CN108864309B

CN108864309B - 重组人sod-生长因子融合蛋白、其制备方法及其应用

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Publication number: CN108864309B
Application number: CN201810839444.2A
Authority: CN
Inventors: 黄亚东; 项琪; 肖巧学
Original assignee: Taiyuan Guangzhou Biotechnology Co ltd; Guangzhou Jinan University Medical Biotechnology Research And Development Center Co ltd
Current assignee: Taiyuan Guangzhou Biotechnology Co ltd; Guangzhou Jinan University Medical Biotechnology Research And Development Center Co ltd
Priority date: 2018-07-26
Filing date: 2018-07-26
Publication date: 2021-07-13
Anticipated expiration: 2038-07-26
Also published as: CN108864309A

Abstract

本发明提供一种重组人SOD‑生长因子融合蛋白、其制备方法及其应用。所述融合蛋白由与人SOD至少85％序列同源的第一区和与人生长因子至少85％序列同源的第二区组成，第一区与第二区之间设有连接肽(GGGGS)n，其中n＝1～5，优选n＝3。本发明还涉及编码所述融合蛋白的核苷酸序列、携带该核苷酸序列的重组细胞。该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入。本发明的重组人SOD‑生长因子融合蛋白兼具人SOD和人生长因子的特性，复配以适当辅料后，可进一步制备成冻干粉剂、纳米微球、纳米脂质体、水剂、凝胶等半固体制剂，作为活性添加剂应用于组织工程、药学以及美容护肤领域。

Description

重组人SOD-生长因子融合蛋白、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及到基因工程领域，通过基因重组的方法获得了重组人SOD-生长因子融合蛋白。本发明还涉及所述重组人SOD-生长因子融合蛋白在组织工程、药学以及美容护肤领域中的应用。

背景技术

1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶，直到1969年McCord等重新发现这种蛋白的生物活性，被正式命名为超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)。超氧化物歧化酶广泛存在于各种生命体中，是体内对抗自由基的第一道防线，它可以将O^2-歧化为H₂O₂和O₂，而H₂O₂可被过氧化氢酶催化分解，最终清除O^2-。SOD对O^2-的及时清除保证了机体内O^2-的相对平衡，但由于体内的SOD随着年龄的增加而逐渐减少，再加上环境的恶化，大量自由基超过身体负荷，机体在自由基清除不足和抗氧化能力下降的情况下，产生系列连锁放大反应，正常细胞被损坏，从而引发衰老或疾病，因此外源补充成为必要。

SOD作为一种生物酶制剂，在抗氧化应激、抗炎、抗衰老、抑制肿瘤等方面有重要作用，广泛应用于临床和科研上，由于它具有抗氧化的优良性能，可添加在化妆品中，以SOD为主要成分的产品一时成为风靡，但一般的微生物、动植物中提取出来的SOD稳定性差，不耐高温和酸，随着生物技术的发展，利用基因工程技术生产SOD，其产率、质量、安全性得到提高，但技术瓶颈仍然是其稳定性差，难以长期保持活性。

因此，本领域中亟需开发稳定性好、半衰期长、活性优的SOD蛋白衍生物，以满足应用需求。

发明内容

本发明涉及一种重组人SOD-生长因子融合蛋白、其制备方法及其应用。本发明还涉及编码所述融合蛋白的核苷酸序列，携带该核苷酸序列的重组细胞，例如，细菌、酵母、动物细胞、植物细胞。

本发明的重组人SOD生长因子融合蛋白的半衰期较单独的SOD长，活性优于单独的SOD，不仅能迅速清除创伤部位的大量自由基，同时促进创伤部位血管和神经的修复再生，提高免疫，加速止血、愈合，活性保存时间长，不易丧失。

本发明获得的重组人SOD-生长因子融合蛋白纯度达95％以上，兼具人SOD和人生长因子的特性，复配以适当辅料后，可进一步制备成冻干粉剂、纳米微球、纳米脂质体、水剂、凝胶等半固体制剂，作为活性添加剂应用于组织工程、药学以及美容护肤领域。该重组人SOD-生长因子融合蛋白具有人源化，免疫原性低，不易发生过敏反应的突出优点。

在第一方面，本发明提供一种重组人SOD-生长因子融合蛋白，所述融合蛋白由第一区和第二区组成，其中第一区与人SOD至少85％序列同源，第二区与人生长因子至少85％序列同源。并且所述第一区与第二区之间设有连接肽，所述连接肽的通式是(GGGGS)n，其中n＝1～5，优选n＝3。

优选地，第一区与人SOD至少90％、更优选至少95％、甚至至少99％序列同源，第二区与人生长因子至少90％、更优选至少95％、甚至至少99％序列同源。

更优选地，第一区为人SOD，第二区为人生长因子。

并且，在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入所得到的融合蛋白的衍生物也在本发明的范围内。

在优选的实施方案中，所述重组人SOD-生长因子融合蛋白由第一区和第二区组成，其中第一区为人SOD，第二区为人生长因子，并且所述第一区与第二区之间的连接肽为(GGGGS)n，其中n＝1～5，优选n＝3。

在本发明的某些实施方案中，提供了一种重组人SOD-生长因子融合蛋白，其特征在于该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入。

在本发明的某些实施方案中，提供了一种重组人SOD-生长因子融合蛋白，其特征在于所述与人SOD同源的第一区位于融合蛋白的N-末端，与人生长因子同源的第二区位于融合蛋白的C-末端，第一区和第二区之间的连接肽为(GGGGS)n，其中n＝1～5，优选n＝3。

根据本发明的某些实施方案中的一个方面，提供的上述任何一项所述的融合蛋白，其特征在于所述的人生长因子选自aFGF、bFGF、EGF或NGF。在优选的实施方案中，所述人生长因子为bFGF。

在更优选的实施方案中，在所述重组人SOD-生长因子融合蛋白中，第一区为人SOD，第二区为人aFGF(人酸性成纤维生长因子)。其中第一区位于融合蛋白的N-末端，第二区位于融合蛋白的C-末端，二者通过连接肽(GGGGS)n连接，其中n为3。

具体地，所述重组人SOD-生长因子融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。

在第二方面，本发明提供编码本发明第一方面的重组人SOD-生长因子融合蛋白的核苷酸序列。

优选地，当第一区为人SOD，第二区为人aFGF，并且其中第一区位于融合蛋白的N-末端，第二区位于融合蛋白的C-末端，第一区和第二区通过连接肽(GGGGS)3连接，所述编码核苷酸序列为SEQ ID No.2或3。其中SEQ ID No.2具有大肠杆菌密码子偏好性，SEQ IDNo.3具有酵母密码子偏好性，分别适合在大肠杆菌和酵母细胞中表达所述融合蛋白。

在第三方面，本发明提供了一种包含重组人SOD-生长因子融合蛋白的编码核苷酸序列的重组细胞，所述细胞可以选自细菌、酵母、动物细胞或植物细胞，其中优选酵母或大肠杆菌细胞，酵母细胞优选是毕赤酵母细胞。

在第四方面，本发明提供所述重组人SOD-生长因子融合蛋白的应用。本发明的融合蛋白复配以适当辅料后，可进一步制备成冻干粉剂、纳米微球、纳米脂质体、水剂、凝胶等半固体制剂，作为活性添加剂应用于组织工程、药学以及美容护肤领域。

在第五方面，本发明提供一种活性添加剂，其包含本发明所述的重组人SOD-生长因子融合蛋白。所述添加剂中还可以复配以适当的辅料，应用于组织工程、药学以及美容护肤领域。并且，所述添加剂可以与适当的辅料进一步制备成冻干粉剂、纳米微球、纳米脂质体、水剂、凝胶等半固体制剂。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图1.(A)重组hSOD1-haFGF融合基因的获得，引物F1/R1用于扩增基因hSOD1，5’端加了BamHI酶切位点，3’端加了编码接头GGGGS的核苷酸序列，F2/R2用于扩增基因hSOD1，3’端加了EcoRI酶切位点，5’端加了编码接头GGGGS的核苷酸序列，用F1/R1和F2/R2扩增的两个基因作模板，用F1/R2扩增就能得到融合基因；(B)重组质粒pET28a-hSOD1-haFGF的构建示意图。

图2.编码融合蛋白的核苷酸的PCR验证。泳道1：DL2000；泳道2：编码融合蛋白的核苷酸片段，约为900bp(理论值为933bp)。

图3.在大肠杆菌中表达的融合蛋白的SDS-PAGE电泳图。泳道1：分子量Marker；泳道2-3：融合蛋白。

图4.蛋白质印迹结果。(A)和(B)分别为haFGF和hSOD1。

图5.琼脂糖凝胶电泳图。泳道1：分子量Marker；泳道2：重组质粒pPIC9k-hSOD1-haFGF；泳道3：hSOD1-haFGF融合基因片段。

图6.在酵母中表达的融合蛋白的SDS-PAGE电泳图，泳道M：分子量Marker；泳道1：融合蛋白。

图7.重组pPIC9k-hSOD1-haFGF图谱。

图8.WST-1法测定SOD活性的原理。

图9.单独的SOD(◇)和本发明的重组SOD-生长因子融合蛋白(□)的稳定性检测结果。

具体实施方式

下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。

实施例1重组人SOD-haFGF融合蛋白的在大肠杆菌系统的构建、表达和纯化

其中所述重组人SOD-haFGF融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1。其中haFGF表示人酸性成纤维蛋白。

相应地，该融合蛋白的大肠杆菌密码子偏好性的编码核苷酸序列为SEQ ID No.2。

1、构建融合基因

根据Genebank公布的基因序列，合成hSOD1和haFGF基因序列(由华大基因公司全基因合成)。分别设计引物F1，R1，F2和R2，采用PCR分别扩增出hSOD1(引物F1和R1，引物序列如下)和haFGF(引物F2和R2，引物序列如下)的基因片段。利用重叠延伸法，得到融合片段模板，以此模板进行PCR扩增融合片段hSOD1-haFGF-1(SEQ ID No.2)。用于扩增hSOD1的引物(从5’到3’方向)：

F1：CGCGGATCCATGCATCATCATCATCATCAC(下划线为BamHI位点)

R1：CGATGGTGGTGGTGGCTGCGCAATGCCAATCACGCC

用于扩增haFGF的引物：

F2：GGTGGTGGTGGTAGCGCCAACTATAAAAAACCT

R2：CCGGAATTCTTAATCGCTGCTAACAGG(下划线为EcoRI位点)

将构建成功的融合片段hSOD1-haFGF-1用EcoRI和BamHI酶切后与经相同酶酶切的pET28a质粒(购自Invitrogen公司，由实验室保存)连接，构建重组质粒，名称为：pET28a-hSOD1-haFGF，经酶切及测序检测，序列正确。

2、融合基因在大肠杆菌DE3中的表达

将含所构建的融合基因pET28a-hSOD1-haFGF的质粒转化E.coli DE3。方法如下：

(1)挑取E.coli DE3单菌落，接种于3～5ml LB液体培养中，37℃振荡培养8h左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1∶100～1∶50(v/v)转接于50ml LB液体培养基中，37℃扩大培养10h；

(2)取2ml培养液转入2ml离心管中，在冰上冷却20-30min，于4℃，4000r/min离心10min；

(3)倒净上清培养液，用1ml冰冷的0.1mol/L CaCl₂溶液轻轻悬浮细胞，冰浴；

(4)0～4℃，4000r/min离心10min；

(5)弃去上清液，加入500μl冰冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，小心悬浮细胞。0～4℃，4000r/min离心10min；

(6)弃去上清液，加入100μl冰冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；

(7)分别取3个100μl感受态细胞悬液，加入10μl重组质粒DNA(体积不超过10μl)+100μl感受态细胞，轻轻摇匀冰上放置30min，立即于42℃水浴中保温1.5min，然后迅速冰上冷却2min；

(8)立即向上述管中分别加入0.9ml LB液体培养基，摇匀后于37℃振荡培养约45～60min，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达卡那霉素抗性基因产物；

(9)取上述液体涂布于添加卡那霉素LB平板培养12h；

(10)挑取划线分离后的转化子于30ml添加卡那霉素的LB培养基中，37℃培养10h，取1ml转接至50ml LB培养基中，37℃培养约8h，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，诱导5h后收集菌体，破壁后收集上清，利用蛋白质印迹(western-blot)进行检测。

3、融合蛋白的发酵、纯化

将含有表达质粒pET28a-hSOD1-haFGF的E.coli于37℃培养至对数期，加入IPTG至终浓度1mmol/L，诱导4h。4000rpm/min离心20min收集菌体，用无菌20mmol咪唑/0.5molNaCl pH 7.8，重悬沉淀，高压均质破碎大肠杆菌，4℃，20000rpm/min离心20min，取上清；上样至用20mmol咪唑/0.5mol NaCl pH7.8预平衡的Ni柱，继续用20mmol咪唑/0.5mol NaClpH7.8洗杂，直至基线走平；换50mmol咪唑/0.5mol NaCl pH4.0洗去杂质直至基线走平；改为50mmol咪唑/0.5mol NaCl pH 7.8洗去杂质直至基线走平；再用300mmol咪唑/0.5molNaCl pH 7.8的缓冲液将目的蛋白洗脱。含目的蛋白洗脱液经1∶1稀释后加入0.5％烷基葡萄糖苷上样至用0.3mol NaCl/0.5％烷基葡萄糖苷pH 7.8预平衡的G25凝胶柱进行脱盐。

纯化得到的蛋白经SDS-APGE电泳，考马斯亮蓝染色显示，与分子量Marker对照，在Mr34000附近有一条目的条带(图3)，制得的hSOD1-haFGF融合蛋白的分子量约为32KDa，纯度达到90％以上。

实施例2重组人SOD-haFGF融合蛋白在毕赤酵母的构建、表达和纯化

其中所述重组人SOD-haFGF融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1，其酵母密码子偏好性的编码核苷酸序列为SEQ ID No.3。

1、构建融合基因

根据Genebank公布的基因序列，结合酵母密码子偏好性重新合成hSOD1和haFGF基因序列。分别设计引物hSOD-F，hSOD1-haFGF-R，hSOD1-haFGF-F和haFGF-R(引物序列见下)，采用PCR分别扩增出hSOD1(引物为hSOD-F和hSOD1-haFGF-R)和haFGF(引物为hSOD1-haFGF-F和haFGF-R)的基因片段。

引物序列(从5’到3’方向)：

hSOD1-F：TTCCGGAATTCCATCATCATCATCATCAC(下划线表示EcoRI位点)

hSOD1-haFGF-R：GTAGTTAGCCTGCGCAATGCCAATCACG

hSOD1-haFGF-F：ATTGCGCAGGCTAACTACAAGAAG(下划线表示NotI位点)

haFGF-R：TAATATTAGCGGCCGCTTAATCAGAAGAAACTGG

将上述得到的hSOD1和haFGF片段等量混合，互为模板进行PCR，得到融合片段模板hSOD1-haFGF，以hSOD1-haFGF为模板进行PCR扩增酵母密码子偏好的融合片段hSOD1-haFGF-2(SEQ ID No.3)。

2、重组表达质粒的构建

将构建成功的酵母密码子偏好的融合片段hSOD1-haFGF-2用EcoRI和NotI酶切后连接到用相同的酶酶切的pPIC9k质粒(质粒购自Invitrogen公司，由实验室保存)上，得到的重组质粒为：pPIC9k-hSOD1-haFGF，经酶切及测序检测，序列正确。

3、融合基因在毕赤酵母中的表达

将含所构建的融合基因pPIC9k-hSOD1-haFGF的质粒转化毕赤酵母GS115，用作转化的毕赤酵母还可以是KM71，X33等(GS115、KM71、X33酵母菌株购自Invitrogen公司，由实验室保存)。

挑取转化子于MD平板上进行多次划线分离，挑取单菌落于15ml YPD培养基中，30℃培养10h，即为种子液。取1ml种子液转接至30ml YPG培养基中，30℃培养约16h后收集菌体，重悬于pH 5.5无甘油的BSM培养基中，添加0.5％甲醇(均已添加PTM1培养基)进行诱导，每隔12h添加0.5％甲醇，离心收集取上清进行SDS-PAGE，分析证实，上述融合基因在毕赤酵母GS115中获得高效表达。

MD培养基成分：1.34％YNB，0.004％生物素，2％葡萄糖；

YPD培养基成分：2％蛋白胨，1％酵母提取物，2％葡萄糖；

YPG培养基成分：2％蛋白胨，1％酵母提取物，2％甘油；

BSM培养基成分：26.7mL/L 85％磷酸，0.93g/L二水硫酸钙，18.2g/L硫酸钾，14.9g/L七水合硫酸镁，4.13g/L氢氧化钾，40g/L甘油。

PMT1培养基成分：CuSO₄·5H₂O 6.0g/L(五水硫酸铜)，0.088g/L碘化钾，MnSO₄·1H₂O 3.0g/L(一水合硫酸锰)，0.2g/L二水钼酸钠，0.02g/L硼酸，0.5g/L六水氯化钴，20.0g/L氯化锌，65.0g/L七水合硫酸亚铁，0.2g/L生物素，5.0ml浓H₂SO₄。

4、融合蛋白的纯化

发酵结束后，离心收集上清，经微滤(0.45μm)和超滤(MWCO＝30kDa)浓缩后，上Ni柱，脱盐后，收集峰，得到最终纯化产品。融合蛋白的SDS-PAGE电泳图见图6，分子量约为32KDa。

实施例3重组人hSOD1-haFGF的活性测定

1、活性测定原理

超氧化物歧化酶(SOD)是一种重要的抗氧化酶，它可以催化超氧阴离子(O^2-)的歧化反应，生成过氧化氢和单质氧，WST-1法是利用水溶性四唑盐WST-1(2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯基)-2氢-四唑盐，二钠盐)能与超氧阴离子(O^2-)反应生成一种水溶性的染料，WST-1被超氧阴离子还原的比率与黄嘌呤氧化酶的活性线性相关，并且会被SOD所抑制(见图8，即粉色区域SOD反应优先发生，SOD反应完后蓝色区域WST-1反应才能发生)，因此，SOD或SOD类似物的IC50(50％的抑制浓度)就能用比色法来测定。

2、试剂组成与配制(试剂盒购自南京建成生物工程研究所，批号：20120808)

试剂组成：(1)缓冲液：12mL×1瓶

(2)底物贮备液：0.06mL×1支

(3)酶贮备液：0.11mL×1支

(4)酶稀释液：1.5mL×1瓶

溶液配制：

(1)底物应用液的配制：底物贮备液：缓冲液按1∶200的比例混匀配成底物应用液，现用现配，用多少配多少，用不完的2至零下8℃可保存7天。

(2)酶工作液的配制：酶贮备液：酶稀释液按1∶10的比例混匀配成酶工作液，现用现配，用多少配多少，用不完的2至零下8℃可保存3天。3、仪器

酶标仪(450nm波长)(Thermo，3001-1473)；温孵育箱(科力仪器，PYX-250Q-A)；96孔微孔板(Corning)；

3、操作表

4、单位定义

单位定义：在本反应体系中SOD抑制率达50％时所对应的酶量为一个SOD活力单位(U)。

5、实验结果

计算公式

按公式计算样品的抑制率：

按公式计算SOD的活性

SOD比活力＝SOD活力/蛋白质浓度6、计算结果

分别纯化单独的SOD和重组SOD-生长因子样品，取抑制率接近50％的样品进行计算：

重组SOD-生长因子SOD活力(U/mL)＝56.8％÷50％×(0.24/0.02)×25＝340.75(U/mL)，

比活力＝340.75÷1.1＝309.77(U/mg)＞单独的SOD样品比活力(125.62U/mg)

表1.SOD活性测定结果分析

	重组SOD-生长因子	单独的SOD
			原浓度(mg/ml)	1.1	2.03
SOD活力(U/ml)	340.75	255
			比活力(U/mg)	309.77	125.62

实施例4重组SOD-生长因子稳定性的测定

在等温条件下，酶的失活一般服从一级反应动力学关系式。酶的失活半衰期可表示为式(1)：t_1/2＝0.693/[(-2.303/t)lgX/X₀]，其中X/X₀是t天后酶活力保持的百分数。以单独的SOD为对照，重组SOD-生长因子置于4℃下，隔日检测其活力。分别将第4天、第8天、第12天、第16天与第20天所得活力值代入公式，计算半衰期，取平均值。

根据图9中的相对酶活力与储存时间的关系由式(1)计算半衰期。经计算，在4℃，单独的SOD的半衰期为9.5天，本发明制备的重组SOD-生长因子半衰期为19.5天。结果表明，本发明制备的重组SOD-生长因子具有较好的储存效果，活性较为稳定。储存12天后，单独的SOD的相对酶活力在35％以下，重组SOD-生长因子的相对酶活力保持在60％以上。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行了具体的显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由权利要求书所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

Claims

1.一种重组人SOD-生长因子融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.编码权利要求1的融合蛋白的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其如SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示。

4.包含权利要求2或3的核苷酸序列的重组细胞，所述重组细胞选自包含权利要求2或3的核苷酸序列的细菌、酵母或动物细胞。

5.根据权利要求4的重组细胞，其为酵母细胞或大肠杆菌细胞。

6.根据权利要求5的重组细胞，其为毕赤酵母细胞。

7.一种活性添加剂，其包含权利要求1所述的融合蛋白，其中所述添加剂中还复配以适当的辅料，应用于组织工程、药学以及美容护肤领域。

8.根据权利要求7所述的活性添加剂，其中权利要求1所述的融合蛋白与适当的辅料进一步被制备成冻干粉剂、纳米微球、纳米脂质体、水剂或凝胶半固体制剂。