发明的第五方面,提供了一种制备融合蛋白的方法,包括步骤:
在适合表达的条件下,培养第四方面所述的宿主细胞,从而表达出第一方面所述的融合蛋白;和
分离所述融合蛋白。
在另一优选例中,所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。优选地,所述宿主细胞为酵母细胞。更优选地,所述酵母细胞为毕赤酵母,如GS115菌株。
在本发明的第六方面,提供了一种制备白介素-21或其类似物的方法,所述方法选自:
(a)将本发明第一方面的融合蛋白降解为白介素-21或其类似物;和
分离纯化所述白介素-21或其类似物;和
(b)将白介素-21基因在含有稀有密码子的大肠杆菌菌株中表达白介素-21包涵体。
在另一优选例中,所述(b)中大肠杆菌菌株为BL21(RP)菌株。
在另一优选例中,所述(b)中还包括将所述包涵体复性的步骤。
在本发明的第七方面,提供了一种药物组合物,所述组合物包含:
第一方面的融合蛋白,以及药学上可接受的载体或赋形剂。
在本发明的第八方面,提供了本发明第一方面所述的融合蛋白的用途,用于制备治疗疾病的药物。
在另一优选例中,所述的疾病选自:肿瘤和低蛋白血症。
在另一优选例中,所述肿瘤包括:大肠癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、肾细胞癌和/或结肠癌。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示人血清白蛋白(HSA)基因和IL21基因PCR、融合基因(HI)拼接PCR电泳图谱。
图2显示线性化处理pPIC9-HI质粒,回收鉴定电泳图谱。
图3显示毕赤酵母表达融合蛋白(80KD左右),SDS-PAGE检测图谱,其中1-6泳道为融合蛋白HSA-IL21在GS115中表达鉴定电泳,可见融合蛋白在GS115中有表达。
图4显示融合蛋白HSA-IL21产物纯化后电泳图谱。
图5显示IL21的PCR电泳结果。
图6显示IL21在大肠杆菌BL21中的表达情况。
图7显示IL21在含有稀有密码子的BL21(RP)菌株中的表达情况。
图8显示IL21和融合蛋白HSA-IL21的活性检测结果。
图9显示融合蛋白HSA-IL21的安全性检测结果。
图10显示包涵体表达的IL21的稳定性(SDS-PAGE检测),其中图10A为刚复性成功的IL21蛋白;图10B为-20℃保存2周的IL21蛋白;图10C为-20℃保存3个月的IL21蛋白;图10D为-20℃保存约6个月的IL21蛋白。
图11显示包涵体表达的IL21的稳定性(Native-PAGE检测),其中图11A为刚复性成功的IL21蛋白;图11B为-20℃保存2周的IL21蛋白;图11C为-20℃保存3个月的IL21蛋白;图11D为-20℃保存约6个月的IL21蛋白。
图12显示融合蛋白HSA-IL21的稳定性(SDS-PAGE检测),其中图12A为刚纯化的融合蛋白HSA-IL21;图12B为-20℃保存两周的融合蛋白HSA-IL21;图12C为-20℃保存三个月的融合蛋白HSA-IL21;图12D为-20℃保存六个月的融合蛋白HSA-IL21。
图13显示现纯化的融合蛋白HSA-IL21的western-blot检测其降解情况。图13A中一抗为鼠抗人IL21-Ab,二抗为兔抗鼠IgG-HRP;图13B中一抗为鼠抗人His-tag-Ab;二抗为兔抗人IgG-HRP。
图14显示融合HSA-IL21的体内半衰期。
图15显示了不同保存时间的融合蛋白和IL21的生物活性。
图16显示IL21-linker-HSA融合蛋白在毕赤酵母中无法表达。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究,意外地获得了一种通过酵母发酵制备IL21(白介素-21)的方法,该方法中将IL21基因与人血清白蛋白基因N端融合,构建到酵母表达载体中,成功地实现融合蛋白HSA-IL21在酵母中的表达,而IL21蛋白在酵母中是很难得到制备的。而且本发明人意外地发现将HSA和IL21融合表达,制备的融合蛋白,不仅仍具有IL21活性,且IL21活性的半衰期显著延长,稳定性有很大的改善。在此基础上完成了本发明。
术语
本发明的一个优选的实施方式中使用的IL21氨基酸序列为IL21氨基酸CDS区序列(根据NCBI中NM_021803.3编码所示,IL21-mRNAvarient1):共162个氨基酸残基,其中1-29为信号肽(下划线所示,切除,不用),第30-162位氨基酸为根据本发明的一个较佳的实施方式中所使用的氨基酸序列,共计133个氨基酸残基,如下所示:
MRSSPGNMERIVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS(SEQIDNO.:1)。
本发明的一个优选的实施方式中使用的血清白蛋白氨基酸序列为人血清白蛋白(Humanserumalbumin,HSA):
HSA氨基酸序列(根据NCBI中AY728024.1编码所示,Homosapiensserumalbuminprecursor,mRNA,completecds):共609个氨基酸残基,其中本实验中使用的是第25-609位HSA氨基酸片段(为去除信号肽的序列,在其它实施方式中也可使用扩展到全长的HSA序列),共计585个氨基酸残基(除下划线之外的序列),如下所示:
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL(SEQIDNO.:2)。
本发明的一个优选的实施方式中使用的连接肽基因序列为ggtggtggtggttcc,共5个氨基酸残基,氨基酸序列为GGGGS(SEQIDNO.:3)。
本发明的一个优选的实施方式中构建的融合蛋白HSA-linker-IL21的基因序列如SEQIDNO.:4所示。其中第1-1755位核苷酸编码HSA的第25-609位氨基酸;第1756-1770位核苷酸编码连接肽;第1771-2172位核苷酸编码IL21第30-162位氨基酸。
融合蛋白及其制备
在本发明中,“重组融合蛋白”、“本发明蛋白”、“本发明融合蛋白”、“融合蛋白”可互换使用,指具有式Ia或Ib所述结构,即含有包括HSA元件和IL21元件的融合蛋白。本发明蛋白可以是单体或由单体形成的多聚体(如二聚体)。此外,应理解,所述术语还包括融合蛋白的活性片段和衍生物。
本发明还包括根据本发明融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持人IL-21功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(iii)融合蛋白与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导,这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类优选的活性衍生物指与式Ia或式Ib的氨基酸序列相比,有至多3个,较佳地至多2个,更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与SEQIDNO3所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异,也可以是不影响序列的修饰形式上的差异,或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物,以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解,本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括:体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化,如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸,磷酸丝氨酸,磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明多肽还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐:氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。其他盐包括:与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐,以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。
如本文所用,“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的,但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开,则为分离纯化的。
如本文所用,“分离的重组融合蛋白”是指重组融合蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化重组融合蛋白。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体,其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的,等位变异体是一个多核苷酸的替换形式,它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入,但不会从实质上改变其编码多肽的功能。
如本文所用,术语“引物”指的是在与模板配对,在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA,也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸,但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如,在一个3'端与模板互补的引物的5'端加上一段与模板不互补的序列,这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合,非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物,从而进行扩增。
本发明融合蛋白或其元件的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据已公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。当序列较长时,常常需要进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择,并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体,以及用本发明的载体或融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞,以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。
通过常规的重组DNA技术,可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤:
(1).用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体),或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞;
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞;
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上,以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外,表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP),或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体,可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属的细菌细胞;真菌细胞如酵母;植物细胞;果蝇S2或Sf9的昆虫细胞;CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
抗体
本发明中,“抗体”、“配体”可互换使用,是指对本发明蛋白具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体,尤其是单克隆抗体。这里,“特异性”是指抗体能分别结合于本发明蛋白或其片段。较佳地,指那些能与本发明蛋白或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体,而且还包括具有免疫活性的抗体片段,如Fab'或(Fab)2片段;抗体重链;抗体轻链;遗传工程改造的单链Fv分子;或嵌合抗体。
连接肽
本发明提供了一种融合蛋白,它可任选地含有连接肽(肽接头)。连接肽大小和复杂性可能会影响蛋白的活性。通常,连接肽应当具有足够的长度和柔韧性,以保证连接的两个蛋白在空间上有足够的自由度以发挥其功能。同时避免连接肽中形成α螺旋或β折叠等对融合蛋白的稳定性的影响。
连接肽的长度一般为0-10个氨基酸,较佳地1-5个氨基酸。
药物组合物及施用方法
本发明还提供了一种组合物,它含有有效量的本发明的融合蛋白,以及药学上可接受的载体。通常,可将本发明的融合蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,其中pH通常约为5-8,较佳地,pH约为6-8。
如本文所用,术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量,如0.001-99wt%;较佳的0.01-95wt%;更佳的,0.1-90wt%。
如本文所用,“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的,即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体,包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的融合蛋白以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配,本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
本发明融合蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:本发明融合蛋白的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等;患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。针对肿瘤患者,通常,当本发明的融合蛋白每天以约0.5mg-5mg/kg动物体重(较佳的2mg-4mg/kg动物体重)的剂量给予,能得到令人满意的效果。例如,由治疗状况的迫切要求,可每天给予若干次分开的剂量,或将剂量按比例地减少。
本发明的主要优点在于:
(1)增加IL21稳定性。
(2)延长IL21半衰期。
(3)由于融合有HSA,能够补充体内特别是肿瘤病人体内的蛋白。
(4)IL21蛋白在酵母中表达困难,而IL21和HSA的融合蛋白,在酵母中能够很好的表达,因此本法明能够显著降低IL21的生产成本。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)或植物分子生物学-实验手册(PlantMolecularBiology-ALaboratoryMannual,MelodyS.Clark编,Springer-verlagBerlinHeidelberg,1997)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
本发明中所用的试剂和材料均可从市售获得,其中Balb/C小鼠、SD大鼠SPF级,购自上海斯莱克实验动物中心,由本所动物中心饲养。
Jurkat细胞株购自中科院上海细胞库;大肠杆菌DH5a、BL21、BL21(RP)菌株、毕赤酵母GS115菌株购自购自Invitogen公司。
试剂:PMA+lonomycin、胶回收试剂盒、限制性内切酶、DNA连接酶、TaqPCR酶、T-Vector、BCA蛋白定量试剂盒、His-单克隆抗体(His-monoantibody)、羊抗鼠-HRP、羊抗人-HRP、iptg、ppic9、pet28a购自TAKARA公司;第二代IL21Elisa方法快速检测试剂盒(HumanIL-21ElisaReady-SET-Go!(2ndGeneration))购自eBioscience公司。
实施例1IL21基因和HSA基因的获得
人外周血淋巴细胞经过PMA+lonomycin刺激48小时后,抽提RNA,反转录得到cDNA,以cDNA为模板,扩增得到IL21基因。
人外周血淋巴细胞mRNA的逆转录PCR(RT-PCR)
以人外周血淋巴细胞总RNA为模板,以Oligo(dt)18为引物进行逆转录反应获得人外周血淋巴细胞mRNA方法参照Fermentas公司RT-PCR操作说明)。
以HSA的阳性质粒(可以采用本领域的常规方法制备HSA阳性质粒,具体制备方法可参考中国专利申请;CN201110067373.7或者参考陈静,陈枢青,血清白蛋白与PTH(1-34)融合蛋白的克隆、表达及鉴定,2006年全国生化与生物技术药物学术年会论文集)为模板,进行PCR扩增得到HSA片段。N-端带有his-tag标签。
以含有HSA的阳性质粒为模板扩增HSA片段PCR引物序列如表1所示。
表1HSA的PCR引物序列
上述PCR条件:96℃预变性5min;95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸90s,15个循环;72℃延伸10min。经电泳检测,扩增序列正确。
实施例2融合基因的获得
将上述基因片段通过拼接PCR的方式,将HSA的C端基因和IL21的N端基因连接,获得融合基因HSA-IL21(HI),送测序,和原始序列进行比对确认无氨基酸密码子突变后进行下一步实验。
表2HSA片段PCR引物序列
上述PCR条件:96℃预变性5min;95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸90s,15个循环;72℃延伸10min。
表3IL21片段PCR引物设计:IL21片段PCR引物序列
上述PCR条件:96℃预变性5min;95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,15个循环;72℃延伸10min。
表4融合基因HSA-IL21拼接PCR引物序列
上述PCR条件:96℃预变性5min;95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸90s,15个循环;72℃延伸10min。
表5PCR反应体系
实验结果如图1所示,图1显示人血清白蛋白(HSA)基因、IL21基因PCR、融合基因(HI)拼接PCR电泳图谱,DL2000为核酸分子量Marker,电泳证明PCR所得序列与预期相符。
实施例3融合蛋白在毕赤酵母GS115中的表达及纯化
将融合基因整合到酵母表达载体pPIC9中,构建重组表达质粒pPIC9-HSA-IL21,线性化处理后转化GS115菌株,终浓度0.5%甲醇诱导蛋白表达。表达完成后进行SDS-PAGE检测。
图2显示线性化处理pPIC9-HI质粒(pPIC9-HSA-IL21质粒),回收鉴定电泳图谱,DL10000泳道为DNA分子量标记,HSA-IL21/PPIC9泳道为pPIC9-HI质粒线性化后的电泳泳道,从图中可以看出线性化载体处理情况较好,条带亮而单一,可以使用软件程序估计DNA量。
毕赤酵母GS115中蛋白的表达与鉴定
1毕赤酵母GS115感受态制备
a)将-70摄氏度保存的GS115菌株采用划线法在YPD平板划线,30摄氏度温箱培养2天,至长出肉眼可见白色单菌落;
b)挑取上述GS115肉眼单菌落至3mlYPD培养基中,30摄氏度摇菌过夜;
c)按照1:100接种至装有50mlYPD培养基的三角瓶中,扩大培养,30摄氏度至OD0.6-1.0,冰上放置,待用;
d)将至少10mlGS115感受态离心,收菌体,冰ddH2O洗涤三次,冰1M山梨醇洗涤三次;少量(根据每次转化需要的支数确定最后的体积,一般每次每支感受态为80ul)1M山梨醇重悬GS115。
e)将处理好的线性质粒加入到80ulGS115感受态细胞中,混匀,加入到电击杯中,冰上放置。电击杯提前用无水乙醇浸泡至少10min.超净工作台吹干乙醇(残留乙醇对转化过程有影响)。
f)电击法转化毕赤酵母:转化条件2000V,5ms,点击后取出电极杯,迅速加入0.5ml1M山梨醇,混匀后,快速吸出,涂MD板。电击杯电击前需要在冰上放置,防止电击过程产热过多,对转化效率有影响。电击杯放进电机槽之前要注意干燥,防止电击时短路。
2毕赤酵母重组菌阳性菌落的筛选与蛋白表达鉴定
a)挑取MD平板上的白色单菌落至装有2mlBMGY液体培养基的中试管中,28摄氏度摇床培养过夜。
b)按照1:100接种量将上述中试管中的菌体接种至装有30ml的小三角瓶中,6层灭菌白沙布封口,28摄氏度摇至OD0.6后,0.5%甲醇诱导表达。
c)从第一次诱导开始,每24小时诱导一次,连续诱导3次。
d)取1ml菌体,12000rpm离心,加5μl5×上样缓冲液;100℃煮沸10min。
e)以未转质粒的GS115菌体作为阴性对照。
f)转PVDF膜进行WesternBlot检测。
SDS-PAGE电泳图谱如图3所示,图中泳道M为分子量标记,图3A中泳道1-6为HSA-IL21/PPIC9转化毕赤酵母蛋白后的表达情况鉴定,在80KD处有明显的条带,泳道7为GS115空白菌对照,泳道8-12为IL21蛋白表达鉴定图,可以看出,在15KD左右有处没有明显条带,说明IL21较难在GS115中表达。电泳结果表明,融合蛋白在毕赤酵母GS115中成功地进行了表达。
图3,泳道1-6:融合蛋白HSA-IL21/PPIC9(GS115)上清;7:GS115空菌诱导表达对照;8-12:IL21/PPIC9(GS115)上清。
3融合蛋白镍柱纯化
纯化步骤为:PBS平衡镍柱5-10个柱体积;上样,重复两次;PBS洗涤5个柱体积;低浓度咪唑洗涤杂蛋白10Mm,20mM;500mM咪唑洗脱蛋白;使用透析袋在PBS中透析,除咪唑,过夜;超滤管浓缩,测蛋白浓度;SDS-PAGE电泳检测。
对纯化后的融合蛋白进行SDS-PAGE检测,结果如图4所示,图中在80KD处有明显条带,与预期相符。
对比例1将人IL21在毕赤酵母表达系统中进行表达
将人IL21在毕赤酵母表达系统中进行表达,通过将人IL21基因构建到毕赤酵母表达载体pPIC9中,通过SDS-PAGE和western-blot方法检测IL21是否有表达。
1、IL21(毕赤酵母GS115中表达)基因的PCR引物及反应条件:
表6IL21片段PCR引物序列
PCR条件:96℃预变性5min;95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,15个循环;72℃延伸10min。
2、以人外周血淋巴细胞全基因组DNA为模板,选择合适的酶切位点,设计合理的上下游引物,通过PCR方法获得人IL21基因片段,经过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定与预期相符,电泳结果如图5所示。
3、上述回收产物连接pMD18-T,连接转化大肠杆菌DH5a,筛选阳性克隆,测序正确。
4、同时双酶切处理载体pPIC9和IL21/pMD18-T,分别回收后,连接体系进行连接,构建酵母重组表达载体IL21/PPIC9,酶切鉴定阳性克隆。上述阳性质粒可经SalI单酶切线性化后转化毕赤酵母感受态GS115。
实验结果如图3B所示,电泳结果中,泳道8、9、10、11、12为IL21蛋白表达鉴定结果,泳道7为空白GS115菌诱导表达电泳结果,可以看出,在15KD左右有处没有明显条带。将酵母表达上清通过镍柱纯化,电泳鉴定也没有观察到条带,因此本实验证明IL21在毕赤酵母中表达困难。
对比例2将IL21在大肠杆菌BL21中进行表达
IL21/pET28a大肠杆菌重组表达载体的构建
以人外周血淋巴细胞全基因组DNA为模板,选择合适的酶切位点,设计合理的上下游引物,通过PCR方法获得人IL21基因片段,经过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,在400bp左右有明亮单一条带出现,即为目的条带,结果如图5所示。
上述回收产物连接pMD18-T,连接转化大肠杆菌DH5a,筛选阳性克隆,测序正确。
同时双酶切处理载体pET28a和IL21/pMD18-T,分别回收后,连接体系进行连接,构建大肠杆菌重组表达载体IL21/pET28a,双酶切鉴定阳性克隆。
将上述酶切鉴定为阳性的质粒转化大肠杆菌BL21感受态中诱导表达,电泳鉴定表达结果。
电泳结果分析:由图6(1为沉淀,2为上清,3为全菌,4为对照,转化有空质粒PET28a的大肠杆菌,可以看出IL21蛋白在大肠杆菌BL21菌株中有表达,且为包涵体表达,条带很浅,说明表达量很低。
对比例3将IL21在含有稀有密码子的BL21(RP)菌株中的表达
将人IL21在大肠杆菌BL21(RP)表达系统中进行表达,实验步骤同上,只是后期转化的是BL21(RP)菌株。
结果分析:由图7(1-3分别为对照菌上清、沉淀、全菌,4-6分别为重组菌上清、沉淀、全菌)可见,在含有稀有密码子的大肠杆菌BL21(RP)菌株中,IL21蛋白有大量表达,但在包涵体中表达。最终优化的诱导条件为:37摄氏度诱导表达6小时,IPTG0.5mM
将包涵体表达的IL21蛋白进行复性,以进行后续试验。
实施例4蛋白活性测定
IL21蛋白可作用于jurkat细胞,引起jurkat细胞的凋亡,因此本实验以IL21为研究对象,设计实验方案,检测IL21蛋白和融合蛋白HSA-IL21是否具有生物学活性。
检测手段:CCK8试剂盒测OD450nm吸光值。
(1)超净工作台中操作:将培养至生长对数期的jurkat细胞转移至15mL离心管,800rpm,25摄氏度离心10min后,吸出上清液,加入新鲜RPMI1640(10%胎牛血清),无菌吸管重悬,测细胞数量。
(2)根据计数结果,按照每孔5*10^4个/100铺板,注意不要有气泡。并设置空白对照,即新鲜RPMI1640(10%胎牛血清)/100ul每孔。
(3)将用新鲜RPMI1640(10%胎牛血清)不同倍数稀释后的HSA-IL21蛋白和IL21蛋白,分别加10ul到对应的细胞培养板孔中,并设置阴性对照,即不加任何蛋白刺激,只相应加入10ul新鲜RPMI1640(10%胎牛血清)。空白对照处理相同。
(4)将上述细胞培养板放置到37摄氏度,5%CO2培养箱中继续孵育,分别于不同时间点1h、2h、3h、24h取出使用CCK8试剂盒检测细胞凋亡情况。
(5)加入10ulCCK8工作液,放回37摄氏度,5%CO2培养箱中继续孵育20min,读取OD450nm处吸光光度值,记录。并用相关生物软件作图,分析细胞增殖抑制情况。
实验结果如图8所示,由于IL21和HSA-IL21分子量为1:5,上述实验实验结果表明在相同摩尔比的情况下两种蛋白对jurkat细胞的作用效果基本相同,即具有明显的抑制jurkat细胞增殖促进其凋亡的作用,因此本发明的HSA-IL21融合蛋白具有与天然IL21相同的活性。
实施例5融合蛋白安全性检测
以普通8周龄Balb/c小鼠作为研究对象,分四组研究,分别为三个浓度梯度的HSA-IL21给药组;1ug/ml/只、10ug/ml/只、100ug/ml/只,PBS给药组,尾静脉注射小鼠后,观察小鼠的活动,监测体温情况,以及体重变化情况,每隔一天测一次小鼠体重,持续观察两周时间,记录数据,进行分析。
结果如图9所示,实验证明各组小鼠的生理状态良好,无不良反应。PBS组处理的小鼠体重稍微有增加趋势,100ug/ml/只HSA-IL21处理的小鼠体重较之PBS组体重略有下降,但下降幅度不明显。证明本发明的融合蛋白具有良好的安全性。
实施例6非融合蛋白和融合蛋白体外稳定性检测
将纯化后的蛋白置于-20℃保存,然后分不同的时间(-20℃冻存之前、-20℃冻存两周、-20℃冻存3个月、-20℃冻存6个月)电泳鉴定观察蛋白降解情况。
本实施例分四部分进行:
(1)包涵体表达的IL21蛋白复性后SDS-PAGE检测在不同时间的蛋白降解情况。
(2)包涵体表达的IL21蛋白复性后Native-PAGE检测在不同时间的蛋白降解情况。
(3)毕赤酵母上清表达的HSA-IL21蛋白SDS-PAGE检测在不同时间的蛋白降解情况。
(4)毕赤酵母上清表达的融合蛋白HSA-IL21Western-Blot检测融合蛋白HSA-IL21降解发生的位置,以确定人血清白蛋白HS是否发挥了保护IL21蛋白不被降解的作用。
对IL21蛋白体外稳定性分析:
IL21蛋白为大肠杆菌BL21(RP)菌株表达的包涵体蛋白,包涵体蛋白经尿素变性洗涤后,通过稀释复性的方法获得接近自然状态的IL21蛋白。由图10A、图11A可见蛋白条带单一,有较少拖尾条带,纯度达95%以上,复性效果较为理想。
-20℃保存两周左右的IL21蛋白仍然具有较好的稳定性,从图10B、图11B可以看出IL21蛋白条带比较单一,未出现大面积的弥散条带,性质相对稳定.
-20℃冻存3个月左右蛋白降解情况较为严重,由图10C、图11C可以看出和刚复性好的蛋白相比,冻存3个月后的发生降解情况比较严重。
-20℃冻存6个月左右后蛋白降解相对更多,见图10D、图11D。
融合蛋白HSA-IL21体外稳定性结果分析:
由图12A可以看出,融合蛋白在刚纯化出来进行电泳鉴定时就发现有三条特异性条带,后经western-blot鉴定,三个大小相近的片段均含有IL21蛋白表位,说明该融合蛋白较容易降解。由图12B(-20℃冻存两周)、12C(-20℃冻存三个月)、12D(-20℃冻存六个月)可见,制备的融合蛋白HSA-IL21在-20℃保存的条件下,随着时间变化的降解比例越来越大。
为了鉴定融合蛋白HSA-IL21降解发生在蛋白的N-端还是C-端,即通过western-blot的方法鉴定纯化的融合蛋白HSA-IL21的降解位置。
实验结果如图13所示,由western-blot结果分析可以知道融合蛋白HSA-IL21降解主要发生在蛋白的N-端,即从白蛋白HSA部分开始发生降解,融合蛋白的C-端IL21部分相对完整。由此可见,在IL21蛋白的N-端连接人血清白蛋白HSA可以起到很好的保护IL21蛋白不被降解的作用。
蛋白体外活性随稳定性变化研究
将-20℃保存的蛋白,每隔一段时间取样,检测蛋白体外活性随时间变化情况。融合蛋白HSA-IL21作用浓度为100ug/L,IL21蛋白作用浓度为20ug/L,作用时间均为24小时。结果如15所示,由图可知,IL21蛋白随时间变化活性有所降低。
HSA-IL21蛋白活性基本无变化。说明本发明的融合蛋白,在稳定性方面,远优于IL21蛋白。
实施例7融合蛋白体内半衰期检测
SD大鼠,雌性,5-6周龄,血液体积约6-8ml,按照7ml计算。
IL21(分子量15KD):注射剂量为100ug/ml/只
HSA-IL21(分子量80KD):注射剂量为500ug/ml/只
注射方式:尾静脉注射
鉴于试剂盒灵敏度范围在8pg/ml-1000pg/ml,故ELISA检测前将血清按照1:100稀释。
试验结果如图14所示,从图中可以看出IL21和HSA-IL21在SD大鼠体内的变化情况:
IL21注射组蛋白在SD大鼠体内浓度降解到一半的时间大概是在7h左右;
而HSA-IL21注射组蛋白在SD大鼠体内浓度降解到一半的时间约为130h。由此可知HSA-IL21和非融合的IL21相比,在SD大鼠血液中的半衰期显著延长,约为非融合蛋白半衰期的18倍左右。
实施例8构建IL21-HSA融合蛋白在毕赤酵母中检测是否有表达
参照实施例1-3的操作,构建IL21-linker-HS融合蛋白在毕赤酵母中进行表达。
表7IL21片段PCR引物序列
PCR条件:96℃预变性5min;95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,15个循环;72℃延伸10min。
表8HSA片段PCR引物序列
PCR条件:96℃预变性5min;95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸90s,15个循环;72℃延伸10min。
表9融合基因IL21-HSA拼接PCR引物序列
经SDS-PAGE和western-blot检测,该蛋白无法在GS115中无表达。图16A显示了SDS-PAGE电泳结果,泳道1、2为实验组,泳道GS115为对照组,在80KD处未见有明显条带,没有蛋白表达。采用灵敏度更高的western-blot鉴定,实验结果如图16B所示,一抗为鼠抗人His-tag-Ab,二抗为兔抗人IgG-HRP,泳道1、2为实验组,泳道GS115为对照组,电泳证明该蛋白在GS115中无表达。
讨论:
本发明中融合蛋白HSA-IL21在GS115中有表达,而IL21蛋白在GS115中无表达。此结果说明,融合蛋白更容易在酵母细胞中成功表达,而且相比于IL21蛋白融合蛋白HSA-IL21的半衰期得到了极大的延长。通过本发明的方法制备的融合蛋白HSA-IL21,半衰期明显延长,而且由于HSA的存在能有效的保护IL21不被降解,又能保留IL21的生物活性。另外,也可以在本发明融合蛋白的基础上,经过降解制备IL21,能够显著降低制备IL21的成本。HSA的存在有很多优点,一方面HSA不存在糖基化位点,使得在酵母中表达时不会增加糖基化基团,这大大降低了蛋白的免疫原性;另一方面,HSA的存在,可以补充病人体内特别是肿瘤病人体内的蛋白质,这针对一些特殊人群如低蛋白症肿瘤患者有双重功效。另一方面,本发明人实验发现IL21-HSA融合蛋白在酵母内表达困难,说明酵母表达系统对IL21融合蛋白中的表达元件的排列顺序具有一定的选择性,具体原因需要进一步地研究。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白具有式Ia或式Ib所述结构:
A-B-C(Ia),或
C-B-A(Ib)
其中,
A为包括白介素-21的多肽元件;
B为连接肽;
C为包括血清白蛋白的多肽元件;
“-”表示连接上述各元件的肽键。
2.如权利要求1所述的融合蛋白,其中,所述元件A包含SEQIDNO:1中第30-162位所示的氨基酸序列并且长度为133-170个氨基酸。
3.如权利要求1所述的融合蛋白,其中,所述的元件C包含SEQIDNO:2中第25-609位所示的氨基酸序列,并且长度为585-650个氨基酸序列。
4.一种分离的多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋白。
5.一种载体,其特征在于,所述载体包括权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞表达权利要求1所述的融合蛋白;和/或
所述宿主细胞含有权利要求5所述的载体;和/或
所述宿主细胞基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸。
7.一种制备融合蛋白的方法,其特征在于,包括步骤:
在适合表达的条件下,培养权利要求6所述的宿主细胞,从而表达出权利要求1所述的融合蛋白;和
分离所述融合蛋白。
8.一种制备白介素-21或其类似物的方法,其特征在于,所述方法选自:
(a)将本发明第一方面的融合蛋白降解为白介素-21或其类似物;和
分离纯化所述白介素-21或其类似物;和
(b)将白介素-21基因在含有稀有密码子的大肠杆菌菌株中表达白介素-21包涵体。
9.一种药物组合物,其特征在于,所述组合物包含:权利要求1所述的融合蛋白,以及药学上可接受的载体或赋形剂。
10.权利要求1所述的融合蛋白的用途,其特征在于,用于制备治疗疾病的药物。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20151230 |
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |