CN111647089A - 一种重组类人弹性蛋白及其组合物 - Google Patents

一种重组类人弹性蛋白及其组合物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组类人弹性蛋白及其组合物，由短重复氨基酸序列串联而成，所述短重复氨基酸序列为(VAPGVG)3S，串联重复3～7次构成目的蛋白多肽序列，所述目的蛋白多肽序列如SEQ NO.1所示。利用原核表达系统体外表达获得的重组类人弹性蛋白具有较高的超氧自由基清除活性。活性多肽片段经过较少次数的串联重复后具有较好的耐降解性能，催化活性较单一原始片段保持更久，辅以筛选后的保护剂成分，可以显著提高重组类人弹性蛋白的使用周期。

Description

一种重组类人弹性蛋白及其组合物
技术领域
本发明涉及重组蛋白领域，特别涉及一种重组类人弹性蛋白及其组合物。
背景技术
弹性蛋白是生皮组织中弹性纤维(elastic fiber)的主要成分。弹性蛋白的肽链含有713个以上的氨基酸残基。不同于胶原和角蛋白，弹性蛋白的氨基酸序列中不存在贯穿整个肽链的连续的重复性周期结构，但是存在交替的疏水和亲水性肤段。由氧化赖氨酰形成的锁链素和开链锁链素是弹性蛋白特有的交联结构。从牛颈韧带制得的弹性蛋白证明具有超氧自由基清除活性，而通过体外重组实验表达得到的人弹性蛋白无相关生物学活性报道。
由于全长人弹性蛋白的分子量较大，原核系统中克隆表达全长蛋白极易导致蛋白折叠错误，或产生包涵体蛋白，导致弹性蛋白无法形成有活性的空间结构，无法体外制备有活性的重组类人弹性蛋白，因此，可以设法通过提取全长弹性蛋白中的部分活性多肽序列进行体外重组构建有催化活性的重组类人弹性蛋白，以克服上述重组类人弹性蛋白的困难。然而，提取多肽片段进行重组类人弹性蛋白的构建又存在蛋白分子量小易降解，催化活性较低的问题，因此需要进行重组人弹性的进一步设计构建以克服这些问题。
对于经常需要使用的弹性蛋白，一般将弹性蛋白放在-20度保存，为了避免弹性蛋白反复冻融，一般的做法是在弹性蛋白中加入一定量的甘油，但仅仅加入甘油，可以避免弹性蛋白反复冻融，但不能有效的防止弹性蛋白的降解。且由于保护剂的成分比较多，加入的量不同对弹性蛋白的影响也不一样，所以需要一种方法来保护弹性蛋白稳定性和生物学活性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题：克隆重组类人弹性蛋白中的催化活性多肽序列，体外重组后的蛋白保持高催化活性，配合保护剂成分显著提高重组蛋白的耐降解性。
为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：
一种重组类人弹性蛋白，由短重复氨基酸序列串联而成，所述短重复氨基酸序列为(VAPGVG)3S，串联重复3～7次构成目的蛋白多肽序列，所述目的蛋白多肽序列如SEQNO.1所示。
优选地，所述(VAPGVG)3S片段的重复次数为5。
优选地，重组类人弹性蛋白的蛋白质编码基因序列为SEQ NO.2，所述蛋白质编码基因序列的5’端插入酶切位点BamH I和3’端插入酶切位点Hind III，所述蛋白质编码基因序列采用大肠杆菌表达系统进行重组蛋白表达。
优选地，所述大肠杆菌表达系统中载体为pET32a(+)，重组蛋白90％以上以可溶性蛋白形式表达，重组蛋白分子量大小为30kDa。
一种重组类人弹性蛋白组合物，由0.1mg/mL浓度的上述重组类人弹性蛋白原液、终浓度50mM/L～200mM/L的精氨酸；重组类人弹性蛋白原液质量分数0.2％～2.0％的牛血清白蛋白混合制备而成。
一种上述重组类人弹性蛋白的制备方法，具体步骤如下：
(A)目的蛋白序列设计：以人弹性蛋白全长氨基酸序列为参考设计人工序列，选取人弹性蛋白全长氨基酸序列中的(VAPGVG)3S氨基酸序列为重复单元，重复串联若干次后形成重组类人弹性蛋白的全长氨基酸序列；
(B)目的基因获得：以重组类人弹性蛋白的全长氨基酸序列为模板获得目的基因序列，按照大肠杆菌的密码子偏好对目的基因序列进行优化，并在目的基因的两端加入酶切位点后获得重组类人弹性蛋白基因rhELP，人工合成rhELP；
(C)载体构建：PCR扩增rhELP，将rhELP克隆至原核载体pET32a(+)，获得重组表达载体pET32a-rhELP；
(D)将重组表达载体转化进入大肠杆菌中获得重组类人弹性蛋白表达工程菌BL21/pET32a-rhELP；
(E)摇瓶培养工程菌，表达重组蛋白，收获重组菌体经超声破碎、离心，分别留取少量破碎后的菌体、离心后的上清和沉淀做12％SDS-PAGE电泳，分析蛋白的表达量和表达形式；
(F)将含重组蛋白的菌体破碎上清采用AKTA prime纯化系统对目的蛋白进行纯化，获得纯度高于95％的重组类人弹性蛋白。
本发明获得的有益效果：
利用原核表达系统体外表达获得的重组类人弹性蛋白具有较高的超氧自由基清除活性。活性多肽片段经过较少次数的串联重复后具有较好的耐降解性能，催化活性较单一原始片段保持更久，辅以筛选后的保护剂成分，可以显著提高重组类人弹性蛋白的使用周期。
附图说明
图1SDS-PAGE鉴定BL21/pET32a-rhELP表达量和表达形式；其中：
M：Markers；
Lane 1：BL21/pET32a破碎上清液(对照)；
Lane 2：BL21/pET32a-rhELP破碎液；
Lane 3：BL21/pET32a-rhELP破碎液离心后的上清液；
Lane 4：BL21/pET32a-rhELP破碎液离心后的沉淀物。
图2 SDS-PAGE鉴定纯化的rhELP。
其中M为Markers；Lane1为纯化后的rhELP。
具体实施方式
下面通过对实施例的描述，对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
实施例1：重组类人弹性蛋白表达工程菌构建技术方案如下：
1.目的蛋白序列设计：类人弹性蛋白(elastin-like protein,ELP)是一种由原弹性蛋白氨基酸序列为参考所设计的人工序列，通过异源表达的方式所获得的重组蛋白。通常是以(VAPGVG)3S氨基酸序列重复序列组成的肽链，其结构和功能均优于动物体内的原弹性蛋白，本实施例设计蛋白序列重复5次，即[(VAPGVG)3S]5，如SEQ NO.1所示。
2.目的基因获得：重组类人弹性蛋白基因(rhELP)由通用生物系统(安徽)有限公司进行人工合成，并按照大肠杆菌的密码子偏好对目的序列进行优化，在目的基因N端和C端分别插入酶切位点BamH I(GGATCC)和Hind III(AAGCTT)。经密码子优化后的编码区序列为：
GGATCCGTTGCACCTGGTGTTGGTGTTGCCCCAGGTGTTGGCGTGGCACCTGGCGTGGGTAGCGTTGCGCCAGGCGTGGGTGTAGCCCCTGGTGTGGGAGTTGCGCCTGGCGTTGGTTCAGTGGCACCAGGTGTAGGGGTAGCTCCAGGCGTTGGAGTTGCACCCGGTGTGGGTTCAGTAGCTCCTGGCGTAGGCGTCGCACCAGGCGTCGGTGTTGCACCAGGCGTTGGTAGTGTTGCCCCTGGTGTAGGTGTAGCTCCCGGTGTAGGCGTAGCGCCAGGTGTGGGTAGCAAGC TT，如SEQ NO.2所示。
3.载体构建：由通用生物系统(安徽)有限公司进行克隆，将步骤1合成的目的基因克隆至原核载体pET32a(+)，获得重组载体pET32a-rhELP。
4.重组载体转化：取2μl重组载体pET32a-rhELP与大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞混匀，静置冰浴30min。置于42℃水浴锅热激90s，静置冰浴5min。加入1ml无抗性的LB，经37℃、220rpm震荡培养1h。掌上离心机离心1min，弃800μl上清，悬浮剩余沉淀物，均匀涂布于含100μg/ml氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)的琼脂平板上。正置培养1h后翻转平皿，在37℃温箱过夜培养。次日挑取转化菌落进行接种培养。提取转化菌落过夜培养菌液的质粒，经核苷酸测序检查无误，则获得重组类人弹性蛋白表达工程菌BL21/pET32a-rhELP。
5.摇瓶表达(发酵液体积为1L)：菌种用含有Amp抗性的LB培养基复壮，经37℃培养至OD 0.6，添加终浓度为1mM的IPTG，在30℃震荡培养诱导5h。收获菌体后用150ml BindingBuffer(pH 8.0 PBS)进行重悬，经超声破碎、离心，分别留取少量破碎后的菌体、离心后的上清和沉淀做12％SDS-PAGE电泳，分析蛋白的表达量和表达形式。结果(图1)显示，目的蛋白表达量占全菌表达量约为35％，目的蛋白90％以上清形式表达，蛋白大小约为30kDa。
6.蛋白纯化：使用GE Healthcare公司AKTA prime纯化系统对目的蛋白进行纯化。使用GE Healthcare公司Chelating Sepharose TM Fast Flow镍离子螯合亲和层析填料自行装柱。用3个柱体积的纯化水清洗Ni2+螯合亲和层析柱，再用Binding Buffer平衡2-3个柱体积。在线检测电导率值及280nm波长吸收值，待两者都稳定后开始上蛋白样(步骤4破碎后离心的上清)，设置样品经过泵和层析柱流速为5-6ml/min。再用Binding Buffer过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到OD 280nm稳定。用2个柱体积Washing Buffer(pH8.0PBS containing 100mM Imidazole)清洗杂蛋白，2个柱体积Elution Buffer(pH8.0PBS containing 300mM Imidazole)洗脱目的蛋白。纯化后的rhELP蛋白做12％SDS-PAGE电泳分析(图2)，纯度高于95％。
实施例2：其余均与实施例1相同，不同之处在于将(VAPGVG)3S氨基酸序列重复次数设计为1、3、5、7、9、11、15、32次，分别进行重组菌的构建，并纯化获得不同重复次数的重组类人弹性蛋白，以纯化后的蛋白原液(浓度为0.1mg/mL)为测试样本，于恒温37℃比较不同存放天数下不同重组蛋白的超氧阴离子清除率(即催化活性)，结果见表1。
表1不同重复次数的重组类人弹性蛋白的催化活性比较结果
Figure BDA0002561939050000041
重组蛋白的催化活性取决于其表面催化活性位点的多少，理论上，一级结构上多肽活性片段的重复次数越多，重组蛋白的催化活性位点就越多，那么催化活性应当与一级结构上多肽片段的重复次数成正比，但本研究中发现，多肽片段的重复次数并不与催化活性成正比，反而在活性片段重复次数较高时重组蛋白的初始催化活性出现了下降，这可能是由于原核表达系统中表达分子量过大的蛋白时，容易出现蛋白折叠错误或蛋白活性位点的遮盖，大量活性多肽片段位于蛋白质二级或三级结构的内部，导致蛋白表面的活性催化位点不升反降，因此降低重复次数反而获得较好的初始催化活性。
由表8结果可知，重复次数在3～7时，重组蛋白的催化活性达到峰值，因此摒弃了高通量重复多肽片段的策略，选用少量重复次数的重组蛋白，这种少量的重复次数蛋白更利于在原核表达系统中克隆表达，多为分泌型表达，不形成包涵体，更利于后续的蛋白质纯化和活性的保持。
同时，我们也发现，片段的重复次数越高，耐降解的能力也就越强，主要是因为蛋白质分子量越大，降解半衰期也就越长，降解过程中活性片段的分解消耗对其催化活性的影响也就越小，因此，需要进一步解决小分子量重组蛋白的不耐降解的问题。
实施例3：将实施例1中制备的已知浓度的重组类人弹性蛋白原液(浓度应大于等于0.1mg/ml)采用含有2％甘油的Tris-Nacl缓冲液稀释成0.1mg/ml弹性蛋白原液。
1.使用0.1mg/ml弹性蛋白原液分别配制含特定含量的精氨酸、牛血清白蛋白BSA的保护液，精氨酸、牛血清白蛋白的含量为：
1)精氨酸:50mM/L、100mM/L、150mM/L、200mM/L；
2)牛血清白蛋白BSA(质量分数):0.2％、0.5％、1.0％、1.5％、2.0％。
2.将配制好的试剂进行37℃加速破坏实验，为期7天。
检测操作步骤如下：将所有样品均放入37℃恒温箱中进行加速破坏，分别在第0、1、3、5、7天的时候取出样品，用超氧阴离子清除能力检测试剂盒(Solarbio超氧阴离子清除能力检测试剂盒货号:BC1410规格:50管/48样)分别检测其超氧阴离子清除率(即生物学活性)。
本发明所述的超氧阴离子自由基作为生物体代谢过程中产生的一种自由基，可攻击生物大分子，如脂质、蛋白质、核酸和聚不饱和脂肪酸等，使其交链或者断裂，引起细胞结构和功能的破坏，与机体衰老和病变有很密切的关系，清除超氧阴离子自由基的研究已经得到了广泛的关注。
AP-TEMED系统产生超氧阴离子，与盐酸羟胺反应生成NO2－，NO2－与对氨基苯磺酸和α－萘胺的作用生成红色的偶氮化合物，在530nm处有特征吸收峰，样品对超氧阴离子的清除能力与530nm的吸光值呈负相关。
产品内容:提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体2mL×1瓶，4℃避光保存；试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加8mL蒸馏水充分溶解；试剂三：液体10mL×1瓶，4℃保存；试剂四：液体10mL×1瓶，4℃避光保存；试剂五：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。
将试剂盒中各试剂按以下顺序加入。
表2测定操作表
Figure BDA0002561939050000061
计算公式：超氧阴离子清除率I％＝(A对照管-A测定管)/A对照管×100％
结果
经检测，37℃加速破坏7天后最优结果为：100mM精氨酸、1.0％牛血清白蛋白。试验结果如下表所示。
表3 OD值结果统计表
Figure BDA0002561939050000062
表4使用不同保护剂37℃加速破坏第0天
Figure BDA0002561939050000063
Figure BDA0002561939050000071
表5使用不同保护剂37℃加速破坏第1天
Figure BDA0002561939050000072
Figure BDA0002561939050000081
表6使用不同保护剂37℃加速破坏第3天
Figure BDA0002561939050000082
Figure BDA0002561939050000091
表7使用不同保护剂37℃加速破坏第5天
Figure BDA0002561939050000092
Figure BDA0002561939050000101
表8使用不同保护剂37℃加速破坏第7天
Figure BDA0002561939050000102
结果分析：
由表4可知，只添加Tris 50mM/L，Nacl 100mM/L和质量分数为2％甘油时，37℃加速破坏7天后的超氧阴离子清除率明显低于添加不同浓度精氨酸和不同浓度的牛血清白蛋白组。该实验结果表明精氨酸和牛血清白蛋白对于维持重组类人弹性蛋白的生物学活性起到了显著效果。
由表4～8可知，保护液中精氨酸浓度为100mM/L时，37℃加速破坏7天后各组样品的超氧阴离子清除率高于保护液中精氨酸浓度为50mM/L的各组样品。另外，保护液中牛血清白蛋白的质量分数为1％的各组样品37℃加速破坏7天后的超氧阴离子清除率高于质量分数为0.2％、0.5％各组样品。该实验结果表明保护液中精氨酸浓度为100mM/L，牛血清白蛋白的质量分数为1％时，能够较好的保持蛋白的生物学活性。
所以，上述蛋白保护技术可以有效的防止蛋白发生变性分解，保持小分子量重组类人弹性蛋白的生物学活性。
综上所述，利用原核表达系统体外表达获得的重组类人弹性蛋白具有较高的超氧自由基清除活性。活性多肽片段经过较少次数的串联重复后具有较好的耐降解性能，催化活性较单一原始片段保持更久，辅以筛选后的保护剂成分，可以显著提高重组类人弹性蛋白的使用周期。
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽九川生物科技有限公司
<120> 一种重组类人弹性蛋白及其组合物
<130> 14453
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly
1 5 10 15
Val Gly Ser Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val
20 25 30
Ala Pro Gly Val Gly Ser Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly
35 40 45
Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Ser Val Ala Pro Gly Val Gly Val
50 55 60
Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Ser Val Ala Pro Gly
65 70 75 80
Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Ser
85 90 95
<210> 2
<211> 297
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggatccgttg cacctggtgt tggtgttgcc ccaggtgttg gcgtggcacc tggcgtgggt 60
agcgttgcgc caggcgtggg tgtagcccct ggtgtgggag ttgcgcctgg cgttggttca 120
gtggcaccag gtgtaggggt agctccaggc gttggagttg cacccggtgt gggttcagta 180
gctcctggcg taggcgtcgc accaggcgtc ggtgttgcac caggcgttgg tagtgttgcc 240
cctggtgtag gtgtagctcc cggtgtaggc gtagcgccag gtgtgggtag caagctt 297

Claims (6)

1.一种重组类人弹性蛋白，其特征在于，由短重复氨基酸序列串联而成，所述短重复氨基酸序列为(VAPGVG)3S，串联重复3～7次构成目的蛋白多肽序列，所述目的蛋白多肽序列如SEQ NO.1所示。
2.根据权利要求1中所述的重组类人弹性蛋白，其特征在于：所述(VAPGVG)3S片段的重复次数为5。
3.根据权利要求1中所述的重组类人弹性蛋白，其特征在于：其蛋白质编码基因序列为SEQ NO.2，所述蛋白质编码基因序列的5’端插入酶切位点BamH I和3’端插入酶切位点HindIII，所述蛋白质编码基因序列采用大肠杆菌表达系统进行重组蛋白表达。
4.根据权利要求3中所述的重组类人弹性蛋白，其特征在于：所述大肠杆菌表达系统中载体为pET32a(+)，重组蛋白90％以上以可溶性蛋白形式表达，重组蛋白分子量大小为30kDa。
5.一种重组类人弹性蛋白组合物，其特征在于：由0.1mg/mL浓度的重组类人弹性蛋白原液、终浓度50mM/L～200mM/L的精氨酸；重组类人弹性蛋白原液质量分数0.2％～2.0％的牛血清白蛋白混合制备而成。
6.一种如权利要求1-5中任一项所述重组类人弹性蛋白的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(A)目的蛋白序列设计：以人弹性蛋白全长氨基酸序列为参考设计人工序列，选取人弹性蛋白全长氨基酸序列中的(VAPGVG)3S氨基酸序列为重复单元，重复串联若干次后形成重组类人弹性蛋白的全长氨基酸序列；
(B)目的基因获得：以重组类人弹性蛋白的全长氨基酸序列为模板获得目的基因序列，按照大肠杆菌的密码子偏好对目的基因序列进行优化，并在目的基因的两端加入酶切位点后获得重组类人弹性蛋白基因rhELP，人工合成rhELP；
(C)载体构建：PCR扩增rhELP，将rhELP克隆至原核载体pET32a(+)，获得重组表达载体pET32a-rhELP；
(D)将重组表达载体转化进入大肠杆菌中获得重组类人弹性蛋白表达工程菌BL21/pET32a-rhELP；
(E)摇瓶培养工程菌，表达重组蛋白，收获重组菌体经超声破碎、离心，分别留取少量破碎后的菌体、离心后的上清和沉淀做12％SDS-PAGE电泳，分析蛋白的表达量和表达形式；
(F)将含重组蛋白的菌体破碎上清采用AKTA prime纯化系统对目的蛋白进行纯化，获得纯度高于95％的重组类人弹性蛋白。
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